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特許7421400ヒトガレクチン－３の分析、検出、測定に関する抗体、方法及びキット
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-01-16
(45)【発行日】2024-01-24
(54)【発明の名称】ヒトガレクチン－３の分析、検出、測定に関する抗体、方法及びキット
(51)【国際特許分類】
G01N 33/53 20060101AFI20240117BHJP
C07K 16/28 20060101ALN20240117BHJP
【ＦＩ】
G01N33/53 D
C07K16/28 ZNA
【請求項の数】
10
(21)【出願番号】P 2020061224
(22)【出願日】2020-03-30
(65)【公開番号】P2021162342
(43)【公開日】2021-10-11
【審査請求日】2022-11-22
【微生物の受託番号】NPMD NITE BP-03099
(73)【特許権者】
【識別番号】000141897
【氏名又は名称】アークレイ株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110000040
【氏名又は名称】弁理士法人池内アンドパートナーズ
(72)【発明者】
【氏名】山城 宏道
(72)【発明者】
【氏名】李 賢
(72)【発明者】
【氏名】三上 寿幸
【審査官】小澤 理
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１５－５０５３６８（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１４－１９９２６１（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２０１３／００２９９５５（ＵＳ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１９／０２３２４７（ＷＯ，Ａ１）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｇ０１Ｎ ３３／５３
Ｃ０７Ｋ １６／２８
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
試料中のヒトガレクチン－３の免疫学的分析方法であって、ヒトガレクチン－３のＹＰＧＡＰＡＰＧＶＹＰ（配列番号１）からなるアミノ酸配列Ａに存在する線状エピトープＡを認識するモノクローナル抗体Ａと、
ヒトガレクチン－３の糖鎖認識ドメイン（ＣＲＤ）よりもＮ末端側に位置し、かつ、エピトープＡとは異なるエピトープＢを認識するモノクローナル抗体Ｂとを用いて、
ヒトガレクチン－３を検出又は濃度測定することを含み、
前記モノクローナル抗体Ａが、下記（１）及び（２）からなる群から選択される、方法。
（１）アイソタイプＩｇＧ１であり、軽鎖定常領域がラムダ鎖である；
（２）ハイブリドーマ１－７－Ｈ－１（受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－０３０９９）から産生される抗体又は該抗体に由来する小型抗体若しくは抗体断片である。
【請求項2】
エピトープＢが、Ｎ末端から１００アミノ酸残基の間の領域である、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
エピトープＢが、ＹＰＧＱＡＰＰＧＡＹＰＧＱＡＰＰＧＡ（配列番号２）からなるアミノ酸配列Ｂに存在する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
モノクローナル抗体Ｂが、ラット抗ガレクチン－３モノクローナル抗体Ｍ３／３８である、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項5】
免疫学的分析方法が、ＥＬＩＳＡ（エライザ）又はＣＬＥＩＡ（クレイア）である、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項6】
請求項１から５のいずれかに記載のガレクチン－３の免疫学的分析方法を行うためのキットであって、モノクローナル抗体Ａ及びモノクローナル抗体Ｂを備えるキット。
【請求項7】
ヒトガレクチン－３のＹＰＧＡＰＡＰＧＶＹＰ（配列番号１）からなるアミノ酸配列Ａに存在する線状エピトープを認識し、アイソタイプＩｇＧ１であり、軽鎖定常領域がラムダ鎖であるモノクローナル抗体、又は該抗体に由来する小型抗体若しくは抗体断片。
【請求項8】
ハイブリドーマ１－７－Ｈ－１（受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－０３０９９）から産生される抗ガレクチン－３モノクローナル抗体又は該抗体に由来する小型抗体若しくは抗体断片。
【請求項9】
ハイブリドーマ１－７－Ｈ－１（受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－０３０９９）。
【請求項10】
請求項７又は８に記載の抗ガレクチン－３モノクローナル抗体又は該抗体に由来する小型抗体若しくは抗体断片を備える、ガレクチン－３の免疫学的分析方法を行うためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、一態様において、ヒトガレクチン－３の分析、検出又は測定のための抗体、方法及びキットに関する。
【背景技術】
【0002】
ガレクチンは、ガラクトースを含む糖鎖構造（β―ガラクシド）を特異的に認識して結合するタンパク質である。哺乳類のガレクチンとしては、ガレクチン－１からガレクチン－１５まで知られている。ヒトのガレクチンとしては、現在、１０種類が知られている。
ヒトガレクチンは、バイオマーカーとして使用されることがある。ヒトガレクチンの１つであるヒトガレクチン－３は、さまざまな疾病、症状のバイオマーカーとして注目されている（特許文献１～３）。
ヒトガレクチンは、バイオマーカーとして使用されることがある。ヒトガレクチンの１つであるヒトガレクチン－３は、さまざまな疾病、症状のバイオマーカーとして注目されている（特許文献１～３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0003】
【文献】特表２０１２－５０７７２４
【文献】特表２０１４－５１４５３６
【文献】ＷＯ２０１６／０２４６２７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
バイオマーカーとして診断などに利用する場合、検出や濃度測定が高感度になれば、診断の信頼性も向上すると考えれられる。
本開示は、ヒトガレクチン－３の検出や測定に利用可能なモノクローナル抗体、及び、該抗体を利用したヒトガレクチン－３の免疫学的分析方法を提供する。
本開示は、ヒトガレクチン－３の検出や測定に利用可能なモノクローナル抗体、及び、該抗体を利用したヒトガレクチン－３の免疫学的分析方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【0005】
本開示は、一態様において、
ヒトガレクチン－３のＹＰＧＡＰＡＰＧＶＹＰ（配列番号１）からなるアミノ酸配列Ａに存在する線状エピトープＡを認識するモノクローナル抗体Ａと、
ヒトガレクチン－３の糖鎖認識ドメイン（ＣＲＤ）よりもＮ末端側に位置し、かつ、エピトープＡとは異なるエピトープＢを認識するモノクローナル抗体Ｂとを用いて、
ヒトガレクチン－３を検出又は濃度測定することを含む、ヒトガレクチン－３の免疫学的分析方法に関する。
ヒトガレクチン－３のＹＰＧＡＰＡＰＧＶＹＰ（配列番号１）からなるアミノ酸配列Ａに存在する線状エピトープＡを認識するモノクローナル抗体Ａと、
ヒトガレクチン－３の糖鎖認識ドメイン（ＣＲＤ）よりもＮ末端側に位置し、かつ、エピトープＡとは異なるエピトープＢを認識するモノクローナル抗体Ｂとを用いて、
ヒトガレクチン－３を検出又は濃度測定することを含む、ヒトガレクチン－３の免疫学的分析方法に関する。
【0006】
本開示は、その他の一態様において、前記モノクローナル抗体Ａ及び前記モノクローナル抗体Ｂを備える、ヒトガレクチン－３の免疫学的分析方法を行うためのキットに関する。
本開示は、その他の一態様において、ヒトガレクチン－３のＹＰＧＡＰＡＰＧＶＹＰ（配列番号１）からなるアミノ酸配列で表される線状エピトープを認識し、アイソタイプＩｇＧ１であり、軽鎖定常領域がラムダ鎖であるモノクローナル抗体、又は該抗体に由来する小型抗体若しくは抗体断片に関する。
本開示は、その他の一態様において、ハイブリドーマ（寄託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－０３０９９）から産生される抗ガレクチン－３モノクローナル抗体又は該抗体に由来する小型抗体若しくは抗体断片、及び／又は、前記ハイブリドーマ、及び／又は、前記抗体又は該抗体に由来する小型抗体若しくは抗体断片を備えるヒトガレクチン－３の免疫学的分析方法を行うためのキットに関する。
本開示は、その他の一態様において、ヒトガレクチン－３のＹＰＧＡＰＡＰＧＶＹＰ（配列番号１）からなるアミノ酸配列で表される線状エピトープを認識し、アイソタイプＩｇＧ１であり、軽鎖定常領域がラムダ鎖であるモノクローナル抗体、又は該抗体に由来する小型抗体若しくは抗体断片に関する。
本開示は、その他の一態様において、ハイブリドーマ（寄託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－０３０９９）から産生される抗ガレクチン－３モノクローナル抗体又は該抗体に由来する小型抗体若しくは抗体断片、及び／又は、前記ハイブリドーマ、及び／又は、前記抗体又は該抗体に由来する小型抗体若しくは抗体断片を備えるヒトガレクチン－３の免疫学的分析方法を行うためのキットに関する。
【発明の効果】
【0007】
本開示によれば、ヒトガレクチン－３のＹＰＧＡＰＡＰＧＶＹＰ（配列番号１）からなるアミノ酸配列Ａに存在する線状エピトープＡを認識するモノクローナル抗体Ａを提供できる。
本開示によれば、該モノクローナル抗体Ａを用いたガレクチン－３の免疫学的分析が可能となる。
本開示によれば、該モノクローナル抗体Ａを用いたガレクチン－３の免疫学的分析が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【0008】
【発明を実施するための形態】
【0009】
本開示は、ヒトガレクチン－３のＹＰＧＡＰＡＰＧＶＹＰ（配列番号１）からなるアミノ酸配列Ａに存在する線状エピトープＡを認識するモノクローナル抗体Ａを用いることで、感度が向上したヒトガレクチン－３の免疫学的分析が可能になるという知見に基づく。
【0010】
［ヒトガレクチン－３］
本開示において「ヒトガレクチン－３」は、一又は複数の実施形態において、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００２２９７又はＮＰ＿００２２９７．２で特定されるタンパク質をいい、そのアミノ酸配列としては配列番号３の配列が挙げられる。
本開示における「ヒトガレクチン－３」には、上記で特定されるタンパク質のほか、一又は複数の実施形態において、本開示に係るモノクローナル抗体が抗体抗原反応しうるアイソフォームやバリアントも含まれうる。
本開示において、単にヒトガレクチン－３という場合には、ヒトガレクチン－３タンパク質を指すことがある。ただし、ヒトガレクチン－３タンパク質をコードする遺伝子を指すことを排除しない。
本開示において、特に言及がない場合、ガレクチン－３は、ヒトガレクチン－３をいう。
本開示において「ヒトガレクチン－３」は、一又は複数の実施形態において、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００２２９７又はＮＰ＿００２２９７．２で特定されるタンパク質をいい、そのアミノ酸配列としては配列番号３の配列が挙げられる。
本開示における「ヒトガレクチン－３」には、上記で特定されるタンパク質のほか、一又は複数の実施形態において、本開示に係るモノクローナル抗体が抗体抗原反応しうるアイソフォームやバリアントも含まれうる。
本開示において、単にヒトガレクチン－３という場合には、ヒトガレクチン－３タンパク質を指すことがある。ただし、ヒトガレクチン－３タンパク質をコードする遺伝子を指すことを排除しない。
本開示において、特に言及がない場合、ガレクチン－３は、ヒトガレクチン－３をいう。
【0011】
本開示において、免疫学的分析方法とは、一又は複数の実施形態において、抗体を用いて対象を検出又は濃度測定することを含み、２種類若しくはそれ以上の抗体を用いて対象を検出又は濃度測定することを含み、異なるエピトープを認識する２種類若しくはそれ以上の抗体を用いて対象を検出又は濃度測定することを含む。
２種類以上の抗体を用いる免疫学的分析方法の一又は複数の実施形態として、ＥＬＩＳＡ（エライザ）若しくはＣＬＥＩＡ（クレイア）、又は、イムノクロマトグラフィーが挙げられる。２種類以上の抗体を用いるＥＬＩＳＡのなかでも、捕捉抗体と検出抗体を用いるＥＬＩＳＡはサンドイッチ法と呼ばれることがある。イムノクロマトグラフィーは、イムノクロマト法とも呼ばれ、抗原に対して、標識抗体と捕捉抗体を用いる。イムノクロマト法は、一又は複数の実施形態において、金属コロイドやポリエスチレンラテックス粒子等で標識された標識抗体が配置されたパッドに検体を滴下して抗原－標識抗体の複合体を形成させ、それらをセルロース膜等のメンブレン上で一方向に展開し、セルロース膜上に固定された捕捉抗体で抗原－標識抗体の複合体を捕捉させ、目視で検出するという方法である。
但し、本開示において免疫学的分析方法はこれらに限定されなくてもよい。
２種類以上の抗体を用いる免疫学的分析方法の一又は複数の実施形態として、ＥＬＩＳＡ（エライザ）若しくはＣＬＥＩＡ（クレイア）、又は、イムノクロマトグラフィーが挙げられる。２種類以上の抗体を用いるＥＬＩＳＡのなかでも、捕捉抗体と検出抗体を用いるＥＬＩＳＡはサンドイッチ法と呼ばれることがある。イムノクロマトグラフィーは、イムノクロマト法とも呼ばれ、抗原に対して、標識抗体と捕捉抗体を用いる。イムノクロマト法は、一又は複数の実施形態において、金属コロイドやポリエスチレンラテックス粒子等で標識された標識抗体が配置されたパッドに検体を滴下して抗原－標識抗体の複合体を形成させ、それらをセルロース膜等のメンブレン上で一方向に展開し、セルロース膜上に固定された捕捉抗体で抗原－標識抗体の複合体を捕捉させ、目視で検出するという方法である。
但し、本開示において免疫学的分析方法はこれらに限定されなくてもよい。
【0012】
［ヒトガレクチン－３の免疫学的分析方法］
本開示は、一態様において、ヒトガレクチン－３のＹＰＧＡＰＡＰＧＶＹＰ（配列番号１）からなるアミノ酸配列Ａに存在する線状エピトープＡを認識するモノクローナル抗体Ａと、
ヒトガレクチン－３の糖鎖認識ドメイン（ＣＲＤ）よりもＮ末端側に位置し、かつ、エピトープＡとは異なるエピトープＢを認識するモノクローナル抗体Ｂとを用いて、
ヒトガレクチン－３を検出又は濃度測定することを含む、ガレクチン－３の免疫学的分析方法（以下、「本開示に係る分析方法」ともいう）に関する。
本開示は、一態様において、ヒトガレクチン－３のＹＰＧＡＰＡＰＧＶＹＰ（配列番号１）からなるアミノ酸配列Ａに存在する線状エピトープＡを認識するモノクローナル抗体Ａと、
ヒトガレクチン－３の糖鎖認識ドメイン（ＣＲＤ）よりもＮ末端側に位置し、かつ、エピトープＡとは異なるエピトープＢを認識するモノクローナル抗体Ｂとを用いて、
ヒトガレクチン－３を検出又は濃度測定することを含む、ガレクチン－３の免疫学的分析方法（以下、「本開示に係る分析方法」ともいう）に関する。
【0013】
［モノクローナル抗体Ａ］
本開示に係る分析方法で使用されるモノクローナル抗体Ａは、線状エピトープＡを認識する抗体であって、該線状エピトープＡは、ヒトガレクチン－３のＹＰＧＡＰＡＰＧＶＹＰ（配列番号１）からなるアミノ酸配列Ａに存在する。
アミノ酸配列Ａは、配列番号３で表されるヒトガレクチン－３タンパク質のアミノ酸配列において、７０番目から８０番目のアミノ酸配列に該当する。
線状エピトープＡは、アミノ酸配列Ａそのものであってもよく、アミノ酸配列Ａの一部であってもよい。通常、抗体のエピトープはアミノ酸残基数個から十数個で構成されることが知られている。
なお、ガレクチンファミリーに共通性が高い糖鎖認識ドメイン（ＣＲＤ）は、ヒトガレクチン－３のＣ末端側、配列番号３の１１３番目以降である。ガレクチンファミリーで共通性が低い７０番目から８０番目のアミノ酸配列に該当するアミノ酸配列Ａに存在する線状エピトープＡを認識するモノクローナル抗体Ａは、ヒトガレクチン－３に特異的な抗体といえる。
本開示に係る分析方法で使用されるモノクローナル抗体Ａは、線状エピトープＡを認識する抗体であって、該線状エピトープＡは、ヒトガレクチン－３のＹＰＧＡＰＡＰＧＶＹＰ（配列番号１）からなるアミノ酸配列Ａに存在する。
アミノ酸配列Ａは、配列番号３で表されるヒトガレクチン－３タンパク質のアミノ酸配列において、７０番目から８０番目のアミノ酸配列に該当する。
線状エピトープＡは、アミノ酸配列Ａそのものであってもよく、アミノ酸配列Ａの一部であってもよい。通常、抗体のエピトープはアミノ酸残基数個から十数個で構成されることが知られている。
なお、ガレクチンファミリーに共通性が高い糖鎖認識ドメイン（ＣＲＤ）は、ヒトガレクチン－３のＣ末端側、配列番号３の１１３番目以降である。ガレクチンファミリーで共通性が低い７０番目から８０番目のアミノ酸配列に該当するアミノ酸配列Ａに存在する線状エピトープＡを認識するモノクローナル抗体Ａは、ヒトガレクチン－３に特異的な抗体といえる。
【0014】
本開示において、線状エピトープとは、連続エピトープともいわれるものであり、単純な直鎖状アミノ酸配列によって構成されるエピトープをいう。
一方、本開示において、構造的エピトープとは、不連続エピトープともいわれるものであり、タンパク質の特定の立体構造に依存しているエピトープをいう。
一方、本開示において、構造的エピトープとは、不連続エピトープともいわれるものであり、タンパク質の特定の立体構造に依存しているエピトープをいう。
【0015】
本開示に係る分析方法では、立体構造に依存しない線状エピトープＡを認識するモノクローナル抗体Ａを使用するからヒトガレクチン－３の免疫学的分析において感度が向上すると推定される。ただし、本開示はこのメカニズムに限定されなくてもよい。
【0016】
モノクローナル抗体Ａの一又は複数の実施形態としては、アイソタイプＩｇＧ１であり、軽鎖定常領域がラムダ鎖であるものが挙げられる。本実施形態にあたるモノクローナル抗体Ａは、実施例に記載の方法で作成できる。
本実施形態にあたるモノクローナル抗体Ａとしては、ハイブリドーマ１－７－Ｈ－１（受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－０３０９９）から産生される抗体が該当する。
本実施形態にあたるモノクローナル抗体Ａとしては、ハイブリドーマ１－７－Ｈ－１（受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－０３０９９）から産生される抗体が該当する。
【0017】
本開示において、抗体というときは、一又は複数の実施形態において、通常のＩｇＧの形態であるほか、該形態と共通する少なくとも１つの抗原認識部位（ＣＤＲ）を有するバイスペシフィック抗体、小型抗体、抗体断片を含みうる。小型抗体及び抗体断片としては、Ｆ（ａｂ′）２、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆｖ－ｃｌａｓｐ、ｍｉｎｉｂｏｄｙ、ｓｃＦｖ－ｌｕｃｉｎｅ ｚｉｐｐｅｒ、ｔａｎｄｅｍ ｓｃＦｖ（ｔａＦｖ）、及びｄｉａｂｏｄｙなどが挙げられる。
したがって、モノクローナル抗体Ａは、一又は複数の実施形態において、ハイブリドーマ１－７－Ｈ－１（寄託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－０３０９９）から産生される抗ガレクチン－３モノクローナル抗体に由来する、あるいは、該抗体のＣＤＲを少なくとも１つ有する小型抗体若しくは抗体断片が挙げられる。
したがって、モノクローナル抗体Ａは、一又は複数の実施形態において、ハイブリドーマ１－７－Ｈ－１（寄託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－０３０９９）から産生される抗ガレクチン－３モノクローナル抗体に由来する、あるいは、該抗体のＣＤＲを少なくとも１つ有する小型抗体若しくは抗体断片が挙げられる。
【0018】
［モノクローナル抗体Ｂ］
本開示に係る分析方法で使用されるモノクローナル抗体Ｂは、エピトープＢを認識する抗体であって、該エピトープＢは、ヒトガレクチン－３の糖鎖認識ドメイン（ＣＲＤ）よりもＮ末端側に位置し、かつ、エピトープＡとは異なるエピトープである。
ヒトガレクチン－３のＣＲＤよりもＮ末端側で、エピトープＡとは異なるエピトープを認識するモノクローナル抗体Ｂをモノクローナル抗体Ａと組み合わせて免疫学的分析を行うことで、一又は複数の実施形態において、ヒトガレクチン－３の検出、濃度測定、及び分析の感度の向上が達成されうる。
本開示に係る分析方法で使用されるモノクローナル抗体Ｂは、エピトープＢを認識する抗体であって、該エピトープＢは、ヒトガレクチン－３の糖鎖認識ドメイン（ＣＲＤ）よりもＮ末端側に位置し、かつ、エピトープＡとは異なるエピトープである。
ヒトガレクチン－３のＣＲＤよりもＮ末端側で、エピトープＡとは異なるエピトープを認識するモノクローナル抗体Ｂをモノクローナル抗体Ａと組み合わせて免疫学的分析を行うことで、一又は複数の実施形態において、ヒトガレクチン－３の検出、濃度測定、及び分析の感度の向上が達成されうる。
【0019】
モノクローナル抗体ＢのエピトープＢの位置としては、一又は複数の実施形態において、ヒトガレクチン－３のＮ末端から１００アミノ酸残基の間の領域のなかである。
エピトープＢは、線状エピトープでもよく、構造的エピトープであってもよい。構造に依存しない点、及び、エピトープＡが線状エピトープである点から、エピトープＢは、一又は複数の実施形態において、線状エピトープである。
エピトープＢは、一又は複数の実施形態において、ＹＰＧＱＡＰＰＧＡＹＰＧＱＡＰＰＧＡ（配列番号２）のアミノ酸配列Ｂに存在する。アミノ酸配列Ｂは、配列番号３で表されるヒトガレクチン－３タンパク質のアミノ酸配列において、４５番目から６２番目のアミノ酸配列に該当する。
モノクローナル抗体Ｂとしては、一又は複数の実施形態において、市販の抗体Ｍ３／３８が使用できる。
エピトープＢは、線状エピトープでもよく、構造的エピトープであってもよい。構造に依存しない点、及び、エピトープＡが線状エピトープである点から、エピトープＢは、一又は複数の実施形態において、線状エピトープである。
エピトープＢは、一又は複数の実施形態において、ＹＰＧＱＡＰＰＧＡＹＰＧＱＡＰＰＧＡ（配列番号２）のアミノ酸配列Ｂに存在する。アミノ酸配列Ｂは、配列番号３で表されるヒトガレクチン－３タンパク質のアミノ酸配列において、４５番目から６２番目のアミノ酸配列に該当する。
モノクローナル抗体Ｂとしては、一又は複数の実施形態において、市販の抗体Ｍ３／３８が使用できる。
【0020】
［ＥＬＩＳＡ／ＣＬＥＩＡ］
本開示に係る分析方法において、ＥＬＩＳＡ又はＣＬＥＩＡを行う場合、固相に固定する捕捉抗体としては、一又は複数の実施形態において、モノクローナル抗体ＡでもよくＢでもよい。感度を向上させる点から、捕捉抗体としてモノクローナル抗体Ｂを使用し、検出抗体としてモノクローナル抗体Ａを使用することが好ましい。
検出抗体は、適宜、ビオチン化など検出のための修飾がほどこされてもよい。
検出は、限定されない一又は複数の実施形態において、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とその基質（発色剤）である３，３’，５，５’－テトラメチルベンチジン（ＴＭＢ）を用いる系が挙げられ、あるいは、アルカリフォスターゼ（ＡＰ）とその基質（発色剤）を用いる系が挙げられる。
本開示に係る分析方法において、ＥＬＩＳＡ又はＣＬＥＩＡを行う場合、固相に固定する捕捉抗体としては、一又は複数の実施形態において、モノクローナル抗体ＡでもよくＢでもよい。感度を向上させる点から、捕捉抗体としてモノクローナル抗体Ｂを使用し、検出抗体としてモノクローナル抗体Ａを使用することが好ましい。
検出抗体は、適宜、ビオチン化など検出のための修飾がほどこされてもよい。
検出は、限定されない一又は複数の実施形態において、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とその基質（発色剤）である３，３’，５，５’－テトラメチルベンチジン（ＴＭＢ）を用いる系が挙げられ、あるいは、アルカリフォスターゼ（ＡＰ）とその基質（発色剤）を用いる系が挙げられる。
【0021】
本開示に係る分析方法の試料としては、ヒトガレクチン－３が含まれうる試料があげられ、一又は複数の実施形態において、生体試料、血液試料、血清試料、その他の体液試料が挙げられる。
【0022】
本開示において、ヒトガレクチン－３の分析方法とは、ガレクチン－３の検出又は濃度測定をすることを含む。
【0023】
本開示に係る分析方法は、一又は複数の実施形態において、高い感度が求められる早産／低体重児出産のリスク判定方法（特許文献３）において、利用されうる。
【0024】
［キット・第１の形態］
本開示は、一態様において、モノクローナル抗体Ａ及びモノクローナル抗体Ｂを備える、ヒトガレクチン－３の免疫学的分析方法を行うためのキットに関する。
モノクローナル抗体Ａ及びモノクローナル抗体Ｂについては、上述のとおりである。
本態様に係るキットは、さらに、ヒトガレクチン－３の標準物質、及び、免疫学的分析方法に必要な試薬を含みうる。
本態様に係るキットとしては、一又は複数の実施形態において、モノクローナル抗体Ａ及びモノクローナル抗体Ｂを備える、ヒトガレクチン－３のＥＬＩＳＡキット又はＣＬＥＩＡキットが挙げられる。本態様に係るキットとしては、その他の一又は複数の実施形態において、モノクローナル抗体Ａ及びモノクローナル抗体Ｂを備える、ヒトガレクチン－３のイムノクロマトキットが挙げられる。
本開示は、一態様において、モノクローナル抗体Ａ及びモノクローナル抗体Ｂを備える、ヒトガレクチン－３の免疫学的分析方法を行うためのキットに関する。
モノクローナル抗体Ａ及びモノクローナル抗体Ｂについては、上述のとおりである。
本態様に係るキットは、さらに、ヒトガレクチン－３の標準物質、及び、免疫学的分析方法に必要な試薬を含みうる。
本態様に係るキットとしては、一又は複数の実施形態において、モノクローナル抗体Ａ及びモノクローナル抗体Ｂを備える、ヒトガレクチン－３のＥＬＩＳＡキット又はＣＬＥＩＡキットが挙げられる。本態様に係るキットとしては、その他の一又は複数の実施形態において、モノクローナル抗体Ａ及びモノクローナル抗体Ｂを備える、ヒトガレクチン－３のイムノクロマトキットが挙げられる。
【0025】
［キット・第２の形態］
本開示は、一態様において、ヒトガレクチン－３のＹＰＧＡＰＡＰＧＶＹＰ（配列番号１）のアミノ酸配列に存在する線状エピトープを認識し、アイソタイプＩｇＧ１であり、軽鎖定常領域がラムダ鎖であるモノクローナル抗体、又は該抗体に由来する小型抗体若しくは抗体断片を備える、ヒトガレクチン－３の免疫学的分析方法を行うためのキットに関する。
本態様に係るキットは、さらに、ヒトガレクチン－３の標準物質、及び、免疫学的分析方法に必要な試薬を含みうる。
本態様に係るキットとしては、上述の第１の形態のキットと重複する部分があるが、より限定された形態のモノクローナル抗体Ａを含み、モノクローナル抗体Ｂを含まなくてもよい点で相違する。
本態様に係るキットとしては、サンドイッチ法以外のＥＬＩＳＡキット、その他の免役測定方法に用いるキットが挙げられる。
本開示は、一態様において、ヒトガレクチン－３のＹＰＧＡＰＡＰＧＶＹＰ（配列番号１）のアミノ酸配列に存在する線状エピトープを認識し、アイソタイプＩｇＧ１であり、軽鎖定常領域がラムダ鎖であるモノクローナル抗体、又は該抗体に由来する小型抗体若しくは抗体断片を備える、ヒトガレクチン－３の免疫学的分析方法を行うためのキットに関する。
本態様に係るキットは、さらに、ヒトガレクチン－３の標準物質、及び、免疫学的分析方法に必要な試薬を含みうる。
本態様に係るキットとしては、上述の第１の形態のキットと重複する部分があるが、より限定された形態のモノクローナル抗体Ａを含み、モノクローナル抗体Ｂを含まなくてもよい点で相違する。
本態様に係るキットとしては、サンドイッチ法以外のＥＬＩＳＡキット、その他の免役測定方法に用いるキットが挙げられる。
【0026】
本開示は以下の限定されない一又は複数の実施形態に関しうる。
〔１〕 試料中のヒトガレクチン－３の免疫学的分析方法であって、
ヒトガレクチン－３のＹＰＧＡＰＡＰＧＶＹＰ（配列番号１）からなるアミノ酸配列Ａに存在する線状エピトープＡを認識するモノクローナル抗体Ａと、
ヒトガレクチン－３の糖鎖認識ドメイン（ＣＲＤ）よりもＮ末端側に位置し、かつ、エピトープＡとは異なるエピトープＢを認識するモノクローナル抗体Ｂとを用いて、
ヒトガレクチン－３を検出又は濃度測定することを含む、方法。
〔２〕 エピトープＢが、Ｎ末端から１００アミノ酸残基の間の領域である、〔１〕に記載の方法。
〔３〕 エピトープＢが、ＹＰＧＱＡＰＰＧＡＹＰＧＱＡＰＰＧＡ（配列番号２）からなるアミノ酸配列Ｂに存在する、〔１〕又は〔２〕に記載の方法。
〔４〕 モノクローナル抗体Ｂが、ラット抗ガレクチン－３モノクローナル抗体Ｍ３／３８である、〔１〕から〔３〕のいずれかに記載の方法。
〔５〕 免疫学的分析方法が、ＥＬＩＳＡ（エライザ）又はＣＬＥＩＡ（クレイア）である、〔１〕から〔４〕のいずれかに記載の方法。
〔６〕 モノクローナル抗体Ａが、アイソタイプＩｇＧ１であり、軽鎖定常領域がラムダ鎖である、〔１〕から〔５〕のいずれかに記載の方法。
〔７〕 モノクローナル抗体Ａが、ハイブリドーマ１－７－Ｈ－１（受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－０３０９９）から産生される抗体又は該抗体に由来する小型抗体若しくは抗体断片である、〔１〕から〔６〕のいずれかに記載の方法。
〔８〕 〔１〕から〔７〕のいずれかに記載のガレクチン－３の免疫学的分析方法を行うためのキットであって、モノクローナル抗体Ａ及びモノクローナル抗体Ｂを備えるキット。
〔９〕 ヒトガレクチン－３のＹＰＧＡＰＡＰＧＶＹＰ（配列番号１）からなるアミノ酸配列Ａに存在する線状エピトープを認識し、アイソタイプＩｇＧ１であり、軽鎖定常領域がラムダ鎖であるモノクローナル抗体、又は該抗体に由来する小型抗体若しくは抗体断片。
〔１０〕 ハイブリドーマ１－７－Ｈ－１（受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－０３０９９）から産生される抗ガレクチン－３モノクローナル抗体又は該抗体に由来する小型抗体若しくは抗体断片。
〔１１〕 ハイブリドーマ１－７－Ｈ－１（受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－０３０９９）。
〔１２〕 〔９〕又は〔１０〕に記載の抗ガレクチン－３モノクローナル抗体又は該抗体に由来する小型抗体若しくは抗体断片を備える、ガレクチン－３の免疫学的分析方法を行うためのキット。
〔１〕 試料中のヒトガレクチン－３の免疫学的分析方法であって、
ヒトガレクチン－３のＹＰＧＡＰＡＰＧＶＹＰ（配列番号１）からなるアミノ酸配列Ａに存在する線状エピトープＡを認識するモノクローナル抗体Ａと、
ヒトガレクチン－３の糖鎖認識ドメイン（ＣＲＤ）よりもＮ末端側に位置し、かつ、エピトープＡとは異なるエピトープＢを認識するモノクローナル抗体Ｂとを用いて、
ヒトガレクチン－３を検出又は濃度測定することを含む、方法。
〔２〕 エピトープＢが、Ｎ末端から１００アミノ酸残基の間の領域である、〔１〕に記載の方法。
〔３〕 エピトープＢが、ＹＰＧＱＡＰＰＧＡＹＰＧＱＡＰＰＧＡ（配列番号２）からなるアミノ酸配列Ｂに存在する、〔１〕又は〔２〕に記載の方法。
〔４〕 モノクローナル抗体Ｂが、ラット抗ガレクチン－３モノクローナル抗体Ｍ３／３８である、〔１〕から〔３〕のいずれかに記載の方法。
〔５〕 免疫学的分析方法が、ＥＬＩＳＡ（エライザ）又はＣＬＥＩＡ（クレイア）である、〔１〕から〔４〕のいずれかに記載の方法。
〔６〕 モノクローナル抗体Ａが、アイソタイプＩｇＧ１であり、軽鎖定常領域がラムダ鎖である、〔１〕から〔５〕のいずれかに記載の方法。
〔７〕 モノクローナル抗体Ａが、ハイブリドーマ１－７－Ｈ－１（受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－０３０９９）から産生される抗体又は該抗体に由来する小型抗体若しくは抗体断片である、〔１〕から〔６〕のいずれかに記載の方法。
〔８〕 〔１〕から〔７〕のいずれかに記載のガレクチン－３の免疫学的分析方法を行うためのキットであって、モノクローナル抗体Ａ及びモノクローナル抗体Ｂを備えるキット。
〔９〕 ヒトガレクチン－３のＹＰＧＡＰＡＰＧＶＹＰ（配列番号１）からなるアミノ酸配列Ａに存在する線状エピトープを認識し、アイソタイプＩｇＧ１であり、軽鎖定常領域がラムダ鎖であるモノクローナル抗体、又は該抗体に由来する小型抗体若しくは抗体断片。
〔１０〕 ハイブリドーマ１－７－Ｈ－１（受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－０３０９９）から産生される抗ガレクチン－３モノクローナル抗体又は該抗体に由来する小型抗体若しくは抗体断片。
〔１１〕 ハイブリドーマ１－７－Ｈ－１（受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－０３０９９）。
〔１２〕 〔９〕又は〔１０〕に記載の抗ガレクチン－３モノクローナル抗体又は該抗体に由来する小型抗体若しくは抗体断片を備える、ガレクチン－３の免疫学的分析方法を行うためのキット。
【0027】
以下、実施例により本開示をさらに詳細に説明するが、これらは例示的なものであって、本開示はこれら実施例に制限されるものではない。
【実施例】
【0028】
ヒトガレクチン－３（ｈＧａｌ３）特異的モノクローナル抗体の取得
１）ヒトガレクチン－３（ｈＧａｌ３）をコードするｃＤＮＡ（７８０ｂｐ）をｐＥＴ２１ａ（＋）ベクターのＮｄｅＩ／ＸｈｏＩに挿入し、ニッケルカラム精製用に６残基のヒスチジンをＣ末端に付加した。
２）このベクターをＢＬ２１大腸菌にヒートショック法で形質転換した。
３）小スケール（２ｍｌ）系でＩＰＴＧ添加によりＧａｌ３のタンパク質発現誘導が出来ていることを確認後、大スケール（１．５Ｌ）で抗原を調製した。
４）調製できたｈＧａｌ３抗原溶液を、等量の完全フロイントアジュバントと混合することでエマルジョンを作製し、Ｂａｌｂ／ｃマウス（メス、８週齢）腹腔内に約１００ｕｇ投与した（初回免疫）。
５）２週間後に、ｈＧａｌ３抗原溶液を、等量の不完全フロイントアジュバントと混合し、腹腔内に約１００ｕｇ投与した。この作業を２週間おきに更に３回実施した。
６）免疫マウスから採血後に血清を分離し、ｈＧａｌ３特異的ポリクロが検出されるか検討した。免疫抗原にはＨｉｓタグが付加されていることから、ポリクロ中にＨｉｓタグに対する抗体も含まれていることが推察される。これを排除する目的で、ｈＧａｌ３－ＧＳＴ融合タンパク（ｐＧＥＸ－４Ｔ－１）を使用してＥＬＩＳＡによるタイターチェックを行った。具体的には、ｈＧａｌ３－ＧＳＴ融合タンパクを９６ｗｅｌｌプレートに１ｕｇ／ｍｌで固相化→３％ＢＳＡでブロッキング→血清添加→抗マウスＩｇＧ 西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）添加→３，３’，５，５’－テトラメチルベンチジン（ＴＭＢ）で発色、という作業フローで行った。
７）Ｇａｌ３ポリクロタイターが十分と判断されたマウスから脾臓を取り出し、不死化の目的でＳＰ２／０ミエローマ細胞とＰＥＧ１５４０で融合させた。融合細胞を９６ｗｅｌｌプレートに播種し、播種の翌日にＨＡＴを添加することで脾臓細胞とＳＰ２／０が融合した細胞のみが生き残る系とした。
８）培養から約１０日後、ハイブリドーマコロニーを形成しているｗｅｌｌの細胞上清を使用してスクリーニングを実施した。実施内容は６）参照。このスクリーニングにおいて、１つの陽性ｗｅｌｌが出現した（１－７－Ｈ）。
９）陽性ハイブリドーマを拡大培養すると共に、リクローニング作業を実施した。具体的にはメチルセルロースＨＡＴ選択培地に各ハイブリドーマを添加し、数日後に目視でシングルコロニー化しているコロニーをピックアップして９６ｗｅｌｌに移した。それから２日後に細胞上清を利用してＥＬＩＳＡ法で特異性を確認した。
１０）最終的に１－７－Ｈ－１がＧａｌ３特異的ハイブリドーマとして樹立された。
以下に重鎖・軽鎖種類を示す。
１）ヒトガレクチン－３（ｈＧａｌ３）をコードするｃＤＮＡ（７８０ｂｐ）をｐＥＴ２１ａ（＋）ベクターのＮｄｅＩ／ＸｈｏＩに挿入し、ニッケルカラム精製用に６残基のヒスチジンをＣ末端に付加した。
２）このベクターをＢＬ２１大腸菌にヒートショック法で形質転換した。
３）小スケール（２ｍｌ）系でＩＰＴＧ添加によりＧａｌ３のタンパク質発現誘導が出来ていることを確認後、大スケール（１．５Ｌ）で抗原を調製した。
４）調製できたｈＧａｌ３抗原溶液を、等量の完全フロイントアジュバントと混合することでエマルジョンを作製し、Ｂａｌｂ／ｃマウス（メス、８週齢）腹腔内に約１００ｕｇ投与した（初回免疫）。
５）２週間後に、ｈＧａｌ３抗原溶液を、等量の不完全フロイントアジュバントと混合し、腹腔内に約１００ｕｇ投与した。この作業を２週間おきに更に３回実施した。
６）免疫マウスから採血後に血清を分離し、ｈＧａｌ３特異的ポリクロが検出されるか検討した。免疫抗原にはＨｉｓタグが付加されていることから、ポリクロ中にＨｉｓタグに対する抗体も含まれていることが推察される。これを排除する目的で、ｈＧａｌ３－ＧＳＴ融合タンパク（ｐＧＥＸ－４Ｔ－１）を使用してＥＬＩＳＡによるタイターチェックを行った。具体的には、ｈＧａｌ３－ＧＳＴ融合タンパクを９６ｗｅｌｌプレートに１ｕｇ／ｍｌで固相化→３％ＢＳＡでブロッキング→血清添加→抗マウスＩｇＧ 西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）添加→３，３’，５，５’－テトラメチルベンチジン（ＴＭＢ）で発色、という作業フローで行った。
７）Ｇａｌ３ポリクロタイターが十分と判断されたマウスから脾臓を取り出し、不死化の目的でＳＰ２／０ミエローマ細胞とＰＥＧ１５４０で融合させた。融合細胞を９６ｗｅｌｌプレートに播種し、播種の翌日にＨＡＴを添加することで脾臓細胞とＳＰ２／０が融合した細胞のみが生き残る系とした。
８）培養から約１０日後、ハイブリドーマコロニーを形成しているｗｅｌｌの細胞上清を使用してスクリーニングを実施した。実施内容は６）参照。このスクリーニングにおいて、１つの陽性ｗｅｌｌが出現した（１－７－Ｈ）。
９）陽性ハイブリドーマを拡大培養すると共に、リクローニング作業を実施した。具体的にはメチルセルロースＨＡＴ選択培地に各ハイブリドーマを添加し、数日後に目視でシングルコロニー化しているコロニーをピックアップして９６ｗｅｌｌに移した。それから２日後に細胞上清を利用してＥＬＩＳＡ法で特異性を確認した。
１０）最終的に１－７－Ｈ－１がＧａｌ３特異的ハイブリドーマとして樹立された。
以下に重鎖・軽鎖種類を示す。
【0029】
【表1】
【0030】
エピトープ解析
ｈＧａｌ３の糖鎖認識ドメイン（ＣＲＤ）と、取得したハイブリドーマ１－７－Ｈ－１が産生するモノクローナル抗体（１－７－Ｈ－１抗体）とが反応するか検討した。具体的には、ＥＬＩＳＡプレートにＣＲＤ部分タンパク（１３０ａａ）を固相化し、ブロッキング後に１－７－Ｈ－１抗体を反応させた。最終検出はＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧで行った。その結果、１－７－Ｈ－１抗体はＣＲＤとは反応しなかった。よって、１－７－Ｈ－１抗体はｈＧａｌ３の中でもＣＲＤ以外を認識していることが判明した。
更に、１－７－Ｈ－１に関して、独ＰＥＰｐｅｒＰＲＩＮＴ社のＰＥＰｐｅｒＭＡＰ Ｌｉｎｅａｒ Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ法にて、エピトープ解析を実施した。その結果、１－７－Ｈ－１抗体は、ｈＧａｌ３のアミノ酸配列のＮ末端から７０番目から８０番目に該当する配列（ＹＰＧＡＰＡＰＧＶＹＰ（配列番号１））に含まれる線状エピトープを認識していることが判明した。
ハイブリドーマ１－７－Ｈ－１は、日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８ １２２号室（郵便番号２９２－０８１８）の独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに寄託した（受託日：２０１９年１２月２６日、受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－０３０９９）。
ｈＧａｌ３の糖鎖認識ドメイン（ＣＲＤ）と、取得したハイブリドーマ１－７－Ｈ－１が産生するモノクローナル抗体（１－７－Ｈ－１抗体）とが反応するか検討した。具体的には、ＥＬＩＳＡプレートにＣＲＤ部分タンパク（１３０ａａ）を固相化し、ブロッキング後に１－７－Ｈ－１抗体を反応させた。最終検出はＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧで行った。その結果、１－７－Ｈ－１抗体はＣＲＤとは反応しなかった。よって、１－７－Ｈ－１抗体はｈＧａｌ３の中でもＣＲＤ以外を認識していることが判明した。
更に、１－７－Ｈ－１に関して、独ＰＥＰｐｅｒＰＲＩＮＴ社のＰＥＰｐｅｒＭＡＰ Ｌｉｎｅａｒ Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ法にて、エピトープ解析を実施した。その結果、１－７－Ｈ－１抗体は、ｈＧａｌ３のアミノ酸配列のＮ末端から７０番目から８０番目に該当する配列（ＹＰＧＡＰＡＰＧＶＹＰ（配列番号１））に含まれる線状エピトープを認識していることが判明した。
ハイブリドーマ１－７－Ｈ－１は、日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８ １２２号室（郵便番号２９２－０８１８）の独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに寄託した（受託日：２０１９年１２月２６日、受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－０３０９９）。
【0031】
公知の抗ｈＧａｌ３モノクローナル抗体とエピトープを比較すると下記の表のようになる。
【表2】
【0032】
ｈＧａｌ３抗体を用いたＥＬＩＳＡ診断キットとの比較
捕捉抗体×検出抗体の組み合わせとして、Ｍ３／３８×１－７－Ｈ－１の組み合わせを使用するｈＧａｌ３ＥＬＩＳＡ系を構築した（以下、１－７－Ｈ－１ＥＬＩＳＡ系という）。
このＥＬＩＳＡ系と、捕捉抗体×検出抗体の組み合わせとしてＭ３／３８×８７Ｂ５を使用するｈＧａｌ３測定診断ＥＬＩＳＡキット（ＢＧＭ社製、以下、市販ＥＬＩＳＡ系という）との反応性の相関を確認した。
検体は外部購入の妊婦血清検体、及び慢性心疾患（ＣＨＦ）検体であり、計40検体を使用した。
この２つのＥＬＩＳＡ系の測定結果を相関プロットで示した（図１）。
捕捉抗体×検出抗体の組み合わせとして、Ｍ３／３８×１－７－Ｈ－１の組み合わせを使用するｈＧａｌ３ＥＬＩＳＡ系を構築した（以下、１－７－Ｈ－１ＥＬＩＳＡ系という）。
このＥＬＩＳＡ系と、捕捉抗体×検出抗体の組み合わせとしてＭ３／３８×８７Ｂ５を使用するｈＧａｌ３測定診断ＥＬＩＳＡキット（ＢＧＭ社製、以下、市販ＥＬＩＳＡ系という）との反応性の相関を確認した。
検体は外部購入の妊婦血清検体、及び慢性心疾患（ＣＨＦ）検体であり、計40検体を使用した。
この２つのＥＬＩＳＡ系の測定結果を相関プロットで示した（図１）。
【0033】
図１は、縦軸がＭ３／３８×１－７－Ｈ－１のＥＬＩＳＡ系で測定されたＯＤ４５０ｎｍの吸光度であり、横軸が市販ＥＬＩＳＡ系で測定されたｈＧａｌ３の濃度（ｎｇ／ｍｌ）である、相関プロットである。
図１に示されるように、１－７－Ｈ－１ＥＬＩＳＡ系と、市販ＥＬＩＳＡ系とは、高い相関を示し、その相関係数は、０．９９４であった。よって、本開示に係る方法は、市販のキットと同等の信頼性があることが確認された。
図１に示されるように、１－７－Ｈ－１ＥＬＩＳＡ系と、市販ＥＬＩＳＡ系とは、高い相関を示し、その相関係数は、０．９９４であった。よって、本開示に係る方法は、市販のキットと同等の信頼性があることが確認された。
【0034】
測定感度の比較
１－７－Ｈ－１ＥＬＩＳＡ系と、市販ＥＬＩＳＡ系とで、以下の手順で測定感度の比較をした。
１）９６ｗｅｌｌ ＥＬＩＳＡプレートにＭ３／３８抗体を固相化してブロッキングする。
２）凍結保管されていた検体（早産、或いは正期産妊婦由来の血清検体、市販品）を融解し、プレートに添加。
３）ＨＲＰ標識１－７－Ｈ－１抗体又は８７Ｂ５抗体添加し、さらに、ＴＭＢ及び硫酸添加後にＯＤ４５０を測定する。
得られた１－７－Ｈ－１ＥＬＩＳＡ系の吸光度を、市販ＥＬＩＳＡ系の吸光度で割った値を図２に示す。
１－７－Ｈ－１ＥＬＩＳＡ系と、市販ＥＬＩＳＡ系とで、以下の手順で測定感度の比較をした。
１）９６ｗｅｌｌ ＥＬＩＳＡプレートにＭ３／３８抗体を固相化してブロッキングする。
２）凍結保管されていた検体（早産、或いは正期産妊婦由来の血清検体、市販品）を融解し、プレートに添加。
３）ＨＲＰ標識１－７－Ｈ－１抗体又は８７Ｂ５抗体添加し、さらに、ＴＭＢ及び硫酸添加後にＯＤ４５０を測定する。
得られた１－７－Ｈ－１ＥＬＩＳＡ系の吸光度を、市販ＥＬＩＳＡ系の吸光度で割った値を図２に示す。
【0035】
【0036】
測定感度の比較２
検体による検討に加え、最小検出感度の検討を実施した。
抗原は大腸菌内でｈＧａｌ３全長タンパクを誘導したものであり、Ｈｉｓタグを付加してあるものである（ｒｈＧａｌ３， Ｃａｔ： Ｐ７３４－１， ＢＢＩ社製）。この抗原を段階的に希釈し、各濃度における市販ＥＬＩＳＡ系、及び、１－７－Ｈ－１ＥＬＩＳＡ系による測定を実施した。
手法は前記「測定感度の比較」に記載される方法と同様であるが、検体が表３に記載される各濃度のｒｈＧａｌ３となっている。各検体濃度における吸光度を表３に示す。
表３中の「－」は測定吸光度が飽和していることを示す。また、各手法によるＬＯＢ（ブランク限界）、ＬＯＤ（検出限界）を表４に示した。
なお、ＬＯＢ・ＬＯＤは以下の定義としている。
ＬＯＢ＝ブランクの平均＋１．６４５×ブランクの標準偏差
ＬＯＤ＝ＬＯＢ＋１．６４５×低濃度サンプルの標準偏差
検体による検討に加え、最小検出感度の検討を実施した。
抗原は大腸菌内でｈＧａｌ３全長タンパクを誘導したものであり、Ｈｉｓタグを付加してあるものである（ｒｈＧａｌ３， Ｃａｔ： Ｐ７３４－１， ＢＢＩ社製）。この抗原を段階的に希釈し、各濃度における市販ＥＬＩＳＡ系、及び、１－７－Ｈ－１ＥＬＩＳＡ系による測定を実施した。
手法は前記「測定感度の比較」に記載される方法と同様であるが、検体が表３に記載される各濃度のｒｈＧａｌ３となっている。各検体濃度における吸光度を表３に示す。
表３中の「－」は測定吸光度が飽和していることを示す。また、各手法によるＬＯＢ（ブランク限界）、ＬＯＤ（検出限界）を表４に示した。
なお、ＬＯＢ・ＬＯＤは以下の定義としている。
ＬＯＢ＝ブランクの平均＋１．６４５×ブランクの標準偏差
ＬＯＤ＝ＬＯＢ＋１．６４５×低濃度サンプルの標準偏差
【0037】
【表3】
【0038】
【表4】
【0039】
表４の値から、０．１５５÷０．０９７＝１．６となり、１－７－Ｈ－１ＥＬＩＳＡ系の組合せは、市販ＥＬＩＳＡ系と比較して最小検出感度が１．６倍高いことが判明した。
【図1】
【図2】
【配列表】