特許 7416686 体細胞を再プログラムするためのＲＮＡレプリコン

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-01-09

(45)【発行日】2024-01-17

(54)【発明の名称】体細胞を再プログラムするためのＲＮＡレプリコン

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/86 20060101AFI20240110BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240110BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20240110BHJP

【ＦＩ】

C12N15/86 Z

C12N5/10

C12N15/12

【請求項の数】 45

(21)【出願番号】P 2020515259

(86)(22)【出願日】2018-09-11

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2020-12-03

(86)【国際出願番号】 EP2018074486

(87)【国際公開番号】W WO2019053012

(87)【国際公開日】2019-03-21

【審査請求日】2021-09-09

(31)【優先権主張番号】PCT/EP2017/073063

(32)【優先日】2017-09-13

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】509146023

【氏名又は名称】バイオエヌテック エスエー

【氏名又は名称原語表記】ＢＩＯＮＴＥＣＨ ＳＥ

【住所又は居所原語表記】Ａｎ ｄｅｒ Ｇｏｌｄｇｒｕｂｅ １２ ５５１３１ Ｍａｉｎｚ Ｇｅｒｍａｎｙ

(73)【特許権者】

【識別番号】515123258

【氏名又は名称】トロン－ トランスラショナル オンコロジー アン デア ウニヴェリジテーツメディツィン デア ヨハネス グーテンベルク－ウニヴェルシテート マインツ ゲマインニューツィゲ ゲーエムベーハー

【氏名又は名称原語表記】ＴＲＯＮ－ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｅ Ｏｎｋｏｌｏｇｉｅ ａｎ ｄｅｒ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｅｔｓｍｅｄｉｚｉｎ ｄｅｒ Ｊｏｈａｎｎｅｓ Ｇｕｔｅｎｂｅｒｇ－Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｅｔ Ｍａｉｎｚ ｇｅｍｅｉｎｎｕｅｔｚｉｇｅ ＧｍｂＨ

【住所又は居所原語表記】Ｆｒｅｉｌｉｇｒａｔｈｓｔｒ． １２ ５５１３１ Ｍａｉｎｚ Ｇｅｒｍａｎｙ

(74)【代理人】

【識別番号】100110928

【弁理士】

【氏名又は名称】速水 進治

(72)【発明者】

【氏名】ポレガノフ， マルコ アレクサンダー

(72)【発明者】

【氏名】ペルコビッチ， マリオ

(72)【発明者】

【氏名】サヒン， ウグル

(72)【発明者】

【氏名】バイセルト， ティム

【審査官】山▲崎▼ 真奈

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１７／０８７７６３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特表２０１５－５１９８９８（ＪＰ，Ａ）

【文献】Naohisa Yoshioka and Steven F. Dowdy，Enhanced generation of iPSCs from older adult human cells by a synthetic five-factor self-replicative RNA，PLOS ONE，2017年07月27日，Vol.12, No.7, Article number e0182018，pp.1-17

【文献】Naohisa Yoshioka et al.，Efficient Generation of Human iPSCs by a Synthetic Self-Replicative RNA，Cell Stem Cell，2013年，Vol.13，pp.246-254

【文献】Noemi FUSAKI et al.，Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome，Proc. Jpn. Acad.，2009年，Vol.85，pp.348-362

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

再プログラミング因子をコードするオープンリーディングフレームと、５'複製認識配列と、を含むＲＮＡレプリコンであって、
前記５'複製認識配列が、天然のアルファウイルス５'複製認識配列と比較して、いかなる開始コドンも含まないことを特徴とする、前記天然のアルファウイルス５'複製認識配列の機能的変異体である、ＲＮＡレプリコン。

【請求項2】

異なる再プログラミング因子をコードする少なくとも１つのさらなるオープンリーディングフレームを含む、請求項１に記載のＲＮＡレプリコン。

【請求項3】

前記再プログラミング因子が、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ｃ－ＭＹＣ、ＬＩＮ２８およびＮＡＮＯＧからなる群より選択される、請求項１または２に記載のＲＮＡレプリコン。

【請求項4】

シスレプリコンまたはトランスレプリコンである、請求項１から３のいずれか一項に記載のＲＮＡレプリコン。

【請求項5】

機能性アルファウイルス非構造タンパク質または再プログラミング因子をコードする第１のオープンリーディングフレームを含む、請求項１から４のいずれか一項に記載のＲＮＡレプリコン。

【請求項6】

前記第１のオープンリーディングフレームが前記５'複製認識配列と重複しない、請求項５に記載のＲＮＡレプリコン。

【請求項7】

前記第１のオープンリーディングフレームの開始コドンが、前記ＲＮＡレプリコンの５'→３'方向で最初の機能的開始コドンである、請求項５または６に記載のＲＮＡレプリコン。

【請求項8】

ＲＮＡレプリコンのセットであって、前記ＲＮＡレプリコンの各々が再プログラミング因子をコードする少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含み、前記ＲＮＡレプリコンのセットが再プログラミング因子のセットをコードし、前記セットの少なくとも１つのＲＮＡレプリコンが、請求項１から７のいずれか一項に記載のＲＮＡレプリコンである、ＲＮＡレプリコンのセット。

【請求項9】

ＲＮＡレプリコンのセットであって、前記ＲＮＡレプリコンの各々が、再プログラミング因子をコードする１つのオープンリーディングフレームを含み、前記ＲＮＡレプリコンのセットが再プログラミング因子のセットをコードし、前記セットの少なくとも１つのＲＮＡレプリコンが、請求項１に記載のＲＮＡレプリコンである、ＲＮＡレプリコンのセット。

【請求項10】

前記再プログラミング因子のセットが、体細胞で発現された場合に、前記体細胞を、幹細胞特性を有する細胞に再プログラムするのに十分である、請求項８または９に記載のＲＮＡレプリコンのセット。

【請求項11】

前記再プログラミング因子のセットが、ＯＣＴ４およびＳＯＸ２を含む、請求項８から１０のいずれか一項に記載のＲＮＡレプリコンのセット。

【請求項12】

前記再プログラミング因子のセットが、ＫＬＦ４および／またはｃ－ＭＹＣをさらに含む、請求項１１に記載のＲＮＡレプリコンのセット。

【請求項13】

前記再プログラミング因子のセットが、ＮＡＮＯＧおよび／またはＬＩＮ２８をさらに含む、請求項１１または１２に記載のＲＮＡレプリコンのセット。

【請求項14】

前記再プログラミング因子のセットが、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４およびｃ－ＭＹＣを含む、請求項８から１２のいずれか一項に記載のＲＮＡレプリコンのセット。

【請求項15】

前記再プログラミング因子のセットが、ＬＩＮ２８をさらに含む、請求項１４に記載のＲＮＡレプリコンのセット。

【請求項16】

前記再プログラミング因子のセットが、ＮＡＮＯＧをさらに含む、請求項１５に記載のＲＮＡレプリコンのセット。

【請求項17】

前記再プログラミング因子のセットが、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧおよびＬＩＮ２８を含む、請求項８から１１および１３のいずれか一項に記載のＲＮＡレプリコンのセット。

【請求項18】

前記セットの各々のＲＮＡレプリコンが、請求項１から７のいずれか一項に記載のＲＮＡレプリコンである、請求項８から１７のいずれか一項に記載のＲＮＡレプリコンのセット。

【請求項19】

請求項１から７のいずれか一項に記載の１つ以上のＲＮＡレプリコンを体細胞に導入する工程を含む、幹細胞特性を有する細胞を生成する方法。

【請求項20】

幹細胞特性を有する細胞を提供する方法であって、
（ｉ）体細胞を含む細胞集団を提供する工程、
（ｉｉ）１つ以上のＲＮＡレプリコンの少なくとも１つのＲＮＡレプリコンが、請求項１から７のいずれか一項に記載のＲＮＡレプリコンであって、前記１つ以上のＲＮＡレプリコンの各々が、機能性アルファウイルス非構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含み、機能性アルファウイルス非構造タンパク質によって複製することができ、および再プログラミング因子をコードする少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含む、前記１つ以上のＲＮＡレプリコンを提供する工程、
（ｉｉｉ）体細胞で発現された場合に、前記体細胞を幹細胞特性を有する細胞に再プログラムするのに十分な再プログラミング因子のセットを前記体細胞が発現するように、前記１つ以上のＲＮＡレプリコンを前記体細胞に導入する工程、ならびに、
（ｉｖ）幹細胞特性を有する細胞の発生を可能にする工程
を含む方法。

【請求項21】

幹細胞特性を有する細胞を提供する方法であって、
（ｉ）体細胞を含む細胞集団を提供する工程、
（ｉｉ）機能性アルファウイルス非構造タンパク質を発現するためのＲＮＡ構築物を提供する工程、
（ｉｉｉ）１つ以上のＲＮＡレプリコンの少なくとも１つのＲＮＡレプリコンが、請求項１から７のいずれか一項に記載のＲＮＡレプリコンであって、前記１つ以上のＲＮＡレプリコンの各々が、機能性アルファウイルス非構造タンパク質によってトランスで複製することができ、および再プログラミング因子をコードする少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含む、前記１つ以上のＲＮＡレプリコンを提供する工程、
（ｉｖ）体細胞で発現された場合に、前記体細胞を幹細胞特性を有する細胞に再プログラムするのに十分な再プログラミング因子のセットを前記体細胞が発現するように、前記ＲＮＡ構築物および前記１つ以上のＲＮＡレプリコンを前記体細胞に導入する工程、ならびに
（ｖ）幹細胞特性を有する細胞の発生を可能にする工程
を含む方法。

【請求項22】

幹細胞特性を有する細胞の発生を可能にする前記工程が、胚性幹細胞培養条件下で前記体細胞を培養することを含む、請求項２０または２１に記載の方法。

【請求項23】

前記１つ以上のＲＮＡレプリコンの各々のＲＮＡレプリコンが、請求項１から７のいずれか一項に記載のＲＮＡレプリコンである、請求項２０から２２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項24】

前記１つ以上のＲＮＡレプリコンが再プログラミング因子のセットをコードする、請求項１９から２３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項25】

前記１つ以上のＲＮＡレプリコンによってコードされる前記再プログラミング因子のセットが、体細胞で発現された場合に、前記体細胞を幹細胞特性を有する細胞に再プログラムするのに十分である、請求項２４に記載の方法。

【請求項26】

前記再プログラミング因子のセットがＯＣＴ４およびＳＯＸ２を含む、請求項２４または２５に記載の方法。

【請求項27】

前記再プログラミング因子のセットがＫＬＦ４および／またはｃ－ＭＹＣをさらに含む、請求項２６に記載の方法。

【請求項28】

前記再プログラミング因子のセットがＮＡＮＯＧおよび／またはＬＩＮ２８をさらに含む、請求項２６または２７に記載の方法。

【請求項29】

前記再プログラミング因子のセットが、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４およびｃ－ＭＹＣを含む、請求項２４から２７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項30】

前記再プログラミング因子のセットが、ＬＩＮ２８をさらに含む、請求項２９に記載の方法。

【請求項31】

前記再プログラミング因子のセットが、ＮＡＮＯＧをさらに含む、請求項２９に記載の方法。

【請求項32】

前記再プログラミング因子のセットが、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧおよびＬＩＮ２８を含む、請求項２４から２６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項33】

前記体細胞の幹細胞特性を有する細胞への再プログラミングを促進するｍｉＲＮＡを前記体細胞に導入することをさらに含む、請求項１９から３２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項34】

少なくとも１つのヒストンデアセチラーゼ阻害剤の存在下で前記体細胞を培養することをさらに含む、請求項１９から３３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項35】

前記少なくとも１つのヒストンデアセチラーゼ阻害剤がバルプロ酸を含む、請求項３４に記載の方法。

【請求項36】

前記幹細胞特性が胚性幹細胞の形態を含む、請求項１９から３５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項37】

前記幹細胞特性を有する細胞が正常な核型を有し、テロメラーゼ活性を発現し、胚性幹細胞に特徴的な細胞表面マーカーを発現し、および／または胚性幹細胞に特徴的な遺伝子を発現する、請求項１９から３６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項38】

前記幹細胞特性を有する細胞が多能性状態を示す、請求項１９から３７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項39】

前記幹細胞特性を有する細胞が、３つの一次胚葉すべての高度派生物に分化する発生能を有する、請求項１９から３８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項40】

前記体細胞が線維芽細胞である、請求項１９から３９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項41】

前記線維芽細胞が、肺線維芽細胞、包皮線維芽細胞または真皮線維芽細胞である、請求項４０に記載の方法。

【請求項42】

前記体細胞がヒト細胞である、請求項１９から４１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項43】

前記１つ以上のＲＮＡレプリコンが、請求項８から１８のいずれか一項に記載のＲＮＡレプリコンのセットを含む、請求項１９から４２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項44】

請求項１から７のいずれか一項に記載のＲＮＡレプリコンまたは請求項８から１８のいずれか一項に記載のＲＮＡレプリコンのセットを含む、細胞。

【請求項45】

（ｉ）請求項１９から４３のいずれか一項に記載の方法を使用して幹細胞特性を有する細胞を提供する工程、および（ｉｉ）分化した細胞型への部分的または完全な分化を誘導または指令する条件下で、前記幹細胞特性を有する細胞を培養する工程を含む、分化細胞型を提供する方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、アルファウイルス起源のレプリカーゼによって複製することができ、再プログラミング因子をコードするオープンリーディングフレームを含むＲＮＡレプリコンを包含する。そのようなＲＮＡレプリコンは、体細胞から幹細胞特性を有する細胞を生成するのに有用であり、特に、１つ以上のＲＮＡレプリコンを体細胞に導入し、その体細胞を培養して細胞を脱分化させることによって、胚または胎児を生成せずに体細胞を幹様細胞などの幹細胞特性、特に多能性を有する細胞に脱分化させる方法において有用である。脱分化させた後、細胞は、神経細胞、造血細胞、筋肉細胞、上皮細胞、および他の細胞型などの同じまたは異なる体細胞型に再分化するように誘導することができる。本発明によって誘導される幹様細胞は、「細胞療法」による変性疾患の治療のための医学的用途を有し、心臓障害、神経障害、内分泌障害、血管障害、網膜障害、皮膚障害、筋骨格障害、および他の疾患の治療における新規治療戦略に利用し得る。

【背景技術】

【0002】

前駆細胞とも呼ばれる幹細胞は、自己複製する能力、未分化状態にとどまる能力、および成熟表現型を有する１つ以上の特殊化した細胞型に分化する能力を持つ細胞である。幹細胞は最終分化しておらず、分化経路の末端にはない。

【0003】

全能性細胞には、胎盤の細胞を含む身体のすべての細胞を作り出すのに必要なすべての遺伝情報が含まれている。ヒト細胞は、受精卵の最初の数回の分裂中にのみ、この分化全能性を有する。全能性細胞が３～４回分裂した後に、細胞がますます特殊化する一連の段階が続く。分裂の次の段階は多能性細胞をもたらし、これは高度に多機能であり、胎盤または子宮の他の支持組織の細胞を除くあらゆる細胞型を生じさせることができる。次の段階で、細胞は複能性になる、すなわち他のいくつかの細胞型を生じさせることができるが、それらの型の数が限られている。胚を作り上げる細胞分裂の長い連鎖の最後にあるのが、特定の機能に永続的に拘束されたとみなされる「最終分化」細胞である。

【0004】

幹細胞には３つの主要な群がある：（ｉ）すべての出生後の生物に存在する成体または体性幹細胞（出生後）、（ｉｉ）前胚または胚発生段階に由来し得る胚性幹細胞、および（ｉｉｉ）発生中の胎児から単離することができる胎児幹細胞（出生前）。

【0005】

ヒト胚性幹細胞の単離および使用を含む幹細胞技術は、医学研究の重要な主題となっている。ヒト胚性幹細胞は、複雑な組織を含む人体のありとあらゆる細胞型に分化する潜在能を有する。細胞の機能障害に起因する多くの疾患は、ヒト胚性幹細胞またはヒト胚性幹細胞由来の細胞の投与による治療に適するであろうと予想される。分化して複数の特殊化した成熟細胞を生じる多能性胚性幹細胞の能力は、損傷または罹患した細胞、組織および臓器を置き換える、修復する、または補完する手段としてのこれらの細胞の潜在的応用を明らかにする。しかし、科学的および倫理的配慮が、中絶胚または体外受精技術を用いて形成された胚から回収された胚性幹細胞を使用する研究の進展を遅らせている。

【0006】

成体幹細胞は低頻度でのみ存在し、制限された分化能と不十分な成長を示す。成体幹細胞の使用に関連するさらなる問題は、これらの細胞が免疫特権を持たないか、または移植後に免疫特権を失い得ることであり、ここで、「免疫特権を持つ」という用語は、レシピエントの免疫系が細胞を異物と認識しない状態を表すために使用される。したがって、成体幹細胞を使用する場合は、ほとんどの場合、自家移植のみが可能である。現在想定されている幹細胞療法の形態の大半は、本質的にカスタマイズされた医療処置であり、したがって、そのような処置に関連する経済的要因が、それらの広範囲にわたる潜在能を制限する。

【0007】

少なくともいくつかの測定された胚特異的遺伝子の発現の回復が、胚性幹細胞との融合後の体細胞で観察されている。しかし、結果として得られる細胞はハイブリッドであり、しばしば四倍体の遺伝子型を有するため、移植目的の正常細胞または組織適合性細胞としては適さない。

【0008】

体細胞核移植の使用は、多能性を採用するように体細胞核含有量を適切に再プログラムすることが示されているが、その道徳的地位を超えた一連の懸念を提起する。卵細胞と導入された核の両方にかかるストレスは非常に大きく、結果として生じる細胞の大きな損失につながる。さらに、この手順は顕微鏡下に手作業で実施しなければならないため、体細胞核移植は非常に資源集約的である。さらに、自身のミトコンドリアＤＮＡを含むドナー細胞のミトコンドリアは取り残されるため、ドナー細胞の遺伝情報のすべてが移植されるわけではない。結果として生じるハイブリッド細胞は、元々卵に属していたミトコンドリア構造を保持する。結果として、クローンは核のドナーの完全なコピーではない。

【0009】

患者由来の多能性細胞に向けた大きな一歩が２００６年にＴａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．によって達成された。幹細胞の多能性を調節し、維持することが公知の定義された転写因子（ＴＦ）（Ｔａｋａｈａｓｉ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｃｅｌｌ １２６，６６３－６７６；Ｓｃｈｕｌｚ＆Ｈｏｆｆｍａｎｎ，２００７，Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃｓ ２，３７－４２）の過剰発現が、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞と称される、マウスの体性線維芽細胞の多能性状態を誘導できることが示された。この試験において著者らは、ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４およびｃ－ＭＹＣがｉＰＳ細胞の生成に必要であると同定した（Ｔａｋａｈａｓｉ ｅｔ ａｌ．，２００６）。その後の試験で、著者らは、同じＴＦが成体ヒト線維芽細胞を再プログラムできることを示した（Ｔａｋａｈａｓｉ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｃｅｌｌ １３１，８６１－８７２）が、他の研究者たちは、ヒト（Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１８，１９１７）またはマウス線維芽細胞（Ｗｅｒｎｉｇ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｎａｔｕｒｅ ４４８，３１８－３２４）に関して、この活性がＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧおよびＬＩＮ２８で構成される改変ＴＦカクテルに起因すると考えた。これらの初期試験およびその後のほとんどの試験では、レトロウイルスまたはレンチウイルスベクターを使用して再プログラミングＴＦが過剰発現された。ウイルスプロモータのサイレンシングに起因して、これらの試験は、再プログラミング過程の間は外因性ＴＦの発現がシャットダウンされることを再現可能に示す（Ｈｏｔｔａ＆Ｅｌｌｉｓ，２００８，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０５，９４０－９４８によって総説されている）。したがって、多能性状態は、活性化された内因性転写因子によって維持される。さらに、ウイルスによって発現されるＴＦのサイレンシングは、その後のｉＰＳ細胞の組織特異的前駆細胞への再分化に必須である（Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，２００７）。ウイルス送達の主要な欠点は、強力な癌遺伝子をコードする組み込み型レトロウイルスの確率的再活性化であり、ｃ－ＭＹＣの場合、これはキメラマウスにおける腫瘍の誘発をもたらした（Ｏｋｉｔａ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｎａｔｕｒｅ ４４８，３１３－３１７）。一方、ｉＰＳ細胞の生成はＭＹＣの非存在下でも可能であることが実証されている（Ｎａｋａｇａｗａ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２６（１），１０１－１０６）。全体として、再プログラミングにはＯＣＴ４とＳＯＸ２のみが不可欠であると報告されており、ＭＹＣやＫＬＦ４のような癌遺伝子はエンハンサーのように働くと考えられる（ＭｃＤｅｖｉｔｔ＆Ｐａｌｅｃｅｋ，２００８，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９，５２７－３３）。したがって、ＳＶ４０ラージＴ抗原またはｈＴＥＲＴのような他の形質転換遺伝子産物がｉＰＳ生成の効率を改善できることが示されている（Ｍａｌｉ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２６，１９９８－２００５）。エピジェネティックな再プログラミングにはクロマチンのリモデリングが含まれるので、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤（バルプロ酸など）またはＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤（５'－ａｚａＣなど）の添加によって再プログラミング効率が大幅に改善され（Ｈｕａｎｇｆｕ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６，７９５－７９７）、ＯＣＴ４およびＳＯＸ２へのＴＦの必要性が低減された（Ｈｕａｎｇｆｕ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６，１２６９－１２７５）。

【0010】

宿主ゲノムへのレトロウイルスの組み込みに関連する危険度を低減するための別の戦略は、再プログラミングに十分な一過性の導入遺伝子発現を媒介する非組み込み型アデノウイルスベクターの使用である（Ｓｔａｄｔｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，２００８，３２２，９４５－９４９）。導入遺伝子の組み込みは、一過性の遺伝子発現をもたらす従来の真核生物発現プラスミドを使用することによっても回避される。これまでのところ、この戦略を用いて、ＭＥＦはｉＰＳ細胞に成功裏に再プログラムされている（Ｏｋｉｔａ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２２，９４９－５３）。この試験ではゲノム組み込みは検出されていないが、トランスフェクトされたプラスミドＤＮＡの細胞のごく一部での安定なゲノム組み込みを完全に排除することはできない。

【0011】

成体ヒト線維芽細胞は、健常ドナーから、または将来の臨床応用では、危険な外科的介入を伴わずに患者から容易に得られる。しかし、最近の試験は、ヒトケラチノサイトがより容易にかつより効率的にｉＰＳ細胞に再プログラムされること、および例えば毛包由来のケラチノサイトは、患者由来のｉＰＳ細胞のより良い選択肢になり得ることを示している（Ａａｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６（１１），１２７６－８４）。

【0012】

分化した体細胞を再プログラムして、脱分化または再プログラムされた細胞を大量にかつ良好な品質で生成するための技術が依然として必要とされている。

【0013】

予防および治療目的のための１つ以上のポリペプチドをコードする外来遺伝子情報を含む核酸分子が、長年にわたって生物医学研究において検討されてきた。デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子の使用に関連する安全性の懸念の影響を受けて、リボ核酸（ＲＮＡ）分子が近年注目を集めている。裸のＲＮＡの形態、または複合体化もしくはパッケージング形態、例えば非ウイルスまたはウイルス送達ビヒクルでの一本鎖または二本鎖ＲＮＡの投与を含む、様々なアプローチが提案されてきた。ウイルスおよびウイルス送達ビヒクルでは、遺伝情報は、典型的にはタンパク質および／または脂質によってカプセル化されている（ウイルス粒子）。例えば、ＲＮＡウイルスに由来する操作されたＲＮＡウイルス粒子が、植物を処理するため（国際公開第２０００／０５３７８０Ａ２号）または哺乳動物のワクチン接種のための（Ｔｕｂｕｌｅｋａｓ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｇｅｎｅ，ｖｏｌ．１９０，ｐｐ．１９１－１９５）送達ビヒクルとして提案されている。一般に、ＲＮＡウイルスは、ＲＮＡゲノムを有する感染性粒子の多様な群である。ＲＮＡウイルスは、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）ウイルスと二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）ウイルスに細分することができ、ｓｓＲＮＡウイルスは、一般にプラス鎖［（＋）鎖］ウイルスおよび／またはマイナス鎖［（－）鎖］ウイルスにさらに分けることができる。プラス鎖ＲＮＡウイルスは、そのＲＮＡが宿主細胞での翻訳の鋳型として直接機能し得るため、生物医学における送達システムとして明らかに魅力的である。

【0014】

アルファウイルスは、プラス鎖ＲＮＡウイルスの典型的な代表例である。アルファウイルスの宿主には、昆虫、魚類、ならびに家畜およびヒトなどの哺乳動物を含む広範囲の生物が含まれる。アルファウイルスは、感染細胞の細胞質で複製する（アルファウイルスの生活環の総説については、Ｊｏｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｆｕｔｕｒｅ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２００９，ｖｏｌ．４，ｐｐ．８３７－８５６参照）。多くのアルファウイルスの総ゲノム長は、典型的には１１，０００～１２，０００ヌクレオチドの範囲であり、ゲノムＲＮＡは、典型的には５'キャップおよび３'ポリ（Ａ）尾部を有する。アルファウイルスのゲノムは、非構造タンパク質（ウイルスＲＮＡの転写、修飾および複製、ならびにタンパク質修飾に関与する）および構造タンパク質（ウイルス粒子を形成する）をコードする。ゲノム内に、典型的には２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が存在する。４つの非構造タンパク質（ｎｓＰ１～ｎｓＰ４）は、典型的にはゲノムの５'末端の近傍から始まる最初のＯＲＦによって一緒にコードされ、一方アルファウイルスの構造タンパク質は、最初のＯＲＦの下流に見出される２番目のＯＲＦによって一緒にコードされ、ゲノムの３'末端の近傍に伸びている。通常、最初のＯＲＦは２番目のＯＲＦよりも大きく、比率はおよそ２：１である。

【0015】

アルファウイルスに感染した細胞では、非構造タンパク質をコードする核酸配列だけがゲノムＲＮＡから翻訳され、一方構造タンパク質をコードする遺伝情報は、真核生物のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ；Ｇｏｕｌｄ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．８７，ｐｐ．１１１－１２４）に類似したＲＮＡ分子であるサブゲノム転写物から翻訳可能である。感染後、すなわちウイルス生活環の初期段階に、（＋）鎖ゲノムＲＮＡは、非構造ポリタンパク質（ｎｓＰ１２３４）をコードするオープンリーディングフレームの翻訳のためにメッセンジャーＲＮＡのように直接作用する。一部のアルファウイルスでは、ｎｓＰ３のコード配列とｎｓＰ４のコード配列との間にオパール終止コドンが存在する：翻訳がオパール終止コドンで終結すると、ｎｓＰ１、ｎｓＰ２およびｎｓＰ３を含むポリタンパク質Ｐ１２３が生成され、さらにｎｓＰ４も含むポリタンパク質Ｐ１２３４がこのオパールコドンの読み取り終了時に生成される（Ｓｔｒａｕｓ＆Ｓｔｒａｕｓｓ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，１９９４，ｖｏｌ．５８，ｐｐ．４９１－５６２；Ｒｕｐｐ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．９６，ｐｐ．２４８３－２５００）。ｎｓＰ１２３４は、ｎｓＰ１２３およびｎｓＰ４断片へと自己タンパク質分解的に切断される。ポリペプチドｎｓＰ１２３およびｎｓＰ４は会合して、（＋）鎖ゲノムＲＮＡを鋳型として使用して、（－）鎖ＲＮＡを転写する（－）鎖レプリカーゼ複合体を形成する。典型的には、後の段階で、ｎｓＰ１２３断片は個別のタンパク質ｎｓＰ１、ｎｓＰ２およびｎｓＰ３に完全に切断される（Ｓｈｉｒａｋｏ＆Ｓｔｒａｕｓｓ，１９９４，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．ｖｏｌ．６８，ｐｐ．１８７４－１８８５）。４つのタンパク質すべてが、ゲノムＲＮＡの（－）鎖相補体を鋳型として使用して、新たな（＋）鎖ゲノムを合成する（＋）鎖レプリカーゼ複合体を形成する（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．３２３，ｐｐ．１５３－１６３、Ｖａｓｉｌｊｅｖａ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．ｖｏｌ．２７８，ｐｐ．４１６３６－４１６４５）。

【0016】

感染細胞では、ｎｓＰ１によってサブゲノムＲＮＡおよび新たなゲノムＲＮＡに５'キャップが与えられ（Ｐｅｔｔｅｒｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８０，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０５，４３５－４４３；Ｒｏｚａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．７３，ｐｐ．２１２９－２１３４）、ｎｓＰ４によってポリアデニル酸［ポリ（Ａ）］尾部が与えられる（Ｒｕｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２００９，ｖｏｌ．３８４，ｐｐ．２０１－２０８）。したがって、サブゲノムＲＮＡとゲノムＲＮＡの両方がメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に類似する。

【0017】

アルファウイルス構造タンパク質（すべてウイルス粒子の成分である、コアヌクレオカプシドタンパク質Ｃ、エンベロープタンパク質Ｅ２およびエンベロープタンパク質Ｅ１）は、典型的にはサブゲノムプロモータの制御下で単一のオープンリーディングフレームによってコードされる（Ｓｔｒａｕｓ＆Ｓｔｒａｕｓｓ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，１９９４，ｖｏｌ．５８，ｐｐ．４９１－５６２）。サブゲノムプロモータは、シスで作用するアルファウイルス非構造タンパク質によって認識される。特に、アルファウイルスレプリカーゼは、ゲノムＲＮＡの（－）鎖相補体を鋳型として使用して（＋）鎖サブゲノム転写物を合成する。（＋）鎖サブゲノム転写物は、アルファウイルス構造タンパク質をコードする（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．３２３，ｐｐ．１５３－１６３、Ｖａｓｉｌｊｅｖａ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．ｖｏｌ．２７８，ｐｐ．４１６３６－４１６４５）。サブゲノムＲＮＡ転写物は、構造タンパク質を１つのポリタンパク質としてコードするオープンリーディングフレームの翻訳のための鋳型として働き、ポリタンパク質は、切断されて構造タンパク質を生成する。宿主細胞でのアルファウイルス感染の後期には、ｎｓＰ２のコード配列内に位置するパッケージングシグナルが、構造タンパク質によってパッケージングされた出芽ビリオンへのゲノムＲＮＡの選択的パッケージングを確実にする（Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，ｖｏｌ．７２，ｐｐ．４３２０－４３２６）。

【0018】

感染細胞では、（－）鎖ＲＮＡの合成は、典型的には感染後最初の３～４時間にのみ観察され、後期段階では検出不能であり、この時点では（＋）鎖ＲＮＡ（ゲノムおよびサブゲノムの両方）の合成のみが観察される。Ｆｒｏｌｏｖ ｅｔ ａｌ．，２００１，ＲＮＡ，ｖｏｌ．７，ｐｐ．１６３８－１６５１によれば、ＲＮＡ合成の調節に関する一般的なモデルは、非構造ポリタンパク質のプロセシングへの依存性を示唆する：非構造ポリタンパク質ｎｓＰ１２３４の最初の切断はｎｓＰ１２３およびｎｓＰ４を生成する；ｎｓＰ４は、（－）鎖合成には活性であるが、（＋）鎖ＲＮＡの生成には非効率的であるＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）として作用する。ｎｓＰ２／ｎｓＰ３接合部での切断を含む、ポリタンパク質ｎｓＰ１２３のさらなるプロセシングは、（＋）鎖ＲＮＡの合成を増加させ、（－）鎖ＲＮＡの合成を減少または終結させるようにレプリカーゼの鋳型特異性を変化させる。

【0019】

アルファウイルスＲＮＡの合成は、４つの保存された配列エレメント（ＣＳＥ；Ｓｔｒａｕｓｓ＆Ｓｔｒａｕｓｓ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，１９９４，ｖｏｌ．５８，ｐｐ．４９１－５６２；およびＦｒｏｌｏｖ，２００１，ＲＮＡ，ｖｏｌ．７，ｐｐ．１６３８－１６５１）を含むシス作用性ＲＮＡエレメントによっても調節される。

【0020】

一般に、アルファウイルスゲノムの５'複製認識配列は、異なるアルファウイルス間での全体的相同性が低いことを特徴とするが、保存された予測二次構造を有する。アルファウイルスゲノムの５'複製認識配列は、翻訳開始に関与するだけでなく、ウイルスＲＮＡの合成に関与する２つの保存された配列エレメント、ＣＳＥ １およびＣＳＥ ２を含む５'複製認識配列も含む。ＣＳＥ １およびＣＳＥ ２の機能にとって、二次構造は直鎖状配列よりも重要であると考えられている（Ｓｔｒａｕｓｓ＆Ｓｔｒａｕｓｓ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，１９９４，ｖｏｌ．５８，ｐｐ．４９１－５６２）。

【0021】

対照的に、アルファウイルスゲノムの３'末端配列、すなわちポリ（Ａ）配列のすぐ上流の配列は、保存された一次構造、特に「１９ヌクレオチド保存配列」とも称される保存された配列エレメント４（ＣＳＥ ４）を特徴とし、これは（－）鎖合成の開始に重要である。

【0022】

「接合配列」とも称されるＣＳＥ ３は、アルファウイルスゲノムＲＮＡの（＋）鎖上の保存された配列エレメントであり、（－）鎖上のＣＳＥ ３の相補体は、サブゲノムＲＮＡ転写のためのプロモータとして働く（Ｓｔｒａｕｓｓ＆Ｓｔｒａｕｓｓ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，１９９４，ｖｏｌ．５８，ｐｐ．４９１－５６２；およびＦｒｏｌｏｖ ｅｔ ａｌ．，２００１，ＲＮＡ，ｖｏｌ．７，ｐｐ．１６３８－１６５１）。ＣＳＥ ３は、典型的にはｎｓＰ４のＣ末端断片をコードする領域と重複する。

【0023】

アルファウイルスタンパク質に加えて、おそらくはタンパク質である宿主細胞因子も、保存された配列エレメントに結合し得る（Ｓｔｒａｕｓｓ＆Ｓｔｒａｕｓｓ、上記）。

【0024】

アルファウイルス由来のベクターは、外来遺伝情報を標的細胞または標的生物に送達するために提案されている。単純なアプローチでは、アルファウイルス構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを、目的のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームに置き換える。アルファウイルスに基づくトランス複製系は、２つの別々の核酸分子上のアルファウイルスヌクレオチド配列エレメントに依存する：一方の核酸分子はウイルスレプリカーゼをコードし（典型的にはポリタンパク質ｎｓＰ１２３４として）、他方の核酸分子は前記レプリカーゼによってトランスで複製されることが可能である（したがってトランス複製系という呼称）。トランス複製には所与の宿主細胞においてこれら両方の核酸分子の存在が必要である。トランスでレプリカーゼによって複製されることができる核酸分子は、アルファウイルスのレプリカーゼによる認識およびＲＮＡ合成を可能にする特定のアルファウイルス配列エレメントを含まなければならない。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0025】

【文献】国際公開第２０００／０５３７８０Ａ２号明細書

【非特許文献】

【0026】

【文献】Ｔａｋａｈａｓｉ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｃｅｌｌ １２６，６６３－６７６

【文献】Ｓｃｈｕｌｚ ＆ Ｈｏｆｆｍａｎｎ，２００７，Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃｓ ２，３７－４２

【文献】Ｔａｋａｈａｓｉ ｅｔ ａｌ．，２００６

【文献】Ｔａｋａｈａｓｉ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｃｅｌｌ １３１，８６１－８７２

【文献】Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１８，１９１７）

【文献】Ｗｅｒｎｉｇ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｎａｔｕｒｅ ４４８，３１８－３２４

【文献】Ｈｏｔｔａ ＆ Ｅｌｌｉｓ，２００８，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０５，９４０－９４８

【文献】Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，２００７

【文献】Ｏｋｉｔａ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｎａｔｕｒｅ ４４８，３１３－３１７

【文献】Ｎａｋａｇａｗａ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２６（１），１０１－１０６

【文献】ＭｃＤｅｖｉｔｔ ＆ Ｐａｌｅｃｅｋ，２００８，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９，５２７－３３

【文献】Ｍａｌｉ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２６，１９９８－２００５

【文献】Ｈｕａｎｇｆｕ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６，７９５－７９７

【文献】Ｈｕａｎｇｆｕ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６，１２６９－１２７５

【文献】Ｓｔａｄｔｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，２００８，３２２，９４５－９４９

【文献】Ｏｋｉｔａ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２２，９４９－５３

【文献】Ａａｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６（１１），１２７６－８４

【文献】Ｔｕｂｕｌｅｋａｓ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｇｅｎｅ，ｖｏｌ．１９０，ｐｐ．１９１－１９５

【文献】Ｊｏｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｆｕｔｕｒｅ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２００９，ｖｏｌ．４，ｐｐ．８３７－８５６

【文献】Ｇｏｕｌｄ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．８７，ｐｐ．１１１－１２４

【文献】Ｓｔｒａｕｓ ＆ Ｓｔｒａｕｓｓ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，１９９４，ｖｏｌ．５８，ｐｐ．４９１－５６２

【文献】Ｒｕｐｐ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．９６，ｐｐ．２４８３－２５００

【文献】Ｓｈｉｒａｋｏ ＆ Ｓｔｒａｕｓｓ，１９９４，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．ｖｏｌ．６８，ｐｐ．１８７４－１８８５

【文献】Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．３２３，ｐｐ．１５３－１６３

【文献】Ｖａｓｉｌｊｅｖａ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．ｖｏｌ．２７８，ｐｐ．４１６３６－４１６４５

【文献】Ｐｅｔｔｅｒｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８０，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０５，４３５－４４３

【文献】Ｒｏｚａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．７３，ｐｐ．２１２９－２１３４

【文献】Ｒｕｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２００９，ｖｏｌ．３８４，ｐｐ．２０１－２０８

【文献】Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，ｖｏｌ．７２，ｐｐ．４３２０－４３２６

【文献】Ｆｒｏｌｏｖ ｅｔ ａｌ．，２００１，ＲＮＡ，ｖｏｌ．７，ｐｐ．１６３８－１６５１

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0027】

本明細書に記載されるように、本発明の態様および実施形態は、分化した体細胞を再プログラミングして脱分化または再プログラムされた細胞を大量にかつ良好な品質で生成する技術を提供する必要性に対処する。

【課題を解決するための手段】

【0028】

本発明は、再プログラミング因子をコードするＲＮＡレプリコンを使用して、再プログラムされた細胞を生成する技術を提供する。これらの技術は、無制限の量で容易にかつ安価に得られる細胞を使用し、細胞療法に有用な再プログラムされた細胞を提供する。本発明によるアプローチは、宿主ゲノムの改変を伴わない再プログラミングの可能性を切り開く。

【0029】

本発明は、適切な因子が提供されると、最終分化細胞の運命を多能性へとリダイレクトできるという事実を利用する。具体的には、本発明は、動物分化体細胞を幹細胞特性を有する細胞に再プログラムするための技術を提供する。この方法は、１つの種類の体細胞を、インビトロで定義された系を使用して多能性幹様細胞に脱分化させることを可能にする。本発明の方法は、一実施形態では、最初の体細胞試料を提供した同じ個体における細胞移植のための自己（同系）細胞型を提供する。

【0030】

本発明によれば、１つ以上の体細胞に、幹細胞特性を有する細胞への体細胞の再プログラミングを誘導する１つ以上の因子を発現することができる１つ以上のＲＮＡレプリコンが提供される。これらの因子の発現は、体細胞に未分化細胞の特性を付与し、体細胞の再プログラミングを促進する。

【0031】

様々な種類のＲＮＡレプリコンが本発明に従って有用である。１つの種類のＲＮＡレプリコンでは、アルファウイルス構造タンパク質をコードするアルファウイルス由来のＲＮＡベクターのオープンリーディングフレームが、再プログラミング因子をコードするオープンリーディングフレームで置き換えられている。それぞれのレプリコンを「シスレプリコン；ＷＴ－ＲＲＳ」として図１に示す。本発明による他の種類のＲＮＡレプリコンは、アルファウイルスに基づくトランス複製系に関連する。それぞれのレプリコンを「トランスレプリコン；ＷＴ－ＲＲＳ」として図１に示す。そのようなレプリコンは、サブゲノムプロモータの制御下で再プログラミング因子をコードするオープンリーディングフレームの増幅を可能にするという利点に結び付く。

【0032】

ｎｓＰ１２３４をコードするオープンリーディングフレームは、典型的にはアルファウイルスゲノムの５'複製認識配列（ｎｓＰ１のコード配列）と重複し、また典型的にはＣＳＥ ３を含むサブゲノムプロモータ（ｎｓＰ４のコード配列）とも重複する。したがって、そのような「トランスレプリコン」では、ＲＮＡ複製に必要な５'複製認識配列はｎｓＰ１のＡＵＧ開始コドンを含み、そのためアルファウイルス非構造タンパク質のＮ末端断片のコード配列と重複し、５'複製認識配列を含むレプリコンは、典型的には（少なくとも）アルファウイルス非構造タンパク質の一部、典型的にはｎｓＰ１のＮ末端断片をコードする。これはいくつかの面で不利である：シスレプリコンの場合、この重複は、例えば異なる哺乳動物標的細胞（ヒト、マウス、家畜）へのレプリカーゼＯＲＦのコドン使用頻度の適合を制限する。ウイルスに見出される５'複製認識配列の二次構造は、あらゆる標的細胞において最適というわけではないと考えられる。しかし、レプリカーゼＯＲＦで生じる可能性のあるアミノ酸変化を考慮し、レプリカーゼ機能への影響を試験しなければならないので、二次構造を自由に改変することはできない。また、完全なレプリカーゼＯＲＦを異種起源からのレプリカーゼに交換することは不可能であり、というのは、これが５'複製認識配列構造の破壊をもたらし得るためである。トランスレプリコンの場合、５'複製認識配列をトランスレプリコン内に保持する必要があるため、この重複はｎｓＰ１タンパク質の断片の合成をもたらす。ｎｓＰ１の断片は、典型的には必要なく、望ましくない：望ましくない翻訳は宿主細胞に不必要な負担を課し、薬学的に活性なタンパク質に加えてｎｓＰ１の断片をコードする治療適用のためのＲＮＡレプリコンは、規制上の懸念に直面する可能性がある。例えば、トランケートされたｎｓＰ１が望ましくない副作用を引き起こさないことを実証する必要がある。さらに、５'複製認識配列内のｎｓＰ１のＡＵＧ開始コドンの存在は、目的の遺伝子の翻訳のための開始コドンがリボソーム翻訳開始にアクセス可能な最も５'側の位置にあるように、目的の異種遺伝子をコードするトランスレプリコンを設計することを妨げてきた。これが次に、ｎｓＰ１の開始コドンとインフレームで融合タンパク質としてクローニングされない限り、先行技術のトランスレプリコンＲＮＡからの導入遺伝子の５'キャップ依存性翻訳を困難にしている（そのような融合構築物は、例えばＭｉｃｈｅｌ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．３６２，ｐｐ．４７５－４８７によって記載されている）。そのような融合構築物は、上記のｎｓＰ１断片の同じ不必要な翻訳をもたらし、上記と同じ懸念を生じさせる。さらに、融合タンパク質は、目的の融合した導入遺伝子の機能もしくは活性を変化させ得るため、またはワクチンベクターとして使用した場合、融合領域にまたがるペプチドが融合した抗原の免疫原性を改変し得るため、さらなる懸念を引き起こす。

【0033】

したがって、本発明は、レプリカーゼによる複製に必要な配列エレメントを含むさらなる種類のＲＮＡレプリコンを提供するが、これらの配列エレメントは、アルファウイルス非構造タンパク質またはその断片などのいかなるタンパク質またはその断片もコードしない。したがって、レプリカーゼによる複製に必要な配列エレメントとタンパク質コード領域は結合していない。それぞれのレプリコンを「トランスレプリコン；Δ５ＡＴＧ－ＲＲＳΔＳＧＰ」として図１に示す。結合解除は、天然のアルファウイルスゲノムＲＮＡと比較して少なくとも１つの開始コドンを除去することによって達成される。レプリカーゼは、ＲＮＡレプリコンによってまたは別個の核酸分子によってコードされ得る。１つの特に好ましい実施形態では、そのようなレプリコンはサブゲノムプロモータを含まず、および再プログラミング因子をコードするオープンリーディングフレームの翻訳のための開始コドンは、リボソーム翻訳開始にアクセス可能な最も５'側の位置にある。

【0034】

第１の態様では、本発明は、再プログラミング因子をコードするオープンリーディングフレームを含むＲＮＡレプリコンを提供する。一実施形態では、ＲＮＡレプリコンは、同じまたは異なる再プログラミング因子をコードする１つ以上のさらなるオープンリーディングフレームを含む。一実施形態では、ＲＮＡレプリコンは、体細胞を、幹細胞特性を有する細胞に再プログラムするのに有用な再プログラミング因子のセットである再プログラミング因子の機能的セット、すなわち体細胞で発現された場合に、幹細胞特性を有する細胞への体細胞の再プログラミングを生じさせるのに十分である再プログラミング因子のセットをコードするオープンリーディングフレームを含む。

【0035】

一実施形態では、再プログラミング因子は、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ｃ－ＭＹＣ、ＬＩＮ２８およびＮＡＮＯＧからなる群より選択される。

【0036】

一実施形態では、ＲＮＡレプリコンは、シスレプリコンまたはトランスレプリコンである。

【0037】

一実施形態では、ＲＮＡレプリコンは、機能性アルファウイルス非構造タンパク質または再プログラミング因子をコードする第１のオープンリーディングフレームを含む。

【0038】

一実施形態では、ＲＮＡレプリコンは５'複製認識配列を含み、この５'複製認識配列は、天然のアルファウイルス５'複製認識配列と比較して少なくとも１つの開始コドンの除去を含むことを特徴とする。

【0039】

一実施形態では、第１のオープンリーディングフレームは５'複製認識配列と重複しない。

【0040】

一実施形態では、第１のオープンリーディングフレームの開始コドンは、ＲＮＡレプリコンの５'→３'方向で最初の機能的開始コドンである。

【0041】

一実施形態では、特にＲＮＡレプリコンがシスレプリコンである場合、ＲＮＡレプリコンは、機能性アルファウイルス非構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む。ＲＮＡレプリコンは、１つ以上の再プログラミング因子をコードする１つ以上のオープンリーディングフレームを含み得る。

【0042】

一実施形態では、特にＲＮＡレプリコンがトランスレプリコンである場合、ＲＮＡレプリコンは、機能性アルファウイルス非構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含まない。この実施形態では、レプリコンの複製のための機能性アルファウイルス非構造タンパク質は、本明細書に記載されるようにトランスで提供され得る。ＲＮＡレプリコンは、１つ以上の再プログラミング因子をコードする１つ以上のオープンリーディングフレームを含み得る。したがって、一実施形態では、ＲＮＡレプリコンは、１つの再プログラミング因子をコードする１つのオープンリーディングフレームのみを含み得る。そのようなＲＮＡレプリコンのいくつかは、本明細書に記載されるＲＮＡレプリコンの機能的セットなどのＲＮＡレプリコンのセットを形成し得る。

【0043】

一実施形態では、ＲＮＡレプリコンは、目的のタンパク質、例えば機能性アルファウイルス非構造タンパク質または再プログラミング因子をコードする第１のオープンリーディングフレームを含む。一実施形態では、第１のオープンリーディングフレームは５'複製認識配列と重複しない。

【0044】

ＲＮＡレプリコンがシスレプリコンである場合、第１のオープンリーディングは一般に、機能性アルファウイルス非構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームである。この実施形態では、ＲＮＡレプリコンは一般に、サブゲノムプロモータの制御下にある再プログラミング因子をコードする少なくとも１つのさらなるオープンリーディングフレームを含む。ＲＮＡレプリコンがトランスレプリコンである場合、第１のオープンリーディングは一般に、再プログラミング因子をコードするオープンリーディングであり、ＲＮＡレプリコンは、好ましくは機能性アルファウイルス非構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含まない。

【0045】

一実施形態では、ＲＮＡレプリコンは、（修飾された）５'複製認識配列、および５'複製認識配列の下流に位置する、目的のタンパク質、例えば機能性アルファウイルス非構造タンパク質または再プログラミング因子をコードする第１のオープンリーディングフレームを含み、５'複製認識配列と目的のタンパク質をコードする第１のオープンリーディングフレームは重複せず、好ましくは５'複製認識配列はＲＮＡレプリコンのいずれのオープンリーディングフレームとも重複せず、例えば５'複製認識配列は機能的開始コドンを含まず、好ましくはいかなる開始コドンも含まない。最も好ましくは、第１のオープンリーディングフレームの開始コドンは、ＲＮＡレプリコンの５'→３'方向で最初の機能的開始コドン、好ましくは最初の開始コドンである。一実施形態では、第１のオープンリーディングフレームおよび好ましくはＲＮＡレプリコン全体が、アルファウイルス非構造タンパク質の断片、特にｎｓＰ１および／またはｎｓＰ４の断片などの非機能性アルファウイルス非構造タンパク質を発現しない。一実施形態では、機能性アルファウイルス非構造タンパク質は５'複製認識配列に対して異種である。一実施形態では、第１のオープンリーディングフレームはサブゲノムプロモータの制御下にない。

【0046】

一実施形態では、第１のオープンリーディングフレームは機能性アルファウイルス非構造タンパク質をコードし、ＲＮＡレプリコンは、サブゲノムプロモータの制御下にある再プログラミング因子をコードする少なくとも１つのさらなるオープンリーディングフレームを含む。一実施形態では、サブゲノムプロモータと第１のオープンリーディングフレームは重複しない。

【0047】

別の実施形態では、第１のオープンリーディングフレームは再プログラミング因子をコードし、ＲＮＡレプリコンは、好ましくは機能性アルファウイルス非構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含まない。ＲＮＡレプリコンは、サブゲノムプロモータの制御下にある１つ以上の再プログラミング因子（例えば第１のオープンリーディングフレームによってコードされる再プログラミング因子と共に、再プログラミング因子の機能的セットを形成する１つ以上の再プログラミング因子）をコードする少なくとも１つのさらなるオープンリーディングフレームを含み得る。一実施形態では、サブゲノムプロモータと第１のオープンリーディングフレームは重複しない。

【0048】

１つの特に好ましい実施形態では、５'複製認識配列の下流に位置する第１のオープンリーディングフレームは再プログラミング因子をコードし、５'複製認識配列と第１のオープンリーディングフレームは重複せず、５'複製認識配列は機能的開始コドンを含まず、好ましくはいかなる開始コドンも含まず、およびＲＮＡレプリコンは機能性アルファウイルス非構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含まない。この実施形態では、第１のオープンリーディングフレームの開始コドンは、ＲＮＡレプリコンがアルファウイルス非構造タンパク質の断片、特にｎｓＰ１および／またはｎｓＰ４の断片などの非機能性アルファウイルス非構造タンパク質を発現しないように、ＲＮＡレプリコンの５'→３'方向で最初の機能的開始コドン、好ましくは最初の開始コドンである。ＲＮＡレプリコンは、サブゲノムプロモータの制御下にある１つ以上の再プログラミング因子（例えば第１のオープンリーディングフレームによってコードされる再プログラミング因子と共に、再プログラミング因子の機能的セットを形成する１つ以上の再プログラミング因子）をコードする少なくとも１つのさらなるオープンリーディングフレームを含み得る。一実施形態では、サブゲノムプロモータと第１のオープンリーディングフレームは重複しない。

【0049】

一実施形態では、少なくとも１つの開始コドンの除去を特徴とするＲＮＡレプリコンの５'複製認識配列は、アルファウイルスの５'末端の約２５０ヌクレオチドの相同な配列を含む。好ましい実施形態では、前記５'複製認識配列は、アルファウイルスの５'末端の約３００～５００ヌクレオチドに相同な配列を含む。好ましい実施形態では、前記５'複製認識配列は、ベクター系にとっての親である特定のアルファウイルス種の効率的な複製に必要な５'末端配列を含む。

【0050】

一実施形態では、ＲＮＡレプリコンの５'複製認識配列は、アルファウイルスの保存された配列エレメント１（ＣＳＥ １）および保存された配列エレメント２（ＣＳＥ ２）に相同な配列を含む。

【0051】

好ましい実施形態では、ＲＮＡレプリコンはＣＳＥ ２を含み、アルファウイルス由来の非構造タンパク質のオープンリーディングフレームの断片を含むことをさらに特徴とする。より好ましい実施形態では、非構造タンパク質のオープンリーディングフレームの前記断片は、いかなる開始コドンも含まない。

【0052】

一実施形態では、５'複製認識配列は、アルファウイルス由来の非構造タンパク質のオープンリーディングフレームまたはその断片に相同な配列を含み、アルファウイルス由来の非構造タンパク質のオープンリーディングフレームまたはその断片に相同な配列は、天然のアルファウイルス配列と比較して少なくとも１つの開始コドンの除去を含むことを特徴とする。

【0053】

好ましい実施形態では、アルファウイルス由来の非構造タンパク質のオープンリーディングフレームまたはその断片に相同な配列は、少なくとも非構造タンパク質のオープンリーディングフレームの天然開始コドンの除去を含むことを特徴とする。

【0054】

好ましい実施形態では、アルファウイルス由来の非構造タンパク質のオープンリーディングフレームまたはその断片に相同な配列は、非構造タンパク質のオープンリーディングフレームの天然開始コドン以外の１つ以上の開始コドンの除去を含むことを特徴とする。より好ましい実施形態では、前記核酸配列は、非構造タンパク質、好ましくはｎｓＰ１のオープンリーディングフレームの天然開始コドンの除去をさらに特徴とする。

【0055】

好ましい実施形態では、５'複製認識配列は、ＲＮＡレプリコンに関する５'複製認識配列の機能性を提供する１つ以上のステムループを含む。好ましい実施形態では、５'複製認識配列の１つ以上のステムループは欠失または破壊されない。より好ましくは、ステムループ１、３および４のうちの１つ以上、好ましくはステムループ１、３および４のすべて、またはステムループ３および４は、欠失または破壊されない。より好ましくは、５'複製認識配列のステムループのいずれも欠失または破壊されない。

【0056】

好ましい実施形態では、ＲＮＡレプリコンは、少なくとも１つの開始コドンの除去によって導入された１つ以上のステムループ内のヌクレオチド対合破壊を補償する１つ以上のヌクレオチド変化を含む。

【0057】

一実施形態では、ＲＮＡレプリコンは、トランケートされたアルファウイルス非構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含まない。

【0058】

一実施形態では、ＲＮＡレプリコンは３'複製認識配列を含む。

【0059】

一実施形態では、ＲＮＡレプリコンは、第１のオープンリーディングフレームによってコードされる目的のタンパク質がＲＮＡレプリコンから鋳型として発現され得ることを特徴とする。一実施形態では、ＲＮＡレプリコンは、第１のオープンリーディングフレームを含むサブゲノムＲＮＡの産生を制御するサブゲノムプロモータを含む。

【0060】

一実施形態では、ＲＮＡレプリコンは、サブゲノムプロモータを含むことを特徴とする。典型的には、サブゲノムプロモータは、目的のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含むサブゲノムＲＮＡの産生を制御する。

【0061】

一実施形態では、第１のオープンリーディングフレームによってコードされる目的のタンパク質は、ＲＮＡレプリコンから鋳型として発現され得る。より好ましい実施形態では、第１のオープンリーディングフレームによってコードされる目的のタンパク質は、サブゲノムＲＮＡからさらに発現され得る。

【0062】

好ましい実施形態では、ＲＮＡレプリコンは、目的のタンパク質をコードする第２のオープンリーディングフレームを含むサブゲノムＲＮＡの産生を制御するサブゲノムプロモータを含むことをさらに特徴とする。目的のタンパク質は、第１のオープンリーディングフレームによってコードされる目的のタンパク質と同一または異なる第２のタンパク質であり得る。

【0063】

より好ましい実施形態では、サブゲノムプロモータおよび目的のタンパク質をコードする第２のオープンリーディングフレームは、目的のタンパク質をコードする第１のオープンリーディングフレームの下流に位置する。

【0064】

一実施形態では、ＲＮＡレプリコンは、機能性アルファウイルス非構造タンパク質によって複製され得る。

【0065】

第２の態様では、本発明は、ＲＮＡレプリコンのセット、すなわち少なくとも２つ、例えば２、３、４、５、６またはさらにそれ以上のＲＮＡレプリコンを含むセットを提供し、ＲＮＡレプリコンの各々は、再プログラミング因子をコードする少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含み、ＲＮＡレプリコンのセットは、再プログラミング因子のセットをコードする。

【0066】

一実施形態では、ＲＮＡレプリコンの各々は、再プログラミング因子をコードする１つのオープンリーディングフレームを含む。

【0067】

一実施形態では、再プログラミング因子のセットは、再プログラミング因子の機能的セットである、すなわち体細胞を、幹細胞特性を有する細胞に再プログラムするのに有用および／または十分である。

【0068】

一実施形態では、再プログラミング因子のセットは、ＯＣＴ４およびＳＯＸ２を含む。一実施形態では、再プログラミング因子のセットは、ＫＬＦ４および／またはｃ－ＭＹＣをさらに含む。一実施形態では、再プログラミング因子のセットは、ＮＡＮＯＧおよび／またはＬＩＮ２８をさらに含む。

【0069】

一実施形態では、再プログラミング因子のセットは、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４およびｃ－ＭＹＣを含む。一実施形態では、再プログラミング因子のセットは、ＬＩＮ２８および場合によりＮＡＮＯＧをさらに含む。

【0070】

一実施形態では、再プログラミング因子のセットは、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧおよびＬＩＮ２８を含む。

【0071】

一実施形態では、セットの少なくとも１つのＲＮＡレプリコンは、本発明によるＲＮＡレプリコンである。一実施形態では、セットの各ＲＮＡレプリコンは、本発明によるＲＮＡレプリコンである。

【0072】

第３の態様では、本発明は、
機能性アルファウイルス非構造タンパク質を発現するためのＲＮＡ構築物、
機能性アルファウイルス非構造タンパク質によってトランスで複製され得る、本発明の第１の態様によるＲＮＡレプリコンまたは本発明の第２の態様によるＲＮＡレプリコンのセット
を含む系を提供する。好ましくは、ＲＮＡレプリコンまたはＲＮＡレプリコンのセットは、機能性アルファウイルス非構造タンパク質をコードしないことをさらに特徴とする。

【0073】

一実施形態では、第１の態様によるＲＮＡレプリコン、第２の態様によるＲＮＡレプリコンのセット、または第３の態様による系は、アルファウイルスがベネズエラウマ脳炎ウイルスであることを特徴とする。

【0074】

第４の態様では、本発明は、第１の態様によるＲＮＡレプリコン、第２の態様によるＲＮＡレプリコンのセット、または第３の態様による系をコードする核酸配列を含むＤＮＡ（すなわち１つ以上のＤＮＡ分子）を提供する。

【0075】

さらなる態様では、本発明は、本発明による１つ以上のＲＮＡレプリコンを体細胞に導入する工程を含む、幹細胞特性を有する細胞を生成する方法を提供する。

【0076】

さらなる態様では、本発明は、幹細胞特性を有する細胞を提供する方法であって、
（ｉ）体細胞を含む細胞集団を提供する工程、
（ｉｉ）各々が、機能性アルファウイルス非構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含み、機能性アルファウイルス非構造タンパク質によって複製することができ、および再プログラミング因子をコードする少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含む、１つ以上のＲＮＡレプリコンを提供する工程、
（ｉｉｉ）細胞が、体細胞を幹細胞特性を有する細胞に再プログラムするのに有用な再プログラミング因子のセットを発現するように、１つ以上のＲＮＡレプリコンを体細胞に導入する工程、ならびに
（ｉｖ）幹細胞特性を有する細胞の発生を可能にする工程
を含む方法を提供する。

【0077】

さらなる態様では、本発明は、幹細胞特性を有する細胞を提供する方法であって、
（ｉ）体細胞を含む細胞集団を提供する工程、
（ｉｉ）機能性アルファウイルス非構造タンパク質を発現するためのＲＮＡ構築物を提供する工程、
（ｉｉｉ）各々が、機能性アルファウイルス非構造タンパク質によってトランスで複製することができ、および再プログラミング因子をコードする少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含む、１つ以上のＲＮＡレプリコンを提供する工程、
（ｉｖ）細胞が、体細胞を幹細胞特性を有する細胞に再プログラムするのに有用な再プログラミング因子のセットを発現するように、ＲＮＡ構築物および１つ以上のＲＮＡレプリコンを体細胞に導入する工程、ならびに
（ｖ）幹細胞特性を有する細胞の発生を可能にする工程
を含む方法を提供する。

【0078】

本発明によれば、機能性アルファウイルス非構造タンパク質を発現するための１つ以上のＲＮＡレプリコンおよび場合によりＲＮＡ構築物は、好ましくはエレクトロポレーションまたはリポフェクションによって体細胞に導入される。

【0079】

一実施形態では、ＲＮＡレプリコンは、再プログラミング因子の機能的セットをコードするオープンリーディングフレームを含む。一実施形態では、異なるＲＮＡレプリコンは、異なる再プログラミング因子をコードするオープンリーディングフレームを含む。後者の実施形態では、これらの異なるＲＮＡレプリコンは、同じ時点または異なる時点で（場合により機能性アルファウイルス非構造タンパク質を発現するためのＲＮＡ構築物と共に）細胞に同時導入されて、再プログラミング因子の機能的セットを提供し得る。

【0080】

一実施形態では、細胞は再プログラミング因子（１つまたは複数）を発現する。

【0081】

一実施形態では、１つ以上のＲＮＡレプリコンは、再プログラミング因子のセットをコードする。

【0082】

一実施形態では、１つ以上のＲＮＡレプリコンの各々は、再プログラミング因子をコードする１つのオープンリーディングフレームを含む。

【0083】

一実施形態では、１つ以上のＲＮＡレプリコンによってコードされる再プログラミング因子のセットは、再プログラミング因子の機能的セット、すなわち体細胞を、幹細胞特性を有する細胞に再プログラムするのに有用および／または十分な再プログラミング因子のセットである。

【0084】

一実施形態では、再プログラミング因子のセットは、ＯＣＴ４およびＳＯＸ２を含む。一実施形態では、再プログラミング因子のセットは、ＫＬＦ４および／またはｃ－ＭＹＣをさらに含む。一実施形態では、再プログラミング因子のセットは、ＮＡＮＯＧおよび／またはＬＩＮ２８をさらに含む。

【0085】

一実施形態では、再プログラミング因子のセットは、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４およびｃ－ＭＹＣを含む。一実施形態では、再プログラミング因子のセットは、ＬＩＮ２８および場合によりＮＡＮＯＧをさらに含む。

【0086】

一実施形態では、再プログラミング因子のセットは、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧおよびＬＩＮ２８を含む。

【0087】

一実施形態では、本発明の方法は、幹細胞特性を有する細胞への体細胞の再プログラミングを促進するｍｉＲＮＡを体細胞に導入することをさらに含む。

【0088】

一実施形態では、本発明の方法は、少なくとも１つのヒストンデアセチラーゼ阻害剤の存在下で体細胞を培養することをさらに含む。一実施形態では、少なくとも１つのヒストンデアセチラーゼ阻害剤はバルプロ酸を含む。

【0089】

一実施形態では、幹細胞特性を有する細胞の発生を可能にする工程は、胚性幹細胞培養条件下、好ましくは多能性幹細胞を未分化状態に維持するのに適した条件下で体細胞を培養することを含む。

【0090】

一実施形態では、幹細胞特性は胚性幹細胞形態を含み、前記胚性幹細胞形態は、好ましくは、コンパクトなコロニー、高い核対細胞質比および顕著な核小体からなる群より選択される形態学的基準を含む。特定の実施形態では、幹細胞特性を有する細胞は、正常な核型を有し、テロメラーゼ活性を発現し、胚性幹細胞に特徴的な細胞表面マーカーを発現し、および／または胚性幹細胞に特徴的な遺伝子を発現する。胚性幹細胞に特徴的な細胞表面マーカーは、発生段階特異的胎児性抗原３（ＳＳＥＡ－３）、ＳＳＥＡ－４、腫瘍関連抗原１－６０（ＴＲＡ－１－６０）、ＴＲＡ－１－８１、およびＴＲＡ－２－４９／６Ｅからなる群より選択でき、胚性幹細胞に特徴的な遺伝子は、内因性ＯＣＴ４、内因性ＮＡＮＯＧ、増殖分化因子３（ＧＤＦ３）、発現抑制１（ＲＥＸ１）、線維芽細胞増殖因子４（ＦＧＦ４）、胚細胞特異的遺伝子１（ＥＳＧ１）、発生多能性関連２（ＤＰＰＡ２）、ＤＰＰＡ４、およびテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）からなる群より選択し得る。

【0091】

一実施形態では、幹細胞特性を有する細胞は、脱分化および／または再プログラムされた体細胞である。好ましくは、幹細胞特性を有する細胞は、多能性状態などの胚性幹細胞の本質的な特性を示す。好ましくは、幹細胞特性を有する細胞は、３つの一次胚葉すべての高度派生物に分化する発生能を有する。一実施形態では、一次胚葉は内胚葉であり、高度派生物は腸様上皮組織である。さらなる実施形態では、一次胚葉は中胚葉であり、高度派生物は横紋筋および／または軟骨である。なおさらなる実施形態では、一次胚葉は外胚葉であり、高度派生物は神経組織および／または表皮組織である。１つの好ましい実施形態では、幹細胞特性を有する細胞は、神経細胞および／または心臓細胞に分化する発生能を有する。

【0092】

一実施形態では、体細胞は、間葉表現型を有する胚性幹細胞由来の体細胞である。好ましい実施形態では、体細胞は、胎児線維芽細胞もしくは出生後線維芽細胞などの線維芽細胞、またはケラチノサイト、好ましくは毛包由来のケラチノサイトである。さらなる実施形態では、線維芽細胞は、肺線維芽細胞、包皮線維芽細胞または真皮線維芽細胞である。特定の実施形態では、線維芽細胞は、カタログ番号ＣＣＬ－１８６の下にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託されている、またはカタログ番号ＣＲＬ－２０９７の下にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託されている線維芽細胞である。一実施形態では、線維芽細胞は成人皮膚線維芽細胞である。好ましくは、体細胞はヒト細胞である。本発明によれば、体細胞は遺伝的に改変されていてもよい。

【0093】

一実施形態では、１つ以上のＲＮＡレプリコンのうちの少なくとも１つのＲＮＡレプリコンは、本発明によるＲＮＡレプリコンである。一実施形態では、１つ以上のＲＮＡレプリコンの各ＲＮＡレプリコンは、本発明によるＲＮＡレプリコンである。一実施形態では、１つ以上のＲＮＡレプリコンは、本発明によるＲＮＡレプリコンのセットを含む。

【0094】

本発明の方法の特定の実施形態は、幹細胞特性を有する細胞を培養する、増殖させるおよび凍結保存する工程の１つ以上をさらに含む。

【0095】

さらなる態様では、本発明は、本発明の方法によって生成される、幹細胞特性を有する細胞を提供する。一実施形態では、細胞は組換え細胞である。

【0096】

さらなる態様では、本発明は、１つ以上の再プログラミング因子をコードするオープンリーディングフレーム（１つまたは複数）を含む本発明の１つ以上のＲＮＡレプリコンを含む、１つ以上の再プログラミング因子、好ましくは再プログラミング因子の機能的セットを発現する細胞を提供する。本発明はまた、そのような細胞の集団も提供する。

【0097】

さらなる態様では、本発明は、（ｉ）本発明の方法を使用して幹細胞特性を有する細胞を提供する工程、および（ｉｉ）分化した細胞型への部分的または完全な分化を誘導または指令する条件下で、幹細胞特性を有する細胞を培養する工程を含む、分化細胞型を提供する方法を提供する。

【0098】

さらなる態様では、本発明は、分化した細胞型への部分的または完全な分化を誘導または指令する条件下で、本発明の幹細胞特性を有する細胞を培養する工程を含む、分化細胞型を提供する方法に関する。

【0099】

一実施形態では、分化した細胞型への部分的または完全な分化を誘導または指令する条件は、少なくとも１つの分化因子の存在を含む。好ましくは、本発明に従って得られる分化細胞の体細胞型は、脱分化に使用される体細胞の体細胞型とは異なる。好ましくは、脱分化細胞は線維芽細胞に由来し、前記再分化細胞型は線維芽細胞とは異なる。別の実施形態では、脱分化細胞はケラチノサイトに由来し、前記再分化細胞型はケラチノサイトとは異なる。

【0100】

さらなる態様では、本発明は、第１の態様によるＲＮＡレプリコン、第２の態様によるＲＮＡレプリコンのセット、または第３の態様による系を含む、幹細胞特性を有する細胞を生成するためのキットに関する。キットは、胚性幹細胞培養培地をさらに含み得る。

【0101】

さらなる態様では、本発明は、本発明の幹細胞特性を有する細胞を含む、例えば各ＲＮＡレプリコンが再プログラミング因子の機能的セットの再プログラミング因子の１つをコードする、本発明のＲＮＡレプリコンのセットを含む医薬組成物を提供する。

【0102】

なおさらなる態様では、本発明は、第１の態様によるＲＮＡレプリコン、第２の態様によるＲＮＡレプリコンのセット、または第３の態様による系を含む医薬組成物に関する。

【0103】

さらなる態様では、本発明は、薬剤として使用するための本発明の医薬組成物を提供する。

【0104】

さらなる態様では、本発明は、医学、特に移植医学における本発明の細胞または医薬組成物の使用に関する。

【0105】

さらなる態様では、本発明は、本発明の医薬組成物の治療有効量を被験体に投与することを含む、疾患の治療方法を提供する。

【0106】

さらなる態様では、本発明は、疾患を有する被験体を治療する方法であって、本発明の方法によって生成される幹細胞特性を有する細胞を被験体に投与することを含む方法を提供する。

【0107】

一実施形態では、細胞は、被験体に対して自己由来、同種異系または同系であり得る。

【0108】

本発明のすべての態様の一実施形態では、治療方法は、被験体から体細胞の試料を得ること、および幹細胞特性を有する細胞を提供するための本発明の方法によって細胞を処理することをさらに含む。本発明のすべての態様の一実施形態では、幹細胞特性を有する細胞は、１つ以上の再プログラミング因子をコードする核酸で一過性にトランスフェクトされる。したがって、１つ以上の再プログラミング因子をコードする核酸は、細胞のゲノムには組み込まれない。本発明のすべての態様の一実施形態では、体細胞は、幹細胞特性を有する細胞が投与される被験体に由来する。本発明のすべての態様の一実施形態では、体細胞は、幹細胞特性を有する細胞が投与される哺乳動物とは異なる哺乳動物に由来する。

【0109】

本発明の一実施形態では、治療は、細胞移植療法などの細胞療法を含む。

【0110】

さらなる態様では、本発明は、本明細書に記載の方法で使用するための本明細書に記載の作用物質および組成物を提供する。

【0111】

本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかになる。

【図面の簡単な説明】

【0112】

【図1】親ウイルスゲノムおよびベクターのシスおよびトランス複製ＲＮＡ （Ａ）アルファウイルスゲノムの一般的構成。２つの大きなオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、サブゲノムプロモータ（ＳＧＰ）によって分離されている。５'ＯＲＦはＲＮＡ増幅のための酵素複合体（レプリカーゼ）をコードし、３'ＯＲＦはウイルス構造遺伝子（カプシドおよびエンベロープ糖タンパク質）をコードする。５'末端で、２つの保存された配列エレメント（ＣＳＥ）が、レプリカーゼコード領域と部分的に重複する５'複製認識配列（ＲＲＳ）を構築する。３'ＲＲＳは、ＣＳＥ ４（３'末端の１９ヌクレオチド）とポリＡ尾部（Ａ_ｎ）の約１５ヌクレオチドによって構築される。 （Ｂ）シスレプリコンベクターは、ＲＲＳおよびＳＧＰのＷＴ配列を保持し、それらは、目的の遺伝子によって置き換えられる構造遺伝子のＯＲＦを欠く。 （Ｃ）トランスレプリコン（ＴＲ）ベクター系。シスレプリコンは、レプリカーゼをコードするが複製することができないｍＲＮＡと、レプリカーゼによってトランスで増幅される短いＲＮＡに分割される。これらのいわゆるトランスレプリコンには２つの異なる型があり、１つはシスレプリコンと同一のＷＴ配列中にすべてのウイルスＲＲＳを含む。他方の型は、翻訳開始コドンとして機能できるＡＵＧコドンを除去するように変異した短縮５'ＣＳＥを含む。５'ＡＵＧの除去は、目的のＯＲＦの開始コドンのみで翻訳が開始されることを確実にし、目的のＯＲＦは変異した５'ＣＳＥの下流に挿入される。本発明における目的の遺伝子は、多能性を促進する６つの再プログラミング転写因子（ｒＴＦ）（ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＭＹＣ、ＫＬＦ４、ＮＡＮＯＧ、ＬＩＮ２８）およびワクシニアウイルスの３つのインターフェロンエスケープタンパク質（Ｅ３、Ｋ３、Ｂ１８）である。

【図2】トランスレプリコン技術（ＷＴ－ＲＲＳ）を使用したＲＮＡ再プログラミング

【図3ABC】トランスレプリコン技術（Δ５ＡＴＧ－ＲＲＳΔＳＧＰ）を使用したＲＮＡ再プログラミング

【図3D】トランスレプリコン技術（Δ５ＡＴＧ－ＲＲＳΔＳＧＰ）を使用したＲＮＡ再プログラミング

【図4】トランスレプリコン技術（ＷＴ－ＲＳＳ）を使用した１回のトランスフェクションによるＲＮＡベースの再プログラミング

【図5】本発明に従って有用な非修飾または修飾５'複製認識配列を含むＲＮＡレプリコンの概略図 略語：ＡＡＡＡ＝ポリ（Ａ）尾部；ＡＴＧ＝出発コドン／開始コドン（ＤＮＡレベルのＡＴＧ；ＲＮＡレベルのＡＵＧ）；５ｘＡＴＧ＝ｎｓＰ１＊をコードする核酸配列内のすべての開始コドンを含む核酸配列（セムリキ森林ウイルス由来のｎｓＰ１＊をコードする核酸配列の場合、５ｘＡＴＧは５つの特定の開始コドンに対応する）；Δ５ＡＴＧ＝ｎｓＰ１＊をコードする核酸配列に対応する核酸配列；ただし、自然界で見出されるアルファウイルスのｎｓＰ１＊をコードする核酸配列の開始コドンを含まない（セムリキ森林ウイルスに由来するｎｓＰ１＊の場合、「Δ５ＡＴＧ」は、自然界で見出されるセムリキ森林ウイルスと比較して５つの特定の開始コドンの除去に対応する）；ＥｃｏＲＶ＝ＥｃｏＲＶ制限部位；ｎｓＰ＝アルファウイルス非構造タンパク質（例えばｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、ｎｓＰ４）をコードする核酸配列；ｎｓＰ１＊＝ｎｓＰ１の断片をコードする核酸配列、この断片はｎｓＰ１のＣ末端断片を含まない；＊ｎｓＰ４＝ｎｓＰ４の断片をコードする核酸配列、この断片はｎｓＰ４のＮ末端断片を含まない；ＲＲＳ＝５'複製認識配列；ＳａｌＩ＝ＳａｌＩ制限部位；ＳＧＰ＝サブゲノムプロモータ；ＳＬ＝ステムループ（例えばＳＬ１、ＳＬ２、ＳＬ３、ＳＬ４）；ＳＬ１～４の位置は図で示されている；ＵＴＲ＝非翻訳領域（例えば５'－ＵＴＲ、３'－ＵＴＲ）；ＷＴ＝野生型；導入遺伝子は、好ましくは再プログラミング因子をコードするオープンリーディングフレームに関する。 シスレプリコンＷＴ－ＲＲＳ：アルファウイルス構造タンパク質をコードする核酸配列が目的の遺伝子（「導入遺伝子」）をコードするオープンリーディングフレームに置き換えられていることを除いて、本質的にアルファウイルスのゲノムに対応するＲＮＡレプリコン。「レプリコンＷＴ－ＲＲＳ」が細胞に導入された場合、レプリカーゼ（ｎｓＰ１２３４またはその断片（１つまたは複数））をコードするオープンリーディングフレームの翻訳産物は、シスでＲＮＡレプリコンの複製を駆動し、サブゲノムプロモータ（ＳＧＰ）の下流の核酸配列（サブゲノム転写物）の合成を駆動することができる。 トランスレプリコンまたは鋳型ＲＮＡ ＷＴ－ＲＲＳ：アルファウイルス非構造タンパク質ｎｓＰ１～４をコードする核酸配列のほとんどが除去されていることを除いて、本質的に「レプリコンＷＴ－ＲＲＳ」に対応するＲＮＡレプリコン。より具体的には、ｎｓＰ２およびｎｓＰ３をコードする核酸配列は完全に除去されている；「鋳型ＲＮＡ ＷＴ－ＲＲＳ」が、ｎｓＰ１のＣ末端断片を含まない（ただし、ｎｓＰ１のＮ末端断片を含む；ｎｓＰ１＊）ｎｓＰ１の断片をコードするように、ｎｓＰ１をコードする核酸配列はトランケートされている；「鋳型ＲＮＡ ＷＴ－ＲＲＳ」が、ｎｓＰ４のＮ末端断片を含まない（ただし、ｎｓＰ４のＣ末端断片を含む；＊ｎｓＰ４）ｎｓＰ４の断片をコードするように、ｎｓＰ４をコードする核酸配列はトランケートされている。このトランケートされたｎｓＰ４配列は、完全に活性なサブゲノムプロモータと部分的に重複する。ｎｓＰ１＊をコードする核酸配列は、自然界で見出されるアルファウイルスのｎｓＰ１＊をコードする核酸配列のすべての開始コドンを含む（セムリキ森林ウイルス由来のｎｓＰ１＊の場合、５つの特定の開始コドン）。 Δ５ＡＴＧ－ＲＲＳ：自然界で見出されるアルファウイルスのｎｓＰ１＊をコードする核酸配列の開始コドンを含まないことを除いて、本質的に「鋳型ＲＮＡ ＷＴ－ＲＲＳ」に対応するＲＮＡレプリコン（セムリキ森林ウイルスの場合、「Δ５ＡＴＧ－ＲＲＳ」は、自然界で見出されるセムリキ森林ウイルスと比較して５つの特定の開始コドンの除去に対応する）。開始コドンを除去するために導入されたすべてのヌクレオチド変化は、ＲＮＡの予測される二次構造を保存するために追加のヌクレオチド変化によって補償された。 Δ５ＡＴＧ－ＲＲＳΔＳＧＰ：サブゲノムプロモータ（ＳＧＰ）を含まず、＊ｎｓＰ４をコードする核酸配列を含まないことを除いて、本質的に「Δ５ＡＴＧ－ＲＲＳ」に対応するＲＮＡレプリコン。「導入遺伝子１」＝目的の遺伝子。 Δ５ＡＴＧ－ＲＲＳ－バイシストロニック：サブゲノムプロモータの上流の最初の目的遺伝子（「導入遺伝子１」）をコードする最初のオープンリーディングフレームおよびサブゲノムプロモータの下流の２番目の目的遺伝子（「導入遺伝子２」）をコードする２番目のオープンリーディングフレームを含むことを除いて、本質的に「Δ５ＡＴＧ－ＲＲＳ」に対応するＲＮＡレプリコン。２番目のオープンリーディングフレームの局在化は、ＲＮＡレプリコン「Δ５ＡＴＧ－ＲＲＳ」における目的の遺伝子（「導入遺伝子」）の局在化に対応する。 シスレプリコンΔ５ＡＴＧ－ＲＲＳ：最初の目的遺伝子をコードするオープンリーディングフレームが機能性アルファウイルス非構造タンパク質（典型的にはポリタンパク質ｎｓＰ１－ｎｓＰ２－ｎｓＰ３－ｎｓＰ４、すなわちｎｓＰ１２３４をコードする１つのオープンリーディングフレーム）をコードすることを除いて、本質的に「Δ５ＡＴＧ－ＲＲＳ－バイシストロニック」に対応するＲＮＡレプリコン。「シスレプリコンΔ５ＡＴＧ－ＲＲＳ」の「導入遺伝子」は、「Δ５ＡＴＧ－ＲＲＳ－バイシストロニック」の「導入遺伝子２」に対応する。機能性アルファウイルス非構造タンパク質は、サブゲノムプロモータを認識し、目的の遺伝子（「導入遺伝子」）をコードする核酸配列を含むサブゲノム転写物を合成することができる。「シスレプリコンΔ５ＡＴＧ－ＲＲＳ」は、「シスレプリコンＷＴ－ＲＲＳ」と同様に、機能性アルファウイルスの非構造タンパク質をシスでコードする；しかし、「シスレプリコンΔ５ＡＴＧ－ＲＲＳ」によってコードされるｎｓＰ１のコード配列は、すべてのステムループを含む「シスレプリコンＷＴ－ＲＲＳ」の正確な核酸配列を含む必要はない。

【図6】キャップジヌクレオチドの構造。上：天然キャップジヌクレオチド、ｍ^７ＧｐｐｐＧ。下：ホスホロチオエートキャップ類似体β－Ｓ－ＡＲＣＡジヌクレオチド：ステレオジェニックなＰ中心のため、β－Ｓ－ＡＲＣＡには２つのジアステレオマーが存在し、これらは、逆相ＨＰＬＣでの溶出特性に従ってＤ１およびＤ２と呼称される。

【発明を実施するための形態】

【0113】

本発明を以下で詳細に説明するが、本発明は、本明細書に記載の特定の方法論、プロトコルおよび試薬に限定されず、これらは異なり得ることが理解されるべきである。また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的とし、本発明の範囲を限定することを意図するものではなく、本発明の範囲は付属の特許請求の範囲によってのみ限定されることも理解されるべきである。特に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術および科学用語は、当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。

【0114】

好ましくは、本明細書で使用される用語は、"Ａ ｍｕｌｔｉｌｉｎｇｕａｌ ｇｌｏｓｓａｒｙ ｏｆ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｔｅｒｍｓ：（ＩＵＰＡＣ Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ）"，Ｈ．Ｇ．Ｗ．Ｌｅｕｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｂ．Ｎａｇｅｌ，ａｎｄ Ｈ．Ｋｏｌｂｌ，Ｅｄｓ．，Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ，ＣＨ－４０１０ Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ，（１９９５）に記載されているように定義される。

【0115】

本発明の実施は、特に指示されない限り、当技術分野の文献（例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ １９８９参照）で説明されている化学、生化学、細胞生物学、免疫学、および組換えＤＮＡ技術の従来の方法を用いる。

【0116】

以下において、本発明の要素を説明する。これらの要素を具体的な実施形態と共に列挙するが、それらは、追加の実施形態を創製するために任意の方法および任意の数で組み合わせてもよいことが理解されるべきである。様々に説明される例および好ましい実施形態は、本発明を明確に記述される実施形態のみに限定すると解釈されるべきではない。この説明は、明確に記述される実施形態を任意の数の開示される要素および／または好ましい要素と組み合わせた実施形態を開示し、包含すると理解されるべきである。さらに、本出願において記述されるすべての要素の任意の並び替えおよび組合せは、文脈上特に指示されない限り、この説明によって開示されているとみなされるべきである。

【0117】

「約」という用語は、およそまたはほぼを意味し、本明細書に記載の数値または範囲の文脈では、好ましくは列挙または特許請求される数値または範囲の＋／－１０％を意味する。

【0118】

本発明を説明する文脈で（特に特許請求の範囲の文脈で）使用される「１つの」（「ａ」および「ａｎ」）および「その」（「ｔｈｅ」）という用語ならびに同様の言及は、本明細書で特に指示されない限り、または文脈と明らかに矛盾しない限り、単数および複数の両方を包含すると解釈されるべきである。本明細書における値の範囲の列挙は、単に、その範囲内に属する各々別々の値を個別に言及することの簡略方法として機能することが意図されている。本明細書で特に指示されない限り、各個別の値は、本明細書で個別に列挙されているかのごとくに本明細書に組み込まれる。本明細書に記載されるすべての方法は、本明細書で特に指示されない限り、または文脈と明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実施することができる。本明細書で提供されるありとあらゆる例または例示的言語（例えば「など」）の使用は、単に本発明をより良く説明することを意図し、特許請求される本発明の範囲に限定を課すものではない。本明細書中のいかなる言語も、本発明の実施に不可欠な、特許請求されていない要素を指示すると解釈されるべきではない。

【0119】

特に明記されない限り、「含む」という用語は、「含む」によって導入されたリストのメンバーに加えて、さらなるメンバーが場合により存在し得ることを示すために本文書の文脈で使用される。しかし、「含む」という用語は、さらなるメンバーが存在しない可能性を包含することが本発明の特定の実施形態として考えられ、すなわちこの実施形態の目的のために、「含む」は「からなる」の意味を有すると理解されるべきである。

【0120】

総称によって特徴付けられる成分の相対量の表示は、その総称でカバーされるすべての特定の変異体またはメンバーの合計量を指すことを意味する。総称によって定義された特定の成分が特定の相対量で存在すると指定され、この成分が総称でカバーされる特定の変異体またはメンバーであるとさらに特徴付けられる場合、総称でカバーされる他の変異体またはメンバーが、総称でカバーされる成分の合計相対量が指定された相対量を超えるように付加的に存在しないこと、より好ましくは総称でカバーされる他の変異体またはメンバーが全く存在しないことを意味する。

【0121】

本明細書の本文全体を通していくつかの資料を引用する。本明細書で引用される資料（すべての特許、特許出願、科学出版物、製造者の仕様書、指示書等を含む）の各々は、上記または下記のいずれでも、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書のいかなる内容も、本発明がそのような開示に先行する権利を有さなかったことの承認と解釈されるべきではない。

【0122】

本明細書で使用される「低減する」または「阻害する」などの用語は、好ましくは５％以上、１０％以上、２０％以上、より好ましくは５０％以上、最も好ましくは７５％以上のレベルの全体的な減少を生じさせる能力を意味する。「阻害する」という用語または同様の語句には、完全なまたは本質的に完全な阻害、すなわちゼロまたは本質的にゼロへの低減が含まれる。

【0123】

「増加する」または「増強する」などの用語は、好ましくは、少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも１００％の増加または増強に関する。

【0124】

「正味電荷」という用語は、化合物または粒子などの物体全体の電荷を指す。

【0125】

全体的な正味の正電荷を有するイオンは陽イオンであり、一方、全体的な正味の負電荷を有するイオンは陰イオンである。したがって、本発明によれば、陰イオンは陽子よりも多くの電子を有するイオンであり、正味の負電荷を与え、陽イオンは陽子よりも少ない電子を有するイオンであり、正味の正電荷を与える。

【0126】

所与の化合物または粒子に関して、「帯電した」、「正味電荷」、「負に帯電した」または「正に帯電した」という用語は、ｐＨ７．０の水に溶解または懸濁した場合の所与の化合物または粒子の正味電荷を指す。

【0127】

本発明によれば、核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）である。一般に、核酸分子または核酸配列は、好ましくはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）である核酸を指す。本発明によれば、核酸は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ、組換えによって調製された分子および化学合成された分子を含む。本発明によれば、核酸は、一本鎖または二本鎖の線状または共有結合閉環分子として存在し得る。本発明による「核酸」という用語は、ヌクレオチド塩基上、糖上またはリン酸塩上の核酸、ならびに非天然ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体を含む核酸の化学的誘導体化も含む。

【0128】

本発明によれば、「核酸配列」は、核酸、例えばリボ核酸（ＲＮＡ）またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）中のヌクレオチドの配列を指す。この用語は、核酸分子全体（核酸分子全体の一本鎖など）またはその一部（例えば断片）を指してもよい。

【0129】

本発明によれば、「ＲＮＡ」または「ＲＮＡ分子」という用語は、リボヌクレオチド残基を含み、好ましくは完全にまたは実質的にリボヌクレオチド残基からなる分子に関する。「リボヌクレオチド」という用語は、β－Ｄ－リボフラノシル基の２'位にヒドロキシル基を有するヌクレオチドに関する。「ＲＮＡ」という用語は、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、部分的または完全に精製されたＲＮＡなどの単離されたＲＮＡ、本質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、ならびに１つ以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換および／または改変によって天然に存在するＲＮＡとは異なる修飾ＲＮＡなどの組換え生産されたＲＮＡを含む。そのような改変は、例えばＲＮＡの末端（一方もしくは両方）へのまたは内部での、例えばＲＮＡの１つ以上のヌクレオチドにおける、非ヌクレオチド物質の付加を含み得る。ＲＮＡ分子中のヌクレオチドは、非天然のヌクレオチドまたは化学合成されたヌクレオチドもしくはデオキシヌクレオチドなどの非標準のヌクレオチドも含み得る。これらの改変されたＲＮＡは、類似体、特に天然に存在するＲＮＡの類似体と称され得る。

【0130】

本発明によれば、ＲＮＡは一本鎖または二本鎖であり得る。本発明のいくつかの実施形態では、一本鎖ＲＮＡが好ましい。「一本鎖ＲＮＡ」という用語は、一般に、相補的な核酸分子（典型的には相補的なＲＮＡ分子）が結合していないＲＮＡ分子を指す。一本鎖ＲＮＡは、ＲＮＡの一部が折り返され、塩基対、ステム、ステムループおよびバルジを含むがこれらに限定されない二次構造モチーフを形成することを可能にする自己相補的配列を含み得る。一本鎖ＲＮＡは、マイナス鎖［（－）鎖］またはプラス鎖［（＋）鎖］として存在することができる。（＋）鎖は、遺伝情報を含むまたはコードする鎖である。遺伝情報は、例えばタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列であり得る。（＋）鎖ＲＮＡがタンパク質をコードする場合、（＋）鎖は翻訳（タンパク質合成）の鋳型として直接機能し得る。（－）鎖は（＋）鎖の相補体である。二本鎖ＲＮＡの場合、（＋）鎖と（－）鎖は２つの別個のＲＮＡ分子であり、これら両方のＲＮＡ分子が互いに会合して二本鎖ＲＮＡ（「二重鎖ＲＮＡ」）を形成する。

【0131】

ＲＮＡの「安定性」という用語は、ＲＮＡの「半減期」に関する。「半減期」は、分子の活性、量、または数の半分を除去するのに必要な期間に関する。本発明の文脈において、ＲＮＡの半減期は、前記ＲＮＡの安定性の指標である。ＲＮＡの半減期は、ＲＮＡの「発現の持続時間」に影響を与える可能性がある。長い半減期を有するＲＮＡが長期間発現されることが予想される。

【0132】

「翻訳効率」という用語は、特定の期間内にＲＮＡ分子によって提供される翻訳産物の量に関する。

【0133】

核酸配列に関する「断片」は、核酸配列の一部、すなわち５'末端および／または３'末端（一方もしくは両方）で短縮された核酸配列を表す配列に関する。好ましくは、核酸配列の断片は、前記核酸配列からのヌクレオチド残基の少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を含む。本発明では、ＲＮＡの安定性および／または翻訳効率を保持するＲＮＡ分子の断片が好ましい。

【0134】

アミノ酸配列（ペプチドまたはタンパク質）に関する「断片」は、アミノ酸配列の一部、すなわち、Ｎ末端および／またはＣ末端で短縮されたアミノ酸配列を表す配列に関する。Ｃ末端で短縮された断片（Ｎ末端断片）は、例えばオープンリーディングフレームの３'末端を欠くトランケートされたオープンリーディングフレームの翻訳によって得ることができる。Ｎ末端で短縮された断片（Ｃ末端断片）は、例えば、トランケートされたオープンリーディングフレームが翻訳を開始させるように働く開始コドンを含む限り、オープンリーディングフレームの５'末端を欠くトランケートされたオープンリーディングフレームの翻訳によって得ることができる。アミノ酸配列の断片は、例えばアミノ酸配列からのアミノ酸残基の少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％を含む。

【0135】

本発明による、例えば核酸およびアミノ酸配列に関する「変異体」という用語は、任意の変異体、特に突然変異体、ウイルス株変異体、スプライス変異体、立体配座、アイソフォーム、対立遺伝子変異体、種変異体および種ホモログ、特に天然に存在するものを含む。対立遺伝子変異体は、遺伝子の通常の配列における改変に関連しており、その重要性はしばしば不明である。完全な遺伝子配列決定によって、所与の遺伝子の多数の対立遺伝子変異体がしばしば同定される。核酸分子に関して、「変異体」という用語は縮重核酸配列を含み、本発明による縮重核酸は、遺伝暗号の縮重のためにコドン配列において参照核酸とは異なる核酸である。種ホモログは、所与の核酸またはアミノ酸配列のものとは異なる種を起源とする核酸またはアミノ酸配列である。ウイルスホモログは、所与の核酸またはアミノ酸配列のものとは異なるウイルスを起源とする核酸またはアミノ酸配列である。

【0136】

本発明によれば、核酸変異体は、参照核酸と比較して単一または複数のヌクレオチドの欠失、付加、変異、置換および／または挿入を含む。欠失は、参照核酸からの１つ以上のヌクレオチドの除去を含む。付加変異体は、１、２、３、５、１０、２０、３０、５０、またはそれ以上のヌクレオチドなどの、１つ以上のヌクレオチドの５'末端および／または３'末端融合を含む。置換の場合、配列中の少なくとも１つのヌクレオチドが除去され、少なくとも１つの他のヌクレオチドがその場所に挿入される（トランスバージョンおよびトランジションなど）。変異には、脱塩基部位、架橋部位、および化学的に改変または修飾された塩基が含まれる。挿入には、参照核酸への少なくとも１つのヌクレオチドの付加が含まれる。

【0137】

本発明によれば、「ヌクレオチド変化」は、参照核酸と比較した単一または複数のヌクレオチドの欠失、付加、変異、置換および／または挿入を指すことができる。いくつかの実施形態では、「ヌクレオチド変化」は、参照核酸と比較した、単一ヌクレオチドの欠失、単一ヌクレオチドの付加、単一ヌクレオチドの変異、単一ヌクレオチドの置換および／または単一ヌクレオチドの挿入からなる群より選択される。本発明によれば、核酸変異体は、参照核酸と比較した１つ以上のヌクレオチド変化を含み得る。

【0138】

特定の核酸配列の変異体は、好ましくは前記特定の配列の少なくとも１つの機能的特性を有し、好ましくは前記特定の配列と機能的に等価であり、例えば特定の核酸配列の特性と同一または類似の特性を示す核酸配列である。

【0139】

以下に記載されるように、本発明のいくつかの実施形態は、とりわけ、自然界で見出されるアルファウイルスなどのアルファウイルスの核酸配列と相同である核酸配列を特徴とする。これらの相同な配列は、自然界で見出されるアルファウイルスなどのアルファウイルスの核酸配列の変異体である。

【0140】

好ましくは、所与の核酸配列と前記所与の核酸配列の変異体である核酸配列との間の同一性の程度は、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、または最も好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％である。同一性の程度は、好ましくは、少なくとも約３０、少なくとも約５０、少なくとも約７０、少なくとも約９０、少なくとも約１００、少なくとも約１５０、少なくとも約２００、少なくとも約２５０、少なくとも約３００、または少なくとも約４００ヌクレオチドの領域について与えられる。好ましい実施形態では、同一性の程度は、参照アミノ酸配列の全長について与えられる。

【0141】

「配列類似性」は、同一であるかまたは保存的アミノ酸置換を表すアミノ酸の割合を示す。２つのポリペプチドまたは核酸配列間の「配列同一性」は、配列間で同一であるアミノ酸またはヌクレオチドの割合を示す。

【0142】

「％同一」という用語は、特に、比較する２つの配列間の最適なアラインメントにおいて同一であるヌクレオチドの割合を指すことが意図されており、前記割合は純粋に統計的であり、２つの配列間の相違は配列の全長にわたってランダムに分布していてもよく、比較する配列は、２つの配列間の最適なアラインメントを得るために、参照配列と比較して付加または欠失を含んでいてもよい。２つの配列の比較は、通常、対応する配列の局所領域を同定するために、最適なアラインメント後に、セグメントまたは「比較ウィンドウ」に関して前記配列を比較することによって実施される。比較のための最適なアライメントは、手作業によって、またはＳｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，１９８１，Ａｄｓ Ａｐｐ．Ｍａｔｈ．２，４８２による局所相同性アルゴリズムを用いて、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，４４３による局所相同性アルゴリズムを用いて、およびＰｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５，２４４４の類似性検索アルゴリズムを用いて、または前記アルゴリズムを使用したコンピュータプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ Ｐ、ＢＬＡＳＴ ＮおよびＴＦＡＳＴＡ）を援用して実施し得る。

【0143】

同一性パーセントは、比較する配列が一致する同一の位置の数を決定し、この数を比較する位置の数で除して、この結果に１００を乗じることによって得られる。

【0144】

例えば、ウェブサイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｂｌ２ｓｅｑ／ｗｂｌａｓｔ２．ｃｇｉで入手可能なＢＬＡＳＴプログラム「ＢＬＡＳＴ ２ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」を使用し得る。

【0145】

２つの配列が互いに相補的である場合、核酸は別の核酸に「ハイブリダイズできる」または「ハイブリダイズする」。２つの配列が互いに安定な二重鎖を形成できる場合、核酸は別の核酸と「相補的」である。本発明によれば、ハイブリダイゼーションは、好ましくは、ポリヌクレオチド間の特異的なハイブリダイゼーションを可能にする条件（ストリンジェントな条件）下で実施される。ストリンジェントな条件は、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｉｔｏｒｓ，２^ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９またはＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに記載されており、例えばハイブリダイゼーション緩衝液（３．５ｘＳＳＣ、０．０２％Ｆｉｃｏｌｌ、０．０２％ポリビニルピロリドン、０．０２％ウシ血清アルブミン、２．５ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４（ｐＨ７）、０．５％ＳＤＳ、２ｍＭ ＥＤＴＡ）中の６５℃でのハイブリダイゼーションを参照されたい。ＳＳＣは、０．１５Ｍ塩化ナトリウム／０．１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７である。ハイブリダイゼーション後、ＤＮＡが転写された膜を、例えば室温で２×ＳＳＣ中で洗浄し、次に６８℃までの温度で０．１～０．５×ＳＳＣ／０．１×ＳＤＳ中で洗浄する。

【0146】

相補性パーセントは、第２の核酸配列と水素結合（例えばワトソン－クリック塩基対合）を形成することができる核酸分子中の連続する残基の割合を示す（例えば１０個のうちの５、６、７、８、９、１０個が５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、および１００％相補的である）。「完全に相補的」または「全面的に相補的」とは、核酸配列のすべての連続する残基が、第２の核酸配列の同じ数の連続する残基と水素結合することを意味する。好ましくは、本発明による相補性の程度は、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、または最も好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％である。最も好ましくは、本発明による相補性の程度は１００％である。

【0147】

「誘導体」という用語は、ヌクレオチド塩基、糖またはリン酸塩上の核酸の化学的誘導体化を含む。「誘導体」という用語は、天然には存在しないヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体を含む核酸も含む。好ましくは、核酸の誘導体化はその安定性を高める。

【0148】

本発明によれば、「核酸配列に由来する核酸配列」とは、それが由来する核酸の変異体である核酸を指す。好ましくは、ＲＮＡ分子中の特定の配列を置換する場合、特定の配列に関して変異体である配列は、ＲＮＡの安定性および／または翻訳効率を保持する。

【0149】

「ｎｔ」は、１つのヌクレオチドの略語であるか、または複数のヌクレオチド、好ましくは核酸分子中の連続するヌクレオチドの略語である。

【0150】

本発明によれば、「コドン」という用語は、リボソームでのタンパク質合成中に次にどのアミノ酸が付加されるかを特定する、コード核酸中の塩基トリプレットを指す。

【0151】

「転写」および「転写する」という用語は、特定の核酸配列を有する核酸分子（「核酸鋳型」）がＲＮＡポリメラーゼによって読み取られ、その結果ＲＮＡポリメラーゼが一本鎖ＲＮＡ分子を生成する過程に関する。転写中に、核酸鋳型の遺伝情報が転写される。核酸鋳型はＤＮＡであってもよい；しかし、例えばアルファウイルス核酸鋳型からの転写の場合、鋳型は、典型的にはＲＮＡである。その後、転写されたＲＮＡはタンパク質に翻訳され得る。本発明によれば、「転写」という用語は「インビトロ転写」を含み、「インビトロ転写」という用語は、ＲＮＡ、特にｍＲＮＡが無細胞系においてインビトロで合成される過程に関する。好ましくは、クローニングベクターを転写物の生成に適用する。これらのクローニングベクターは、一般に転写ベクターと称され、本発明によれば「ベクター」という用語に包含される。クローニングベクターは、好ましくはプラスミドである。本発明によれば、ＲＮＡは、好ましくはインビトロ転写ＲＮＡ（ＩＶＴ－ＲＮＡ）であり、適切なＤＮＡ鋳型のインビトロ転写によって得られ得る。転写を制御するためのプロモータは、任意のＲＮＡポリメラーゼについての任意のプロモータであり得る。インビトロ転写のためのＤＮＡ鋳型は、核酸、特にｃＤＮＡをクローニングし、それをインビトロ転写のための適切なベクターに導入することによって得られ得る。ｃＤＮＡは、ＲＮＡの逆転写によって得られ得る。

【0152】

転写中に生成される一本鎖核酸分子は、典型的には鋳型の相補的配列である核酸配列を有する。

【0153】

本発明によれば、「鋳型」または「核酸鋳型」または「鋳型核酸」という用語は、一般に、複製または転写され得る核酸配列を指す。

【0154】

「核酸配列から転写された核酸配列」および同様の用語は、適切な場合、鋳型核酸配列の転写産物である完全なＲＮＡ分子の一部としての核酸配列を指す。典型的には、転写された核酸配列は一本鎖ＲＮＡ分子である。

【0155】

「核酸の３'末端」とは、本発明によれば、遊離ヒドロキシ基を有するその末端を指す。二本鎖核酸、特にＤＮＡの図式的表示では、３'末端は常に右側にある。「核酸の５'末端」は、本発明によれば、遊離リン酸基を有するその末端を指す。二本鎖核酸、特にＤＮＡの図式的表示では、５'末端は常に左側にある。
５'末端 ５'－－Ｐ－ＮＮＮＮＮＮＮ－ＯＨ－３' ３'末端
３'－ＨＯ－ＮＮＮＮＮＮＮ－Ｐ－－５'

【0156】

「上流」とは、核酸分子の第１のエレメントと第２のエレメントの両方が同じ核酸分子中に含まれ、核酸分子の第１のエレメントが第２のエレメントよりもその核酸分子の５'末端のより近くに位置する、核酸分子の第１のエレメントの、その核酸分子の第２のエレメントに対する相対的位置を表す。その場合、第２のエレメントは、その核酸分子の第１のエレメントの「下流」であると言われる。第２のエレメントの「上流」に位置するエレメントは、同義的に、その第２のエレメントの「５'」側に位置すると称され得る。二本鎖核酸分子の場合、「上流」および「下流」のような指示は、「＋」鎖に関して与えられる。

【0157】

本発明によれば、「機能的連結」または「機能的に連結された」は、機能的関係内での接続に関する。核酸は、別の核酸配列と機能的に関連している場合、「機能的に連結され」ている。例えば、プロモータは、コード配列の転写に影響を及ぼす場合、前記コード配列に機能的に連結されている。機能的に連結された核酸は、典型的には互いに隣接しているが、適切な場合はさらなる核酸配列によって分離されており、特定の実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼによって転写されて単一のＲＮＡ分子（共通転写物）を生じる。

【0158】

特定の実施形態では、核酸は、本発明に従って、核酸に関して同種または異種であり得る発現制御配列に機能的に連結される。

【0159】

「発現制御配列」という用語は、本発明によれば、プロモータ、リボソーム結合配列、および遺伝子の転写または誘導されたＲＮＡの翻訳を制御する他の制御エレメントを含む。本発明の特定の実施形態では、発現制御配列は調節することができる。発現制御配列の正確な構造は、種または細胞型に応じて異なり得るが、通常、それぞれ転写および翻訳の開始に関与する５'非転写配列ならびに５'および３'非翻訳配列を含む。より具体的には、５'非転写発現制御配列は、機能的に連結された遺伝子の転写制御のためのプロモータ配列を包含するプロモータ領域を含む。発現制御配列は、エンハンサー配列または上流活性化配列も含み得る。ＤＮＡ分子の発現制御配列は、通常、ＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列などの５'非転写配列ならびに５'および３'非翻訳配列を含む。アルファウイルスＲＮＡの発現制御配列は、サブゲノムプロモータおよび／または１つ以上の保存された配列エレメントを含み得る。本発明による特定の発現制御配列は、本明細書に記載されるように、アルファウイルスのサブゲノムプロモータである。

【0160】

本明細書で特定される核酸配列、特に転写可能なコード核酸配列は、任意の発現制御配列、特に前記核酸配列と同種または異種であり得るプロモータと組み合わせてもよく、「同種」という用語は、核酸配列が天然でも発現制御配列に機能的に連結されているという事実を指し、「異種」という用語は、核酸配列が天然では発現制御配列に機能的に連結されていないという事実を指す。

【0161】

転写可能な核酸配列、特にペプチドまたはタンパク質をコードする核酸配列と発現制御配列とは、それらが、転写可能な、特にコード核酸配列の転写または発現が発現制御配列の制御下または影響下にあるように互いに共有結合されている場合、互いに「機能的に」連結されている。核酸配列が機能的なペプチドまたはタンパク質に翻訳される場合、コード配列に機能的に連結された発現制御配列の誘導は、コード配列のフレームシフトを引き起こすことなく、またはコード配列が所望のペプチドまたはタンパク質に翻訳されるのを不可能にすることなく、前記コード配列の転写をもたらす。

【0162】

「プロモータ」または「プロモータ領域」という用語は、ＲＮＡポリメラーゼの認識および結合部位を提供することによって、転写物、例えばコード配列を含む転写物の合成を制御する核酸配列を指す。プロモータ領域は、前記遺伝子の転写の調節に関与するさらなる因子のさらなる認識または結合部位を含み得る。プロモータは、原核生物または真核生物遺伝子の転写を制御し得る。プロモータは「誘導性」であり得、誘導因子に応答して転写を開始し得るか、または転写が誘導因子によって制御されない場合は「構成的」であり得る。誘導因子が存在しない場合、誘導性プロモータはごくわずかしか発現されないかまたは全く発現されない。誘導因子の存在下では、遺伝子の「スイッチが入る」か、または転写のレベルが増加する。これは通常、特定の転写因子の結合によって媒介される。本発明による特定のプロモータは、本明細書に記載されるように、アルファウイルスのサブゲノムプロモータである。他の特定のプロモータは、アルファウイルスのゲノムプラス鎖またはマイナス鎖プロモータである。

【0163】

「コアプロモータ」という用語は、プロモータに含まれる核酸配列を指す。コアプロモータは、典型的には転写を適切に開始するために必要なプロモータの最小部分である。コアプロモータは、典型的には転写開始部位とＲＮＡポリメラーゼの結合部位とを含む。

【0164】

「ポリメラーゼ」は、一般に、モノマー構築ブロックからのポリマー分子の合成を触媒することができる分子実体を指す。「ＲＮＡポリメラーゼ」は、リボヌクレオチド構築ブロックからのＲＮＡ分子の合成を触媒することができる分子実体である。「ＤＮＡポリメラーゼ」は、デオキシリボヌクレオチド構築ブロックからのＤＮＡ分子の合成を触媒することができる分子実体である。ＤＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡポリメラーゼの場合、分子実体は、典型的にはタンパク質または複数のタンパク質の集合体もしくは複合体である。典型的には、ＤＮＡポリメラーゼは、典型的にはＤＮＡ分子である鋳型核酸に基づいてＤＮＡ分子を合成する。典型的には、ＲＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ分子である（その場合、ＲＮＡポリメラーゼはＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、ＤｄＲＰである）か、またはＲＮＡ分子である（その場合、ＲＮＡポリメラーゼはＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、ＲｄＲＰである）、鋳型核酸に基づいてＲＮＡ分子を合成する。

【0165】

「ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ」または「ＲｄＲＰ」は、ＲＮＡ鋳型からのＲＮＡの転写を触媒する酵素である。アルファウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの場合、ゲノムＲＮＡの（－）鎖相補体と（＋）鎖のゲノムＲＮＡの連続合成によってＲＮＡ複製がもたらされる。したがって、アルファウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、同義的に「ＲＮＡレプリカーゼ」と称される。自然界では、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、典型的にはレトロウイルスを除くすべてのＲＮＡウイルスによってコードされている。ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードするウイルスの典型的な代表例はアルファウイルスである。

【0166】

本発明によれば、「ＲＮＡ複製」は、一般に、所与のＲＮＡ分子（鋳型ＲＮＡ分子）のヌクレオチド配列に基づいて合成されたＲＮＡ分子を指す。合成されるＲＮＡ分子は、例えば鋳型ＲＮＡ分子と同一または相補的であり得る。一般に、ＲＮＡ複製は、ＤＮＡ中間体の合成を介して起こり得るか、またはＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲＰ）によって媒介されるＲＮＡ依存性ＲＮＡ複製によって直接起こり得る。アルファウイルスの場合、ＲＮＡ複製はＤＮＡ中間体を介して起こるのではなく、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲＰ）によって媒介される：鋳型ＲＮＡ鎖（第１のＲＮＡ鎖）－またはその一部－が、第１のＲＮＡ鎖またはその一部に相補的な第２のＲＮＡ鎖を合成するための鋳型として働く。第２のＲＮＡ鎖－またはその一部－は、今度は、場合により第２のＲＮＡ鎖またはその一部に相補的な第３のＲＮＡ鎖を合成するための鋳型として働く。それにより、第３のＲＮＡ鎖は、第１のＲＮＡ鎖またはその一部と同一である。したがって、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、鋳型の相補的ＲＮＡ鎖を直接合成することができ、（相補的中間体鎖を介して）同一のＲＮＡ鎖を間接的に合成することができる。

【0167】

本発明によれば、「鋳型ＲＮＡ」という用語は、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによって転写または複製され得るＲＮＡを指す。

【0168】

本発明によれば、「遺伝子」という用語は、１つ以上の細胞産物の産生および／または１つ以上の細胞間もしくは細胞内機能の達成に関与する特定の核酸配列を指す。より具体的には、前記用語は、特定のタンパク質または機能的もしくは構造的ＲＮＡ分子をコードする核酸を含む核酸セクション（典型的にはＤＮＡ；ただしＲＮＡウイルスの場合はＲＮＡ）に関する。

【0169】

本明細書で使用される「単離された分子」は、他の細胞物質などの他の分子を実質的に含まない分子を指すことが意図されている。「単離された核酸」という用語は、本発明によれば、核酸が、（ｉ）例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってインビトロで増幅された、（ｉｉ）クローニングによって組換え生産された、（ｉｉｉ）例えば切断およびゲル電気泳動分画によって精製された、または（ｉｖ）例えば化学合成によって合成されたことを意味する。単離された核酸は、組換え技術による操作に利用可能な核酸である。

【0170】

「ベクター」という用語は、本明細書ではその最も一般的な意味で使用され、例えば核酸を原核生物および／または真核生物宿主細胞に導入し、適切な場合にはゲノムに組み込むことを可能にする、前記核酸のための任意の中間ビヒクルを含む。そのようなベクターは、好ましくは細胞内で複製および／または発現される。ベクターは、プラスミド、ファージミド、ウイルスゲノム、およびそれらの画分を含む。

【0171】

本発明に関連して「組換え」という用語は、「遺伝子操作を介して生成された」ことを意味する。好ましくは、本発明の文脈における組換え細胞などの「組換え物体」は、天然には存在しない。

【0172】

本明細書で使用される「天然に存在する」という用語は、物体が自然界で見出され得るという事実を指す。例えば、生物（ウイルスを含む）中に存在し、自然界の供給源から単離することができ、実験室で人によって意図的に改変されていないペプチドまたは核酸は、天然に存在する。「自然界で見出される」という用語は、「自然界に存在する」ことを意味し、公知の物体ならびに自然からまだ発見および／または単離されていないが、天然源から将来発見および／または単離される可能性がある物体を含む。

【0173】

本発明によれば、「発現」という用語は、その最も一般的な意味で使用され、ＲＮＡの産生、またはＲＮＡおよびタンパク質の産生を含む。また、核酸の部分的発現も含む。さらに、発現は一過性または安定であり得る。ＲＮＡに関して、「発現」または「翻訳」という用語は、コードＲＮＡ（例えばメッセンジャーＲＮＡ）の鎖が、ペプチドまたはタンパク質を生成するようにアミノ酸の配列の集合体に指令する、細胞のリボソームにおける過程に関する。

【0174】

本発明によれば、「ｍＲＮＡ」という用語は「メッセンジャーＲＮＡ」を意味し、典型的にはＤＮＡ鋳型を使用することによって生成され、ペプチドまたはタンパク質をコードする転写物に関する。典型的には、ｍＲＮＡは、５'－ＵＴＲ、タンパク質コード領域、３'－ＵＴＲ、およびポリ（Ａ）配列を含む。ｍＲＮＡは、ＤＮＡ鋳型からのインビトロ転写によって生成され得る。インビトロ転写の方法は当業者に公知である。例えば、様々なインビトロ転写キットが市販されている。本発明によれば、ｍＲＮＡは、安定化修飾およびキャッピングによって改変し得る。

【0175】

本発明によれば、「ポリ（Ａ）配列」または「ポリ（Ａ）尾部」という用語は、典型的にはＲＮＡ分子の３'末端に位置するアデニル酸残基の連続的または断続的な配列を指す。連続的な配列は、連続するアデニル酸残基を特徴とする。自然界では、連続的なポリ（Ａ）配列が典型的である。ポリ（Ａ）配列は通常真核生物のＤＮＡにはコードされていないが、細胞核での真核生物の転写中に、転写後の鋳型非依存性ＲＮＡポリメラーゼによってＲＮＡの遊離３'末端に結合し、本発明はＤＮＡによってコードされるポリ（Ａ）配列を包括する

【0176】

本発明によれば、核酸分子に関して「一次構造」という用語は、ヌクレオチドモノマーの直鎖状配列を指す。

【0177】

本発明によれば、核酸分子に関して「二次構造」という用語は、塩基対合、例えば一本鎖ＲＮＡ分子の場合、特に分子内塩基対合を反映する核酸分子の二次元表示を指す。各ＲＮＡ分子は単一のポリヌクレオチド鎖のみを有するが、分子は、典型的には（分子内）塩基対の領域を特徴とする。本発明によれば、「二次構造」という用語は、塩基対、ステム、ステムループ、バルジ、内部ループおよび多分岐ループなどのループを含むがこれらに限定されない構造モチーフを含む。核酸分子の二次構造は、塩基対合を示す二次元図面（平面グラフ）によって表すことができる（ＲＮＡ分子の二次構造の詳細については、Ａｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｒａｐｈ Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ Ａｐｐｌ．，２００６，ｖｏｌ．１０，ｐｐ．３２９－３５１参照）。本明細書に記載されるように、特定のＲＮＡ分子の二次構造は本発明の文脈に関連する。

【0178】

本発明によれば、核酸分子、特に一本鎖ＲＮＡ分子の二次構造は、ＲＮＡ二次構造予測のためのウェブサーバ（ｈｔｔｐ：／／ｒｎａ．ｕｒｍｃ．ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ．ｅｄｕ／ＲＮＡｓｔｒｕｃｔｕｒｅＷｅｂ／Ｓｅｒｖｅｒｓ／Ｐｒｅｄｉｃｔ１／Ｐｒｅｄｉｃｔ１．ｈｔｍｌ）を使用した予測によって決定される。好ましくは、本発明によれば、核酸分子に関して「二次構造」は、具体的には前記予測によって決定された二次構造を指す。予測は、ＭＦＯＬＤ構造予測（ｈｔｔｐ：／／ｕｎａｆｏｌｄ．ｒｎａ．ａｌｂａｎｙ．ｅｄｕ／？ｑ＝ｍｆｏｌｄ）を使用して実行または確認してもよい。

【0179】

本発明によれば、「塩基対」は、２つのヌクレオチド塩基が塩基上のドナー部位とアクセプタ部位との水素結合を介して互いに会合する二次構造の構造モチーフである。相補的な塩基であるＡ：ＵおよびＧ：Ｃは、塩基上のドナー部位とアクセプタ部位との水素結合を介して安定な塩基対を形成する；Ａ：ＵおよびＧ：Ｃ塩基対はワトソン－クリック塩基対と呼ばれる。より弱い塩基対（ウォブル塩基対と呼ばれる）は、塩基ＧとＵ（Ｇ：Ｕ）によって形成される。塩基対Ａ：ＵおよびＧ：Ｃは、正準塩基対と呼ばれる。Ｇ：Ｕ（ＲＮＡではかなり頻繁に生じる）および他のまれな塩基対（例えばＡ：Ｃ；Ｕ：Ｕ）のような他の塩基対は、非正準塩基対と呼ばれる。

【0180】

本発明によれば、「ヌクレオチド対合」とは、２つのヌクレオチドの塩基が塩基対（正準または非正準塩基対、好ましくは正準塩基対、最も好ましくはワトソン－クリック塩基対）を形成するように互いに会合する、２つのヌクレオチドを指す。

【0181】

本発明によれば、核酸分子に関して「ステムループ」または「ヘアピン」または「ヘアピンループ」という用語は、すべて互換的に、核酸分子、典型的には一本鎖ＲＮＡなどの一本鎖核酸分子の特定の二次構造を指す。ステムループで表される特定の二次構造は、ステムおよびヘアピンループとも呼ばれる（末端）ループを含む連続する核酸配列からなり、ステムは、ステム－ループ構造のループを形成する短い配列（例えば３～１０ヌクレオチド）によって分離された２つの隣接する完全にまたは部分的に相補的な配列エレメントによって形成される。２つの隣接する完全にまたは部分的に相補的な配列は、例えばステムループエレメント、ステム１およびステム２として定義され得る。ステムループは、これらの２つの隣接する完全にまたは部分的に逆相補的な配列、例えばステムループエレメント、ステム１とステム２が互いに塩基対を形成する場合に形成され、ステムループエレメント、ステム１とステム２の間に位置する短い配列によって形成されるその末端に不対ループを含む二本鎖核酸配列をもたらす。したがって、ステムループは２つのステム（ステム１およびステム２）を含み、これらは－核酸分子の二次構造のレベルでは－互いに塩基対を形成し、および－核酸分子の一次構造のレベルでは－ステム１またはステム２の一部ではない短い配列によって分離されている。説明すると、ステムループの二次元表示はロリポップ形構造に類似する。ステムループ構造の形成には、それ自体が折りたたまれて対合した二本鎖を形成することができる配列の存在が必要である；対合した二本鎖はステム１とステム２によって形成される。対合したステムループエレメントの安定性は、典型的には、長さ、ステム２のヌクレオチドと塩基対（好ましくは正準塩基対、より好ましくはワトソン－クリック塩基対）を形成することができるステム１のヌクレオチドの数と、ステム２のヌクレオチドとそのような塩基対を形成することができない（ミスマッチまたはバルジ）ステム１のヌクレオチドの数とによって決定される。本発明によれば、最適なループ長は３～１０ヌクレオチド、より好ましくは４～７ヌクレオチド、例えば４ヌクレオチド、５ヌクレオチド、６ヌクレオチドまたは７ヌクレオチドである。所与の核酸配列がステムループを特徴とする場合、それぞれの相補的な核酸配列も、典型的にはステムループを特徴とする。ステムループは、典型的には一本鎖ＲＮＡ分子によって形成される。例えば、アルファウイルスゲノムＲＮＡの５'複製認識配列には、いくつかのステムループが存在する（図５に示されている）。

【0182】

本発明によれば、核酸分子の特定の二次構造（例えばステムループ）に関して「破壊」または「破壊する」とは、特定の二次構造が存在しないかまたは改変されていることを意味する。典型的には、二次構造は、二次構造の一部である少なくとも１つのヌクレオチドの変化の結果として破壊され得る。例えば、ステムループは、ステムを形成する１つ以上のヌクレオチドの変化によって破壊され得るため、ヌクレオチドの対合は不可能である。

【0183】

本発明によれば、「二次構造破壊を補償する」または「二次構造破壊の補償」とは、核酸配列の１つ以上のヌクレオチド変化を指す；より典型的には、以下を特徴とする、１つ以上の第１のヌクレオチド変化も含む核酸配列における１つ以上の第２のヌクレオチド変化を指す：１つ以上の第１のヌクレオチド変化は、１つ以上の第２のヌクレオチド変化が存在しない場合、核酸配列の二次構造の破壊を引き起こすが、１つ以上の第１のヌクレオチド変化と１つ以上の第２のヌクレオチド変化の共起は、核酸の二次構造の破壊を引き起こさない。共起とは、１つ以上の第１のヌクレオチド変化と１つ以上の第２のヌクレオチド変化の両方の存在を意味する。典型的には、１つ以上の第１のヌクレオチド変化と１つ以上の第２のヌクレオチド変化は、同じ核酸分子内に一緒に存在する。特定の実施形態では、二次構造破壊を補償する１つ以上のヌクレオチド変化は、１つ以上のヌクレオチド対合破壊を補償する１つ以上のヌクレオチド変化である。したがって、一実施形態では、「二次構造破壊の補償」とは、「ヌクレオチド対合破壊の補償」、すなわち１つ以上のヌクレオチド対合破壊、例えば１つ以上のステムループ内の１つ以上のヌクレオチド対合破壊の補償を意味する。１つ以上１つ以上のヌクレオチド対合破壊は、少なくとも１つの開始コドンの除去によって導入された可能性がある。二次構造破壊を補償する１つ以上のヌクレオチド変化の各々は、１つ以上のヌクレオチドの欠失、付加、置換および／または挿入からそれぞれ独立して選択され得るヌクレオチド変化である。説明のための例では、ヌクレオチド対合Ａ：ＵがＡからＣへの置換によって破壊された場合（ＣおよびＵは、典型的にはヌクレオチド対を形成するのに適さない）、ヌクレオチド対合破壊を補償するヌクレオチド変化は、ＧによるＵの置換であり得、それによってＣ：Ｇヌクレオチド対合の形成が可能になる。したがって、ＧによるＵの置換は、ヌクレオチド対合破壊を補償する。代替的な例では、ヌクレオチド対合Ａ：ＵがＡからＣへの置換によって破壊された場合、ヌクレオチド対合破壊を補償するヌクレオチド変化は、ＡによるＣの置換であり得、それによって元のＡ：Ｕヌクレオチド対合の形成が回復する。一般に、本発明では、元の核酸配列を回復せず、新規のＡＵＧトリプレットも生成しない、二次構造破壊を補償するヌクレオチド変化が好ましい。上記の一連の例では、ＵからＧへの置換がＣからＡへの置換よりも好ましい。

【0184】

本発明によれば、核酸分子に関して「三次構造」という用語は、原子座標によって定義される核酸分子の三次元構造を指す。

【0185】

本発明によれば、ＲＮＡ、例えばｍＲＮＡなどの核酸は、ペプチドまたはタンパク質をコードし得る。したがって、転写可能な核酸配列またはその転写物は、ペプチドまたはタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含み得る。

【0186】

本発明によれば、「ペプチドまたはタンパク質をコードする核酸」という用語は、核酸が、適切な環境、好ましくは細胞内に存在する場合、翻訳過程中にペプチドまたはタンパク質を産生するようにアミノ酸の集合体に指令できることを意味する。好ましくは、本発明によるコードＲＮＡは、コードＲＮＡの翻訳を可能にする細胞翻訳機構と相互作用して、ペプチドまたはタンパク質を生成することができる。

【0187】

本発明によれば、「ペプチド」という用語は、オリゴペプチドおよびポリペプチドを含み、ペプチド結合を介して互いに連結された２個以上、好ましくは３個以上、好ましくは４個以上、好ましくは６個以上、好ましくは８個以上、好ましくは１０個以上、好ましくは１３個以上、好ましくは１６個以上、好ましくは２０個以上、および最大で好ましくは５０個、好ましくは１００個または好ましくは１５０個までの連続するアミノ酸を含む物質を指す。「タンパク質」という用語は、大きなペプチド、好ましくは少なくとも１５１個のアミノ酸を有するペプチドを指すが、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、本明細書では通常同義語として使用される。

【0188】

「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、本発明によれば、アミノ酸成分だけでなく、糖およびリン酸構造体などの非アミノ酸成分も含む物質を含み、エステル、チオエーテルまたはジスルフィド結合などの結合を含む物質も含む。

【0189】

本発明によれば、「開始コドン」および「出発コドン」という用語は、同義的に、リボソームによって翻訳される最初のコドンである可能性のあるＲＮＡ分子のコドン（塩基トリプレット）を指す。そのようなコドンは、典型的には真核生物のアミノ酸メチオニンおよび原核生物の修飾メチオニンをコードする。真核生物および原核生物における最も一般的な開始コドンはＡＵＧである。本明細書でＡＵＧ以外の開始コドンを意味すると特に明記されない限り、ＲＮＡ分子に関して「開始コドン」および「出発コドン」という用語は、コドンＡＵＧを指す。本発明によれば、「開始コドン」および「出発コドン」という用語はまた、デオキシリボ核酸の対応する塩基トリプレット、すなわちＲＮＡの開始コドンをコードする塩基トリプレットを指すためにも使用される。メッセンジャーＲＮＡの開始コドンがＡＵＧである場合、ＡＵＧをコードする塩基トリプレットはＡＴＧである。本発明によれば、「開始コドン」および「出発コドン」という用語は、好ましくは機能的な開始コドンまたは出発コドン、すなわち翻訳を開始するためにリボソームによってコドンとして使用されるまたは使用されることになる開始コドンまたは出発コドンを指す。ＲＮＡ分子には、例えばコドンからキャップまでの距離が短いために、翻訳を開始するためにリボソームによってコドンとして使用されないＡＵＧコドンが存在し得る。これらのコドンは、機能的な開始コドンまたは出発コドンという用語には包含されない。

【0190】

本発明によれば、「オープンリーディングフレームの出発コドン」または「オープンリーディングフレームの開始コドン」という用語は、コード配列、例えば自然界で見出される核酸分子のコード配列におけるタンパク質合成の開始コドンとして働く塩基トリプレットを指す。ＲＮＡ分子では、オープンリーディングフレームの開始コドンの前に５'非翻訳領域（５'－ＵＴＲ）がしばしば存在するが、これは厳密には必要ではない。

【0191】

本発明によれば、「オープンリーディングフレームの天然の出発コドン」または「オープンリーディングフレームの天然の開始コドン」という用語は、天然のコード配列におけるタンパク質合成の開始コドンとして働く塩基トリプレットを指す。天然のコード配列は、例えば自然界で見出される核酸分子のコード配列であり得る。いくつかの実施形態では、本発明は、自然界で見出される核酸分子の変異体を提供し、これは、天然の開始コドン（天然のコード配列中に存在する）が除去されている（そのため変異体核酸分子には存在しない）ことを特徴とする。

【0192】

本発明によれば、「最初のＡＵＧ」は、メッセンジャーＲＮＡ分子の最も上流のＡＵＧ塩基トリプレット、好ましくは翻訳を開始するためにリボソームによってコドンとして使用されるまたは使用されることになるメッセンジャーＲＮＡ分子の最も上流のＡＵＧ塩基トリプレットを意味する。したがって、「最初のＡＴＧ」とは、最初のＡＵＧをコードするコードＤＮＡ配列のＡＴＧ塩基トリプレットを指す。いくつかの場合には、ｍＲＮＡ分子の最初のＡＵＧは、オープンリーディングフレームの開始コドン、すなわちリボソームタンパク質合成中に開始コドンとして使用されるコドンである。

【0193】

本発明によれば、核酸変異体の特定のエレメントに関して「除去を含む」または「除去を特徴とする」という用語および同様の用語は、参照核酸分子と比較して、前記特定のエレメントが核酸変異体において機能しないかまたは存在しないことを意味する。限定されることなく、除去は、特定のエレメントのすべてもしくは一部の欠失、特定のエレメントのすべてもしくは一部の置換、または特定のエレメントの機能的もしくは構造的特性の改変で構成され得る。核酸配列の機能的エレメントの除去は、機能が、除去を含む核酸変異体の位置で示されないことを必要とする。例えば、特定の開始コドンの除去を特徴とするＲＮＡ変異体は、リボソームタンパク質合成が除去を特徴とするＲＮＡ変異体の位置で開始されないことを必要とする。核酸配列の構造エレメントの除去は、構造エレメントが除去を含む核酸変異体の位置に存在しないことを必要とする。例えば、特定のＡＵＧ塩基トリプレット、すなわち特定の位置のＡＵＧ塩基トリプレットの除去を特徴とするＲＮＡ変異体は、例えば、特定のＡＵＧ塩基トリプレット（例えばΔＡＵＧ）の一部もしくはすべての欠失、または特定のＡＵＧ塩基トリプレットの１つ以上のヌクレオチド（Ａ、Ｕ、Ｇ）の、１つ以上の異なるヌクレオチドによる置換を特徴とし得るため、生じる変異体のヌクレオチド配列は前記ＡＵＧ塩基トリプレットを含まない。１個のヌクレオチドの適切な置換は、ＡＵＧ塩基トリプレットをＧＵＧ、ＣＵＧもしくはＵＵＧ塩基トリプレットに、またはＡＡＧ、ＡＣＧもしくはＡＧＧ塩基トリプレットに、またはＡＵＡ、ＡＵＣもしくはＡＵＵ塩基トリプレットに変換するものである。より多くのヌクレオチドの適切な置換を、それに応じて選択することができる。

【0194】

本発明によれば、「アルファウイルス」という用語は広く理解されるべきであり、アルファウイルスの特徴を有する任意のウイルス粒子を含む。アルファウイルスの特徴には、ＲＮＡポリメラーゼ活性を含む、宿主細胞での複製に適した遺伝情報をコードする（＋）鎖ＲＮＡの存在が含まれる。多くのアルファウイルスのさらなる特徴は、例えばＳｔｒａｕｓ＆Ｓｔｒａｕｓｓ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，１９９４，ｖｏｌ．５８，ｐｐ．４９１－５６２に記載されている。「アルファウイルス」という用語は、自然界で見出されるアルファウイルス、およびそのあらゆる変異体または誘導体を含む。いくつかの実施形態では、変異体または誘導体は自然界では見出されない。

【0195】

一実施形態では、アルファウイルスは、自然界で見出されるアルファウイルスである。典型的には、自然界で見出されるアルファウイルスは、動物（ヒトなどの脊椎動物、および昆虫などの節足動物を含む）などの１つ以上の真核生物に対して感染性である。

【0196】

自然界で見出されるアルファウイルスは、好ましくは以下からなる群より選択される：バーマフォレストウイルス複合体（バーマフォレストウイルスを含む）；東部ウマ脳炎複合体（７つの抗原型の東部ウマ脳炎ウイルスを含む）；ミデルブルグウイルス複合体（ミデルブルグウイルスを含む）；ヌドゥムウイルス複合体（ヌドゥムウイルスを含む）；セムリキ森林ウイルス複合体（ベバルウイルス、チクングニアウイルス、マヤロウイルスおよびそのサブタイプであるウナウイルス、オニョンニョンウイルスおよびそのサブタイプであるイグボオラウイルス、ロスリバーウイルスおよびそのサブタイプであるベバルウイルス、ゲタウイルス、サギヤマウイルス、セムリキ森林ウイルスおよびそのサブタイプであるメトリウイルスを含む）；ベネズエラウマ脳炎複合体（カバソウウイルス、エバーグレーズウイルス、モッソダスペドラスウイルス、ムカンボウイルス、パラマナウイルス、ピクスナウイルス、リオネグロウイルス、トロカラウイルスおよびそのサブタイプであるビジューブリッジウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルスを含む）；西部ウマ脳炎複合体（アウラウイルス、ババンキーウイルス、キジラガッチェウイルス、シンドビスウイルス、オケルボウイルス、ワタロアウイルス、バギークリークウイルス、フォートモーガンウイルス、ハイランドＪウイルス、西部ウマ脳炎ウイルスを含む）；ならびにサケ膵臓病ウイルスを含むいくつかの未分類ウイルス；睡眠病ウイルス；ミナミゾウアザラシウイルス、トナテウイルス。より好ましくは、アルファウイルスは、セムリキ森林ウイルス複合体（セムリキ森林ウイルスを含む、上記に示したようなウイルス型を含む）、西部ウマ脳炎複合体（シンドビスウイルスを含む、上記に示したようなウイルス型を含む）、東部ウマ脳炎ウイルス（上記に示したようなウイルス型を含む）、ベネズエラウマ脳炎複合体（ベネズエラウマ脳炎ウイルスを含む、上記に示したようなウイルス型を含む）からなる群より選択される。

【0197】

さらなる好ましい実施形態では、アルファウイルスはセムリキ森林ウイルスである。代替的なさらなる好ましい実施形態では、アルファウイルスはシンドビスウイルスである。代替的なさらなる好ましい実施形態では、アルファウイルスはベネズエラウマ脳炎ウイルスである。

【0198】

本発明のいくつかの実施形態では、アルファウイルスは、自然界で見出されるアルファウイルスではない。典型的には、自然界では見出されないアルファウイルスは、ヌクレオチド配列、すなわちゲノムＲＮＡの少なくとも１つの変異によって自然界で見出されるアルファウイルスとは区別される、自然界で見出されるアルファウイルスの変異体または誘導体である。ヌクレオチド配列の変異は、自然界で見出されるアルファウイルスと比較して、１つ以上のヌクレオチドの挿入、置換または欠失から選択され得る。ヌクレオチド配列の変異は、ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドまたはタンパク質における変異と関連していてもよく、または関連していなくてもよい。例えば、自然界では見出されないアルファウイルスは、弱毒化アルファウイルスであり得る。自界では見出されない弱毒化アルファウイルスは、典型的にはそのヌクレオチド配列中に少なくとも１つの変異を有し、この変異によって自然界で見出されるアルファウイルスとは区別され、および全く感染性ではないか、または感染性ではあるが疾患を引き起こす能力がより低いもしくは疾患を引き起こす能力を全く有さないアルファウイルスである。説明のための例として、ＴＣ８３は、自然界で見出されるベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）とは区別される弱毒化アルファウイルスである（ＭｃＫｉｎｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９６３，Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．，１９６３，ｖｏｌ．１２；ｐｐ．５９７－６０３）。

【0199】

アルファウイルス属のメンバーはまた、ヒトにおけるそれらの相対的な臨床的特徴に基づいて、すなわち主に脳炎に関連するアルファウイルスと、主に発熱、発疹、および多発性関節炎に関連するアルファウイルスとに分類され得る。

【0200】

「アルファウイルス性」という用語は、アルファウイルスにおいて見出される、またはアルファウイルスを起源とする、または、例えば遺伝子工学によってアルファウイルスから誘導されることを意味する。

【0201】

本発明によれば、「ＳＦＶ」はセムリキ森林ウイルスを表す。本発明によれば、「ＳＩＮ」または「ＳＩＮＶ」はシンドビスウイルスを表す。本発明によれば、「ＶＥＥ」または「ＶＥＥＶ」はベネズエラウマ脳炎ウイルスを表す。

【0202】

本発明によれば、「アルファウイルスの」という用語は、アルファウイルスを起源とする実体を指す。説明すると、アルファウイルスのタンパク質は、アルファウイルスに見出されるタンパク質および／またはアルファウイルスによってコードされるタンパク質を指し得、アルファウイルスの核酸配列は、アルファウイルスに見出される核酸配列および／またはアルファウイルスによってコードされる核酸配列を指し得る。好ましくは、「アルファウイルスの」核酸配列は、「アルファウイルスのゲノムの」および／または「アルファウイルスのゲノムＲＮＡの」核酸配列を指す。

【0203】

本発明によれば、「アルファウイルスＲＮＡ」という用語は、アルファウイルスゲノムＲＮＡ（すなわち（＋）鎖）、アルファウイルスゲノムＲＮＡの相補体（すなわち（－）鎖）、およびサブゲノム転写物（すなわち（＋）鎖）、またはそのいずれかの断片のうちの任意の１つ以上を指す。

【0204】

本発明によれば、「アルファウイルスゲノム」は、アルファウイルスのゲノム（＋）鎖ＲＮＡを指す。

【0205】

本発明によれば、「天然のアルファウイルス配列」という用語および同様の用語は、典型的には、天然に存在するアルファウイルス（自然界で見出されるアルファウイルス）の（例えば核酸）配列を指す。いくつかの実施形態では、「天然のアルファウイルス配列」という用語には、弱毒化アルファウイルスの配列も含まれる。

【0206】

本発明によれば、「５'複製認識配列」という用語は、好ましくはアルファウイルスゲノムの５'断片と同一または相同である連続する核酸配列、好ましくはリボ核酸配列を指す。「５'複製認識配列」は、アルファウイルスのレプリカーゼによって認識され得る核酸配列である。５'複製認識配列という用語には、天然の５'複製認識配列およびその機能的等価物、例えば自然界で見出されるアルファウイルスの５'複製認識配列の機能的変異体が含まれる。本発明によれば、機能的等価物には、本明細書に記載の少なくとも１つの開始コドンの除去を特徴とする５'複製認識配列の誘導体が含まれる。５'複製認識配列は、アルファウイルスゲノムＲＮＡの（－）鎖相補体の合成に必要であり、（－）鎖鋳型に基づく（＋）鎖ウイルスゲノムＲＮＡの合成に必要である。天然の５'複製認識配列は、典型的には少なくともｎｓＰ１のＮ末端断片をコードするが、ｎｓＰ１２３４をコードするオープンリーディングフレーム全体は含まない。天然の５'複製認識配列が、典型的には少なくともｎｓＰ１のＮ末端断片をコードするという事実を考慮すると、天然の５'複製認識配列は、典型的には少なくとも１つの開始コドン、典型的にはＡＵＧを含む。一実施形態では、５'複製認識配列は、アルファウイルスゲノムの保存された配列エレメント１（ＣＳＥ １）またはその変異体およびアルファウイルスゲノムの保存された配列エレメント２（ＣＳＥ ２）またはその変異体を含む。５'複製認識配列は、典型的には４つのステムループ（ＳＬ）、すなわちＳＬ１、ＳＬ２、ＳＬ３、ＳＬ４を形成することができる。これらのステムループの番号付けは、５'複製認識配列の５'末端から始まる。

【0207】

本発明によれば、「アルファウイルスの５'末端に」という用語は、アルファウイルスのゲノムの５'末端を指す。アルファウイルスの５'末端の核酸配列は、アルファウイルスのゲノムＲＮＡの５'末端に位置するヌクレオチドに加えて、場合によりさらなるヌクレオチドの連続する配列を含む。一実施形態では、アルファウイルスの５'末端の核酸配列は、アルファウイルスゲノムの５'複製認識配列と同一である。

【0208】

「保存された配列エレメント」または「ＣＳＥ」という用語は、アルファウイルスＲＮＡに見出されるヌクレオチド配列を指す。これらの配列エレメントは、オルソログが異なるアルファウイルスのゲノムに存在し、異なるアルファウイルスのオルソログＣＳＥが、好ましくは高い割合の配列同一性および／または類似の二次もしくは三次構造を共有するため、「保存された」と称される。ＣＳＥという用語には、ＣＳＥ １、ＣＳＥ ２、ＣＳＥ ３およびＣＳＥ ４が含まれる。

【0209】

本発明によれば、「ＣＳＥ １」または「４４－ｎｔ ＣＳＥ」という用語は、同義的に、（－）鎖鋳型からの（＋）鎖合成に必要なヌクレオチド配列を指す。「ＣＳＥ １」という用語は、（＋）鎖上の配列を指し、（（－）鎖上の）ＣＳＥ １の相補的配列は（＋）鎖合成のプロモータとして機能する。好ましくは、ＣＳＥ １という用語は、アルファウイルスゲノムの最も５'側のヌクレオチドを含む。ＣＳＥ １は、典型的には保存されたステムループ構造を形成する。特定の理論に拘束されることを望むものではないが、ＣＳＥ １の場合、二次構造は、一次構造、すなわち直鎖状配列よりも重要であると考えられている。モデルアルファウイルスであるシンドビスウイルスのゲノムＲＮＡでは、ＣＳＥ １は、ゲノムＲＮＡの最も５'側の４４個のヌクレオチドによって形成される、４４個のヌクレオチドの連続する配列からなる（Ｓｔｒａｕｓｓ＆Ｓｔｒａｕｓｓ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，１９９４，ｖｏｌ．５８，ｐｐ．４９１－５６２）。

【0210】

本発明によれば、「ＣＳＥ ２」または「５１－ｎｔ ＣＳＥ」という用語は、同義的に、（＋）鎖鋳型からの（－）鎖合成に必要なヌクレオチド配列を指す。（＋）鎖鋳型は、典型的にはアルファウイルスゲノムＲＮＡまたはＲＮＡレプリコンである（ＣＳＥ ２を含まないサブゲノムＲＮＡ転写物は（－）鎖合成のための鋳型として機能しないことに留意されたい）。アルファウイルスのゲノムＲＮＡでは、ＣＳＥ ２は、典型的にはｎｓＰ１のコード配列内に局在する。モデルアルファウイルスであるシンドビスウイルスのゲノムＲＮＡでは、５１－ｎｔ ＣＳＥはゲノムＲＮＡのヌクレオチド位置１５５～２０５に位置する（Ｆｒｏｌｏｖ ｅｔ ａｌ．，２００１，ＲＮＡ，ｖｏｌ．７，ｐｐ．１６３８－１６５１）。ＣＳＥ ２は、典型的には２つの保存されたステムループ構造を形成する。これらのステムループ構造は、アルファウイルスゲノムＲＮＡの５'末端から数えて、それぞれアルファウイルスゲノムＲＮＡの３番目と４番目の保存されたステムループであるため、ステムループ３（ＳＬ３）およびステムループ４（ＳＬ４）と呼称される。特定の理論に拘束されることを望むものではないが、ＣＳＥ ２の場合、二次構造は、一次構造、すなわち直鎖状配列よりも重要であると考えられている。

【0211】

本発明によれば、「ＣＳＥ ３」または「接合配列」という用語は、同義的に、アルファウイルスゲノムＲＮＡに由来し、サブゲノムＲＮＡの開始部位を含むヌクレオチド配列を指す。（－）鎖におけるこの配列の相補体は、サブゲノムＲＮＡ転写を促進するように作用する。アルファウイルスゲノムＲＮＡでは、ＣＳＥ ３は、典型的にはｎｓＰ４のＣ末端断片をコードする領域と重複し、構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームの上流に位置する短い非コード領域にまで及ぶ。

【0212】

本発明によれば、「ＣＳＥ ４」または「１９－ｎｔの保存された配列」または「１９－ｎｔ ＣＳＥ」という用語は、同義的に、アルファウイルスゲノムの３'非翻訳領域のポリ（Ａ）配列のすぐ上流の、アルファウイルスゲノムＲＮＡからのヌクレオチド配列を指す。ＣＳＥ ４は、典型的には１９個の連続するヌクレオチドからなる。特定の理論に拘束されることを望むものではないが、ＣＳＥ ４は、（－）鎖合成の開始のためのコアプロモータとして機能すると理解されており（Ｊｏｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｆｕｔｕｒｅ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２００９，ｖｏｌ．４，ｐｐ．８３７－８５６）、および／またはアルファウイルスゲノムＲＮＡのＣＳＥ ４およびポリ（Ａ）尾部は、効率的な（－）鎖合成のために一緒に機能すると理解されている（Ｈａｒｄｙ＆Ｒｉｃｅ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，２００５，ｖｏｌ．７９，ｐｐ．４６３０－４６３９）。

【0213】

本発明によれば、「サブゲノムプロモータ」または「ＳＧＰ」という用語は、核酸配列（例えばコード配列）の上流（５'側）の核酸配列であって、ＲＮＡポリメラーゼ、典型的にはＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、特に機能性アルファウイルス非構造タンパク質の認識および結合部位を提供することによって前記核酸配列の転写を制御する核酸配列を指す。ＳＧＰは、さらなる因子のためのさらなる認識または結合部位を含み得る。サブゲノムプロモータは、典型的にはアルファウイルスなどのプラス鎖ＲＮＡウイルスの遺伝要素である。アルファウイルスのサブゲノムプロモータは、ウイルスゲノムＲＮＡに含まれる核酸配列である。サブゲノムプロモータは、一般に、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、例えば機能性アルファウイルス非構造タンパク質の存在下で転写の開始（ＲＮＡ合成）を可能にすることを特徴とする。ＲＮＡ（－）鎖、すなわちアルファウイルスゲノムＲＮＡの相補体は、（＋）鎖サブゲノム転写物の合成のための鋳型として働き、（＋）鎖サブゲノム転写物の合成は、典型的にはサブゲノムプロモータにおいてまたはその近くで開始される。本明細書で使用される「サブゲノムプロモータ」という用語は、そのようなサブゲノムプロモータを含む核酸内の特定の局在化に限定されない。一部の実施形態では、ＳＧＰは、ＣＳＥ ３と同一であるか、ＣＳＥ ３と重複するか、またはＣＳＥ ３を含む。

【0214】

「サブゲノム転写物」または「サブゲノムＲＮＡ」という用語は、同義的に、ＲＮＡ分子を鋳型（「鋳型ＲＮＡ」）として使用した転写の結果として得られるＲＮＡ分子を指し、鋳型ＲＮＡは、サブゲノム転写物の転写を制御するサブゲノムプロモータを含む。サブゲノム転写物は、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、特に機能性アルファウイルス非構造タンパク質の存在下で得られる。例えば、「サブゲノム転写物」という用語は、アルファウイルスゲノムＲＮＡの（－）鎖相補体を鋳型として使用して、アルファウイルスに感染した細胞で調製されるＲＮＡ転写物を指し得る。しかし、本明細書で使用される「サブゲノム転写物」という用語はそれに限定されず、異種ＲＮＡを鋳型として使用することによって得られる転写物も含む。例えば、サブゲノム転写物はまた、本発明によるＳＧＰ含有レプリコンの（－）鎖相補体を鋳型として使用することによっても入手され得る。したがって、「サブゲノム転写物」という用語は、アルファウイルスゲノムＲＮＡの断片を転写することによって得られるＲＮＡ分子、ならびに本発明によるレプリコンの断片を転写することにより得られるＲＮＡ分子を指し得る。

【0215】

「自家」という用語は、同じ被験体に由来するものを表すために使用される。例えば、「自己細胞」とは、同じ被験体に由来する細胞を指す。自己細胞の被験体への導入は、これらの細胞が、さもなければ拒絶反応をもたらす免疫学的障壁を克服するため、有利である。

【0216】

「同種異系」という用語は、同じ種の異なる個体に由来するものを表すために使用される。１つ以上の遺伝子座の遺伝子が同一でない場合、２つ以上の個体は互いに同種異系であると言われる。

【0217】

「同系」という用語は、同一の遺伝子型を有する個体または組織、すなわち一卵性双生児もしくは同じ近交系の動物、またはそれらの組織もしくは細胞に由来するものを表すために使用される。

【0218】

「異種」という用語は、複数の異なる要素からなるものを表すために使用される。一例として、ある個体の細胞を異なる個体に導入することは、異種移植を構成する。異種遺伝子は、被験体以外の供給源に由来する遺伝子である。

【0219】

以下は、本発明の個々の特徴の特定のおよび／または好ましい変形を提供する。本発明はまた、本発明の２つ以上の特徴について記載される特定のおよび／または好ましい変形の２つ以上を組み合わせることによって生成される実施形態を、特に好ましい実施形態として企図する。

【0220】

ＲＮＡレプリコン
レプリカーゼ、好ましくはアルファウイルスレプリカーゼによって複製されることができる核酸構築物は、レプリコンと称される。本発明によれば、「レプリコン」という用語は、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによって複製され、ＤＮＡ中間体なしで、ＲＮＡレプリコンの１つまたは複数の同一または本質的に同一のコピーを生成することができるＲＮＡ分子を定義する。「ＤＮＡ中間体なしで」とは、ＲＮＡレプリコンのコピーを形成する過程で、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）のコピーもしくはレプリコンの相補体が形成されないこと、および／またはＲＮＡレプリコンのコピーもしくはその相補体を形成する過程でデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子が鋳型として使用されないことを意味する。レプリカーゼの機能は、典型的には機能性アルファウイルス非構造タンパク質によって提供される。

【0221】

本発明によれば、「複製することができる」および「複製可能である」という用語は一般に、核酸の１つ以上の同一または本質的に同一のコピーが調製できることを表す。「レプリカーゼ」という用語と共に使用される場合、例えば「レプリカーゼによって複製可能である」などにおいて、「複製することができる」および「複製可能である」という用語は、レプリカーゼに関する、核酸分子、例えばＲＮＡレプリコンの機能的特徴を表す。これらの機能的特徴は、（ｉ）レプリカーゼがレプリコンを認識できること、および（ｉｉ）レプリカーゼがＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲＰ）として作用できることの少なくとも１つを含む。好ましくは、レプリカーゼは、（ｉ）レプリコンを認識すること、および（ｉｉ）ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼとして作用することの両方が可能である。

【0222】

「認識できる」という表現は、レプリカーゼがレプリコンと物理的に結合できること、および好ましくは、レプリカーゼが、典型的には非共有結合的に、レプリコンに結合できることを表す。「結合」という用語は、レプリカーゼが保存された配列エレメント１（ＣＳＥ １）またはその相補的配列（レプリコンに含まれる場合）、保存された配列エレメント２（ＣＳＥ ２）またはその相補的配列（レプリコンに含まれる場合）、保存された配列エレメント３（ＣＳＥ ３）またはその相補的配列（レプリコンに含まれる場合）、保存された配列エレメント４（ＣＳＥ ４）またはその相補的配列（レプリコンに含まれる場合）のいずれか１つ以上に結合する能力を有することを意味し得る。好ましくは、レプリカーゼは、ＣＳＥ ２［すなわち（＋）鎖］および／もしくはＣＳＥ ４［すなわち（＋）鎖］に結合することができるか、またはＣＳＥ １の相補体［すなわち（－）鎖］および／もしくはＣＳＥ ３の相補体［すなわち（－）鎖］に結合することができる。

【0223】

「ＲｄＲＰとして作用できる」という表現は、レプリカーゼが、（＋）鎖ＲＮＡが鋳型機能を有する場合、アルファウイルスゲノム（＋）鎖ＲＮＡの（－）鎖相補体の合成を触媒できること、および／またはレプリカーゼが、（－）鎖ＲＮＡが鋳型機能を有する場合、（＋）鎖アルファウイルスゲノムＲＮＡの合成を触媒できることを意味する。一般に、「ＲｄＲＰとして作用できる」という表現には、レプリカーゼが、（－）鎖ＲＮＡが鋳型機能を有し、および（＋）鎖サブゲノム転写物の合成が、典型的にはアルファウイルスサブゲノムプロモータで開始される場合、（＋）鎖サブゲノム転写物の合成を触媒できることも含まれ得る。

【0224】

「結合できる」および「ＲｄＲＰとして作用できる」という表現は、通常の生理学的条件での能力を指す。特に、機能性アルファウイルス非構造タンパク質を発現するか、または機能性アルファウイルス非構造タンパク質をコードする核酸でトランスフェクトされた細胞内の状態を指す。細胞は、好ましくは真核細胞である。結合の能力および／またはＲｄＲＰとして作用する能力は、例えば無細胞インビトロ系または真核細胞において、実験的に試験することができる。場合により、前記真核細胞は、レプリカーゼの起源である特定のアルファウイルスが感染性である種に由来する細胞である。例えば、ヒトに対して感染性である特定のアルファウイルス由来のアルファウイルスレプリカーゼが使用される場合、通常の生理学的条件はヒト細胞における条件である。より好ましくは、真核細胞（一例ではヒト細胞）は、レプリカーゼの起源である特定のアルファウイルスが感染性である同じ組織または器官に由来する。

【0225】

本発明によれば、「天然のアルファウイルス配列と比較して」および同様の用語は、天然のアルファウイルス配列の変異体である配列を指す。変異体は、典型的にはそれ自体が天然のアルファウイルス配列ではない。

【0226】

本発明のＲＮＡレプリコンは、５'複製認識配列を含む。５'複製認識配列は、機能性アルファウイルス非構造タンパク質によって認識され得る核酸配列である。言い換えれば、機能性アルファウイルス非構造タンパク質は、５'複製認識配列を認識することができる。

【0227】

一実施形態では、本発明のＲＮＡレプリコンは５'複製認識配列を含み、５'複製認識配列は、天然のアルファウイルス５'複製認識配列と比較して少なくとも１つの開始コドンの除去を含むことを特徴とする。

【0228】

本発明による、天然のアルファウイルス５'複製認識配列と比較して少なくとも１つの開始コドンの除去を含むことを特徴とする５'複製認識配列は、本明細書では「修飾５'複製認識配列」または「本発明による５'複製認識配列」と称され得る。本明細書で以下に記載されるように、本発明による５'複製認識配列は、場合により１つ以上の追加のヌクレオチド変化の存在を特徴とし得る。

【0229】

一実施形態では、ＲＮＡレプリコンは３'複製認識配列を含む。３'複製認識配列は、機能性アルファウイルス非構造タンパク質によって認識され得る核酸配列である。言い換えれば、機能性アルファウイルス非構造タンパク質は、３'複製認識配列を認識することができる。好ましくは、３'複製認識配列は、レプリコンの３'末端（レプリコンがポリ（Ａ）尾部を含まない場合）、またはポリ（Ａ）尾部のすぐ上流（レプリコンがポリ（Ａ）尾部を含む場合）に位置する。一実施形態では、３'複製認識配列は、ＣＳＥ ４からなるかまたはＣＳＥ ４を含む。

【0230】

一実施形態では、５'複製認識配列および３'複製認識配列は、機能性アルファウイルス非構造タンパク質の存在下で本発明によるＲＮＡレプリコンの複製を指令することができる。したがって、単独または好ましくは一緒に存在する場合、これらの認識配列は、機能性アルファウイルス非構造タンパク質の存在下でＲＮＡレプリコンの複製を指令する。

【0231】

機能性アルファウイルス非構造タンパク質は、シス（レプリコンのオープンリーディングフレームによって目的のタンパク質としてコードされる）またはトランス（第２の態様に記載されるように別のレプリカーゼ構築物のオープンリーディングフレームによって目的のタンパク質としてコードされる）で提供されることが好ましく、これは、レプリコンの場合により修飾された５'複製認識配列と３'複製認識配列の両方を認識することができる。一実施形態では、これは、５'複製認識配列および３'複製認識配列が機能性アルファウイルス非構造タンパク質が由来するアルファウイルスに天然である場合、または３'複製認識配列が機能性アルファウイルス非構造タンパク質が由来するアルファウイルスに天然であり、および修飾５'複製認識配列が機能性アルファウイルス非構造タンパク質が由来するアルファウイルスに天然である５'複製認識配列の変異体である場合に達成される。天然とは、これらの配列の天然の起源が同じアルファウイルスであることを意味する。別の実施形態では、（修飾）５'複製認識配列および／または３'複製認識配列は、機能性アルファウイルス非構造タンパク質がレプリコンの（修飾）５'複製認識配列と３'複製認識配列の両方を認識できることを条件として、機能性アルファウイルス非構造タンパク質が由来するアルファウイルスに天然ではない。言い換えれば、機能性アルファウイルス非構造タンパク質は、（修飾）５'複製認識配列および３'複製認識配列に適合性である。非天然の機能性アルファウイルス非構造タンパク質がそれぞれの配列または配列エレメントを認識できる場合、機能性アルファウイルス非構造タンパク質は適合性であると言われる（交差ウイルス適合性）。機能性アルファウイルス非構造タンパク質と（３'／５'）複製認識配列およびＣＳＥとの任意の組合せは、それぞれ、交差ウイルス適合性が存在する限り可能である。交差ウイルス適合性は、ＲＮＡ複製に適した条件で、例えば適切な宿主細胞で、試験する機能性アルファウイルス非構造タンパク質を、試験する３'および（場合により修飾された）５'複製認識配列を有するＲＮＡと共にインキュベートすることにより、本発明に携わる当業者によって容易に試験することができる。複製が起こる場合、（３'／５'）複製認識配列と機能性アルファウイルス非構造タンパク質は適合性であると決定される。

【0232】

少なくとも１つの開始コドンの除去はいくつかの利点を有する。ｎｓＰ１＊をコードする核酸配列に開始コドンが存在しないことは、典型的にはｎｓＰ１＊（ｎｓＰ１のＮ末端断片）が翻訳されないことを引き起こす。さらに、ｎｓＰ１＊は翻訳されないため、目的のタンパク質（「導入遺伝子」）をコードするオープンリーディングフレームは、リボソームがアクセスできる最も上流のオープンリーディングフレームである；したがって、レプリコンが細胞に存在する場合、翻訳は、目的の遺伝子をコードするオープンリーディングフレーム（ＲＮＡ）の最初のＡＵＧで開始される。これは、Ｓｐｕｕｌ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，２０１１，ｖｏｌ．８５，ｐｐ．４７３９－４７５１）によって記載されているような先行技術のトランスレプリコンを超える利点を示す：Ｓｐｕｕｌ ｅｔ ａｌ．によるレプリコンは、７４アミノ酸のペプチドであるｎｓＰ１のＮ末端部分の発現を指令する。また、特定の変異はＲＮＡを複製できなくすることがあり（国際公開第２０００／０５３７８０ Ａ２号）、アルファウイルスの複製に重要な５'構造の一部の除去は複製の効率に影響を及ぼす（Ｋａｍｒｕｄ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，ｖｏｌ．９１，ｐｐ．１７２３－１７２７）ため、完全長ウイルスゲノムからのＲＮＡレプリコンの構築が些細な問題ではないことも先行技術から公知である。

【0233】

従来のシスレプリコンを超える利点は、少なくとも１つの開始コドンの除去が、５'複製認識配列からアルファウイルス非構造タンパク質のコード領域を切り離すことである。これは、例えば天然の５'複製認識配列を人工配列、変異配列、または別のＲＮＡウイルスから取得した異種配列に交換することによって、シスレプリコンのさらなる操作を可能にする。従来のシスレプリコンにおけるそのような配列操作は、ｎｓＰ１のアミノ酸配列によって制限されている。任意の点突然変異、または点突然変異のクラスタは、複製が影響を受けるかどうか、およびタンパク質への有害な作用のためにフレームシフト突然変異につながる小さな挿入または欠失が不可能であるかどうかを実験的に評価する必要がある。

【0234】

本発明による少なくとも１つの開始コドンの除去は、当技術分野で公知の任意の適切な方法によって達成され得る。例えば、本発明によるレプリコンをコードする、すなわち開始コドンの除去を特徴とする適切なＤＮＡ分子をインシリコで設計し、その後インビトロで合成することができる（遺伝子合成）；あるいは、レプリコンをコードするＤＮＡ配列の部位特異的突然変異誘発によって適切なＤＮＡ分子を入手し得る。いずれの場合も、それぞれのＤＮＡ分子はインビトロ転写のための鋳型として働くことができ、それによって本発明によるレプリコンを提供する。

【0235】

天然のアルファウイルス５'複製認識配列と比較した少なくとも１つの開始コドンの除去は、特に限定されず、１つ以上のヌクレオチドの置換（ＤＮＡレベルでの開始コドンのＡおよび／またはＴおよび／またはＧの置換を含む）、１つ以上のヌクレオチドの欠失（ＤＮＡレベルでの開始コドンのＡおよび／またはＴおよび／またはＧの欠失を含む）、ならびに１つ以上のヌクレオチドの挿入（ＤＮＡレベルでの開始コドンのＡとＴの間および／またはＴとＧの間の１つ以上のヌクレオチドの挿入を含む）を含む任意のヌクレオチド修飾から選択され得る。ヌクレオチド修飾が置換、挿入または欠失であるかどうかにかかわらず、ヌクレオチド修飾は新しい開始コドンの形成をもたらしてはならない（説明のための例として：ＤＮＡレベルでの挿入はＡＴＧの挿入であってはならない）。

【0236】

少なくとも１つの開始コドンの除去を特徴とするＲＮＡレプリコンの５'複製認識配列（すなわち本発明による修飾５'複製認識配列）は、好ましくは自然界で見出されるアルファウイルスのゲノムの５'複製認識配列の変異体である。一実施形態では、本発明による修飾５'複製認識配列は、好ましくは、自然界で見出される少なくとも１つのアルファウイルスのゲノムの５'複製認識配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上の配列同一性の程度を特徴とする。

【0237】

一実施形態では、少なくとも１つの開始コドンの除去を特徴とするＲＮＡレプリコンの５'複製認識配列は、アルファウイルスの５'末端、すなわちアルファウイルスゲノムの５'末端の約２５０個のヌクレオチドに相同な配列を含む。好ましい実施形態では、前記５'複製認識配列は、アルファウイルスの５'末端、すなわちアルファウイルスゲノムの５'末端の約２５０～５００個、好ましくは約３００～５００個のヌクレオチドに相同な配列を含む。「アルファウイルスゲノムの５'末端」とは、アルファウイルスゲノムの最も上流のヌクレオチドから始まり、それを含む核酸配列を意味する。言い換えれば、アルファウイルスゲノムの最も上流のヌクレオチドは、ヌクレオチド番号１と呼称され、例えば「アルファウイルスゲノムの５'末端の２５０個のヌクレオチド」とは、アルファウイルスゲノムのヌクレオチド１～２５０を意味する。一実施形態では、少なくとも１つの開始コドンの除去を特徴とするＲＮＡレプリコンの５'複製認識配列は、自然界で見出される少なくとも１つのアルファウイルスのゲノムの５'末端の少なくとも２５０個のヌクレオチドと８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上の配列同一性の程度を特徴とする。少なくとも２５０個のヌクレオチドには、例えば２５０個のヌクレオチド、３００個のヌクレオチド、４００個のヌクレオチド、５００個のヌクレオチドが含まれる。

【0238】

自然界で見出されるアルファウイルスの５'複製認識配列は、典型的には少なくとも１つの開始コドンおよび／または保存された二次構造モチーフを特徴とする。例えば、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）の天然の５'複製認識配列は、５つの特定のＡＵＧ塩基トリプレットを含む。Ｆｒｏｌｏｖ ｅｔ ａｌ．（２００１，ＲＮＡ，ｖｏｌ．７，ｐｐ．１６３８－１６５１）によれば、ＭＦＯＬＤによる分析は、セムリキ森林ウイルスの天然の５'複製認識配列が、ステムループ１～４（ＳＬ１、ＳＬ２、ＳＬ３、ＳＬ４）と称される４つのステムループ（ＳＬ）を形成すると予測されることを明らかにした。Ｆｒｏｌｏｖ ｅｔ ａｌ．によれば、ＭＦＯＬＤによる分析は、異なるアルファウイルスであるシンドビスウイルスの天然の５'複製認識配列も、４つのステムループ：ＳＬ１、ＳＬ２、ＳＬ３、ＳＬ４を形成すると予測されることを明らかにした。

【0239】

アルファウイルスゲノムの５'末端には、機能性アルファウイルス非構造タンパク質によるアルファウイルスゲノムの複製を可能にする配列エレメントが含まれることは公知である。本発明の一実施形態では、ＲＮＡレプリコンの５'複製認識配列は、アルファウイルスの保存された配列エレメント１（ＣＳＥ １）に相同な配列および／または保存された配列エレメント２（ＣＳＥ ２）に相同な配列を含む。

【0240】

アルファウイルスゲノムＲＮＡの保存された配列エレメント２（ＣＳＥ ２）は、典型的には、アルファウイルス非構造タンパク質ｎｓＰ１の最初のアミノ酸残基をコードする天然の開始コドンを少なくとも含むＳＬ２が先行するＳＬ３およびＳＬ４で表される。しかし、この説明において、いくつかの実施形態では、アルファウイルスゲノムＲＮＡの保存された配列エレメント２（ＣＳＥ ２）は、ＳＬ２からＳＬ４にまたがり、アルファウイルス非構造タンパク質ｎｓＰ１の最初のアミノ酸残基をコードする天然の開始コドンを含む領域を指す。好ましい実施形態では、ＲＮＡレプリコンは、ＣＳＥ ２またはＣＳＥ ２に相同な配列を含む。一実施形態では、ＲＮＡレプリコンは、好ましくは、自然界で見出される少なくとも１つのアルファウイルスのＣＳＥ ２の配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上の配列同一性の程度を特徴とする、ＣＳＥ ２に相同な配列を含む。

【0241】

好ましい実施形態では、５'複製認識配列は、アルファウイルスのＣＳＥ ２に相同な配列を含む。アルファウイルスのＣＳＥ ２は、アルファウイルス由来の非構造タンパク質のオープンリーディングフレームの断片を含み得る。

【0242】

したがって、好ましい実施形態では、ＲＮＡレプリコンは、アルファウイルス由来の非構造タンパク質のオープンリーディングフレームまたはその断片に相同な配列を含むことを特徴とする。非構造タンパク質のオープンリーディングフレームまたはその断片に相同な配列は、典型的には自然界で見出されるアルファウイルスの非構造タンパク質のオープンリーディングフレームまたはその断片の変異体である。一実施形態では、非構造タンパク質のオープンリーディングフレームまたはその断片に相同な配列は、好ましくは、自然界で見出される少なくとも１つのアルファウイルスの非構造タンパク質のオープンリーディングフレームまたはその断片と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上の配列同一性の程度を特徴とする。

【0243】

より好ましい実施形態では、本発明のレプリコンに含まれる非構造タンパク質のオープンリーディングフレームに相同な配列は、非構造タンパク質の天然の開始コドンを含まず、より好ましくは非構造タンパク質のいかなる開始コドンも含まない。好ましい実施形態では、ＣＳＥ ２に相同な配列は、天然のアルファウイルスＣＳＥ ２配列と比較して、すべての開始コドンが除去されていることを特徴とする。したがって、ＣＳＥ ２に相同な配列は、好ましくはいかなる開始コドンも含まない。

【0244】

オープンリーディングフレームに相同な配列がいかなる開始コドンも含まない場合、オープンリーディングフレームに相同な配列は、翻訳の鋳型として機能しないため、それ自体オープンリーディングフレームではない。

【0245】

一実施形態では、５'複製認識配列は、アルファウイルス由来の非構造タンパク質のオープンリーディングフレームまたはその断片に相同な配列を含み、アルファウイルス由来の非構造タンパク質のオープンリーディングフレームまたはその断片に相同な配列は、天然のアルファウイルス配列と比較して少なくとも１つの開始コドンの除去を含むことを特徴とする。

【0246】

好ましい実施形態では、アルファウイルス由来の非構造タンパク質のオープンリーディングフレームまたはその断片に相同な配列は、少なくとも非構造タンパク質のオープンリーディングフレームの天然開始コドンの除去を含むことを特徴とする。好ましくは、前記配列は、少なくともｎｓＰ１をコードするオープンリーディングフレームの天然開始コドンの除去を含むことを特徴とする。

【0247】

天然の開始コドンは、宿主細胞にＲＮＡが存在する場合に宿主細胞のリボソームでの翻訳が始まるＡＵＧ塩基トリプレットである。言い換えれば、天然の開始コドンは、例えば天然の開始コドンを含むＲＮＡが接種された宿主細胞において、リボソームタンパク質合成中に翻訳される最初の塩基トリプレットである。一実施形態では、宿主細胞は、天然のアルファウイルス５'複製認識配列を含む特定のアルファウイルスの天然宿主である真核生物種由来の細胞である。好ましい実施形態では、宿主細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ，ＵＳＡから入手可能な細胞株「ＢＨＫ２１［Ｃ１３］（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ１０（商標））」由来のＢＨＫ２１細胞である。

【0248】

多くのアルファウイルスのゲノムは完全に配列決定されて、公開されており、また、これらのゲノムによってコードされる非構造タンパク質の配列も公開されている。そのような配列情報により、天然の開始コドンをインシリコで決定することができる。

【0249】

一実施形態では、天然の開始コドンは、コザック配列または機能的に等価な配列に含まれる。コザック配列は、Ｋｏｚａｋ（１９８７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．１５，ｐｐ．８１２５－８１４８）によって最初に記述された配列である。ｍＲＮＡ分子上のコザック配列は、翻訳開始部位としてリボソームによって認識される。この参考文献によれば、コザック配列はＡＵＧ開始コドンを含み、すぐ後に高度に保存されたＧヌクレオチドが続く：ＡＵＧＧ。本発明の一実施形態では、アルファウイルス由来の非構造タンパク質のオープンリーディングフレームまたはその断片に相同な配列は、コザック配列の一部である開始コドンの除去を含むことを特徴とする。

【0250】

本発明の一実施形態では、レプリコンの５'複製認識配列は、ＲＮＡレベルでＡＵＧＧ配列の一部である少なくともすべての開始コドンの除去を特徴とする。

【0251】

好ましい実施形態では、アルファウイルス由来の非構造タンパク質のオープンリーディングフレームまたはその断片に相同な配列は、非構造タンパク質のオープンリーディングフレームの天然開始コドン以外の１つ以上の開始コドンの除去を含むことを特徴とする。より好ましい実施形態では、前記核酸配列は、天然開始コドンの除去をさらに特徴とする。例えば、天然開始コドンの除去に加えて、任意の１つまたは２つまたは３つまたは４つまたは４つより多い（例えば５つ）開始コドンが除去されていてもよい。

【0252】

レプリコンが、非構造タンパク質のオープンリーディングフレームの天然開始コドンの除去、および場合により天然開始コドン以外の１つ以上の開始コドンの除去を特徴とする場合、オープンリーディングフレームに相同な配列は、翻訳のための鋳型として働かないため、それ自体はオープンリーディングフレームではない。

【0253】

好ましくは天然開始コドンの除去に加えて、除去される天然開始コドン以外の１つ以上の開始コドンは、好ましくは翻訳を開始する可能性を有するＡＵＧ塩基トリプレットから選択される。翻訳を開始する可能性を有するＡＵＧ塩基トリプレットは、「潜在的な開始コドン」と称され得る。所与のＡＵＧ塩基トリプレットが翻訳を開始する可能性を有するかどうかは、インシリコまたは細胞ベースのインビトロアッセイで決定することができる。

【0254】

一実施形態では、所与のＡＵＧ塩基トリプレットが翻訳を開始する可能性を有するかどうかはインシリコで決定される：その実施形態では、ヌクレオチド配列を調べて、ＡＵＧ塩基トリプレットがＡＵＧＧ配列、好ましくはコザック配列の一部である場合、翻訳を開始する可能性を有すると決定される。

【0255】

一実施形態では、細胞ベースのインビトロアッセイにおいて、所与のＡＵＧ塩基トリプレットが翻訳を開始する可能性を有するかどうかが決定される：天然開始コドンの除去を特徴とし、天然開始コドンの除去位置の下流に所与のＡＵＧ塩基トリプレットを含むＲＮＡレプリコンが宿主細胞に導入される。一実施形態では、宿主細胞は、天然のアルファウイルス５'複製認識配列を含む特定のアルファウイルスの天然宿主である真核生物種由来の細胞である。好ましい実施形態では、宿主細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ，ＵＳＡから入手可能な細胞株「ＢＨＫ２１［Ｃ１３］（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ１０（商標））」由来のＢＨＫ２１細胞である。天然開始コドンの除去位置と所与のＡＵＧ塩基トリプレットとの間にさらなるＡＵＧ塩基トリプレットが存在しないことが好ましい。天然開始コドンの除去を特徴とし、所与のＡＵＧ塩基トリプレットを含むＲＮＡレプリコンの宿主細胞への移入後に、所与のＡＵＧ塩基トリプレットで翻訳が開始される場合、所与のＡＵＧ塩基トリプレットは翻訳を開始する可能性を有すると決定される。翻訳が開始されるかどうかは、当技術分野で公知の任意の適切な方法によって決定され得る。例えば、レプリコンは、所与のＡＵＧ塩基トリプレットの下流におよび所与のＡＵＧ塩基トリプレットとインフレームで、翻訳産物（存在する場合）の検出を容易にするタグ、例えばｍｙｃタグまたはＨＡタグをコードし得る；コードされたタグを有する発現産物が存在するかどうかは、例えばウェスタンブロットによって決定され得る。この実施形態では、所与のＡＵＧ塩基トリプレットとタグをコードする核酸配列との間にさらなるＡＵＧ塩基トリプレットが存在しないことが好ましい。細胞ベースのインビトロアッセイは、複数の所与のＡＵＧ塩基トリプレットについて個別に実施することができる：各々の場合に、天然開始コドンの除去位置と所与のＡＵＧ塩基トリプレットとの間にさらなるＡＵＧ塩基トリプレットが存在しないことが好ましい。これは、天然開始コドンの除去位置と所与のＡＵＧ塩基トリプレットとの間にあるすべてのＡＵＧ塩基トリプレット（存在する場合）を除去することによって達成され得る。それによって、所与のＡＵＧ塩基トリプレットは、天然開始コドンの除去位置の下流の最初のＡＵＧ塩基トリプレットになる。

【0256】

好ましくは、本発明によるレプリコンは、天然開始コドンの除去位置の下流にあり、アルファウイルス非構造タンパク質またはその断片のオープンリーディングフレーム内に位置するすべての潜在的な開始コドンの除去を特徴とする。したがって、本発明によれば、５'複製認識配列は、好ましくはタンパク質に翻訳され得るオープンリーディングフレームを含まない。

【0257】

好ましい実施形態では、本発明によるＲＮＡレプリコンの５'複製認識配列は、アルファウイルスゲノムＲＮＡの５'複製認識配列の二次構造に等しい二次構造を特徴とする。好ましい実施形態では、本発明によるＲＮＡレプリコンの５'複製認識配列は、アルファウイルスゲノムＲＮＡの５'複製認識配列の予測二次構造に等しい予測二次構造を特徴とする。本発明によれば、ＲＮＡ分子の二次構造は、好ましくはＲＮＡ二次構造予測のためのウェブサーバ、ｈｔｔｐ：／／ｒｎａ．ｕｒｍｃ．ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ．ｅｄｕ／ＲＮＡｓｔｒｕｃｔｕｒｅＷｅｂ／Ｓｅｒｖｅｒｓ／Ｐｒｅｄｉｃｔ１／Ｐｒｅｄｉｃｔ１．ｈｔｍｌによって予測される。

【0258】

天然のアルファウイルス５'複製認識配列と比較して少なくとも１つの開始コドンの除去を特徴とするＲＮＡレプリコンの５'複製認識配列の二次構造または予測二次構造を比較することによって、ヌクレオチド対合破壊の有無を同定することができる。例えば、天然のアルファウイルス５'複製認識配列と比較して、少なくとも１つの塩基対、例えばステムループ内、特にステムループのステム内の塩基対が所与の位置に存在しない場合がある。

【0259】

好ましい実施形態では、５'複製認識配列の１つ以上のステムループは欠失または破壊されない。より好ましくは、ステムループ３および４は欠失または破壊されない。より好ましくは、５'複製認識配列のステムループのいずれも欠失または破壊されない。

【0260】

一実施形態では、少なくとも１つの開始コドンの除去は、５'複製認識配列の二次構造を破壊しない。代替的な実施形態では、少なくとも１つの開始コドンの除去は、５'複製認識配列の二次構造を破壊する。この実施形態では、少なくとも１つの開始コドンの除去は、天然のアルファウイルス５'複製認識配列と比較して、所与の位置の少なくとも１つの塩基対、例えばステムループ内の塩基対の不在の原因となり得る。天然のアルファウイルス５'複製認識配列と比較して、ステムループ内に塩基対が存在しない場合、少なくとも１つの開始コドンの除去は、ステムループ内にヌクレオチド対合破壊を導入すると決定される。ステムループ内の塩基対は、典型的にはステムループのステム内の塩基対である。

【0261】

好ましい実施形態では、ＲＮＡレプリコンは、少なくとも１つの開始コドンの除去によって導入された１つ以上のステムループ内のヌクレオチド対合破壊を補償する１つ以上のヌクレオチド変化を含む。

【0262】

少なくとも１つの開始コドンの除去が、天然のアルファウイルス５'複製認識配列と比較して、ステムループ内にヌクレオチド対合破壊を導入する場合、ヌクレオチド対合破壊を補償すると予想される１つ以上のヌクレオチド変化を導入してもよく、それによって得られる二次構造または予測二次構造を天然のアルファウイルス５'複製認識配列と比較し得る。

【0263】

共通の一般的知識および本明細書の開示に基づいて、特定のヌクレオチド変化は、当業者によって、ヌクレオチド対合破壊を補償すると予想され得る。例えば、天然のアルファウイルス５'複製認識配列と比較して、少なくとも１つの開始コドンの除去を特徴とするＲＮＡレプリコンの所与の５'複製認識配列の二次構造または予測二次構造の所与の位置で塩基対が破壊された場合、好ましくは開始コドンを再導入することなく、その位置で塩基対を復元するヌクレオチド変化は、ヌクレオチド対合破壊を補償すると予想される。

【0264】

好ましい実施形態では、レプリコンの５'複製認識配列は、翻訳可能な核酸配列、すなわちペプチドまたはタンパク質、特にｎｓＰ、特にｎｓＰ１、またはそのいずれかの断片に翻訳可能な核酸配列と重複しないか、またはそれを含まない。ヌクレオチド配列が「翻訳可能」であるためには、開始コドンの存在を必要とする；開始コドンは、ペプチドまたはタンパク質の最もＮ末端側のアミノ酸残基をコードする。一実施形態では、レプリコンの５'複製認識配列は、ｎｓＰ１のＮ末端断片をコードする翻訳可能な核酸配列と重複しないか、またはそれを含まない。

【0265】

以下で詳細に説明するいくつかの状況では、ＲＮＡレプリコンは少なくとも１つのサブゲノムプロモータを含む。好ましい実施形態では、レプリコンのサブゲノムプロモータは、翻訳可能な核酸配列、すなわちペプチドまたはタンパク質、特にｎｓＰ、特にｎｓＰ４、またはそのいずれかの断片に翻訳可能な核酸配列と重複しないか、またはそれを含まない。一実施形態では、レプリコンのサブゲノムプロモータは、ｎｓＰ４のＣ末端断片をコードする翻訳可能な核酸配列と重複しないか、またはそれを含まない。翻訳可能な核酸配列、例えばｎｓＰ４のＣ末端断片に翻訳可能な核酸配列と重複しないか、またはそれを含まないサブゲノムプロモータを有するＲＮＡレプリコンは、ｎｓＰ４のコード配列の一部分（典型的にはｎｓＰ４のＮ末端部分をコードする部分）を欠失させることによって、および／または欠失されていないｎｓＰ４のコード配列の一部分のＡＵＧ塩基トリプレットを除去することによって生成され得る。ｎｓＰ４のコード配列またはその一部分のＡＵＧ塩基トリプレットが除去される場合、除去されるＡＵＧ塩基トリプレットは、好ましくは潜在的な開始コドンである。あるいは、サブゲノムプロモータがｎｓＰ４をコードする核酸配列と重複しない場合、ｎｓＰ４をコードする核酸配列全体を欠失させてもよい。

【0266】

一実施形態では、ＲＮＡレプリコンは、トランケートされたアルファウイルス非構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含まない。この実施形態の文脈において、ＲＮＡレプリコンがｎｓＰ１のＮ末端断片をコードするオープンリーディングフレームを含まないこと、および場合によりｎｓＰ４のＣ末端断片をコードするオープンリーディングフレームを含まないことが特に好ましい。ｎｓＰ１のＮ末端断片は、トランケートされたアルファウイルスタンパク質である；ｎｓＰ４のＣ末端断片も、トランケートされたアルファウイルスタンパク質である。

【0267】

いくつかの実施形態では、本発明によるレプリコンは、アルファウイルスのゲノムの５'末端のステムループ２（ＳＬ２）を含まない。上記のＦｒｏｌｏｖ ｅｔ ａｌ．によれば、ステムループ２は、ＣＳＥ ２の上流の、アルファウイルスのゲノムの５'末端に見出される保存された二次構造であるが、複製には不要である。

【0268】

一実施形態では、レプリコンの５'複製認識配列は、アルファウイルス非構造タンパク質またはその断片をコードする核酸配列と重複しない。したがって、本発明は、場合により１つ以上のアルファウイルス非構造タンパク質またはその一部のコード領域の欠失と組み合わせて、ゲノムアルファウイルスＲＮＡと比較して本明細書に記載の少なくとも１つの開始コドンの除去を特徴とするレプリコンを包含する。例えば、ｎｓＰ２およびｎｓＰ３のコード領域を欠失させてもよく、またはｎｓＰ２およびｎｓＰ３のコード領域を、ｎｓＰ１のＣ末端断片のコード領域および／もしくはｎｓＰ４のＮ末端断片のコード領域と共に欠失させてもよく、ならびに１つ以上の残存する、すなわち前記除去後に残存する開始コドンを、本明細書に記載のように除去してもよい。

【0269】

１つ以上のアルファウイルス非構造タンパク質のコード領域の欠失は、標準的な方法、例えばＤＮＡレベルで、制限酵素、好ましくはオープンリーディングフレーム内の固有の制限部位を認識する制限酵素を使用した除去によって達成され得る。場合により、固有の制限部位を、突然変異誘発、例えば部位特異的突然変異誘発によってオープンリーディングフレームに導入してもよい。それぞれのＤＮＡは、インビトロ転写のための鋳型として使用し得る。

【0270】

制限部位は、特定の制限酵素による、制限部位が含まれる核酸分子、例えばＤＮＡ分子の制限（切断）を指令するのに必要かつ十分な核酸配列、例えばＤＮＡ配列である。制限部位の１コピーが核酸分子内に存在する場合、制限部位は所与の核酸分子に固有である。

【0271】

制限酵素は、核酸分子、例えばＤＮＡ分子を制限部位でまたはその近くで切断するエンドヌクレアーゼである。

【0272】

あるいは、オープンリーディングフレームの一部または全部の欠失を特徴とする核酸配列は、合成法によって入手し得る。

【0273】

本発明によるＲＮＡレプリコンは、好ましくは一本鎖ＲＮＡ分子である。本発明によるＲＮＡレプリコンは、典型的には（＋）鎖ＲＮＡ分子である。一実施形態では、本発明のＲＮＡレプリコンは、単離された核酸分子である。

【0274】

再プログラミング因子および細胞の再プログラミング
本発明は、１つの型の高度に特殊化された体細胞、例えば線維芽細胞またはケラチノサイトを、多能性細胞中間体を介して、別の型、例えば神経細胞に変化させる技術を提供する。

【0275】

具体的には、分化した体細胞に、好ましくは多能性細胞型、好ましくは幹細胞、より好ましくは胚性幹細胞に存在する再プログラミング因子を提供することによって、本発明は、細胞のエピジェネティック記憶を多能性幹細胞の状態に類似した状態に戻す。本発明では、幹細胞特性、特に多能性を有する細胞を生成するために、胚を使用する、作製する、または破壊する必要がなく、したがって倫理的懸念を排除する。さらに、本発明は、潜在的に挿入部位に突然変異を導入するウイルスベクターなどの、ゲノムに組み込まれるベクターの使用を必要としない。

【0276】

本発明に従って使用される体細胞は、インビトロで数を容易に拡大できるという点で、再プログラミングを誘導する手段として卵母細胞に比べて重要な利点を有する。さらに、本発明は、患者特異的体細胞の使用を可能にし、したがって、免疫拒絶の懸念および患者の免疫抑制に関連する問題をほぼ排除する。自家細胞移植のために本発明に従って生成された細胞を使用することは、有害な副作用および／または抵抗性を誘発する可能性が低い。必要な場合は、反復細胞移植が可能である。しかしながら、本発明は、急性および超急性拒絶を低減するための患者の免疫抑制の必要性を有意に減少させるので、反復移植処置の必要性も軽減され、疾患治療の費用が削減される。

【0277】

「幹細胞特性を有する細胞」という用語は、本明細書では、分化した体性非幹細胞に由来するが、幹細胞、特に胚性幹細胞に典型的な１つ以上の特徴を示す細胞を表すために使用される。そのような特徴には、コンパクトなコロニー、高い核対細胞質比および顕著な核小体などの胚性幹細胞形態、正常な核型、テロメラーゼ活性の発現、胚性幹細胞に特徴的な細胞表面マーカーの発現、ならびに／または胚性幹細胞に特徴的な遺伝子の発現が含まれる。胚性幹細胞に特徴的な細胞表面マーカーは、例えば発生段階特異的胎児性抗原３（ＳＳＥＡ－３）、ＳＳＥＡ－４、腫瘍関連抗原１－６０（ＴＲＡ－１－６０）、ＴＲＡ－１－８１、およびＴＲＡ－２－４９／６Ｅからなる群より選択される。胚性幹細胞に特徴的な遺伝子は、例えば内因性ＯＣＴ４、内因性ＮＡＮＯＧ、増殖分化因子３（ＧＤＦ３）、発現抑制１（ＲＥＸ１）、線維芽細胞増殖因子４（ＦＧＦ４）、胚細胞特異的遺伝子１（ＥＳＧ１）、発生多能性関連２（ＤＰＰＡ２）、ＤＰＰＡ４、およびテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）からなる群より選択される。一実施形態では、幹細胞に典型的な１つ以上の特徴には多能性が含まれる。一実施形態では、幹細胞特性を有する細胞は多能性状態を示す。一実施形態では、幹細胞特性を有する細胞は、３つの一次胚葉すべての高度派生物に分化する発生能を有する。一実施形態では、一次胚葉は内胚葉であり、高度派生物は腸様上皮組織である。さらなる実施形態では、一次胚葉は中胚葉であり、高度派生物は横紋筋および／または軟骨である。なおさらなる実施形態では、一次胚葉は外胚葉であり、高度派生物は神経組織および／または表皮組織である。１つの好ましい実施形態では、幹細胞特性を有する細胞は、神経細胞および／または心臓細胞に分化する発生能を有する。本発明によれば、一般に、「幹細胞特性を有する細胞」、「幹細胞の性質を有する細胞」、「幹様細胞」、「再プログラム細胞」および「脱分化細胞」という用語または同様の用語は、同様の意味を有し、本明細書では互換的に使用される。

【0278】

「幹細胞」は、自己複製する能力、未分化状態にとどまる能力、および分化状態になる能力を持つ細胞である。幹細胞は、少なくともそれが天然に存在する動物の寿命の間は、無制限に分裂することができる。幹細胞は最終分化しておらず、分化経路の最終段階にはない。幹細胞が分裂する場合、各娘細胞は、幹細胞のままであるか、または最終分化につながる経路に入ることができる。

【0279】

全能性幹細胞は、全能的分化特性を有し、完全な生物に発生することができる細胞である。この特性は、精子による卵母細胞の受精後、８細胞期までの細胞が有している。これらの細胞を単離して子宮に移植すると、完全な生物に発生することができる。

【0280】

多能性幹細胞は、外胚葉層、中胚葉層および内胚葉層に由来する様々な細胞および組織に発生することができる細胞である。受精の４～５日後に生成される、胚盤胞の内側にある内部細胞塊に由来する多能性幹細胞は、「胚性幹細胞」と呼ばれ、他の様々な組織細胞に分化することができるが、新しい生存生物を形成することはできない。

【0281】

複能性幹細胞は、通常、それらの起源の組織および器官に特異的な細胞タイプのみに分化する幹細胞である。複能性幹細胞は、胎児期、新生児期および成体期における様々な組織および器官の成長および発生に関与するだけでなく、成体組織のホメオスタシスの維持および組織損傷時の再生を誘導する機能にも関与する。組織特異的複能性細胞は、「成体幹細胞」と総称される。

【0282】

「胚性幹細胞」は、胚に存在するかまたは胚から単離される幹細胞である。これは、生物に存在するありとあらゆる細胞に分化する能力を有する多能性であり得るか、または複数の細胞型に分化する能力を有する複能性であり得る。

【0283】

本明細書で使用される場合、「胚」とは、その発生の初期段階にある動物を指す。これらの段階は、３つの胚葉が規定され、確立される着床および原腸形成、ならびにそれぞれの器官および器官系への胚葉の分化を特徴とする。３つの胚葉とは、内胚葉、外胚葉および中胚葉である。

【0284】

「胚盤胞」とは、受精卵が卵割を受け、流体で満たされた空洞を取り囲む球状の細胞層が形成されつつあるか、または形成された、発生の初期段階の胚である。この球状の細胞層が栄養外胚葉である。栄養外胚葉の内側には、内部細胞塊（ＩＣＭ）と称される細胞のクラスタがある。栄養外胚葉は胎盤の前駆体であり、ＩＣＭは胚の前駆体である。

【0285】

体性幹細胞とも呼ばれる成体幹細胞は、成体に見出される幹細胞である。成体幹細胞は、分化した組織に見出され、自己複製することができ、いくつかの制限付きで分化して、その起源の組織の特殊化した細胞型を生成することができる。例には、間葉系幹細胞、造血幹細胞、および神経幹細胞が含まれる。

【0286】

「分化細胞」とは、より特殊化した形態または機能への漸進的な発生変化を受けた成熟細胞である。細胞分化は、明らかに特殊化した細胞型に成熟するときに細胞が経る過程である。分化細胞は独特な特性を有し、特定の機能を果たし、より分化していない対応する細胞よりも分裂する可能性が低い。

【0287】

「未分化」細胞、例えば未成熟細胞、胚細胞、または原始細胞は、典型的には非特異的な外観を有し、複数の非特異的な活動を実施し得るが、分化細胞が典型的に実施する機能は、皆無ではないにしても、不十分にしか実施しない。

【0288】

「体細胞」とは、ありとあらゆる分化細胞を指し、幹細胞、生殖細胞、または配偶子を含まない。好ましくは、本明細書で使用される「体細胞」は、最終分化細胞を指す。一実施形態では、体細胞は、肺線維芽細胞、包皮線維芽細胞もしくは皮膚線維芽細胞などの線維芽細胞、またはケラチノサイトである。

【0289】

一実施形態では、体細胞は、間葉表現型を有する胚性幹細胞由来の体細胞である。好ましい実施形態では、体細胞は、胎児線維芽細胞もしくは出生後線維芽細胞などの線維芽細胞、またはケラチノサイト、好ましくは毛包由来のケラチノサイトである。さらなる実施形態では、線維芽細胞は、肺線維芽細胞、包皮線維芽細胞または真皮線維芽細胞である。特定の実施形態では、線維芽細胞は、カタログ番号ＣＣＬ－１８６の下にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託されている、カタログ番号ＣＲＬ－２０９７の下にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託されている、もしくはカタログ番号ＣＲＬ－２５２２の下にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託されている線維芽細胞、またはカタログ番号ＰＣ５０１Ａ－ＨＦＦの下にＳＢＩ Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓによって配給されている、もしくはカタログ番号Ｐ１０８５７の下にＩｎｎｏｐｒｏｔから配給されている線維芽細胞である。一実施形態では、線維芽細胞は成人ヒト皮膚線維芽細胞である。好ましくは、体細胞はヒト細胞である。本発明によれば、体細胞は遺伝的に改変されていてもよい。

【0290】

本明細書で使用される場合、「拘束された」とは、特定の機能に永続的に拘束されたとみなされる細胞を指す。拘束された細胞は、「最終分化細胞」とも称される。

【0291】

本明細書で使用される場合、「分化」とは、特定の形態または機能に対する細胞の適応を指す。細胞では、分化はより拘束された細胞をもたらす。

【0292】

本明細書で使用される場合、「脱分化」とは、形態または機能の特殊化の喪失を指す。細胞では、脱分化はより拘束されていない細胞をもたらす。

【0293】

本明細書で使用される場合、「再プログラミング」とは、細胞の遺伝的プログラムのリセットを指す。再プログラムされた細胞は、好ましくは多能性を示す。

【0294】

「脱分化された」および「再プログラムされた」という用語または同様の用語は、本明細書では、幹細胞特性を有する体細胞由来細胞を示すために互換的に使用される。しかし、前記用語は、機械的または機能的考慮によって本明細書に開示される主題を制限することを意図していない。

【0295】

本明細書で使用される場合、「生殖細胞」とは、精母細胞もしくは卵母細胞などの生殖細胞、または生殖細胞に発生する細胞を指す。

【0296】

本明細書で使用される場合、「多能性」とは、胎盤の細胞または子宮の他の支持細胞を除く任意の細胞型を生じさせることができる細胞を指す。

【0297】

本発明によれば、本明細書に開示される再プログラミング因子を発現することができるＲＮＡレプリコンの体細胞への導入は、再プログラミング過程を完了するための一定期間にわたる前記因子の発現および幹細胞特性を有する細胞の発生をもたらすことが好ましい。好ましくは、本明細書に開示される特定の因子を発現することができるＲＮＡの体細胞への導入は、長期間、好ましくは少なくとも１０日間、好ましくは少なくとも１１日間、より好ましくは少なくとも１２日間、前記因子の発現をもたらす。そのような長期間の発現を達成するために、好ましくはエレクトロポレーションまたはリポフェクションを使用して、ＲＮＡを、好ましくは定期的に２回以上細胞に導入する。好ましくは、１つ以上の因子の長期間の発現を確実にするために、ＲＮＡを少なくとも２回、より好ましくは少なくとも３回、より好ましくは少なくとも４回、さらにより好ましくは少なくとも５回から好ましくは６回まで、より好ましくは７回まで、またはさらに８、９または１０回まで、好ましくは少なくとも１０日間、好ましくは少なくとも１１日間、より好ましくは少なくとも１２日間にわたって細胞に導入する。好ましくは、ＲＮＡの反復導入の間に経過する期間は、２４時間～１２０時間、好ましくは４８時間～９６時間である。一実施形態では、ＲＮＡの反復導入の間に経過する期間は、７２時間以下、好ましくは４８時間または３６時間以下である。一実施形態では、次のエレクトロポレーションに先立って、細胞を前のエレクトロポレーションから回復させる。この実施形態では、ＲＮＡの反復導入の間に経過する期間は、少なくとも７２時間、好ましくは少なくとも９６時間、より好ましくは少なくとも１２０時間である。いずれの場合も、条件は、再プログラミング過程を支持する量で支持する期間にわたって、因子が細胞内で発現されるように選択されるべきである。しかしながら、一実施形態では、ＲＮＡレプリコンの１回の導入が、再プログラミング過程および幹細胞特性を有する細胞の発生に十分であり得る。

【0298】

好ましくは少なくとも０．０１μｇ、好ましくは少なくとも０．０５μｇ、好ましくは少なくとも０．１μｇ、好ましくは少なくとも０．２μｇ、より好ましくは少なくとも０．３μｇ、好ましくは５μｇまで、より好ましくは２μｇまで、より好ましくは１μｇまで、より好ましくは０．５μｇまで、好ましくは０．０５～１μｇ、さらにより好ましくは０．０５～０．７μｇ、または０．０５～０．５μｇの各因子のＲＮＡレプリコンをトランスフェクションごとに使用する。

【0299】

好ましくは、幹細胞特性を有する細胞の発生を可能にする工程は、胚性幹細胞培養条件下、好ましくは多能性幹細胞を未分化状態に維持するのに適した条件下で体細胞を培養することを含む。

【0300】

好ましくは、幹細胞特性を有する細胞の発生を可能にするために、細胞を１つ以上のＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤および／または１つ以上のヒストンデアセチラーゼ阻害剤の存在下で培養する。好ましい化合物は、５'－アザシチジン（５'－ａｚａＣ）、スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）、デキサメタゾン、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）、酪酸ナトリウム（ＮａＢｕ）、スクリプタイドおよびバルプロ酸（ＶＰＡ）からなる群より選択される。好ましくは、細胞を、好ましくは０．５～１０ｍＭ、より好ましくは１～５ｍＭ、最も好ましくは約２ｍＭの濃度のバルプロ酸（ＶＰＡ）の存在下で培養する。

【0301】

本発明の好ましい実施形態では、反復エレクトロポレーションによってＲＮＡを体細胞に導入する。好ましくは、細胞の生存能力の損失が生じた場合は、過去にエレクトロポレーションを受けていない細胞を担体細胞として添加する。好ましくは、過去にエレクトロポレーションを受けていない細胞は、４回目以降、好ましくは５回目以降のエレクトロポレーションの１つ以上の前、間または後に、例えば４回目および６回目のエレクトロポレーションの前、間または後に添加される。好ましくは、過去にエレクトロポレーションを受けていない細胞を、４回目または５回目およびその後の各エレクトロポレーションの前、間または後に添加する。好ましくは、過去にエレクトロポレーションを受けていない細胞は、ＲＮＡが導入される細胞と同じ細胞である。

【0302】

好ましくは、１つ以上の再プログラミング因子を発現することができるＲＮＡレプリコンの細胞への導入は、細胞内で１つ以上の再プログラミング因子の発現を生じさせる。

【0303】

本発明による「再プログラミング因子」という用語は、場合によりさらなる再プログラミング因子などのさらなる作用物質と共に、幹細胞特性を有する細胞への体細胞の再プログラミングを誘導するタンパク質およびペプチドならびにその誘導体および変異体を含む。例えば、「再プログラミング因子」という用語は、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＬＩＮ２８、ＫＬＦ４およびｃ－ＭＹＣを含む。

【0304】

再プログラミング因子は、任意の動物種、例えば哺乳動物およびげっ歯動物のものであり得る。哺乳動物の例には、ヒトおよび非ヒト霊長動物が含まれるが、これらに限定されない。霊長動物には、ヒト、チンパンジー、ヒヒ、カニクイザル、およびその他の新世界ザルまたは旧世界ザルが含まれるが、これらに限定されない。げっ歯動物には、マウス、ラット、モルモット、ハムスターおよびスナネズミが含まれるが、これらに限定されない。

【0305】

本発明の一実施形態では、幹細胞特性を有する細胞への体細胞の再プログラミングを可能にすることができる再プログラミング因子は、（ｉ）ＯＣＴ４およびＳＯＸ２、（ｉｉ）ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、およびＮＡＮＯＧとＬＩＮ２８の一方または両方、（ｉｉｉ）ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、およびＫＬＦ４とｃ－ＭＹＣの一方または両方からなる群より選択される因子の集合体を含む。一実施形態では、前記再プログラミング因子は、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧおよびＬＩＮ２８、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４およびｃ－ＭＹＣ、またはＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ｃ－ＭＹＣ、ＮＡＮＯＧおよびＬＩＮ２８を含む。

【0306】

ＯＣＴ４は、真核生物ＰＯＵ転写因子類の転写因子であり、胚性幹細胞の多能性の指標である。これは、母性発現されるオクトマー結合タンパク質である。卵母細胞、未分化胚芽細胞の内部細胞塊、および始原生殖細胞にも存在することが観察されている。遺伝子ＰＯＵ５Ｆ１はＯＣＴ４タンパク質をコードする。遺伝子名の同義語には、ＯＣＴ３、ＯＣＴ４、ＯＴＦ３、ＭＧＣ２２４８７が含まれる。胚性幹細胞が未分化状態にとどまるには、特定の濃度のＯＣＴ４の存在が必要である。好ましくは、「ＯＣＴ４タンパク質」または単に「ＯＣＴ４」は、ヒトＯＣＴ４に関する。

【0307】

Ｓｏｘ２は、単一のＨＭＧ ＤＮＡ結合ドメインを有する転写因子をコードするＳｏｘ（ＳＲＹ関連ＨＭＧボックス）遺伝子ファミリーのメンバーである。ＳＯＸ２は、分化能力を阻害することによって神経前駆細胞を制御することが認められている。この因子の抑制は脳室帯からの剥離をもたらし、その後に細胞周期からの離脱が起こる。また、これらの細胞は、前駆細胞および初期神経分化マーカーの喪失によってその前駆細胞特性を失い始める。好ましくは、「ＳＯＸ２タンパク質」または単に「ＳＯＸ２」は、ヒトＳＯＸ２に関する。

【0308】

ＮＡＮＯＧはＮＫ－２型ホメオドメイン遺伝子であり、おそらく胚性幹細胞の複製と分化に不可欠な遺伝子の発現を調節することによって、幹細胞の多能性を維持する上で重要な役割を果たすと提案されている。ＮＡＮＯＧは、そのＣ末端に埋め込まれた２つの並外れて強い活性化ドメインを有する転写活性化因子として挙動する。ＮＡＮＯＧ発現の減少は、胚性幹細胞の分化を誘導する。好ましくは、「ＮＡＮＯＧタンパク質」または単に「ＮＡＮＯＧ」はヒトＮＡＮＯＧに関する。

【0309】

ＬＩＮ２８は、ＲＮＡ結合モチーフの珍しい組合せ、すなわち低温ショックドメインと一対のレトロウイルス型ＣＣＨＣジンクフィンガーとを有する保存された細胞質タンパク質である。哺乳動物では、多様な種類の未分化細胞に豊富に存在する。多能性哺乳動物細胞では、ＬＩＮ２８はポリ（Ａ）結合タンパク質とのＲＮａｓｅ感受性複合体中、およびスクロース勾配のポリソーム画分中で観察され、ｍＲＮＡの翻訳に関連することが示唆される。好ましくは、「ＬＩＮ２８タンパク質」または単に「ＬＩＮ２８」はヒトＬＩＮ２８に関する。

【0310】

クルッペル様因子（ＫＬＦ４）は、様々な組織、例えば結腸、胃および皮膚の有糸分裂後上皮細胞で強く発現されるジンクフィンガー転写因子である。ＫＬＦ４は、これらの細胞の最終分化に不可欠であり、細胞周期の調節に関与する。好ましくは、「ＫＬＦ４タンパク質」または単に「ＫＬＦ４」はヒトＫＬＦ４に関する。

【0311】

ＭＹＣ（ｃＭＹＣ）は、広範囲のヒト癌で過剰発現される癌原遺伝子である。特異的に変異するかまたは過剰発現されると、細胞増殖を増加させ、癌遺伝子として機能する。ＭＹＣ遺伝子は、エンハンサーボックス配列（Ｅボックス）への結合およびヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）の動員を介して全遺伝子の１５％の発現を調節する転写因子をコードする。ＭＹＣは、転写因子のＭＹＣファミリーに属し、Ｎ－ＭＹＣおよびＬ－ＭＹＣ遺伝子もこのファミリーに含まれる。ＭＹＣファミリーの転写因子は、ｂＨＬＨ／ＬＺ（塩基性ヘリックス－ループ－ヘリックスロイシンジッパー）ドメインを含む。好ましくは、「ｃＭＹＣタンパク質」または単に「ｃＭＹＣ」はヒトｃＭＹＣに関する。

【0312】

「ｍｉＲＮＡ」（マイクロＲＮＡ）という用語は、ＥＳＣの自己複製／分化および細胞周期の進行に関連するものを含む、標的ｍＲＮＡの分解を誘導するおよび／または翻訳を阻止することによって多くの細胞機能を調節する、真核細胞で見出される２１～２３ヌクレオチド長の非コードＲＮＡに関する。ｍｉＲＮＡは、標的メッセンジャーＲＮＡ転写物（ｍＲＮＡ）上の相補的配列に結合する転写後調節因子であり、通常は翻訳抑制または標的分解および遺伝子サイレンシングをもたらす。正しい組合せのｍｉＲＮＡは、インビトロで幹細胞特性を有する細胞への体細胞の直接的な細胞再プログラミングを誘導できることが認められている。例えば、ｍｉＲＮＡクラスタ３０２－３６７（例えばクラスタ３０２ａ－ｄ／３６７）は体細胞の再プログラミングを増強することが観察されている。

【0313】

本明細書におけるＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＬＩＮ２８、ＫＬＦ４またはｃ－ＭＹＣなどの特定の因子への言及は、これらの因子のすべての変異体も含むように理解されるべきである。特に、細胞によって自然に発現されるこれらの因子のすべてのスプライス変異体、翻訳後修飾変異体、コンフォメーション、アイソフォームおよび種ホモログも含むように理解されるべきである。

【0314】

本発明の目的のために、タンパク質もしくはペプチドの「変異体」またはアミノ酸配列の「変異体」は、アミノ酸挿入変異体、アミノ酸欠失変異体および／またはアミノ酸置換変異体を含む。

【0315】

アミノ酸挿入変異体は、アミノ末端および／またはカルボキシ末端融合物を含み、特定のアミノ酸配列における１個または２個以上のアミノ酸の挿入も含む。挿入を有するアミノ酸配列変異体の場合、１個以上のアミノ酸残基がアミノ酸配列の特定の部位に挿入されるが、結果として生じる産物の適切なスクリーニングを伴うランダム挿入も可能である。

【0316】

アミノ酸欠失変異体は、配列からの１個以上のアミノ酸の除去を特徴とする。

【0317】

アミノ酸置換変異体は、配列内の少なくとも１個の残基が除去され、別の残基がその位置に挿入されていることを特徴とする。相同なタンパク質もしくはペプチド間で保存されていないアミノ酸配列の位置にある修飾、および／またはアミノ酸を類似の性質を有する他のアミノ酸で置換することが好ましい。

【0318】

「保存的置換」は、例えば、関与する残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および／または両親媒性の類似性に基づいて行われ得る。例えば：（ａ）非極性（疎水性）アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンが含まれ；（ｂ）極性中性アミノ酸には、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンが含まれ；（ｃ）正に帯電した（塩基性）アミノ酸には、アルギニン、リジン、およびヒスチジンが含まれ；（ｄ）負に帯電した（酸性）アミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる。典型的には、置換は（ａ）～（ｄ）の群内で行われ得る。さらに、グリシンとプロリンは、α－ヘリックスを破壊するその能力に基づいて相互に置換され得る。いくつかの好ましい置換は、次の群内で行われ得る：（ｉ）ＳおよびＴ；（ｉｉ）ＰおよびＧ；ならびに（ｉｉｉ）Ａ、Ｖ、ＬおよびＩ。公知の遺伝暗号、ならびに組換えおよび合成ＤＮＡ技術を考慮して、当業者は、保存的アミノ酸変異体をコードするＤＮＡを容易に構築することができる。

【0319】

好ましくは、本明細書に記載の特定のアミノ酸配列と前記特定のアミノ酸配列の変異体であるアミノ酸配列との間の類似性、好ましくは同一性の程度は、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、または最も好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％である。類似性または同一性の程度は、好ましくは少なくとも約２０、少なくとも約４０、少なくとも約６０、少なくとも約８０、少なくとも約１００、少なくとも約１２０、少なくとも約１４０、少なくとも約１６０、少なくとも約２００または２５０アミノ酸の領域について与えられる。好ましい実施形態では、類似性または同一性の程度は、参照アミノ酸配列の全長について与えられる。

【0320】

本発明によれば、タンパク質またはペプチドの変異体は、好ましくはそれが由来するタンパク質またはペプチドの機能的特性を有する。そのような機能的特性は、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＬＩＮ２８、ＫＬＦ４およびｃ－ＭＹＣについてそれぞれ上記で説明されている。好ましくは、タンパク質またはペプチドの変異体は、動物分化細胞の再プログラミングにおいて、それが由来するタンパク質またはペプチドと同じ特性を有する。好ましくは、変異体は動物分化細胞の再プログラミングを誘導または増強する。

【0321】

本発明の方法は、任意の種類の体細胞の脱分化を生じさせるために使用することができる。使用し得る細胞には、本発明の方法によって脱分化または再プログラムすることができる細胞、特に完全にまたは部分的に分化した細胞、より好ましくは最終分化した細胞が含まれる。好ましくは、体細胞は、前期胚、胚、胎児、および出生後多細胞生物に由来する二倍体細胞である。使用し得る細胞の例には、胎児および新生児線維芽細胞または成体線維芽細胞などの線維芽細胞、ケラチノサイト、特に初代ケラチノサイト、より好ましくは毛髪に由来するケラチノサイト、Ｂ細胞、Ｔ細胞、樹状細胞、脂肪細胞、上皮細胞、表皮細胞、軟骨細胞、卵丘細胞、神経細胞、グリア細胞、アストロサイト、心臓細胞、食道細胞、筋細胞、メラノサイト、造血細胞、骨細胞、マクロファージ、単球および単核球が含まれるが、これらに限定されない。使用し得る細胞の例には、血液由来の内皮細胞および内皮前駆細胞、および尿由来の上皮細胞が含まれる。

【0322】

本発明の方法を使用できる細胞は、任意の動物種、例えば哺乳動物およびげっ歯動物のものであり得る。本発明によって脱分化および再分化させることができる哺乳動物細胞の例には、ヒトおよび非ヒト霊長動物細胞が含まれるが、これらに限定されない。本発明を実施し得る霊長動物細胞には、ヒト、チンパンジー、ヒヒ、カニクイザル、および他の新世界ザルまたは旧世界ザルの細胞が含まれるが、これらに限定されない。本発明を実施し得るげっ歯動物細胞には、マウス、ラット、モルモット、ハムスターおよびスナネズミの細胞が含まれるが、これらに限定されない。

【0323】

本発明による「生物」という用語は、遺伝物質を増幅または伝達することができる任意の生物学的単位に関し、植物および動物、ならびに細菌、酵母、真菌およびウイルスなどの微生物を含む。「生物」という用語には、ヒト、非ヒト霊長動物、または別の動物、特にウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコなどの哺乳動物またはマウスおよびラットなどのげっ歯動物が含まれるが、これらに限定されない。特に好ましい実施形態では、生物はヒトである。

【0324】

本発明に従って調製される脱分化細胞は、多能性幹細胞と同じ要求性の多くを示すと予想され、胚性幹細胞に使用される条件下で、例えばＥＳ細胞培地または胚細胞の成長を支持する任意の培地で増殖および維持することができる。胚性幹細胞は、培養下の不活化胎児線維芽細胞上で、例えば照射されたマウス胚性線維芽細胞またはヒト線維芽細胞（例えばヒト包皮線維芽細胞、ヒト皮膚線維芽細胞、ヒト子宮内膜線維芽細胞、ヒト卵管線維芽細胞）上で維持された場合、インビトロでその多能性を保持する。一実施形態では、ヒトフィーダー細胞は、直接分化によって再プログラムされた細胞の同じ培養物に由来する自己フィーダー細胞であり得る。

【0325】

さらに、ヒト胚性幹細胞は、マウス胎児線維芽細胞によって馴化された培地中のマトリゲル上でうまく増殖させることができる。ヒト幹細胞は、長期間にわたって培養下で成長させることができ、特定の培養条件下では未分化状態にとどまることができる。

【0326】

特定の実施形態では、細胞培養条件は、細胞を、細胞の分化を阻害するか、さもなければ細胞の脱分化を促進することができる因子、例えば非ＥＳ細胞、栄養外胚葉または他の細胞型への細胞の分化を防止することができる因子と接触させることを含み得る。

【0327】

本発明に従って調製される脱分化細胞は、細胞の表現型の変化を監視し、それらの遺伝子発現およびタンパク質発現を特徴付けることを含む方法によって評価することができる。遺伝子発現はＲＴ－ＰＣＲによって決定することができ、翻訳産物は免疫細胞化学およびウェスタンブロット法によって決定することができる。特に、脱分化細胞を特徴付けて、遺伝子発現のパターンを決定し、トランスクリプトミクスを含む当技術分野で周知の技術を使用して、再プログラムされた細胞が胚性幹細胞などの未分化多能性対照細胞に予想される発現パターンに類似した遺伝子発現のパターンを示すかどうかを決定することができる。

【0328】

これに関して脱分化細胞の以下の遺伝子の発現を評価することができる：ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＬＩＮ２８、増殖分化因子３（ＧＤＦ３）、発現抑制１（ＲＥＸ１）、線維芽細胞増殖因子４（ＦＧＦ４）、胚細胞特異的遺伝子１（ＥＳＧ１）、発生多能性関連２（ＤＰＰＡ２）、ＤＰＰＡ４、テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）、胚抗原３（ＳＳＥＡ－３）、ＳＳＥＡ－４、腫瘍関連抗原１－６０（ＴＲＡ－１－６０）、ＴＲＡ－１－８１、およびＴＲＡ－２－４９／６Ｅ。

【0329】

再プログラム細胞と比較し得る未分化細胞または胚性幹細胞は、分化体細胞と同じ種に由来し得る。あるいは、再プログラム細胞と比較し得る未分化細胞または胚性幹細胞は、分化体細胞とは異なる種に由来し得る。

【0330】

いくつかの実施形態では、未分化細胞で特異的に発現される特定の遺伝子が再プログラム細胞でも発現される場合、再プログラム細胞と未分化細胞、例えば胚性幹細胞との間に遺伝子発現パターンの類似性が存在する。例えば、典型的には分化体細胞では検出できない特定の遺伝子、例えばテロメラーゼを使用して、再プログラミングの程度を監視することができる。同様に、特定の遺伝子については、発現の非存在を使用して、再プログラミングの程度を評価し得る。

【0331】

テロメラーゼ活性の誘導によって特徴付けられる自己複製能は、脱分化細胞において監視できる幹細胞の別の特徴である。

【0332】

核型分析は、有糸分裂細胞からの染色体の広がり、スペクトル核型分析、テロメア長のアッセイ、全ゲノムハイブリダイゼーション、または当技術分野で周知の他の技術によって実施し得る。

【0333】

レプリコンに含まれる少なくとも１つのオープンリーディングフレーム
本発明によるＲＮＡレプリコンは、目的のペプチドまたは目的のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームとして、再プログラミング因子をコードするオープンリーディングフレームを含み、第１の再プログラミング因子と共に再プログラミング因子の機能的セットを形成する１つ以上のさらなる再プログラミング因子などの、目的のペプチドまたは目的のタンパク質をコードする１つ以上のさらなるオープンリーディングフレームを含み得る。好ましくは、目的のタンパク質は異種核酸配列によってコードされる。目的のペプチドまたはタンパク質をコードする遺伝子は、同義的に「目的の遺伝子」または「導入遺伝子」と称される。様々な実施形態では、目的のペプチドまたはタンパク質は異種核酸配列によってコードされる。本発明によれば、「異種」という用語は、核酸配列が天然ではアルファウイルス核酸配列に機能的または構造的に連結されていないという事実を指す。本発明によるレプリコンは、単一のポリペプチド、すなわち再プログラミング因子、または複数の再プログラミング因子もしくは再プログラミング因子と別のポリペプチドなどの複数のポリペプチドをコードし得る。複数のポリペプチドは、単一のポリペプチド（融合ポリペプチド）として、または別々のポリペプチドとしてコードされ得る。いくつかの実施形態では、本発明によるレプリコンは、サブゲノムプロモータの制御下にあるかどうかにかかわらずそれぞれ独立して選択され得る、複数のオープンリーディングフレームを含み得る。あるいは、ポリタンパク質または融合ポリペプチドは、場合により自己触媒性プロテアーゼ切断部位（例えば口蹄疫ウイルス２Ａタンパク質）またはインテインによって分離された個々のポリペプチドを含む。

【0334】

目的のタンパク質は、例えばレポータタンパク質、薬学的に活性なペプチドまたはタンパク質、細胞外インターフェロン（ＩＦＮ）によるＩＦＮ受容体の係合の阻害剤、細胞内インターフェロンシグナル伝達の阻害剤、および機能性アルファウイルス非構造タンパク質からなる群より選択され得る。

【0335】

インターフェロン（ＩＦＮ）シグナル伝達の阻害剤
オープンリーディングフレームによってコードされるさらなる適切な目的のタンパク質は、インターフェロン（ＩＦＮ）シグナル伝達の阻害剤である。ＲＮＡが発現のために導入された細胞の生存能力は、特に細胞がＲＮＡで複数回トランスフェクトされた場合、低下し得ることが報告されているが、ＩＦＮ阻害剤は、ＲＮＡが発現されるべき細胞の生存能力を高めることが認められた（国際公開第２０１４／０７１９６３ Ａ１号）。好ましくは、阻害剤はＩ型ＩＦＮシグナル伝達の阻害剤である。細胞外ＩＦＮによるＩＦＮ受容体の係合を防止することおよび／または細胞における細胞内ＩＦＮシグナル伝達を阻害することは、細胞内でのＲＮＡの安定な発現を可能する。あるいはまたはさらに、細胞外ＩＦＮによるＩＦＮ受容体の係合を防止することおよび／または細胞内ＩＦＮシグナル伝達を阻害することは、特に細胞がＲＮＡで繰り返しトランスフェクトされる場合、細胞の生存を増強する。

【0336】

一実施形態では、細胞外ＩＦＮによるＩＦＮ受容体の係合を防止することは、細胞外ＩＦＮに対するウイルス結合物質などの、細胞外ＩＦＮに対する結合物質を提供することを含む。一実施形態では、細胞外ＩＦＮに対するウイルス結合物質は、ウイルスインターフェロン受容体である。一実施形態では、細胞外ＩＦＮに対するウイルス結合物質は、ワクシニアウイルスＢ１８Ｒである。Ｂ１８Ｒタンパク質は、強力な中和活性を有する、マウス、ヒト、ウサギ、ブタ、ラット、およびウシのＩ型インターフェロンに特異性を持つワクシニアウイルスにコードされたＩ型インターフェロン受容体である。ワクシニアウイルスＷｅｓｔｅｒｎ Ｒｅｓｅｒｖｅ株のＢ１８Ｒ遺伝子によってコードされるＢ１８Ｒタンパク質。６０～６５ｋＤの糖タンパク質は、インターロイキン１受容体に関連し、他のＩ型ＩＦＮ受容体とは異なって、クラスＩＩサイトカイン受容体ファミリーに属する免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである。Ｂ１８Ｒタンパク質はヒトＩＦＮαに高い親和性（ＫＤ、１７４ｐＭ）を有する。ウイルスの宿主応答修飾因子の中で、Ｂ１８Ｒタンパク質は、可溶性細胞外タンパク質としても細胞表面タンパク質としても存在し、自己分泌およびパラ分泌ＩＦＮ機能の両方の遮断を可能にするという点で独特である。

【0337】

理論に拘束されることを望むものではないが、細胞内ＩＦＮシグナル伝達は、翻訳の阻害および／またはＲＮＡ分解をもたらし得ることが想定される。これは、１つ以上のＩＦＮ誘導性の抗ウイルス活性エフェクタータンパク質を阻害することによって対処できる。ＩＦＮ誘導性の抗ウイルス活性エフェクタータンパク質は、ＲＮＡ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＲ）、２'，５'－オリゴアデニル酸合成酵素（ＯＡＳ）およびＲＮａｓｅＬからなる群より選択することができる。細胞内ＩＦＮシグナル伝達を阻害することは、ＰＫＲ依存性経路および／またはＯＡＳ依存性経路を阻害することを含み得る。適切な目的のタンパク質は、ＰＫＲ依存性経路および／またはＯＡＳ依存性経路を阻害することができるタンパク質である。ＰＫＲ依存性経路を阻害することは、ｅＩＦ２－αリン酸化を阻害することを含み得る。ＰＫＲを阻害することは、少なくとも１つのＰＫＲ阻害剤で細胞を処理することを含み得る。ＰＫＲ阻害剤は、ＰＫＲのウイルス阻害剤であり得る。ＰＫＲの好ましいウイルス阻害剤は、ワクシニアウイルスＥ３である。ペプチドまたはタンパク質（例えばＥ３、Ｋ３）が細胞内ＩＦＮシグナル伝達を阻害すべきである場合、ペプチドまたはタンパク質の細胞内発現が好ましい。ワクシニアウイルスＥ３は、ｄｓＲＮＡに結合して隔離し、ＰＫＲおよびＯＡＳの活性化を防ぐ２５ｋＤａのｄｓＲＮＡ結合タンパク質（遺伝子Ｅ３Ｌによってコードされる）である。Ｅ３は、ＰＫＲに直接結合することができ、その活性を阻害して、ｅＩＦ２－αのリン酸化の低減をもたらす。ワクシニアウイルス遺伝子Ｋ３Ｌは、ＰＫＲの非リン酸化可能な偽基質として作用し、ｅＩＦ２－αのリン酸化を競合的に阻害する、ｅＩＦ２－αサブユニットの１０．５ｋＤａホモログをコードする。ＩＦＮシグナル伝達の他の適切な阻害剤は、単純ヘルペスウイルスＩＣＰ３４．５、トスカーナウイルスＮＳ、カイコ核多角体病ウイルスＰＫ２、およびＨＣＶ ＮＳ３４Ａである。

【0338】

一実施形態では、本発明は、ワクシニアウイルスＢ１８Ｒもしくはその機能的変異体およびワクシニアウイルスＥ３もしくはその機能的変異体またはワクシニアウイルスＫ３もしくはその機能的変異体、またはその両方を細胞に提供することを含み得る。トスカーナウイルス由来のウイルスエスケープタンパク質ＮＳ（Ｎ）は、ＩＦＮ応答の強力な阻害剤であり、ＲＮＡベースの再プログラミングを成功させるためにＥＫＢ（Ｅ３、Ｋ３、Ｂ１８Ｒ）を置換するのに使用できる。

【0339】

ＩＦＮシグナル伝達の阻害剤は、ＩＦＮシグナル伝達の阻害剤をコードする核酸配列（例えばＲＮＡ）の形態で細胞に提供され得る。

【0340】

一実施形態では、細胞内または細胞外ＩＦＮシグナル伝達の阻害剤は、ｍＲＮＡ分子によってコードされる。そのｍＲＮＡ分子は、本明細書に記載される非ポリペプチド配列を改変する修飾、例えばキャップ、５'－ＵＴＲ、３'－ＵＴＲ、ポリ（Ａ）配列、コドン使用頻度の適合を含み得る。

【0341】

別の実施形態では、細胞内または細胞外ＩＦＮシグナル伝達の阻害剤は、レプリコン、好ましくはトランスレプリコンまたは本明細書に記載のトランスレプリコンによってコードされる。レプリコンは、アルファウイルスレプリカーゼ、典型的にはＣＳＥ １、ＣＳＥ ２およびＣＳＥ ４による複製を可能にする核酸配列エレメントを含み、好ましくは、典型的にはＣＳＥ ３を含むサブゲノム転写物、すなわちサブゲノムプロモータの産生を可能にする核酸配列エレメントも含む。レプリコンは、本明細書に記載される１つ以上の非ポリペプチド配列を改変する修飾、例えばキャップ、ポリ（Ａ）配列、コドン使用頻度の適合をさらに含み得る。複数のオープンリーディングフレームがレプリコン上に存在する場合、ＩＦＮシグナル伝達の阻害剤は、場合によりサブゲノムプロモータの制御下または非制御下で、それらのいずれかによってコードされ得る。好ましい実施形態では、ＩＦＮシグナル伝達の阻害剤は、ＲＮＡレプリコンの最も上流のオープンリーディングフレームによってコードされる。ＩＦＮシグナル伝達の阻害剤がＲＮＡレプリコンの最も上流のオープンリーディングフレームによってコードされる場合、ＩＦＮシグナル伝達の阻害剤をコードする遺伝情報は、ＲＮＡレプリコンの宿主細胞への導入後早期に翻訳され、結果として生じるタンパク質は、その後、ＩＦＮシグナル伝達を阻害し得る。

【0342】

機能性アルファウイルス非構造タンパク質
オープンリーディングフレームによってコードされるさらなる適切な目的のタンパク質は、機能性アルファウイルス非構造タンパク質である。「アルファウイルス非構造タンパク質」という用語には、糖鎖修飾（グリコシル化など）および脂質修飾形態のアルファウイルス非構造タンパク質を含む、ありとあらゆる同時翻訳または翻訳後修飾形態が含まれる。

【0343】

いくつかの実施形態では、「アルファウイルス非構造タンパク質」という用語は、アルファウイルス起源の個々の非構造タンパク質（ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、ｎｓＰ４）のいずれか１つ以上、またはアルファウイルス起源の複数の非構造タンパク質のポリペプチド配列を含むポリタンパク質を指す。いくつかの実施形態では、「アルファウイルス非構造タンパク質」は、ｎｓＰ１２３および／またはｎｓＰ４を指す。他の実施形態では、「アルファウイルス非構造タンパク質」は、ｎｓＰ１２３４を指す。一実施形態では、オープンリーディングフレームによってコードされる目的のタンパク質は、単一の、場合により切断可能なポリタンパク質：ｎｓＰ１２３４としてのｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３およびｎｓＰ４のすべてからなる。一実施形態では、オープンリーディングフレームによってコードされる目的のタンパク質は、単一の、場合により切断可能なポリタンパク質：ｎｓＰ１２３としてのｎｓＰ１、ｎｓＰ２およびｎｓＰ３からなる。その実施形態では、ｎｓＰ４はさらなる目的のタンパク質であり得、さらなるオープンリーディングフレームによってコードされ得る。

【0344】

いくつかの実施形態では、アルファウイルス非構造タンパク質は、例えば宿主細胞において、複合体または会合体を形成することができる。いくつかの実施形態では、「アルファウイルス非構造タンパク質」は、ｎｓＰ１２３（同義語としてＰ１２３）とｎｓＰ４の複合体または会合体を指す。一部の実施形態では、「アルファウイルス非構造タンパク質」は、ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、およびｎｓＰ３の複合体または会合体を指す。いくつかの実施形態では、「アルファウイルス非構造タンパク質」は、ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３およびｎｓＰ４の複合体または会合体を指す。いくつかの実施形態では、「アルファウイルス非構造タンパク質」は、ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３およびｎｓＰ４からなる群より選択されるいずれか１つ以上の複合体または会合体を指す。いくつかの実施形態では、アルファウイルス非構造タンパク質は少なくともｎｓＰ４を含む。

【0345】

「複合体」または「会合体」という用語は、空間的に近接している２つ以上の同じまたは異なるタンパク質分子を指す。複合体のタンパク質は、好ましくは互いに直接または間接的に物理的または物理化学的に接触している。複合体または会合体は、複数の異なるタンパク質（ヘテロ多量体）および／または１つの特定のタンパク質の複数のコピー（ホモ多量体）で構成され得る。アルファウイルス非構造タンパク質の文脈において、「複合体または会合体」という用語は、多数の、そのうちの少なくとも１つがアルファウイルス非構造タンパク質である少なくとも２つのタンパク質分子を表す。複合体または会合体は、１つの特定のタンパク質（ホモ多量体）および／または複数の異なるタンパク質（ヘテロ多量体）の複数のコピーで構成され得る。多量体の文脈において、「多」とは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１０を超えるなどの、１より多いことを意味する。

【0346】

「機能性アルファウイルス非構造タンパク質」という用語は、レプリカーゼ機能を有するアルファウイルス非構造タンパク質を含む。したがって、「機能性アルファウイルス非構造タンパク質」は、アルファウイルスレプリカーゼを含む。「レプリカーゼ機能」は、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲＰ）、すなわち（＋）鎖ＲＮＡ鋳型に基づいて（－）鎖ＲＮＡの合成を触媒することができる、および／または（－）鎖ＲＮＡ鋳型に基づいて（＋）鎖ＲＮＡの合成を触媒することができる酵素の機能を含む。したがって、「機能性アルファウイルス非構造タンパク質」という用語は、（＋）鎖（例えばゲノム）ＲＮＡを鋳型として使用して（－）鎖ＲＮＡを合成するタンパク質もしくは複合体、ゲノムＲＮＡの（－）鎖相補体を鋳型として使用して新しい（＋）鎖ＲＮＡを合成するタンパク質もしくは複合体、および／またはゲノムＲＮＡの（－）鎖相補体の断片を鋳型として使用してサブゲノム転写物を合成するタンパク質もしくは複合体を指すことができる。機能性アルファウイルス非構造タンパク質は、例えばプロテアーゼ（自己切断のため）、ヘリカーゼ、末端アデニリルトランスフェラーゼ（ポリ（Ａ）尾部の付加のため）、メチルトランスフェラーゼおよびグアニリルトランスフェラーゼ（核酸に５'キャップを提供するため）、核局在化部位、トリホスファターゼなどの１つ以上の追加の機能をさらに有し得る（Ｇｏｕｌｄ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．８７ ｐｐ．１１１－１２４；Ｒｕｐｐ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，ｖｏｌ．９６，ｐｐ．２４８３－５００）。

【0347】

本発明によれば、「アルファウイルスレプリカーゼ」という用語は、天然に存在するアルファウイルス（自然界で見出されるアルファウイルス）由来のＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、および弱毒化アルファウイルス由来などのアルファウイルスの変異体または誘導体由来のＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを含む、アルファウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを指す。本発明の文脈において、文脈上特定のレプリカーゼがアルファウイルスレプリカーゼではないことが指示されない限り、「レプリカーゼ」および「アルファウイルスレプリカーゼ」という用語は互換的に使用される。

【0348】

「レプリカーゼ」という用語は、アルファウイルス感染細胞によって発現されるか、またはアルファウイルスレプリカーゼをコードする核酸でトランスフェクトされた細胞によって発現される、アルファウイルスレプリカーゼのすべての変異体、特に翻訳後修飾変異体、立体配座、アイソフォームおよびホモログを含む。さらに、「レプリカーゼ」という用語は、組換え法によって生成されたおよび生成され得るすべての形態のレプリカーゼを含む。例えば、実験室でのレプリカーゼの検出および／または精製を容易にするタグ、例えばｍｙｃタグ、ＨＡタグまたはオリゴヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）を含むレプリカーゼは、組換え法によって生成され得る。

【0349】

場合により、アルファウイルスレプリカーゼは、アルファウイルスの保存された配列エレメント１（ＣＳＥ １）またはその相補的な配列、保存された配列エレメント２（ＣＳＥ ２）またはその相補的な配列、保存された配列エレメント３（ＣＳＥ ３）またはその相補的な配列、保存された配列エレメント４（ＣＳＥ ４）またはその相補的な配列のいずれか１つ以上に結合する能力によってさらに機能的に定義される。好ましくは、レプリカーゼは、ＣＳＥ ２［すなわち（＋）鎖］および／もしくはＣＳＥ ４［すなわち（＋）鎖］に結合することができるか、またはＣＳＥ １の相補体［すなわち（－）鎖］および／もしくはＣＳＥ ３の相補体［すなわち（－）鎖］に結合することができる。

【0350】

レプリカーゼの起源は特定のアルファウイルスに限定されない。好ましい実施形態では、アルファウイルスレプリカーゼは、天然に存在するセムリキ森林ウイルスおよび弱毒化セムリキ森林ウイルスなどのセムリキ森林ウイルスの変異体または誘導体を含む、セムリキ森林ウイルス由来の非構造タンパク質を含む。代替的な好ましい実施形態では、アルファウイルスレプリカーゼは、天然に存在するシンドビスウイルスおよび弱毒シンドビスウイルスなどのシンドビスウイルスの変異体または誘導体を含む、シンドビスウイルス由来の非構造タンパク質を含む。代替的な好ましい実施形態では、アルファウイルスレプリカーゼは、天然に存在するベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）および弱毒化ＶＥＥＶなどのＶＥＥＶの変異体または誘導体を含む、ＶＥＥＶ由来の非構造タンパク質を含む。代替的な好ましい実施形態では、アルファウイルスレプリカーゼは、天然に存在するチクングニアウイルス（ＣＨＩＫＶ）および弱毒化ＣＨＩＫＶなどのＣＨＩＫＶの変異体または誘導体を含む、ＣＨＩＫＶ由来の非構造タンパク質を含む。

【0351】

レプリカーゼは、複数のアルファウイルス由来の非構造タンパク質を含むこともできる。したがって、アルファウイルス非構造タンパク質を含み、レプリカーゼ機能を有する異種複合体または会合体も、同様に本発明に含まれる。単に例示目的のために、レプリカーゼは、第１のアルファウイルス由来の１つ以上の非構造タンパク質（例えばｎｓＰ１、ｎｓＰ２）、および第２のアルファウイルス由来の１つ以上の非構造タンパク質（ｎｓＰ３、ｎｓＰ４）を含み得る。複数の異なるアルファウイルス由来の非構造タンパク質は、別々のオープンリーディングフレームによってコードされ得るか、またはポリタンパク質、例えばｎｓＰ１２３４として単一のオープンリーディングフレームによってコードされ得る。

【0352】

いくつかの実施形態では、機能性アルファウイルス非構造タンパク質は、機能性アルファウイルス非構造タンパク質が発現される細胞において膜複製複合体および／または液胞を形成することができる。

【0353】

機能性アルファウイルス非構造タンパク質、すなわちレプリカーゼ機能を有するアルファウイルス非構造タンパク質が本発明による核酸分子によってコードされる場合、レプリコンのサブゲノムプロモータは、存在する場合、前記レプリカーゼと適合性であることが好ましい。この文脈において適合性であるとは、アルファウイルスレプリカーゼが、サブゲノムプロモータが存在する場合、サブゲノムプロモータを認識できることを意味する。一実施形態では、これは、サブゲノムプロモータが、レプリカーゼが由来するアルファウイルスに天然である、すなわちこれらの配列の天然起源が同じアルファウイルスである場合に達成される。代替的な実施形態では、サブゲノムプロモータは、アルファウイルスレプリカーゼがサブゲノムプロモータを認識できることを条件として、アルファウイルスレプリカーゼが由来するアルファウイルスに天然ではない。言い換えれば、レプリカーゼはサブゲノムプロモータと適合性である（交差ウイルス適合性）。異なるアルファウイルスに由来するサブゲノムプロモータおよびレプリカーゼに関する交差ウイルス適合性の例は、当技術分野で公知である。交差ウイルス適合性が存在する限り、サブゲノムプロモータとレプリカーゼの任意の組合せが可能である。交差ウイルス適合性は、サブゲノムプロモータからのＲＮＡ合成に適した条件で、試験するレプリカーゼを、試験するサブゲノムプロモータを有するＲＮＡと共にインキュベートすることにより、本発明を実施する当業者によって容易に試験され得る。サブゲノム転写物が生成された場合、サブゲノムプロモータとレプリカーゼは適合性であると決定される。交差ウイルス適合性の様々な例が公知である（Ｓｔｒａｕｓｓ＆Ｓｔｒａｕｓｓ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，１９９４，ｖｏｌ．５８，ｐｐ．４９１－５６２によって総説されている）。

【0354】

一実施形態では、アルファウイルス非構造タンパク質は、異種タンパク質、例えばユビキチンとの融合タンパク質としてコードされない。

【0355】

本発明では、機能性アルファウイルス非構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームは、ＲＮＡレプリコン上に提供され得るか、あるいは、別個の核酸分子、例えばｍＲＮＡ分子として提供され得る。別個のｍＲＮＡ分子は、場合により、例えばキャップ、５'－ＵＴＲ、３'－ＵＴＲ、ポリ（Ａ）配列、および／またはコドン使用頻度の適合を含み得る。本発明の系について本明細書に記載されるように、別個のｍＲＮＡ分子はトランスで提供され得る。

【0356】

機能性アルファウイルス非構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームがＲＮＡレプリコン上に提供される場合、レプリコンは、好ましくは機能性アルファウイルス非構造タンパク質によって複製され得る。特に、機能性アルファウイルス非構造タンパク質をコードするＲＮＡレプリコンは、レプリコンによってコードされる機能性アルファウイルス非構造タンパク質によって複製され得る。この実施形態は、機能性アルファウイルス非構造タンパク質をコードする核酸分子がトランスで提供されない場合に非常に好ましい。この実施形態では、レプリコンのシス複製が目的とされる。好ましい実施形態では、ＲＮＡレプリコンは、機能性アルファウイルス非構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームおよび目的のタンパク質をコードするさらなるオープンリーディングフレームを含み、機能性アルファウイルス非構造タンパク質によって複製され得る。この実施形態は、本発明に従って目的のタンパク質を生産するためのいくつかの方法に特に適する。それぞれのレプリコンの例を図５に示す（「シスレプリコンΔ５ＡＴＧ－ＲＲＳ」）。

【0357】

レプリコンが機能性アルファウイルス非構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む場合、機能性アルファウイルス非構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームは５'複製認識配列と重複しないことが好ましい。一実施形態では、機能性アルファウイルス非構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームは、サブゲノムプロモータが存在する場合、サブゲノムプロモータと重複しない。それぞれのレプリコンの例を図５に示す（「シスレプリコンΔ５ＡＴＧ－ＲＲＳ」）。

【0358】

複数のオープンリーディングフレームがレプリコン上に存在する場合、機能性アルファウイルス非構造タンパク質は、場合によりサブゲノムプロモータの制御下にあるまたは制御下にない、好ましくはサブゲノムプロモータの制御下にない、それらのいずれかによってコードされ得る。好ましい実施形態では、機能性アルファウイルス非構造タンパク質は、ＲＮＡレプリコンの最も上流のオープンリーディングフレームによってコードされる。機能性アルファウイルス非構造タンパク質がＲＮＡレプリコンの最も上流のオープンリーディングフレームによってコードされる場合、機能性アルファウイルス非構造タンパク質をコードする遺伝情報は、宿主細胞へのＲＮＡレプリコンの導入後早期に翻訳され、結果として生じたタンパク質は、その後、宿主細胞内で複製、および場合によりサブゲノム転写物の産生を駆動することができる。それぞれのレプリコンの例を図５に示す（「シスレプリコンΔ５ＡＴＧ－ＲＲＳ」）。

【0359】

レプリコンに含まれるかまたはトランスで提供される別の核酸分子に含まれる、機能性アルファウイルス非構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームの存在は、レプリコンが複製され、その結果として、レプリコンによってコードされる目的の遺伝子が、場合によりサブゲノムプロモータの制御下で、高レベルで発現されることを可能にする。これは、他の導入遺伝子発現系と比較してコスト面の利点に結び付く。本発明のレプリコンは機能性アルファウイルス非構造タンパク質の存在下で複製され得るため、比較的少量のレプリコンＲＮＡが投与された場合でも、目的の遺伝子の高レベルの発現が達成され得る。レプリコンＲＮＡの量が少ないことは、コストにプラスの影響を与える。

【0360】

ＲＮＡレプリコンにおける少なくとも１つのオープンリーディングフレームの位置
ＲＮＡレプリコンは、場合によりサブゲノムプロモータの制御下で、目的のペプチドまたは目的のタンパク質をコードする１つ以上の遺伝子の発現に適する。様々な実施形態が可能である。それぞれが目的のペプチドまたは目的のタンパク質をコードする１つ以上のオープンリーディングフレームがＲＮＡレプリコン上に存在し得る。ＲＮＡレプリコンの最も上流のオープンリーディングフレームは、「第１のオープンリーディングフレーム」と称される。いくつかの実施形態では、「第１のオープンリーディングフレーム」は、ＲＮＡレプリコンの唯一のオープンリーディングフレームである。場合により、１つ以上のさらなるオープンリーディングフレームが第１のオープンリーディングフレームの下流に存在し得る。第１のオープンリーディングフレームの下流の１つ以上のさらなるオープンリーディングフレームは、それらが第１のオープンリーディングフレームの下流に存在する順序で（５'から３'へ）、「第２のオープンリーディングフレーム」、「第３のオープンリーディングフレーム」などと称され得る。好ましくは、各オープンリーディングフレームは、開始コドン（塩基トリプレット）、典型的にはＡＴＧ（それぞれのＤＮＡ分子中）に対応するＡＵＧ（ＲＮＡ分子中）を含む。

【0361】

レプリコンが３'複製認識配列を含む場合、すべてのオープンリーディングフレームが３'複製認識配列の上流に局在することが好ましい。

【0362】

１つ以上のオープンリーディングフレームを含むＲＮＡレプリコンが宿主細胞に導入される場合、５'複製認識配列から少なくとも１つの開始コドンが除去されているため、翻訳は、好ましくは第１のオープンリーディングフレームの上流位置では開始されない。したがって、レプリコンは、直接第１のオープンリーディングフレームの翻訳のための鋳型として働き得る。好ましくは、レプリコンは５'キャップを含む。これは、レプリコンから直接第１のオープンリーディングフレームによってコードされる遺伝子の発現に役立つ。

【0363】

いくつかの実施形態では、レプリコンの少なくとも１つのオープンリーディングフレームは、サブゲノムプロモータ、好ましくはアルファウイルスサブゲノムプロモータの制御下にある。アルファウイルスサブゲノムプロモータは非常に効率的であり、したがって高レベルでの異種遺伝子発現に適する。好ましくは、サブゲノムプロモータは、アルファウイルスのサブゲノム転写物のプロモータである。これは、サブゲノムプロモータがアルファウイルスに天然であり、好ましくは前記アルファウイルス中の１つ以上の構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームの転写を制御するものであることを意味する。あるいは、サブゲノムプロモータは、アルファウイルスのサブゲノムプロモータの変異体であり、宿主細胞においてサブゲノムＲＮＡ転写のプロモータとして機能する任意の変異体が適切である。レプリコンがサブゲノムプロモータを含む場合、レプリコンは、保存された配列エレメント３（ＣＳＥ ３）またはその変異体を含むことが好ましい。

【0364】

好ましくは、サブゲノムプロモータの制御下にある少なくとも１つのオープンリーディングフレームは、サブゲノムプロモータの下流に局在する。好ましくは、サブゲノムプロモータは、オープンリーディングフレームの転写物を含むサブゲノムＲＮＡの産生を制御する。

【0365】

いくつかの実施形態では、第１のオープンリーディングフレームはサブゲノムプロモータの制御下にある。第１のオープンリーディングフレームがサブゲノムプロモータの制御下にある場合、その局在化は、アルファウイルスのゲノム内の構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームの局在化に類似する。第１のオープンリーディングフレームがサブゲノムプロモータの制御下にある場合、第１のオープンリーディングフレームによってコードされる遺伝子は、レプリコンとそのサブゲノム転写物の両方から発現され得る（後者は機能性アルファウイルス非構造タンパク質の存在下で）。それぞれの実施形態を、図５のレプリコン「Δ５ＡＴＧ－ＲＲＳ」によって例示する。好ましくは、「Δ５ＡＴＧ－ＲＲＳ」は、ｎｓＰ４のＣ末端断片（＊ｎｓＰ４）をコードする核酸配列中に開始コドンを含まない。それぞれがサブゲノムプロモータの制御下にある１つ以上のさらなるオープンリーディングフレームは、サブゲノムプロモータの制御下にある第１のオープンリーディングフレームの下流に存在し得る（図５には示していない）。１つ以上のさらなるオープンリーディングフレームによって、例えば第２のオープンリーディングフレームによってコードされる遺伝子は、それぞれサブゲノムプロモータの制御下で、１つ以上のサブゲノム転写物から翻訳され得る。例えば、ＲＮＡレプリコンは、目的の第２のタンパク質をコードする転写物の産生を制御するサブゲノムプロモータを含み得る。

【0366】

他の実施形態では、第１のオープンリーディングフレームはサブゲノムプロモータの制御下にない。第１のオープンリーディングフレームがサブゲノムプロモータの制御下にない場合、第１のオープンリーディングフレームによってコードされる遺伝子はレプリコンから発現され得る。それぞれの実施形態を、図５のレプリコン「Δ５ＡＴＧ－ＲＲＳΔＳＧＰ」によって例示する。それぞれがサブゲノムプロモータの制御下にある１つ以上のさらなるオープンリーディングフレームは、第１のオープンリーディングフレームの下流に存在し得る（２つの例示的な実施形態の説明については、図５の「Δ５ＡＴＧ－ＲＲＳ－バイシストロニック」および「シスレプリコンΔ５ＡＴＧ－ＲＲＳ」参照）。１つ以上のさらなるオープンリーディングフレームによってコードされる遺伝子は、サブゲノム転写物から発現され得る。

【0367】

本発明によるレプリコンを含む細胞では、レプリコンは機能性アルファウイルス非構造タンパク質によって増幅され得る。さらに、レプリコンがサブゲノムプロモータの制御下にある１つ以上のオープンリーディングフレームを含む場合、１つ以上のサブゲノム転写物が機能性アルファウイルス非構造タンパク質によって生成されると予想される。機能性アルファウイルス非構造タンパク質は、トランスで提供され得るか、またはレプリコンのオープンリーディングフレームによってコードされ得る。

【0368】

レプリコンが目的のタンパク質をコードする複数のオープンリーディングフレームを含む場合、各オープンリーディングフレームは異なるタンパク質をコードすることが好ましい。例えば、第２のオープンリーディングフレームによってコードされるタンパク質は、第１のオープンリーディングフレームによってコードされるタンパク質とは異なる。

【0369】

いくつかの実施形態では、第１のオープンリーディングフレームおよび／またはさらなるオープンリーディングフレームによって、好ましくは第１のオープンリーディングフレームによってコードされる目的のタンパク質は、機能性アルファウイルス非構造タンパク質である。いくつかの実施形態では、第１のオープンリーディングフレームおよび／またはさらなるオープンリーディングフレームによって、例えば第２のオープンリーディングフレームによってコードされる目的のタンパク質は、再プログラミング因子である。

【0370】

一実施形態では、第１のオープンリーディングフレームによってコードされる目的のタンパク質は、機能性アルファウイルス非構造タンパク質である。その実施形態では、レプリコンは、好ましくは５'キャップを含む。特に、第１のオープンリーディングフレームによってコードされる目的のタンパク質が機能性アルファウイルス非構造タンパク質である場合、および好ましくはレプリコンが５'キャップを含む場合、機能性アルファウイルス非構造タンパク質をコードする核酸配列は、レプリコンから効率的に翻訳されることができ、および結果として生じるタンパク質は、その後、レプリコンの複製を駆動し、サブゲノム転写物（１つまたは複数）の合成を駆動することができる。この実施形態は、機能性アルファウイルス非構造タンパク質をコードするさらなる核酸分子がレプリコンと共に使用されないまたは存在しない場合に好ましい可能性がある。この実施形態では、レプリコンのシス複製が目的とされる。

【0371】

第１のオープンリーディングフレームが機能性アルファウイルス非構造タンパク質をコードする一実施形態を、図５の「シスレプリコンΔ５ＡＴＧ－ＲＲＳ」によって示す。ｎｓＰ１２３４をコードする核酸配列の翻訳後、翻訳産物（ｎｓＰ１２３４またはその断片（１つまたは複数））はレプリカーゼとして働くことができ、ＲＮＡ合成、すなわちレプリコンの複製および第２のオープンリーディングフレームを含むサブゲノム転写物の合成を駆動することができる（図５の「導入遺伝子」）。

【0372】

トランス複製系
さらなる態様では、本発明は、
機能性アルファウイルス非構造タンパク質を発現するためのＲＮＡ構築物、
機能性アルファウイルス非構造タンパク質によってトランスで複製され得る、本発明の第１の態様によるＲＮＡレプリコン
を含む系を提供する。

【0373】

この態様では、ＲＮＡレプリコンは、機能性アルファウイルス非構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含まないことが好ましい。

【0374】

したがって、本発明は、２つの核酸分子：機能性アルファウイルス非構造タンパク質を発現するための第１のＲＮＡ構築物（すなわち機能性アルファウイルス非構造タンパク質をコードする）および第２のＲＮＡ分子であるＲＮＡレプリコンを含む系を提供する。機能性アルファウイルス非構造タンパク質を発現するためのＲＮＡ構築物は、本明細書では同義的に「機能性アルファウイルス非構造タンパク質を発現するためのＲＮＡ構築物」または「レプリカーゼ構築物」と称される。

【0375】

機能性アルファウイルス非構造タンパク質は上記で定義されたとおりであり、典型的にはレプリカーゼ構築物に含まれるオープンリーディングフレームによってコードされる。レプリカーゼ構築物によってコードされる機能性アルファウイルス非構造タンパク質は、レプリコンを複製することができる任意の機能性アルファウイルス非構造タンパク質であり得る。

【0376】

本発明の系が細胞、好ましくは真核細胞に導入された場合、機能性アルファウイルス非構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームが翻訳され得る。翻訳後、機能性アルファウイルス非構造タンパク質は、トランスで別のＲＮＡ分子（ＲＮＡレプリコン）を複製することができる。したがって、本発明は、ＲＮＡをトランスで複製するための系を提供する。その結果として、本発明の系はトランス複製系である。第２の態様によれば、レプリコンはトランスレプリコンである。

【0377】

本明細書では、トランス（例えばトランス作用性、トランス調節性の文脈において）は、一般に、「異なる分子から作用する」（すなわち分子間）を意味する。これは、一般に、「同じ分子から作用する」（すなわち分子内）を意味するシス（例えばシス作用性、シス調節性の文脈において）の反対である。ＲＮＡ合成（転写およびＲＮＡ複製を含む）の文脈において、トランス作用性要素には、ＲＮＡ合成が可能な酵素（ＲＮＡポリメラーゼ）をコードする遺伝子を含む核酸配列が含まれる。ＲＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡの合成のための鋳型として、第２の核酸分子、すなわちそれがコードされるもの以外の核酸分子を使用する。ＲＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子を含む核酸配列の両方が、第２の核酸分子に対して「トランスで作用する」と言われる。本発明の文脈において、トランス作用性ＲＮＡによってコードされるＲＮＡポリメラーゼは、機能性アルファウイルス非構造タンパク質である。機能性アルファウイルス非構造タンパク質は、ＲＮＡレプリコンの複製を含むＲＮＡ合成のための鋳型として、ＲＮＡレプリコンである第２の核酸分子を使用することができる。本発明によるトランスでレプリカーゼによって複製され得るＲＮＡレプリコンは、本明細書では同義的に「トランスレプリコン」と称される。

【0378】

本発明の系において、機能性アルファウイルス非構造タンパク質の役割は、レプリコンを増幅すること、およびサブゲノムプロモータがレプリコン上に存在する場合、サブゲノム転写物を生成することである。レプリコンが発現のための目的の遺伝子をコードする場合、目的の遺伝子の発現レベルおよび／または発現の持続時間は、機能性アルファウイルス非構造タンパク質のレベルを変更することによってトランスで調節され得る。

【0379】

アルファウイルスレプリカーゼが一般にトランスで鋳型ＲＮＡを認識し、複製することができるという事実は、１９８０年代に最初に発見されたが、とりわけ、トランス複製されたＲＮＡは効率的な複製を妨げると考えられていた（これは、感染細胞のアルファウイルスゲノムと共複製する欠陥干渉（ＤＩ）ＲＮＡの場合に発見された）ため、生物医学的適用についてのトランス複製の潜在的可能性は認識されなかった（Ｂａｒｒｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，ｖｏｌ．６５（Ｐｔ ８），ｐｐ．１２７３－１２８３；Ｌｅｈｔｏｖａａｒａ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ，ｖｏｌ．７８，ｐｐ．５３５３－５３５７；Ｐｅｔｔｅｒｓｓｏｎ，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ，ｖｏｌ．７８，ｐｐ．１１５－１１９）。ＤＩ ＲＮＡは、高いウイルス量での細胞株の感染中に準天然に発生し得るトランスレプリコンである。ＤＩエレメントは非常に効率的に共複製するため、親ウイルスの毒性を低下させ、それによって阻害性寄生ＲＮＡとして作用する（Ｂａｒｒｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，ｖｏｌ．６５（Ｐｔ １１），ｐｐ．１９０９－１９２０）。生物医学的適用の潜在的可能性は認識されていなかったが、トランス複製の現象は、シスで同じ分子からレプリカーゼを発現することを必要とせずに、複製の機構を解明することを目的としたいくつかの基礎研究で用いられた；さらに、レプリカーゼとレプリコンの分離はまた、それぞれの変異体が機能喪失変異体である場合でも、ウイルスタンパク質の変異体を含む機能試験を可能にする（Ｌｅｍｍ ｅｔ ａｌ．，１９９４，ＥＭＢＯ Ｊ．，ｖｏｌ．１３，ｐｐ．２９２５－２９３４）。これらの機能喪失試験およびＤＩ ＲＮＡは、アルファウイルスエレメントに基づくトランス活性化系が最終的に治療目的に適うように利用可能になり得ることを示唆しなかった。

【0380】

本発明の系は、少なくとも２つの核酸分子を含む。したがって、それは、好ましくはＲＮＡ分子である、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、または１０個以上の核酸分子を含み得る。好ましい実施形態では、系は、正確に２つのＲＮＡ分子、レプリコンおよびレプリカーゼ構築物からなる。代替的な好ましい実施形態では、系は、それぞれが好ましくは少なくとも１つの目的のタンパク質をコードする複数のレプリコンを含み、レプリカーゼ構築物も含む。これらの実施形態では、レプリカーゼ構築物によってコードされる機能性アルファウイルス非構造タンパク質は、複製およびサブゲノム転写物の産生をそれぞれ駆動するように各レプリコンに作用することができる。例えば、各レプリコンは再プログラミング因子をコードし得る。これは、例えば再プログラミング因子の機能的セットを形成するために細胞における複数の再プログラミング因子の発現を所望する場合に有利である。

【0381】

好ましくは、レプリカーゼ構築物は、（＋）鎖鋳型に基づく（－）鎖合成、および／または（－）鎖鋳型に基づく（＋）鎖合成に必要な少なくとも１つの保存された配列エレメント（ＣＳＥ）を欠く。より好ましくは、レプリカーゼ構築物は、アルファウイルスの保存された配列エレメント（ＣＳＥ）を含まない。特に、アルファウイルスの４つのＣＳＥの中で（Ｓｔｒａｕｓｓ＆Ｓｔｒａｕｓｓ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，１９９４，ｖｏｌ．５８，ｐｐ．４９１－５６２；Ｊｏｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｆｕｔｕｒｅ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２００９，ｖｏｌ．４，ｐｐ．８３７－８５６）、次のＣＳＥのいずれか１つ以上が、好ましくはレプリカーゼ構築物上に存在しない：ＣＳＥ １；ＣＳＥ ２；ＣＳＥ ３；ＣＳＥ ４。特に、１つ以上のアルファウイルスＣＳＥの非存在下では、本発明のレプリカーゼ構築物は、アルファウイルスゲノムＲＮＡに類似するよりも典型的な真核生物ｍＲＮＡにはるかに類似する。

【0382】

本発明のレプリカーゼ構築物は、好ましくは、少なくとも自己複製することができない、および／またはサブゲノムプロモータの制御下にあるオープンリーディングフレームを含まないという点でアルファウイルスゲノムＲＮＡと区別される。自己複製することができない場合、レプリカーゼ構築物は「自殺構築物」とも称され得る。

【0383】

トランス複製系は次の利点に結び付く：
何よりもまず、トランス複製系の多用途性は、レプリコンおよびレプリカーゼ構築物を様々な時点および／または様々な部位で設計および／または調製できることを可能にする。一実施形態では、レプリカーゼ構築物を最初の時点で調製し、レプリコンをより後の時点で調製する。例えば、その調製後、後の時点での使用のためにレプリカーゼ構築物を保存し得る。本発明は、シスレプリコンと比較して高い柔軟性を提供する：本発明の系は、新しい再プログラミング因子をコードする核酸をレプリコンにクローニングすることによって、治療用に設計され得る。事前に調製したレプリカーゼ構築物を保存から復元し得る。言い換えれば、特定のレプリコンとは独立してレプリカーゼ構築物を設計および調製することができる。

【0384】

第二に、本発明によるトランスレプリコンは、典型的には、典型的なシスレプリコンよりも短い核酸分子である。これは、目的のタンパク質をコードするレプリコンのより迅速なクローニングを可能にし、目的のタンパク質の高い収率を提供する。

【0385】

本発明の系のさらなる利点には、核転写からの独立性および２つの別個のＲＮＡ分子上の重要な遺伝情報の存在が含まれ、これはかつてない設計の自由度を提供する。互いに組み合わせることができるその多様な要素を考慮して、本発明は、所望のレベルのＲＮＡ増幅、所望の標的生物、目的のタンパク質の所望のレベルの生産などのためにレプリカーゼ発現を最適化することを可能にする。本発明による系は、インビトロまたはインビボで、所与の細胞型－休止または周期中－について様々な量または比率のレプリコンとレプリカーゼ構築物を同時トランスフェクトすることを可能にする。

【0386】

本発明によるレプリカーゼ構築物は、好ましくは一本鎖ＲＮＡ分子である。本発明によるレプリカーゼ構築物は、典型的には（＋）鎖ＲＮＡ分子である。一実施形態では、本発明のレプリカーゼ構築物は、単離された核酸分子である。

【0387】

本発明によるＲＮＡ分子の好ましい特徴
本発明によるＲＮＡ分子は、場合により、さらなる特徴、例えば５'キャップ、５'－ＵＴＲ、３'－ＵＴＲ、ポリ（Ａ）配列、および／またはコドン使用頻度の適合によって特徴付けられ得る。詳細を以下で説明する。

【0388】

キャップ
いくつかの実施形態では、本発明によるレプリコンは５'キャップを含む。

【0389】

いくつかの実施形態では、本発明によるレプリカーゼ構築物は５'キャップを含む。

【0390】

「５'キャップ」、「キャップ」、「５'キャップ構造」、「キャップ構造」という用語は、前駆体メッセンジャーＲＮＡなどの一部の真核生物一次転写物の５'末端に見出されるジヌクレオチドを指すために同義的に使用される。５'キャップは、（場合により修飾された）グアノシンが５'－５'三リン酸結合（または特定のキャップ類似体の場合は修飾三リン酸結合）を介してｍＲＮＡ分子の最初のヌクレオチドに結合している構造である。これらの用語は、従来のキャップまたはキャップ類似体を指す場合がある。説明のために、いくつかの特定のキャップジヌクレオチド（キャップ類似体ジヌクレオチドを含む）を図６に示す。

【0391】

「５'キャップを含むＲＮＡ」または「５'キャップを備えたＲＮＡ」または「５'キャップで修飾されたＲＮＡ」または「キャップされたＲＮＡ」は、５'キャップを含むＲＮＡを指す。例えば、ＲＮＡに５'キャップを提供することは、前記５'キャップの存在下でのＤＮＡ鋳型のインビトロ転写によって達成され得、前記５'キャップは、生成されたＲＮＡ鎖に共転写によって組み込むか、または、例えばインビトロ転写によってＲＮＡを生成し、転写後にキャッピング酵素、例えばワクシニアウイルスのキャッピング酵素を使用して５'キャップをＲＮＡに付着させ得る。キャップされたＲＮＡでは、（キャップされた）ＲＮＡ分子の最初の塩基の３'位置は、ホスホジエステル結合を介してＲＮＡ分子の次の塩基（「２番目の塩基」）の５'位置に連結される。

【0392】

宿主細胞または宿主生物へのそれぞれのＲＮＡの導入後の初期段階でタンパク質をコードする核酸配列の翻訳が望ましい場合、ＲＮＡ分子上のキャップの存在が非常に好ましい。例えば、キャップの存在は、ＲＮＡレプリコンによってコードされる目的の遺伝子が、それぞれのＲＮＡの宿主細胞への導入後の初期段階で効率的に翻訳されることを可能にする。「初期段階」とは、典型的には、ＲＮＡの導入後最初の１時間以内、または最初の２時間以内、または最初の３時間以内を意味する。

【0393】

機能的なレプリカーゼの非存在下で翻訳が行われることが望ましい場合、または宿主細胞にわずかなレベルのレプリカーゼしか存在しない場合も、ＲＮＡ分子上のキャップの存在が好ましい。例えば、レプリカーゼをコードする核酸分子が宿主細胞に導入された場合でも、導入後の初期段階では、典型的にはレプリカーゼのレベルはわずかである。

【0394】

本発明による系では、機能性アルファウイルス非構造タンパク質を発現するためのＲＮＡ構築物は５'キャップを含むことが好ましい。

【0395】

特に、本発明によるＲＮＡレプリコンが機能性アルファウイルス非構造タンパク質をコードする第２の核酸分子（例えばｍＲＮＡ）と共に使用または提供されない場合、ＲＮＡレプリコンは５'キャップを含むことが好ましい。独立して、ＲＮＡレプリコンは、機能性アルファウイルス非構造タンパク質をコードする第２の核酸分子と共に使用または提供される場合でも、５'キャップを含み得る。

【0396】

「従来の５'キャップ」という用語は、天然に存在する５'キャップ、好ましくは７－メチルグアノシンキャップを指す。７－メチルグアノシンキャップでは、キャップのグアノシンは修飾されたグアノシンであり、修飾は７位のメチル化からなる（図６の上部）。

【0397】

本発明の文脈において、「５'キャップ類似体」という用語は、従来の５'キャップに類似するが、好ましくはインビボおよび／または細胞内で、ＲＮＡに付着した場合にそのＲＮＡを安定化する能力を有するように修飾された分子構造を指す。キャップ類似体は従来の５'キャップではない。

【0398】

真核生物のｍＲＮＡの場合、５'キャップは一般にｍＲＮＡの効率的な翻訳に関与すると記述されている：一般に、真核生物では、翻訳は、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）が存在しない限り、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子の５'末端でのみ開始される。真核細胞は、核内での転写中にＲＮＡに５'キャップを提供することができる：新しく合成されたｍＲＮＡは通常、例えば転写物が２０～３０ヌクレオチドの長さに到達すると、５'キャップ構造で修飾される。まず、５'末端ヌクレオチドｐｐｐＮ（ｐｐｐは三リン酸を表す；Ｎは任意のヌクレオシドを表す）は、ＲＮＡ ５'－トリホスファターゼおよびグアニリルトランスフェラーゼ活性を有するキャッピング酵素によって細胞内で５'ＧｐｐｐＮに変換される。ＧｐｐｐＮは、その後、（グアニン－７）－メチルトランスフェラーゼ活性を有する第２の酵素によって細胞内でメチル化されて、モノメチル化ｍ^７ＧｐｐｐＮキャップを形成し得る。一実施形態では、本発明で使用される５'キャップは、天然の５'キャップである。

【0399】

本発明では、天然の５'キャップジヌクレオチドは、典型的には、非メチル化キャップジヌクレオチド（Ｇ（５'）ｐｐｐ（５'）Ｎ；ＧｐｐｐＮとも称される）およびメチル化キャップジヌクレオチド（（ｍ^７Ｇ（５'）ｐｐｐ（５'）Ｎ；ｍ^７ＧｐｐｐＮとも称される）からなる群より選択される。ｍ^７ＧｐｐｐＮ（ＮはＧである）は、次の式で表される：

【化1】

【0400】

本発明のキャップされたＲＮＡはインビトロで調製することができ、したがって、宿主細胞のキャッピング機構に依存しない。キャップされたＲＮＡをインビトロで生成するために最も頻繁に使用される方法は、４つのリボヌクレオシド三リン酸すべておよびｍ^７Ｇ（５'）ｐｐｐ（５'）Ｇ（ｍ^７ＧｐｐｐＧとも呼ばれる）などのキャップジヌクレオチドの存在下で細菌またはバクテリオファージＲＮＡポリメラーゼでＤＮＡ鋳型を転写することである。ＲＮＡポリメラーゼは、次の鋳型ヌクレオシド三リン酸（ｐｐｐＮ）のα－リン酸上のｍ^７ＧｐｐｐＧのグアノシン部分の３'－ＯＨによる求核攻撃で転写を開始し、中間体ｍ^７ＧｐｐｐＧｐＮ（ＮはＲＮＡ分子の２番目の塩基である）をもたらす。競合するＧＴＰ開始産物ｐｐｐＧｐＮの形成は、インビトロ転写中のキャップ対ＧＴＰのモル比を５～１０に設定することによって抑制される。

【0401】

本発明の好ましい実施形態では、５'キャップ（存在する場合）は５'キャップ類似体である。これらの実施形態は、ＲＮＡがインビトロ転写によって得られる、例えばインビトロ転写ＲＮＡ（ＩＶＴ－ＲＮＡ）である場合に特に適する。キャップ類似体は、最初に、インビトロ転写によるＲＮＡ転写物の大規模合成を促進すると記述された。

【0402】

メッセンジャーＲＮＡについて、いくつかのキャップ類似体（合成キャップ）がこれまでに一般的に記述されており、それらはすべて本発明の文脈で使用することができる。理想的には、より高い翻訳効率および／またはインビボ分解に対する耐性の増加および／またはインビトロ分解に対する耐性の増加に関連するキャップ類似体が選択される。

【0403】

好ましくは、一方向でのみＲＮＡ鎖に組み込むことができるキャップ類似体が使用される。Ｐａｓｑｕｉｎｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．（１９９５，ＲＮＡ Ｊ．，ｖｏｌ．，１，ｐｐ．９５７－９６７）は、インビトロ転写中に、バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼが転写の開始のために７－メチルグアノシン単位を使用し、それによりキャップを有する転写物の約４０～５０％がキャップジヌクレオチドを逆方向に有する（すなわち最初の反応産物はＧｐｐｐｍ^７ＧｐＮである）ことを明らかにした。正しいキャップを有するＲＮＡと比較して、逆キャップを有するＲＮＡは、核酸配列のタンパク質への翻訳に関して機能的ではない。したがって、キャップを正しい方向に組み込むこと、すなわちｍ^７ＧｐｐｐＧｐＮなどに本質的に対応する構造を有するＲＮＡが得られることが望ましい。キャップジヌクレオチドの逆組み込みは、メチル化グアノシン単位の２'－または３'－ＯＨ基の置換によって阻害されることが示されている（Ｓｔｅｐｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，２００１；ＲＮＡ Ｊ．，ｖｏｌ．７，ｐｐ．１４８６－１４９５；Ｐｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．，ｖｏｌ．２４，ｐｐ．１６１－１６４）。そのような「抗逆キャップ類似体」の存在下で合成されるＲＮＡは、従来の５'キャップｍ^７ＧｐｐｐＧの存在下でインビトロ転写されるＲＮＡよりも効率的に翻訳される。そのために、メチル化グアノシン単位の３'ＯＨ基がＯＣＨ_３で置き換えられた１つのキャップ類似体が、例えばＨｏｌｔｋａｍｐ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｂｌｏｏｄ，ｖｏｌ．１０８，ｐｐ．４００９－４０１７（７－メチル（３'－Ｏ－メチル）ＧｐｐｐＧ；抗逆キャップ類似体（ＡＲＣＡ））によって記述されている。ＡＲＣＡは、本発明による適切なキャップジヌクレオチドである。

【化2】

【0404】

本発明の好ましい実施形態では、本発明のＲＮＡは、本質的にキャップ除去を受けにくい。一般に、培養哺乳動物細胞に導入された合成ｍＲＮＡから産生されるタンパク質の量は、ｍＲＮＡの自然分解によって制限されるため、これは重要である。ｍＲＮＡ分解の１つのインビボ経路は、ｍＲＮＡキャップの除去から始まる。この除去は、調節サブユニット（Ｄｃｐ１）と触媒サブユニット（Ｄｃｐ２）を含むヘテロ二量体ピロホスファターゼによって触媒される。触媒サブユニットは、三リン酸架橋のαリン酸基とβリン酸基の間を切断する。本発明では、この種の切断を受けないか、または受けにくいキャップ類似体を選択し得るかまたは存在させ得る。この目的に適したキャップ類似体は、式（Ｉ）：

【化3】

式（Ｉ）
［式中、Ｒ^１は、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいアルケニル、置換されていてもよいアルキニル、置換されていてもよいシクロアルキル、置換されていてもよいヘテロシクリル、置換されていてもよいアリール、および置換されていてもよいヘテロアリールからなる群より選択され、
Ｒ^２およびＲ^３は、Ｈ、ハロ、ＯＨ、および置換されていてもよいアルコキシからなる群より独立して選択されるか、またはＲ^２とＲ^３は一緒になってＯ－Ｘ－Ｏ［Ｘは、置換されていてもよいＣＨ_２、ＣＨ_２ＣＨ_２、ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２、ＣＨ_２ＣＨ（ＣＨ_３）、およびＣ（ＣＨ_３）_２からなる群より選択される］を形成するか、またはＲ^２は、Ｒ^２が結合している環の４'位の水素原子と結合して－Ｏ－ＣＨ_２－もしくは－ＣＨ_２－Ｏ－を形成し、
Ｒ^５は、Ｓ、Ｓｅ、およびＢＨ_３からなる群より選択され、
Ｒ^４およびＲ^６は、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、およびＢＨ_３からなる群より独立して選択され、
ｎは１、２、または３である］
に従うキャップジヌクレオチドから選択され得る。

【0405】

Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６の好ましい実施形態は、国際公開第２０１１／０１５３４７Ａ１号に開示されており、本発明において適宜に選択され得る。

【0406】

例えば、本発明の好ましい実施形態では、本発明のＲＮＡはホスホロチオエートキャップ類似体を含む。ホスホロチオエートキャップ類似体は、三リン酸鎖の３つの非架橋Ｏ原子の１つがＳ原子で置換された、すなわち式（Ｉ）のＲ^４、Ｒ^５またはＲ^６の１つがＳである特定のキャップ類似体である。ホスホロチオエートキャップ類似体は、Ｊ．Ｋｏｗａｌｓｋａ ｅｔ ａｌ．，２００８，ＲＮＡ，ｖｏｌ．１４，ｐｐ．１１１９－１１３１によって、望ましくないキャップ除去過程に対する解決策、したがってインビボでのＲＮＡの安定性を高めるための解決策として記載されている。特に、５'キャップのβリン酸基で硫黄原子を酸素原子に置換すると、Ｄｃｐ２に対する安定化をもたらす。本発明において好ましいその実施形態では、式（Ｉ）のＲ^５はＳであり、Ｒ^４およびＲ^６はＯである。

【0407】

本発明のさらなる好ましい実施形態では、本発明のＲＮＡは、ＲＮＡ ５'キャップのホスホロチオエート修飾が「抗逆キャップ類似体」（ＡＲＣＡ）修飾と組み合わされたホスホロチオエートキャップ類似体を含む。それぞれのＡＲＣＡ－ホスホロチオエートキャップ類似体は、国際公開第２００８／１５７６８８ Ａ２号に記載されており、それらはすべて本発明のＲＮＡに使用することができる。その実施形態では、式（Ｉ）のＲ^２またはＲ^３の少なくとも一方はＯＨではなく、好ましくはＲ^２およびＲ^３の一方はメトキシ（ＯＣＨ_３）であり、Ｒ^２およびＲ^３の他方は、好ましくはＯＨである。好ましい実施形態では、酸素原子は、βリン酸基で硫黄原子に置換される（したがって、式（Ｉ）のＲ^５はＳであり、Ｒ^４およびＲ^６はＯである）。ＡＲＣＡのホスホロチオエート修飾は、α、β、およびγホスホロチオエート基が翻訳およびキャップ除去機構の両方でキャップ結合タンパク質の活性部位内に正確に配置されることを確実にすると考えられている。これらの類似体の少なくとも一部は、本質的にピロホスファターゼＤｃｐ１／Ｄｃｐ２に耐性である。ホスホロチオエート修飾ＡＲＣＡは、ホスホロチオエート基を欠く対応するＡＲＣＡよりも、ｅＩＦ４Ｅに対してはるかに高い親和性を有すると記載された。

【0408】

本発明において特に好ましいそれぞれのキャップ類似体、すなわちｍ_２' ^{７，２'－Ｏ}Ｇｐｐ_ｓｐＧは、β－Ｓ－ＡＲＣＡと称される（国際公開第２００８／１５７６８８ Ａ２号；Ｋｕｈｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，２０１０，ｖｏｌ．１７，ｐｐ．９６１－９７１）。したがって、本発明の一実施形態では、本発明のＲＮＡはβ－Ｓ－ＡＲＣＡで修飾される。β－Ｓ－ＡＲＣＡは次の構造で表される：

【化4】

【0409】

一般に、架橋リン酸塩の酸素原子を硫黄原子に置き換えると、ＨＰＬＣでの溶出パターンに基づき、Ｄ１およびＤ２と称されるホスホロチオエートジアステレオマーをもたらす。簡単に言えば、β－Ｓ－ＡＲＣＡのＤ１ジアステレオマー」または「β－Ｓ－ＡＲＣＡ（Ｄ１）」は、β－Ｓ－ＡＲＣＡのＤ２ジアステレオマー（β－Ｓ－ＡＲＣＡ（Ｄ２））と比較して、ＨＰＬＣカラムで最初に溶出し、したがってより短い保持時間を示すβ－Ｓ－ＡＲＣＡのジアステレオマーである。ＨＰＬＣによる立体化学的配置の決定は、国際公開第２０１１／０１５３４７ Ａ１号に記載されている。

【0410】

本発明の第１の特に好ましい実施形態では、本発明のＲＮＡは、β－Ｓ－ＡＲＣＡ（Ｄ２）ジアステレオマーで修飾される。β－Ｓ－ＡＲＣＡの２つのジアステレオマーは、ヌクレアーゼに対する感受性が異なる。β－Ｓ－ＡＲＣＡのＤ２ジアステレオマーを担持するＲＮＡは、Ｄｃｐ２切断に対してほぼ完全に耐性である（非修飾ＡＲＣＡ ５'キャップの存在下で合成されたＲＮＡと比較して、わずか６％の切断）が、β－Ｓ－ＡＲＣＡ（Ｄ１）５'キャップを有するＲＮＡは、Ｄｃｐ２切断に対して中程度の感受性を示す（７１％の切断）ことが示されている。さらに、Ｄｃｐ２切断に対する安定性の増加は、哺乳動物細胞におけるタンパク質発現の増加と相関することも示されている。特に、β－Ｓ－ＡＲＣＡ（Ｄ２）キャップを担持するＲＮＡは、哺乳動物細胞においてβ－Ｓ－ＡＲＣＡ（Ｄ１）キャップを担持するＲＮＡよりも効率的に翻訳されることが示されている。したがって、本発明の一実施形態では、本発明のＲＮＡは、β－Ｓ－ＡＲＣＡのＤ２ジアステレオマーのＰ_β原子における立体化学的配置に対応する式（Ｉ）の置換基Ｒ^５を含むＰ原子における立体化学的配置を特徴とする、式（Ｉ）に従うキャップ類似体で修飾される。その実施形態では、式（Ｉ）のＲ^５はＳであり、Ｒ^４およびＲ^６はＯである。さらに、式（Ｉ）のＲ^２またはＲ^３の少なくとも一方は、好ましくはＯＨではなく、好ましくはＲ^２およびＲ^３の一方はメトキシ（ＯＣＨ３）であり、Ｒ^２およびＲ^３の他方は、好ましくはＯＨである。

【0411】

第２の特に好ましい実施形態では、本発明のＲＮＡは、β－Ｓ－ＡＲＣＡ（Ｄ１）ジアステレオマーで修飾される。β－Ｓ－ＡＲＣＡ（Ｄ１）ジアステレオマーは、それぞれキャップされたＲＮＡを未成熟抗原提示細胞に移入すると、ＲＮＡの安定性を高め、ＲＮＡの翻訳効率を高め、ＲＮＡの翻訳を延長し、ＲＮＡの総タンパク質発現を増加させ、および／または前記ＲＮＡによってコードされる抗原または抗原ペプチドに対する免疫応答を増加させるのに特に適することが実証されている（Ｋｕｈｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，ｖｏｌ．１７，ｐｐ．９６１－９７１）。したがって、本発明の代替的な実施形態では、本発明のＲＮＡは、β－Ｓ－ＡＲＣＡのＤ１ジアステレオマーのＰ_β原子における立体化学的配置に対応する式（Ｉ）の置換基Ｒ^５を含むＰ原子における立体化学的配置を特徴とする、式（Ｉ）に従うキャップ類似体で修飾される。それぞれのキャップ類似体およびその実施形態は、国際公開第２０１１／０１５３４７ Ａ１号およびＫｕｈｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，ｖｏｌ．１７，ｐｐ．９６１－９７１に記載されている。置換基Ｒ^５を含むＰ原子における立体化学的配置がβ－Ｓ－ＡＲＣＡのＤ１ジアステレオマーのＰ_β原子における立体化学的配置に対応する、国際公開第２０１１／０１５３４７ Ａ１号に記載されている任意のキャップ類似体を本発明で使用し得る。好ましくは、式（Ｉ）のＲ^５はＳであり、Ｒ^４およびＲ^６はＯである。さらに、式（Ｉ）のＲ^２またはＲ^３の少なくとも一方は、好ましくはＯＨではなく、好ましくはＲ^２およびＲ^３の一方はメトキシ（ＯＣＨ３）であり、Ｒ^２およびＲ^３の他方は、好ましくはＯＨである。

【0412】

一実施形態では、本発明のＲＮＡは、いずれか１つのリン酸基がボラノリン酸基またはホスホセレノエート基によって置換されている、式（Ｉ）に従う５'キャップ構造で修飾される。そのようなキャップは、インビトロおよびインビボの両方で安定性が増加している。場合により、それぞれの化合物は２'－Ｏ－または３'－Ｏ－アルキル基を有する（アルキルは、好ましくはメチルである）；それぞれのキャップ類似体は、ＢＨ_３－ＡＲＣＡまたはＳｅ－ＡＲＣＡと称される。ｍＲＮＡのキャッピングに特に適する化合物には、国際公開第２００９／１４９２５３ Ａ２号に記載されている、β－ＢＨ_３－ＡＲＣＡおよびβ－Ｓｅ－ＡＲＣＡが含まれる。これらの化合物については、β－Ｓ－ＡＲＣＡのＤ１ジアステレオマーのＰ_β原子における立体化学的配置に対応する、式（Ｉ）の置換基Ｒ^５を含むＰ原子における立体化学的配置が好ましい。

【0413】

ＵＴＲ
「非翻訳領域」または「ＵＴＲ」という用語は、転写されるがアミノ酸配列に翻訳されないＤＮＡ分子の領域、またはｍＲＮＡ分子などのＲＮＡ分子の対応する領域に関する。非翻訳領域（ＵＴＲ）は、オープンリーディングフレームの５'側（上流）（５'－ＵＴＲ）および／またはオープンリーディングフレームの３'側（下流）（３'－ＵＴＲ）に存在し得る。

【0414】

３'－ＵＴＲは、存在する場合、タンパク質コード領域の終結コドンの下流で、遺伝子の３'末端に位置するが、「３'－ＵＴＲ」という用語は、好ましくはポリ（Ａ）尾部を含まない。したがって、３'－ＵＴＲはポリ（Ａ）尾部（存在する場合）の上流にあり、例えばポリ（Ａ）尾部に直接隣接している。

【0415】

５'－ＵＴＲは、存在する場合、タンパク質コード領域の開始コドンの上流で、遺伝子の５'末端に位置する。５'－ＵＴＲは５'キャップ（存在する場合）の下流にあり、例えば５'キャップに直接隣接している。

【0416】

５'および／または３'非翻訳領域は、本発明によれば、これらの領域が、オープンリーディングフレームを含むＲＮＡの安定性および／または翻訳効率を高めるような方法でオープンリーディングフレームと結合されるように、前記オープンリーディングフレームに機能的に連結され得る。

【0417】

いくつかの実施形態では、本発明によるレプリカーゼ構築物は、５'－ＵＴＲおよび／または３'－ＵＴＲを含む。

【0418】

好ましい実施形態では、本発明によるレプリカーゼ構築物は、
（１）５'－ＵＴＲ、
（２）オープンリーディングフレーム、および
（３）３'－ＵＴＲ
を含む。

【0419】

ＵＴＲは、ＲＮＡの安定性および翻訳効率に関与する。特定の５'および／または３'非翻訳領域（ＵＴＲ）を選択することによって、本明細書に記載の５'キャップおよび／または３'ポリ（Ａ）尾部に関する構造修飾に加えて、両方を改善することができる。ＵＴＲ内の配列エレメントは一般に、翻訳効率（主に５'－ＵＴＲ）およびＲＮＡ安定性（主に３'－ＵＴＲ）に影響を及ぼすと理解されている。レプリカーゼ構築物の翻訳効率および／または安定性を高めるために、活性な５'－ＵＴＲが存在することが好ましい。独立してまたはさらに、レプリカーゼ構築物の翻訳効率および／または安定性を高めるために、活性な３'－ＵＴＲが存在することが好ましい。

【0420】

第１の核酸配列（例えばＵＴＲ）に関して、「翻訳効率を高めるために活性な」および／または「安定性を高めるために活性な」という用語は、第１の核酸配列が、第２の核酸配列を有する一般的な転写物において、前記第１の核酸配列の非存在下での前記第２の核酸配列の翻訳効率および／または安定性と比較して翻訳効率および／または安定性が増加するような方法で、前記第２の核酸配列の翻訳効率および／または安定性を改変できることを意味する。

【0421】

一実施形態では、本発明によるレプリカーゼ構築物は、機能性アルファウイルス非構造タンパク質が由来するアルファウイルスに対して異種または非天然である５'－ＵＴＲおよび／または３'－ＵＴＲを含む。これは、非翻訳領域を所望の翻訳効率およびＲＮＡ安定性に従って設計することを可能にする。したがって、異種または非天然ＵＴＲは高度の柔軟性を可能にし、この柔軟性は、天然のアルファウイルスＵＴＲと比較して有利である。特に、アルファウイルス（天然）ＲＮＡは５'－ＵＴＲおよび／または３'－ＵＴＲも含むことが公知であるが、アルファウイルスＵＴＲは二重の機能を果たす、すなわち（ｉ）ＲＮＡ複製を駆動し、（ｉｉ）翻訳を駆動する。アルファウイルスＵＴＲは翻訳に非効率的であると報告されたが（Ｂｅｒｂｅｎ－Ｂｌｏｅｍｈｅｕｖｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．２０８，ｐｐ．５８１－５８７）、典型的には、その二重機能のために、より効率的なＵＴＲに容易に置き換えることはできない。しかし、本発明では、トランスでの複製のためのレプリカーゼ構築物に含まれる５'－ＵＴＲおよび／または３'－ＵＴＲは、ＲＮＡ複製に対するそれらの潜在的な影響とは独立して選択することができる。

【0422】

好ましくは、本発明によるレプリカーゼ構築物は、ウイルス起源ではない、特にアルファウイルス起源ではない５'－ＵＴＲおよび／または３'－ＵＴＲを含む。一実施形態では、レプリカーゼ構築物は、真核生物５'－ＵＴＲに由来する５'－ＵＴＲおよび／または真核生物３'－ＵＴＲに由来する３'－ＵＴＲを含む。

【0423】

本発明による５'－ＵＴＲは、場合によりリンカーによって分離された、複数の核酸配列の任意の組合せを含み得る。本発明による３'－ＵＴＲは、場合によりリンカーによって分離された、複数の核酸配列の任意の組合せを含み得る。

【0424】

本発明による「リンカー」という用語は、２つの核酸配列を連結するために前記２つの核酸配列の間に付加される核酸配列に関する。リンカー配列に関して特に制限はない。

【0425】

３'－ＵＴＲは、典型的には２００～２０００ヌクレオチド、例えば５００～１５００ヌクレオチドの長さを有する。免疫グロブリンｍＲＮＡの３'非翻訳領域は比較的短い（約３００ヌクレオチド未満）が、他の遺伝子の３'非翻訳領域は比較的長い。例えば、ｔＰＡの３'非翻訳領域は約８００ヌクレオチド長であり、第ＶＩＩＩ因子の３'非翻訳領域は約１８００ヌクレオチド長であり、エリスロポエチンの３'非翻訳領域は約５６０ヌクレオチド長である。哺乳動物ｍＲＮＡの３'非翻訳領域は、典型的にはＡＡＵＡＡＡヘキサヌクレオチド配列として公知の相同領域を有する。この配列はおそらくポリ（Ａ）付着シグナルであり、ポリ（Ａ）付着部位の１０～３０塩基上流に位置することが多い。３'－非翻訳領域は、エキソリボヌクレアーゼに対するバリアとして働く、またはＲＮＡ安定性を高めることが公知のタンパク質（例えばＲＮＡ結合タンパク質）と相互作用するステムループ構造を与えるように折りたたむことができる、１つ以上の逆方向反復配列を含み得る。

【0426】

ヒトβグロビン３'－ＵＴＲ、特にヒトβグロビン３'－ＵＴＲの２つの連続する同一のコピーは、高い転写物安定性と翻訳効率に寄与する（Ｈｏｌｔｋａｍｐ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｂｌｏｏｄ，ｖｏｌ．１０８，ｐｐ．４００９－４０１７）。したがって、一実施形態では、本発明によるレプリカーゼ構築物は、ヒトβグロビン３'－ＵＴＲの２つの連続する同一のコピーを含む。したがって、本発明によるレプリカーゼ構築物には、５'→３'方向に：（ａ）場合により５'－ＵＴＲ；（ｂ）オープンリーディングフレーム；（ｃ）ヒトβ－グロビン３'－ＵＴＲの２つの連続する同一のコピー、その断片、またはヒトβ－グロビン３'－ＵＴＲの変異体もしくはその断片を含む３'－ＵＴＲが含まれる。

【0427】

一実施形態では、本発明によるレプリカーゼ構築物は、翻訳効率および／または安定性を高めるために活性であるが、ヒトβ－グロビン３'－ＵＴＲ、その断片、またはヒトβ‐グロビン３'－ＵＴＲの変異体もしくはその断片ではない３'－ＵＴＲを含む。

【0428】

一実施形態では、本発明によるレプリカーゼ構築物は、翻訳効率および／または安定性を高めるために活性である５'－ＵＴＲを含む。

【0429】

本発明によるＵＴＲ含有レプリカーゼ構築物は、例えばインビトロ転写によって調製することができる。これは、５'－ＵＴＲおよび／または３'－ＵＴＲを有するＲＮＡの転写を可能にするような方法で、鋳型核酸分子（例えばＤＮＡ）を遺伝子改変することによって達成され得る。

【0430】

図５に示すように、レプリコンはまた、５'－ＵＴＲおよび／または３'－ＵＴＲによって特徴付けることもできる。レプリコンのＵＴＲは、典型的にはアルファウイルスＵＴＲまたはその変異体である。

【0431】

ポリ（Ａ）配列
いくつかの実施形態では、本発明によるレプリコンは３'－ポリ（Ａ）配列を含む。レプリコンが保存された配列エレメント４（ＣＳＥ ４）を含む場合、レプリコンの３'－ポリ（Ａ）配列は、好ましくはＣＳＥ ４の下流に存在し、最も好ましくはＣＳＥ ４に直接隣接する。

【0432】

いくつかの実施形態では、本発明によるレプリカーゼ構築物は３'－ポリ（Ａ）配列を含む。

【0433】

本発明によれば、一実施形態では、ポリ（Ａ）配列は、少なくとも２０、好ましくは少なくとも２６、好ましくは少なくとも４０、好ましくは少なくとも８０、好ましくは少なくとも１００、好ましくは最大５００、好ましくは最大４００、好ましくは最大３００、好ましくは最大２００、特に最大１５０個のＡヌクレオチド、特に約１２０個のＡヌクレオチドを含む、または本質的にこれらからなる、またはこれらからなる。この文脈において、「本質的に～からなる」とは、ポリ（Ａ）配列のほとんどのヌクレオチド、典型的には「ポリ（Ａ）配列」のヌクレオチド数で少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７５％がＡヌクレオチド（アデニル酸）であるが、残りのヌクレオチドが、Ｕヌクレオチド（ウリジル酸）、Ｇヌクレオチド（グアニル酸）、Ｃヌクレオチド（シチジル酸）などのＡヌクレオチド以外のヌクレオチドであることを許容することを意味する。この文脈において、「からなる」とは、ポリ（Ａ）配列内のすべてのヌクレオチド、すなわちポリ（Ａ）配列内のヌクレオチド数の１００％がＡヌクレオチドであることを意味する。「Ａヌクレオチド」または「Ａ」という用語は、アデニル酸を指す。

【0434】

実際に、約１２０個のＡヌクレオチドの３'ポリ（Ａ）配列は、トランスフェクトされた真核細胞中のＲＮＡのレベル、および３'ポリ（Ａ）配列の上流（５'側）に存在するオープンリーディングフレームから翻訳されるタンパク質のレベルに有益な影響を及ぼすことが実証されている（Ｈｏｌｔｋａｍｐ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｂｌｏｏｄ，ｖｏｌ．１０８，ｐｐ．４００９－４０１７）。

【0435】

アルファウイルスでは、少なくとも１１個の連続するアデニル酸残基、または少なくとも２５個の連続するアデニル酸残基の３'ポリ（Ａ）配列が、マイナス鎖の効率的な合成に重要であると考えられている。特に、アルファウイルスでは、少なくとも２５個の連続するアデニル酸残基の３'ポリ（Ａ）配列は、保存された配列エレメント４（ＣＳＥ ４）と共に機能して（－）鎖の合成を促進すると理解されている（Ｈａｒｄｙ＆Ｒｉｃｅ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，２００５，ｖｏｌ．７９，ｐｐ．４６３０－４６３９）。

【0436】

本発明は、コード鎖に相補的な鎖内に反復ｄＴヌクレオチド（デオキシチミジル酸）を含むＤＮＡ鋳型に基づいて、ＲＮＡの転写中、すなわちインビトロ転写ＲＮＡの生成中に付着される３'ポリ（Ａ）配列を提供する。ポリ（Ａ）配列（コード鎖）をコードするＤＮＡ配列は、ポリ（Ａ）カセットと称される。

【0437】

本発明の好ましい実施形態では、ＤＮＡのコード鎖に存在する３'ポリ（Ａ）カセットは、本質的にｄＡヌクレオチドからなるが、４つのヌクレオチド（ｄＡ、ｄＣ、ｄＧ、ｄＴ）が均等に分布するランダム配列によって中断されている。そのようなランダム配列は、５～５０、好ましくは１０～３０、より好ましくは１０～２０ヌクレオチドの長さであり得る。そのようなカセットは、国際公開第２０１６／００５００４ Ａ１号に開示されている。国際公開第２０１６／００５００４ Ａ１号に開示されている任意のポリ（Ａ）カセットを本発明で使用し得る。本質的にｄＡヌクレオチドからなるが、４つのヌクレオチド（ｄＡ、ｄＣ、ｄＧ、ｄＴ）が均等に分布し、例えば５～５０ヌクレオチドの長さを有するランダム配列によって中断されているポリ（Ａ）カセットは、ＤＮＡレベルでは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）でプラスミドＤＮＡの一定な増殖を示し、ＲＮＡレベルでは、ＲＮＡの安定性と翻訳効率の支持に関する有益な特性とまだ関連する。

【0438】

結果として、本発明の好ましい実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡ分子に含まれる３'ポリ（Ａ）配列は、本質的にＡヌクレオチドからなるが、４つのヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕ）が均等に分布するランダム配列によって中断されている。そのようなランダム配列は、５～５０、好ましくは１０～３０、より好ましくは１０～２０ヌクレオチドの長さであり得る。

【0439】

コドン使用頻度
一般に、遺伝暗号の縮重は、同じコード能力を維持しながら、ＲＮＡ配列に存在する特定のコドン（アミノ酸をコードする塩基トリプレット）を他のコドン（塩基トリプレット）で置換することを可能にする（置換するコドンは、置換されるコドンと同じアミノ酸をコードする）。本発明のいくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子に含まれるオープンリーディングフレームの少なくとも１つのコドンは、オープンリーディングフレームが由来する種のそれぞれのオープンリーディングフレーム内のそれぞれのコドンとは異なる。その実施形態では、オープンリーディングフレームのコード配列は「適合」または「改変」されていると言われる。レプリコンに含まれるオープンリーディングフレームのコード配列を適合させ得る。代替的または追加的に、レプリカーゼ構築物に含まれる機能性アルファウイルス非構造タンパク質のコード配列を適合させ得る。

【0440】

例えば、オープンリーディングフレームのコード配列を適合させる場合、高頻度で使用されるコドンを選択し得る：国際公開第２００９／０２４５６７ Ａ１号は、より高頻度で使用されるコドンによる希少なコドンの置換を含む、核酸分子のコード配列の適合を記載している。コドン使用頻度は宿主細胞または宿主生物に依存するため、この種の適合は、核酸配列を特定の宿主細胞または宿主生物での発現に適応させるのに適する。一般的に言えば、より高頻度で使用されるコドンは、典型的には宿主細胞または宿主生物においてより効率的に翻訳されるが、オープンリーディングフレームのすべてのコドンの適合が必ずしも必要とされるわけではない。

【0441】

例えば、オープンリーディングフレームのコード配列を適合させる場合、Ｇ（グアニル酸）残基とＣ（シチジル酸）残基の含有量は、各アミノ酸のＧＣリッチ含有量が最も高いコドンを選択することによって変更し得る。ＧＣリッチなオープンリーディングフレームを備えるＲＮＡ分子は、免疫活性化を低下させ、ＲＮＡの翻訳と半減期を改善する潜在的可能性を有することが報告されている（Ｔｈｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２３，１４５７－１４６５）。

【0442】

本発明によるレプリコンがアルファウイルス非構造タンパク質をコードする場合、アルファウイルス非構造タンパク質のコード配列は、所望に応じて適合させることができる。アルファウイルス非構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームはレプリコンの５'複製認識配列と重複しないため、この自由さが可能である。

【0443】

本発明の実施形態の安全性特徴
以下の特徴は、単独でまたは任意の適切な組合せで、本発明において好ましい：

【0444】

好ましくは、本発明のレプリコンまたは系は、粒子形成性ではない。これは、本発明のレプリコンまたは系による宿主細胞の接種後、宿主細胞が、次世代ウイルス粒子などのウイルス粒子を産生しないことを意味する。一実施形態では、本発明によるすべてのＲＮＡ分子は、コアヌクレオカプシドタンパク質Ｃ、エンベロープタンパク質Ｐ６２、および／またはエンベロープタンパク質Ｅ１などのアルファウイルス構造タンパク質をコードする遺伝情報を全く含まない。本発明のこの態様は、構造タンパク質がトランス複製ヘルパーＲＮＡ上にコードされる先行技術の系よりも安全性に関して付加価値を提供する（例えばＢｒｅｄｅｎｂｅｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，１９９３，ｖｏｌ．６７，ｐｐ．６４３９－６４４６）。

【0445】

好ましくは、本発明の系は、コアヌクレオカプシドタンパク質Ｃ、エンベロープタンパク質Ｐ６２、および／またはエンベロープタンパク質Ｅ１などのアルファウイルス構造タンパク質を含まない。

【0446】

好ましくは、本発明の系のレプリコンとレプリカーゼ構築物は、互いに同一ではない。一実施形態では、レプリコンは機能性アルファウイルス非構造タンパク質をコードしない。一実施形態では、レプリカーゼ構築物は、（＋）鎖鋳型に基づく（－）鎖合成、および／または（－）鎖鋳型に基づく（＋）鎖合成に必要な少なくとも１つの配列エレメント（好ましくは少なくとも１つのＣＳＥ）を欠く。一実施形態では、レプリカーゼ構築物は、ＣＳＥ １および／またはＣＳＥ ４を含まない。

【0447】

好ましくは、本発明によるレプリコンも本発明によるレプリカーゼ構築物も、アルファウイルスパッケージングシグナルを含まない。例えば、ＳＦＶのｎｓＰ２のコード領域に含まれるアルファウイルスパッケージングシグナル（Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ．１９９８，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，ｖｏｌ．７２，ｐｐ．４３２０－４３２６）は、例えば欠失または突然変異によって除去し得る。アルファウイルスパッケージングシグナルを除去する適切な方法には、ｎｓＰ２のコード領域のコドン使用頻度の適合が含まれる。遺伝暗号の縮重は、コードされるｎｓＰ２のアミノ酸配列に影響を及ぼすことなく、パッケージングシグナルの機能を欠失させることを可能にし得る。

【0448】

一実施形態では、本発明の系は単離された系である。その実施形態では、系は、哺乳動物細胞の内部などの細胞の内部に存在しないか、またはアルファウイルス構造タンパク質を含むコートの内部などのウイルスカプシドの内部に存在しない。一実施形態では、本発明の系はインビトロで存在する。

【0449】

ＤＮＡ
さらなる態様では、本発明は、本発明によるＲＮＡレプリコン、ＲＮＡレプリコンのセットまたは系をコードする核酸配列を含むＤＮＡを提供する。本発明によれば、例えば細胞のトランスフェクションのためにＲＮＡを使用する代わりに、ＲＮＡをコードするＤＮＡを、例えば細胞内でＲＮＡが産生されるように細胞をトランスフェクトするために使用し得る。

【0450】

好ましくは、ＤＮＡは二本鎖である。

【0451】

好ましい実施形態では、ＤＮＡはプラスミドである。本明細書で使用される「プラスミド」という用語は、一般に、染色体ＤＮＡとは独立して複製することができる染色体外遺伝物質の構築物、通常は環状ＤＮＡ二重鎖に関する。

【0452】

本発明のＤＮＡは、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによって認識され得るプロモータを含み得る。これは、コードされるＲＮＡ、例えば本発明のＲＮＡのインビボまたはインビトロでの転写を可能にする。ＩＶＴベクターは、インビトロ転写の鋳型として標準化された方法で使用し得る。本発明による好ましいプロモータの例は、ＳＰ６、Ｔ３またはＴ７ポリメラーゼのプロモータである。

【0453】

一実施形態では、本発明のＤＮＡは単離された核酸分子である。

【0454】

ＲＮＡを調製する方法
本発明による任意のＲＮＡ分子は、それが本発明の系の一部であってもなくても、インビトロ転写によって入手可能であり得る。インビトロ転写ＲＮＡ（ＩＶＴ－ＲＮＡ）は、本発明において特に興味深い。ＩＶＴ－ＲＮＡは、核酸分子（特にＤＮＡ分子）からの転写によって入手できる。本発明のＤＮＡ分子（１つまたは複数）は、特にＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによって認識され得るプロモータを含む場合、そのような目的に適する。

【0455】

本発明によるＲＮＡは、インビトロで合成することができる。これは、インビトロ転写反応にキャップ類似体を添加することを可能にする。典型的には、ポリ（Ａ）尾部は、ＤＮＡ鋳型上のポリ（ｄＴ）配列によってコードされる。あるいは、キャッピングおよびポリ（Ａ）尾部の付加は、転写後に酵素的に達成することができる。

【0456】

インビトロ転写の方法は当業者に公知である。例えば、国際公開第２０１１／０１５３４７ Ａ１号に記載されているように、様々なインビトロ転写キットが市販されている。

【0457】

細胞を生成する方法およびそれによって生成される細胞
さらなる態様では、本発明は、本発明の１つ以上のＲＮＡレプリコンおよび場合により機能性アルファウイルス非構造タンパク質を発現するためのＲＮＡ構築物を体細胞に形質導入することを含む、幹細胞特性を有する細胞を生成する方法を提供する。

【0458】

一実施形態では、本発明は、幹細胞特性を有する細胞を提供する方法であって、
（ｉ）体細胞を含む細胞集団を提供する工程、
（ｉｉ）各々が、機能性アルファウイルス非構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含み、機能性アルファウイルス非構造タンパク質によって複製することができ、および再プログラミング因子をコードする少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含む、１つ以上のＲＮＡレプリコンを提供する工程、（ｉｉｉ）細胞が、体細胞を幹細胞特性を有する細胞に再プログラムするのに有用な再プログラミング因子のセットを発現するように、１つ以上のＲＮＡレプリコンを体細胞に導入する工程、ならびに
（ｉｖ）幹細胞特性を有する細胞の発生を可能にする工程
を含む方法を提供する。

【0459】

さらなる実施形態では、本発明は、幹細胞特性を有する細胞を提供する方法であって、
（ｉ）体細胞を含む細胞集団を提供する工程、
（ｉｉ）機能性アルファウイルス非構造タンパク質を発現するためのＲＮＡ構築物を提供する工程、
（ｉｉｉ）各々が、機能性アルファウイルス非構造タンパク質によってトランスで複製することができ、および再プログラミング因子をコードする少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含む、１つ以上のＲＮＡレプリコンを提供する工程、
（ｉｖ）細胞が、体細胞を幹細胞特性を有する細胞に再プログラムするのに有用な再プログラミング因子のセットを発現するように、ＲＮＡ構築物および１つ以上のＲＮＡレプリコンを体細胞に導入する工程、ならびに
（ｖ）幹細胞特性を有する細胞の発生を可能にする工程
を含む方法を提供する。

【0460】

本発明によれば、「ＲＮＡを体細胞に導入する」という用語は、ＲＮＡが細胞の一部にのみ導入され、細胞の一部がトランスフェクトされないままである実施形態を含み、好ましくは前記実施形態に関する。複数のＲＮＡ分子、例えば複数のＲＮＡレプリコンまたは機能性アルファウイルス非構造タンパク質を発現するためのＲＮＡ構築物と１つ以上のＲＮＡレプリコンとを細胞に導入しようとする場合、この用語は、すべてのＲＮＡ分子が細胞の一部にのみ導入され、細胞の一部はトランスフェクトされないままであるかまたはすべてではない前記ＲＮＡ分子によってトランスフェクトされたままである実施形態を含み、好ましくは前記実施形態に関する。いずれの場合も、本発明に従って複数のＲＮＡ分子、例えば再プログラミング因子の機能的セットを発現する複数のＲＮＡレプリコンまたは機能性アルファウイルス非構造タンパク質を発現するためのＲＮＡ構築物と１つ以上のＲＮＡレプリコンとを細胞に導入しようとする場合、その目的は、例えば単一細胞内で再プログラミング因子の機能的セットを発現させるために、すべてのＲＮＡ分子を細胞に導入することである。

【0461】

一実施形態では、トランスフェクトされた細胞は、１つ以上のトランスフェクトされたレプリコンおよび／もしくはトランスフェクトされたレプリカーゼ構築物によってコードされる機能性アルファウイルス非構造タンパク質、ならびに／または１つ以上のトランスフェクトされたレプリコンによってコードされる再プログラミング因子（１つもしくは複数）を発現する。異なる再プログラミング因子は、同じＲＮＡレプリコンまたは異なるＲＮＡレプリコンに存在する異なるオープンリーディングフレームによってコードされ得る。後者の実施形態では、異なるレプリコンは、好ましくは細胞に同時トランスフェクトされる。

【0462】

本方法の様々な実施形態では、機能性アルファウイルス非構造タンパク質を発現するためのＲＮＡ構築物および／またはＲＮＡレプリコンは、ＲＮＡレプリコンが機能性アルファウイルス非構造タンパク質によってトランスで複製されることができ、および再プログラミング因子をコードするオープンリーディングフレームを含む限り、本発明の系について上記で定義したとおりである。機能性アルファウイルス非構造タンパク質を発現するためのＲＮＡ構築物および１つ以上のＲＮＡレプリコンは、同じ時点で接種されてもよく、あるいは異なる時点で接種されてもよい。２番目の場合、機能性アルファウイルス非構造タンパク質を発現するためのＲＮＡ構築物は、典型的には最初の時点で接種され、１つ以上のレプリコンは、典型的にはより後の２番目の時点で接種される。その場合、レプリカーゼは細胞内で既に合成されているため、１つ以上のレプリコンは直ちに複製されると想定される。２番目の時点は、典型的には最初の時点のすぐ後、例えば最初の時点の１分後から２４時間後である。

【0463】

１つ以上の核酸分子を接種またはトランスフェクトできる細胞は、「宿主細胞」と称され得る。本発明によれば、「宿主細胞」という用語は、外因性核酸分子で形質転換またはトランスフェクトできる任意の細胞を指す。「細胞」という用語は、好ましくは無傷の細胞、すなわち酵素、細胞小器官、または遺伝物質などのその通常の細胞内成分を放出していない無傷の膜を有する細胞である。無傷の細胞は、好ましくは生存可能な細胞、すなわちその通常の代謝機能を実施することができる生細胞である。「宿主細胞」という用語は、本発明によれば、原核細胞（例えば大腸菌）または真核細胞（例えばヒトおよび動物細胞、植物細胞、酵母細胞および昆虫細胞）を含む。ヒト、マウス、ハムスター、ブタ、ウマ、ウシ、ヒツジおよびヤギを含む家畜、ならびに霊長動物由来の細胞などの哺乳動物細胞が特に好ましい。細胞は、多数の組織型に由来してもよく、初代細胞および細胞株を含み得る。具体的な例には、ケラチノサイト、末梢血白血球、骨髄幹細胞、および胚性幹細胞が含まれる。他の実施形態では、宿主細胞は、抗原提示細胞、特に樹状細胞、単球またはマクロファージである。核酸は、単一またはいくつかのコピーで宿主細胞に存在してもよく、一実施形態では、宿主細胞で発現される。

【0464】

細胞は、原核細胞または真核細胞であり得る。原核細胞は、本明細書では、例えば本発明によるＤＮＡの増殖に適し、真核細胞は、本明細書では、例えばレプリコンのオープンリーディングフレームの発現に適する。

【0465】

本発明の目的のために、「形質導入」または「トランスフェクション」などの用語は、インビトロまたはインビボでの細胞への核酸の導入もしくは組み込みまたは細胞による核酸の取り込みを指す。本発明によれば、本明細書に記載の核酸のトランスフェクションのための細胞は、インビトロまたはインビボで存在することができ、例えば細胞は、患者の器官、組織および／または生物の一部を形成することができる。本発明によれば、トランスフェクションは一過性または安定であり得る。トランスフェクションのいくつかの適用では、トランスフェクトされた遺伝物質が一過性に発現されるだけで十分である。トランスフェクションの過程で導入された核酸は、通常、核ゲノムに組み込まれないため、外来核酸は有糸分裂によって希釈されるかまたは分解される。核酸のエピソーム増幅を可能にする細胞は、希釈率を大幅に低下させる。トランスフェクトされた核酸が実際に細胞およびその娘細胞のゲノムに残ることが望ましい場合は、安定なトランスフェクションが起こらなければならない。ＲＮＡを細胞にトランスフェクトして、そのコードされたタンパク質を一過性に発現させることができる。

【0466】

本発明によれば、核酸を細胞に導入する、すなわち組み込む、移入するまたはトランスフェクトするのに有用な任意の技術を使用し得る。好ましくは、ＲＮＡなどの核酸は、標準的な技術によって細胞にトランスフェクトされる。そのような技術には、エレクトロポレーション、リポフェクションおよびマイクロインジェクションが含まれる。本発明の１つの特に好ましい実施形態では、ＲＮＡはエレクトロポレーションによって細胞に導入される。エレクトロポレーションまたはエレクトロパーミアビリゼーションは、外部から印加された電場によって引き起こされる細胞形質膜の電気伝導率と透過性の有意な増加に関連する。通常、分子生物学では、細胞にある種の物質を導入する方法として使用される。本発明によれば、タンパク質またはペプチドをコードする核酸の細胞への導入は、前記タンパク質またはペプチドの発現をもたらすことが好ましい。

【0467】

インビボでの細胞のトランスフェクションのために、核酸を含む医薬組成物を使用し得る。核酸を特定の細胞に指向させる送達ビヒクルを患者に投与して、インビボでトランスフェクションを生じさせ得る。

【0468】

一実施形態では、細胞を生成する方法はインビトロ法である。一実施形態では、細胞を生成する方法は、手術または治療法によるヒトまたは動物被験体からの細胞の除去を含むかまたは含まない。

【0469】

この実施形態では、本発明に従って生成された細胞を被験体に投与し得る。細胞は、被験体に関して自己、同系、同種異系または異種であり得る。細胞は、当技術分野で公知の任意の手段を使用して被験体に（再）導入し得る。

【0470】

他の実施形態では、体細胞は、患者などの被験体に存在し得る。これらの実施形態では、幹細胞特性を有する細胞を生成する方法は、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡ分子を被験体に投与することを含むインビボ法である。

【0471】

これに関して、本発明はまた、被験体において幹細胞特性を有する細胞を提供する方法であって、
（ｉ）各々が、機能性アルファウイルス非構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含み、機能性アルファウイルス非構造タンパク質によって複製することができ、および再プログラミング因子をコードする少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含む、１つ以上のＲＮＡレプリコンを提供する工程、
（ｉｉ）１つ以上のＲＮＡレプリコンを被験体に投与する工程、ならびに
（ｉｉｉ）幹細胞特性を有する細胞の発生を可能にする工程
を含む方法も提供する。

【0472】

本方法の様々な実施形態では、ＲＮＡレプリコンは、機能性アルファウイルス非構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームおよび再プログラミング因子をコードするオープンリーディングフレームを含み、ならびに機能性アルファウイルス非構造タンパク質によって複製され得る限り、本発明のＲＮＡレプリコンについて上記で定義したとおりである。

【0473】

本発明はさらに、被験体において幹細胞特性を有する細胞を提供する方法であって、
（ｉ）機能性アルファウイルス非構造タンパク質を発現するためのＲＮＡ構築物を提供する工程、
（ｉｉ）各々が、機能性アルファウイルス非構造タンパク質によってトランスで複製することができ、および再プログラミング因子をコードする少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含む、１つ以上のＲＮＡレプリコンを提供する工程、
（ｉｉｉ）ＲＮＡ構築物および１つ以上のＲＮＡレプリコンを被験体に投与する工程、ならびに
（ｖ）幹細胞特性を有する細胞の発生を可能にする工程
を含む方法を提供する。

【0474】

本方法の様々な実施形態では、機能性アルファウイルス非構造タンパク質を発現するためのＲＮＡ構築物および／またはＲＮＡレプリコンは、ＲＮＡレプリコンが機能性アルファウイルス非構造タンパク質によってトランスで複製されることができ、および再プログラミング因子をコードするオープンリーディングフレームを含む限り、本発明の系について上記で定義したとおりである。機能性アルファウイルス非構造タンパク質を発現するためのＲＮＡ構築物および１つ以上のＲＮＡレプリコンは、同じ時点で投与されてもよく、あるいは異なる時点で投与されてもよい。２番目の場合、機能性アルファウイルス非構造タンパク質を発現するためのＲＮＡ構築物は、典型的には最初の時点で投与され、１つ以上のＲＮＡレプリコンは、典型的にはより後の２番目の時点で投与される。その場合、レプリカーゼは細胞内で既に合成されているため、１つ以上のレプリコンは直ちに複製されると想定される。２番目の時点は、典型的には最初の時点のすぐ後、例えば最初の時点の１分後から２４時間後である。好ましくは、１つ以上のＲＮＡレプリコンおよび機能性アルファウイルス非構造タンパク質を発現するためのＲＮＡ構築物が同じ標的組織または細胞に到達する可能性を高めるために、１つ以上のＲＮＡレプリコンの投与は、機能性アルファウイルス非構造タンパク質を発現するためのＲＮＡ構築物の投与と同じ部位で同じ投与経路を介して実施される。「部位」とは、被験体の身体の位置を指す。適切な部位は、例えば左腕、右腕などである。

【0475】

一実施形態では、さらなるＲＮＡ分子、好ましくはｍＲＮＡ分子を被験体に投与し得る。場合により、さらなるＲＮＡ分子は、Ｅ３などのＩＦＮを阻害するのに適したタンパク質をコードする。場合により、本発明による１つ以上のレプリコンまたはレプリカーゼ構築物または系の投与の前に、さらなるＲＮＡ分子を投与し得る。

【0476】

本発明によるＲＮＡレプリコン、本発明によるセット、本発明による系、または本発明によるキット、または本発明による医薬組成物のいずれも、本発明に従って被験体において細胞を生成する方法で使用することができる。例えば、本発明の方法では、ＲＮＡは、例えば本発明に記載されるように、薬学的組成物の形態で、または裸のＲＮＡとして使用することができる。

【0477】

本発明の一実施形態では、再プログラミング因子の機能的セットは、再プログラミングを達成するために細胞内にすべて存在しなければならない再プログラミング因子よりも多くを含み得る。したがって、本発明は、ＲＮＡレプリコンのセットが異なる再プログラミング因子をコードする実施形態を含む。例えば、異なるＲＮＡレプリコンは、異なる再プログラミング因子をコードする異なるオープンリーディングフレームを含み得る。これらの異なるＲＮＡレプリコン、すなわちＲＮＡレプリコンのセットは、（場合により機能性アルファウイルス非構造タンパク質を発現するためのＲＮＡ構築物と共に）再プログラミング因子の機能的セットを提供するために細胞に共接種され得る。

【0478】

キット
本発明はまた、本発明によるＲＮＡレプリコン、本発明によるセット、または本発明による系を含むキットも提供する。

【0479】

一実施形態では、キットの構成要素は別個の実体として存在する。例えば、キットの１つの核酸分子が１つの実体に存在し、キットの別の核酸が別の実体に存在してもよい。例えば、開放容器または閉鎖容器は適切な実体である。閉鎖容器が好ましい。使用される容器は、好ましくはＲＮアーゼ不含であるかまたは本質的にＲＮアーゼ不含であるべきである。

【0480】

一実施形態では、本発明のキットは、細胞への接種および／またはヒトもしくは動物被験体への投与のためのＲＮＡを含む。

【0481】

本発明によるキットは、場合によりラベルまたは他の形態の情報要素、例えば電子データキャリアを含む。ラベルまたは情報要素は、好ましくは指示書、例えば印刷された書面による指示書、または場合により印刷可能な電子形式の指示書を含む。説明書には、キットの少なくとも１つの適切で可能な使用に言及し得る。

【0482】

再プログラムされた細胞の使用
本発明を使用して、適切な因子をコードするＲＮＡレプリコンを、例えばエレクトロポレーションまたはリポフェクションによって１つ以上の体細胞に組み込む。組み込み後、好ましくは脱分化細胞の維持を支持する条件（すなわち幹細胞培養条件）を使用して、細胞を培養する。次いで、脱分化細胞を、例えば細胞療法において被験体に投与することができ、または場合により増殖させ、体細胞に再分化するように誘導して、その後、例えば細胞療法において被験体に投与することができる。したがって、本発明に従って得られる脱分化細胞は、インビトロまたはインビボで１つ以上の所望の体細胞型に分化するように誘導することができる。

【0483】

「細胞療法」（細胞性療法または細胞治療とも呼ばれる）という用語は、一般に無傷の生細胞である細胞物質が患者において提供される、好ましくは患者に投与される療法である。この用語には、ドナーが細胞のレシピエントとは異なる人物である同種異系細胞療法および自己細胞療法が含まれる。細胞療法は、複数の器官での多くの臨床的適応において、およびいくつかの細胞送達方法によって標的とされる。したがって、治療に関与する特定の作用機構は広範囲にわたる。しかし、細胞が治療作用を促進する２つの主な原則がある：（１）細胞が損傷した組織を置き換える、したがって器官または組織の機能の改善を促進する。この例は、心筋梗塞後の心筋細胞を置き換えるための細胞の使用である。（２）細胞が、パラ分泌または内分泌的に作用するサイトカイン、ケモカイン、および成長因子などの可溶性因子を放出する能力を有する。これらの因子は、器官または領域の自己修復を促進する。この例には、血管新生、抗炎症、および抗アポトーシスを促進する因子を分泌する細胞が含まれる。

【0484】

好ましくは、本発明に従って得られる脱分化細胞は、３つの胚性胚葉、すなわち内胚葉、中胚葉、および外胚葉のいずれかから細胞を生じさせ得る。例えば、脱分化した細胞は、骨格筋、骨格、皮膚の真皮、結合組織、泌尿生殖器系、心臓、血液（リンパ細胞）、および脾臓（中胚葉）；胃、結腸、肝臓、膵臓、膀胱；尿道の内壁、気管の上皮部分、肺、咽頭、甲状腺、副甲状腺、腸（内胚葉）；または中枢神経系、網膜および水晶体、脳および感覚、神経節および神経、色素細胞、頭部結合組織、表皮、毛髪、乳腺（外胚葉）に分化し得る。本発明に従って得られる脱分化細胞は、当技術分野で公知の技術を使用してインビトロまたはインビボで再分化させることができる。

【0485】

本発明の一実施形態では、本発明の方法から生じる再プログラムされた細胞を使用して、分化した子孫を生成する。したがって、一態様では、本発明は、（ｉ）本発明の方法を使用して再プログラム細胞を得ること；および（ｉｉ）再プログラム細胞の分化を誘導して、分化細胞を生成することを含む、分化細胞を生成する方法を提供する。工程（ｉｉ）は、インビボまたはインビトロで実施することができる。さらに、分化は、添加することができるかまたは、例えば再プログラム細胞が導入された身体、器官または組織にインサイチュで存在する適切な分化因子の存在によって誘導され得る。分化細胞は、細胞、組織、および／または臓器移植の分野で有利に使用される細胞、組織、および／または臓器を誘導するために使用することができる。所望する場合は、例えば、再プログラミングの前に体細胞に遺伝子改変を導入することができる。本発明の分化細胞は、好ましくは胚性幹細胞または胚性生殖細胞の多能性を有さず、本質的に、組織特異的な部分的または完全に分化した細胞である。

【0486】

本発明の方法の１つの利点は、本発明によって得られる再プログラム細胞が、事前の選択または精製または細胞株の樹立を行わずに分化させることができることである。したがって特定の実施形態では、再プログラム細胞を含む不均一な細胞の集団を所望の細胞型に分化させる。一実施形態では、本発明の方法から得られる細胞の混合物を、１つ以上の分化因子に曝露し、インビトロで培養する。

【0487】

本明細書に開示される方法によって得られる再プログラム細胞を分化させる方法は、再プログラム細胞を透過処理する工程を含み得る。例えば、本明細書に記載の再プログラミング技術によって生成された細胞、あるいは再プログラム細胞を含む不均一な細胞の混合物を、１つ以上の分化因子または分化因子を含む細胞抽出物もしくは他の調製物に曝露する前に、透過処理し得る。

【0488】

例えば、分化細胞は、少なくとも１つの分化因子の存在下で未分化の再プログラム細胞を培養し、培養物から分化細胞を選択することによって得られ得る。分化細胞の選択は、分化細胞上に存在する特定の細胞マーカーの発現などの表現型に基づいてもよく、または機能的アッセイ（例えば特定の分化細胞型の１つ以上の機能を実施する能力）によってもよい。

【0489】

別の実施形態では、本発明に従って再プログラムされた細胞を、それらのＤＮＡ配列（１つまたは複数）の付加、欠失、または修飾によって遺伝的に改変する。

【0490】

本発明に従って調製される再プログラム細胞もしくは脱分化細胞、または再プログラム細胞もしくは脱分化細胞に由来する細胞は、研究および治療法において有用である。再プログラムされた多能性細胞は、皮膚、軟骨、骨、骨格筋、心筋、腎臓、肝臓、血液および造血、血管前駆体および血管内皮、膵β、ニューロン、グリア、網膜、神経、腸、肺、および肝臓の細胞を含むがこれらに限定されない、体内の細胞のいずれかに分化させ得る。

【0491】

再プログラム細胞は、再生／修復治療に有用であり、それを必要とする患者に移植し得る。一実施形態では、細胞は患者にとって自己由来である。

【0492】

本発明に従って提供される再プログラム細胞は、例えば、心疾患、神経疾患、内分泌疾患、血管障害、網膜疾患、皮膚疾患、筋骨格障害、および他の疾患の処置における治療戦略に使用し得る。

【0493】

例えば、限定としてではないが、本発明の再プログラム細胞は、年齢のために、または癌放射線療法および化学療法などのアブレーション療法のために天然細胞が枯渇した動物において細胞を補充するために使用できる。別の非限定的な例では、本発明の再プログラム細胞は、器官再生および組織修復に有用である。本発明の一実施形態では、再プログラム細胞は、ジストロフィ筋および心筋梗塞などの虚血事象によって損傷した筋を含む、損傷した筋組織を再活性化するために使用できる。本発明の別の実施形態では、本明細書に開示される再プログラム細胞は、外傷または手術後の、ヒトを含む動物の瘢痕を改善するために使用できる。この実施形態では、本発明の再プログラム細胞は、静脈内投与などで全身投与され、損傷細胞が分泌する循環サイトカインによって動員される、新たに外傷を受けた組織の部位に移動する。本発明の別の実施形態では、修復または再生を必要とする治療部位に再プログラム細胞を局所投与することができる。

【0494】

医薬組成物
本明細書に記載の核酸および細胞などの作用物質および組成物は、任意の適切な医薬組成物の形態で投与され得る。

【0495】

本発明の医薬組成物は、好ましくは無菌であり、所望の反応または所望の効果を生じさせるために、本明細書に記載の作用物質および場合により本明細書で論じるさらなる作用物質の有効量を含む。

【0496】

医薬組成物は通常、均一な剤形で提供され、それ自体公知の方法で調製され得る。医薬組成物は、例えば溶液または懸濁液の形態であり得る。

【0497】

医薬組成物は、塩、緩衝物質、防腐剤、担体、希釈剤および／または賦形剤を含んでもよく、そのすべてが、好ましくは薬学的に許容される。「薬学的に許容される」という用語は、医薬組成物の活性成分の作用と相互作用しない物質の非毒性を指す。

【0498】

薬学的に許容されない塩は、薬学的に許容される塩を調製するために使用されてもよく、本発明に含まれる。この種の薬学的に許容される塩は、非限定的に、以下の酸：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、クエン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸などから調製される塩を含む。薬学的に許容される塩は、ナトリウム塩、カリウム塩またはカルシウム塩などのアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩としても調製され得る。

【0499】

医薬組成物での使用に適する緩衝物質には、塩中の酢酸、塩中のクエン酸、塩中のホウ酸、および塩中のリン酸が含まれる。

【0500】

医薬組成物での使用に適する防腐剤には、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、パラベンおよびチメロサールが含まれる。

【0501】

注射製剤は、乳酸リンゲルなどの薬学的に許容される賦形剤を含み得る。

【0502】

「担体」という用語は、適用を容易にする、増強するまたは可能にするために活性成分が組み合わされる、天然または合成の有機または無機成分を指す。本発明によれば、「担体」という用語は、患者への投与に適する１つ以上の適合性の固体もしくは液体充填剤、希釈剤または封入物質も含む。

【0503】

非経口投与のための可能な担体物質は、例えば滅菌水、リンゲル液、乳酸リンゲル液、滅菌塩化ナトリウム溶液、ポリアルキレングリコール、水素化ナフタレンおよび、特に生体適合性ラクチドポリマー、ラクチド／グリコリドコポリマーまたはポリオキシエチレン／ポリオキシプロピレンコポリマーである。

【0504】

本明細書で使用される場合「賦形剤」という用語は、例えば担体、結合剤、潤滑剤、増粘剤、界面活性剤、防腐剤、乳化剤、緩衝剤、香味剤、または着色剤などの、活性成分ではない医薬組成物中に存在し得るすべての物質を示すことが意図されている。

【0505】

一実施形態では、医薬組成物が核酸を含む場合、少なくとも１つのカチオン性実体を含む。一般に、カチオン性脂質、カチオン性ポリマーおよび正電荷を有する他の物質は、負に帯電した核酸と複合体を形成し得る。カチオン性化合物、好ましくは、例えばカチオン性またはポリカチオン性ペプチドまたはタンパク質などのポリカチオン性化合物との複合体化によって、本発明によるＲＮＡを安定化することが可能である。一実施形態では、本発明による医薬組成物は、プロタミン、ポリエチレンイミン、ポリ－Ｌ－リジン、ポリ－Ｌ－アルギニン、ヒストンまたはカチオン性脂質からなる群より選択される少なくとも１つのカチオン性分子を含む。

【0506】

本発明によれば、カチオン性脂質は、カチオン性両親媒性分子、例えば少なくとも１つの親水性および親油性部分を含む分子である。カチオン性脂質は、モノカチオン性またはポリカチオン性であり得る。カチオン性脂質は、典型的にはステロール鎖、アシル鎖またはジアシル鎖などの親油性部分を有し、全体として正味の正電荷を有する。脂質の頭部基は、典型的には正電荷を担持する。カチオン性脂質は、好ましくは１～１０価の正電荷、より好ましくは１～３価の正電荷、より好ましくは１価の正電荷を有する。カチオン性脂質の例には、１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＭＡ）、ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡＢ）、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、１，２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）、１，２－ジアシルオキシ－３－ジメチルアンモニウムプロパン、１，２－ジアルキルオキシ－３－ジメチルアンモニウムプロパン、ジオクタデシルジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、１，２－ジミリストイルオキシプロピル－１，３－ジメチルヒドロキシエチルアンモニウム（ＤＭＲＩＥ）、および２，３－ジオレオイルオキシ－Ｎ－［２（スペルミンカルボキシアミド）エチル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－プロパナミウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）が含まれるが、これらに限定されない。カチオン性脂質には、１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）を含む第三級アミン基を有する脂質も含まれる。カチオン性脂質は、リポソーム、エマルジョンおよびリポプレックスなどの本明細書に記載の脂質製剤にＲＮＡを配合するのに適する。典型的には、正電荷には少なくとも１つのカチオン性脂質が寄与し、負電荷にはＲＮＡが寄与する。一実施形態では、医薬組成物は、カチオン性脂質に加えて、少なくとも１つのヘルパー脂質を含む。ヘルパー脂質は、中性またはアニオン性脂質であり得る。ヘルパー脂質は、リン脂質などの天然脂質、または天然脂質の類似体、または完全合成脂質、または天然脂質と類似性のない脂質様分子であり得る。医薬組成物がカチオン性脂質とヘルパー脂質の両方を含む場合、カチオン性脂質対中性脂質のモル比は、製剤の安定性などを考慮して適切に決定することができる。

【0507】

一実施形態では、本発明による医薬組成物はプロタミンを含む。本発明によれば、プロタミンはカチオン性担体剤として有用である。「プロタミン」という用語は、アルギニンに富み、魚類などの動物の精子細胞中で体細胞ヒストンの代わりに特にＤＮＡと会合して見出される、比較的低分子量の様々な強塩基性タンパク質のいずれかを指す。特に、「プロタミン」という用語は、強塩基性で、水に可溶性であり、熱によって凝固せず、複数のアルギニンモノマーを含む、魚類の精子中で見出されるタンパク質を指す。本発明によれば、本明細書で使用される「プロタミン」という用語は、その断片を含む、天然源または生物源から得られるまたはそれに由来する任意のプロタミンアミノ酸配列、および前記アミノ酸配列またはその断片の多量体形態を含むことが意図されている。さらに、この用語は、人工的であり、特定の目的のために特別に設計され、天然源または生物源から単離することができない（合成された）ポリペプチドを包含する。

【0508】

本発明による医薬組成物は、緩衝することができる（例えば酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、コハク酸緩衝液、トリス緩衝液、リン酸緩衝液を用いて）。

【0509】

ＲＮＡ含有粒子
いくつかの実施形態では、保護されていないＲＮＡの不安定性のため、本発明のＲＮＡ分子を複合体化形態または封入形態で提供することが有利である。それぞれの医薬組成物が本発明で提供される。特に、いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物は、核酸含有粒子、好ましくはＲＮＡ含有粒子を含む。それぞれの医薬組成物は、粒子製剤と称される。本発明による粒子製剤では、粒子は、本発明による核酸と、核酸の送達に適した薬学的に許容される担体または薬学的に許容されるビヒクルとを含む。核酸含有粒子は、例えばタンパク質性粒子の形態または脂質含有粒子の形態であり得る。適切なタンパク質または脂質は、粒子形成剤と称される。タンパク質性粒子および脂質含有粒子は、粒子形態のアルファウイルスＲＮＡの送達に適することが以前に記載されている（例えばＳｔｒａｕｓｓ＆Ｓｔｒａｕｓｓ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，１９９４，ｖｏｌ．５８，ｐｐ．４９１－５６２）。特に、アルファウイルス構造タンパク質（例えばヘルパーウイルスによって提供される）は、タンパク質性粒子の形態でＲＮＡを送達するための適切な担体である。

【0510】

本発明による系が粒子製剤として製剤化される場合、各ＲＮＡ種（例えばレプリコン、レプリカーゼ構築物、および場合によりＩＦＮを阻害するのに適したタンパク質をコードするＲＮＡなどのさらなるＲＮＡ種）を個々の粒子製剤として別々に製剤化することが可能である。その場合、個々の粒子製剤はそれぞれ１つのＲＮＡ種を含む。個々の粒子製剤は、例えば別々の容器中に、別々の実体として存在し得る。そのような製剤は、粒子形成剤と共に各ＲＮＡ種を別々に（典型的にはそれぞれＲＮＡ含有溶液の形態で）提供し、それにより粒子の形成を可能にすることによって得られる。それぞれの粒子は、粒子が形成されるときに提供される特定のＲＮＡ種のみを含む（個々の粒子製剤）。

【0511】

一実施形態では、本発明による医薬組成物は、複数の個別粒子製剤を含む。それぞれの医薬組成物は、混合粒子製剤と称される。本発明による混合粒子製剤は、上記のように、個々の粒子製剤を別々に形成し、その後個々の粒子製剤を混合する工程によって得られる。混合の工程によって、ＲＮＡ含有粒子の混合集団を含む１つの製剤が得られる（説明のために、例えば粒子の第１の集団は本発明によるレプリコンを含み、粒子の第２の集団は本発明によるレプリカーゼ構築物を含み得る）。個々の粒子集団は、個々の粒子製剤の混合集団を含む１つの容器に一緒に存在し得る。

【0512】

あるいは、医薬組成物のすべてのＲＮＡ種（例えばレプリコン、レプリカーゼ構築物、および場合によりＩＦＮを阻害するのに適したタンパク質をコードするＲＮＡなどのさらなる種）を組合せ粒子製剤として一緒に製剤化することが可能である。そのような製剤は、粒子形成剤と共にすべてのＲＮＡ種の組合せ製剤（典型的には組合せ溶液）を提供し、それにより粒子の形成を可能にすることによって得られる。混合粒子製剤とは対照的に、組合せ粒子製剤は、典型的には複数のＲＮＡ種を含む粒子を含む。組合せ粒子組成物では、異なるＲＮＡ種が、典型的には単一の粒子中に一緒に存在する。

【0513】

一実施形態では、本発明の粒子製剤は、ナノ粒子製剤である。その実施形態では、本発明による組成物は、ナノ粒子の形態の本発明による核酸を含む。ナノ粒子製剤は、様々なプロトコルにより、様々な複合体化合物を用いて入手できる。脂質、ポリマー、オリゴマー、または両親媒性物質は、ナノ粒子製剤の典型的な構成要素である。

【0514】

本明細書で使用される場合、「ナノ粒子」という用語は、粒子を、特に核酸の全身投与、特に非経口投与に適したものにする直径、典型的には１０００ナノメートル（ｎｍ）以下の直径を有する任意の粒子を指す。一実施形態では、ナノ粒子は、約５０ｎｍ～約１０００ｎｍ、好ましくは約５０ｎｍ～約４００ｎｍ、好ましくは約１００ｎｍ～約３００ｎｍ、例えば約１５０ｎｍ～約２００ｎｍの範囲の平均直径を有する。一実施形態では、ナノ粒子は、約２００～約７００ｎｍ、約２００～約６００ｎｍ、好ましくは約２５０～約５５０ｎｍ、特に約３００～約５００ｎｍまたは約２００～約４００ｎｍの範囲の直径を有する。

【0515】

一実施形態では、動的光散乱によって測定される、本明細書に記載のナノ粒子の多分散指数（ＰＩ）は、０．５以下、好ましくは０．４以下、さらにより好ましくは０．３以下である。「多分散指数」（ＰＩ）は、粒子混合物中の個々の粒子（リポソームなど）の均一または不均一なサイズ分布の測定値であり、混合物中の粒子分布の幅を示す。ＰＩは、例えば、国際公開第２０１３／１４３５５５ Ａ１号に記載されているように決定することができる。

【0516】

本明細書で使用される場合、「ナノ粒子製剤」という用語または同様の用語は、少なくとも１つのナノ粒子を含む任意の粒子製剤を指す。いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は、ナノ粒子の均一な集合体である。いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は、リポソーム製剤またはエマルジョンなどの脂質含有医薬製剤である。

【0517】

脂質含有医薬組成物
一実施形態では、本発明の医薬組成物は、少なくとも１つの脂質を含む。好ましくは、少なくとも１つの脂質はカチオン性脂質である。前記脂質含有医薬組成物は、本発明による核酸を含む。一実施形態では、本発明による医薬組成物は、小胞、例えばリポソーム中に封入されたＲＮＡを含む。一実施形態では、本発明による医薬組成物は、エマルジョンの形態のＲＮＡを含む。一実施形態では、本発明による医薬組成物は、カチオン性化合物との複合体中にＲＮＡを含み、それにより、例えばいわゆるリポプレックスまたはポリプレックスを形成する。リポソームなどの小胞内へのＲＮＡの封入は、例えば脂質／ＲＮＡ複合体とは異なる。脂質／ＲＮＡ複合体は、例えば、ＲＮＡを、例えばあらかじめ形成されたリポソームと混合する場合に得られる。

【0518】

一実施形態では、本発明による医薬組成物は、小胞に封入されたＲＮＡを含む。そのような製剤は、本発明による特定の粒子製剤である。小胞は、小さな空間を囲み、その空間を小胞の外側の空間から分離する、球状の殻に取り巻かれた脂質二重層である。典型的には、小胞内部の空間は水性空間であり、すなわち水を含む。典型的には、小胞の外側の空間は水性空間であり、すなわち水を含む。脂質二重層は、１つ以上の脂質（小胞形成脂質）によって形成される。小胞を取り囲む膜は、細胞膜のものと類似のラメラ相である。本発明による小胞は、多層小胞、単層小胞、またはそれらの混合物であり得る。小胞に封入されると、ＲＮＡは、典型的には外部媒体から分離される。したがって、ＲＮＡは、機能的に天然アルファウイルスの保護された形態と同等の、保護された形態で存在する。適切な小胞は、本明細書に記載の粒子、特にナノ粒子である。

【0519】

例えば、ＲＮＡはリポソームに封入され得る。その実施形態では、医薬組成物はリポソーム製剤であるかまたはそれを含む。リポソーム内への封入は、典型的にはＲＮＡをＲＮアーゼ消化から保護する。リポソームは一部の外部ＲＮＡを含む（例えばその表面に）が、ＲＮＡの少なくとも半分（理想的にはそのすべて）をリポソームのコア内に封入することが可能である。

【0520】

リポソームは、リン脂質などの小胞形成脂質の１つ以上の二重層を有することが多い顕微鏡的脂質小胞であり、薬物、例えばＲＮＡを封入することができる。多重層小胞（ＭＬＶ）、小型単層小胞（ＳＵＶ）、大型単層小胞（ＬＵＶ）、立体的に安定化されたリポソーム（ＳＳＬ）、多小胞性小胞（ＭＶ）および大型多小胞性小胞（ＬＭＶ）、ならびに当技術分野で公知の他の二重層形態を含むがこれらに限定されない、様々な種類のリポソームを本発明の文脈において使用し得る。リポソームのサイズとラメラ性は、調製方法に依存する。単層からなるラメラ相、六方相および逆六方相、立方相、ミセル、逆ミセルを含む脂質が水性媒体中に存在し得る、超分子構造のいくつかの他の形態が存在する。これらの相は、ＤＮＡまたはＲＮＡと組み合わせて得ることもでき、ＲＮＡおよびＤＮＡとの相互作用は、相状態に実質的に影響を及ぼし得る。そのような相は、本発明のナノ粒子ＲＮＡ製剤中に存在し得る。

【0521】

リポソームは、当業者に公知の標準的な方法を使用して形成され得る。それぞれの方法には、逆蒸発法、エタノール注入法、脱水－再水和法、超音波処理または他の適切な方法が含まれる。リポソームの形成後に、リポソームをサイズ分類して、実質的に均一なサイズ範囲を有するリポソームの集団を得ることができる。

【0522】

本発明の好ましい実施形態では、ＲＮＡは、少なくとも１つのカチオン性脂質を含むリポソーム中に存在する。それぞれのリポソームは、少なくとも１つのカチオン性脂質が使用されることを条件として、単一の脂質からまたは脂質の混合物から形成され得る。好ましいカチオン性脂質は、プロトン化され得る窒素原子を有し、好ましくは、そのようなカチオン性脂質は、第三級アミン基を有する脂質である。第三級アミン基を有する特に適切な脂質は、１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）である。一実施形態では、本発明によるＲＮＡは、国際公開第２０１２／００６３７８ Ａ１号に記載されているリポソーム製剤中に存在し、リポソームは、ＲＮＡを含む水性コアを封入する脂質二重層を有し、脂質二重層は、好ましくは第三級アミン基を有する、５．０～７．６の範囲のｐＫａを有する脂質を含む。第三級アミン基を有する好ましいカチオン性脂質には、ＤＬｉｎＤＭＡ（ｐＫａ ５．８）が含まれ、国際公開第２０１２／０３１０４６ Ａ２号に一般的に記載されている。国際公開第２０１２／０３１０４６ Ａ２号によれば、それぞれの化合物を含むリポソームは、ＲＮＡの封入、したがってＲＮＡのリポソーム送達に特に適する。一実施形態では、本発明によるＲＮＡはリポソーム製剤中に存在し、リポソームは、その頭部基が、プロトン化され得る少なくとも１つの窒素原子（Ｎ）を含む少なくとも１つのカチオン性脂質を含み、リポソームおよびＲＮＡは、１：１～２０：１のＮ：Ｐ比を有する。本発明によれば、「Ｎ：Ｐ比」は、国際公開第２０１３／００６８２５ Ａ１号に記載されているように、カチオン性脂質中の窒素原子（Ｎ）対脂質含有粒子（例えばリポソーム）に含まれるＲＮＡ中のリン酸原子（Ｐ）のモル比を指す。１：１～２０：１のＮ：Ｐ比は、リポソームの正味電荷および脊椎動物細胞へのＲＮＡの送達効率に関与する。

【0523】

一実施形態では、本発明によるＲＮＡは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を含む少なくとも１つの脂質を含むリポソーム製剤中に存在し、ＲＮＡは、国際公開第２０１２／０３１０４３ Ａ１号および国際公開第２０１３／０３３５６３ Ａ１号に記載されているように、ＰＥＧ部分がリポソームの外側に存在するようにＰＥＧ化リポソーム内に封入される。

【0524】

一実施形態では、本発明によるＲＮＡは、国際公開第２０１２／０３０９０１ Ａ１号に記載されているように、リポソームが６０～１８０ｎｍの範囲の直径を有するリポソーム製剤中に存在する。

【0525】

一実施形態では、本発明によるＲＮＡは、国際公開第２０１３／１４３５５５ Ａ１号に開示されているように、ＲＮＡ含有リポソームがゼロに近いまたは負の正味電荷を有するリポソーム製剤中に存在する。

【0526】

他の実施形態では、本発明によるＲＮＡはエマルジョンの形態で存在する。エマルジョンは、ＲＮＡ分子などの核酸分子を細胞に送達するために使用されることが以前に記載されている。本明細書では、水中油型エマルジョンが好ましい。それぞれのエマルジョン粒子は、油コアおよびカチオン性脂質を含む。本発明によるＲＮＡがエマルジョン粒子に複合体化されているカチオン性水中油型エマルジョンがより好ましい。エマルジョン粒子は、油コアおよびカチオン性脂質を含む。カチオン性脂質は負に帯電したＲＮＡと相互作用することができ、それによってＲＮＡをエマルジョン粒子に固定する。水中油型エマルジョンでは、エマルジョン粒子は水性連続相に分散している。例えば、エマルジョン粒子の平均直径は、典型的には約８０ｎｍ～１８０ｎｍであり得る。一実施形態では、本発明の医薬組成物はカチオン性水中油型エマルジョンであり、エマルジョン粒子は、国際公開第２０１２／００６３８０ Ａ２号に記載されているように、油コアおよびカチオン性脂質を含む。本発明によるＲＮＡは、国際公開第２０１３／００６８３４ Ａ１号に記載されているように、Ｎ：Ｐ比が少なくとも４：１である、カチオン性脂質を含むエマルジョンの形態で存在し得る。本発明によるＲＮＡは、国際公開第２０１３／００６８３７ Ａ１号に記載されているように、カチオン性脂質エマルジョンの形態で存在し得る。特に、組成物は、カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体化したＲＮＡを含んでもよく、油／脂質の比は少なくとも約８：１（モル：モル）である。

【0527】

他の実施形態では、本発明による医薬組成物は、リポプレックスの形式のＲＮＡを含む。「リポプレックス」または「ＲＮＡリポプレックス」という用語は、脂質とＲＮＡなどの核酸の複合体を指す。リポプレックスは、カチオン性（正に帯電した）リポソームとアニオン性（負に帯電した）核酸で形成され得る。カチオン性リポソームは、中性の「ヘルパー」脂質も含み得る。最も単純な場合には、特定の混合プロトコルで核酸とリポソームを混合することによってリポプレックスが自発的に形成されるが、他の様々なプロトコルも適用し得る。正に帯電したリポソームと負に帯電した核酸との間の静電的相互作用が、リポプレックス形成の駆動力であることが理解されている（国際公開第２０１３／１４３５５５ Ａ１号）。本発明の一実施形態では、ＲＮＡリポプレックス粒子の正味電荷はゼロに近いかまたは負である。ＲＮＡおよびリポソームの電気的に中性または負に帯電したリポプレックスは、全身投与後に脾臓樹状細胞（ＤＣ）における実質的なＲＮＡ発現をもたらし、正に帯電したリポソームおよびリポプレックスについて報告されている毒性の増加には関連しないことが公知である（国際公開第２０１３／１４３５５５ Ａ１号参照）。したがって、本発明の一実施形態では、本発明による医薬組成物は、（ｉ）ナノ粒子中の正電荷の数がナノ粒子中の負電荷の数を超えず、および／または（ｉｉ）ナノ粒子が中性もしくは正味の負電荷を有し、および／または（ｉｉｉ）ナノ粒子の正電荷対負電荷の電荷比が１．４：１以下であり、および／または（ｉｖ）ナノ粒子のゼータ電位が０以下である、ナノ粒子、好ましくはリポプレックスナノ粒子の形式のＲＮＡを含む。国際公開第２０１３／１４３５５５ Ａ１号に記載されているように、ゼータ電位は、コロイド系の界面動電位の科学用語である。本発明では、（ａ）ゼータ電位および（ｂ）ナノ粒子中のＲＮＡに対するカチオン性脂質の電荷比は、両方とも、国際公開第２０１３／１４３５５５ Ａ１号に開示されているように計算することができる。要約すると、国際公開第２０１３／１４３５５５ Ａ１号に開示されているように、粒子の正味電荷がゼロに近いかまたは負である、規定の粒径を有するナノ粒子リポプレックス製剤である医薬組成物が、本発明の文脈において好ましい医薬組成物である。

【0528】

治療的処置
被験体に投与される能力を考慮して、本発明によるＲＮＡレプリコン、本発明によるセット、本発明による系、本発明によるＤＮＡ、本発明による細胞、本発明によるキット、または本発明による医薬組成物の各々は、「薬剤」などと称され得る。本発明は、本発明のＲＮＡレプリコン、セット、系、ＤＮＡ、細胞、キット、または医薬組成物が薬剤として使用するために提供されることを予測する。

【0529】

薬剤は、被験体を治療するために使用することができる。「治療する」とは、本明細書に記載の化合物または組成物または他の実体を被験体に投与することを意味する。この用語には、療法によってヒトまたは動物の身体を治療する方法が含まれる。

【0530】

「治療」または「治療的処置」という用語は、好ましくは個体の健康状態を改善する、および／または寿命を延長させる（増加させる）任意の治療に関する。前記治療は、個体の疾患を除去し、個体の疾患の発症を停止もしくは遅延させ、個体の疾患の発症を阻害もしくは遅延させ、個体の症状の頻度もしくは重症度を減少させ、および／または現在疾患を有しているかもしくは以前に有していたことがある個人の再発を減少させ得る。

【0531】

「予防的治療」または「予防的処置」という用語は、個体において疾患が発生するのを防ぐことを意図した任意の治療に関する。「予防的治療」または「予防的処置」という用語は、本明細書では互換的に使用される。

【0532】

特に、細胞、例えば本明細書に記載の脱分化細胞または分化細胞は、細胞移植に有用であり、特に、これらの細胞の提供がその疾患の予防的および／または治療的処置をもたらす疾患の治療に有用である。

【0533】

したがって、本明細書に記載の作用物質、組成物および方法は、疾患、例えば細胞の喪失または変性を特徴とする疾患を有する被験体を治療するために使用できる。本明細書に記載の作用物質、組成物および方法は、本明細書に記載の疾患を予防するためにも使用し得る。

【0534】

「疾患」という用語は、個体の身体に影響を及ぼす異常な状態を指す。疾患はしばしば、特定の症状および徴候に関連する医学的状態として解釈される。疾患は、感染症などの外部からの要因によって引き起こされ得るか、または自己免疫疾患などの内部機能障害によって引き起こされ得る。ヒトでは、「疾患」はしばしば、罹患した個体に疼痛、機能障害、困難、社会的問題、もしくは死を引き起こす、または個体と接触するものに対して同様の問題を引き起こす状態を指すためにより広く使用される。このより広い意味では、疾患は時に、損傷、無力、障害、症候群、感染、孤立した症状、逸脱した挙動、および構造と機能の非定型のバリエーションを含むが、他の状況および他の目的では、これらは区別可能なカテゴリーとみなされ得る。多くの疾患を患い、それと共に生活することは人生観および人格を変える可能性があるため、疾患は通常、身体的にだけでなく感情的にも個体に影響を及ぼす。

【0535】

「個体」および「被験体」という用語は、本明細書では互換的に使用される。これらは、疾患または障害（例えば癌）に罹患し得るかまたは罹患しやすいが、疾患または障害を有していてもよくまたは有していなくてもよいヒト、非ヒト霊長動物または他の哺乳動物（例えばマウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマまたは霊長動物）を指す。多くの実施形態では、個体はヒトである。特に明記されない限り、「個体」および「被験体」という用語は特定の年齢を示すものではなく、したがって成人、高齢者、子供、および新生児を包含する。本発明の好ましい実施形態では、「個体」または「被験体」は「患者」である。「患者」という用語は、本発明によれば、治療のための被験体、特に疾患被験体を意味する。

【0536】

本発明の作用物質または組成物の予防的投与は、好ましくはレシピエントを疾患の発症から保護する。本発明の作用物質または組成物の治療的投与は、疾患の進行の阻害をもたらし得る。これは、好ましくは疾患の排除につながる、疾患の進行の減速、特に疾患の進行の中断を含む。

【0537】

本明細書に記載の作用物質および組成物は、注射または注入を含む非経口投与などによる、任意の従来の経路を介して投与し得る。投与は、好ましくは非経口的であり、例えば静脈内、動脈内、皮下、皮内または筋肉内経路である。

【0538】

非経口投与に適する組成物は、通常、活性化合物の滅菌水性または非水性調製物を含み、これは、好ましくはレシピエントの血液と等張である。適合性の担体および溶媒の例は、リンゲル液および等張塩化ナトリウム溶液である。さらに、通常滅菌の固定油が溶液または懸濁液として使用される。

【0539】

本明細書に記載の作用物質および組成物は、有効量で投与される。「有効量」は、単独でまたはさらなる用量と共に、所望の反応または所望の効果を達成する量を指す。特定の疾患または特定の状態の治療の場合、所望の反応は、好ましくは疾患の経過の阻止に関する。これは、疾患の進行を遅くすること、特に疾患の進行を妨げるまたは逆転させることを含む。疾患または状態の治療における所望の反応はまた、前記疾患または前記状態の発症の遅延または発症の防止であり得る。

【0540】

本明細書に記載の作用物質または組成物の有効量は、治療される状態、疾患の重症度、年齢、生理学的状態、サイズおよび体重を含む患者の個々のパラメータ、治療の期間、付随する治療の種類（存在する場合）、特定の投与経路ならびに同様の因子に依存する。したがって、本明細書に記載の作用物質の投与量は、様々なそのようなパラメータに依存し得る。患者の反応が初期用量では不十分である場合、より高い用量（または異なる、より局所的な投与経路によって達成される実質的により高い用量）を使用し得る。

【0541】

本明細書に記載の作用物質および組成物は、本明細書に記載のもののような様々な障害を治療または予防するために、例えばインビボで患者に投与することができる。好ましい患者には、本明細書に記載の作用物質および組成物を投与することによって治すまたは改善することができる障害を有するヒト患者が含まれる。

【0542】

医薬組成物は、局所的または全身的に、好ましくは全身的に投与することができる。

【0543】

「全身投与」という用語は、作用物質が個体の体内に有意な量で広く分布するようになり、所望の効果を発現するような作用物質の投与を指す。例えば、作用物質は、血液中でその所望の効果を発現し得る、および／または血管系を介してその所望の作用部位に達する。典型的な全身投与経路には、作用物質を血管系に直接導入することによる投与、または経口、肺もしくは筋肉内投与が含まれ、この場合作用物質は吸着され、血管系に入り、血液を介して１つ以上の所望の作用部位に運ばれる。

【0544】

本発明によれば、全身投与は非経口投与によることが好ましい。「非経口投与」という用語は、作用物質が腸管を通過しないような作用物質の投与を指す。「非経口投与」という用語には、静脈内投与、皮下投与、皮内投与または動脈内投与が含まれるが、これらに限定されない。

【0545】

投与は、例えば経口的、腹腔内または筋肉内経路でも実施し得る。

【0546】

本明細書で提供される作用物質および組成物は、単独で、または従来の治療レジメンと組み合わせて使用し得る。
以下、参考形態の例を付記する。
１． 再プログラミング因子をコードするオープンリーディングフレームを含むＲＮＡレプリコン。
２． 異なる再プログラミング因子をコードする少なくとも１つのさらなるオープンリーディングフレームを含む、１．に記載のＲＮＡレプリコン。
３． 前記再プログラミング因子が、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ｃ－ＭＹＣ、ＬＩＮ２８およびＮＡＮＯＧからなる群より選択される、１．または２．に記載のＲＮＡレプリコン。
４． シスレプリコンまたはトランスレプリコンである、１．から３．のいずれか一つに記載のＲＮＡレプリコン。
５． 機能性アルファウイルス非構造タンパク質または再プログラミング因子をコードする第１のオープンリーディングフレームを含む、１．から４．のいずれか一つに記載のＲＮＡレプリコン。
６． ５'複製認識配列を含み、前記５'複製認識配列が、天然のアルファウイルス５'複製認識配列と比較して少なくとも１つの開始コドンの除去を含むことを特徴とする、１．から５．のいずれか一つに記載のＲＮＡレプリコン。
７． 前記第１のオープンリーディングフレームが前記５'複製認識配列と重複しない、５．または６．に記載のＲＮＡレプリコン。
８． 前記第１のオープンリーディングフレームの開始コドンが、前記ＲＮＡレプリコンの５'→３'方向で最初の機能的開始コドンである、５．から７．のいずれか一つに記載のＲＮＡレプリコン。
９． ＲＮＡレプリコンのセットであって、前記ＲＮＡレプリコンの各々が再プログラミング因子をコードする少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含み、および前記ＲＮＡレプリコンのセットが再プログラミング因子のセットをコードする、ＲＮＡレプリコンのセット。
１０． 前記ＲＮＡレプリコンの各々が、再プログラミング因子をコードする１つのオープンリーディングフレームを含む、９．に記載のＲＮＡレプリコンのセット。
１１． 前記再プログラミング因子のセットが、体細胞を、幹細胞特性を有する細胞に再プログラムするのに有用である、９．または１０．に記載のＲＮＡレプリコンのセット。
１２． 前記再プログラミング因子のセットが、ＯＣＴ４およびＳＯＸ２を含む、９．から１１．のいずれか一つに記載のＲＮＡレプリコンのセット。
１３． 前記再プログラミング因子のセットが、ＫＬＦ４および／またはｃ－ＭＹＣをさらに含む、１２．に記載のＲＮＡレプリコンのセット。
１４． 前記再プログラミング因子のセットが、ＮＡＮＯＧおよび／またはＬＩＮ２８をさらに含む、１２．または１３．に記載のＲＮＡレプリコンのセット。
１５． 前記再プログラミング因子のセットが、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４およびｃ－ＭＹＣを含む、９．から１３．のいずれか一つに記載のＲＮＡレプリコンのセット。
１６． 前記再プログラミング因子のセットが、ＬＩＮ２８および場合によりＮＡＮＯＧをさらに含む、１５．に記載のＲＮＡレプリコンのセット。
１７． 前記再プログラミング因子のセットが、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧおよびＬＩＮ２８を含む、９．から１２．および１４．のいずれか一つに記載のＲＮＡレプリコンのセット。
１８． 前記セットの少なくとも１つのＲＮＡレプリコンが、１．から８．のいずれか一つに記載のＲＮＡレプリコンである、９．から１７．のいずれか一つに記載のＲＮＡレプリコンのセット。
１９． 前記セットの各々のＲＮＡレプリコンが、１．から８．のいずれか一つに記載のＲＮＡレプリコンである、９．から１７．のいずれか一つに記載のＲＮＡレプリコンのセット。
２０． １．から８．のいずれか一つに記載の１つ以上のＲＮＡレプリコンを体細胞に導入する工程を含む、幹細胞特性を有する細胞を生成する方法。
２１． 幹細胞特性を有する細胞を提供する方法であって、
（ｉ）体細胞を含む細胞集団を提供する工程、
（ｉｉ）各々が、機能性アルファウイルス非構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含み、機能性アルファウイルス非構造タンパク質によって複製することができ、および再プログラミング因子をコードする少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含む、１つ以上のＲＮＡレプリコンを提供する工程、
（ｉｉｉ）前記細胞が、体細胞を幹細胞特性を有する細胞に再プログラムするのに有用な再プログラミング因子のセットを発現するように、前記１つ以上のＲＮＡレプリコンを前記体細胞に導入する工程、ならびに、
（ｉｖ）幹細胞特性を有する細胞の発生を可能にする工程
を含む方法。
２２． 幹細胞特性を有する細胞を提供する方法であって、
（ｉ）体細胞を含む細胞集団を提供する工程、
（ｉｉ）機能性アルファウイルス非構造タンパク質を発現するためのＲＮＡ構築物を提供する工程、
（ｉｉｉ）各々が、機能性アルファウイルス非構造タンパク質によってトランスで複製することができ、および再プログラミング因子をコードする少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含む、１つ以上のＲＮＡレプリコンを提供する工程、
（ｉｖ）前記細胞が、体細胞を幹細胞特性を有する細胞に再プログラムするのに有用な再プログラミング因子のセットを発現するように、前記ＲＮＡ構築物および前記１つ以上のＲＮＡレプリコンを前記体細胞に導入する工程、ならびに
（ｉｖ）幹細胞特性を有する細胞の発生を可能にする工程
を含む方法。
２３． 前記１つ以上のＲＮＡレプリコンが再プログラミング因子のセットをコードする、２０．から２２．に記載の方法。
２４． 前記１つ以上のＲＮＡレプリコンの各々が、再プログラミング因子をコードする１つのオープンリーディングフレームを含む、２０．から２３．のいずれか一つに記載の方法。
２５． 前記１つ以上のＲＮＡレプリコンによってコードされる前記再プログラミング因子のセットが、体細胞を幹細胞特性を有する細胞に再プログラムするのに有用である、２３．または２４．に記載の方法。
２６． 前記再プログラミング因子のセットがＯＣＴ４およびＳＯＸ２を含む、２０．から２５．のいずれか一つに記載の方法。
２７． 前記再プログラミング因子のセットがＫＬＦ４および／またはｃ－ＭＹＣをさらに含む、２６．に記載の方法。
２８． 前記再プログラミング因子のセットがＮＡＮＯＧおよび／またはＬＩＮ２８をさらに含む、２６．または２７．に記載の方法。
２９． 前記再プログラミング因子のセットが、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４およびｃ－ＭＹＣを含む、２３．から２７．のいずれか一つに記載の方法。
３０． 前記再プログラミング因子のセットが、ＬＩＮ２８および場合によりＮＡＮＯＧをさらに含む、２９．に記載の方法。
３１． 前記再プログラミング因子のセットが、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧおよびＬＩＮ２８を含む、２３．から２６．および２８．のいずれか一つに記載の方法。
３２． 前記体細胞の幹細胞特性を有する細胞への再プログラミングを促進するｍｉＲＮＡを前記体細胞に導入することをさらに含む、２０．から３１．のいずれか一項に記載の方法。
３３． 少なくとも１つのヒストンデアセチラーゼ阻害剤の存在下で前記体細胞を培養することをさらに含む、２０．から３２．のいずれか一つに記載の方法。
３４． 前記少なくとも１つのヒストンデアセチラーゼ阻害剤がバルプロ酸を含む、３３．に記載の方法。
３５． 幹細胞特性を有する細胞の発生を可能にする前記工程が、胚性幹細胞培養条件下で前記体細胞を培養することを含む、２１．から３４．のいずれか一つに記載の方法。
３６． 前記幹細胞特性が胚性幹細胞の形態を含む、２０．から３５．のいずれか一つに記載の方法。
３７． 前記幹細胞特性を有する細胞が正常な核型を有し、テロメラーゼ活性を発現し、胚性幹細胞に特徴的な細胞表面マーカーを発現し、および／または胚性幹細胞に特徴的な遺伝子を発現する、２０．から３６．のいずれか一つに記載の方法。
３８． 前記幹細胞特性を有する細胞が多能性状態を示す、２０．から３７．のいずれか一つに記載の方法。
３９． 前記幹細胞特性を有する細胞が、３つの一次胚葉すべての高度派生物に分化する発生能を有する、２０．から３８．のいずれか一つに記載の方法。
４０． 前記体細胞が線維芽細胞である、２０．から３９．のいずれか一つに記載の方法。
４１． 前記線維芽細胞が、肺線維芽細胞、包皮線維芽細胞または真皮線維芽細胞である、４０．に記載の方法。
４２． 前記体細胞がヒト細胞である、２０．から４１．のいずれか一つに記載の方法。
４３． 前記１つ以上のＲＮＡレプリコンの少なくとも１つのＲＮＡレプリコンが、１．から８．のいずれか一つに記載のＲＮＡレプリコンである、２１．から４２．のいずれか一つに記載の方法。
４４． 前記１つ以上のＲＮＡレプリコンの各々のＲＮＡレプリコンが、１．から８．のいずれか一つに記載のＲＮＡレプリコンである、２１．から４３．のいずれか一つに記載の方法。
４５． 前記１つ以上のＲＮＡレプリコンが、９．から１９．のいずれか一つに記載のＲＮＡレプリコンのセットを含む、２０．から４４．のいずれか一つに記載の方法。
４６． ２０．から４４．のいずれか一つに記載の方法によって生成される、幹細胞特性を有する細胞。
４７． （ｉ）２０．から４５．のいずれか一つに記載の方法を使用して幹細胞特性を有する細胞を提供する工程、および（ｉｉ）分化した細胞型への部分的または完全な分化を誘導または指令する条件下で、前記幹細胞特性を有する細胞を培養する工程を含む、分化細胞型を提供する方法。

【実施例】

【0547】

（実施例）
材料および方法：
レプリコンおよびトランスレプリコン構築物をコードするＤＮＡ：本明細書で使用するベクター系は、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ；アクセッション番号Ｌ０１４４２）から設計されており、全体的なベクターのデザインは、以前に生成されたセムリキ森林ウイルスベクター系に類似する（図１）。最初の工程では、ＶＥＥＶに基づく自己複製ＲＮＡ（シスレプリコン）をコードするプラスミドを、商業的供給者からの遺伝子合成によって入手した。この構築物は、ＶＥＥＶ構造遺伝子を欠くが、複製認識配列（ＲＲＳ）として働き、Ｔ７ファージＲＮＡポリメラーゼプロモータの転写制御下でｐＳＴ１プラスミド骨格へのウイルス複製を制御する（Ｈｏｌｔｋａｍｐ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｂｌｏｏｄ，ｖｏｌ．１０８，ｐｐ．４００９－４０１７）ＶＥＥＶのすべての保存された配列エレメント（ＣＳＥ）を含む。ＶＥＥＶ ３'ＣＳＥの一番最後のヌクレオチドのすぐ下流に、１０個のヌクレオチドのランダム配列（国際公開第２０１６／００５００４ Ａ１号）で分離された３０および７０個のアデニル酸残基（ポリＡ３０－７０）からなる、プラスミドにコードされたポリ（Ａ）カセットを付加した。プラスミドの線形化のためのＳａｐＩ制限部位をポリ（Ａ）カセットのすぐ下流に配置した。さらなる遺伝子合成およびＰＣＲベースのシームレスクローニング／組換え技術を使用して、ＶＥＥＶレプリカーゼの完全なオープンリーディングフレームをコードするｍＲＮＡをｐＳＴ１プラスミド骨格にインビトロ転写するための鋳型として働くプラスミドを生成した（Ｈｏｌｔｋａｍｐ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｂｌｏｏｄ，ｖｏｌ．１０８，ｐｐ．４００９－４０１７）。このベクターは、上流にヒトアルファグロビン５'ＵＴＲ、およびレプリカーゼＯＲＦの下流にプラスミドにコードされたポリ（Ａ３０－７０）カセットを含む。再び、プラスミドの線形化のためにＳａｐＩ制限部位をポリ（Ａ）カセットのすぐ下流に配置した。インビトロ転写では、得られるｍＲＮＡはＶＥＥＶの機能的ＲＲＳを欠き、複製することができない。トランスで複製するＲＮＡ（トランスレプリコン）のインビトロ転写のために、鋳型プラスミドの２つの異なる変異体を生成した。最初の変異体では、ＷＴ－ＲＲＳ（非修飾５'ＣＳＥ、サブゲノムプロモータ、３'ＣＳＥ）を有するトランスレプリコンをコードするプラスミドを、シスレプリコンからＶＥＥＶ－レプリカーゼコード配列の大部分を除去し、機能的ＲＲＳ（５'－ＣＳＥおよびサブゲノムプロモータ）を含むものだけを保持することによって得た。レプリカーゼＯＲＦの大部分の除去により、それぞれのプラスミドによってコードされたＲＮＡは、宿主細胞中に存在する場合、シスで複製を駆動することができないが、複製のためにトランスで機能性アルファウイルス非構造タンパク質の存在を必要とする。目的の遺伝子はサブゲノムプロモータの下流に挿入する。

【0548】

２番目のトランスレプリコン型では、サブゲノムプロモータを含む配列を除去し、５'ＲＲＳをＶＥＥＶゲノムの最初の～２７０ヌクレオチドに短縮した。さらに、５'ＲＲＳを変異させて、翻訳開始コドンとして働き得るＡＵＧコドンを除去した。５'ＲＲＳの正しい折りたたみと機能を確保するために、補償ヌクレオチド変化を導入し、このトランスレプリコンはΔ５ＡＴＧ－ＲＲＳΔＳＧＰであった。５'ＡＵＧの除去は、目的のＯＲＦの開始コドンのみで翻訳が開始されることを確実にし、目的のＯＲＦは変異した５'ＣＳＥの下流に挿入される。

【0549】

トランス複製ＲＮＡの両方の変異体間の主な生物学的相違は、ＷＴ－ＲＲＳとサブゲノムプロモータを備えたトランスレプリコンが、複製時にのみ生成されるサブゲノム転写物上に導入遺伝子をコードすることである。これは、トランスで発現されるレプリカーゼが存在しない場合、目的のタンパク質が翻訳されないことを意味する。対照的に、Δ５ＡＴＧ－ＲＲＳΔＳＧＰトランスレプリコンは、合成キャップ類似体でインビトロ転写が行われることを条件として、レプリカーゼなしでもタンパク質に翻訳され得る。

【0550】

本明細書における目的の遺伝子は、多能性を促進する６つの再プログラミング転写因子（ｒＴＦ）（ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＭＹＣ、ＫＬＦ４、ＮＡＮＯＧ、ＬＩＮ２８）およびワクシニアウイルスの３つのインターフェロンエスケープタンパク質（Ｅ３、Ｋ３、Ｂ１８）である。

【0551】

（実施例１）
トランスレプリコン技術（ＷＴ－ＲＲＳ）を使用したＲＮＡ再プログラミング
初代ヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ、Ｉｎｎｏｐｒｏｔ）を６ウェル（１００，０００細胞／ウェル）に播種し、６ウェルにつき６μｌのＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および０．７μｇの非修飾合成ＴＲ－ＷＴ－ＲＲＳ ｍＲＮＡ混合物を、０．７μｇのレプリカーゼｍＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ ３０２ａ－ｄと３６７からなる０．４μｇのｍｉＲＮＡ混合物（１：１：１：１：１：１）と共に使用して、４時間後にリポフェクションを行った。これにより、ＴＲ－ＷＴ－ＲＲＳ ｍＲＮＡ混合物は、再プログラミングＴＦ ＯＳＫＭＮＬ（１：１：１：１：１：１）をコードする０．４μｇの合成ｍＲＮＡと０．１μｇの各ＥＫＢで構成された。９６時間後（５日目）に、１．７μｌのＲＮＡｉＭＡＸと０．４μｇのレプリカーゼｍＲＮＡを使用して、細胞に２回目のリポフェクションを行った。細胞を、１０ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および０．５μＭチアゾビビン（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）を添加したヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞培地（ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ培地、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）で培養し、すべてのリポフェクションを製造者の指示に従って実施した。コロニー形成は１２日目から観察され、実験手順のスケジュールを表示している（図２Ａ）。図２Ｂは、１日目から１８日目までのコロニー形成の顕微鏡分析を示す。ＴＲ－ＷＴ－ＲＲＳ ｍＲＮＡを使用して得られたｉＰＳ細胞コロニーのコロニー形態および成長挙動は、明確なコロニー中に密に詰まった小細胞とはっきりした境界を有するｈＥＳ細胞様であった。コロニーは、ｈＥＳ細胞表面マーカーＴＲＡ－１－８１（灰色／緑色）に対して陽性に染色することができた。Ｓｔａｉｎ－Ａｌｉｖｅ ＴＲＡ－１－８１抗体（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）を製造者の指示に従って使用して、ＴＲＡ－１－８１の生染色を実施した。コロニーの代表的な写真を図２Ｃに示す。コロニーの多能性をさらに評価するために、細胞を１８日目にペレット化し、全ＲＮＡを単離し、ｈＥＳマーカーＯＣＴ４（内因性）、ＮＡＮＯＧ（内因性）、ＬＩＮ２８（内因性）、ＴＥＲＴおよびＲＥＸ１のｍＲＮＡ発現をｑＲＴ－ＰＣＲによって定量化した。ｍＲＮＡ発現をＨＰＲＴの発現に対して正規化し、入力細胞の転写物レベルと比較した誘導倍率として図２Ｄに示す。分析したすべてのマーカーが、入力細胞と比較して高度に発現され、再プログラム細胞の多能性を示した。

【0552】

データは、ＴＲ－ＷＴ－ＲＲＳ技術がｉＰＳ細胞のＲＮＡベースの生成に使用できることを示す。細胞の再プログラミングの成功は、結果として生じたｉＰＳ細胞コロニーのｈＥＳ細胞様の形態および成長挙動ならびにｈＥＳ細胞表面および内因性マーカーの発現によって確認された。

【0553】

（実施例２）
トランスレプリコン技術（Δ５ＡＴＧ－ＲＲＳΔＳＧＰ）を使用したＲＮＡ再プログラミング
図３Ａは、初代ヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ、Ｉｎｎｏｐｒｏｔ）の再プログラミングのスケジュールを示す。４０，０００細胞を１２ウェルプレートに播種し、１２ウェルにつき２．５μｌのＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および再プログラミングＴＦ ＯＳＫＭＮＬ（１：１：１：１：１：１）をコードする０．３３μｇの非修飾合成ＴＲ－Δ５ＡＴＧ－ＲＲＳΔＳＧＰ ｍＲＮＡと各ＥＫＢの０．０２μｇの合成ｍＲＮＡ（＋「ＥＫＢ」）、またはＯＳＫＭＮＬ（１：１：１：１：１：１）をコードする０．２５μｇの非修飾合成ＴＲ－Δ５ＡＴＧ－ＲＲＳΔＳＧＰ ｍＲＮＡと０．０４μｇのＮ単独の合成ｍＲＮＡ（「＋Ｎ」）（トスカーナウイルス由来のウイルスエスケープタンパク質ＮＳ（Ｎ）はＩＦＮ応答の強力な阻害剤であり、ＲＮＡベースの再プログラミングを成功させるためにＥＫＢの代わりに使用することができる）のいずれかからなるｍＲＮＡ混合物を使用して、４時間後にリポフェクションを行った。両方の混合物に、０．３μｇのレプリカーゼｍＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ ３０２ａ－ｄと３６７からなる０．１７μｇのｍｉＲＮＡ混合物（１：１：１：１：１：１）を組み合わせた。７２時間後（４日目）に、１日目と全く同じ手順と混合物を使用して、細胞に２回目のリポフェクションを行った。実験全体を通して、１０ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および０．５μＭチアゾビビン（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）を添加したヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞培地（ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ培地、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）で細胞を培養し、すべてのリポフェクションを製造者の指示に従って実施した。示されているように、１５日目以降にコロニー形成を観察することができた。図３Ｂは、１２日目以降のコロニー形成の顕微鏡分析を示す。ＴＲ－Δ５ＡＴＧ－ＲＲＳΔＳＧＰ ｍＲＮＡおよびＥＫＢ ｍＲＮＡまたはＮ ｍＲＮＡのいずれかを使用して得られたｉＰＳ細胞コロニーのコロニー形態および成長挙動は、明確なコロニー中に密に詰まった小細胞およびはっきりした境界を有するｈＥＳ細胞様であった。コロニーは、ｈＥＳ細胞表面マーカーＴＲＡ－１－８１（灰色／緑色）に対して陽性に染色することができた。Ｓｔａｉｎ－Ａｌｉｖｅ ＴＲＡ－１－８１抗体（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）を製造者の指示に従って使用して、ＴＲＡ－１－８１の生染色を実施した。コロニーの代表的な写真を図３Ｃに示す。コロニーの多能性をさらに評価するために、細胞を２２日目にペレット化し、全ＲＮＡを単離し、ｈＥＳマーカーＯＣＴ４（内因性）、ＮＡＮＯＧ（内因性）、ＬＩＮ２８（内因性）、ＴＥＲＴおよびＲＥＸ１のｍＲＮＡ発現をｑＲＴ－ＰＣＲによって定量化した。ｍＲＮＡ発現をＨＰＲＴの発現に対して正規化し、入力細胞の転写物レベルと比較した誘導倍率として図３Ｄに示す。分析したすべてのマーカーが、入力細胞と比較して、ＴＲ－Δ５ＡＴＧ－ＲＲＳΔＳＧＰ ｍＲＮＡおよびＥＫＢ ｍＲＮＡまたはＮ ｍＲＮＡのいずれかを使用して得られたｉＰＳ細胞コロニーで高度に発現され、再プログラム細胞の多能性を示した。

【0554】

データは、ＴＲ技術（Δ５ＡＴＧ－ＲＲＳΔＳＧＰ）がｉＰＳ細胞のＲＮＡベースの生成に使用できることを示す。それにより、非修飾合成ＲＮＡに対するＩＦＮ応答は、ＥＫＢまたはＮ ｍＲＮＡを使用することによってブロックすることができ、ｉＰＳコロニーの形成をもたらす。細胞の再プログラミングの成功は、結果として生じたｉＰＳ細胞コロニーのｈＥＳ細胞様の形態および成長挙動ならびにｈＥＳ細胞表面および内因性マーカーの発現によって確認された。

【0555】

（実施例３）
トランスレプリコン技術（ＷＴ－ＲＳＳ）を使用した１回のトランスフェクションによるＲＮＡベースの再プログラミング
初代ヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ、Ｉｎｎｏｐｒｏｔ）を６ウェル（１００，０００細胞／ウェル）に播種し、６ウェルにつき６μｌのＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および０．７μｇの非修飾合成ＴＲ－ＷＴ－ＲＲＳ ｍＲＮＡ混合物を、０．７μｇのレプリカーゼｍＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ ３０２ａ－ｄと３６７からなる０．４μｇのｍｉＲＮＡ混合物（１：１：１：１：１：１）と共に使用して、４時間後にリポフェクションを行った。これにより、ＴＲ－ＷＴ－ＲＲＳ ｍＲＮＡ混合物は、再プログラミングＴＦ ＯＳＫＭＮＬ（１：１：１：１：１：１）をコードする０．４μｇの合成ｍＲＮＡと０．１μｇの各ＥＫＢで構成された。細胞を、１０ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および０．５μＭチアゾビビン（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）を添加したヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞培地（ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ培地、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）で培養し、すべてのリポフェクションを製造者の指示に従って実施した。コロニー形成は１１日目から観察され、実験手順のスケジュールを表示している（図４Ａ）。図４Ｂは、１日目から１４日目までのコロニー形成の顕微鏡分析を示す。ＴＲ－ＷＴ－ＲＲＳ ｍＲＮＡを使用して得られたｉＰＳ細胞コロニーのコロニー形態および成長挙動は、明確なコロニー中に密に詰まった小細胞とはっきりした境界を有するｈＥＳ細胞様であった。コロニーは、ｈＥＳ細胞表面マーカーＴＲＡ－１－８１（灰色／緑色）に対して陽性に染色することができた。Ｓｔａｉｎ－Ａｌｉｖｅ ＴＲＡ－１－８１抗体（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）を製造者の指示に従って使用して、ＴＲＡ－１－８１の生染色を実施した。コロニーの代表的な写真を図４Ｃに示す。コロニーの多能性をさらに評価するために、細胞を１８日目にペレット化し、全ＲＮＡを単離し、ｈＥＳマーカーＯＣＴ４（内因性）、ＮＡＮＯＧ（内因性）、ＬＩＮ２８（内因性）、ＴＥＲＴおよびＲＥＸ１のｍＲＮＡ発現をｑＲＴ－ＰＣＲによって定量化した。ｍＲＮＡ発現をＨＰＲＴの発現に対して正規化し、入力細胞の転写物レベルと比較した誘導倍率として図４Ｄに示す。分析したすべてのマーカーが、入力細胞と比較して高度に発現され、再プログラム細胞の多能性を示した。

【0556】

データは、ＴＲ技術（ＷＴ－ＲＲＳ）が、１回のトランスフェクションだけでｉＰＳ細胞のＲＮＡベースの生成に使用できることを示す。細胞の再プログラミングの成功は、結果として生じたｉＰＳ細胞コロニーのｈＥＳ細胞様の形態および成長挙動ならびにｈＥＳ細胞表面および内因性マーカーの発現によって確認された。

【図1】

【図2】

【図3ABC】

【図3D】

【図4】

【図5】

【図6】