特許 7417012 有用大腸菌二重変異株を用いた外来糖鎖修飾メンブレンヴェシクル

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-01-10

(45)【発行日】2024-01-18

(54)【発明の名称】有用大腸菌二重変異株を用いた外来糖鎖修飾メンブレンヴェシクル

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/21 20060101AFI20240111BHJP

   C12N 1/20 20060101ALN20240111BHJP

   C12N 15/31 20060101ALN20240111BHJP

【ＦＩ】

C12N1/21 ZNA

C12N1/20 A

C12N1/20 Z

C12N15/31

【請求項の数】 1

(21)【出願番号】P 2018227517

(22)【出願日】2018-12-04

(65)【公開番号】P2020089292

(43)【公開日】2020-06-11

【審査請求日】2021-12-03

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】591222245

【氏名又は名称】国立感染症研究所長

(72)【発明者】

【氏名】中尾 龍馬

(72)【発明者】

【氏名】平山 悟

【審査官】小金井 悟

(56)【参考文献】

【文献】Sci. Rep.，2016年，Vol.6, No.24931，pp.1-9

【文献】Open Biol.，2016年04月13日，Vol.6, No.4. 150243，pp.1-14

【文献】平山悟ら，グリシンによる大腸菌メンブレンベシクル産生の増大とその特性解析，農芸化学会2018年度大会，2018年03月16日，講演番号：2A03p15

【文献】Journal of Bacteriology，2016年11月，Vol.198, No.22，pp.3070-3079

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０

Ｃ１２Ｎ １／００－ ７／０８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ΔｆｌｈＤ及びΔｗｂｂＬである遺伝子変異を有する大腸菌二重変異株。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、有用大腸菌二重変異株を用いた外来糖鎖修飾メンブレンヴェシクルに関する。

【背景技術】

【0002】

細菌は、細胞外へメンブレンヴェシクル(以下、MV:membrane vesicleと称することがある。)と呼ばれるナノサイズの小胞を放出する。歴史的には、グラム陰性で偏性嫌気性非芽胞形成桿菌として主要な腸内細菌であるバクテロイデスで類似する構造が電顕写真で1963年に報告された(非特許文献１)、様々なグラム陰性細菌がメンブレンヴェシクルを産生することが明らかとなっている(非特許文献２)。また、モデル生物である大腸菌でも1966年にはリジン要求性変異株をリジン制限下で培養したときの異常形態として報告されている(非特許文献３)。また、細菌の培養時に培養液に1.0～1.2 w/v％のグリシンを添加することにより、細菌由来のMVの産生量が増大する手法(以下、この手法をグリシン誘導法と記載することがある。)が報告されている(非特許文献４、５)。

【0003】

メンブレンヴェシクルは細胞膜由来のリン脂質や膜タンパク質、リポポリサッカライド(LPS)等で構成されるほか、核酸や酵素等の様々な物質を含有するため、多面的な機能を有し、新規ワクチン抗原のような応用展開も期待されている。例えば、ターゲットタンパク質を抗原として載せた大腸菌のMVを用いた簡便なワクチン製造として利用されている(非特許文献６)。外来性糖鎖を表層に局在させたMVのワクチン応用の可能性について報告されている（非特許文献７)。しかしながら、ヒトに使用経験のある有用大腸菌を用いて、この大腸菌に外来性糖鎖を表層に局在させる技術は確立されていなかった。またこの有用大腸菌株のMVをワクチン抗原として使用された報告はない。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0004】

【文献】H.A.Bladen & J.F.Waters:J.Bacteriol., 86,1339(1963).

【文献】Jain S, Pillai J. Int J Nanomedicin.1543563422645_012:6329-6341(2017)

【文献】K.W.Knox,M.Vesk & E.Work:J.Bacteriol.,92,1206(1966).

【文献】Satoru Hirayama, Ryoma Nakao., Budapest, Hungary. Glycine strongly enhances immunoactive membrane vesicle production from flagella-deficient E. coli., 12th Vaccine Congress. 9/16-19(2018)

【文献】平山悟、中尾龍馬,日本農芸化学会2018名古屋.グリシンによる大腸菌メンブレンベシクル産生の増大とその特性解析.3/15-18(2018)

【文献】D.J.Chen,N.Osterrieder,S.M.Metzger,E.Buckles,A.M. Doody,M.P.DeLisa & D.Putnam:Proc.Natl.Acad.Sci.USA,107,3099(2010).

【文献】Price NL, Goyette-Desjardins G, Nothaft H, Valguarnera E, Szymanski CM, Segura M, Feldman MF. Glycoengineered Outer Membrane Vesicles: A Novel Platform for Bacterial Vaccines. Sci Rep. 22;6:24931(2016).

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

本発明は、肺炎球菌莢膜ポリサッカライド(以下、莢膜ポリサッカライドをCPSと略することがある。)を載せたグラム陰性菌のMVを提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明にかかるグラム陰性菌のメンブレンヴェシクルは、外膜の構成部分であるLPSが、リピドＡと、コアオリゴ糖と、肺炎球菌莢膜ポリサッカライドを有することを特徴とする。

【発明の効果】

【0007】

本発明によれば、肺炎球菌莢膜ポリサッカライドを載せた有用大腸菌等のグラム陰性菌のMVが得られる。そのため肺炎球菌抗体を誘導できる肺炎球菌ワクチンを製造することができる。

【図面の簡単な説明】

【0008】

【図1】本実施形態にかかる有用大腸菌等のグラム陰性菌のMVの概略を説明する図である。

【図2】本実施例にかかる有用大腸菌等のグラム陰性菌のMVの透過型電子顕微鏡による写真図である。

【図3】本実施例にかかる有用大腸菌等のグラム陰性菌のMVのウエスタンブロットによる検出を示す写真図である。

【図4】本実施例にかかる有用大腸菌等のグラム陰性菌のMVを用いたワクチンによる血清中の抗体産生誘導の結果を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0009】

以下、添付の図面を参照して本発明の実施形態について具体的に説明するが、当該実施形態は本発明の原理の理解を容易にするためのものであり、本発明の範囲は、下記の実施形態に限られるものではなく、当業者が以下の実施形態の構成を適宜置換した他の実施形態も、本発明の範囲に含まれる。

【0010】

本実施形態にかかるグラム陰性菌のメンブレンヴェシクルは、外膜の構成部分であるリポ多糖が、リピドＡと、コアオリゴ糖と、肺炎球菌莢膜ポリサッカライドを有することを特徴とする(図１)。

【0011】

LPSはリピドAと呼ばれる脂質に、多分子の糖からなる糖鎖が結合した構造をとる。糖鎖部分は、コア多糖（またはコアオリゴ糖）と呼ばれる部分と、O側鎖多糖（O抗原）と呼ばれる部分から構成される。本願発明者は、グラム陰性菌のメンブレンヴェシクルの外膜の構成部分であるリポ多糖のO側鎖多糖（O抗原）と呼ばれる部分が、グラム陰性菌のメンブレンヴェシクルに肺炎球菌莢膜ポリサッカライドを載せる場合において障害になることを新知見として見出し、そのO側鎖多糖（O抗原）と呼ばれる部分を除去することに成功して本発明を完成するに至った。図１においては、例えば、大腸菌から放出されたメンブレンヴェシクルは、外膜の構成部分であるリポ多糖が、リピドＡと、コアオリゴ糖と、肺炎球菌莢膜ポリサッカライドCPS14を有していることが示されている。

【0012】

後述の実施例にも記載されているが、例えば有用大腸菌等のグラム陰性菌に対してwbbL遺伝子を欠損させることにより、糖鎖部分におけるO側鎖多糖（O抗原）と呼ばれる部分の除去を可能とした。そして例えば大腸菌等のグラム陰性菌の鞭毛がワクチンへコンタミすること等を防止するべくflhD遺伝子を欠損させることにより鞭毛の除去を可能とした。そのため本実施形態にかかる有用大腸菌二重変異株は、ΔflhD及びΔwbbLである遺伝子変異を有することを特徴とする。なお、本実施形態にかかる有用大腸菌変異株はΔwbbLのみであり、flhD遺伝子の欠損は行わないとすることも可能である。

【0013】

メンブレンヴェシクルはグラム陰性菌の膜が出芽するような形で放出されるが、メンブレンヴェシクル形成を誘発する経路はさまざま存在し、本実施形態にかかるメンブレンヴェシクルの形成経路は特に限定されるものではない。

【0014】

糖鎖部分におけるO側鎖多糖（O抗原）と呼ばれる部分の除去を行うメンブレンヴェシクルを得るグラム陰性菌は、特に限定されるものではないが、例えば、大腸菌、エシェリキア属の種、シゲラ属の種、クレブシエラ属の種、サルモネラ属の種、イェルシニア属の種、ナイセリア属の種、ビブリオ属の種及びシュードモナス属の種からなる群より選択される。好ましくは大腸菌、有用大腸菌であり、更に好ましくは、有用大腸菌はプロバイオティクス大腸菌であり、プロバイオティクス大腸菌は特に限定されるものではいが、例えば大腸菌Nissle 1917株である。本発明によれば、ヒトに使用経験のある有用大腸菌を用いて、この大腸菌に外来性糖鎖を表層に局在させることができ、この有用大腸菌株のMVをワクチン抗原として使用することにより安全に抗体産生を強く誘導できる。しかもグリシン誘導法と組み合わせることにより有用大腸菌株のMV産生量を大量に増大させることもでき、本発明により得られる利益は計り知れない。

【0015】

糖鎖部分におけるO側鎖多糖（O抗原）と呼ばれる部分を除去して、除去したO側鎖多糖（O抗原）の代わりにコアオリゴ糖に結合させる肺炎球菌莢膜ポリサッカライドは、特に限定されるものではないが、例えば、肺炎連鎖球菌CPS1、CPS2、CPS3、CP4、CPS5、CPS6(A及びB)、CPS7(A、B、C)、CPS8、CPS9(A、L、N、V)、CPS10(A、B、C、F)、CPS11(A、B、C、D、F)、CPS12(A、B、F)、CPS13、CPS14、CPS15(A、B、C、F)、CPS16(A、F)、CPS17(A、F)、CPS18(A、B、C、F)、CPS19(A、B、C、F)、CPS20、CPS21、CPS22(A、F)、CPS23(A、B、F)、CPS24(A、B、F)、CPS25(A、F)、CPS26、CPS27、CPS28(A、F)、CPS29、CPS31、CPS32(A、F)、CPS33(A、B、C、D、F)、CPS34、CPS35(A、B、C、D、F)、CPS36、CPS37、CPS38、CPS39、CPS40、CPS41(A、F)、CPS42、CPS43、CPS44、CPS45、CPS46、CPS47(A、F)、又は、CPS48であり、例えばCPS14である。

【0016】

なお、本実施形態においては、糖鎖部分におけるO側鎖多糖（O抗原）と呼ばれる部分を除去して、除去したO側鎖多糖（O抗原）の代わりにコアオリゴ糖に結合させる莢膜ポリサッカライドを肺炎球菌莢膜ポリサッカライドとしているが、肺炎球菌莢膜ポリサッカライドではなく、例えば抗原性を有する莢膜等(糖鎖)であればその他の真正細菌の莢膜ポリサッカライドとすることも可能であり、具体的には肺炎桿菌（腸内細菌科クレブシエラ属）の莢膜、化膿レンサ球菌のヒアルロン酸莢膜、髄膜炎菌のシアル酸（N-アセチルノイラミン酸）莢膜、炭疽菌のポリ-DL-グルタミン酸莢膜等をあげることができる。

【0017】

本実施形態にかかるワクチンは、本実施形態にかかるメンブレンヴェシクル(即ち、外膜の構成部分であるリポ多糖が、リピドＡと、コアオリゴ糖と、肺炎球菌莢膜ポリサッカライドを有するメンブレンヴェシクルである。)を含むことを特徴とする。本実施形態にかかるワクチンは、本実施形態にかかるメンブレンヴェシクルを含む凍結乾燥状態のワクチン製剤とすることができ、例えば使用時に溶解して注射により投与される。

【実施例】

【0018】

1. MVの作製
1-1.形質転換大腸菌の作製
大腸菌の遺伝子破壊はDatsenko and Wannerの方法(Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2000)に従った。Baba et al.のsupplemental material (Mol. Syst. Biol. 2006)に掲載されているflhD及びwbbLに特異的な配列を有するプライマーを用いて、プラスミドpKD4よりカナマイシン耐性遺伝子(Km^R)をRT-PCRにて増幅した。

【0019】

flhDに特異的な配列を有するプライマーは下記であった。
・flhDup50+P1
TCACGGGGTGCGGTGAAACCGCATAAAAATAAAGTTGGTTATTCTGGGTGgtgtaggctggagctgcttc(配列番号１)
・flhDdown50+P2
TTCCTGAACAATGCTTTTTTCACTCATGATCAGGCCCTTTTCTTGCGCAGcatatgaatatcctccttag(配列番号２)
wbbLに特異的な配列を有するプライマーは下記であった。
・wbbLup50+P1
AGTTGGGTTTGATGAACTAGTTAATTTTATTACTGAAGAACATTGAAATGgtgtaggctggagctgcttc(配列番号３)
・wbbLdown50+P2
ATCCATGCTTATATGCTTACGGCTTTATATTACGGGTGAAAAACTGATGAcatatgaatatcctccttag(配列番号４)
PCR産物をpKD46を有するE. coli Nissle 1917株にエレクトロポレーションにより導入し、アラビノース存在下で培養することによりλRed recombinaseを発現させ、flhD遺伝子をKm^Rに置換した。その後、Km^R遺伝子の上下に存在するFLRサイトを認識するフリッパーゼを発現するpCL20で形質転換し、43℃で培養して発現させることにより、Km^R遺伝子を排除した。続いて、同様の方法でwbbL遺伝子の欠損を行った。これにより形質転換大腸菌、即ち、大腸菌二重変異株EcNΔΔを作製した。

【0020】

1-2.形質転換大腸菌への肺炎球菌莢膜ポリサッカライド(CPS14)発現ベクターの導入
上記で得られた形質転換大腸菌へ、CPS14発現ベクターである肺炎球菌CPS14発現ベクターpNLP80を導入した。なおCPS14の配列は配列番号５で示される。

【0021】

1-3.形質転換大腸菌からのMVの単離
LB培地に大腸菌の前培養液を培地の1/200量接種し、37℃で16時間振盪培養した。この時、グリシン添加区には最終濃度1%のグリシンを添加した。この培養液を遠心分離して得られた培養上清を、0.45 μmのフィルターに通して細菌細胞を取り除いた後、超遠心分離することにより、MV画分を調製した。MVのペレットは20 mM Tris-HCl (pH 8.0)に懸濁した。以上により本実施例にかかるMVを作製した。

【0022】

2.作製したMVの解析
2-1.透過型電子顕微鏡によるMVの解析
透過型電子顕微鏡(Transmission Electron Microscope)は120kV 透過電子顕微鏡 H-7650を使用した(日立ハイテクノロジーズ)。染色剤としては酢酸ウラニルを使用した。透過型電子顕微鏡による解析図を図２に示す。図２に示されるようにCPS14を発現した大腸菌二重変異株EcNΔΔ-MVが観察された。

【0023】

2-2.ウエスタンブロットによるMVの解析
MVと全細胞菌体は12.5%のSDS-PAGEジェルで展開後、ウエスタンブロットに供試された。CPS14の検出にあたり、ウサギ抗CPS14抗体(Statens Serum Institut (SSI) 社、デンマーク)を一次抗体、ホースラディッシュペルオキシダーゼ標識抗ウサギ抗体-rabbit IgG (GE Healthcare社、英国) を二次抗体として使用した。HRP基質の発色後、化学発光としてシグナルを検出した。ウエスタンブロットによる解析図を図３に示す。図３に示されるようにCPS14を発現した大腸菌二重変異株EcNΔΔ-MVのバンドが観察された。

【0024】

3.本実施例にかかるMVによる抗体誘導
3-1.動物実験
６週齢メスBALB/cマウスに三週間隔で2回経鼻免疫を行なった。2回目の免疫の２週間後、血清、唾液、鼻腔洗浄液、肺洗浄液を採取した。経鼻免疫に使用した抗原は、通常の培養条件で得た菌液の上清から回収したMV1 μg（B群）、１％のグリシンを添加した培養液を用いて得た菌液の上清から回収したMV1 μg（C群）であった。B及びCいずれの群も免疫した量は10 μLであった。陰性対照群としてA群には同容量のPBSのみ経鼻接種した。

【0025】

CPS14抗体産生の有無はELISA法により解析した。即ち、CPS14を固相化したELISAプレートにマウス血清(または唾液、鼻腔洗浄液、肺洗浄液)を反応させた。更にアルカリフォスファターゼ標識抗マウスIgG抗体 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 、又はホースラディッシュペルオキシダーゼ標識抗マウスIgA抗体(KPL社、米国)を反応させた後、CPS14抗体産生の有無を調べた。

【0026】

動物実験の結果を図４に示す。図４に示されるように、B群及びC群においてCPS14抗体が強く誘導されており、本実施例にかかるMVによれば血中、鼻腔、口腔及び肺の各部位にCPS14抗体が強く誘導されることが示された。即ち、本実施例にかかるMVを含むワクチンの鼻腔内投与により、血中、鼻腔、口腔及び肺の各部位に肺炎球菌に対する抗体を産生誘導できることが示された。

【産業上の利用可能性】

【0027】

ワクチンの製造に利用できる。

【配列表フリーテキスト】

【0028】

配列番号１～４：プライマー

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【配列表】

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