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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-01-15
(45)【発行日】2024-01-23
(54)【発明の名称】変異ノロウイルス粒子とその生産方法
(51)【国際特許分類】
C12N 7/01 20060101AFI20240116BHJP
C12N 15/40 20060101ALI20240116BHJP
A61K 35/76 20150101ALN20240116BHJP
A61P 31/14 20060101ALN20240116BHJP
A61P 37/04 20060101ALN20240116BHJP
A61K 39/295 20060101ALN20240116BHJP
A61K 39/12 20060101ALN20240116BHJP
【ＦＩ】
C12N7/01
C12N15/40 ZNA
A61K35/76
A61P31/14
A61P37/04
A61K39/295
A61K39/12
【請求項の数】
6
(21)【出願番号】P 2019188238
(22)【出願日】2019-10-11
(65)【公開番号】P2021063034
(43)【公開日】2021-04-22
【審査請求日】2022-10-03
(73)【特許権者】
【識別番号】598041566
【氏名又は名称】学校法人北里研究所
(73)【特許権者】
【識別番号】000125347
【氏名又は名称】学校法人近畿大学
(74)【代理人】
【識別番号】100103160
【弁理士】
【氏名又は名称】志村 光春
(72)【発明者】
【氏名】片山 和彦
(72)【発明者】
【氏名】戸高 玲子
(72)【発明者】
【氏名】及川 和樹
(72)【発明者】
【氏名】石山 涼翔
(72)【発明者】
【氏名】中西 章
【審査官】長谷川 茜
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１９／１０４４３９（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２００７－５０００１７（ＪＰ，Ａ）
【文献】Two Nonoverlapping Domains on the Norwalk Virus Open Reading Frame 3 (ORF3) Protein Are Involved in the Formation of the Phosphorylated 35K Protein and in ORF3-Capsid Protein Interactions，Journal of Virology，2003年，Vol.77, No.6，pp.3569-3577，https://doi.org/10.1128/jvi.77.6.3569-3577.2003
【文献】The 3′ End of Norwalk Virus mRNA Contains Determinants That Regulate the Expression and Stability of the Viral Capsid Protein VP1: a Novel Function for the VP2 Protein，Journal of Virology，2003年，Vol.77, No.21，pp.11603-11615，https://doi.org/10.1128/jvi.77.21.11603-11615.2003
【文献】Journal of General Virology，2007年，Vol.88，pp.2168-2175
【文献】Journal of Virology，2018年，Vol.92, No.18，e00787-18. pp.1-20，https://doi.org/10.1128/JVI.00787-18
【文献】Journal of General Virology，2017年，Vol.98，pp.2759-2770，DOI 10.1099/jgv.0.000936
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ ７／００ － ７／０８
Ａ６１Ｋ ３５／００ －３５／７６８
Ａ６１Ｋ ３９／００ －３９／４４
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
完全なＶＰ２タンパク質を産生できなくする変異として；
ノロウイルスゲノムのオープンリーディングフレーム３（ＯＲＦ３）の開始コドンからＯＲＦ３の２／３以内の領域であって、当該領域の欠損したゲノムを保有するノロウイルス粒子は、一度限りの感染能力を保持しつつ新生ウイルスを産生しないゲノム領域；
の全てが欠損しているか、又は、当該ゲノム領域にＶＰ２タンパク質を実質的に産生できなくなる変異；
が導入されたノロウイルスゲノム、を保有するノロウイルス粒子であって、一度限りの感染能力を保持しつつ新生ウイルスを産生しないノロウイルス粒子。
【請求項2】
前記ノロウイルス粒子において、ノロウイルスゲノムのオープンリーディングフレーム３（ＯＲＦ３）の開始コドンからＯＲＦ３の２／３以内の領域であって、当該領域の欠損を含むノロウイルス粒子は、一度限りの感染能力を保持しつつ新生ウイルスを産生しないゲノム領域；
に導入されたＶＰ２タンパク質を実質的に産生できなくなる変異は、ＯＲＦ３の開始コドンの欠損変異、開始コドン下流における一箇所又は二箇所以上のストップコドンの導入、又は、１５塩基以上の部分欠損、である、請求項１に記載のノロウイルス粒子。
【請求項3】
前記ノロウイルス粒子において、ノロウイルスゲノムのオープンリーディングフレーム３（ＯＲＦ３）の開始コドンからＯＲＦ３の２／３以内の領域であって、当該領域の欠損を含むノロウイルス粒子は、一度限りの感染能力を保持しつつ新生ウイルスを産生しないゲノム領域；
に、ノロウイルス以外の微生物の１種又は２種以上のタンパク質をコードする遺伝子が１種又は２種以上組み込まれているノロウイルス粒子である、請求項１又は２に記載のノロウイルス粒子。
【請求項4】
前記ノロウイルス粒子において、ノロウイルス以外の微生物は、ウイルスである、請求項３に記載のノロウイルス粒子。
【請求項5】
前記ノロウイルス粒子において、ノロウイルス以外の微生物は、腸管感染性のウイルスである、請求項４に記載のノロウイルス粒子。
【請求項6】
下記（１）及び（２）をノロウイルス感受性細胞中に共発現させ、当該共発現により生成したノロウイルス粒子を回収する、一度限りの感染能力を保持しつつ新生ウイルスを生成しない、変異ノロウイルス粒子の生産方法：（１）ノロウイルスゲノムのオープンリーディングフレーム３（ＯＲＦ３）の開始コドンからＯＲＦ３の２／３以内の領域であって、当該領域の欠損を含むノロウイルス粒子は、一度限りの感染能力を保持しつつ新生ウイルスを産生しないゲノム領域、
の全てが欠損しているか、又は、当該ゲノム領域にＶＰ２を実質的に産生できなくなる変異が導入されている、改変ＯＲＦ３を含むノロウイルスゲノム；
（２）ＶＰ２タンパク質をコードする遺伝子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ワクチンに関する発明であり、さらに具体的には、生ワクチンとしての優れた免疫付与能を有しながらも新生ウイルスを産生せず、少なくともノロウイルスに対する免疫付与能を有し、さらに他の病原体に対する免疫付与能を与えることが可能な弱毒化生ウイルスワクチン、その有効成分、及びその有効成分の生産方法についての発明である。
【背景技術】
【0002】
エドワード・ジェンナーの天然痘ワクチンの発明と、ルイ・パスツールによる理論的な裏付けがなされて以来、様々な感染症に対するワクチンが提供されている。
【0003】
ワクチンは、毒性を弱めたウイルス等の病原微生物を免疫原として用いる「生ワクチン」、殺傷した病原微生物の全部又は一部を免疫原として用いる「不活化ワクチン」、変性させた病原体の産生する毒素を免疫原として用いる「トキソイド」、に大別されている。
【0004】
これらの中でも生ワクチンは、液性免疫と共に、強い細胞性免疫を誘導することが可能であり、かつ、一般的に免疫も長期にわたり保持されることが知られている。しかしながら、生ワクチンは、弱毒化されているとはいえ自己増殖可能な生きた微生物を使用するので、極めて稀であっても、突然変異や強毒株との遺伝子組換えにより毒力が強い微生物に先祖返りする(強毒復帰)可能性がある。従って、生ワクチンに使用される微生物は安定で、強毒復帰しない性質を持っているものが求められる。特にウイルスの生ワクチンの場合は、宿主細胞内でウイルスが複製増殖する過程で、遺伝子変異、遺伝子組換えが起き、強毒復帰する。現在、生ワクチンは、ＢＣＧ、麻疹・風疹混合（ＭＲ）、麻疹（はしか）、風疹、水痘、流行性耳下腺炎（おたふくかぜ）、ロタウイルス、黄熱等、限定された範囲で用いられている。さらに生ワクチンは、強毒復帰しなくても、ヒトの個体差によって、ワクチンとして用いた微生物が毒力を発揮する場合があり、その接種には慎重な対応が求められている。
【0005】
これらの事項は、非特許文献１等に記載されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0006】
【文献】「ワクチン」日本ワクチン学会編、２０１８年１０月１０日朝倉書店発行、２３８頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
上記のように、生ワクチンは優れた免疫誘導作用を有する反面、その性質上必然的ともいえる問題点が存在する。本発明は、新生ウイルスを産生不可能な弱毒変異の導入により、この問題点を抜本的に解決する手段を、少なくともノロウイルスを対象として、提供する発明である。
【課題を解決するための手段】
【0008】
ノロウイルスは、カリシウイルス科ノロウイルス属ノーウォークウイルス種のウイルスであり、直径約３８ｎｍの正二十面体構造を有する球形のＲＮＡウイルスである。ノロウイルスには、５つの遺伝子グループが知られており、ＧＩ（９種類）、ＧＩＩ（１９種類）、ＧＩＶ（１種類）がヒトに感染するノロウイルスである。ノロウイルスは宿主特異性が高く、ヒトに感染するウイルスはヒト以外に感染できず、ネズミなど動物に感染するノロウイルスはヒトに感染できない。
【0009】
ノロウイルスゲノムは、７５００－８０００塩基のsingle stranded positive sense ＲＮＡであり、３つのＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）を有しており（ネズミノロウイルスの場合、４つのＯＲＦを有している。ＯＲＦ４は、ＶＦ１という非構造タンパク質をコードしている）、ＯＲＦ１にプロテアーゼやポリメラーゼ等の非構造タンパク質がコードされており、ＯＲＦ２、３に構造タンパク質がコードされている。ＯＲＦ２がコードする構造タンパク質はＶＰ１であり、ＯＲＦ２を発現させると、ＶＰ１が１８０個集まったウイルス様中空粒子（ＶＬＰ）が形成される。これに対してＯＲＦ３がコードするＶＰ２は分子量２２．４ｋＤａ程度で、ウイルス粒子中に複数個存在し、ウイルス粒子の安定性に寄与すると考えられているが、その詳細は分かっていない。
【0010】
本発明者らは、このＯＲＦ３ないしＶＰ２の機能の検討を行った。この機能の検討の内容は後述するが、結論としては、ノロウイルスゲノム上のＯＲＦ３（ＶＰ２コード領域）の３’側 の塩基配列には、ゲノムの複製に必須な塩基配列があることを明らかにした。さらに、ＯＲＦ３は、核酸配列として必須な領域の直前まで（（ＯＲＦ３を三等分すると、ＯＲＦ３の開始コドンから約２／３の領域）は、その全てを欠損させたり、ＶＰ２タンパク質（以下、特に断らない限り、ＶＰ２と略記する）を供給できなくなるような変異を導入したり、外来性遺伝子に置き換えた遺伝子改変ノロウイルスゲノムであっても、ＶＰ２を細胞内に別途供給すれば、遺伝子改変ノロウイルスゲノムを内包した新生ウイルス粒子を産生可能であることを見出した。
【0011】
この遺伝子改変ノロウイルスゲノムを内包した新生ノロウイルス粒子（ｍｕｔａｎｔ ｐｒｏｇｅｎｙ ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ：ＭＰＮＶ）は、野生型ノロウイルスと同様の感染力は保持されるが、一旦通常の標的細胞に感染して細胞内に遺伝子改変ゲノムを放出すると、ＶＰ２を除くウイルスタンパク質の翻訳、遺伝子改変ノロウイルスゲノムの複製は起きるが、新生ウイルスを産生する能力を持たず、一度だけ感染可能な弱毒化ウイルス（いわば半生ウイルス）であることが明らかになった。つまり、感受性細胞、自然宿主内標的細胞に感染することができ、自然感染と同様のウイルス抗原（ＶＰ２を除く）を発現し、あらゆる免疫を誘導可能であるが、新生ウイルスを産生して感染と増殖を繰り返すことはなく、病原性を発揮しない、極めて高度に弱毒化されたウイルスである。更に、外来性遺伝子を導入したのであれば、それに対する免疫賦活能力も有する弱毒化生混合ワクチン（多価ワクチン）となり得ることを明らかにした。
【0012】
すなわち本発明は、完全なＶＰ２タンパク質を産生できなくする変異が導入されたノロウイルスゲノム、を保有するノロウイルス粒子であって、一度限りの感染能力を保持しつつ新生ウイルスを産生しないノロウイルス粒子（ＭＰＮＶ）、を有効成分として含有する、ノロウイルス用の弱毒化生ワクチン（以下、本発明の生ワクチンともいう）を提供する発明である。
【0013】
上記の通りに、当該ＭＰＮＶは、本発明の生ワクチンの有効成分である。本発明は、この有効成分も提供する。
【0014】
本発明の生ワクチンにおける、「完全なＶＰ２タンパク質を産生できなくするゲノムの変異」は、例えば、ノロウイルスゲノムのオープンリーディングフレーム３（ＯＲＦ３）の開始コドンからＯＲＦ３の約２／３以内の領域であって、当該領域の欠損を含むノロウイルス粒子は、一度限りの感染能力を保持しつつ新生ウイルスを産生しないゲノム領域；
の全てが欠損しているか、又は、当該ゲノム領域にＶＰ２を実質的に産生できなくなる変異である。
の全てが欠損しているか、又は、当該ゲノム領域にＶＰ２を実質的に産生できなくなる変異である。
【0015】
以下、上記の「ノロウイルスゲノムのＯＲＦ３の開始コドンからＯＲＦ３の約２／３以内の領域であって、当該領域の欠損を含むノロウイルス粒子は、一度限りの感染能力を保持しつつ新生ウイルスを産生しない」ゲノム領域を、「ＯＲＦ３特定領域」ともいう。
【0016】
上記の「ＯＲＦ３特定領域に導入されたＶＰ２を実質的に産生できなくなる変異」において、「ＶＰ２を実質的に産生できなくなる」とは、ＶＰ２を全く産生できないことを含む。そしてさらに、ＶＰ２を外形上産生できても、当該ＶＰ２は導入された変異によってＶＰ２本来の働きをすることができないこと、すなわち、当該変異ＶＰ２を産生するノロウイルスは、感染能力を保持しつつ新生ウイルスを産生しないことも含まれる。そのようなＯＲＦ３特定領域における変異は、ＯＲＦ３特定領域の欠損、ＯＲＦ３特定領域の開始コドンの欠損変異、ＯＲＦ３特定領域の開始コドン下流における一箇所又は二箇所以上、好ましくは近接した二箇所以上のストップコドンの導入、又は、１５塩基以上のＯＲＦ特定領域の部分欠損である。当該部分欠損は、１８塩基以上であることが好ましい。ストップコドンの導入に関し、「近接した二箇所以上のストップコドン」は、当該個数のストップコドンを連続させて設けるか、ストップコドン同士の間に１－３個、好ましくは１個の他のコドンを挟み込むこと等が例示される。
【0017】
さらに、ＯＲＦ３特定領域に、ノロウイルス以外のウイルス（以下、外来ウイルスともいう）の１種又は２種以上のタンパク質をコードする遺伝子を１種又は２種以上組み込むことも可能である。外来ウイルスのタンパク質は、構造タンパク質であっても、非構造タンパク質であってもよい。また、外来ウイルスの種類は特に限定されないが、ノロウイルスと同じく腸管感染性のウイルスであることが好ましい。このような外来ウイルスのタンパク質をコードする遺伝子を組み込んだＯＲＦ３を有するＭＰＮＶは、ノロウイルスに対する免疫と共に、上記外来ウイルスに対する免疫を付与することのできる、多価の弱毒化生ワクチンの有効成分である。
【0018】
加えて本発明は、本発明の生ワクチンの有効成分であるＭＰＮＶの生産方法を提供する。
【0019】
すなわち本発明は、下記（１）及び（２）をノロウイルス感受性細胞中に共発現させ、当該共発現により生成したノロウイルス粒子を回収する、一度限りの感染能力を保持しつつ新生ウイルスを生成しない、変異ノロウイルス粒子の生産方法（以下、本発明の生産方法ともいう）を提供する。
（１）ノロウイルスゲノムのオープンリーディングフレーム３（ＯＲＦ３）の開始コドンからＯＲＦ３の約２／３以内の領域であって、当該領域の欠損を含むノロウイルス粒子は、一度限りの感染能力を保持しつつ新生ウイルスを産生しない、
の全てが欠損しているか、又は、当該ゲノム領域にＶＰ２を実質的に産生できなくなる変異が導入されている、改変ＯＲＦ３を含むノロウイルスゲノム；
（２）ＶＰ２をコードする遺伝子。
（１）ノロウイルスゲノムのオープンリーディングフレーム３（ＯＲＦ３）の開始コドンからＯＲＦ３の約２／３以内の領域であって、当該領域の欠損を含むノロウイルス粒子は、一度限りの感染能力を保持しつつ新生ウイルスを産生しない、
の全てが欠損しているか、又は、当該ゲノム領域にＶＰ２を実質的に産生できなくなる変異が導入されている、改変ＯＲＦ３を含むノロウイルスゲノム；
（２）ＶＰ２をコードする遺伝子。
【発明の効果】
【0020】
本発明により、ノロウイルスに対する弱毒化生ワクチンが提供される。当該弱毒化生ワクチンは、対ノロウイルス以外のウイルスに対しても免疫を付与することが可能な、多価ワクチンとして用いることも可能である。また、本発明は、当該弱毒化生ワクチンの有効成分となる遺伝子改変ノロウイルスゲノムを内包した新生ノロウイルス粒子（ＭＰＮＶ）の生産方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0021】
【図1-1】ＭＮＶの全長のｃＤＮＡを持つインフェクシャスクローン（ｐＭＮＶ－Ｆ）の全塩基配列の一部を示す第１の図面である。
【図1-2】ＭＮＶの全長のｃＤＮＡを持つインフェクシャスクローン（ｐＭＮＶ－Ｆ）の全塩基配列の一部を示す第２の図面である。
【図1-3】ＭＮＶの全長のｃＤＮＡを持つインフェクシャスクローン（ｐＭＮＶ－Ｆ）の全塩基配列の一部を示す第３の図面である。
【図1-4】ＭＮＶの全長のｃＤＮＡを持つインフェクシャスクローン（ｐＭＮＶ－Ｆ）の全塩基配列の一部を示す第４の図面である。
【図1-5】ＭＮＶの全長のｃＤＮＡを持つインフェクシャスクローン（ｐＭＮＶ－Ｆ）の全塩基配列の一部を示す第５の図面である。
【図2】ＶＰ２発現ベクター（ｐＫＳ－ＭＮＶ ＶＰ２）の概略図である。
【図3】ＯＲＦ３の機能を解析するために用いたＶＰ２欠損ゲノムの変異の内容の概略を示した図面である。
【図4】ＶＰ２欠損ゲノムを含むベクターである「ｐＭＮＶ－Ｆ＿ＶＰ２ ＳＴＯＰ」の塩基配列構造を示した図面である。
【図5】ＶＰ２欠損ゲノムを含むベクターである「ｐＭＮＶ－Ｆ＿ＶＰ２ ｄｅｌｔａＮ」の塩基配列構造を示した図面である。
【図6】ＶＰ２欠損ゲノムを含むベクターである「ｐＭＮＶ－Ｆ＿ＶＰ２ ｄｅｌｔａＮｓｔｏｐ」の塩基配列構造を示した図面である。
【図7】ＶＰ２欠損ゲノムを含むベクターである「ｐＭＮＶ－Ｆ＿ＶＰ２ ｄｅｌｔａＭ」の塩基配列構造を示した図面である。
【図8】ＶＰ２欠損ゲノムを含むベクターである「ｐＭＮＶ－Ｆ＿ＶＰ２ ｄｅｌｔａＭｓｔｏｐ」の塩基配列構造を示した図面である。
【図9】ＶＰ２欠損ゲノムを含むベクターである「ｐＭＮＶ－Ｆ＿ＶＰ２ ｄｅｌｔａＣ」の塩基配列構造を示した図面である。
【図10】ＶＰ２欠損ゲノムを含むベクターである「ｐＭＮＶ－Ｆ＿ＶＰ２ ｄｅｌｔａＣｓｔｏｐ」の塩基配列構造を示した図面である。
【図11】ＶＰ２欠損ゲノムを含むベクターである「ｐＭＮＶ－Ｆ＿ＶＰ２ ｄｅｌｔａ」の塩基配列構造を示した図面である。
【図12】ＶＰ２に変異を導入したゲノムを内包する新生ウイルス粒子（ＭＰＮＶ）の調製工程の概略を示した図面である。
【図13】ＯＲＦ３特定領域に外来性タンパク質遺伝子を組み込んだＭＰＮＶを用いた試験の内容を示す図面である。
【発明を実施するための形態】
【0022】
本発明の生ワクチンは、ヒトが主要な対象であり、その他基礎試験用としてマウス等が挙げられる。
【0023】
本発明の生ワクチンをヒトに用いる場合には、ノロウイルスもヒトノロウイルスを用いることが必要である。しかしながら、ＯＲＦ３の構造と機能はヒトもマウスも共通するものであり、マウスノロウイルスのＯＲＦ３特定領域における知見をヒトノロウイルスのＯＲＦ３特定領域に対応させることにより、ヒトノロウイルスのＯＲＦ３特定領域における「ＶＰ２を実質的に産生できなくなる」遺伝子改変の内容を類推することが可能である。
【0024】
本発明の生ワクチンを多価ワクチンとして用いる場合に、ＯＲＦ３特定領域に組み込むノロウイルス由来のタンパク質以外の微生物タンパク質（他の微生物タンパク質ともいう）の出所となる微生物は、ワクチンの有効成分となるタンパク質を保有する微生物であれば特に限定されず、ウイルス、細菌等が例示できる。
【0025】
上記ウイルスは特に限定されず、ＤＮＡウイルスであっても、ＲＮＡウイルスであっても、レトロウイルスであってもよい。例えば、ポリオウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス（ムンプスウイルス）、水痘ウイルス、黄熱病ウイルス、ロタウイルス、帯状疱疹ウイルス（ヘルペスウイルス）、インフルエンザウイルス、狂犬病ウイルス、日本脳炎ウイルス、肝炎ウイルス（Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎等）、ヒトパピローマウイルス、ＨＩＶ、エボラウイルス等の現在ワクチンが提供されている感染症の病原ウイルスだけではなく、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）等のワクチンが提供されていない感染症の病原ウイルスも含めて挙げられる。これらのウイルスの構造タンパク質又は非構造タンパク質の全部又は一部を選択して「他の微生物タンパク質」として、それをコードする遺伝子をＯＲＦ３特定領域に組み込むことにより、ノロウイルスに対する免疫と共に、所望の他のウイルスの免疫を行うことが可能な多価ワクチンの有効成分としてのＭＰＮＶとすることができる。これらの他のウイルスの中でも、ノロウイルスと同じ腸管感染性のウイルスとすることが好適である。具体的には、ロタウイルス、サポウイルス、アストロウイルス等が例示できる。
【0026】
上記細菌は特に限定されず、結核菌、百日咳菌、ジフテリア菌、破傷風菌、肺炎双球菌、肺炎球菌、インフルエンザ菌ｂ型、髄膜炎菌、腸チフス菌、コレラ菌等が挙げられる。これらの菌体の構成タンパク質の全部又は一部を選択して「他の微生物タンパク質」として、それをコードする遺伝子をＯＲＦ３特定領域に組み込むことにより、ノロウイルスに対する免疫と共に、所望の細菌の免疫を行うことが可能な多価ワクチンの有効成分としてのＭＰＮＶとすることができる。
【0027】
本発明の生ワクチンは、ＶＰ２をコードするＯＲＦ３特定領域に所定の変異を導入したノロウイルスを、ノロウイルス感受性細胞に感染させて、これを培養してノロウイルス粒子を抗原液として取得して、その有効成分とすることができる。これに必要に応じて、緩衝剤、安定剤、保存剤、アジュバント等を添加して、生ワクチンとすることができる。これをバイアル、アンプル、シリンジ等の容器に無菌充填される。その際、必要に応じて凍結乾燥処理を行うことも可能である。
【実施例】
【0028】
上述したノロウイルスのＯＲＦ３にコードされるＶＰ２の機能解析を実施するにあたり、ノロウイルスゲノムのうちゲノムの複製と粒子への内包に必要な核酸配列を決定するため、リバースジェネティックスの手法（核酸からウイルスを作り出す技術）を用いて検討を行った。ノロウイルスとしては、ネズミノロウイルス（ｍｕｒｉｎｅ ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ； ＭＮＶ）を用いた。
【0029】
ＶＰ２の機能を調べる場合、ＭＮＶの感染性クローンであるプラスミドｐＭＮＶ－Ｆ（完全長の野生型ＭＮＶの遺伝子配列のｃＤＮＡを持ち、細胞内に導入すると野生型ＭＮＶの新生ウイルスを産生可能）のＶＰ２コード領域であるＯＲＦ３に単純に変異を導入することで検討を行った。
【0030】
先ずＯＲＦ３の３'側の領域には、核酸としての機能と、翻訳された後のタンパク質としての機能が重複して存在する可能性が高いため、ＶＰ２の機能とその領域の核酸配列の機能を分けて調べなければならない。ＶＰ２に変異を導入するため、むやみに核酸配列を改変すると、ＶＰ２の機能と核酸配列の機能、どちらの影響で新生ウイルス生成ができなくなるのかを明らかにできない。そこで、ＯＲＦ３に変異を入れた「ｐＭＮＶ－Ｆ－ＯＲＦ３ｍｕｔａｎｔ」と、野生型のＯＲＦ３だけを発現するベクター「ｐＭＮＶ－ＶＰ２」を調製し、これらをＭＮＶ感受性細胞内に同時導入（コトランスフェクション）して、ｐＭＮＶ－Ｆ－ＯＲＦ３ｍｕｔａｎｔからＯＲＦ３領域に変異の入ったミュータントＭＮＶゲノムを供給し、同時にｐＭＮＶ－ＶＰ２から野生型のＶＰ２をトランスに供給することで、ＭＰＮＶが作出できるか否かを調べた。さらに、この過程で作出されたＭＰＮＶが、細胞に感染し、再びＭＰＮＶ増殖を行う能力があるのか否かを調べるため、ＶＰ２とＭＮＶレセプターを定常的に発現し続ける細胞株を作出し、それにＭＰＮＶを感染させることで、ウイルスとしての感染増殖能力を検討した。
【0031】
（１）ｐＭＮＶ－Ｆ－ＯＲＦ３ｍｕｔａｎｔから、ＭＮＶ－ＯＲＦ３ｍｕｔａｎｔゲノムが転写され、当該遺伝子変異によってＭＮＶ－ＯＲＦ３ｍｕｔａｎｔゲノムの複製機能が核酸配列レベルで損なわれないのであれば、細胞内にトランスに供給された野生型ＶＰ２の補完によって、当該変異遺伝子を内包したＭＰＮＶが産生される。
【0032】
（２）ｐＭＮＶ－Ｆ－ＯＲＦ３ｍｕｔａｎｔから、ＭＮＶ－ＯＲＦ３ｍｕｔａｎｔゲノムが転写され、当該遺伝子変異によってＭＮＶ－ＯＲＦ３ｍｕｔａｎｔゲノムの複製機能が核酸配列レベルで損なわれているならば、細胞内にトランスに供給された野生型ＶＰ２が補完されても、当該変異遺伝子を内包したＭＰＮＶは産生されない。
【0033】
（３）さらに（１）で産生されたＭＰＮＶを、ＶＰ２を定常的に発現する、もしくは一過性に発現するＭＮＶ感受性細胞に感染させた場合、再びＭＰＮＶが産生される。
【0034】
（４）しかし、（１）で産生されたＭＰＮＶを、ＶＰ２を発現していないＭＮＶ感受性細胞に感染させた場合、（１）で産生されたＭＰＮＶは、細胞に感染して侵入し、自身の内包するＭＮＶ－ＯＲＦ３ｍｕｔａｎｔゲノムを細胞内に放出し、タンパク質を発現するが、機能を有するＶＰ２が存在しないため、自身のＭＮＶ－ＯＲＦ３ｍｕｔａｎｔゲノムを複製することができず、再びＭＰＮＶが産生されることも無い。つまり、一度だけ感受性細胞内部にＭＮＶ－ＯＲＦ３ｍｕｔａｎｔゲノムを送り届け、それにコードされるタンパク質を発現させることができるいわば、本発明の生ワクチンの有効成分となり得るのである。
【0035】
以上（１）－（４）の検討を行うことにより、ＯＲＦ３における欠失変異によるノロウイルスの複製機能における影響を解明し、遺伝子運搬システムもしくは、半生ワクチンの可能性を見出す。
【0036】
［試験系の開示］
＜材料＞
１．ＭＮＶ感受性細胞
ＭＮＶ感受性細胞である、Ｈｕｈ７５１細胞は、Ａｐａｔｈ，ＬＬＣ（１１７３Ａ Ｓｅｃｏｎｄ Ａｖｅｎｕｅ Ｓｕｉｔｅ ３５５ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ１００６５－ＵＳＡ）とＭＴＡ（Ｍａｔｅｒｉａｌ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ａｇｒｅｅｍｅｎｔ）を交わして、入手した。この細胞はＨｕｈ７細胞のインターフェロン誘導遺伝子欠損変異を持つ特殊なクローンであるが、ＣＤ３００ｌｆ遺伝子を導入してＭＮＶ感染感受性細胞である「Ｈｕｈ７５１＋ＣＤ３００ｌｆ細胞」とした場合、ＭＮＶ遺伝子の細胞内での安定性は、Ｈｕｈ７５１細胞がＨｕｈ７細胞を僅かに上回るため、本実施例においては、「Ｈｕｈ７５１＋ＣＤ３００ｌｆ細胞」を用いた。以下の（１）－（５）に、このＭＮＶ感受性細胞の作製方法について示した。
＜材料＞
１．ＭＮＶ感受性細胞
ＭＮＶ感受性細胞である、Ｈｕｈ７５１細胞は、Ａｐａｔｈ，ＬＬＣ（１１７３Ａ Ｓｅｃｏｎｄ Ａｖｅｎｕｅ Ｓｕｉｔｅ ３５５ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ１００６５－ＵＳＡ）とＭＴＡ（Ｍａｔｅｒｉａｌ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ａｇｒｅｅｍｅｎｔ）を交わして、入手した。この細胞はＨｕｈ７細胞のインターフェロン誘導遺伝子欠損変異を持つ特殊なクローンであるが、ＣＤ３００ｌｆ遺伝子を導入してＭＮＶ感染感受性細胞である「Ｈｕｈ７５１＋ＣＤ３００ｌｆ細胞」とした場合、ＭＮＶ遺伝子の細胞内での安定性は、Ｈｕｈ７５１細胞がＨｕｈ７細胞を僅かに上回るため、本実施例においては、「Ｈｕｈ７５１＋ＣＤ３００ｌｆ細胞」を用いた。以下の（１）－（５）に、このＭＮＶ感受性細胞の作製方法について示した。
【0037】
（１）マウスのＣＤ３００ｌｆ分子のｃＤＮＡを合成し、レンチウイルスベクターに組み込み、組換えレンチウイルスを作製した。
（２）このＣＤ３００ｌｆ遺伝子を組み込んだ組換えレンチウイルスを、Ｈｕｈ７５１に感染させ、共発現させた薬剤耐性因子により、ＣＤ３００ｌｆを定常的に発現する細胞Ｈｕｈ７５１＋ＣＤ３００ｌｆを得た。
（３）このＨｕｈ７５１＋ＣＤ３００ｌｆをシングルセルクローニングし、Ｈｕｈ７５１＋ＣＤ３００ｌｆ ｃｌｏｎｅ １２－２細胞を得た。
（４）Ｈｕｈ７５１＋ＣＤ３００ｌｆ ｃｌｏｎｅ１２－２細胞は、定常的にマウスＣＤ３００ｌｆを発現するＭＮＶ感染感受性細胞であり、通常のＭＮＶでは、１０の９乗個／ミリリットル以上のウイルスタイターのＭＮＶを培養可能な細胞である。
（５）Ｈｕｈ７５１＋ＣＤ３００ｌｆ ｃｌｏｎｅ １２－２細胞に、更にＭＮＶ ＶＰ２遺伝子を上記の組換えレンチウイルスシステムを用いて導入し、定常的にＭＮＶ－ＶＰ２を発現する細胞Ｈｕｈ７５１＋ＣＤ３００ｌｆ＋ＭＮＶ－ＶＰ２細胞を得た。この細胞をＭＰＮＶ産生などの試験に用いた。
（２）このＣＤ３００ｌｆ遺伝子を組み込んだ組換えレンチウイルスを、Ｈｕｈ７５１に感染させ、共発現させた薬剤耐性因子により、ＣＤ３００ｌｆを定常的に発現する細胞Ｈｕｈ７５１＋ＣＤ３００ｌｆを得た。
（３）このＨｕｈ７５１＋ＣＤ３００ｌｆをシングルセルクローニングし、Ｈｕｈ７５１＋ＣＤ３００ｌｆ ｃｌｏｎｅ １２－２細胞を得た。
（４）Ｈｕｈ７５１＋ＣＤ３００ｌｆ ｃｌｏｎｅ１２－２細胞は、定常的にマウスＣＤ３００ｌｆを発現するＭＮＶ感染感受性細胞であり、通常のＭＮＶでは、１０の９乗個／ミリリットル以上のウイルスタイターのＭＮＶを培養可能な細胞である。
（５）Ｈｕｈ７５１＋ＣＤ３００ｌｆ ｃｌｏｎｅ １２－２細胞に、更にＭＮＶ ＶＰ２遺伝子を上記の組換えレンチウイルスシステムを用いて導入し、定常的にＭＮＶ－ＶＰ２を発現する細胞Ｈｕｈ７５１＋ＣＤ３００ｌｆ＋ＭＮＶ－ＶＰ２細胞を得た。この細胞をＭＰＮＶ産生などの試験に用いた。
【0038】
２．ＭＮＶ（マウスノロウイルス）の野生型
本試験で用いた野生型ＭＮＶは、「ＧｅｎＢＡＮＫ番号ＡＢ４３５５１５」として登録された塩基配列のＭＮＶを用いた。
本試験で用いた野生型ＭＮＶは、「ＧｅｎＢＡＮＫ番号ＡＢ４３５５１５」として登録された塩基配列のＭＮＶを用いた。
【0039】
また図１（配列番号１）に、ＭＮＶの全長のｃＤＮＡを持つインフェクシャスクローン（ｐＭＮＶ－Ｆ）の全塩基配列を示した。［図１－１、－２、－３、－４、－５］において、大文字はＭＮＶの全長のｃＤＮＡを示しており、小文字は、ベクターとしての機能を司る部分であり、ＥＦ－１αプロモーターを含んでいる。
【0040】
３．ＶＰ２発現ベクターの作製
上記のｐＭＮＶ－Ｆの大文字部分（ＭＮＶの全長ｃＤＮＡ）と、ＡＢ４３５５１５のＯＲＦ３のＶＰ２（配列番号２）をコードする塩基配列（ＤＮＡ）をインフュージョンクローニングによって入れ替え、ＶＰ２発現ベクター（ｐＫＳ－ＭＮＶ ＶＰ２）とした。つまり、上記大文字部分からＯＲＦ１とＯＲＦ２は取り除かれ、ＯＲＦ３が上記ｐＭＮＶ－Ｆの大文字部分と入れ替わって残ったものである。図２に、ｐＫＳ－ＭＮＶ ＶＰ２の概略図を示した。
上記のｐＭＮＶ－Ｆの大文字部分（ＭＮＶの全長ｃＤＮＡ）と、ＡＢ４３５５１５のＯＲＦ３のＶＰ２（配列番号２）をコードする塩基配列（ＤＮＡ）をインフュージョンクローニングによって入れ替え、ＶＰ２発現ベクター（ｐＫＳ－ＭＮＶ ＶＰ２）とした。つまり、上記大文字部分からＯＲＦ１とＯＲＦ２は取り除かれ、ＯＲＦ３が上記ｐＭＮＶ－Ｆの大文字部分と入れ替わって残ったものである。図２に、ｐＫＳ－ＭＮＶ ＶＰ２の概略図を示した。
【0041】
４．ＶＰ２欠損ゲノムが組み込まれたベクターの作製
ＯＲＦ３の機能を解析するために、ＶＰ２をコードする遺伝子に種々の欠損変異や、タンパク質への翻訳を阻害する変異を導入した「ＶＰ２欠損ゲノム」を保有し、これを、上記のｐＫＳ－ＭＮＶ ＶＰ２の「ＶＰ２をコードする部分」に置き換えたベクターを構築した。図３に、これらの変異の概略をアミノ酸配列で示した。図３の各変異断片の横方向の数字は、野生型のＶＰ２のアミノ酸配列の番号である。
ＯＲＦ３の機能を解析するために、ＶＰ２をコードする遺伝子に種々の欠損変異や、タンパク質への翻訳を阻害する変異を導入した「ＶＰ２欠損ゲノム」を保有し、これを、上記のｐＫＳ－ＭＮＶ ＶＰ２の「ＶＰ２をコードする部分」に置き換えたベクターを構築した。図３に、これらの変異の概略をアミノ酸配列で示した。図３の各変異断片の横方向の数字は、野生型のＶＰ２のアミノ酸配列の番号である。
【0042】
図３において、実線部分はタンパク質を発現していることを示しており、点線部分は核酸配列のみ存在する（ストップコドンでタンパク質への翻訳が遮断されている）。Ｓｔｏｐは、７番目と１０番目のアミノ酸残基が、当該アミノ酸残基をコードするコドンを、ストップコドンＴＡＧに置き換えた変異断片であることを示している。ΔＮは、５’末端側の３アミノ酸残基ＭＡＧと１０６番目以降のＳＫＳＤＡＡ以下２０８のアラニン残基までを直結させた変異ＶＰ２（言い換えれば４－１０５番目のアミノ酸残基を欠損した）をコードする変異断片であることを示している。ΔＮｓｔｏｐは、ΔＮと殆ど同じ塩基配列であるが、１０６番目、１０８番目のアミノ酸残基をコードするＳコドン（ＴＣＧ ＡＡＧ ＴＣＧのアンダーライン部分）をストップコドンに置き換えた（ＴＡＧ ＡＡＧ ＴＡＧ）ことにより、ＴＡＧ ＡＡＧ ＴＡＧの最初のストップコドン以降がタンパク質へ翻訳されない、欠損ＶＰ２をコードする変異断片である。以下、同様に、ΔＭは、中盤（５２－１５７番目のアミノ酸残基）が欠損したＶＰ２をコードする変異断片、ΔＭｓｔｏｐは、５'側（７番目と１０番目のアミノ酸残基）のストップコドンへの置き換えにより、殆どの核酸がタンパク質への翻訳が遮断されている変異断片である。ΔＣは、３’末端側（１１４番目以降のアミノ酸残基をコードする塩基配列）の欠損変異であり、ΔＣｓｔｏｐは、これに加えて５’側のストップコドン（７番目と１０番目のアミノ酸残基）のストップコドンへの置き換えにより、殆どの核酸がタンパク質への翻訳が遮断されている変異断片である。ΔはＶＰ２核酸配列、タンパク質配列のほぼ全欠損変異体である。
【0043】
以下にこれらの変異断片を含むベクターを、その作製工程の概略と共に記載する。
【0044】
（１）ｐＭＮＶ－Ｆ＿ＶＰ２ ＳＴＯＰ
ｐＭＮＶ－Ｆ＿ＶＰ２ ＳＴＯＰは、ｐＭＮＶ－ＦのＯＲＦ３領域の配列（１番目のメチオニン残基をコードするＡＴＧから、アラニン残基をコードするＧＣＡの下流のストップコドンＴＡＧまで）を、アミノ酸座位７番目と１０番目のコドンをストップコドンＴＡＧに改変した（□で囲った）下記の配列をＤＮＡ合成装置で合成して、インフュージョンクローニングによって入れ替えたクローンである（図４：配列番号３）。
ｐＭＮＶ－Ｆ＿ＶＰ２ ＳＴＯＰは、ｐＭＮＶ－ＦのＯＲＦ３領域の配列（１番目のメチオニン残基をコードするＡＴＧから、アラニン残基をコードするＧＣＡの下流のストップコドンＴＡＧまで）を、アミノ酸座位７番目と１０番目のコドンをストップコドンＴＡＧに改変した（□で囲った）下記の配列をＤＮＡ合成装置で合成して、インフュージョンクローニングによって入れ替えたクローンである（図４：配列番号３）。
【0045】
（２）ｐＭＮＶ－Ｆ＿ＶＰ２ ｄｅｌｔａＮ
ｐＭＮＶ－Ｆ＿ＶＰ２ ｄｅｌｔａＮ（ｐＭＮＶ－Ｆ＿ＶＰ２ΔＮ）は、ｐＭＮＶ－ＦのＯＲＦ３領域の配列を図５（配列番号４）の配列に、インフュージョンクローニングによって入れ替えたクローンである。図５において、（－－－－－－）の部分は核酸配列を欠損させた部分であり、実際はＡＴＧ ＧＣＴ ＧＧＴをＡＡＧ ＴＣＧ ＧＡＴに直結させた配列をＤＮＡ合成装置で合成して入れ替えに用いた。
ｐＭＮＶ－Ｆ＿ＶＰ２ ｄｅｌｔａＮ（ｐＭＮＶ－Ｆ＿ＶＰ２ΔＮ）は、ｐＭＮＶ－ＦのＯＲＦ３領域の配列を図５（配列番号４）の配列に、インフュージョンクローニングによって入れ替えたクローンである。図５において、（－－－－－－）の部分は核酸配列を欠損させた部分であり、実際はＡＴＧ ＧＣＴ ＧＧＴをＡＡＧ ＴＣＧ ＧＡＴに直結させた配列をＤＮＡ合成装置で合成して入れ替えに用いた。
【0046】
（３）ｐＭＮＶ－Ｆ＿ＶＰ２ ｄｅｌｔａＮｓｔｏｐ
ｐＭＮＶ－Ｆ＿ＶＰ２ ｄｅｌｔａＮｓｔｏｐ（ｐＭＮＶ－Ｆ＿ＶＰ２ΔＮｓｔｏｐ）は、ｐＭＮＶ－ＦのＯＲＦ３領域の配列を図６（配列番号５）の配列に、インフュージョンクローニングによって入れ替えたクローンである。図６において、（－－－－－－）の部分は核酸配列を欠損させた部分であり、ｐＭＮＶ－Ｆ＿ＶＰ２ΔＮの配列と同様に作製した。ただし、１０６、１０８番目のアミノ酸残基に対応するＳコドン（ＴＣＧ ＡＡＧ ＴＣＧのアンダーライン部分）をストップコドンに置き換えた（ＴＡＧ ＡＡＧ ＴＡＧ）。
ｐＭＮＶ－Ｆ＿ＶＰ２ ｄｅｌｔａＮｓｔｏｐ（ｐＭＮＶ－Ｆ＿ＶＰ２ΔＮｓｔｏｐ）は、ｐＭＮＶ－ＦのＯＲＦ３領域の配列を図６（配列番号５）の配列に、インフュージョンクローニングによって入れ替えたクローンである。図６において、（－－－－－－）の部分は核酸配列を欠損させた部分であり、ｐＭＮＶ－Ｆ＿ＶＰ２ΔＮの配列と同様に作製した。ただし、１０６、１０８番目のアミノ酸残基に対応するＳコドン（ＴＣＧ ＡＡＧ ＴＣＧのアンダーライン部分）をストップコドンに置き換えた（ＴＡＧ ＡＡＧ ＴＡＧ）。
【0047】
（４）ｐＭＮＶ－Ｆ＿ＶＰ２ ｄｅｌｔａＭ
ｐＭＮＶ－Ｆ＿ＶＰ２ ｄｅｌｔａＭ（ｐＭＮＶ－Ｆ＿ＶＰ２ΔＭ）は、ｐＭＮＶ－ＦのＯＲＦ３領域の配列を図７（配列番号６）の配列に、インフュージョンクローニングによって入れ替えたクローンである。図７において、（－－－－－－）の部分は核酸配列を欠損させた部分であり、実際はＣＡＡＧＣＣＣＡＧをＴＣＡＧＧＴＧＧＣに直結させた配列をＤＮＡ合成装置で合成して入れ替えに用いた。
ｐＭＮＶ－Ｆ＿ＶＰ２ ｄｅｌｔａＭ（ｐＭＮＶ－Ｆ＿ＶＰ２ΔＭ）は、ｐＭＮＶ－ＦのＯＲＦ３領域の配列を図７（配列番号６）の配列に、インフュージョンクローニングによって入れ替えたクローンである。図７において、（－－－－－－）の部分は核酸配列を欠損させた部分であり、実際はＣＡＡＧＣＣＣＡＧをＴＣＡＧＧＴＧＧＣに直結させた配列をＤＮＡ合成装置で合成して入れ替えに用いた。
【0048】
（５）ｐＭＮＶ－Ｆ＿ＶＰ２ ｄｅｌｔａＭｓｔｏｐ
ｐＭＮＶ－Ｆ＿ＶＰ２ ｄｅｌｔａＭｓｔｏｐ（ｐＭＮＶ－Ｆ＿ＶＰ２ΔＭｓｔｏｐ）は、ｐＭＮＶ－ＦのＯＲＦ３領域の配列を図８（配列番号７）の配列に、インフュージョンクローニングによって入れ替えたクローンである。図８において、（－－－－－－）の部分は核酸配列を欠損させた部分であり、実際はＣＡＡＧＣＣＣＡＧをＴＣＡＧＧＴＧＧＣに直結させた配列である。さらに、アミノ酸座位７番目と１０番目のコドンをストップコドンＴＡＧに置き換えた（□で囲った）。これをＤＮＡ合成装置で合成して入れ替えに用いた。
ｐＭＮＶ－Ｆ＿ＶＰ２ ｄｅｌｔａＭｓｔｏｐ（ｐＭＮＶ－Ｆ＿ＶＰ２ΔＭｓｔｏｐ）は、ｐＭＮＶ－ＦのＯＲＦ３領域の配列を図８（配列番号７）の配列に、インフュージョンクローニングによって入れ替えたクローンである。図８において、（－－－－－－）の部分は核酸配列を欠損させた部分であり、実際はＣＡＡＧＣＣＣＡＧをＴＣＡＧＧＴＧＧＣに直結させた配列である。さらに、アミノ酸座位７番目と１０番目のコドンをストップコドンＴＡＧに置き換えた（□で囲った）。これをＤＮＡ合成装置で合成して入れ替えに用いた。
【0049】
（６）ｐＭＮＶ－Ｆ＿ＶＰ２ ｄｅｌｔａＣ
ｐＭＮＶ－Ｆ＿ＶＰ２ ｄｅｌｔａＣ（ｐＭＮＶ－Ｆ＿ＶＰ２ΔＣ）は、ｐＭＮＶ－ＦのＯＲＦ３領域の配列を図９（配列番号８）に、インフュージョンクローニングによって入れ替えたクローンである。図９において、（－－－－－－）の部分は核酸配列を欠損させた部分であり、実際はＣＧＣＣＴＴＧＣＣをＡＧＣＡＧＧＧＣＡＴＡＧに直結させた配列をＤＮＡ合成装置で合成して入れ替えに用いた。
ｐＭＮＶ－Ｆ＿ＶＰ２ ｄｅｌｔａＣ（ｐＭＮＶ－Ｆ＿ＶＰ２ΔＣ）は、ｐＭＮＶ－ＦのＯＲＦ３領域の配列を図９（配列番号８）に、インフュージョンクローニングによって入れ替えたクローンである。図９において、（－－－－－－）の部分は核酸配列を欠損させた部分であり、実際はＣＧＣＣＴＴＧＣＣをＡＧＣＡＧＧＧＣＡＴＡＧに直結させた配列をＤＮＡ合成装置で合成して入れ替えに用いた。
【0050】
（７）ｐＭＮＶ－Ｆ＿ＶＰ２ ｄｅｌｔａＣｓｔｏｐ
ｐＭＮＶ－Ｆ＿ＶＰ２ ｄｅｌｔａＣｓｔｏｐ（ｐＭＮＶ－Ｆ＿ＶＰ２ΔＣｓｔｏｐ）は、ｐＭＮＶ－ＦのＯＲＦ３領域の配列を図１０（配列番号９）の配列に、インフュージョンクローニングによって入れ替えたクローンである。図１０において、（－－－－－－）の部分は核酸配列を欠損させた部分であり、実際はＣＧＣＣＴＴＧＣＣをＡＧＣＡＧＧＧＣＡＴＡＧに直結させた配列である。さらに、７番目と１０番目のアミノ酸残基のコドンをストップコドンＴＡＧに改変した（□で囲った）に入れ替えた。これをＤＮＡ合成装置で合成して入れ替えに用いた。
ｐＭＮＶ－Ｆ＿ＶＰ２ ｄｅｌｔａＣｓｔｏｐ（ｐＭＮＶ－Ｆ＿ＶＰ２ΔＣｓｔｏｐ）は、ｐＭＮＶ－ＦのＯＲＦ３領域の配列を図１０（配列番号９）の配列に、インフュージョンクローニングによって入れ替えたクローンである。図１０において、（－－－－－－）の部分は核酸配列を欠損させた部分であり、実際はＣＧＣＣＴＴＧＣＣをＡＧＣＡＧＧＧＣＡＴＡＧに直結させた配列である。さらに、７番目と１０番目のアミノ酸残基のコドンをストップコドンＴＡＧに改変した（□で囲った）に入れ替えた。これをＤＮＡ合成装置で合成して入れ替えに用いた。
【0051】
（８）ｐＭＮＶ－Ｆ＿ＶＰ２ ｄｅｌｔａ
ｐＭＮＶ－Ｆ＿ＶＰ２ ｄｅｌｔａ（ｐＭＮＶ－Ｆ＿ＶＰ２Δ）は、ｐＭＮＶ－ＦのＯＲＦ３領域の配列を図１１（配列番号１０）の配列に、インフュージョンクローニングによって入れ替えたクローンである。図１１において、（－－－－－－）の部分は核酸配列を欠損させた部分であり、これをＤＮＡ合成装置で合成して入れ替えに用いた。
ｐＭＮＶ－Ｆ＿ＶＰ２ ｄｅｌｔａ（ｐＭＮＶ－Ｆ＿ＶＰ２Δ）は、ｐＭＮＶ－ＦのＯＲＦ３領域の配列を図１１（配列番号１０）の配列に、インフュージョンクローニングによって入れ替えたクローンである。図１１において、（－－－－－－）の部分は核酸配列を欠損させた部分であり、これをＤＮＡ合成装置で合成して入れ替えに用いた。
【0052】
＜方法＞
１．ＶＰ２に変異を導入したゲノムを内包する新生ウイルス粒子（ＭＰＮＶ）の調製（図１２）
ＶＰ２を細胞内に一時的に供給して、ＯＲＦ３（ＶＰ２コード領域）に変異を導入したゲノムを内包する新生ウイルス粒子を作出するため、「＜材料＞４．（１）－（８）」に示したＭＮＶ－ＯＲＦ３ｍｕｔａｎｔゲノム供給用ベクター「ｐＭＮＶ－Ｆ＿ＶＰ２」（ｐＭＮＶ－Ｆ＿ＶＰ２ ＳＴＯＰ等）それぞれと、ＶＰ２発現用ベクター「ｐＫＳ－ＭＮＶ ＶＰ２」を同時に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクションして、４８時間のインキュベートの後、上清に含まれるＭＰＮＶを回収した。
１．ＶＰ２に変異を導入したゲノムを内包する新生ウイルス粒子（ＭＰＮＶ）の調製（図１２）
ＶＰ２を細胞内に一時的に供給して、ＯＲＦ３（ＶＰ２コード領域）に変異を導入したゲノムを内包する新生ウイルス粒子を作出するため、「＜材料＞４．（１）－（８）」に示したＭＮＶ－ＯＲＦ３ｍｕｔａｎｔゲノム供給用ベクター「ｐＭＮＶ－Ｆ＿ＶＰ２」（ｐＭＮＶ－Ｆ＿ＶＰ２ ＳＴＯＰ等）それぞれと、ＶＰ２発現用ベクター「ｐＫＳ－ＭＮＶ ＶＰ２」を同時に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクションして、４８時間のインキュベートの後、上清に含まれるＭＰＮＶを回収した。
【0053】
２．ＭＰＮＶの感染試験
上記ＭＰＮＶは、ＶＰ２を定常的に発現し、かつＭＮＶレセプターＣＤ３００ｌｆも定常的に発現する「Ｈｕｈ７５１＋ＣＤ３００ｌｆ＋ＶＰ２ ｃｌｏｎｅ１２－２細胞」に感染させることでＭＰＮＶの複製増殖が可能である。しかし、ＭＮＶレセプターＣＤ３００ｌｆを定常的に発現するＨｕｈ７５１＋ＣＤ３００ｌｆや、本来の感染感受性細胞であるＲＡＷ２６４．７細胞は、ＶＰ２の産生能は無く、発現するＶＰ２に欠陥がある、又は、ＶＰ２が発現しないＭＰＮＶは複製増殖することができないのが原則である筈である。
上記ＭＰＮＶは、ＶＰ２を定常的に発現し、かつＭＮＶレセプターＣＤ３００ｌｆも定常的に発現する「Ｈｕｈ７５１＋ＣＤ３００ｌｆ＋ＶＰ２ ｃｌｏｎｅ１２－２細胞」に感染させることでＭＰＮＶの複製増殖が可能である。しかし、ＭＮＶレセプターＣＤ３００ｌｆを定常的に発現するＨｕｈ７５１＋ＣＤ３００ｌｆや、本来の感染感受性細胞であるＲＡＷ２６４．７細胞は、ＶＰ２の産生能は無く、発現するＶＰ２に欠陥がある、又は、ＶＰ２が発現しないＭＰＮＶは複製増殖することができないのが原則である筈である。
【0054】
本感染試験の手順は、下記の通りである。
（１）それぞれの変異がＶＰ２遺伝子に導入されたＭＰＮＶを、「Ｈｕｈ７５１＋ＣＤ３００ｌｆ＋ＶＰ２ ｃｌｏｎｅ１２－２細胞」に感染させ、４８時間のインキュベートを行い、上清を回収した。
（２）回収した１回目の培養上清に含まれるＭＰＮＶは、再び新たに培養して準備した「Ｈｕｈ７５１＋ＣＤ３００ｌｆ＋ＶＰ２ ｃｌｏｎｅ１２－２細胞」に感染させ、４８時間のインキュベートを行い、２回目の培養上清を回収した。
（３）回収した２回目の培養上清を「Ｈｕｈ７５１＋ＣＤ３００ｌｆ細胞」（ＶＰ２は発現していない）に感染させ、４８時間のインキュベートを行い、３回目の培養上清を回収した。
（４）回収した３回目の培養上清を、再び「Ｈｕｈ７５１＋ＣＤ３００ｌｆ細胞」（ＶＰ２は発現していない）に感染させ、４８時間のインキュベートを行い、３回目の培養上清を回収した。
（１）それぞれの変異がＶＰ２遺伝子に導入されたＭＰＮＶを、「Ｈｕｈ７５１＋ＣＤ３００ｌｆ＋ＶＰ２ ｃｌｏｎｅ１２－２細胞」に感染させ、４８時間のインキュベートを行い、上清を回収した。
（２）回収した１回目の培養上清に含まれるＭＰＮＶは、再び新たに培養して準備した「Ｈｕｈ７５１＋ＣＤ３００ｌｆ＋ＶＰ２ ｃｌｏｎｅ１２－２細胞」に感染させ、４８時間のインキュベートを行い、２回目の培養上清を回収した。
（３）回収した２回目の培養上清を「Ｈｕｈ７５１＋ＣＤ３００ｌｆ細胞」（ＶＰ２は発現していない）に感染させ、４８時間のインキュベートを行い、３回目の培養上清を回収した。
（４）回収した３回目の培養上清を、再び「Ｈｕｈ７５１＋ＣＤ３００ｌｆ細胞」（ＶＰ２は発現していない）に感染させ、４８時間のインキュベートを行い、３回目の培養上清を回収した。
【0055】
細胞のＭＰＮＶの感染は、感染後４８時間のインキュベートを行ったそれぞれの細胞を、パラホルムアルデヒドで固定し、抗ＭＮＶ Ｎ－ｔｅｒｍｉｎａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ 抗体による免疫染色を実施して確認した。
【0056】
結果を表１に示す。
【0057】
【表1】
【0058】
（ａ）ｐＭＮＶ－Ｆ（野生型ＭＮＶのインフェクシャスクローン）は、ＶＰ２発現用ベクターとコトランスフェクションせずとも、自らの野生型ゲノムよりＶＰ２を産生するため、野生型ＭＮＶを培養上清に産生する。従って、ｐＫＳ－ＭＮＶ ＶＰ２とのコトランスフェクションでも野生型ＭＮＶを効率良く産生したため、表１（１）が（＋＋＋）であった。同（１）でＭＮＶが効率良く増殖したため、同（２）も（＋＋＋）であった。２回目の感染で増殖した野生型ＭＮＶは、自身がＯＲＦ３にコードするＶＰ２を発現可能であり、自己供給できるため、「Ｈｕｈ７５１＋ＣＤ３００ｌｆ細胞」（ＶＰ２は発現していない）に感染しても、増殖が可能であり、同（３）で（＋＋＋）を示した。さらに、同（４）でも同様の結果となった。
【0059】
（ｂ）Ｓｔｏｐ、ｄｅｌｔａＮ、ｄｅｌｔａＮｓｔｏｐは、ｐＫＳ－ＭＮＶ ＶＰ２とのコトランスフェクションしたときのみ、ＭＰＮＶを産生し、表１（１）が（＋＋）ないし（＋＋＋）を示した。ｐＫＳ－ＭＮＶ ＶＰ２とコトランスフェクションを行わない場合、ＶＰ２が供給されない状態になるため、ＭＰＮＶは産生されなかった（表示せず）。同（１）と（２）では、「Ｈｕｈ７５１＋ＣＤ３００ｌｆ＋ＶＰ２ ｃｌｏｎｅ１２－２細胞」を用いたため、この細胞内で定常的に発現しているＶＰ２がトランスに供給され、ＭＰＮＶが増殖培養されたことにより、全て（＋＋＋）を示した。同（３）では、２回目の感染で増殖したＭＰＮＶが培養上清中に存在するため、そのＭＰＮＶが「Ｈｕｈ７５１＋ＣＤ３００ｌｆ細胞」（ＶＰ２は発現していない）に感染して、変異ゲノムを細胞内に送り込むため、（＋＋＋）を示した。しかし、同（４）では、３回目の培養上清にはＭＰＮＶが産生されないため、持ち越された２回目の培養上清に存在したウイルスが僅かに感染したものの、感染細胞は激しく減少し、僅かに（＋）を示した。表示外であるが、４回目の培養上清をＨｕｈ７５１＋ＣＤ３００ｌｆ細胞（ＶＰ２は発現していない）に感染させた場合は、全て（－）となった。
【0060】
（ｃ）ｄｅｌｔａＭとｄｅｌｔａＭｓｔｏｐは、ｐＫＳ－ＭＮＶ ＶＰ２とのコトランスフェクションしたときのみ、ＭＰＮＶを産生し、表１（１）は（＋）ないし（＋＋）を示した。ｐＫＳ－ＭＮＶ ＶＰ２とコトランスフェクションを行わない場合、ＶＰ２が供給されない状態になるため、ＭＰＮＶは産生されなかった（表示せず）。同（１）と（２）では、「Ｈｕｈ７５１＋ＣＤ３００ｌｆ＋ＶＰ２ ｃｌｏｎｅ１２－２細胞」を用いたため、この細胞内で定常的に発現しているＶＰ２がトランスに供給され、ＭＰＮＶが増殖培養されたことにより、（＋）ないし（＋＋）を示した。同（３）では、ｄｅｌｔａＭｓｔｏｐのみ２回目の感染で増殖したＭＰＮＶが培養上清中に存在するため、そのＭＰＮＶがＨｕｈ７５１＋ＣＤ３００ｌｆ細胞（ＶＰ２は発現していない）に感染して、変異ゲノムを細胞内に送り込むため、（＋）を示した。しかし、同（４）では、３回目の培養上清にはＭＰＮＶが産生されないため、持ち越された２回目の培養上清に存在したウイルスが僅かに感染した結果、感染細胞は激しく減少し、僅かに（＋）を示したのみであった。表示外であるが、４回目の培養上清をＨｕｈ７５１＋ＣＤ３００ｌｆ細胞（ＶＰ２は発現していない）に感染させた場合、全て（－）となった。一方ｄｅｌｔａＭは、ｄｅｌｔａＭｓｔｏｐよりもＭＰＮＶ産生量が少なく、同（３）以降全て（－）となった。
【0061】
（ｄ）ｄｅｌｔａＣ、ｄｅｌｔａＣｓｔｏｐ、ｄｅｌｔａは、ｐＫＳ－ＭＮＶ ＶＰ２とコトランスフェクションしても、ＭＰＮＶを産生できず、表１（１）から（４）まで全て（－）を示した。
【0062】
（ｅ）ネガティブコントロールとして用いた、ｐＭＮＶ－Ｆ（野生型ＭＮＶのインフェクシャスクローン）のＲＮＡ依存的ＲＮＡポリメラーゼの活性中心を欠失させたＲｄＲｐ変異体（ｐＭＮＶ－ＦｄｅｌｔａＲｄＲｐ）は、自ら複製することができず、表１（１）から（４）まで全て（－）を示した。
【0063】
上記の結果を検討する。特に、ｄｅｌｔａ Ｍにおいて、ＶＰ２がトランス供給される場合はＭＰＮＶの産生が可能となることから、ＯＲＦ３（ＶＰ２）の２０８アミノ酸コード領域のうち、Ｎ末端側４アミノ酸から１５３アミノ酸コード領域までを失った場合でも、ＭＰＮＶ産生能力が保持されていることが分かった（ＯＲＦ３特定領域に該当する）。逆にｄｅｌｔａＣに関する結果から、１５４番目のアミノ酸から２０６番目のアミノ酸をコードするコドンまでの間の核酸配列は、ゲノム遺伝子の複製又はウイルス粒子へのパッケージングに必要な領域であり、核酸配列の欠損が致死的になることが明らかになった。
【0064】
また、ＭＰＮＶは、ＶＰ２をトランス供給すると細胞内でＶＰ２変異ゲノムを複製し、最終的に当該変異ゲノムをウイルス粒子内にパッケージしてＭＰＮＶを産生することが可能だが、産生されたＭＰＮＶは、ＶＰ２がトランス供給されない細胞、すなわち通常のノロウイルス感受性細胞に対しては一度だけしか感染できず、その後、ＭＰＮＶの産生はなされないことが明らかになった。
【0065】
すなわち、所定のＶＰ２変異ゲノムを内包した新生ウイルスＭＰＮＶは、一度だけ感染することで宿主に野生型ウイルスと同じように免疫を惹起できるが、ＭＰＮＶを新たに産生することができない、高度弱毒化生ワクチンの有効成分としての有用性が明らかになった。
【0066】
３．ＯＲＦ３特定領域に外来性タンパク質遺伝子を組み込んだＭＰＮＶ
次に、ＯＲＦ３特定領域に外来性タンパク質を組み込んだ場合のＭＰＮＶの振る舞いについて検討する。
次に、ＯＲＦ３特定領域に外来性タンパク質を組み込んだ場合のＭＰＮＶの振る舞いについて検討する。
【0067】
外来性タンパク質遺伝子として、蛍光タンパク質遺伝子を用いた。蛍光タンパク質遺伝子を組み込んだ領域は、ｄｅｌｔａＮｓｔｏｐの欠損領域（Ｎ末端側４番目のアミノ酸残基から１０５アミノ酸残基のコード領域）、ｄｅｌｔａＭｓｔｏｐの欠損領域（Ｎ末端側４番目のアミノ酸残基から１５６アミノ酸残基のコード領域）で、蛍光タンパク質遺伝子として、ＵｎａＧ［（Cell 153, 1602-1611, June 20, 2013）ニホンウナギ由来の緑色蛍光タンパク質：４１４塩基、１３９アミノ酸］組み込まれたベクター（最初のＡＴＧを除く）を作製した。さらにこれとは別に、ＧＦＰの高輝度変異体であるＶＥＮＵＳ［（生物物理４２（６），３０５－３０８（２００２））７１７塩基、２３９アミノ酸］組み込まれたベクター（最初のＡＴＧを除く）を作製した。
【0068】
これらのベクターとｐＫＳ－ＭＮＶ－ＶＰ２を、上記の要領（図１２参照）でコトランスフェクションして、外来性の蛍光タンパク質遺伝子を内包したＭＰＮＶの作製と感染実験を実施した。
【0069】
方法は、上記したＭＰＮＶの作製と感染試験と同様である。ただし、組み込んだ遺伝子が蛍光たんぱく質遺伝子であるため、免疫染色は実施せず、蛍光たんぱく質の発色を検出して、結果を検討した。
【0070】
結果としては、２種類の蛍光タンパク質遺伝子を内包したＭＰＮＶの作製は成功し、上記の感染試験と同様に、当該ＭＰＮＶが一度だけノロウイルス感受性細胞に感染可能であり、当該細胞内に組み込んだ蛍光タンパク質を発現させることができることを確認した。
【0071】
従って、これらの蛍光タンパク質に代えて、ノロウイルス以外のウイルスタンパク質遺伝子（構造タンパク質であっても、非構造タンパク質であっても良い）をＯＲＦ３特定領域に組み込み、ＭＰＮＶとして産生させると、高度弱毒化多価生ワクチンの有効成分として利用可能であることが示された。
【図1-1】
【図1-2】
【図1-3】
【図1-4】
【図1-5】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【配列表】