特許 7416269 細胞培養容器及び細胞培養システム

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-01-09

(45)【発行日】2024-01-17

(54)【発明の名称】細胞培養容器及び細胞培養システム

(51)【国際特許分類】

   C12M 1/00 20060101AFI20240110BHJP

   C12M 1/34 20060101ALI20240110BHJP

   C12Q 1/06 20060101ALI20240110BHJP

【ＦＩ】

C12M1/00 C

C12M1/34 D

C12Q1/06

【請求項の数】 4

(21)【出願番号】P 2022545502

(86)(22)【出願日】2021-07-07

(86)【国際出願番号】 JP2021025595

(87)【国際公開番号】W WO2022044555

(87)【国際公開日】2022-03-03

【審査請求日】2023-02-01

(31)【優先権主張番号】P 2020142616

(32)【優先日】2020-08-26

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】000001993

【氏名又は名称】株式会社島津製作所

(74)【代理人】

【識別番号】110001195

【氏名又は名称】弁理士法人深見特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】井上 統宏

(72)【発明者】

【氏名】橋本 豊之

(72)【発明者】

【氏名】米田 恭子

(72)【発明者】

【氏名】田窪 健二

(72)【発明者】

【氏名】藤山 陽一

(72)【発明者】

【氏名】大久保 智樹

(72)【発明者】

【氏名】小関 英一

(72)【発明者】

【氏名】▲高▼井 亮吾

(72)【発明者】

【氏名】後藤 洋臣

(72)【発明者】

【氏名】冨田 定

【審査官】菅原 洋平

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１９／２２２３３３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特開２０１９－０１７３４６（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１４－５３０６１８（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開昭６０－２５１８７８（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｍ １／００－３／１０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

容器本体と、
筒状部及び酸素透過性のメンブレンを有するセルカルチャーインサートと、
蓋部材とを備え、
前記容器本体には、前記容器本体の内部に連通している開口が形成されており、
前記筒状部は、上端と、下端とを含み、前記下端が前記容器本体の内部に位置するように前記開口に挿入されており、
前記筒状部の前記下端側は、前記メンブレンにより閉塞されており、
前記筒状部の前記上端側は、前記蓋部材により閉塞されており、
前記蓋部材は、前記筒状部の内部側を向いている下面を含み、
前記蓋部材には、前記下面において前記筒状部の内部に連通している電極挿入口及び培地排出口が形成されており、
前記メンブレンと前記下面との間の距離は、前記電極挿入口の前記下面側の端から前記培地排出口の前記下面側の端に近づくにしたがって大きくなっている、細胞培養容器。

【請求項2】

前記蓋部材は、前記下面の反対面である上面を含み、
前記下面は、前記上面に向かって凸の曲面であり、
前記下面には、凹部が形成されており、
前記下面は、前記凹部において、前記凹部の周囲にある前記下面の部分よりも前記上面側に向かって窪んでおり、
前記培地排出口の前記下面側の端は、前記凹部に位置している、請求項１に記載の細胞培養容器。

【請求項3】

前記蓋部材には、前記下面において前記筒状部の内部に連通している培地導入口が形成されており、
前記メンブレンと前記下面との間の距離は、前記培地導入口の前記下面側の端から前記培地排出口の前記下面側の端に近づくにしたがって大きくなっている、請求項１に記載の細胞培養容器。

【請求項4】

請求項３に記載の前記細胞培養容器と、
前記培地導入口に接続されている第１チューブと、
前記培地排出口に接続されている第２チューブと、
前記第１チューブを介して前記筒状部の内部に第１培地を導入するとともに、前記第２チューブを介して前記筒状部の内部から前記第１培地を排出させるポンプと、
前記筒状部の内部に貯留されている前記第１培地に電気的に接続されるように前記電極挿入口に挿入されている第１電極と、
前記容器本体に埋設されることにより前記容器本体の内部に貯留されている第２培地と電気的に接続されている第２電極と、
前記第１電極と前記第２電極との間の電気抵抗値を測定する経上皮電気抵抗測定装置とを備える、細胞培養システム。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、細胞培養容器及び細胞培養システムに関する。

【背景技術】

【0002】

特許文献１（国際公開第２０１８／０７９７９３号）に記載の細胞培養容器は、培養槽と、細胞培養インサート（以下においては「セルカルチャーインサート」とする）とを有している。培養槽には、培養槽の内部に連通している開口部が設けられている。セルカルチャーインサートは、筒状部と、筒状部の下端を閉塞している多孔質膜（以下においては「メンブレン」とする）とを有している。筒状部は、メンブレンが培養槽の内部に位置するように開口部に挿入されている。筒状部の内部には第１培地が貯留されており、培養槽の内部には第２培地が貯留されている。メンブレン上では、細胞の培養が行われる。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0003】

【文献】国際公開第２０１８／０７９７９３号

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

特許文献１に記載の細胞培養容器においては、実験中に第１培地の交換を行うこと及びメンブレン上で培養されている細胞の状態をモニタリングすることが想定されていない。

【0005】

本発明は、培地の交換を行いながらメンブレン上の細胞の状態を正確にモニタリングすることが可能な細胞培養容器を提供するものである。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明の細胞培養容器は、容器本体と、筒状部及び酸素透過性のメンブレンを有するセルカルチャーインサートと、蓋部材とを備える。容器本体には、容器本体の内部に連通している開口が形成されている。筒状部は、上端と、下端とを含み、下端が容器本体の内部に位置するように開口に挿入されている。筒状部の下端側は、メンブレンにより閉塞されている。筒状部の上端側は、蓋部材により閉塞されている。蓋部材は、筒状部の内部側を向いている下面を含む。蓋部材には、下面において筒状部の内部に連通している電極挿入口及び培地排出口が形成されている。メンブレンと下面との間の距離は、電極挿入口の下面側の端から培地排出口の下面側の端に近づくにしたがって大きくなっている。

【発明の効果】

【0007】

本発明の細胞培養容器によると、培地の交換を行いながらメンブレン上の細胞の状態を正確にモニタリングすることができる。

【図面の簡単な説明】

【0008】

【図1】細胞培養容器１０の断面図である。

【図2】蓋部材１３の平面図である。

【図3】蓋部材１３の底面図である。

【図4】図２のＩＶ－ＩＶにおける断面図である。

【図5】細胞培養システム１００の模式図である。

【発明を実施するための形態】

【0009】

実施形態の詳細を、図面を参照しながら説明する。ここでは、同一又は相当する部分に同一の参照符号を付し、重複する説明は繰り返さないものとする。

【0010】

（実施形態に係る細胞培養容器の構成）
以下に、実施形態に係る細胞培養容器（以下においては「細胞培養容器１０」とする）の構成を説明する。

【0011】

図１は、細胞培養容器１０の断面図である。図１に示されるように、細胞培養容器１０は、容器本体１１と、セルカルチャーインサート１２と、蓋部材１３と、蓋部材１４と、電極１５ａ及び電極１５ｂと、電極１５ｃ及び電極１５ｄとを有している。

【0012】

容器本体１１は、上壁１１ａと、底壁１１ｂと、側壁１１ｃとを有している。上壁１１ａ及び底壁１１ｂは、間隔を空けて互いに対向している。側壁１１ｃは、その上端において上壁１１ａに連なっているとともに、その下端において底壁１１ｂに連なっている。上壁１１ａ、底壁１１ｂ及び側壁１１ｃにより、容器本体１１の内部空間が画されている。容器本体１１は、例えば樹脂材料により形成されている。

【0013】

上壁１１ａには、開口１１ａａが形成されている。開口１１ａａは、厚さ方向に沿って上壁１１ａを貫通している。このことを別の観点から言えば、開口１１ａａは、容器本体１１の内部と連通している。上壁１１ａは、起立部１１ａｂを有している。起立部１１ａｂは、底壁１１ｂとは反対側に向かって（上方に向かって）延在している。起立部１１ａｂは、開口１１ａａの周囲に位置している。

【0014】

セルカルチャーインサート１２は、筒状部１２ａと、メンブレン１２ｂと、フランジ部１２ｃとを有している。

【0015】

筒状部１２ａは、筒状の形状を有している。筒状部１２ａの上端から筒状部１２ａの下端に向かう方向に直交している断面視において、筒状部１２ａは、例えば、円環形状を有している。筒状部１２ａの上端は、開口している。筒状部１２ａの下端は、メンブレン１２ｂにより閉塞されている。

【0016】

筒状部１２ａは、その下端が容器本体１１の内部に位置するように（メンブレン１２ｂが容器本体１１の内部に位置するように）開口１１ａａに挿入されている。なお、筒状部１２ａと開口１１ａａとの間は、適宜の方法により気密に封止されている。

【0017】

メンブレン１２ｂは、酸素透過性である。メンブレン１２ｂは、例えば、ポリカーボネート製のトラックエッチ膜である。メンブレン１２ｂは、第１主面１２ｂａと、第２主面１２ｂｂとを有している。第２主面１２ｂｂは、第１主面１２ｂａの反対面である。

【0018】

第１主面１２ｂａは、容器本体１１の内部側を向いている面である。第２主面１２ｂｂは、筒状部１２ａの内部側を向いている面である。このことを別の観点から言えば、容器本体１１の内部空間の一部は第１主面１２ｂａにより画されており、筒状部１２ａの内部空間の一部は第２主面１２ｂｂにより画されている。

【0019】

第２主面１２ｂｂ上には、細胞が培養される。この細胞は、例えば、第２主面１２ｂｂ上においてタイトジャンクション（密着結合）を形成する腸管上皮細胞である。この細胞の具体例としては、Ｃａｃｏ－２細胞が挙げられる。

【0020】

筒状部１２ａの内部には、第１培地１６が貯留されている。第１培地１６は、細菌を含んでいる。この細菌は、例えば、嫌気性細菌である。容器本体１１の内部には、第２培地１７が貯留されている。第１培地１６中の溶存酸素濃度は、第２培地１７中の溶存酸素濃度よりも低い。このことを別の観点から言えば、第１培地１６は嫌気培地であり、第２培地１７は好気培地である。

【0021】

上記のとおり、メンブレン１２ｂは、酸素透過性である。そのため、第２培地１７中の酸素は、メンブレン１２ｂを透過して第２主面１２ｂｂ上で培養されている細胞に供給される。これにより、第２主面１２ｂｂ上において細胞の培養が可能になる。

【0022】

フランジ部１２ｃは、筒状部１２ａの上端側にある。フランジ部１２ｃは、筒状部１２ａの外周面から、筒状部１２ａの上端から筒状部１２ａの下端に向かう方向と交差する方向に沿って張り出している。セルカルチャーインサート１２は、フランジ部１２ｃが起立部１１ａｂにより支持されることにより、上壁１１ａから底壁１１ｂに向かう方向に沿った移動が規制されている。

【0023】

蓋部材１３は、例えば、樹脂材料により形成されている。この樹脂材料は、例えば、シリコーン樹脂である。蓋部材１３は、筒状部１２ａの上端側から、筒状部１２ａの内部に挿入されている。これにより、筒状部１２ａの上端側が、蓋部材１３により閉塞されている。

【0024】

蓋部材１３は、上面１３ａと、下面１３ｂとを有している。下面１３ｂは、上面１３ａの反対面である。下面１３ｂは、筒状部１２ａの内部側を向いている。

【0025】

図２は、蓋部材１３の平面図である。図３は、蓋部材１３の底面図である。図４は、図２のＩＶ－ＩＶにおける断面図である。図１～図４に示されるように、下面１３ｂは、上面１３ａに向かって凸の曲面であることが好ましい。下面１３ｂには、凹部１３ｂａが形成されていることが好ましい。下面１３ｂは、凹部１３ｂａにおいて、凹部１３ｂａの周囲よりも上面１３ａに向かって窪んでいる。凹部１３ｂａは、例えば、上面１３ａに向かって凸の曲面である。

【0026】

蓋部材１３には、培地導入口１３ｃと、培地排出口１３ｄと、電極挿入口１３ｅと、電極挿入口１３ｆとが形成されている。培地導入口１３ｃ、培地排出口１３ｄ、電極挿入口１３ｅ及び電極挿入口１３ｆは、例えば、上面１３ａから下面１３ｂに向かって蓋部材１３を貫通している。このことを別の観点から言えば、培地導入口１３ｃ、培地排出口１３ｄ、電極挿入口１３ｅ及び電極挿入口１３ｆは、下面１３ｂ側の端において、筒状部１２ａの内部と連通している。

【0027】

筒状部１２ａの内部には、培地導入口１３ｃから第１培地１６が導入される。筒状部１２ａの内部に貯留されている第１培地１６は、培地排出口１３ｄから排出される。

【0028】

下面１３ｂは、電極挿入口１３ｅの下面１３ｂ側の端から培地排出口１３ｄの下面１３ｂ側の端に向かうにしたがって、メンブレン１２ｂとの間の距離が大きくなっている。このことを別の観点から言えば、下面１３ｂは、電極挿入口１３ｅの下面１３ｂ側の端から培地排出口１３ｄの下面１３ｂ側の端に向かうにしたがって、上面１３ａとの間の距離が小さくなっている。

【0029】

図示されていないが、下面１３ｂは、電極挿入口１３ｆの下面１３ｂ側の端から培地排出口１３ｄの下面１３ｂ側の端に向かうにしたがって、メンブレン１２ｂとの間の距離が大きくなっている（上面１３ａとの間の距離が小さくなっている）。

【0030】

下面１３ｂは、培地導入口１３ｃの下面１３ｂ側の端から培地排出口１３ｄの下面１３ｂ側の端に向かうにしたがって、メンブレン１２ｂとの間の距離が小さくなっている（上面１３ａとの間の距離が小さくなっている）。

【0031】

培地排出口１３ｄの下面１３ｂ側の端は、凹部１３ｂａに配置されている。培地排出口１３ｄの下面１３ｂ側の端は、凹部１３ｂａを構成している曲面の頂点に配置されていることが好ましい。凹部１３ｂａを構成している曲面の頂点は、凹部１３ｂａのうちの上面１３ａとの距離が最も小さくなっている位置である。

【0032】

蓋部材１４は、容器本体１１に着脱可能に取り付けられている。より具体的には、蓋部材１４は、起立部１１ａｂとの間でフランジ部１２ｃを挟み込むように容器本体１１に取り付けられている。これにより、セルカルチャーインサート１２が容器本体１１から脱落することが防止されている。なお、蓋部材１４には開口１４ａが形成されている。開口１４ａからは、上面１３ａが露出している。

【0033】

電極１５ａは、電極挿入口１３ｅに挿入されている。これにより、電極１５ａの一方端は、筒状部１２ａの内部に貯留されている第１培地１６に電気的に接続されている。電極１５ａの他方端は、蓋部材１３の外部に位置している。

【0034】

電極１５ｂは、電極挿入口１３ｆに挿入されている。これにより、電極１５ｂの一方端は、筒状部１２ａの内部に貯留されている第１培地１６に電気的に接続されている。電極１５ｂの他方端は、蓋部材１３の外部に位置している。

【0035】

電極１５ｃ及び電極１５ｄは、容器本体１１に埋設されている。より具体的には、電極１５ｃ及び電極１５ｄは、底壁１１ｂに埋設されている。電極１５ｃ及び電極１５ｄは、容器本体１１の内部に貯留されている第２培地１７に電気的に接続されている。電極１５ｃ及び電極１５ｄは、容器本体１１の外部に露出している。

【0036】

（実施形態に係る細胞培養システムの構成）
以下に、実施形態に係る細胞培養システム（以下においては、「細胞培養システム１００」とする）の構成を説明する。

【0037】

図５は、細胞培養システム１００の模式図である。図５に示されるように、細胞培養システム１００は、細胞培養容器１０と、培地容器２０と、培地容器３０と、チューブ４０と、チューブ５０と、ポンプ６０と、経上皮電気抵抗測定装置８０とを有している。細胞培養容器１０、培地容器２０、培地容器３０、チューブ４０、チューブ５０、ポンプ６０及び経上皮電気抵抗測定装置８０は、嫌気チャンバ９０内に収納されている。

【0038】

培地容器２０には、第１培地１６が貯留されている。チューブ４０は、一方端において培地容器２０に接続されており、他方端において培地導入口１３ｃに接続されている。これにより、筒状部１２ａの内部と培地容器２０とが、チューブ４０を介して接続されている。ポンプ６０は、チューブ４０に取り付けられている。ポンプ６０は、例えば、チューブポンプである。ポンプ６０を駆動することにより、培地容器２０に貯留されている第１培地１６が、チューブ４０を介して、培地導入口１３ｃから筒状部１２ａの内部に導入される。

【0039】

チューブ５０は、一方端において培地容器３０に接続されており、他方端において培地排出口１３ｄに接続されている。これにより、筒状部１２ａの内部と培地容器３０とが、チューブ５０を介して接続されている。ポンプ６０を駆動することにより、筒状部１２ａの内部に貯留されている第１培地１６は、培地排出口１３ｄから、チューブ５０を介して培地容器３０に排出される。すなわち、第１培地１６の培地容器３０への供給及び第１培地１６の培地容器３０からの回収は、ポンプ６０により行われる。

【0040】

経上皮電気抵抗測定装置８０は、第１端子と、第２端子とを有している。経上皮電気抵抗測定装置８０の第１端子は、電極１５ａ及び電極１５ｂに接続されている。経上皮電気抵抗測定装置８０の第２端子は、電極１５ｃ及び電極１５ｄに接続されている。経上皮電気抵抗測定装置８０は、電極１５ａ及び電極１５ｂと電極１５ｃ及び電極１５ｄとの間の電気抵抗値を、例えば、４端子法により測定する。

【0041】

第２主面１２ｂｂ上に培養されている細胞がタイトジャンクションを形成している場合とそうでない場合とで、電極１５ａ及び電極１５ｂと電極１５ｃ及び電極１５ｄとの間の電気抵抗値が変動する。そのため、経上皮電気抵抗測定装置８０を用いて上記の電気抵抗値を測定することにより、第２主面１２ｂｂ上に培養されている細胞がタイトジャンクションを形成しているか否かの判定が可能である。

【0042】

（実施形態に係る細胞培養容器の効果）
以下に、細胞培養容器１０の効果を説明する。

【0043】

細胞培養容器１０においては、培地導入口１３ｃを介して第１培地１６を筒状部１２ａの内部に導入することができるとともに、培地排出口１３ｄを介して第１培地１６を筒状部１２ａの外部に排出することができる。このように、細胞培養容器１０によると、第１培地１６を実験中に交換することにより筒状部１２ａの内部における細菌の過度の増殖を抑制することができるため、実験を長時間継続させることができる。

【0044】

第１培地１６を交換する結果、筒状部１２ａの内部には、第１培地１６とともに気泡が導入されることがある。また、筒状部１２ａの内部において、第１培地１６に含まれる細菌が、気泡を排出することがある。これらの気泡が電極１５ａ及び電極１５ｂに付着することにより、経上皮電気抵抗測定装置８０により測定される電気抵抗値に変動が生じる。すなわち、これらの気泡が電極１５ａ及び電極１５ｂに付着することにより、メンブレン１２ｂ上で培養されている細胞の状態を正確にモニタリングすることが困難になる。

【0045】

しかしながら、細胞培養容器１０においては、下面１３ｂが電極挿入口１３ｅ（電極挿入口１３ｆ）の下面１３ｂ側の端から培地排出口１３ｄの下面１３ｂ側の端に近づくにしたがってメンブレン１２ｂとの間の距離が大きくなっている。

【0046】

その結果、上記の気泡は、電極１５ａ（電極１５ｂ）に付着したとしても、浮力の作用により下面１３ｂに沿って培地排出口１３ｄに向かって移動し、培地排出口１３ｄから排出されやすい。このように、細胞培養容器１０によると、第１培地１６の交換を行いながらメンブレン１２ｂ上の細胞の状態を正確にモニタリングすることが可能となる。

【0047】

細胞培養容器１０において、下面１３ｂに凹部１３ｂａが形成されている場合、上記の気泡が凹部に集まりやすくなる。そのため、この場合には、培地排出口１３ｄから上記の気泡をさらに排出しやすくなる。

【0048】

また、細胞培養容器１０において、下面１３ｂが培地導入口１３ｃの下面１３ｂ側の端から培地排出口１３ｄの下面１３ｂ側の端に近づくにしたがってメンブレン１２ｂとの距離が大きくなっている場合、第１培地１６とともに培地導入口１３ｃから導入された気泡が、浮力の作用により下面１３ｂに沿って培地排出口１３ｄから排出されやすくなる。

【0049】

以上のように本発明の実施形態について説明を行ったが、上述の実施形態を様々に変形することも可能である。また、本発明の範囲は、上述の実施形態に限定されるものではない。本発明の範囲は、請求の範囲によって示され、請求の範囲と均等の意味及び範囲内での全ての変更を含むことが意図される。

【符号の説明】

【0050】

１００ 細胞培養システム、１０ 細胞培養容器、１１ 容器本体、１１ａ 上壁、１１ａａ 開口、１１ａｂ 起立部、１１ｂ 底壁、１１ｃ 側壁、１２ セルカルチャーインサート、１２ａ 筒状部、１２ｂ メンブレン、１２ｂａ 第１主面、１２ｂｂ 第２主面、１２ｃ フランジ部、１３ 蓋部材、１３ａ 上面、１３ｂ 下面、１３ｂａ 凹部、１３ｃ 培地導入口、１３ｄ 培地排出口、１３ｅ，１３ｆ 電極挿入口、１４ 蓋部材、１４ａ 開口、１５ａ，１５ｂ，１５ｃ，１５ｄ 電極、１６ 第１培地、１７ 第２培地、２０，３０ 培地容器、４０，５０ チューブ、６０ ポンプ、８０ 経上皮電気抵抗測定装置。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】