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特許7416445ブタにおけるＴ細胞の活性化度を評価する方法、ブタにおけるＴ細胞活性化を評価する剤、ブタＴ細胞活性化剤をスクリーニングする方法、ブタの病原体感染を検査する方法、及びハイブリドーマ
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-01-09
(45)【発行日】2024-01-17
(54)【発明の名称】ブタにおけるＴ細胞の活性化度を評価する方法、ブタにおけるＴ細胞活性化を評価する剤、ブタＴ細胞活性化剤をスクリーニングする方法、ブタの病原体感染を検査する方法、及びハイブリドーマ
(51)【国際特許分類】
G01N 33/68 20060101AFI20240110BHJP
G01N 33/50 20060101ALI20240110BHJP
C12Q 1/06 20060101ALI20240110BHJP
C07K 14/705 20060101ALN20240110BHJP
C12N 5/0783 20100101ALN20240110BHJP
【ＦＩ】
G01N33/68 ZNA
G01N33/50 K
G01N33/50 Z
C12Q1/06
C07K14/705
C12N5/0783
【請求項の数】
2
(21)【出願番号】P 2021502039
(86)(22)【出願日】2020-02-18
(86)【国際出願番号】 JP2020006335
(87)【国際公開番号】W WO2020171080
(87)【国際公開日】2020-08-27
【審査請求日】2022-03-29
(31)【優先権主張番号】P 2019026862
(32)【優先日】2019-02-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 発行所ＷＩＬＥＹが平成３０年２月１８日にＡｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｊｏｕｒｎａｌ（２０１８）８９，８２５－８３２をオンラインにて発行した。
(73)【特許権者】
【識別番号】505327631
【氏名又は名称】株式会社栄養・病理学研究所
(74)【代理人】
【識別番号】100131705
【弁理士】
【氏名又は名称】新山 雄一
(74)【代理人】
【識別番号】100114292
【弁理士】
【氏名又は名称】来間 清志
(74)【代理人】
【識別番号】100164758
【弁理士】
【氏名又は名称】長谷川 博道
(72)【発明者】
【氏名】塚原 隆充
(72)【発明者】
【氏名】井上 亮
【審査官】三木 隆
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１２－５２４７８０（ＪＰ，Ａ）
【文献】林裕美子等，細胞性免疫評価に有用な抗ブタCD69抗体の作製，日本畜産学会大会講演要旨，2015年09月11日，Vol.120th，Page.42
【文献】長谷川明洋等，免疫炎症疾患におけるCD4T細胞の役割：新展開－抗炎症治療ターゲットとしてのCD69－，Jpn. J. Clin. Immunol.，2010年，Vol.33 No.4，Page.189-195
【文献】Laurence Piriou-Guzylack et al.，Membrane markers of the immune cells in swine: an update，Vet. Res.，2008年，39:54，10
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｇ０１Ｎ ３３／６８
Ｇ０１Ｎ ３３／５０
Ｃ１２Ｑ １／０６
Ｃ０７Ｋ １４／７０５
Ｃ１２Ｎ ５／０７８３
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ブタ由来の検体中のＣＤ６９タンパク質の存在量を定量する工程を含む、ブタの病原体による感染を検査する方法であって、前記ブタが予めワクチン接種していないブタであり、前記定量を行い、
健常時の当該ブタの前記検体から得られた測定値、又は、健常ブタの検体群から予め収集して得られた統計的な値若しくは範囲に対してＣＤ６９タンパク質の前記存在量が低下している場合、前記接種していないワクチンに対応する病原体により前記ブタが感染したと検査する工程を含む、方法。
【請求項2】
前記感染が、ブタ繁殖障害・呼吸障害症候群（ＰＲＲＳ）、及びブタ流行性下痢（ＰＥＤ）よりなる群から選択される少なくとも１つのウイルスによる感染、細菌感染、原虫感染、又は真菌感染である、請求項１に記載の方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ブタにおける細胞性免疫の主体となるＴ細胞の活性化度を評価する方法、ブタにおけるＴ細胞活性化を評価する剤、ブタＴ細胞活性化剤をスクリーニングする方法、ブタの病原体感染を検査する方法、及びブタＣＤ６９タンパク質に選択的に結合する抗体を産生するハイブリドーマに関する。
【背景技術】
【0002】
ブタサーコウイルス関連疾患（ＰＣＶＡＤ）、ブタ生殖器・呼吸器症候群（ＰＲＲＳ）、ブタ流行性下痢（ＰＥＤ）などの感染症は世界中のブタの個体数に深刻な影響を及ぼしている。ワクチン接種はこれら感染症の拡大を防ぐための１つの手段である。
体液性免疫は主にＢ細胞が介在することが知られており、上記体液性免疫に対する上記ワクチン接種の有効性分析のために、抗体価が評価されてきた。
しかしながら、感染源によっては体液性免疫及び細胞性免疫のいずれが有効であるかは本来的には様々であるはずである。
体液性免疫は主にＢ細胞が介在することが知られており、上記体液性免疫に対する上記ワクチン接種の有効性分析のために、抗体価が評価されてきた。
しかしながら、感染源によっては体液性免疫及び細胞性免疫のいずれが有効であるかは本来的には様々であるはずである。
【0003】
例えば、ＰＲＲＳウイルス（ＰＲＲＳＶ）感染の過程において、抗体が、生きているウイルスの食作用を増強することにより感染をさらに加速してしまうことが知られており（非特許文献１及び２）、ワクチンによる疾病対策が困難であることが知られている。
また、抗体ではＰＲＲＳＶ感染細胞を完全に除去するのは困難であり、細胞性免疫は、感染細胞を排除するために体液性免疫よりも効果的であると知られている（非特許文献３）。
また、抗体ではＰＲＲＳＶ感染細胞を完全に除去するのは困難であり、細胞性免疫は、感染細胞を排除するために体液性免疫よりも効果的であると知られている（非特許文献３）。
【0004】
また、ブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）によるＰＣＶＡＤはワクチン接種により効果的に予防し得る。
上記ワクチン接種が、ＰＣＶ２特異的インターフェロン（ＩＦＮ）－γ産生細胞及びＰＣＶ２特異的腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）－α産生細胞を誘導する一方、ＰＣＶ２特異的抗体は誘導しないことが報告されており（非特許文献４）、上記ワクチン接種による予防には細胞性免疫が関与していることが示唆される。
上記ワクチン接種が、ＰＣＶ２特異的インターフェロン（ＩＦＮ）－γ産生細胞及びＰＣＶ２特異的腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）－α産生細胞を誘導する一方、ＰＣＶ２特異的抗体は誘導しないことが報告されており（非特許文献４）、上記ワクチン接種による予防には細胞性免疫が関与していることが示唆される。
【0005】
しかしながら、ヒトモデル及びマウスモデルを用いた疾患の研究とは異なり、ブタの疾患の研究においては、細胞性免疫については看過されてきたのが現状である。
例えば、活性化ブタＴ細胞のマーカー物質等は未だ見出されていないこと等から、ブタにおけるＴ細胞活性の評価は、免疫細胞からの分泌物質の一部の作用を指標として、Ｔ細胞の活性を間接的に評価する、Ｅｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ（ＥＬＩＳｐｏｔ）、遅延型過敏症等の間接的方法にほとんど依存している（非特許文献５及び６）。
例えば、活性化ブタＴ細胞のマーカー物質等は未だ見出されていないこと等から、ブタにおけるＴ細胞活性の評価は、免疫細胞からの分泌物質の一部の作用を指標として、Ｔ細胞の活性を間接的に評価する、Ｅｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ（ＥＬＩＳｐｏｔ）、遅延型過敏症等の間接的方法にほとんど依存している（非特許文献５及び６）。
【0006】
しかしながら、ＥＬＩＳｐｏｔ等の間接的方法で検出し得る分泌物質の多少では区別できない活性化されたＴ細胞の存在も、あり得る。
したがって、活性化したＴ細胞の特質等を指標として直接的にＴ細胞の活性を評価し得る上記間接的方法に代わる直接的な方法が求められるが、ブタにおけるＴ細胞の活性を直接評価する方法は、未だ開発されていないのが現状である（非特許文献７及び８）。
したがって、活性化したＴ細胞の特質等を指標として直接的にＴ細胞の活性を評価し得る上記間接的方法に代わる直接的な方法が求められるが、ブタにおけるＴ細胞の活性を直接評価する方法は、未だ開発されていないのが現状である（非特許文献７及び８）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0007】
【文献】Ｙｏｏｎ ＫＪ，Ｗｕ ＬＬ，Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ ＪＪ，Ｈｉｌｌ ＨＴ，Ｐｌａｔｔ ＫＢ．１９９６．「Ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ （ＡＤＥ） ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ａｎｄ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｖｉｒｕｓ（ＰＲＲＳＶ） ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｐｉｇｓ．」Ｖｉｒａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ９，５１－６３．
【文献】Ｔｉｒａｄｏ ＳＭ，Ｙｏｏｎ ＫＪ．２００３．「Ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ．」Ｖｉｒａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １６，６９－８６．
【文献】Ｊｉｎ Ｘ，Ｂａｕｅｒ ＤＥ，Ｔｕｔｔｌｅｔｏｎ ＳＥ，Ｌｅｗｉｎ Ｓ，Ｇｅｔｔｉｅ Ａ，Ｂｌａｎｃｈａｒｄ Ｊ， ｅｔ ａｌ．１９９９．「Ｄｒａｍａｔｉｃ ｒｉｓｅ ｉｎ ｐｌａｓｍａ ｖｉｒｅｍｉａ ａｆｔｅｒ ＣＤ８（＋） Ｔ ｃｅｌｌ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ｉｎ ｓｉｍｉａｎｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ－ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｍａｃａｑｕｅｓ．」Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １８９，９９１－９９８．
【文献】Ｋｏｉｎｉｇ ＨＣ，Ｔａｌｋｅｒ ＳＣ，Ｓｔａｄｌｅｒ Ｍ，Ｌａｄｉｎｉｇ Ａ，Ｇｒａａｇｅ Ｒ，Ｒｉｔｚｍａｎｎ Ｍ， ｅｔ ａｌ．２０１５．「ＰＣＶ２ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｓ ＩＦＮ－ｇａｍｍａ／ＴＮＦ－ａｌｐｈａ ｃｏ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｒｏｌｅ ｉｎ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ．」Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４６，２０．
【文献】Ｆｅｎｇ ＷＨ，Ｔｏｍｐｋｉｎｓ ＭＢ，Ｘｕ ＪＳ，Ｚｈａｎｇ ＨＸ，Ｍｃｃａｗ ＭＢ．２００３．「Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ｐｉｇｓ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｉｎ－ｕｔｅｒｏ ｗｉｔｈ ｐｏｒｃｉｎｅ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ａｎｄ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｖｉｒｕｓ．」Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ９４，３５－４５．
【文献】Ｋｌｉｎｇｅ ＫＬ，Ｖａｕｇｈｎ ＥＭ，Ｒｏｏｆ ＭＢ，Ｂａｕｔｉｓｔａ ＥＭ，Ｍｕｒｔａｕｇｈ ＭＰ．２００９．「Ａｇｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ Ｐｏｒｃｉｎｅ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ａｎｄ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｖｉｒｕｓ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｓｗｉｎｅ．」Ｖｉｒｏｌｏｇｙ Ｊｏｕｒｎａｌ ６，１７７．
【文献】Ｌｉ Ｊ，Ｌｉ Ｙ，Ｙａｏ ＪＹ，Ｊｉｎ Ｒ，Ｚｈｕ ＭＺ，Ｑｉａｎ ＸＰ，ｅｔ ａｌ．２００７．「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｐａｔｈｗａｙ ｏｆ ＣＤ４＋ ＣＤ８－ ｍｅｄｕｌｌａｒｙ ｔｈｙｍｏｃｙｔｅｓ ｄｕｒｉｎｇ ｍｏｕｓｅ ｏｎｔｏｇｅｎｙ ａｎｄ ｉｔｓ ｄｅｆｅｃｔ ｉｎ Ａｉｒｅ－／－ｍｉｃｅ．」Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ １０４，１８１７５－１８１８０．
【文献】Ｒａｖｅｔ Ｓ，Ｓｃｏｔｔ－Ａｌｇａｒａ Ｄ，Ｂｏｎｎｅｔ Ｅ，Ｔｒａｎ ＨＫ，Ｔｒａｎ Ｔ，Ｎｇｕｙｅｎ Ｎ， ｅｔ ａｌ．２００７．「Ｄｉｓｔｉｎｃｔｉｖｅ ＮＫ－ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ ｓｕｓｔａｉｎ ｈｉｇｈ－ｌｅｖｅｌ ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ ＮＫ－ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｉｎ ＨＩＶ－ｅｘｐｏｓｅｄ ｕｎｉｎｆｅｃｔｅｄ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ．」Ｂｌｏｏｄ １０９，４２９６－４３０５．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
本発明は、このような従来技術の実情に鑑みてなされたものであり、ブタにおける細胞性免疫の主体となるＴ細胞の活性化度を評価する方法、ブタにおけるＴ細胞活性化を評価する剤、ブタＴ細胞活性化剤をスクリーニングする方法、ブタの病原体感染を検査する方法、及びブタＣＤ６９タンパク質に選択的に結合する抗体を産生するハイブリドーマを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、ブタのＴ細胞においてＣＤ６９遺伝子が発現するだけでなく、その表面に発現することを初めて発見し、さらには、その細胞表面にＣＤ６９タンパク質が発現するＴ細胞の頻度が免疫刺激に反応して増すことを見出した。
本発明は、上記知見に基づき完成されるに至ったものである。
すなわち本発明は以下の通りである。
本発明は、上記知見に基づき完成されるに至ったものである。
すなわち本発明は以下の通りである。
【0010】
＜１＞ブタ由来の検体中のＣＤ６９タンパク質の存在量を定量する工程を含む、ブタにおけるＴ細胞の活性化度を評価する方法。
＜２＞細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、記憶性Ｔ細胞及びγδＴ細胞よりなる群から選択される少なくとも１種のＴ細胞を識別する工程を更に含む、＜１＞に記載の方法。
＜３＞ブタＣＤ６９タンパク質の定量化剤を含む、ブタにおけるＴ細胞活性化を評価する剤。
＜４＞細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、記憶性Ｔ細胞及びγδＴ細胞よりなる群から選択される少なくとも１種のＴ細胞を識別する剤と併用して用いられる、＜３＞に記載の剤。
＜５＞被験物質を投与したブタ由来の検体中のＣＤ６９タンパク質の存在量に基づき評価されるＴ細胞の活性化度の増加を指標としてブタＴ細胞活性化剤をスクリーニングする方法。
＜６＞前記ブタＴ細胞活性化剤が、ブタ疾患に対するワクチン候補物質及び細胞性免疫活性化剤よりなる群から選択される少なくとも１つの剤である、＜５＞に記載の方法。
＜７＞ブタ由来の検体中のＣＤ６９タンパク質の存在量を定量する工程を含む、ブタの病原体感染を検査する方法。
＜８＞ブタ由来の検体中のＣＤ６９タンパク質の存在量を定量する工程を含む、ブタの病原体感染を検査する方法であって、
前記ブタが予めワクチン接種して免疫獲得後のブタであり、前記定量を行い、健常時の当該ブタ又は健常ブタに対してＣＤ６９タンパク質の前記存在量が増加している場合、前記ワクチンに対応する病原体により前記ブタが感染したと検査（診断若しくは判定）する工程、又は、
前記ブタが予めワクチン接種していないブタであり、前記定量を行い、健常時の当該ブタ又は健常ブタに対してＣＤ６９タンパク質の前記存在量が低下している場合、前記接種していないワクチンに対応する病原体により前記ブタが感染したと検査（診断若しくは判定）する工程
を含む、方法。
＜９＞
ブタ由来の検体中のＣＤ６９タンパク質の存在量を定量する工程を含む、ブタの病原体感染を検査する方法であって、
前記検体に抗原刺激を付与した後に前記定量を行い、前記抗原刺激を付与していない前記検体又は健常ブタの検体に対してＣＤ６９タンパク質の前記存在量が増加している場合、当該ブタが前記病原体に感染したと検査する工程を含む、方法。
＜１０＞前記ＣＤ６９タンパク質の存在量が、ブタＴ細胞表面における存在量、又は、健常ブタ若しくは前記ワクチン接種前のブタと比較してＣＤ６９タンパク質が細胞表面に多く存在するＴ細胞の前記検体中の存在割合である、＜７＞～＜９＞のいずれか１項に記載の方法。
＜１１＞ブタＣＤ６９タンパク質に選択的に結合する抗体を産生するハイブリドーマ。
＜２＞細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、記憶性Ｔ細胞及びγδＴ細胞よりなる群から選択される少なくとも１種のＴ細胞を識別する工程を更に含む、＜１＞に記載の方法。
＜３＞ブタＣＤ６９タンパク質の定量化剤を含む、ブタにおけるＴ細胞活性化を評価する剤。
＜４＞細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、記憶性Ｔ細胞及びγδＴ細胞よりなる群から選択される少なくとも１種のＴ細胞を識別する剤と併用して用いられる、＜３＞に記載の剤。
＜５＞被験物質を投与したブタ由来の検体中のＣＤ６９タンパク質の存在量に基づき評価されるＴ細胞の活性化度の増加を指標としてブタＴ細胞活性化剤をスクリーニングする方法。
＜６＞前記ブタＴ細胞活性化剤が、ブタ疾患に対するワクチン候補物質及び細胞性免疫活性化剤よりなる群から選択される少なくとも１つの剤である、＜５＞に記載の方法。
＜７＞ブタ由来の検体中のＣＤ６９タンパク質の存在量を定量する工程を含む、ブタの病原体感染を検査する方法。
＜８＞ブタ由来の検体中のＣＤ６９タンパク質の存在量を定量する工程を含む、ブタの病原体感染を検査する方法であって、
前記ブタが予めワクチン接種して免疫獲得後のブタであり、前記定量を行い、健常時の当該ブタ又は健常ブタに対してＣＤ６９タンパク質の前記存在量が増加している場合、前記ワクチンに対応する病原体により前記ブタが感染したと検査（診断若しくは判定）する工程、又は、
前記ブタが予めワクチン接種していないブタであり、前記定量を行い、健常時の当該ブタ又は健常ブタに対してＣＤ６９タンパク質の前記存在量が低下している場合、前記接種していないワクチンに対応する病原体により前記ブタが感染したと検査（診断若しくは判定）する工程
を含む、方法。
＜９＞
ブタ由来の検体中のＣＤ６９タンパク質の存在量を定量する工程を含む、ブタの病原体感染を検査する方法であって、
前記検体に抗原刺激を付与した後に前記定量を行い、前記抗原刺激を付与していない前記検体又は健常ブタの検体に対してＣＤ６９タンパク質の前記存在量が増加している場合、当該ブタが前記病原体に感染したと検査する工程を含む、方法。
＜１０＞前記ＣＤ６９タンパク質の存在量が、ブタＴ細胞表面における存在量、又は、健常ブタ若しくは前記ワクチン接種前のブタと比較してＣＤ６９タンパク質が細胞表面に多く存在するＴ細胞の前記検体中の存在割合である、＜７＞～＜９＞のいずれか１項に記載の方法。
＜１１＞ブタＣＤ６９タンパク質に選択的に結合する抗体を産生するハイブリドーマ。
【発明の効果】
【0011】
本発明によれば、ブタにおける細胞性免疫の主体となるＴ細胞の活性化度を評価する方法、ブタにおけるＴ細胞活性化を評価する剤、ブタＴ細胞活性化剤をスクリーニングする方法、ブタの病原体感染を検査する方法、及びブタＣＤ６９タンパク質に選択的に結合する抗体を産生するハイブリドーマを提供し得る。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1】Ｔ細胞活性化に伴うＣＤ６９タンパク質発現量の変化を示す図である。
【図2】Ｔ細胞の各サブセット（細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、及び記憶性Ｔ細胞）個別の活性化によるＣＤ６９タンパク質発現量の変化を示す図である。
【図3】ＣＤ６９及びＣＤ３タンパク質の発現量に基づくＰＲＲＳＶ感染前後におけるブタＴ細胞の活性化の変化を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0013】
以下、本発明の実施態様について詳細に説明するが、本発明は、以下の実施態様に何ら限定されるものではなく、本発明の目的の範囲内において、適宜変更を加えて実施することができる。
【0014】
（ブタＣＤ６９タンパク質）
Ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ６９（ＣＤ６９；以前はＥＡ１、ＭＬＲ３、ＡＩＭ、Ｌｅｕ２３、又はＢＬ－Ａｃ／ｐ２６としても知られている）は、Ｃ型レクチンスーパーファミリーのＩＩ型膜タンパク質として知られている。
ブタＣＤ６９のｃＤＮＡは、３８アミノ酸の細胞内領域、２６アミノ酸の膜貫通ドメイン、及び１３６アミノ酸の細胞外ドメインからなる２００アミノ酸のポリペプチド配列をコードする。また、ブタＣＤ６９のアミノ酸配列は、ウシ、ヒト及びマウスのＣＤ６９分子のアミノ酸配列とそれぞれ約７５％、約６７％及び約５７％類似していることが知られている（Ｙｉｍ Ｄ，Ｓｏｔｉｒｉａｄｉｓ Ｊ，Ｋｉｍ ＫＳ，Ｓｈｉｎ ＳＣ，Ｊｉｅ ＨＢ，Ｒｏｔｈｓｃｈｉｌｄ ＭＦ，ｅｔ ａｌ． ２００２．「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ， ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎ ａｎｄ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ｐｉｇ ＣＤ６９．」Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ５４，２７６－２８１．）。
ブタＣＤ６９タンパク質のアミノ酸配列や遺伝子配列は既に報告されている（非特許文献９）。配列番号１は、ブタＣＤ６９タンパク質のアミノ酸配列を表す。
配列表の配列番号１に記載したブタＣＤ６９タンパク質のアミノ酸配列上の置換、挿入、欠失等による変異タンパク質であっても、その変異がブタＣＤ６９タンパク質の３次元構造において保存性が高い変異であれば、これらは全てブタＣＤ６９タンパク質の範囲内に属し得る。
タンパク質の構成要素となるアミノ酸の側鎖は、疎水性、電荷、大きさなどにおいてそれぞれ異なるものであるが、実質的にタンパク質全体の３次元構造（立体構造とも言う）に影響を与えないという意味で保存性の高い幾つかの関係が、経験的にまた物理化学的な実測により知られている。例えば、アミノ酸残基の置換については、グリシン（Ｇｌｙ）とプロリン（Ｐｒｏ）、Ｇｌｙとアラニン（Ａｌａ）又はバリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）とイソロイシン（Ｉｌｅ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）とグルタミン（Ｇｌｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）とアスパラギン（Ａｓｎ）、システイン（Ｃｙｓ）とスレオニン（Ｔｈｒ）、Ｔｈｒとセリン（Ｓｅｒ）又はＡｌａ、リジン（Ｌｙｓ）とアルギニン（Ａｒｇ）等が挙げられる。
Ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ６９（ＣＤ６９；以前はＥＡ１、ＭＬＲ３、ＡＩＭ、Ｌｅｕ２３、又はＢＬ－Ａｃ／ｐ２６としても知られている）は、Ｃ型レクチンスーパーファミリーのＩＩ型膜タンパク質として知られている。
ブタＣＤ６９のｃＤＮＡは、３８アミノ酸の細胞内領域、２６アミノ酸の膜貫通ドメイン、及び１３６アミノ酸の細胞外ドメインからなる２００アミノ酸のポリペプチド配列をコードする。また、ブタＣＤ６９のアミノ酸配列は、ウシ、ヒト及びマウスのＣＤ６９分子のアミノ酸配列とそれぞれ約７５％、約６７％及び約５７％類似していることが知られている（Ｙｉｍ Ｄ，Ｓｏｔｉｒｉａｄｉｓ Ｊ，Ｋｉｍ ＫＳ，Ｓｈｉｎ ＳＣ，Ｊｉｅ ＨＢ，Ｒｏｔｈｓｃｈｉｌｄ ＭＦ，ｅｔ ａｌ． ２００２．「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ， ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎ ａｎｄ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ｐｉｇ ＣＤ６９．」Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ５４，２７６－２８１．）。
ブタＣＤ６９タンパク質のアミノ酸配列や遺伝子配列は既に報告されている（非特許文献９）。配列番号１は、ブタＣＤ６９タンパク質のアミノ酸配列を表す。
配列表の配列番号１に記載したブタＣＤ６９タンパク質のアミノ酸配列上の置換、挿入、欠失等による変異タンパク質であっても、その変異がブタＣＤ６９タンパク質の３次元構造において保存性が高い変異であれば、これらは全てブタＣＤ６９タンパク質の範囲内に属し得る。
タンパク質の構成要素となるアミノ酸の側鎖は、疎水性、電荷、大きさなどにおいてそれぞれ異なるものであるが、実質的にタンパク質全体の３次元構造（立体構造とも言う）に影響を与えないという意味で保存性の高い幾つかの関係が、経験的にまた物理化学的な実測により知られている。例えば、アミノ酸残基の置換については、グリシン（Ｇｌｙ）とプロリン（Ｐｒｏ）、Ｇｌｙとアラニン（Ａｌａ）又はバリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）とイソロイシン（Ｉｌｅ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）とグルタミン（Ｇｌｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）とアスパラギン（Ａｓｎ）、システイン（Ｃｙｓ）とスレオニン（Ｔｈｒ）、Ｔｈｒとセリン（Ｓｅｒ）又はＡｌａ、リジン（Ｌｙｓ）とアルギニン（Ａｒｇ）等が挙げられる。
【0015】
≪ブタにおけるＴ細胞の活性化度を評価する方法≫
本発明の第１の態様は、ブタ由来の検体中のＣＤ６９タンパク質の存在量を定量する工程を含む、ブタにおけるＴ細胞の活性化度を評価する方法である。
上記存在量としては、ブタＴ細胞表面におけるＣＤ６９タンパク質の存在量であることが好ましい。
ブタ由来の検体中のＣＤ６９タンパク質の存在量を指標として、ブタにおけるＴ細胞の活性化度（免疫による活性化の程度）を評価し得る。
上記検体中のＣＤ６９タンパク質の存在量は、検体中のＴ細胞集団に含まれる１細胞ごと又は２細胞以上に関するＣＤ６９タンパク質の存在量であってよい。２細胞以上に関するＣＤ６９タンパク質の存在量は、平均値、中央値、積分値等の分布（典型的には、各細胞のＣＤ６９タンパク質の存在量と、各細胞の存在頻度との２軸でプロットされた分布の全体、またはＣＤ６９タンパク質の存在量が所定範囲内であるＴ細胞画分）を表すパラメータで表現されてよい。
上記存在量としては、上記検体中のＣＤ６９タンパク質を発現する細胞の存在割合であってもよい。
傾向として、上記存在量が高いとＴ細胞の活性化度が高く、上記存在量が低いとＴ細胞の活性化度が低いと言える。
本発明の第１の態様は、ブタ由来の検体中のＣＤ６９タンパク質の存在量を定量する工程を含む、ブタにおけるＴ細胞の活性化度を評価する方法である。
上記存在量としては、ブタＴ細胞表面におけるＣＤ６９タンパク質の存在量であることが好ましい。
ブタ由来の検体中のＣＤ６９タンパク質の存在量を指標として、ブタにおけるＴ細胞の活性化度（免疫による活性化の程度）を評価し得る。
上記検体中のＣＤ６９タンパク質の存在量は、検体中のＴ細胞集団に含まれる１細胞ごと又は２細胞以上に関するＣＤ６９タンパク質の存在量であってよい。２細胞以上に関するＣＤ６９タンパク質の存在量は、平均値、中央値、積分値等の分布（典型的には、各細胞のＣＤ６９タンパク質の存在量と、各細胞の存在頻度との２軸でプロットされた分布の全体、またはＣＤ６９タンパク質の存在量が所定範囲内であるＴ細胞画分）を表すパラメータで表現されてよい。
上記存在量としては、上記検体中のＣＤ６９タンパク質を発現する細胞の存在割合であってもよい。
傾向として、上記存在量が高いとＴ細胞の活性化度が高く、上記存在量が低いとＴ細胞の活性化度が低いと言える。
【0016】
ＣＤ６９タンパク質の存在量についての対照は、その目的に応じて適宜選択されてよく、例えば、健常ブタの検体中のＣＤ６９タンパク質の存在量（その場で定量した量でもよいし、予め定めた範囲でもよい）、免疫刺激の適用前又は非適用のブタの検体中のＣＤ６９タンパク質の存在量、被験物質の投与前又は非投与のブタの検体中のＣＤ６９タンパク質の存在量であってよい。
【0017】
ブタ由来の検体中のＣＤ６９タンパク質の存在量を指標として、ブタにおけるＴ細胞の活性化度を評価し得る理由は以下のように推定される。
【0018】
まず、ＣＤ６９タンパク質はスフィンゴシン１－リン酸受容体１（Ｓ１Ｐ１）と複合体を形成することにより、Ｓ１Ｐ１が仲介する細胞遊走を阻害し得る。その結果、ＣＤ６９タンパク質を発現するＴ細胞はリンパ組織に留まり、そこでＴ細胞は分裂し増殖して活性化し得る。
【0019】
また、ＣＤ６９タンパク質の発現が誘導されると、転写因子活性化タンパク質１（ＡＰ－１）も誘導され、ＡＰ－１により各種免疫細胞が活性化し得る。
例えば、ＡＰ－１により、インターロイキン－２（ＩＬ－２）のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の発現が増加し得、ＩＬ－２は細胞傷害性Ｔ細胞の生成及びＮＫ細胞の活性化を誘導し得る。
以上のように、ＣＤ６９タンパク質の発現の増加は、Ｔ細胞等の細胞性免疫の活性化をもたらすと推定し得る。
例えば、ＡＰ－１により、インターロイキン－２（ＩＬ－２）のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の発現が増加し得、ＩＬ－２は細胞傷害性Ｔ細胞の生成及びＮＫ細胞の活性化を誘導し得る。
以上のように、ＣＤ６９タンパク質の発現の増加は、Ｔ細胞等の細胞性免疫の活性化をもたらすと推定し得る。
【0020】
上記増加としては特に制限はないが、対照に比べて２倍以上、５倍以上、１０倍以上に、又は１５倍以上であってよい。
上記増加の上限値としては特に制限はないが、対照に対し、例えば、４０倍以下、３０倍以下が挙げられる。
上記増加の上限値としては特に制限はないが、対照に対し、例えば、４０倍以下、３０倍以下が挙げられる。
【0021】
上記低下は特に制限はないが、対照に比べて、１／２以下、１／５以下、１／１０以下、又は１／１５以下であってよい。
上記低下の程度の下限値としては特に制限はないが、例えば、１／４０以上、１／３０以上が挙げられる。
上記低下の程度の下限値としては特に制限はないが、例えば、１／４０以上、１／３０以上が挙げられる。
【0022】
第１の態様に係るＴ細胞の活性化度を評価する方法において、ブタ由来の検体としては任意の検体でよく、例えば、血液、尿、汗等が挙げられ、血液が好ましい。
第１の態様に係るＴ細胞の活性化度を評価する方法において、上記定量は、標識物質（例えば、標識抗体）における測定される標識の強度（例えば、吸光度、酵素標識強度、蛍光強度、紫外線強度、放射線強度等）に基づき得る。
また、上記強度と、ＣＤ６９タンパク質の量（例えば、濃度、好ましくは、ＣＤ６９タンパク質を発現する細胞数、ＣＤ６９タンパク質を発現する細胞の存在割合）との関係に基づき検量線を作成し、上記検量線に基づき（例えば、対比して）定量してもしなくてもよい。
上記定量としては、フローサイトメトリー、酵素免疫測定法（ＥＩＡ，ＥＬＩＳＡ）、蛍光酵素免疫測定法（ＦＬＥＩＡ）、化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ）、化学発光免疫測定法（ＣＬＩＡ）、電気化学発光測免疫測定法（ＥＣＬＩＡ）、蛍光抗体法（ＦＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ウェスタンブロット法（ＷＢ）、イムノブロット法などに基づく定量が挙げられる。
第１の態様に係るＴ細胞の活性化度を評価する方法において、上記定量は、標識物質（例えば、標識抗体）における測定される標識の強度（例えば、吸光度、酵素標識強度、蛍光強度、紫外線強度、放射線強度等）に基づき得る。
また、上記強度と、ＣＤ６９タンパク質の量（例えば、濃度、好ましくは、ＣＤ６９タンパク質を発現する細胞数、ＣＤ６９タンパク質を発現する細胞の存在割合）との関係に基づき検量線を作成し、上記検量線に基づき（例えば、対比して）定量してもしなくてもよい。
上記定量としては、フローサイトメトリー、酵素免疫測定法（ＥＩＡ，ＥＬＩＳＡ）、蛍光酵素免疫測定法（ＦＬＥＩＡ）、化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ）、化学発光免疫測定法（ＣＬＩＡ）、電気化学発光測免疫測定法（ＥＣＬＩＡ）、蛍光抗体法（ＦＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ウェスタンブロット法（ＷＢ）、イムノブロット法などに基づく定量が挙げられる。
【0023】
第１の態様に係るＴ細胞の活性化度を評価する方法において、αβＴ細胞（好ましくは細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞及び記憶性Ｔ細胞）並びにγδＴ細胞よりなる群から選択される少なくとも１種のＴ細胞を識別する工程を更に含むことが好ましい。
細胞型及びサブセットを同定（好ましくは、フローサイトメトリーによる同定）する観点から、マーカー分子に選択的に結合する抗体が知られている（Ｏｇａｗａ Ｓ，Ｔｓｕｋａｈａｒａ Ｔ，Ｉｍａｏｋａ Ｔ，Ｎａｋａｎｉｓｈｉ Ｎ，Ｕｓｈｉｄａ Ｋ，Ｉｎｏｕｅ Ｒ．２０１６．「Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｃｏｌｏｓｔｒｕｍ ｉｎｇｅｓｔｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ２４ ｈｏｕｒｓ ｏｆ ｌｉｆｅ ｏｎ ｅａｒｌｙ ｐｏｓｔｎａｔａｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｐｉｇｌｅｔ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍｓ．」Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ８７，１５１１－１５１５．）。
具体的には、Ｔ細胞（好ましくはαβＴ細胞、γδＴ細胞）のマーカー分子としてＣＤ２タンパク質、ＣＤ３タンパク質が、ヘルパーＴ細胞のマーカー分子としてＣＤ４タンパク質が、細胞傷害性Ｔ細胞のマーカー分子としてＣＤ８タンパク質が、記憶性Ｔ細胞のマーカー分子としてＣＤ４タンパク質及びＣＤ８タンパク質の両方が、γδＴ細胞のマーカー分子としてＳＷＣ６タンパク質が、それぞれ挙げられる。
すなわち、抗ＣＤ２抗体又は抗ＣＤ３抗体を用いてＴ細胞（好ましくはαβＴ細胞、γδＴ細胞）を検出することができ、抗ＣＤ４抗体を用いてヘルパーＴ細胞を検出することができ、抗ＣＤ８抗体を用いて細胞傷害性Ｔ細胞を検出することができ、抗ＣＤ４抗体及び抗ＣＤ８抗体を組み合わせて用いて記憶性Ｔ細胞を検出することができ、抗ＳＷＣ６抗体を用いてγδＴ細胞を検出することができる。
ヘルパーＴ細胞はＣＤ８タンパク質の発現が少ないことから、抗ＣＤ４抗体とともに抗ＣＤ８抗体を組み合わせてヘルパーＴ細胞を検出することができる。
細胞傷害性Ｔ細胞はＣＤ４タンパク質の発現が少ないことから、抗ＣＤ８抗体とともに抗ＣＤ４抗体を組み合わせて細胞傷害性Ｔ細胞を検出することができる。
また、γδＴ細胞は抗ＳＷＣ６抗体とともに抗ＣＤ２抗体又は抗ＣＤ３抗体を組み合わせて検出することが好ましい。
ＣＤ６９タンパク質の発現量とこれらのマーカー分子とを組み合わせることにより、ある種の刺激（抗原による刺激、好ましくはワクチン抗原）に応答して、上記抗原に特異的なＴ細胞の活性化評価、活性化Ｔ細胞のサブセット分類評価（例えば、αβＴ細胞（好ましくは細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞及び記憶性Ｔ細胞）並びにγδＴ細胞のいずれであるかを分類評価）を行うことができる。
細胞型及びサブセットを同定（好ましくは、フローサイトメトリーによる同定）する観点から、マーカー分子に選択的に結合する抗体が知られている（Ｏｇａｗａ Ｓ，Ｔｓｕｋａｈａｒａ Ｔ，Ｉｍａｏｋａ Ｔ，Ｎａｋａｎｉｓｈｉ Ｎ，Ｕｓｈｉｄａ Ｋ，Ｉｎｏｕｅ Ｒ．２０１６．「Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｃｏｌｏｓｔｒｕｍ ｉｎｇｅｓｔｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ２４ ｈｏｕｒｓ ｏｆ ｌｉｆｅ ｏｎ ｅａｒｌｙ ｐｏｓｔｎａｔａｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｐｉｇｌｅｔ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍｓ．」Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ８７，１５１１－１５１５．）。
具体的には、Ｔ細胞（好ましくはαβＴ細胞、γδＴ細胞）のマーカー分子としてＣＤ２タンパク質、ＣＤ３タンパク質が、ヘルパーＴ細胞のマーカー分子としてＣＤ４タンパク質が、細胞傷害性Ｔ細胞のマーカー分子としてＣＤ８タンパク質が、記憶性Ｔ細胞のマーカー分子としてＣＤ４タンパク質及びＣＤ８タンパク質の両方が、γδＴ細胞のマーカー分子としてＳＷＣ６タンパク質が、それぞれ挙げられる。
すなわち、抗ＣＤ２抗体又は抗ＣＤ３抗体を用いてＴ細胞（好ましくはαβＴ細胞、γδＴ細胞）を検出することができ、抗ＣＤ４抗体を用いてヘルパーＴ細胞を検出することができ、抗ＣＤ８抗体を用いて細胞傷害性Ｔ細胞を検出することができ、抗ＣＤ４抗体及び抗ＣＤ８抗体を組み合わせて用いて記憶性Ｔ細胞を検出することができ、抗ＳＷＣ６抗体を用いてγδＴ細胞を検出することができる。
ヘルパーＴ細胞はＣＤ８タンパク質の発現が少ないことから、抗ＣＤ４抗体とともに抗ＣＤ８抗体を組み合わせてヘルパーＴ細胞を検出することができる。
細胞傷害性Ｔ細胞はＣＤ４タンパク質の発現が少ないことから、抗ＣＤ８抗体とともに抗ＣＤ４抗体を組み合わせて細胞傷害性Ｔ細胞を検出することができる。
また、γδＴ細胞は抗ＳＷＣ６抗体とともに抗ＣＤ２抗体又は抗ＣＤ３抗体を組み合わせて検出することが好ましい。
ＣＤ６９タンパク質の発現量とこれらのマーカー分子とを組み合わせることにより、ある種の刺激（抗原による刺激、好ましくはワクチン抗原）に応答して、上記抗原に特異的なＴ細胞の活性化評価、活性化Ｔ細胞のサブセット分類評価（例えば、αβＴ細胞（好ましくは細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞及び記憶性Ｔ細胞）並びにγδＴ細胞のいずれであるかを分類評価）を行うことができる。
【0024】
≪ブタにおけるＴ細胞活性化を評価する剤≫
本発明の第２の態様は、ブタＣＤ６９タンパク質の定量化剤を含む、ブタにおけるＴ細胞活性化を評価する剤である。
第２の態様に係る剤は、ブタＴ細胞表面におけるＣＤ６９タンパク質の定量に用いられることが好ましい。
第２の態様に係るブタにおけるＴ細胞活性化を評価する剤は、第１の態様に係るＴ細胞の活性化度を評価する方法に好ましく適用し得る。
ブタＣＤ６９タンパク質の定量化剤としては、上記ＣＤ６９タンパク質に選択的（好ましくは特異的）に結合する物質が挙げられ、上記ＣＤ６９タンパク質に選択的（好ましくは特異的）に結合する抗体が好ましく、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のいずれでもよい。
ブタＣＤ６９タンパク質の定量化剤としては、マウス抗ブタＣＤ６９抗体、ウサギ抗ブタＣＤ６９抗体、ラット抗ブタＣＤ６９抗体、ヤギ抗ブタＣＤ６９抗体、ハムスター抗ブタＣＤ６９抗体等が挙げられる。
ブタＣＤ６９タンパク質の定量化剤は、定量性の観点から標識物質（例えば、標識のための２次抗体）により標識されていることが好ましい。標識としては、吸光度、酵素標識強度、蛍光強度、紫外線強度、放射線強度等が挙げられる。
本発明の第２の態様は、ブタＣＤ６９タンパク質の定量化剤を含む、ブタにおけるＴ細胞活性化を評価する剤である。
第２の態様に係る剤は、ブタＴ細胞表面におけるＣＤ６９タンパク質の定量に用いられることが好ましい。
第２の態様に係るブタにおけるＴ細胞活性化を評価する剤は、第１の態様に係るＴ細胞の活性化度を評価する方法に好ましく適用し得る。
ブタＣＤ６９タンパク質の定量化剤としては、上記ＣＤ６９タンパク質に選択的（好ましくは特異的）に結合する物質が挙げられ、上記ＣＤ６９タンパク質に選択的（好ましくは特異的）に結合する抗体が好ましく、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のいずれでもよい。
ブタＣＤ６９タンパク質の定量化剤としては、マウス抗ブタＣＤ６９抗体、ウサギ抗ブタＣＤ６９抗体、ラット抗ブタＣＤ６９抗体、ヤギ抗ブタＣＤ６９抗体、ハムスター抗ブタＣＤ６９抗体等が挙げられる。
ブタＣＤ６９タンパク質の定量化剤は、定量性の観点から標識物質（例えば、標識のための２次抗体）により標識されていることが好ましい。標識としては、吸光度、酵素標識強度、蛍光強度、紫外線強度、放射線強度等が挙げられる。
【0025】
本明細書で抗体と言う場合、全長の抗体だけではなく抗体の断片も包含するものとする。抗体の断片とは、機能性の断片であることが好ましく、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’などが挙げられる。Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’とは、イムノグロブリンを、蛋白分解酵素（例えば、ペプシン又はパパイン等）で処理することにより製造されるもので、ヒンジ領域中の２本のＨ鎖間に存在するジスルフィド結合の前後で消化されて生成される抗体断片である。
また、抗体は、固相担体などの不溶性担体上に固定された固定化抗体として使用したり、標識物質で標識した標識抗体として使用することができる。このような固定化抗体や標識抗体も全て本発明の範囲内である。
ポリクローナル抗体は、抗原（例えば、ＣＤ６９タンパク質）を免疫した動物（例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、ラット又はハムスター）から得られる血清を分離、精製することにより調製することができる。モノクローナル抗体は、抗原（例えば、ＣＤ６９タンパク質）を免疫した動物から得られる抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを融合させてハイブリドーマを作製し、該ハイブリドーマを培養するか、動物に投与して該動物を腹水癌化させ、上記の培養液または腹水を分離、精製することにより調製することができる。
また、抗体は、固相担体などの不溶性担体上に固定された固定化抗体として使用したり、標識物質で標識した標識抗体として使用することができる。このような固定化抗体や標識抗体も全て本発明の範囲内である。
ポリクローナル抗体は、抗原（例えば、ＣＤ６９タンパク質）を免疫した動物（例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、ラット又はハムスター）から得られる血清を分離、精製することにより調製することができる。モノクローナル抗体は、抗原（例えば、ＣＤ６９タンパク質）を免疫した動物から得られる抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを融合させてハイブリドーマを作製し、該ハイブリドーマを培養するか、動物に投与して該動物を腹水癌化させ、上記の培養液または腹水を分離、精製することにより調製することができる。
【0026】
ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体は、遠心分離、硫安沈殿、カプリル酸沈殿、またはＤＥＡＥ－セファロースカラム、陰イオン交換カラム、プロテインＡ若しくはＧ－カラム、若しくはゲル濾過カラム等を用いるクロマトグラフィー等による方法を、単独または組み合わせて処理する方法等により分離ないし精製して用い得る。
【0027】
第２の態様に係るブタにおけるＴ細胞活性化を評価する剤は、必要に応じて吸着防止剤（ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン、スキムミルク、ポリエチレングリコール等）、前処理液（任意の界面活性剤、任意の緩衝液等）、反応緩衝液（任意の緩衝液等）、発色基質（３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン、過酸化水素水等）等を含んでいてもよい。
上記吸着防止剤の含有量としては本発明の効果を損なわない限りにおいて特に制限はないが、０．０５～１０質量％であることが好ましい。
上記吸着防止剤の含有量としては本発明の効果を損なわない限りにおいて特に制限はないが、０．０５～１０質量％であることが好ましい。
【0028】
第２の態様に係るブタにおけるＴ細胞活性化を評価する剤は、細胞型及びサブセットを同定する観点から、αβＴ細胞（好ましくは細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞及び記憶性Ｔ細胞）並びにγδＴ細胞よりなる群から選択される少なくとも１種のＴ細胞を識別する剤と併用して用いられることが好ましい。
細胞型及びサブセットを同定する観点から、αβＴ細胞（好ましくは細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞及び記憶性Ｔ細胞）並びにγδＴ細胞よりなる群から選択される少なくとも１種のＴ細胞を識別する剤は、単独又は複数組み合わせて用いることができ、各々の識別する剤は、それぞれ、検出性ないし定量性の観点から標識物質（例えば、標識のための２次抗体）により標識されていることが好ましい。
Ｔ細胞（好ましくはαβＴ細胞、γδＴ細胞）を識別する剤としては、ＣＤ２タンパク質又はＣＤ３タンパク質に選択的（好ましくは特異的）に結合する物質が挙げられ、ＣＤ２タンパク質又はＣＤ３タンパク質に選択的（好ましくは特異的）に結合する抗体が好ましい。
細胞型及びサブセットを同定する観点から、αβＴ細胞（好ましくは細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞及び記憶性Ｔ細胞）並びにγδＴ細胞よりなる群から選択される少なくとも１種のＴ細胞を識別する剤は、単独又は複数組み合わせて用いることができ、各々の識別する剤は、それぞれ、検出性ないし定量性の観点から標識物質（例えば、標識のための２次抗体）により標識されていることが好ましい。
Ｔ細胞（好ましくはαβＴ細胞、γδＴ細胞）を識別する剤としては、ＣＤ２タンパク質又はＣＤ３タンパク質に選択的（好ましくは特異的）に結合する物質が挙げられ、ＣＤ２タンパク質又はＣＤ３タンパク質に選択的（好ましくは特異的）に結合する抗体が好ましい。
【0029】
ヘルパーＴ細胞を識別する剤としては、ＣＤ４タンパク質に選択的（好ましくは特異的）に結合する物質が挙げられ、ＣＤ４タンパク質に選択的（好ましくは特異的）に結合する抗体が好ましい。
ヘルパーＴ細胞は、ＣＤ８タンパク質の発現が少ないことから、ヘルパーＴ細胞を識別する剤として、ＣＤ８タンパク質に選択的（好ましくは特異的）に結合する物質を含むことも好ましく、ＣＤ８タンパク質に選択的（好ましくは特異的）に結合する抗体を含むことがより好ましい。
したがって、ヘルパーＴ細胞を識別する剤としては、ＣＤ４タンパク質に選択的（好ましくは特異的）に結合する物質及びＣＤ８タンパク質に選択的（好ましくは特異的）に結合する物質の組み合わせが更に好ましく、ＣＤ４タンパク質に選択的（好ましくは特異的）に結合する抗体及びＣＤ８タンパク質に選択的（好ましくは特異的）に結合する抗体の組み合わせが特に好ましい。
ヘルパーＴ細胞は、ＣＤ８タンパク質の発現が少ないことから、ヘルパーＴ細胞を識別する剤として、ＣＤ８タンパク質に選択的（好ましくは特異的）に結合する物質を含むことも好ましく、ＣＤ８タンパク質に選択的（好ましくは特異的）に結合する抗体を含むことがより好ましい。
したがって、ヘルパーＴ細胞を識別する剤としては、ＣＤ４タンパク質に選択的（好ましくは特異的）に結合する物質及びＣＤ８タンパク質に選択的（好ましくは特異的）に結合する物質の組み合わせが更に好ましく、ＣＤ４タンパク質に選択的（好ましくは特異的）に結合する抗体及びＣＤ８タンパク質に選択的（好ましくは特異的）に結合する抗体の組み合わせが特に好ましい。
【0030】
細胞傷害性Ｔ細胞を識別する剤としては、ＣＤ８タンパク質に選択的（好ましくは特異的）に結合する物質が挙げられ、ＣＤ８タンパク質に選択的（好ましくは特異的）に結合する抗体が好ましい。
細胞傷害性Ｔ細胞は、ＣＤ４タンパク質の発現が少ないことから、細胞傷害性Ｔ細胞を識別する剤として、ＣＤ４タンパク質に選択的（好ましくは特異的）に結合する物質を含むことも好ましく、ＣＤ４タンパク質に選択的（好ましくは特異的）に結合する抗体を含むことがより好ましい。
したがって、細胞傷害性Ｔ細胞を識別する剤としては、ＣＤ４タンパク質に選択的（好ましくは特異的）に結合する物質及びＣＤ８タンパク質に選択的（好ましくは特異的）に結合する物質の組み合わせが更に好ましく、ＣＤ４タンパク質に選択的（好ましくは特異的）に結合する抗体及びＣＤ８タンパク質に選択的（好ましくは特異的）に結合する抗体の組み合わせが特に好ましい。
細胞傷害性Ｔ細胞は、ＣＤ４タンパク質の発現が少ないことから、細胞傷害性Ｔ細胞を識別する剤として、ＣＤ４タンパク質に選択的（好ましくは特異的）に結合する物質を含むことも好ましく、ＣＤ４タンパク質に選択的（好ましくは特異的）に結合する抗体を含むことがより好ましい。
したがって、細胞傷害性Ｔ細胞を識別する剤としては、ＣＤ４タンパク質に選択的（好ましくは特異的）に結合する物質及びＣＤ８タンパク質に選択的（好ましくは特異的）に結合する物質の組み合わせが更に好ましく、ＣＤ４タンパク質に選択的（好ましくは特異的）に結合する抗体及びＣＤ８タンパク質に選択的（好ましくは特異的）に結合する抗体の組み合わせが特に好ましい。
【0031】
記憶性Ｔ細胞を識別する剤としては、ＣＤ４タンパク質に選択的（好ましくは特異的）に結合する物質及びＣＤ８タンパク質に選択的（好ましくは特異的）に結合する物質の組み合わせが挙げられ、ＣＤ４タンパク質に選択的（好ましくは特異的）に結合する抗体及びＣＤ８タンパク質に選択的（好ましくは特異的）に結合する抗体の組み合わせが好ましい。
γδＴ細胞を識別する剤としては、ＳＷＣ６タンパク質に選択的（好ましくは特異的）に結合する物質が挙げられ、ＳＷＣ６タンパク質に選択的（好ましくは特異的）に結合する抗体が好ましい。また、γδＴ細胞を識別する剤としては、ＳＷＣ６タンパク質に選択的（好ましくは特異的）に結合する物質とともに、ＣＤ２タンパク質又はＣＤ３タンパク質に選択的（好ましくは特異的）に結合する物質を組み合わせて用いることがより好ましい。
γδＴ細胞を識別する剤としては、ＳＷＣ６タンパク質に選択的（好ましくは特異的）に結合する物質が挙げられ、ＳＷＣ６タンパク質に選択的（好ましくは特異的）に結合する抗体が好ましい。また、γδＴ細胞を識別する剤としては、ＳＷＣ６タンパク質に選択的（好ましくは特異的）に結合する物質とともに、ＣＤ２タンパク質又はＣＤ３タンパク質に選択的（好ましくは特異的）に結合する物質を組み合わせて用いることがより好ましい。
【0032】
≪ブタＴ細胞活性化剤をスクリーニングする方法≫
本発明の第３の態様は、被験物質を投与したブタ由来の検体中のＣＤ６９タンパク質の存在量に基づき評価されるＴ細胞の活性化度の増加を指標としてブタＴ細胞活性化剤をスクリーニングする方法である。
上記存在量としては、ブタＴ細胞表面における存在量、又は、ＣＤ６９タンパク質発現細胞の上記検体中の存在割合であることが好ましい。
具体的には、被験物質投与によるＴ細胞の活性化度（すなわち、ＣＤ６９タンパク質の存在量）の増加を指標としてブタＴ細胞活性化剤をスクリーニングすることができる。
また、被験物質投与により感作後に、感染源（例えば、ウイルス抗原、細菌抗原、原虫抗原、真菌抗原等の抗原、ワクチン）による刺激（例えば、投与）することによりＴ細胞の活性化度（すなわち、ＣＤ６９タンパク質の存在量）の増加を指標としてブタＴ細胞活性化剤をスクリーニングすることもできる。
上記増加の程度としては統計的に有意な増加であれば特に制限はないが、無刺激下におけるＣＤ６９タンパク質の存在量（好ましくはＣＤ６９タンパク質発現細胞の存在割合）と対比して、１．２倍以上にＣＤ６９タンパク質の存在量（好ましくはＣＤ６９タンパク質発現細胞の存在割合）が増加することが好ましく、１．３倍以上にＣＤ６９タンパク質の存在量（好ましくはＣＤ６９タンパク質発現細胞の存在割合）が増加することがより好ましく、１．４倍以上にＣＤ６９タンパク質の存在量（好ましくはＣＤ６９タンパク質発現細胞の存在割合）が増加することがさらに好ましく、２倍以上であることが特に好ましい。
上記増加の程度の上限値としては特に制限はないが、例えば、５倍以下、３倍以下が挙げられる。
第３の態様に係るスクリーニング方法に供される被験物質としては任意の物質を使用することができ、抗原（例えば、ウイルス抗原、細菌抗原、原虫抗原、真菌抗原）、抗体でもよいし、核酸分子でもよいし、個々の低分子合成化合物でもよいし、天然物抽出物中に存在する化合物でもよく、合成ペプチドでもよい。あるいは、被験化合物はまた、化合物ライブラリー、ファージディスプレーライブラリーもしくはコンビナトリアルライブラリーでもよい。化合物ライブラリーの構築は当業者に公知であり、また市販の化合物ライブラリーを使用することもできる。
第３の態様に係るスクリーニング方法におけるブタ由来の検体としては、第１の態様に係るＴ細胞の活性化度を評価する方法におけるブタ由来の検体と同様のものが挙げられる。
第３の態様に係るスクリーニング方法において、ＣＤ６９タンパク質の存在量に基づき評価されるＴ細胞の活性化度は、第１の態様に係るＴ細胞の活性化度を評価する方法における定量方法と同様の定量方法により定量し得る。
第３の態様に係るスクリーニング方法において、上記ブタＴ細胞活性化剤が、ブタ疾患に対するワクチン候補物質及び細胞性免疫活性化剤よりなる群から選択される少なくとも１つの剤であることが好ましい。
本発明の第３の態様は、被験物質を投与したブタ由来の検体中のＣＤ６９タンパク質の存在量に基づき評価されるＴ細胞の活性化度の増加を指標としてブタＴ細胞活性化剤をスクリーニングする方法である。
上記存在量としては、ブタＴ細胞表面における存在量、又は、ＣＤ６９タンパク質発現細胞の上記検体中の存在割合であることが好ましい。
具体的には、被験物質投与によるＴ細胞の活性化度（すなわち、ＣＤ６９タンパク質の存在量）の増加を指標としてブタＴ細胞活性化剤をスクリーニングすることができる。
また、被験物質投与により感作後に、感染源（例えば、ウイルス抗原、細菌抗原、原虫抗原、真菌抗原等の抗原、ワクチン）による刺激（例えば、投与）することによりＴ細胞の活性化度（すなわち、ＣＤ６９タンパク質の存在量）の増加を指標としてブタＴ細胞活性化剤をスクリーニングすることもできる。
上記増加の程度としては統計的に有意な増加であれば特に制限はないが、無刺激下におけるＣＤ６９タンパク質の存在量（好ましくはＣＤ６９タンパク質発現細胞の存在割合）と対比して、１．２倍以上にＣＤ６９タンパク質の存在量（好ましくはＣＤ６９タンパク質発現細胞の存在割合）が増加することが好ましく、１．３倍以上にＣＤ６９タンパク質の存在量（好ましくはＣＤ６９タンパク質発現細胞の存在割合）が増加することがより好ましく、１．４倍以上にＣＤ６９タンパク質の存在量（好ましくはＣＤ６９タンパク質発現細胞の存在割合）が増加することがさらに好ましく、２倍以上であることが特に好ましい。
上記増加の程度の上限値としては特に制限はないが、例えば、５倍以下、３倍以下が挙げられる。
第３の態様に係るスクリーニング方法に供される被験物質としては任意の物質を使用することができ、抗原（例えば、ウイルス抗原、細菌抗原、原虫抗原、真菌抗原）、抗体でもよいし、核酸分子でもよいし、個々の低分子合成化合物でもよいし、天然物抽出物中に存在する化合物でもよく、合成ペプチドでもよい。あるいは、被験化合物はまた、化合物ライブラリー、ファージディスプレーライブラリーもしくはコンビナトリアルライブラリーでもよい。化合物ライブラリーの構築は当業者に公知であり、また市販の化合物ライブラリーを使用することもできる。
第３の態様に係るスクリーニング方法におけるブタ由来の検体としては、第１の態様に係るＴ細胞の活性化度を評価する方法におけるブタ由来の検体と同様のものが挙げられる。
第３の態様に係るスクリーニング方法において、ＣＤ６９タンパク質の存在量に基づき評価されるＴ細胞の活性化度は、第１の態様に係るＴ細胞の活性化度を評価する方法における定量方法と同様の定量方法により定量し得る。
第３の態様に係るスクリーニング方法において、上記ブタＴ細胞活性化剤が、ブタ疾患に対するワクチン候補物質及び細胞性免疫活性化剤よりなる群から選択される少なくとも１つの剤であることが好ましい。
【0033】
第３の態様に係るスクリーニング方法において、被験物質によってＴ細胞のいずれの細胞型ないしサブセットを活性化するかを特定する観点から、細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞及び記憶性Ｔ細胞よりなる群から選択される少なくとも１種のＴ細胞を識別する工程を更に含むことが好ましい。
【0034】
≪ブタの病原体感染を検査する方法≫
本発明の第４の態様は、ブタ由来の検体中のＣＤ６９タンパク質の存在量を定量する工程を含む、ブタの病原体感染を検査する方法である。
上記病原体としては、ウイルス、細菌、原虫、真菌等が挙げられる。
上記存在量としては、ブタＴ細胞表面におけるＣＤ６９タンパク質の存在量であることが好ましい。
第４の態様の好ましい１つの実施形態としては、ブタ由来の検体中のＣＤ６９タンパク質の存在量を定量する工程を含む、ブタの病原体感染を検査する方法であって、
前記ブタが予めワクチン接種して免疫獲得後のブタであり、前記定量を行い、健常時の当該ブタ又は健常ブタに対してＣＤ６９タンパク質の前記存在量が増加している場合、前記ワクチンに対応する病原体により前記ブタが感染したと検査（診断若しくは判定）する工程、又は、
前記ブタが予めワクチン接種していないブタであり、前記定量を行い、健常時の当該ブタ又は健常ブタに対してＣＤ６９タンパク質の前記存在量が低下している場合、前記接種していないワクチンに対応する病原体により前記ブタが感染したと検査（診断若しくは判定）する工程を含む、方法が挙げられ、
前記ブタが予めワクチン接種したブタであり、前記定量を行い、健常時の当該ブタ又は健常ブタに対してＣＤ６９タンパク質の前記存在量が増加している場合、前記ワクチンに対応する病原体により前記ブタが感染したと検査する工程を含む方法であることが好ましい。
上記定量は、ワクチン免疫獲得の観点から、上記接種後少なくとも１週間後に行うことが好ましく、上記接種後少なくとも２週間後に行うことがより好ましく、上記接種後少なくとも３週間後に行うことが更に好ましく、上記接種後少なくとも１か月後に行うことが特に好ましい。
また、上記定量は、ワクチン免疫獲得の観点から、上記接種後半年以内に行うことが好ましく、上記接種後５か月以内に行うことがより好ましく、上記接種後４か月以内に行うことが更に好ましい。
ワクチン接種しない場合について、上記定量の時期として特に制限はない。
本発明の第４の態様は、ブタ由来の検体中のＣＤ６９タンパク質の存在量を定量する工程を含む、ブタの病原体感染を検査する方法である。
上記病原体としては、ウイルス、細菌、原虫、真菌等が挙げられる。
上記存在量としては、ブタＴ細胞表面におけるＣＤ６９タンパク質の存在量であることが好ましい。
第４の態様の好ましい１つの実施形態としては、ブタ由来の検体中のＣＤ６９タンパク質の存在量を定量する工程を含む、ブタの病原体感染を検査する方法であって、
前記ブタが予めワクチン接種して免疫獲得後のブタであり、前記定量を行い、健常時の当該ブタ又は健常ブタに対してＣＤ６９タンパク質の前記存在量が増加している場合、前記ワクチンに対応する病原体により前記ブタが感染したと検査（診断若しくは判定）する工程、又は、
前記ブタが予めワクチン接種していないブタであり、前記定量を行い、健常時の当該ブタ又は健常ブタに対してＣＤ６９タンパク質の前記存在量が低下している場合、前記接種していないワクチンに対応する病原体により前記ブタが感染したと検査（診断若しくは判定）する工程を含む、方法が挙げられ、
前記ブタが予めワクチン接種したブタであり、前記定量を行い、健常時の当該ブタ又は健常ブタに対してＣＤ６９タンパク質の前記存在量が増加している場合、前記ワクチンに対応する病原体により前記ブタが感染したと検査する工程を含む方法であることが好ましい。
上記定量は、ワクチン免疫獲得の観点から、上記接種後少なくとも１週間後に行うことが好ましく、上記接種後少なくとも２週間後に行うことがより好ましく、上記接種後少なくとも３週間後に行うことが更に好ましく、上記接種後少なくとも１か月後に行うことが特に好ましい。
また、上記定量は、ワクチン免疫獲得の観点から、上記接種後半年以内に行うことが好ましく、上記接種後５か月以内に行うことがより好ましく、上記接種後４か月以内に行うことが更に好ましい。
ワクチン接種しない場合について、上記定量の時期として特に制限はない。
【0035】
第４の態様のもう１つの好ましい実施形態としては、ブタ由来の検体中のＣＤ６９タンパク質の存在量を定量する工程を含む、ブタの病原体感染を検査する方法であって、
前記検体に抗原刺激を付与した後に前記定量を行い、前記抗原刺激を付与していない前記検体又は健常ブタの検体に対してＣＤ６９タンパク質の前記存在量が増加している場合、当該ブタが前記病原体に感染したと検査する工程を含む方法が挙げられ、
当該実施形態において、前記抗原刺激を付与していない前記検体又は健常ブタの検体に対してＣＤ６９タンパク質の前記存在量に有意差がない場合又は低下している場合、当該ブタは前記病原体に感染していないと検査する工程を含むことがより好ましい。
前記検体に抗原刺激を付与した後に前記定量を行い、前記抗原刺激を付与していない前記検体又は健常ブタの検体に対してＣＤ６９タンパク質の前記存在量が増加している場合、当該ブタが前記病原体に感染したと検査する工程を含む方法が挙げられ、
当該実施形態において、前記抗原刺激を付与していない前記検体又は健常ブタの検体に対してＣＤ６９タンパク質の前記存在量に有意差がない場合又は低下している場合、当該ブタは前記病原体に感染していないと検査する工程を含むことがより好ましい。
【0036】
上記抗原刺激としては、病原体そのものによる刺激であっても、上記病原体における一部の抗原による刺激であっても、上記病原体に対応するワクチンによる刺激であってもよい。
また、抗原刺激を付与する方法としては、上記病原体に対応する上記抗原に、上記検体を接触若しくは曝露させる方法等が挙げられ、上記接触若しくは曝露させる温度、上記接触若しくは曝露させる上記抗原の濃度等の条件は適宜設定してよい。
また、上記接触若しくは曝露させる時間としては、上記検体に抗原刺激を付与する限り特に制限はなく、例えば、１分以上が挙げられ、３０分以上が好ましく、１時間以上がより好ましく、３時間以上が更に好ましく、５時間以上が特に好ましい。上記接触若しくは曝露させる時間の上限としては特に制限はなく、例えば、３０時間以下、２０時間以下、１０時間以下、８時間以下等が挙げられる。
また、付与後の上記定量の時期としては特に制限はなく、例えば、上記抗原刺激の直後であってもよく、上記抗原刺激後の３０分後であってもよく、上記抗原刺激後の１時間後であってもよく、上記抗原刺激後の３時間後であってもよい。
上記定量の時期の上限値としては特に制限はなく、例えば、上記抗原刺激後の１０時間以内、上記抗原刺激後の８時間以内、上記抗原刺激後の５時間以内等が挙げられる。
また、抗原刺激を付与する方法としては、上記病原体に対応する上記抗原に、上記検体を接触若しくは曝露させる方法等が挙げられ、上記接触若しくは曝露させる温度、上記接触若しくは曝露させる上記抗原の濃度等の条件は適宜設定してよい。
また、上記接触若しくは曝露させる時間としては、上記検体に抗原刺激を付与する限り特に制限はなく、例えば、１分以上が挙げられ、３０分以上が好ましく、１時間以上がより好ましく、３時間以上が更に好ましく、５時間以上が特に好ましい。上記接触若しくは曝露させる時間の上限としては特に制限はなく、例えば、３０時間以下、２０時間以下、１０時間以下、８時間以下等が挙げられる。
また、付与後の上記定量の時期としては特に制限はなく、例えば、上記抗原刺激の直後であってもよく、上記抗原刺激後の３０分後であってもよく、上記抗原刺激後の１時間後であってもよく、上記抗原刺激後の３時間後であってもよい。
上記定量の時期の上限値としては特に制限はなく、例えば、上記抗原刺激後の１０時間以内、上記抗原刺激後の８時間以内、上記抗原刺激後の５時間以内等が挙げられる。
【0037】
上記定量は、マウス抗ブタＣＤ６９抗体、ウサギ抗ブタＣＤ６９抗体、ラット抗ブタＣＤ６９抗体、ヤギ抗ブタＣＤ６９抗体又はハムスター抗ブタＣＤ６９抗体と、前記検体とを接触させ、上記抗体と、上記ＣＤ６９タンパク質との抗原抗体反応に基づく定量であることが好ましい。
第４の態様において、上記ＣＤ６９タンパク質の存在量が、ブタＴ細胞表面における存在量、又は、上述したＣＤ６９タンパク質発現細胞の上記検体中の存在割合であることが好ましく、ＣＤ６９タンパク質発現Ｔ細胞の上記検体中の存在割合であることがより好ましい。
本発明は、ブタＣＤ６９タンパク質の定量化剤に関するものでもある。
また、本発明は、ブタの病原体感染を診断するための、ブタＣＤ６９タンパク質の定量化剤に関するものでもある。
上記定量化剤としては、第２の態様として上述した通りである。
第４の態様において、上記ＣＤ６９タンパク質の存在量が、ブタＴ細胞表面における存在量、又は、上述したＣＤ６９タンパク質発現細胞の上記検体中の存在割合であることが好ましく、ＣＤ６９タンパク質発現Ｔ細胞の上記検体中の存在割合であることがより好ましい。
本発明は、ブタＣＤ６９タンパク質の定量化剤に関するものでもある。
また、本発明は、ブタの病原体感染を診断するための、ブタＣＤ６９タンパク質の定量化剤に関するものでもある。
上記定量化剤としては、第２の態様として上述した通りである。
【0038】
具体的には、病原体感染後のＴ細胞の活性化度（すなわち、ＣＤ６９タンパク質の存在量）の変化（具体的には、低下又は増加）を指標としてブタの病原体感染の有無を検査することができる。
上記低下の程度としては統計的に有意な低下であれば特に制限はないが、対照と対比して、３／４以下にＣＤ６９タンパク質の存在量（好ましくはＣＤ６９タンパク質発現細胞の存在割合）が低下することが挙げられ、２／５以下に低下することが好ましく、１／２以下に低下することがより好ましく、１／３以下に低下することが更に好ましく、１／４以下に低下することが特に好ましい。
上記低下の程度の下限値としては特に制限はないが、例えば、１／１０以上が挙げられる。
上記増加の程度としては統計的に有意な増加であれば特に制限はないが、対照と対比して、１．５倍以上にＣＤ６９タンパク質の存在量（好ましくはＣＤ６９タンパク質発現細胞の存在割合）が増加することが挙げられ、１．６倍以上に増加することが好ましく、２倍以上に増加することがより好ましく、３倍以上に増加することが更に好ましく、４倍以上に増加することが特に好ましい。
上記増加の程度の上限値としては特に制限はないが、例えば、１０倍以下が挙げられる。
健常時の当該ブタ、健常ブタ等の上記対照としては、ワクチン接種前若しくは接種後の、病原体感染前の当該ブタの検体から得られた測定値であっても、予め健常ブタの検体群から収集して得られた統計的な値ないし範囲であってもよい。
上記低下の程度としては統計的に有意な低下であれば特に制限はないが、対照と対比して、３／４以下にＣＤ６９タンパク質の存在量（好ましくはＣＤ６９タンパク質発現細胞の存在割合）が低下することが挙げられ、２／５以下に低下することが好ましく、１／２以下に低下することがより好ましく、１／３以下に低下することが更に好ましく、１／４以下に低下することが特に好ましい。
上記低下の程度の下限値としては特に制限はないが、例えば、１／１０以上が挙げられる。
上記増加の程度としては統計的に有意な増加であれば特に制限はないが、対照と対比して、１．５倍以上にＣＤ６９タンパク質の存在量（好ましくはＣＤ６９タンパク質発現細胞の存在割合）が増加することが挙げられ、１．６倍以上に増加することが好ましく、２倍以上に増加することがより好ましく、３倍以上に増加することが更に好ましく、４倍以上に増加することが特に好ましい。
上記増加の程度の上限値としては特に制限はないが、例えば、１０倍以下が挙げられる。
健常時の当該ブタ、健常ブタ等の上記対照としては、ワクチン接種前若しくは接種後の、病原体感染前の当該ブタの検体から得られた測定値であっても、予め健常ブタの検体群から収集して得られた統計的な値ないし範囲であってもよい。
【0039】
第４の態様に係るブタの病原体感染を検査する方法におけるブタ由来の検体としては、第１の態様に係るＴ細胞の活性化度を評価する方法におけるブタ由来の検体と同様のものが挙げられる。
第４の態様に係るブタの病原体感染を検査する方法において、ＣＤ６９タンパク質の存在量の定量は、第１の態様に係るＴ細胞の活性化度を評価する方法における定量方法と同様の定量方法により定量し得る。
第４の態様に係るブタの病原体感染を検査する方法において、病原（例えば、感染源）によってＴ細胞のいずれの細胞型ないしサブセットが関与するかは様々であることから、細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞及び記憶性Ｔ細胞よりなる群から選択される少なくとも１種のＴ細胞を識別する工程を更に含むことが好ましい。
第４の態様に係るブタの病原体感染を検査する方法において、ブタの病原体感染としては、ブタ生殖器・呼吸器症候群（ＰＲＲＳ）、ブタサーコウイルス関連疾患（ＰＣＶＡＤ）、ブタ流行性下痢（ＰＥＤ）等のウイルス感染、細菌感染、原虫感染、真菌感染等が挙げられる。
第４の態様に係るブタの病原体感染を検査する方法において、ＣＤ６９タンパク質の存在量の定量は、第１の態様に係るＴ細胞の活性化度を評価する方法における定量方法と同様の定量方法により定量し得る。
第４の態様に係るブタの病原体感染を検査する方法において、病原（例えば、感染源）によってＴ細胞のいずれの細胞型ないしサブセットが関与するかは様々であることから、細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞及び記憶性Ｔ細胞よりなる群から選択される少なくとも１種のＴ細胞を識別する工程を更に含むことが好ましい。
第４の態様に係るブタの病原体感染を検査する方法において、ブタの病原体感染としては、ブタ生殖器・呼吸器症候群（ＰＲＲＳ）、ブタサーコウイルス関連疾患（ＰＣＶＡＤ）、ブタ流行性下痢（ＰＥＤ）等のウイルス感染、細菌感染、原虫感染、真菌感染等が挙げられる。
【0040】
第４の態様に係るブタの病原体感染を検査する方法において、上記感染の検査が、感染の進行状況の判断、治療方針の参考にされることはもちろんであるが、感染に基づく疾患の重篤度の判定、感染に基づく疾患発症リスクの予測及び疾患進行のモニタリングよりなる群から選択される少なくとも１種の検査が好ましい。
【0041】
≪ハイブリドーマ≫
本発明の第５の態様は、ブタＣＤ６９タンパク質に選択的に結合する抗体を産生するハイブリドーマである。
また、本発明は、第５の態様に係るハイブリドーマを含む、第２の態様に係る剤の製造用原料に関するものでもある。
ハイブリドーマは、抗原（例えば、ＣＤ６９タンパク質）を免疫した動物から得られる抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを融合させて作製し得る。
抗原は、ブタからＣＤ６９タンパク質を精製してもよいし、ＣＤ６９タンパク質のアミノ酸配列またはその変異配列またはそれらの一部を有するタンパク質をコードするＤＮＡを含む組換えベクターを大腸菌、酵母、動物細胞または昆虫細胞などの宿主に導入して、該ＤＮＡを発現させて得られるタンパク質を分離、精製することによっても調製できる。また、抗原は、ＣＤ６９タンパク質のアミノ酸配列の部分配列を有するペプチドをアミノ酸合成機を用いて合成することによって調製することもできる。
免疫方法としては、抗原を、ウサギ、ヤギ、ラット、マウスまたはハムスター等などの非ヒト哺乳動物の皮下、静脈内または腹腔内にそのまま投与してもよいが、抗原をスカシガイヘモシアニン、キーホールリンペットヘモシアニン、牛血清アルブミン、牛チログロブリン等の抗原性の高いキャリアタンパク質と結合して投与したり、完全フロイントアジュバント（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ Ａｄｊｕｖａｎｔ）、水酸化アルミニウムゲル、百日咳菌ワクチン等の適当なアジュバントとともに投与することも好ましい。
本発明の第５の態様は、ブタＣＤ６９タンパク質に選択的に結合する抗体を産生するハイブリドーマである。
また、本発明は、第５の態様に係るハイブリドーマを含む、第２の態様に係る剤の製造用原料に関するものでもある。
ハイブリドーマは、抗原（例えば、ＣＤ６９タンパク質）を免疫した動物から得られる抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを融合させて作製し得る。
抗原は、ブタからＣＤ６９タンパク質を精製してもよいし、ＣＤ６９タンパク質のアミノ酸配列またはその変異配列またはそれらの一部を有するタンパク質をコードするＤＮＡを含む組換えベクターを大腸菌、酵母、動物細胞または昆虫細胞などの宿主に導入して、該ＤＮＡを発現させて得られるタンパク質を分離、精製することによっても調製できる。また、抗原は、ＣＤ６９タンパク質のアミノ酸配列の部分配列を有するペプチドをアミノ酸合成機を用いて合成することによって調製することもできる。
免疫方法としては、抗原を、ウサギ、ヤギ、ラット、マウスまたはハムスター等などの非ヒト哺乳動物の皮下、静脈内または腹腔内にそのまま投与してもよいが、抗原をスカシガイヘモシアニン、キーホールリンペットヘモシアニン、牛血清アルブミン、牛チログロブリン等の抗原性の高いキャリアタンパク質と結合して投与したり、完全フロイントアジュバント（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ Ａｄｊｕｖａｎｔ）、水酸化アルミニウムゲル、百日咳菌ワクチン等の適当なアジュバントとともに投与することも好ましい。
【0042】
ハイブリドーマ細胞は、例えば、以下の方法により作製できる。先ず、抗体産生細胞と骨髄腫細胞を混合し、ＨＡＴ培地［正常培地にヒポキサンチン、チミジンおよびアミノプテリンを加えた培地］に懸濁したのち、７～１４日間培養する。培養後、培養上清の一部をとり酵素免疫測定法などにより、抗原に反応し、抗原を含まないタンパク質には反応しないものを選択する。次いで、限界希釈法によりクローニングを行い、酵素免疫測定法により安定して高い抗体価の認められたものをモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞として選択する。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ細胞を培養して得られる培養液、またはハイブリドーマ細胞を動物の腹腔内に投与して該動物を腹水癌化させて得られる腹水から分離、精製することにより調製できる（Ｈａｙａｓｈｉ Ｙ，Ｏｋｕｔａｎｉ Ｍ，Ｏｇａｗａ Ｓ，Ｔｓｕｋａｈａｒａ Ｔ．２０１８．「Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉ－ｐｏｒｃｉｎｅ ＣＤ６９ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｕｓｅｆｕｌｎｅｓｓ ｔｏ ｅｖａｌｕａｔｅ ｅａｒｌｙ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｂｙ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ」Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ８９，８２５－８３２．）。
【実施例】
【0043】
以下に本発明の実施例を示し、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではなく、本発明の技術的思想を逸脱しない範囲内で種々の応用が可能である。
【0044】
＜実施例１：ブタＣＤ６９タンパク質に選択的に結合する抗体（ＩｇＧ２ｂ－κ及びＩｇＧ２ａ－κ）を産生するハイブリドーマ（０１－１４－２２－５１及び０１－２２－４４－１０２）の調製＞
（抗ブタＣＤ６９抗体の抗原）
キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）又はオボアルブミンとのコンジュゲートのためのＮＨ２末端に１つのシステイン、シート構造及び細胞外ドメインを有するブタＣＤ６９の２９アミノ酸（残基１３３～１６１）からなる３０アミノ酸のカスタムペプチドを設計した。この合成ペプチドは、製造委託したＥｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ社から入手した。
このペプチドのアミノ酸配列は、Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）分析（ｈｔｔｐｓ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）により、ＣＤ６９タンパク質以外のブタ参照タンパク質との相同性は８０％未満であった。
１０ｍｇ／ｍＬのブタＣＤ６９ペプチドを等容量のマレイミド活性化ｍｃＫＬＨ（Ｉｍｊｅｃｔ（登録商標）マレイミド活性化ｍｃＫＬＨ；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社製）とコンジュゲートした。コンジュゲーション緩衝液中のエチレンジアミン四酢酸を、滅菌した１×リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（－）（１３７ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、２．７ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＣｌ、１０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４、１．８ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．４）に対する透析によって除去した。
（抗ブタＣＤ６９抗体の抗原）
キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）又はオボアルブミンとのコンジュゲートのためのＮＨ２末端に１つのシステイン、シート構造及び細胞外ドメインを有するブタＣＤ６９の２９アミノ酸（残基１３３～１６１）からなる３０アミノ酸のカスタムペプチドを設計した。この合成ペプチドは、製造委託したＥｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ社から入手した。
このペプチドのアミノ酸配列は、Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）分析（ｈｔｔｐｓ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）により、ＣＤ６９タンパク質以外のブタ参照タンパク質との相同性は８０％未満であった。
１０ｍｇ／ｍＬのブタＣＤ６９ペプチドを等容量のマレイミド活性化ｍｃＫＬＨ（Ｉｍｊｅｃｔ（登録商標）マレイミド活性化ｍｃＫＬＨ；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社製）とコンジュゲートした。コンジュゲーション緩衝液中のエチレンジアミン四酢酸を、滅菌した１×リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（－）（１３７ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、２．７ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＣｌ、１０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４、１．８ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．４）に対する透析によって除去した。
【0045】
（ブタＣＤ６９ペプチドに対する動物免疫）
８週齢の雌ＩＣＲマウス（日本ＳＬＣ社製）５匹を、フロイント完全アジュバント（和光純薬社製）中の１００μｇのＫＬＨ結合ＣＤ６９ペプチドで腹腔内免疫した。末梢血を尾静脈から３週間後に集めた。オボアルブミン結合ＣＤ６９ペプチド（Ｉｍｊｅｃｔ Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｏｖａｌｍｕｍｉｎ；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社製）に対する抗体価の上昇が末梢血中で確認された。ブタＣＤ６９ペプチドに対する抗体価を検出した後、マウスに過剰量のペントバルビタール（共立社製）を注射し、放血によって殺した。脾細胞及び末梢リンパ節由来の細胞を回収し、マウスミエローマ細胞株ＳＰ２／０－Ａｇ１４（Ｒｉｋｅｎ ＢｉｏＲｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ製）と融合した。抗ブタＣＤ６９ｍＡｂ産生ハイブリドーマを、卵白アルブミン結合ＣＤ６９ペプチドを抗原として用いたＥＬＩＳＡを用いてスクリーニングした。陽性反応したハイブリドーマを限界希釈法により２回クローン化した。
８週齢の雌ＩＣＲマウス（日本ＳＬＣ社製）５匹を、フロイント完全アジュバント（和光純薬社製）中の１００μｇのＫＬＨ結合ＣＤ６９ペプチドで腹腔内免疫した。末梢血を尾静脈から３週間後に集めた。オボアルブミン結合ＣＤ６９ペプチド（Ｉｍｊｅｃｔ Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｏｖａｌｍｕｍｉｎ；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社製）に対する抗体価の上昇が末梢血中で確認された。ブタＣＤ６９ペプチドに対する抗体価を検出した後、マウスに過剰量のペントバルビタール（共立社製）を注射し、放血によって殺した。脾細胞及び末梢リンパ節由来の細胞を回収し、マウスミエローマ細胞株ＳＰ２／０－Ａｇ１４（Ｒｉｋｅｎ ＢｉｏＲｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ製）と融合した。抗ブタＣＤ６９ｍＡｂ産生ハイブリドーマを、卵白アルブミン結合ＣＤ６９ペプチドを抗原として用いたＥＬＩＳＡを用いてスクリーニングした。陽性反応したハイブリドーマを限界希釈法により２回クローン化した。
【0046】
（フローサイトメトリーによるハイブリドーマのスクリーニング）
ＥＬＩＳＡにおいて、２つのハイブリドーマクローン（０１－１４－２２－５１及び０１－２２－４４－１０２）からの培養上清がいずれも、オボアルブミンコンジュゲートＣＤ６９ペプチドと強く反応した（０１－１４－２２－５１からの培養上清：２．７３±０．１１、０１－２２－４４－１０２からの培養上清：２．８４±０．１３、ＳＰ２／０－Ａｇ１４の培養上清：０．０７±０．０１（光学濃度（ＯＤ）４５０平均±標準偏差（ＳＤ）、６反復）。
ＥＬＩＳＡにおいて、２つのハイブリドーマクローン（０１－１４－２２－５１及び０１－２２－４４－１０２）からの培養上清がいずれも、オボアルブミンコンジュゲートＣＤ６９ペプチドと強く反応した（０１－１４－２２－５１からの培養上清：２．７３±０．１１、０１－２２－４４－１０２からの培養上清：２．８４±０．１３、ＳＰ２／０－Ａｇ１４の培養上清：０．０７±０．０１（光学濃度（ＯＤ）４５０平均±標準偏差（ＳＤ）、６反復）。
【0047】
ＥＬＩＳＡにおいて強く反応する２つのハイブリドーマクローン（０１－１４－２２－５１及び０１－２２－４４－１０２）からの培養上清をフローサイトメトリーによってさらに評価した。
健康な成ブタ（ランドレース×ラージホワイト×デュロック）１匹から全血を採取した。分割量（１００μＬ）の血液を、ＰＭＡ（最終濃度５０ｎｇ／ｍＬ；Ｓｉｇｍａ社製）及びイオノマイシン（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｎｇｌｏｂａｔｕｓからのイオノマイシンカルシウム塩、最終濃度１μｍｏｌ／Ｌ；Ｓｉｇｍａ社製）存在下又は非存在下インキュベートした。
５％ＣＯ２環境中３７℃で６時間インキュベートした後、赤血球（ＲＢＣ）を２ｍＬの１×ＲＢＣ溶解緩衝液（Ｔｏｎｂｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）で溶解した。得られた末梢単核細胞を、０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（ｗ／ｖ）を含む１×ＰＢＳ（－）で４×１０６細胞／ｍＬに調整した。
４０μＬの細胞懸濁液を１００μＬのハイブリドーマクローン培養上清と共にインキュベートした（１：１０希釈）。４℃で３０分間インキュベートした後、細胞を０．５％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）及び二次抗体を含む１×ＰＢＳ（－）で洗浄し、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８結合ヤギ抗マウスＩｇＧ Ｈ＆Ｌ（Ａｂcａｍ社製）を加えた（１：２０００希釈）。次に、細胞を再び４℃で１０分間インキュベートし、０．５％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）を含む１×ＰＢＳ（－）で洗浄し、０．５％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）を含む１×ＰＢＳ（－）で分離した。次いで、細胞をナイロンメッシュ（孔径：３２μｍ；東京スクリーン社製）を通して濾過し、そしてＦＬ－１の蛍光をフローサイトメーター（ＢＤアキュリＣ６；ＢＤ社製）により分析した。
その結果、モノクローナル抗体（ＩｇＧ２ｂ－κ及びＩｇＧ２ａ－κ）はいずれも、フローサイトメトリーアッセイにおいてＰＭＡ及びイオノマイシンで上記６時間刺激した後のほとんどのブタ末梢リンパ球と良好に反応することを確認した。
健康な成ブタ（ランドレース×ラージホワイト×デュロック）１匹から全血を採取した。分割量（１００μＬ）の血液を、ＰＭＡ（最終濃度５０ｎｇ／ｍＬ；Ｓｉｇｍａ社製）及びイオノマイシン（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｎｇｌｏｂａｔｕｓからのイオノマイシンカルシウム塩、最終濃度１μｍｏｌ／Ｌ；Ｓｉｇｍａ社製）存在下又は非存在下インキュベートした。
５％ＣＯ２環境中３７℃で６時間インキュベートした後、赤血球（ＲＢＣ）を２ｍＬの１×ＲＢＣ溶解緩衝液（Ｔｏｎｂｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）で溶解した。得られた末梢単核細胞を、０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（ｗ／ｖ）を含む１×ＰＢＳ（－）で４×１０６細胞／ｍＬに調整した。
４０μＬの細胞懸濁液を１００μＬのハイブリドーマクローン培養上清と共にインキュベートした（１：１０希釈）。４℃で３０分間インキュベートした後、細胞を０．５％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）及び二次抗体を含む１×ＰＢＳ（－）で洗浄し、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８結合ヤギ抗マウスＩｇＧ Ｈ＆Ｌ（Ａｂcａｍ社製）を加えた（１：２０００希釈）。次に、細胞を再び４℃で１０分間インキュベートし、０．５％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）を含む１×ＰＢＳ（－）で洗浄し、０．５％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）を含む１×ＰＢＳ（－）で分離した。次いで、細胞をナイロンメッシュ（孔径：３２μｍ；東京スクリーン社製）を通して濾過し、そしてＦＬ－１の蛍光をフローサイトメーター（ＢＤアキュリＣ６；ＢＤ社製）により分析した。
その結果、モノクローナル抗体（ＩｇＧ２ｂ－κ及びＩｇＧ２ａ－κ）はいずれも、フローサイトメトリーアッセイにおいてＰＭＡ及びイオノマイシンで上記６時間刺激した後のほとんどのブタ末梢リンパ球と良好に反応することを確認した。
【0048】
（モノクローナル抗体サブクラスの決定）
ＥＬＩＳＡ及びフローサイトメトリーにおいて良好な反応性を示した２つのハイブリドーマクローン（０１－１４－２２－５１及び０１－２２－４４－１０２）の培養上清を選択し、それらのＩｇＧサブクラス及び軽鎖クラスをＩｓｏＳｔｒｉｐマウスモノクローナルキット（ロシュ社製）によって決定してモノクローナル抗体（ＩｇＧ２ｂ－κ及びＩｇＧ２ａ－κ）を得た。
ＥＬＩＳＡ及びフローサイトメトリーにおいて良好な反応性を示した２つのハイブリドーマクローン（０１－１４－２２－５１及び０１－２２－４４－１０２）の培養上清を選択し、それらのＩｇＧサブクラス及び軽鎖クラスをＩｓｏＳｔｒｉｐマウスモノクローナルキット（ロシュ社製）によって決定してモノクローナル抗体（ＩｇＧ２ｂ－κ及びＩｇＧ２ａ－κ）を得た。
【0049】
（抗ブタＣＤ６９モノクローナル抗体（ＩｇＧ２ｂ－κ及びＩｇＧ２ａ－κ）の精製及び蛍光標識）
１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１００μｍｏｌ／Ｌヒポキサンチン（和光純薬社製）、１６μｍｏｌ／Ｌチミジン（和光純薬社製）及び５％（ｖ／ｖ）ＢＭ－Ｃｏｎｄｉｍｅｄ Ｈ１（Ｒｏｃｈｅ社製））を含有するＢＭ－ＨＴ（ＧＩＴ培地（和光純薬社製））を用いて、２つの微小ハイブリドーマクローン（０１－１４－２２－５１及び０１－２２－４４－１０２）を血清栄養培地（ハイブリドーマＳＦＭ；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社製）中での増殖に適応させた。
２．５％のＦＢＳの最終濃度となるように、下記３回の一連の５代継代培養で連続希釈した。
１０％ＦＢＳを含むＢＭ－ＨＴによる５代継代培養、
５％ＦＢＳを含むＢＭ－ＨＴ：ハイブリドーマＳＦＭ（１：１、ｖ／ｖ）による５代継代培養、及び
ＢＭ：ＨＡＴ：ＳＦＭ（１：３、ｖ／ｖ）による２．５％ＦＢＳを含む５代継代培養。
１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１００μｍｏｌ／Ｌヒポキサンチン（和光純薬社製）、１６μｍｏｌ／Ｌチミジン（和光純薬社製）及び５％（ｖ／ｖ）ＢＭ－Ｃｏｎｄｉｍｅｄ Ｈ１（Ｒｏｃｈｅ社製））を含有するＢＭ－ＨＴ（ＧＩＴ培地（和光純薬社製））を用いて、２つの微小ハイブリドーマクローン（０１－１４－２２－５１及び０１－２２－４４－１０２）を血清栄養培地（ハイブリドーマＳＦＭ；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社製）中での増殖に適応させた。
２．５％のＦＢＳの最終濃度となるように、下記３回の一連の５代継代培養で連続希釈した。
１０％ＦＢＳを含むＢＭ－ＨＴによる５代継代培養、
５％ＦＢＳを含むＢＭ－ＨＴ：ハイブリドーマＳＦＭ（１：１、ｖ／ｖ）による５代継代培養、及び
ＢＭ：ＨＡＴ：ＳＦＭ（１：３、ｖ／ｖ）による２．５％ＦＢＳを含む５代継代培養。
【0050】
Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５（３０ＫＮＭＷＬ；メルクミリポア社製）を用いて１００ｍＬの培養上清を約１ｍＬに濃縮した。
次に、抗体をＩｇＧ精製キットＡ（同仁堂社製）で精製した。全ての手順は製造業者の説明書通りに行なった。精製されたｍＡｂの濃度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ ＮＤ－１０００分光計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社製）にて吸光度２８０ｎｍ（Ａ２８０）で測定した。精製されたモノクローナル抗体を、ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７ラベリングキット－ＮＨ２（同仁堂社製）を用いて製造業者の説明書に従って蛍光標識した。蛍光標識抗ブタＣＤ６９モノクローナル抗体を、以下の実施例で使用するまで－３０℃で５０％グリセロール（ナカライテスク社製）中で保存した。
次に、抗体をＩｇＧ精製キットＡ（同仁堂社製）で精製した。全ての手順は製造業者の説明書通りに行なった。精製されたｍＡｂの濃度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ ＮＤ－１０００分光計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社製）にて吸光度２８０ｎｍ（Ａ２８０）で測定した。精製されたモノクローナル抗体を、ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７ラベリングキット－ＮＨ２（同仁堂社製）を用いて製造業者の説明書に従って蛍光標識した。蛍光標識抗ブタＣＤ６９モノクローナル抗体を、以下の実施例で使用するまで－３０℃で５０％グリセロール（ナカライテスク社製）中で保存した。
【0051】
＜実施例２：ＣＤ６９タンパク質の発現量に基づくブタＴ細胞の活性化度の評価＞
インビトロにおいて、ホルボール１２－ミリステート１３－アセテート（ＰＭＡ）等で刺激することによって、Ｔ細胞においてＣＤ６９タンパク質の発現が誘導されることが知られている。
インビトロにおいて、ホルボール１２－ミリステート１３－アセテート（ＰＭＡ）等で刺激することによって、Ｔ細胞においてＣＤ６９タンパク質の発現が誘導されることが知られている。
【0052】
ＰＭＡはプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）のアクチベーターであり、イオノマイシン（Ｉｏｎｏｍｙｃｉｎ）はカルシウムイオノフォアである。ＰＭＡ及びイオノマイシンの組み合わせはマイトジェンとして、ＰＫＣの活性化及びＣａ＋依存性シグナル伝達経路を活性化し細胞を人工的に活性化するために使用することができる。
例えば、ブタ白血球において、ＣＤ６９、ＩＦＮ－γ及びＴＮＦ－αを含むいくつかの免疫関連遺伝子の発現が、ＰＭＡ及びイオノマイシンの組み合わせによる刺激によって誘導されることが報告されている（Ｌｅｄｇｅｒ ＴＮ，Ｐｉｎｔｏｎ Ｐ，Ｂｏｕｒｇｅｓ Ｄ，Ｒｏｕｍｉ Ｐ，Ｓａｌｍｏｎ Ｈ，Ｏｓｗａｌｄ ＩＰ．２００４．「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｍａｃｒｏａｒｒａｙ ｔｏ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ａｎａｌｙｚｅ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｓｗｉｎｅ．」Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １１，６９１－６９８．；Ｇａｏ Ｙ，Ｆｌｏｒｉ Ｌ，Ｌｅｃａｒｄｏｎｎｅｌ Ｊ，Ｅｓｑｕｅｒｒｅ Ｄ，Ｈｕ ＺＬ，Ｔｅｉｌｌａｕｄ Ａ，ｅｔ ａｌ．２０１０．「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅ ＰＢＭＣｓ ａｆｔｅｒ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｂｙ ＬＰＳ ｏｒ ＰＭＡ／ｉｏｎｏｍｙｃｉｎ ｕｓｉｎｇ ａｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｒｒａｙ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｔｈｅ ｐｉｇ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ．」ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １１，２９２．）。
例えば、ブタ白血球において、ＣＤ６９、ＩＦＮ－γ及びＴＮＦ－αを含むいくつかの免疫関連遺伝子の発現が、ＰＭＡ及びイオノマイシンの組み合わせによる刺激によって誘導されることが報告されている（Ｌｅｄｇｅｒ ＴＮ，Ｐｉｎｔｏｎ Ｐ，Ｂｏｕｒｇｅｓ Ｄ，Ｒｏｕｍｉ Ｐ，Ｓａｌｍｏｎ Ｈ，Ｏｓｗａｌｄ ＩＰ．２００４．「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｍａｃｒｏａｒｒａｙ ｔｏ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ａｎａｌｙｚｅ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｓｗｉｎｅ．」Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １１，６９１－６９８．；Ｇａｏ Ｙ，Ｆｌｏｒｉ Ｌ，Ｌｅｃａｒｄｏｎｎｅｌ Ｊ，Ｅｓｑｕｅｒｒｅ Ｄ，Ｈｕ ＺＬ，Ｔｅｉｌｌａｕｄ Ａ，ｅｔ ａｌ．２０１０．「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅ ＰＢＭＣｓ ａｆｔｅｒ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｂｙ ＬＰＳ ｏｒ ＰＭＡ／ｉｏｎｏｍｙｃｉｎ ｕｓｉｎｇ ａｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｒｒａｙ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｔｈｅ ｐｉｇ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ．」ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １１，２９２．）。
【0053】
成ブタ３頭（ランドレース×ラージホワイト×デュロック）から全血を採取した。上述のように、ＰＭＡ及びイオノマイシンを用いて２００ｍＬの全血を刺激した。コントロールとしてＰＭＡ及びイオノマイシンで刺激しない２００ｍＬの全血を用意した。
それぞれについて上記実施例１で得られたモノクローナル抗体でＣＤ６９タンパク質を染色するために、５％ＣＯ２環境下において３７℃で６時間インキュベートした。
インキュベーション後、赤血球を１×ＲＢＣ溶解バッファー（Ｔｏｎｂｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）で溶解した。ＣＤ６９タンパク質をＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７コンジュゲートモノクローナル抗体（最終濃度１９μｇ／ｍＬ）で染色した。
最後に、細胞をナイロンメッシュ（孔径：３２μｍ；東京スクリーン社製）で濾過し、蛍光をフローサイトメトリーにより分析した。
ＣＤ６９陽性細胞の百分率は平均±標準偏差（ＳＤ）として示し、ウィルコクソンの順位和検定によってＰＭＡ及びイオノマイシン６時間刺激Ｔ細胞と無刺激Ｔ細胞との間で統計的に比較した。Ｐ＜０．０５を細胞群間の有意差とみなした。結果を図１に示す。
図１はＴ細胞活性化に伴うＣＤ６９タンパク質発現量の変化を示すドットプロットである。（ａ）は、リンパ球中のＴ細胞のドットプロットを示し、（ｂ）中、（ａ）中のＴ細胞のうち、黒は無刺激Ｔ細胞のカウント数を示し、グレー（灰）はＰＭＡ及びイオノマイシン６時間刺激により活性化したＴ細胞のカウント数を示す。
横軸の数値は、常用対数を示す。図２においても同様である。
それぞれについて上記実施例１で得られたモノクローナル抗体でＣＤ６９タンパク質を染色するために、５％ＣＯ２環境下において３７℃で６時間インキュベートした。
インキュベーション後、赤血球を１×ＲＢＣ溶解バッファー（Ｔｏｎｂｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）で溶解した。ＣＤ６９タンパク質をＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７コンジュゲートモノクローナル抗体（最終濃度１９μｇ／ｍＬ）で染色した。
最後に、細胞をナイロンメッシュ（孔径：３２μｍ；東京スクリーン社製）で濾過し、蛍光をフローサイトメトリーにより分析した。
ＣＤ６９陽性細胞の百分率は平均±標準偏差（ＳＤ）として示し、ウィルコクソンの順位和検定によってＰＭＡ及びイオノマイシン６時間刺激Ｔ細胞と無刺激Ｔ細胞との間で統計的に比較した。Ｐ＜０．０５を細胞群間の有意差とみなした。結果を図１に示す。
図１はＴ細胞活性化に伴うＣＤ６９タンパク質発現量の変化を示すドットプロットである。（ａ）は、リンパ球中のＴ細胞のドットプロットを示し、（ｂ）中、（ａ）中のＴ細胞のうち、黒は無刺激Ｔ細胞のカウント数を示し、グレー（灰）はＰＭＡ及びイオノマイシン６時間刺激により活性化したＴ細胞のカウント数を示す。
横軸の数値は、常用対数を示す。図２においても同様である。
【0054】
図１（ｂ）に示した結果から明らかなように、無刺激Ｔ細胞に比べて、ＰＭＡ及びイオノマイシン６時間刺激により活性化したＴ細胞では、ＣＤ６９タンパク質の標識強度、すなわちＣＤ６９タンパク質の発現量が有意に増加していることがわかる（Ｐ＜０．０１）。
ブタ由来の検体中のＣＤ６９タンパク質の存在量を定量することによりブタにおけるＴ細胞の活性化度を評価し得る。
ブタ由来の検体中のＣＤ６９タンパク質の存在量を定量することによりブタにおけるＴ細胞の活性化度を評価し得る。
【0055】
（比較例）
従来、ブタの研究では、ＩＦＮ－γ又はＴＮＦ－αを標的とするＥＬＩＳＰＯＴ又はＥＬＩＳＡアッセイが、特定の抗原で活性化されたリンパ球を検出するために頻繁に使用されてきた（Ｋｌｉｎｇｅ ＫＬ，Ｖａｕｇｈｎ ＥＭ，Ｒｏｏｆ ＭＢ，Ｂａｕｔｉｓｔａ ＥＭ，Ｍｕｒｔａｕｇｈ ＭＰ．２００９．「Ａｇｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ Ｐｏｒｃｉｎｅ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ａｎｄ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｖｉｒｕｓ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｓｗｉｎｅ．」Ｖｉｒｏｌｏｇｙ Ｊｏｕｒｎａｌ ６，１７７．；Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ Ｒ，Ｅｌｅｙ Ｔ，Ｂｒｏｗｎｅ Ｃ，Ｍａｒｔｉｎｅａｕ ＨＭ，Ｗｅｒｌｉｎｇ Ｄ．２０１５．「Ｏｒａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｒｅｅｚｅ－ｄｒｉｅｄ ｙｅａｓｔ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｔｈｅ ＰＣＶ２ｂ Ｃａｐ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｎ ｔｈｅｉｒ ｓｕｒｆａｃｅ ｉｎｄｕｃｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｔｏ ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔ ＰＣＶ２ｂ ｃｈａｌｌｅｎｇｅ ｉｎ ｖｉｖｏ． Ｖａｃｃｉｎｅ ３３，６１９９－６２０５．）。
比較例としてサイトカイン（ＩＦＮ－γ及びＴＮＦ－α）の発現量と、ブタＴ細胞の活性化度との相関の評価も行った。
具体的には、サイトカイン（ＩＦＮ－γ及びＴＮＦ－α）を染色するために、細胞膜からサイトカインの放出を防ぐために、ＰＭＡ及びイオノマイシンとともにブレフェルジンＡ（最終濃度１０μｇ／ｍＬ；Ｓｉｇｍａ社製）を添加した。混合物を５％ＣＯ２環境中３７℃で２０時間インキュベートした。インキュベーション後、赤血球を１×ＲＢＣ溶解バッファー（Ｔｏｎｂｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）で溶解した。ＩＦＮ－γ及びＴＮＦ－αを染色し、次いで、ＰＥコンジュゲート抗ブタＩＦＮ－γマウスモノクローナル抗体（クローン：Ｐ２Ｇ１０；ＢＤ社製）及びＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５コンジュゲート抗ヒトＴＮＦ－αマウスモノクローナル抗体（クローン：ＭＡｂ１１；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）を用いて２％パラホルムアルデヒド（ナカライテスク社製）で透過処理した。
最後に、細胞をナイロンメッシュ（孔径：３２μｍ；東京スクリーン社製）で濾過し、蛍光をフローサイトメトリーにより分析した。
従来、ブタの研究では、ＩＦＮ－γ又はＴＮＦ－αを標的とするＥＬＩＳＰＯＴ又はＥＬＩＳＡアッセイが、特定の抗原で活性化されたリンパ球を検出するために頻繁に使用されてきた（Ｋｌｉｎｇｅ ＫＬ，Ｖａｕｇｈｎ ＥＭ，Ｒｏｏｆ ＭＢ，Ｂａｕｔｉｓｔａ ＥＭ，Ｍｕｒｔａｕｇｈ ＭＰ．２００９．「Ａｇｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ Ｐｏｒｃｉｎｅ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ａｎｄ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｖｉｒｕｓ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｓｗｉｎｅ．」Ｖｉｒｏｌｏｇｙ Ｊｏｕｒｎａｌ ６，１７７．；Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ Ｒ，Ｅｌｅｙ Ｔ，Ｂｒｏｗｎｅ Ｃ，Ｍａｒｔｉｎｅａｕ ＨＭ，Ｗｅｒｌｉｎｇ Ｄ．２０１５．「Ｏｒａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｒｅｅｚｅ－ｄｒｉｅｄ ｙｅａｓｔ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｔｈｅ ＰＣＶ２ｂ Ｃａｐ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｎ ｔｈｅｉｒ ｓｕｒｆａｃｅ ｉｎｄｕｃｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｔｏ ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔ ＰＣＶ２ｂ ｃｈａｌｌｅｎｇｅ ｉｎ ｖｉｖｏ． Ｖａｃｃｉｎｅ ３３，６１９９－６２０５．）。
比較例としてサイトカイン（ＩＦＮ－γ及びＴＮＦ－α）の発現量と、ブタＴ細胞の活性化度との相関の評価も行った。
具体的には、サイトカイン（ＩＦＮ－γ及びＴＮＦ－α）を染色するために、細胞膜からサイトカインの放出を防ぐために、ＰＭＡ及びイオノマイシンとともにブレフェルジンＡ（最終濃度１０μｇ／ｍＬ；Ｓｉｇｍａ社製）を添加した。混合物を５％ＣＯ２環境中３７℃で２０時間インキュベートした。インキュベーション後、赤血球を１×ＲＢＣ溶解バッファー（Ｔｏｎｂｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）で溶解した。ＩＦＮ－γ及びＴＮＦ－αを染色し、次いで、ＰＥコンジュゲート抗ブタＩＦＮ－γマウスモノクローナル抗体（クローン：Ｐ２Ｇ１０；ＢＤ社製）及びＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５コンジュゲート抗ヒトＴＮＦ－αマウスモノクローナル抗体（クローン：ＭＡｂ１１；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）を用いて２％パラホルムアルデヒド（ナカライテスク社製）で透過処理した。
最後に、細胞をナイロンメッシュ（孔径：３２μｍ；東京スクリーン社製）で濾過し、蛍光をフローサイトメトリーにより分析した。
【0056】
その結果、リンパ球中のＴＮＦ－α陽性細胞もまた、ＰＭＡ及びイオノマイシン刺激により有意に増加したものの（無刺激：１．５５±０．０６％、ＰＭＡ及びイオノマイシン刺激：１３．５３＋５．８１％、Ｐ＜０．０１）、無刺激リンパ球数と刺激リンパ球数との差は上記ＣＤ６９陽性細胞における差よりもはるかに小さかった（約１／５）。
また、ＩＦＮ－γ陽性細胞の数は、ＰＭＡ及びイオノマイシンの刺激によってわずかに増加したものの有意差はなかった（無刺激：１．１６±０．２５％、ＰＭＡ及びイオノマイシン刺激：４．９３±０．６３％、ＣＤ６９陽性細胞における差の約１／１５）。
この結果は、刺激に反応して発現されるサイトカインが細胞の種類によって大きく相違するためであると考えられる一方、下記実施例３に示した結果からもわかるように、ＣＤ６９タンパク質は活性化刺激に反応してほとんどのリンパ球（Ｔ細胞を含む。）で発現された。
したがって、サイトカイン（ＩＦＮ－γ及びＴＮＦ－α）の発現量に基づいて、ブタＴ細胞の活性化度を評価することは困難である一方、ブタ由来の検体中のＣＤ６９タンパク質の存在量を定量することは、サイトカインよりも感度よくブタにおけるＴ細胞の活性化度を評価し得るといえる。
また、ＩＦＮ－γ陽性細胞の数は、ＰＭＡ及びイオノマイシンの刺激によってわずかに増加したものの有意差はなかった（無刺激：１．１６±０．２５％、ＰＭＡ及びイオノマイシン刺激：４．９３±０．６３％、ＣＤ６９陽性細胞における差の約１／１５）。
この結果は、刺激に反応して発現されるサイトカインが細胞の種類によって大きく相違するためであると考えられる一方、下記実施例３に示した結果からもわかるように、ＣＤ６９タンパク質は活性化刺激に反応してほとんどのリンパ球（Ｔ細胞を含む。）で発現された。
したがって、サイトカイン（ＩＦＮ－γ及びＴＮＦ－α）の発現量に基づいて、ブタＴ細胞の活性化度を評価することは困難である一方、ブタ由来の検体中のＣＤ６９タンパク質の存在量を定量することは、サイトカインよりも感度よくブタにおけるＴ細胞の活性化度を評価し得るといえる。
【0057】
＜実施例３：ＣＤ６９、ＣＤ４及びＣＤ８タンパク質の発現量に基づくＴ細胞の各サブセット（細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、及び記憶性Ｔ細胞）個別の活性化度評価＞
上記実施例２で得られたＰＭＡ及びイオノマイシン６時間刺激Ｔ細胞と無刺激Ｔ細胞において、上記実施例１で得られた抗ブタＣＤ６９モノクローナル抗体、抗ブタＣＤ４モノクローナル抗体及び抗ブタＣＤ８モノクローナル抗体を組み合わせて用いて、活性化ブタＴ細胞の各サブセット（細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、及び記憶性Ｔ細胞）について個別に活性化度を評価した。結果を図２に示す。
図２は、Ｔ細胞の各サブセット（細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、及び記憶性Ｔ細胞）個別の活性化によるＣＤ６９タンパク質発現量の変化を示す図である。
（ａ）に示したドットプロット中、ＣＤ４陰性ＣＤ８陽性の領域は細胞傷害性Ｔ細胞の領域を示す。
ＣＤ４及びＣＤ８二重陽性の領域は記憶性Ｔ細胞の領域を示す。
ＣＤ４陽性及びＣＤ８陰性の領域はヘルパーＴ細胞の領域を示す。
上記実施例２で得られたＰＭＡ及びイオノマイシン６時間刺激Ｔ細胞と無刺激Ｔ細胞において、上記実施例１で得られた抗ブタＣＤ６９モノクローナル抗体、抗ブタＣＤ４モノクローナル抗体及び抗ブタＣＤ８モノクローナル抗体を組み合わせて用いて、活性化ブタＴ細胞の各サブセット（細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、及び記憶性Ｔ細胞）について個別に活性化度を評価した。結果を図２に示す。
図２は、Ｔ細胞の各サブセット（細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、及び記憶性Ｔ細胞）個別の活性化によるＣＤ６９タンパク質発現量の変化を示す図である。
（ａ）に示したドットプロット中、ＣＤ４陰性ＣＤ８陽性の領域は細胞傷害性Ｔ細胞の領域を示す。
ＣＤ４及びＣＤ８二重陽性の領域は記憶性Ｔ細胞の領域を示す。
ＣＤ４陽性及びＣＤ８陰性の領域はヘルパーＴ細胞の領域を示す。
【0058】
（ｂ）中、黒は無刺激細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ４陰性ＣＤ８陽性）のカウント数を示し、グレーはＰＭＡ及びイオノマイシン６時間刺激により活性化した細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ４陰性ＣＤ８陽性）のカウント数を示す。
（ｃ）中、黒は無刺激記憶性Ｔ細胞（ＣＤ４及びＣＤ８二重陽性）のカウント数を示し、グレーはＰＭＡ及びイオノマイシン６時間刺激により活性化した記憶性Ｔ細胞（ＣＤ４及びＣＤ８二重陽性）のカウント数を示す。
（ｄ）中、黒は無刺激ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４陽性及びＣＤ８陰性）のカウント数を示し、グレーはＰＭＡ及びイオノマイシン６時間刺激により活性化したヘルパーＴ細胞（ＣＤ４陽性及びＣＤ８陰性）のカウント数を示す。
（ｃ）中、黒は無刺激記憶性Ｔ細胞（ＣＤ４及びＣＤ８二重陽性）のカウント数を示し、グレーはＰＭＡ及びイオノマイシン６時間刺激により活性化した記憶性Ｔ細胞（ＣＤ４及びＣＤ８二重陽性）のカウント数を示す。
（ｄ）中、黒は無刺激ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４陽性及びＣＤ８陰性）のカウント数を示し、グレーはＰＭＡ及びイオノマイシン６時間刺激により活性化したヘルパーＴ細胞（ＣＤ４陽性及びＣＤ８陰性）のカウント数を示す。
【0059】
図２（ｂ）～（ｄ）に示した結果から明らかなように、無刺激に比べて、ＰＭＡ及びイオノマイシン６時間刺激により活性化した各サブセット（細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、及び記憶性Ｔ細胞）では、ＣＤ６９タンパク質の標識強度、すなわちＣＤ６９タンパク質の発現量が有意に増加していることがわかる。
すなわち、ＣＤ６９タンパク質は活性化刺激に反応してＴ細胞の各サブセット（細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、及び記憶性Ｔ細胞）で発現されていることがわかる。
すなわち、ＣＤ６９タンパク質は活性化刺激に反応してＴ細胞の各サブセット（細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、及び記憶性Ｔ細胞）で発現されていることがわかる。
【0060】
＜実施例４：ＣＤ６９及びＣＤ３タンパク質の発現量に基づくＰＲＲＳＶ感染前後におけるブタＴ細胞の活性化度の評価＞
上記実施例１で得られた抗ブタＣＤ６９モノクローナル抗体と、Ｔ細胞マーカーＣＤ３タンパク質を検出する抗ブタＣＤ３抗体とを組み合わせて用いて、抗体及びワクチンによる疾病対策が困難なＰＲＲＳウイルス（ＰＲＲＳＶ）感染におけるＴ細胞の活性化度を評価した。結果を図３に示す。
上記実施例１で得られた抗ブタＣＤ６９モノクローナル抗体と、Ｔ細胞マーカーＣＤ３タンパク質を検出する抗ブタＣＤ３抗体とを組み合わせて用いて、抗体及びワクチンによる疾病対策が困難なＰＲＲＳウイルス（ＰＲＲＳＶ）感染におけるＴ細胞の活性化度を評価した。結果を図３に示す。
【0061】
図３は、ＣＤ６９及びＣＤ３タンパク質の発現量に基づくＰＲＲＳＶ感染前後におけるブタＴ細胞の活性化の変化を示す図である。
グラフ１は、ＰＲＲＳＶ感染前の無刺激のブタ血液中活性化Ｔ細胞（ＣＤ６９及びＣＤ３二重陽性細胞）の割合を示すグラフである。
グラフ２は、ＰＲＲＳＶ感染前のＰＲＲＳＶ刺激のブタ血液中活性化Ｔ細胞（ＣＤ６９及びＣＤ３二重陽性細胞）の割合を示すグラフである。ＰＲＲＳＶ刺激は、ＰＲＲＳＶにおけるＭタンパク質の一部のペプチド（配列番号２）をウイルス抗原として用いてインビトロにて行った。
グラフ３は、ＰＲＲＳＶ感染２週間後の無刺激のブタ血液中活性化Ｔ細胞（ＣＤ６９及びＣＤ３二重陽性細胞）の割合を示すグラフである。
グラフ４は、ＰＲＲＳＶ感染２週間後のＰＲＲＳＶ刺激のブタ血液中活性化Ｔ細胞（ＣＤ６９及びＣＤ３二重陽性細胞）の割合を示すグラフである。
グラフ１は、ＰＲＲＳＶ感染前の無刺激のブタ血液中活性化Ｔ細胞（ＣＤ６９及びＣＤ３二重陽性細胞）の割合を示すグラフである。
グラフ２は、ＰＲＲＳＶ感染前のＰＲＲＳＶ刺激のブタ血液中活性化Ｔ細胞（ＣＤ６９及びＣＤ３二重陽性細胞）の割合を示すグラフである。ＰＲＲＳＶ刺激は、ＰＲＲＳＶにおけるＭタンパク質の一部のペプチド（配列番号２）をウイルス抗原として用いてインビトロにて行った。
グラフ３は、ＰＲＲＳＶ感染２週間後の無刺激のブタ血液中活性化Ｔ細胞（ＣＤ６９及びＣＤ３二重陽性細胞）の割合を示すグラフである。
グラフ４は、ＰＲＲＳＶ感染２週間後のＰＲＲＳＶ刺激のブタ血液中活性化Ｔ細胞（ＣＤ６９及びＣＤ３二重陽性細胞）の割合を示すグラフである。
【0062】
グラフ１及び２の比較から、ウイルス感染前は、ブタ血液中活性化Ｔ細胞（ＣＤ６９及びＣＤ３二重陽性細胞）の割合に有意差がなく、感作していないといえる。
【0063】
グラフ１及び３の比較から、ウイルス感染２週間後は、ブタ血液中活性化Ｔ細胞（ＣＤ６９及びＣＤ３二重陽性細胞）の割合が有意に低下し（Ｐ＝０．０１２）、免疫力が低下しＰＲＲＳに罹患しているといえる。
すなわち、ブタ由来の検体中のＣＤ６９タンパク質の存在量を定量することにより、ブタの病原体感染を検査し得る。
また、グラフ３及び４の比較から、ウイルス感染２週間後（感作後）は、ブタ血液中活性化Ｔ細胞（ＣＤ６９及びＣＤ３二重陽性細胞）の割合が、ウイルス刺激直後に有意に増加することから（Ｐ＝０．０１５）、ブタの病原体感染を迅速に検査し得るといえる。
また、グラフ１（及び２）と、グラフ３（及び４）との比較から、ウイルス感染前は、抗原刺激によるブタ血液中活性化Ｔ細胞の割合に有意差がないのに対し、ウイルス感染後は、抗原刺激によりブタ血液中活性化Ｔ細胞の割合が有意に増加することから（Ｐ＝０．０１５）、ブタの病原体感染を検査し得るといえる。
すなわち、ブタ由来の検体中のＣＤ６９タンパク質の存在量を定量することにより、ブタの病原体感染を検査し得る。
また、グラフ３及び４の比較から、ウイルス感染２週間後（感作後）は、ブタ血液中活性化Ｔ細胞（ＣＤ６９及びＣＤ３二重陽性細胞）の割合が、ウイルス刺激直後に有意に増加することから（Ｐ＝０．０１５）、ブタの病原体感染を迅速に検査し得るといえる。
また、グラフ１（及び２）と、グラフ３（及び４）との比較から、ウイルス感染前は、抗原刺激によるブタ血液中活性化Ｔ細胞の割合に有意差がないのに対し、ウイルス感染後は、抗原刺激によりブタ血液中活性化Ｔ細胞の割合が有意に増加することから（Ｐ＝０．０１５）、ブタの病原体感染を検査し得るといえる。
【0064】
グラフ３及び４の比較から、ウイルス感染２週間後（感作後）は、ブタ血液中活性化Ｔ細胞（ＣＤ６９及びＣＤ３二重陽性細胞）の割合が、抗原刺激により有意に増加し（Ｐ＝０．０１５）、ＰＲＲＳに対して細胞性免疫が働いているといえる。
したがって、ワクチン候補物質（例えば、ＰＲＲＳＶ様物質）を投与したブタ血液中のＣＤ６９タンパク質の存在量に基づき評価されるＴ細胞の活性化度の増加を指標としてブタ疾患（例えば、ＰＲＲＳ）に対するワクチン候補物質をスクリーニングし得ることが考えられる。
したがって、ワクチン候補物質（例えば、ＰＲＲＳＶ様物質）を投与したブタ血液中のＣＤ６９タンパク質の存在量に基づき評価されるＴ細胞の活性化度の増加を指標としてブタ疾患（例えば、ＰＲＲＳ）に対するワクチン候補物質をスクリーニングし得ることが考えられる。
【図1】
【図2】
【図3】
【配列表】