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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B1)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-01-09
(45)【発行日】2024-01-17
(54)【発明の名称】癌免疫増強用のＶＩＰＲ２アンタゴニストペプチド
(51)【国際特許分類】
A61K 38/12 20060101AFI20240110BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240110BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20240110BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240110BHJP
C07K 7/00 20060101ALN20240110BHJP
【ＦＩ】
A61K38/12 ZNA
A61P35/00
A61P37/04
A61P43/00 111
C07K7/00
【請求項の数】
4
(21)【出願番号】P 2023542946
(86)(22)【出願日】2023-03-30
(86)【国際出願番号】 JP2023013061
【審査請求日】2023-07-14
(31)【優先権主張番号】P 2022057810
(32)【優先日】2022-03-31
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【早期審査対象出願】
(73)【特許権者】
【識別番号】304028346
【氏名又は名称】国立大学法人 香川大学
(73)【特許権者】
【識別番号】000119472
【氏名又は名称】一丸ファルコス株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110002697
【氏名又は名称】めぶき弁理士法人
(74)【代理人】
【識別番号】100110973
【弁理士】
【氏名又は名称】長谷川 洋
(74)【代理人】
【識別番号】100116528
【弁理士】
【氏名又は名称】三宅 俊男
(72)【発明者】
【氏名】西山 成
(72)【発明者】
【氏名】キイッテイクウス ワララット
(72)【発明者】
【氏名】坂元 孝太郎
【審査官】松浦 安紀子
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０２１／２００２５９（ＷＯ，Ａ１）
【文献】RAVINDRANATHAN, S. et al.，643 Vasoactive intestinal peptide as a novel immune checkpoint molecule in activated T cells.，J. Immunother. Cancer，2021年11月，Vol.9 Suppl.2，p.A672
【文献】FNU, T.P. et al.，Inhibition of Vasoactive Intestinal Peptide Signaling with More Potent Inhibitors Augments T-Cell Ac，Blood，2021年11月，Vol.136 Suppl.1，p.1868-1870
【文献】MAR, C. et al.，VIP impairs acquisition of the macrophage proinflammatory polarization profile.，J. Leukoc. Biol.，2016年12月，Vol.100 No.6，p.1385-1393
【文献】KITTIKULSUTH, W. et al.，Vasoactive intestinal peptide blockade suppresses tumor growth by regulating macrophage polarization，Sci. Rep.，2023年01月17日，Vol.13，Article number: 927
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ３８／１２
Ａ６１Ｐ ３５／００
Ａ６１Ｐ ３７／０４
Ａ６１Ｐ ４３／００
Ｃ０７Ｋ ７／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
式（１）：ｃ［Ｘ１－Ｐｒｏ２－Ｘ３－Ｔｙｒ４－Ｌｅｕ５－Ｐｒｏ６－ｃ（Ｘ７－Ｘ８－Ｌｅｕ９－Ｃｙｓ１０］－Ｘ１１）－Ｘ１２－Ｘ１３ （１）
（式中、Ｘ１は、システイン、又はＭｐａ（３－メルカプトプロピオン酸）を表し、
Ｘ３が、プロリン、セリン、又はリジンを表し、
Ｘ ７ が、リジンを表し、
Ｘ８が、チロシン、又はアルギニンを表し、
Ｘ １１ が、アスパラギン酸を表し、
Ｘ１２及びＸ１３が、それぞれ独立にロイシン、イソロイシン又はノルロイシンを表し、Ｘ １ がシステインの場合はＮ末端アミノ基がアセチル化され、Ｃ末端カルボキシ基がアミド化されている。）
で表されるアミノ酸配列からなる環状ペプチド、又は薬理学的に許容されるその塩を含む、癌免疫増強のための組成物であって、
前記癌免疫が、腫瘍関連マクロファージの腫瘍抑制分極（Ｍ１分極）を含み、Ｍ１／Ｍ２マクロファージ比を増加させるための当該組成物。
【請求項2】
Ｘ３が、プロリンであり、Ｘ８が、チロシンである、請求項１に記載の癌免疫増強のための組成物。
【請求項3】
前記環状ペプチドが配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列を有する、請求項１又は２に記載の癌免疫増強のための組成物。
【請求項4】
前記癌免疫が、固形癌の増殖を抑制することを含む請求項１又は２に記載の組成物。【発明の詳細な説明】
【クロスリファレンス】
【0001】
本出願は、２０２２年３月３１日に日本国において出願された特願２０２２－０５７８１０に基づき優先権を主張し、当該出願に記載された内容は、本明細書に援用する。
【技術分野】
【0002】
本発明は癌免疫増強のための組成物に関し、より詳細には、癌免疫増強のためのＶＩＰＲ２アンタゴニストペプチドを含む組成物に関する。
【背景技術】
【0003】
癌免疫増強のための薬剤として、主にＴ細胞（例えばＣＤ８陽性Ｔ細胞）の活性化を促す免疫チェックポイント阻害剤が知られているが、その効果は大腸癌や膵臓癌などの固形癌に対しては十分とはいえない。その理由の一つは固形癌の腫瘍微小環境（ＴＭＥ）であり、Ｔ細胞の腫瘍内への浸潤のハードルとなっている。一方で腫瘍内まで浸潤する腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）と癌の関係が近年注目されている。ＴＡＭは、サイトカインやケモカインを分泌する能力に応じて、Ｍ１様とＭ２様の表現型に分けられる。Ｍ１様ＴＡＭはクラスＩＩ主要組織適合性複合体（ＭＨＣＩＩ）を多く含み、抗原提示細胞として、癌に対するＴ細胞の機能を活性化する腫瘍抑制性のマクロファージである。しかし、腫瘍が進行すると、腫瘍細胞は多くのサイトカインを放出し、Ｍ２様ＴＡＭへの分極を促進する。すると、Ｍ２様ＴＡＭは抗炎症性のサイトカインや成長因子を放出し、腫瘍の成長を助ける。実際に臨床知見として、Ｍ２様ＴＡＭの増加は、患者の生存率の低下と関連していることが報告されている。さらに、腫瘍微小環境におけるＭ１／Ｍ２マクロファージの比率が高いことは、大腸癌患者の予後の改善と相関していることも報告されている。そのため、Ｍ２マクロファージをＭ１表現型に再分極させる治療法は、腫瘍治療に有益であると考えられる。
【0004】
２６アミノ酸のペプチドである血管作動性腸管ペプチド（ＶＩＰ）は、腫瘍細胞や免疫細胞から放出され、免疫機能を調節する役割を果たしている。ＶＩＰが強力な抗炎症性サイトカイン活性を持ち、炎症反応を抑制することはよく知られている。ＶＩＰは、その受容体であるＶＩＰＲ１及びＶＩＰＲ２（別名ＶＰＡＣ１及びＶＰＡＣ２）を介して、マウスやヒトのマクロファージにおいて、ＬＰＳ培養後に抗炎症性サイトカイン遺伝子の発現を活性化し、逆に炎症性サイトカイン遺伝子の発現を抑制する。また、ウイルス感染症やリンパ腫モデルにおいても、ＶＩＰシグナルを阻害することでＣＤ８陽性Ｔ細胞の増殖と機能が促進され、良好な予後が得られることがいくつかの証拠によって示されている。しかし、腫瘍モデルにおけるマクロファージの分極と機能に対するＶＩＰＲ１とＶＩＰＲ２の役割については、まだ不明である。
【0005】
一方、本発明者らは、新規なＶＩＰＲ２アンタゴニストペプチド群を見出し、これらについて開示している（非特許文献１及び特許文献１参照）。その中の代表的な二環性ペプチドであるＫＳ－１３３（非特許文献２に開示。後述する実施例ではＳｅｑ－１０（配列番号２）と称する。）は、精神疾患モデルマウスにおける認知機能の低下を抑制することも報告している（非特許文献２参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0006】
【文献】Ｓａｋａｍｏｔｏ Ｋ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ（２０１８），５０３：１９７３－１９７９．
【文献】Ｓａｋａｍｏｔｏ Ｋ ｅｔ ａｌ．Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ（２０２１），１２：７５１５８
【特許文献】
【0007】
【文献】国際公開ＷＯ２０２１／２００２５９号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
本発明が解決しようとする課題は、例えば、腫瘍関連マクロファージの分極と機能に対するＶＩＰＲ２シグナルの役割とそのメカニズムを調べることにより、新規な癌免疫増強手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明は、上記課題を解決するためになされたものであって、ＶＩＰアンタゴニストが、少なくともＶＩＰＲ２を介して、癌に対するマクロファージの機能を高める役割を果たしているという発見に基づき、創作された。すなわち、本発明は、ＶＩＰＲ２の機能を阻害することにより腫瘍関連マクロファージの腫瘍抑制分極（Ｍ１分極）を促進する手段を提供するものであり、具体的には以下の実施形態を含む。
【0010】
式（１）：
ｃ［Ｘ１－Ｐｒｏ２－Ｘ３－Ｔｙｒ４－Ｌｅｕ５－Ｐｒｏ６－ｃ（Ｘ７－Ｘ８－Ｌｅｕ９－Ｃｙｓ１０］－Ｘ１１）－Ｘ１２－Ｘ１３ （１）
（式中、Ｘ１は、システイン、Ｍｐａ（３－メルカプトプロピオン酸）又はＤ体システインを表し、Ｘ３は、Ｎ－メチル化グリシン、Ｎ－メチル化アラニン、２－アゼチジン－２－カルボン酸、プロリン、ヒドロキシプロリン、３，４－デヒドロプロリン、ピペコリン酸、セリン又はリジンを表し、Ｘ８は、チロシン、プロリン又はアルギニンを表し、Ｘ７及びＸ１１は、リジンとアスパラギン酸、オルニチンとグルタミン酸、アスパラギン酸とリジン、グルタミン酸とオルニチン、リジンとグルタミン酸、又はグルタミン酸とリジンのいずれかの組み合わせを表し、Ｘ１２及びＸ１３は、それぞれ独立にロイシン、イソロイシン又はノルロイシンを表し、Ｘ１とＣｙｓ１０は、それぞれの側鎖の間でジスルフィド結合を形成し、Ｘ７とＸ１１は、それぞれの側鎖の間でアミド結合を形成し、それによって式（１）のペプチドは分子内に２つの環状構造を有し、Ｎ末端アミノ基及びＣ末端カルボキシ基は、修飾されていても欠失していてもよい。）で表されるアミノ酸配列からなる環状ペプチド、その誘導体若しくは修飾体又は薬理学的に許容されるそれらの塩を含む、癌免疫増強のための組成物。
ｃ［Ｘ１－Ｐｒｏ２－Ｘ３－Ｔｙｒ４－Ｌｅｕ５－Ｐｒｏ６－ｃ（Ｘ７－Ｘ８－Ｌｅｕ９－Ｃｙｓ１０］－Ｘ１１）－Ｘ１２－Ｘ１３ （１）
（式中、Ｘ１は、システイン、Ｍｐａ（３－メルカプトプロピオン酸）又はＤ体システインを表し、Ｘ３は、Ｎ－メチル化グリシン、Ｎ－メチル化アラニン、２－アゼチジン－２－カルボン酸、プロリン、ヒドロキシプロリン、３，４－デヒドロプロリン、ピペコリン酸、セリン又はリジンを表し、Ｘ８は、チロシン、プロリン又はアルギニンを表し、Ｘ７及びＸ１１は、リジンとアスパラギン酸、オルニチンとグルタミン酸、アスパラギン酸とリジン、グルタミン酸とオルニチン、リジンとグルタミン酸、又はグルタミン酸とリジンのいずれかの組み合わせを表し、Ｘ１２及びＸ１３は、それぞれ独立にロイシン、イソロイシン又はノルロイシンを表し、Ｘ１とＣｙｓ１０は、それぞれの側鎖の間でジスルフィド結合を形成し、Ｘ７とＸ１１は、それぞれの側鎖の間でアミド結合を形成し、それによって式（１）のペプチドは分子内に２つの環状構造を有し、Ｎ末端アミノ基及びＣ末端カルボキシ基は、修飾されていても欠失していてもよい。）で表されるアミノ酸配列からなる環状ペプチド、その誘導体若しくは修飾体又は薬理学的に許容されるそれらの塩を含む、癌免疫増強のための組成物。
【0011】
上記式（１）の環状ペプチドにおいて、Ｘ１が、システインを表し、Ｘ３が、プロリン又はセリンを表し、Ｘ７が、リジンを表し、Ｘ８が、チロシンを表し、Ｘ１１が、アスパラギン酸を表し、Ｘ１２及びＸ１３が、それぞれ独立にロイシン、イソロイシン又はノルロイシンを表し、Ｎ末端アミノ基がアセチル化され、Ｃ末端カルボキシ基がアミド化されていることが好ましい。
【0012】
当該組成物は、腫瘍関連マクロファージの腫瘍抑制分極（Ｍ１分極）を促進すること、すなわち、Ｍ１／Ｍ２マクロファージ比を増加させるために用いることが好ましく、固形癌、例えば、免疫チェックポイント阻害剤を用いて治療等を行おうとしている対象の癌（大腸癌など）の治療に用いることができる。
【発明の効果】
【0013】
本発明の組成物によれば、例えば、ＶＩＰＲ２の機能を阻害することにより腫瘍関連マクロファージの腫瘍抑制分極（Ｍ１分極）を促進し、新規な癌免疫増強の手段を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【図1】図１は、マウス大腸癌細胞株ＣＴ２６の培養上清（ＣＴ２６－ＣＭ）がマウスのマクロファージであるＲＡＷ２６４．７細胞のＭ２マクロファージへの分極とＶＩＰＲ１及びＶＩＰＲ２（別名ＶＰＡＣ１及びＶＰＡＣ２）の発現に与える影響を評価した結果である。（Ａ）はＭ１マクロファージマーカー；（Ｂ）はＭ２マクロファージマーカー；（Ｃ）は免疫チェックポイントマーカー；（Ｄ）はＶＩＰＲ１及びＶＩＰＲ２の遺伝子発現（Relative gene expression:相対的遺伝子発現）をリアルタイムＰＣＲで評価した結果である。（Ｅ）は対照培地又はＣＴ２６－ＣＭで培養して４日目のＲＡＷ２６４．７細胞におけるＶＩＰＲ１及びＶＩＰＲ２のタンパク質発現レベルを示す代表的なウェスタンブロット画像である。
【図2】図２は、ＶＩＰＲ１及びＶＩＰＲ２の両方に作用するアンタゴニストが、ＣＴ２６－ＣＭで培養したＲＡＷ２６４．７細胞の分極に与える影響を評価した結果である。（Ａ）はＭ１マクロファージマーカー；（Ｂ）はＭ２マクロファージマーカー；（Ｃ）は免疫チェックポイントマーカーの相対的遺伝子発現(Relative gene expression)の結果である。（Ｄ）マクロファージの貪食作用；（Ｅ）マクロファージの貪食作用の％表記(Phagocytosis (% gate))である。
【図3】図３は、ＶＩＰＲ１及びＶＩＰＲ２の両方に作用するアンタゴニストが、Ｔ細胞とＢ細胞を欠く免疫不全ＳＣＩＤマウスにおいて、皮下に移植されたマウス大腸癌細胞株ＣＴ２６の増殖を抑制することを示す結果である。（Ａ）腫瘍の体積(Tumor volume)；（Ｂ）Ｍ１マクロファージの存在率(M1 macrophage (%CD45))、（Ｃ）Ｍ２マクロファージの存在率(M2 macrophage (%CD45)、（Ｄ）ＮＫ細胞の存在率(NK cells (%CD45))、（Ｅ）Ｍ１／Ｍ２のＴＡＭ比率(M1/M2 ratio (normalized to control))；（Ｆ）マクロファージの貪食作用(Phagocytosis (%CD45))である。
【図4】図４は、ＶＩＰＲ１及びＶＩＰＲ２の両方に作用するアンタゴニストを単独又はマウス抗ＰＤ－１抗体と併用で皮下投与した時、Ｔ細胞とＢ細胞を欠く免疫不全ＳＣＩＤマウスにおいて、皮下に移植されたマウス大腸癌細胞株ＣＴ２６の増殖を抑制することを示す結果である。（Ａ）腫瘍の体積(Tumor volume)；（Ｂ）Ｍ１マクロファージ(M1 macrophade)の存在率、（Ｃ）Ｍ２マクロファージ(M2 macrophage)の存在率、（Ｄ）Ｍ１／Ｍ２のＴＡＭ比率(M1/M2 ratio (normalized to control))、（Ｅ）ＮＫ細胞(NK cells)存在率、（Ｆ）マクロファージの貪食作用(Phagocytosis (%CD45))である。
【図5-1】図５－１は、ＶＩＰＲ１又はＶＩＰＲ２の発現を各ｓｉＲＮＡでノックダウンした時（Ａ～Ｃ）のマクロファージの分極（Relative gene expression:相対的遺伝子発現）を示す結果である。
【図5-2】図５－２は、ＶＩＰＲ１又はＶＩＰＲ２の発現を各ｓｉＲＮＡでノックダウンした時（Ｄ）又はＶＩＰＲ２選択的なアゴニストであるＢＡＹ５５－９８３７で活性化した時（Ｅ）のマクロファージの分極（Relative gene expression:相対的遺伝子発現）を示す結果である。
【図7】図７は、対照群及びＶＩＰハイブリッド群から分離した腫瘍浸潤性白血球（ＴＩＬ）におけるＰＤ－１＋マクロファージのフローサイトメトリー解析（ｎ＝４－５／群）の結果である。データは平均±ＳＥＭで表した。
【図8】図８は、ＶＩＰＲ２選択的なアンタゴニストＫＳ－１３３が、ＣＴ２６－ＣＭで培養したＲＡＷ２６４．７細胞の分極に与える影響を評価した結果である。（Ａ）はＭ１マクロファージマーカー；（Ｂ）はＭ２マクロファージマーカーの相対的遺伝子発現(Relative gene expression)である。
【発明を実施するための形態】
【0015】
次に、本発明の各実施形態について、図面を参照して説明する。なお、以下に説明する各実施形態は、特許請求の範囲に係る発明を限定するものではなく、また、各実施形態の中で説明されている諸要素及びその組み合わせの全てが本発明の解決手段に必須であるとは限らない。
【0016】
（定義）
本明細書においてペプチドは、２つ以上のアミノ酸がアミド結合（ペプチド結合）で結合しているものを指し、例えば２～２０アミノ酸がアミド結合したものとすることができる。また、ペプチド標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシ末端）である。ペプチド結合を形成するカルボニル基に隣接する１番目の炭素原子をＣα炭素と称する。
本明細書においてペプチドは、２つ以上のアミノ酸がアミド結合（ペプチド結合）で結合しているものを指し、例えば２～２０アミノ酸がアミド結合したものとすることができる。また、ペプチド標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシ末端）である。ペプチド結合を形成するカルボニル基に隣接する１番目の炭素原子をＣα炭素と称する。
【0017】
本明細書において「任意のアミノ酸、又はその誘導体」は、その最も広い意味で用いられ、天然アミノ酸に加え、非天然構造を有する人工のアミノ酸、アミノ酸の特徴である当業界で公知の特性を有する化学的に合成された化合物、さらに官能基を有するカルボン酸も含む。非天然アミノ酸の例として、Ｄ体アミノ酸、主鎖の構造が天然型と異なるα／α－二置換アミノ酸（２－アミノイソ酪酸といったα－メチル化アミノ酸など）、Ｎ－アルキル－アミノ酸（Ｎ－メチル化アミノ酸など）、Ｎ－置換グリシン（ペプトイド）、主鎖が伸長しているアミノ酸（βホモアミノ酸やγホモアミノ酸）、側鎖の構造が天然型と異なるアミノ酸（シクロヘキシルアラニンやアリルグリシンや２－（２－ピリジル）－グリシンや３－（１Ｈ－ベンゾイミダゾール－２－イル）－アラニンなど）、側鎖の一部が置換されているアミノ酸（ノルロイシンやジアミノプロパン酸や３－（２－ピリジル）－アラニンなど）、側鎖に余分の官能基を有するアミノ酸；側鎖に余分のＣやアルキル基やメチル基を有するアミノ酸（ホモノルロイシンやγ－メチルロイシンなど）、側鎖にハロゲン原子（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）を有するアミノ酸（３－クロロ－アラニンなど）、側鎖にハロゲン原子（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）を有するカルボン酸（３－クロロプロパン酸など）、側鎖に官能基を有するカルボン酸（３－ブテン酸など）、側鎖に余分のＮやアミノ基を有するアミノ酸（β－アジドアラニンやオルニチンなど）、側鎖に余分のＯやメトキシ基を有するアミノ酸（Ｏ－メチル－セリンやＯ－メチル－スレオニンなど）、側鎖に余分のヒドロキシ基を有するアミノ酸（３－ヒドロキシ－フェニルアラニンなど）、側鎖に余分のカルボキシ基（－ＣＯＯＨ）を有するアミノ酸（３－カルボキシ－フェニルアラニンなど）、側鎖に余分のＳを有するアミノ酸（エチオニンなど）、側鎖中のカルボン酸官能基がエステルで保護されているアミノ酸（アスパラギン酸－４－メチルエステルなど）、側鎖のチオ基（－Ｓ－）が酸化されてスルフィニル基（－Ｓ（＝Ｏ）－）やスルホニル基（－Ｓ（＝Ｏ）２－）に変換されているアミノ酸（メチオニンスルホキシド）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【0018】
本明細書において、「ＶＩＰＲ２」はマウス、ラット、イヌ、サル、ヒトなどの哺乳類のタンパク質、「血管作動性腸管ペプチド受容体２」を意味する。
【0019】
本明細書において、「癌免疫」は、典型的には、癌細胞（腫瘍細胞）に対する免疫機構を意味する。宿主の免疫機構は癌細胞を認識して、排除することが可能である。癌免疫には細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）や液性免疫などの獲得免疫系だけでなく、ＮＫ細胞やＮＫＴ細胞、マクロファージ、顆粒球などの自然免疫も関与しており、癌の成長を抑制できることが知られている。好ましい実施形態における「癌免疫」には、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）の制御が挙げられる。マクロファージは食細胞の1つで骨髄や末梢血に由来し、侵入した病原微生物や異常細胞を貪食して退治するが、癌微小環境にいるマクロファージはその環境で性質が変わり、宿主免疫を活性化して抗腫瘍活性を有するＭ１型マクロファージと、免疫や炎症の抑制や創傷治癒、組織リモデリング、血管新生、腫瘍成長促進等の機能を有するＭ２型マクロファージに分極している。Ｍ１型とＭ２型は決定的なものでなく、サイトカイン（細胞間の情報伝達ホルモンのようなもの）などの刺激で移行しあうことが分かっている。本実施形態の癌免疫は、Ｍ２型からＭ１型へのマクロファージ分極を促進することが好ましい。ある特定の実施形態では、Ｍ１マクロファージは、Ｍ２マクロファージと比較して、ＩＮＦγ、ＩＬ－１２、ＩＬ－２３、ＴＮＦα、ＩＬ－６、ＩＬ－１、ＣＳＣＬ９、ＣＸＣＬ１０及びＣＸＣＬ１１からなる群から選択される炎症性サイトカイン及びケモカインの増加した分泌を呈する。ある特定の実施形態では、Ｍ１マクロファージは、Ｍ２マクロファージと比較して、ＩＬ－１０、ＴＧＦβ、ＰＧＥ２、ＣＣＬ２、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ２２及びＣＣＬ２４からなる群から選択される免疫抑制性サイトカイン及びケモカインの減少した分泌を呈する。ある特定の実施形態では、Ｍ１マクロファージは、Ｍ２マクロファージと比較して、増加した腫瘍関連抗原を発現する。ある特定の実施形態では、Ｍ１マクロファージは、Ｍ２マクロファージと比較して、ＣＤ８＋Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞の刺激を増加させる。
【0020】
（環状ペプチド）
本発明の１つの有効成分である環状ペプチドは特許文献１に開示されており、その内容は全て参照により本願に組み込まれるものとする。特許文献１に開示されたペプチドは、非特許文献１に開示されたＶＩｐｅｐ－３のＶＩＰＲ２結合活性にかかわる特徴（ファーマコフォア）を維持又は増強しつつ、二環状化により安定化されたものである。これらの文献に開示されたペプチドはいずれも本発明の新規用途に用いることが可能である。
本発明の１つの有効成分である環状ペプチドは特許文献１に開示されており、その内容は全て参照により本願に組み込まれるものとする。特許文献１に開示されたペプチドは、非特許文献１に開示されたＶＩｐｅｐ－３のＶＩＰＲ２結合活性にかかわる特徴（ファーマコフォア）を維持又は増強しつつ、二環状化により安定化されたものである。これらの文献に開示されたペプチドはいずれも本発明の新規用途に用いることが可能である。
【0021】
これらの環状ペプチドの中でも、癌免疫増強のために特に適した実施形態の環状ペプチドは、下記式（１）：
ｃ［Ｘ１－Ｐｒｏ２－Ｘ３－Ｔｙｒ４－Ｌｅｕ５－Ｐｒｏ６－ｃ（Ｘ７－Ｘ８－Ｌｅｕ９－Ｃｙｓ１０］－Ｘ１１）－Ｘ１２－Ｘ１３ （１）で表されるアミノ酸配列からなる。
式（１）において、Ｘ１は、システイン、Ｍｐａ（３－メルカプトプロピオン酸）又はＤ体システインを表し、Ｘ３は、Ｎ－メチル化グリシン、Ｎ－メチル化アラニン、２－アゼチジン－２－カルボン酸、プロリン、ヒドロキシプロリン、３，４－デヒドロプロリン、ピペコリン酸、セリン又はリジンを表し、Ｘ８は、チロシン、プロリン又はアルギニンを表し、Ｘ７及びＸ１１は、リジンとアスパラギン酸、オルニチンとグルタミン酸、アスパラギン酸とリジン、グルタミン酸とオルニチン、リジンとグルタミン酸、又はグルタミン酸とリジンのいずれかの組み合わせを表し、Ｘ１２及びＸ１３は、それぞれ独立にロイシン、イソロイシン又はノルロイシンを表し、Ｘ１とＣｙｓ１０は、それぞれの側鎖の間でジスルフィド結合を形成し、Ｘ７とＸ１１は、それぞれの側鎖の間でアミド結合を形成し、それによって式（１）のペプチドは分子内に２つの環状構造を有し、Ｎ末端アミノ基及びＣ末端カルボキシ基は、修飾されていても欠失していてもよい。
ｃ［Ｘ１－Ｐｒｏ２－Ｘ３－Ｔｙｒ４－Ｌｅｕ５－Ｐｒｏ６－ｃ（Ｘ７－Ｘ８－Ｌｅｕ９－Ｃｙｓ１０］－Ｘ１１）－Ｘ１２－Ｘ１３ （１）で表されるアミノ酸配列からなる。
式（１）において、Ｘ１は、システイン、Ｍｐａ（３－メルカプトプロピオン酸）又はＤ体システインを表し、Ｘ３は、Ｎ－メチル化グリシン、Ｎ－メチル化アラニン、２－アゼチジン－２－カルボン酸、プロリン、ヒドロキシプロリン、３，４－デヒドロプロリン、ピペコリン酸、セリン又はリジンを表し、Ｘ８は、チロシン、プロリン又はアルギニンを表し、Ｘ７及びＸ１１は、リジンとアスパラギン酸、オルニチンとグルタミン酸、アスパラギン酸とリジン、グルタミン酸とオルニチン、リジンとグルタミン酸、又はグルタミン酸とリジンのいずれかの組み合わせを表し、Ｘ１２及びＸ１３は、それぞれ独立にロイシン、イソロイシン又はノルロイシンを表し、Ｘ１とＣｙｓ１０は、それぞれの側鎖の間でジスルフィド結合を形成し、Ｘ７とＸ１１は、それぞれの側鎖の間でアミド結合を形成し、それによって式（１）のペプチドは分子内に２つの環状構造を有し、Ｎ末端アミノ基及びＣ末端カルボキシ基は、修飾されていても欠失していてもよい。
【0022】
さらに好ましい実施形態の環状ペプチドは、上記式（１）において、Ｘ１が、システインを表し、Ｘ３が、プロリン又はセリンを表し、Ｘ７が、リジンを表し、Ｘ８が、チロシンを表し、Ｘ１１が、アスパラギン酸を表し、そして、Ｘ１２及びＸ１３が、それぞれ独立にロイシン、イソロイシン又はノルロイシンを表す。Ｎ末端アミノ基はアセチル化され、Ｃ末端カルボキシ基はアミド化されている。
【0023】
上記式（１）に含まれる個々の環状ペプチドとしては、例えば、以下のような例を挙げることができる。
ｃ（Ｍｐａ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｔｙｒ－Ｌｅｕ－Ｐｒｏ－ｃ［Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｌｅｕ－Ｃｙｓ）－Ａｓｐ］－Ｌｅｕ－Ｉｌｅ－ＮＨ２（配列番号１）
Ａｃ－ｃ［Ｃｙｓ１－Ｐｒｏ２－Ｐｒｏ３－Ｔｙｒ４－Ｌｅｕ５－Ｐｒｏ６－ｃ（Ｌｙｓ７－Ｔｙｒ８－Ｌｅｕ９－Ｃｙｓ１０］－Ａｓｐ１１）－Ｌｅｕ１２－Ｉｌｅ１３－ＮＨ２（配列番号２）及び特許文献１の段落００５６から段落００５９に記載されたペプチドである。
ｃ（Ｍｐａ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｔｙｒ－Ｌｅｕ－Ｐｒｏ－ｃ［Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｌｅｕ－Ｃｙｓ）－Ａｓｐ］－Ｌｅｕ－Ｉｌｅ－ＮＨ２（配列番号１）
Ａｃ－ｃ［Ｃｙｓ１－Ｐｒｏ２－Ｐｒｏ３－Ｔｙｒ４－Ｌｅｕ５－Ｐｒｏ６－ｃ（Ｌｙｓ７－Ｔｙｒ８－Ｌｅｕ９－Ｃｙｓ１０］－Ａｓｐ１１）－Ｌｅｕ１２－Ｉｌｅ１３－ＮＨ２（配列番号２）及び特許文献１の段落００５６から段落００５９に記載されたペプチドである。
【0024】
本発明に係るペプチドは、上記式（１）で表されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、付加、及び／又は置換された相同性を有するペプチドであっても、ＶＩＰＲ２に対する結合活性を有するものは包含する。本明細書において、「１～数個のアミノ酸が欠失、付加、及び／又は置換されているペプチド」という場合、それらのアミノ酸の個数は、そのペプチドがＶＩＰＲ２結合活性を有する限りは特に限定されないが、好ましくは１～５個、さらに好ましくは１個若しくは２個である。欠失、付加、及び／又は置換されている場所は、ペプチドの末端であっても、中間であってもよく、１ヶ所であっても２ヶ所以上であってもよい。
【0025】
このような上記アミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が欠失、付加、及び／又は置換されたアミノ酸配列として、前記アミノ酸配列と、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ ａｔ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（米国国立生物学情報センターの基本ローカルアラインメント検索ツール））等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータを用いて）を用いて計算したときに、少なくとも５０％以上、好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、特に好ましくは９０％以上の相同性を有しているものが挙げられる。
【0026】
本発明に係るペプチドは、本発明の課題を解決するものである限り、その種々の誘導体、及び／又は修飾体も包含する。係る誘導体としては、ペプチドの飽和脂肪鎖が不飽和脂肪鎖に置換されているもの、ペプチドの原子の一部が放射性または非放射性の同位体原子を含む他の原子に置換されているもの、ペプチドのアミド結合がチオアミド結合（－ＮＨ－Ｃ（＝Ｓ）－）に置換されているもの、ペプチドのアミド結合がアルケン（－Ｃ＝Ｃ－）に置換されているもの、ペプチドのアミド結合がアルキル（－Ｃ－Ｃ－）に置換されているもの、ペプチドのアミド結合がヒドロキシエチレン（－Ｃ（－ＯＨ）－Ｃ－）に置換されているもの、ペプチドのアミド結合がエステル（－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－）に置換されているもの、ペプチドのアミド結合がアルケン（－Ｃ＝Ｃ－）に置換されているもの、ペプチドのアミド結合が（－Ｃ－ＮＨ－）に置換されているもの、又はペプチドのアミド結合が（－Ｃ（＝Ｏ）－Ｃ－）に置換されているものなどが挙げられ、係る修飾体としては、ペプチドのα位炭素が二置換されているもの、ペプチドのアミド結合がＮ－アルキル化されているもの、ペプチドの官能基の一部がハロゲン化、シアノ化、ニトロ化、オキソ化、ヒドロキシ化、アミノ化、デアミノ化、デヒドロ化、アミド化、アセチル化、メトキシ化、プレニル化、アルキル化などの修飾を受けているもの（例えば、ペプチドのアミノ基の一部がアセチル化、ホルミル化、ミリストイル化、パルミトイル化、ピログルタミン酸化、アルキル化又はデアミノ化されているもの、ペプチドのカルボキシ基の一部がＮ－ピロリジニル化やＮ－ピペリジニル化されていたり、アミド（アミド、メチルアミド、エチルアミド、ｐ－ニトロアニリド、β－ナフチルアミド等）やエステル（メチルエステル、エチルエステル、チオエステル等）になっているものなど）、ペプチドのＳがスルホキシドＳ（＝Ｏ）又はスルホンＳ（＝Ｏ）２になっているもの、ペプチドがケミカルリンカーを介して多量体化しているもの、ペプチドがビオチン標識化されているもの、ペプチドが蛍光標識化されているもの、ペプチドが発光標識化されているもの、さらにはアルキル鎖、ポリエチレングリコール、抗体、レクチン類、糖鎖、酵素、膜透過性ペプチド、低分子化合物、又はタンパク質のユビキチン化を誘導する分子などとペプチドを融合させたもの等が挙げられるが、これらに限定されない。
【0027】
本発明に係るペプチドは、ペプチドの塩も包含する。ペプチドの塩としては、生理学的に許容される塩基や酸との塩が用いられ、例えば、無機酸（塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、リン酸等）の付加塩、有機酸（ｐ－トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、シュウ酸、ｐ－ブロモフェニルスルホン酸、カルボン酸、コハク酸、クエン酸、安息香酸、酢酸等）の付加塩、無機塩基（水酸化アンモニウム、又はアルカリ、若しくはアルカリ土類金属水酸化物、炭酸塩、重炭酸塩等）、アミノ酸の付加塩等が挙げられる。
【0028】
本発明に係るペプチドは、プロドラッグであってもよい。プロドラッグは、生体内における生理条件下で酵素や胃酸などによる反応によって本発明に係るペプチドに変換される化合物、すなわち酵素的に酸化、還元、加水分解などを起こして本発明に係るペプチドに変化する化合物、胃酸などにより加水分解などを起こして本発明に係るペプチドに変化する化合物をいう。
【0029】
本発明に係るペプチドのプロドラッグとしては、本発明に係るペプチドのアミノ基がアシル化、アルキル化またはリン酸化された化合物（例えば、本発明に係るペプチドのアミノ基がエイコサノイル化、アラニル化、ペンチルアミノカルボニル化、（５－メチル－２－オキソ－１，３－ジオキソレン－４－イル）メトキシカルボニル化、テトラヒドロフラニル化、ピロリジルメチル化、ピバロイルオキシメチル化、又はｔｅｒｔ－ブチル化された化合物）、本発明に係るペプチドのヒドロキシ基がアシル化、アルキル化、リン酸化、又はホウ酸化された化合物（例えば、本発明に係るペプチドのヒドロキシ基がアセチル化、パルミトイル化、プロパノイル化、ピバロイル化、スクシニル化、フマリル化、アラニル化、又はジメチルアミノメチルカルボニル化された化合物）、本発明に係るペプチドのヒドロキシ基やカルボキシ基がエステル化、又はアミド化された化合物（例えば、本発明に係るペプチドのヒドロキシ基やカルボキシ基がＣ１－６アルキルエステル化、フェニルエステル化、カルボキシメチルエステル化、ジメチルアミノメチルエステル化、ピバロイルオキシメチルエステル化、エトキシカルボニルオキシエチルエステル化、フタリジルエステル化、（５－メチル－２－オキソ－１，３－ジオキソレン－４－イル）メチルエステル化、シクロヘキシルオキシカルボニルエチルエステル化、又はメチルアミド化された化合物）などが挙げられるが、これらに限定されない。これらの化合物は自体公知の方法によって本発明に係るペプチドから製造することができる。
【0030】
本発明に係るペプチドのプロドラッグは、広川書店１９９０年刊「医薬品の開発」第７巻分子設計１６３～１９８頁に記載されているような生理的条件で本発明に係るペプチドに変化するものであってもよい。
【0031】
本明細書において、プロドラッグは塩を形成していてもよく、係る塩としては、本発明に係るペプチドの塩として例示したものが挙げられる。
【0032】
本発明に係るペプチドは、結晶であってもよく、結晶形が単一であっても結晶形混合物であっても本発明に係るペプチド本発明に係るペプチドに包含される。結晶は、自体公知の結晶化法を適用して、結晶化することによって製造することができる。
【0033】
本発明に係るペプチドは、薬学的に許容され得る共結晶や共結晶塩であってもよい。ここで共結晶、又は共結晶塩とは、各々が異なる物理的特性（例えば、構造、融点、融解熱、吸湿性、溶解性及び安定性等）を持つ、室温で二種、又はそれ以上の独特な固体から構成される結晶性物質を意味する。共結晶、又は共結晶塩は、自体公知の共結晶化法に従い製造することができる。
【0034】
（環状ペプチドを含む組成物）
本発明の１つの有効成分としての環状ペプチド、その誘導体若しくは修飾体は、医薬、診断薬、研究用試薬として組成物の形態で使用することが可能である。組成物（例えば、医薬組成物）の投与形態は特に限定されず、経口的投与でも非経口的投与でもよい。非経口投与としては、例えば、経粘膜投与（経鼻、経口腔、経眼、経肺、経膣、又は経直腸投与）、注射投与（静脈内注射、皮下注射、筋肉内注射等）、経皮投与等が挙げられる。組成物中のペプチドは、代謝及び排泄されやすい性質に鑑みて、各種の修飾を行うことができる。例えば、ペプチドにアルキル鎖、ポリエチレングリコール、又は糖鎖などを付加することで、血中滞留時間を長くする、抗原性を低下させることができる。また、ポリ乳酸・グリコール（ＰＬＧＡ）などの生体内分解性の高分子化合、多孔性ヒドロキシアパタイト、リポソーム、表面修飾リポソーム、不飽和脂肪酸で調製したエマルジョン、ナノパーティクル、ナノスフェア等を徐放化基剤として用い、これにペプチドを内包させてもよい。経皮投与する場合、弱い電流を皮膚表面に流して角質層を透過させることもできる（イオントフォレシス法）。
本発明の１つの有効成分としての環状ペプチド、その誘導体若しくは修飾体は、医薬、診断薬、研究用試薬として組成物の形態で使用することが可能である。組成物（例えば、医薬組成物）の投与形態は特に限定されず、経口的投与でも非経口的投与でもよい。非経口投与としては、例えば、経粘膜投与（経鼻、経口腔、経眼、経肺、経膣、又は経直腸投与）、注射投与（静脈内注射、皮下注射、筋肉内注射等）、経皮投与等が挙げられる。組成物中のペプチドは、代謝及び排泄されやすい性質に鑑みて、各種の修飾を行うことができる。例えば、ペプチドにアルキル鎖、ポリエチレングリコール、又は糖鎖などを付加することで、血中滞留時間を長くする、抗原性を低下させることができる。また、ポリ乳酸・グリコール（ＰＬＧＡ）などの生体内分解性の高分子化合、多孔性ヒドロキシアパタイト、リポソーム、表面修飾リポソーム、不飽和脂肪酸で調製したエマルジョン、ナノパーティクル、ナノスフェア等を徐放化基剤として用い、これにペプチドを内包させてもよい。経皮投与する場合、弱い電流を皮膚表面に流して角質層を透過させることもできる（イオントフォレシス法）。
【0035】
上記の組成物は、有効成分をそのまま用いてもよいし、薬学的に許容できる担体、賦形剤、添加剤等を加えて製剤化してもよい。剤形としては、例えば、液剤（注射剤など）、分散剤、懸濁剤、錠剤、丸剤、粉末剤、坐剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、トローチ剤、吸入剤、軟膏剤、点眼剤、点鼻剤、点耳剤、パップ剤等が挙げられる。これらの製剤は、速放性製剤又は徐放性製剤等の放出制御製剤（徐放性マイクロカプセルなど）であってもよい。製剤化は、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、溶解剤、溶解補助剤、着色剤、矯味矯臭剤、安定化剤、乳化剤、吸収促進剤、界面活性剤、ｐＨ調整剤、防腐剤、抗酸化剤などを適宜使用し、常法により行うことができる。製剤化に用いられる成分の例としては、精製水、食塩水、リン酸緩衝液、デキストロース、グリセロール、エタノール等の薬学的に許容される有機溶剤、動植物油、乳糖、マンニトール、ブドウ糖、ソルビトール、結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、デンプン、コーンスターチ、無水ケイ酸、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ぺクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、トラ癌ト、カゼイン、寒天、ポリエチレングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ワセリン、パラフィン、ミリスチン酸オクチルドデシル、ミリスチン酸イソプロピル、高級アルコール、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン等が挙げられるが、これらに限定されない。ペプチドが経粘膜吸収されにくい場合は、難吸収性薬物の吸収を改善する吸収促進剤として、ポリオキシエチレンラウリルエーテル類、ラウリル硫酸ナトリウム、サポニン等の界面活性剤；グリココール酸、デオキシコール酸、タウロコール酸等の胆汁酸塩；ＥＤＴＡ、サリチル酸類等のキレート剤；カプロン酸、カプリン酸、ラウリン酸、オレイン酸、リノール酸、混合ミセル等の脂肪酸類；エナミン誘導体、Ｎ－アシルコラーゲンペプチド、Ｎ－アシルアミノ酸、シクロデキストリン類、キトサン類、一酸化窒素供与体等を用いてもよい。
【0036】
丸剤又は錠剤は、糖衣、胃溶性、腸溶性物質で被覆することもできる。注射剤は、注射用蒸留水、生理食塩水、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、アルコール類等を含むことができる。さらに、湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤、溶解剤、溶解補助剤、防腐剤等を加えることができる。必要に応じ、通常の防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤、吸着剤、湿潤剤等の添加物を適宜、適量用いることもできる。
【0037】
本発明の組成物は、癌免疫増強作用を有することから、癌の治療に特に適している。特に腫瘍微小環境に存在する腫瘍関連マクロファージの集団がＭ２型に偏向している場合に、このマクロファージ集団をＭ１型に分極させるために用いることが好ましい。例えば、マクロファージのＭ１型への分極を生体外で行い、同Ｍ１型マクロファージを生体に戻してもよい。本明細書において「癌」とは、当技術分野でその一般的な意味を有し、全タイプの癌を意味する。癌の非限定的な例は、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、肝臓癌、肺癌、膀胱癌、膵臓癌又は大腸癌、肉腫、リンパ腫、黒色腫、白血病、胚細胞癌及び芽細胞腫などの癌腫又は腺癌である。特に、癌は固形癌でも非固形癌でもよいが、癌微小環境の発達した固形癌が好ましく、中でも大腸癌が特に好ましい。
【0038】
本発明において、「癌免疫増強」は、例えば、癌に対して免疫による攻撃力を高めること、癌によってブレーキがかかった免疫の攻撃力を回復させること（免疫チェックポイント阻害療法など）、である。本発明の組成物において、当該更なる癌免疫増強を発揮させるために、本発明に係るペプチド以外にも、例えば免疫チェックポイント阻害薬などを更に併用等（組成物に含有することも含む）することもできる。免疫チェックポイント阻害剤は、例えば、ＰＤ－１阻害薬（ニボルマブ（オプジーボ）、ペムブロリズマブ（キイトルーダ）など）、CTLA-４阻害薬（イピリムマブ（ヤーボイ）など）、PD-L１阻害剤（アベルマブ（バベンチオ）、アテゾリズマブ（テセントリク）、アベルマブ（バベンチオ）など）、が挙げられる。
【0039】
本発明の組成物は、上記疾患に有用な各種の化学療法、外科的治療、放射線療法といった他の医薬や治療法と組み合わせて併用してもよい。
【0040】
本発明の組成物を哺乳類（例えば、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、ウマ、サル、ブタ等）、特にヒトに投与する場合の投与量は、症状、患者の年齢、性別、体重、感受性差、投与方法、投与間隔、有効成分の種類、製剤の種類によって異なり、特に限定されないが、例えば、３０μｇ～１０００ｍｇ、１００μｇ～５００ｍｇ、１００μｇ～１００ｍｇを１回、又は数回に分けて投与することができる。
【0041】
以下に示す実施例は、単なる例示であって、上述した実施形態と共に本発明を詳細に説明することのみを意図しており、本発明を限定するものではない。当業者は、本発明の意義を逸脱することなく様々な態様に本発明を変更することができ、係る変更も本発明の範囲に含まれる。
【実施例】
【0042】
（ペプチド合成）
本実施例に使用した全てのペプチドの化学合成は、株式会社スクラム（東京、日本）に委託し、９－フルオレニルメトキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ基）をαアミノ基の保護基として用いる標準的な固相合成法を自動合成機ＳｙｒｏＩＩ（Ｂｉｏｔａｇｅ社製）で実施した。Ｃ末端に位置する側鎖保護アミノ酸－レジンを合成カラムに入れて、装置をセットした。続いて、Ｆｍｏｃ基で保護した次アミノ酸に１－［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］－１Ｈ－１，２，３－トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジニウム３－オキシドヘキサフルオロフォスフェート（ＨＡＴＵ）／ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を加えて活性化し、カラムに入れて反応させた。反応終了後に洗浄し、２０％ピペリジンを用いて、Ｆｍｏｃ基を脱保護した。本工程を繰り返すことで、ペプチド鎖を伸長し、最終アミノ酸のＦｍｏｃ基を脱保護した後、装置からペプチドレジンを取り出した。直鎖の側鎖保護ペプチドレジンをジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）にて膨潤させ、２％ヒドラジン溶液中で５～１０分間反応させることで、リジンの側鎖の保護基（Ｄｄｅ）とアスパラギン酸の側鎖の保護基（ＯＤｍａｂ）を脱保護した後、カップリング試薬であるＯｘｉｍａ Ｐｕｒｅとジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）を加え、５０℃で３時間反応させた。レジンを洗浄後、ＴＦＡを加えて、チオール基の保護基を脱保護すると同時にレジンから単環ペプチドを切り出した。ＳｕｎＦｉｒｅ Ｃ１８カラム（１０×１５０ｍｍ）（Ｗａｔｅｒｓ社製）を用いたＲＴ－ＨＰＬＣによって、単環ペプチドを精製した後、凍結乾燥した。単環ペプチドをＴｒｉｓ－ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．５）とアセトニトリルの混液に溶解後、ＤＭＳＯを添加し、室温で３６時間撹拌することで、ジスルフィド結合によって、ペプチドを環状化した。ＳｕｎＦｉｒｅ Ｃ１８カラム（１０×１５０ｍｍ）（Ｗａｔｅｒｓ社製）を用いたＲＴ－ＨＰＬＣによって、二環ペプチドを精製した後、凍結乾燥した。最終的に得られたペプチドの分子量は、ｍｉｃｒｏｆｌｅｘ（Ｂｒｕｋｅｒ社）を用いて測定し、目的物を同定した。
本実施例に使用した全てのペプチドの化学合成は、株式会社スクラム（東京、日本）に委託し、９－フルオレニルメトキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ基）をαアミノ基の保護基として用いる標準的な固相合成法を自動合成機ＳｙｒｏＩＩ（Ｂｉｏｔａｇｅ社製）で実施した。Ｃ末端に位置する側鎖保護アミノ酸－レジンを合成カラムに入れて、装置をセットした。続いて、Ｆｍｏｃ基で保護した次アミノ酸に１－［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］－１Ｈ－１，２，３－トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジニウム３－オキシドヘキサフルオロフォスフェート（ＨＡＴＵ）／ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を加えて活性化し、カラムに入れて反応させた。反応終了後に洗浄し、２０％ピペリジンを用いて、Ｆｍｏｃ基を脱保護した。本工程を繰り返すことで、ペプチド鎖を伸長し、最終アミノ酸のＦｍｏｃ基を脱保護した後、装置からペプチドレジンを取り出した。直鎖の側鎖保護ペプチドレジンをジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）にて膨潤させ、２％ヒドラジン溶液中で５～１０分間反応させることで、リジンの側鎖の保護基（Ｄｄｅ）とアスパラギン酸の側鎖の保護基（ＯＤｍａｂ）を脱保護した後、カップリング試薬であるＯｘｉｍａ Ｐｕｒｅとジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）を加え、５０℃で３時間反応させた。レジンを洗浄後、ＴＦＡを加えて、チオール基の保護基を脱保護すると同時にレジンから単環ペプチドを切り出した。ＳｕｎＦｉｒｅ Ｃ１８カラム（１０×１５０ｍｍ）（Ｗａｔｅｒｓ社製）を用いたＲＴ－ＨＰＬＣによって、単環ペプチドを精製した後、凍結乾燥した。単環ペプチドをＴｒｉｓ－ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．５）とアセトニトリルの混液に溶解後、ＤＭＳＯを添加し、室温で３６時間撹拌することで、ジスルフィド結合によって、ペプチドを環状化した。ＳｕｎＦｉｒｅ Ｃ１８カラム（１０×１５０ｍｍ）（Ｗａｔｅｒｓ社製）を用いたＲＴ－ＨＰＬＣによって、二環ペプチドを精製した後、凍結乾燥した。最終的に得られたペプチドの分子量は、ｍｉｃｒｏｆｌｅｘ（Ｂｒｕｋｅｒ社）を用いて測定し、目的物を同定した。
【0043】
本実施例で合成したペプチドの理論分子量、実測分子量、純度、環状化タイプ、配列を表１に示す。また、これらの中でＳｅｑ－１及びＳｅｑ－１０のアミノ酸配列を以下に示す。なお、表１及び以下のアミノ酸配列において、Ｄ体表記のないアミノ酸はＬ体を示す。
【0044】
【表1】
【0045】
Ｓｅｑ－１：ｃ（Ｍｐａ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｔｙｒ－Ｌｅｕ－Ｐｒｏ－ｃ［Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｌｅｕ－Ｃｙｓ）－Ａｓｐ］－Ｌｅｕ－Ｉｌｅ－ＮＨ２ （配列番号１）
Ｓｅｑ－１０：Ａｃ－ｃ［Ｃｙｓ１－Ｐｒｏ２－Ｐｒｏ３－Ｔｙｒ４－Ｌｅｕ５－Ｐｒｏ６－ｃ（Ｌｙｓ７－Ｔｙｒ８－Ｌｅｕ９－Ｃｙｓ１０］－Ａｓｐ１１）－Ｌｅｕ１２－Ｉｌｅ１３－ＮＨ２ （配列番号２）
Ｓｅｑ－１０：Ａｃ－ｃ［Ｃｙｓ１－Ｐｒｏ２－Ｐｒｏ３－Ｔｙｒ４－Ｌｅｕ５－Ｐｒｏ６－ｃ（Ｌｙｓ７－Ｔｙｒ８－Ｌｅｕ９－Ｃｙｓ１０］－Ａｓｐ１１）－Ｌｅｕ１２－Ｉｌｅ１３－ＮＨ２ （配列番号２）
【0046】
Ｓｅｑ－１とＳｅｑ－１０は、ＶＩｐｅｐ－３（非特許文献１参照）のＣ末端３残基（Ｌｅｕ－Ａｒｇ－Ｓｅｒ）を除去し、１位－１０位間のＳ－Ｓ結合と７位－１１位間のアミド結合によって二環化したペプチドである。
【0047】
（参考例）ＶＩＰＲ２シグナルの阻害による腫瘍関連マクロファージの分極と大腸癌の増殖についての解析
材料と方法
＜動物＞
すべての実験手順は、香川大学が制定した動物の管理と使用に関するガイドラインに基づいて行った。５週齢の免疫不全ＳＣＩＤマウス（日本クレア株式会社から購入）を、１２時間の明暗サイクルで飼育し、標準的な餌と水を自由に摂取させた。すべての手術および実験手順は，香川大学の動物管理・使用委員会の承認を得た。
材料と方法
＜動物＞
すべての実験手順は、香川大学が制定した動物の管理と使用に関するガイドラインに基づいて行った。５週齢の免疫不全ＳＣＩＤマウス（日本クレア株式会社から購入）を、１２時間の明暗サイクルで飼育し、標準的な餌と水を自由に摂取させた。すべての手術および実験手順は，香川大学の動物管理・使用委員会の承認を得た。
【0048】
＜細胞株と試薬＞
ＣＴ－２６大腸癌細胞（ＡＴＣＣから入手）は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１００ＩＵ／ｍＬペニシリン、１００ＩＵ／ｍＬストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ（和光純薬株式会社製）で培養した。ＧＦＰタグ付きのＣＴ－２６細胞（ＣＴ－２６－ＧＦＰ）を作製するために、ｐＥＧＦＰ－Ｃ１プラスミド（クロンテック社製）を、製造者の推奨に従って、リポフェクタミン３０００（サーモフィッシャーサイエンティフィク社製）によりＣＴ－２６細胞にトランスフェクトした。その後、ＣＴ－２６－ＧＦＰ細胞をセルソーティング（ベックマン・コールター株式会社）によって選択し、６００μｇ／ｍＬのジェネティシン（サーモフィッシャーサイエンティフィク社製）、１０％ＦＢＳ、１００ＩＵ／ｍＬペニシリン、１００ＩＵ／ｍＬストレプトマイシンを含むＲＰＭＩで培養することでＧＦＰを安定発現するＣＴ－２６細胞を樹立した。ＲＡＷ２６４．７細胞は、１０％ＦＢＳ、１００ＩＵ／ｍＬペニシリン、１００ＩＵ／ｍＬストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ（シグマ・アルドリッチ社製）で培養した。
ＣＴ－２６大腸癌細胞（ＡＴＣＣから入手）は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１００ＩＵ／ｍＬペニシリン、１００ＩＵ／ｍＬストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ（和光純薬株式会社製）で培養した。ＧＦＰタグ付きのＣＴ－２６細胞（ＣＴ－２６－ＧＦＰ）を作製するために、ｐＥＧＦＰ－Ｃ１プラスミド（クロンテック社製）を、製造者の推奨に従って、リポフェクタミン３０００（サーモフィッシャーサイエンティフィク社製）によりＣＴ－２６細胞にトランスフェクトした。その後、ＣＴ－２６－ＧＦＰ細胞をセルソーティング（ベックマン・コールター株式会社）によって選択し、６００μｇ／ｍＬのジェネティシン（サーモフィッシャーサイエンティフィク社製）、１０％ＦＢＳ、１００ＩＵ／ｍＬペニシリン、１００ＩＵ／ｍＬストレプトマイシンを含むＲＰＭＩで培養することでＧＦＰを安定発現するＣＴ－２６細胞を樹立した。ＲＡＷ２６４．７細胞は、１０％ＦＢＳ、１００ＩＵ／ｍＬペニシリン、１００ＩＵ／ｍＬストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ（シグマ・アルドリッチ社製）で培養した。
【0049】
＜ＣＴ－２６の培養上清（ＣＴ２６－ＣＭ）の調製＞
４×１０６個のＣＴ－２６細胞を、１０％ＦＢＳ、１００ＩＵ／ｍＬペニシリン、１００ＩＵ／ｍＬストレプトマイシンを含む２０ｍＬのＲＰＭＩ培地で３日間培養した。上澄み液を回収し、４００ｇで５分間遠心分離した。その後、上澄み液を分注し、使用するまで－８０℃で保存した。
４×１０６個のＣＴ－２６細胞を、１０％ＦＢＳ、１００ＩＵ／ｍＬペニシリン、１００ＩＵ／ｍＬストレプトマイシンを含む２０ｍＬのＲＰＭＩ培地で３日間培養した。上澄み液を回収し、４００ｇで５分間遠心分離した。その後、上澄み液を分注し、使用するまで－８０℃で保存した。
【0050】
＜ＣＴ２６－ＣＭで培養したＲＡＷ２６４．７細胞とその性状評価＞
マウスマクロファージＲＡＷ２６４．７細胞（２４×１０４個）を２０％ＣＴ２６－ＣＭ存在下で培養した。その際、ＶＩＰＲ１及びＶＩＰＲ２アンタゴニストであるＶＩＰｈｙｂ（Ｇｏｚｅｓ Ｉ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ １９９５，１５：６７５－６８７）（１μＭ及び３μＭの用量）又は選択的ＶＩＰＲ２アゴニストであるＢＡＹ５５－９８３７（Ｔｓｕｔｓｕｍｉ Ｍ，ｅｔ ａｌ． Ｄｉａｂｅｔｅｓ ２００２，５１：１４５３－１４６０）（１００ｎＭの用量）を添加した。
マウスマクロファージＲＡＷ２６４．７細胞（２４×１０４個）を２０％ＣＴ２６－ＣＭ存在下で培養した。その際、ＶＩＰＲ１及びＶＩＰＲ２アンタゴニストであるＶＩＰｈｙｂ（Ｇｏｚｅｓ Ｉ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ １９９５，１５：６７５－６８７）（１μＭ及び３μＭの用量）又は選択的ＶＩＰＲ２アゴニストであるＢＡＹ５５－９８３７（Ｔｓｕｔｓｕｍｉ Ｍ，ｅｔ ａｌ． Ｄｉａｂｅｔｅｓ ２００２，５１：１４５３－１４６０）（１００ｎＭの用量）を添加した。
【0051】
ＶＩＰＲ１に対するｓｉＲＮＡまたはＶＩＰＲ２に対するｓｉＲＮＡの細胞へのトランスフェクトは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉｍａｘ（サーモフィッシャーサイエンティフィク社製）を用いて、メーカーの推奨に従って行った。ＣＴ２６－ＣＭ培養後３日目にＶＩＰＲ１またはＶＩＰＲ２のｍＲＮＡ発現を解析し、ノックダウン効率を評価した。Ｍ１およびＭ２遺伝子の発現は、ＣＴ２６－ＣＭ培養後４日目に測定した。
【0052】
＜リアルタイムＰＣＲ＞
ＲＡＷ２６４．７細胞から、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン株式会社製）を用いてメーカーの指示に従ってＲＮＡを抽出した。ｃＤＮＡを調製して、７３００ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（アプライドバイオシステムズ、サーモフィッシャーサイエンティフィク社）とＬｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ Ｆａｓｔ Ｓｔａｒｔ ＤＮＡ Ｍａｓｔｅｒ ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ社）を用いたリアルタイムＰＣＲにより、以下のマーカー解析に用いた。Ｍ１マーカー：ＴＮＦ－α、ｉＮＯＳ、ＣＸＣＬ１０；Ｍ２マーカー：Ｍｒｃ－１、ＩＬ－１ｒｎ、ＣＣＬ２２；ＶＩＰ受容体サブタイプ：ＶＩＰＲ１、ＶＩＰＲ２；免疫チェックポイントマーカー：ＳＩＲＰ－α、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１；及びβ－ａｃｔｉｎの遺伝子発現。相対的なｍＲＮＡの発現量は、２－ΔΔＣｔ法を用いて決定した。対照群のデータを用いてΔΔＣｔ値を算出した。プライマー配列を以下の表２に示す。
ＲＡＷ２６４．７細胞から、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン株式会社製）を用いてメーカーの指示に従ってＲＮＡを抽出した。ｃＤＮＡを調製して、７３００ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（アプライドバイオシステムズ、サーモフィッシャーサイエンティフィク社）とＬｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ Ｆａｓｔ Ｓｔａｒｔ ＤＮＡ Ｍａｓｔｅｒ ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ社）を用いたリアルタイムＰＣＲにより、以下のマーカー解析に用いた。Ｍ１マーカー：ＴＮＦ－α、ｉＮＯＳ、ＣＸＣＬ１０；Ｍ２マーカー：Ｍｒｃ－１、ＩＬ－１ｒｎ、ＣＣＬ２２；ＶＩＰ受容体サブタイプ：ＶＩＰＲ１、ＶＩＰＲ２；免疫チェックポイントマーカー：ＳＩＲＰ－α、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１；及びβ－ａｃｔｉｎの遺伝子発現。相対的なｍＲＮＡの発現量は、２－ΔΔＣｔ法を用いて決定した。対照群のデータを用いてΔΔＣｔ値を算出した。プライマー配列を以下の表２に示す。
【0053】
【表2】
【0054】
＜マクロファージの癌細胞を貪食する能力の評価＞
ＣＴ２６－ＣＭで４日間培養したＲＡＷ２６４．７細胞を、ＰＫＨ－２６（PKH26赤色蛍光細胞リンカーキット、一般細胞膜標識用、ＭＥＲＣＫ、PKH26GL-1KT）で標識したＣＴ２６細胞（シグマ・アルドリッチ社、メーカーの指示に従って）と１：２の割合で混合し、２時間共培養した。その後、ＣＤ１１ｂ－ＦＩＴＣ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、サーモフィッシャーサイエンティフィク社）を用いて、ＲＡＷ２６４．７細胞を標識した。ＲＡＷ２６４．７細胞が貪食によって取り込んだＣＴ２６細胞の量をＰＫＨ－２６で検出した。貪食能はＣｙｔＥｘｐｅｒｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ベックマン・コールター社）を用いてＣｙｔｏＦＬＥＸ（ベックマン・コールター社）で解析した。
ＣＴ２６－ＣＭで４日間培養したＲＡＷ２６４．７細胞を、ＰＫＨ－２６（PKH26赤色蛍光細胞リンカーキット、一般細胞膜標識用、ＭＥＲＣＫ、PKH26GL-1KT）で標識したＣＴ２６細胞（シグマ・アルドリッチ社、メーカーの指示に従って）と１：２の割合で混合し、２時間共培養した。その後、ＣＤ１１ｂ－ＦＩＴＣ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、サーモフィッシャーサイエンティフィク社）を用いて、ＲＡＷ２６４．７細胞を標識した。ＲＡＷ２６４．７細胞が貪食によって取り込んだＣＴ２６細胞の量をＰＫＨ－２６で検出した。貪食能はＣｙｔＥｘｐｅｒｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ベックマン・コールター社）を用いてＣｙｔｏＦＬＥＸ（ベックマン・コールター社）で解析した。
【0055】
＜抗癌試験＞
ＣＴ－２６－ＧＦＰ（１×１０５個）を６週齢のＳＣＩＤマウスの皮下（ｓ．ｃ．）に移植した。腫瘍ができた時点で、ＰＢＳ又はＶＩＰｈｙｂ（１０μｇ／日、ｓ．ｃ．毎日、ＫａｒｅＢａｙ Ｂｉｏｃｈｅｍ社製）を２週間投与した。抗ＰＤ－１抗体との併用試験では，マウスを次の４つのグループに分けた：１）ＰＢＳ、２）ＶＩＰｈｙｂ（１０μｇ／日、毎日）、３）抗ＰＤ－１抗体（２００μｇ／日、ｉ．ｐ．、３回／週、Ｂｉｏ Ｘ ｃｅｌｌ社製）、４）ＶＩＰｈｙｂと抗ＰＤ－１抗体の併用療法を２週間行った．腫瘍の大きさは１週間ごとに測定し、腫瘍の体積は、長さ×（幅×幅）／２で算出した。
ＣＴ－２６－ＧＦＰ（１×１０５個）を６週齢のＳＣＩＤマウスの皮下（ｓ．ｃ．）に移植した。腫瘍ができた時点で、ＰＢＳ又はＶＩＰｈｙｂ（１０μｇ／日、ｓ．ｃ．毎日、ＫａｒｅＢａｙ Ｂｉｏｃｈｅｍ社製）を２週間投与した。抗ＰＤ－１抗体との併用試験では，マウスを次の４つのグループに分けた：１）ＰＢＳ、２）ＶＩＰｈｙｂ（１０μｇ／日、毎日）、３）抗ＰＤ－１抗体（２００μｇ／日、ｉ．ｐ．、３回／週、Ｂｉｏ Ｘ ｃｅｌｌ社製）、４）ＶＩＰｈｙｂと抗ＰＤ－１抗体の併用療法を２週間行った．腫瘍の大きさは１週間ごとに測定し、腫瘍の体積は、長さ×（幅×幅）／２で算出した。
【0056】
＜腫瘍中の細胞種の解析＞
抗癌試験に供したマウスの腫瘍を、各治療の１２～１４日後に摘出し、ＰＢＳ中でコラゲナーゼＩＶ（シグマ・アルドリッチ社）、ディスパーゼＩＩ（シグマ・アルドリッチ社）及びＤＮａｓｅＩ（サーモフィッシャーサイエンティフィク社）と混合し、３７℃で酵素分解した後、１００及び７０μｍのセルストレーナー（サーモフィッシャーサイエンティフィク社）を用いて腫瘍懸濁液を調製した。ＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ中の５％ＦＢＳ、０．１％アジ化ナトリウム）を加えて、４℃で４００ｇの遠心分離を行った。白血球は、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ（登録商標）－１０８３（シグマ・アルドリッチ社）を用いて、４００ｇ、３０分、室温で勾配遠心分離することにより、腫瘍懸濁液からさらに分離し、白血球を回収した。
抗癌試験に供したマウスの腫瘍を、各治療の１２～１４日後に摘出し、ＰＢＳ中でコラゲナーゼＩＶ（シグマ・アルドリッチ社）、ディスパーゼＩＩ（シグマ・アルドリッチ社）及びＤＮａｓｅＩ（サーモフィッシャーサイエンティフィク社）と混合し、３７℃で酵素分解した後、１００及び７０μｍのセルストレーナー（サーモフィッシャーサイエンティフィク社）を用いて腫瘍懸濁液を調製した。ＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ中の５％ＦＢＳ、０．１％アジ化ナトリウム）を加えて、４℃で４００ｇの遠心分離を行った。白血球は、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ（登録商標）－１０８３（シグマ・アルドリッチ社）を用いて、４００ｇ、３０分、室温で勾配遠心分離することにより、腫瘍懸濁液からさらに分離し、白血球を回収した。
【0057】
＜フローサイトメトリー＞
腫瘍浸潤性白血球（ＴＩＬ）は、一連の抗体で染色する前に、氷上で１０分間、１μｇ／１０６細胞のＣＤ１６／ＣＤ３２（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、サーモフィッシャーサイエンティフィク社）でブロックした。抗体の情報は以下の表３に示した。各抗体の最適な濃度は、各実験の前に決定した。死細胞は、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤＴＭｆｉｘａｂｌｅ ｎｅａｒ－ＩＲ ｄｅａｄ ｃｅｌｌ ｓｔａｉｎ ｋｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィク社）で染色した。白血球集団は以下のように定義した。Ｍ１マクロファージ（ＣＤ４５＋、ＣＤ３ｅ－、ＣＤ１１ｂ＋、Ｆ４／８０＋、ＭＨＣＩＩｈｉｇｈ）、Ｍ２マクロファージ（ＣＤ４５＋、ＣＤ３ｅ－、ＣＤ１１ｂ＋、Ｆ４／８０＋、ＭＨＣＩＩｌｏｗ、ＣＤ２０６＋）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞（ＣＤ４５＋、ＣＤ３ｅ－、ＣＤ１１ｂ―，ＣＤ３３５＋）、ＣＴ－２６のマクロファージ貪食（ＣＤ４５＋、ＣＤ３ｅ－、ＣＤ１１ｂ＋、Ｆ４／８０＋、ＣＴ－２６－ＧＦＰ＋）、ＰＤ－１＋マクロファージ（ＣＤ４５＋、ＣＤ３ｅ－、ＣＤ１１ｂ＋、ＰＤ－１＋）である。細胞懸濁液をＦＡＳＣ緩衝液中で、４℃にて２０分間関連抗体で染色し、２回洗浄し、ＣｙｔＥｘｐｅｒｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ベックマン・コールター社）を用いてＣｙｔｏＦＬＥＸ（ベックマン・コールター社）で分析した。陰性コントロールを用いてゲートを設定し、真の陽性染色のレベルを決定した。
腫瘍浸潤性白血球（ＴＩＬ）は、一連の抗体で染色する前に、氷上で１０分間、１μｇ／１０６細胞のＣＤ１６／ＣＤ３２（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、サーモフィッシャーサイエンティフィク社）でブロックした。抗体の情報は以下の表３に示した。各抗体の最適な濃度は、各実験の前に決定した。死細胞は、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤＴＭｆｉｘａｂｌｅ ｎｅａｒ－ＩＲ ｄｅａｄ ｃｅｌｌ ｓｔａｉｎ ｋｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィク社）で染色した。白血球集団は以下のように定義した。Ｍ１マクロファージ（ＣＤ４５＋、ＣＤ３ｅ－、ＣＤ１１ｂ＋、Ｆ４／８０＋、ＭＨＣＩＩｈｉｇｈ）、Ｍ２マクロファージ（ＣＤ４５＋、ＣＤ３ｅ－、ＣＤ１１ｂ＋、Ｆ４／８０＋、ＭＨＣＩＩｌｏｗ、ＣＤ２０６＋）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞（ＣＤ４５＋、ＣＤ３ｅ－、ＣＤ１１ｂ―，ＣＤ３３５＋）、ＣＴ－２６のマクロファージ貪食（ＣＤ４５＋、ＣＤ３ｅ－、ＣＤ１１ｂ＋、Ｆ４／８０＋、ＣＴ－２６－ＧＦＰ＋）、ＰＤ－１＋マクロファージ（ＣＤ４５＋、ＣＤ３ｅ－、ＣＤ１１ｂ＋、ＰＤ－１＋）である。細胞懸濁液をＦＡＳＣ緩衝液中で、４℃にて２０分間関連抗体で染色し、２回洗浄し、ＣｙｔＥｘｐｅｒｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ベックマン・コールター社）を用いてＣｙｔｏＦＬＥＸ（ベックマン・コールター社）で分析した。陰性コントロールを用いてゲートを設定し、真の陽性染色のレベルを決定した。
【0058】
【表3】
【0059】
＜ウェスタンブロッティング分析＞
ＣＴ２６－ＣＭの存在下、又は非存在下で培養したＲＡＷ２６４．７細胞を、ＲＩＰＡバッファー（サーモフィッシャーサイエンティフィク社）を用いてメーカーの推奨に従って溶解し、溶解液を１２，０００ｒｐｍで１０分間、４℃で遠心分離した。７５μｇのタンパク質を１２％ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲルで分離し、ニトロセルロースフィルター膜に転写した。その後、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（ＬＩ－ＣＯＲ社製）で膜を室温で１時間ブロッキングし，抗ＶＩＰＲ１抗体（１：２００希釈）又は抗ＶＩＰＲ２抗体（１：２００希釈）と４℃で一晩反応させた。洗浄後、ＩＲ－Ｄｙｅ８００結合抗ウサギまたは抗マウス二次抗体（ＬＩ－ＣＯＲ社製）を用いて、室温で１時間反応させた。膜はＯｄｙｓｓｅｙ赤外線イメージングシステム（ＬＩ－ＣＯＲ社製）で可視化した。β－ａｃｔｉｎは内部コントロールとして使用した。
ＣＴ２６－ＣＭの存在下、又は非存在下で培養したＲＡＷ２６４．７細胞を、ＲＩＰＡバッファー（サーモフィッシャーサイエンティフィク社）を用いてメーカーの推奨に従って溶解し、溶解液を１２，０００ｒｐｍで１０分間、４℃で遠心分離した。７５μｇのタンパク質を１２％ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲルで分離し、ニトロセルロースフィルター膜に転写した。その後、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（ＬＩ－ＣＯＲ社製）で膜を室温で１時間ブロッキングし，抗ＶＩＰＲ１抗体（１：２００希釈）又は抗ＶＩＰＲ２抗体（１：２００希釈）と４℃で一晩反応させた。洗浄後、ＩＲ－Ｄｙｅ８００結合抗ウサギまたは抗マウス二次抗体（ＬＩ－ＣＯＲ社製）を用いて、室温で１時間反応させた。膜はＯｄｙｓｓｅｙ赤外線イメージングシステム（ＬＩ－ＣＯＲ社製）で可視化した。β－ａｃｔｉｎは内部コントロールとして使用した。
【0060】
＜患者サンプルと組織処理＞
香川大学医学部附属病院で病理組織学的検査により大腸癌と診断され、外科的切除を受けた患者から一連の大腸癌標本を入手した。すべてのプロトコールは、香川大学倫理委員会の承認を得た。また、試料採取の前に、すべての患者またはその保護者からインフォームド・コンセントを得た。
香川大学医学部附属病院で病理組織学的検査により大腸癌と診断され、外科的切除を受けた患者から一連の大腸癌標本を入手した。すべてのプロトコールは、香川大学倫理委員会の承認を得た。また、試料採取の前に、すべての患者またはその保護者からインフォームド・コンセントを得た。
【0061】
＜免疫蛍光染色＞
大腸癌組織を４％ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋した。これらの組織を脱パラフィンし、１０％ヤギ抗血清で室温にて１時間ブロックした。その後、ＣＤ６８（１：１００希釈）、ＶＩＰＲ１（１：１００希釈）又はＶＩＰＲ２（１：１００希釈）に対する抗体を用いて、４℃で一晩反応させた。その後、組織を洗浄し、Ａｌｅｘａ ｆｌｏｕｒ ４８８ ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（１：５００、サーモフィッシャーサイエンティフィク社）又はＡｌｅｘａ ｆｌｏｕｒ ５９４ ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ（１：５００、サーモフィッシャーサイエンティフィク社）の二次抗体を用いて、室温で１時間、暗所で反応させた。核は４’，６－ジアミノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で１０分間染色した。画像は蛍光顕微鏡（ＢＺ９０００；株式会社キーエンス製）で撮影した。
大腸癌組織を４％ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋した。これらの組織を脱パラフィンし、１０％ヤギ抗血清で室温にて１時間ブロックした。その後、ＣＤ６８（１：１００希釈）、ＶＩＰＲ１（１：１００希釈）又はＶＩＰＲ２（１：１００希釈）に対する抗体を用いて、４℃で一晩反応させた。その後、組織を洗浄し、Ａｌｅｘａ ｆｌｏｕｒ ４８８ ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（１：５００、サーモフィッシャーサイエンティフィク社）又はＡｌｅｘａ ｆｌｏｕｒ ５９４ ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ（１：５００、サーモフィッシャーサイエンティフィク社）の二次抗体を用いて、室温で１時間、暗所で反応させた。核は４’，６－ジアミノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で１０分間染色した。画像は蛍光顕微鏡（ＢＺ９０００；株式会社キーエンス製）で撮影した。
【0062】
＜ＫＳ－１３３の抗癌試験＞
ＣＴ－２６（１×１０５個）を６週齢のＢａｌｂ／ｃマウスの皮下（ｓ．ｃ．）に移植した。腫瘍ができた時点で、マウスを次の４つのグループに分けた：１）１％ＤＭＳＯ／ＰＢＳ、２）ＫＳ－１３３（３０μｇ／日、ｓ．ｃ．毎日）、３）抗ＰＤ－１抗体（２００μｇ／日、ｉ．ｐ．、３回／週、Ｂｉｏ Ｘ ｃｅｌｌ社製）、４）ＫＳ－１３３と抗ＰＤ－１抗体の併用療法を３週間行った．腫瘍の大きさは１週間ごとに測定し、腫瘍の体積は、長さ×（幅×幅）／２で算出した。
ＣＴ－２６（１×１０５個）を６週齢のＢａｌｂ／ｃマウスの皮下（ｓ．ｃ．）に移植した。腫瘍ができた時点で、マウスを次の４つのグループに分けた：１）１％ＤＭＳＯ／ＰＢＳ、２）ＫＳ－１３３（３０μｇ／日、ｓ．ｃ．毎日）、３）抗ＰＤ－１抗体（２００μｇ／日、ｉ．ｐ．、３回／週、Ｂｉｏ Ｘ ｃｅｌｌ社製）、４）ＫＳ－１３３と抗ＰＤ－１抗体の併用療法を３週間行った．腫瘍の大きさは１週間ごとに測定し、腫瘍の体積は、長さ×（幅×幅）／２で算出した。
【0063】
＜データと統計解析＞
２つのグループのデータを比較するために、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ－ｔｅｓｔを使用した。複数のグループの比較は，一元配置または二元配置の分散分析（ＡＮＯＶＡ）を行った後，Ｔｕｋｅｙの多重比較検定を行った。すべての統計解析は，ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ６（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．）を用いて行った。ｐ＜０．０５の値は統計的に有意であると考えられた。
２つのグループのデータを比較するために、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ－ｔｅｓｔを使用した。複数のグループの比較は，一元配置または二元配置の分散分析（ＡＮＯＶＡ）を行った後，Ｔｕｋｅｙの多重比較検定を行った。すべての統計解析は，ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ６（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．）を用いて行った。ｐ＜０．０５の値は統計的に有意であると考えられた。
【0064】
結果
＜大腸癌細胞株であるＣＴ－２６の培養上清はマクロファージＲＡＷ２６４．７の極性をＭ２型に分極させる＞
Ｉｎ ｖｉｖｏの腫瘍環境を模すため、大腸癌細胞株であるＣＴ－２６の培養上清の存在下でマクロファージＲＡＷ２６４．７細胞を培養し、マクロファージの分極とＶＩＰＲ１及びＶＩＰＲ２の発現を評価した。図１Ａは、Ｍ１マクロファージマーカーであるＴＮＦ－α、ｉＮＯＳ、ＣＸＣＬ１０のｍＲＮＡ発現量、図１Ｂは、Ｍ２マクロファージマーカーであるＭｒｃ－１、ＩＬ－１ｒｎ、ＣＣＬ－２２のｍＲＮＡ発現量、図１Ｃは、免疫チェックポイントマーカーであるＳＩＲＰ－α、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１のｍＲＮＡ発現量、図１Ｄは、ＶＩＰＲ１及びＶＩＰＲ２のｍＲＮＡ発現量、図１Ｅは、ＶＩＰＲ１及びＶＩＰＲ２のタンパク質発現量を示す。データは平均±ＳＥＭで表した。コントロールと比較して＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１（ｔｗｏ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）。
＜大腸癌細胞株であるＣＴ－２６の培養上清はマクロファージＲＡＷ２６４．７の極性をＭ２型に分極させる＞
Ｉｎ ｖｉｖｏの腫瘍環境を模すため、大腸癌細胞株であるＣＴ－２６の培養上清の存在下でマクロファージＲＡＷ２６４．７細胞を培養し、マクロファージの分極とＶＩＰＲ１及びＶＩＰＲ２の発現を評価した。図１Ａは、Ｍ１マクロファージマーカーであるＴＮＦ－α、ｉＮＯＳ、ＣＸＣＬ１０のｍＲＮＡ発現量、図１Ｂは、Ｍ２マクロファージマーカーであるＭｒｃ－１、ＩＬ－１ｒｎ、ＣＣＬ－２２のｍＲＮＡ発現量、図１Ｃは、免疫チェックポイントマーカーであるＳＩＲＰ－α、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１のｍＲＮＡ発現量、図１Ｄは、ＶＩＰＲ１及びＶＩＰＲ２のｍＲＮＡ発現量、図１Ｅは、ＶＩＰＲ１及びＶＩＰＲ２のタンパク質発現量を示す。データは平均±ＳＥＭで表した。コントロールと比較して＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１（ｔｗｏ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）。
【0065】
図１Ａに示すように、ＣＴ２６－ＣＭはＭ１マクロファージマーカーであるＣＸＣＬ１０のｍＲＮＡの発現を有意に低下させ、ＴＮＦ－α及びｉＮＯＳのｍＲＮＡの発現には影響を与えなかった。一方、図１Ｂに示すように、Ｍ２マクロファージマーカーであるマンノース受容体（Ｍｒｃ－１）、ＩＬ－１ｒｎ、ＣＣＬ－２２のｍＲＮＡの発現を有意に増加させた。そして、図１Ｃに示すように、免疫チェックポイントマーカーであるＳＩＲＰ－αとＰＤ－Ｌ１のｍＲＮＡの発現を増加させたが、ＰＤ－１のｍＲＮＡの発現には影響を与えなかった。（図１Ｃ）。
【0066】
さらに、ＣＴ２６－ＣＭがＲＡＷ２６４．７細胞のＶＩＰＲ１及びＶＩＰＲ２発現に与える影響を評価した。その結果、ＣＴ２６－ＣＭを添加したＲＡＷ２６４．７細胞では、ＶＩＰＲ１及びＶＩＰＲ２のｍＲＮＡの発現がいずれも有意に増加していた（図１Ｄ）。同様に、ＶＩＰＲ１及びＶＩＰＲ２のタンパク質発現量も有意に増加していた（図１Ｅ）。これらのデータは、大腸癌細胞株ＣＴ２６から分泌された液性分子がマクロファージＲＡＷ２６４．７細胞に作用し、その極性をＭ２型に誘導すること、そしてＶＩＰＲ1及びＶＩＰＲ２の両方のタンパク質発現を亢進することを示している。
【0067】
＜ＶＩＰＲ１とＶＩＰＲ２に対するアンタゴニストは、ＣＴ２６－ＣＭで培養したＲＡＷ２６４．７細胞の極性をＭ１に誘導し、貪食作用を増加させる＞
次に、ＶＩＰによるシグナル伝達がマクロファージの分極と機能に関与しているかどうかを調べた。図２は、ＶＩＰＲ１とＶＩＰＲ２に対するアンタゴニストＶＩＰｈｙｂが、ＣＴ２６－ＣＭで培養したＲＡＷ２６４．７細胞において、Ｍ１極性化を誘導し、マクロファージのＣＴ－２６に対する貪食を促進した結果を示す。１μＭ及び３μＭのＶＩＰｈｙｂのＭ１マクロファージマーカーのｍＲＮＡ発現に対する影響を図２Ａに、Ｍ２マクロファージマーカーのｍＲＮＡ発現に対する影響を図２Ｂに、及び免疫チェックポイントマーカーのｍＲＮＡ発現に対する影響を図２Ｃに示す（ｎ＝７～９／グループ）。図２Ｄは、ＲＡＷ２６４．７細胞そのもの（Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｏｒｏｌ）、標識化されたＣＴ－２６を貪食したＲＡＷ２６４．７細胞（ＶＩＰｈｙｂ非存在下：Ｃｏｎｔｏｒｏｌ）、標識化されたＣＴ－２６を貪食したＲＡＷ２６４．７細胞（ＶＩＰｈｙｂ存在下）の代表的なＦＡＣＳヒストグラムである。図２Ｅは、同貪食作用を定量化し比較した結果である。データは平均±ＳＥＭで表した。二元配置のＡＮＯＶＡ又はＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ－ｔｅｓｔでコントロールと比較して＊：ｐ＜０．０５。
次に、ＶＩＰによるシグナル伝達がマクロファージの分極と機能に関与しているかどうかを調べた。図２は、ＶＩＰＲ１とＶＩＰＲ２に対するアンタゴニストＶＩＰｈｙｂが、ＣＴ２６－ＣＭで培養したＲＡＷ２６４．７細胞において、Ｍ１極性化を誘導し、マクロファージのＣＴ－２６に対する貪食を促進した結果を示す。１μＭ及び３μＭのＶＩＰｈｙｂのＭ１マクロファージマーカーのｍＲＮＡ発現に対する影響を図２Ａに、Ｍ２マクロファージマーカーのｍＲＮＡ発現に対する影響を図２Ｂに、及び免疫チェックポイントマーカーのｍＲＮＡ発現に対する影響を図２Ｃに示す（ｎ＝７～９／グループ）。図２Ｄは、ＲＡＷ２６４．７細胞そのもの（Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｏｒｏｌ）、標識化されたＣＴ－２６を貪食したＲＡＷ２６４．７細胞（ＶＩＰｈｙｂ非存在下：Ｃｏｎｔｏｒｏｌ）、標識化されたＣＴ－２６を貪食したＲＡＷ２６４．７細胞（ＶＩＰｈｙｂ存在下）の代表的なＦＡＣＳヒストグラムである。図２Ｅは、同貪食作用を定量化し比較した結果である。データは平均±ＳＥＭで表した。二元配置のＡＮＯＶＡ又はＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ－ｔｅｓｔでコントロールと比較して＊：ｐ＜０．０５。
【0068】
ＶＩＰＲ１とＶＩＰＲ２に対する非選択的なアンタゴニストＶＩＰｈｙｂは、３μＭの濃度で、Ｍ１マクロファージマーカーであるＴＮＦ－α、ｉＮＯＳ、ＣＸＣＬ１０のｍＲＮＡの発現を有意に増強し（図２Ａ）、Ｍ２マクロファージマーカーの一つであるＭｒｃ－１のｍＲＮＡの発現を有意に減少させた（図２Ｂ）。また、ＶＩＰｈｙｂは、免疫チェックポイントマーカーのｍＲＮＡの発現には影響を及ぼさなかった（図２Ｃ）。さらに、ＶＩＰｈｙｂで処理したＲＡＷ２６４．７細胞のＣＴ－２６細胞に対する貪食作用はＣＴ－２６に対する貪食作用を増強した（図２Ｄ及びＥ）。これらのデータは、ＶＩＰＲ１及び/又はＶＩＰＲ２のシグナルの阻害が、マクロファージの極性をＭ１型に誘導すること、マクロファージの貪食機能が促進されることを示している。
【0069】
＜ＶＩＰＲ１とＶＩＰＲ２に対するアンタゴニストは、ＳＣＩＤマウスの皮下に移植されたＣＴ－２６腫瘍の成長を抑制し、腫瘍関連マクロファージのＭ１／Ｍ２比を向上させる＞
Ｔ細胞とＢ細胞を欠く免疫不全のＳＣＩＤマウスの皮下にＧＦＰを安定発現するＣＴ－２６大腸癌を移植し、ＶＩＰＲ１とＶＩＰＲ２に対するアンタゴニストを投与し、その抗癌効果とＴＡＭの機能に対する効果を評価した。図３Ａは、腫瘍の体積変化を示す（ｎ＝５～６／グループ）。図３Ｂは、Ｍ１マクロファージの、図３Ｃは、Ｍ２マクロファージの、図３Ｄは、ＮＫ細胞の比率をそれぞれ示す。図３Ｅは、Ｍ１／Ｍ２マクロファージ比を、図３Ｆは、腫瘍を形成していたＧＦＰ安定発現ＣＴ２６細胞が貪食された比率をフローサイトメトリーで解析した結果を示す（ｎ＝４～５／グループ）。データは平均±ＳＥＭで表した。＊コントロールと比較してｐ＜０．０５；Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ－ｔｅｓｔ。
Ｔ細胞とＢ細胞を欠く免疫不全のＳＣＩＤマウスの皮下にＧＦＰを安定発現するＣＴ－２６大腸癌を移植し、ＶＩＰＲ１とＶＩＰＲ２に対するアンタゴニストを投与し、その抗癌効果とＴＡＭの機能に対する効果を評価した。図３Ａは、腫瘍の体積変化を示す（ｎ＝５～６／グループ）。図３Ｂは、Ｍ１マクロファージの、図３Ｃは、Ｍ２マクロファージの、図３Ｄは、ＮＫ細胞の比率をそれぞれ示す。図３Ｅは、Ｍ１／Ｍ２マクロファージ比を、図３Ｆは、腫瘍を形成していたＧＦＰ安定発現ＣＴ２６細胞が貪食された比率をフローサイトメトリーで解析した結果を示す（ｎ＝４～５／グループ）。データは平均±ＳＥＭで表した。＊コントロールと比較してｐ＜０．０５；Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ－ｔｅｓｔ。
【0070】
ＶＩＰｈｙｂはコントロールと比較してＳＣＩＤマウスの皮下に移植された腫瘍の成長を有意に減少させた（図３Ａ）。そして、腫瘍において、Ｍ１マクロファージを増加させる傾向（図３Ｂ）、Ｍ２マクロファージを減少させる傾向（図３Ｃ）を示した。一方、ＮＫ細胞には増減の傾向がみられなかった（図３Ｄ）。ＴＭＥにおけるＭ１／Ｍ２マクロファージの比率が患者の予後と相関していることはよく知られている。そこで、Ｍ１／Ｍ２腫瘍関連マクロファージの比率を解析したところ、ＶＩＰｈｙｂ投与群は対照群に比べてＭ１／Ｍ２腫瘍関連マクロファージの比率が高いことがわかった（図３Ｅ）。また、ＶＩＰアンタゴニスト投与群の腫瘍組織から回収されたマクロファージは、対照群の腫瘍組織から回収されたマクロファージと比較して、より多くのＣＴ－２６細胞（ＧＦＰを安定発現）を貪食していることがわかった（図３Ｆ）。これらの結果は、ＶＩＰＲ１及び/又はＶＩＰＲ２のシグナルの阻害が、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてもマクロファージの極性をＭ１型に誘導すること、マクロファージの貪食機能が促進されることを示している。ところで、ＰＤ－１の発現は、マクロファージの食細胞活性に影響を与えることが報告されている。そこで、腫瘍から単離されたマクロファージにおけるＰＤ－１の発現をさらに調べたところ、ＶＩＰアンタゴニスト投与マウスから単離されたＴＡＭでは、ＰＤ－１がわずかに増加していた（図７参照）。
【0071】
＜ＶＩＰＲ１とＶＩＰＲ２に対するアンタゴニストと抗ＰＤ－１抗体を併用すると抗腫瘍活性が増大する＞
ＶＩＰｈｙｂを投与したマウスの腫瘍から分離したマクロファージではＰＤ－１が増加する傾向があったことから、ＶＩＰｈｙｂと抗ＰＤ－１抗体を併用することで、さらに腫瘍の成長を抑え、マクロファージの機能を高めるという追加的な効果が期待できるのではないかと考えた。図４は、免疫不全ＳＣＩＤマウスにおけるＣＴ－２６腫瘍の成長に対するＶＩＰｈｙｂと抗ＰＤ－１抗体の併用効果を調べた結果である。図４Ａは、腫瘍の体積変化を示す（ｎ＝５～６／グループ）。図４Ｂは、Ｍ１マクロファージの、図４Ｃは、Ｍ２マクロファージの、図４Ｄは、ＮＫ細胞の比率をそれぞれ示す。図４Ｅは、Ｍ１／Ｍ２マクロファージ比を、図４Ｆは、腫瘍を形成していたＧＦＰ安定発現ＣＴ２６細胞が貪食された比率をフローサイトメトリーで解析した結果を示す（ｎ＝４～５／グループ）。データは平均±ＳＥＭで表した。コントロールと比較して＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１；ｔｗｏ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ。
ＶＩＰｈｙｂを投与したマウスの腫瘍から分離したマクロファージではＰＤ－１が増加する傾向があったことから、ＶＩＰｈｙｂと抗ＰＤ－１抗体を併用することで、さらに腫瘍の成長を抑え、マクロファージの機能を高めるという追加的な効果が期待できるのではないかと考えた。図４は、免疫不全ＳＣＩＤマウスにおけるＣＴ－２６腫瘍の成長に対するＶＩＰｈｙｂと抗ＰＤ－１抗体の併用効果を調べた結果である。図４Ａは、腫瘍の体積変化を示す（ｎ＝５～６／グループ）。図４Ｂは、Ｍ１マクロファージの、図４Ｃは、Ｍ２マクロファージの、図４Ｄは、ＮＫ細胞の比率をそれぞれ示す。図４Ｅは、Ｍ１／Ｍ２マクロファージ比を、図４Ｆは、腫瘍を形成していたＧＦＰ安定発現ＣＴ２６細胞が貪食された比率をフローサイトメトリーで解析した結果を示す（ｎ＝４～５／グループ）。データは平均±ＳＥＭで表した。コントロールと比較して＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１；ｔｗｏ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ。
【0072】
興味深いことに、Ｔ細胞とＢ細胞を欠くＳＣＩＤマウスにおいても抗ＰＤ－１抗体の投与は腫瘍の成長を抑制した。そして、その抗腫瘍活性はＶＩＰｈｙｂと併用投与することで増強された（図４Ａ）。腫瘍におけるＭ１マクロファージマーカー（図４Ｂ）、Ｍ２マクロファージマーカー（図４Ｃ）、Ｍ１／Ｍ２マクロファージ比率（図４Ｄ）には、各群間で差がなかった。同様に、ＮＫ細胞の数も群間で差はなかった（図４Ｅ）。ＶＩＰｈｙｂと抗ＰＤ－１抗体の併用投与では、対照群に比べてマクロファージの貪食作用が増加する傾向が見られた（図４Ｆ）。
【0073】
＜ＶＩＰＲ１ではなくＶＩＰＲ２のシグナルがマクロファージの極性に影響を与える＞
次に、ＶＩＰＲ１とＶＩＰＲ２のいずれ、若しくは両方がマクロファージＲＡＷ２６４．７細胞のＭ２極性化に関与しているのかを調べた。その結果を図５－１及び図５－２に示す。まず、ＶＩＰＲ１に対するｓｉＲＮＡとＶＩＰＲ２に対するｓｉＲＮＡによって、各受容体のｍＲＮＡ発現量が低下することを確認した（図５－１のＡおよびＢ、ｎ＝６～８／グループ）。続いて、それぞれのｓｉＲＮＡ存在下におけるＭ１マクロファージマーカーとＭ２マクロファージマーカーを評価した（図５－１のＣおよびＤ）。そして、ＶＩＰＲ２選択的なアゴニストであるＢＡＹ５５－９８３７のマクロファージＲＡＷ２６４．７細胞の極性に対する影響も評価した（図５－２のＥ、ｎ＝７～１０／グループ）。データは平均±ＳＥＭで表した。＊：コントロールと比較してｐ＜０．０５；Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ－ｔｅｓｔまたはｔｗｏ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ。
次に、ＶＩＰＲ１とＶＩＰＲ２のいずれ、若しくは両方がマクロファージＲＡＷ２６４．７細胞のＭ２極性化に関与しているのかを調べた。その結果を図５－１及び図５－２に示す。まず、ＶＩＰＲ１に対するｓｉＲＮＡとＶＩＰＲ２に対するｓｉＲＮＡによって、各受容体のｍＲＮＡ発現量が低下することを確認した（図５－１のＡおよびＢ、ｎ＝６～８／グループ）。続いて、それぞれのｓｉＲＮＡ存在下におけるＭ１マクロファージマーカーとＭ２マクロファージマーカーを評価した（図５－１のＣおよびＤ）。そして、ＶＩＰＲ２選択的なアゴニストであるＢＡＹ５５－９８３７のマクロファージＲＡＷ２６４．７細胞の極性に対する影響も評価した（図５－２のＥ、ｎ＝７～１０／グループ）。データは平均±ＳＥＭで表した。＊：コントロールと比較してｐ＜０．０５；Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ－ｔｅｓｔまたはｔｗｏ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ。
【0074】
ＶＩＰＲ１に対するｓｉＲＮＡとＶＩＰＲ２に対するｓｉＲＮＡは、いずれもＭ１マクロファージマーカーを変動させなかった。そして、ＶＩＰＲ１に対するｓｉＲＮＡは、Ｍ２マクロファージマーカーも変動させなかった。一方、ＶＩＰＲ２に対するｓｉＲＮＡは、Ｍ２マクロファージマーカーであるＭｒｃ－１およびＩＬ－１ｒｎのｍＲＮＡの発現を有意に減少させた。
【0075】
さらに、ＶＩＰＲ２選択的なアゴニストであるＢＡＹ５５－９８３７は、Ｍ１マクロファージマーカーの一つであるｉＮＯＳのｍＲＮＡの発現を低下させる傾向を示し、Ｍ２マクロファージマーカーであるＭｒｃ－１およびＩＬ－１ｒｎのｍＲＮＡの発現を有意に増加させた。これらの結果は、ＶＩＰＲ１ではなくＶＩＰＲ２のシグナルがマクロファージの極性に影響を与えることを示している。
【0076】
＜ヒト大腸癌組織の腫瘍関連マクロファージにおけるＶＩＰＲ１とＶＩＰＲ２の発現解析＞
ヒト大腸癌組織におけるＶＩＰＲ１とＶＩＰＲ２の分布を調べた。図６は、ヒト大腸癌標本の腫瘍間質におけるＣＤ６８（緑）とＶＩＰＲ１（赤、図６Ａは１００×；図６Ｂは２００×）、及びＣＤ６８（緑）とＶＩＰＲ２（赤、図６Ｃは１００×；図６Ｄは２００×）の染色の代表的な画像である。核はＤＡＰＩ（青）で染色した。
ヒト大腸癌組織におけるＶＩＰＲ１とＶＩＰＲ２の分布を調べた。図６は、ヒト大腸癌標本の腫瘍間質におけるＣＤ６８（緑）とＶＩＰＲ１（赤、図６Ａは１００×；図６Ｂは２００×）、及びＣＤ６８（緑）とＶＩＰＲ２（赤、図６Ｃは１００×；図６Ｄは２００×）の染色の代表的な画像である。核はＤＡＰＩ（青）で染色した。
【0077】
図６に示すように、マクロファージマーカーであるＣＤ６８の発現は腫瘍間質で高発現していたが，隣接する正常組織ではＣＤ６８陽性細胞はほとんど見られなかった。一方，ＶＩＰＲ１とＶＩＰＲ２の発現は，腫瘍間質と隣接する正常組織の間質に存在する細胞に認められた。腫瘍間質では，ＣＤ６８を発現している細胞はＶＩＰＲ１の染色に陽性ではなく（図６Ａ及び図６Ｂ）、ＶＩＰＲ２の染色に陽性であった（図６Ｃ及び図６Ｄ）。
【0078】
＜ＶＩＰＲ２選択的アンタゴニストＫＳ－１３３は、ＣＴ２６－ＣＭで培養したＲＡＷ２６４．７細胞の極性をＭ１に誘導する＞
図８は、ＶＩＰＲ２選択的アンタゴニストＫＳ－１３３が、ＣＴ２６－ＣＭで培養したＲＡＷ２６４．７細胞において、Ｍ１極性化を誘導した結果を示す。１μＭ、３μＭ及び１０μＭのＫＳ－１３３のＭ１マクロファージマーカーのｍＲＮＡ発現に対する影響を図８Ａに、Ｍ２マクロファージマーカーのｍＲＮＡ発現に対する影響を図８Ｂに示す（ｎ＝５～７／グループ）。データは平均±ＳＥＭで表した。二元配置のＡＮＯＶＡ又はＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ－ｔｅｓｔでコントロールと比較して＊：ｐ＜０．０５。
図８は、ＶＩＰＲ２選択的アンタゴニストＫＳ－１３３が、ＣＴ２６－ＣＭで培養したＲＡＷ２６４．７細胞において、Ｍ１極性化を誘導した結果を示す。１μＭ、３μＭ及び１０μＭのＫＳ－１３３のＭ１マクロファージマーカーのｍＲＮＡ発現に対する影響を図８Ａに、Ｍ２マクロファージマーカーのｍＲＮＡ発現に対する影響を図８Ｂに示す（ｎ＝５～７／グループ）。データは平均±ＳＥＭで表した。二元配置のＡＮＯＶＡ又はＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ－ｔｅｓｔでコントロールと比較して＊：ｐ＜０．０５。
【0079】
ＶＩＰＲ２選択的アンタゴニストＫＳ－１３３は、１０μＭの濃度で、Ｍ１マクロファージマーカーであるｉＮＯＳのｍＲＮＡの発現を増強する傾向を示し、ＣＸＣＬ１０のｍＲＮＡの発現を有意に増強した（図８Ａ）。そして、Ｍ２マクロファージマーカーの一つであるＭｒｃ－１のｍＲＮＡの発現を有意に減少させた（図８Ｂ）。これらのデータは、ＫＳ－１３３によるＶＩＰＲ２のシグナルの阻害が、マクロファージの極性をＭ１型に誘導することを示している。
【0080】
＜ＶＩＰＲ２選択的アンタゴニストＫＳ－１３３は単独投与と抗ＰＤ－１抗体との併用投与の両方で抗腫瘍活性を示す＞
図９は、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおけるＣＴ－２６腫瘍の成長に対するＫＳ－１３３の単独投与と抗ＰＤ－１抗体との併用投与による抗癌効果を調べた結果であり、腫瘍の体積変化を示す（ｎ＝５～６／グループ）。ＫＳ－１３３は単独投与と抗ＰＤ－１抗体との併用投与の両方で有意な抗腫瘍活性を示した。図１０は、実験終了後にマウスから摘出した腫瘍を並べたものである。特にＫＳ－１３３と抗ＰＤ－１抗体の併用投与群では腫瘍の大きさが顕著に縮小していることが分かる。
図９は、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおけるＣＴ－２６腫瘍の成長に対するＫＳ－１３３の単独投与と抗ＰＤ－１抗体との併用投与による抗癌効果を調べた結果であり、腫瘍の体積変化を示す（ｎ＝５～６／グループ）。ＫＳ－１３３は単独投与と抗ＰＤ－１抗体との併用投与の両方で有意な抗腫瘍活性を示した。図１０は、実験終了後にマウスから摘出した腫瘍を並べたものである。特にＫＳ－１３３と抗ＰＤ－１抗体の併用投与群では腫瘍の大きさが顕著に縮小していることが分かる。
【産業上の利用可能性】
【0081】
本発明に係る環状ペプチドを含む組成物は、癌免疫増強のための組成物などの医薬品として使用される可能性がある。
【要約】
腫瘍関連マクロファージの分極と機能に対するＶＩＰアンタゴニストの影響を解析し、新規な癌免疫増強剤を提供する。この癌免疫増強のための組成物は、式（１）：
ｃ［Ｘ１－Ｐｒｏ２－Ｘ３－Ｔｙｒ４－Ｌｅｕ５－Ｐｒｏ６－ｃ（Ｘ７－Ｘ８－Ｌｅｕ９－Ｃｙｓ１０］－Ｘ１１）－Ｘ１２－Ｘ１３ （１）
で表されるアミノ酸配列からなる環状ペプチド、その誘導体若しくは修飾体又は薬理学的に許容されるそれらの塩を含む。
ｃ［Ｘ１－Ｐｒｏ２－Ｘ３－Ｔｙｒ４－Ｌｅｕ５－Ｐｒｏ６－ｃ（Ｘ７－Ｘ８－Ｌｅｕ９－Ｃｙｓ１０］－Ｘ１１）－Ｘ１２－Ｘ１３ （１）
で表されるアミノ酸配列からなる環状ペプチド、その誘導体若しくは修飾体又は薬理学的に許容されるそれらの塩を含む。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5-1】
【図5-2】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【配列表】