特許 7416549 第Ｘａ因子解毒剤の凍結乾燥製剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-01-09

(45)【発行日】2024-01-17

(54)【発明の名称】第Ｘａ因子解毒剤の凍結乾燥製剤

(51)【国際特許分類】

   A61K 38/36 20060101AFI20240110BHJP

   A61K 9/08 20060101ALI20240110BHJP

   A61K 47/18 20170101ALI20240110BHJP

   A61K 47/12 20060101ALI20240110BHJP

   A61K 47/26 20060101ALI20240110BHJP

   A61K 9/19 20060101ALI20240110BHJP

   A61P 7/04 20060101ALI20240110BHJP

   C07K 14/745 20060101ALN20240110BHJP

【ＦＩ】

A61K38/36

A61K9/08

A61K47/18

A61K47/12

A61K47/26

A61K9/19

A61P7/04

C07K14/745 ZNA

【請求項の数】 16

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2021172975

(22)【出願日】2021-10-22

(62)【分割の表示】P 2019165981の分割

【原出願日】2015-08-20

(65)【公開番号】P2022003101

(43)【公開日】2022-01-11

【審査請求日】2021-10-22

(31)【優先権主張番号】62/039,809

(32)【優先日】2014-08-20

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】506109155

【氏名又は名称】ポートラ ファーマシューティカルズ， エルエルシー

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(72)【発明者】

【氏名】フアン ワン

(72)【発明者】

【氏名】グレゴリー エー． サチャ

(72)【発明者】

【氏名】フォン エム． グエン

【審査官】柴原 直司

(56)【参考文献】

【文献】特許第６７４２９８６（ＪＰ，Ｂ２）

【文献】特表２０１２－５３３５５２（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ ３８／００－３８／５８

Ａ６１Ｋ ４１／００－４５／０８

Ａ６１Ｋ ４８／００

Ａ６１Ｋ ５０／００－５１／１２

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ｉ）１０ｍＭから５５ｍＭのアルギニンまたは８ｍＭから３５ｍＭのシトラート、（ｉｉ）１％から３％のスクロース（ｗ／ｖ）、（ｉｉｉ）２％から８％のマンニトール（ｗ／ｖ）ならびに（ｉｖ）配列番号４と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の鎖、配列番号５と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の鎖及び配列番号４の９８位の第１のシステイン残基（Ｃｙｓ９８）と配列番号５の１０８位の第２のシステイン残基（Ｃｙｓ１０８）との間のジスルフィド結合を含む２本鎖のポリペプチドを含み、７．５から８のｐＨを有し、ここで、前記２本鎖のポリペプチドは、ｆＸａ阻害剤と結合することができるが、集まってプロトロンビナーゼ複合体を形成することができず、かつ野生型ｆＸａタンパク質と比較して低減された触媒活性を有する、水性製剤。

【請求項2】

前記２本鎖のポリペプチドは、野生型ｆＸａタンパク質と比較してＧｌａドメインおよび活性部位に修飾を有する、請求項１に記載の製剤。

【請求項3】

（ｉ）８ｍＭから３５ｍＭのシトラート、（ｉｉ）１％から３％のスクロース（ｗ／ｖ）、（ｉｉｉ）２％から８％のマンニトール（ｗ／ｖ）ならびに（ｉｖ）配列番号４のアミノ酸配列を含む第１の鎖、配列番号５のアミノ酸配列を含む第２の鎖及び配列番号４の９８位の第１のシステイン残基（Ｃｙｓ９８）と配列番号５の１０８位の第２のシステイン残基（Ｃｙｓ１０８）との間のジスルフィド結合を含む少なくとも５ｍｇ／ｍＬの２本鎖のポリペプチドを含み、７．５から８のｐＨを有する、請求項１に記載の製剤。

【請求項4】

１０ｍＭから３０ｍＭのシトラート、１．５％から２．５％のスクロース（ｗ／ｖ）、４．５％から５．５％のマンニトール（ｗ／ｖ）及び少なくとも１０ｍｇ／ｍＬの前記ポリペプチドを含む、請求項３に記載の製剤。

【請求項5】

前記ポリペプチドが、前記第１及び第２の鎖のそれぞれに関して少なくとも鎖内ジスルフィド結合を含む、請求項３に記載の製剤。

【請求項6】

少なくとも１８ｍｇ／ｍＬの前記ポリペプチドを含む、請求項４または５に記載の製剤。

【請求項7】

前記ポリペプチドが、天然アミノ酸とは異なるよう修飾されたアミノ酸残基を含む、請求項４または５に記載の製剤。

【請求項8】

前記第１の鎖の残基Ａｓｐ２９が、Ａｓｐ２９において（３Ｒ）－３－ヒドロキシＡｓｐに修飾されている、請求項７に記載の製剤。

【請求項9】

（ｉ）４５ｍＭのアルギニンまたは１０ｍＭのシトラート、２％のスクロース（ｗ／ｖ）、５％のマンニトール（ｗ／ｖ）ならびに配列番号４のアミノ酸配列を含む第１の鎖、配列番号５のアミノ酸配列を含む第２の鎖及び配列番号４の９８位の第１のシステイン残基（Ｃｙｓ９８）と配列番号５の１０８位の第２のシステイン残基（Ｃｙｓ１０８）との間のジスルフィド結合を含む１０ｍｇ／ｍＬの２本鎖のポリペプチドを含み、７．８のｐＨを有する、あるいは
（ｉｉ）４５ｍＭのアルギニンまたは１０ｍＭのシトラート、２％のスクロース（ｗ／ｖ）、５％のマンニトール（ｗ／ｖ）ならびに配列番号４のアミノ酸配列を含む第１の鎖、配列番号５のアミノ酸配列を含む第２の鎖及び配列番号４の９８位の第１のシステイン残基（Ｃｙｓ９８）と配列番号５の１０８位の第２のシステイン残基（Ｃｙｓ１０８）との間のジスルフィド結合を含む２０ｍｇ／ｍＬの２本鎖のポリペプチドを含み、７．８のｐＨを有する、
請求項１に記載の製剤。

【請求項10】

請求項１～９のいずれか一項に記載の水性製剤を凍結乾燥することを含む凍結乾燥製剤を調製する方法。

【請求項11】

請求項１～９のいずれか一項に記載の水性製剤を凍結乾燥することによって得られる凍結乾燥組成物。

【請求項12】

配列番号４に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列の第１の鎖、配列番号５に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列の第２の鎖及び配列番号４の９８位の第１のシステイン残基（Ｃｙｓ９８）と配列番号５の１０８位の第２のシステイン残基（Ｃｙｓ１０８）との間のジスルフィド結合を含む２本鎖のポリペプチドならびに（０．１５～０．６６）：（１～３）：（２～８）の範囲の重量比のシトラート：スクロース：マンニトールを含む、凍結乾燥組成物であって、ここで、前記２本鎖のポリペプチドは、ｆＸａ阻害剤と結合することができるが、集まってプロトロンビナーゼ複合体を形成することができず、かつ野生型ｆＸａタンパク質と比較して低減された触媒活性を有する、凍結乾燥組成物。

【請求項13】

少なくとも１８％（ｗ／ｗ）の前記２本鎖のポリペプチドを含む、請求項１２に記載の凍結乾燥組成物。

【請求項14】

前記シトラート：スクロース：マンニトールの重量比が、（０．１９～０．５７）：（１．５～２．５）：（４．５～５．５）の範囲である、請求項１３に記載の凍結乾燥組成物。

【請求項15】

第Ｘａ因子阻害剤を用いた抗凝固療法を受けている対象の出血を低減する方法であって、前記凍結乾燥組成物を水性溶媒に溶解することによって調製される溶液を前記対象に投与することを含む方法における使用のための、請求項１２～１４のいずれか一項に記載の凍結乾燥組成物。

【請求項16】

前記第Ｘａ因子阻害剤はアピキサバン、リバーロキサバンまたはベトリキサバンである、請求項１５に記載の使用のための凍結乾燥組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連特許出願の相互参照
本出願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．第１１９（ｅ）条のもとに２０１４年８月２０日に出願された米国仮出願第６２／０３９８０９号の利益を主張するものであり、その全体をあらゆる目的のために参照によって本明細書に組み込んだものとする。

【背景技術】

【0002】

抗凝固剤は、例えば、凝固障害がある患者、動けない期間に制限された患者または医学的手術を受ける患者など凝血塊を形成しやすい患者の望ましくない血栓症の処置または予防の市場においてニーズを満たしている。しかしながら、抗凝固療法の重大な制約の１つは、処置に関連する出血のリスクであり、過剰投与の場合または緊急の外科的手技が必要とされる場合に速やかに抗凝固活性を逆行させる能力に関する限界である。したがって、あらゆる形態の抗凝固療法に対して特異的で効果的な解毒剤が極めて望まれている。

【0003】

経口送達が実用的でないか、または即時の治療活性が必要とされる場合、生物学的に活性なタンパク質の注入による送達が一般に最適な送達経路である。しかしながら、不良な長期保管、重量オスモル濃度、溶解性及び安定性の生物学的、化学的及び物理的障害により、哺乳動物に対する生物活性剤の注入による送達が問題となる。凍結乾燥は、長期保管の問題を解決することができる。しかし、凍結乾燥物の不十分な溶解性及び安定性などの凍結乾燥に伴って起こる問題もある。したがって、安定で可溶性の、抗凝固剤に対する解毒剤の改良された注入可能な調製物に対してニーズがある。本開示は、こうしたニーズ及びその他のニーズを満たすものである。

【0004】

本明細書中で言及される任意の及びすべての公報、特許、特許出願は、その全体を参照により本明細書に組み込んだものとする。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0005】

本開示は、「ｒ－Ａｎｔｉｄｏｔｅ」とも呼ばれる第Ｘａ因子（ｆＸａ）タンパク質の誘導体の凍結乾燥製剤を提供する。野生型ｆＸａタンパク質と比較して、ｒ－Ａｎｔｉｄｏｔｅは、Ｇｌａドメイン及び活性部位に修飾があり、ｆＸａ阻害剤と結合するｆＸａの能力を保持するが、集まってプロトロンビナーゼ複合体は形成しない。ｒ－Ａｎｔｉｄｏｔｅは２本鎖のポリペプチドである（表３の配列番号３を参照のこと、これは、軽鎖のシステイン９８（Ｃｙｓ９８）と重鎖のシステイン１０８（Ｃｙｓ１０８）との間の１つのジスルフィド結合により結合した軽鎖（配列番号４）及び重鎖（配列番号５）を含む。

【0006】

また野生型ｆＸａのように、ｒ－Ａｎｔｉｄｏｔｅは、翻訳後修飾を受けて、結果として特定のアミノ酸残基、例えば、軽鎖のＳｅｒ５６、Ｓｅｒ７２、Ｓｅｒ７６及びＴｈｒ８２ならびに重鎖のＴｈｒ２４９におけるグリコシル化、ならびに軽鎖のＡｓｐ２９における修飾残基、（３Ｒ）－３－ヒドロキシＡｓｐが生じる。さらに、鎖間のジスルフィド結合に加えて、軽鎖のシステイン１６と２７、２１と３６、３８と４７、５５と６６、６２と７５及び７７と９０との間、ならびに重鎖のシステイン７と１２、２７と４３、１５６と１７０及び１８１と２０９の間に形成された鎖内ジスルフィド結合がある。

【0007】

ｒ－Ａｎｔｉｄｏｔｅの２本鎖構造及びさまざまな翻訳後修飾のために、許容できる重量オスモル濃度の安定した可溶性の溶液を提供する安定した凍結乾燥製剤の開発には大きな難題が生じることが本明細書において示されている。しかしながら、予想外にも、本発明者らは、タンパク質の溶解性、安定性、ケーク構造及び重量オスモル濃度がバランスを保った溶液に到達することができた。

【0008】

一実施形態において、本開示は、水性製剤を提供する。一実施形態において、本製剤は、１０ｍＭから５５ｍＭのアルギニンまたは８ｍＭから３５ｍＭのシトラート、１％から３％のスクロース（ｗ／ｖ）、２％から８％のマンニトール（ｗ／ｖ）ならびに配列番号４のアミノ酸配列の第１の鎖、配列番号５のアミノ酸配列の第２の鎖及び配列番号４の９８位の第１のシステイン残基（Ｃｙｓ９８）と配列番号５の１０８位の第２のシステイン残基（Ｃｙｓ１０８）との間のジスルフィド結合を含む少なくとも５ｍｇ／ｍＬの２本鎖のポリペプチドを含み、７．５から８のｐＨを有する。

【0009】

一部の態様において、本製剤は、４０ｍＭから５０ｍＭのアルギニン、１．５％から２．５％のスクロース（ｗ／ｖ）、４．５％から５．５％のマンニトール（ｗ／ｖ）及び少なくとも１０ｍｇ／ｍＬのポリペプチドを含む。一部の態様において、本製剤は、１０ｍＭから３０ｍＭのシトラート、１．５％から２．５％のスクロース（ｗ／ｖ）、４．５％から５．５％のマンニトール（ｗ／ｖ）及び少なくとも１０ｍｇ／ｍＬのポリペプチドを含む。

【0010】

一部の態様において、本製剤は、４０ｍＭから５０ｍＭのアルギニン、１．５％から２．５％のスクロース（ｗ／ｖ）、４．５％から５．５％のマンニトール（ｗ／ｖ）及び少なくとも１８、１９または２０ｍｇ／ｍＬのポリペプチドを含む。一部の態様において、本製剤は、１０ｍＭから３０ｍＭのシトラート、１．５％から２．５％のスクロース（ｗ／ｖ）、４．５％から５．５％のマンニトール（ｗ／ｖ）及び少なくとも１０ｍｇ／ｍＬのポリペプチドを含む。

【0011】

一部の態様において、本製剤は、約４５ｍＭのアルギニン、約２％のスクロース（ｗ／ｖ）、約５％のマンニトール（ｗ／ｖ）ならびに配列番号４のアミノ酸配列を含む第１の鎖、配列番号５のアミノ酸配列を含む第２の鎖及び配列番号４の９８位の第１のシステイン残基（Ｃｙｓ９８）と配列番号５の１０８位の第２のシステイン残基（Ｃｙｓ１０８）との間のジスルフィド結合を含む約１０ｍｇ／ｍＬの２本鎖のポリペプチドを含み、約７．８のｐＨを有する。一態様において、本製剤は、ポリソルベート８０（０．０１％ｗ／ｖから０．０２％ｗ／ｖ）及び／または緩衝剤をさらに含む。

【0012】

一部の態様において、本製剤は、約４５ｍＭのアルギニン、約２％のスクロース（ｗ／ｖ）、約５％のマンニトール（ｗ／ｖ）ならびに配列番号４のアミノ酸配列を含む第１の鎖、配列番号５のアミノ酸配列を含む第２の鎖及び配列番号４の９８位の第１のシステイン残基（Ｃｙｓ９８）と配列番号５の１０８位の第２のシステイン残基（Ｃｙｓ１０８）との間のジスルフィド結合を含む約２０ｍｇ／ｍＬの２本鎖のポリペプチドを含み、約７．８のｐＨを有する。一態様において、本製剤は、ポリソルベート８０（０．０１％ｗ／ｖから０．０２％ｗ／ｖ）及び／または緩衝剤をさらに含む。

【0013】

一部の態様において、本ポリペプチドは、天然アミノ酸とは異なるよう修飾されたアミノ酸残基を含む。一部の態様において、第１の鎖の残基Ａｓｐ２９は、Ａｓｐ２９において（３Ｒ）－３－ヒドロキシＡｓｐに修飾される。一部の態様において、本ポリペプチドは、第１及び第２の鎖のそれぞれに関して少なくとも鎖内ジスルフィド結合を含む。

【0014】

一実施形態において、配列番号４のアミノ酸配列の第１の鎖、配列番号５のアミノ酸配列の第２の鎖及び配列番号４の９８位の第１のシステイン残基（Ｃｙｓ９８）と配列番号５の１０８位の第２のシステイン残基（Ｃｙｓ１０８）との間のジスルフィド結合を含む２本鎖のポリペプチドの凍結乾燥製剤を調製する方法であって、上記のとおりの水性製剤を凍結乾燥することを含む方法も提供される。

【0015】

別の実施形態は、本開示の水性製剤を凍結乾燥することによって調製される凍結乾燥組成物を提供する。

【0016】

一実施形態において、本開示は、配列番号４のアミノ酸配列の第１の鎖、配列番号５のアミノ酸配列の第２の鎖及び配列番号４の９８位の第１のシステイン残基（Ｃｙｓ９８）と配列番号５の１０８位の第２のシステイン残基（Ｃｙｓ１０８）との間のジスルフィド結合を含む少なくとも１０％（ｗ／ｗ）の２本鎖のポリペプチドならびにアルギニン：スクロース：マンニトールを（０．６～０．９５）：（１～３）：（２～８）の範囲の重量比で、あるいはＬ－アルギニンＨＣｌ：スクロース：マンニトールを（０．５～１．４）：（１～３）：（２～８）の範囲の重量比で含む凍結乾燥組成物を提供する。

【0017】

一部の態様において、本凍結乾燥組成物は、少なくとも１５％、１６％、１７％、１８％または１９％（ｗ／ｗ）の２本鎖のポリペプチドを含む。一部の態様において、Ｌ－アルギニンＨＣｌ：スクロース：マンニトールの重量比は、（０．９～１）：（１．５～２．５）：（４．５～５．５）の範囲である。

【0018】

配列番号４のアミノ酸配列の第１の鎖、配列番号５のアミノ酸配列の第２の鎖及び配列番号４の９８位の第１のシステイン残基（Ｃｙｓ９８）と配列番号５の１０８位の第２のシステイン残基（Ｃｙｓ１０８）との間のジスルフィド結合を含む少なくとも１０％（ｗ／ｗ）の２本鎖のポリペプチドならびにシトラート：スクロース：マンニトールを（０．１５～０．６６）：（１～３）：（２～８）の範囲の重量比で含む凍結乾燥組成物も提供される。一部の態様において、本凍結乾燥組成物は、少なくとも１０％、１５％、１６％、１７％、１８％または１９％（ｗ／ｗ）の２本鎖のポリペプチドを含む。一部の態様において、シトラート：スクロース：マンニトールの重量比は、（０．１９～０．５７）：（１．５～２．５）：（４．５～５．５）の範囲である。

【0019】

本開示の別の実施形態は、本開示の凍結乾燥組成物を溶解することによって調製された溶液を提供する。一部の態様において、溶媒は、水または生理的食塩水である。

【0020】

さらに別の実施形態は、第Ｘａ因子阻害剤を用いた抗凝固療法を受けている対象の出血を低減する方法であって、有効量の本開示の溶液を対象に投与することを含む方法を提供する。一部の態様において、第Ｘａ因子阻害剤はアピキサバン、リバーロキサバンまたはベトリキサバンである。

【0021】

さらに、一実施形態において、配列番号３のアミノ酸配列または配列番号３と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、可溶化剤、安定剤及び結晶性構成成分を含み、凍結乾燥中に崩壊しない水性製剤も提供される。

【0022】

一部の態様において、結晶性構成成分はマンニトールである。一部の態様において、マンニトールは、２％から８％（ｗ／ｖ）の濃度で存在する。一部の態様において、可溶化剤はアルギニンまたはシトラートであり、安定剤はスクロースである。一部の態様において、本水性製剤は、界面活性剤及び緩衝剤をさらに含む。一部の実施形態において、本水性製剤を凍結乾燥することによって調製された凍結乾燥組成物が提供される。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
１０ｍＭから５５ｍＭのアルギニン、１％から３％のスクロース（ｗ／ｖ）、２％から８％のマンニトール（ｗ／ｖ）ならびに配列番号４のアミノ酸配列を含む第１の鎖、配列番号５のアミノ酸配列を含む第２の鎖及び配列番号４の９８位の第１のシステイン残基（Ｃｙｓ９８）と配列番号５の１０８位の第２のシステイン残基（Ｃｙｓ１０８）との間のジスルフィド結合を含む少なくとも５ｍｇ／ｍＬの２本鎖のポリペプチドを含み、７．５から８のｐＨを有する、水性製剤。
（項目２）
４０ｍＭから５０ｍＭのアルギニン、１．５％から２．５％のスクロース（ｗ／ｖ）、４．５％から５．５％のマンニトール（ｗ／ｖ）及び少なくとも１０ｍｇ／ｍＬの前記ポリペプチドを含む、項目１に記載の製剤。
（項目３）
少なくとも１８ｍｇ／ｍＬの前記ポリペプチドを含む、項目２に記載の製剤。
（項目４）
前記ポリペプチドは、天然アミノ酸とは異なるよう修飾されたアミノ酸残基を含む、項目２に記載の製剤。
（項目５）
前記第１の鎖の残基Ａｓｐ２９は、Ａｓｐ２９において（３Ｒ）－３－ヒドロキシＡｓｐに修飾されている、項目４に記載の製剤。
（項目６）
前記ポリペプチドは、前記第１及び第２の鎖のそれぞれに関して少なくとも鎖内ジスルフィド結合を含む、項目１に記載の製剤。
（項目７）
約４５ｍＭのアルギニン、約２％のスクロース（ｗ／ｖ）、約５％のマンニトール（ｗ／ｖ）ならびに配列番号４のアミノ酸配列を含む第１の鎖、配列番号５のアミノ酸配列を含む第２の鎖及び配列番号４の９８位の第１のシステイン残基（Ｃｙｓ９８）と配列番号５の１０８位の第２のシステイン残基（Ｃｙｓ１０８）との間のジスルフィド結合を含む約１０ｍｇ／ｍＬの２本鎖のポリペプチドを含み、約７．８のｐＨを有する、水性製剤。
（項目８）
約４５ｍＭのアルギニン、約２％のスクロース（ｗ／ｖ）、約５％のマンニトール（ｗ／ｖ）ならびに配列番号４のアミノ酸配列を含む第１の鎖、配列番号５のアミノ酸配列を含む第２の鎖及び配列番号４の９８位の第１のシステイン残基（Ｃｙｓ９８）と配列番号５の１０８位の第２のシステイン残基（Ｃｙｓ１０８）との間のジスルフィド結合を含む約２０ｍｇ／ｍＬの２本鎖のポリペプチドを含み、約７．８のｐＨを有する、水性製剤。（項目９）
１０ｍＭから５５ｍＭのアルギニン、１％から３％のスクロース（ｗ／ｖ）、２％から８％のマンニトール（ｗ／ｖ）ならびに配列番号４のアミノ酸配列を含むか、または配列番号４と少なくとも９０％の配列同一性を有する第１の鎖、配列番号５のアミノ酸配列のまたは、配列番号５と少なくとも９０％の配列同一性を有する第２の鎖及び配列番号４の９８位の第１のシステイン残基（Ｃｙｓ９８）と配列番号５の１０８位の第２のシステイン残基（Ｃｙｓ１０８）との間のジスルフィド結合を含む少なくとも５ｍｇ／ｍＬの２本鎖のポリペプチドを含み、７．５から８のｐＨを有する、水性製剤。
（項目１０）
前記２本鎖のポリペプチドはＧｌａドメインに修飾を有し、活性部位は、野生型ｆＸａタンパク質と比較した場合、ｆＸａ阻害剤と結合することができるが、集まってプロトロンビナーゼ複合体を形成しない、項目９に記載の製剤。
（項目１１）
項目１～１０のいずれか一項に記載の水性製剤を凍結乾燥することを含む凍結乾燥製剤を調製する方法。
（項目１２）
項目１～１０のいずれか一項に記載の水性製剤を凍結乾燥することによって得られる凍結乾燥組成物。
（項目１３）
配列番号４のアミノ酸配列の第１の鎖、配列番号５のアミノ酸配列の第２の鎖及び配列番号４の９８位の第１のシステイン残基（Ｃｙｓ９８）と配列番号５の１０８位の第２のシステイン残基（Ｃｙｓ１０８）との間のジスルフィド結合を含む少なくとも１０％（ｗ／ｗ）の２本鎖のポリペプチドならびにＬ－アルギニンＨＣｌ：スクロース：マンニトールを（０．５～１．４）：（１～３）：（２～８）の範囲の重量比で含む、凍結乾燥組成物。
（項目１４）
少なくとも１８％（ｗ／ｗ）の前記２本鎖のポリペプチドを含む、項目１３に記載の凍結乾燥組成物。
（項目１５）
前記Ｌ－アルギニンＨＣｌ：スクロース：マンニトールの重量比は、（０．９～１）：（１．５～２．５）：（４．５～５．５）の範囲である、項目１３に記載の凍結乾燥組成物。
（項目１６）
配列番号４のアミノ酸配列の第１の鎖、配列番号５のアミノ酸配列の第２の鎖及び配列番号４の９８位の第１のシステイン残基（Ｃｙｓ９８）と配列番号５の１０８位の第２のシステイン残基（Ｃｙｓ１０８）との間のジスルフィド結合を含む少なくとも１０％（ｗ／ｗ）の２本鎖のポリペプチドならびにＬ－アルギニンＨＣｌ：スクロース：マンニトールを約０．９５：２：５の重量比で含む、凍結乾燥組成物。
（項目１７）
第Ｘａ因子阻害剤を用いた抗凝固療法を受けている対象の出血を低減する方法であって、項目１３～１６のいずれか一項に記載の凍結乾燥組成物を水性溶媒に溶解させることによって調製された溶液を前記対象に投与することを含む、前記方法。
（項目１８）
前記第Ｘａ因子阻害剤はアピキサバン、リバーロキサバンまたはベトリキサバンである、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
配列番号３のアミノ酸配列または配列番号３と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、可溶化剤、安定剤及び結晶性構成成分を含み、凍結乾燥中に崩壊しない、水性製剤。
（項目２０）
前記結晶性構成成分は２％から８％（ｗ／ｖ）の濃度で存在するマンニトールであり、前記可溶化剤はアルギニンであり、前記安定剤はスクロースである、項目１９に記載の製剤。
（項目２１）
界面活性剤及び緩衝剤をさらに含む、項目１９または２０に記載の製剤。

【図面の簡単な説明】

【0023】

【図1A】図１Ａ～Ｆは、さまざまな条件下（ｐＨ、可溶化剤、イオン強度）におけるｒ－Ａｎｔｉｄｏｔｅの溶解性を示すチャートである。影付きの棒はタンパク質の沈殿が観察されたことを示し、空白の棒はタンパク質の沈殿が観察されなかったことを示す。

【図1B】図１Ａ～Ｆは、さまざまな条件下（ｐＨ、可溶化剤、イオン強度）におけるｒ－Ａｎｔｉｄｏｔｅの溶解性を示すチャートである。影付きの棒はタンパク質の沈殿が観察されたことを示し、空白の棒はタンパク質の沈殿が観察されなかったことを示す。

【図1C】図１Ａ～Ｆは、さまざまな条件下（ｐＨ、可溶化剤、イオン強度）におけるｒ－Ａｎｔｉｄｏｔｅの溶解性を示すチャートである。影付きの棒はタンパク質の沈殿が観察されたことを示し、空白の棒はタンパク質の沈殿が観察されなかったことを示す。

【図1D】図１Ａ～Ｆは、さまざまな条件下（ｐＨ、可溶化剤、イオン強度）におけるｒ－Ａｎｔｉｄｏｔｅの溶解性を示すチャートである。影付きの棒はタンパク質の沈殿が観察されたことを示し、空白の棒はタンパク質の沈殿が観察されなかったことを示す。

【図1E】図１Ａ～Ｆは、さまざまな条件下（ｐＨ、可溶化剤、イオン強度）におけるｒ－Ａｎｔｉｄｏｔｅの溶解性を示すチャートである。影付きの棒はタンパク質の沈殿が観察されたことを示し、空白の棒はタンパク質の沈殿が観察されなかったことを示す。

【図1F】図１Ａ～Ｆは、さまざまな条件下（ｐＨ、可溶化剤、イオン強度）におけるｒ－Ａｎｔｉｄｏｔｅの溶解性を示すチャートである。影付きの棒はタンパク質の沈殿が観察されたことを示し、空白の棒はタンパク質の沈殿が観察されなかったことを示す。

【図2】１℃／分での冷却及び－３２℃におけるトリスの結晶化発熱を示す１０ｍＭのトリス溶液のＤＳＣヒートフローサーモグラムである。

【図3】９５ｍｍのアルギニンを伴う１０ｍｍのトリスの冷却中のＤＳＣサーモグラムである。トリスの結晶化発熱なし。

【図4】およそ－１８℃におけるマンニトールの結晶化を示す１０ｍｍのトリス、２％のスクロース及び２％のマンニトールを含有する溶液のＤＳＣサーモグラムである。

【図5】－４２℃におけるスクロースのｔｇ’を示す１０ｍｍのトリス、９５ｍｍのアルギニン、２％のスクロース及び２％のマンニトールの溶液のＤＳＣサーモグラムである。溶液は、－２０℃で５時間アニーリングされた。

【図6】結晶化発熱の形跡のない－２０℃における５時間のアニーリング工程を示す１０ｍｍのトリス、９５ｍｍのアルギニン、２％のスクロース及び２％のマンニトールの溶液のＤＳＣサーモグラムである。

【図7】およそ－１０℃におけるリン酸ナトリウムの結晶化発熱を示す１０ｍｍのリン酸ナトリウム溶液のＤＳＣサーモグラムである。

【図8】およそ－３３℃で開始する結晶化発熱を示す２％のスクロース及び２％のマンニトールを伴う１０ｍｍのリン酸ナトリウムのＤＳＣノンリバーシングヒートフローサーモグラムである。

【図9】氷の融解吸熱の他には熱現象が示されていない１０ｍｍのリン酸ナトリウム、９５ｍｍのアルギニン、２％のスクロース及び２％のマンニトールのＤＳＣヒートフローサーモグラムである。

【図10】－２５℃においておよそ２４分に開始した結晶化発熱を示す１０ｍｍのトリス、１０ｍｍのシトラート、２％のスクロース及び５％のマンニトールのＤＳＣヒートフローサーモグラムである。

【図11】－２５℃においておよそ３０分に開始した結晶化発熱を示す１０ｍｍのトリス、２０ｍｍのシトラート、２％のスクロース及び５％のマンニトールのＤＳＣヒートフローサーモグラムである。

【図12】Ｔ０における凍結乾燥製剤と比較した５℃で最大２週間保管されたトリス及びリン酸塩溶液製剤に関するＵＶ濃度データである。

【図13】Ｔ０における凍結乾燥製剤と比較した２５℃で最大２週間保管されたトリス及びリン酸塩溶液製剤に関するＵＶ濃度データである。

【図14】Ｔ０における溶液製剤と比較した２５℃で保管されたトリス及びリン酸塩凍結乾燥製剤に関するＵＶ濃度データである。

【図15】－２２℃で７０分の時点（アニーリングの開始時間）におけるマンニトールの結晶化の開始を示す１０ｍｍのトリス、９．５ｍｍのアルギニン、２％のスクロース、２％のマンニトール及び０．０１％のＰＳ８０製剤のＤＳＣサーモグラムである。

【図16】－２５℃で３０分の時点におけるマンニトールの結晶化の開始を示す１０ｍｍのトリス、４７．５ｍｍのアルギニン、２％のスクロース、４％のマンニトール及び０．０１％のＰＳ８０製剤のＤＳＣサーモグラムである。

【図17】１０ｍｍのトリス、４７．５ｍｍのアルギニン、２％のスクロース、５％のマンニトール及び０．０１％のＰＳ８０溶液を１℃／分で－４０ｏｃまで冷却した場合のマンニトールのＤＳＣ結晶化発熱である。

【図18】１０ｍｍのトリス、４７．５ｍｍのアルギニン、２％のスクロース、５％のマンニトール及び０．０１％のＰＳ８０溶液を－２５℃でアニーリングする場合のマンニトールのＤＳＣ結晶化発熱を示す。結晶化の開始はおよそ２３分である。

【発明を実施するための形態】

【0024】

Ｉ．定義
範囲を含むすべての数値的指示、例えば、ｐＨ、温度、時間、濃度及び分子量は近似値であり、これは、０．１もしくは１０％ずつ（＋）または（－）に変動する。常に明記されている訳ではないが、すべての数値的指示に「約」という用語が前に付くものと解釈されるべきである。常に明記されている訳ではないが、本明細書に記載される試薬は単に例となるものであり、そのようなものの等価物は当該技術分野において既知であると理解されるべきである。

【0025】

本明細書及び請求項において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに別のことを指示していない限り複数の言及を含む。例えば、「ａ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ ｃａｒｒｉｅｒ（薬学的に許容される担体）」という用語は、それらの混合物を含む複数の薬学的に許容される担体を含む。

【0026】

本明細書中で使用される場合、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含むこと）」という用語は、組成物および方法が挙げた要素を含むが、その他のものを除外しないこと意味するものとする。「本質的に～からなること」とは、組成物および方法を定義するために使用される場合、意図した使用のための組み合わせに本質的に意味のあるあらゆる他の要素を除外することを意味するものとする。したがって、本質的に本明細書中で定義される要素から成る組成物は、単離及び精製法による微量の夾雑物ならびにリン酸緩衝食塩水、保存料及び同種のものなどの薬学的に許容される担体を除外しないことになろう。「から成ること」とは、その他の成分及び本開示の組成物を投与するための実質的な方法ステップのわずかでない要素を除外することを意味するものとする。それぞれのこうした移行語によって定義される実施形態は、本開示の範囲内にある。

【0027】

「タンパク質」及び「ポリペプチド」という用語は同義に使用され、その最も広い意味では２つ以上のサブユニットアミノ酸、アミノ酸アナログまたはペプチド模倣物の化合物を指すために使用される。サブユニットは、ペプチド結合によって連結されていてもよい。別の実施形態において、サブユニットは、例えば、エステル、エーテルなどの他の結合によって連結されていてもよい。タンパク質またはペプチドは、少なくとも２つのアミノ酸を含まなくてはならないが、アミノ酸の最大数に制限はなく、これは、タンパク質またはペプチドの配列を含んでもよい。本明細書中で使用される場合、「アミノ酸」という用語は、グリシンならびにＤ及びＬ型光学異性体の両方、アミノ酸アナログならびにペプチド模倣物を含む天然及び／または非天然のあるいは合成のアミノ酸のいずれかを指す。天然に生じるアミノ酸の一文字及び三文字の略語を下に挙げる。

【0028】

「第Ｘａ因子」または「ｆＸａ」または「ｆＸａタンパク質」は、血液凝固経路におけるセリンプロテアーゼであり、これは不活性第Ｘ因子（ｆＸ、配列番号１、表１）から作り出される。ヒト第Ｘ因子（「ｆＸ」）をコードするヌクレオチド配列は、受託番号「ＮＭ＿０００５０４」によりＧｅｎＢａｎｋで見つけることができる。重鎖の最初の５２残基が触媒的に切断されたとき、ｆＸがｆＸａに活性化される。ｆＸａは、軽鎖及び重鎖を含む。軽鎖の最初の４５個のアミノ酸残基（配列番号１の残基１～４５）は、翻訳後に修飾された１１個のγ－カルボキシグリタミン酸残基（Ｇｌａ）を含むためＧｌａドメインと呼ばれる。これはまた、短い（６アミノ酸残基）芳香族スタッキング配列（配列番号１の残基４０～４５）も含む。キモトリプシン消化が選択的に１～４４残基を除去し、結果としてＧｌａ－ドメインのないｆＸａが生じる。ｆＸａのセリンプロテアーゼ触媒ドメインは、Ｃ末端重鎖に位置する。ｆＸａの重鎖は、その他のセリンプロテアーゼ、例えば、トロンビン、トリプシン及び活性化プロテインＣと極めて相同的である。

【0029】

「未変性ｆＸａ」または「野生型ｆＸａ」とは、血漿中にもともと存在するｆＸａまたはその元の無修飾の形態で単離されたｆＸａを指し、これは、活性化プロトロンビンの生物学的活性をプロセシングすることにより、凝血塊の形成を促進する。この用語は、組織サンプルから単離された天然に生じるポリペプチドならびに組み換えで作製されたｆＸａを含む。「活性型ｆＸａ」は、活性化プロトロンビンのプロコアグラント活性を有するｆＸａを指す。「活性型ｆＸａ」は、プロコアグラント活性を保持している未変性ｆＸａまたは修飾ｆＸａでもよい。

【0030】

本明細書中で使用される場合、「ｆＸａ誘導体」とは、集まってプロトロンビナーゼ複合体を形成する際にｆＸａと競合せず、プロコアグラントまたは触媒活性が低いか、またはないが、ｆＸａ阻害剤などの抗凝固剤と結合する及び／またはそれを実質的に中和する修飾ｆＸａタンパク質を指す。ｆＸａタンパク質またはｆＸａ誘導体の「プロコアグラント活性」は、一部の態様では、野生型の活性型ｆＸａポリペプチドが持つ酵素活性を指す。ｆＸａ誘導体の例は、米国特許第８，１５３，５９０号ならびにＰＣＴ公報ＷＯ２００９／０４２９６２及びＷＯ２０１０／０５６７６５で提供されており、さらに配列番号：２及び３ならびにそれらの生物学的等価物など本明細書で提供される。

【0031】

ｆＸａポリペプチドまたはその誘導体の「酵素活性」は、基質との直接の相互作用により基質との生化学的反応を触媒するポリペプチドの能力を指す。

【0032】

配列番号：２は、野生型ｆＸａと比較して３つの変異を含む。第１の変異は、ｆＸのＧｌａ－ドメインの６～３９番目のアミノ酸の欠失である。第２の変異は、活性化ペプチド配列１４３～１９４番目のアミノ酸の－ＲＫＲ－による置換である。これが、－ＲＫＲＲＫＲ－（配列番号：６）リンカーをもたらし、軽鎖（配列番号：４）と重鎖（配列番号：５）を結合する。分泌時、このリンカーが切断され、結果として２本鎖のポリペプチド、配列番号：３（ｒ－Ａｎｔｉｄｏｔｅ）が生じる。第３の変異は、活性部位残基Ｓ３７９のＡｌａ残基への変異である。このアミノ酸置換は、それぞれ配列番号：１及び３のアミノ酸２９６及び２９０に該当する。

【0033】

「ｒ－Ａｎｔｉｄｏｔｅ」という用語は、リンカーの切断後の配列番号：２のプロセシングされた２本鎖のポリペプチドプロセシング産物を指す。これは、配列番号：３によって表される。ｒ－Ａｎｔｉｄｏｔｅについては、例えば、内容が参照によって本開示に組み込まれるＵＳ８，１５３，５９０に開示されている。ｒ－Ａｎｔｉｄｏｔｅは、軽鎖のシステイン９８（Ｃｙｓ９８）と重鎖のシステイン１０８（Ｃｙｓ１０８）との間の１つのジスルフィド結合により結合した軽鎖（配列番号４）及び重鎖（配列番号５）を含む。野生型ｆＸａのように、特定の生産バッチにおいて、ｒ－Ａｎｔｉｄｏｔｅは、翻訳後修飾を受けて、結果として特定のアミノ酸残基、例えば、軽鎖のＳｅｒ５６、Ｓｅｒ７２、Ｓｅｒ７６及びＴｈｒ８２ならびに重鎖のＴｈｒ２４９におけるグリコシル化、ならびに軽鎖のＡｓｐ２９における修飾残基、（３Ｒ）－３－ヒドロキシＡｓｐが生じる。さらに、鎖間のジスルフィド結合に加えて、軽鎖のシステイン１６と２７、２１と３６、３８と４７、５５と６６、６２と７５及び７７と９０の間、ならびに重鎖のシステイン７と１２、２７と４３、１５６と１７０及び１８１と２０９の間に形成される鎖内ジスルフィド結合が存在することがある。

【表1】

【表2】

【表3-1】

【表3-2】

【0034】

本開示はまた、ｒ－Ａｎｔｉｄｏｔｅのさまざまな生物学的等価物（または配列番号：２によって表されるその前駆体）、あるいは配列番号：３とある一定の配列同一性を有するポリペプチドを提供する。一態様において、そのような生物学的等価物は、配列番号：３の構造的特徴、すなわち、修飾された活性部位及び除去されたか、または修飾されたＧｌａドメインを保持している。別の態様において、そのような生物学的等価物は、配列番号：３の機能的特徴、すなわち、集まってプロトロンビナーゼ複合体を形成する際にｆＸａと競合せず、プロコアグラント（例えば、酵素もしくは触媒）活性が低いか、またはない特徴を保持している。

【0035】

「活性部位」という用語は、化学反応が起こる酵素または抗体の部分を指す。「修飾された活性部位」とは、構造的に修飾されて化学反応性または特異性が向上したか、または低下した活性部位がもたらされた活性部位である。活性部位の例としては、２３５～４８８アミノ酸残基を含むヒト第Ｘ因子の触媒ドメイン及び１９５～４４８アミノ酸残基を含むヒト第Ｘａ因子の触媒ドメインが挙げられるが、これらに限定されるものではない。修飾された活性部位の例としては、Ａｒｇ３０６、Ｇｌｕ３１０、Ａｒｇ３４７、Ｌｙｓ３５１、Ｌｙｓ４１４またはＡｒｇ４２４位に少なくとも１つのアミノ酸置換がある配列番号：１の１９５～４４８アミノ酸残基を含むヒト第Ｘａ因子の触媒ドメインが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

【0036】

「組成物」とは、活性剤と、不活性（例えば、検知可能薬剤もしくは標識）または活性の、例えば、アジュバントなどの別の化合物または組成物との組み合わせを意味するものとする。

【0037】

「医薬組成物」とは、その組成物をインビトロ、インビボまたはエクスビボにおける診断上のまたは治療的使用に適したものにする、活性剤と不活性または活性の担体との組み合わせを含むものとする。

【0038】

「凍結乾燥製剤」という用語は、フリーズドライされた対象のポリペプチドを含む医薬製剤または組成物を指す。

【0039】

本明細書中で使用される場合、「増量剤」という用語は、凍結乾燥製剤にかさを与える成分を指す。増量剤の例としては、マンニトール、トレハロース、ラクトース、スクロース、ポリビニルピロリドン、スクロース、グルコース、グリシン、サイクロデキストリン、デキストラン、固体ＰＥＧならびにそれらの誘導体及び混合物が挙げられるが、これらに限定されるものではない。一実施形態において、本開示の製剤は、任意に増量剤を含む。

【0040】

本明細書中で使用される場合、「薬学的に許容されるケーク」とは、凍結乾燥後に残り、例えば、薬学的に許容される、長期安定性、短い再構成時間、見事な外見及び再構成時に元の溶液の特徴を維持することなど特定の望ましい特徴を有する非崩壊型固体薬生成物を指す。薬学的に許容されるケークは、固体、粉末または粒状の材料が可能である。薬学的に許容されるケークは、重量でケークの最大５パーセントの水も含んでよい。

【0041】

本明細書中で使用される場合、「凍結乾燥」またはフリーズドライという用語は、凍結され、真空下に置かれ、氷を液相になることなく固体から蒸気へ直接変えた後、生成物から水が除去されるプロセスを指す。このプロセスは、凍結、一次乾燥（昇華）及び二次乾燥（放出）の分離した、固有の相互依存的な３つの個別のプロセスから成る。本開示に使用されるポリペプチドを凍結乾燥するための方法は、本明細書に記載されており、当該技術分野において周知である。

【0042】

「緩衝剤」という用語は、本明細書中で使用される場合、医薬調製物のｐＨを安定化させる薬学的に許容される賦形剤を指す。適した緩衝剤は、当該技術分野において周知であり、文献に見出すことができる。薬学的に許容される緩衝剤は、トリス緩衝剤、アルギニン緩衝剤、ヒスチジン緩衝剤、クエン酸緩衝剤、コハク酸緩衝剤及びリン酸緩衝剤を含むが、これらに限定されるものではない。使用される緩衝剤とは無関係に、ｐＨは、当該技術分野において既知の酸または塩基、例えば、コハク酸、塩酸、酢酸、リン酸、硫酸及びクエン酸、スクシナート、シトラート、トリス塩基、ヒスチジン、ヒスチジンＨＣｌ、水酸化ナトリウムならびに水酸化カリウムにより調節することができる。適した緩衝剤としては、ヒスチジン緩衝剤、２－モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、カコジル酸塩、リン酸塩、アセタート、スクシナート及びシトラートが挙げられるが、これらに限定さるものではない。緩衝剤の濃度は、約４ｍＭから約６０ｍＭ、あるいは約４ｍＭから約４０ｍＭ、あるいは約５ｍＭから約２５ｍＭの間であってもよい。

【0043】

「凍結保護物質」は、当該技術分野において既知であり、例えば、スクロース、トレハロース及びグリセロールが挙げられるが、これらに限定されるものではない。生物系において低毒性の凍結保護物質が一般に使用される。

【0044】

「張性調整薬剤」という用語は、本明細書中で使用される場合、製剤の張性を調整するために使用される薬学的に許容される薬剤を指す。等張性は、一般に溶液に対する浸透圧、一般にはヒト血清の浸透圧に関する。製剤は、低張、等張または高張であってもよい。一態様において、本製剤は等張である。等張製剤とは、液体または固体の形態、例えば、凍結乾燥された形態から再構成された液体であり、例えば、生理的食塩水及び血清などの比較されるいくつかの他の溶液と同じ張性を有する溶液を指す。適した等張化剤としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、グリセリン及び本明細書中で定義されるアミノ酸、糖の群からの任意の構成成分ならびにそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

【0045】

本明細書中で使用される場合、「界面活性剤」という用語は、両親媒性構造を有する薬学的に許容される有機物質を指し、すなわち、これは、反対の溶解傾向の基、一般に油溶性炭化水素鎖と水溶性イオン基から構成される。界面活性剤は、界面活性部分の電荷に応じてアニオン性、カチオン性及び非イオン性界面活性剤に分類することができる。界面活性剤は、各種医薬組成物及び生物学的材料の調製物に湿潤剤、乳化剤、可溶化剤及び分散剤として使用されることが多い。本明細書に記載される医薬製剤の一部の実施形態において、界面活性剤の量は、重量／体積パーセント（ｗ／ｖ％）で表される百分率として記載される。適した薬学的に許容される界面活性剤としては、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（Ｔｗｅｅｎ）、ポリオキシエチレンアルキルエーテル（Ｂｒｉｊ）、アルキルフェニルポリオキシエチレンエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ）、ポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレンコポリマー（Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）またはドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の群が挙げられるが、これらに限定されるものではない。ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルとしては、ポリソルベート２０（商標Ｔｗｅｅｎ２０（商標）として販売されている）及びポリソルベート８０（商標Ｔｗｅｅｎ８０（商標）として販売されている）が挙げられる。ポリエチレン－ポリプロピレンコポリマーとしては、名称Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８またはＰｏｌｏｘａｍｅｒ１８８（商標）として販売されているものが挙げられる。ポリオキシエチレンアルキルエーテルとしては、商標Ｂｒｉｊ（商標）として販売されているものが挙げられる。アルキルフェノールポリオキシエチレンエーテルとしては、商標名Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘとして販売されているものが挙げられる。

【0046】

「凍結乾燥保護物質」とは、凍結乾燥（急速な凍結及び高真空における乾燥のプロセス）中にタンパク質を安定化させる薬学的に許容される物質を指す。凍結乾燥保護物質の例としては、スクロース、トレハロースまたはマンニトールが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

【0047】

「酸化防止剤」とは、他の分子の酸化を遅らせるか、または妨げることができる分子を指す。酸化とは、電子を物質から酸化剤に運搬する化学反応である。酸化反応はフリーラジカルをもたらす可能性があり、フリーラジカルはタンパク質治療薬を不安定にし、最終的に生成物活性に影響を及ぼす連鎖反応を開始する。酸化防止剤は、フリーラジカル中間体を取り除くことによってこうした連鎖反応を終わらせ、それ自体が酸化されることによって他の酸化反応を阻害する。結果として、酸化防止剤は、還元剤、キレート剤及び脱酸素剤、例えば、シトラート、ＥＤＴＡ、ＤＰＴＡ、チオール、アスコルビン酸またはポリフェノールである場合が多い。酸化防止剤の非限定例としては、アスコルビン酸（ＡＡ、Ｅ３００）、チオ硫酸塩、メチオニン、トコフェロール（Ｅ３０６）、没食子酸プロピル（ＰＧ、Ｅ３１０）、ターシャリーブチルヒドロキノン（ＴＢＨＱ）、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ、Ｅ３２０）及びブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ、Ｅ３２１）が挙げられる。

【0048】

「保存料」とは、例えば、食物、医薬品、塗料、生物学的サンプル、木などの製品に添加され、微生物の増殖による、もしくは望ましくない化学的変化による分解を防ぐ天然または合成の化学物質である。保存添加物は、単独で、または他の保存方法と併せて使用することができる。保存料は、細菌及び真菌の増殖を抑制する抗菌性保存料または構成成分の酸化を抑制する酸素吸収剤などの酸化防止剤であってもよい。一般的な抗菌性保存料としては、塩化ベンザルコニウム、安息香酸、クロロヘキシジン（ｃｈｏｌｏｒｏｈｅｘｉｄｉｎｅ）、グリセリン、フェノール、ソルビン酸カリウム、チメロサール、スルフィット（二酸化硫黄、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸カリウムなど）及び二ナトリウムＥＤＴＡが挙げられる。その他の保存料としては、非経口タンパク質に一般的に使用されるもの、例えば、ベンジルアルコール、フェノール、ｍ－クレゾール、クロロブタノールまたはメチルパラベンが挙げられる。

【0049】

「界面活性剤」とは、本明細書中で使用される場合、２つの液体の間または液体と固体の間の表面張力（または界面張力）を低下させる化合物を意味する。界面活性剤は、界面活性剤、湿潤剤、乳化剤、発泡剤及び分散剤として働く場合もある。

【0050】

界面活性剤の例としては、ポリソルベート８０、脂肪酸及びスルホン酸アルキル；塩化ベンゼタニウム（ｂｅｎｚｅｔｈａｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、例えば、Ｌｏｎｚａ， Ｉｎｃ．（フェアローン、ニュージャージー州）のＨＹ ＡＭＩＮＥ １６２２；ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、例えば、Ｕｎｉｑｅｍａ（ウィルミントン、デラウェア州）のＴＷＥＥＮシリーズ及び天然の界面活性剤、例えば、タウロコール酸ナトリウム、ｌ－パルミトイル－２－Ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、レシチン及びその他のリン脂質が挙げられる。そのような界面活性剤は、例えば、製品の再構成時における凍結乾燥粒子の凝集を最小限にする。これらの界面活性剤は、約０．００１％から約５％ｗ／ｖを構成してもよい。

【0051】

ＩＩ．製剤
記述のとおり、野生型ｆＸａは２本鎖のポリペプチドである。ｒ－Ａｎｔｉｄｏｔｅ（配列番号：３）を含むｆＸａ解毒剤の多くの形態がそうであり、これは、軽鎖のシステイン９８（Ｃｙｓ９８）と重鎖のシステイン１０８（Ｃｙｓ１０８）との間の１つのジスルフィド結合により結合した軽鎖（配列番号４）及び重鎖（配列番号５）を含む。また野生型ｆＸａのように、細胞で発現したｒ－Ａｎｔｉｄｏｔｅは、翻訳後修飾を受けて、結果として特定のアミノ酸残基、例えば、軽鎖のＳｅｒ５６、Ｓｅｒ７２、Ｓｅｒ７６及びＴｈｒ８２ならびに重鎖のＴｈｒ２４９においてグリコシル化、ならびに軽鎖のＡｓｐ２９において修飾残基（３Ｒ）－３－ヒドロキシＡｓｐが生じる。さらに、鎖間ジスルフィド結合に加えて、軽鎖のシステイン１６と２７、２１と３６、３８と４７、５５と６６、６２と７５及び７７と９０の間ならびに重鎖のシステイン７と１２、２７と４３、１５６と１７０及び１８１と２０９の間に形成される１つ以上の鎖内ジスルフィド結合が存在することがある。

【0052】

２本鎖構造及びｆＸａ解毒剤のさまざまな翻訳後修飾のため、許容できる重量オスモル濃度の安定した可溶性の溶液を提供する安定した凍結乾燥製剤の開発には大きな難題が生じることが本明細書において示されている。

【0053】

例としてｒ－Ａｎｔｉｄｏｔｅを使用した実験データは、ｒ－Ａｎｔｉｄｏｔｅの適度な溶解性を保持するために高濃度の可溶化剤が必要とされることを示した。特に、実施例４における溶解性試験は、シトラート及びアルギニンの両方がｒ－Ａｎｔｉｄｏｔｅの溶解性を著しく高めたことを示している。さらに、実施例は、アルギニンの濃度が９５ｍＭまたは少なくとも１０ｍＭのときに、ｒ－Ａｎｔｉｄｏｔｅは溶液に可溶性のままでいられることを示した。

【0054】

さらに、凍結乾燥プロセス中、タンパク質の温度は、許容できる凍結乾燥サンプルを得るためには測定された崩壊温度（約－４０℃）未満に維持される必要があることが明らかになった（実施例６）。しかしながら、そのような低い生成物温度を維持することは、実際には実現不可能である。したがって、このデータは、非結晶タンパク質材料をフリーズドライの間及び後に所定の位置に保持することができる足場として働く結晶化構成成分（例えば、マンニトール）が必要とされることを示している。

【0055】

しかしながら、高濃度のアルギニン（例えば、９５ｍＭ）が存在すると、マンニトールの結晶化（実施例７）が妨げられることがさらにわかった。同時に、マンニトールの存在により製剤中の糖の合計濃度が増加して、許容できない重量オスモル濃度の溶液になる（実施例７）。

【0056】

よって、ｒ－Ａｎｔｉｄｏｔｅの適した凍結乾燥構造の開発には、可溶化剤としてのアルギニン、結晶化剤としてのマンニトール及び安定化剤としてのスクロースの濃度に対して相反する要件があった。最も良くても、許容される凍結乾燥構造を形成するためのそのような要件のバランスをとることができるかどうか予測できなかった。

【0057】

しかしながら、驚くべきことに、予想外にも、本発明者らは、タンパク質の溶解性、安定性、ケーク構造及び重量オスモル濃度のバランスを保った溶液に到達することができた。さらに具体的には、適した凍結乾燥構造を形成するための例となるｒ－Ａｎｔｉｄｏｔｅ溶液は、約４５ｍＭのアルギニン（１０～５５ｍＭ）、約２％のスクロース（１～３％）及び約５％のマンニトール（２～８％）を含む。さらに、溶液は、約１０ｍＭのトリス及び０．０１％～０．０２％のＰＳ８０を所望の量のｒ－Ａｎｔｉｄｏｔｅ（例えば、１０ｍｇ／ｍＬ、１５ｍｇ／ｍＬ、２０ｍｇ／ｍＬ、３０ｍｇ／ｍＬ、４０ｍｇ／ｍＬまたは５０ｍｇ／ｍＬ）とともに含み、約７．８のｐＨを有する。

【0058】

さらに、治療タンパク質に対する好適な可溶化剤として知られているが、シトラートには抗凝血作用があることがわかっている。例えば、Ｗｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ （Ｃａｒｌｔｏｎ）． ２０１１ Ｍａｙ；１６（４）：３９６－４０２を参照のこと。したがって、ｒ－Ａｎｔｉｄｏｔｅは抗凝血剤に対する解毒剤（ｆＸａ阻害剤）と意図されるため、シトラートはｒ－Ａｎｔｉｄｏｔｅとともに使用するのに適していないと考えられた。予想外にも、本発明において、シトラートは実際にはインビボにおけるｒ－Ａｎｔｉｄｏｔｅの活性を妨げないことがわかった。凍結乾燥に適した溶液中のシトラートの適した濃度は、約２％のスクロース（１～３％）及び約５％のマンニトール（２～８％）に加えて約１０ｍＭから約２５ｍＭであることがわかっている。

【0059】

それゆえに、この溶液が凍結乾燥される場合、それは、Ｌ－アルギニンＨＣｌ：スクロース：マンニトールの重量比を（０．５～１．４）：（１～３）：（２～８）の範囲で含む乾燥組成物を形成する。溶液中に５ｍｇ／ｍＬから５０ｍｇ／ｍＬの間のｒ－Ａｎｔｉｄｏｔｅが使用される場合、その結果、例えば、Ｌ－アルギニンＨＣｌ：スクロース：マンニトール：ｒ－Ａｎｔｉｄｏｔｅの重量比は（０．５～１．４）：（１～３）：（２～８）：（０．５－５）の範囲である。

【0060】

反対に、そのような凍結乾燥製剤が水、生理的食塩水またはその他の類似の溶媒に溶解される場合、それは、約１０～５５ｍＭのアルギニン、約１～３％のスクロース及び約２～８％のマンニトールを含む溶液をもたらすことができる。

【0061】

同様に、可溶化剤としてシトラートを使用した溶液が凍結乾燥される場合、それは、（０．１５～０．６６）：（１～３）：（２～８）の範囲のシトラート：スクロース：マンニトールの重量比を含む乾燥組成物を形成することになる。溶液中に５ｍｇ／ｍＬから５０ｍｇ／ｍＬの間のｒ－Ａｎｔｉｄｏｔｅが使用される場合、その結果、例えば、Ｌ－アルギニンＨＣｌ：スクロース：マンニトール：ｒ－Ａｎｔｉｄｏｔｅの重量比は（０．１５～０．６６）：（１～３）：（２～８）：（０．５～５）の範囲である。反対に、そのような凍結乾燥製剤が水、生理的食塩水またはその他の類似の溶媒に溶解される場合、それは、約８～３５ｍＭのシトラート、約１～３％のスクロース及び約２～８％のマンニトールを含む溶液をもたらすことができる。

【0062】

ｒ－Ａｎｔｉｄｏｔｅに対して観察された結果は、ｒ－Ａｎｔｉｄｏｔｅの生物学的等価物（もしくは配列番号：２によって表されるその前駆体）を含む類似の構造を有する他のｆＸａ解毒剤に対しても容易に予測することができる。一態様において、そのような生物学的等価物は、配列番号：３と少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％の配列同一性を有する。一態様において、そのような生物学的等価物は、それぞれが、配列番号：４または配列番号：５それぞれと少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％の配列同一性を有する２つのペプチド鎖を含む。一態様において、そのような生物学的等価物は、配列番号：３の構造的特徴、すなわち、修飾された活性部位及び除去されたか、または修飾されたＧｌａドメインを保持している。別の態様において、そのような生物学的等価物は、配列番号：３の機能的特徴、すなわち、集まってプロトロンビナーゼ複合体を形成する際にｆＸａと競合せず、プロコアグラント（例えば、酵素もしくは触媒）活性が低いか、またはない特徴を保持している。

【0063】

また、アルギニンは別の可溶化剤で置き換えることができ、マンニトールは別の結晶化剤で置き換えることができ、スクロースは別の安定化剤で置き換えることができることが予想され、それらそれぞれの適当な例が当該技術分野において利用可能であり、本開示において提供される。

【0064】

Ａ．凍結乾燥に適したポリペプチド溶液
一実施形態において、本開示は、凍結乾燥に適した水性製剤を提供し、この製剤は、本明細書中で開示されているｆＸａ解毒剤またはその生物学的等価物を可溶化剤、安定化剤（または安定剤）及び結晶性薬剤とともに含む。本製剤は、界面活性剤及び／または緩衝剤をさらに含んでもよい。一部の態様において、これらの薬剤のそれぞれの存在が、例えば、フリーズドライ温度が－４０℃、－３０℃、－２０℃、－１０℃、０℃、５℃、１０℃もしくは１５℃よりも高い、２０℃または２５℃と同じ高さの場合、凍結乾燥中にｆＸａ解毒剤が崩壊するのを妨げる。

【0065】

本開示の一実施形態は、凍結乾燥に使用することができる水性製剤を提供する。本水性製剤は、ｆＸａ誘導体ポリペプチド、例えば、配列番号３のアミノ酸配列または配列番号３と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。ポリペプチドに加えて、本製剤は、可溶化剤、安定剤及び結晶性構成成分をさらに含む。そのような製剤は、所望の条件下の凍結乾燥中に崩壊しない。一態様において、所望の条件は、－４０℃よりも高い、あるいは、－４０℃、－３０℃、－２０℃、－１０℃、０℃、５℃、１０℃または１５℃より高い温度におけるフリーズドライである。別の態様において、所望の条件は、２５℃よりも低い、あるいは２０℃、１５℃、１０℃または５℃よりも低い温度におけるフリーズドライである。

【0066】

一態様において、ｆＸａ誘導体ポリペプチドは、野生型ｆＸａタンパク質と比較した場合にＧｌａドメイン及び活性部位に修飾がある。一態様において、ｆＸａ誘導体ポリペプチドは、ｆＸａ阻害剤と結合するｆＸａの能力を保持しているが、集まってプロトロンビナーゼ複合体を形成しない。一態様において、ｆＸａ誘導体ポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列を有する２本鎖のポリペプチドであり、これは、軽鎖のシステイン９８（Ｃｙｓ９８）と重鎖のシステイン１０８（Ｃｙｓ１０８）との間の１つのジスルフィド結合により結合した軽鎖（配列番号４）及び重鎖（配列番号５）を含む。一態様において、本水性製剤は、少なくとも５ｍｇ／ｍＬのポリペプチドを含む。一態様において、本水性製剤は、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０ｍｇ／ｍＬのポリペプチドを含む。

【0067】

一部の態様において、本製剤中にはフリーズドライプロセス中に結晶マトリックスを形成するのに適した濃度で結晶性構成成分が含まれる。結晶マトリックスの製剤は、実施例において示されたとおり崩壊を防ぐのに有用である。

【0068】

「結晶性構成成分」とは、フリーズドライプロセス中にポリペプチドを含む製剤中で結晶マトリックスを形成する分子を指す。結晶性構成成分の非限定例としては、マンニトール及びグリシンが挙げられる。

【0069】

一部の態様において、結晶性構成成分は、マンニトール（例えば、結晶性マンニトール）である。一態様において、水性製剤中の結晶性構成成分の濃度は、少なくとも１％（ｗ／ｖ）である。一態様において、水性製剤中の結晶性構成成分の濃度は、少なくとも１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％または４％（ｗ／ｖ）である。一態様において、水性製剤中の結晶性構成成分の濃度は８％以下、あるいは、７％、６．５％、６％、５．５％、５％、４．５％または４％（ｗ／ｖ）以下である。一態様において、水性製剤中の結晶性構成成分の濃度は、約１％から約８％もしくは約２％から約６％もしくは約３％から約５．５％もしくは約４．５％から約５．５％もしくは約４．６％から約５．４％もしくは約４．７％から約５．３％もしくは約４．８％から約５．２％もしくは約４．９％から約５．１％または約４％、４．５％もしくは５％（ｗ／ｖ）である。

【0070】

一部の態様において、本水性製剤中には可溶化剤が含まれる。「可溶化剤」という用語は、塩、イオン、炭水化物、複合体形成剤、ポリマー及びその他の化合物を指し、これが溶液中に存在すると、溶液中の別の分子（例えば、活性成分）の溶解性を高める。可溶化剤の非限定例としては、アルギニン及びシトラートが挙げられる。一態様において、可溶化剤はアルギニンである。一態様において、可溶化剤はシトラートである。

【0071】

可溶化剤の存在がｆＸａポリペプチドを製剤中で可溶性で安定した状態に維持する際に有用であることが本明細書において示されている。一部の態様において、可溶化剤（例えば、アルギニン）の濃度は、少なくとも１０ｍＭ、あるいは少なくとも２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３６ｍＭまたは４０ｍＭである。一部の態様において、可溶化剤（例えば、アルギニン）の濃度は、１００ｍＭ、９６ｍＭ、９０ｍＭ、８０ｍＭ、７０ｍＭ、６０ｍＭまたは５０ｍＭ以下である。一部の態様において、可溶化剤の濃度は、約１０ｍＭもしくは２０ｍＭから約６０ｍＭ、約１０ｍＭもしくは２０ｍＭから約５５ｍＭ、約３５ｍＭから約５５ｍＭ、約４０ｍＭから約５０ｍＭ、約４１ｍＭから約４９ｍＭ、約４２ｍＭから約４８ｍＭ、約４３ｍＭから約４７ｍＭ、約４４ｍＭから約４６ｍＭまたは約４０ｍＭ、４５ｍＭもしくは５０ｍＭである。なお、本明細書中で使用される場合、アルギニンという用語は、アミノ酸ならびにその塩（例えば、アルギニンＨＣｌ）を指す。アルギニンは、約１７４．２ダルトンの分子量を有し、アルギニンＨＣｌ（例えば、Ｌ－アルギニンＨＣｌ）は、約２１０．７ダルトンの分子量を有する。

【0072】

一実施形態において、可溶化剤はシトラートまたはその塩である。シトラートの塩はクエン酸ナトリウムである。一態様において、シトラートは、約１．０ｍＭから約２００．０ｍＭの濃度を構成する。別の態様において、シトラートの濃度は約２５ｍＭである。別の態様において、シトラートの濃度は約５０ｍＭである。さらに別の実施形態において、シトラートの濃度は、約５ｍＭ、１０ｍＭまたは２０ｍＭである。別の実施形態において、シトラートは、約０．０５Ｍから約０．２Ｍの濃度を構成する。

【0073】

一部の態様において、本水性製剤中には安定剤が含まれる。「安定剤」という用語は、薬学的な許容される賦形剤を指し、これは、製造、保管及び利用時における化学的及び／または物理的分解から活性成分（例えば、ｆＸａ誘導体ポリペプチド）及び／または製剤を保護する。安定剤の例としては、スクロース、アルギニン、シトラート、マンニトール、トレハロース、グリシン、塩化ナトリウム、デキストラン及びグルコースを挙げることができる。一態様において、安定剤はスクロースである。

【0074】

一態様において、水性製剤中の安定剤（例えば、スクロース）の濃度は、少なくとも約０．５％（ｗ／ｖ）である。一態様において、水性製剤中の安定剤（例えば、スクロース）の濃度は、少なくとも約０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、１．１％、１．２％、１．３％、１．４％、１．５％、１．６％、１．７％、１．８％、１．９％または２％（ｗ／ｖ）である。一態様において、水性製剤中の安定剤（例えば、スクロース）の濃度は、約５％、４．５％、４％、３．５％、３％、２．５％または２％（ｗ／ｖ）以下である。一態様において、水性製剤中の安定剤（例えば、スクロース）の濃度は、約１％から約５％もしくは約１％から約４％もしくは約１％から約３％もしくは約１．５％から約２．５％もしくは約１．６％から約２．４％もしくは約１．７％から約２．３％もしくは約１．７％から約２．２％もしくは約１．９％から約２．１％または約１％、１．５％、２％、２．５％もしくは３％（ｗ／ｖ）である。

【0075】

一部の態様において、本水性製剤は、界面活性剤、緩衝剤、張性調整薬剤、凍結保護物質、界面活性剤、凍結乾燥保護物質、保存料またはそれらの組み合わせをさらに含んでもよい。

【0076】

一部の態様において、本水性製剤は、６以上または６．５以上または７以上または７．５以上のｐＨを有する。一部の態様において、ｐＨは、９、８．５または８以下である。一部の態様において、ｐＨは、６から９の間、６．５から８．５の間、７から８．５の間、７．５から８．２の間、７．６から８．１の間、７．７から７．９の間または約７．５、７．６、７．７、７．８、７．９もしくは８である。

【0077】

一態様において、本水性製剤は、約４５ｍＭのアルギニン、約２％のスクロース（ｗ／ｖ）、約５％のマンニトール（ｗ／ｖ）及び約１０ｍｇ／ｍＬの２本鎖のｒ－Ａｎｔｉｄｏｔｅを含み、約７．８のｐＨを有する。一態様において、本水性製剤は、約４５ｍＭのアルギニン、約２％のスクロース（ｗ／ｖ）、約５％のマンニトール（ｗ／ｖ）及び約２０ｍｇ／ｍＬの２本鎖のｒ－Ａｎｔｉｄｏｔｅを含み、約７．８のｐＨを有する。一態様において、本水性製剤は、約４５ｍＭのアルギニン、約２％のスクロース（ｗ／ｖ）、約５％のマンニトール（ｗ／ｖ）及び約４０ｍｇ／ｍＬの２本鎖のｒ－Ａｎｔｉｄｏｔｅを含み、約７．８のｐＨを有する。一態様において、本水性製剤は、０．０１％～０．０２％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０及び緩衝剤をさらに含む。

【0078】

Ｂ．凍結乾燥及び凍結乾燥組成物
一部の実施形態において、本開示の水性製剤を凍結乾燥する方法も提供される。一態様において、本開示は、表８．２に例示される保存的凍結乾燥サイクルを提供し、これは、凍結工程、等温工程、アニーリング工程、一次乾燥工程及び二次乾燥工程を含む。

【0079】

別の態様において、凍結乾燥サイクルは、表６に記載されている工程を含む。凍結乾燥に適した水溶液が特定されると、それに応じて、当該技術分野において既知の方法を用いてその溶液を凍結乾燥する方法を導き出すことができることにさらに留意されたい。一態様において、１つ以上またはすべての乾燥工程は、－４０℃以上の温度で行われる。一態様において、乾燥工程は、－３５℃、－３０℃、－２５℃、－２０℃、－１０℃または０℃以上であるが、１０℃、１５℃、２０℃または２５℃以下の温度で行われる。

【0080】

一部の態様において、本開示の水性製剤を凍結乾燥することによって調製された凍結乾燥組成物も提供される。本水性製剤中の各薬剤の濃度に基づいて、凍結乾燥組成物中の薬剤の相対的含有量は、容易に決定することができる。

【0081】

一態様において、本凍結乾燥組成物は、少なくとも５％、あるいは少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％または３５％（ｗ／ｗ）のｆＸａ誘導体ポリペプチドを含む。その結果、他の主な成分間で、例えば、（０．５～１．４）：（１～３）：（２～６）の範囲のＬ－アルギニンＨＣｌ：スクロース：マンニトールの重量比が可能である。一部の態様において、Ｌ－アルギニンＨＣｌ：スクロース：マンニトールの重量比は、（０．９～１）：（１．５～２．５）：（４．５～５．５）または（０．９１～０．９９）：（１．６～２．４）：（４．６～５．４）または（０．９２～０．９８）：（１．７～２．３）：（４．７～５．３）、（０．９３～０．９７）：（１．８～２．２）：（４．８～５．２）または（０．９４～０．９６）：（１．９～２．１）：（４．９～５．１）の範囲である。一部の態様において、本凍結乾燥組成物は、界面活性剤及び／または緩衝剤の固体部分をさらに含む。

【0082】

さらに、一部の態様において、本開示の凍結乾燥組成物を溶媒に溶解させることによって調製された溶液が提供される。一部の態様において、溶媒は、水または生理的食塩水である。一態様において、溶媒は水である。一態様において、この溶液は、少なくとも５ｍｇ／ｍｌ、あるいは少なくとも１０ｍｇ／ｍｌの対象ポリペプチドを含む。

【0083】

一実施形態において、本開示は、少なくとも１０％（ｗ／ｗ）のｒ－Ａｎｔｉｄｏｔｅ及び約０．９５：２：５の重量比のＬ－アルギニンＨＣｌ：スクロース：マンニトールを含む凍結乾燥組成物を提供する。一実施形態において、本開示は、少なくとも２０％（ｗ／ｗ）のｒ－Ａｎｔｉｄｏｔｅ及び約０．９５：２：５の重量比のＬ－アルギニンＨＣｌ：スクロース：マンニトールを含む凍結乾燥組成物を提供する。一実施形態において、本開示は、少なくとも４０％（ｗ／ｗ）のｒ－Ａｎｔｉｄｏｔｅ及び約０．９５：２：５の重量比のＬ－アルギニンＨＣｌ：スクロース：マンニトールを含む凍結乾燥組成物を提供する。

【0084】

ＩＩＩ．製剤を使用する方法
本開示はまた、ｆＸａ阻害剤を用いた抗凝固療法を受けている対象の出血を処置、予防または低減する治療方法であって、適した溶媒に溶解されたときに有効量の凍結乾燥製剤を対象に投与することを含む方法に関する。本開示の解毒剤または誘導体は、選択的なまたは緊急の状況で使用されることになる持続時間の短い薬物であってもよく、これが有害な血行力学的副作用または損傷に対する増殖性血管反応の悪化を生じることなく、ｆＸａ阻害剤の通常の抗凝固特性を安全に特異的に中和することができることが予想される。

【0085】

本明細書中で使用される場合、「処置すること」、「処置」という用語及び同種のものは、所望の薬理学的及び／または生理学的効果を得ることを意味するよう本明細書中で使用される。その効果は、障害またはその徴候もしくは症状を完全にまたは部分的に予防することに関して予防的であってもよく、ならびに／あるいは障害及び／または障害に起因する有害な影響の部分的または完全な回復に関して治療的であってもよい。

【0086】

「処置すること」は、哺乳動物の障害のあらゆる処置も含み、（ａ）障害にかかりやすい可能性があるが、障害があるとはまだ診断されていない場合もある対象において障害が生じるのを予防すること、例えば、抗凝固剤の過剰摂取による患者の出血を予防する；（ｂ）障害を抑制すること、すなわち、その発生を抑えること、例えば、出血を抑制すること；または（ｃ）障害を軽減もしくは改善すること、例えば、出血を低減することが挙げられる。

【0087】

本明細書中で使用される場合、「処置する」ことは、病態と関連する症状の全身的改善及び／または症状の発症の遅延をさらに含む。「処置」の臨床的及び準臨床的証拠は、病態、個体及び処置によって変化することになる。

【0088】

「投与」は、処置の過程全体をとおして１回の用量で、連続的にまたは断続的に行うことができる。投与の最も有効な手段及び投与量を判断する方法は当業者に知られており、療法に使用される組成物、療法の目的、処置される標的細胞及び処置される対象によって変化することになる。単一または複数の投与は、治療医師によって選択された用量レベル及びパターンで行うことができる。適した剤形及び薬剤を投与する方法は、当該技術分野において知られている。診断または処置の「対象」は、細胞またはヒトを含む哺乳動物である。診断または処置に対する非ヒト動物対象としては、例えば、ラット、マウスなどのネズミ科動物、イヌなどのイヌ科動物、ウサギなどのウサギ科動物、家畜、スポーツ用動物及びペットが挙げられる。

【0089】

本開示の薬剤及び組成物は、医薬組成物中の活性成分など医薬の製造ならびに従来の手順に従った投与によるヒト及び他の動物の処置のために使用することができる。

【0090】

本開示の薬剤は、任意の適切な経路、具体的には、非経口（皮下、筋肉内、静脈内及び皮内を含む）投与によって治療のために投与することができる。好適な経路は、受け手の状態及び年齢ならびに処置される疾患によって変化することになることも認識されるであろう。

【0091】

「薬学的に許容されるポリマー」という語句は、本明細書中に記載されている１つ以上のポリペプチドと結合できる化合物の群を指す。ポリマーのポリペプチドとの結合は、インビボ及びインビトロにおけるポリペプチドの半減期を延長することができると予想される。非限定例としては、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、セルロース誘導体、ポリアクリラート、ポリメタクリラート、糖、ポリオール及びそれらの混合物が挙げられる。

【0092】

「抗凝固性薬剤」または「抗凝固剤」とは、凝血塊形成を抑制する薬剤である。抗凝固性薬剤の例としては、トロンビン、第ＩＸａ因子、第Ｘａ因子、第ＸＩａ因子、第ＸＩＩａ因子または第ＶＩＩａ因子の特異的な阻害剤、ヘパリン及び誘導体、ビタミンＫアンタゴニストならびに抗組織因子抗体が挙げられるが、これらに限定されるものではない。トロンビンの特異的な阻害剤の例としては、ヒルジン、ビバリルジン（Ａｎｇｉｏｍａｘ（登録商標））、アルガトロバン及びレピルジン（Ｒｅｆｌｕｄａｎ（登録商標））が挙げられる。ヘパリン及び誘導体の例としては、未分画ヘパリン（ＵＦＨ）、低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）、例えば、エノキサパリン（Ｌｏｖｅｎｏｘ（登録商標））、ダルテパリン（Ｆｒａｇｍｉｎ（登録商標））及びダナパロイド（Ｏｒｇａｒａｎ（登録商標））ならびに合成五糖、例えば、フォンダパリヌクス（Ａｒｉｘｔｒａ（登録商標））が挙げられる。ビタミンＫアンタゴニストの例としては、ワルファリン（Ｃｏｕｍａｄｉｎ（登録商標））、フェノクマロール、アセノクマロール（Ｓｉｎｔｒｏｍ（登録商標））、クロリンジオン、ジクマロール、ジフェナジオン、エチルビスクマセタート、フェンプロクモン、フェニンジオン及びチオクロマロールが挙げられる。一実施形態において、抗凝固剤は、第Ｘａ因子の阻害剤である。一実施形態において、抗凝固剤はベトリキサバンである。

【0093】

「抗凝固療法」とは、望ましくない凝血塊または血栓症を予防するために患者に施される治療計画を指す。抗凝固療法は、１つの抗凝固性薬剤または２つ以上の抗凝固性薬剤もしくはその他の薬剤の組み合わせを患者の望ましくない凝血塊または血栓症を処置または予防するのに適した投与量及びスケジュールで投与することを含む。

【0094】

「第Ｘａ因子阻害剤」または「第Ｘａ因子の阻害剤」という用語は、インビトロ及び／またはインビボにおけるプロトロンビンのトロンビンへの変換を触媒する凝固第Ｘａ因子の活性を直接的または間接的のいずれかで阻害することができる化合物を指す。

【0095】

「直接的第Ｘａ因子阻害剤」はｆＸａに直接結合する。非限定例としては、ＮＡＰ－５、ｒＮＡＰｃ２、組織因子経路阻害剤（ＴＦＰＩ）、ＤＸ－ＤＸ－９０６５ａ（例えば、Ｈｅｒｂｅｒｔ， Ｊ．Ｍ．， ｅｔ ａｌ， Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ． １９９６ ２７６（３）：１０３０－８に記載されている）、ＹＭ－６０８２８（例えば、Ｔａｎｉｕｃｈｉ， Ｙ．， ｅｔ ａｌ， Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ． １９９８ ７９（３）：５４３－８に記載されている）、ＹＭ－１５０（例えば、Ｅｒｉｋｓｓｏｎ， Ｂ．Ｉ． ｅｔ． ａｌ， Ｂｌｏｏｄ ２００５；１０６（１１）， Ａｂｓｔｒａｃｔ １８６５に記載されている）、アピキサバン、リバーロキサバン、ＴＡＫ－４４２、ＰＤ－３４８２９２（例えば、Ｐｉｐｅｌｉｎｅ Ｉｎｓｉｇｈｔ：
Ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃｓ － Ｒｅａｃｈｉｎｇ ｔｈｅ Ｕｎｔｒｅａｔｅｄ Ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ Ｍａｒｋｅｔ， ２００７に記載されている）、オタミキサバン、エドキサバン（例えば、Ｈｙｌｅｋ ＥＭ， Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｒｕｇｓ ２００７ ８（９）：７７８－７８３に記載されている）、ＬＹ５１７７１７（例えば、Ａｇｎｅｌｌｉ， Ｇ．， ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｔｈｒｏｍｂ． Ｈａｅｍｏｓｔ． ２００７ ５（４）：７４６－５３に記載されている）、ＧＳＫ９１３８９３、ラザキサバン、ベトリキサバンまたは薬学的に許容されるその塩、及びそれらの組み合わせが挙げられる。特定の態様において、直接的第Ｘａ因子阻害剤はリバーロキサバンである。一部の態様において、直接的ｆＸａ阻害剤は小分子化学化合物である。

【0096】

「間接的第Ｘａ因子阻害剤」のｆＸａ活性の阻止には、１つ以上の他の因子が関係する。間接的第Ｘａ因子阻害剤の非限定例としては、フォンダパリヌクス、イドラパリヌクス、ビオチン化イドラパリヌクス、エノキサパリン、フラグミン、チンザパリン、低分子量ヘパリン（「ＬＭＷＨ」）及びそれらの組み合わせが挙げられる。特定の態様において、間接的第Ｘａ因子阻害剤はエノキサパリンである。

【0097】

一実施形態において、第Ｘａ因子阻害剤は、ベトリキサバン、リバーロキサバン、ＬＭＷＨ、ＤＸ－９０６５ａ、ＹＭ－６０８２８、ＹＭ－１５０、ＰＤ－３４８２９２、オタミキサバン、エドキサバン、ＬＹ５１７７１７、ＧＳＫ９１３８９３、ラザキサバン、アピキサバン及びそれらの組み合わせから選択される。

【0098】

「ベトリキサバン」という用語は、化合物「［２－（｛４－［（ジメチルアミノ）イミノメチル］フェニル｝カルボニルアミノ）－５－メトキシフェニル］－Ｎ－（５－クロロ（２－ピリジル））カルボキサミド」またはその薬学的に許容される塩を指す。「［２－（｛４－［（ジメチルアミノ）イミノメチル］フェニル｝カルボニルアミノ）－５－メトキシフェニル］－Ｎ－（５－クロロ（２－ピリジル））カルボキサミド」とは、以下の構造：

【化1】

を有する化合物またはその互変異性体もしくは薬学的に許容される塩を指す。

【0099】

ベトリキサバンは、米国特許第６，３７６，５１５号及び同第６，８３５，７３９号及び２００６年１１月７日に出願された米国特許出願公開第２００７／０１１２０３９号に記載されており、その内容を参照によって本明細書に組み込んだものとする。ベトリキサバンは、特異的な第Ｘａ因子の阻害剤であることが知られている。

【0100】

ｆＸａの阻害剤の活性を「中和する」、「逆行させる」もしくは「打ち消す」または同様の語句は、ｆＸａ阻害剤の第Ｘａ因子阻害性または抗凝固性作用を阻害またはブロックすることを指す。そのような語句は、インビトロ及び／またはインビボにおけるｆＸａ阻害剤の作用の部分的阻害またはブロックならびに活性の大半もしくはすべてを阻害またはブロックすることを言及する。

【0101】

「有効量」とは、所望の生物学的及び／または治療的結果を引き起こすのに十分な誘導体の量を指す。この結果は、疾患の徴候、症状または原因の軽減であってもよく、あるいは生物系の任意の他の所望の変更であってもよい。本開示において、この結果は、一般に以下のもののうちの１つ以上を含むことになる：患者に投与されたｆＸａ阻害剤の中和、ｆＸａ阻害剤の抗凝固活性の逆行、ｆＸａ阻害剤の血漿からの除去、止血の回復、及び出血の低減または停止。有効量は、使用される特定の解毒剤、対象が投与された特定のｆＸａ阻害剤、ｆＸａ阻害剤の投与計画、解毒剤の投与のタイミング、処置される対象及び疾患の状態、対象の体重及び年齢、疾患状態の重症度、投与の様式及び同種のものによって変化することになり、そのすべては当業者が容易に決定できる。

【0102】

特定の態様において、約１０ミリグラム（ｍｇ）から約２グラム（ｇ）のｆＸａ誘導体（例えば、ｒ－Ａｎｔｉｄｏｔｅ）の量を送達するために溶液が投与される。使用されるｒ－Ａｎｔｉｄｏｔｅのその他の量としては、約１００ｍｇから約１．５ｇ、約２００ｍｇから約１ｇ及び約４００ｍｇから約９００ｍｇが挙げられる。一部の態様において、使用されるｒ－Ａｎｔｉｄｏｔｅの量は、約４００ｍｇまたは９６０ｍｇである。一部の態様において、使用されるｒ－Ａｎｔｉｄｏｔｅの量は、約１０ｍｇから約１００ｍｇ、約１５ｍｇから約９５ｍｇ及び約２０ｍｇから約８０ｍｇである。

【0103】

別の実施形態において、溶液は、少なくとも約３０分間、第Ｘａ因子阻害剤の血中濃度に対するｒ－Ａｎｔｉｄｏｔｅの血中濃度が少なくとも約１：１倍モル比である中和量で投与される。他の実施形態において、モル比は、約１：１または約２：１または約４：１である。

【0104】

投与されると、本製剤は第Ｘａ因子阻害剤を少なくとも約２０％だけ、または少なくとも約５０％だけ、または少なくとも約７５％だけ、または少なくとも約９０％だけ、または少なくとも約９５％だけ中和する。

【0105】

本方法が、すなわち、第Ｘａ因子阻害剤の阻害または逆行が達成されるかどうかは、多くのインビトロアッセイ、例えば、トロンビン生成アッセイならびに臨床的血液凝固アッセイ、例えば、ａＰＴＴ、ＰＴ及びＡＣＴによって判定することができる。

【0106】

本開示の一態様は、ｆＸａ阻害剤を用いた抗凝固療法を受けている対象において体外から投与されたｆＸａ阻害剤と選択的に結合し、それを阻害する方法であって、有効量の凍結乾燥製剤の溶液を対象に投与することを含む方法に関する。この療法に適した患者は、事前に抗凝固療法を受けており、例えば、直接的または間接的なｆＸａの阻害剤などの１つ以上の抗凝固剤を投与されている。

【0107】

一部の実施形態において、本溶液は、過量のｆＸａ阻害剤を投与した後または対象を出血のリスクにさらす可能性がある手術に先立って投与される。対象は、細胞またはヒトなどの哺乳動物であってもよい。

【0108】

別の態様において、本明細書において提供される方法は、凍結乾燥製剤の溶液を対象に投与することを含み、第Ｘａ因子阻害剤を用いた抗凝固療法を受けている対象において体外から投与された第Ｘａ因子阻害剤と選択的に結合し、それを阻害する。対象は、細胞またはヒトなどの哺乳動物であってもよい。

【0109】

本明細書に記載される溶解した凍結乾燥製剤の投与及び随伴する方法から利益を得ることになる対象としては、臨床的な重大な出血事象もしくは臨床的に大幅な重大でない出血事象を経験しているか、またはそれを起こしやすい対象が挙げられる。臨床的な重大な出血事象の例は、大量出血、重要臓器への出血、再手術または新たな治療手技を必要とする出血、及び関連する明白な出血を伴う≧２．０の出血指数からなる群から選択される。（Ｔｕｒｐｉｅ ＡＧＧ， ｅｔ ａｌ， ＮＥＪＭ， ２００１， ３４４： ６１９－６２５。）さらに、対象は、持続性もしくは再発性で、相当な量の、または介入なしには止まらない鼻出血、治療手技を必要とするレベルまでにはならない直腸または尿路出血、注射部位または自然発生的なまたは些細な外傷により生じた他の部位のひどい血腫、ドレナージを必要としない、通常の外科的手技に関連するよりも大幅な失血及び予定外の輸血を必要とする出血からなる群から選択される重大でない出血事象を経験しているか、またはそれを起こしやすい可能性がある。

【0110】

一部の実施形態において、溶解した凍結乾燥製剤は、過量のｆＸａ阻害剤を投与した後または対象を大量出血のリスクにさらす可能性がある手術に先立って投与される。

【0111】

本明細書に記載される任意の方法において、常に明確に述べられている訳ではない場合でも、有効量の溶解した凍結乾燥製剤が対象に投与されることが理解されるべきである。その量は、治療医師が経験的に決定することができ、対象の年齢、性別、体重及び健康により変化することになる。治療医師が考慮するさらなる要素としては、投与された可能性のある第Ｘａ因子阻害剤の素性及び／または量、凍結乾燥製剤が対象に投与されることになる方法または様式ならびに患者に対する治療的ゴールが挙げられるが、これらに限定されるものではない。こうした変化する要素を考慮して、当業者は治療有効量を処置される対象に投与する。

【実施例】

【0112】

本開示は、以下の実施例を参照することによりさらに理解される。実施例は、本開示の単なる例示的なものであるとする。本開示は、例示された実施形態によって範囲が限定されるものではなく、これらは、本開示の一態様の単なる実例として意図される。機能的に等価な任意の方法は、本開示の範囲内にある。本明細書に記載されるものに加えて本開示のさまざまな改変物が前述の説明及び添付の図から当業者には明らかになるであろう。そのような改変物は、添付の特許請求の範囲内にある。

【0113】

別に明記されない限り、すべての温度は摂氏温度である。また、これらの実施例及び別の場所において、略語は以下の意味を有する：

【化2】

【化3】

【0114】

実施例１．ｒ－Ａｎｔｉｄｏｔｅの調製
イオン強度が０．１５のクエン酸リン酸（２０ｍＭ）緩衝液（ＮａＣｌで調節した）を、クエン酸一水和物（Ｆｉｓｈｅｒ、ピッツバーグ、ペンシルベニア州）及びリン酸ナトリウム二塩基性、無水物（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリ州）を使用して調製し、６ＭのＨＣｌまたは６ＭのＮａＯＨのいずれかを使用してｐＨを調節した。追加の塩を含まないリン酸（２０ｍＭ）緩衝液を、６．６１ｇのリン酸ナトリウム二塩基性無水物を２．０ＬのＭｉｌｉ－Ｑ水に溶解させることによって調製し、ｐＨを７．５に調節した。塩を含有するリン酸（２０ｍＭ）緩衝液に関しては（Ｉ＝０．１５Ｍ）、１４．８ｇのＮａＣｌを上記のリン酸緩衝液に添加した。他に記載がない限り、すべての他の試薬をＳｉｇｍａ（セントルイス、ミズーリ州）から購入した。

【0115】

ｒ－Ａｎｔｉｄｏｔｅのポリペプチド（配列番号３）を、２％のアルギニンを含有するｐＨ８．０の１０ｍＭのトリス中でおよそ５ｍｇ／ｍｌの濃度の原液として保存した。ｒ－Ａｎｔｉｄｏｔｅの透析を、４℃でＳｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ（登録商標）透析カセット、３０００ ＭＷＣＯ（Ｐｉｅｒｃｅ、ロックフォード、イリノイ州）を使用して選択したｐＨ値のクエン酸リン酸緩衝液に対して行った。透析中の凝集を防ぐために、タンパク質原液を、カセットに充填する前にろ過した透析緩衝液で０．５ｍｇ／ｍｌに希釈した。透析後、ｒ－Ａｎｔｉｄｏｔｅを０．３ｍｇ／ｍｌに希釈し、タンパク質濃度を１．１６ｍｌ・ｍｇ^－１・ｃｍ^－１の吸光係数を使用したＵＶ吸収分光法（Ａ_２８０）で測定した。この方法によって生成したｒ－Ａｎｔｉｄｏｔｅを以下の実施例に使用した。

【0116】

実施例２．安定性監視のための示差走査熱量測定（ＤＳＣ）
温度制御されたサンプル充填チャンバーを備えたＭｉｃｒｏｃａｌキャピラリーオート－ＤＳＣを使用して示差走査熱量測定（ＤＳＣ）を行った。６０℃／ｈｒのスキャン速度及び２５分のスキャン前平衡化時間を用いて６～１００℃の熱的変動を行った。適切な適合バッファーをリファレンスセルに使用したと同時に、適合バッファー中の典型的なサンプル濃度を約０．６ｍｇ／ｍＬとした。解析に先立って、すべてのサンプルスキャンから、バッファー対バッファーリファレンススキャンを差し引いて、サーモグラムを濃度により正規化した。Ｍｉｃｒｏｃａｌから供給されたソフトウェアを使用してデータを処理した。非２状態フィッティング関数を使用して吸熱反応のピークを単一のピークにフィッティングし、転移温度（Ｔｍ）値をフィッティング関数によって算出した。開始温度（Ｔｏｎｓｅｔ）値を、低温ベースラインとの吸熱反応のピークのずれによって求めた。

【0117】

不均質なサンプル中の複数の集団の存在を示すためにＤＬＳが利用されることが多い。ＷｙａｔｔプレートリーダーＤＬＳ機器を使用して、異なるｐＨ条件における１０～２０μＬのタンパク質溶液（０．３ｍｇ／ｍＬ）を１セットの実験として２０℃で測定した。そのサンプルを５分間、３０００ｒｐｍで遠心分離して、あらゆる気泡を除去し、それぞれ２０秒の５回のスキャンをして、平均サンプル半径を得た。ｐＨ５．０～７．５において、流体力学的半径約３ｎｍの１つの集団を確認した。

【0118】

実施例３．安定剤の特定
実施例２のデータは、ｒ－ＡｎｔｉｄｏｔｅがｐＨ７．５で全体的に安定であることを示した。したがって、賦形剤スクリーニング試験を、ｐＨ７．５で２０ｍＭのリン酸緩衝液中において行った。Ｄｙｎａｐｒｏ動的光散乱プレートリーダー機器（Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、サンタバーバラ、カリフォルニア州）を使用してタンパク質の流体力学的直径を測定した。流体力学的直径を拡散係数からキュムラントの方法を使用してＳｔｏｋｅｓ－Ｅｉｎｓｔｅｉｎの式によって算出した（対数分布型数値に基づく）。与えられたサンプルの均質性を評価するために測定を使用した。

【0119】

賦形剤がある状態またはない状態で０．３ｍｇ／ｍｌのタンパク質を用いて６０℃、ｐＨ７．５におけるタンパク質凝集反応速度を観察することによって安定化賦形剤の可能性を特定するためにＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ３プレートリーダーをまず利用した。表４．１で挙げたとおりＧｅｎｅｒａｌｌｙ－Ｒｅｇａｒｄｅｄ－Ａｓ－Ｓａｆｅ（ＧＲＡＳ）賦形剤のライブラリーの、全部で３２の賦形剤を試験した。

【表4-1】

【0120】

試験した賦形剤、スクロース、ソルビトール及びシトラートが最も大きな安定化効果を有することが確認された。タンパク質の安定性に対する賦形剤の組み合わせの効果の次の試験は、表４．２に概要が示されるこれら３つの賦形剤に基づくものとした。ＯＤ３５０ｎｍでの融解を二連で行って、各製剤に対するΔＴ値を上記のとおり算出した。表２に示したΔＴ値に基づいて、製剤３、４、５及び６の安定効果が最も大きいことを特定した。

【表4-2】

ΔＴは、ｐＨ７．５におけるタンパク質単独と、賦形剤のさまざまな組み合わせを伴うタンパク質との間の転移温度の差である。重量オスモル濃度は３連の測定値を平均し、ΔＴは２連の測定値を平均する。

【0121】

これらの製剤中の治療タンパク質の凝集特性を、これらの組み合わせ製剤においてＮａＣｌを含まないｐＨ７．５の２０ｍＭのリン酸緩衝液中でＯＤ３５０ｎｍでの融解法を使用してさらに試験した。一般に、凝集の程度は、ＮａＣｌがないとかなり低くなる。実際、ＯＤ３５０ｎｍでの融解を初めに３５～７５℃で行い、明らかな凝集が観察されなかったので、同じサンプルを用いて７５から１００℃で再び融解実験を行った。それにより、７５℃における約１０分間の停滞ため、この温度でＯＤ３５０ｎｍ曲線に急な変化が見られた。１００℃まで上昇させた後でも、製剤３、４、５及び６中のタンパク質に関しては明らかな凝集が観察されなかった。付加的なＮａＣｌを除去することの別の利益は、製剤の対応する重量オスモル濃度がＮａＣｌを含むこれらの製剤と比較してはるかに低いことである。

【0122】

実施例４．溶解性試験
この実施例は、ｒ－Ａｎｔｉｄｏｔｅの溶解性に対するｐＨ、温度、安定剤（例えば、シトラート、アルギニン、グリシン及びリシン）ならびにイオン強度の影響を試験した。

【0123】

材料及び方法
使用した材料は、ｐＨ８．０の１０ｍＭのトリス中のｒ－Ａｎｔｉｄｏｔｅ（４．８ｍｇ／ｍｌ）及び２％のアルギニンの溶液とした。室温（ＲＴ）における溶解性に関しては、少なくとも１～２時間の物理的な観察により試験を行った。５℃における溶解性に関しては、サンプルを５℃で一晩平衡化し、サンプルに対して物理的な観察を行った。さらに、そのサンプルを５℃で１５分間遠心分離し、上清のタンパク質濃度をＵＶ Ａ２８０ｎｍにより分析した（二倍希釈）。元の原液を対照として日毎に分析した。

【0124】

タンパク質の沈殿が観察された場合、上清濃度から決定される溶解性を、＜ＸＸｍｇ／ｍＬと解釈した（対応する図の影付きの棒）。これは、過剰量のタンパク質の存在及び緩衝液のｐＨに近いＰＩを有するタンパク質の部分集団の選択的沈殿によるものである。タンパク質の沈殿が観察されない場合、溶液濃度から決定される溶解性を、＞ＸＸｍｇ／ｍＬと解釈した（図中の空白の棒）。

【0125】

室温での溶解性に対するｐＨの影響を、５．０、６．０、７．０及び８．０を含むさまざまなｐＨを用いて試験した。図１Ａに示されるとおり、ｒ－Ａｎｔｉｄｏｔｅは、ｐＨ８．０で溶解性が最も高かった（４２．２ｍｇ／ｍＬで目に見える沈殿がなかった）。それに反して、それぞれｐＨ５．０、６．０及び７．０における溶解性は、３．５ｍｇ／ｍＬ（沈殿なし）、１２．３ｍｇ／ｍＬ（沈殿が観察された）及び２４．４ｍｇ／ｍＬ（沈殿が観察された）であった。

【0126】

表５．１は、５℃における溶解性に関して試験したサンプルを列記する。示したとおり、ＵＦ緩衝液は、４２ｍＭのＭＥＳ、４ｍＭのリン酸ナトリウム、８３３ｍＭのＮａＣｌ、８ｍＭのトリス及び５８ｍＭの約５ｍｇ／ｍＬに濃縮されたアルギニンから成る。

【表5-1】

【0127】

ｐＨ７．３において、１０ｍＭのシトラートは、解毒剤の５℃における溶解性をわずかに改善した。シトラートまたはアルギニンがないと、５℃における溶解性は以下の順序であった：ｐＨ７．５５＞ｐＨ７．８０＞ｐＨ７．３０（図１Ｂ）。ＵＦ緩衝液（ｐＨ７．４８）が最も溶解性が高いようであった（５０ｍｇ／ｍＬ）。これは、適したｐＨ７．５において５８ｍＭのＡｒｇ＋８３３ｍＭのＮａＣｌが存在していたことによる可能性が高い（図１Ｂ）。

【0128】

表５．２は、ｐＨ７．５５におけるアルギニン対シトラートの効果を試験するためのサンプルを列記する。図１Ｃに示されるとおり、ｐＨ７．５５において、シトラート及びアルギニンはともに、ｒ－Ａｎｔｉｄｏｔｅの５℃における溶解性を著しく改善した。さらに、シトラートは、同じモル濃度においてアルギニンよりも有効なようであった：１０ｍＭのシトラート≒５０ｍＭのアルギニン＞２０ｍＭのアルギニン＞１０ｍＭのアルギニン。

【表5-2】

【0129】

表５．３のサンプルを使用して、アルギニン対シトラートの効果をｐＨ７．８及び８．０でさらに試験した。図１Ｄは、ｒ－Ａｎｔｉｄｏｔｅは、５℃においてｐＨ８．０でｐＨ７．８よりもわずかに可溶性が高かったことを示している。１０ｍＭのシトラート及び２０ｍＭのアルグニン（Ａｒｇｎｉｎｅ）はともに、ｐＨ７．８及び８．０において溶解性を少なくとも１５ｍｇ／ｍＬに改善した。

【表5-3】

【0130】

ｐＨ７．８におけるアルギニンの効果をグリシン及びリシンとも比較し（表５．４）、結果を図１Ｅに示した。図に示されるとおり、５℃においてグリシン及びリシンは、ｒ－Ａｎｔｉｄｏｔｅの溶解性に対して効果がなく、５℃においてｐＨ７．５５に対してｐＨ８．０で２０ｍＭのＡｒｇに、より可溶化効果が観察された。

【表5-4】

【0131】

ｒ－Ａｎｔｉｄｏｔｅの溶解性に対するイオン強度の影響も試験した（表５．５）。図１Ｆに示されるとおり、イオン強度は、５℃でアルギニンまたはシトラートの非存在下においてｒ－Ａｎｔｉｄｏｔｅの溶解性を高め、その効果は、イオン強度＞０．１０Ｍで顕著なようであった。

【表5-5】

【0132】

要約すると、この実施例は、室温、アルギニン及びシトラートなどの可溶化剤の非存在下においてｒ－ＡｎｔｉｄｏｔｅがｐＨ８．０で溶解性が最も高いことを示している。５℃においては、ｐＨ８．０がｒ－Ａｎｔｉｄｏｔｅに対して最も良い。さらに、シトラート及びアルギニンはともに、ｒ－Ａｎｔｉｄｏｔｅの５℃における溶解性を著しく改善する。グリシン及びリシンはともにｒ－ＡｎｔｉｄｏｔｅのＴｍを増加させるが、溶解性には影響がない。全体的に、ｒ－Ａｎｔｉｄｏｔｅの５℃における最も高い溶解性は、ｐＨ７．８で９５ｍＭのアルギニンにより達成された。１０日後にも沈殿は観察されなかった。

【0133】

実施例５．最初の凍結乾燥プロセス
凍結乾燥プロセスを、凍結乾燥サイクルのさまざまな段階における製剤構成成分の物理的性質の理解に基づいて合理的なアプローチを使用して開発した。ＤＳＣ及びフリーズドライ顕微鏡法（ＦＤＭ）を含む熱的性質決定法を使用して、Ｔｇ’（凍結濃縮物のガラス転移温度）及びＴｃ（一次乾燥中の崩壊温度）を測定した。表６に示すサイクルを本凍結乾燥製剤の凍結乾燥に選択した。アニーリング工程はマンニトールの結晶化を可能にし、確実に生成物温度が一次乾燥中の崩壊温度未満に下がらないようにする。一次乾燥温度を、適度な一次乾燥の継続時間とともにケーク崩壊を避けるよう選択した。水分レベルが＜１％の凍結乾燥製剤を生成するために２工程の二次乾燥条件を開発した。

【表6】

【0134】

実施例６．結晶化構成成分を用いない凍結乾燥
実験／試験デザイン
１０の異なる製剤を調製して、ｒ－Ａｎｔｉｄｏｔｅの溶解性及び安定性に対する緩衝剤組成物、ｐＨ、安定剤及び薬物濃度の影響を試験した（表７）。製剤を、ｐＨ７．８及び８．２のトリスまたはリン酸緩衝剤を使用して調製した。溶液を、遠心ろ過を使用して、１０ｍｇ／ｍＬ及び２５ｍｇ／ｍＬに濃縮した。

【0135】

トリスまたはリン酸緩衝液中で調製した濃縮溶液のサンプルを短期安定性に関して２～８℃及び２５℃で２週間評価した。同時に、各溶液のサンプルを凍結／解凍試験に使用し、沈殿及び凝集に関して調べた。凍結／解凍試験のためのサンプルは、２ｍＬのＩ型ガラス管バイアルに入った０．５ｍＬの各製剤から成るものとした。０．５ｍＬのサンプルを、凍結前及び各凍結／解凍サイクルの後に視覚的に調べた。各サンプルを－８０℃でおよそ２時間置き、室温でおよそ１５から３０分間解凍し、およそ１～２分間視覚的に調べ、－８０℃の冷凍庫に戻した。各製剤の２５０Ｌのサンプルを、３回目の凍結サイクルの後に取り出し、アッセイのために研究室に提出した。残りの溶液を２回のさらなる凍結サイクルに供した後、アッセイのために研究室に提出した。

【0136】

すべての残りの溶液を０．２５ｍＬのサンプルとして保存的サイクルを使用して凍結乾燥し、サンプルを２５℃及び４０℃における加速安定性に関して評価した。

【0137】

ポリソルベートを含まない溶液を使用して２つのさらなる製剤を調製して、保護剤の存在がない場合の分子に対する凍結／解凍及び凍結乾燥の影響を試験した（表７の製剤５及び６）。溶液のサンプルを残しておき、変調型ＤＳＣ及びフリーズドライ顕微鏡法を使用した熱的性質決定のために使用した。

【表7】

ポリソルベート８０（ＰＳ８０）を含む製剤及び含まない製剤を、３ｍｇ／ｍＬ、３．３ｍｇ／ｍＬ及び４．８ｍｇ／ｍＬで供給される原薬を使用して調製した。

【0138】

製剤５及び６を、まず１９ｍＬの各製剤の原薬溶液を使用して調製した。その体積の原体を１０Ｋ膜を備えた透析カセットに入れ、カセットをｐＨ７．８の２Ｌの１０ｍＭのトリスまたは１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液に入れた。その溶液をおよそ２時間透析し、その透析溶液を新しい別の２Ｌの緩衝液で置き換え、少なくともさらに２時間透析した。その溶液を各カセットから取り出し、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ Ｕｌｔｒａｃｅｌ １０Ｋ遠心式フィルター管に入れた。その溶液を、３／４の速度でおよそ３０分間遠心分離した。残りの溶液を遠心管から取り出し、９５ｍＭのアルギニンを添加した後、濃縮溶液のｐＨ及び体積を調節した。

【0139】

同じ手順を使用して、製剤１Ａから４Ａ及び１Ｂから４Ｂを調製した。製剤を、３ｍｇ／ｍＬの原体溶液を使用して１０ｍｇ／ｍＬの溶液を調製するために１３．５ｍＬの原体及び２５ｍｇ／ｍＬの溶液を調製するために３３．５ｍＬの原体を使用して調製した。４．８ｍｇ／ｍＬの原体溶液を使用した製剤は、１０ｍｇ／ｍＬの溶液を調製するために８．４ｍＬの原体及び２５ｍｇ／ｍＬの溶液を調製するために２０．９ｍＬの原体を使用した。

【0140】

最終体積のサンプル溶液に必要とされるスクロース及びアルギニンの濃縮物を溶液の濃縮後に原体溶液に添加した後、溶液を適切なｐＨ及び最終体積に調節した。１％のＰＳ８０溶液を使用してＰＳ８０を最終サンプル溶液に加えて、０．０１％の濃度にした。

【0141】

その溶液を０．２２μｍのシリンジフィルターによりろ過した後、バイアルに分けた。２ｍＬのバイアルをそれぞれ２５０Ｌの溶液で満たし、以下の条件を使用して凍結乾燥した。
１．１℃／分で－４０℃まで冷却する
２．－４０℃で１時間保持した後、１００ｍＴｏｒｒの真空にする
３．０．５℃／分で－３５℃まで上昇させ、ピラニ真空計測定値が１００ｍＴｏｒｒのキャパシタンスマノメータ測定値と一致し、生成物温度が棚温度に達するまで保持する。
４．０．５℃／分で２０℃まで上昇させ、ピラニ真空計測定値が１００ｍＴｏｒｒのキャパシタンスマノメータ測定値と一致し、生成物温度が棚温度に達するまで保持する。
凍結乾燥後に、栓をしバイアルにキャップを付けた。最初の時点（Ｔ０）の試験のためにサンプルを提出し、残りのバイアルの安定性を評価した。

【0142】

変調型示差走査熱量測定（ＤＳＣ）
溶液サンプルの熱挙動を変調型及び標準ＤＳＣを使用して調べた。１２Ｌの溶液をＴｚｅｒｏパンに入れ密封することによってサンプルを調べた。溶液を１℃／分で－４０℃まで冷却し、等温的に５分間保持した。サンプルの温度を１２０秒毎に１℃の変調で０．５℃／分で１０℃まで上昇させた。アニーリング工程を使用して一部のサンプルを調べた。これらのサンプルを、１℃／分で－４０℃まで冷却し、等温的に５分間保持し、温度を１から５℃／分で－１５℃または－２０℃まで上昇させ、等温的に少なくとも６０分間保持することによって調べた。サンプルの温度を５℃／分で－４０℃に戻し、等温的に５分間保持し、１２０秒毎に１℃の変調で０．５℃／分で上昇させた。

【0143】

フリーズドライ顕微鏡法
サンプルを、Ｌｉｎｋａｍフリーズドライ顕微鏡ステージにある２枚のカバーガラスの間に２から４Ｌの溶液を置くことによってフリーズドライ顕微鏡法を使用して調べた。サンプルを１℃／分で－４０℃以下に冷却し、等温的に２分間保持した。１００マイクロメートルで真空にし、サンプルを偏光顕微鏡に搭載されたビデオカメラを使用して視覚的に調べた。乾燥した材料が認められ、撮影されるまでサンプルをその温度でフリーズドライした。その後、サンプルの温度を２℃ずつ上昇させ、フリーズドライしたサンプルを観察するために各温度で保持した。サンプルの温度を完全な崩壊が観察されるまで上昇させた。

【0144】

分析方法
Ａ．紫外可視による濃度
溶液の濃度をＮａｎｏ Ｄｒｏｐ ２０００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して測定した。２Ｌの溶液を試験プラットフォームに置き、２８０ｎｍの範囲でスキャンすることによってスキャンを行った。

【0145】

Ｂ．ｐＨ
Ｏｒｉｏｎ ｐＨメーターモデル９２０Ａを使用して溶液のｐＨを測定した。Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した予め作製された緩衝液を使用してメーター／プローブをｐＨ７からｐＨ１０の範囲に較正した。

【0146】

Ｃ．ＳＥＣ－ＨＰＬＣ
Ａｇｉｌｅｎｔ １１００シリーズのＨＰＬＣを使用してサイズ排除ＨＰＬＣ分析を行った。０．１Ｍのリン酸ナトリウム、０．７５Ｍの塩酸アルギニンで調製したｐＨ７．４の移動相を分離に使用した。分析カラムは、ＹＭＣ－Ｐａｃｋジオール－２００、３００×４．６ｍｍ、平均粒子径５μｍを使用した。カラムを含むＨＰＬＣ系の適合性を、基準材料の６回の繰り返し測定を使用して検証し、主なタンパク質ピークに対する保持時間、面積及びパーセント面積に関して評価した。さらに、ゲルろ過スタンダードを使用して、カラムの分離能を評価した。サンプルを、製剤緩衝液を使用して１ｍｇ／ｍＬのタンパク質に希釈し、１回の注入当たり５０μｇのタンパク質のカラム負荷となるよう注入した。

【0147】

Ｄ．ＲＰ－ＨＰＬＣ
Ａｇｉｌｅｎｔ １１００シリーズのＨＰＬＣ使用して逆相ＨＰＬＣ分析を行った。この方法は、ＨＰＬＣグレードの水に０．１％のトリフルオロ酢酸及びアセトニトリル中に０．０８％のトリフルオロ酢酸で調製した移動相を使用した分離のためにグラジエントを利用した。分析カラムは、Ｖｙｄａｃ Ｃ１８カラム、１５０×４．６ｍｍ、平均粒子径５μｍを使用した。カラムを含むＨＰＬＣ系の適合性は、基準材料の６回の繰り返し測定ならびに主なタンパク質ピークに関する保持時間、面積及びパーセント面積の評価を使用して検証した。サンプルを、製剤緩衝液を使用して１ｍｇ／ｍＬのタンパク質に希釈し、１回の注入当たり２５μｇのタンパク質のカラム負荷になるよう注入した。

【0148】

Ｅ．ＩＥＸ
Ａｇｉｌｅｎｔ １１００シリーズのＨＰＬＣを使用してイオン交換ＨＰＬＣ分析を行った。この方法は、ｐＨ６．５において２０ｍＭのリン酸ナトリウム及びｐＨ６．５において２０ｍＭのリン酸ナトリウム、１Ｍの塩化ナトリウムで調製した移動相を使用してグラジエントを利用した。分析カラムは、Ｄｉｏｎｅｘ Ｐｒｏｐａｃ ＷＣＸ－１０、２５０×４ｍｍを使用した。カラムを含むＨＰＬＣ系の適合性を、基準材料の６回の反復導入ならびにピーク＃２としてラベルされたピークの保持時間、面積及びパーセント面積の評価を使用して検証した。サンプルを、製剤緩衝液を使用して１ｍｇ／ｍＬのタンパク質に希釈し、１回の注入当たり５０μｇのタンパク質のカラム充填となるよう注入した。

【0149】

結果：
溶液サンプルの一部を、保存的サイクルを使用して凍結乾燥し、２５℃及び４０℃で２か月間安定性を評価した。凍結乾燥サイクルは、充填体積が小さいためおよそ２０時間以内に完了した。場合によってフィルターが破れるため製剤２Ａを除いて、すべての凍結乾燥ケークは許容されるように見えた。

【0150】

全般的に、ＳＥＣ及びＲＰを使用して得たデータは、製剤間の差異を区別しているように見えた。これは、この方法が安定性を示すものであり、サンプルを比較するために使用することができることを示唆している。このデータは、ｒ－Ａｎｔｉｄｏｔｅの安定性がｐＨの影響を受けることを裏付けている。このデータは、ｐＨ７．８で調製した製剤の安定性が、ｐＨ８．２で調製した製剤の安定性よりも良好であることを示している。これは、４０℃で保管されたサンプルに特にあてはまる。

【0151】

この試験には、ｒ－Ａｎｔｉｄｏｔｅの安定性に対する緩衝剤のタイプの比較が含まれていた。緩衝剤は、ｐＨ７．８及び８．２で調製したトリス及びリン酸塩を含むものとした。このデータは、緩衝剤のタイプがｒ－Ａｎｔｉｄｏｔｅの安定性に影響を及ぼさず、安定性の差は主にｐＨの働きであったことを示唆している。

【0152】

この試験の２つの製剤（製剤５及び６）は、スクロース及びポリソルベート８０を用いずに調製した。スクロースは、凍結乾燥保護物質として使用し、ポリソルベート８０は、バイアルの壁との相互作用及び凍結工程中の氷との相互作用によるタンパク質の凝集を防ぐために使用する。保護物質なしで調製した製剤は、４０℃で１か月保管した後にＳＥＣによって測定したパーセント凝集体が増加した。このデータは、タンパク質の安定性を向上させるためには製剤中に賦形剤が必要であることを裏付けている。

【0153】

安定性試験はまた、凍結乾燥サンプルが溶液として調製した製剤よりも安定していることを裏付けている。溶液サンプルの比較は、溶液サンプルの安定性が５℃よりも高い温度で保管された場合よりも５℃で保管された場合に良好であることを示している。

【0154】

安定性試験のためのサンプルは、２ｍＬの各バイアル当たり０．２５ｍＬを使用して調製した。崩壊は、サンプル２Ａにおいてケークを支えるための十分な固体が存在していなかった場合にのみ観察された。他のすべてのサンプルは許容できるように見えたが、そのような小さな充填体積を使用する場合、ケーク収縮の程度を判定するのには適していなかった。完全な規模における製剤の凍結乾燥の実現性を判定するために熱的性質決定試験を安定性試験と同時に行った。

【0155】

変調型ＤＳＣを使用して製剤５及び６を調べた。両製剤ともおよそ２５ｍｇ／ｍＬのｒ－Ａｎｔｉｄｏｔｅ及び９５ｍＭのアルギニンＨＣｌを含むが、製剤５は１０ｍＭのトリスを用いて調製し、製剤６は１０ｍＭのリン酸塩を用いて調製した。トータルヒートフロー、ノンリバーシングヒートフローまたはリバーシングヒートフローを使用して観察した場合、加温変動中に熱現象は観察されなかった。トータルヒートフローサーモグラムは、動力学的に関連する現象及び非動力学的に関連する現象の両方を示すことになる。ノンリバーシングヒートフローサーモグラムは、結晶化などの動力学的に関連する現象を示すことになり、リバーシングヒートフローサーモグラムは、ガラス転移などの非動力学的に関連する現象を示すことになる。観察可能な現象がないのは、構成成分の濃度が十分な強度の信号を生成するには低過ぎることを示唆している可能性もある。

【0156】

崩壊温度がＭＤＳＣを使用して測定したＴｇ’に対して観察された結果と一致するかどうかを判定するためにフリーズドライ顕微鏡実験を行った。すべて同じ賦形剤を同様の濃度で含んでいたため、すべてのサンプルの熱挙動は同様であると予測した。

【0157】

製剤５及び６を、およそ２５ｍｇ／ｍＬのｒ－Ａｎｔｉｄｏｔｅ濃度で調製し、ともにｐＨ７．８の９５ｍＭのアルギニンを含むものとした。これらの製剤間の差異は緩衝剤だけであった。製剤５は１０ｍＭのトリスを含み、製剤６は１０ｍＭのリン酸塩を含んでいた。製剤５は－４０℃で崩壊し、製剤６は－３９℃で崩壊した。このデータは、許容できる凍結乾燥サンプルを得るためには、生成物の温度が測定された崩壊温度未満に維持される必要があることを裏付けている。そのような低い生成物温度を維持することは、実験室またはフルスケールの凍結乾燥機では実現できない。

【0158】

凍結乾燥製剤に関する安定性データは許容できるように見えるが、熱的性質決定データは、崩壊温度が低いために製剤がスケールアップに適していないことを示した。ＭＤＳＣ及びフリーズドライ顕微鏡法を使用して得た熱的性質決定は、本製剤が凍結及び乾燥後、非結晶のままであること及び構成成分の組み合わせが低い崩壊温度につながることを示唆している。スケールアップに適した製剤を作り出す唯一の方法は、フリーズドライの間及び後に非結晶の材料を所定の位置に保持することができる足場として働く結晶化構成成分を添加することである。医薬製剤に添加される最も一般的な結晶化構成成分はマンニトールである。すべてのさらなる製剤及びプロセスの開発研究では、さまざまな濃度のマンニトールの添加を調べた。マンニトールを含有する製剤の開発及び製剤の安定性試験については、個別の開発報告に記載している。

【0159】

結論
ｒ－Ａｎｔｉｄｏｔｅの安定性に対する緩衝剤のタイプ、ｐＨ、安定剤及びタンパク質濃度の影響を溶液製剤及び凍結乾燥製剤として調べた。溶液サンプルを５℃及び２５℃で最大２週間保管し、凍結乾燥サンプルを２５℃及び４０℃で最大２か月保管した。２ｍＬのバイアルに０．２５ｍＬとして凍結乾燥した製剤は、２か月後に許容できる安定性を示した。しかしながら、熱的性質決定実験は、すべての製剤が－３７℃以下の崩壊温度を有し、スケールアップに適していないことを示した。このデータは、崩壊を防ぐため及びさらに高温での凍結乾燥を可能にするために製剤中に結晶化構成成分が必要とされることを示唆している。

【0160】

実施例７．製剤の熱挙動及び安定性に対する緩衝剤のタイプ及びマンニトールの影響。
実施例６のデータは、フリーズドライ中の崩壊を防ぐためにｒ－Ａｎｔｉｄｏｔｅ製剤中に結晶化構成成分が必要とされることを示唆していた。この実施例は、製剤の熱挙動及び凍結乾燥ケークの外観に対するマンニトール及びアルギニン濃度の影響を調べた。２％から４％のマンニトールを含有する製剤をアルギニンの濃度を低減しながら試験した。アルギニンは、濃度が４７．５ｍＭ以下にならない限りマンニトールの結晶化を妨げた。試験は、１０ｍＭのトリス、１０ｍｇ／ｍＬのｒ－Ａｎｔｉｄｏｔｅ、４５ｍＭのアルギニン、２％のスクロース、５％のマンニトール及び０．０１％のポリソルベート８０を含有する製剤が結果として許容される外観ならびに物理的及び化学的安定性を有する凍結乾燥ケークをもたらすことを発見した。凍結乾燥の試験は、－２５℃での３時間のアニーリング後に－２５℃の一次乾燥棚温度を使用することを裏付けるデータをもたらした。２工程の二次乾燥プロセスは、残存水分値が１％未満のケークをもたらす。

【0161】

実験／試験デザイン
同時に製剤の熱挙動を調べ、保存サイクルを使用して凍結乾燥した製剤の化学的安定性を比較するための試験を設計した。最初の製剤を、９５ｍＭのアルギニン、２％のスクロース、２％のマンニトール及び１０ｍＭのトリスまたは１０ｍＭのリン酸緩衝剤のいずれかを用いてｐＨ７．８で調製した。この製剤はまた、活性成分を１０または２５ｍｇ／ｍＬのいずれかで含むものとした（表８．１）。

【表8-1】

【0162】

解凍した薬物溶液のアリコートを、３Ｋ分画分子量（ＭＷＣＯ）膜を備えた透析カセットに入れた。このカセットを、アルギニン、スクロース及びマンニトールとともにトリスまたはリン酸塩のいずれかを含有する緩衝液に入れた。薬物溶液を収容したそれぞれのカセットを、２Ｌの緩衝液に入れ、４時間透析した。２時間後に緩衝液を新しく足し、その溶液をさらに４時間または一晩、２～８℃で透析した。その溶液を、１８Ｇ注射針を備えたＢＤシリンジを使用して透析カセットから取り出し、３Ｋ ＭＷＣＯ膜を備えた遠心ろ過チューブに入れた。そのチューブを、およそ３０００ＲＰＭで２０から３０分間遠心分離し、ＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００分光光度計を使用して溶液の濃度を確認した。溶液を、１０ｍｇ／ｍＬまたは２５ｍｇ／ｍＬ超に濃縮し、適切な緩衝液を使用して適切な濃度に希釈し、１％のポリソルベート８０の溶液を使用してポリソルベート濃度を０．０１％に調節した。その溶液を０．２２μｍのシリンジフィルターによりろ過し、３ｍＬのガラス管バイアルに各バイアル当たり０．２５ｍＬ及び０．８ｍＬで入れた。その溶液を保存的サイクル（表８．２）を使用してフリーズドライし、２５℃及び４０℃で最大２か月間安定性を評価した。

【表8-2】

【0163】

各溶液のサンプルのフリーズドライに先立ってＤＳＣ及びＦＤＭを使用した熱分析のために取っておいた。

【0164】

追加の熱解析及び凍結乾燥サイクルの開発試験は、タンパク質を用いずに調製した緩衝液を使用して完了した。マンニトールの結晶化を妨げないと同時にタンパク質を可溶化するのに製剤中に必要とされるアルギニンの最小濃度を求めるために実験を行った。タンパク質を可溶化するために必要とされるアルギニンの最小濃度を求めるために取引先が溶解性試験を行った。_１熱挙動、凍結乾燥サイクル条件及びケークの外観に対するアルギニン及びマンニトール濃度の影響を試験するためにＢａｘｔｅｒが実験を行った。緩衝液には、ｐＨ７．８の２％のスクロースとともに１０ｍＭのトリス緩衝剤が含まれた。アルギニン濃度は９５ｍＭから９．５ｍＭまで変動させ、マンニトール濃度は２％から５％の間で変動させた。

【0165】

熱挙動、ケークの外観及び短期間加速安定性データに基づいて優良な製剤候補を特定した。さらなる開発のために提示した製剤は、１０～２５ｍｇ／ｍＬのｒ－Ａｎｔｉｄｏｔｅ、ｐＨ７．８の１０ｍＭのトリス、４５ｍＭのアルギニン、２％のスクロース、５％のマンニトール及び０．０１％のポリソルベート８０を含む。初期の試験は、３ｍＬの各バイアル当たり０．２ｍＬから１ｍＬを使用した。低アルギニン製剤を使用した最初の安定性試験を、２５ｍｇ／ｍＬの薬物濃度を使用して行い、保存的サイクルを使用して凍結乾燥した。サンプルの安定性を２５℃及び４０℃で最大３か月間評価した。

【0166】

プロセスを確認するために行ったサイクルは、各バイアル当たり５ｍＬで１０ｍＬのバイアルに入れた薬物溶液を使用した。二次乾燥の試験の間に水分含有量の影響を試験するために同じバイアル及び充填体積を使用した。これらの試験のための製剤を、実験室規模のタンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）ユニットを使用し、適切な緩衝剤に交換した薬物溶液を使用して調製した。ＴＦＦユニットは、管を備えたタンジェンシャルフローフィルターに接続された溶液の収容容器を備えているものとした。その容器を薬物溶液で満たし、適切な緩衝剤に交換し、１０ＫＤａ ＭＷＣＯ膜によりろ過することによって１０から２５ｍｇ／ｍＬに濃縮した。十分な量の１％のポリソルベート８０（ＰＳ８０）を添加して０．０１％のＰＳ８０濃度を作り出した。最終溶液を０．２２μｍのシリンジフィルターまたは真空ろ過システムによりろ過した。

【0167】

凍結乾燥サイクルは、冷却変動速度及び一次乾燥と二次乾燥の間の変動速度ならびにアニーリング及び一次乾燥中の棚温度などのプロセスパラメータを調べた。二次乾燥の開始時ならびに４０℃における４、８及び１０時間後にサンプルを取り出すことによって残存水分試験を行った。４０℃における８時間後ならびに５０℃における１及び２時間後にサンプルを取り出すことによって第２の試験を行った。Ｋａｒｌ Ｆｉｓｃｈｅｒ分析を使用してサンプルを残存水分に関して試験した、残存水分に関する値がプラトーに達したら乾燥が完了したと見なした。二次乾燥中の特定の残存水分値に対応する時点にサンプルを取り出すことによって製剤の安定性に対する残存水分の影響を試験した。４０℃において最大２か月間及び５０℃において１週間、サンプルの安定性を評価した。

【0168】

１０ｍｇ／ｍＬのｒ－Ａｎｔｉｄｏｔｅ、１０ｍＭのトリス、４５ｍＭのアルギニン、２％のスクロース、５％のマンニトール及び０．０１％のポリソルベート８０、ｐＨ７．８を含有する提示した薬物製剤のための凍結乾燥サイクルデザインスペースを作り出した。製剤を各バイアル当たり５ｍＬの溶液を使用して１０ｍＬのガラス管バイアルに入れた。デザインスペースの開発には、製剤の崩壊温度及びバイアルの熱伝達係数と組み合わせた設備能力の知識が必要とされる。製品に使用されるまさにそのガラス管バイアルを使用し、水でバイアルを満たし、生成物を乾燥するための対象棚温度を使用して氷を昇華させてバイアルの熱伝達係数を測定した。チャンバー圧力をおよそ２５ｍＴｏｒｒからおよそ４００ｍＴｏｒｒまで変化させながら生成物温度及び質量流量データを収集した。波長可変半導体レーザ吸収分光法（ＴＤＬＡＳ）を使用して各圧力における質量流量データを収集し、圧力とともに質量流量の変化を使用してバイアルの熱伝達係数を算出した。

【0169】

結果：
１．示差走査熱量測定（ＤＳＣ）
緩衝剤製剤の熱挙動に対するそれぞれの構成成分の影響を判定するために、各緩衝剤構成成分の個々の溶液を調製し、ＤＳＣを使用して試験した。一般に、製剤の熱挙動は、最も高い濃度で存在する構成成分によって決まる。熱挙動の変化は、他の賦形剤または薬物の添加により起こる可能性がある。例えば、塩の添加により、製剤中の非結晶の材料のＴｇ’が低下することがある。提示する薬物製剤は、マンニトールを含む。結晶化増量剤として働くようマンニトールを賦形剤として凍結乾燥製剤に添加する。マンニトールは、溶液中で初めに凍結されると非結晶である。マンニトールがケークのための構造体を提供できるようマンニトールの結晶化を促進するために凍結中にアニーリング工程が一般に含まれる。製剤中のその他の賦形剤及び／または活性成分がマンニトールの結晶化を妨げるか、または遅延させる場合がある。本セクションで論述する試験は、マンニトールの結晶化及び溶液の熱挙動に対するトリス、リン酸塩及びアルギニンの影響を試験した。

【0170】

ｐＨ７．８で調製した１０ｍＭのトリス溶液を、ＤＳＣを使用して１℃／分で－５０℃まで冷却した（図２）。サーモグラムは、およそ－２０℃で開始した氷の結晶化発熱に続き、－３２℃のトリスの結晶化発熱を示している。

【0171】

製剤中に９５ｍＭのアルギニンが含まれる場合、結晶化発熱がもはや存在しない（図３）。この試験の温度範囲では氷の融解吸熱の他に熱現象が観察されなかった。

【0172】

１０ｍＭのトリス、９５ｍＭのアルギニン製剤が４％のスクロースを含む場合、およそ－４２℃の中間点のＴｇ’が観察される。スクロース単独のＴｇ’の中間点は、一般におよそ－３３℃である。この試験は、トリス／アルギニン混合物がスクロースのＴｇ’を低下させることを示している。Ｔｇ’が－４０℃未満の溶液は、凍結乾燥に好適な候補ではない。一次乾燥中にそのような低い生成物温度を維持するのは難しい。マンニトールなどの結晶化構成成分の添加は、一次乾燥の開始前にマンニトールが結晶化する限り、構造体をもたらし、凍結乾燥の可能性を向上させることができる。

【0173】

製剤中の合計糖含有量が４％に維持されるようマンニトールを製剤に２％Ｗ／Ｖで添加し、スクロース濃度を２％まで低減した。１０ｍＭのトリス、２％のスクロース及び２％のマンニトールを用いて調製した溶液は、マンニトールがおよそ－２０℃で結晶化し始めることを示している（図４）。その溶液に９５ｍＭのアルギニンを添加した場合、マンニトールの結晶化が妨げられる（図５）。凍結溶液を－２０℃で最大５時間アニーリングした場合でもマンニトールは結晶化しなかった（図６）。

【0174】

製剤の熱挙動に対する緩衝剤の影響を試験するために同じセットの熱解析を１０ｍＭのリン酸ナトリウムを用いて調製した溶液に対して行った。１０ｍＭの溶液としてｐＨ７．８で調製した場合、リン酸ナトリウムは冷却工程中に結晶化した（図７）。

【0175】

１０ｍＭのリン酸ナトリウムと９５ｍＭのアルギニン及び４％のスクロースとの混合物は、およそ－３８℃の中間点を有するＴｇ’を示す。

【0176】

トリス溶液と同様に、スクロース及びマンニトールを含有するリン酸塩溶液は、マンニトールの結晶化発熱を示す（図８）。その混合物に９５ｍＭのアルギニンを添加した場合、結晶化発熱は観察されない（図９）。トリスを用いて調製した製剤と同様に、リン酸塩製剤を－２０℃で５時間アニーリングした場合でもマンニトールの結晶化発熱は観察されなかった。

【0177】

この試験は、トリスまたはリン酸塩のいずれかを含有する製剤に９５ｍＭのアルギニンを添加すると、スクロースのＴｇ’が激しく低下することになり、マンニトールの結晶化が妨げられることになることを示している。このデータは、成功した凍結乾燥ケークのためにマンニトールの結晶化を促進するのに製剤の変更が必要であることを示した。この試験の時点において、データは、タンパク質の溶解性を維持するために９５ｍＭのアルギニンまたは１０ｍＭから２０ｍＭのシトラートのいずれかが必要であることを示唆していた。よって、製剤中のアルギニンの代用として、２％のスクロース及び５％のマンニトールとともに１０ｍＭのトリス中に１０ｍＭまたは２０ｍＭのシトラートを含有する溶液を使用して試験を行った。マンニトールの結晶化の可能性を高めるために、マンニトール濃度を増加し、スクロース濃度を低減した。アルギニンとともに２％のスクロース及び５％のマンニトールを使用した試験については、この報告の後に記載する。

【0178】

シトラートを含有する溶液を－２５℃でアニーリングした。１０ｍＭのシトラートでは－２５℃で２４分に開始した結晶化発熱（図１０）、及び２０ｍＭのシトラートでは－２５℃で３０分に開始した結晶化発熱（図１１）が観察された。

【0179】

２．フリーズドライ顕微鏡法（ＦＤＭ）
１０ｍｇ／ｍＬのｒ－Ａｎｔｉｄｏｔｅ、９５ｍＭのアルギニン、２％のスクロース及び２％のマンニトールとともに１０ｍＭのリン酸塩または１０ｍＭのトリスを用いてｐＨ７．８で調製した製剤を、ＦＤＭを使用して調べた。トリス製剤を用いて行った実験は、－２５℃で最大３時間アニーリングした場合、およそ－３４℃で製剤崩壊の開始を示していた。

【0180】

１０ｍＭのリン酸塩を含有する製剤は、さらに高い崩壊温度を有した。－３２℃で安定した乾燥層が観察され、－３０℃で崩壊の開始が観察された。

【0181】

ＦＤＭデータは、両製剤が機械的生産に適用できる条件を使用して凍結乾燥することができることを示唆している。これは、ＤＳＣを使用して得たデータと対応していない。ＦＤＭを使用して行った実験は、温度制御されたステージと直接接触した２枚のカバーガラスの間の溶液の薄層を利用する。これらの条件は、乾燥が容易であるためＤＳＣデータと対応せず、ＤＳＣデータをその関連性を得る次の試験のために信用することとした。

【0182】

３．凍結乾燥及び安定性
９５ｍＭのアルギニン、２％のスクロース及び２％のマンニトールとともに１０ｍｇ／ｍＬ及び２５ｍｇ／ｍＬのｒ－Ａｎｔｉｄｏｔｅを用いてｐＨ７．８で調製したリン酸塩製剤及びトリス製剤を溶液及び凍結乾燥サンプルとして安定性に関して調べた。それぞれの溶液を各バイアル当たり０．２０ｍＬで３ｍＬのバイアルに入れた。サンプルの一部を５℃及び２５℃で最大２週間保管し、サンプルの残りの部分を保存的サイクルを使用して凍結乾燥し、２５℃で最大３か月間及び４０℃で最大２か月間安定性を評価した。

【0183】

－３０℃で凍結乾燥する前にサンプルを－２５℃で１時間アニーリングした。二次乾燥も２０℃の棚温度を用いた保存的条件を使用して行った。タンパク質の温度感受性についてほとんどわかっていなかったため、保存的で非従来的なサイクルを使用した。凍結乾燥サイクルは、およそ２１時間以内に完了した。そのバイアルを凍結乾燥機から取り出す前に栓で封をし、キャップを付けて、安定性を評価した。

【0184】

凍結乾燥ケークは、崩壊の形跡がなく許容できるように見え、精製水で速やかに再構成された。確実にマンニトールの結晶化が生じる場合、それがバイアルを破損しないようにするために、薬物を含まない同じ製剤を使用した第２の試験を同時に行った。プラセボ製剤を２０ｍＬのバイアルにそれぞれ１０ｍＬの溶液で入れた。バイアルを一杯にした１つのトレーを１℃／分で－４０℃まで冷却し、１２０分間等温的に保持した後、３時間のアニーリングのために１℃／分で－２５℃まで上昇させた。バイアルの第２のセットを－２５℃まで冷却し、３時間等温的に保持し、－３５℃まで冷却した後、バイアルを一杯にしたトレーを収容する乾燥機に移した。すべてのバイアルを－３０℃で凍結乾燥し、二次乾燥のために２５℃で乾燥した。両製剤が入ったバイアルで崩壊が観察された。

【0185】

これは、マンニトールが結晶化しなかったことを示唆し、アルギニンがマンニトールの結晶化を妨げていたというＤＳＣを使用した熱分析中に出された結論を裏付けている。したがって、製剤開発に対するその関連性からＦＤＭの結果よりもＤＳＣ及び凍結乾燥データをその後の実験のために信用することとした。

【0186】

次の実施例に記載されている試験は、アルギニンの低減ならびにタンパク質の溶解性及びマンニトールの結晶化に対するその影響に焦点を当てた。上記の９５ｍＭのアルギニンを用いて調製したリン酸塩製剤及びトリス製剤は、安定したままであり、初期データを得た。

【0187】

５℃及び２５℃で最大２週間保管した場合、溶液サンプルの濃度の低下は観察されず、液体サンプルと凍結乾燥サンプルの間にＴ０における濃度の差はなかった（図１２及び１３）。

【0188】

同様に、２５℃で最大３か月間（図１４）または４０℃で最大２か月間保管したいずれの凍結乾燥製剤でも濃度の低下は観察されなかった。

【0189】

ＳＥＣデータは、溶液製剤を５℃で最大２週間保管した場合に主ピークの低下がなかったことを示している。２５℃で最大２週間保管した場合、１０ｍｇ／ｍＬのサンプルで１％を超えて、２５ｍｇ／ｍＬのサンプルで３％を超えてパーセント主ピークが低下した。

【0190】

したがって、製剤の化学的安定性は許容できるように見えるが、凍結乾燥中に物理的安定性が不十分なため製剤に対して変更が必要であった。不十分な物理的安定性は、プラセボ製剤に対して観察された崩壊したケークが示していた。ＤＳＣ実験のデータは、アルギニン濃度を低下させ、マンニトール濃度を増加させると、マンニトールの結晶化が促進され、凍結乾燥ケークの物理的安定性が改善されるであろうことを示唆している。

【0191】

実施例８．凍結乾燥サンプルの熱挙動及び外観に対するアルギニン及びマンニトール濃度の影響
熱挙動及びケークの外観に対するアルギニン濃度及びマンニトール濃度の影響を試験するためにプラセボ製剤を使用してこの実施例を行った。この試験は、トリス緩衝剤を用いて調製したプラセボ製剤に焦点を当てた。トリス緩衝剤は原薬溶液を調製するために使用される緩衝剤であり、トリス及びリン酸ナトリウムを用いて調製したサンプルの化学的安定性に差がなかったためトリス緩衝剤を選択した。

【0192】

以下の試験は、９．５ｍＭから９５ｍＭのアルギニン濃度範囲及び２％から５％のマンニトール濃度範囲を使用して調べた。

【0193】

１．熱分析
熱分析実験の目的は、製剤中の固体の濃度を実質的に増加させることなくマンニトールの結晶化を促進するアルギニンの濃度及びマンニトールの濃度を求めることであった。高濃度の固体は、凍結乾燥中の物質移動に対する抵抗力を増加させ、極端に長い凍結乾燥サイクルをもたらす可能性がある。

【0194】

マンニトール濃度を一定に維持しながら１０ｍＭのトリス、２％のスクロース、２％のマンニトール及び０．０１％のＰＳ８０製剤中のアルギニン濃度を低下させた。結晶化を促進するために製剤を－１５℃から－２５℃で最大５時間アニーリングした。マンニトールの結晶化は、アルギニン濃度が９．５ｍＭに低減され、アニーリング温度が－２２℃以上であった場合にのみ観察された。マンニトールの結晶化は、－２２℃におけるアニーリングの開始時に始まった（図１５）。

【0195】

マンニトールの結晶化の開始は、濃度が４％に増加され、アルギニン濃度が９５ｍＭから４７．５ｍＭに低減されると－２５℃のアニーリングの３０分後に起こる（図１６）。より高温でアニーリングが行われた場合の凍結乾燥ケークの外観に対する変化は観察したため、より低いアニーリング温度を試験した。アニーリングが－１５℃で行われた場合、外観に対する変化には、ケークの収縮が含まれた。

【0196】

製剤に２％の濃度を使用した場合のマンニトールの結晶化は、アルギニンの濃度が４７．５ｍＭより高い場合、遅延されるか、または妨げられる。マンニトールの結晶化に影響を及ぼすことなく製剤に含ませることができるアルギニンの最高濃度は４７．５ｍＭである。２％のマンニトール及び４７．５ｍＭ、７１ｍＭまたは８５．５ｍＭのアルギニンを含むプラセボ製剤を使用して行った凍結乾燥実験を使用してこの主張を確認した。４７．５ｍＭのアルギニンを用いて調製したサンプルは、薬学的に許容されたが、さらに多くのアルギニンを用いて調製したサンプルは崩壊を示した。マンニトールの濃度を増加させると、結晶化の可能性を高めることができる。アルギニンの濃度が４７．５ｍＭを超える場合にマンニトールの濃度を４％及び５％に増加させると、結晶化を促進するために凍結溶液のアニーリングが必要とされる。

【0197】

５％のマンニトール及び４７．５ｍＭのアルギニンを含有する製剤中でマンニトールは容易に結晶化した。１０ｍＭのトリス、４７．５ｍＭのアルギニン、２％のスクロース、５％のマンニトール及び０．０１％のＰＳ８０を含有する製剤を１℃／分で－４０℃までゆっくりと冷却した（図１７）。製剤を１℃／分で冷却した場合、冷却工程中にマンニトールの結晶化発熱が観察された。

【0198】

製剤のサンプルを－４０℃まで急速に冷却した（１０℃／分よりも速く冷却した）後－２５℃でアニーリングした（図１８）。溶液を－２５℃でアニーリングした場合、マンニトールは２３分後に結晶化した。この実験は、アルギニン濃度が４７．５ｍＭ未満である限り、製剤中でマンニトールは容易に結晶化することを示している。

【0199】

熱分析データは、アルギニン濃度が４７．５ｍＭ以下である場合、４％以上の濃度のマンニトールは、凍結乾燥プロセスの適度な時期において容易に結晶化することを裏付けている。

【0200】

２．凍結乾燥
熱分析実験と同時に凍結乾燥の試験を行った。１０ｍＭのトリス、９．５ｍＭから２３．７５ｍＭのアルギニン、２％のスクロース及び２％から４％のマンニトールを用いて、または４％のスクロースあり、もしくはなしで４７．５ｍＭのアルギニンとともに１０ｍＭのトリスを用いてプラセボ溶液を調製した。１０ｍＭのトリス、４７．５ｍＭのアルギニン、２％のスクロース及び５％のマンニトールを含有する製剤も含まれた。その溶液を、各バイアル当たり３ｍＬの溶液を使用して２０ｍＬのバイアルに入れた。保存的で非従来的な凍結乾燥サイクルを、許容できるケークが生成できるか判定するために使用した。サンプルを１℃／分で－２０℃まで冷却し、３時間アニーリングし、１℃／分で－４０℃まで冷却し、２時間保持した。１００ｍＴｏｒｒの真空にし、棚温度を０．５℃／分で－３０℃まで上昇させた。ピラニ真空計の値がキャパシタンスマノメータ（ＣＭ）の値と一致するまでサンプルを－３０℃に保持し、その後、０．５℃／分で２５℃の二次乾燥に進んだ。ピラニ真空計の値がＣＭの値と一致したとき二次乾燥が完了した。およそ３０時間後に一次乾燥が完了し、二次乾燥は数時間だけ必要とされた。

【0201】

トリス及びアルギニンだけを用いて調製したサンプルは完全に崩壊し、４％のスクロースを含んだサンプルはケークが収縮した。

【0202】

４７．５ｍＭ以下のアルギニン及び２％から５％のマンニトールを含有するすべての製剤は許容できるケークであるように見えた。

【0203】

１０ｍＬの充填体積を使用した冷却変動中のアニーリングの影響を試験するための試験が含まれた。この試験は、２３．７５ｍＭ及び４７．５ｍＭのアルギニンとともに１０ｍＭのトリス、２％のスクロースならびに２％から５％のマンニトールを用いて調製したサンプルを使用した。その溶液を１℃／分で－２５℃まで冷却し、３時間保持し、１００ｍＴｏｒｒの真空にし、棚温度を０．５℃／分で－２０℃まで上げた。そのサンプルを－２０℃で乾燥し、二次乾燥のために棚を２５℃にまで温めた。すべてのサンプルは、崩壊の形跡がなく許容できるように見えた。

【0204】

凍結乾燥ケークの外観に対する冷却速度の影響を調べるために同じ製剤を使用した。１セットのサンプルを１℃／分で－２５℃まで冷却し、３時間アニーリングした。第２のセットのサンプルを５℃／分で－２５℃まで冷却し、３時間アニーリングした。これらのセットのサンプルを１つの乾燥機中で組み合わせ、一次乾燥のために－３０℃で、続いて二次乾燥のために２５℃で凍結乾燥した。

【0205】

すべてのサンプルは、崩壊の形跡がなく許容できるように見えた。このデータは、１℃／分から５℃／分の間の冷却速度がサンプルの外観に影響を及ぼさないことを裏付けている。

【0206】

取引先が行った溶解性試験は、７．５から８．２のｐＨ範囲でアルギニンの濃度が３６ｍＭ以上の場合、溶液中のタンパク質が可溶性のままであることを裏付けた。４５ｍＭのアルギニンを含有する溶液を使用することを決めた。その理由は、それがマンニトールの結晶化を妨げることになる濃度よりも十分に低いと同時にタンパク質の完全な溶解性を確保するであろうからである。マンニトール濃度は、サイクル中に確実にマンニトールが容易に結晶化するよう５％と選択した。したがって、最良の製剤候補は、ｐＨ７．８で調製された０．０１％のＰＳ８０を伴う１０ｍＭのトリス、１０ｍｇ／ｍＬまたは２５ｍｇ／ｍＬのｒ－Ａｎｔｉｄｏｔｅ、４５ｍＭのアルギニン、２％のスクロース、５％のマンニトールであった。

【0207】

プラセボ溶液を用いて完了した凍結乾燥の試験は、アルギニン濃度が４７．５ｍＭ以下で２％以上のマンニトールである場合に許容できるケークが生成できることを示した。その溶液を、－２０℃と高い棚温度を使用して凍結乾燥し、崩壊の形跡はなかった。サンプルを、冷却工程中または－４０℃の凍結工程の後に－２０℃で３時間アニーリングし、ケークの外観に影響がなかった。保存的で従来のアプローチは、サンプルを－４０℃で最初に凍結し、一次乾燥とともにアニーリング工程が続くことになる。凍結乾燥サイクルのためにこのアプローチを選択した。－２０℃におけるアニーリング工程の後に一次乾燥を行った後、続いて二次乾燥のために棚温度を０．５℃／分で２５℃まで上げた。それに続く凍結乾燥開発試験は、適切な二次乾燥の棚温度及び継続時間に焦点を当てた。

【0208】

凍結乾燥製剤の開発の目的には以下のものが含まれた（１）少なくとも１０ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度、（２）２～８℃における改善された安定性、（３）≦５分の再構成時間、及び（４）堅牢な凍結乾燥プロセス。

【0209】

製剤スクリーニングのいくつかの過程は、タンパク質の安定性（凍結乾燥ケーク及び溶液の両方として）及び５℃における溶解性に対する個々の変化する要素の影響を評価するために行った。製剤スクリーニングの間は保存的な凍結乾燥サイクルを使用した。凍結乾燥プロセス開発を平行して行った。

【0210】

この試験は、タンパク質濃度に関して、高い濃度（例えば、２５ｍｇ／ｍＬ）の溶液ほど、低い溶液（例えば、１０ｍｇ／ｍＬ）よりも室温で２日後に安定していなかった（すなわち、ＳＥＣによる合計凝集体及びＲＰ－ＨＰＬＣによる％ベータピークがより大きく増加）ことを示した。ｒ－Ａｎｔｉｄｏｔｅの安定性に最適なｐＨ（凍結乾燥生成物及び溶液）は、ｐＨ７．８０±０．３であることが確認された。

【0211】

他の安定化構成成分（すなわち、スクロース及びアルギニン）の存在下ではトリス緩衝剤とリン酸緩衝剤の間で安定性に有意な差は見られなかった。

【0212】

安定剤のタイプ及び濃度に関して、２％及び４％ｗ／ｗのスクロース双方とも良好な安定効果をもたらした。５℃、ｐＨ７．８０±０．３において≧５０ｍｇ／ｍＬのｒ－Ａｎｔｉｄｏｔｅの溶解性を維持するためには、≧３６ｍＭのアルギニン濃度が必要とされる。

【0213】

≧４％ｗ／ｗの濃度の結晶性構成成分（増量剤）であるマンニトール（１０ｍＭのトリス、２％ｗ／ｗのスクロース、４５ｍＭのアルギニンの存在下）は、一次乾燥中のケーク崩壊を回避するのに重要である。さらに、少量のポリソルベート８０の存在が剪断条件下（室温における振盪）における溶液中のｒ－Ａｎｔｉｄｏｔｅの安定性を確保するのに重要である

【0214】

以下に示す組成は凍結乾燥に適した溶液を例示する。

【表8-3】

^１凍結乾燥中に除去される。
^２４．７０ｍＬの注射用の滅菌水（ＳＷＦＩ）で再構成される。

【0215】

凍結乾燥製剤は、ｒ－Ａｎｔｉｄｏｔｅ医薬品の安定性を向上させ、２～８℃で保管することができる。以下の表は、凍結した液体医薬品の組成と再構成された凍結乾燥医薬品とを比較する。１００ｍｇ／バイアル及び４００ｍｇ／バイアルの凍結乾燥医薬品の組成の例ならびに例の再構成された組成を提示する。

【表8-4】

【表8-5】

【表8-6】

【表8-7】

【0216】

フリーズドライ顕微鏡法を２つの異なる製剤に対して行った。およそ０．１５ｍＬの溶液をガラスセルに分注し、それを温度制御されたフリーズドライステージに置いた。サンプル温度を監視するために熱電温度計をセルの底部及び真ん中に置いた。その液体を０．５℃／分の速度で－５０℃まで冷却し、－２０℃で１時間アニーリングし、－５０℃に再凍結した。チャンバーを真空にし、０．５℃／分の速度で加熱した。この崩壊温度に基づいて、崩壊温度未満の生成物温度をもたらすフリーズドライ温度と圧力の組み合わせが、崩壊しないケークを生成することになる。例えば、崩壊しないケークを生成するために１００ｍＴｏｒｒで最大２０℃の生成物温度が使用できるであろう。

【表9】

【0217】

再構成後、ＳＷＦＩを含む注射用ｒ－Ａｎｔｉｄｏｔｅ、５０ｍｇ／バイアルは、ｐＨ７．８で約４８０ｍＯｓｍ／ｋｇの重量オスモル濃度である。したがって、再構成したＤＰは静脈内投与に許容される。

【0218】

ｒ－Ａｎｔｉｄｏｔｅ ＢＤＳは、１０ｍＭのトリス、ｐＨ７．８±０．３、４％のスクロース、９５ｍＭのアルギニン中３．０ｍｇ／ｍＬで製剤化され、－６０℃以下で凍結保管される。注射用のｒ－Ａｎｔｉｄｏｔｅの製造は、３ｍｇ／ｍＬのｒ－Ａｎｔｉｄｏｔｅ ＢＤＳを解凍及びプールすること、製剤緩衝液（１０ｍＭのトリス、２％のスクロース、５％のマンニトール、４５ｍＬのアルギニン ＨＣｌ、ｐＨ７．８）に対して限外ろ過／透析ろ過し１０ｍｇ／ｍＬの最終濃度にすること、ポリソルベート８０を添加して０．０１％ｗ／ｗにすること、ｒ－Ａｎｔｉｄｏｔｅ注射用容器施栓系に無菌充填すること、凍結乾燥、栓をすること、キャップを付けること及びラベルを貼ることから成る。

【0219】

注射用ｒ－Ａｎｔｉｄｏｔｅ製造プロセスは、他の殺菌液体医薬品の生産のために開発された手順を利用する。注射用ｒ－Ａｎｔｉｄｏｔｅを生産するために使用される滅菌の方法は０．２μｍろ過である。ｒ－Ａｎｔｉｄｏｔｅは熱不安定性であるため、０．２μｍろ過が注射用殺菌ｒ－Ａｎｔｉｄｏｔｅを生産する最も適した手段である。

【0220】

凍結乾燥プロセスを、凍結乾燥サイクルのさまざまな段階における製剤構成成分の物理的性質の理解に基づいて合理的なアプローチを使用して開発した。Ｔｇ’（凍結濃縮物のガラス転移温度）及びＴｃ（一次乾燥中の崩壊温度）を測定するために示差走査熱量測定（ＤＳＣ）及びフリーズドライ顕微鏡法（ＦＤＭ）を含む熱的性質決定を使用した。下記表で示したサイクルを、プロトタイプバッチＪ７１２８の凍結乾燥のために選択した。アニーリング工程はマンニトールの結晶化を可能にし、確実に一次乾燥中の生成物温度が崩壊温度未満に下がらないようにする。一次乾燥温度を、適度な一次乾燥の継続時間とともにケーク崩壊を避けるよう選択した。水分レベルが＜１％の凍結乾燥ＤＰを生産するために２工程の二次乾燥条件を開発した（例えば、表６を参照）。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図1E】

【図1F】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【配列表】

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