特許 7415674 スピニングディスク、共焦点スキャナ、及び顕微鏡システム

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-01-09

(45)【発行日】2024-01-17

(54)【発明の名称】スピニングディスク、共焦点スキャナ、及び顕微鏡システム

(51)【国際特許分類】

   G02B 21/06 20060101AFI20240110BHJP

   G02B 21/36 20060101ALI20240110BHJP

   G01N 21/01 20060101ALI20240110BHJP

   G01N 21/64 20060101ALI20240110BHJP

【ＦＩ】

G02B21/06

G02B21/36

G01N21/01 D

G01N21/64 E

【請求項の数】 5

(21)【出願番号】P 2020037655

(22)【出願日】2020-03-05

(65)【公開番号】P2021140030

(43)【公開日】2021-09-16

【審査請求日】2022-12-28

(73)【特許権者】

【識別番号】000006507

【氏名又は名称】横河電機株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100106909

【弁理士】

【氏名又は名称】棚井 澄雄

(74)【代理人】

【識別番号】100146835

【弁理士】

【氏名又は名称】佐伯 義文

(74)【代理人】

【識別番号】100167553

【弁理士】

【氏名又は名称】高橋 久典

(74)【代理人】

【識別番号】100181124

【弁理士】

【氏名又は名称】沖田 壮男

(72)【発明者】

【氏名】中村 剛

【審査官】瀬戸 息吹

(56)【参考文献】

【文献】特開平１０－１６１０３２（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２００９－１６８９６４（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１０－０２６３４４（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２００７－２２５３８１（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２００８／０７２３６５（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｇ０２Ｂ １９／００ － ２１／３６

Ｇ０１Ｎ ２１／６２ － ２１／７４

Ｇ０１Ｎ ２１／００ － ２１／０１

Ｇ０１Ｎ ２１／１７ － ２１／７４

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

複数の波長を含む光から試料を走査するための照明光を生成するスピニングディスクであって、
複数のピンホールを有し、回転可能に構成された第１ディスクと、
前記ピンホールに対応づけて形成された複数のマイクロレンズを有し、前記第１ディスクとともに回転可能に構成された第２ディスクと、
前記第１ディスクとともに回転可能であり、前記第１ディスクの回転軸に垂直な面内における予め規定された領域毎に異なる特定波長帯域の光を透過させる光学フィルタと、
を備え、
前記光学フィルタは、前記第２ディスクに形成されている、
スピニングディスク。

【請求項2】

請求項１に記載のスピニングディスクと、
前記照明光を前記試料に照射して得られる蛍光を、前記特定波長帯域に対応して設定された観察波長帯域毎に弁別する蛍光弁別部と、
を備える共焦点スキャナ。

【請求項3】

前記光学フィルタは、第１特定波長帯域の光、第２特定波長帯域の光、第３特定波長帯域の光、及び第４特定波長帯域の光を透過させる領域を備えており、
前記蛍光弁別部は、前記蛍光を、前記第１特定波長帯域に対応して設定された第１観察波長帯域、前記第２特定波長帯域に対応して設定された第２観察波長帯域、前記第３特定波長帯域に対応して設定された第３観察波長帯域、及び前記第４特定波長帯域に対応して設定された第４観察波長帯域毎に弁別する、
請求項２記載の共焦点スキャナ。

【請求項4】

前記光学フィルタは、波長の長さ順に並べられる第１特定波長帯域、第２特定波長帯域、第３特定波長帯域、及び第４特定波長帯域のうち、前記第１特定波長帯域及び第３特定波長帯域の光を透過させる第１領域と、前記第２特定波長帯域及び第４特定波長帯域の光を透過させる第２領域と、を備えており、
前記蛍光弁別部は、前記蛍光を、前記第１特定波長帯域に対応して設定された第１観察波長帯域、前記第２特定波長帯域に対応して設定された第２観察波長帯域、前記第３特定波長帯域に対応して設定された第３観察波長帯域、及び前記第４特定波長帯域に対応して設定された第４観察波長帯域毎に弁別する、
請求項２記載の共焦点スキャナ。

【請求項5】

複数の波長を含む光を出力する光源部と、
前記光源部から出力される光から試料を走査するための照明光を生成するとともに、前記照明光を前記試料に照射して得られる蛍光を前記観察波長帯域毎に弁別する請求項２から４の何れか一項に記載の共焦点スキャナと、
前記試料の前記観察波長帯域毎の共焦点像を撮影する複数の撮影装置と、
前記撮影装置で撮影された前記共焦点像の画像処理を行う画像処理装置と、
を備える顕微鏡システム。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、スピニングディスク、共焦点スキャナ、及び顕微鏡システムに関する。

【背景技術】

【0002】

近年、ディスク走査型共焦点顕微鏡を用いて、生体の組織、器官、細胞等の試料を２次元画像又は３次元画像に画像化する技術が注目されている。この技術は、スピニングディスクを回転させて試料に対する照明光（励起光）の照射位置を変更する（照明光によって試料を走査する）ことで、試料の共焦点像を得るものである。この技術では、焦点面における情報のみが得られるため、解像度及びコントラストが優れた画像が得られるという利点がある。

【0003】

以下の特許文献１，２には、同一箇所における多色の共焦点像を同時に得ることが可能なディスク走査型共焦点顕微鏡が開示されている。具体的に、以下の特許文献１，２に開示されたディスク走査型共焦点顕微鏡では、波長が異なる複数の励起光が含まれる照明光を試料に照射し、試料から得られる蛍光を予め規定された波長帯域毎に弁別することで、同一箇所における多色の共焦点像を同時に得るようにしている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【文献】特開２００９－２８８０８７号公報

【文献】特許第６４８４２３４号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

ところで、一般的に、試料から得られる蛍光は、幅広い波長帯域を有する（スペクトル幅が広い）。このため、波長が近い複数の励起光が含まれる照明光を試料に照射した場合に得られる蛍光のスペクトルは、各々の励起光を個別に試料に照射したときに得られる蛍光のスペクトルが重なり合ったものとなることがある。スペクトルが重なった蛍光は、観察波長帯域毎に弁別することが困難であることから、互いにノイズになりあう現象（以下、「蛍光クロストーク」という）が生ずる。このような蛍光クロストークが生ずると、共焦点像の解像度及びコントラストの低下が引き起こされるという問題がある。

【0006】

本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、蛍光クロストークの影響が殆ど無く、解像度及びコントラストが優れた共焦点像を得ることができるスピニングディスク、共焦点スキャナ、及び顕微鏡システムを提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0007】

上記課題を解決するために、本発明の一態様によるスピニングディスクは、複数の波長を含む光から試料（ＳＰ）を走査するための照明光を生成するスピニングディスク（２１）であって、複数のピンホール（３２ａ）を有し、回転可能に構成された第１ディスク（３２）と、前記第１ディスクとともに回転可能であり、前記第１ディスクの回転軸（３４）に垂直な面内における予め規定された領域（Ｒ１～Ｒ８、Ｒ１１～Ｒ１４、Ｒ２１，Ｒ２２）毎に異なる特定波長帯域の光を透過させる光学フィルタ（３３）と、を備える。

【0008】

また、本発明の一態様によるスピニングディスクは、前記ピンホールに対応づけて形成された複数のマイクロレンズ（３１ａ）を有し、前記第１ディスクとともに回転可能に構成された第２ディスク（３１）を更に備える。

【0009】

また、本発明の一態様によるスピニングディスクは、前記光学フィルタが形成され、前記第１ディスクとともに回転可能に構成された第３ディスク（３５）を更に備える。

【0010】

或いは、本発明の一態様によるスピニングディスクは、前記光学フィルタが、前記第１ディスクに形成されている。

【0011】

或いは、本発明の一態様によるスピニングディスクは、前記光学フィルタが、前記第２ディスクに形成されている。

【0012】

また、本発明の一態様によるスピニングディスクは、前記第３ディスクが、前記第１ディスク又は前記第２ディスクに近接配置される。

【0013】

本発明の一態様による共焦点スキャナ（２０）は、上記の何れかに記載のスピニングディスクと、前記照明光を前記試料に照射して得られる蛍光を、前記特定波長帯域に対応して設定された観察波長帯域毎に弁別する蛍光弁別部（２４、２５ａ～２５ｃ、２６ａ～２６ｄ、２７ａ～２７ｄ）と、を備える。

【0014】

また、本発明の一態様による共焦点スキャナは、前記光学フィルタが、第１特定波長帯域（λ１）の光、第２特定波長帯域（λ２）の光、第３特定波長帯域（λ３）の光、及び第４特定波長帯域（λ４）の光を透過させる領域（Ｒ１～Ｒ８、Ｒ１１～Ｒ１４）を備えており、前記蛍光弁別部が、前記蛍光を、前記第１特定波長帯域に対応して設定された第１観察波長帯域（ＷＢ１）、前記第２特定波長帯域に対応して設定された第２観察波長帯域（ＷＢ２）、前記第３特定波長帯域に対応して設定された第３観察波長帯域（ＷＢ３）、及び前記第４特定波長帯域に対応して設定された第４観察波長帯域（ＷＢ４）毎に弁別する。

【0015】

或いは、本発明の一態様による共焦点スキャナは、前記光学フィルタが、波長の長さ順に並べられる第１特定波長帯域（λ１）、第２特定波長帯域（λ２）、第３特定波長帯域（λ３）、及び第４特定波長帯域（λ４）のうち、前記第１特定波長帯域及び第３特定波長帯域の光を透過させる第１領域（Ｒ２１）と、前記第２特定波長帯域及び第４特定波長帯域の光を透過させる第２領域（Ｒ２２）と、を備えており、前記蛍光弁別部が、前記蛍光を、前記第１特定波長帯域に対応して設定された第１観察波長帯域（ＷＢ１）、前記第２特定波長帯域に対応して設定された第２観察波長帯域（ＷＢ２）、前記第３特定波長帯域に対応して設定された第３観察波長帯域（ＷＢ３）、及び前記第４特定波長帯域に対応して設定された第４観察波長帯域（ＷＢ４）毎に弁別する。

【0016】

本発明の一態様による顕微鏡システム（１）は、複数の波長を含む光を出力する光源部（１０）と、前記光源部から出力される光から試料を走査するための照明光を生成するとともに、前記照明光を前記試料に照射して得られる蛍光を前記観察波長帯域毎に弁別する上記の何れかに記載の共焦点スキャナ（２０）と、前記試料の前記観察波長帯域毎の共焦点像を撮影する複数の撮影装置（３０ａ～３０ｄ）と、前記撮影装置で撮影された前記共焦点像の画像処理を行う画像処理装置（４０）と、を備える。

【発明の効果】

【0017】

本発明によれば、蛍光クロストークの影響が殆ど無く、解像度及びコントラストが優れた共焦点像を得ることができる、という効果がある。

【図面の簡単な説明】

【0018】

【図1】本発明の実施形態による顕微鏡システムの要部構成を示す図である。

【図2】本発明の実施形態によるスピニングディスクを示す図である。

【図3】本発明の実施形態において、試料に照射される照明光の波長と、観察の対象となっている波長帯域との関係の一例を示す図である。

【図4】本発明の実施形態によるスピニングディスクの変形例を示す側面図である。

【図5】本発明の実施形態によるスピニングディスクの他の変形例を示す平面透視図である。

【発明を実施するための形態】

【0019】

以下、図面を参照して本発明の実施形態によるスピニングディスク、共焦点スキャナ、及び顕微鏡システムについて詳細に説明する。以下では、まず本発明の実施形態の概要について説明し、続いて本発明の実施形態の詳細について説明する。

【0020】

〔概要〕
本発明の実施形態は、蛍光クロストークの影響が殆ど無く、解像度及びコントラストが優れた共焦点像を得ることができるスピニングディスク、共焦点スキャナ、及び顕微鏡システムを提供するものである。具体的には、第１ディスク及び光学フィルタによって、複数の波長を含む光から、予め規定された領域毎に異なる特定波長帯域の光のみが含まれる照明光を試料に照射することで、蛍光クロストークの影響が殆ど無く、解像度及びコントラストが優れた共焦点像を得ることができるようにするものである。

【0021】

ここで、上述した特許文献１に開示された発明では、波長が異なる複数の励起光を含む光を試料に照射し、試料から得られる蛍光を観察波長帯域毎に弁別することで、同一箇所における多色の共焦点像を同時に得るようにしている。また、上述した特許文献２に開示された技術では、ある程度波長が離れた２つの励起光が含まれる照明光を試料に照射することでスペクトルの重なりが少ない蛍光を得て、試料から得られる蛍光を観察波長帯域毎に弁別することで、同一箇所における多色の共焦点像を同時に得るようにしている。

【0022】

上述した特許文献１に開示された発明は、波長が異なる複数の励起光を含む光を試料に照射していることから、照明光に含まれる励起光の波長が近い場合には、試料から得られる蛍光はスペクトルが重なり合ったものとなることがある。このようなスペクトルが重なった蛍光は、観察波長帯域毎に弁別することが困難であることから、蛍光クロストークが生じてしまう。その結果、共焦点像の解像度及びコントラストの低下が引き起こされることがある。

【0023】

上述した特許文献２に開示された技術は、ある程度波長が離れた２つの励起光が含まれる照明光を試料に照射することにより、スペクトルの重なりが少ない蛍光を得て、蛍光クロストークを低減するようにしている。しかしながら、上述した特許文献２に開示された技術では、上述の通り、ある程度波長が離れた２つの励起光が含まれる照明光を試料に照射する必要があることから、同時に得ることができる同一箇所における共焦点像の波長帯域が制限されることが考えられる。

【0024】

本発明の実施形態では、複数のピンホールを有し、回転可能に構成された第１ディスクと、第１ディスクとともに回転可能であり、第１ディスクの回転軸に垂直な面内における予め規定された領域毎に異なる特定波長帯域の光を透過させる光学フィルタと、を備えるスピニングディスクによって、複数の波長を含む光から、予め規定された領域毎に異なる特定波長帯域の光のみが含まれる照明光を試料に照射するようにしている。これにより、照明光が照射された箇所からは、特定波長帯域の光が試料に個別に照射されたときの蛍光が得られるため、蛍光クロストークの影響が殆ど無く、解像度及びコントラストが優れた共焦点像を得ることができる。

【0025】

また、本発明の実施形態では、第１ディスクの回転とともに光学フィルタが回転するため、試料に照射される照明光の波長帯域（特定波長帯域）が順次切り替わる。これにより、異なる特定波長帯域の光を試料に照明光として順次照射したときの共焦点像を順次得ることができる。

【0026】

〔実施形態〕
〈顕微鏡システムの要部構成〉
図１は、本発明の実施形態による顕微鏡システムの要部構成を示す図である。図１に示す通り、本実施形態の顕微鏡システム１は、光源部１０、共焦点スキャナ２０、カメラ３０ａ～３０ｄ（撮影装置）、画像処理装置４０、及び表示装置５０を備える。

【0027】

このような顕微鏡システム１は、光源部１０から出力される光から試料ＳＰを走査するための照明光を共焦点スキャナ２０で生成し、照明光が照射される試料ＳＰの共焦点像をカメラ３０ａ～３０ｄで撮影する。そして、顕微鏡システム１は、カメラ３０ａ～３０ｄで撮影された共焦点像を画像処理装置４０で画像処理して表示装置５０に表示するものである。

【0028】

光源部１０は、試料ＳＰを照明するために必要となる光を出力する。光源部１０から出力される光は、コヒーレント光（レーザ光）であってもよく、インコヒーレント光であっても良い。尚、本実施形態では、理解を容易にするために、光源部１０から出力される光はレーザ光であるとする。

【0029】

光源部１０は、複数の波長を含む光を出力する。例えば、光源部１０は、波長λ１（第１特定波長帯域）のレーザ光、波長λ２（第２特定波長帯域）のレーザ光、波長λ３（第３特定波長帯域）のレーザ光、波長λ４（第４特定波長帯域）のレーザ光を含む光を出力する。例えば、波長λ１は４０５［ｎｍ］であり、波長λ２は４８８［ｎｍ］であり、波長λ３は５６１［ｎｍ］であり、波長λ４は６４０［ｎｍ］である。尚、光源部１０は、これらの波長を含む白色光を出力するものであっても良い。また、光源部１０から出力される光の波長範囲は、上記の波長範囲（４０５～６４０［ｎｍ］）に制限される訳ではなく、試料ＳＰの光学的な特性に応じた任意の波長範囲にすることができる。

【0030】

共焦点スキャナ２０は、光源部１０から出力される光から試料ＳＰを走査するための照明光を生成するとともに、照明光を試料ＳＰに照射して得られる反射光や蛍光等（以下、これらを総称する場合には、単に「戻り光」という）をカメラ３０ａ～３０ｄに導くものである。共焦点スキャナ２０は、スピニングディスク２１、対物光学系２２、ダイクロイックミラー２３、リレー光学系２４（蛍光弁別部）、ダイクロイックミラー２５ａ～２５ｃ（蛍光弁別部）、リレー光学系２６ａ～２６ｄ（蛍光弁別部）、及びバンドパスフィルタ２７ａ～２７ｄ（蛍光弁別部）を備える。

【0031】

スピニングディスク２１は、光源部１０から出力される光から、試料ＳＰを走査するための照明光を生成する。図２は、本発明の実施形態によるスピニングディスクを示す図である。尚、図２（ａ）は、スピニングディスク２１の側面図であり、図２（ｂ）は、スピニングディスク２１の平面透視図である。図２に示す通り、スピニングディスク２１は、マイクロレンズアレイディスク３１（第２ディスク）、ピンホールアレイディスク３２（第１ディスク）、バンドパスコーティング３３（光学フィルタ）、及び回転軸３４を備える。尚、図１では、図示を簡略化するために、マイクロレンズアレイディスク３１及びピンホールアレイディスク３２等を回転軸３４の周りに回転駆動するモータの図示は省略している。

【0032】

マイクロレンズアレイディスク３１は、所定のパターンに形成された複数のマイクロレンズ３１ａを有する円板状のディスクである。このマイクロレンズアレイディスク３１の第１面Ｐ１１に設定された照射領域Ａ１（図２（ｂ）参照）には光源部１０から出力される光が照射される。ピンホールアレイディスク３２は、マイクロレンズアレイディスク３１のマイクロレンズ３１ａに対応づけられて形成された複数のピンホール３２ａを有する円板状のディスクである。ピンホールアレイディスク３２のピンホール３２ａは、図２（ｂ）に示す通り、螺旋放射状に配列されて形成されている。尚、マイクロレンズアレイディスク３１のマイクロレンズ３１ａも、図２（ｂ）に示すピンホール３２ａと同様に、螺旋放射状に形成されている。

【0033】

バンドパスコーティング３３は、マイクロレンズアレイディスク３１の第２面Ｐ１２に形成されており、光源部１０から出力される光から、回転軸３４に垂直な面内における予め規定された領域毎に異なる特定波長帯域の光を透過させるものである。このバンドパスコーティング３３は、試料ＳＰの一箇所に特定波長帯域の光のみが照射される（複数の波長を含む光が照射されない）ようにするためのものである。尚、試料ＳＰの一箇所に複数の特定波長帯域の光が照射されることはないが、試料ＳＰの異なる箇所に異なる特定波長帯域の光が同時に照射されることがある点に注意されたい。

【0034】

バンドパスコーティング３３は、例えば、図２（ｂ）に示す通り、回転軸３４に垂直な面内において、螺旋放射状の８つの領域Ｒ１～Ｒ８に均等に分割されている。例えば、図２（ｂ）において、領域Ｒ１，Ｒ５は波長λ１の光を透過させる領域であり、領域Ｒ２，Ｒ６は波長λ２の光を透過させる領域であり、領域Ｒ３，Ｒ７は波長λ３の光を透過させる領域であり、領域Ｒ４，Ｒ８は、波長λ４の光を透過させる領域である。尚、領域Ｒ１～Ｒ８は、領域Ｒ１～Ｒ８の何れか２つが同じ波長の光を透過させるように設定されていれば良く、回転軸３４の周りにおいて、透過させる波長の長さの順に配列されている必要は必ずしもない。

【0035】

回転軸３４の両端にはマイクロレンズアレイディスク３１及びピンホールアレイディスク３２がそれぞれ取り付けられている。よって、マイクロレンズアレイディスク３１及びピンホールアレイディスク３２は、回転軸３４の周りでともに（一体的に）回転可能に構成されている。尚、バンドパスコーティング３３は、マイクロレンズアレイディスク３１の第２面Ｐ１２に形成されていることから、マイクロレンズアレイディスク３１及びピンホールアレイディスク３２とともに回転軸３４の周りで回転可能である。

【0036】

マイクロレンズアレイディスク３１に形成されたマイクロレンズ３１ａ、ピンホールアレイディスク３２に形成されたピンホール３２ａ、及びバンドパスコーティング３３の領域Ｒ１～Ｒ８の関係は、スピニングディスク２１が回転しても変わらない。このため、ピンホールアレイディスク３２に設けられたピンホール３２ａの各々を通過する照明光は、波長λ１のレーザ光、波長λ２のレーザ光、波長λ３のレーザ光、波長λ４のレーザ光の何れかとなる。

【0037】

対物光学系２２は、スピニングディスク２１で生成された照明光を試料ＳＰに照射するとともに、試料ＳＰに照明光を照射して得られる戻り光をスピニングディスク２１に導く。尚、図１では、対物光学系２２及び試料ＳＰを共焦点スキャナ２０の内部に図示しているが、対物光学系２２及び試料ＳＰは、共焦点スキャナ２０の外部に設けられていても良い。

【0038】

ダイクロイックミラー２３は、試料ＳＰに照射される光（照明光）を透過させるとともに、試料ＳＰに照明光を照射して得られる戻り光をリレー光学系２４に向けて反射する。具体的に、ダイクロイックミラー２３は、対物光学系２２の光軸上であって、スピニングディスク２１に設けられたマイクロレンズアレイディスク３１とピンホールアレイディスク３２との間に配置されている。尚、ダイクロイックミラー２３に代えて、ハーフミラーを用いることもできる。

【0039】

尚、ダイクロイックミラー２３は、マイクロレンズアレイディスク３１に設けられたマイクロレンズ３１ａで分割・収束された複数の光束を透過させる。ダイクロイックミラー２３を透過した光束は、ピンホールアレイディスク３２に設けられたピンホール３２ａに集光され、ピンホール３２ａを通過してスピニングディスク２１の外部に射出される。

【0040】

リレー光学系２４とリレー光学系２６ａ～２６ｄとは、ダイクロイックミラー２３で反射された戻り光を、カメラ３０ａ～３０ｄに導く光学系を構成する。リレー光学系２４とリレー光学系２６ａ～２６ｄとによって構成される光学系は、像のシェーディング（明るさの不均一性）を無くすために、テレセントリック光学系であることが望ましい。ここで、テレセントリック光学系とは、主光線が光軸に対して平行である光学系のことをいう。

【0041】

リレー光学系２４とリレー光学系２６ａ～２６ｄとによってテレセントリック光学系が構成される場合には、リレー光学系２４の物体側焦点面は、ピンホールアレイディスク３２のピンホール３２ａの位置に設定される対物光学系２２の像側焦点面と一致するように設定される。また、リレー光学系２６ａ～２６ｄの像側焦点面はそれぞれ、カメラ３０ａ～３０ｄの撮像面に一致するように設定される。

【0042】

ダイクロイックミラー２５ａ～２５ｃは、リレー光学系２４とリレー光学系２６ｄとの間の光軸上に順に配置され、ダイクロイックミラー２３で反射された戻り光を、波長に応じて反射又は透過させる。ダイクロイックミラー２５ａ～２５ｃは、概して、短波長帯域の光を反射させ、長波長帯域の光を透過させる。

【0043】

具体的に、ダイクロイックミラー２５ａは、波長λ１の照明光を試料ＳＰに照射して得られる蛍光の、観察の対象となっている波長帯域ＷＢ１（第１波長観察帯域）の光を反射させ、波長帯域ＷＢ１よりも長波長帯域の光を透過させる。ダイクロイックミラー２５ｂは、波長λ２の照明光を試料ＳＰに照射して得られる蛍光の、観察の対象となっている波長帯域ＷＢ２（第２波長観察帯域）の光を反射させ、波長帯域ＷＢ２よりも長波長帯域の光を透過させる。

【0044】

ダイクロイックミラー２５ｃは、波長λ３の照明光を試料ＳＰに照射して得られる蛍光の、観察の対象となっている波長帯域ＷＢ３（第３波長観察帯域）の光を反射させ、波長帯域ＷＢ３よりも長波長帯域の光を透過させる。ダイクロイックミラー２５ｃを透過した光には、波長λ４の照明光を試料ＳＰに照射して得られる蛍光の、観察の対象となっている波長帯域ＷＢ４（第４波長観察帯域）の光が含まれる。

【0045】

図３は、本発明の実施形態において、試料に照射される照明光の波長と、観察の対象となっている波長帯域との関係の一例を示す図である。図３に示す通り、試料ＳＰに波長λ１の照明光が照射された場合にはスペクトルＳＰ１を有する蛍光が得られ、試料ＳＰに波長λ２の照明光が照射された場合にはスペクトルＳＰ２を有する蛍光が得られる。また、試料ＳＰに波長λ３の照明光が照射された場合にはスペクトルＳＰ３を有する蛍光が得られ、試料ＳＰに波長λ４の照明光が照射された場合にはスペクトルＳＰ４を有する蛍光が得られる。

【0046】

試料ＳＰに照射される照明光の波長λ１が４０５［ｎｍ］である場合の波長帯域ＷＢ１は、例えば、４２２．５～４７６．５［ｎｍ］に設定され、試料ＳＰに照射される照明光の波長λ２が４８８［ｎｍ］である場合の波長帯域ＷＢ２は、例えば、５００．５～５５０［ｎｍ］に設定される。また、試料ＳＰに照射される照明光の波長λ３が５６１［ｎｍ］である場合の波長帯域ＷＢ３は、例えば、５８１．５～６１８．５［ｎｍ］であり、試料ＳＰに照射される照明光の波長λ４が６４０［ｎｍ］である場合の波長帯域ＷＢ４は、例えば、６６１．５～６９０．５［ｎｍ］である。尚、上述した波長帯域ＷＢ１～ＷＢ４はあくまでも一例であって、試料ＳＰに照射されるレーザ光の波長に応じて任意の波長帯域を設定することができる。

【0047】

バンドパスフィルタ２７ａ～２７ｄは、ある波長帯域の光を透過させ、他の波長帯域の光を遮断する特性を有するフィルタである。具体的に、バンドパスフィルタ２７ａは、波長帯域ＷＢ１の光を透過させる特性を有し、バンドパスフィルタ２７ｂは、波長帯域ＷＢ２の光を透過させる特性を有し、バンドパスフィルタ２７ｃは、波長帯域ＷＢ３の光を透過させる特性を有し、バンドパスフィルタ２７ｄは、波長帯域ＷＢ４の光を透過させる特性を有する。

【0048】

尚、リレー光学系２６ａ及びバンドパスフィルタ２７ａは、ダイクロイックミラー２５ａで反射される光の光路上に配置され、リレー光学系２６ｂ及びバンドパスフィルタ２７ｂは、ダイクロイックミラー２５ｂで反射される光の光路上に配置され、リレー光学系２６ｃ及びバンドパスフィルタ２７ｃは、ダイクロイックミラー２５ｃで反射される光の光路上に配置されている。リレー光学系２６ｄ及びバンドパスフィルタ２７ｄは、ダイクロイックミラー２５ｃを透過した光の光路上に配置されている。

【0049】

カメラ３０ａ～３０ｄは、試料ＳＰの共焦点像を得るものである。このカメラ３０ａ～３０ｄは、例えばＣＣＤ（Charge Coupled Device：電荷結合素子）やＣＭＯＳ（Complementary Metal Oxide Semiconductor：相補型金属酸化膜半導体）等の固体撮像素子を備えており、二次元の静止画像又は動画を撮影可能なカメラである。カメラ３０ａ～３０ｄは、バンドパスフィルタ２７ａ～２７ｄを介した光が撮像面に入射するよう、共焦点スキャナ２０に対して位置合わせされている。

【0050】

画像処理装置４０は、カメラ３０ａ～３０ｄで撮影された共焦点像の画像データを逐次記憶し、記憶した画像データを読み出して画像処理を行う。この画像処理装置４０としては、例えばデスクトップ型のパーソナルコンピュータ、或いはワークステーションにより実現される。表示装置５０は、例えば液晶表示装置を備えており、画像処理装置４０で画像処理がれた共焦点像を表示する。

【0051】

〈顕微鏡システムの動作〉
顕微鏡システム１の動作が開始されると、光源部１０から波長λ１～λ４のレーザ光を含む光が出力されるとともに、スピニングディスク２１の回転（回転軸３４の周りの回転）が開始される。光源部１０から出力された光は、共焦点スキャナ２０に入力される。共焦点スキャナ２０に入力された光は、スピニングディスク２１のマイクロレンズアレイディスク３１の第１面Ｐ１１に設定された照射領域Ａ１（図２（ｂ）参照）に照射される。

【0052】

マイクロレンズアレイディスク３１に照射された光は、マイクロレンズアレイディスク３１に設けられたマイクロレンズ３１ａで複数の光束に分割される。マイクロレンズ３１ａで分割された複数の光束は、マイクロレンズアレイディスク３１の第２面Ｐ１２に形成されたバンドパスコーティング３３に入射する。そして、各々の光束に含まれる複数の波長成分のうち、図２（ｂ）に示す領域Ｒ１～Ｒ８毎に異なる波長の光のみがバンドパスコーティング３３を通過することとなる。

【0053】

例えば、バンドパスコーティング３３の領域Ｒ１，Ｒ５に入射した光束については、波長λ１の光のみが通過し、バンドパスコーティング３３の領域Ｒ２，Ｒ６に入射した光束については、波長λ２の光のみが通過する。また、バンドパスコーティング３３の領域Ｒ３，Ｒ７に入射した光束については、波長λ３の光のみが通過し、バンドパスコーティング３３の領域Ｒ４，Ｒ８に入射した光束については、波長λ４の光のみが通過する。

【0054】

バンドパスコーティング３３を通過した光は、ダイクロイックミラー２３を透過し、マイクロレンズ３１ａに対応づけてピンホールアレイディスク３２に形成されたピンホール３２ａを介して照明光としてスピニングディスク２１の外部に射出される。このとき、ダイクロイックミラー２３を透過した光は、ピンホール３２ａに集光されてからスピニングディスク２１の外部に射出される。

【0055】

スピニングディスク２１の外部に射出された照明光は、対物光学系２２を介して試料ＳＰに照射される。ここで、試料ＳＰの異なる箇所に異なる波長の光が同時に照射されることはあるものの、試料ＳＰの一箇所には特定の波長の光のみが照射され、複数の波長を含む光が照射されることはない。つまり、試料ＳＰは、局所的に見ると、所謂単色励起される。

【0056】

試料ＳＰからの戻り光（照明光を試料ＳＰに照射して得られた戻り光）は、対物光学系２２を介して、スピニングディスク２１に入射する。そして、スピニングディスク２１のピンホールアレイディスク３２に形成されたピンホール３２ａを介した後に、ダイクロイックミラー２３によってリレー光学系２４に向けて反射される。

【0057】

ダイクロイックミラー２３で反射された戻り光は、リレー光学系２４、ダイクロイックミラー２５ａ～２５ｃ、リレー光学系２６ａ～２６ｄ、及びバンドパスフィルタ２７ａ～２７ｄを順に介してカメラ３０ａ～３０ｄに入射し結像する。

【0058】

具体的に、ダイクロイックミラー２３で反射された戻り光のうち、波長帯域ＷＢ１の光は、リレー光学系２４、ダイクロイックミラー２５ａ、リレー光学系２６ａ、及びバンドパスフィルタ２７ａを順に介してカメラ３０ａに入射し結像する。また、ダイクロイックミラー２３で反射された戻り光のうち、波長帯域ＷＢ２の光は、リレー光学系２４、ダイクロイックミラー２５ａ，２５ｂ、リレー光学系２６ｂ、及びバンドパスフィルタ２７ｂを順に介してカメラ３０ｂに入射し結像する。

【0059】

また、ダイクロイックミラー２３で反射された戻り光のうち、波長帯域ＷＢ３の光は、リレー光学系２４、ダイクロイックミラー２５ａ～２５ｃ、リレー光学系２６ｃ、及びバンドパスフィルタ２７ｃを順に介してカメラ３０ｃに入射し結像する。また、ダイクロイックミラー２３で反射された戻り光のうち、波長帯域ＷＢ４の光は、リレー光学系２４、ダイクロイックミラー２５ａ～２５ｃ、リレー光学系２６ｄ、及びバンドパスフィルタ２７ｄを順に介してカメラ３０ｄに入射し結像する。

【0060】

ここで、スピニングディスク２１は回転軸３４の周りで回転していることから、試料ＳＰに照射される照明光はスピニングディスク２１の回転に応じて走査される。これにより、カメラ３０ａ～３０ｄには、照明光の走査位置に応じた戻り光が順次入力される。このようにして、試料ＳＰの共焦点像がカメラ３０ａ～３０ｄで得られる。

【0061】

尚、バンドパスコーティング３３は、図２（ｂ）に示す通り、回転軸３４に垂直な面内において、螺旋放射状の８つの領域Ｒ１～Ｒ８に均等に分割されている。このため、試料ＳＰは、順次異なる波長の照明光で走査されたり、異なる位置が異なる波長の照明光で同時に走査されたりする。このため、カメラ３０ａ～３０ｄで得られる共焦点像は、試料ＳＰに照明光が照射される領域（観察対象領域）の一部についてのものになることある。

【0062】

カメラ３０ａ～３０ｄで撮影された共焦点像の画像データは、画像処理装置４０に順次出力される。そして、画像処理装置４０では、カメラ３０ａ～３０ｄから順次出力される画像データを逐次記憶し、記憶した画像データを読み出して試料ＳＰの共焦点像を作成するための画像処理が行われる。この画像処理は、例えば、観察対象領域の一部についての共焦点像を合成して、観察対象領域全体の共焦点像を得る処理である。このようにして得られた試料ＳＰの共焦点像は、表示装置５０に表示される。

【0063】

以上の通り、本実施形態では、マイクロレンズアレイディスク３１、ピンホールアレイディスク３２、及びバンドパスコーティング３３を備えるスピニングディスク２１を用い、試料ＳＰの一箇所には特定の波長の照明光のみが照射されるようにしている。これにより、照明光が照射された箇所からは、特定の波長の光が試料に個別に照射されたときの蛍光が得られるため、蛍光クロストークの影響が殆ど無く、解像度及びコントラストが優れた共焦点像を得ることができる。

【0064】

また、本実施形態では、試料ＳＰの観察対象領域の一箇所に複数の波長を含む照明光が照射されることはないが、試料ＳＰの観察対象領域は、異なる波長λ１～λ４の光で走査されることになる。このため、観察対象領域について、異なる波長λ１～λ４の各々についての共焦点像を得ることができ、前述した特許文献２のように、同時に得ることができる同一箇所における共焦点像の波長帯域が制限されることはない。

【0065】

また、本実施形態では、試料ＳＰからの戻り光（照明光を試料ＳＰに照射して得られた戻り光）は、ダイクロイックミラー２３によってリレー光学系２４に向けて反射され、マイクロレンズアレイディスク３１に形成されたバンドパスコーティング３３を透過することはない。このため、使用する蛍光色素の種類の自由度を高めることができる。

【0066】

〈変形例〉
図４は、本発明の実施形態によるスピニングディスクの変形例を示す側面図である。尚、図４においては、図２（ａ）に示す構成と同じ構成については同一の符号を付してある。図４（ａ）に示すスピニングディスク２１は、図２に示すスピニングディスク２１のマイクロレンズアレイディスク３１に形成されていたバンドパスコーティング３３を省略し、補助ディスク３５（第３ディスク）を追加した構成である。

【0067】

補助ディスク３５は、少なくとも光源部１０から出力される光に対して透明な円板状のディスクである。例えば、補助ディスク３５は、透明なガラスで形成された円板状のディスクである。補助ディスク３５は、マイクロレンズアレイディスク３１及びピンホールアレイディスク３２とともに（一体的に）、回転軸３４の周りで回転可能に構成されている。この補助ディスク３５の第１面Ｐ３１には、バンドパスコーティング３３が形成されている。補助ディスク３５は、図４（ａ）に示す通り、第２面Ｐ３２をマイクロレンズアレイディスク３１の第１面Ｐ１１側に向けた状態で、マイクロレンズアレイディスク３１に近接配置されている。

【0068】

尚、補助ディスク３５は、バンドパスコーティング３３が形成された第１面Ｐ３１をマイクロレンズアレイディスク３１の第１面Ｐ１１側に向けた状態で、マイクロレンズアレイディスク３１に近接配置されていても良い。また、補助ディスク３５は、マイクロレンズアレイディスク３１とピンホールアレイディスク３２との間において、マイクロレンズアレイディスク３１に近接配置されていても良い。

【0069】

このように、図４（ａ）に示すスピニングディスク２１は、マイクロレンズアレイディスク３１とは別に、バンドパスコーティング３３が形成されている補助ディスク３５を設けたものである。図４（ａ）に示すスピニングディスク２１では、マイクロレンズアレイディスク３１にバンドパスコーティング３３を形成する必要はないため、スピニングディスク２１を容易に作成することができる。

【0070】

図４（ｂ）に示すスピニングディスク２１は、図２に示すスピニングディスク２１のマイクロレンズアレイディスク３１に形成されていたバンドパスコーティング３３を省略し、ピンホールアレイディスク３２にバンドパスコーティング３３を形成した構成である。バンドパスコーティング３３は、図４（ｂ）に示す通り、ピンホールアレイディスク３２の第１面Ｐ２１に形成されている。尚、ピンホールアレイディスク３２は、ピンホールアレイディスク３２の第２面Ｐ２２に形成されていても良い。

【0071】

図４（ｃ）に示すスピニングディスク２１は、図４（ａ）に示すスピニングディスク２１と同様に、図２に示すスピニングディスク２１のマイクロレンズアレイディスク３１に形成されていたバンドパスコーティング３３を省略し、補助ディスク３５（第３ディスク）を追加した構成である。但し、図４（ｃ）に示すスピニングディスク２１において、補助ディスク３５は、ピンホールアレイディスク３２に近接配置されている。

【0072】

具体的に、補助ディスク３５は、バンドパスコーティング３３が形成された第１面Ｐ３１をピンホールアレイディスク３２の第２面Ｐ２２側に向けた状態で、ピンホールアレイディスク３２に近接配置されている。尚、補助ディスク３５は、第２面Ｐ３２をピンホールアレイディスク３２の第２面Ｐ２２側に向けた状態でピンホールアレイディスク３２に近接配置されていても良い。また、補助ディスク３５は、マイクロレンズアレイディスク３１とピンホールアレイディスク３２との間において、ピンホールアレイディスク３２に近接配置されていても良い。

【0073】

このように、図４（ｃ）に示すスピニングディスク２１は、図４（ａ）に示すスピニングディスク２１と同様に、マイクロレンズアレイディスク３１とは別に、バンドパスコーティング３３が形成されている補助ディスク３５を設けたものである。このため、図４（ｃ）に示すスピニングディスク２１では、ピンホールアレイディスク３２にバンドパスコーティング３３を形成する必要はないため、スピニングディスク２１を容易に作成することができる。

【0074】

図４（ｄ）に示すスピニングディスク２１は、図２に示すスピニングディスク２１のマイクロレンズアレイディスク３１に代えて、補助ディスク３５を設けた構成である。補助ディスク３５は、第２面Ｐ３２をピンホールアレイディスク３２の第１面Ｐ２１側に向けた状態で回転軸３４に取り付けられている。尚、補助ディスク３５は、バンドパスコーティング３３が形成された第１面Ｐ３１をピンホールアレイディスク３２の第１面Ｐ２１側に向けた状態で回転軸３４に取り付けられていても良い。

【0075】

図５は、本発明の実施形態によるスピニングディスクの他の変形例を示す平面透視図である。尚、図５においては、図２（ｂ）示す構成と同じ構成については同一の符号を付してある。図５（ａ），（ｂ）に示すスピニングディスク２１は、図２に示すスピニングディスク２１のマイクロレンズアレイディスク３１に形成されていたバンドパスコーティング３３の分割方法を変えたものである。

【0076】

図５（ａ）に示すスピニングディスク２１において、バンドパスコーティング３３は、回転軸３４に垂直な面内において、中心から径方向に伸びる直線で４つの領域Ｒ１１～Ｒ１４に均等に分割されている。例えば、領域Ｒ１１は波長λ１の光を透過させる領域であり、領域Ｒ１２は波長λ２の光を透過させる領域であり、領域Ｒ１３は波長λ３の光を透過させる領域であり、領域Ｒ１４は、波長λ４の光を透過させる領域である。尚、領域Ｒ１１～Ｒ１４は、回転軸３４の周りにおいて、透過させる波長の長さの順に配列されている必要は必ずしもない。

【0077】

図５（ｂ）に示すスピニングディスク２１において、バンドパスコーティング３３は、回転軸３４に垂直な面内において、中心から径方向に伸びる直線で２つの領域Ｒ２１（第１領域）と領域Ｒ２２（第２領域）とに均等に分割されている。例えば、領域Ｒ２１は波長λ１の光と波長λ３の光とを透過させる領域であり、領域Ｒ２２は波長λ２の光と波長λ４の光とを透過させる領域である。

【0078】

図５（ｂ）に示すスピニングディスク２１では、複数の波長の含む照明光が試料ＳＰに照射される。具体的には、波長λ１の光と波長λ３の光とを含む照明光、又は、波長λ２の光と波長λ４の光とを含む照明光が、試料ＳＰの一箇所に照射される。但し、試料ＳＰに照射される照明光に含まれる波長λ１，λ３の光はある程度波長が離れている。また、試料ＳＰに照射される照明光に含まれる波長λ２，λ４の光も、ある程度波長が離れている。このため、多少の蛍光クロストークは生じ得るものの、解像度及びコントラストが優れた共焦点像を得ることができる。

【0079】

以上、本発明の実施形態によるスピニングディスク、共焦点スキャナ、及び顕微鏡システムについて説明したが、本発明は上記実施形態に制限されることなく本発明の範囲内で自由に変更が可能である。例えば、上述した実施形態では、光源部１０から４つの波長λ１～λ４を含む光が出力され、試料ＳＰから得られる戻り光を共焦点スキャナ２０で４つの波長帯域ＷＢ１～ＷＢ４に弁別する例について説明した。しかしながら、光源部１０から出力される光に含まれる波長は４つ以外（例えば、２つ、３つ、又は５つ以上）であっても良く、共焦点スキャナ２０で弁別される波長帯域は４つ以外（例えば、２つ、３つ、又は５つ以上）であっても良い。

【符号の説明】

【0080】

１ 顕微鏡システム
１０ 光源部
２０ 共焦点スキャナ
２１ スピニングディスク
２４ リレー光学系
２５ａ～２５ｃ ダイクロイックミラー
２６ａ～２６ｄ リレー光学系
２７ａ～２７ｄ バンドパスフィルタ
３０ａ～３０ｄ カメラ
３１ マイクロレンズアレイディスク
３１ａ マイクロレンズ
３２ ピンホールアレイディスク
３２ａ ピンホール
３３ バンドパスコーティング
３４ 回転軸
３５ 補助ディスク
４０ 画像処理装置
Ｒ１～Ｒ８ 領域
Ｒ１１～Ｒ１４ 領域
Ｒ２１，Ｒ２２ 領域
ＳＰ 試料
ＷＢ１～ＷＢ４ 波長帯域
λ１～λ４ 波長

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】