特許 7416134 検出装置

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B1)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-01-09

(45)【発行日】2024-01-17

(54)【発明の名称】検出装置

(51)【国際特許分類】

   G01N 35/00 20060101AFI20240110BHJP

   G01N 21/03 20060101ALI20240110BHJP

   G01N 21/64 20060101ALI20240110BHJP

   G01N 37/00 20060101ALI20240110BHJP

   G01N 35/04 20060101ALI20240110BHJP

   C12M 1/00 20060101ALI20240110BHJP

   C12Q 1/68 20180101ALN20240110BHJP

【ＦＩ】

G01N35/00 B

G01N21/03 Z

G01N21/64 F

G01N37/00 101

G01N37/00 103

G01N35/04 G

C12M1/00 A

C12Q1/68

【請求項の数】 13

(21)【出願番号】P 2022106963

(22)【出願日】2022-07-01

【審査請求日】2023-05-29

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】000003193

【氏名又は名称】ＴＯＰＰＡＮホールディングス株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100149548

【弁理士】

【氏名又は名称】松沼 泰史

(74)【代理人】

【識別番号】100139686

【弁理士】

【氏名又は名称】鈴木 史朗

(74)【代理人】

【識別番号】100169764

【弁理士】

【氏名又は名称】清水 雄一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100147267

【弁理士】

【氏名又は名称】大槻 真紀子

(72)【発明者】

【氏名】鈴木 雄太

(72)【発明者】

【氏名】牧野 洋一

【審査官】岩永 寛道

(56)【参考文献】

【文献】特表２０２０－５２１９６０（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２００７／０７４９２９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特開２００２－１４８２６５（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１３－１２２３９５（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０２１－０８１３５９（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１７－０７０３０８（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｇ０１Ｎ ３５／００－ ３７／００

Ｇ０１Ｎ ２１／０３

Ｇ０１Ｎ ２１／６４

Ｃ１２Ｍ １／００

Ｃ１２Ｑ １／６８

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

流体デバイスの温度を調整する温度調整部と、
前記流体デバイスに励起光を照射するとともに、前記流体デバイスから発せられる蛍光の像を撮像する撮像部と、
前記流体デバイスを前記温度調整部及び前記撮像部に搬送する搬送部と、を有し、
前記流体デバイスは、標的物質を含む液状試料と、前記標的物質と反応して前記蛍光を発する生成物を生じる検出試薬と、の混合水溶液を収容し、
前記温度調整部は、前記流体デバイスを加熱する加熱部と、
加熱された前記流体デバイスを冷却する冷却部と、を有し、
前記流体デバイスは、前記加熱部、前記冷却部、前記撮像部の順に搬送される検出装置。

【請求項2】

前記温度調整部の動作を制御する制御部を有し、
前記制御部は、前記加熱部を５０℃以上９９℃以下に制御する請求項１に記載の検出装置。

【請求項3】

前記制御部は、前記流体デバイスの加熱に先立って、前記加熱部を、室温より高く且つ予め設定された反応温度以下に加熱する予備加熱を行う請求項２に記載の検出装置。

【請求項4】

前記温度調整部の動作を制御する制御部を有し、
前記制御部は、前記冷却部を０．１℃以上３０℃未満に制御する請求項１から３のいずれか１項に記載の検出装置。

【請求項5】

前記制御部は、前記流体デバイスの冷却に先立って、前記冷却部を、予め設定された冷却温度以上室温未満に冷却する予備冷却を行う請求項４に記載の検出装置。

【請求項6】

前記撮像部は、前記励起光を射出する光源部と、
前記励起光を反射するとともに前記蛍光を透過させるダイクロイックミラーと、
前記ダイクロイックミラーに反射された前記励起光を前記流体デバイスに投射する投射レンズと、
前記ダイクロイックミラーを透過した前記蛍光を結像させる結像レンズと、
前記結像レンズにより結像された像を撮像する撮像手段と、を有し、
前記投射レンズは、前記流体デバイスから生じる前記蛍光を集光し前記結像レンズに導光する対物レンズを兼ねる請求項１に記載の検出装置。

【請求項7】

前記光源部は、前記励起光を含む光を射出する光源と、
前記光のうち前記励起光として用いる波長の光を透過する光学フィルタと、を有する請求項６に記載の検出装置。

【請求項8】

前記光源部は、前記光のうち前記励起光として用いる第１波長の光を透過させる第１光学フィルタと、
前記励起光として用いる第２波長の光を透過させる第２光学フィルタと、
前記第１光学フィルタと前記第２光学フィルタとを切り替える切替部と、を有する請求項７に記載の検出装置。

【請求項9】

前記光源部は、外光を導入し前記流体デバイスに導光する外光導入部を有する請求項６に記載の検出装置。

【請求項10】

前記投射レンズと前記結像レンズとが共焦点光学系を形成する請求項６に記載の検出装置。

【請求項11】

前記撮像部は、前記結像レンズと前記撮像手段との間に、ピンホールを有する空間フィルタを備え、
前記共焦点光学系の共焦点位置は、前記結像レンズと前記撮像手段との間の位置し、
前記ピンホールは、前記共焦点位置と空間的に重なる請求項１０に記載の検出装置。

【請求項12】

前記流体デバイスは、前記標的物質と前記検出試薬とを収容し、前記生成物を生じる反応場として用いられるマイクロウェルを有し、
前記対物レンズは、オートフォーカス機構を有し、
前記撮像手段による撮像に先だって、前記オートフォーカス機構を制御し、前記対物レンズの焦点位置を前記マイクロウェルに合わせる制御部を有する請求項６に記載の検出装置。

【請求項13】

前記加熱部は、複数の前記流体デバイスを収容する温調ホルダを有し、
前記搬送部は、複数の前記流体デバイスを収容する測定ホルダを有し、
前記温調ホルダは、前記搬送部の搬送方向に向かって延びて設けられ前記流体デバイスを収容する第１収容部を有し、
前記測定ホルダは、前記搬送部の搬送方向に向かって延びて設けられ前記流体デバイスを収容する第２収容部を有し、
前記温調ホルダと前記測定ホルダとを近接させた状態で、前記第１収容部に収容された前記流体デバイスを、前記第２収容部に向けて押し出して移動させる移動手段をさらに有する請求項１に記載の検出装置。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、検出装置に関する。

【背景技術】

【0002】

生体分子を流体デバイス内で検出する技術が知られている。例えば、ＤＮＡマイクロアレイ技術では、微小孔に生体分子を導入し、加熱を伴う反応を行うことにより、生体分子を検出する場合がある。その際、生体分子を単分子検出できる技術として、デジタルInvasive Cleavaged Assay（ＩＣＡ）のようなデジタル計測技術が知られている。

【0003】

発明者らは、以前に、複数のウェルを有する反応容器（流体デバイス）を用いたデジタル計測技術を開発している（特許文献１参照）。特許文献１に記載の方法では、流体デバイスの流路に標的物質を含む水性媒体を送液し、流路壁面に設けられた複数のウェルに封じ込める。さらに、流体デバイスを加熱することで反応溶液を加熱し検出反応させることにより、特定の蛍光発光を生じさせ、標的物質の検出を行う。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【文献】国際公開第２０１５／１１５６３５号

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

本技術分野においては、短時間で多くの検出を可能とする検出装置が求められている。一方、デジタルＩＣＡでは、検出反応において加熱を必要とするが、過加熱による副反応を抑制し、検出精度を向上させることも同時に求められている。

【0006】

本発明はこのような事情に鑑みてなされたものであって、デジタルＩＣＡを原理とした検出において、高い検出精度を担保しながら、短時間で多くの検出を可能とする検出装置を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0007】

上記の課題を解決するため、本発明の一態様は、以下の態様を包含する。

【0008】

［１］流体デバイスの温度を調整する温度調整部と、前記流体デバイスに励起光を照射するとともに、前記流体デバイスから発せられる蛍光の像を撮像する撮像部と、前記流体デバイスを前記温度調整部及び前記撮像部に搬送する搬送部と、を有し、前記流体デバイスは、標的物質を含む液状試料と、前記標的物質と反応して前記蛍光を発する生成物を生じる検出試薬と、の混合水溶液を収容し、前記温度調整部は、前記流体デバイスを加熱する加熱部と、加熱された前記流体デバイスを冷却する冷却部と、を有する検出装置。

【0009】

［２］前記温度調整部の動作を制御する制御部を有し、前記制御部は、前記加熱部を５０℃以上９９℃以下に制御する［１］に記載の検出装置。

【0010】

［３］前記制御部は、前記流体デバイスの加熱に先立って、前記加熱部を、室温より高く且つ予め設定された反応温度以下に加熱する予備加熱を行う［２］に記載の検出装置。

【0011】

［４］前記温度調整部の動作を制御する制御部を有し、前記制御部は、前記冷却部を０．１℃以上３０℃未満に制御する［１］から［３］のいずれか１項に記載の検出装置。

【0012】

［５］前記制御部は、前記流体デバイスの冷却に先立って、前記冷却部を、予め設定された冷却温度以上室温未満に冷却する予備冷却を行う［４］に記載の検出装置。

【0013】

［６］前記撮像部は、前記励起光を射出する光源部と、前記励起光を反射するとともに前記蛍光を透過させるダイクロイックミラーと、前記ダイクロイックミラーに反射された前記励起光を前記流体デバイスに投射する投射レンズと、前記ダイクロイックミラーを透過した前記蛍光を結像させる結像レンズと、前記結像レンズにより結像された像を撮像する撮像手段と、を有し、前記投射レンズは、前記流体デバイスから生じる前記蛍光を集光し前記結像レンズに導光する対物レンズを兼ねる［１］から［５］のいずれか１項に記載の検出装置。

【0014】

［７］前記光源部は、前記励起光を含む光を射出する光源と、前記光のうち前記励起光として用いる波長の光を透過する光学フィルタと、を有する［６］に記載の検出装置。

【0015】

［８］前記光源部は、前記光のうち前記励起光として用いる第１波長の光を透過させる第１光学フィルタと、前記励起光として用いる第２波長の光を透過させる第２光学フィルタと、前記第１光学フィルタと前記第２光学フィルタとを切り替える切替部と、を有する［７］に記載の検出装置。

【0016】

［９］前記光源部は、外光を導入し前記流体デバイスに導光する外光導入部を有する［６］に記載の検出装置。

【0017】

［１０］前記投射レンズと前記対物レンズとが共焦点光学系を形成する［６］から［９］のいずれか１項に記載の検出装置。

【0018】

［１１］前記撮像部は、前記結像レンズと前記撮像手段との間に、ピンホールを有する空間フィルタを備え、前記共焦点光学系の共焦点位置は、前記結像レンズと前記撮像手段との間の位置し、前記ピンホールは、前記共焦点位置と空間的に重なる［１０］に記載の検出装置。

【0019】

［１２］前記流体デバイスは、前記標的物質と前記検出試薬とを収容し、前記生成物を生じる反応場として用いられるマイクロウェルを有し、前記対物レンズは、オートフォーカス機構を有し、前記撮像手段による撮像に先だって、前記オートフォーカス機構を制御し、前記対物レンズの焦点位置を前記マイクロウェルに合わせる制御部を有する［６］から［１１］のいずれか１項に記載の検出装置。

【0020】

［１３］前記加熱部は、複数の前記流体デバイスを収容する温調ホルダを有し、前記搬送部は、複数の前記流体デバイスを収容する搬送ホルダを有し、前記温調ホルダは、前記搬送部の搬送方向に向かって延びても受けられ前記流体デバイスを収容する第１収容部を有し、前記温調ホルダは、前記搬送部の搬送方向に向かって延びても受けられ前記流体デバイスを収容する第２収容部を有し、前記温調ホルダと前記搬送ホルダとを近接させた状態で、前記第１収容部に収容された前記流体デバイスを、前記第２収容部に向けて押し出して移動させる移動手段をさらに有する［１］から［１２］のいずれか１項に記載の検出装置。

【発明の効果】

【0021】

本発明によれば、デジタルＩＣＡを原理とした検出において、高い検出精度を担保しながら、短時間で多くの検出を可能とする検出装置を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0022】

【図1】図１は、検出装置１を示す概略斜視図である。

【図2】図２は、撮像部２０の構成を示す概略図である。

【図3】図３は、検出装置１が有する搬送部３０の模式図である。

【図4】図４は、流体デバイス１００を示す概略斜視図である。

【図5】図５は、流体デバイス１００の断面図である。

【図6】図６は、複数のマイクロウェル１１０の一部を示す平面図である。

【図7】図７は、上述の流体デバイス１００を用いて試料を検出する方法の説明図である。

【図8】図８は、上述の流体デバイス１００を用いて試料を検出する方法の説明図である。

【図9】図９は、上述の流体デバイス１００を用いて試料を検出する方法の説明図である。

【図10】図１０は、ＩＣＡ法の一例を説明する模式図である。

【図11】図１１は、検出装置１の動作を説明する説明図である。

【図12】図１２は、検出装置１の動作を説明する説明図である。

【図13】図１３は、検出装置１の動作を説明する説明図である。

【図14】図１４は、検出装置１の動作を説明する説明図である。

【図15】図１５は、検出装置２を示す概略斜視図であり。

【図16】図１６は、移動手段７０の概略斜視図である。

【図17】図１７は、加熱部１１及び搬送部３５を示す概略斜視図である。

【図18】図１８は、検出装置２の動作を説明する説明図である。

【図19】図１９は、検出装置２の動作を説明する説明図である。

【発明を実施するための形態】

【0023】

［第１実施形態］
以下、図１～図１４を参照しながら、本発明の第１実施形態に係る検出装置及び流体デバイスについて説明する。なお、以下の全ての図面においては、図面を見やすくするため、各構成要素の寸法や比率などは適宜異ならせてある。

【0024】

以下の説明においては、ｘｙｚ直交座標系を設定し、このｘｙｚ直交座標系を参照しつつ各部材の位置関係について説明する。ここでは、水平面内の所定方向をｘ軸方向、水平面内においてｘ軸方向と直交する方向をｙ軸方向、ｘ軸方向及びｙ軸方向のそれぞれと直交する方向（すなわち鉛直方向）をｚ軸方向とする。

【0025】

《検出装置》
図１は、本実施形態の検出装置１を示す概略斜視図である。検出装置１は、温度調整部１０と、撮像部２０と、搬送部３０とを有する。さらに、検出装置１は、検出装置１の動作を制御する制御部４０を有する。

【0026】

温度調整部１０、撮像部２０、搬送部３０及び制御部４０は、基台９０の上に設けられている。

【0027】

検出装置１は、液状の試料に含まれる標的物質の検出に用いられる。詳しくは、検出装置１は、流体デバイス１００を用い、デジタルＩＣＡ（以下、ｄＩＣＡ）を原理として標的物質を検出する際に用いられる。検出装置１では、流体デバイス１００の内部で生成する生成物を光で励起させ、生じる蛍光を撮像して解析することで標的物質を検出する。
以下、順に説明する。

【0028】

［温度調整部］
温度調整部１０は、流体デバイス１００の加熱を行う加熱部１１と、加熱された流体デバイス１００を冷却する冷却部１２と、を有する。

【0029】

図１の加熱部１１は、上面（＋ｚ側の面）が発熱し、上面に接する対象物を直接加熱する。加熱部１１は、公知の加熱方式によるヒータを採用することができ、抵抗加熱や誘導加熱等の方式を例示することができる。図１では、加熱部１１は、平面視矩形の部材として示している。加熱部１１は、熱電対等の公知の温度センサが併設され、温度を測定しながら温度制御を可能とする構成が好ましい。「平面視」とは、＋ｚ側からｚ軸に沿って－ｚ側を見た視野を指す。

【0030】

なお、加熱部１１は、上記のような構成の他、例えば、対象物（流体デバイス１００）を収容する内部空間を有する蓋を有し、当該内部空間を加熱することで対象物を間接的に加熱する構成も採用することができる。

【0031】

加熱部１１は、制御部４０により３０℃以上９９℃以下に制御される。

【0032】

図１の冷却部１２は、上面に接する対象物を冷却する。冷却部１２は、公知の冷却方式による手段を採用することができる。例えば、冷却部１２は、公知のペルチェ素子を採用し、通電により上面が冷却される構成であってもよい。図１では、冷却部１２は、平面視矩形の部材として示している。冷却部１２は、熱電対等の公知の温度センサが併設され、温度を測定しながら温度制御を可能とする構成が好ましい。

【0033】

冷却部１２は、制御部４０により０．１℃以上３０℃未満に制御される。

【0034】

その他、冷却部１２は、上面が伝熱特性のよい金属を採用した伝熱板であり、下面に公知の水冷式や空冷式の放熱部を有する構成であってもよい。さらに、冷却部１２は、伝熱特性のよい金属板が設けられているだけでもよい。

【0035】

温度調整部１０は、基台９０の上方（＋ｚ方向）に架け渡された載置部５０に設けられている。載置部５０は、ｘ方向に延びる平面視矩形のステージ５１と、ステージ５１の長手方向の両端に設けられた一対の橋脚５２とを有する。温度調整部１０はステージ５１の一端５１ａから＋ｘ方向に順に、加熱部１１、冷却部１２の順に配置されている。

【0036】

ステージ５１において、加熱部１１よりも－ｘ側には、搬送部３０が有する搬送ステージ（後述）が待機する待機部５５を設けてもよい。

【0037】

［撮像部］
撮像部２０は、ステージ５１において冷却部１２よりも＋ｘ側に設けられている。撮像部２０は、流体デバイス１００に励起光を照射するとともに、流体デバイス１００から発せられる蛍光の像を撮像する。

【0038】

図２は、撮像部２０の構成を示す概略図である。撮像部２０は、光源部２１と、ダイクロイックミラー２２と、投射レンズ２３と、結像レンズ２４と、撮像手段２５と、吸収フィルタ２６と、空間フィルタ２７、反射ミラー２８を有する。

【0039】

光源部２１は、励起光ＥＬを射出する。光源部２１は、励起光ＥＬを含む光Ｌ１を射出する光源２１１と、光Ｌ１のうち励起光ＥＬとして用いる波長の光と透過させる光学フィルタ２１２と、を有する。

【0040】

光源２１１は、例えば公知の水銀ランプを採用することができる。また、光源２１１は、公知のＬＥＤ光源やＬＤ光源であってもよい。以下の説明では、光源２１１が白色光源である水銀ランプであり、光Ｌ１が白色光であることとする。

【0041】

光学フィルタ２１２は、白色光である光Ｌ１のうち、流体デバイス１００の内部で生成する生成物（蛍光物質）の励起に必要な波長の光（励起光ＥＬ）を透過させ、励起光ＥＬを抽出する。光学フィルタ２１２は、励起光ＥＬを透過させ、その他の光を遮蔽する性質を有するバンドパスフィルタである。

【0042】

このような光源部２１では、光源２１１から射出された光Ｌ１から励起光ＥＬを抽出し、励起光ＥＬを射出することができる。

【0043】

なお、光源部２１は、光路上の光源２１１と光学フィルタ２１２との間の位置に、光源２１１から射出される光Ｌ１とは異なる外光Ｌ２を導入し、流体デバイス１００に導光する外光導入部２１５を有してもよい。外光導入部２１５は、光路内に出し入れ自在に設けられた反射ミラー２１５ａと、外光Ｌ２を導入する導入口２１５ｂとを有する。

【0044】

光源部２１において、光源２１１から射出される光Ｌ１を用いる際には、外光導入部２１５の反射ミラー２１５ａが光路上から退避し光Ｌ１を通過させる。また、外光Ｌ２を用いる際には、外光導入部２１５の反射ミラー２１５ａが光路上に配置され、光Ｌ１を遮蔽するとともに、導入口２１５ｂから導入される外光Ｌ２を光学フィルタ２１２の方に導く。

【0045】

光源部２１から射出される励起光ＥＬは、ダイクロイックミラー２２に入射する。

【0046】

ダイクロイックミラー２２は、励起光ＥＬを反射するとともに、蛍光ＦＬを透過させる性質を有する。ダイクロイックミラー２２は、励起光ＥＬの入射方向に対して４５°の角度（入射角４５°）で配置されており、励起光ＥＬを励起光ＥＬの入射方向に対して９０°の方向に反射する。

【0047】

ダイクロイックミラー２２で反射された励起光ＥＬは、投射レンズ２３に入射し、流体デバイス１００に投射される。流体デバイス１００においては、励起光ＥＬにより励起された蛍光物質から蛍光ＦＬが発せられる。

【0048】

蛍光ＦＬは、投射レンズ２３を介してダイクロイックミラー２２に入射する。ダイクロイックミラー２２は、蛍光ＦＬを透過させる。一方、励起光ＥＬの一部が流体デバイス１００において反射し、ダイクロイックミラー２２に戻ってきたとしても、ダイクロイックミラー２２は励起光ＥＬを反射する。これにより、励起光ＥＬと蛍光ＦＬとが分離される。

【0049】

ダイクロイックミラー２２を透過した蛍光ＦＬは、吸収フィルタ２６に入射する。吸収フィルタ２６は、蛍光ＦＬを透過し、他の波長の光を透過しないダイクロイックミラーを採用することができる。例えば、吸収フィルタ２６として、ダイクロイックミラー２２よりも波長分離能が優れ、蛍光ＦＬを含む長波長の光は透過させ、励起光ＥＬを含む短波長の光は遮蔽（反射）するダイクロイックミラーを用いることで、迷光を除去し、高精度の検出が可能となる。

【0050】

吸収フィルタ２６を透過した蛍光ＦＬは、反射ミラー２８を介して結像レンズ２４に入射して結像される。

【0051】

撮像手段２５は、結像レンズ２４により結像された像を撮像する。撮像手段２５としては、公知の撮像素子を有するデジタルカメラを採用することができる。

【0052】

上述の撮像部２０においては、光源部２１から射出される励起光ＥＬを流体デバイス１００に投射する投射レンズ２３は、流体デバイス１００から生じる蛍光ＦＬを集光し、結像レンズ２４に導光する対物レンズを兼ねている。投射レンズ２３（対物レンズ）は、オートフォーカス機構を有していてもよい。

【0053】

さらに、撮像部２０において投射レンズ２３と結像レンズ２４とが共焦点光学系を形成しているとよい。撮像部２０は、結像レンズ２４と撮像手段２５との間に、ピンホールＰを有する空間フィルタ２７を備え、共焦点光学系の共焦点ＦＰが、結像レンズ２４と撮像手段２５との間の位置している。共焦点光学系のもう一方の共焦点は、流体デバイス１００に重なる位置に位置している。空間フィルタ２７は、ピンホールＰが共焦点ＦＰと空間的に重なる位置に配置されている。これにより、撮像部２０では、迷光を除去し、高精度の検出が可能となる。なお、共焦点光学系を機能させるため、共焦点光学系を構成する公知の部材については、適宜採用することができる。

【0054】

なお、図１，２に示すように、撮像部２０は、光学フィルタ２１２と、ダイクロイックミラー２２と、吸収フィルタ２６とが一体となったフィルタブロック２９を有していてもよい。

【0055】

また、光源部２１は、光Ｌ１のうち励起光ＥＬとして用いる第１波長の光を透過させる第１光学フィルタ２１２ａと、励起光ＥＬとして用いる第２波長の光を透過させる第２光学フィルタ２１２ｂと、第１光学フィルタ２１２ａと第２光学フィルタ２１２ｂとを切り替え可能に構成されていてもよい。

【0056】

具体的には、光源部２１は、第１光学フィルタ２１２ａを有するフィルタブロック２９１と、第２光学フィルタ２１２ｂを有するフィルタブロック２９２と、フィルタブロック２９１とフィルタブロック２９２とを切り替える切替部２９５と、を有する。切替部２９５は、フィルタブロックが設けられたターンテーブル２９６と、ターンテーブル２９６を周方向に駆動させる駆動部２９７とを有する。フィルタブロック２９、切替部２９５は、基台９０上に設けられた支持台２９９に支持されている。

【0057】

切替部２９５は、駆動部２９７によりターンテーブル２９６を周方向に動かすことにより、ターンテーブル２９６に設けられたフィルタブロック２９２を切り替えることができる。

【0058】

［搬送部］
図１に示すように、搬送部３０は、ｘ軸方向に延びるレール３１と、レール３１に沿って±ｘ軸方向に移動する搬送本体３２と、搬送本体３２を駆動する駆動部３３と、を有する。

【0059】

図３は、検出装置１が有する搬送部３０の模式図である。搬送本体３２は、レール３１と接続し±ｘ軸方向に移動する第１部材３２１と、第１部材３２１に接続し±ｚ軸方向に移動する第２部材３２２と、第２部材３２２に接続するステージ３２３と、ステージ３２３を照明する照明部３２５と、を有する。

【0060】

ステージ３２３は、上面がｘｙ平面と並行な面であり、観察対象である流体デバイス１００が載置される。ステージ３２３は、流体デバイス１００を載置すると共に、下方（－ｚ方向）から流体デバイス１００を観察可能であれば種々の構成を採用することができる。例えば、ステージ３２３は、光透過性を有する板状部材であってもよく、流体デバイス１００の観察部分が空隙である枠体であってもよい。また、ステージ３２３は、流体デバイス１００を側方から把持する把持部材であっても構わない。図３では、流体デバイス１００が３つ載置されているが、ステージ３２３に載置される流体デバイス１００の数は、ステージ３２３の大きさに応じて設定することができる。

【0061】

照明部３２５は、ステージ３２３に載置された流体デバイス１００に白色光を照射して照明し、明視野での撮像を可能とする。

【0062】

このような搬送部３０は、ステージ３２３に載置された流体デバイス１００をｘ軸方向及びｚ軸方向に移動させることができる。

【0063】

［制御部］
図１に示す制御部４０は、温度調整部１０、撮像部２０及び搬送部３０の動作を制御する。制御部４０は、検出装置１に設けられた専用の装置であってもよく、制御用のソフトウエアをインストールした汎用のコンピュータを用いてもよい。

【0064】

［流体デバイス］

【0065】

図４は、流体デバイス１００を示す概略斜視図である。図５は、流体デバイス１００の断面図であり、図４の線分Ｖ－Ｖにおける矢視断面図である。流体デバイス１００は、液状の試料（液状試料）に含まれる標的物質の検出に用いられる。

【0066】

液状試料は、標的物質を含む水溶液であり、例えば、生体試料、環境試料を含む。生体試料としては、特に制限されず、血清、血漿、尿、細胞培養液等が挙げられる。また、生体試料を鋳型とし、検出試薬として染色用試薬を含むＰＣＲ反応溶液等であってもよい。さらに、環境試料としては、例えば、河川の水、工場排水等が挙げられる。

【0067】

標的物質としては、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、ウイルス、細胞、エキソソーム等が挙げられる。ここで、ＲＮＡとしては、ｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ等が挙げられる。また、細胞としては、細菌、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞等が挙げられる。

【0068】

流体デバイス１００において、上述のような試料に含まれる標的物質と、検出試薬とを反応させ、標的物質を検出する。

【0069】

［流体デバイス］
図４，５に示すように、流体デバイス１００は、ウェルプレート１０１、蓋部材１０２、壁部材１０３を有する。流体デバイス１００は、内部空間Ｓに試料を収容し、試料に含まれる標的物質の検出反応を行う反応容器として用いられる。

【0070】

（ウェルプレート）
ウェルプレート１０１は、平面視矩形又は短冊状を呈する板状部材である。ウェルプレート１０１の上面１０１ａには、ウェルプレート１０１の長手方向の中央に、複数のウェル（マイクロウェル）１１０が設けられている。

【0071】

マイクロウェル１１０は、ウェルプレート１０１の上面１０１ａに設けられた凹部であり、上面１０１ａに開口している。マイクロウェル１１０とは、上記凹部と、上面１０１ａと平行であって上面１０１ａに接する仮想平面とに囲まれた空間を指す。

【0072】

マイクロウェル１１０は、内部空間Ｓに収容した試料を内部に収容し、試料に含まれる標的物質と、検出試薬との反応場として機能する。

【0073】

ウェルプレート１０１の材料は、電磁波透過性を有する。ここで、透過性判断の対象である電磁波としては、Ｘ線、紫外線、可視光線、赤外線等が挙げられる。ウェルプレート１０１が電磁波透過性を有する場合、ウェルプレート１０１を有する流体デバイス１００で行った実験結果を解析するために、電磁波を利用することが可能になる。例えば、電磁波を照射した結果生じる蛍光、燐光等をウェルプレート１０１側から計測することができる。

【0074】

詳しくは後述するが、例えば、マイクロウェル１１０において、可視光領域である４００～７００ｎｍの波長範囲にピークを有する蛍光を生じさせ試料検出を行う場合には、少なくとも可視光領域の光に対して良好な透過性を有する材料を用いればよい。

【0075】

電磁波透過性を有する材料としては、例えば、ガラス、樹脂等が挙げられる。樹脂としては、例えば、ＡＢＳ樹脂、ポリカーボネート、ＣＯＣ（シクロオレフィンコポリマー）、ＣＯＰ（シクロオレフィンポリマー）、アクリル樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ酢酸ビニル、ＰＥＴ（ポリエチレンテレフタレート）、ＰＥＮ（ポリエチレンナフタレート）等が挙げられる。これらの樹脂は各種添加剤を含んでいてもよく、複数の樹脂が混合されたポリマーアロイであってもよい。

【0076】

電磁波透過性を有する材料は、自家蛍光を実質的に有しないことが好ましい。自家蛍光を実質的に有しないとは、材料が、試料検出に使用する波長の自家蛍光を全く有しないか、有していても試料検出に影響を与えないほど微弱であることを意味する。例えば、検出対象の蛍光に比べて１／２以下、１／１０以下程度の自家蛍光であれば、試料検出に影響を与えないほど微弱であるといえる。このような材料を用いてウェルプレート１０１を形成すると、電磁波を利用した試料検出において、検出の感度を高めることができる。

【0077】

電磁波透過性を有し、かつ自家蛍光を発しない材料としては、例えば、石英ガラスが挙げられる。自家蛍光が微弱であり、電磁波を用いた試料検出に支障がない素材としては、低蛍光ガラス、アクリル樹脂、ＣＯＣ（シクロオレフィンコポリマー）、ＣＯＰ（シクロオレフィンポリマー）等が挙げられる。

【0078】

ウェルプレート１０１の厚みは、適宜決定することが出来る。ウェルプレート１０１側から蛍光顕微鏡を用いて蛍光を観察する場合には、ウェルプレート１０１の厚みは、例えば５ｍｍ以下であってもよく、２ｍｍ以下であってもよく、１．６ｍｍ以下であってもよい。

【0079】

ウェルプレート１０１は、上記材料のみを用いた単層の構成であってもよく、複数の材料の積層体であってもよい。積層体を加工してウェルプレート１０１を形成する場合、マイクロウェル１１０を有する層と、当該層を支持する層とは別の材料であってもよい。

【0080】

（マイクロウェル）
マイクロウェル１１０の形状は、種々の形状を採用することができる。マイクロウェル１１０の形状として、例えば円筒形、楕円筒形、多角筒形等の筒形、円錐形、角錐形等の錘形、円錐台、角錐台等の錘台形を例示できる。マイクロウェル１１０が錐形又は錘台形の場合、開口径がウェルの深さ方向に漸減する形状であるとよい。

【0081】

マイクロウェル１１０の底部は、平坦であってもよく、曲面（凸面や凹面）であってもよい。

【0082】

マイクロウェル１１０が円筒形の場合、平面視におけるマイクロウェル１１０の最大径は、例えば１０ｎｍ～１００μｍであれば好ましく、１００ｎｍ～５０μｍがより好ましく、１μｍ～２０μｍがさらに好ましい。また、マイクロウェル１１０の深さは、例えば１０ｎｍ～１００μｍであれば好ましく、１００ｎｍ～５０μｍがより好ましく、１μｍ～２０μｍがさらに好ましい。

【0083】

マイクロウェル１１０の容量は、例えば１ｆＬ～６ｎＬであれば好ましく、１ｆＬ～５ｐＬがより好ましく、１ｆＬ～２ｐＬがさらに好ましく、１ｆＬ～３００ｆＬが特に好ましい。１つあたりのマイクロウェル１１０の容量がこのような範囲であると、デジタルＰＣＲやインベーダー反応等の微小空間内で行う酵素反応を好適に行うことができる。デジタルＰＣＲにより、例えば遺伝子の変異検出等を行うことができる。

【0084】

ウェルプレート１０１は、同形同大の複数のマイクロウェル１１０を有している。同形同大とは、デジタル計測を行うために要求される程度に同一の形状で同一の容量であればよく、製造上の誤差程度のばらつきであれば許容される。

【0085】

マイクロウェル１１０の密度は、例えば１０万～１０００万個／ｃｍ^２であり、好ましくは１０万～５００万個／ｃｍ^２であり、更に好ましくは１０万～１００万個／ｃｍ^２である。マイクロウェル１１０の密度がこのような範囲であると、所定数のマイクロウェル１１０に試料を封入させる操作が容易である。また、実験結果を解析するためのウェルの観察も容易である。

【0086】

例えば、流体デバイス１００を用いてセルフリーＤＮＡの変異を測定する際に、検出対象の変異の野生型に対する存在割合が０．０１％程度である場合、例えば、１００万～２００万個のマイクロウェル１１０を使用することが好適である。

【0087】

図６は、複数のマイクロウェル１１０の一部を示す平面図である。図６に示すように、ウェルプレート１０１において複数のマイクロウェル１１０は、平面視で同一形状である。なお、撮像やデバイス製造におけるアライメントマークとして使用するため、複数のマイクロウェルのうち、少数（例えば、１～４個）は異なる形状であってもよい。

【0088】

また、複数のマイクロウェル１１０は、マトリクス状に規則的に配置されている。ここで、マイクロウェル１１０が「規則的に配置されている」とは、複数のマイクロウェル１１０の開口部の重心同士が、一定のパターンで配置されていることを意味する。

【0089】

例えば、マイクロウェル１１０の開口部の重心同士が四角格子状に配置されていてもよい。この場合、互いに隣り合う４つのマイクロウェル１１０の開口部の重心同士を結ぶ線は、矩形、好ましくは正方形を形成する。

【0090】

または、マイクロウェル１１０の開口部の重心同士が三角格子状（六角格子状）に配置されていてもよい。この場合、互いに隣り合う３つのマイクロウェル１１０の開口部の重心同士を結ぶ線は正三角形を形成する。

【0091】

複数のマイクロウェル１１０のうち、任意のウェル（第１ウェル）Ａと、ウェルＡに最も近接するウェル（第２ウェル）Ｂとは、下記式（１）を満たすことが好ましい。
０．８≦Ｄａ／Ｄａｂ＜１ …（１）
（Ｄａは、ウェルＡの開口部の円相当径であり、Ｄａｂは、ウェルＡの開口部の重心と、ウェルＢの開口部の重心と、との距離である。）

【0092】

ウェルプレート１０１において、Ｄａ／Ｄａｂの値の下限は、０．８であり、０．８３以上であってもよい。また、Ｄａ／Ｄａｂの値の上限は、１未満であり、０．９２以下であってもよく、約０．９であってもよい。これらの下限値及び上限値は任意に組み合わせることができる。

【0093】

上記式（１）を満たす場合、複数のマイクロウェル１１０が三角格子状に配置されていると、任意のマイクロウェル１１０の開口部の重心と、当該マイクロウェル１１０に最も近接するマイクロウェル１１０の開口部の重心との間の距離が一定になる。

【0094】

図６に示すマイクロウェル１１０は、三角格子状に配置されている。図６に示すように、任意のウェルＡと、ウェルＡに最も近接するウェルＢと、ウェルＡ及びウェルＢの双方に最も近接しているウェルＣのそれぞれの開口部の重心Ｃａ、Ｃｂ、Ｃｃは、それぞれを頂点とする正三角形を形成している。

【0095】

図６において、ウェルＡ、ウェルＢ及びウェルＣのそれぞれの開口部の重心Ｃａ、Ｃｂ、Ｃｃを結ぶ線は正三角形である。

【0096】

ウェルプレート１０１において、マイクロウェル１１０の開口部の円相当径は、１μｍ以上５０μｍ以下であることが好ましい。すなわち、マイクロウェル１１０の開口部の円相当径の下限は１μｍであることが好ましい。

【0097】

また、マイクロウェル１１０の開口部の円相当径の上限は、２０μｍ未満であってもよく、１９μｍ以下であってもよく、１８μｍ以下であってもよく、１７μｍ以下であってもよく、１６μｍ以下であってもよく、１５μｍ以下であってもよく、１４μｍ以下であってもよく、１３μｍ以下であってもよく、１２μｍ以下であってもよく、１１μｍ以下であってもよく、１０μｍ以下であってもよい。

【0098】

マイクロウェル１１０の開口部の円相当径について、上限値と下限値とは任意に組み合わせることができる。

【0099】

（蓋部材）
蓋部材１０２は、平面視でウェルプレート１０１と同じ輪郭形状（短冊状）を呈している。蓋部材１０２は、ウェルプレート１０１の上面１０１ａに対し隙間を開けて対向して配置されている。

【0100】

蓋部材１０２には、厚さ方向に貫通する２つの貫通孔を有する。２つの貫通孔は、蓋部材１０２の長手方向の一端側と他端側とにそれぞれ設けられている。一方の貫通孔は、流体デバイス１００の内部空間Ｓに液状物を注入する際に用いる注入口１２１であり、他方の貫通孔は、内部空間Ｓから液状物を排出させる際に用いる排出口１２２である。

【0101】

ここで、「液状物」には、液状の試料の他、検出試薬や封止液も該当する。

【0102】

注入口１２１、内部空間Ｓ及び排出口１２２はこの順に連通し、全体として流路ＦＣを形成している。流体デバイス１００では、流路ＦＣに液状物を適宜流動させて、標的物質の検出反応を行う。平面視において、注入口１２１と排出口１２２との間に、複数のマイクロウェル１１０が配置されている。

【0103】

蓋部材１０２の上面１０２ａには、注入口１２１の周囲を囲む筒状の注入ポート１２５が設けられている。注入ポート１２５は注入口１２１と連通している。注入ポート１２５は、例えば、液状物を充填したシリンジを用いて内部空間に液状物を充填する際、シリンジの接続に用いる。

【0104】

同様に、蓋部材１０２の上面１０２ａには、排出口１２２の周囲を囲む筒状の排出ポート１２６が設けられている。排出ポート１２６は排出口１２２と連通している。排出ポート１２６は、例えば、内部空間Ｓから液状物を抜き出す際に、液状物が流動するチューブの接続に用いる。

【0105】

蓋部材１０２の材料は、上述したウェルプレート１０１の材料として例示した材料を採用することができる。蓋部材１０２の材料は、ウェルプレート１０１の材料と同じであってもよく、異なっていてもよい。

【0106】

また、蓋部材１０２の材料は、電磁波透過性を有していてもよく、電磁波透過性を有していなくてもよい。

【0107】

蓋部材１０２の材料は、疎水であることが好ましい。詳しくは、蓋部材１０２の内部空間Ｓに面する面（下面１０２ｂ）を構成する材料は、封止液ＳＬとの接触角が５°以上８０°以下であることが好ましい。このような材料で蓋部材１０２を形成すると、下面１０２ｂと封止液ＳＬとの接触角が５°以上８０°以下となる。下面１０２ｂの接触角が上記の範囲であると、後述する方法で内部空間Ｓに封止液を導入した場合に、マイクロウェル１１０に試料を隔離しやすい傾向にある。

【0108】

（壁部材）
壁部材１０３は、平面視で閉環状に形成され、ウェルプレート１０１の上面１０１ａの外縁に沿って配置されている。図４では、壁部材１０３の内部空間Ｓに面する壁面は、平面視で略矩形であり、注入口１２１側において幅が漸減している。

【0109】

壁部材１０３は、ウェルプレート１０１と蓋部材１０２とに挟持され、一体となることで流体デバイス１００を形成する。ウェルプレート１０１と蓋部材１０２と壁部材１０３とで囲まれた空間は、液状の試料が収容される内部空間Ｓである。内部空間Ｓは、短冊状のウェルプレート１０１に沿って、ウェルプレート１０１の長手方向に伸びている。

【0110】

壁部材１０３は、内部空間Ｓの壁面として機能する上、ウェルプレート１０１と蓋部材１０２との間のスペーサとして機能する。壁部材１０３の高さ、すなわち内部空間Ｓの高さは、例えば１００μｍ以下であってもよい。

【0111】

壁部材１０３の材料は、特に制限されないが、例えば芯材フィルムの両面にアクリル系粘着剤が積層された両面粘着テープを好適に用いることができる。芯材フィルムの材料は、シリコーンゴム、アクリル発泡体を例示することができる。このような材料を用いて壁部材１０３を形成することで、内部空間Ｓを液密に形成することができる。

【0112】

また、壁部材１０３の材料は、上述したウェルプレート１０１と同じ材料を採用することができる。このような材料で形成された壁部材１０３は、接着剤による接着、又は熱溶着、超音波溶着、レーザー溶着等による溶着により、ウェルプレート１０１及び蓋部材１０２と一体化することができる。

【0113】

なお、壁部材１０３は、ウェルプレート１０１と一体的に形成され、ウェルプレート１０１の一部を構成していてもよい。同様に、壁部材１０３は蓋部材１０２と一体的に形成され、蓋部材１０２の一部を構成していてもよい。

【0114】

上述のウェルプレート１０１は、公知の射出成形、マイクロインプリンティング技術やナノインプリンティング技術を用いて製造することができる。また、ウェルプレート１０１は、公知のフォトリソグラフィ技術を用い、エッチングでマイクロウェル１１０を形成することで製造することもできる。

【0115】

上述の蓋部材１０２、壁部材１０３は、公知の射出成形にて製造することができる。

【0116】

［検出試薬］
検出試薬は、標的物質と反応して、標的物質の検出に用いられる。検出試薬としては、緩衝物質、酵素、基質、抗体、抗体断片等が挙げられる。

【0117】

酵素は、例えば標的物質が核酸である場合には、標的物質に関連する鋳型核酸に対する酵素反応等の生化学的反応を行うために、生化学的反応の内容に対応して選択される。鋳型核酸に対する生化学的反応は、例えば、鋳型核酸が存在する条件下でシグナル増幅が起こるような反応である。

【0118】

検出試薬は、採用する検出反応に応じて選択される。具体的な検出反応としては、ＩＣＡ法、ループ介在等温増幅（ＬＡＭＰ）法（商標登録）、５’→３’ヌクレアーゼ法（ＴａｑＭａｎ（登録商標）法）、蛍光プローブ法等が挙げられる。

【0119】

図７～９は、上述の流体デバイス１００を用いて試料を検出する方法の説明図である。

【0120】

まず、液状の試料と検出試薬とを混合し、混合水溶液を調整する。混合水溶液における検出試薬の濃度は、用いる検出試薬の種類及び検出反応の種類に応じて適宜調整する。

【0121】

用いる検出試薬は、吸着防止剤を含んでもよい。吸着防止剤には、界面活性剤、タンパク質が挙げられる。

【0122】

標的物質の検出を容易にするため、混合水溶液の調整に先立って試料を前処理してもよい。前処理としては、濃度調整（希釈、濃縮）、担持体による担持、２種以上の標的物質の結合反応が挙げられる。

【0123】

次いで、図７に示すように、注入口１２１から内部空間Ｓに、検出試薬を含む混合水溶液Ｌを注入する。混合水溶液Ｌが内部空間Ｓ（流路ＦＣ）を流動すると、内部空間Ｓに開口しているマイクロウェル１１０にも混合水溶液Ｌが充填される。

【0124】

内部空間Ｓ及び全てのマイクロウェル１１０が混合水溶液Ｌで充填された後、流路ＦＣを通過した混合水溶液Ｌは排出口１２２から排出される。

【0125】

このとき、１つのマイクロウェル１１０の内部に１つの標的物質が充填されるように、予め混合水溶液Ｌの濃度を調整しておくことが好ましい。例えば、後述の試料検出方法を実施した後、混合水溶液Ｌが高濃度であることによって標的物質の定量が困難という結果となった場合には、当該結果を予備実験結果として用い、混合水溶液Ｌを希釈する。

【0126】

上記操作により、１つのマイクロウェル１１０に１つ以下、すなわち、０個又は１個の標的物質が充填される。これにより、後述の検出反応が確認されたマイクロウェル１１０の数と、標的物質の数とが対応して、標的物質の検出を１個単位で行うことができ、すなわちデジタル計測が可能となる。なお、全てのマイクロウェル１１０に標的物質が導入される必要はない。

【0127】

標的物質をマイクロウェル１１０に導入する手段は、特に制限されず、検出対象である標的物質に応じた適切な手段を選択することができる。例えば、標的物質を自重により流体デバイス１００内（流路ＦＣ内）で沈降させ、マイクロウェルに分配する方法が挙げられる。

【0128】

また、標的物質を捕捉する物質（捕捉物）を利用し、自重で沈降しにくい標的物質に捕捉物を結合させて送液してもよい。さらに、予めマイクロウェルに捕捉物を固定化させておき、混合水溶液Ｌと共に送液された標的物質を捕捉物に捕捉させることで、標的物質のマイクロウェル１１０への導入効率を向上させることもできる。

【0129】

捕捉物と標的物質とを結合させる反応は、任意の時点で行うことができる。例えば、混合水溶液を調整する前に、サンプルチューブ内で標的物質と捕捉物を接触させることにより行ってもよい。

【0130】

または、捕捉物をマイクロウェル１１０に導入した後に、標的物質をマイクロウェル１１０に導入し、マイクロウェル１１０で捕捉物と標的物質とを接触させてもよい。

【0131】

捕捉物は、標的物質を捕捉することができる物質である。捕捉物は、例えば、固相と標的物質に対する特異的結合物質との結合体であってもよい。

【0132】

補足物を構成する固相としては、粒子、膜、基板等が挙げられる。また、標的物質に対する特異的結合物質は１種類でもよいし、２種類以上であってもよい。例えば３種類であってもよいし、４種類であってもよいし、５種類以上であってもよい。

【0133】

粒子としては、特に制限されず、ポリマー粒子、磁気粒子、ガラス粒子等が挙げられる。粒子は、非特異的な吸着を避けるための表面処理が施された粒子が好ましい。また、特異的結合物質を固定化するために、表面にカルボキシル基等の官能基を有する粒子が好ましい。より具体的には、ＪＳＲ社製の商品名「Ｍａｇｎｏｓｐｈｅｒｅ ＬＣ３００」等を用いることができる。

【0134】

また、例えば標的物質としてウイルスを用いる場合、ウイルスが付着することができる細胞（すなわち、ウイルス受容体を有する細胞）を、捕捉物として用いてもよい。

【0135】

次いで、図８に示すように、注入口１２１から流路ＦＣに封止液ＳＬを送液する。流路ＦＣに送液された封止液ＳＬは、内部空間Ｓにおいて上面１０１ａの面方向に流動し、流路ＦＣに送液された混合水溶液Ｌのうち、マイクロウェル１１０に収容されていない混合水溶液Ｌを押し流して置換する。

【0136】

これにより、封止液ＳＬは、標的物質を含む混合水溶液Ｌを収容した複数のマイクロウェル１１０をそれぞれ個別に封止し、マイクロウェル１１０は独立した反応空間となる。流路ＦＣが封止液ＳＬで満たされると、余分な封止液ＳＬは排出口１２２から排出される。図９は、複数のマイクロウェル１１０の全てが封止液ＳＬで封止され、且つ流路ＦＣが全て封止液ＳＬで置換された状態を示す。

【0137】

次いで、流体デバイス１００を加熱して標的物質と検出試薬との反応を生じさせる。標的物質を検出する方法は、検出したい標的物質の特性に合わせて、公知の任意の検出方法を使用することができる。まず、標的物質由来のシグナルを検出可能なレベルまで増幅させる反応（シグナル増幅反応）を行い、次いで増幅されたシグナルを適切な手段を用いて検出することにより行うことができる。

【0138】

検出装置１においては、シグナル増幅反応として、等温のシグナル増幅反応を採用することができ、ＩＣＡ反応、ループ介在等温増幅（ＬＡＭＰ）法（登録商標）、５’→３’ヌクレアーゼ法（ＴａｑＭａｎ（登録商標）法）、蛍光プローブ法を採用することができる。ＩＣＡ反応は、（１）核酸同士の相補的結合と、（２）酵素による三重鎖構造の認識および切断との２つの反応のサイクルによってシグナル増幅が進行する。このようなシグナル増幅反応においては、標的物質以外の夾雑物による反応サイクル阻害の影響が小さい。したがって、マイクロウェル１１０内に標的物質以外の様々な成分（夾雑物）が存在する場合でも、ＩＣＡ反応を用いることにより、標的物質を精度よく検出することができる。

【0139】

混合水溶液Ｌは、ＩＣＡ反応に必要な反応試薬及び鋳型核酸を含む。ウェルに標的物質が存在する場合には、等温反応による酵素反応によって蛍光物質が消光物質から遊離し、励起光に対応して所定の蛍光シグナルを発する。

【0140】

ＩＣＡ反応では、標的物質と検出試薬との反応温度は５０℃以上９９℃以下であると好ましい。具体的な反応温度は、用いる試薬や求める結果の感度に応じて、予備実験により決定するとよい。用いる試薬の組成を決定した後、予備実験としてＩＣＡ反応を実施し、一定時間後のシグナル、ノイズ、シグナルノイズ比（Ｓ／Ｎ比）、シグナルノイズの差等の結果などから反応温度を最適化するとよい。

【0141】

以下、ＩＣＡ反応について、より詳細に説明する。
図１０は、ＩＣＡ法の一例を説明する模式図である。図１０では、ＩＣＡ法により標的物質であるＤＮＡを検出する様子を示す。

【0142】

ＩＣＡ反応に必要な反応試薬としては、フラッププローブ８１０、フラップエンドヌクレアーゼＦＥＮ、蛍光基質８２０、侵入プローブ（インベーダーオリゴ）８３０等のＩＣＡ反応試薬が挙げられる。

【0143】

フラッププローブ８１０と侵入プローブ８３０とは、標的物質であるＤＮＡ（標的ＤＮＡ）にハイブリダイズして二本鎖核酸１４０とフラップ構造を形成するように設計された核酸断片（オリゴヌクレオチド）である。

【0144】

蛍光基質８２０は、ヘアピン構造を有し、蛍光物質Ｆと消光物質Ｑとが結合した核酸断片である。図１０に示す蛍光基質８２０においては、核酸断片の５’末端に蛍光物質Ｆが結合され、５’末端から数塩基３’側に消光物質Ｑが結合されている。消光物質Ｑは、蛍光物質Ｆの発光を抑制している。

【0145】

まず、標的ＤＮＡにフラッププローブ８１０と侵入プローブ８３０とをハイブリダイズさせる。フラッププローブ８１０と侵入プローブ８３０とは、それぞれ標的ＤＮＡのＳＮＰ部位で１塩基オーバーラップし、不安定な３塩基様構造を形成する。その結果、第１フラップ部位８１１が形成される。第１フラップ部位８１１は、フラッププローブ８１０のうち、標的ＤＮＡとハイブリダイズしなかった部分である。

【0146】

続いて、ＦＥＮは、上記３塩基様構造を認識して反応する。これにより、第１フラップ部位８１１が切断されて核酸断片８１１が生成し、混合水溶液Ｌ中に遊離する。

【0147】

生じた核酸断片８１１は、蛍光基質８２０にハイブリダイズする。核酸断片８１１は、蛍光基質８２０のヘアピン構造に侵入し、ＳＮＰ部位で１塩基オーバーラップして、不安定な３塩基様構造を形成する。その結果、第２フラップ部位８２１が形成される。第２フラップ部位８２１は、蛍光基質８２０のうち、核酸断片８１１の侵入によりハイブリダイズしなくなった部分である。

【0148】

続いて、ＦＥＮは、上記３塩基様構造を認識して反応する。これにより、第２フラップ部位８２１が切断され、核酸断片８２１が生成される。図１０においては、蛍光基質８２０から核酸断片８２１が切断された残部を、符号８２０’で示している。

【0149】

その結果、蛍光物質Ｆが消光物質Ｑから離れ、蛍光ＦＬを発生する。この蛍光ＦＬを検出することにより、標的ＤＮＡを検出することができる。

【0150】

また、標的物質の検出は、標的物質に特異的に結合する物質（特異的結合物質）を標的物質に結合させ、結合した特異的結合物質を検出することによっても、行うことができる。例えば、標的物質がタンパク質である場合、ＥＬＩＳＡを用いて検出することができる。より具体的には、検出は、例えばＦＲＥＴの原理を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡにより、行ってもよい。

【0151】

ＦＲＥＴの原理を用いたサンドイッチ法を行う場合は、まず、第１の蛍光物質（ドナー）で標識した第１の特異的結合物質（例えば抗体）と、第１の蛍光物質の蛍光波長と重複する吸光波長を有する第２の蛍光物質（アクセプター）で標識した第２の特異的結合物質を準備する。

【0152】

続いて、標的物質（例えば抗原）を、第１の特異的結合物質と第２の特異的結合物質の両方と接触させ、複合体を形成させる。複合体が形成されると、ドナーとアクセプターの距離が近づき、ドナーの励起波長の照射によりアクセプターの蛍光波長を検出することができるようになる。あるいは、特異的結合物質を核酸断片で標識しておき、核酸断片をＩＣＡ反応により検出してもよい。

【0153】

特異的結合物質としては、後述する構造体に対する特異的結合分子と同様のもの、例えば抗体、抗体断片、アプタマー等を使用することができる。標的物質に結合した特異的結合物質を検出するために、特異的結合物質を、例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）等の酵素により、直接的又は間接的に標識してもよい。２以上の特異的結合物質を使用する場合は、各々の特異的結合分子を、互いに識別可能に標識することができる。

【0154】

シグナルの観察方法は、観察するシグナルの種類に応じて公知の適切な方法を選択することができる。例えば、明視野観察を行う場合は、ウェルアレイが設けられた基材に対して垂直方向に白色光を照射する。蛍光シグナルを観察する場合は、蛍光物質に対応する励起光をウェルの底側からウェル内へ照射し、蛍光物質が発する蛍光を観察する。観察されたウェルアレイの全体又は一部の画像を撮影して保存し、コンピューターシステムによる画像処理を行う。なお、上述した明視野観察及び蛍光シグナル観察における光（白色光、励起光）の照射方向は一例であり、目的とする観察が可能であれば適宜変更可能である。例えば、蛍光シグナル観察においては、明視野観察における白色光の照射方向と同様に、基材に対して垂直方向に励起光を照射してもよい。

【0155】

［動作］
図１１～１４は、検出装置１の動作を説明する説明図である。

【0156】

まず、図１１に示すように、標的物質を含む液状試料と、標的物質と反応して蛍光を発する生成物を生じる検出試薬と、の混合水溶液を流体デバイス１００に収容し、搬送本体３２のステージ３２３に載置する。この操作は、流体デバイス１００の待機部５５において行うとよい。

【0157】

このとき、制御部４０は、予め加熱部１１を、室温より高く且つ予め設定された反応温度以下に加熱（予備加熱）しておくとよい。上述したように、ＩＣＡ反応では、一例として標的物質と検出試薬との反応温度は５０℃以上９９℃以下であると好ましい。この温度条件の場合、予備加熱の温度は、室温より高く、例えば９０℃以下であると好ましい。「室温」とは、例えば２５℃である。

【0158】

次いで、図１２に示すように、搬送部３０を駆動させて、ステージ３２３に載置した流体デバイス１００を加熱部１１に移動させる。これにより、加熱部１１において、流体デバイス１００を加熱する。

【0159】

上述のように、流体デバイスの加熱に先立って加熱部１１を予備加熱しておくと、流体デバイス１００の加熱を素早く行うことができるため好ましい。加熱部１１を予備加熱する場合、搬送部３０が待機部５５から加熱部１１に流体デバイス１００の搬送を開始する際に、制御部４０は加熱部１１の加熱温度を、予備加熱の設定温度から、ＩＣＡ反応の反応温度に変更するとよい。その他、制御部４０は、搬送部３０が待機部５５から加熱部１１まで流体デバイス１００を搬送する間のいずれかで、加熱部１１の加熱温度を、予備加熱の設定温度からＩＣＡ反応の反応温度に変更するとよい。

【0160】

このとき、制御部４０は、予め冷却部１２を、予め設定された冷却温度以上、加熱部１１における反応温度未満に冷却（予備冷却）しておくとよい。例えば、ＩＣＡ反応の反応温度が６０℃である場合、予備冷却の温度は、例えば０℃以上室温未満であると好ましい。

【0161】

次いで、図１３に示すように、搬送部３０を駆動させて、ステージ３２３に載置した流体デバイス１００を加熱部１１から冷却部１２に移動させる。これにより、冷却部１２において、流体デバイス１００を冷却する。

【0162】

上述のように、流体デバイスの冷却に先立って冷却部１２を予備冷却しておくと、流体デバイス１００の冷却を素早く行うことができるため好ましい。冷却部１２を予備冷却する場合、搬送部３０が加熱部１１から冷却部１２に流体デバイス１００の搬送を開始する際に、制御部４０は冷却部１２の冷却温度を、予備冷却の設定温度から、実際の冷却温度に変更するとよい。その他、制御部４０は、搬送部３０が加熱部１１から冷却部１２まで流体デバイス１００を搬送する間のいずれかで、冷却部１２の冷却温度を、予備冷却の設定温度から実際の冷却温度に変更するとよい。

【0163】

次いで、図１４に示すように、搬送部３０を駆動させて、ステージ３２３に載置した流体デバイス１００を冷却部１２から撮像部２０の投射レンズ２３の上方に移動させる。撮像部２０では、流体デバイス１００に励起光を照射し、生じる蛍光の像を撮像する。

【0164】

その後、撮像した蛍光の像を画像解析することで、蛍光発光しているウェルの数を計測し、標的物質を定量することができる。

【0165】

以上のような検出装置１では、次のような効果が得られる。

【0166】

検出試薬は、加熱を続けると、標的物質が存在しなくても副反応により蛍光を発する生成物を生じる。このように生じた生成物は、撮像部２０において撮像する画像において、標的物質に起因した蛍光と区別ができず、標的物質の検出の誤差の原因となり得る。また、流体デバイス１００では、加熱から冷却までの間にもＩＣＡ反応が進む。そのため、加熱から冷却までに時間を要すると、検出対象であるシグナルの発光と、ノイズの発光との両方が強くなり、検出感度が低くなることが想定される。

【0167】

対して、検出装置１では、加熱部１１における加熱の後、加熱部１１とは別に設けられた冷却部１２において流体デバイス１００を冷却する。そのため、加熱により加速されていた標的物質と検出試薬との反応を失活させ、副反応を抑制することができる。これらにより、検出装置１では、高精度の検出が可能となる。

【0168】

また、加熱部１１が設けられた場所に冷却部も設け、同じ場所において加熱も冷却も行うことが可能な構成とすると、加熱の後に冷却を開始する際、流体デバイス１００と共に、ＩＣＡ反応等の検出反応における反応温度にまで加熱された加熱部１１も冷却する必要が生じる。このような構成の場合、流体デバイス１００の冷却は可能であるが、加熱部１１の冷却に要する時間が余分に必要となる。

【0169】

また、上述した様に、流体デバイス１００は、ガラスや樹脂を材料としている。また、流体デバイス１００の内部には液体試料や試薬等の液体が貯留される。さらに、流体デバイス１００の容積を増大させるため、デバイスに別途部材を取り付ける、デバイス自体を大型化する等の変更が想定される。これらは全て流体デバイス１００の比熱を高め、流体デバイス１００の素早い冷却を阻害する。

【0170】

対して、検出装置１では、加熱部１１と冷却部１２とが別に設けられているため、加熱部１１が設けられた場所に冷却部も設けた装置構成と比べ、流体デバイス１００の加熱の後に、素早く流体デバイス１００を冷却することができる。さらに、検出装置１では、加熱部１１と冷却部１２とが別に設けられているため、上述の予備加熱、予備冷却が可能となる。これにより、検出装置１では、短時間での検出が可能となり、作業効率が向上する。

【0171】

以上のような構成の検出装置１によれば、デジタルＩＣＡを原理とした検出において、高い検出精度を担保しながら、短時間で多くの検出を可能とする検出装置を提供することができる。

【0172】

なお、本実施形態の検出装置１では、冷却部１２の位置に対象物を冷却するための部材を設けることとしたが、これに限らない。冷却装置においては、加熱部１１で加熱した流体デバイス１００を撮像部２０の撮像位置にまで搬送し、観察を開始するまでの間に流体デバイス１００の冷却が完了する構成であればよい。

【0173】

例えば、流体デバイス１００を加熱部１１から撮像位置にまで搬送する途中で流体デバイス１００に対して送風し、冷却することとしてもよい。この場合、加熱部１１から撮像位置までの搬送経路にて送風する手段が冷却部に該当する。

【0174】

また、流体デバイス１００を撮像位置において冷却することとしてもよい。流体デバイス１００を冷却する手段は、公知の構成を採用することができる。この場合、撮像位置において流体デバイス１００を冷却する手段が冷却部に該当する。このような構成では、冷却しながら観察（撮像）してもよく、冷却後に観察（撮像）してもよい。

【0175】

また、本実施形態においては、投射レンズ２３（対物レンズ）がオートフォーカス機構を有する場合、制御部４０が撮像に先だってオートフォーカス機構を制御し、対物レンズの焦点位置をマイクロウェル１１０に合わせることしてもよい。制御部４０がこのような制御を行うことにより、検出装置１では、精度良く撮像でき、高精度の検出が可能となる。また、マイクロウェル１１０をアライメントマークとして用い、予めマイクロウェル１１０に焦点位置を合わせることにより、流体デバイス１００の全体に反りや歪みが生じている場合であっても、焦点位置の再調整を素早く行うことができる。

【0176】

撮像部２０がオートフォーカス機構を有していない場合、他の方法で対物レンズの焦点位置をマイクロウェル１１０に合わせてもよい。例えば、流体デバイス１００にアライメントマークを設け、検出装置１においては、アライメントマークを用いて焦点を合わせた後に他のマイクロウェル１１０を撮像してもよい。アライメントマークは、マイクロウェル１１０と同じ焦点位置に設けておくとよい。

【0177】

また、ｚ軸方向において、アライメントマークの焦点位置がマイクロウェル１１０の焦点位置と異なっていたとしても、両者の焦点位置のずれ量を測定し、ずれ量を補正して焦点位置をあわせマイクロウェル１１０を撮像してもよい。

【0178】

例えば、流体デバイス１００の全体に反りや歪みが生じている場合には、マイクロウェル１１０に対する焦点距離がマイクロウェル１１０ごとに異なることが考えられる。その場合、複数のマイクロウェル（ウェルアレイ）について、例えばアレイの周囲と、アレイの中央とにそれぞれ位置するマイクロウェル１１０の焦点距離を測定し、得られた焦点距離と、焦点距離を測定したマイクロウェル１１０の位置との対応関係から、流体デバイス１００の反り量を概算してもよい。得られた反り量をずれ量の補正値として用い、焦点位置をあわせてマイクロウェル１１０を撮像するとよい。

【0179】

なお、上記方法では、マイクロウェル１１０の焦点距離から流体デバイス１００の反り量を概算することとしたが、反り量を求める際の測定対象として、流体デバイス１００が有するアライメントマークを用いてもよい。

【0180】

この場合、流体デバイス１００に設けるアライメントマークは、上述したように複数のウェルの一部（たとえば１～４個）を用いてもよく、マイクロウェル１１０が設けられた領域の周囲に別途設けてもよい。

【0181】

また、流体デバイス１００を複数の焦点位置で撮像し、得られた複数の画像を用いて公知のｚスタック画像を合成することで、画像全体で焦点のあった合成画像を得てもよい。

【0182】

［第２実施形態］
図１５～１９は、本発明の第２実施形態に係る検出装置の説明図である。本実施形態において第１実施形態と共通する構成要素については同じ符号を付し、詳細な説明は省略する。

【0183】

図１５は、本実施形態の検出装置２を示す概略斜視図であり、第１実施形態の図１に対応する図である。検出装置２は、温度調整部１０と、撮像部２０と、搬送部３５と、制御部４０とを有する。さらに検出装置２は、蓋６０と、移動手段７０とを有する。

【0184】

蓋６０は、ステージ５１上に配置された各構成の全体を覆う箱形の部材である。蓋６０は、点Ｐ１を通りｘ軸に並行に設定された回働軸まわりを回働することで、開閉可能に設けられている。

【0185】

図１６は、移動手段７０の概略斜視図である。移動手段７０は、蓋６０の内側上面に設けられている（図１５参照）。移動手段７０は、ｙ方向に配列する複数（図では３つ）の押出し部７１と、ｘ方向の両側において押出し部７１を支持する一対の取り付け部７２とを有する。図１６では、取り付け部７２を、複数の押出し部７１をまとめて支持する板状の部材として示しているが、特に限定はない。

【0186】

押出し部７１は、モータ７１１、送りネジ７１２、ガイドシャフト７１３、ナット７１４、フック７１５を有する。

【0187】

モータ７１１は、不図示の減速ギアを介して送りネジ７１２を回転させる。

【0188】

送りネジ７１２は、ｘ方向に延びて設けられている。送りネジ７１２のｘ方向の両端は、取り付け部７２において回転可能に支持されている。送りネジ７１２は、モータ７１１が駆動することにより、送りネジ７１２の中心軸周りに回転する。

【0189】

ガイドシャフト７１３は、送りネジ７１２の－ｚ方向の位置において、ｘ方向に延びて設けられている。ガイドシャフト７１３は、フック７１５に設けられた不図示の貫通孔に挿通されており、ｘ方向の両端は、取り付け部７２において固定されている。

【0190】

ナット７１４は、送りネジ７１２が挿入されている。ナット７１４の下側（－ｚ側）にはフック７１５が結合している。フック７１５の形状は、後述する押出し機能を有するならば特に限定はない。

【0191】

このような移動手段７０においては、モータ７１１を回転させ送りネジ７１２を回転させることにより、ガイドシャフト７１３に沿って±ｘ方向にナット７１４及びフック７１５が移動する。

【0192】

図１７は、加熱部１１及び搬送部３５を示す概略斜視図である。加熱部１１は、温調ホルダ１５を有する。温調ホルダ１５は、加熱部１１の上面に一体的に形成されていてもよく、加熱部１１とは別部材として形成され、加熱部１１の上面に固定されていてもよい。

【0193】

温調ホルダ１５は、平面視矩形の基部１５１と、基部１５１の上面においてｘ方向に延びる複数（図では４本）のレール１５２と、を有する。隣り合うレール１５２の間隔は、流体デバイス１００の短手方向の幅と同等であり、レール１５２の間には、流体デバイス１００が挿入される溝（第１収容部）１５２ａが形成されている。溝１５２ａは、搬送本体３６の搬送方向、すなわちｘ方向に延びて形成されている。

【0194】

温調ホルダ１５が加熱部１１とは別部材である場合、少なくとも基部１５１は、アルミニウム、銅など熱伝導性の高い金属材料で形成されていることが好ましい。

【0195】

搬送部３５は、搬送本体３６を有する。搬送本体３６は、第１部材３２１、第２部材３２２、測定ホルダ３３０を有する。

【0196】

測定ホルダ３３０は、平面視矩形の基部３３１と、基部３３１の上面においてｘ方向に延びる複数（図では４本）のレール３３２と、レール３３２の＋ｘ側の端部に設けられた壁部３３３と、を有する。

【0197】

基部３３１は、上述したステージ３２３と同様に、流体デバイス１００を載置すると共に、下方（－ｚ方向）から流体デバイス１００を観察可能であれば種々の構成を採用することができる。例えば、ステージ３２３は、光透過性を有する板状部材であってもよく、流体デバイス１００の観察部分が空隙である枠体であってもよい。

【0198】

測定ホルダ３３０の基部３３１の上面と、温調ホルダ１５の基部１５１の上面とは、ｚ方向の高さ位置が略等しい。

【0199】

隣り合うレール３３２の間隔は、流体デバイス１００の短手方向の幅と同等であり、レール３３２の間には、流体デバイス１００が挿入される溝（第２収容部）３３２ａが形成されている。溝３３２ａは、搬送本体３６の搬送方向、すなわちｘ方向に延びて形成されている。また、溝３３２ａの＋ｘ側は壁部３３３により閉じられている。

【0200】

図１７に示す温調ホルダ１５の溝１５２ａと、測定ホルダ３３０の溝３３２ａとは同数であるが異なっていてもよい。溝１５２ａと溝３３２ａとは、それぞれｘ方向に配列している。

【0201】

また、温調ホルダ１５の溝１５２ａと、図１６に示す移動手段７０の押出し部７１とは、例えば同数であるが異なっていてもよい。

【0202】

図１８，１９は、検出装置２の動作を説明する説明図である。図１８，１９では、図を見やすくするため、押出し部７１のガイドシャフトの図示を省略している。検出装置２は、複数の流体デバイス１００のそれぞれを異なる時間で加熱、冷却観察することができる。

【0203】

まず、図１８に示すように、温調ホルダ１５の溝１５２ａ（図１７参照）に流体デバイス１００を配置し、加熱部１１において温調ホルダ１５ごと流体デバイス１００を加熱する。

【0204】

また、搬送本体３６を－ｘ方向に移動させ、測定ホルダ３３０の－ｘ側の端部と、温調ホルダ１５の＋ｘ側に端部とを近接させる。

【0205】

押出し部７１のフック７１５は、図１５に示す蓋６０を閉じることにより、下端位置が流体デバイス１００の上面よりも－ｚ側に位置している。

【0206】

次いで、図１９に示すように、押出し部７１のモータ７１１を駆動させ、ナット７１４及びフック７１５を＋ｘ方向に移動させる。フック７１５は、＋ｘ方向に移動する際に流体デバイス１００Ａに接触し、フック７１５の移動に伴って流体デバイス１００Ａを＋ｘ方向に押出し、測定ホルダ３３０に移動させる。測定ホルダ３３０に移動する流体デバイス１００は、溝３３２ａに収容される。残る流体デバイス１００Ｂは、温調ホルダ１５に配置されたままとなる。

【0207】

搬送部３５は、搬送本体３６を＋ｘ方向に移動させる。検出装置２は、適宜、冷却部１２（図１５参照）において流体デバイス１００Ａを冷却し、撮像部２０により撮像、検出を行う。

【0208】

その後、検出装置２は、残る流体デバイス１００Ｂについて流体デバイス１００Ａと同様の操作を行い、撮像部２０（図１５参照）により撮像、検出を行う。

【0209】

これらの処理を流体デバイス１００に行うことで、流体デバイス１００Ａと流体デバイス１００Ｂとで加熱時間を異ならせ、検出処理を行うことができる。

【0210】

以上のような構成の検出装置２によっても、デジタルＩＣＡを原理とした検出において、高い検出精度を担保しながら、短時間で多くの検出を可能とする検出装置を提供することができる。

【0211】

以上、添付図面を参照しながら本発明に係る好適な実施の形態例について説明したが、本発明は係る例に限定されない。上述した例において示した各構成部材の諸形状や組み合わせ等は一例であって、本発明の主旨から逸脱しない範囲において設計、仕様等に基づき種々変更可能である。

【符号の説明】

【0212】

１，２…検出装置、１０…温度調整部、１１…加熱部、１２…冷却部、１５…温調ホルダ、２０…撮像部、２１…光源部、２２…ダイクロイックミラー、２３…投射レンズ、２４…結像レンズ、２５…撮像手段、２７…空間フィルタ、３０，３５…搬送部、４０…制御部、７０…移動手段、１００，１００Ａ，１００Ｂ…流体デバイス、１１０…ウェル（マイクロウェル）、１５２ａ…溝（第１収容部）、２１１…光源、２１２…光学フィルタ、２１２ａ…第１光学フィルタ、２１２ｂ…第２光学フィルタ、２１５…外光導入部、２９５…切替部、３２７ａ…溝（第２収容部）、Ａ，Ｂ，Ｃ…ウェル、ＤＮＡ…標的、ＥＬ…励起光、ＦＬ…蛍光、ＦＰ…共焦点、Ｌ…混合水溶液、Ｌ１…光、Ｌ２…外光、Ｐ…ピンホール

【要約】

【課題】デジタルＩＣＡを原理とした検出において、高い検出精度を担保しながら、短時間で多くの検出を可能とする検出装置を提供する。
【解決手段】流体デバイスの温度を調整する温度調整部と、流体デバイスに励起光を照射するとともに、流体デバイスから発せられる蛍光の像を撮像する撮像部と、流体デバイスを温度調整部及び撮像部に搬送する搬送部と、を有し、流体デバイスは、標的物質を含む液状試料と、標的物質と反応して蛍光を発する生成物を生じる検出試薬と、の混合水溶液を収容し、温度調整部は、流体デバイスを加熱する加熱部と、加熱された流体デバイスを冷却する冷却部と、を有する検出装置。
【選択図】図１

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】