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特許7418429磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）によるβ－アミロイドプラークの検出のための造影剤としてのナフタレン誘導体と結合した金属酸化物ナノ粒子
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-01-11
(45)【発行日】2024-01-19
(54)【発明の名称】磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）によるβ－アミロイドプラークの検出のための造影剤としてのナフタレン誘導体と結合した金属酸化物ナノ粒子
(51)【国際特許分類】
A61K 49/18 20060101AFI20240112BHJP
【ＦＩ】
A61K49/18
【請求項の数】
4
(21)【出願番号】P 2021525088
(86)(22)【出願日】2019-05-13
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-02-22
(86)【国際出願番号】 CU2019050005
(87)【国際公開番号】W WO2020094161
(87)【国際公開日】2020-05-14
【審査請求日】2022-02-28
(31)【優先権主張番号】2018-0138
(32)【優先日】2018-11-06
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CU
【前置審査】
(73)【特許権者】
【識別番号】521195180
【氏名又は名称】セントロ デ ネウロシエンシアス デ キューバ、セネウロ
(73)【特許権者】
【識別番号】521195191
【氏名又は名称】ファクルタ デ ケミカ． ウニベルシダ デ ラ ハバナ
(74)【代理人】
【識別番号】110000855
【氏名又は名称】弁理士法人浅村特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ロドリゲス － タンティー、クリスレイネ
(72)【発明者】
【氏名】サブロン カルラザーナ、マルキーザ
(72)【発明者】
【氏名】ゴンザレス ダルモー、エヴェリオ
(72)【発明者】
【氏名】ディアス ガルシア、アリシア マルセリーナ
(72)【発明者】
【氏名】パネク ケヴェード、アルマンド アウグスト
(72)【発明者】
【氏名】グズマン ロドリゲス、アンディー
(72)【発明者】
【氏名】ロドリゲス イズキエルド、フリオ リカルド
(72)【発明者】
【氏名】リヴェラ マレーロ、スキティル
(72)【発明者】
【氏名】ヘルナンデス ロドリゲス、アルナンド ホセ
(72)【発明者】
【氏名】レイエス モリーナ、イスラエル
(72)【発明者】
【氏名】イリアルテ メサ、クラウディア
(72)【発明者】
【氏名】レオン チャヴィアーノ、サミラ
(72)【発明者】
【氏名】ソト メネンデス デル ヴァーレ、ロベルト
(72)【発明者】
【氏名】ベンコモ マルティネス、アルベルト
【審査官】伊藤 良子
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１０／１１８７０６（ＷＯ，Ａ１）
【文献】CLINICAL RADIOLOGY，2015年，Vol.70, No.1，p.74-80
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ
Ｂ２２Ｆ
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
磁気共鳴画像法によるアルツハイマー病の診断のための凝集体およびβ－アミロイドプラークに関連する、多機能有機層でコーティングされた金属酸化物コアを含む式Ｉで特徴付けられる磁性ナノ粒子であって、ここで、前記有機層はナフチル化合物と結合している、前記の磁性ナノ粒子。【化I】
ここで、：
Ｒ１：は、金属酸化物コアへの、ポリ乳酸－コ－グリコール酸（ＰＬＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アミノ－ＰＥＧ、ＰＥＧ－カルボン酸、アミノ－ＰＥＧ－カルボン酸、ＰＥＧ－ジカルボン酸、ＰＥＧ－ＰＬＡ、ＰＥＧ－ＰＬＧＡ、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、デキストランおよびキトサンの群から選択されるポリマータイプの有機コーティングであり；
Ｒ２：－ＮＨＣＯ－アルキレニル－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－アルキレニル－Ｒ３；
Ｒ３：－ＣＯＯ－，－ＣＯ－，－ＮＨ，－Ｏ－，－Ｓ－，－ＮＨ－アルキレニル－ＮＨ－，－ＮＲ４－ＣＳＳ－；
Ｒ４：－Ｈ，－ＣＨ３，－ＣＨ２－ＣＨ３，－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３，及び
ＭｘＯｙ：酸化鉄-Ｆｅ ３ Ｏ ４ ／γＦｅ ２ Ｏ ３ ，酸化ガドリニウム（ＩＩＩ），酸化マンガン（ＩＩ）及び酸化銅（ＩＩ）；
ここで、ナフチル化合物が、下記の群から選択され：Ｎ１－（２－アミノエチル）－Ｎ４－（１－ナフチル）スクシンアミド、Ｎ－［４－（１－ナフチルアミノ）－４－オキソブタノイル］－β－アラニン、６－｛［４－（１－ナフチルアミノ）－４－オキソブタノイル］アミノ｝ヘキサン酸、Ｎ１－（２－アミノブチル）－Ｎ４－（１－ナフチル）スクシンアミド、Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）－Ｎ’－１－ナフチルスクシンアミド、Ｎ－（３－メルカプトプロピル）－Ｎ’－１－ナフチスクシンアミド、Ｎ－｛２－［（２－アミノエチル）アミノ］エチル｝－Ｎ’－１－ナフチスクシンアミドおよび（２－｛［４－（１－ナフチルアミノ）－４－オキソブタノイル］アミノ｝エチル）カルバモジチオ酸ナトリウム塩；
ここで、前記Ｒ ２ およびＲ ３ のアルキレニル項が、
エチレニル基（－ＣＨ ２ ＣＨ ２ －）、ブチレニル（－ＣＨ ２ ＣＨ ２ ＣＨ ２ ＣＨ ２ －）、及びヘキシレニル（－ＣＨ ２ ＣＨ ２ ＣＨ ２ ＣＨ ２ ＣＨ ２ ＣＨ ２ －）から選択され；
ここで、結合されて機能化されてコーティングされた磁性ナノ粒子は、哺乳動物に投与されると、血液脳関門を通過して、脳組織中に存在する凝集体およびβ－アミロイドプラークに特異的に結合することができ；
ここで、当該ナノ粒子が脳組織中の凝集体およびβ－アミロイドプラークに結合すると、磁気共鳴画像法により、関心領域で低強度または高強度のシグナルが観察される。
【請求項2】
金属酸化物コアの有機コーティングＲ１が、基－ＳＨ、－ＯＨ、－ＮＨ２、－ＮＣＳ、－ＣＯＯＨおよびＮ－ヒドロキシスクシンイミドのそのエステル及び－Ｂｒから選択される末端機能基によってＲ
３
と結合された、請求項１に記載の凝集物およびβ－アミロイドプラークに関連する磁性ナノ粒子。
【請求項3】
ナフチル化合物と結合して機能化したコーティングされたナノ粒子の流体力学的半径が１５０ｎｍ未満である、請求項１に記載の凝集物およびβ－アミロイドプラークに関連する磁性ナノ粒子。
【請求項4】
ナフチル化合物と結合して機能化したコーティングされたナノ粒子の流体力学的半径が１００～５ｎｍである、請求項１に記載の凝集物およびβ－アミロイドプラークに関連する磁性ナノ粒子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
説明
本発明は、医学の分野に適用される化学および物理学に関連し、神経変性疾患に存在するβ－アミロイドプラーク及び凝集物に関連するナフタレン化合物と結合してコーティングされ便利に機能化された金属酸化物ナノ粒子のカテゴリーに属する磁気特性を有する化合物の使用を指す。これらの新しいナノ粒子（ＮＰｓ）は、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）技術を使用した凝集体およびアミロイドプラークの非侵襲的検出に使用される。ここで説明するナノ粒子は、膜破壊剤を使用せずに、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過する。同様に、それらは凝集体およびβ－アミロイドプラークに高い親和性および特異性で結合し、アルツハイマー病（ＡＤ）の早期発見のためのＭＲＩの造影剤として使用される。
本発明は、医学の分野に適用される化学および物理学に関連し、神経変性疾患に存在するβ－アミロイドプラーク及び凝集物に関連するナフタレン化合物と結合してコーティングされ便利に機能化された金属酸化物ナノ粒子のカテゴリーに属する磁気特性を有する化合物の使用を指す。これらの新しいナノ粒子（ＮＰｓ）は、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）技術を使用した凝集体およびアミロイドプラークの非侵襲的検出に使用される。ここで説明するナノ粒子は、膜破壊剤を使用せずに、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過する。同様に、それらは凝集体およびβ－アミロイドプラークに高い親和性および特異性で結合し、アルツハイマー病（ＡＤ）の早期発見のためのＭＲＩの造影剤として使用される。
【背景技術】
【0002】
ＡＤは、認知能力と記憶の喪失、見当識障害、言語障害及び行動の変化につながる神経変性障害であり、時間の経過とともに急速かつ進行的に悪化する問題となり、患者の生活の質に悪影響を与える。それは、認知症の症例の６０～８０％を占め、世界保健機関（ＷＨＯ）によってリストされている６つの状態の１つである。
【0003】
ＡＤの神経病理学的特徴は、脳内のタンパク質沈着物の存在によるものである。神経原線維変化（ＮＦＴ）と老人プラーク（ＳＰ）は、進行性の神経変性と神経細胞死につながるプロセスに関与している。ＳＰは３９－４２個のアミノ酸のβ－アミロイドペプチドの沈着物で構成され、ＮＦＴはタウタンパク質の過剰リン酸化によって生成される(Gong et al., in Proceedings of the National Academy of Sciences, 2003, 100 (18), 10417-10422 and Scheuner et al., in Nature Medicine, 1996, 2 (8), 864.2, 3)。
【0004】
β－アミロイドペプチドの沈着は、この病気の症状が現れる前の２０年までに現れる。したがって、それらは治療標的と見なされる。早期治療の実施はＡＤの発現の発症を遅らせ、その有病率を低下させる可能性があることも知られているため、その早期診断は非常に重要である(DeKosky, in Science, 2003: 830-834 and Monsonego, in Science, 2003, 834-838)。
【0005】
ＡＤの臨床診断は中程度の信頼性があり、十分な感度と特異性を欠いていることがよくある(Wolk et Klunk, in Current Neurology and Neuroscience Reports 2009, 9 (5), 345-352)。コンゴーレッド、クリサミン－Ｇ、チオフラビン－Ｔなどの特定の染色剤で病理学的構造を視覚化することにより、死後に実行された場合にのみ正確である(Klunk, in Neurobiology of Aging, 1998, 19 (2), 145 -147)。
【0006】
βアミロイドプラークを検出し、ＡＤを早期に診断するための非侵襲的方法を開発するために、下記のような従来のニューロイメージング技術が多かれ少なかれ成功して使用されてきた：磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）(Higuchi et al., in Nature Neuroscience, 2005, 8 (4): 527)、ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）(Ter-Pogossian, in Diagnostic Imaging in Medicine, 1983, Springer, 273-277)および単一光子放射型コンピューター断層撮影（ＳＰＥＣＴ）(Wagner et al., in The Lancet, 2003, 361 (9355): 374-379)。この目的のために、多くの化合物が、イメージング分子試験における神経病理学的構造のインビボ標識に使用されてきた。
【0007】
陽電子（ポジトロン）放出放射性核種で標識（ラベル）されたいくつかの化合物は、ＡＤ患者のＳＰを検出するための放射性医薬品として研究されてきた(Catafau et al in Clin Transl Imaging 2015; 3: 39-55)：例えば、スチリルベンゼン、ベンゾチアゾール、スチルベン、ビニルベンゾオキサゾール、ナフタレン誘導体およびその他(Furumoto et al., in Curr Top Med Chem 2007; 7: 1773-1789)。その例は、２－（４’－［１１Ｃ］メチルアミノフェニル）－６－ヒドロキシベンゾチアゾール（［１１Ｃ］ＰＩＢ）(Klunk et al., in Ann Neurol., 2004; 55: 306-319)、２－（１－｛６－［（２［１８Ｆ］－フルオロエチル）（メチル）－アミノ］２－ナフチル｝エチル－デン）－マロノニトリル（［１８Ｆ］ＦＤＤＮＰ）(Nordberg, in Lancet Neurol., 2004; 3: 519-527)、４－Ｎ－［１１Ｃ］メチルアミノ－４’－ヒドロキシスチルベン（ＳＢ－１３）(Verhoeff et al., in Am J Geriatr Psychiatry 2004; 12: 584)、４－［（Ｅ）－２－（６－｛２－［２－（２－［１８Ｆ］フルオロエトキシ）－エトキシ］エトキシ｝ピリジン－３－イル）ビニル］－Ｎ－メチルアニリン（［１８Ｆ］ＡＶ－４５）(Choi et al., in J. Nucl Med. 2009; 50: 1887-1894)、４－［（Ｅ）－２－（４－｛２－［２－（２－［１８Ｆ］フルオロエトキシ）エトキシ］エトキシ｝フェニル）ビニル］－Ｎ－メチルアニリン（［１８Ｆ］ＢＡＹ９４－９１７２）(Kung et al., in J Med Chem 2010; 53: 933-941)、２－［３－［１８Ｆ］フルオロ－４－（メチルアミノ）フェニル］－１，３－ベンゾチアゾール－６－オール（［１８Ｆ］ＧＥ－０６７）(Kung et al., in J Med Chem 2010; 53: 933- 941)および２－（２－［１８Ｆ］フルオロ－６－（メチルアミノ）ピリジン－３－イル）ベンゾフラン－６－ｏｌ（［１８Ｆ］ＡＺＤ４６９４）(Rowe et al., in J. Nucl Med. 2013; 54: 880-886; Cselenyi et al., in J. Nucl Med. 2012; 53: 415-424)。一般に、放射性トレーサーは、Ａβプラークのインビボ検出に使用される特定の特性を備えている必要がある。たとえば、それらは、インビトロでの高い結合親和性（Ｋｉ＜１０ｎＭ）、ＢＢＢを介した高い透過性（ｌｏｇＰ＜３）、正常な脳での急速なクリアランスを伴う高い初期脳取り込みを有するべきであり、および脳内の非特異的結合比に対する高い特異性も有するべきである(Salerno et al., in Coordination Chemistry Reviews 2016; 327: 27-34)。さらに、ラベリング手順は効率的でなければならない(Kung et al in J Med Chem 2010; 53: 933-941)。過去５年間で、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）は、上記の３つの化合物の使用を承認した：[18F] Florbetapir ([18F] AV- 45, Amyvid, 2012) (Choi, et al., in Alzheimer Dis. Assoc Disord 2012; 26: 8), [18F] Flutemetamol ([18F] GE-067, Vizamyl, 2013) (Lartigue et al., in Drugs Today 2014; 50: 219-229)およびアルツハイマー病患者の脳内のＡβプラークの沈着を視覚化するためのＰＥＴ放射性医薬品としての[18F] Florbetaben ([18F] BAY94-9172, Neuraceq, 2014) (Villemagne et al., in J. Nucl Med. 2011; 52: 1210-1217)。しかし、１８Ｆ－で標識されたプローブのほとんどは、健康な被験者とアルツハイマー病に苦しむ被験者の両方で、脳の白質に高い非特異的結合を持っており、病気の初期段階で正確な診断が低下する(Tu et al., in Expert Opin. Ther. Patents, 2015, 25 (4), doi 10.1517% 2F13543776.2015.1007953)。さらに、ＰＥＴ技術には、放射性トレーサーを使用するため、空間分解能が低く、侵襲性が低いという欠点がある(Habte et al in Phys. Med. Biol. 2007, 52, 3753-3772)。また、これらのプローブは非常に高価であり、サイクロトロンへの迅速なアクセスを必要とするため、主に研究に限定されている(Alzheimer's Association, Alzheimer & Dement, 2018, 14, 367-429)。
【0008】
ＳＰＥＣＴ技術の場合、神経画像を取得するために最も一般的に使用される放射性医薬品は９９ｍＴｃ－ＨＭＰＡＯ（９９ｍＴｃ－ヘキサメチルプロピレンオキシム）である。親油性の特性を持つこの化合物は、ＢＢＢを急速に通過し、脳灌流研究で使用されて、脳の特定の領域での血流の減少を特徴付ける。これは、脳疾患やＡＤの初期段階で証明されている(Borroni et al in European Journal of Pharmacology 2006, 545 (1), 73-80)。ただし、この放射性医薬品はＳＰやＮＦＴとは関係がないため、この病気を正確に診断することはできない。これがなければ、別の適切な放射性医薬品がある(Tu et al., in Expert Opin. Ther. Patents, 2015, 25 (4))。一方、この手法には別の大きな欠点があり、脳内の微細構造を視覚化できないのは空間分解能が低いことである。
【0009】
臨床診療でＭＲＩを使用すると、他の放射線検査よりも優れた情報を、非侵襲的な方法で、電離放射線を放出することなく、さまざまな解剖学的構造から取得できる。ＡＤの診断にこの技術を使用することは、他の脳損傷を除外するための最初のステップとして役立つ。ＭＲＩを介して実施された研究は、発生する最初の形態学的変化の１つが側頭葉の体積の減少、特に海馬の萎縮であることを示している。これは、病気の初期段階で記憶喪失につながる神経病理学的プロセスと相関しているため、海馬領域の体積の決定は、ＡＤの早期診断に役立つ情報を提供する(Mier W et Mier D in Front Hum Neurosci 2015, 9: 249 and Azria D et al in J. Mater, Chem. B, 2017, 5 (35), 7216-7237)。一方、記録された画像は、微視的なものに近い、より高い時空間分解能を持っている。臨床診療におけるその主な制限は、ＳＰの同定に対する感度と特異性が低いことである。
【0010】
Higuchi et al. (in Nat Neurosci, 2005, 8 (4), 527-33)は、この技術の特異性を高めることを目的として、１９Ｆ－ＭＲＩを使用した視覚化のためのアミロイドプラークに関連するプローブとして、（Ｅ，Ｅ）－１－フルオロ－２，５－ディス（３－ヒドロキシカルボニル－４－ヒドロキシ）スチリルベンゼンの使用を評価した。この化合物はアルツハイマー病のトランスジェニックマウスで評価され、画像を取得することは可能であったが、この研究の著者は、人間への適用は、より良い特異性を達成するために、ＭＲＩ用の新しいハードウェア技術（コイル表面無線周波数受信機）とソフトウェアの開発に依存すると考えている。さらに、分子内のフッ素原子の数が最適なシグナル対ノイズ比を得るには不十分であるため、彼らは、ＳＰ検出の感度が不十分であると考えている。同様に、Sablon et al. (in US 20120321560 A1)は、ＭＲＩによって検出されるフッ素化ナフタレン誘導体の使用を提案している。ただし、この特許は、これらの化合物の使用に関連する例を指定しておらず、ＭＲＩ用の１９Ｆプローブを使用してアミロイドプラークを検出するための最先端技術に見られる感度の問題を解決していない。
【0011】
ＭＲＩでの検出感度の向上は、より高いコントラストの画像の記録を可能にする造影剤（ＣＡ）を使用することで解決できる。これらの化合物は、画像の品質を向上させるために、経口、経鼻、皮下、直腸、脳室内、または静脈内に人体に導入される物質として定義されている。しかし、神経変性疾患の診断のためのこれらの化合物の開発は、現在の最先端技術では未解決の課題である。これまでに説明したＣＡｓは、組織への蓄積、つまり毒性、その化学的安定性およびＢＢＢを通過するその能力に関連する問題があるため、安全で効果的ではない(Azria D et al., in J. Mater, Chem. B, 2017, 5 (35), 7216-7237)。
【0012】
臨床使用のためのＭＲＩ装置（０．２－３Ｔ）は、脈動磁場勾配を伴う強磁場を使用して、関心領域を研究し、その磁場の方向に１Ｈ原子の核スピンの分極を引き起こす。特定の高周波パルスが印加されると、陽子はエネルギーを吸収して励起状態になる。励起が停止すると、陽子はさまざまなメカニズムによって緩和する：吸収したエネルギーを放出するスピン網状組織（Ｔ１）、及びスピンスピン（Ｔ２）。共鳴周波数が１Ｈ原子の幾何学的位置に依存する放出エネルギーは、スキャナーによって検出される。ＭＲＩシグナルは、励起パルスシーケンスを適切に選択することでマルチパラメトリック依存性を持つため、Ｔ１、Ｔ２、または水プロトンの拡散で重み付けされた画像を取得できる(Shokrollahi, H., et al., in Journal of Magnetism and Magnetic Materials, 2014, 369: 126-183, 60 and Felton, C., et al., in Drug Metabolism Reviews, 2014. 46 (2): 142-154)。
【0013】
緩和時間Ｔ１とＴ２も、技術の感度を向上させるＣＡを使用して変更（修正）される。理想的なＣＡは、体内で適切な寿命に達し、正確な診断を確立するために管理され、悪影響を最小限に抑え、体に吸収され、尿や糞便によってクリアランスされるものである。
【0014】
ＣＡは、さまざまなメカニズムによって緩和時間を短縮する。これにより、ピクセルの強度が変化し、Ｔ１とＴ２の重み付けされた画像のコントラストが増加する(Pierre V. C et al., in J. Biol. Inorg. Chem., 2014, 19, 127-131, Caravan, P et al., in Chem. Rev., 1999, 99, 2293-2352 and in Chem. Soc. Rev., 2006, 35, 512-523, Burtea, S. in Molecular Imaging I, Springer, Berlin, Heidelberg, 2008 , 135-165)。
【0015】
ＣＡｓは次のように分けられる：
・ポジティブ（陽性）造影剤：それが蓄積する組織のＴ１を主に減少させ、Ｔ１の重い画像の組織強度を増加させる。ガドリニウム化合物はこのカテゴリに含まれる。（Ｇａｄｏｖｉｓｔ、Ｍａｇｎｅｖｉｓｔ）(Gadovist, Magnevist) (Ahren M, et al in Nanopart, Res. 2012, 14, 1; Faucher L., et al., in ACS Appl. Mater. Interfaces 2012, 4, 4506)
・ネガティブ（陰性）造影剤：それが蓄積する組織のＴ２を主に減少させ、Ｔ２の重い画像の組織強度を減少させる。このカテゴリには、酸化鉄ナノ粒子(USPIO Resovist)が含まれる(Rohrer, M. et al in Invest Radiol 2005; 40: 715-724)。
・ポジティブ（陽性）造影剤：それが蓄積する組織のＴ１を主に減少させ、Ｔ１の重い画像の組織強度を増加させる。ガドリニウム化合物はこのカテゴリに含まれる。（Ｇａｄｏｖｉｓｔ、Ｍａｇｎｅｖｉｓｔ）(Gadovist, Magnevist) (Ahren M, et al in Nanopart, Res. 2012, 14, 1; Faucher L., et al., in ACS Appl. Mater. Interfaces 2012, 4, 4506)
・ネガティブ（陰性）造影剤：それが蓄積する組織のＴ２を主に減少させ、Ｔ２の重い画像の組織強度を減少させる。このカテゴリには、酸化鉄ナノ粒子(USPIO Resovist)が含まれる(Rohrer, M. et al in Invest Radiol 2005; 40: 715-724)。
【0016】
ＭＲＩによるＡβ沈着物の可視化を通じて、ＡＤ診断に適切なＣＡを開発するために、さまざまな要件が説明されてきた。これらのＣＡは、（ｉ）ＢＢＢを通過し、（ｉｉ）Ａβ凝集体に特異的にラベルを付け、（ｉｉｉ）毒性がなく、（ｉｖ）患者の体内に保持されている間に代謝されず、最後に（ｖ）体から排除されなければならない(Cheng et al in Biomaterial 2015: 44: 155-172)。ＢＢＢを通過する能力の低さと脳内の不十分な内在化は、ＭＲＩでのＣＡの臨床使用に対する主な障害となっている。
【0017】
ＭＲＩで最も使用されているＣＡの中には、Ｇｄ（ＩＩＩ）の化合物がある。これは、常磁性が高く、電子緩和、効率的な生体内分布、除去、および熱力学と速度論の両方で比較的高い安定性と慣性の点で優れた特性があるためである(Port et al., in Biometals 2008, 21, 469-490, Frullano et al in Curr, Org Synth, 2011, 8, 535-565 and Zhou et al in Wiley Interdiscip, Rev. Nanomed, Nanobiotechnol, 2013, 5 (1), 1892-94)。Ｇｄ（ＩＩＩ）イオンは、両方の類似したイオン無線を使用することにより、体内のカルシウム（ＩＩ）イオンを簡単に置き換えることができるため、それ自体が毒性がある。Ｇｄ（ＩＩＩ）イオンは、生理的ｐＨで、Ｇｄ水酸化物結晶の形で沈殿する。これは肝臓、脾臓、骨に蓄積し、健康に非常に有害である。これを回避するために、それらは有機リガンドと複合体を形成し、生物への毒性放出を防ぐ。医学で最も使用されているＧｄ（ＩＩＩ）錯体は、Ｍａｇｎｅｖｉｓｔ（登録商標）（Ｇｄ（ＤＴＰＡ））、Ｄｏｔａｒｅｍ（登録商標）（Ｇｄ（ＤＯＴＡ））、Ｐｒｏｈａｎｃｅ（登録商標）（Ｇｄ（ＨＰ－ＤＯ３Ａ））、Ｏｍｎｉｓｃａｎ（登録商標）（Ｇｄ（ＤＴＰＡ－ＢＭＡ））である。これらの錯体は、金属解離、配位子交換、金属交換反応に関して、高い熱力学的安定性と速度論的不活性を備えている。これらはすべて、Ｇｄ（ＩＩＩ）錯体がインビボでの毒性を回避するために必要である。ただし、慢性腎不全の患者への使用は、生体からの排出が遅いため禁忌である(Grobner in Nephrology Dialysis Transplantation 2006, 21 (4), 1104-1108)。
【0018】
これらの市販のＧｄ（ＩＩＩ）複合体は、脳内のアミロイドプラークの検出についてＡＤ患者でも評価されてきた(Bort et al in European Journal of Medicinal Chemistry 2014, 87, 843-861 and Caravan in Chemical Society Reviews 2006, 35 (6), 512-523)。したがって、Poduslo et al. (in Journal of Neurochemistry 2002, 81 (s1), 60-63)は、Ｇｄ－ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）の複合体を修飾Ａβペプチド（１－４０）に結合させ、ＡＤトランスジェニックマウスにおけるＢＢＢを介したＣＡの通過を改善した。実験の実現可能性は実証されたが、長い探査時間と高い磁場強度（＞７Ｔ）が必要であった。臨床診療におけるＭＲＩの現在の機器は１．５から３Ｔの間で動作するため、これはこの方法を非実用的にする(Sillerud et al in Journal of Alzheimer's Disease 2013, 34 (2), 349-365)。Ｇｄ－ＤＴＰＡ複合体とＡβ（１－４０）ペプチドに結合した単結晶酸化鉄ナノ粒子の両方の使用を含む同様のアプローチがWadghiri et al.によって提案された(in Magnetic Resonance in Medicine 2003, 50 (2), 293-302)。どちらの場合も、マンニトールを使用して培地の浸透圧を高め、ＢＢＢの透過性に一時的な影響を与え、ＣＡの移行を促進するのと同様に、ＣＡの投与は頸動脈内で必要であった(Bort, G., in Eur. J. Med. Chem. 2014, 87, 843-861)。マンニトールは非経口浸透圧利尿薬であり、６０歳以上の患者には注意して使用する必要がある。この年齢層では、腎臓、心臓、脳の病気がより頻繁に起こるため、それらの使用は禁忌である。同様に、げっ歯類におけるマンニトールの効果は短期間（げっ歯類では１５分）であり(McCarty DM et al in Gene Ther 2009, 16: 1340-1352)、いくつかの毒性と関連している。
【0019】
この移行の改善に焦点を当てた他の調査では、Ａβペプチドに結合したＧｄ（ＩＩＩ）複合体の使用(Poduslo et al in Journal of Neurochemistry 2007, 102 (2), 420-433, in Biochemistry 2004, 43 (20), 6064-6075, Yang et al., in Med. Chem. Comm. 2012, 3 (5), 552-565)、抗Ａβ抗体(Poduslo et al., in J. Neurochem., 2007, 102, 420-433; Xu et al in Advanced Drug Delivery Reviews 2013, 65 (5), 732-743)および大環状化合物が提案されているが、これらすべての研究で結果は満足のいくものではない。同様に、Sigurdsson et al. (in Neurobiol Aging, 2008, 29 (6): 836-47)は、Ａβと結合したＧｄ－ＤＰＴＡ複合体のＢＢＢを介した透過性を高める試みで、ポリリジン残基（Ｋ６）をＡβペプチド（Ｋ６－Ａβ－Ｇｄ－ＤＰＴＡ）中に組み込んだ。しかし、結果も満足のいくものではなかったため、マンニトールを使用する必要があった。これらの著者は、ＣＡへのプトレシンの導入についても調査したが、Ａβ沈着物の認識は非効率的であった。このＣＡのもう１つの欠点は、血漿中の半減期が短い（３分）ことであった。これは、不安定性または急速な排泄を示している。
【0020】
Ａβプラーク認識に焦点を合わせたＣＡの別の選択肢は酸化鉄ＮＰｓであり、その表面はプラークに選択的に結合するいくつかの分子と結合することができる。したがって、Wadghiri et al. (in Magnetic Resonance in Medicine 2003, 50 (2): 293-302)は、ＢＢＢを透過処理した後にＡβプラークを検出できる、Ａβペプチド（１－４０）に結合した単結晶酸化鉄ＮＰｓを提示す。また、Yang et al. (in Neuroimage, 2011, 55 (4): 1600-1609)は、Ａβペプチド（１－４２）で機能化された超小型超常磁性酸化鉄ＮＰｓ（ＵＳＰＩＯＮ、１０－４０ｎｍ）を使用した場合、ＢＢＢを透過性にする必要があった。
【0021】
別のアプローチでは、Yang et al. (in ACS Chemical Neuroscience, 2011, 2 (9): 500-505)は、ＵＳＰＩＯＮをＡβ（１－４０）およびＡβ（１－４２）に対する抗体と結合させ、両方のペプチドを標識する可能性をインビトロで示した。この研究の著者は、これらのＮＰｓが、ヒト血漿中のＡβペプチドの検出を通じて、ＡＤの診断薬として使用できることを示唆している。この手順は、量子干渉デバイス（ＳＱＵＩＤ）を使用して、正常な被験者とＡＤ患者のサンプルに含まれるＮＰｓの免疫磁気シグナルを低減することに基づいている。したがって、それらは血漿中の非常に低濃度のＡβ凝集体を決定する。しかし、それは脳内の凝集体とＡβプラークの局在化を可能にしないため、診断は正確ではない。一方、これらのＵＳＰＩＯＮＳは細胞膜を通過し、細胞代謝を妨害して毒性をもたらす可能性があることが報告されている(Hafeli et al in Mol Pharm 2009; 6: 1417-28; Jeng et al., In J Environ Sci Health A Tox Hazard Subst Environ Eng 2006; 41: 2699-711 and Singh et al in Nano Rev. 2010; 1:10.3402/nano.v1i0.5358)。
【0022】
別の抗Ａβ抗体であるＢＡＭ１０をＵＳＰＩＯＮ表面に結合させ、ＭＲＩによってラット脳のＡβプラークをex vivoで検出した(Skaat et al., in International Journal of Nanomedicine, 2013, 8: 4063)。Sillerud et al. (in Journal of Alzheimer's disease, 2013, 34 (2): 349-365)）は、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）を認識する抗体に結合したＵＳＰＩＯＮが、ＢＢＢを通過し、Ａβプラークにリンクし、ＭＲＩ中のコントラストを改善できることを報告した。このＣＡの注射（注入）後、マンニトールを使用せずに、ＡＰＰ／ＰＳ１トランスジェニックマウスを犠牲にして脳スライスを得た。サンプルは９．４ＴのＭＲＩで分析され、評価されたＵＳＰＩＯＮは、ＣＡで処理しない脳サンプルと比較して負のコントラストを改善することが観察された。これは、これらのＮＰｓがＢＢＢを通過できることを示唆している。使用したシーケンスはｍＡＳＥ（複数の非対称スピンエコー）であった。このプロトコルから、６つのエコーが個別に再構築され、ＳＰの存在を示す結果の画像ボリュームが追加され、シグナル対ノイズ比が向上した。９．４Ｔフィールドを使用するこの方法は、ex vivo組織のサンプルにのみ適用できる。これはすべて、ＳＰのin vivo検出を実行することが望まれる場合、説明されている感度が達成できないことを示している。また、人間での臨床使用のために、規制機関によって承認された制限を超える９．４Ｔフィールドの使用が必要である。
【0023】
Viola et al. (in Nat Nanotechnol 2015, 10(1): 91-8)は、Ａβオリゴマーに対する選択的抗体を超常磁性ナノ粒子と結合させることにより、Ａβオリゴマーに親和性のあるＮＵ４ＭＮＳと呼ばれるＭＲＩのプローブを合成した。このプローブは特異的かつ高感度であり、ＭＲＩを使用して、ＡＤトランスジェニック動物の病理学的脳組織をコントロールからインビトロで区別することができる。エクスビボおよびインビボの結果によると、鼻腔内に投与されたプローブは、ＢＢＢを通過し、４日以上脳組織に留まり、Ａβプラークの存在を観察する。この長時間は、不十分なクリアランスを示唆しており、毒性作用を引き起こす可能性がある。
【0024】
Ku et al. (in Biochemical and Biophysical Research Communications 2010, 394, 871-876) and Howard et al. (in Journal of Biomedical Nanotechnology 2008, 4, 133-148)は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）でコーティングされたＵＳＰＩＯＮの合成を示している。このタイプのコーティングは、細網内皮系によるＮＰの取り込みを阻害し、それらの循環を延長して、中枢神経系へのアクセスを可能にする。他の研究者は、このアプローチを使用して、ＢＢＢを通過するＵＳＰＩＯＮを増やし、トランスジェニックマウスのＡβプラークをインビボで視覚化した。しかし、Ａβプラークの検出における特異性は実証されていない。したがって、Wadghiri et al. (in PLoS One 2013; 8 (2): e57097)は、トランスジェニックマウスの脳のプラークの検出にＵＳＰＩＯ－ＰＥＧ－Ａβ（１－４２）タイプのＮＰを使用した。この作業では、健康な動物のＭＲＩによる偽陽性の取得が宣言されている。彼らはまた、ＭＲＩによるＡβプラークのインビボ検出から得られた結果を免疫組織化学的アッセイと相関させることができないと述べた。
【0025】
いくつかの研究は、Ａβプラークの古典的な色素の使用またはＰＥＴの研究で開発された化合物に基づいて、ＵＳＰＩＯＮと低分子量の化合物との結合を試みた。したがって、ＵＳＰＩＯＮマグヘマイトは、インビトロでＡβ（１－４０）フィブリルをマークすることができたローダミンまたはコンゴーレッドと結合した。ただし、コンゴーレッドとその誘導体のin vivoでの使用は、毒性が高く、ＢＢＢを通過できないため、実行できない。
【0026】
Zhou et al. and Zhang et al. (それぞれ、in Mater. Sci. Eng., 2014, C37, 348-355 and in Clin. Radiol., 2015, 70-74-80)は、Ａβプラークに結合することができた、１、１－ジシアノ－２－［６－（ジメチルアミノ）ナフタレン－２－イル］プロペン（ＤＤＮＰ）のカルボン酸誘導体に結合したＵＳＰＩＯＮタイプのＮＰｓを取得することができた。これらのナノ粒子はＢＢＢを通過しなかったが、マンニトールが使用されると、インビボでのトランスジェニックマウスの脳におけるＴ２シグナルの喪失が達成された。しかし、異なる著者(Nordberg et al., in Current Opinion in Neurology 2007, 20 (4): 398-402; Henriksen G. et al., in Eur J Nucl Med Mol Imaging, 2008, 35: S75-S81; Tolboom et al in J. Neurol Neurosurg Psychiatry 2010; 81: 882-884)は、アミロイドプラークの検出に対するＤＤＮＰの特異性が低いことを示しているため、その使用は破棄された。
【0027】
Cheng et al. (in Biomaterials, 2015, 44 155e172)は、磁性鉄ＮＰｓの表面にクルクミンを結合させ、ブロック共重合体ＰＥＧ－ＰＬＡおよびその後のＰＶＰを使用してそれらを安定化した。これらの結合ＮＰｓは直径が１００ｎｍ未満であり、Ｃｈｅｎｇによれば、ＡＤトランスジェニックマウス（Ｔｇ－２５７６）の脳と非トランスジェニックマウスの両方で、低い細胞毒性を示し、ＢＢＢを通過すると言われている。ＭＲＩのex vivo研究では、Ｔｇマウスの脳組織に対照マウスよりも多くのダークスポットが見られる。したがって、彼らはＡＤの早期診断のためにこのＣＡの潜在的な使用を提起する。ただし、クルクミンの高い親油性が認識されているため、白質に結合すると脳組織に非特異的な認識が生じ、ＢＢＢを通過する能力も低くなる。
【0028】
Kouyoumdjian et al. (in ACS Chem. Neurosci, 2013, 4, 575-584)は、シアル酸タイプのガングリオシドと結合した酸化鉄の超磁性ＮＰｓを使用して、老人プラークに関連し、ＭＲＩによるそれらのインビトロおよびex vivo検出を可能にするグリコナノ粒子を取得した。ただし、この高分子のin vivoでの使用は、脳の免疫系に影響を与える必要があるため、毒性がある。一方、神経変性の患者では、脳内の鉄沈着物の存在が増加することが知られており、これは、ＡＤ、パーキンソン病、多発性硬化症、およびハンチントン病の診断のための興味深いバイオマーカーである可能性がある。このアプローチは、Martinez-Lorca et al. (in Rev Neurol 2017; 64: 480)によって対処されており、ＡＤトランスジェニックマウスの海馬の領域、特にアミロイドプラークの周囲に鉄と鉄を貯蔵するタンパク質（フェリチン）の存在の増加を説明している。この発見は、フェリチンを認識する抗体で機能化されたＮＰｓを開発するための基礎として役立った。著者によると、示された領域にＮＰｓが蓄積すると、ＭＲＩのＴ２値が大幅に減少する。この方法の欠点は、フェリチンタンパク質が血漿中を循環し、そこで鉄が輸送されることである。血漿中のフェリチンは、膜に存在するフェリチン－Ｈ受容体を使用して、脳実質をＢＢＢを通過することが示されている。したがって、血漿フェリチンは、酸化鉄ナノ粒子で利用可能なすべての抗体認識部位を飽和させる可能性があり、したがって、脳実質に存在するフェリチンへのナノ結合の結合を回避することができる。ナノ結合の結合能力と親和性を高めるために、将来の作業が必要になるであろう。これらの結合ナノ粒子を使用する方法の別の制限は、ＢＢＢを透過性にするためにマンニトールの使用を必要とすることである。
【0029】
金属ＮＰｓの合成と調製は、主に最終製品の要件のために、医療行為にナノテクノロジーを含めるための最大の課題の１つを構成する。
【0030】
フェリ磁性酸化鉄ＮＰｓ（Ｆｅ３Ｏ４およびγ－Ｆｅ２Ｏ３）は、両方とも液相でいくつかの方法で合成できる：共沈(Lu et al. in Angewandte Chemie International Edition, 2007, 46 (8): 1222-1244)、熱水合成(Zheng et al., in Materials Research Bulletin, 2006. 41 (3): 525-529)、有機媒体中での分解(Hyeon et al., in Journal of the American Chemical Society, 2001, 123 (51): 12798-12801)およびマイクロエマルジョン(Lawrence et al in Advanced Drug Delivery Reviews, 2012, 64: 175-193)、気相の場合：エアロゾル熱分解およびレーザー熱分解(Bautista et al., in Journal of Magnetism and Magnetic Materials, 2005, 293 (1): p.20-27)。
【0031】
Ｇｄ酸化物ＮＰｓの合成の場合、報告されている方法は、ポリオール、熱水、ゾルゲル、テンプレート支援技術、レーザーアブレーション、電子ビーム蒸発、およびメカノケミカルである(Gayathri et al. Bionanoscience 2015, 9 (6), 409-423)。
【0032】
一般に、安定したＮＰｓを得るために最も使用される有機コーティングは次のとおりである：ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）(Faucher et al in ACS Applied Materials & Interfaces 2012, 4 (9), 4506-4515)、ポリグリコール酸またはポリ乳酸（ＰＬＧＡ）、デンドリマー、キトサン(Liu et al in Biomaterials 2012, 33 (21), 5363-5375, Tokumitsu et al in Chemical and Pharmaceutical Bulletin 1999, 47 (6), 838-842)、アルギン酸ナトリウムおよびデキストラン(McDonald et al., in Academic Radiology 2006, 13 (4), 421-427)。それらは、同じ合成プロセスでその場でＮＰ表面に組み込むことができるという利点を持っている。さらに、それらは金属コアとの相互作用を可能にする多数の機能基を有し、優れた生体適合性を有することを特徴とする。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0033】
本発明は、凝集体およびβ－アミロイドプラークに高度に関連するナフタレン化合物に結合してコーティングされて機能化された、磁気特性を有する金属酸化物ナノ粒子の使用に関する。ここに提示されたＮＰｓの設計は、他の脳構造との非特異的認識を回避するために、老人プラークの構造、特にＡβペプチドの凝集体の分析に基づいていた。これを行うために、さまざまなデータベースとコンピュータープログラムを組み合わせて単一の方法で分析した(3D structure of fibrils Aβ 1-42 of Alzheimer's, Code: 2BEG, DOI: 10.2210/pdb2beg/pdb, deposited: 2005 -10- 24, published: 2005-11-22, Wyrzykowska et al Nanotechnology 2016, 27 445702; Chen, et al., in J. Mol. Biol. 2005; 354: 760-776; Landau et al., in PLoS Biol. 2011; 9: e1001080, Hetenyi et al in Biochem Biophys, Res. Commun 2002; 292: 931-936)。そして、ここで説明されているＮＰｓは、疎水性の相互作用、ファンデルワールス力及びＨ結合を本質的に介して、Ａβペプチドと（主にアミノ酸残基と）予期せず相互作用することが得られた。したがって、ＮＰｓのβ－アミロイドペプチド－有機コーティング複合体の推定エネルギー値ΔＧ（－９．８～－６．６ｋｃａｌ／ｍｏｌ）および親和性定数Ｋｉ（１．３３×１０－７～２．７９×１０－７）は、プラークを伴うこれらのＮＰｓの安定性を例証する。したがって、ＮＰｓは、βフォールディング構造の形成において重要であると思われる領域においてＡβペプチドと相互作用する(Chen et al., in the Journal of Molecular Biology, 2005, 354 (4): 760-776; Hetenyi et al in Biochemical and Biophysical Research Communications 2002, 292 (4): 931-936)。これらの機能化ＮＰｓの設計は、ナフタレン誘導体との選択的結合を可能にするさまざまな機能基を運ぶ炭素鎖で構成され、両方の構造の相乗効果で構造的に応答する新しい鎖を生み出す。また、驚くべきことに、それはこの特許で主張されているＮＰｓは、ＢＢＢを通過し、従来の最先端技術で他のＣＡが直面した欠点を解決し、説明されている手法を克服するのに役立つ。
【0034】
本発明は、磁気共鳴画像法によってアルツハイマー病を初期段階で診断するための、新しい機能化された結合された磁性ナノ粒子の使用を伴う。式Ｉのこれらのナノ粒子は、多機能有機層でコーティングされた金属酸化物コアを含み、ここで、前記有機層は、β－アミロイドプラークに関連するナフタレン誘導体に結合している。
ここで、：
Ｒ１：金属酸化物コアへの、ポリマータイプのカテコール誘導体およびトリアルコキシアルキルアミノシランの有機コーティングであり；
Ｒ２：－ＮＨＣＯ－アルキレニル－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－アルキレニル－Ｒ３；
Ｒ３：－ＣＯＯ－，－ＣＯ－，－ＮＨ，－Ｏ－，－Ｓ－，－ＮＨ－アルキレニル－ＮＨ－，－ＮＲ４－ＣＳＳ－；
Ｒ４：－Ｈ，－ＣＨ３，－ＣＨ２－ＣＨ３，－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３，及び
ＭｘＯｙ：酸化鉄（Ｆｅ３Ｏ４／γＦｅ２Ｏ３），酸化ガドリニウム（ＩＩＩ），酸化マンガン（ＩＩ）及び酸化銅（ＩＩ）；
ここで、結合されて機能化されてコーティングされた磁性ナノ粒子は、哺乳動物に投与されると、血液脳関門を通過して、脳組織中に存在する凝集体およびβ－アミロイドプラークに特異的に結合することができ；
ここで、当該ナノ粒子が脳組織中の凝集体およびβ－アミロイドプラークに結合すると、磁気共鳴画像法により、関心領域で低強度または高強度のシグナルが観察される。
【化I】
ここで、：
Ｒ１：金属酸化物コアへの、ポリマータイプのカテコール誘導体およびトリアルコキシアルキルアミノシランの有機コーティングであり；
Ｒ２：－ＮＨＣＯ－アルキレニル－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－アルキレニル－Ｒ３；
Ｒ３：－ＣＯＯ－，－ＣＯ－，－ＮＨ，－Ｏ－，－Ｓ－，－ＮＨ－アルキレニル－ＮＨ－，－ＮＲ４－ＣＳＳ－；
Ｒ４：－Ｈ，－ＣＨ３，－ＣＨ２－ＣＨ３，－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３，及び
ＭｘＯｙ：酸化鉄（Ｆｅ３Ｏ４／γＦｅ２Ｏ３），酸化ガドリニウム（ＩＩＩ），酸化マンガン（ＩＩ）及び酸化銅（ＩＩ）；
ここで、結合されて機能化されてコーティングされた磁性ナノ粒子は、哺乳動物に投与されると、血液脳関門を通過して、脳組織中に存在する凝集体およびβ－アミロイドプラークに特異的に結合することができ；
ここで、当該ナノ粒子が脳組織中の凝集体およびβ－アミロイドプラークに結合すると、磁気共鳴画像法により、関心領域で低強度または高強度のシグナルが観察される。
【0035】
ここで説明するＮＰｓを介して、磁気共鳴画像法の取得が実行され、脳に存在する凝集体とβ－アミロイドプラークが検出される。これらのＮＰｓは、β－アミロイドプラークに関連する各ナフタレン誘導体に特定のコーティングを使用することの組み合わせから生じる特性の相乗効果により、膜破壊剤を使用せずにＢＢＢを通過する。これまでの最先端技術では説明されていない。
【0036】
予期せぬことに、β－アミロイドプラークに関連するナフタレン誘導体と使用されるコーティングの特異な組み合わせにより、金属酸化物コアのみを変更することにより、タイプＴ１およびＴ２のＣＡを得ることができ、より高い診断精度が保証される。最先端の技術では、この特性は同じ化合物については報告されていない。
【0037】
本発明のＮＰｓは、β－アミロイド凝集体と高度に関連しており、それらの弛緩性の値がコントラストを４０％以上改変し、高感度を保証するため、低濃度で使用することができる。
【0038】
本発明では、前述のナフタレン誘導体に結合した、磁気特性を有する金属酸化物の新しい機能化ナノ粒子を良好な収率で合成する一般的な方法、およびアルツハイマー病の診断のためのそれらの使用が記載されているが、これは何らかの方法で本発明を制限するように解釈されるべきではない。手順は実用的で経済的であり、大規模な製造に適合させることができる。
【0039】
磁気的で高度に単分散の合成ＮＰｓの非限定的な例は、カルボキシル基とアミン基で機能化されたポリエチレングリコールでコーティングされた酸化鉄（Ｆｅ３Ｏ４／γＦｅ２Ｏ３）のＮＰｓであった。これらのコーティングは、凝集体およびβ－アミロイドプラークに関連する、ナフタレン誘導体のアミノ基またはカルボキシル基とそれぞれアミド結合を形成するという利点を提供する：例えば、それぞれ、酸：Ｎ－［４－（１－ナフチルアミノ）－４－オキソブタノイル］－β－アラニン（Ａ）または６－｛［４－（１－ナフチルアミノ）－４－オキソブタノイル］アミノ｝ヘキサン酸およびアミン：Ｎ１－（２－アミノエチル）－Ｎ４－（１－ナフチル）スクシンアミド（Ｂ）またはＮ１－（４－アミノブチル）－Ｎ４－（１－ナフチル）スクシンアミド。共有結合の形成は、Ｓｔｅｇｌｉｃｈ反応またはカルボジイミド法として知られる方法(Xia et al., in Int. J. Electrochem, Sci, 2013. 8: 2459-2467)を介して実行される。本発明に限定されない例２では、Ｎ－［４－（１－ナフチルアミノ）－４－オキソブタノイル］－β－アラニン（ＮＰｓ－１Ａ）で機能化された磁性ＮＰｓが、それが図１に示されるスキームに従って合成された。これは限定的ではない。続いて、それらを単離し、洗浄し、室温でＤＭＳＯに分散させた。
【0040】
ＮＰｓ－１Ａの構造特性は、さまざまな分析技術を使用して実行された。図２は、Ｎ－［４－（１－ナフチルアミノ）－４－オキソブタノイル］－β－アラニンとＮＰｓ－１Ａの合成ＮＰのＦＴ－ＩＲスペクトルを示している。ここで、合成されたＮＰの表面上のＮ－［４－（１－ナフチルアミノ）－４－オキソブタノイル－β－アラニン（Ａ）が示されている。
【0041】
ＮＰｓ－１のＦＴ－ＩＲスペクトルには、このタイプのシステムの典型的なバンドのセットが表示される。したがって、３４２０ｃｍ－１に、－ＮＨ２基の原子価振動に対応するバンドが現れる。２９２０および２８５０ｃｍ－１で、ＰＥＧの炭素鎖の原子価振動υａｓ
（ＣＨ）およびυｓ
（ＣＨ）が観察される。最後に、５８０ｃｍ－１に、υ（Ｆｅ－Ｏ）の特徴的なバンドが現れ、ＮＰｓ中にマグネタイトが存在することを確認する。
【0042】
一方、ＮＰｓ－１ＡのＦＴ－ＩＲスペクトルでは、Ｎ－［４－（１－ナフチルアミノ）－４－オキソブタノイル－β－アラニンの末端カルボキシル基がＮＰｓ－１の末端アミノ基とカップリングしたことを裏付けるシグナル（Ａ）が観察される。したがって、それぞれ３２４８ｃｍ－１および１７１１ｃｍ－１でのＮ－［４－（１－ナフチルアミノ）－４－オキソブタノイル－β－アラニン（Ａ）の原子価振動バンドυ（ＯＨ）およびυ（ＣＯ）が、消える。これは、ナフタレン誘導体（Ａ）の遊離カルボキシル基が反応してアミド結合を生じ、その振動バンドが１６４５ｃｍ－１に観察されることを確認する。また、それぞれυ（ＮＨ）とυ（Ｃ－Ｏ－Ｃ）に起因する３３７０ｃｍ－１の広帯域と１０１８ｃｍ－１の強い帯域も現れる。原子価振動帯υ（Ｆｅ－Ｏ）は６４０ｃｍ－１で観測される。
【0043】
表１では、原子吸光によって測定されたＮＰｓ－１Ａの鉄含有量は３０～４５％の範囲であると報告されている。
【0044】
ＮＰｓ－１Ａの流体力学的直径（ＤＬＳプロファイル）の測定は、２分の時間間隔で行われた（図３）。このパラメーターの値は約２１ｎｍで、多分散度指数は５％未満であった。また、測定時の直径値は安定しており、システム内に凝集物が形成されていないことがわかる。これは、特殊なアミドアルキル鎖を持つＮ－［４－（１－ナフチルアミノ）－４－オキソブタノイル－β－アラニン（Ａ）が、近くの粒子の間の相互作用なしに、立体障害によりＮＰｓに予想外に高い安定性を与えるという事実によるものである。ＴＥＭ顕微鏡写真（図４）によると、ＮＰｓ－１Ａの直径は１１．１±１．８ｎｍである。それらでは、ＮＰｓ－１Ａの表面の有機コーティングを評価することはできない。
【0045】
Ｎ１－（２－アミノエチル）－Ｎ４－（１－ナフチル）スクシンアミド（Ｂ）とジカルボキシル化ＰＥＧでコーティングされたマグネタイトＮＰｓ（ＮＰｓ－２）との結合の一般的な手順を図５に示すが、本発明はこれに限定されない。ＮＰｓ－２Ｂを磁気的に分離し、ＤＭＦで洗浄し、続いて水で洗浄して、反応から残留物を除去した。製品を真空乾燥したら、ＮＰｓをＤＭＳＯに分散させ、使用するまで室温で保存した。ＮＰｓ－２Ｂの化学構造は、ＦＴ－ＩＲスペクトルで確認できる（図６）。
【0046】
ＮＰｓ－２Ｂのスペクトルでは、３４３２ｃｍ－１付近に広くて強いバンドが観察される。これは、２級アミドのυ（ＮＨ）に対応する。１５９３ｃｍ－１（σＮＨおよびυＣ＝Ｏ）および１３９８ｃｍ－１（υＣＮ）に３つのバンドが観察され、構造内に化合物Ｂが存在することを示している。また、６１６ｃｍ－１にυＦｅ－Ｏ振動のバンドがある。
【0047】
図７では、ＮＰｓ－２ＢのＤＬＳプロファイルが観察されている。ＤＬＳによって行われた測定では、流体力学的直径が９５～９９ｎｍで、多分散度指数が１６％未満であることが報告された。ＮＰｓ－２Ｂの安定性は、２分間隔でＤＬＳによる測定によって評価された（図７）。これらの結果によると、ＮＰｓ－２Ｂの流体力学的直径の値に感知できるほどの変動はないため、システムはＤＭＳＯでの研究時間中に適切な安定性を示す。これは、ＢとＮＰｓ－２の結合によるものであり、ＮＰｓ－１Ａの場合と同様に、他の分子相互作用が発生しないため、ＮＰｓ－結合体を凝集させる傾向はない。したがって、β－アミロイドの凝集体に関連するナフタレン誘導体は、予想外に酸化鉄の磁性ＮＰｓに安定性を与えると言うことができる。
【0048】
図８は、ＮＰｓ－２Ｂの熱重量分析（ＴＧ）、示差熱分析（ＤＴＡ）、および熱重量分析（ＴＧＤ）に対応するサーモグラムを示している。ＴＧ曲線は、サンプルからの水分の除去に対応する、突然の質量損失の最初の段階の存在によって特徴付けられる。次に、質量の２１％の損失が、１２５～４６０℃で発生する。ＡＴＤの曲線には、２１４℃と３６５℃の２つの最大値がある。これは、サンプル中の有機物の脱着と分解の吸熱プロセスに対応する。３番目の４％の重量損失が５９１℃から記録された。これは、６３２℃で最大となる吸熱プロセスとしてＤＴＡ曲線で観察される。次に、６７５℃で重量増加が発生する。これは、マグネタイトの結晶相から酸化によるマグヘマイトへの遷移に対応する。最後に、最も安定した熱力学的に結晶相であるヘマタイトが得られる(Pati et al in J. Appl. Phys, 2012, 112: 210-220)。
【0049】
この特許で主張されている磁性および高度に単分散のＮＰｓの別の非限定的な例は、ナフタレン誘導体で機能化されたＰＥＧ化Ｇｄ２Ｏ３ナノ粒子であった。これらのＮＰｓは、ポリオール法によってポリエチレングリコールでコーティングすることができる(Wasi Md. et al in Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects 2014, 450, 67-75.)。限定的でない図９に、２つの段階で構成される一般的な合成手順を示す。最初の段階では、ＰＥＧでコーティングされたナノ粒子が得られ、２番目の段階では、リガンドがジカルボキシル化ＰＥＧと交換される（ＮＰｓ－３）。ＮＰｓ－３とＢの結合は、Ｓｔｅｇｌｉｃｈ反応によって実行される。
【0050】
ＮＰｓ－３ＢのＦＴ－ＩＲスペクトル（図１０）では、１６５０、１４９８、および１３８７ｃｍ－１にバンドの存在が観察される。これは、Ｇｄ２Ｏ３に結合したジカルボキシル化ＰＥＧのカルボキシレートの反対称原子価（υａｓＯＣＯ）および対称（υｓＯＣＯ）の振動に対応し、発生するアミド基のカルボキシレートとオーバーラップする（σＮＨ、υＣ＝ＯおよびυＣＮ）。１３８７、１２５５、および１０９５ｃｍ－１で、ナノ粒子に付着したジカルボキシル化ＰＥＧを特徴付けるバンドが観察される。３４５４ｃｍ－１の広帯域は、２級アミンの原子価振動υＮＨに割り当てられる。
【0051】
ＮＰｓ－３ＢのＧｄの含有量は、誘導結合プラズマ（ＩＣＰ）を使用した発光分光分析技術を使用して決定された。２回の繰り返しで得られた平均値は３０．２９％であった（表２）。
ＮＰｓ－３Ｂの流体力学的直径は、ＤＬＳ法によって決定された（図１１）。流体力学的直径は４７ｎｍで、多分散度指数は１５％未満であった。ＮＰｓ－２Ｂと同様に、ＤＭＳＯに分散したＮＰｓ－３Ｂは、長期間にわたって安定性を維持した。
ＮＰｓ－３Ｂの流体力学的直径は、ＤＬＳ法によって決定された（図１１）。流体力学的直径は４７ｎｍで、多分散度指数は１５％未満であった。ＮＰｓ－２Ｂと同様に、ＤＭＳＯに分散したＮＰｓ－３Ｂは、長期間にわたって安定性を維持した。
【0052】
熱分析は、温度変化に対するサンプルの変化に関する情報を提供し、Ｎｐｓ－３Ｂの表面コーティングの質量パーセンテージを推定することを可能にする。図１２は、熱重量分析（ＴＧ）、示差熱分析（ＤＴＡ）、および熱重量分析（ＴＧＤ）の導関数に対応するサーモグラムを示している。サーモグラムでは、１０５℃付近で質量がわずかに減少し（０．１８％）、これはＮＰｓ－３Ｂでの水和水の損失に関連している。次に、９００℃まで、サンプルの総質量の６４．３４％の損失が発生する。これは、ナノ粒子の有機コーティングの脱着と分解のプロセスが原因である。９００℃の時点では、質量の有意な変化は観察されていない。これは、サンプル中の安定した酸化ガドリニウムの核に対応する。
【0053】
本発明のナフタレン誘導体を有する機能化および結合ＮＰｓの磁気特性を測定するために、ｒ１およびｒ２の緩和値、ならびにそれらの関係ｒ２／ｒ１（実施例７）が決定された。これは、ＣＡの溶解の磁気緩和速度がその濃度に応じてどのように変化するかを反映する物理化学的特性である。
【0054】
図１３および１４は、非限定的な例として、異なる濃度で調製されたＮＰｓ－１ＡおよびＮＰｓ－３Ｂの溶液のシグナル強度の変化を示している。これらの曲線は、Ｅｓｐｉｎ Ｅｃｏシーケンスで得られた磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）で行われた測定から生成される(Fanea L, et al. in Romanian Reports in Physics, 2011; 63 (2): 456-464)。
【0055】
図１３－Ａは、固定エコー時間（ＴＥ＝１１ｍｓ）とさまざまなＴＲ値の縦緩和曲線を示し、図１３－Ｂは、繰り返し時間（ＴＲ＝１００００ｍｓ）が固定されて異なるＴＥ値の横緩和曲線を示している。実験データから評価された緩和能の比率ｒ２／ｒ１は、３ＴのＭＲＩ装置でｒ２／ｒ１＝９０であった（図１３－Ｃ）。商用のネガティブResovist CAの場合、ｒ２／ｒ１の値は３１であった(Rohrer, M. et al in Invest Radiol 2005, 40: 715-724 and Reimer et al., in European Radiology, 2003, 13(6): 1266-1276)。Resovistと比較してＮＰｓ－１Ａのｒ２／ｒ１の値が高いのは、結晶化度が高いためである可能性があり、ｒ２の値が増加する(Levy et al., in Biomaterials, 2011, 32(16): 3988-3999 and Salafranca et al., in Nano letters, 2012. 12(5): 2499-2503)。これらの結果は、ＮＰｓ－１ＡがＭＲＩで造影剤として使用するための優れた磁気特性を持っていることを確認している。ＮＰｓ－１Ａ（図１３－Ｃ）および例７の式１および２から得られた値ｒ１およびｒ２から、ＡＰＰＳｗｅ／ＰＳ１ｄＥ９トランスジェニック動物の脳の縦方向および横方向の組織弛緩時間に対するＮＰｓ－１Ａの効果が計算される。結果は表３にまとめられている。観察されたように、ＮＰｓ－１Ａの効果の存在下でのＴ１の値は１２％から６％の間で変化し、ＮＰｓ－１Ａの濃度に依存して、Ｔ２の値は５６％から４０％の間で変化する。これらの結果は、Ｔ２の値がＴ１の値に対して大幅に変化する場合、ＮＰｓ－１Ａが負の造影剤であることを確認する。これらの結果をResovistで説明した結果（０．１ｍＭの濃度で組織のＴ２の５３％の変動）と比較すると、ＮＰｓ－１Ａが優れた造影剤であることが確認される。
【0056】
図１４－Ａは、エコー時間（ＴＥ＝１１ｍｓ）を固定してＴＲの値を変えた場合の縦緩和曲線を示している。図１４－Ｂでは、繰り返し時間（ＴＲ＝１００００ｍｓ）を固定してＴＥの値を変えた場合の横緩和曲線が観察される。ＮＰｓ－３Ｂの緩和度の値ｒ１およびｒ２は、ｒ１＝７．７４ｍｇ－１ｓ－１Ｌおよびｒ２＝１７．９ｍｇ－１ｓ－１Ｌであり、その関係ｒ２／ｒ１は２．３１である。この値は、ＭＲＩで商業的に使用するための陽性造影剤であるＭａｇｎｅｖｉｓｔ（ｒ２／ｒ１＝１．１９）について説明されている値と比較された(Rohrer M, et al in Invest Radiol 2005; 40: 715-724)。これは、ＮＰｓ－３ＢがＭＲＩで造影剤として使用するための優れた磁気特性を持っていることを示している。
【0057】
ＮＰｓ－３Ｂから得られたｒ１とｒ２の値から、トランスジェニック動物ＡＰＰＳｗｅ／ＰＳ１ｄＥ９の脳組織の縦方向および横方向の緩和時間に対するそれらの影響を計算した。実施例７の式１および２を用いて、組織において観察された弛緩時間（Ｔ１ｏｂｓまたはＴ２ｏｂｓ）は、ＮＰｓ－３Ｂの蓄積の結果として計算される。値を表４に示す。観察されたように、ＮＰｓ－３Ｂの影響下の組織のＴ１値は、濃度に応じて４４％から４７％の間で変化するが、Ｔ２は１２％から１３％の間で変化する。観察されたＴ１値の主な変動は、ＮＰｓ－３Ｂが陽性造影剤であることを示している。この結果を組織Ｔ１のマグネビストによって引き起こされた２０％の変動と比較すると、ＮＰｓ－３Ｂが適切な陽性造影剤であると結論付けられる。
本発明に関連して、以下の内容を更に開示する。
［１］
磁気共鳴画像法によるアルツハイマー病の診断のための凝集体およびβ－アミロイドプラークに関連する、多機能有機層でコーティングされた金属酸化物コアを含む式Ｉの磁性ナノ粒子であって、ここで、前記有機層はナフタレン誘導体に結合している、前記の磁性ナノ粒子。
ここで、：
Ｒ １ ：金属酸化物コアへの、ポリマータイプのカテコール誘導体およびトリアルコキシアルキルアミノシランの有機コーティングであり；
Ｒ ２ ：－ＮＨＣＯ－アルキレニル－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－アルキレニル－Ｒ ３ ；
Ｒ ３ ：－ＣＯＯ－，－ＣＯ－，－ＮＨ，－Ｏ－，－Ｓ－，－ＮＨ－アルキレニル－ＮＨ－，－ＮＲ ４ －ＣＳＳ－；
Ｒ ４ ：－Ｈ，－ＣＨ ３ ，－ＣＨ ２ －ＣＨ ３ ，－ＣＨ ２ ＣＨ ２ ＣＨ ３ ，及び
Ｍ ｘ Ｏ ｙ ：酸化鉄（Ｆｅ ３ Ｏ ４ ／γＦｅ ２ Ｏ ３ ），酸化ガドリニウム（ＩＩＩ），酸化マンガン（ＩＩ）及び酸化銅（ＩＩ）；
ここで、結合されて機能化されてコーティングされた磁性ナノ粒子は、哺乳動物に投与されると、血液脳関門を通過して、脳組織中に存在する凝集体およびβ－アミロイドプラークに特異的に結合することができ；
ここで、当該ナノ粒子が脳組織中の凝集体およびβ－アミロイドプラークに結合すると、磁気共鳴画像法により、関心領域で低強度または高強度のシグナルが観察される。
［２］
前記Ｒ ２ およびＲ ３ のアルキレニル項が、
エチレニル基（－ＣＨ ２ ＣＨ ２ －）、ブチレニル（－ＣＨ ２ ＣＨ ２ ＣＨ ２ ＣＨ ２ －）、及びヘキシレニル（－ＣＨ ２ ＣＨ ２ ＣＨ ２ ＣＨ ２ ＣＨ ２ ＣＨ ２ －）から選択される、［１］に記載の凝集体およびβ－アミロイドプラークに関連する磁性ナノ粒子。
［３］
金属酸化物コアの有機コーティングＲ １ が、基－ＳＨ、－ＯＨ、－ＮＨ ２ 、－ＮＣＳ、－ＣＯＯＨおよびＮ－ヒドロキシスクシンイミドのそのエステル及び－Ｂｒから選択される末端機能基をさらに有する、［１］に記載の凝集物およびβ－アミロイドプラークに関連する磁性ナノ粒子。
［４］
前記Ｒ １ は、ポリ乳酸－コ－グリコール酸（ＰＬＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびその誘導体、ＰＥＧ－ＰＬＡ、ＰＥＧ－ＰＬＧＡ、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、デキストランおよびキトサンの群から選択されるポリマーである、［１］に記載の凝集物およびβ－アミロイドプラークに関連する磁性ナノ粒子。
［５］
前記Ｒ １ が、４－（２－アミノエチル）ベンゼン－１，２－ジオール、３，４－ジヒドロキシ桂皮酸、３，４－ジヒドロキシフェネチルイソチオシアネートおよび４－（ブロモエチル）ベンゼン－１，２－ジオールの群から選択されるカテコール誘導体である、［１］に記載の凝集物およびβ－アミロイドプラークに関連する磁性ナノ粒子。
［６］
Ｒ １ が、（２－アミノエチル）トリエトキシシラン、（３－アミノプロピル）トリエトキシシラン、Ｎ－（２－アミノエチル）－３－（トリメトキシシリル）プロピルアミンおよび（４－アミノブチル）トリエトキシシランの群から選択されるトリアルコキシアルキルアミノシランである、［１］に記載の凝集物およびβ－アミロイドプラークに関連する磁性ナノ粒子。
［７］
Ｒ １ が、［４］のポリマーおよび［５］のカテコール誘導体の混合物を、１：０．０１～１：１の化学量論比で含む有機コーティングである、［１］に記載の凝集体およびβ－アミロイドプラークに関連する磁性ナノ粒子。
［８］
Ｒ １ が、［４］のポリマーと［６］のトリアルコキシアルキルアミノシラン誘導体の混合物を、１：０．０１～１：１の化学量論比で含む有機コーティングである、［１］に記載の凝集体およびβ－アミロイドプラークに関連する磁性ナノ粒子。
［９］
Ｒ １ が、［５］のカテコール誘導体の混合物と［６］のトリアルコキシアルキルアミノシランの混合物を、１：０．０１～１：１の化学量論比で含む有機コーティングである、［１］に記載の凝集体およびβ－アミロイドプラークに関連する磁性ナノ粒子。
［１０］
ナフタレン誘導体が、下記の群から選択される、［１］に記載の凝集物およびβ－アミロイドプラークに関連する磁性ナノ粒子：Ｎ１－（２－アミノエチル）－Ｎ４－（１－ナフチル）スクシンアミド、Ｎ－［４－（１－ナフチルアミノ）－４－オキソブタノイル］－β－アラニン、６－｛［４－（１－ナフチルアミノ）－４－オキソブタノイル］アミノ｝ヘキサン酸、Ｎ１－（２－アミノブチル）－Ｎ４－（１－ナフチル）スクシンアミド、Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）－Ｎ’－１－ナフチルスクシンアミド、Ｎ－（３－メルカプトプロピル）－Ｎ’－１－ナフチスクシンアミド、Ｎ－｛２－［（２－アミノエチル）アミノ］エチル｝－Ｎ’－１－ナフチスクシンアミドおよび（２－｛［４－（１－ナフチルアミノ）－４－オキソブタノイル］アミノ｝エチル）カルバモジチオ酸ナトリウム塩。
［１１］
ナフタレン誘導体と結合して機能化したコーティングされたナノ粒子の流体力学的半径が１５０ｎｍ未満である、［１］に記載の凝集物およびβ－アミロイドプラークに関連する磁性ナノ粒子。
［１２］
ナフタレン誘導体と結合して機能化したコーティングされたナノ粒子の流体力学的半径が１００～５ｎｍである、［１］に記載の凝集物およびβ－アミロイドプラークに関連する磁性ナノ粒子。
［１３］
式Ｉの磁性ナノ粒子の医薬組成物：
ここで、：
Ｒ １ ：金属酸化物コアへの、ポリマータイプのカテコール誘導体およびトリアルコキシアルキルアミノシランの有機コーティングであり；
Ｒ ２ ：－ＮＨＣＯ－アルキレニル－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－アルキレニル－Ｒ ３ ；
Ｒ ３ ：－ＣＯＯ－，－ＣＯ－，－ＮＨ，－Ｏ－，－Ｓ－，－ＮＨ－アルキレニル－ＮＨ－，－ＮＲ ４ －ＣＳＳ－；
Ｒ ４ ：－Ｈ，－ＣＨ ３ ，－ＣＨ ２ －ＣＨ ３ ，－ＣＨ ２ ＣＨ ２ ＣＨ ３ ，及び
Ｍ ｘ Ｏ ｙ ：酸化鉄（Ｆｅ ３ Ｏ ４ ／γＦｅ ２ Ｏ ３ ），酸化ガドリニウム（ＩＩＩ），酸化マンガン（ＩＩ）及び酸化銅（ＩＩ）；
ここで、薬学的に許容される賦形剤が、当該ナノ粒子の医薬組成物中に使用され；
ここで、当該ナノ粒子の医薬組成物が投与されると、磁気共鳴によって、低強度または高強度の画像が、哺乳動物の脳組織中に存在する凝集物およびβ－アミロイドプラークに関連する関心領域中に記録される。
［１４］
製剤が、鼻腔、脳室内、腹腔内および静脈内の群から選択される経路によって哺乳動物に投与される、［１３］に記載の磁性ナノ粒子の医薬組成物。
本発明に関連して、以下の内容を更に開示する。
［１］
磁気共鳴画像法によるアルツハイマー病の診断のための凝集体およびβ－アミロイドプラークに関連する、多機能有機層でコーティングされた金属酸化物コアを含む式Ｉの磁性ナノ粒子であって、ここで、前記有機層はナフタレン誘導体に結合している、前記の磁性ナノ粒子。
【化I】
ここで、：
Ｒ １ ：金属酸化物コアへの、ポリマータイプのカテコール誘導体およびトリアルコキシアルキルアミノシランの有機コーティングであり；
Ｒ ２ ：－ＮＨＣＯ－アルキレニル－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－アルキレニル－Ｒ ３ ；
Ｒ ３ ：－ＣＯＯ－，－ＣＯ－，－ＮＨ，－Ｏ－，－Ｓ－，－ＮＨ－アルキレニル－ＮＨ－，－ＮＲ ４ －ＣＳＳ－；
Ｒ ４ ：－Ｈ，－ＣＨ ３ ，－ＣＨ ２ －ＣＨ ３ ，－ＣＨ ２ ＣＨ ２ ＣＨ ３ ，及び
Ｍ ｘ Ｏ ｙ ：酸化鉄（Ｆｅ ３ Ｏ ４ ／γＦｅ ２ Ｏ ３ ），酸化ガドリニウム（ＩＩＩ），酸化マンガン（ＩＩ）及び酸化銅（ＩＩ）；
ここで、結合されて機能化されてコーティングされた磁性ナノ粒子は、哺乳動物に投与されると、血液脳関門を通過して、脳組織中に存在する凝集体およびβ－アミロイドプラークに特異的に結合することができ；
ここで、当該ナノ粒子が脳組織中の凝集体およびβ－アミロイドプラークに結合すると、磁気共鳴画像法により、関心領域で低強度または高強度のシグナルが観察される。
［２］
前記Ｒ ２ およびＲ ３ のアルキレニル項が、
エチレニル基（－ＣＨ ２ ＣＨ ２ －）、ブチレニル（－ＣＨ ２ ＣＨ ２ ＣＨ ２ ＣＨ ２ －）、及びヘキシレニル（－ＣＨ ２ ＣＨ ２ ＣＨ ２ ＣＨ ２ ＣＨ ２ ＣＨ ２ －）から選択される、［１］に記載の凝集体およびβ－アミロイドプラークに関連する磁性ナノ粒子。
［３］
金属酸化物コアの有機コーティングＲ １ が、基－ＳＨ、－ＯＨ、－ＮＨ ２ 、－ＮＣＳ、－ＣＯＯＨおよびＮ－ヒドロキシスクシンイミドのそのエステル及び－Ｂｒから選択される末端機能基をさらに有する、［１］に記載の凝集物およびβ－アミロイドプラークに関連する磁性ナノ粒子。
［４］
前記Ｒ １ は、ポリ乳酸－コ－グリコール酸（ＰＬＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびその誘導体、ＰＥＧ－ＰＬＡ、ＰＥＧ－ＰＬＧＡ、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、デキストランおよびキトサンの群から選択されるポリマーである、［１］に記載の凝集物およびβ－アミロイドプラークに関連する磁性ナノ粒子。
［５］
前記Ｒ １ が、４－（２－アミノエチル）ベンゼン－１，２－ジオール、３，４－ジヒドロキシ桂皮酸、３，４－ジヒドロキシフェネチルイソチオシアネートおよび４－（ブロモエチル）ベンゼン－１，２－ジオールの群から選択されるカテコール誘導体である、［１］に記載の凝集物およびβ－アミロイドプラークに関連する磁性ナノ粒子。
［６］
Ｒ １ が、（２－アミノエチル）トリエトキシシラン、（３－アミノプロピル）トリエトキシシラン、Ｎ－（２－アミノエチル）－３－（トリメトキシシリル）プロピルアミンおよび（４－アミノブチル）トリエトキシシランの群から選択されるトリアルコキシアルキルアミノシランである、［１］に記載の凝集物およびβ－アミロイドプラークに関連する磁性ナノ粒子。
［７］
Ｒ １ が、［４］のポリマーおよび［５］のカテコール誘導体の混合物を、１：０．０１～１：１の化学量論比で含む有機コーティングである、［１］に記載の凝集体およびβ－アミロイドプラークに関連する磁性ナノ粒子。
［８］
Ｒ １ が、［４］のポリマーと［６］のトリアルコキシアルキルアミノシラン誘導体の混合物を、１：０．０１～１：１の化学量論比で含む有機コーティングである、［１］に記載の凝集体およびβ－アミロイドプラークに関連する磁性ナノ粒子。
［９］
Ｒ １ が、［５］のカテコール誘導体の混合物と［６］のトリアルコキシアルキルアミノシランの混合物を、１：０．０１～１：１の化学量論比で含む有機コーティングである、［１］に記載の凝集体およびβ－アミロイドプラークに関連する磁性ナノ粒子。
［１０］
ナフタレン誘導体が、下記の群から選択される、［１］に記載の凝集物およびβ－アミロイドプラークに関連する磁性ナノ粒子：Ｎ１－（２－アミノエチル）－Ｎ４－（１－ナフチル）スクシンアミド、Ｎ－［４－（１－ナフチルアミノ）－４－オキソブタノイル］－β－アラニン、６－｛［４－（１－ナフチルアミノ）－４－オキソブタノイル］アミノ｝ヘキサン酸、Ｎ１－（２－アミノブチル）－Ｎ４－（１－ナフチル）スクシンアミド、Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）－Ｎ’－１－ナフチルスクシンアミド、Ｎ－（３－メルカプトプロピル）－Ｎ’－１－ナフチスクシンアミド、Ｎ－｛２－［（２－アミノエチル）アミノ］エチル｝－Ｎ’－１－ナフチスクシンアミドおよび（２－｛［４－（１－ナフチルアミノ）－４－オキソブタノイル］アミノ｝エチル）カルバモジチオ酸ナトリウム塩。
［１１］
ナフタレン誘導体と結合して機能化したコーティングされたナノ粒子の流体力学的半径が１５０ｎｍ未満である、［１］に記載の凝集物およびβ－アミロイドプラークに関連する磁性ナノ粒子。
［１２］
ナフタレン誘導体と結合して機能化したコーティングされたナノ粒子の流体力学的半径が１００～５ｎｍである、［１］に記載の凝集物およびβ－アミロイドプラークに関連する磁性ナノ粒子。
［１３］
式Ｉの磁性ナノ粒子の医薬組成物：
【化I】
ここで、：
Ｒ １ ：金属酸化物コアへの、ポリマータイプのカテコール誘導体およびトリアルコキシアルキルアミノシランの有機コーティングであり；
Ｒ ２ ：－ＮＨＣＯ－アルキレニル－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－アルキレニル－Ｒ ３ ；
Ｒ ３ ：－ＣＯＯ－，－ＣＯ－，－ＮＨ，－Ｏ－，－Ｓ－，－ＮＨ－アルキレニル－ＮＨ－，－ＮＲ ４ －ＣＳＳ－；
Ｒ ４ ：－Ｈ，－ＣＨ ３ ，－ＣＨ ２ －ＣＨ ３ ，－ＣＨ ２ ＣＨ ２ ＣＨ ３ ，及び
Ｍ ｘ Ｏ ｙ ：酸化鉄（Ｆｅ ３ Ｏ ４ ／γＦｅ ２ Ｏ ３ ），酸化ガドリニウム（ＩＩＩ），酸化マンガン（ＩＩ）及び酸化銅（ＩＩ）；
ここで、薬学的に許容される賦形剤が、当該ナノ粒子の医薬組成物中に使用され；
ここで、当該ナノ粒子の医薬組成物が投与されると、磁気共鳴によって、低強度または高強度の画像が、哺乳動物の脳組織中に存在する凝集物およびβ－アミロイドプラークに関連する関心領域中に記録される。
［１４］
製剤が、鼻腔、脳室内、腹腔内および静脈内の群から選択される経路によって哺乳動物に投与される、［１３］に記載の磁性ナノ粒子の医薬組成物。
【図面の簡単な説明】
【0058】
図の内容の説明
【図1】図１：ＮＰｓ－１Ａを得るために、最も重要な反応条件を含む、ＨＯＯＣ－ＰＥＧ－ＮＨ２で機能化され、Ｎ－［４－（１－ナフチルアミノ）－４－オキソブタノイル］－β－アラニン（Ａ）と結合したＮＰｓ－１マグネタイトナノ粒子の結合の一般的な手順を示す。
【図2-1】表１：原子吸光によって決定されたＮＰｓ－１ＡのＦｅ含有量の値が示されている。Ｆｅの検量線と線形調整。
【図3】図３：ＤＬＳ技術によって決定されたＤＭＳＯに分散されたＮＰｓ－１Ａの流体力学的直径を示している。測定間の時間２分。ＤＬＳプロファイルは、the Beckman Coulter firmのDelsaNano C分光計で取得した。測定は１７９°の角度で行われた。
【図5】図５：ＮＰｓ－２Ｂを得るために、最も重要な反応条件を含む、ＰＥＧ－ジカルボキシル化で機能化されたマグネタイトナノ粒子ＮＰｓ－２とＮ１－（２－アミノエチル）－Ｎ４－（１－ナフチル）スクシンアミド（Ｂ）の結合の一般的な手順を示す。
【図7】図７：ＤＬＳ技術によって決定されたＤＭＳＯに分散されたＮＰｓ－２Ｂの流体力学的直径を示している。測定間の時間２分。ＤＬＳプロファイルは、the Beckman Coulter firmのDelsaNano C分光計で取得した。測定は１７９°の角度で行われた。
【図8】図８：Ａｒの流れの下で室温から１０００℃までの熱処理を受けたＮＰｓ－２Ｂのサーモグラム（ＴＧ）と示差熱分析（ＤＴＡ）の曲線を示している。ＡＴＤとＴＧの同時サーモグラムは、ＮＥＴＺＳＣＨ機器、モデルＳＴＡ ４４９Ｆ３に登録された。温度によるサンプルの重量の変化の実験データは、装置“Proteus”、バージョン５．２．１／０７．０４．２００１に含まれているプログラムの助けを借りて処理された。定量的ＴＧ分析の誤差は２．０％である。
【図9】図９：ＮＰｓ－３Ｂを得るために、最も重要な反応条件を含む、ＰＥＧ－ジカルボン酸（ＮＰｓ－３）で機能化された酸化ガドリニウムナノ粒子とＮ１－（２－アミノエチル）－Ｎ４－（１－ナフチル）スクシンアミド（Ｂ）の結合の一般的な手順を示す。
【図10-2】表２：ＮＰｓ－３ＢのＧｄ濃度の測定値を示す。Ｇｄの含有量は、ＩＣＰ－ＯＥＳデバイス、Ｓｐｅｃｔｒｏブランド、Ｓｐｅｃｔｒｏｆｌａｍｅモデルで測定された。装置で使用された電力は１２００Ｗであった。１．２Ｌ／分のアルゴンの噴霧流量と３．８バールの噴霧圧力が使用された。補助流量と冷却流量は、それぞれ１．２Ｌ／ｍｉｎ（Ａｒ）と１８．８Ｌ／ｍｉｎ（Ａｒ）であった。観測高さはコイルに対して１５ｍｍであった。純度９９．９％のＧｄ２Ｏ３を使用し、これをＨＣｌ（３７％）に溶解して検量線を作成した。
【図11】図１１：ＤＬＳ技術によって決定されたＤＭＳＯに分散されたＮＰｓ－３Ｂの流体力学的直径を示している。測定間の時間２分。ＤＬＳプロファイルは、the Beckman Coulter firmのDelsaNano C分光計で取得した。測定は１７９°の角度で行われた。
【図12】図１２：Ａｒフロー下で室温から１０００℃までの熱処理を受けたＮＰｓ－３Ｂのサーモグラム（ＴＧ）と示差熱分析（ＤＴＡ）の曲線が示されている。ＡＴＤとＴＧの同時サーモグラムは、ＮＥＴＺＳＣＨ機器、モデルＳＴＡ ４４９Ｆ３に登録された。温度によるサンプルの重量の変化の実験データは、装置“Proteus”、バージョン５．２．１／０７．０４．２００１に含まれているプログラムの助けを借りて処理された。定量的ＴＧ分析の誤差は２．０％である。
【図13】図１３：さまざまな濃度で調製されたＮＰｓ－１Ａのシグナル強度の変化を示している。これらの曲線は、スピンエコ（ＳＥ）シーケンスで得られた磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）で行われた測定から生成される。図１３Ａ－は、固定エコー時間（ＴＥ＝１１ｍｓ）及び異なるＴＲ値を使用した場合の縦緩和曲線を示している。図１３Ｂ－は、固定繰り返し時間（ＴＲ＝１００００ｍｓ）及び異なるＴＥ値を使用した横緩和曲線を示している。Ｃ－ ＭＲＩによるResovistとＮＰｓ－１Ａの弛緩性の比較研究。
【図13-3】表３：ＮＰｓ－１Ａの存在下でトランスジェニック動物ＡＰＰＳｗｅ／ＰＳ１ｄＥ９の脳組織で観察された縦方向および横方向の緩和時間の変化（パーセンテージで表される）が示されている。
【図14】図１４：さまざまな濃度で調製されたＮＰｓ－３Ｂのシグナル強度の変化を示している。これらの曲線は、スピンエコ（ＳＥ）シーケンスで得られた磁気共鳴画像で行われた測定から生成される。図１４Ａ－は、エコー時間（ＴＥ＝１１ｍｓ）が固定されてＴＲの値が異なる場合の縦緩和曲線を示している。図１４Ｂ－は、繰り返し時間（ＴＲ＝１００００ｍｓ）が固定されてＴＥ値が異なる場合の横緩和曲線を示している。
【図14-4】表４：ＮＰｓ－３Ｂの存在下でトランスジェニック動物ＡＰＰＳｗｅ／ＰＳ１ｄＥ９の脳組織で観察された縦方向および横方向の緩和時間の変化（パーセンテージで表される）が示されている。
【図15】図１５：さまざまな領域での強度測定値がトランスジェニックマウスの脳画像に表示される。左側では、４つのゾーン（参照を含む）で造影剤投与前に測定された強度。右側は、投与後に測定された強度である。
【図15-5】表５：１８か月の健康な動物の関心領域の強度の変化。ゾーンは脳と小脳で１～３と、参照の１つである。ゾーン１～３では、コントラストの変化は最大２２％であった。コントラストが到達しない参照領域では、統計的に有意な変化はなかった。
【発明を実施するための形態】
【0059】
本発明のナノ粒子の入手およびアルツハイマー病の診断のためのそれらの使用は、以下の例によって示されているが、これは決して限定的なものとして解釈されるべきではない。
【0060】
例１：ＨＯＯＣ－ＰＥＧ－ＮＨ
２
で機能化されたマグネタイトナノ粒子（ＮＰｓ－１）。
アルゴン雰囲気下の５０ｍＬ丸底フラスコ中で、Ｆｅ（ａｃａｃ）３（２．５ｍｍｏｌ、０．８８３ｇ）、ＨＯＯＣ－ＰＥＧ－ＮＨ２１０００（２．５ｍｍｏｌ、２．５ｇ）およびＰＥＧ－３００（３７．３ｍｍｏｌ、１１．２ｇ）を絶えず攪拌しながら混合した。反応混合物を１６０℃で３０分間、続いて、激しく攪拌しながら、２２０℃で２時間加熱した。反応混合物を室温に冷却し、エタノールを加えた。粒子を１００００ｒｐｍでの遠心分離によって分離し、ＤＭＦ（１ｍＬ）中に分散させて室温で保存した。ＦＴ－ＩＲ、υ（ｃｍ－１）：３４２０；２９２０；２８５０；１６０３；１０７０；５８０（υＦｅ－Ｏ）。
アルゴン雰囲気下の５０ｍＬ丸底フラスコ中で、Ｆｅ（ａｃａｃ）３（２．５ｍｍｏｌ、０．８８３ｇ）、ＨＯＯＣ－ＰＥＧ－ＮＨ２１０００（２．５ｍｍｏｌ、２．５ｇ）およびＰＥＧ－３００（３７．３ｍｍｏｌ、１１．２ｇ）を絶えず攪拌しながら混合した。反応混合物を１６０℃で３０分間、続いて、激しく攪拌しながら、２２０℃で２時間加熱した。反応混合物を室温に冷却し、エタノールを加えた。粒子を１００００ｒｐｍでの遠心分離によって分離し、ＤＭＦ（１ｍＬ）中に分散させて室温で保存した。ＦＴ－ＩＲ、υ（ｃｍ－１）：３４２０；２９２０；２８５０；１６０３；１０７０；５８０（υＦｅ－Ｏ）。
【0061】
例２：Ｎ－［４－（１－ナフチルアミノ）－４－オキソブタノイル］－β－アラニン（Ａ）と結合したマグネタイトナノ粒子（ＮＰｓ－１Ａ）。
５０ｍＬの丸底フラスコに、ＤＭＦ（１ｍＬ）に溶解したＡ（１０ｍｇ、３１．８μｍｏｌ）を加えた。あらかじめＤＭＦ（５００μＬ）に溶解したヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴｚ、４．７ｍｇ、３５μｍｏｌ）を反応混合物に加えた。続いて、ＤＭＦ（５００μＬ）に溶解した１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）（８．２ｍｇ、５２．４μｍｏｌ）を加えた。反応混合物を３０分間撹拌し、次に２００μＬの磁性ナノ粒子ＮＰｓ－１の分散液を加える。反応混合物を室温で４時間撹拌した。生成物を磁気的に分離し、ＤＭＦ（２×２５０μＬ）および水（２×２５０μＬ）で洗浄し、次にＰ２Ｏ５で真空乾燥した。ＮＰｓ－１ＡをＤＭＳＯ（１ｍＬ）に分散させ、室温で保存した。ＦＴ－ＩＲ、υ（ｃｍ－１）：３３７０；１６４５；１０１８；６４０（υＦｅ－Ｏ）。
５０ｍＬの丸底フラスコに、ＤＭＦ（１ｍＬ）に溶解したＡ（１０ｍｇ、３１．８μｍｏｌ）を加えた。あらかじめＤＭＦ（５００μＬ）に溶解したヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴｚ、４．７ｍｇ、３５μｍｏｌ）を反応混合物に加えた。続いて、ＤＭＦ（５００μＬ）に溶解した１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）（８．２ｍｇ、５２．４μｍｏｌ）を加えた。反応混合物を３０分間撹拌し、次に２００μＬの磁性ナノ粒子ＮＰｓ－１の分散液を加える。反応混合物を室温で４時間撹拌した。生成物を磁気的に分離し、ＤＭＦ（２×２５０μＬ）および水（２×２５０μＬ）で洗浄し、次にＰ２Ｏ５で真空乾燥した。ＮＰｓ－１ＡをＤＭＳＯ（１ｍＬ）に分散させ、室温で保存した。ＦＴ－ＩＲ、υ（ｃｍ－１）：３３７０；１６４５；１０１８；６４０（υＦｅ－Ｏ）。
【0062】
例３：ポリエチレングリコールジカルボキシレートでコーティングされたマグネタイトナノ粒子（ＮＰｓ－２）。
アルゴン雰囲気下の５０ｍＬ丸底フラスコ内で、ＰＥＧ－ｄｉ－ＣＯＯＨ－６００（０．４ｇ、０．７ｍｍｏｌ）と１０ｍＬのＰＥＧ－３００（３３ｍｍｏｌ）を絶えず攪拌しながら混合する。次に、２．５ｍＬのＰＥＧ－３００中のＦｅ（ａｃａｃ）３（０．１８ｇ、０．５１ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。反応混合物を１６０℃で３０分間、続いて、激しく攪拌しながら、２２０℃で２時間加熱した。反応混合物を室温に冷却し、エタノールを加えた。粒子を１００００ｒｐｍでの遠心分離によって分離し、ＤＭＦ（１ｍＬ）に分散させて室温で保存した。得られた生成物の質量：２００ｍｇ。ＦＴ－ＩＲ、υ（ｃｍ－１）：３４２０；２９２４；１６２６；１４１２；１０９６；５７１
アルゴン雰囲気下の５０ｍＬ丸底フラスコ内で、ＰＥＧ－ｄｉ－ＣＯＯＨ－６００（０．４ｇ、０．７ｍｍｏｌ）と１０ｍＬのＰＥＧ－３００（３３ｍｍｏｌ）を絶えず攪拌しながら混合する。次に、２．５ｍＬのＰＥＧ－３００中のＦｅ（ａｃａｃ）３（０．１８ｇ、０．５１ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。反応混合物を１６０℃で３０分間、続いて、激しく攪拌しながら、２２０℃で２時間加熱した。反応混合物を室温に冷却し、エタノールを加えた。粒子を１００００ｒｐｍでの遠心分離によって分離し、ＤＭＦ（１ｍＬ）に分散させて室温で保存した。得られた生成物の質量：２００ｍｇ。ＦＴ－ＩＲ、υ（ｃｍ－１）：３４２０；２９２４；１６２６；１４１２；１０９６；５７１
【0063】
例４：Ｎ１－（２－アミノエチル）－Ｎ４－（１－ナフチル）スクシンアミド（Ｂ）に結合したポリエチレングリコールジカルボキシレートでコーティングされたマグネタイトナノ粒子（ＮＰｓ－２）（ＮＰｓ－２Ｂ）。
氷浴に浸した５０ｍＬの丸底フラスコに、２００μＬのＮＰ－２（実施例３のＤＭＦ（１ｍＬ）に分散）およびＤＭＦ中のＨＯＢＴｚ（４．７ｍｇ、３５μｍｏｌ）の溶液を加えた（５００μＬ）。次に、ＤＭＦ（５００μＬ）中のＥＤＣ（８．２ｍｇ、５２．４μｍｏｌ）の溶液を加えた。反応混合物を３０分間撹拌して、ＤＭＦ（５００μＬ）中の３（１０ｍｇ、３５μモル）の溶液を加え、次いで、室温で４８時間撹拌した。最後に、結合ナノ粒子（ＮＰｓ－２Ｂ）を磁気的に分離し、ＤＭＦと水（それぞれ２×２５０μＬ）で洗浄し、Ｐ２Ｏ５下で２４時間真空乾燥した。粒子をＤＭＳＯ（４ｍＬ）に分散させ、室温で保存した。得られた生成物の質量：４０ｍｇ。ＦＴ－ＩＲ、υ（ｃｍ－１）：３４３２；２９２０；１５９２；１３９７；６１６
氷浴に浸した５０ｍＬの丸底フラスコに、２００μＬのＮＰ－２（実施例３のＤＭＦ（１ｍＬ）に分散）およびＤＭＦ中のＨＯＢＴｚ（４．７ｍｇ、３５μｍｏｌ）の溶液を加えた（５００μＬ）。次に、ＤＭＦ（５００μＬ）中のＥＤＣ（８．２ｍｇ、５２．４μｍｏｌ）の溶液を加えた。反応混合物を３０分間撹拌して、ＤＭＦ（５００μＬ）中の３（１０ｍｇ、３５μモル）の溶液を加え、次いで、室温で４８時間撹拌した。最後に、結合ナノ粒子（ＮＰｓ－２Ｂ）を磁気的に分離し、ＤＭＦと水（それぞれ２×２５０μＬ）で洗浄し、Ｐ２Ｏ５下で２４時間真空乾燥した。粒子をＤＭＳＯ（４ｍＬ）に分散させ、室温で保存した。得られた生成物の質量：４０ｍｇ。ＦＴ－ＩＲ、υ（ｃｍ－１）：３４３２；２９２０；１５９２；１３９７；６１６
【0064】
例５：ポリエチレングリコールジカルボキシレートでコーティングされた酸化ガドリニウムナノ粒子（Ｇｄ
２
Ｏ
３
－ＰＥＧジカルボキシレート）（ＮＰｓ－３）。
還流冷却器を備えた５０ｍＬの丸底フラスコで、３．４５ｇ（５ｍｍｏｌ）のＧｄＣｌ３×６Ｈ２Ｏを２５ｍＬのＰＥＧ（Ｍｎ＝４００）に、１００℃で撹拌しながら溶解した。この溶液に、１０ｍＬのＰＥＧ（Ｍｎ＝４００）中のＮａＯＨ（０．６ｇ、１５ミリモル）の溶液を加えた。反応混合物を、絶えず撹拌しながら、１８０℃で４時間加熱した。次に、温度を８０℃に下げて、８ミリモル（４ｍＬ）のＰＥＧジカルボキシレート（ＰＥＧＤ、Ｍｎ＝６００）を加え、その後、絶えず攪拌しながら、１８０℃で４時間再び加熱した。反応混合物を室温に冷却して、５００ｍＬの蒸留Ｈ２Ｏを加えた。コロイド懸濁液を１０分間撹拌し、次に粒子が沈降するまで（約１週間）沈降させた。上澄み液をデカントし、固体をデシケーター内でＰ２Ｏ５上で真空乾燥した。ＮＰｓ－３から得られた質量：８９３ｍｇ。ＦＴ－ＩＲ、υ（ｃｍ－１）：３２９５；１５８０；１５２５；１４３１；１４０１；１３０１；１００６。
還流冷却器を備えた５０ｍＬの丸底フラスコで、３．４５ｇ（５ｍｍｏｌ）のＧｄＣｌ３×６Ｈ２Ｏを２５ｍＬのＰＥＧ（Ｍｎ＝４００）に、１００℃で撹拌しながら溶解した。この溶液に、１０ｍＬのＰＥＧ（Ｍｎ＝４００）中のＮａＯＨ（０．６ｇ、１５ミリモル）の溶液を加えた。反応混合物を、絶えず撹拌しながら、１８０℃で４時間加熱した。次に、温度を８０℃に下げて、８ミリモル（４ｍＬ）のＰＥＧジカルボキシレート（ＰＥＧＤ、Ｍｎ＝６００）を加え、その後、絶えず攪拌しながら、１８０℃で４時間再び加熱した。反応混合物を室温に冷却して、５００ｍＬの蒸留Ｈ２Ｏを加えた。コロイド懸濁液を１０分間撹拌し、次に粒子が沈降するまで（約１週間）沈降させた。上澄み液をデカントし、固体をデシケーター内でＰ２Ｏ５上で真空乾燥した。ＮＰｓ－３から得られた質量：８９３ｍｇ。ＦＴ－ＩＲ、υ（ｃｍ－１）：３２９５；１５８０；１５２５；１４３１；１４０１；１３０１；１００６。
【0065】
例６：Ｎ１－（２－アミノエチル）－Ｎ４－（１－ナフチル）スクシンアミド（Ｂ）と結合したＧｄ
２
Ｏ
３
－ＰＥＧジカルボキシル化ナノ粒子（ＮＰｓ－３）（ＮＰｓ－３Ｂ）。
２５ｍＬの丸底フラスコに、５ｍｇのＧｄ２Ｏ３－ＰＥＧＤを４ｍＬのＤＭＦに分散させ、ＤＭＦ（４ｍＬ）中のＥＤＣ溶液（４０ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を氷浴で冷却し、ＨＯＢＴ（２０ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）および３（４０ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）を、それらの間に３０分の段階的時間で加えた。次に、それを室温で２日間撹拌し、１０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して、上澄み液を除去した。固体をエタノール（１０ｍＬ×３）で洗浄し、デシケーター内でＰ２Ｏ５上で真空乾燥した。ＮＰｓ－３Ｂから得られた質量：２．７ｍｇ。ＦＴ－ＩＲ、υ（ｃｍ－１）：３４５４；２９３３；２８７０；１６５０；１４９８；１３８７；１２５５、１０９５。
２５ｍＬの丸底フラスコに、５ｍｇのＧｄ２Ｏ３－ＰＥＧＤを４ｍＬのＤＭＦに分散させ、ＤＭＦ（４ｍＬ）中のＥＤＣ溶液（４０ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を氷浴で冷却し、ＨＯＢＴ（２０ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）および３（４０ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）を、それらの間に３０分の段階的時間で加えた。次に、それを室温で２日間撹拌し、１０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して、上澄み液を除去した。固体をエタノール（１０ｍＬ×３）で洗浄し、デシケーター内でＰ２Ｏ５上で真空乾燥した。ＮＰｓ－３Ｂから得られた質量：２．７ｍｇ。ＦＴ－ＩＲ、υ（ｃｍ－１）：３４５４；２９３３；２８７０；１６５０；１４９８；１３８７；１２５５、１０９５。
【0066】
例７：ＮＰｓ－１ＡおよびＮＰｓ－３Ｂの磁気特性のインビトロ特性化。
造影剤（ＣＡ）は、それが蓄積する組織中で観察されるＴ１とＴ２（Ｔ１ｏｂｓ、Ｔ２ｏｂｓ）の両方に影響を与える。式（１）および（２）は、この現象を説明している(Haacke E M, et al., in Magnetic Resonance Imaging Physical Principles and Sequence Design, 1999. United States, New York.)。
Ｒ１ｏｂｓ≡１／Ｔ１ｏｂｓ＝１／Ｔ１ｔ＋ｒ１＊Ｃ
≡Ｒ１ｔ＋ｒ１＊Ｃ （１）
ここで：
・Ｃ－ＣＡの濃度（物質の入手可能性に応じて、ｍＭまたはｍｇ／ｍｌ）
・Ｒ１ｏｂｓ－観察された速度または緩和率（ｓ－１）。これは、濃度ＣのＣＡによって修飾された組織の弛緩率である。
・Ｔ１ｏｂｓ－観測されたＴ１（ｍｓ）
・Ｔ１ｔ－組織のＴ１（ｍｓ）
・ｒ１－縦緩和率（ｍＭ－１ｓ－１）
同様の方法で、Ｔ２に対して下記が提案される：
Ｒ２ｏｂｓ≡１／Ｔ２ｏｂｓ＝１／Ｔ２ｔ＋ｒ２＊Ｃ
≡Ｒ２ｔ＋ｒ２＊Ｃ （２）
ここで：
・Ｒ２ｏｂｓ－観察された速度または緩和率（ｓ－１）。これは、濃度ＣのＣＡによって修飾された組織の弛緩率である。
・Ｔ２ｏｂｓ－観測されたＴ１（ｍｓ）
・Ｔ２ｔ－組織のＴ１（ｍｓ）
・ｒ２－横緩和度（ｍＭ－１ｓ－１）
造影剤（ＣＡ）は、それが蓄積する組織中で観察されるＴ１とＴ２（Ｔ１ｏｂｓ、Ｔ２ｏｂｓ）の両方に影響を与える。式（１）および（２）は、この現象を説明している(Haacke E M, et al., in Magnetic Resonance Imaging Physical Principles and Sequence Design, 1999. United States, New York.)。
Ｒ１ｏｂｓ≡１／Ｔ１ｏｂｓ＝１／Ｔ１ｔ＋ｒ１＊Ｃ
≡Ｒ１ｔ＋ｒ１＊Ｃ （１）
ここで：
・Ｃ－ＣＡの濃度（物質の入手可能性に応じて、ｍＭまたはｍｇ／ｍｌ）
・Ｒ１ｏｂｓ－観察された速度または緩和率（ｓ－１）。これは、濃度ＣのＣＡによって修飾された組織の弛緩率である。
・Ｔ１ｏｂｓ－観測されたＴ１（ｍｓ）
・Ｔ１ｔ－組織のＴ１（ｍｓ）
・ｒ１－縦緩和率（ｍＭ－１ｓ－１）
同様の方法で、Ｔ２に対して下記が提案される：
Ｒ２ｏｂｓ≡１／Ｔ２ｏｂｓ＝１／Ｔ２ｔ＋ｒ２＊Ｃ
≡Ｒ２ｔ＋ｒ２＊Ｃ （２）
ここで：
・Ｒ２ｏｂｓ－観察された速度または緩和率（ｓ－１）。これは、濃度ＣのＣＡによって修飾された組織の弛緩率である。
・Ｔ２ｏｂｓ－観測されたＴ１（ｍｓ）
・Ｔ２ｔ－組織のＴ１（ｍｓ）
・ｒ２－横緩和度（ｍＭ－１ｓ－１）
【0067】
組織シグナルの強度の改善は、造影剤の緩和度ｒ１およびｒ２によってだけでなく、組織内のこれの濃度レベルによっても、決定される。高濃度の極限の場合では、シグナルの飽和とコントラストの喪失につながる可能性がある(Elster AD et al in Radiology 1990; 174: 379-381)。このため、低濃度では、より良い結果が得られる。
【0068】
【表0】
【0069】
例８：インビボ研究。ＮＰｓ－１Ａの存在下でのアミロイドプラークを伴う脳組織におけるＴ１およびＴ２緩和時間の変更。
インビボ研究は、５匹のマウス（ＡＰＰＳｗｅ／ＰＳ１ｄＥ９トランスジェニックマウス、１２ヶ月）および同じ年齢の３匹の健康なマウスで実施された。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の１００ｍｇ／ｍＬケタミンと１０ｍｇ／ｍＬキシラジンの混合物でマウスを麻酔した（５ｍＬ／ｋｇ体重）。ＮＰ－１Ａの懸濁液は、注射の直前に５ｍｇ／ｋｇ Ｆｅ／ｋｇ体重の用量でＰＢＳ（ｐＨ７．４）で希釈された。合計１００μＬの希釈ＮＰ－１Ａを尾静脈から注射した。
インビボ研究は、５匹のマウス（ＡＰＰＳｗｅ／ＰＳ１ｄＥ９トランスジェニックマウス、１２ヶ月）および同じ年齢の３匹の健康なマウスで実施された。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の１００ｍｇ／ｍＬケタミンと１０ｍｇ／ｍＬキシラジンの混合物でマウスを麻酔した（５ｍＬ／ｋｇ体重）。ＮＰ－１Ａの懸濁液は、注射の直前に５ｍｇ／ｋｇ Ｆｅ／ｋｇ体重の用量でＰＢＳ（ｐＨ７．４）で希釈された。合計１００μＬの希釈ＮＰ－１Ａを尾静脈から注射した。
【0070】
ＣＡの投与の結果としての強度の変動を定量化するために、マウスの脳で生体内（インビボ）測定が行われた。コントラスト変動の定量化は、次の式に従って実行された。
Ｃｏｎｔｒａｓｔ＝１００*（ＡｒｅａＢｅｆｏｒｅ－ＡｒｅａＡｆｔｅｒ）／ＡｒｅａＢｅｆｏｒｅ
ここで、ＡｒｅａＢｅｆｏｒｅは、ＣＡの管理（投与）前の領域の強度であり、ＡｒｅａＡｆｔｅｒは、管理後の領域の強度である。
Ｃｏｎｔｒａｓｔ＝１００*（ＡｒｅａＢｅｆｏｒｅ－ＡｒｅａＡｆｔｅｒ）／ＡｒｅａＢｅｆｏｒｅ
ここで、ＡｒｅａＢｅｆｏｒｅは、ＣＡの管理（投与）前の領域の強度であり、ＡｒｅａＡｆｔｅｒは、管理後の領域の強度である。
【0071】
図１５では、ＣＡの注射前後の動物の画像が観察されている。これらは、スピンエコーシーケンス（ＴＲ／ＴＥ ４０００／８０）および１８０μｍの空間分解能でＴ２で重み付けされた冠状断面である。
【0072】
表７は、ＮＰｓ－１Ａの適用によるインビボ効果を示している。コントラストの変化は１７～２２％で達成された。これは、画像の強度を低下させるため、ＮＰｓ－１Ａをネガティブエージェント（陰性剤）として裏付ける良い結果と見なされる。
【0073】
ＮＰｓ－３Ｂは同様のグループで投与され、約２５％のシグナル強度の増加が得られる。このようにして、この新しい化合物が陽性造影剤であることが裏付けられる。
【0074】
例９：マウスの脳組織におけるプラークの検出の組織学的評価。
画像検査が完了したら、動物を深く麻酔し、０．０１ｍｏｌ／Ｌ ＰＢＳ ｐＨ＝７．２中の４％パラホルムアルデヒドの溶液で灌流した。マウスが死亡した後、それらの脳を取り出し、生理食塩水で洗浄し、乾燥させ、半分に切断し、パラフィンに包埋した。次に、ミクロトームを使用して脳を厚さ４ｍｍのスライスに切断した。切片を脱ロウし、蒸留水で水和し、７０％ギ酸で３０分間処理した。切片を連続的に染色して、β－アミロイド沈着を見つけた。カットを３％Ｈ２Ｏ２で３０分間処理して、残留ペルオキシダーゼ活性を除去し、０．０１ｍｏｌ／Ｌ ＰＢＳ（ｐＨ＝７．２）で再度リンスした。切片を、１：１０００希釈の抗Ａβ１－４２モノクローナル抗体（ＳＩＧＭＡ、ＵＳＡ）とともに４℃で一晩インキュベートした。次に、スライドを０．０１ｍｏｌ／Ｌ ＰＢＳ（ｐＨ＝７．２）でリンスし、最初に二次抗体（ＳＩＧＭＡ、ＵＳＡ）で３０分間、次にアビジン－ビオチン複合体（ＳＩＧＭＡ、ＵＳＡ）で３０分間インキュベートした。室温で。染色には、ジアミノベンジジンを色原体として１０分間使用した。切片はハリスのヘマトキシリンと対比され、水性媒体にマウントされた。健康なマウスからの脳スライスを陰性対照として採取し、同じ処置を受けた。画像はオリンパスＢＸ５１顕微鏡カメラ（日本）で視覚化された（図１５）。
画像検査が完了したら、動物を深く麻酔し、０．０１ｍｏｌ／Ｌ ＰＢＳ ｐＨ＝７．２中の４％パラホルムアルデヒドの溶液で灌流した。マウスが死亡した後、それらの脳を取り出し、生理食塩水で洗浄し、乾燥させ、半分に切断し、パラフィンに包埋した。次に、ミクロトームを使用して脳を厚さ４ｍｍのスライスに切断した。切片を脱ロウし、蒸留水で水和し、７０％ギ酸で３０分間処理した。切片を連続的に染色して、β－アミロイド沈着を見つけた。カットを３％Ｈ２Ｏ２で３０分間処理して、残留ペルオキシダーゼ活性を除去し、０．０１ｍｏｌ／Ｌ ＰＢＳ（ｐＨ＝７．２）で再度リンスした。切片を、１：１０００希釈の抗Ａβ１－４２モノクローナル抗体（ＳＩＧＭＡ、ＵＳＡ）とともに４℃で一晩インキュベートした。次に、スライドを０．０１ｍｏｌ／Ｌ ＰＢＳ（ｐＨ＝７．２）でリンスし、最初に二次抗体（ＳＩＧＭＡ、ＵＳＡ）で３０分間、次にアビジン－ビオチン複合体（ＳＩＧＭＡ、ＵＳＡ）で３０分間インキュベートした。室温で。染色には、ジアミノベンジジンを色原体として１０分間使用した。切片はハリスのヘマトキシリンと対比され、水性媒体にマウントされた。健康なマウスからの脳スライスを陰性対照として採取し、同じ処置を受けた。画像はオリンパスＢＸ５１顕微鏡カメラ（日本）で視覚化された（図１５）。
【図1】
【図2】
【図2-1】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図10-2】
【図11】
【図12】
【図13】
【図13-3】
【図14】
【図14-4】
【図15】
【図15-5】
【図16】
【図 】