特許7416433標的指向性親和性ドメインに基づく膜タンパク質を含む細胞外小胞
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-01-09
(45)【発行日】2024-01-17
(54)【発明の名称】標的指向性親和性ドメインに基づく膜タンパク質を含む細胞外小胞
(51)【国際特許分類】
C12N 15/62 20060101AFI20240110BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240110BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240110BHJP
C12N 15/88 20060101ALI20240110BHJP
A61K 9/00 20060101ALN20240110BHJP
A61K 31/7088 20060101ALN20240110BHJP
A61K 38/00 20060101ALN20240110BHJP
A61K 48/00 20060101ALN20240110BHJP
【ＦＩ】
C12N15/62 Z
C12N5/10
C12N15/63 Z ZNA
C12N15/88 Z
A61K9/00
A61K31/7088
A61K38/00
A61K48/00
【請求項の数】
24
(21)【出願番号】P 2020555922
(86)(22)【出願日】2019-04-10
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2021-08-26
(86)【国際出願番号】 US2019026751
(87)【国際公開番号】W WO2019199941
(87)【国際公開日】2019-10-17
【審査請求日】2022-02-16
(31)【優先権主張番号】62/655,521
(32)【優先日】2018-04-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】500041019
【氏名又は名称】ノースウェスタン ユニバーシティ
(74)【代理人】
【識別番号】110003007
【氏名又は名称】弁理士法人謝国際特許商標事務所
(72)【発明者】
【氏名】レナード、ジョシュア、エヌ
(72)【発明者】
【氏名】ストランフォード、デヴィン、エム
【審査官】山▲崎▼ 真奈
(56)【参考文献】
【文献】特表２０２１－５０８６９１（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２０１７／００８７０８７（ＵＳ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１５／００２９５６（ＷＯ，Ａ１）
【文献】米国特許出願公開第２０１５／００５７１９１（ＵＳ，Ａ１）
【文献】米国特許出願公開第２０１５／００９３４３３（ＵＳ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１７／１３４１００（ＷＯ，Ａ１）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ
Ｃ０７Ｋ
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
標的指向性タンパク質を含む細胞外小胞であって、前記標的指向性タンパク質が、（ｉ）折り畳まれたタンパク質ドメインを含む親和性物質であって、前記親和性物質が前記細胞外小胞の表面で発現され、細胞外小胞の標的細胞への結合を促進する親和性物質と、
（ｉｉ）血小板由来増殖因子受容体の膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）であって、前記膜貫通ドメインは、融合タンパク質を細胞外小胞の膜に指向させ、前記親和性物質およびＴＭＤが、直接連結されるか、またはリンカーを介して間接的に連結される、膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）と、を含む融合タンパク質である、細胞外小胞。
【請求項2】
血小板由来増殖因子受容体のＴＭＤが、配列番号４０のアミノ酸配列、または配列番号４０と少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する変異体を含む、請求項１に記載の細胞外小胞。
【請求項3】
細胞外小胞がエキソソームまたは微小胞である、請求項１に記載の細胞外小胞。
【請求項4】
前記細胞外小胞が、リソソームから形成されるか、原形質膜からの出芽によって形成されるか、または他の細胞膜出芽プロセスによって形成される、請求項１に記載の細胞外小胞。
【請求項5】
親和性物質が、抗体の一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、ラクダのナノボディ、フィブロネクチンドメイン由来モノボディ、またはＤＡＲＰｉｎからなる群から選択される、請求項１に記載の細胞外小胞。
【請求項6】
前記融合タンパク質が、構造Ｎｔｅｒ－ＶＬ－Ｌ１－ＶＨ－Ｌ２－ＴＭＤ－ＣｔｅｒまたはＮｔｅｒ－ＶＨ－Ｌ１－ＶＬ－Ｌ２－ＴＭＤ－Ｃｔｅｒを有し、ＮｔｅｒがＮ末端であり、ＶＬが抗体の可変軽鎖断片であり、Ｌ１がグリシン、セリン、およびトレオニンから選択される１０～５０個のアミノ酸の第１のリンカーであり、ＶＨが抗体の可変重鎖断片であり、Ｌ２が１０～５０個のアミノ酸の第２のリンカーであり、ＴＭＤが血小板由来増殖因子受容体のＴＭＤであり、ＣｔｅｒがＣ末端である、請求項５に記載の細胞外小胞。
【請求項7】
前記１０～５０個のアミノ酸の第２のリンカーが、グリシン、セリン、およびトレオニンまたは配列番号４１～４６から選択される配列から選択される、請求項６に記載の細胞外小胞。
【請求項8】
Ｎ末端タンパク質タグ、Ｃ末端タンパク質タグ、またはＮ末端タンパク質タグおよびＣ末端タンパク質タグの両方をさらに含む、請求項１に記載の細胞外小胞。
【請求項9】
前記融合タンパク質が、（ｉｉｉ）操作されたグリコシル化部位をさらに含む、請求項５に記載の細胞外小胞。
【請求項10】
前記融合タンパク質が、Ｎｔｅｒ－ＶＬ－Ｌ１－ＶＨ－Ｌ２－ＥＧＳ－ＴＭＤ－（任意選択のＲＢＤ）－Ｃｔｅｒ、
Ｎｔｅｒ－ＶＬ－Ｌ１－ＶＨ－ＥＧＳ－Ｌ２－ＴＭＤ－（任意選択のＲＢＤ）－Ｃｔｅｒ、
Ｎｔｅｒ－ＶＨ－Ｌ１－ＶＬ－Ｌ２－ＥＧＳ－ＴＭＤ－（任意選択のＲＢＤ）－Ｃｔｅｒ、および
Ｎｔｅｒ－ＶＨ－Ｌ１－ＶＬ－ＥＧＳ－Ｌ２－ＴＭＤ－（任意選択のＲＢＤ）－Ｃｔｅｒ、
から選択される構造を有し、ＮｔｅｒがＮ末端であり、ＶＬが抗体の可変軽鎖断片であり、Ｌ１がグリシン、セリン、およびトレオニンから選択される１０～５０個のアミノ酸の第１のリンカーであり、ＶＨが抗体の可変重鎖断片であり、Ｌ２が１０～５０個のアミノ酸の第２のリンカーであり、ＥＧＳが操作されたグリコシル化部位であり、ＴＭＤが血小板由来増殖因子受容体のＴＭＤであり、ＲＢＤはＲＮＡ結合ドメインであり、ＣｔｅｒがＣ末端である、請求項９に記載の細胞外小胞。
【請求項11】
前記１０～５０個のアミノ酸の第２のリンカーが、グリシン、セリン、およびトレオニンまたは配列番号４１～４６から選択される配列から選択される、請求項１０に記載の細胞外小胞。
【請求項12】
前記グリコシル化部位が、配列番号３７および配列番号３８から選択される配列を含む、請求項９に記載の細胞外小胞。
【請求項13】
前記融合タンパク質が、（ｉｖ）エキソソーム標的指向性ドメインをさらに含む、請求項５に記載の細胞外小胞。
【請求項14】
前記融合タンパク質が、構造Ｎｔｅｒ－ＶＬ－Ｌ１－ＶＨ－Ｌ２－ＥＴＤ－ＴＭＤ－（任意選択のＲＢＤ）－Ｃｔｅｒ、
Ｎｔｅｒ－ＶＬ－Ｌ１－ＶＨ－Ｌ２－ＴＭＤ－ＥＴＤ－（任意選択のＲＢＤ）－Ｃｔｅｒ、
Ｎｔｅｒ－ＶＨ－Ｌ１－ＶＬ－Ｌ２－ＥＴＤ－ＴＭＤ－（任意選択のＲＢＤ）－Ｃｔｅｒ、および
Ｎｔｅｒ－ＶＨ－Ｌ１－ＶＬ－Ｌ２－ＴＭＤ－ＥＴＤ－（任意選択のＲＢＤ）－Ｃｔｅｒ、
を有し、ＮｔｅｒがＮ末端であり、ＶＬが抗体の可変軽鎖断片であり、Ｌ１がグリシン、セリン、およびトレオニンから選択される１０～５０個のアミノ酸の第１のリンカーであり、ＶＨが抗体の可変重鎖断片であり、Ｌ２が１０～５０個のアミノ酸の第２のリンカーであり、ＴＭＤが血小板由来増殖因子受容体のＴＭＤであり、ＥＴＤがエキソソーム標的指向性ドメインであり、ＲＢＤがＲＮＡ結合ドメインであり、ＣｔｅｒがＣ末端である、請求項１３に記載の細胞外小胞。
【請求項15】
前記１０～５０個のアミノ酸の第２のリンカーが、グリシン、セリン、およびトレオニンまたは配列番号４１～４６から選択される配列から選択される、請求項１４に記載の細胞外小胞。
【請求項16】
前記エキソソーム標的指向性ドメインが、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３１、および配列番号３４、配列番号３５、および配列番号３６からなる群から選択される配列、または配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３１、および配列番号３４、配列番号３５、および配列番号３６に対してそれぞれ少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するそれらの変異型を含む、請求項１３に記載の細胞外小胞。
【請求項17】
前記細胞外小胞が、小分子の治療薬、治療用ＲＮＡ、および治療用タンパク質または組み合わせからなる群から選択される治療薬をさらに含む、請求項１に記載の細胞外小胞。
【請求項18】
前記細胞外小胞が、カーゴＲＮＡとして治療用ＲＮＡをさらに含み、前記融合タンパク質が、前記カーゴＲＮＡのためのＲＮＡ結合ドメインをさらに含み、かつ／または前記細胞外小胞が、カーゴタンパク質として治療用タンパク質をさらに含み、前記融合タンパク質が、前記治療用タンパク質上の同族ドメインに結合するドメインをさらに含む、請求項１に記載の細胞外小胞。
【請求項19】
前記融合タンパク質が、構造：Ｎｔｅｒ－ＶＬ－Ｌ１－ＶＨ－ＴＭＤ－ＲＢＤ－ＣｔｅｒまたはＮｔｅｒ－ＶＨ－Ｌ１－ＶＬ－ＴＭＤ－ＲＢＤ－Ｃｔｅｒを有し、ＮｔｅｒがＮ末端であり、ＶＬが抗体の可変軽鎖断片であり、Ｌ１がグリシン、セリン、およびトレオニンから選択される１０～６０個のアミノ酸のリンカーであり、ＶＨが抗体の可変重鎖断片であり、ＴＭＤが血小板由来増殖因子受容体のＴＭＤであり、ＲＢＤが前記カーゴＲＮＡのための前記ＲＮＡ結合ドメインであり、ＣｔｅｒがＣ末端である、請求項１８に記載の細胞外小胞。
【請求項20】
前記カーゴＲＮＡが、融合タンパク質のＲＮＡ結合ドメインに結合するＲＮＡモチーフを含み、かつ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｎｃＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、またはこれらのＲＮＡのいずれかの組み合わせをさらに含む、ハイブリッドＲＮＡである、請求項１８に記載の細胞外小胞。
【請求項21】
前記融合タンパク質をコードするｍＲＮＡを真核細胞内で発現させることを含む、請求項１に記載の細胞外小胞の調製方法。
【請求項22】
（ａ）前記融合タンパク質をコードするｍＲＮＡを真核細胞内で発現させることと、（ｂ）前記カーゴＲＮＡを真核細胞内で発現させるか、もしくは前記カーゴＲＮＡで前記真核細胞を形質導入するか、または前記カーゴタンパク質を発現させるか、またはその両方と、を含む、請求項１８に記載の細胞外小胞の調製方法。
【請求項23】
（ａ）前記融合タンパク質を発現させるためのベクターと、（ｂ）前記カーゴＲＮＡまたは前記カーゴタンパク質を発現させるためのベクターと、を含む、請求項１８に記載の細胞外小胞を調製するためのキット。
【請求項24】
前記ベクターが別々のベクターである、請求項２３に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
連邦政府の支援による研究開発に関する声明
本発明は、政府の支援を受け、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈによる助成Ｐ３０ＡＩ１１７９４３のもと実施された。政府は本発明において一定の権利を有する。
本発明は、政府の支援を受け、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈによる助成Ｐ３０ＡＩ１１７９４３のもと実施された。政府は本発明において一定の権利を有する。
【0002】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年４月１０日に出願された米国仮特許出願第６２／６５５，５２１号に対する米国特許第１１９条（ｅ）に基づく優先権の利益を主張するものであり、その内容は参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１８年４月１０日に出願された米国仮特許出願第６２／６５５，５２１号に対する米国特許第１１９条（ｅ）に基づく優先権の利益を主張するものであり、その内容は参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【0003】
本発明の分野は、薬剤を標的細胞に送達するための脂質粒子の使用に関する。特に、本発明の分野は、一本鎖抗体ドメインなどの標的指向性親和性ドメインに基づく膜タンパク質を含有する、分泌細胞外小胞（ＥＶ）に関する。分泌細胞外小胞は、治療薬などの薬剤を標的細胞に送達するために利用され得る。
【0004】
分泌細胞外小胞、例えば、エキソソームおよび微小胞は、多くの細胞型によって産生され、ヒト体内の細胞間ならびに他の動物の細胞間でタンパク質、核酸、および他の分子を移動させるナノメートルスケールの脂質小胞である。特に標的化エキソソームには、多種多様な潜在的治療用途があり、既に、神経細胞および腫瘍細胞へのＲＮＡ送達に有効であることがマウスにおいて示されている。
【0005】
ここでは、標的指向性親和性ドメインに基づく膜タンパク質を、エキソソームおよび微小胞の表面にそれぞれ、エキソソームおよびミクロソームの形成を介して提示させる方法を記載する。本開示の技術は、抗体または抗体の抗原結合ドメインなどの親和性物質を利用して、標的指向性膜タンパク質のための親和性ドメインを提供する。特に、記載の技術により、ＥＶに局在して外部の親和性ドメインを示す操作されたタンパク質の発現を介した、ＥＶ表面での標的指向性タンパク質提示のための堅牢な方法が提供される。開示される標的指向性システムは、インビボでの標的遺伝子療法または標的薬物送達ビヒクルに使用するためのＥＶを操作するために使用することができる。したがって、開示される技術は、多種多様な細胞型および疾患に適用され得る標的化ＥＶを操作するために使用され得る。
【発明の概要】
【0006】
細胞外小胞を標的細胞、組織、または経路に指向させる操作された標的指向性タンパク質を含む細胞外小胞を開示する。操作された標的指向性タンパク質は、特定の経路を介して標的細胞の表面タンパク質のエンドサイトーシスに指向させることによって、標的細胞に細胞外小胞を指向させ得る。標的指向性タンパク質は融合タンパク質であり、ドメインとして、（ｉ）抗体の一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）などの親和性物質であって、ｓｃＦｖが細胞外小胞の表面で発現される親和性物質と、（ｉｉ）融合タンパク質を細胞外小胞の膜へと配向する膜貫通ドメインと、が最小限に含まれる。例示的な細胞外小胞には、エキソソームおよび微小胞が含まれ得るが、これらに限定されない。
【0007】
細胞外小胞の操作された標的指向性タンパク質または「融合タンパク質」には、追加のドメインがさらに含まれ得る。追加のドメインには、例えば、融合タンパク質が細胞内でグリコシル化されることを可能にする操作されたグリコシル化部位が含まれ得る。好ましくは、操作されたグリコシル化部位がグリコシル化される場合、融合タンパク質および／または融合タンパク質の構成要素ドメインが、融合タンパク質の切断および／またはリソソームでの分解から保護される。例えば、操作されたグリコシル化部位がグリコシル化される場合、好ましくは、ｓｃＦｖは、融合タンパク質の残部から切断されることから保護される。
【0008】
融合タンパク質の追加のドメインには、エキソソーム標的指向性ドメインが含まれ得る。好ましくは、エキソソーム標的指向性ドメインは、融合タンパク質をリソソームなどの細胞内小胞に指向させ、そこで、融合タンパク質がリソソームの膜内に組み込まれ、エキソソームなどの細胞外小胞に入って分泌され得る。
【0009】
融合タンパク質の追加のドメインには、微小胞標的指向性ドメインが含まれ得る。好ましくは、微小胞標的指向性ドメインは、融合タンパク質を細胞表面に指向させ、そこで、融合タンパク質が細胞膜内に組み込まれ、微小胞などの細胞外小胞に入って分泌され得る。
【0010】
細胞外小胞は、治療薬などの薬剤をさらに含み得、細胞外小胞は、含まれた薬剤を標的細胞に送達するために利用され得る。細胞外小胞により含まれる薬剤には、カーゴＲＮＡなどの生体分子、および他の小分子の治療用の分子またはタンパク質が含まれ得るが、これらに限定されない。例えば、融合タンパク質は、細胞外小胞が細胞から分泌される前に、融合タンパク質がパッケージングタンパク質として機能してカーゴＲＮＡを細胞外小胞内にパッケージングするよう、カーゴＲＮＡ上に存在する１つ以上のＲＮＡモチーフに結合するＲＮＡ結合ドメインをさらに含み得る。いくつかの実施形態では、パッケージングタンパク質は、細胞外小胞搭載タンパク質または「ＥＶ搭載タンパク質」と呼ばれ得る。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図1】ＨＩＶ感染を治癒させるための組み合わせによるｓｇＲＮＡ療法の概要。
【図2】組み合わせｓｇＲＮＡを受けるＣａｓ９発現ＳｕｐＴ１細胞におけるウイルス複製の抑制。（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．”Ａ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ Ａｔｔａｃｋ ｏｎ ＨＩＶ－１ ＤＮＡ Ｅｘｔｉｎｇｕｉｓｈｅｓ Ａｌｌ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｐｒｏｖｉｒｕｓ ｉｎ Ｉｎｆｅｃｔｅｄ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ，Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ，Ｖｏｌｕｍｅ １７，Ｉｓｓｕｅ １１，ｐ２８１９－２８２６，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ １３，２０１６を参照のこと。なお、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【図3】ＥＶ産生およびＥＶ媒介性生体分子送達の概要。（Ｓｔｒａｎｆｏｒｄ ａｎｄ Ｌｅｏｎａｒｄ，”Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｖｉａ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ：Ａ Ｂｕｄｄｉｎｇ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｓｔｒａｔｅｇｙ，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，９８：１５５－１７５，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ １１，２０１７を参照のこと。なお、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。産生：エキソソームは、エンドソーム膜の陥入により形成されて多胞体（ＭＶＢ）を形成し、ＭＶＢと原形質膜との逆融合によりエキソソームが細胞から放出される。微小胞は、原形質膜から直接出芽することによって形成される。どちらの種類の小胞にも、産生細胞由来のＲＮＡおよびタンパク質が組み込まれるが、エキソソームでは、エンドソーム膜タンパク質が豊富になっている。取り込み：ＥＶは、レシピエント細胞による様々なエンドサイトーシス経路によって、または細胞表面での直接融合によって取り込まれ得る。カーゴ送達：レシピエント細胞の細胞質中へのＥＶカーゴの放出には、エンドソーム区画または原形質膜のいずれかにおけるＥＶと細胞膜との間の融合を必要とする。融合ができない場合、エンドソーム－リソソーム経路を介してＥＶおよびそれらのカーゴの分解が生じる。
【図4】ＥＶに媒介されるＣａｓ９および組み合わせｓｇＲＮＡのＴ細胞への送達ならびにＣａｓ９に媒介される潜伏感染Ｔ細胞でのＨＩＶプロウイルスの切断についての概略図。
【図5】潜伏感染Ｔ細胞などのＣＤ２担持細胞にＥＶを指向させる抗ＣＤ２ ｓｃＦｖを提示するＥＶの概略図。
【図6】ＥＶを、ＣＤ４６担持細胞およびシグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭ）担持細胞（ＳＬＡＭ担持）に指向させる、麻疹ウイルス糖タンパク質変異型のＨおよびＦを提示するＥＶの概略図。
【図7】ＥＶを、活性化Ｔ細胞などのリンパ球機能関連抗原１（ＬＦＡ－１）担持細胞に指向させる細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ－１）を提示するＥＶの概略図。
【図8】ＥＶにＣａｓ９およびｓｇＲＮＡを搭載する方法。
【図9】抗ＣＤ２ ｓｃＦｖのＥＶへの局在化（Ｎ末端検出）。ＰＤＧＦＲ膜貫通ドメインに融合させたＦＬＡＧタグ付きＣＤ２ ｓｃＦｖ、またはＥＶ提示対照としての、ＰＤＧＦＲ膜貫通ドメインに融合させたＦＬＡＧタグのいずれかをコードする構成体をＨＥＫ２９３ＦＴ細胞にトランスフェクトした。細胞溶解物（２μｇ）またはＥＶ（レーンあたり８．９×１０８）を搭載し、構成体を抗ＦＬＡＧ抗体によって検出した（ＦＬＡＧタグは、すべての提示構成体のＮ末端に位置する）。レーン９およびレーン１０の陽性シグナルは、微小胞およびエキソソームの両方についてタンパク質のＮ末端（ＥＶ表面上のｓｃＦｖドメインが含まれている）が検出されることを示す。
【図10】抗ＣＤ２ ｓｃＦｖのＥＶへの局在化（Ｃ末端検出）。ＰＤＧＦＲ膜貫通ドメインに融合させたＦＬＡＧタグ付きＣＤ２ ｓｃＦｖ、またはＥＶ提示対照としての、ＰＤＧＦＲ膜貫通ドメインに融合させたＦＬＡＧタグのいずれかをコードする構成体をＨＥＫ２９３ＦＴ細胞にトランスフェクトした。細胞溶解物（２μｇ）またはＥＶ（レーンあたり８．９×１０８）を搭載し、構成体を抗ＨＡ抗体（Ｃ末端に位置するＨＡタグ）によって検出した。レーン９およびレーン１０の陽性シグナルは、微小胞およびエキソソームの両方についてタンパク質のＣ末端（細胞内ＨＡタグが含まれている）が検出されることを示す。
【図11】Ｃａｓ９搭載ＥＶおよびｓｇＲＮＡ搭載ＥＶ、ならびにレシピエントＴ細胞への機能的送達の概略図。
【発明を実施するための形態】
【0012】
本発明は、以下および本出願を通じて記載される、いくつかの定義を使用して本明細書に記載される。
【0013】
他に指定されるか、または文脈によって指示されない限り、用語「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、「１つ以上」を意味する。例えば、「融合タンパク質」、「ＲＮＡ」、および「ループ」はそれぞれ、「１つ以上の融合タンパク質」、「１つ以上のＲＮＡ」、および「１つ以上のループ」を意味すると解釈されるべきである。「操作されたグリコシル化部位」は、「１つ以上の操作されたグリコシル化部位」を意味すると解釈されるべきである。
【0014】
本明細書で使用する場合、「約」、「およそ」、「実質的に」、および「顕著に」は、当業者によって理解され、それらが使用される文脈によってある程度異なる。これらの用語が使用される文脈を考慮して、それらの用語の使用で当業者に明らかではないものがある場合、「約」および「およそ」は、特定の用語のプラスまたはマイナス１０％以下を意味し、「実質的に」および「顕著に」は、特定の用語のプラスまたはマイナス１０％超を意味する。
【0015】
本明細書で使用する場合、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と同じ意味を有し、これにおいて、これらの後者の用語は、これらの移行用語に続く記述の要素のみに特許請求の範囲を限定しない「オープン」な移行用語である。「からなる」という用語は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語に包含されるが、この移行用語に続く記述の要素のみに特許請求の範囲を限定する「クローズド」な移行用語として解釈されるべきである。用語「から本質的になる」は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語に包含されるが、この移行用語に続く追加要素を許可する「部分的クローズド」な移行用語として解釈されるべきであるが、ただし、それらの追加要素が特許請求の範囲の基本的かつ新規な特徴に実質的に影響を及ぼさない場合に限る。
【0016】
細胞外小胞を標的細胞に指向させる標的指向性タンパク質を含む細胞外小胞を開示する。例示的な細胞外小胞にはエキソソームが含まれ得るが、これに限定されない。しかしながら、「細胞外小胞」という用語は、リソソームから形成される分泌小胞または原形質膜からの出芽によってもしくは細胞膜の他の出芽プロセスによって分泌される小胞などの、細胞により分泌される全てのナノメートルスケールの脂質小胞が含まれると解釈されるべきである。
【0017】
開示の細胞外小胞は、「標的指向性タンパク質」を含む。標的タンパク質は、「融合タンパク質」として記載される場合があり、「標的指向性タンパク質」および「融合タンパク質」という用語は、文脈に応じて本明細書において互換的に使用され得る。融合タンパク質には、典型的には、（ｉ）細胞外小胞の表面に発現され、好ましくは細胞外小胞を標的細胞に指向させる、抗体（ｓｃＦｖ）の一本鎖可変断片などの親和性物質と、（ｉｉ）融合タンパク質を細胞外小胞の膜へと好ましく配向する膜貫通ドメインと、が含まれる。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は管腔または細胞外のＮ末端と細胞質Ｃ末端とを有する。
【0018】
「親和性物質」とは、ＥＶが標的細胞と特異的に結合することを促進する部分が含まれることを意味する。好ましい部分は、タンパク質ドメイン（好ましくは折り畳まれたタンパク質ドメイン）であり、折り畳まれていないペプチドではない。親和性物質の実例には、ｓｃＦｖ、ラクダのナノボディ、フィブロネクチンドメイン由来モノボディ、およびＤＡＲＰｉｎｓが含まれる（ただし、これらに限定されない）（Ｋｏｉｄｅ Ａ，Ｋｏｉｄｅ Ｓ，２００７、Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ：ａｎｔｉｂｏｄｙ ｍｉｍｉｃｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｓｃａｆｆｏｌｄ ｏｆ ｔｈｅ ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ ｔｙｐｅ ＩＩＩ ｄｏｍａｉｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３５２：９５－１０９、Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ：Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｉｎｇｌｅ－Ｄｏｍａｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ ８２：７７５－７９７，２０１３、Ｄｅｓｉｇｎｅｄ Ａｎｋｙｒｉｎ Ｒｅｐｅａｔ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（ＤＡＲＰｉｎｓ）：Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ，ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｎｎ Ｒｅｖ ｏｆ Ｐｈａｒｍ Ｔｏｘ，Ｖｏｌ ５５：４８９－５１１，２０１５を参照のこと）。
【0019】
開示の細胞外小胞の融合タンパク質には、典型的には、ｓｃＦｖなどの一本鎖抗体が含まれる。一本鎖抗体は、重鎖可変ドメイン断片と軽鎖可変ドメイン断片（Ｆｖ領域）とをアミノ酸リンカーを介して連結し、単一のポリペプチド鎖をもたらすことによって形成され得る。かかる一本鎖Ｆｖまたは「ｓｃＦｖ」は、２つの可変ドメインポリペプチド（ＶＬおよびＶＨ）をコードするＤＮＡの間に、ペプチドリンカーをコードするＤＮＡを融合させることによって調製されている。ＶＬ断片のカルボキシ末端は、ＶＨ断片のアミノ末端にリンカーを介してインフレームで融合され得、逆もまた同様であり、ＶＨ断片のカルボキシ末端は、ＶＬ断片のアミノ末端にリンカーを介してインフレームで融合され得る。得られたポリペプチドは、２つの可変ドメイン間の可動性リンカーの長さに応じて、自己の折り畳みに戻って抗原結合モノマーを形成することができ、また多量体（例えば、二量体、三量体、または四量体）を形成することもできる（Ｋｏｒｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．１０：４２３、Ｋｏｒｔｔ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｂｉｏｍｏｌ．Ｅｎｇ．１８：９５－１０８）。リンカーは、通常、１０～５０個のアミノ酸長であり、可動性のためにグリシンが、また溶解性のためにセリンもしくはトレオニンが豊富であり、ＶＬのＮ末端とＶＨのＣ末端とを接続するか、またはその逆が可能である。ＶＬドメインとＶＨドメインとの間のリンカーは、グリシンおよびセリン（および／またはトレオニン）が豊富であり得るため、ＶＬドメインとＶＨドメインとの間のリンカーは、「ＧＳ」リンカーと呼ばれる場合がある。好適なＧＳリンカーには、ＧＬＧＳＧＳＧＧＳＳ（配列番号４１）またはＧＳＧＳＧＳＧＧＳＳ（配列番号４２）のような１０個のアミノ酸を有するＧＳリンカー、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４３）のような１５個のアミノ酸を有するＧＳリンカー、およびＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧ（配列番号４４）のような４０個のアミノ酸を有するＧＳリンカーが含まれ得るが、これらに限定されない。ＶＬドメインとＶＨドメインとの間のリンカーは、本明細書ではＬ１リンカーと呼ばれる場合があり、これは、以下に考察されるＬ２リンカーとは区別される。
【0020】
異なるＶＬおよびＶＨを組み合わせて連結することによって、ダイアボディ、トリボディ、およびテトラボディなど、異なるエピトープに結合する多量体ｓｃＦｖを形成することができる。（Ｋｒｉａｎｇｋｕｍ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｂｉｏｍｏｌ．Ｅｎｇ．１８：３１－４０）。一本鎖抗体の産生のために開発された技法には、米国特許第４，９４６，７７８号、Ｂｉｒｄ，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３、Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９、Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５４４，ｄｅ Ｇｒａａｆ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７８：３７９－８７に記載されているものが含まれ、その内容は参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。多量体ｓｃＦｖは、単一特異性（すなわち、単一のエピトープに特異的）または多重特異性（すなわち、２つ以上のエピトープに特異的を有する）であり得る。
【0021】
融合タンパク質の親和性物質、例えば、ｓｃＦｖは、典型的には、標的細胞の表面に存在するエピトープに結合する。融合タンパク質のｓｃＦｖは、典型的には、融合タンパク質の管腔末端に存在し、任意選択で、融合タンパク質のＮ末端であり得る。例えば、融合タンパク質は、以下の構造：Ｎｔｅｒ－シグナルペプチド－ｓｃＦＶ－膜貫通ドメイン－Ｃｔｅｒを含み得る。
【0022】
開示の細胞外小胞の融合タンパク質には、典型的には、膜貫通ドメインが含まれる。膜貫通ドメインは当該技術分野で既知である。膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）は、主に非極性アミノ酸残基からなっており、二重層を１回（単回通過）または数回通過し得る。ＴＭＤは通常、αヘリックスからなる。ペプチド結合は極性であり、カルボニルの酸素原子とアミドの窒素原子との間に形成される、水和され得る内部水素結合を含むことができる。水が本質的に除外される脂質二重層内部では、ペプチドは、それらの内部水素結合を最大化するために、通常、αヘリックス構造を採る。１８～２１個のアミノ酸残基であるヘリックスの長さは、通常、脂質二層の通常の幅にまたがるのに十分である。細胞質外Ｎ末端と細胞質Ｃ末端で配向されるＴＭＤはＩ型ＴＭＤとして分類され、細胞質外Ｃ末端と細胞質Ｎ末端で配向されるＴＭＤはＩＩ型ＴＭＤとして分類される。開示のｅ細胞質外のいくつかの実施形態では、それらはＩ型として分類され、または細胞質の場合はＩＩ型として分類される。いくつかの実施形態では、開示の細胞外小胞の融合タンパク質は、１８～２１個のアミノ酸を含む、１回通過のＩ型膜貫通ドメインであり、アミノ酸の少なくとも約９０％は非極性である。開示の融合タンパク質に好適なＴＭＤには、細胞受容体の膜貫通ドメイン、例えば、血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）などが含まれ得、その配列を配列番号４０として提供する。ＴＭＤは、親和性物質（ａｓｃＦｖなど）に直接連結され得るか、またはＴＭＤは、本明細書においてＬ２と呼ばれるリンカーを介して連結され得る。（すなわち、融合タンパク質が、ＶＬとＶＨとの間のリンカー（Ｌ１）、およびＶＨとＴＭＤとの間のリンカー（Ｌ２）を含む場合）。Ｌ２に好適な連結配列には、グリシン、セリン（および／もしくはトレオニン）から選択される約１０～５０個のアミノ酸を含むアミノ酸配列（例えば、いわゆるＧＳリンカー）、または免疫グロブリン中に存在するヘリカルリンカーおよびヒンジリンカーなどの他の連結配列が含まれ得る。好適なＧＳリンカーには、ＧＬＧＳＧＳＧＧＳＳ（配列番号４１）またはＧＳＧＳＧＳＧＧＳＳ（配列番号４２）のような１０個のアミノ酸を有するＧＳリンカー、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４３）のような１５個のアミノ酸を有するＧＳリンカー、およびＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧ（配列番号４４）のような４０個のアミノ酸を有するＧＳリンカーが含まれ得るが、これらに限定されない。好適なヘリカルリンカーには、ＤＱＳＮＳＥＥＡＫＫＥＥＡＫＫＥＥＡＫＫＳＮＳ（配列番号４５）が含まれ得るが、これに限定されない。好適なヒンジリンカーには、アミノ酸配列ＥＳＫＹＧＰＰＡＰＰＡＰ（配列番号４６）を有するＩｇＧ４のヒンジリンカーが含まれ得る。他の好適なリンカーは、制限部位に由来する隣接配列、例えば、ヘリカルリンカー：ＴＧＤＱＳＮＳＥＥＡＫＫＥＥＡＫＫＥＥＡＫＫＳＮＳＩＤ（配列番号４７）、ＩｇＧ４ヒンジリンカー：ＴＧＥＳＫＹＧＰＰＡＰＰＡＰＩＤ（配列番号４８）、４０ＧＳリンカー：ＴＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＩＤ（配列番号４９）、１０ＧＳリンカー：ＴＧＧＬＧＳＧＳＧＧＳＳＩＤまたはＴＧＧＳＧＳＧＳＧＧＳＳＩＤ（配列番号５０および５１）、１５ＧＳリンカー：ＴＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＩＤ（配列番号５２）を有し得る。
【0023】
開示の細胞外小胞の融合タンパク質には、任意選択で、融合タンパク質を検出または単離するために利用することができる操作されたタグが含まれ得る。例えば、融合タンパク質には、そのＮ末端、Ｃ末端、またはその両方において、ＦＬＡＧエピトープ（配列番号３９）などの人工エピトープが含まれ得る。他の好適な操作されたタグには、４～１０個のヒスチジン残基を含むヒスチジンタグ、または９個のアミノ酸を含むヘマグルチニン（ＨＡ）タグが含まれ得る。
【0024】
開示の細胞外小胞の融合タンパク質には、任意選択で、操作されたグリコシル化部位（ＥＧＳ）（例えば、融合タンパク質のドメインのアミノ酸配列のいずれでも天然には生じない異種グリコシル化部位）が含まれ得る。融合タンパク質の操作されたグリコシル化部位は、融合タンパク質が細胞内で発現される際に、酵素的Ｎ－連結型グリコシル化の標的であるアミノ酸の配列として定義され得る。操作されたグリコシル化部位は、融合タンパク質のｓｃＦｖに隣接して存在し得る（例えば、Ｎｔｅｒ－シグナルペプチド－ｓｃＦｖ－操作されたグリコシル化部位（ＥＧＳ）－ＴＭＤ－Ｃｔｅｒ）。好ましくは、操作されたグリコシル化部位がグリコシル化される場合、融合タンパク質または融合タンパク質の構成要素ドメインは、融合タンパク質からの切断および／またはリソソームでの分解から保護される。（Ｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ．、およびＳｃｈｕｌｚを参照のこと）。例えば、融合タンパク質には、融合タンパク質および／もしくは融合タンパク質の構成要素ドメインがタンパク質分解により融合タンパク質から切断されること、または細胞内タンパク質分解などで分解されることから保護もしくは阻害するために、グリコシル化モチーフが含まれ得、かつ／あるいはグリコシル化モチーフが含まれるよう操作され得る。（Ｋｕｎｄｒａ ｅｔ ａｌ．を参照のこと）。好適なグリコシル化モチーフには、ＮＸ（Ｓ／Ｔ）コンセンサスシークオン、特にＮＳＴシークオン（配列番号３７）が含まれ得る。いくつかの実施形態では、融合タンパク質には、ＧＮＳＴＭシークオン（配列番号３８）が含まれ得る。ＮＳＴ配列は、既知のＮ－結合連結型グリコシル化シークオンであり、シークオンに隣接するアミノ酸Ｇおよびアミノ酸Ｍは、哺乳類におけるグリコシル化頻度を増加させ得る。（Ｂａｎｏ－Ｐｏｌｏ ｅｔ ａｌ．を参照のこと）。グリコシル化部位は、典型的には「操作されている」とは、グリコシル化部位が、典型的には、融合タンパク質または融合タンパク質のいずれの構成タンパク質にも天然では存在せず、むしろ、融合タンパク質に、例えば、組換え操作によって導入されることを意味する。
【0025】
開示の細胞外小胞の融合タンパク質には、任意選択で、エキソソーム標的指向性ドメイン（ＥＴＤ）が含まれ得る。融合タンパク質のエキソソーム標的指向性ドメインには、エキソソーム関連タンパク質および／またはリソソーム関連タンパク質のドメインが含まれ得るが、これらに限定されない。エキソソームタンパク質、ＲＮＡ、および脂質のデータベースは、ＥｘｏＣａｒｔａによりそのウェブサイトで提供されている。（２０１１年１０月１１日にオンラインで公開され、その内容が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｍａｔｈｉｖａｎａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１２，Ｖｏｌ．４０，Ｄａｔａｂａｓｅ ｉｓｓｕｅ Ｄ１２４１－１２４４も参照のこと）。好適なエキソソーム関連タンパク質は、エキソソーム小胞に富むタンパク質または（ＥＥＰ）としても記載され得る記載されている。（Ｈｕｎｇ ａｎｄ Ｌｅｏｎａｒｄ，”Ａ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ａｃｔｉｖｅｌｙ ｌｏａｄｉｎｇ ｃａｒｇｏ ＲＮＡ ｔｏ ｅｌｕｃｉｄａｔｅ ｌｉｍｉｔｉｎｇ ｓｔｅｐｓ ｉｎ ＥＶ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，”Ｊ．Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ，２０１６，５：３１０２７（２０１６年５月１３日発刊）を参照のこと。なお、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態では、リソソーム関連タンパク質の好適なドメインには、管腔Ｎ末端および細胞質Ｃ末端を有するリソソーム膜タンパク質由来のドメインが含まれ得るが、異なる配向を有する膜タンパク質も好適であり得る（例えば、管腔Ｃ末端および細胞質Ｎ末端を有する膜タンパク質）。
【0026】
開示の細胞外小胞の融合タンパク質には、任意選択で、微小胞標的指向性ドメインが含まれ得る。微小胞標的指向性ドメインは、融合タンパク質を細胞表面に指向させ得、そこで、融合タンパク質は細胞膜に組み込まれ、微小胞などの細胞外小胞として分泌され得る。微小胞標的指向性ドメインには、血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）が含まれるＧタンパク質共役受容体（ＧＣＲ）のような細胞表面受容体のドメインが含まれる細胞表面タンパク質のドメインが含まれ得る。いくつかの実施形態では、本明細書で企図される「微小胞標的指向性ドメイン」は、「細胞表面標的指向性ドメイン」である。細胞表面標的指向性ドメインは当該技術分野で既知である。
【0027】
本明細書に開示の融合タンパク質のいくつかの実施形態では、融合タンパク質にはエキソソーム標的指向性ドメインが含まれ、エキソソーム標的指向性ドメインはＬＡＭＰのエキソソーム標的指向性ドメインである。好適なＬＡＭＰには、ＬＡＭＰ－１およびＬＡＭＰ－２、ならびにそれらのアイソフォームが含まれ得るが、これらに限定されない。（Ｆｕｋｕｄａ ｅｔ ａｌ．，”Ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｃＤＮＡｓ Ｅｎｃｏｄｉｎｇ Ｈｕｍａｎ Ｌｙｓｏｓｏｍａｌ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ，ｈ－ｌａｍｐ－１ ａｎｄ ｈ－ｌａｍｐ－２，”Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２６３，Ｎｏ．３５ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ １９８８，ｐｐ．１８９２０－１８９２８、およびＦｕｋｕｄａ，”Ｌｙｓｏｓｏｍａｌ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ，”Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２６６，Ｎｏ．３２，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ １９９１，ｐｐ．２１３２７，２１３３０を参照のこと）。ＬＡＭＰは、管腔（すなわち、細胞質外）Ｎ末端および細胞質Ｃ末端を有するリソソーム膜タンパク質である。（同文献を参照のこと）。ＬＡＭＰを発現させるためのｍＲＮＡは、アイソフォームを与えるために様々に処理され得る。例えば、ＬＡＭＰ－２ａ、ＬＡＭＰ－２ｂ、およびＬＡＭＰ－２ｃと表わされるＬＡＭＰ－２には３つのアイソフォームがある。（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｄａｔａｂａｓｅ，ｅｎｔｒｙ ｎｕｍｂｅｒ Ｐ１３４７３－ＬＡＭＰ２＿ＨＵＭＡＮを参照のこと。なお、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。ＬＡＭＰ－１は単一のアイソフォームを有する。（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｄａｔａｂａｓｅ，ｅｎｔｒｙ ｎｕｍｂｅｒ Ｐ１１２７９－ＬＡＭＰ１＿ＨＵＭＡＮを参照のこと。なお、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。ＬＡＭＰ－２ａ、ＬＡＭＰ－２ｂ、およびＬＡＭＰ－２ｃの完全長アミノ酸配列はそれぞれ、本明細書では配列番号２０、２１、および２２として提供される。ＬＡＭＰ－１の完全長アミノ酸配列は、本明細書では配列番号２６として提供される。本明細書に開示の融合タンパク質には、ＬＡＭＰの完全長アミノ酸配列、もしくはその変異型であって、野生型ＬＡＭＰのアミノ酸配列と比較して、あるパーセンテージの配列同一性を有することが本明細書で企図されるような変異型、またはそれらの断片であって、野生型ＬＡＭＰの一部を含む断片（例えば、ＬＡＭＰ－２ａ、ＬＡＭＰ－２ｂ、ＬＡＭＰ－２ｃ、およびＬＡＭＰ－１のＣ末端の一部を含む、それぞれ、配列番号２３、２４、２５、および２７）が含まれ得る。
【0028】
ＬＡＭＰでは、Ｃ末端（例えば、１０～１１個のＣ末端アミノ酸を含む）は、ＬＡＭＰをリソソームに指向させるために重要であることが示されている。（同文献およびＦｕｋｕｄａ １９９１を参照のこと）。開示の細胞外小胞のいくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号２３、２４、２５、および２７のうちの１つのＣ末端に融合されたＲＮＡ結合ドメインを含み、それぞれＬＡＭＰ－２ａ、ＬＡＭＰ－２ｂ、ＬＡＭＰ－２ｃ、およびＬＡＭＰ－１のＣ末端の一部を含む）。融合タンパク質には、ＬＡＭＰの細胞質ドメインが含まれ得、任意選択で、追加のアミノ酸配列（例えば、膜貫通ドメインの少なくとも一部および／または管腔ドメインの少なくとも一部）が含まれ得る。
【0029】
いくつかの実施形態では、エキソソーム標的指向性ドメインは、ＬＩＭＰのエキソソーム標的指向性ドメインである。好適なＬＩＭＰには、ＬＩＭＰ－１（ＣＤ６３）およびＬＡＭＰ－２、ならびにそれらのアイソフォームが含まれ得るが、これらに限定されない。ＬＩＭＰは、１つ以上の管腔ドメイン、複数の膜貫通ドメイン、および細胞質Ｃ末端を有するリソソーム膜タンパク質である。（Ｏｇａｔａ ｅｔ ａｌ．，”Ｌｙｓｏｓｏｍａｌ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ Ｌｉｍｐ ＩＩ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｑｕｉｒｅｓ ａ Ｎｏｖｅｌ Ｌｅｕ－Ｉｌｅ Ｍｏｔｉｆ ａｔ ａ Ｐａｒｔｉｃｕｌａｒ Ｐｏｓｉｔｉｏｎ ｉｎ Ｉｔｓ Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ Ｔａｉｌ，”Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２６９，Ｎｏ．７，Ｆｅｂｒｕａｒｙ １９９４，ｐｐ．５２１０－５２１７を参照のこと）。ＬＩＭＰを発現させるためのｍＲＮＡは、アイソフォームを与えるために様々に処理され得る。例えば、ＬＩＭＰ－１ａ、ＬＩＭＰ－１ｂ、およびＬＩＭＰ－１ｃとして表わされるＬＩＭＰ－１には３つのアイソフォームがあり、ＬＩＭＰ－２ａおよびＬＩＭＰ－２ｂとして表わされるＬＩＭＰ－２には２つのアイソフォームがある。（ＵｎｉＰｒｏｔデータベース、エントリ番号Ｑ１０１４８－ＳＣＲＢ２＿ＨＵＭＡＮ、およびＵｎｉＰｒｏｔデータベース、エントリ番号Ｐ０８９６２－ＣＤ６３＿ＨＵＭＡＮを参照のこと。なお、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。ＬＩＭＰ－１ａ、ＬＩＭＰ－１ｂ、およびＬＩＭＰ－１ｃの完全長アミノ酸配列はそれぞれ、本明細書では配列番号２８、２９、および３０として提供される。ＬＩＭＰ－２ＡおよびＬＩＭＰ－２ｂの完全長アミノ酸配列はそれぞれ、本明細書では配列番号３２および３３として提供される。本明細書に開示の融合タンパク質には、ＬＩＭＰの完全長アミノ酸配列、もしくはその変異型であって、野生型ＬＩＭＰのアミノ酸配列と比較して、あるパーセンテージの配列同一性を有することが本明細書で企図されるような変異型、またはそれらの断片であって、野生型ＬＩＭＰの一部を含む断片（例えば、ＬＩＭＰ－１ａ、ＬＩＭＰ－１ｂ、ＬＩＭＰ－１Ｃ、ならびにＬＩＭＰ－２ａおよびＬＩＭＰ－２ｂのＣ末端の一部を含む配列番号３４のＣ末端の一部を含む配列番号３１）が含まれ得る。
【0030】
ＬＩＭＰでは、Ｃ末端（例えば、１４～１９個のＣ末端アミノ酸を含む）は、ＬＡＭＰをリソソームに指向させるために重要であることが示されている。（Ｏｇａｔａ ｅｔ ａｌ．を参照のこと）。開示の細胞外小胞のいくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号３１および３４のいずれか１つのＣ末端に融合されたＲＮＡ結合ドメインを含み、ＬＩＭＰ－１ａ、ＬＩＭＰ－１ｂ、ＬＩＭＰ－１ｃ、ならびにＬＩＭＰ－２ａおよびＬＩＭＰ－２ｂのＣ末端の一部を含む）。融合タンパク質には、ＬＩＭＰの細胞質ドメインが含まれ得、任意選択で、追加のアミノ酸配列（例えば、膜貫通ドメインの少なくとも一部および／または管腔ドメインの少なくとも一部）が含まれ得る。
【0031】
本明細書に開示の融合タンパク質のいくつかの実施形態では、エキソソーム標的指向性ドメインは、ＣＤ６３のエキソソーム標的指向性ドメインまたはそのアイソフォームである。別の方法では、ＣＤ６３タンパク質は、リソソーム組み込み膜タンパク質１（ＬＩＭＰ－１）、ＭＬＡ１、リソソーム関連膜タンパク質３、眼黒色腫関連抗原、黒色腫１抗原、黒色腫関連抗原ＭＥ４９１、テトラスパニン－３０、グラニュロフィジン（Ｇｒａｎｕｌｏｐｈｙｓｉｎ）、およびＴｓｐａｎ－３０などの別名で言及され得る。ＣＤ６３のアイソフォームには、ＣＤ６３アイソフォームＡ（すなわち、ＬＩＭＰ－１ａ（配列番号２８））、ＣＤ６３アイソフォームＣ（すなわち、ＬＩＭＰ－１ｂ（配列番号２９））、およびＣＤ６３アイソフォームＤ前駆体（本明細書では配列番号３５として提供）が含まれ得る。
【0032】
本明細書に開示の融合タンパク質のいくつかの実施形態では、エキソソーム標的指向性ドメインは、ウイルス膜貫通タンパク質のエキソソーム標的指向性ドメインである。ウイルス膜貫通タンパク質は当該技術分野で既知である。（例えば、Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｓｉｘｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，２０１３を参照のこと。また、Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００８；４３（３）：１８９－２１９も参照のこと）。具体的には、エキソソーム標的指向性ドメインは、水疱性口内炎ウイルスのＧ糖タンパク質（ＶＳＶ Ｇ－タンパク質）のエキソソーム標的指向性ドメインであり得る。ＶＳＶ Ｇ－タンパク質のアミノ酸配列は、本明細書では配列番号３６として提供される。
【0033】
開示の細胞外小胞は、治療薬などの薬剤をさらに含み得、細胞外小胞が薬剤を標的細胞に送達する。細胞外小胞により含まれる薬剤には、治療薬物（例えば、小分子薬物）、治療用タンパク質、および治療用核酸（例えば、治療用ＲＮＡ）が含まれ得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、開示の細胞外小胞は、治療用ＲＮＡを、いわゆる「カーゴＲＮＡ」として含む。例えば、いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、細胞外小胞が細胞から分泌される前に、カーゴＲＮＡ内に存在する１つ以上のＲＮＡモチーフに結合して、カーゴＲＮＡを細胞外小胞にパッケージングするＲＮＡ－ドメイン（例えば、融合タンパク質の細胞質Ｃ末端）をさらに含み得る。したがって、融合タンパク質は、「標的指向性タンパク質」としても、また「パッケージングタンパク質」としても機能し得る。いくつかの実施形態では、パッケージングタンパク質は、細胞外小胞搭載タンパク質または「ＥＶ搭載タンパク質」とも呼ばれ得る。（Ｈｕｎｇ ａｎｄ Ｌｅｏｎａｒｄ，”Ａ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ａｃｔｉｖｅｌｙ ｌｏａｄｉｎｇ ｃａｒｇｏ ＲＮＡ ｔｏ ｅｌｕｃｉｄａｔｅ ｌｉｍｉｔｉｎｇ ｓｔｅｐｓ ｉｎ ＥＶ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，”Ｊ．Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ，２０１６，５：３１０２７（２０１６年５月１３日発刊）を参照のこと。なお、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【0034】
要約すると、いくつかの実施形態では、開示の細胞外小胞の融合タンパク質は、Ｎｔｅｒ－シグナルペプチド－（任意選択のタグ）－ＶＬ－Ｌ１－ＶＨ－（任意選択の１つ以上のＥＧＳおよび／または任意の１つ以上のリンカーＬ２を任意の順序で）－ＴＭＤ－（任意選択のＥＴＤ）－（任意選択のＲＢＤ）－（任意選択のタグ）－Ｃｔｅｒ、またはＮｔｅｒ－シグナルペプチド－（任意選択のタグ）－ＶＬ－Ｌ１－ＶＨ（任意選択の１つ以上のＥＧＳおよび／または１つ以上のリンカーＬ２を任意の順序で）－ＴＭＤ－（任意選択のＥＴＤ）－（任意選択のＲＢＤ）－（任意選択のタグ）－Ｃｔｅｒとして特徴付けられる構造を有し得、その場合、ＮｔｅｒがＮ末端であり、ＶＬが抗体の可変軽鎖断片であり、Ｌ１がグリシン、セリン、およびトレオニンから選択される約１０～５０個のアミノ酸のリンカー（例えば配列番号４１、４２、４３、または４４）であり、ＶＨが抗体の可変重鎖断片であり、ＥＧＳが任意選択で操作されたグリコシル化部位であり、Ｌ２が約１０～５０個のアミノ酸のリンカー（例えば配列番号４１、４２、４３、４４、４５、または４６）であり、ＴＭＤが膜貫通ドメインであり、ＥＴＤが任意選択のエキソソーム標的指向性ドメインであり、ＲＢＤが任意選択のＲＮＡ結合ドメインであり、かつ、ＣｔｅｒがＣ末端である。
【0035】
開示の細胞外小胞には、カーゴＲＮＡなどのカーゴ核酸が含まれ得る。細胞外小胞がカーゴＲＮＡを含む実施形態では、融合ＲＮＡとして記載され得るカーゴＲＮＡは、（１）融合タンパク質のＲＮＡ結合ドメインと結合するＲＮＡモチーフ、および、さらに（２）治療目的に利用される追加の機能性ＲＮＡ配列（例えば、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｎｃＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、またはこれらのＲＮＡのいずれかの組み合わせ）を含む。ＲＮＡはまた受動的に搭載もされ得る。
【0036】
開示の細胞外小胞のカーゴＲＮＡは、任意の好適な長さのものであり得る。例えば、いくつかの実施形態では、カーゴＲＮＡは、少なくとも約１０ｎｔ，２０ｎｔ，３０ｎｔ，４０ｎｔ，５０ｎｔ，１００ｎｔ，２００ｎｔ，５００ｎｔ，１０００ｎｔ，２０００ｎｔ，５０００ｎｔ、またはそれ以上の長さのヌクレオチド長を有し得る。他の実施形態では、カーゴＲＮＡは、約５０００ｎｔ，２０００ｎｔ，１０００ｎｔ，５００ｎｔ，２００ｎｔ，１００ｎｔ，５０ｎｔ，４０ｎｔ，３０ｎｔ，２０ｎｔ、または１０ｎｔ以下のヌクレオチド長を有し得る。よりさらなる実施形態では、カーゴＲＮＡは、これらの企図されるヌクレオチド長のいずれかによって画される範囲内のヌクレオチド長、例えば、約１０ｎｔ～５０００ｎｔの範囲、または他の範囲のヌクレオチド長を有し得る。開示の細胞外小胞のカーゴＲＮＡは、例えば、カーゴＲＮＡがｍＲＮＡまたは別の比較的長いＲＮＡを含む、比較的長いものであり得る。
【0037】
本明細書に開示の細胞外小胞の構成要素に好適なＲＮＡ結合ドメインおよびＲＮＡモチーフには、バクテリオファージのＲＮＡ結合ドメインおよびＲＮＡモチーフが含まれ得るが、これらに限定されない。（例えば、Ｋｅｒｙｅｒ－Ｂｉｂｅｎｓ ｅｔ ａｌ．，”Ｔｅｔｈｅｒｉｎｇ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｔｏ ＲＮＡｓ ｂｙ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，”Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ（２００８）１００，１２５－１３８を参照のこと。なお、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【0038】
開示の細胞外小胞のいくつかの実施形態では、融合タンパク質のＲＮＡ結合ドメインは、交換可能であると考えられ得るＭＳ２バクテリオファージまたはＲ１７バクテリオファージのコートタンパク質のＲＮＡ結合ドメインである。（例えば、Ｋｅｒｙｅｒ－Ｂｉｂｅｎｓ ｅｔ ａｌ．、およびＳｔｏｃｋｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，”Ｐｒｏｂｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＲＮＡ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ ＭＳ２ ｃｏａｔ ｐｒｏｔｅｉｎ，”Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，１９９５，Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．１３，ｐａｇｅｓ ２５１２－２５１８を参照のこと。なお、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。ＭＳ２バクテリオファージのコートタンパク質の完全長アミノ酸配列は、本明細書では配列番号１として提供される。本明細書に開示の融合タンパク質には、ＭＳ２バクテリオファージのコートタンパク質の完全長アミノ酸配列、もしくはその変異型であって、ＭＳ２バクテリオファージのコートタンパク質のアミノ酸配列と比較して、あるパーセンテージの配列同一性を有することが本明細書で企図されるような変異型、またはそれらの断片であって、ＭＳ２バクテリオファージのコートタンパク質の一部を含む断片（例えば、ＭＳ２のＲＮＡ結合ドメインまたは配列番号２であって、ＭＳ２バクテリオファージのコートタンパク質のアミノ酸配列（２～２２個）を含む）が含まれ得る。
【0039】
融合タンパク質がＭＳ２バクテリオファージのコートタンパク質のＲＮＡ結合ドメインを含む実施形態では、カーゴＲＮＡは、典型的には、融合タンパク質のＲＮＡ結合ドメインに結合する高親和性結合ループを形成し得る、ＭＳ２バクテリオファージＲＮＡのＲＮＡモチーフを含む。（Ｐｅａｂｏｄｙ ｅｔ ａｌ．，”Ｔｈｅ ＲＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ ＭＳ２ ｃｏａｔ ｐｒｏｔｅｉｎ，”Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊ．，ｖｏｌ．１２，ｎｏ．２，ｐｐ．５９５－６００，１９９３、Ｋｅｒｙｅｒ－Ｂｉｂｅｎｓ ｅｔ ａｌ．、およびＳｔｏｃｋｌｅｙ ｅｔ ａｌ．を参照のこと。なお、それらの内容は参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）。ＭＳ２バクテリオファージおよびＲ１７バクテリオファージのＲＮＡモチーフは特徴付けられている。（同文献を参照のこと）。ＲＮＡモチーフは、ステムを形成するヌクレオチドの同一性はＲＮＡモチーフに対するコートタンパク質の親和性に影響を及ぼさないように思われるが、ループの配列が４ｎｔの配列（ＡＵＵＡ（配列番号３））を含有し、これがＲＮＡモチーフに対するコートタンパク質の親和性に影響を及ぼす、２１ｎｔのステムループ構造を最小限含むことが決定されている。また、ループの上流の対になっていないアデノシンの２個のヌクレオチドも重要である。開示の細胞外小胞のいくつかの実施形態では、ＲＮＡモチーフは、
（配列表１）
からなる群から選択される配列および構造を含む１つ以上の野生型および／または高親和性結合ループを含み、
Ｎ－Ｎは、塩基対を形成している任意の２つのＲＮＡヌクレオチドである（例えば、Ｎ－Ｎの各出現は、独立して、Ａ－Ｕ、Ｃ－Ｇ、Ｇ－Ｃ、Ｇ－Ｕ、Ｕ－Ａ、またはＵ－Ｇのいずれかから選択され、Ｎ－Ｎの各出現は、同じであっても異なっていてもよい）。具体的には、高親和性結合ループは、配列番号７（５’－ＡＣＡＵＧＡＧＧＡＵＵＡＣＣＣＡＵＧＵ－３’）、配列番号８（５’－ＡＣＡＵＧＡＧＧＡＣＵＡＣＣＣＡＵＧＵ－３’）、および配列番号９（５’－ＡＣＡＵＧＡＧＧＡＵＣＡＣＣＣＡＵＧＵ－３’）からなる群から選択される配列、またはあるパーセンテージの配列同一性を有するその変異型を含み得る。
（配列表１）
からなる群から選択される配列および構造を含む１つ以上の野生型および／または高親和性結合ループを含み、
Ｎ－Ｎは、塩基対を形成している任意の２つのＲＮＡヌクレオチドである（例えば、Ｎ－Ｎの各出現は、独立して、Ａ－Ｕ、Ｃ－Ｇ、Ｇ－Ｃ、Ｇ－Ｕ、Ｕ－Ａ、またはＵ－Ｇのいずれかから選択され、Ｎ－Ｎの各出現は、同じであっても異なっていてもよい）。具体的には、高親和性結合ループは、配列番号７（５’－ＡＣＡＵＧＡＧＧＡＵＵＡＣＣＣＡＵＧＵ－３’）、配列番号８（５’－ＡＣＡＵＧＡＧＧＡＣＵＡＣＣＣＡＵＧＵ－３’）、および配列番号９（５’－ＡＣＡＵＧＡＧＧＡＵＣＡＣＣＣＡＵＧＵ－３’）からなる群から選択される配列、またはあるパーセンテージの配列同一性を有するその変異型を含み得る。
【0040】
好ましくは、融合タンパク質のＲＮＡ結合ドメインは、少なくとも約１×１０－８Ｍの親和性でＲＮＡモチーフに結合する。より好ましくは、融合タンパク質のＲＮＡ結合ドメインは、少なくとも約１×１０－９Ｍの親和性で、さらにより好ましくは、少なくとも約１×１０－１０Ｍの親和性でＲＮＡモチーフに結合する。
【0041】
融合タンパク質のＲＮＡ結合ドメインに結合するためのＲＮＡモチーフに加えて、カーゴＲＮＡには、治療目的に利用される追加の機能性ＲＮＡ配列（例えば、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｎｃＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、またはこれらのＲＮＡのいずれかの組み合わせ）が含まれ得る。（Ｍａｒｃｕｓ ｅｔ ａｌ．，”ＦｅｄＥｘｏｓｏｍｅｓ：Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｔｈａｔ Ｔｒｕｌｙ Ｄｅｌｉｖｅｒ，”Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ２０１３，６，６５９－６８０、Ｇｙｏｒｇｙ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ： ｃｌｉｎｉｃａｌ ｐｒｏｍｉｓｅ ａｎｄ ｏｐｅｎ ｑｕｅｓｔｉｏｎｓ，”Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．２０１５；５５：４３９－６４，Ｅｐｕｂ ２０１４ Ｏｃｔ ３を参照のこと。なお、それらの内容は参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）。したがって、カーゴＲＮＡは、融合タンパク質のＲＮＡ結合ドメインに結合するためのＲＮＡモチーフが含まれ、かつ、追加のＲＮＡ（例えば、５’末端もしくは３’末端、またはＲＮＡ内部の内部部分にて融合された、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｎｃＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、あるいはこれらのＲＮＡのいずれかの組み合わせで）が含まれるハイブリッドＲＮＡとして特徴付けられ得、これは、治療用ＲＮＡであり得る。
【0042】
開示の細胞外小胞の他の実施形態では、融合タンパク質のＲＮＡ結合ドメインは、ラムダバクテリオファージ、Ｐ２２バクテリオファージ、およびｐｈｉ２１バクテリオファージが含まれ得るがこれらに限定されないラムダ状バクテリオファージのＮ－タンパク質のＲＮＡ結合ドメインである。（例えば、Ｋｅｒｙｅｒ－Ｂｉｂｅｎｓ ｅｔ ａｌ．、Ｂａｈａｄｕｒ ｅｔ ａｌ．，”Ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ Ｐ２２ Ｎ－ｐｅｐｔｉｄｅ ｔｏ ｔｈｅ ｂｏｘＢ ＲＮＡ－ｍｏｔｉｆ Ｓｔｕｄｉｅｄ ｂｙ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，”Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｊ．，Ｖｏｌ．，９７，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２００９，３１３９－３１４９、Ｃｉｌｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，”Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｍｉｍｉｃｒｙ ｉｎ ｔｈｅ ｐｈａｇｅ ｐｈｉ２１ Ｎ ｐｅｐｔｉｄｅ－ｂｏｘＢ ＲＮＡ ｃｏｍｐｌｅｘ，”ＲＮＡ（２００３），９：６６３－３７６を参照のこと。なお、それらの内容は参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）。ラムダバクテリオファージ、Ｐ２２バクテリオファージ、およびｐｈｉ２１バクテリオファージのＮタンパク質の完全長アミノ酸配列はそれぞれ、本明細書では配列番号１０、１１、および１２として提供される。本明細書に開示の融合タンパク質には、ラムダ状バクテリオファージのＮタンパク質の完全長アミノ酸配列、もしくはその変異型であって、ラムダ状バクテリオファージのＮタンパク質のアミノ酸配列と比較して、あるパーセンテージの配列同一性を有することが本明細書で企図されるような変異型、またはそれらの断片であって、ラムダ状バクテリオファージのＮタンパク質の一部を含む断片（例えば、ラムダバクテリオファージ、Ｐ２２バクテリオファージ、およびｐｈｉ２１バクテリオファージのいずれかのＮタンパク質のＲＮＡ結合ドメイン、またはラムダバクテリオファージ、Ｐ２２バクテリオファージ、およびｐｈｉ２１バクテリオファージのＮタンパク質の一部を含む、それぞれ、配列番号１３、１４、および１５）が含まれ得る。
【0043】
融合タンパク質がラムダ状バクテリオファージのコートタンパク質のＲＮＡ結合ドメインを含む実施形態では、カーゴＲＮＡは、典型的には、融合タンパク質のＲＮＡ結合ドメインに結合する「ｂｏｘＢ」と呼ばれる高親和性結合ループを形成し得るラムダバクテリオファージＲＮＡのＲＮＡモチーフを含む。（Ｋｅｒｙｅｒ－Ｂｉｂｅｎｓ ｅｔ ａｌ．を参照のこと）。ラムダ状バクテリオファージのＢｏｘＢは特徴付けられている。（同文献、Ｂａｈａｄｕｒ，ｅｔ ａｌ．、およびＣｉｌｌｅｙ ｅｔ ａｌ．を参照のこと）。ラムダバクテリオファージでは、ｂｏｘＢは、ステムおよびループを形成するヌクレオチドの同一性が、ＲＮＡモチーフに対するコートタンパク質の親和性に影響を与える、１５ｎｔのステムループ構造を最小限含むことが決定されている。（Ｋｅｒｙｅｒ－Ｂｉｂｅｎｓ ｅｔ ａｌ．を参照のこと）。開示の細胞外小胞のいくつかの実施形態では、ＲＮＡモチーフは、
（配列表２）
からなる群から選択される配列および構造、またはあるパーセンテージの配列同一性を有するその変異型であって、融合タンパク質のＲＮＡ結合ドメインに結合する変異型を含む、１つ以上の高親和性結合ループを含む。好ましくは、ＲＮＡモチーフは、少なくとも約１×１０－８Ｍの親和性、より好ましくは、少なくとも約１×１０－９Ｍの親和性、さらにより好ましくは、少なくとも約１×１０－１０Ｍの親和性で融合タンパク質のＲＮＡ結合ドメインに結合する。
（配列表２）
からなる群から選択される配列および構造、またはあるパーセンテージの配列同一性を有するその変異型であって、融合タンパク質のＲＮＡ結合ドメインに結合する変異型を含む、１つ以上の高親和性結合ループを含む。好ましくは、ＲＮＡモチーフは、少なくとも約１×１０－８Ｍの親和性、より好ましくは、少なくとも約１×１０－９Ｍの親和性、さらにより好ましくは、少なくとも約１×１０－１０Ｍの親和性で融合タンパク質のＲＮＡ結合ドメインに結合する。
【0044】
Ｐ２２バクテリオファージでは、ｂｏｘＢは、ステムおよびループを形成するヌクレオチドの同一性が、ＲＮＡモチーフに対するコートタンパク質の親和性に影響を与える、１５ｎｔのステムループ構造を最小限含むことが決定されている。（Ｂａｈａｄｕｒ ｅｔ ａｌ．を参照のこと）。開示の細胞外小胞のいくつかの実施形態では、ＲＮＡモチーフは、
（配列表３）
の配列および構造を含む１つ以上の高親和性結合ループを含む。
（配列表３）
の配列および構造を含む１つ以上の高親和性結合ループを含む。
【0045】
Ｐｈｉ２１バクテリオファージでは、ｂｏｘＢは、ステムおよびループを形成するヌクレオチドの同一性が、ＲＮＡモチーフに対するコートタンパク質の親和性に影響を与える、２０ｎｔのステムループ構造を最小限含むことが決定されている。（Ｃｉｌｌｅｙ ｅｔ ａｌ．を参照のこと）。開示の細胞外小胞のいくつかの実施形態では、ＲＮＡモチーフは、
（配列表４）
の配列および構造を含む１つ以上の高親和性結合ループを含む。
（配列表４）
の配列および構造を含む１つ以上の高親和性結合ループを含む。
【0046】
いくつかの実施形態では、開示の細胞外小胞の融合タンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質のＲＮＡ結合ドメインを含む。そのような実施形態では、開示の細胞外小胞は、ＲＮＡ結合ドメインによって認識、結合され、かつ、細胞外小胞に能動的にパッケージングされる配列を含む、カーゴＲＮＡを含み得る。
【0047】
開示の細胞外小胞は、当該技術分野で既知の方法によって調製され得る。例えば、開示の細胞外小胞は、真核細胞内で（ａ）パッケージング／融合タンパク質をコードするｍＲＮＡを発現させること、および（ｂ）真核細胞内でカーゴＲＮＡもしくはカーゴタンパク質を発現させること（またはインシリコで調製済みのカーゴＲＮＡを用いて真核細胞を形質導入すること）によって調製され得る。パッケージング／融合タンパク質およびカーゴＲＮＡのためのｍＲＮＡは、開示の細胞外小胞の産生するための好適な産生細胞にトランスフェクトされるベクターから発現され得る。ベクターはまた、安定してトランスフェクトされ得ることに留意されたい。パッケージング／融合タンパク質およびカーゴＲＮＡのためのｍＲＮＡは、同一のベクターから発現され得る（例えば、ベクターが別々のプロモーターからのパッケージング／融合タンパク質およびカーゴＲＮＡのためのｍＲＮＡを発現する場合）か、またはパッケージング／融合タンパク質およびカーゴＲＮＡのためのｍＲＮＡが別々のベクターから発現され得る。パッケージング／融合タンパク質およびカーゴＲＮＡのためのｍＲＮＡを発現させるためのベクター（複数可）は、開示の細胞外小胞を調製するために設計されたキットにパッケージングされ得る。
【0048】
本明細書ではまた、開示の細胞外小胞を使用するための方法も企図される。例えば、開示の細胞外小胞は、カーゴＲＮＡまたはカーゴタンパク質またはカーゴＲＮＡ－タンパク質複合体などの治療薬を標的細胞に送達するために使用され得、かかる方法には、標的細胞を開示の細胞外小胞と接触させることが含まれる。開示の細胞外小胞は、疾患または障害を治療するための医薬組成物の一部として製剤化され得、医薬組成物は、疾患または障害を治療するためにカーゴ分子を標的細胞に送達するために、それを必要とする患者に投与され得る。
【0049】
開示の細胞外小胞には、カーゴタンパク質（例えば、治療用タンパク質またはタンパク質／ＲＮＡコンプレ）が含まれ得る。いくつかの実施形態では、治療用タンパク質は、（例えば、治療用タンパク質と融合タンパク質との間の相互作用を介して）細胞外小胞に能動的にパッケージングされる。
【0050】
開示の細胞外小胞は、新規のタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドを含み得る。本明細書で使用する場合、「タンパク質」または「ポリペプチド」または「ペプチド」という用語は、アミノ酸のポリマーを指すために互換的に使用され得る。典型的には、「ポリペプチド」または「タンパク質」は、長さが、典型的には、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、または１００個のアミノ酸を超える、より長いアミノ酸のポリマーとして定義される。「ペプチド」は、長さが、典型的には、５０個、４０個、３０個、２０個以下のアミノ酸の、アミノ酸の短いポリマーとして定義される。
【0051】
本明細書で企図される「タンパク質」は、典型的には、天然または非天然に生じるアミノ酸（例えば、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリン）のポリマーを含む。本明細書で企図されるタンパク質は、非アミノ酸部分が含まれるようインビトロまたはインビボでさらに修飾され得る。これらの修飾には、アシル化（例えば、Ｏ－アシル化（エステル）、Ｎ－アシル化（アミド）、Ｓ－アシル化（チオエステル））、アセチル化（例えば、タンパク質のＮ末端またはリジン残基のいずれかにおけるアセチル基の付加）、ホルミル化リポイル化（例えば、リポ酸塩、Ｃ８官能基の結合）、ミリストイル化（例えば、ミリスチン酸塩、Ｃ１４飽和酸の結合）、パルミトイル化（例えば、パルミチン酸塩、Ｃ１６飽和酸の結合）、アルキル化（例えば、リジン残基またはアルギニン残基におけるメチルなど、アルキル基の付加）、イソプレニル化もしくはプレニル化（例えば、ファルネゾールまたはゲラニノールなど、イソプレノイド基の付加）、Ｃ末端でのアミド化、グリコシル化（例えば、アスパラギン、ヒドロキシリジン、セリン、またはトレオニンのいずれかへのグリコシル基の付加で、糖タンパク質を生じさせるもの）が含まれ得るが、これらに限定されない。ポリシアリル化（例えば、ポリシアル酸の付加）、グリピエーション（例えば、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化（例えば、甲状腺ホルモンの）、およびリン酸化（例えば、通常はセリン、チロシン、トレオニン、またはヒスチジンに対する、リン酸基の付加）は、非酵素的な糖の結合と見なされる糖化とは区別される。
【0052】
用語「アミノ酸残基」にはまた、ホモシステイン、２－アミノアジピン酸、Ｎ－エチラスパラギン、３－アミノアジピン酸、ヒドロキシリジン、β－アラニン、β－アミノプロピオン酸、アロ－ヒドロキシリジン酸、２－アミノブチル酸、３－ヒドロキシプロリン、４－アミノブチル酸、４－ヒドロキシプロリン、ピペリジン酸、６－アミノカプロン酸、イソデスモシン、２－アミノヘプタン酸、アロ－イソロイシン、２－アミノイソブチル酸、Ｎ－メチルグリシン、サルコシン、３－アミノイソブチル酸、Ｎ－メチルイソロイシン、２－アミノピメリン酸、６－Ｎ－メチルリジン、２，４－ジアミノブチル酸、Ｎ－メチルバリン、デスモシン、ノルバリン、２，２’－ジアミノピメリン酸、ノルロイシン、２，３－ジアミノプロピオン酸、オルニチン、およびＮ－エチルグリシンからなる群に含まれるアミノ酸残基が含まれ得る。
【0053】
本明細書に開示のタンパク質には、「野生型」タンパク質ならびにその変異型、変異体、および誘導体が含まれ得る。本明細書で使用する場合、「野生型」という用語は、当業者によって理解される当技術分野の用語であり、変異体または変異型と区別される、それが天然に生じる場合の生物、株、遺伝子、もしくは特徴の典型的な形態を意味する。本明細書で使用する場合、「変異型」、「変異体」、または「誘導体」は、参照のタンパク質またはポリペプチドの分子と異なるアミノ酸配列を有するタンパク質分子を指す。変異型または変異体は、参照分子に対し、アミノ酸残基の１つ以上の挿入、欠失、または置換を有し得る。変異型または変異体には、参照分子の断片が含まれ得る。例えば、変異体または変異型の分子は、参照ポリペプチド（例えば、配列番号１～４０のいずれか）に対して少なくとも１つのアミノ酸残基の１つ以上の挿入、欠失、または置換の場合。ＭＳ２バクテリオファージの完全長コートタンパク質の配列、ラムダバクテリオファージの完全長Ｎタンパク質の配列、Ｐ２２バクテリオファージの完全長Ｎタンパク質の配列、ｐｈｉ２１バクテリオファージの完全長Ｎタンパク質の配列、完全長ＬＡＭＰ－２ａの配列、完全長ＬＡＭＰ－２ｂの配列、および完全長ＬＡＭＰ－２ｃの配列はそれぞれ、配列番号１、１０、１１、１２、２０、２１、および２２として提示されており、この点に関して参照として使用され得る。
【0054】
タンパク質に関して、「欠失」は、１つ以上のアミノ酸残基の非存在をもたらす、アミノ酸配列における変化を指す。欠失では、少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、１０個、２０個、５０個、１００個、もしくは２００個のアミノ酸残基、またはこれらの値のいずれかによって画される、アミノ酸残基の範囲が除去される（例えば、５～１０個のアミノ酸の欠失）。欠失には、内部欠失または末端欠失（例えば、参照ポリペプチドのＮ末端切断またはＣ末端切断）が含まれ得る。参照ポリペプチド配列の「変異型」、「変異体」、または「誘導体」には、参照ポリペプチド配列に対する欠失が含まれ得る。
【0055】
タンパク質に関して、「断片」は、配列が参照配列と同一であるが、長さが参照配列よりも短いアミノ酸配列の一部である。断片は、少なくとも１つのアミノ酸残基を差し引いた、参照配列の全長まで含み得る。例えば、断片は、それぞれ、参照ポリペプチドの５～１０００個の連続するアミノ酸残基を含み得る。いくつかの実施形態では、断片は、参照ポリペプチドの少なくとも５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、１５０個、２５０個、もしくは５００個の連続するアミノ酸残基を含み得るか、他の実施形態では、断片は、参照ポリペプチドの約５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、１５０個、２５０個、もしくは５００個未満の連続するアミノ酸残基を含み得るか、または他の実施形態では、断片は、これらの値のうちのいずれかによって画される範囲（例えば、参照ポリペプチドの５０～１００個の連続するアミノ酸の範囲）内の長さを有する。断片は、分子の特定の領域から優先的に選択され得る。「少なくとも断片」という用語には、完全長ポリペプチドが包含される。例えば、タンパク質の断片は、配列番号１～４０のいずれかの完全長タンパク質のアミノ酸配列の連続部分を含むか、または本質的にそれからなり得る。断片には、完全長タンパク質に対して、Ｎ末端切断、Ｃ末端切断、または両方の切断が含まれ得る。参照ポリペプチド配列の「変異型」、「変異体」、または「誘導体」には、参照ポリペプチド配列の断片が含まれ得る。
【0056】
タンパク質に関して、「挿入」および「付加」という語は、１つ以上のアミノ酸残基の付加をもたらす、アミノ酸配列の変化を指す。挿入または付加は、１個、２個、３個、４個、５個、１０個、２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、１５０個、２００個、もしくはそれ以上のアミノ酸残基、またはこれらの値のいずれかによって画されるアミノ酸残基の範囲（例えば、５～１０個のアミノ酸の挿入または付加）を指し得る。参照ポリペプチド配列の「変異型」、「変異体」、または「誘導体」には、参照ポリペプチド配列に対する挿入または付加が含まれ得る。タンパク質の変異型は、Ｎ末端挿入、Ｃ末端挿入、内部挿入、またはＮ末端挿入と、Ｃ末端挿入と、内部挿入との任意の組み合わせを有し得る。
【0057】
「融合ポリペプチド」とは、そのアミノ酸配列のＮ末端、Ｃ末端、または両端に異種アミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。参照ポリペプチド配列の「変異型」には、参照ポリペプチドを含む融合ポリペプチドが含まれ得る。
【0058】
タンパク質に関して、語句「同一性パーセント」および「同一性％」は、標準化アルゴリズムを使用して整列させた少なくとも２つのアミノ酸配列間の残基一致のパーセンテージを指す。アミノ酸配列アラインメントの方法は周知である。いくつかのアラインメント方法では、保存的アミノ酸置換が考慮される。そのような保存的置換は、以下により詳細に説明されるが、概して、置換部位において電荷および疎水性を保持し、したがって、ポリペプチドの構造（ひいては機能）を保持する。アミノ酸配列の同一性パーセントは、当該技術分野で理解されるように決定され得る。（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第７，３９６，６６４号を参照のこと）。一般的に使用され、自由に入手可能な配列比較アルゴリズムのパッケージ（ｓｕｉｔｅ）は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）によって提供されており、これは、ＮＣＢＩ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．を含むいくつかの供給源から、そのウェブサイトで入手可能である。ＢＬＡＳＴソフトウェアパッケージには、「ｂｌａｓｔｐ」を含む様々な配列分析プログラムが含まれており、これは、既知のアミノ酸配列を、様々なデータベースからの他のアミノ酸配列と整列させるために使用される。本明細書に記載されるように、変異型、変異体、または断片（例えば、タンパク質の変異型、変異体、またはその断片）は、参照分子に対して（例えば、配列番号１～４０のいずれかに対して）９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、もしくは２０％のアミノ酸配列同一性を有し得る。
【0059】
タンパク質に関して、同一性パーセントは、例えば、特定の配列番号によって定義されるように、定義されたポリペプチド配列全体の長さにわたって測定され得るか、またはより短い長さにわたって、例えば、より大きな定義されたポリペプチド配列から取り出された断片、例えば、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも７０個、もしくは少なくとも１５０個の連続する残基の断片の長さにわたって測定され得る。そのような長さは例示的な長さに過ぎず、本明細書内、表、図、または配列表に示される配列によって支持されるいかなる断片長も、同一性パーセンテージが測定され得る長さを記載するために使用され得ることが理解される。
【0060】
タンパク質に関して、本明細書で企図される変異型、変異体、または誘導体のアミノ酸配列には、参照アミノ酸配列に対する保存的アミノ酸置換が含まれ得る。例えば、変異型、変異体、または誘導体タンパク質には、参照分子に対する保存的アミノ酸置換が含まれ得る。「保存的アミノ酸置換」は、置換が参照ポリペプチドの特性を少なくとも干渉すると予測される、異なるアミノ酸に対するアミノ酸の置換である。換言すれば、保存的アミノ酸置換は、参照ポリペプチドの構造および機能を実質的に保存する。以下の表に、本明細書で企図される例示的な保存的アミノ酸置換の一覧を提供する。
保存的アミノ酸置換は、概して、（ａ）例えば、ベータシートもしくはアルファヘリックス立体構造としての、置換領域におけるポリペプチド骨格の構造、（ｂ）置換部位における分子の電荷もしくは疎水性、および／または（ｃ）側鎖のかさを維持する。
【表1】
保存的アミノ酸置換は、概して、（ａ）例えば、ベータシートもしくはアルファヘリックス立体構造としての、置換領域におけるポリペプチド骨格の構造、（ｂ）置換部位における分子の電荷もしくは疎水性、および／または（ｃ）側鎖のかさを維持する。
【0061】
開示のタンパク質、変異体、変異型、または本明細書に記載は、参照ポリペプチドによって示される１つ以上の機能的または生物学的活性（例えば、野生型タンパク質によって示される１つ以上の機能的または生物学的活性）を有し得る。例えば、開示のタンパク質、変異体、変異型、またはそれらの誘導体は、一本鎖ＲＮＡへの結合、二本鎖ＲＮＡへの結合、標的ポリヌクレオチド配列への結合、および小胞（例えば、リソソームまたはエキソソーム）へのタンパク質の指向が含まれる、１つ以上の生物学的活性を有し得る。
【0062】
開示のタンパク質は、実質的に単離または精製され得る。「実質的に単離または精製された」という用語は、それらの天然環境から除去され、それらが天然に会合する他の成分を少なくとも６０％含まない、好ましくは、少なくとも７５％含まない、より好ましくは、少なくとも９０％含まない、さらにより好ましくは、少なくとも９５％含まないタンパク質を指す。
【0063】
本明細書ではまた、ポリヌクレオチド、例えば、タンパク質（例えば、配列番号１～４０のいずれかのいずれかのアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは配列番号１～４０のいずれかに対する配列同一性が少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％であるアミノ酸配列を有するポリペプチド変異型をコードするＤＮＡ、配列番号１～４０のいずれかのいずれかのポリヌクレオチド配列をコードするかまたは配列番号１～４０のいずれかのいずれかに対する配列同一性が少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド変異型をコードするＤＮＡ，配列番号１～４０のいずれかのポリヌクレオチド配列または配列番号１～４０のいずれかに対する配列同一性が少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド変異型を含むＲＮＡ）をコードするポリヌクレオチド配列を開示する。
【0064】
「ポリヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」、「核酸」、および「核酸配列」という用語は、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド（これらの用語は互換的に使用され得る）、またはそれらの任意の断片を指す。これらの語句はまた、ゲノム起源、天然起源、または合成起源のＤＮＡもしくはＲＮＡ（一本鎖または二本鎖であり得、センス鎖またはアンチセンス鎖を表し得る）を指す。
【0065】
ポリヌクレオチド配列に関して、「同一性パーセント」および「同一性％」という用語は、標準化アルゴリズムを使用して整列された少なくとも２つのポリヌクレオチド配列間の残基一致のパーセンテージを指す。そのようなアルゴリズムでは、２つの配列間のアラインメントを最適化するために、比較される配列中に、標準化された再現可能な方法でギャップが挿入され得るため、２つの配列のより有意義な比較が達成され得る。核酸配列についての同一性パーセントは、当該技術分野において理解されるように決定され得る。（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第７，３９６，６６４号を参照のこと）。一般的に使用され、自由に入手可能な配列比較アルゴリズムのパッケージは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）によって提供されており、これは、ＮＣＢＩ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．を含むいくつかの供給源から、そのウェブサイトで入手可能である。ＢＬＡＳＴソフトウェアパッケージには、「ｂｌａｓｔｎ」を含む様々な配列分析プログラムが含まれており、これは、既知のポリヌクレオチド配列を、様々なデータベースからの他のポリヌクレオチド配列と整列させるために使用される。また、２つのヌクレオチド配列の直接的な一対比較に使用される「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」と呼ばれるツールも利用可能である。「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」は、ＮＣＢＩウェブサイトでインタラクティブにアクセスし、使用することができる。「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ツールは、ｂｌａｓｔｎとｂｌａｓｔｐの両方に使用することができる（上述）。
【0066】
ポリヌクレオチド配列に関して、同一性パーセントは、例えば、特定の配列番号によって定義されるように、定義されたポリヌクレオチド配列全体の長さにわたって測定され得るか、またはより短い長さにわたって、例えば、より大きな定義された配列から取り出された断片、例えば、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも７０個、少なくとも１００個、もしくは少なくとも２００個の連続するヌクレオチドの断片の長さにわたって測定され得る。そのような長さは例示的な長さに過ぎず、本明細書内、表、図、または配列表に示される配列によって支持されるいかなる断片長も、同一性パーセンテージが測定され得る長さを記載するために使用され得ることが理解される。
【0067】
ポリヌクレオチド配列に関して、「変異型」、「変異体」、または「誘導体」は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのウェブサイトで入手可能な「ＢＬＡＳＴ ２配列」ツールを用いてｂｌａｓｔｎを使用して、核酸配列のうちの１つの特定の長さにわたって，特定の核酸配列に対して少なくとも５０％の配列同一性を有する核酸配列として定義され得る。（Ｔａｔｉａｎａ Ａ．Ｔａｔｕｓｏｖａ，Ｔｈｏｍａｓ Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ（１９９９），”Ｂｌａｓｔ ２ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ－ａ ｎｅｗ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｃｏｍｐａｒｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ”，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ．１７４：２４７－２５０を参照のこと）。そのような一対の核酸は、例えば、特定の定義された長さにわたって少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％、またはそれ以上の配列同一性を示し得る。
【0068】
それにもかかわらず、高度の同一性を示さない核酸配列も、複数のコドンが単一のアミノ酸についてコードし得る遺伝暗号の縮重により、類似のアミノ酸配列をコードし得る。核酸配列の変化は、この縮重を使用して、どれもが実質的に同一のタンパク質をコードする複数の核酸配列を産生するよう行うことができることが理解される。例えば、本明細書で企図されるポリヌクレオチド配列は、タンパク質をコードし得、また特定の宿主での発現のためにコドン最適化がされ得る。当該技術分野では、ヒト、マウス、ラット、ブタ、Ｅ．ｃｏｌｉ、植物、および他の宿主細胞を含むいくつかの宿主生物について、コドン使用頻度表が作成されている。
【0069】
「組換え核酸」は、天然には生じないか、または本来は分離されている、配列の２つ以上のセグメントの人工的な組み合わせによって作製される配列を有する配列である。この人工的な組み合わせは、多くの場合、化学合成によって、またはより一般的には、核酸の単離されたセグメントの人工的な操作によって、例えば、当該技術分野で既知の遺伝子操作技法によって達成される。組換えという用語には、核酸の一部の付加、置換、または欠失によってのみ改変された核酸が含まれる。しばしば、組換え核酸には、プロモーター配列に機能的に連結された核酸配列が含まれ得る。そのような組換え核酸は、例えば、細胞を形質転換するために使用されるベクターの一部であり得る。
【0070】
本明細書に開示の核酸は、「実質的に単離または精製され」得る。「実質的に単離または精製された」という用語は、その天然環境から除去され、それが天然に会合する他の成分を少なくとも６０％含まない、好ましくは、少なくとも７５％含まない、より好ましくは、少なくとも９０％含まない、さらにより好ましくは、少なくとも９５％含まない核酸を指す。
【0071】
「形質転換」または「トランスフェクトされた」は、外因性核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）がレシピエント細胞に導入されるプロセスを表す。形質転換またはトランスフェクションは、当該技術分野で周知の様々な方法に従って、天然または人工の条件下で生じ得、原核生物または真核生物の宿主細胞への外来核酸配列の挿入のための任意の既知の方法に依存し得る。形質転換またはトランスフェクションのための方法は、形質転換される宿主細胞の種類に基づいて選択され、これには、バクテリオファージまたはウイルス感染または非ウイルス送達が含まれ得るが、これらに限定されない。核酸の非ウイルス送達方法には、リポフェクション、ヌクレオフェクション、マイクロインジェクション、電気穿孔、ヒートショック、粒子衝撃、バイオリスティック、ビロソーム、リポソーム、イムノリポソーム、ポリカチオンまたは脂質：核酸複合体、裸のＤＮＡ、人工ビリオン、および薬剤により増強されたＤＮＡの取り込みなどが含まれる。リポフェクションは、例えば、米国特許第５，０４９，３８６号、第４，９４６，７８７号、および第４，８９７，３５５号）に記載されており、リポフェクション試薬は、市販されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）およびＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに好適なカチオン性および中性の脂質には、Ｆｅｌｇｎｅｒ，ＷＯ９１／１７４２４、ＷＯ９１／１６０２４のものが含まれる。送達は、細胞（例えば、インビトロまたはエキソビボの投与）または標的組織（例えば、インビボ投与）に対してであり得る。「形質転換細胞」または「トランスフェクトされた細胞」という用語には、挿入されたＤＮＡが自己複製プラスミドとして、もしくは宿主染色体の一部として複製することができる、安定的に形質転換またはトランスフェクトされた細胞、ならびに挿入されたＤＮＡもしくはＲＮＡを限られた期間発現する、一過性に形質転換またはトランスフェクトされた細胞が含まれる。別の実施形態では、かかる用語には、安定してトランスフェクトされた細胞も含まれる。
【0072】
本明細書で企図されるポリヌクレオチド配列は、発現ベクター中に存在し得る。例えば、ベクターは、（ａ）タンパク質のＯＲＦをコードするポリヌクレオチド、（ｂ）ＲＮＡ媒介性の、標的ＤＮＡ配列の結合、ニッキング、および／または切断を誘導するＲＮＡを発現するポリヌクレオチド、ならびに（ａ）および（ｂ）の両方を含み得る。ベクターに存在するポリヌクレオチドは、原核生物または真核生物のプロモーターに機能的に連結され得る。「機能的に連結された」とは、第１の核酸配列が第２の核酸配列と機能的関係に置かれる状況を指す。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合、そのプロモーターはコード配列に機能的に連結されている。機能的に連結されたＤＮＡ配列は、近接していても隣接していてもよく、また２つのタンパク質コード領域を結合することが必要な場合は同じ読み枠内にあってもよい。本明細書で企図されるベクターは、タンパク質をコードするポリヌクレオチドに機能的に連結された異種プロモーター（例えば、真核生物または原核生物のプロモーター）を含み得る。「異種プロモーター」は、発現しているタンパク質またはＲＮＡにとって天然または内因性ではないプロモーターを指す。例えば、ＬＡＭＰの異種プロモーターには、真核生物のプロモーターまたはＬＡＭＰにとって天然の内因性プロモーターではない原核生物のプロモーターが含まれ得る。
【0073】
本明細書で使用する場合、「発現」とは、ポリヌクレオチドがＤＮＡテンプレートから（例えば、内へおよびｍＲＮＡまたは他のＲＮＡ転写産物）転写される過程、および／または転写されたｍＲＮＡがその後ペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質に翻訳される過程を指す。転写産物およびコードされたポリペプチドは、集合的に「遺伝子産物」と呼ばれ得る。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、発現には、真核細胞におけるｍＲＮＡのスプライシングが含まれ得る。
【0074】
「ベクター」という用語は、核酸（例えば、ＤＮＡ）を宿主生物または宿主組織に導入することができるいくつかの手段を指す。プラスミドベクター、バクテリオファージベクター、コスミドベクター、細菌ベクター、およびウイルスベクターが含まれる、様々な種類のベクターがある。本明細書で使用する場合、「ベクター」は、異種ポリペプチド（例えば、本明細書で開示される融合タンパク質）を発現するよう操作されている組換え核酸を指し得る。組換え核酸には、典型的には、異種ポリペプチドの発現のためのシス作用エレメントが含まれる。
【0075】
真核細胞での発現に使用される従来のベクターのいずも、対象にＤＮＡを直接導入するために使用され得る。真核生物ウイルス由来の調節エレメントを含有する発現ベクターは、真核生物の発現ベクター（例えば、ＳＶ４０、ＣＭＶ、またはレトロウイルスのプロモーターもしくはエンハンサーを含有するベクター）において使用され得る。例示的なベクターには、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒトサイトメガロウイルスプロモーター、マウス乳癌ウイルスプロモーター、およびラウス肉腫ウイルスプロモーターなどのプロモーターの誘導下でタンパク質を発現するものが含まれる。本明細書で企図される発現ベクターには、異種タンパク質（例えば、本明細書に開示される融合タンパク質）の発現を調節する真核生物または原核生物の制御配列が含まれ得る。原核生物の発現制御配列には、構成的または誘導性のプロモーター（例えば、Ｔ３、Ｔ７、Ｌａｃ、ｔｒｐ、またはｐｈｏＡ）、リボソーム結合部位、または転写終結因子が含まれ得る。
【0076】
本明細書で企図されるベクターは、真核細胞に導入されるベクターのコピーを増幅するために使用され得るか、または真核細胞に導入されるベクターの産生における中間ベクターとして使用され得る（例えば、ウイルスベクターパッケージングシステムの一部としてプラスミドを増幅させる）、原核生物中に導入および増殖され得る。原核生物は、宿主細胞または宿主生物に送達するための１つ以上のタンパク質の供給源を提供するように、ベクターのコピーを増幅させ、１つ以上の核酸を発現させるために使用され得る。原核生物におけるタンパク質の発現は、タンパク質、またはタンパク質もしくはその断片を含む融合タンパク質のいずれかの発現を誘導する、構成的もしくは誘導性プロモーターを含有するベクターとともにＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉを使用して行われ得る。融合ベクターにより、その中でコードされるタンパク質、例えば、組換えタンパク質のアミノ末端に、いくつかのアミノ酸が付加される。そのような融合ベクターは、以下のような１つ以上の目的のために使用され得る：（ｉ）組換えタンパク質の発現を増加させることと、（ｉｉ）組換えタンパク質の溶解性を増大させることと、（ｉｉｉ）親和性精製（例えば、Ｈｉｓタグ）においてリガンドとして作用することによって組換えタンパク質の精製を補助することと、（ｉｖ）識別用に組換えタンパク質にタグ（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）または標識された抗体によって認識され得る抗原（例えば、ＨＡ）を付けることと、（ｖ）細胞の特定の領域への組換えタンパク質の局在化を促進する（例えば、タンパク質が（そのＮ末端またはＣ末端で）核局在化シグナル（ＮＬＳ）、例えば、ＳＶ４０、ヌクレオプラスミン、Ｃ－ｍｙｃ、ｈｎＲＮＰ Ａ１のＭ９ドメインのＮＬＳ、または合成ＮＬＳが含まれ得るＮＬＳと融合している場合）こと。ＮＬＳにおける中性および酸性のアミノ酸の重要性が研究されている。（Ｍａｋｋｅｒｈ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ ６（８）：１０２５－１０２７を参照のこと）。多くの場合、融合発現ベクターでは、融合タンパク質の精製後に、融合部分からの組換えタンパク質の分離を可能にするために、融合部分と組換えタンパク質の接合部にタンパク質分解部位が導入される。かかる酵素、およびそれらの同族認識配列には、第Ｘａ因子、トロンビン、およびエンテロキナーゼが含まれる。
【0077】
本開示の方法には、宿主細胞に、１つ以上のポリヌクレオチド、例えば、または、本明細書に記載の１つ以上のベクター、その１つ以上の転写産物、および／または１つもしくはそこから転写されたタンパク質などを送達することが含まれ得る。そのような方法によって産生される宿主細胞、およびそのような細胞を含むかまたはそのような細胞から産生される生物（動物、植物、または真菌など）がさらに企図される。開示の細胞外小胞は、本明細書に記載のような融合タンパク質およびカーゴＲＮＡをコードするｍＲＮＡを発現するベクターを導入することによって調製され得る。ウイルスまたは非ウイルスによる従来の遺伝子導入方法を使用して、哺乳類細胞または標的組織に核酸を導入することができる。非ウイルスベクター送達系には、ＤＮＡプラスミド、ＲＮＡ（例えば、本明細書に記載されるベクターの転写産物）、裸の核酸、およびリポソームなどの送達ビヒクルと複合体化された核酸が含まれる。ウイルスベクター送達系には、細胞への送達後にエピソームまたは組み込まれたゲノムのいずれかを有するＤＮＡウイルスおよびＲＮＡウイルスが含まれる。
【0078】
本明細書で企図される方法では、宿主細胞は、本明細書に記載の１つ以上のベクターで一過性または非一過性にトランスフェクトされ得る（すなわち、安定的に形質導入され得る）。いくつかの実施形態では、細胞は、それが対象において天然に生じるように（すなわち、インサイチュで）トランスフェクトされる。いくつかの実施形態では、トランスフェクトされる細胞は、対象から採取される（すなわち、外植される）。いくつかの実施形態では、細胞は、対象から採取された細胞、例えば、細胞株に由来する。好適な細胞には、幹細胞（例えば、胚性幹細胞および多能性幹細胞）が含まれ得る。本明細書に記載される１つ以上のベクターでトランスフェクトされた細胞は、１つ以上のベクター由来配列を含む新しい細胞株を樹立するために使用され得る。本明細書で企図される方法では、細胞は、修飾を含有するが、他のいかなる外因性配列も欠く細胞を含む新しい細胞株を樹立するために、本明細書に記載のシステムの構成要素で一過性にトランスフェクトされ（例えば、一過性の、１つ以上のベクターのトランスフェクションまたはＲＮＡによるトランスフェクションによって）、複合体の活性を通じて修飾され得る。
（発明を実施するための形態）
（発明を実施するための形態）
【0079】
以下の実施形態は例示であり、特許請求される発明の範囲を限定することを意図しない。
【0080】
実施形態１．標的指向性タンパク質を含む細胞外小胞であって、標的指向性タンパク質が、（ｉ）抗体（ｓｃＦｖ）の一本鎖可変断片であって、ｓｃＦｖが細胞外小胞の表面で発現される、一本鎖可変断片と、（ｉｉ）膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）であって、ｓｃＦｖおよびＴＭＤが、リンカーを介して直接連結されるかまたは間接的に連結される、膜貫通ドメインと、を含む融合タンパク質である、細胞外小胞。
【0081】
実施形態２．細胞外小胞が、エキソソームまたは微小胞である、実施形態１に記載の細胞外小胞。
【0082】
実施形態３．融合タンパク質が、構造Ｎｔｅｒ－ＶＬ－Ｌ－ＶＨ－Ｌ２－ＴＭＤ－ＣｔｅｒまたはＮｔｅｒ－ＶＨ－Ｌ－ＶＬ－Ｌ２－ＴＭＤ－Ｃｔｅｒを有し、ＮｔｅｒがＮ末端であり、ＶＬが抗体の可変軽鎖断片であり、Ｌ１がグリシン、セリン、およびトレオニンから選択される約１０～５０個のアミノ酸の第１のリンカーであり、ＶＨが抗体の可変重鎖断片であり、Ｌ２がグリシン、セリン、およびトレオニンまたは配列番号４１～４６から選択される配列から任意選択で選択される約１０～５０個のアミノ酸の第２のリンカーであり、ＴＭＤが膜貫通ドメインであり、ＣｔｅｒがＣ末端である、実施形態１または実施形態２に記載の細胞外小胞。
【0083】
実施形態４．Ｎ末端タンパク質タグ、Ｃ末端タンパク質タグ、またはＮ末端タンパク質タグとＣ末端タンパク質タグの両方をさらに含む、実施形態１～３のいずれかに記載の細胞外小胞。
【0084】
実施形態５．膜貫通が、融合タンパク質を細胞外小胞の膜に指向させる、実施形態１～４のいずれかに記載の細胞外小胞。
【0085】
実施形態６．膜貫通ドメインが、細胞受容体タンパク質の膜貫通ドメインである、実施形態１～５のいずれかに記載の細胞外小胞。
【0086】
実施形態７．細胞受容体タンパク質が、血小板由来増殖因子受容体である、実施形態６に記載の細胞外小胞。
【0087】
実施形態８．膜貫通ドメインが、リソソーム関連膜タンパク質の膜貫通ドメインである、実施形態１～７のいずれかに記載の細胞外小胞。
【0088】
実施形態９．リソソーム膜タンパク質が、管腔Ｎ末端および細胞質Ｃ末端を含む、実施形態１～８のいずれかに記載の細胞外小胞。
【0089】
実施形態１０．膜貫通ドメインが、ＬＡＭＰ－１またはＬＡＭＰ－２の膜貫通ドメインを含む、実施形態１～９のいずれかに記載の細胞外小胞。
【0090】
実施形態１１．融合タンパク質が、（ｉｉｉ）操作されたグリコシル化部位をさらに含む、実施形態１～１０のいずれかに記載の細胞外小胞。
【0091】
実施形態１２．融合タンパク質が、（ｉ）Ｎｔｅｒ－ＶＬ－Ｌ－ＶＨ－Ｌ２－ＥＧＳ－ＴＭＤ－（任意選択のＲＢＤ）－Ｃｔｅｒ、（ｉｉ）Ｎｔｅｒ－ＶＬ－Ｌ－ＶＨＥＧＳ－Ｌ２－ＴＭＤ－（任意選択のＲＢＤ）－Ｃｔｅｒ、（ｉｉｉ）Ｎｔｅｒ－ＶＨＬ－ＶＬ－Ｌ２－ＥＧＳ－ＴＭＤ－（任意選択のＲＢＤ）－Ｃｔｅｒ、および（ｉｖ）Ｎｔｅｒ－ＶＨ－Ｌ－ＶＬ－ＥＧＳ－Ｌ２－ＴＭＤ－（任意選択のＲＢＤ）－Ｃｔｅｒから選択される構造を有し、ＮｔｅｒがＮ末端であり、ＶＬが抗体の可変軽鎖断片であり、Ｌ１がグリシン、セリン、およびトレオニンから選択される約１０～５０アミノ酸の第１のリンカーであり、ＶＨが抗体の可変重鎖断片であり、Ｌ２がグリシン、セリン、およびトレオニンまたは配列番号４１～４６から選択される配列から任意選択で選択される約１０～５０個のアミノ酸の第２のリンカーであり、ＥＧＳが操作されたグリコシル化部位であり、ＴＭＤが膜貫通ドメインであり、ＣｔｅｒがＣ末端である、実施形態１１に記載の細胞外小胞。
【0092】
実施形態１３．グリコシル化部位が、配列番号３７および配列番号３８から選択される配列を含む、実施形態１１または１２に記載の細胞外小胞。
【0093】
実施形態１４．融合タンパク質が、（ｉｖ）エキソソーム標的指向性ドメインをさらに含む、実施形態１～１３に記載の細胞外小胞。
【0094】
実施形態１５．融合タンパク質が、構造（ｉ）Ｎｔｅｒ－ＶＬ－Ｌ－ＶＨ－Ｌ２－ＥＴＤ－ＴＭＤ－（任意選択のＲＢＤ）－Ｃｔｅｒ、（ｉｉ）Ｎｔｅｒ－ＶＬ－Ｌ－ＶＨ－Ｌ２－ＴＭＤ－ＥＴＤ－（任意選択のＲＢＤ）－Ｃｔｅｒ、（ｉｉｉ）Ｎｔｅｒ－ＶＨ－Ｌ－ＶＬ－Ｌ２－ＥＴＤ－ＴＭＤ－（任意選択のＲＢＤ）－Ｃｔｅｒ、および（ｉｖ）Ｎｔｅｒ－ＶＨ－Ｌ－ＶＬ－Ｌ２－ＴＭＤ－ＥＴＤ－（任意選択のＲＢＤ）－Ｃｔｅｒを有し、ＮｔｅｒがＮ末端であり、ＶＬが抗体の可変軽鎖断片であり、Ｌ１がグリシン、セリン、およびトレオニンから選択される約１０～５０個のアミノ酸の第１のリンカーであり、ＶＨが抗体の可変重鎖断片であり、Ｌ２がグリシン、セリン、およびトレオニンまたは配列番号４１～４６から選択される配列から任意選択で選択される約１０～５０個のアミノ酸の第２のリンカーであり、ＴＭＤが膜貫通ドメインであり、ＥＴＤがエキソソーム標的指向性ドメインであり、ＣｔｅｒがＣ末端である，実施形態１４に記載の細胞外小胞。
【0095】
実施形態１６．エキソソーム標的指向性ドメインが、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３１、および配列番号３４、配列番号３５、および配列番号３６からなる群から選択される配列、または配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３１、および配列番号３４、配列番号３５、および配列番号３６に対してそれぞれ少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するそれらの変異型を含む、実施形態１４または１５に記載の細胞外小胞。
【0096】
実施形態１７．細胞外小胞が、小分子の治療薬、治療用ＲＮＡ、および治療用タンパク質からなる群から選択される治療薬をさらに含む、実施形態１～１６のいずれかに記載の細胞外小胞。
【0097】
実施形態１８．細胞外小胞が、カーゴＲＮＡとして治療用ＲＮＡをさらに含み、融合タンパク質が、カーゴＲＮＡのためのＲＮＡ結合ドメインをさらに含み、かつ／または細胞外小胞が、カーゴタンパク質として治療用タンパク質をさらに含み、融合タンパク質が、治療用タンパク質上の同族ドメインに結合するドメインをさらに含む、実施形態１～１７のいずれかに記載の細胞外小胞。
【0098】
実施形態１９．融合タンパク質が、構造Ｎｔｅｒ－ＶＬ－Ｌ１－ＶＨ－ＴＭＤ－ＲＢＤ－ＣｔｅｒまたはＮＮｔｅｒ－ＶＨ－Ｌ１－ＶＬ－ＴＭＤ－ＲＢＤ－Ｃｔｅｒを有し、ＮｔｅｒがＮ末端であり、ＶＬが抗体の可変軽鎖断片であり、Ｌ１がグリシン、セリン、およびトレオニンから選択される約１０～６０個のアミノ酸のリンカーであり、ＶＨが抗体の可変重鎖断片であり、ＴＭＤが膜貫通ドメインであり、ＲＢＤが前記カーゴＲＮＡのためのＲＮＡ結合ドメインであり、ＣｔｅｒがＣ末端である、実施形態１８に記載の細胞外小胞。
【0099】
実施形態２０．カーゴＲＮＡがＲＮＡモチーフを含み、融合タンパク質のＲＮＡ結合ドメインがカーゴＲＮＡのＲＮＡモチーフに特異的に結合する、実施形態１８に記載の細胞外小胞。
【0100】
実施形態２１．ＲＮＡ結合ドメインがバクテリオファージのＲＮＡ結合ドメインであり、ＲＮＡモチーフが、バクテリオファージのＲＮＡの１つ以上の高親和性結合ループを含む、実施形態１８に記載の細胞外小胞。
【0101】
実施形態２２．ＲＮＡ結合ドメインが、配列番号２を含むＭＳ２バクテリオファージのＲＮＡ結合ドメインであるか、または配列番号２と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するその変異型であり、ＲＮＡモチーフが、
（配列表５）
からなる群から選択される配列および構造を含む１つ以上の高親和性結合ループを含み、
Ｎ－Ｎが、塩基対を形成している任意の２つのＲＮＡヌクレオチドである、実施形態２１に記載の細胞外小胞。
（配列表５）
からなる群から選択される配列および構造を含む１つ以上の高親和性結合ループを含み、
Ｎ－Ｎが、塩基対を形成している任意の２つのＲＮＡヌクレオチドである、実施形態２１に記載の細胞外小胞。
【0102】
実施形態２３．高親和性結合ループが、配列番号７、配列番号８、および配列番号９からなる群から選択される配列、または、配列番号７、配列番号８、および配列番号９に対して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性をそれぞれ有するその変異型を含む、実施形態２１に記載の細胞外小胞。
【0103】
実施形態２４．ＲＮＡ結合ドメインが、配列番号１３を含むラムダバクテリオファージのＮタンパク質のＲＮＡ結合ドメインであるか、または、配列番号１３と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するその変異型であり、ＲＮＡモチーフが、
（配列表６）
からなる群から選択される配列および構造を含む１つ以上の高親和性結合ループを含む、実施形態２３に記載の細胞外小胞。
（配列表６）
からなる群から選択される配列および構造を含む１つ以上の高親和性結合ループを含む、実施形態２３に記載の細胞外小胞。
【0104】
実施形態２５．ＲＮＡ結合ドメインは、配列番号１４を含むＰ２２バクテリオファージのＮタンパク質のＲＮＡ結合ドメインであるか、または配列番号１４と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するその変異型であり、ＲＮＡモチーフは、
（配列表７）
の配列および構造を含む１つ以上の高親和性結合ループを含む、実施形態２１に記載の細胞外小胞。
（配列表７）
【0105】
実施形態２６．ＲＮＡ結合ドメインが、配列番号１５を含むｐｈｉ２２バクテリオファージのＮタンパク質のＲＮＡ結合ドメインであるか、または配列番号１５と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するその変異型であり、ＲＮＡモチーフが、
（配列表８）
の配列および構造を含む１つ以上の高親和性結合ループを含む、実施形態２５に記載の細胞外小胞。
（配列表８）
の配列および構造を含む１つ以上の高親和性結合ループを含む、実施形態２５に記載の細胞外小胞。
【0106】
実施形態２７．カーゴＲＮＡは、ＲＮＡモチーフを含み、かつ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｎｃＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、またはこれらのＲＮＡのいずれかの組み合わせをさらに含む、ハイブリッドＲＮＡである、実施形態１８に記載の細胞外小胞。
【0107】
実施形態２８．実施形態１～２７のいずれかに記載の細胞外小胞を調製する方法であって、融合タンパク質をコードするｍＲＮＡを真核細胞内で発現させることを含む、方法。
【0108】
実施形態２９．実施形態１８に記載の細胞外小胞を調製するための方法であって、（ａ）融合タンパク質をコードするｍＲＮＡを真核細胞内で発現させることと、（ｂ）カーゴＲＮＡを真核細胞内で発現させるか、もしくはカーゴＲＮＡで前記真核細胞を形質導入するか、またはカーゴタンパク質を発現させることと、を含む、方法。
【0109】
実施形態３０．実施形態１８に記載の細胞外小胞を調製するためのキットであって、（ａ）融合タンパク質を発現させるためのベクターと、（ｂ）カーゴＲＮＡまたはカーゴタンパク質またはＲＮＡ／タンパク質複合体を発現させるためのベクターと、を含む、キット。
【0110】
実施形態３１．ベクターが別々のベクターである、実施形態３０に記載のキット。
【実施例】
【0111】
以下の実施例は例示的なものであり、特許請求される主題の範囲を限定することを意図していない。
【0112】
実施例１
Ｔｈｉｒｄ Ｃｏａｓｔ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ ＡＩＤＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＣＦＡＲ）Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍにて２０１７年１０月２日に発表された「ＨＩＶプロウイルスＤＮＡを不活性化するための、操作された細胞外小胞に誘導される標的化ヌクレアーゼの送達」（”Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｔｏ ｉｎａｃｔｉｖａｔｅ ＨＩＶ ｐｒｏｖｉｒａｌ ＤＮＡ，”）と題されたポスター発表を参照されたい。なお、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
Ｔｈｉｒｄ Ｃｏａｓｔ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ ＡＩＤＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＣＦＡＲ）Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍにて２０１７年１０月２日に発表された「ＨＩＶプロウイルスＤＮＡを不活性化するための、操作された細胞外小胞に誘導される標的化ヌクレアーゼの送達」（”Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｔｏ ｉｎａｃｔｉｖａｔｅ ＨＩＶ ｐｒｏｖｉｒａｌ ＤＮＡ，”）と題されたポスター発表を参照されたい。なお、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0113】
ＨＩＶプロウイルスＤＮＡを不活性化するための、操作された細胞外小胞に誘導される標的化ヌクレアーゼの送達
【0114】
緒言
ＨＩＶ感染を治癒させることへ大きな障害は、細胞における潜伏ウイルスリザーバーの持続である。最近、Ｃａｓ９およびコンビナトリアルガイドＲＮＡの使用が潜伏プロウイルスを損傷し、ウイルスの脱出を防ぐことが実証されている。このパイロットプロジェクトでは、臨床的に翻訳可能な方法でＴ細胞にＣａｓ９療法を送達するための細胞外小胞の使用を調査する
ＨＩＶ感染を治癒させることへ大きな障害は、細胞における潜伏ウイルスリザーバーの持続である。最近、Ｃａｓ９およびコンビナトリアルガイドＲＮＡの使用が潜伏プロウイルスを損傷し、ウイルスの脱出を防ぐことが実証されている。このパイロットプロジェクトでは、臨床的に翻訳可能な方法でＴ細胞にＣａｓ９療法を送達するための細胞外小胞の使用を調査する
【0115】
機会
潜伏ＨＩＶプロウイルスは、治療の中断または失敗時にウイルス量に寄与し、そのようなリザーバーを排除することは満たされていない臨床的ニーズである。有望な戦略は、ＨＩＶゲノムをＴ細胞に指向させてプロウイルスＤＮＡを損傷させる、Ｃａｓ９など操作されたヌクレアーゼの使用である。そのように取り組みがなされ、インビトロでのウイルス複製を損なわせるが、このアプローチを翻訳するにはいくつかの課題を克服する必要がある。
潜伏ＨＩＶプロウイルスは、治療の中断または失敗時にウイルス量に寄与し、そのようなリザーバーを排除することは満たされていない臨床的ニーズである。有望な戦略は、ＨＩＶゲノムをＴ細胞に指向させてプロウイルスＤＮＡを損傷させる、Ｃａｓ９など操作されたヌクレアーゼの使用である。そのように取り組みがなされ、インビトロでのウイルス複製を損なわせるが、このアプローチを翻訳するにはいくつかの課題を克服する必要がある。
【0116】
課題
ＨＩＶは、タンパク質コード配列または非必須配列で標的にされたヌクレアーゼからすぐに脱出する。（図１を参照のこと）。しかしながら、最近の報告により、Ｃａｓ９を用いて特定の対のＨＩＶ遺伝子座を同時に標的とすることが、ウイルスの複製および脱出を抑制することが実証された。（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．”Ａ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ Ａｔｔａｃｋ ｏｎ ＨＩＶ－１ ＤＮＡ Ｅｘｔｉｎｇｕｉｓｈｅｓ Ａｌｌ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｐｒｏｖｉｒｕｓ ｉｎ Ｉｎｆｅｃｔｅｄ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ，Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ，Ｖｏｌｕｍｅ １７，Ｉｓｓｕｅ １１，ｐ２８１９－２８２６，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ １３，２０１６による図２を参照のこと。なお、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。実際には、ウイルスの除去には、新興ウイルスを抑制するために、多重かつおそらく連続的な標的化ヌクレアーゼ治療を必要とし得る。
ＨＩＶは、タンパク質コード配列または非必須配列で標的にされたヌクレアーゼからすぐに脱出する。（図１を参照のこと）。しかしながら、最近の報告により、Ｃａｓ９を用いて特定の対のＨＩＶ遺伝子座を同時に標的とすることが、ウイルスの複製および脱出を抑制することが実証された。（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．”Ａ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ Ａｔｔａｃｋ ｏｎ ＨＩＶ－１ ＤＮＡ Ｅｘｔｉｎｇｕｉｓｈｅｓ Ａｌｌ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｐｒｏｖｉｒｕｓ ｉｎ Ｉｎｆｅｃｔｅｄ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ，Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ，Ｖｏｌｕｍｅ １７，Ｉｓｓｕｅ １１，ｐ２８１９－２８２６，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ １３，２０１６による図２を参照のこと。なお、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。実際には、ウイルスの除去には、新興ウイルスを抑制するために、多重かつおそらく連続的な標的化ヌクレアーゼ治療を必要とし得る。
【0117】
さらに、ヌクレアーゼをＴ細胞に送達するための容易に翻訳可能な戦略は特定されておらず、特に、複数の回数／種類の治療が必要なのかは特定されていない。したがって、標的化治療薬をインビボでＴ細胞に送達するための新たな方法が必要とされている。
【0118】
戦略
ＥＶは、多くの種類の細胞間でＲＮＡおよびタンパク質を移動させるナノスケール粒子である。（図３を参照のこと）。ますます、ＥＶは、それらが、合成送達ビヒクルと比較して良好な安定性、非毒性、および送達を示すことから、実行可能な治療用送達ビヒクルであると考えられている。所望のカーゴを搭載し、特定の細胞を標的とするようにＥＶを操作する能力により、ＥＶが、Ｔ細胞へのヌクレアーゼ送達のための有望なビヒクルとなる。
ＥＶは、多くの種類の細胞間でＲＮＡおよびタンパク質を移動させるナノスケール粒子である。（図３を参照のこと）。ますます、ＥＶは、それらが、合成送達ビヒクルと比較して良好な安定性、非毒性、および送達を示すことから、実行可能な治療用送達ビヒクルであると考えられている。所望のカーゴを搭載し、特定の細胞を標的とするようにＥＶを操作する能力により、ＥＶが、Ｔ細胞へのヌクレアーゼ送達のための有望なビヒクルとなる。
【0119】
目標
分泌ＥＶに媒介される移動を利用することによって、治療用生体分子をＴ細胞に送達するための新規の戦略を開発することを目指す。具体的には、ＥＶ表面に様々なタンパク質を提示させることによって、ＥＶをＴ細胞に指向させるための様々な方法を探索し、複数のガイドＲＮＡと組み合わせたＣａｓ９タンパク質またはｍＲＮＡの搭載および送達を調査する。（図４を参照のこと）。
分泌ＥＶに媒介される移動を利用することによって、治療用生体分子をＴ細胞に送達するための新規の戦略を開発することを目指す。具体的には、ＥＶ表面に様々なタンパク質を提示させることによって、ＥＶをＴ細胞に指向させるための様々な方法を探索し、複数のガイドＲＮＡと組み合わせたＣａｓ９タンパク質またはｍＲＮＡの搭載および送達を調査する。（図４を参照のこと）。
【0120】
Ｔ細胞を標的とするＥＶを操作する方法
ＥＶ産生細胞における目的カーゴの過剰産生は、ＥＶにおける蓄積の増加につながる。プロデューサーＨＥＫ２９３ＦＴ細胞を様々なＴ細胞指向性構成体でトランスフェクトし、そのような構成体を提示するＥＶを作製する。図５は、抗ＣＤ２ ｓｃＦＶを提示するＥＶを示し、抗ＣＤ２ ｓｃＦＶは、ＨＩＶに潜伏感染したＴ細胞などのＣＤ２担持細胞にこれらのＥＶを指向させる。図６は、麻疹ウイルス糖タンパク質変異型ＨおよびＦを提示するＥＶを示し、これらの変異型は、ＣＤ４６担持細胞およびシグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭ）担持細胞にこれらのＥＶを指向させる。これらのＥＶを利用して、安静Ｔ細胞を形質導入することができる。図７は、細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ－１）を提示するＥＶを示し、細胞間接着分子１は、リンパ球機能関連抗原１（ＬＦＡ－１）担持細胞にこれらのＥＶを指向させる。これらのＥＶを利用して、樹状細胞由来のＥＶの取り込みを増加させることができる。
ＥＶ産生細胞における目的カーゴの過剰産生は、ＥＶにおける蓄積の増加につながる。プロデューサーＨＥＫ２９３ＦＴ細胞を様々なＴ細胞指向性構成体でトランスフェクトし、そのような構成体を提示するＥＶを作製する。図５は、抗ＣＤ２ ｓｃＦＶを提示するＥＶを示し、抗ＣＤ２ ｓｃＦＶは、ＨＩＶに潜伏感染したＴ細胞などのＣＤ２担持細胞にこれらのＥＶを指向させる。図６は、麻疹ウイルス糖タンパク質変異型ＨおよびＦを提示するＥＶを示し、これらの変異型は、ＣＤ４６担持細胞およびシグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭ）担持細胞にこれらのＥＶを指向させる。これらのＥＶを利用して、安静Ｔ細胞を形質導入することができる。図７は、細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ－１）を提示するＥＶを示し、細胞間接着分子１は、リンパ球機能関連抗原１（ＬＦＡ－１）担持細胞にこれらのＥＶを指向させる。これらのＥＶを利用して、樹状細胞由来のＥＶの取り込みを増加させることができる。
【0121】
Ｃａｓ９およびｓｇＲＮＡをＥＶに搭載する方法
産生細胞をＣａｓ９およびｓｇＲＮＡでトランスフェクトし、レシピエント細胞への搭載および機能的送達を調査する。（図８を参照のこと）。Ｃａｓ９タンパク質またはｍＲＮＡとＥＶに富むタンパク質との間の操作された相互作用は、必要に応じて搭載を増加させるよう探索される。
産生細胞をＣａｓ９およびｓｇＲＮＡでトランスフェクトし、レシピエント細胞への搭載および機能的送達を調査する。（図８を参照のこと）。Ｃａｓ９タンパク質またはｍＲＮＡとＥＶに富むタンパク質との間の操作された相互作用は、必要に応じて搭載を増加させるよう探索される。
【0122】
ＥＶ上のｓｃＦＶ提示
必要性：Ｔ細胞は低エンドサイトーシス率を示すため、レシピエント細胞によるＥＶ取り込みを増加させるための方法が必要である。現在未探索の取り組みの１つは、ＥＶと標的細胞との間の結合を増大させるために、ＥＶの表面にｓｃＦｖを提示させることである。ここでは、Ｔ細胞に特異的に指向させるため、ＥＶへの抗ＣＤ２ ｓｃＦｖの提示を調査した。（図９および図１０を参照のこと）。
必要性：Ｔ細胞は低エンドサイトーシス率を示すため、レシピエント細胞によるＥＶ取り込みを増加させるための方法が必要である。現在未探索の取り組みの１つは、ＥＶと標的細胞との間の結合を増大させるために、ＥＶの表面にｓｃＦｖを提示させることである。ここでは、Ｔ細胞に特異的に指向させるため、ＥＶへの抗ＣＤ２ ｓｃＦｖの提示を調査した。（図９および図１０を参照のこと）。
【0123】
抗ＣＤ２ ｓｃＦｖと血小板由来増殖因子受容体膜貫通ドメインとの融合により、ＥＶの２つのサブセットである、微小胞（細胞表面から直接出芽）およびエキソソーム（エンドソーム経路を起源とする）へのｓｃＦｖの局在化がもたらされる。
【0124】
細胞溶解物（２μｇ）またはＥＶ（レーンあたり８．９×１０８）を搭載し、構成体を抗ＦＬＡＧ抗体によって検出した。（図９および図１０を参照のこと）。完全長ｓｃＦｖ構成体の予測：約４０ｋＤａ。ＦＬＡＧ－ＧＤＧＦＲ構成体（約１２ｋＤａ）は、Ｅｖ提示対照としてｓｃＦｖ領域を欠く。ＳｃＦｖは、複数のＥＶサブセットに提示され得ることが観察された。
【0125】
進行中の作業の一環として、ＥＶ上でｓｃＦｖの提示を増加させる方法を探索中である。また、Ｊｕｒｋａｔ細胞および初代Ｔ細胞へのｓｃＦｖ提示ＥＶの結合および取り込みも調査中である。さらに、麻疹ウイルス糖タンパク質変異型ＨおよびＦをＥＶの表面に提示させており、ＥＶ取り込みに対する影響を調査中である。最後に、Ｃａｓ９およびｓｇＲＮＡのＥＶ中への搭載、ならびにレシピエント細胞への機能的送達を評価する予定である。（図１１を参照のこと）。
【0126】
上記の説明において、本発明の範囲および趣旨から逸脱することなく、本明細書に開示される本発明に様々な置換および変更が行われ得ることは当業者に容易に明らかとなるであろう。本明細書に例示的に説明されている本発明は、本明細書に具体的に開示されていない任意の要素（複数可）、制限（複数可）の不在下で好適に実施され得る。使用された用語および表現は、限定ではなく説明の用語として使用されており、そのような用語および表現の使用において、示されるか記載されている特徴またはその一部のいかなる等価物をも除外する意図はないが、本発明の範囲内で様々な変更が可能であることが認識される。したがって、本発明は、特定の実施形態および任意の特徴によって例示されているが、本明細書に開示される概念の変更および／または変形は、当業者によって行われてよく、そのような変更および変形は、本発明の範囲内であると見なされることを理解されるべきである。
【0127】
いくつかの特許および非特許の参考文献への引用が本明細書で行われる。引用される参照文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。引用文献における用語の定義と比較して、本明細書における用語の定義との間に矛盾がある場合、その用語は本明細書における定義に基づいて解釈されるべきである。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【配列表】