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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-01-10
(45)【発行日】2024-01-18
(54)【発明の名称】卵アレルギーの予防剤等およびそれを含有する食品組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 38/01 20060101AFI20240111BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20240111BHJP
A61P 37/08 20060101ALI20240111BHJP
A23L 33/17 20160101ALI20240111BHJP
A61K 35/57 20150101ALI20240111BHJP
【ＦＩ】
A61K38/01
A61P37/06
A61P37/08
A23L33/17
A61K35/57
【請求項の数】
5
(21)【出願番号】P 2021565666
(86)(22)【出願日】2020-12-18
(86)【国際出願番号】 JP2020047305
(87)【国際公開番号】W WO2021125303
(87)【国際公開日】2021-06-24
【審査請求日】2022-06-09
(31)【優先権主張番号】P 2019229144
(32)【優先日】2019-12-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】510136312
【氏名又は名称】国立研究開発法人国立成育医療研究センター
(73)【特許権者】
【識別番号】000229519
【氏名又は名称】日本ハム株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】230104019
【弁護士】
【氏名又は名称】大野 聖二
(74)【代理人】
【識別番号】100119183
【弁理士】
【氏名又は名称】松任谷 優子
(74)【代理人】
【識別番号】100149076
【弁理士】
【氏名又は名称】梅田 慎介
(74)【代理人】
【識別番号】100173185
【弁理士】
【氏名又は名称】森田 裕
(74)【代理人】
【識別番号】100162503
【弁理士】
【氏名又は名称】今野 智介
(74)【代理人】
【識別番号】100144794
【弁理士】
【氏名又は名称】大木 信人
(72)【発明者】
【氏名】綾部 絢子
(72)【発明者】
【氏名】長谷川 隆則
(72)【発明者】
【氏名】松本 健治
(72)【発明者】
【氏名】森田 英明
【審査官】松浦 安紀子
(56)【参考文献】
【文献】LOZANO-OJALVO D, et al.，Hydrolysed ovalbumin offers more effective preventive and therapeutic protection against egg allergy，Clinical & Experimental Allergy，2017年，Vol.47 No.10，p.1342-1354，ISSN : 0954-7894
【文献】MATSUDA T, et al.，Reduction of ovomucoid immunogenic activity on peptic fragmentation and heat denaturation.，Agricultural and Biological Chemistry，1985年，Vol.49 No.7，p.2237-2241，ISSN : 0002-1369
【文献】HILDEBRANDT S, et al.，In Vitro Determination of the Allergenic Potential of Technologically Altered Hen's Egg.，Journal of Agricultural and Food Chemistry，2008年，Vol.56 No.5，p.1727-1733，ISSN : 0021-8561
【文献】JIMENEZ‐SAIZ R, et al，Human Immunoglobulin E (IgE) Binding to Heated and Glycated Ovalbumin and Ovomucoid before and after，Journal of Agricultural and Food Chemistry，2011年，Vol.59 No.18，p.10044-10051，ISSN : 0021-8561
【文献】BESLER M, et al.，Identification of IgE-binding peptides derived from chemical and enzymatic cleavage of Ovomucoid (Gal d 1)，Internet Symposium on Food Allergens，1999年，Vol.1 No.1，p.1-12，ISSN : 1437-0573
【文献】海野浩寿, 他，IL-33とアレルギー，医学のあゆみ，2015年，Vol.252 No.12，p.1233-1238
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ３５／５７
Ａ６１Ｋ ３８／０１
Ａ６１Ｐ ３７／０６
Ａ６１Ｐ ３７／０８
Ａ２３Ｌ ３３／１７
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
加熱変性卵白のペプシンまたはサーモライシンによる分解物を含む、卵アレルギーの予防または治療のための経口免疫寛容剤。
【請求項2】
加熱変性卵白のペプシンまたはサーモライシンによる分解物を含む、卵アレルギーの予防または治療のための食品組成物。
【請求項3】
加熱変性卵白をペプシンまたはサーモライシンで分解する工程を含む、卵アレルギーの予防または治療のための経口免疫寛容剤の製造方法。
【請求項4】
加熱変性卵白のペプシンまたはサーモライシンによる分解物を原料に配合する工程を含む、卵アレルギーの予防または治療のための食品組成物の製造方法。
【請求項5】
卵アレルギーを経口免疫寛容により治療または予防するための成分として食品に添加する、加熱変性卵白のペプシンまたはサーモライシンによる分解物の使用方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、卵アレルギーの予防および治療のために用いることのできる経口免疫寛容剤、およびそれを含有する食品組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
食物アレルギー患者は乳幼児が圧倒的に多く、中でも卵（鶏卵）アレルギーは乳幼児にとって有病率の高い食物アレルギーの一つである。乳幼児が食物アレルギーになる原因は長年研究されてきたが、アトピー性皮膚炎があると食物に感作されやすいことが報告されており（非特許文献１）、皮膚バリア機能の障害と経皮的な抗原の侵入が、食物アレルギーの一因となっている可能性が指摘されている（非特許文献２）。鶏卵アレルゲンは子供のベッドの全てから検出され、その量はダニアレルゲンよりも有意に多いという報告もあり（非特許文献３）、環境中に鶏卵アレルゲンがあふれているために乳幼児の卵アレルギー患者も多くなっている可能性がある。
【0003】
卵アレルギーを予防するためには、アトピー性皮膚炎の治療を行い、炎症皮膚からのアレルゲンの侵入を防いだ上で、加熱した全卵を例えば生後６ヶ月など早期から少量食べさせる方法の有効性が示唆されている（非特許文献４～６）。しかしながら、生後６ヶ月ですでに卵に感作している（卵の抗体が体内にできている）乳幼児もおり、生卵粉末を摂取させた臨床試験においてアナフィラキシーショックが多発すること（非特許文献７）、また加熱卵（加熱卵黄または加熱卵白）であっても必ずしも安全というわけではなくアレルギー反応を起こす乳幼児も多くいること（非特許文献８）が報告されている。
【0004】
卵アレルギーを予防または治療するためのより具体的な方法としては、例えば次のようなものが提案されている。
【0005】
非特許文献９には、卵白の感作前に、非加熱のオボアルブミンのペプシン分解物を一定期間マウスに経口投与することにより、卵白を投与したときのアナフィラキシーショックは抑制されることが記載されている。しかしながら、非特許文献９による方法は、非加熱のオボアルブミンまたはそれを含む非加熱の卵白もしくは全卵（生卵）によるアレルギーを、経口免疫寛容によって予防できることを示唆するに留まる。非特許文献９には、加熱卵白、特にそこに含まれる加熱してもアレルゲン性が失われにくいオボムコイドによるアレルギーを予防するための方法は記載されていない。
【0006】
特許文献１には、「ａ）アレルゲンタンパク質を含むアレルゲンの天然源を抽出して抽出物を生成し、ｂ）前記抽出物を精製して非タンパク質成分を除去して精製抽出物を生成し、ｃ）前記精製抽出物を変性させて精製変性抽出物を生成する工程を含み、前記精製変性抽出物はタンパク質を含み、合わせて全タンパク質の少なくとも６０％（ｗ／ｗ）を構成する最も豊富な（ｗ／ｗ）タンパク質群は少なくとも２種のタンパク質であり、全タンパク質が前記精製変性抽出物の乾燥重量の少なくとも６０％（ｗ／ｗ）に相当する天然アレルゲンの精製抽出物の製造方法。」（請求項１）の発明や、「ａ）変性アレルゲンを加水分解してアレルゲン加水分解物を生成し、ｂ）前記アレルゲン加水分解物を精製して１０，０００Ｄａ超の分子量を有するペプチドおよび１，０００Ｄａ未満の分子量を有するペプチドを除去して、７０％、より好ましくは８０％のペプチドが１０，０００Ｄａ～１，０００Ｄａである精製加水分解物を得る工程を含む天然アレルゲンの精製抽出物の製造方法。」（請求項８）の発明が記載されている。この発明における「加水分解」は「好ましくは、ペプシン、トリプシンまたはキモトリプシン」を用いて行われることなども記載されている。また、「加水分解に先立ち、未変性アレルゲンを変性して変性アレルゲンを生成する」ことや、その変性が「カオトロピック剤、還元剤およびこれらの混合物の存在下で行われる」ことなども記載されている。さらに、このような方法により得られる「天然アレルゲンの精製変性抽出物」および「精製アレルゲン加水分解物」が「免疫寛容を誘導するための医薬組成物および／または食品組成物の調製のため」に使用されることや、「免疫寛容の誘導がアレルギー反応を治療または予防するために用いられる」ことも記載されている。「アレルゲン」としては多数の食品の中に「卵アレルゲン」も例示されている。しかしながら、特許文献１には、卵アレルゲンに関する実施形態については、一般的な記載以上のことは記載されておらず、実施例としても開示されていない。特に、卵アレルゲンとして、例えば卵白に含まれているオボアルブミン、オボムコイドなどを抽出し精製して用いるのではなく、卵白全体を加熱により変性した上で用いるということや、それによって奏される作用効果は、記載も示唆もされていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0007】
【文献】特表２０１０－５０４２７８号公報
【非特許文献】
【0008】
【文献】Flohr et al. J Invest Dermatol. 2014Feb;134(2):345-350. doi: 10.1038/jid.2013.298. Epub 2013 Jul 18.
【文献】Kubo etal. J Clin Invest. 2012 Feb;122(2):440-7. doi:10.1172/JCI57416. Epub 2012 Feb 1.
【文献】KitagawaH et al. Allergology Int. 2019
【文献】福家ら. 鶏卵アレルギー発症予防に関する提言.2017
【文献】Natsume et al. Lancet. 2017 Jan21;389(10066):276-286. doi:10.1016/S0140-6736(16)31418-0. Epub 2016 Dec 9.
【文献】du Toitet al. J Allergy Clin Immunol. 2018 Apr;141(4):1343-1353. doi:10.1016/j.jaci.2017.09.034. Epub 2017 Oct 31.
【文献】Matsumotoet al. J Allergy Clin Immunol. 2018 Jun;141(6):1997-2001.e3. doi: 10.1016/j.jaci.2018.02.033. Epub2018 Mar 6.
【文献】池松ら, アレルギー, 55(5), p.533-541, 2006.
【文献】Lozano-Ojalvo et al., Clin Exp Allergy,47(10), p.1342-1354, 2017.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
本発明は、乳幼児の卵アレルギーを予防または治療することができる、従来よりも有効性が高く、危険性の低い手段を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明者らは、卵のうち卵白だけを加熱変性した後、特定の食品用タンパク質分解酵素を用いて処理したもの（本明細書において「ＰＥＷ」（protease-digested egg white）と称する。）が、経口摂取したときに、卵アレルギー、特に卵白に含まれるオボムコイドおよびオボアルブミンによるアレルギーを予防することができ、しかも皮膚バリア機能が傷害されていても経皮膚感作を起こしにくい、高い有効性と低い危険性を両立できる剤として利用できることを見出し、本発明を完成させるに至った。特に、ペプシン等のアスパルティックプロテアーゼ、およびサーモライシン（例えば「サモアーゼ（登録商標）ＰＣ１０Ｆ」）等の金属プロテアーゼは、セリンプロテアーゼ等のその他の各種の食品用タンパク質分解酵素に比べて、経口摂取したときに卵アレルギーを予防等する効果の安定性に優れており、本発明にとって好適な食品用タンパク質分解酵素である。
【0011】
すなわち、本発明には以下の事項が包含される。
［１］
加熱変性卵白のアスパルティックプロテアーゼまたは金属プロテアーゼによる分解物を含む、卵アレルギーの予防または治療のための経口免疫寛容剤。
［２］
前記アスパルティックプロテアーゼがペプシンである、項１に記載の経口免疫寛容剤。
［３］
前記金属プロテアーゼがサーモライシンである、項１に記載の経口免疫寛容剤。
［４］
加熱変性卵白のアスパルティックプロテアーゼまたは金属プロテアーゼによる分解物を含む、食品組成物。
［５］
卵アレルギーの予防または治療用である、項４に記載の食品組成物。
［６］
前記アスパルティックプロテアーゼがペプシンである、項４または５に記載の食品組成物。
［７］
前記金属プロテアーゼがサーモライシンである、項４または５に記載の食品組成物。
［８］
加熱変性卵白をアスパルティックプロテアーゼまたは金属プロテアーゼで分解する工程を含む、卵アレルギーの予防または治療のための経口免疫寛容剤の製造方法。
［９］
加熱変性卵白のアスパルティックプロテアーゼまたは金属プロテアーゼによる分解物を原料に配合する工程を含む、食品組成物の製造方法。
［１０］
前記食品組成物が、卵アレルギーの予防または治療用である、項９に記載の食品組成物の製造方法。
［１１］
卵アレルギーを経口免疫寛容により治療または予防するための成分として食品に添加する、加熱変性卵白のアスパルティックプロテアーゼまたは金属プロテアーゼによる分解物の使用方法。
［１］
加熱変性卵白のアスパルティックプロテアーゼまたは金属プロテアーゼによる分解物を含む、卵アレルギーの予防または治療のための経口免疫寛容剤。
［２］
前記アスパルティックプロテアーゼがペプシンである、項１に記載の経口免疫寛容剤。
［３］
前記金属プロテアーゼがサーモライシンである、項１に記載の経口免疫寛容剤。
［４］
加熱変性卵白のアスパルティックプロテアーゼまたは金属プロテアーゼによる分解物を含む、食品組成物。
［５］
卵アレルギーの予防または治療用である、項４に記載の食品組成物。
［６］
前記アスパルティックプロテアーゼがペプシンである、項４または５に記載の食品組成物。
［７］
前記金属プロテアーゼがサーモライシンである、項４または５に記載の食品組成物。
［８］
加熱変性卵白をアスパルティックプロテアーゼまたは金属プロテアーゼで分解する工程を含む、卵アレルギーの予防または治療のための経口免疫寛容剤の製造方法。
［９］
加熱変性卵白のアスパルティックプロテアーゼまたは金属プロテアーゼによる分解物を原料に配合する工程を含む、食品組成物の製造方法。
［１０］
前記食品組成物が、卵アレルギーの予防または治療用である、項９に記載の食品組成物の製造方法。
［１１］
卵アレルギーを経口免疫寛容により治療または予防するための成分として食品に添加する、加熱変性卵白のアスパルティックプロテアーゼまたは金属プロテアーゼによる分解物の使用方法。
【0012】
上記［１］～［１１］の発明は、他のカテゴリーの発明に適宜変換することができる。例えば、本発明は他の側面において、卵アレルギーを予防または治療するために使用されるＰＥＷ、および卵アレルギーを予防または治療するための（有効成分としての）ＰＥＷの使用、が提供される。本発明は他の側面において、卵アレルギーを予防または治療するための経口免疫寛容剤または食品組成物の製造における、ＰＥＷの使用、が提供される。また、本発明は他の側面において、有効量のＰＥＷを投与する（経口摂取させる）ことを含む、卵アレルギーの予防、治療または抑制方法が提供される。上記［１］～［１１］との関係で本明細書中に記載した事項も、上記の各発明に即して適宜変換することができる。
【発明の効果】
【0013】
本発明の経口免疫寛容剤およびそれを含む食品は、卵アレルギー発症のリスクが高い対象者、特に乳幼児に摂取させることにより、安定的に経口免疫寛容を誘導して卵アレルギーを予防または治療することができる一方、皮膚からの侵入による経皮膚感作は起こしにくいので、これまでにない水準で有効性と安全性を両立させることのできる剤および食品として極めて有用である。また、本発明の経口免疫寛容剤およびそれを含む食品は、すでに卵に感作されている幼児に対しても、経口摂取によっては卵アレルギーの症状を誘発しにくいことが予想されるので、安全性が高いといえる。
【0014】
なお、本発明では「特定の食品用タンパク質分解酵素」（アスパルティックプロテアーゼ、金属プロテアーゼ等）を用いることにより、卵アレルギーの予防等のために好適な剤が得られるが、その理由としては、例えば、加熱変性卵白を「特定の食品用タンパク質分解酵素」処理することにより得られる分解物（ＰＥＷ）は、適度な分子量のペプチドを含んでいること、あるいは生成した様々なペプチドの混合物として適度な分子量の分布を有するものを含んでいることが考えられる。すなわち、ＰＥＷに含まれるペプチド（混合物）は、Ｔｒｅｇ細胞（制御性Ｔ細胞）に対しては免疫寛容を誘導するのに適した抗原となる（Ｔ細胞エピトープを有する）一方、Ｂ細胞に対しては抗体を産生させる抗原とはならず、経皮膚感作を防ぐことができ、またＳ－ＩｇＥ（特異的ＩｇＥ）に対する抗原ともならず、アレルギー症状を起こさないことが考えられる。
【0015】
これに対して、食品用タンパク質分解酵素で分解されていない加熱変性卵白（ＥＷ）は、Ｔｒｅｇ細胞に作用して一定程度の免疫寛容を誘導することはできるかもしれないが、Ｔｈ２細胞への分化誘導（Ｔｈ２細胞の増殖）を抑制し、サイトカイン（ＩＬ－１３等）の産生を抑制する効果は、ＰＥＷの方が優れている（実施例４参照）。ＥＷには、Ｂ細胞に作用して抗体を産生させ、経皮膚感作を引き起こしたり、Ｓ－ＩｇＥに作用してアレルギー症状を引き起こしたりするおそれもある。
【0016】
また、「特定の食品用タンパク質分解酵素」以外の食品用タンパク質分解酵素を用いた場合は、Ｔｒｅｇ細胞に対して必要なＴ細胞エピトープまで分解されてしまい、免疫寛容を誘導できない、または免疫寛容の誘導の安定性に欠ける場合がある。
【0017】
但し、本発明はこのような推察によって不当に制約されるものではなく、仮に他の理由によって、アスパルティックプロテアーゼ（例えばペプシン）または金属プロテアーゼ（例えばサーモライシン）を用いることにより本発明の作用効果が奏されるとしても、本発明は本明細書の記載により担保されるものである。
【図面の簡単な説明】
【0018】
【図1】図１は、実施例３における、加熱変性卵白に含まれるタンパク質（ペプチド）の分子量分布［Ａ］、ペプシン処理ＰＥＷ（ＰＥＷ１）に含まれるペプチドの分子量分布［Ｂ］、サモアーゼ（登録商標）ＰＣ１０Ｆ処理ＰＥＷ（ＰＥＷ２）に含まれるペプチドの分子量分布［Ｃ］、プロテアーゼＰ『アマノ』３ＳＤ処理ＰＥＷ（Ｒ-ＰＥＷ１）に含まれるペプチドの分子量分布［Ｄ］、およびプロチンＳＤ－ＡＹ１０処理ＰＥＷ（Ｒ-ＰＥＷ２）に含まれるペプチドの分子量分布［Ｅ］の測定結果を表す。
【図2】図２［Ａ］－［Ｂ］は、実施例４における、それぞれＯＶＡまたはＯＶＭに特異的な、ＩｇＥの血中濃度の測定結果を表す。また、図２［Ｃ］－［Ｄ］は、実施例３における、腸間膜リンパ節から分離し培養した細胞の細胞増殖率［Ｃ］と、培養上清中のＩＬ－１３濃度［Ｄ］の測定結果を表す。***：p<0.001, **：p<0.01，*：p<0.05，ノンパラメトリック検定：Kruskal-Wallis test，多重比較：Dunn’s multiplecomparisons test，n=7-8。
【図3】図３は、ＰＥＷ１等を用いた実施例５における、アナフィラキシーショックを反映する体温変化［Ａ］、およびｍＭＣＰ－１のサンプル投与前の血中濃度［Ｂ］と投与後の血中濃度［Ｃ］の測定結果を表す。***：p<0.001，**：p<0.01，*：p<0.05，ノンパラメトリック検定：Kruskal-Wallis test，多重比較：Dunn’s multiple comparisons test，n=13-15（血清中ＯＶＡｓＩｇＥが５０ｎｇ／ｍｌ以上）。
【図4】図４は、ＰＥＷ２等を用いた実施例６における、アナフィラキシーショック誘発を反映する体温変化［Ａ］、およびｍＭＣＰ－１のサンプル投与前の血中濃度［Ｂ］と投与後の血中濃度［Ｃ］の測定結果を表す。****：p<0.0001,*：p<0.05，ノンパラメトリック検定：Kruskal-Wallis test，多重比較：Dunn’s multiplecomparisons test，n=13（血清中ＯＶＡｓＩｇＥが５０ｎｇ／ｍｌ以上）。
【発明を実施するための形態】
【0019】
－経口免疫寛容剤－
本発明の卵アレルギーの予防または治療のための経口免疫寛容剤（本明細書において「本発明の経口免疫寛容剤」と称する。）は、特定の食品用タンパク質分解酵素（本発明において「特定酵素」と称する。）による加熱変性卵白の分解物（ＰＥＷ）を含む。
本発明の卵アレルギーの予防または治療のための経口免疫寛容剤（本明細書において「本発明の経口免疫寛容剤」と称する。）は、特定の食品用タンパク質分解酵素（本発明において「特定酵素」と称する。）による加熱変性卵白の分解物（ＰＥＷ）を含む。
【0020】
本発明の経口免疫寛容剤は、少なくともＰＥＷを有効成分として含み、必要に応じてその他の成分をさらに含んでいてもよい。すなわち、本発明の経口免疫寛容剤は、ＰＥＷのみからなるものであってもよいし、それと同様に卵アレルギーの予防または治療に有効な他の成分や、食品用の添加剤として用いられている各種の成分をさらに含むものであってもよい。
【0021】
本発明の経口免疫寛容剤は、水、緩衝液等の適切な溶媒に溶解した液状の形態であってもよいし、そのような液状の形態で調製された後に粉末化等の処理がなされた粉末状その他の固形状であってもよい。例えば、ＰＥＷをスプレードライ、フリーズドライなどにより粉末化し、その際に必要に応じて添加剤（賦形剤、着色料、香料、甘味料等）を配合した上で、粉末状の経口免疫寛容剤を製造することができる。例えば、サプリメント（栄養補助食品）のように、散剤（粉末剤）、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、その他の固形状の剤形、ゼリー剤、液剤などの剤形となるよう、適切な添加剤を用いて経口免疫寛容剤を製造してもよい。
【0022】
（ＰＥＷ）
本発明で用いられるＰＥＷは、卵白を加熱して変性させたものを、特定酵素によって分解することにより調製される物質である。卵白の加熱温度は、卵白に含まれるタンパク質（オボアルブミン、オボムコイド等）の変性が起こるのに十分な温度、少なくとも６０～８０℃、またはそれ以上で、例えば沸騰水中で、十分な時間をかけて行えばよい。卵白は、保存性のためあらかじめ乾燥粉末化しておき、ＰＥＷの調製の際にそれを水等に再分散させて加熱するようにしてもよい。
本発明で用いられるＰＥＷは、卵白を加熱して変性させたものを、特定酵素によって分解することにより調製される物質である。卵白の加熱温度は、卵白に含まれるタンパク質（オボアルブミン、オボムコイド等）の変性が起こるのに十分な温度、少なくとも６０～８０℃、またはそれ以上で、例えば沸騰水中で、十分な時間をかけて行えばよい。卵白は、保存性のためあらかじめ乾燥粉末化しておき、ＰＥＷの調製の際にそれを水等に再分散させて加熱するようにしてもよい。
【0023】
なお、本発明では、卵白全体の加熱変性物を、特定酵素により分解する対象とすることができ、従来技術のように、卵白に含まれる主要なアレルゲンであるオボアルブミンまたはオボムコイドを卵白から抽出した（その他のタンパク質および非タンパク質成分を除去した）上で加熱変性したものを対象とする必要はない。ニワトリの卵白には、オボアルブミンおよびオボムコイド以外にも、オボトランスフェリン（コンアルブミン）、リゾチームなどのアレルゲン性を有するタンパク質が含まれている。また、加熱変性させた卵白の特定酵素による分解物と、加熱変性させていない卵白の特定酵素による分解物は、加熱変性の有無によって酵素による切断箇所が変化し、生成するペプチド混合物の組成が同一とはならないため、物質として区別できるものである。
【0024】
また、「卵白」は、全卵から（卵黄と）分離された状態の卵白であってもよいし、全卵に含まれたままの状態の卵白であってもよい。すなわち、「加熱変性卵白」の特定酵素による分解物は、全卵から分離した卵白の加熱変性物を酵素処理することにより得られるものであってもよいし、全卵に含まれたままの卵白の加熱変性物を酵素処理することにより得られるものであってもよい。
【0025】
換言すれば、加熱変性卵白の特定酵素による分解物を「含む」本発明の経口免疫寛容剤は、「卵白」（タンパク質）の加熱変性物の特定酵素による分解物だけでなく、全卵に含まれたままの卵白の加熱変性物を酵素処理したときに自ずと生成する、「卵黄」（タンパク質）の加熱変性物の特定酵素による分解物を一緒に含むものであってもよい。加熱変性卵白の特定酵素による分解物を「含む」本発明の食品組成物、およびその他の関連する発明においても同様である。そのような実施形態の発明に関しては、本明細書における「加熱変性卵白」（の特定酵素による分解物）を、「加熱変性全卵」（の特定酵素による分解物）と読み替えることも可能である。
【0026】
（特定酵素）
本発明で用いられる「特定酵素」は、様々な微生物に由来する、各種の食品用タンパク質分解酵素（プロテアーゼ、ペプチダーゼ等）のうち、本発明の作用効果を奏することのできるもの、すなわちその酵素で処理された加熱変性卵白を用いることで卵アレルギーを予防等できるものを指す。特定酵素としては、例えば、「アスパルティックプロテアーゼ」（「アスパラギン酸プロテアーゼ」と呼ばれることもある。）および「金属プロテアーゼ」（「メタロプロテアーゼ」と呼ばれることもある。）が挙げられる。アスパルティックプロテアーゼおよび金属プロテアーゼとしてはそれぞれ様々な種類のものが知られており、食品用の一般的なものを本発明においても用いることができる。特定酵素は、至適温度、至適ｐＨなどを考慮した条件下で、適切な時間、加熱変性卵白に作用させればよい。
本発明で用いられる「特定酵素」は、様々な微生物に由来する、各種の食品用タンパク質分解酵素（プロテアーゼ、ペプチダーゼ等）のうち、本発明の作用効果を奏することのできるもの、すなわちその酵素で処理された加熱変性卵白を用いることで卵アレルギーを予防等できるものを指す。特定酵素としては、例えば、「アスパルティックプロテアーゼ」（「アスパラギン酸プロテアーゼ」と呼ばれることもある。）および「金属プロテアーゼ」（「メタロプロテアーゼ」と呼ばれることもある。）が挙げられる。アスパルティックプロテアーゼおよび金属プロテアーゼとしてはそれぞれ様々な種類のものが知られており、食品用の一般的なものを本発明においても用いることができる。特定酵素は、至適温度、至適ｐＨなどを考慮した条件下で、適切な時間、加熱変性卵白に作用させればよい。
【0027】
「アスパルティックプロテアーゼ」の具体例としては、ペプシン（EC.3.4.23.1-3）、キモシン（EC 3.4.23.4）、カテプシンＤ（EC 3.4.23.5）が挙げられるが、その他の食品用に使用されている、様々な微生物に由来する公知のアスパルティックプロテアーゼを使用することも可能である。
【0028】
「金属プロテアーゼ」の具体例としては、サーモライシン（EC.3.4.24.27）が挙げられるが、その他の食品用に使用されている、様々な微生物に由来する公知の金属プロテアーゼを使用することも可能である。例えば、「サモアーゼ（登録商標）ＰＣ１０Ｆ」（天野エンザイム株式会社製、Geobacillus stearothermophilus由来）は、サーモライシンを含む食品用プロテアーゼとして市販されている。
【0029】
なお、食品用タンパク質分解酵素としては、他にもセリンプロテアーゼ（トリプシン、キモトリプシン、トロンビン、プラスミン、エラスターゼ、ズブチリシンなど、例えば実施例で用いた「プロテアーゼＰ『アマノ』３ＳＤ」、「プロチンＳＤ－ＡＹ１０」などの製品）、チオールプロテアーゼ（パパイン、フィシン、ブロメライン、カテプシンＢなど）も知られている。しかしながら、経口摂取したときの卵アレルギーの予防または治療の効果、例えばｓ－ＩｇＥの産生を抑制する効果における安定性は、ペプシン等のアスパルティックプロテアーゼおよびサーモライシン等の金属プロテアーゼの方が、セリンプロテアーゼ等よりも優れている。
【0030】
ただし、後記実施例４（図２）に示されているように、「プロテアーゼＰ『アマノ』３ＳＤ」を用いた加熱変性卵白分解物（Ｒ－ＰＥＷ１）は、ＯＶＭ（オボムコイド）特異的ＩｇＥ抗体の産生を抑制する（血中濃度を低下させる）作用が認められる。オボムコイドは加熱によって変性しにくく、オボアルブミンよりもアレルゲン性の高い卵白中のタンパク質である。したがって、本発明の一実施形態において、特定酵素として、「プロテアーゼＰ『アマノ』３ＳＤ」を使用することも可能である。
【0031】
（卵）
本発明における「卵」は、典型的にはニワトリの卵（鶏卵）である。すなわち、本発明の典型的な実施形態において、経口免疫寛容剤の製造に用いられる加熱変性卵白は鶏卵の卵白であり、本発明によって予防等をする卵アレルギーは、鶏卵のアレルギーである。しかしながら本発明における卵は鶏卵に限定されるものではなく、例えばウズラ、アヒル、その他の食用の鳥類の卵のように、鶏卵のアレルゲンタンパク質と相同性の高いタンパク質を含有する卵（加熱変性卵白）を用いて、その卵のアレルギーを予防または治療するために、本発明を実施できる可能性もあると考えられる。
本発明における「卵」は、典型的にはニワトリの卵（鶏卵）である。すなわち、本発明の典型的な実施形態において、経口免疫寛容剤の製造に用いられる加熱変性卵白は鶏卵の卵白であり、本発明によって予防等をする卵アレルギーは、鶏卵のアレルギーである。しかしながら本発明における卵は鶏卵に限定されるものではなく、例えばウズラ、アヒル、その他の食用の鳥類の卵のように、鶏卵のアレルゲンタンパク質と相同性の高いタンパク質を含有する卵（加熱変性卵白）を用いて、その卵のアレルギーを予防または治療するために、本発明を実施できる可能性もあると考えられる。
【0032】
（調製方法）
特定酵素としてペプシンを用いる場合、ＰＥＷは例えば次のような工程に従って調製することができる。ペプシン以外のアスパルティックプロテアーゼについても、必要に応じて改変した同様の工程とすることができる。
（１）あらかじめ乾燥粉末化しておいた卵白を水で希釈し、適切な濃度（例えば２０ｍｇ／ｍＬ）の卵白水溶液を調製する。
（２）卵白水溶液を、卵白の変性にとって適切な温度（例えば沸騰水中）で、適切な時間（例えば約１０分）加熱する。
（３）加熱変性卵白水溶液のｐＨを、酸（例えばＨＣｌ）を添加して、ペプシンにとって適切な範囲（例えば１．５）に調節する。
（４）加熱変性卵白水溶液に適量（例えば加熱変性卵白水溶液に対して２ｗｔ％）のペプシンを添加する。
（５）加熱変性卵白水溶液を、ペプシンを作用させるのに適切な温度（例えば３７℃）で、適切な時間（例えば１８０分）保持する。
（６）ペプシン処理加熱変性卵白水溶液のｐＨを、アルカリ（例えばＮａＯＨ）を添加して中性付近に調節する。
（７）ペプシン処理加熱変性卵白水溶液を、酵素を失活させるのに適切な温度（例えば沸騰水中）で、適切な時間（例えば約１５分）加熱する。
特定酵素としてペプシンを用いる場合、ＰＥＷは例えば次のような工程に従って調製することができる。ペプシン以外のアスパルティックプロテアーゼについても、必要に応じて改変した同様の工程とすることができる。
（１）あらかじめ乾燥粉末化しておいた卵白を水で希釈し、適切な濃度（例えば２０ｍｇ／ｍＬ）の卵白水溶液を調製する。
（２）卵白水溶液を、卵白の変性にとって適切な温度（例えば沸騰水中）で、適切な時間（例えば約１０分）加熱する。
（３）加熱変性卵白水溶液のｐＨを、酸（例えばＨＣｌ）を添加して、ペプシンにとって適切な範囲（例えば１．５）に調節する。
（４）加熱変性卵白水溶液に適量（例えば加熱変性卵白水溶液に対して２ｗｔ％）のペプシンを添加する。
（５）加熱変性卵白水溶液を、ペプシンを作用させるのに適切な温度（例えば３７℃）で、適切な時間（例えば１８０分）保持する。
（６）ペプシン処理加熱変性卵白水溶液のｐＨを、アルカリ（例えばＮａＯＨ）を添加して中性付近に調節する。
（７）ペプシン処理加熱変性卵白水溶液を、酵素を失活させるのに適切な温度（例えば沸騰水中）で、適切な時間（例えば約１５分）加熱する。
【0033】
特定酵素として「サモアーゼ（登録商標）ＰＣ１０Ｆ」を用いる場合、ＰＥＷは例えば次のような工程に従って調製することができる。「サモアーゼ（登録商標）ＰＣ１０Ｆ」（サーモライシン）以外の金属プロテアーゼについても、必要に応じて改変した同様の工程とすることができる。
（１）あらかじめ乾燥粉末化しておいた卵白を水で希釈し、適切な濃度（例えば２０ｍｇ／ｍＬ）の卵白水溶液を調製する。
（２）卵白水溶液を、卵白の変性にとって適切な温度（例えば沸騰水中）で、適切な時間（例えば約１０分）加熱する。
（３）加熱変性卵白水溶液のｐＨを、アルカリ（例えばＮａＯＨ）を添加して、「サモアーゼ（登録商標）ＰＣ１０Ｆ」にとって適切な範囲（例えば８．０）に調節する。
（４）加熱変性卵白水溶液に適量の「サモアーゼ（登録商標）ＰＣ１０Ｆ」（例えば加熱変性卵白水溶液に対して５ｗｔ％）を添加する。
（５）加熱変性卵白水溶液を、「サモアーゼ（登録商標）ＰＣ１０Ｆ」を作用させるのに適切な温度（例えば６５℃）で、適切な時間（例えば１８０分）保持する。
（６）「サモアーゼ（登録商標）ＰＣ１０Ｆ」処理加熱変性卵白水溶液のｐＨを、必要があれば酸を添加して中性付近に調節する。
（７）「サモアーゼ（登録商標）ＰＣ１０Ｆ」処理加熱変性卵白水溶液を、酵素を失活させるのに適切な温度（例えば沸騰水中）で、適切な時間（例えば約１５分）加熱する。
（１）あらかじめ乾燥粉末化しておいた卵白を水で希釈し、適切な濃度（例えば２０ｍｇ／ｍＬ）の卵白水溶液を調製する。
（２）卵白水溶液を、卵白の変性にとって適切な温度（例えば沸騰水中）で、適切な時間（例えば約１０分）加熱する。
（３）加熱変性卵白水溶液のｐＨを、アルカリ（例えばＮａＯＨ）を添加して、「サモアーゼ（登録商標）ＰＣ１０Ｆ」にとって適切な範囲（例えば８．０）に調節する。
（４）加熱変性卵白水溶液に適量の「サモアーゼ（登録商標）ＰＣ１０Ｆ」（例えば加熱変性卵白水溶液に対して５ｗｔ％）を添加する。
（５）加熱変性卵白水溶液を、「サモアーゼ（登録商標）ＰＣ１０Ｆ」を作用させるのに適切な温度（例えば６５℃）で、適切な時間（例えば１８０分）保持する。
（６）「サモアーゼ（登録商標）ＰＣ１０Ｆ」処理加熱変性卵白水溶液のｐＨを、必要があれば酸を添加して中性付近に調節する。
（７）「サモアーゼ（登録商標）ＰＣ１０Ｆ」処理加熱変性卵白水溶液を、酵素を失活させるのに適切な温度（例えば沸騰水中）で、適切な時間（例えば約１５分）加熱する。
【0034】
ＰＥＷには、卵白に含まれていたオボアルブミン、オボムコイド等のタンパク質の特定酵素による分解物（ペプチド混合物）と、それ以外の成分とが含まれている。特定酵素を用いた処理の実施形態（特定酵素の種類、処理時間、処理温度、その他の処理条件等）により、タンパク質の分解のされ方は変動し、得られるペプチド混合物の組成や分子量分布も変動しうるが、本発明の作用効果が奏される限りそのような変動は許容される。ペプチド混合物の分子量分布は、周知慣用の方法、例えばサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）を用いて、適切な条件下で測定することができる。なお、標準的な鶏卵には、水分が約９０％、タンパク質が約１０％含まれており、タンパク質中には、オボアルブミンが約５４％、オボムコイドが約１１％、オボトランスフェリンが約１２％含まれている。
【0035】
（用途）
本発明の経口免疫寛容剤は、それ自体を単独でサプリメントのような食品として摂取することもできるし、他の食品に適量加えて摂取することもできる。また、本発明の経口免疫寛容剤をあらかじめ調製しておいて、本発明の食品組成物を製造するための原料の一部として、特に経口免疫寛容を誘導するための成分として、食品組成物に配合するようにしてもよい。
本発明の経口免疫寛容剤は、それ自体を単独でサプリメントのような食品として摂取することもできるし、他の食品に適量加えて摂取することもできる。また、本発明の経口免疫寛容剤をあらかじめ調製しておいて、本発明の食品組成物を製造するための原料の一部として、特に経口免疫寛容を誘導するための成分として、食品組成物に配合するようにしてもよい。
【0036】
しかしながら、本発明の経口免疫寛容剤の用途は上記のようなものに限定されるものではなく、卵アレルギーの予防または治療という作用効果に関係する様々な目的のために使用することができる。例えば、卵アレルギーの経口免疫寛容に関係する可能性のある細胞（Ｔｒｅｇ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、その他の免疫に関係する細胞等）または抗体（ｓ－ＩｇＥ）との相互作用を分析することなどを目的として、加熱変性卵白の特定酵素分解物をin vitroで用いる実施形態も、本発明の経口免疫寛容剤の一実施形態である。
【0037】
本発明の経口免疫寛容剤は、卵アレルギーの予防または治療のために経口免疫寛容を誘導したい対象に摂取させる（投与する）ことができる。そのような対象は、ヒトであってもよいし、ヒト以外の哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、スナネズミ、ハムスター、フェレット、イヌ、ミニブタ、サル、ウシ、ウマ、ヒツジなど）であってもよい。また、ヒトを対象とする場合は、乳幼児、例えば離乳食を摂取するようになる生後６ヶ月頃から、１歳頃まで、あるいは卵アレルギーが発症しやすい小学校就学前の年齢までの、乳幼児に摂取させることが好ましい。卵アレルギーを予防する場合は、卵白由来のアレルゲン、代表的にはオボアルブミン（ＯＶＡ）、オボムコイド（ＯＶＭ）などに感作されていない対象に本発明の経口免疫寛容剤を経口摂取させればよく、卵アレルギーを治療する場合は、それらのアレルゲンに感作されている対象に本発明の経口免疫寛容剤を経口摂取させればよい。
【0038】
本発明の経口免疫寛容剤の一日あたりの摂取目安量、または一食あたりの摂取目安量および一日あたりの摂取回や、摂取する期間（日数）は、本発明の経口免疫寛容の実施形態、それを経口摂取させる（経口投与する）対象の年齢、体重、性別や、卵アレルギーと関係性を有する指標や属性（卵白由来のアレルゲンに感作しているか、アトピー性皮膚炎を発症しているか等）、期待される卵アレルギーの予防または治療の効果の程度、さらにヒトまたはヒト以外の哺乳動物を対象とした非臨床的または臨床的な試験結果等に基づいて、適宜設定することができる。
【0039】
本発明の経口免疫寛容剤の、卵アレルギーを予防する効果については、例えば次のような方法により評価することができる。
（Ａ１）対象（例えばマウス）に本発明の経口免疫寛容剤を一定期間経口摂取させる（経口投与する）。
（Ａ２）卵白に含まれる主要なアレルゲンであるオボアルブミン（ＯＶＡ）、またはＯＶＡとオボムコイド（ＯＶＭ）を、必要に応じてアジュバンド（例えばアルミニウム塩）とともに、対象の腹腔内に投与（注射）して感作させる。この工程は、必要に応じて一定期間をおいて複数回行ってもよい。
（Ａ３）対象から採血し、ＯＶＡまたはＯＶＭに対して特異的な抗体（ＩｇＥ）の濃度を測定する。上記（Ａ１）において、本発明の経口免疫寛容剤以外の物質（例えば水、タンパク質加水分解酵素により分解されていない卵白（ＥＷ））を経口摂取させたコントロール群と比較して、抗体濃度における統計学的な有意差の有無を検定する。例えば、水を経口摂取させたコントロール群と比較して、抗体濃度が統計学的に有意に低ければ、本発明の経口免疫寛容剤を事前に経口摂取させることにより卵白アレルゲンに対するＩｇＥ抗体の産生を抑制できる、つまり卵アレルギーを予防できる作用効果が奏されたと評価できる。
（Ａ１）対象（例えばマウス）に本発明の経口免疫寛容剤を一定期間経口摂取させる（経口投与する）。
（Ａ２）卵白に含まれる主要なアレルゲンであるオボアルブミン（ＯＶＡ）、またはＯＶＡとオボムコイド（ＯＶＭ）を、必要に応じてアジュバンド（例えばアルミニウム塩）とともに、対象の腹腔内に投与（注射）して感作させる。この工程は、必要に応じて一定期間をおいて複数回行ってもよい。
（Ａ３）対象から採血し、ＯＶＡまたはＯＶＭに対して特異的な抗体（ＩｇＥ）の濃度を測定する。上記（Ａ１）において、本発明の経口免疫寛容剤以外の物質（例えば水、タンパク質加水分解酵素により分解されていない卵白（ＥＷ））を経口摂取させたコントロール群と比較して、抗体濃度における統計学的な有意差の有無を検定する。例えば、水を経口摂取させたコントロール群と比較して、抗体濃度が統計学的に有意に低ければ、本発明の経口免疫寛容剤を事前に経口摂取させることにより卵白アレルゲンに対するＩｇＥ抗体の産生を抑制できる、つまり卵アレルギーを予防できる作用効果が奏されたと評価できる。
【0040】
本発明の経口免疫寛容剤の安全性については、例えば次のような方法により、アナフィラキシーショックを起こす危険性及び経皮膚感作の可能性の観点から評価することができる。
（Ｂ１）上記（Ａ２）と同様に、対象に、ＯＶＡ、またはＯＶＡとＯＶＭを、必要に応じてアジュバンドとともに、対象の腹腔内に投与（注射）して感作させる。
（Ｂ２）感作から一定期間経過後、対象に本発明の経口免疫寛容剤を腹腔内投与する。
（Ｂ３）投与前と投与後（例えば３０分後）の対象の体温の変化を測定する。上記（Ｂ２）において、本発明の経口免疫寛容剤以外の物質（例えば水、ＥＷ）を投与したコントロール群と比較して、体温変化における統計学的な有意差の有無を検定する。例えば、水を投与したコントロール群と比較して、体温変化に統計学的な有意差がなければ、本発明の経口免疫寛容剤によってアナフィラキシーによる体温変化（低下）は起きない、つまり危険性が低いと評価できる。
（Ｃ１）対象（例えばマウス）の皮膚炎症部に本発明の経口免疫寛容剤を一定期間貼付する）。この工程は、必要に応じて一定期間をおいて複数回行ってもよい。
（Ｃ２）対象から採血し、ＯＶＡまたはＯＶＭに対して特異的な抗体（ＩｇＥ）の濃度を測定する。上記（Ｃ１）において、本発明の経口免疫寛容剤以外の物質（例えば水、ＥＷ）を貼付したコントロール群と比較して、抗体濃度における統計学的な有意差の有無を検定する。例えば、水を投与したコントロール群と比較して、抗体濃度に統計学的な有意差がなければ、本発明の経口免疫寛容剤によっては、ＯＶＡまたはＯＶＭに対する抗体は産生されにくい、つまり経皮膚感作の可能性が低いと評価できる。
（Ｂ１）上記（Ａ２）と同様に、対象に、ＯＶＡ、またはＯＶＡとＯＶＭを、必要に応じてアジュバンドとともに、対象の腹腔内に投与（注射）して感作させる。
（Ｂ２）感作から一定期間経過後、対象に本発明の経口免疫寛容剤を腹腔内投与する。
（Ｂ３）投与前と投与後（例えば３０分後）の対象の体温の変化を測定する。上記（Ｂ２）において、本発明の経口免疫寛容剤以外の物質（例えば水、ＥＷ）を投与したコントロール群と比較して、体温変化における統計学的な有意差の有無を検定する。例えば、水を投与したコントロール群と比較して、体温変化に統計学的な有意差がなければ、本発明の経口免疫寛容剤によってアナフィラキシーによる体温変化（低下）は起きない、つまり危険性が低いと評価できる。
（Ｃ１）対象（例えばマウス）の皮膚炎症部に本発明の経口免疫寛容剤を一定期間貼付する）。この工程は、必要に応じて一定期間をおいて複数回行ってもよい。
（Ｃ２）対象から採血し、ＯＶＡまたはＯＶＭに対して特異的な抗体（ＩｇＥ）の濃度を測定する。上記（Ｃ１）において、本発明の経口免疫寛容剤以外の物質（例えば水、ＥＷ）を貼付したコントロール群と比較して、抗体濃度における統計学的な有意差の有無を検定する。例えば、水を投与したコントロール群と比較して、抗体濃度に統計学的な有意差がなければ、本発明の経口免疫寛容剤によっては、ＯＶＡまたはＯＶＭに対する抗体は産生されにくい、つまり経皮膚感作の可能性が低いと評価できる。
【0041】
上記の各種の評価方法のより具体的な実施形態については、本明細書の実施例を参照することができる。このような評価方法を通じて、統計学的有意差の有無や有意水準等を考慮することにより、より好ましい実施形態の経口免疫寛容剤（またはそれを含む食品組成物）、例えば特定酵素による処理の好ましい条件、ヒトまたはヒト以外の哺乳動物に対する摂取のさせ方、すなわち１回あたりの量や期間などを追究することが可能である。
【0042】
－食品組成物－
本発明の食品組成物は、少なくとも加熱変性卵白の特定酵素による分解物（ＰＥＷ）、例えばアスパルティックプロテアーゼ（ペプシン等）または金属プロテアーゼ（サモアーゼ（登録商標）ＰＣ１０Ｆ等）による分解物、すなわち本発明の経口免疫寛容剤を含み、さらに食品組成物の実施形態に応じた少なくとも１種の食品原料、食品用添加物、その他の成分を含む。
本発明の食品組成物は、少なくとも加熱変性卵白の特定酵素による分解物（ＰＥＷ）、例えばアスパルティックプロテアーゼ（ペプシン等）または金属プロテアーゼ（サモアーゼ（登録商標）ＰＣ１０Ｆ等）による分解物、すなわち本発明の経口免疫寛容剤を含み、さらに食品組成物の実施形態に応じた少なくとも１種の食品原料、食品用添加物、その他の成分を含む。
【0043】
本発明の食品組成物は、典型的には、卵アレルギーの予防または治療用の食品組成物（食品用途発明）である。また、このような用途を標榜しないとしても、本発明の食品組成物は、卵アレルギーを発症する可能性のある対象（例えば乳幼児）に対して、あるいは卵アレルギーおよび／またはアトピー性皮膚炎を発症している対象に対して、危険性の低い食品組成物として摂取させることができるものである。
【0044】
本発明の食品組成物の種類は特に限定されるものではなく、一般的な食品と同様の種類のものとして製造することができる。そのような食品としては、例えば、清涼飲料（ジュース、コーヒー飲料、茶系飲料、ミネラルウォーター、スポーツ飲料等）、乳飲料、豆乳飲料、発酵乳（ヨーグルト）、乳酸菌飲料、ココア、インスタント粉末から調製される飲料、ゼリー、プリン、菓子類（ビスケット、クッキー、チョコレートなど）、パン、シリアル、惣菜、調味料（マヨネーズ、ドレッシング等）などが挙げられる。また、本発明の食品組成物は、乳幼児が摂取するのに適したベビーフードの形態とすることが好ましく、例えば、上に例示した各種の食品を、ウェットタイプ（レトルト食品や瓶詰め等の液状又は半固形状の食品）またはドライタイプ（水や湯を加えて元の形状にして食べる、粉末状、顆粒状、フレーク状、固形状の食品）のベビーフードとして製造することが好ましい。
【0045】
本発明の食品組成物中のＰＥＷ（本発明の経口免疫寛容剤）の含有量は、食品組成物を摂取することによって卵アレルギーを予防または治療する作用効果が奏される範囲にある限り、特に限定されるものではない。そのような含有量は、一食または一日あたりのＰＥＷ（有効成分としての経口免疫寛容剤）の量や摂取される食品組成物の重量などを考慮して、また食品組成物の形態や製造方法なども適宜考慮して、設定することができる。なお、本発明の食品組成物との関係における一食または一日あたりのＰＥＷの量は、本発明の経口免疫寛容剤との関係で前述した通りである。
【0046】
本発明の食品組成物は、原料の一つとしてＰＥＷ（本発明の経口免疫寛容剤）を配合する工程をさらに含むこと以外は、従来の食品組成物と同様の方法により製造することができる。ＰＥＷは、前述したようにしてあらかじめ調製しておき、食品組成物の製造までの間保管しておくことができる。
【0047】
本発明の食品組成物について、卵アレルギーの治療または予防用であるという用途は、直接的にまたは間接的に表示することができる。直接的な表示の例は、製品自体、パッケージ、容器、ラベル、タグ等の有体物への記載であり、間接的な表示の例は、ウェブサイト、店頭、展示会、看板、掲示板、新聞、雑誌、テレビ、ラジオ、郵送物、電子メール等の場所または手段による、広告・宣伝活動である。
【実施例】
【0048】
［実施例１］ペプシン処理ＰＥＷ（ＰＥＷ１）の調製
鶏卵の卵白の乾燥粉末を純水に加え、２０ｍｇ／ｍＬの濃度の卵白水溶液を調製した。卵白水溶液を沸騰水中で加熱し、１０分間保持した。得られた加熱変性卵白水溶液に塩酸を加えてｐＨを１．５に調節した。加熱変性卵白水溶液に２ｗｔ％のペプシン (Pepsin from porcine gastric mucosa powder ≧250 units/mg solid, SIGMA)を加え、３７℃で１８０分間保持した。得られたペプシン処理加熱変性卵白水溶液に水酸化ナトリウムを加えて中和し、その後沸騰水中で１５分間加熱し酵素を失活させた。得られた水溶液をＰＥＷ１の水溶液とした。
鶏卵の卵白の乾燥粉末を純水に加え、２０ｍｇ／ｍＬの濃度の卵白水溶液を調製した。卵白水溶液を沸騰水中で加熱し、１０分間保持した。得られた加熱変性卵白水溶液に塩酸を加えてｐＨを１．５に調節した。加熱変性卵白水溶液に２ｗｔ％のペプシン (Pepsin from porcine gastric mucosa powder ≧250 units/mg solid, SIGMA)を加え、３７℃で１８０分間保持した。得られたペプシン処理加熱変性卵白水溶液に水酸化ナトリウムを加えて中和し、その後沸騰水中で１５分間加熱し酵素を失活させた。得られた水溶液をＰＥＷ１の水溶液とした。
【0049】
［実施例２］「サモアーゼ（登録商標）ＰＣ１０Ｆ」を用いたＰＥＷ（ＰＥＷ２）の調製
鶏卵の卵白の乾燥粉末を純水に加え、２０ｍｇ／ｍＬの濃度の卵白水溶液を調製した。卵白水溶液を沸騰水中で加熱し、１０分間保持した。得られた加熱変性卵白水溶液に水酸化ナトリウムを加えてｐＨを８．０に調節した。加熱変性卵白水溶液に５ｗｔ％の「サモアーゼ（登録商標）ＰＣ１０Ｆ」（天野エンザイム株式会社、以下「ＰＣ１０Ｆ」と略記する。）を加え、６５℃で１８０分間保持した。その後沸騰水中で１５分間加熱し酵素を失活させた。得られたＰＣ１０Ｆ処理加熱変性卵白水溶液をＰＥＷ２の水溶液とした。
鶏卵の卵白の乾燥粉末を純水に加え、２０ｍｇ／ｍＬの濃度の卵白水溶液を調製した。卵白水溶液を沸騰水中で加熱し、１０分間保持した。得られた加熱変性卵白水溶液に水酸化ナトリウムを加えてｐＨを８．０に調節した。加熱変性卵白水溶液に５ｗｔ％の「サモアーゼ（登録商標）ＰＣ１０Ｆ」（天野エンザイム株式会社、以下「ＰＣ１０Ｆ」と略記する。）を加え、６５℃で１８０分間保持した。その後沸騰水中で１５分間加熱し酵素を失活させた。得られたＰＣ１０Ｆ処理加熱変性卵白水溶液をＰＥＷ２の水溶液とした。
【0050】
［参考例１］「プロテアーゼＰ『アマノ』３ＳＤ」を用いた加熱変性卵白分解物（Ｒ－ＰＥＷ１）の調製
鶏卵の卵白の乾燥粉末を純水に加え、２０ｍｇ／ｍＬの濃度の卵白水溶液を調製した。卵白水溶液を沸騰水中で加熱し、１０分間保持した。得られた加熱変性卵白水溶液に水酸化ナトリウムを加えてｐＨを８．０に調節した。加熱変性卵白水溶液に６．７ｗｔ％の「プロテアーゼＰ『アマノ』３ＳＤ」（天野エンザイム株式会社、以下「Ｐ３ＳＤ」と略記する。）を加え、４０℃で１８０分間保持した。その後沸騰水中で１５分間加熱し酵素を失活させた。得られたＰ３ＳＤ処理加熱変性卵白水溶液をＲ－ＰＥＷ１の水溶液とした。
鶏卵の卵白の乾燥粉末を純水に加え、２０ｍｇ／ｍＬの濃度の卵白水溶液を調製した。卵白水溶液を沸騰水中で加熱し、１０分間保持した。得られた加熱変性卵白水溶液に水酸化ナトリウムを加えてｐＨを８．０に調節した。加熱変性卵白水溶液に６．７ｗｔ％の「プロテアーゼＰ『アマノ』３ＳＤ」（天野エンザイム株式会社、以下「Ｐ３ＳＤ」と略記する。）を加え、４０℃で１８０分間保持した。その後沸騰水中で１５分間加熱し酵素を失活させた。得られたＰ３ＳＤ処理加熱変性卵白水溶液をＲ－ＰＥＷ１の水溶液とした。
【0051】
［参考例２］「プロチンＳＤ－ＡＹ１０」を用いた加熱変性卵白分解物（Ｒ－ＰＥＷ２）の調製
鶏卵の卵白の乾燥粉末を純水に加え、２０ｍｇ／ｍＬの濃度の卵白水溶液を調製した。卵白水溶液を沸騰水中で加熱し、１０分間保持した。得られた加熱変性卵白水溶液に水酸化ナトリウムを加えてｐＨを９．０に調節した。加熱変性卵白水溶液に８．３ｗｔ％の「プロチンＳＤ－ＡＹ１０」（天野エンザイム株式会社、以下「ＡＹ」と略記する。）を加え、６０℃で１８０分間保持した。その後沸騰水中で１５分間加熱し酵素を失活させた。得られたＡＹ処理加熱変性卵白水溶液をＲ－ＰＥＷ２の水溶液とした。
鶏卵の卵白の乾燥粉末を純水に加え、２０ｍｇ／ｍＬの濃度の卵白水溶液を調製した。卵白水溶液を沸騰水中で加熱し、１０分間保持した。得られた加熱変性卵白水溶液に水酸化ナトリウムを加えてｐＨを９．０に調節した。加熱変性卵白水溶液に８．３ｗｔ％の「プロチンＳＤ－ＡＹ１０」（天野エンザイム株式会社、以下「ＡＹ」と略記する。）を加え、６０℃で１８０分間保持した。その後沸騰水中で１５分間加熱し酵素を失活させた。得られたＡＹ処理加熱変性卵白水溶液をＲ－ＰＥＷ２の水溶液とした。
【0052】
［実施例３］加熱変性卵白に含まれるペプチドの分子量分布と、実施例１および２、ならびに参考例１および２で調製されたＰＥＷ１、ＰＥＷ２、Ｒ－ＰＥＷ１、Ｒ－ＰＥＷ２それぞれに含まれるペプチドの分子量分布を(株)島津製作所製ＨＰＬＣ（カラム：Superdex peptide 10/300GL、溶離液：0.1% TFA、30% CAN、吸光波長:214 nm）を用いて測定した。結果を図１に示す。
【0053】
［実施例４］種々の酵素を用いたＰＥＷの鶏卵アレルギーの予防効果の比較
試験動物（ＢＡＬＢ／ｃ系統、メス、３～４週齢）に、実施例１および２で調製したペプシン処理ＰＥＷ１および「サモアーゼ（登録商標）ＰＣ１０Ｆ」処理ＰＥＷ２、また参考例１および２で調製した「プロテアーゼＰ『アマノ』３ＳＤ」処理Ｒ－ＰＥＷ１および「プロチンＳＤ－ＡＹ１０」処理Ｒ－ＰＥＷ２を、それぞれ２ｍｇずつ５日間、経口投与した（day-18～-14）。その１週間後から５日間（day-11～-7）、試験動物に再度ＰＥＷ１および２、Ｒ－ＰＥＷ１および２をそれぞれ２ｍｇずつ５日間、経口投与した。その１週間後（day0）、オボアルブミン（ＯＶＡ）およびオボムコイド（ＯＶＭ）それぞれ１００μｇを、アジュバンドとしてのアルミニウム塩と共に、試験動物に腹腔内注射した。その２週間後（day14）、再度ＯＶＡおよびＯＶＭそれぞれ１００μｇを、アルミニウム塩と共に、試験動物に腹腔内注射した。その１３日後（day27）、試験動物から採血をし、それぞれＯＶＡまたはＯＶＭに特異的な、ＩｇＥの血中濃度を測定した。種々の酵素処理加熱変性卵白水溶液に代えて、水または２ｍｇの加熱変性卵白（ＥＷ）を経口投与したこと以外は同様にして、対照群を設けた。
試験動物（ＢＡＬＢ／ｃ系統、メス、３～４週齢）に、実施例１および２で調製したペプシン処理ＰＥＷ１および「サモアーゼ（登録商標）ＰＣ１０Ｆ」処理ＰＥＷ２、また参考例１および２で調製した「プロテアーゼＰ『アマノ』３ＳＤ」処理Ｒ－ＰＥＷ１および「プロチンＳＤ－ＡＹ１０」処理Ｒ－ＰＥＷ２を、それぞれ２ｍｇずつ５日間、経口投与した（day-18～-14）。その１週間後から５日間（day-11～-7）、試験動物に再度ＰＥＷ１および２、Ｒ－ＰＥＷ１および２をそれぞれ２ｍｇずつ５日間、経口投与した。その１週間後（day0）、オボアルブミン（ＯＶＡ）およびオボムコイド（ＯＶＭ）それぞれ１００μｇを、アジュバンドとしてのアルミニウム塩と共に、試験動物に腹腔内注射した。その２週間後（day14）、再度ＯＶＡおよびＯＶＭそれぞれ１００μｇを、アルミニウム塩と共に、試験動物に腹腔内注射した。その１３日後（day27）、試験動物から採血をし、それぞれＯＶＡまたはＯＶＭに特異的な、ＩｇＥの血中濃度を測定した。種々の酵素処理加熱変性卵白水溶液に代えて、水または２ｍｇの加熱変性卵白（ＥＷ）を経口投与したこと以外は同様にして、対照群を設けた。
【0054】
結果を図２［Ａ］および［Ｂ］に示す。ＯＶＡ特異的ＩｇＥおよびＯＶＭ特異的ＩｇＥのどちらについても、実施例１のＰＥＷ１およびＰＥＷ２を経口摂取させることにより、加熱変性卵白（図中のＥＷ）よりも高い確実性で、それらのＩｇＥの産生を抑制できる、つまり卵アレルギーを予防できると考えられる。一方、Ｒ－ＰＥＷ１およびＲ－ＰＥＷ２のＯＶＡ特異的ＩｇＥ抗体の血中濃度は、Ｗａｔｅｒ群と有意差が認められなかった。どのような食品用タンパク質分解酵素で処理した加熱変性卵白分解物であっても経口免疫寛容剤としての有用性を有するわけではなく、ペプシンや「サモアーゼ（登録商標）ＰＣ１０Ｆ」のような特定のものを選択して用いることによって初めて、経口免疫寛容剤としての有用性を有する加熱変性卵白分解物が得られることが示唆されている。
【0055】
さらに、採血から１週間後（day34）、試験動物を解剖して腸間膜リンパ節を採取し、そこに含まれる細胞を分離した。培地にＯＶＡを添加し、７２時間培養した後、まず培養上清を回収してそこに含まれるサイトカインＩＬ－１３をＥＬＩＳＡ法により定量した。また、培地に３Ｈチミジンを添加して細胞に取り込ませるアッセイにより、細胞増殖率を測定した。
【0056】
結果を図２［Ｃ］および［Ｄ］に示す。実施例１のＰＥＷ１は、感作マウス特有のＯＶＡ抗原特異的な細胞増殖［Ｃ］や抗原刺激特異的なＩＬ－１３の産生［Ｄ］が認められなかった。このことから、感作処置によるＴｈ２細胞への分化を、ＰＥＷ１の経口投与により抑制することができると考えられる。
【0057】
［実施例５］ＰＥＷ１のアナフィラキシーショックの危険性の評価
試験動物（ＢＡＬＢ／ｃ系統、メス、６週齢）に、オボアルブミン（ＯＶＡ）およびオボムコイド（ＯＶＭ）それぞれ１００μｇを、アジュバンドとしてのアルミニウム塩と共に、腹腔内注射し、これらのアレルゲンで試験動物を感作させた。その２週間後（day14）、再度ＯＶＡおよびＯＶＭそれぞれ１００μｇを、アルミニウム塩と共に、試験動物に腹腔内注射し、同様に感作させた。その１４日後（day28）、試験動物に、水、加熱変性卵白（ＥＷ）および実施例１のＰＥＷ１を、２００ｍｇ／ｋｇの量で腹腔内に投与した（腹腔内負荷試験）。投与時および投与から３０分後の体温を測定し、その体温変化を算出した。また、腹腔内負荷試験の２日前（day26）および試験後（day28）に試験動物から採血し、マスト細胞が活性化したときに産生されるマーカーであるｍＭＣＰ－１（mouse mast cell protease 1）の血中濃度を測定した。
試験動物（ＢＡＬＢ／ｃ系統、メス、６週齢）に、オボアルブミン（ＯＶＡ）およびオボムコイド（ＯＶＭ）それぞれ１００μｇを、アジュバンドとしてのアルミニウム塩と共に、腹腔内注射し、これらのアレルゲンで試験動物を感作させた。その２週間後（day14）、再度ＯＶＡおよびＯＶＭそれぞれ１００μｇを、アルミニウム塩と共に、試験動物に腹腔内注射し、同様に感作させた。その１４日後（day28）、試験動物に、水、加熱変性卵白（ＥＷ）および実施例１のＰＥＷ１を、２００ｍｇ／ｋｇの量で腹腔内に投与した（腹腔内負荷試験）。投与時および投与から３０分後の体温を測定し、その体温変化を算出した。また、腹腔内負荷試験の２日前（day26）および試験後（day28）に試験動物から採血し、マスト細胞が活性化したときに産生されるマーカーであるｍＭＣＰ－１（mouse mast cell protease 1）の血中濃度を測定した。
【0058】
結果を図３に示す。［Ａ］より、投与対象がＯＶＡおよびＯＶＭによって感作されている場合、加熱変性卵白（図中のＥＷ）を摂取するとアナフィラキシーショックによる体温変化（低下）が認められたが、実施例１のＰＥＷ１にはそのような体温変化は認められなかった。［Ｂ］より、ＭＣＰ－１の血中濃度は、腹腔内投与前には各群に差は認められないが、［Ｃ］より、投与後のＭＣＰ－１の血中濃度は、加熱変性卵白（図中のＥＷ）よりも実施例１のＰＥＷ１の方が有意に低かった。これらの結果から、アナフィラキシーショックを誘発する危険性は加熱変性卵白（ＥＷ）よりもそのペプシンによる処理物（ＰＥＷ１）の方が低いと考えられる。
【0059】
［実施例６］ＰＥＷ２のアナフィラキシーショックの危険性の評価
試験動物（ＢＡＬＢ／ｃ系統、メス、６週齢）を、実施例５と同様の手順で、ＯＶＡおよびＯＶＭに感作させた。２度目の腹腔内注射の１４日後（day28）、試験動物に、水、加熱変性卵白（ＥＷ）および実施例２のＰＥＷ２を、２００ｍｇ／ｋｇの量で腹腔内に投与した（腹腔内負荷試験）。腹腔内負荷試験の２日前（day26）および試験後（day28）に試験動物から採血し、マスト細胞が活性化したときに産生されるマーカーであるｍＭＣＰ－１（mouse mast cell protease 1）の血中濃度を測定した。
試験動物（ＢＡＬＢ／ｃ系統、メス、６週齢）を、実施例５と同様の手順で、ＯＶＡおよびＯＶＭに感作させた。２度目の腹腔内注射の１４日後（day28）、試験動物に、水、加熱変性卵白（ＥＷ）および実施例２のＰＥＷ２を、２００ｍｇ／ｋｇの量で腹腔内に投与した（腹腔内負荷試験）。腹腔内負荷試験の２日前（day26）および試験後（day28）に試験動物から採血し、マスト細胞が活性化したときに産生されるマーカーであるｍＭＣＰ－１（mouse mast cell protease 1）の血中濃度を測定した。
【0060】
結果を図４に示す。［Ａ］より、投与対象がＯＶＡおよびＯＶＭによって感作されている場合、加熱変性卵白（図中のＥＷ）を摂取するとアナフィラキシーショックによる体温変化（低下）が認められたが、実施例２のＰＥＷ２にはそのような体温変化は認められなかった。［Ｂ］より、ＭＣＰ－１の血中濃度は、腹腔内投与前には各群に差は認められないが、［Ｃ］より、投与後のＭＣＰ－１の血中濃度は、加熱変性卵白（図中のＥＷ）よりも実施例２のＰＥＷ２の方が有意に低かった。これらの結果から、アナフィラキシーショックを誘発する危険性は加熱変性卵白（ＥＷ）よりもその「サモアーゼ（登録商標）ＰＣ１０Ｆ」による処理物（ＰＥＷ２）の方が低いと考えられる。
【0061】
［実施例７］ＰＥＷ１の経皮膚感作の可能性の評価
試験動物（ＢＡＬＢ／ｃ系統、メス、６週齢）に、次の手順で経皮膚感作を行った。試験動物の背中の毛を刈り、クリームで除毛した後に、テープを貼って剥がす操作を３回行った後、水、４ｍｇの加熱変性卵白（ＥＷ）または４ｍｇの実施例１のＰＥＷ１を背中に貼付した。包帯を巻き付けて３日間保持した後、包帯を外して７日間保持した。このサイクルを、３回（day0～day9、day10～day19、day20～day29）行った。day31に採血し、ＯＶＡ特異的ＩｇＥ抗体およびＯＶＭ特異的ＩｇＥ抗体の血中濃度を測定した。さらに、day32に試験動物を解剖して脾臓を採取し、そこに含まれる細胞を分離した。培地にＯＶＡまたはＯＶＭを添加し、７２時間培養した後、培地に３Ｈチミジンを添加して細胞に取り込ませるアッセイにより、細胞増殖率を測定した。
試験動物（ＢＡＬＢ／ｃ系統、メス、６週齢）に、次の手順で経皮膚感作を行った。試験動物の背中の毛を刈り、クリームで除毛した後に、テープを貼って剥がす操作を３回行った後、水、４ｍｇの加熱変性卵白（ＥＷ）または４ｍｇの実施例１のＰＥＷ１を背中に貼付した。包帯を巻き付けて３日間保持した後、包帯を外して７日間保持した。このサイクルを、３回（day0～day9、day10～day19、day20～day29）行った。day31に採血し、ＯＶＡ特異的ＩｇＥ抗体およびＯＶＭ特異的ＩｇＥ抗体の血中濃度を測定した。さらに、day32に試験動物を解剖して脾臓を採取し、そこに含まれる細胞を分離した。培地にＯＶＡまたはＯＶＭを添加し、７２時間培養した後、培地に３Ｈチミジンを添加して細胞に取り込ませるアッセイにより、細胞増殖率を測定した。
【0062】
結果を図５に示す。ＯＶＡ特異的ＩｇＥ抗体［Ａ］およびＯＶＭ特異的ＩｇＥ抗体［Ｂ］のどちらの産生量も、実施例１のＰＥＷ１は加熱変性卵白（図中のＥＷ）よりも有意に低く、コントロール（図中のＷａｔｅｒ）と有意差がない程度にほとんど産生されなかった。これらの結果から、ペプシン処理加熱変性卵白分解物（ＰＥＷ１）の経皮膚感作を起こす危険性はほとんどない、少なくとも加熱変性卵白（ＥＷ）よりも低いと考えられる。さらに、ＯＶＡ刺激［Ｃ］において実施例１のＰＥＷ１は、加熱変性卵白（図中のＥＷ）よりも、抗原特異的な細胞増殖率が、統計的に有意な差はないものの低値を示し、ＯＶＭ刺激［Ｄ］についても、実施例１のＰＥＷ１は、加熱変性卵白（図中のＥＷ）よりも、抗原特異的細胞増殖が抑制されており、経皮膚感作の処置を行っても、ＯＶＡおよびＯＶＭ特異的に増殖するＴ細胞が分化されにくい点で優れていると考えられる。
【0063】
［実施例８］ＰＥＷ２の経皮膚感作の可能性の評価
試験動物（ＢＡＬＢ／ｃ系統、メス、６週齢）に、実施例１のＰＥＷ１に代えて実施例２のＰＥＷ２を用いたこと以外は実施例７と同様にして、経皮膚感作を行った後、ＯＶＡ特異的ＩｇＥ抗体およびＯＶＭ特異的ＩｇＥ抗体の血中濃度の測定と、脾臓細胞の増殖率の測定を行った。
試験動物（ＢＡＬＢ／ｃ系統、メス、６週齢）に、実施例１のＰＥＷ１に代えて実施例２のＰＥＷ２を用いたこと以外は実施例７と同様にして、経皮膚感作を行った後、ＯＶＡ特異的ＩｇＥ抗体およびＯＶＭ特異的ＩｇＥ抗体の血中濃度の測定と、脾臓細胞の増殖率の測定を行った。
【0064】
結果を図６に示す。ＯＶＡ特異的ＩｇＥ抗体［Ａ］およびＯＶＭ特異的ＩｇＥ抗体［Ｂ］のどちらの産生量も、実施例２のＰＥＷ２は加熱変性卵白（図中のＥＷ）よりも有意に低く、コントロール（図中のＷａｔｅｒ）と有意差がない程度にほとんど産生されなかった。これらの結果から、「サモアーゼ（登録商標）ＰＣ１０Ｆ処理加熱変性卵白分解物（ＰＥＷ２）の経皮膚感作を起こす危険性はほとんどない、少なくとも加熱変性卵白（ＥＷ）よりも低いと考えられる。さらに、ＯＶＡ刺激［Ｃ］において実施例１のＰＥＷ１は、加熱変性卵白（図中のＥＷ）よりも、抗原特異的な細胞増殖率が、統計的に有意な差はないものの低値を示し、ＯＶＭ刺激［Ｄ］についても、実施例２のＰＥＷ２は、加熱変性卵白（図中のＥＷ）よりも、抗原特異的細胞増殖が抑制されており、経皮膚感作の処置を行っても、ＯＶＡおよびＯＶＭ特異的に増殖するＴ細胞が分化されにくい点で優れていると考えられる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】