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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-01-18
(45)【発行日】2024-01-26
(54)【発明の名称】外来抗原レセプター遺伝子導入細胞の製造方法
(51)【国際特許分類】
C12N 5/10 20060101AFI20240119BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20240119BHJP
A61K 35/545 20150101ALI20240119BHJP
A61P 37/08 20060101ALI20240119BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240119BHJP
A61P 31/00 20060101ALI20240119BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20240119BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20240119BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20240119BHJP
C12N 15/13 20060101ALN20240119BHJP
C12N 15/62 20060101ALN20240119BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20240119BHJP
【ＦＩ】
C12N5/10
A61K35/17
A61K35/545
A61P37/08
A61P35/00
A61P31/00
A61P37/06
A61K48/00
C12N15/12 ZNA
C12N15/13
C12N15/62 Z
C12N15/09 100
【請求項の数】
24
(21)【出願番号】P 2020532522
(86)(22)【出願日】2019-07-26
(86)【国際出願番号】 JP2019029537
(87)【国際公開番号】W WO2020022512
(87)【国際公開日】2020-01-30
【審査請求日】2022-07-22
(31)【優先権主張番号】P 2018140523
(32)【優先日】2018-07-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成３０年度、国立研究開発法人日本医療研究開発機構、次世代がん医療創生研究事業、「異分野先端技術融合による薬剤抵抗性を標的とした革新的複合治療戦略の開発」委託研究開発、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願
(73)【特許権者】
【識別番号】504132272
【氏名又は名称】国立大学法人京都大学
(73)【特許権者】
【識別番号】504177284
【氏名又は名称】国立大学法人滋賀医科大学
(74)【代理人】
【識別番号】100101454
【弁理士】
【氏名又は名称】山田 卓二
(74)【代理人】
【識別番号】100106518
【弁理士】
【氏名又は名称】松谷 道子
(74)【代理人】
【識別番号】100138911
【弁理士】
【氏名又は名称】櫻井 陽子
(72)【発明者】
【氏名】河本 宏
(72)【発明者】
【氏名】縣 保年
(72)【発明者】
【氏名】永野 誠治
(72)【発明者】
【氏名】寺田 晃士
(72)【発明者】
【氏名】増田 喬子
【審査官】松井 一泰
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１７／０７９６７３（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１７／１８０９８９（ＷＯ，Ａ２）
【文献】特表２０１４－５３２４１３（ＪＰ，Ａ）
【文献】中国特許出願公開第１０５３１６３６２（ＣＮ，Ａ）
【文献】特表２００５－５０５２３６（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００－ １５／９０
Ｃ１２Ｎ １／００－ ７／０８
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
T細胞受容体（ＴＣＲ）の再構成が生じていない材料細胞へ、ＴＣＲ遺伝子座のＶ領域のプロモーターとＴＣＲ遺伝子座のＣ領域のエンハンサーが、その間に挟まれる遺伝子の発現制御機能を発揮する距離となるよう外来の再構成済みＴＣＲまたはＣＡＲ遺伝子を導入する工程を含む、抗原レセプター遺伝子が導入された細胞の製造方法。
【請求項2】
（１）Ｔ細胞受容体の再構成が生じていない材料細胞ゲノムのＴＣＲ遺伝子座を、上流から順にＴＣＲ遺伝子座Ｖ領域のプロモーター配列、
薬剤耐性遺伝子あるいはレポーター遺伝子もしくは既知再構成済みＴＣＲまたはＣＡＲ遺伝子、
ＴＣＲ遺伝子座Ｃ領域のエンハンサー配列
を含み、かつ前記ＴＣＲ遺伝子座のＶ領域のプロモーターとＴＣＲ遺伝子座のＣ領域のエンハンサーが、その間に挟まれる遺伝子の発現制御機能を発揮する距離となるよう改変して外来抗原レセプター遺伝子を導入するための材料細胞を提供する工程、
（２）前記薬剤耐性遺伝子あるいはレポーター遺伝子もしくは既知再構成済みＴＣＲまたはＣＡＲ遺伝子を、外来の再構成済みＴＣＲまたはＣＡＲ遺伝子と交換する工程
を含む、請求項１記載の方法。
【請求項3】
前記ＴＣＲ遺伝子座のＶ領域のプロモーターとＴＣＲ遺伝子座のＣ領域のエンハンサーの間の距離が８～５０ｋｂｐである、請求項１または２記載の方法。
【請求項4】
材料細胞が、多能性幹細胞である、請求項１から３いずれかに記載の方法。
【請求項5】
外来の再構成済みＴＣＲまたはＣＡＲ遺伝子の導入を、Recombinase-mediated Cassette Exchange(RMCE)法あるいはゲノム編集法にて行う、請求項１～4いずれかに記載の方法。
【請求項6】
材料細胞ゲノムのT細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子座に、上流から順にＴＣＲ遺伝子座Ｖ領域のプロモーター配列、
薬剤耐性遺伝子あるいはレポーター遺伝子もしくは既知再構成済みＴＣＲまたはＣＡＲ遺伝子、および
ＴＣＲ遺伝子座Ｃ領域のエンハンサー配列
を有し、前記ＴＣＲ遺伝子座Ｖ領域のプロモーター配列と、薬剤耐性遺伝子あるいはレポーター遺伝子もしくは既知再構成済みＴＣＲまたはＣＡＲ遺伝子の間に、組換え酵素の標的配列（ｉ）を有し、薬剤耐性遺伝子あるいはレポーター遺伝子もしくは既知再構成済みＴＣＲまたはＣＡＲ遺伝子と前記ＴＣＲ遺伝子座Ｃ領域のエンハンサー配列の間に組換え酵素の標的配列（ｉｉ）を有し、前記ＴＣＲ遺伝子座のＶ領域のプロモーターとＴＣＲ遺伝子座のＣ領域のエンハンサーが、その間に挟まれる遺伝子の発現制御機能を発揮する距離にある、外来抗原レセプター遺伝子を導入するための材料細胞。
【請求項7】
既知再構成済みＴＣＲまたはＣＡＲ遺伝子を有している、請求項６記載の外来抗原レセプター遺伝子を導入するための材料細胞。
【請求項8】
材料細胞ゲノムのＴＣＲ遺伝子座に、上流から順にＴＣＲ遺伝子座Ｖ領域のプロモーター配列、第１の組換え酵素の標的配列（ｉ）、材料細胞で発現可能なプロモーター配列、材料細胞で発現可能なプロモーター下で発現するよう連結された第１の薬剤耐性遺伝子、第１の組換え酵素の標的配列（ｉｉ）、第２の薬剤耐性遺伝子、第２の組換え酵素の標的配列、およびＴＣＲ遺伝子座Ｃ領域のエンハンサー配列を有し、前記ＴＣＲ遺伝子座のＶ領域のプロモーターとＴＣＲ遺伝子座のＣ領域のエンハンサーが、その間に挟まれる遺伝子の発現制御機能を発揮する距離にある、外来の抗原レセプター遺伝子を導入するための材料細胞。
【請求項9】
前記ＴＣＲ遺伝子座のＶ領域のプロモーターとＴＣＲ遺伝子座のＣ領域のエンハンサーの間の距離が８～５０ｋｂｐである、請求項６から８いずれかに記載の材料細胞。
【請求項10】
材料細胞ゲノムＴＣＲ遺伝子座が、材料細胞ＴＣＲα鎖またはβ鎖である請求項６～９いずれかに記載の材料細胞。
【請求項11】
材料細胞ゲノムＴＣＲ遺伝子座において、薬剤耐性遺伝子あるいはレポーター遺伝子もしくは既知再構成済みＴＣＲまたはＣＡＲ遺伝子が導入されている遺伝子座以外のＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖が欠損されている、請求項１０記載の材料細胞。
【請求項12】
材料細胞が多能性幹細胞である、請求項６～１１いずれかに記載の材料細胞。
【請求項13】
（ａ）上流から順に、第１の組換え酵素の標的配列（ｉ）、材料細胞で発現可能なプロモーター配列、材料細胞で発現可能なプロモーター配列下で発現するよう連結された第１の薬剤耐性遺伝子、（ｉ）と相違する第１の組換え酵素の標的配列（ｉｉ）、第２の薬剤耐性遺伝子、および第２の組換え酵素の標的配列を含む薬剤耐性遺伝子カセットを含むベクターを準備する工程、（ｂ）材料細胞ゲノムのＴＣＲ遺伝子座へ（ａ）で準備したベクターを、ＴＣＲ遺伝子座のＶ領域のプロモーターとＴＣＲ遺伝子座のＣ領域のエンハンサーが、その間に挟まれる遺伝子の発現制御機能が発揮される距離となるようにノックインする工程、
（ｃ）（ｂ）で得られた細胞を第１の薬剤耐性遺伝子が耐性を有する薬剤の存在下で培養する工程を含む、薬剤耐性遺伝子カセットのノックインに成功した細胞を選択する工程、を含む、請求項８～１２いずれかに記載の材料細胞の製造方法。
【請求項14】
工程（ｂ）において、材料細胞ゲノムの再構成されていないＴＣＲ遺伝子座の１のＶ領域プロモーター配列の下流に、当前記Ｖ領域プロモーター配列より下流にあるＶ領域とＤＪ領域と置換するよう（ａ）で準備したベクターをノックインする、請求項１３記載の方法。
【請求項15】
工程（ａ）のベクターが、さらにＴＣＲ遺伝子座Ｖ領域のプロモーター配列を最上流に有しており、工程（ｂ）において、前記ベクターを材料細胞ゲノムＴＣＲ遺伝子座のＤＪ領域に、前記ベクターに含まれるTCR遺伝子座V領域のプロモーターと、材料細胞のTCR遺伝子座C領域のエンハンサー間が、その間に挟まれる遺伝子の発現制御機能が発揮される距離にとなるようにノックインする、請求項１３記載の方法。
【請求項16】
工程（ａ）のベクターが、さらにＴＣＲ遺伝子座Ｃ領域のエンハンサー配列を最下流に有しており、工程（ｂ）において、当前記ベクターを材料細胞ゲノムＴＣＲ遺伝子座のＶ領域に、前記材料細胞ゲノムのＴＣＲ遺伝子座のＶ領域のプロモーターと、前記ベクターに含まれるＴＣＲ遺伝子座Ｃ領域のエンハンサー間の距離が、その間に挟まれる遺伝子の発現制御機能を発揮する距離となるようにノックインする、請求項１４記載の方法。
【請求項17】
（Ａ）請求項８に記載の材料細胞を準備する工程、（Ｂ）上流から順に第１の組換え酵素の標的配列（ｉ）、外来の再構成済みＴＣＲまたはＣＡＲ遺伝子、第２の組換え酵素の標的配列、材料細胞で発現可能なプロモーター配列、および第１の組換え酵素の標的配列（ｉｉ）を含む、ＴＣＲまたはＣＡＲ遺伝子カセット交換ベクターを準備する工程、
（Ｃ）前記ＴＣＲまたはＣＡＲ遺伝子カセット交換ベクターを前記材料細胞へ導入し、同時に第１の組換え酵素を作用させることによって、ＴＣＲまたはＣＡＲ遺伝子カセットベクターの第１の組換え酵素の標的配列（ｉ）（ｉｉ）に挟まれる配列を、材料細胞中の第１の組換え酵素の標的配列（ｉ）（ｉｉ）に挟まれる第１の薬剤耐性遺伝子と交換(カセット交換）する工程、
（Ｄ）第２の薬剤耐性遺伝子が耐性を有する薬剤にて、カセット交換に成功した細胞を選択する工程、
（Ｅ）第２の組換え酵素を（Ｄ）で選択された細胞に作用させて、第２の組換え酵素の標的配列で挟まれる第２の薬剤耐性遺伝子部分を除去する工程
を含む、外来抗原レセプター遺伝子が導入された細胞の製造方法。
【請求項18】
（１）上流から順に、ＴＣＲ遺伝子座Ｖ領域のプロモーター配列、および第１の組換え酵素の標的配列（ｉ）、材料細胞で発現可能なプロモーター配列、材料細胞で発現可能なプロモーター配列下で発現するよう連結された第１の薬剤耐性遺伝子、（ｉ）と相違する第１の組換え酵素の標的配列（ｉｉ）、第２の薬剤耐性遺伝子、および第２の組換え酵素の標的配列を含む薬剤耐性遺伝子カセットを含むベクターを準備する工程、（２）材料細胞ゲノムのＴＣＲ遺伝子座へ（１）のベクターを、ベクター中のＴＣＲ遺伝子座Ｖ領域のプロモーターと、材料細胞ゲノムのＴＣＲ遺伝子座Ｃ領域のエンハンサー間の距離が、その間に挟まれる遺伝子の発現制御機能を発揮する距離となるようにノックインする工程、
（３）（２）で得られた細胞を第１の薬剤耐性遺伝子が耐性を有する薬剤の存在下で培養する工程を含む、薬剤耐性遺伝子カセットのノックインに成功した細胞を選択する工程、
（４）上流から順に第１の組換え酵素の標的配列（ｉ）、外来の再構成済みＴＣＲまたはＣＡＲ遺伝子、第２の組換え酵素の標的配列、材料細胞で発現可能なプロモーター配列、および第１の組換え酵素の標的配列（ｉｉ）を含む、ＴＣＲまたはＣＡＲ遺伝子カセット交換ベクターを準備する工程、
（５）ＴＣＲまたはＣＡＲ遺伝子カセット交換ベクターを（３）で選択された薬剤耐性カセットがノックインされた材料細胞へ導入し、同時に第１の組換え酵素を作用させることによって、ＴＣＲまたはＣＡＲ遺伝子カセットベクターの第１の組換え酵素の標的配列（ｉ）（ｉｉ）に挟まれる配列を、材料細胞中の第１の組換え酵素の標的配列（ｉ）（ｉｉ）に挟まれる第１の薬剤耐性遺伝子と交換(カセット交換）する工程、
（６）第２の薬剤耐性遺伝子が耐性を有する薬剤にて、カセット交換に成功した細胞を選択する工程、
（７）第２の組換え酵素を（６）で選択された細胞に作用させて、第２の組換え酵素の標的配列で挟まれる第２の薬剤耐性遺伝子部分を除去する工程
を含む、外来の抗原レセプター遺伝子を導入した細胞の製造方法。
【請求項19】
外来の再構成済みＴＣＲまたはＣＡＲ遺伝子が、再構成済ＴＣＲ遺伝子である、請求項１７または１８記載の方法。
【請求項20】
外来の再構成済みＴＣＲ遺伝子が、再構成済ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖の両方を含む、請求項１９記載の方法。
【請求項21】
請求項１７～２０いずれかに記載の方法にて外来の再構成済みＴＣＲまたはＣＡＲ遺伝子が導入された細胞を得、得られた細胞をＴ細胞へと分化誘導する工程を含む、細胞療法用細胞の製造方法。
【請求項22】
請求項８～１２いずれかに記載の外来の抗原レセプター遺伝子を導入するための材料細胞をＴ前駆細胞またはＴ細胞へと分化誘導する工程、外来の再構成済みＴＣＲまたはＣＡＲ遺伝子を、ゲノム編集法あるいはRecombinase-mediated Cassette Exchange(RMCE)法にて前記分化誘導されたＴ前駆細胞またはＴ細胞のゲノムＴＣＲ遺伝子座のＶ領域のプロモーター配列とＣ領域のエンハンサー配列の間に導入する工程を含む、細胞療法用細胞の製造方法。
【請求項23】
請求項８～１２いずれかに記載の外来抗原レセプター遺伝子を導入するための材料細胞をＴ前駆細胞またはＴ細胞へと分化誘導する工程、ゲノム編集法あるいはRecombinase-mediated Cassette Exchange(RMCE)法にて前記分化誘導されたＴ前駆細胞またはＴ細胞の既知再構成済みＴＣＲまたはＣＡＲ遺伝子を外来の再構成済みＴＣＲまたはＣＡＲ遺伝子と入れ替える工程、および既知再構成済みＴＣＲまたはＣＡＲ遺伝子に特異的な抗体またはテトラマーを用いて外来の再構成済みＴＣＲまたはＣＡＲ遺伝子との入れ替えに成功していない細胞を除く工程を含む、細胞療法用細胞の製造方法。
【請求項24】
細胞療法が、外来の再構成済みＴＣＲまたはＣＡＲが特異的に結合する抗原を発現している患者における免疫関連疾患の治療のために行われる、請求項２１～２３いずれかに記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
外来のＴ細胞受容体またはキメラ抗原受容体が導入された細胞を製造するための方法に関する。
【背景技術】
【0002】
疾患に特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）やキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）のような抗原レセプター遺伝子を成熟Ｔ細胞に導入してこれを疾患の治療に用いる方法が提案されている。特にＣＡＲを導入したＣＡＲ－Ｔ細胞を用いる治療法は既に承認され、臨床に用いられている。遺伝子を導入する細胞として患者由来のＴ細胞が用いられており、いわゆる自家移植の系である。遺伝子の導入はレトロウイルスやレンチウイルス用いてゲノム中にランダムに導入されている。かかる方法にて遺伝子を導入する場合、正常遺伝子を傷つける、がん遺伝子を活性化してしまうといったリスクがある。一方でゲノム編集の技術を用いて成熟Ｔ細胞の再構成されたＴＣＲ遺伝子座にＣＡＲ遺伝子をノックインするという方法も論文では報告されている(Nature, 543:113, 2017)。この方法では導入遺伝子は生理的なＴＣＲの発現制御を受けることになり、そのようにして作製されたＣＡＲ－Ｔ細胞はより高機能であると言われている。
【0003】
上記とは異なるアプローチとして、発明者らは多能性幹細胞のレベルでＴＣＲを導入する方法を提案している(特許文献１)。これは多能性幹細胞からＴ細胞を再生して細胞療法に用いようという戦略である。ＣＡＲ遺伝子を多能性幹細胞のレベルでＴＣＲを導入する方法がまた、M. Sadelainにより提案されている(特許文献２および非特許文献１）。
【0004】
現在まで、ＴＣＲ遺伝子であれＣＡＲ遺伝子であれ、Ｔ細胞以外の細胞のＴＣＲ遺伝子座にノックインするという報告は無い。Ｔ細胞以外の細胞のＴＣＲ遺伝子座では遺伝子再構成が起こらない。すなわち遺伝子再構成が生じていないＴＣＲ遺伝子座にＴＣＲ遺伝子あるいはＣＡＲ遺伝子をノックインすることについての報告は無い。
【0005】
遺伝子の導入法として、Recombinase-mediated Cassette Exchange（ＲＭＣＥ）法が知られている。これはカセットデッキのように細胞の遺伝子上の特定の部分を外来の配列（カセットテープ）に組換えられる構造を対象細胞にあらかじめ入れておいて、ＣｒｅやＦｌｉｐｐａｓｅといった組換え酵素を使ってカセットテープを交換するように導入するという技術である。Ｔ細胞株に応用したという文献もある（非特許文献２）。しかし、Ｔ細胞遺伝子座にこの仕組みを導入したという例はない。
【0006】
ＴＣＲ遺伝子やＣＡＲ遺伝子は、成熟Ｔ細胞に遺伝子導入するというのが一般的な戦略である。一方、本発明者らの一部は多能性幹細胞のレベルでＴＣＲを導入するという方法を提案している（特許文献３～５）。またＣＡＲ遺伝子を導入する方法についても提案されている。かかる方法において、ＴＣＲやＣＡＲ遺伝子を導入するに際しては、レンチウイルスなどでゲノム中にランダムに導入するという方法が採用されている。しかし、ＴＣＲ遺伝子やＣＡＲ遺伝子は本来のＴＣＲ遺伝子座にノックインした方が生理的な発現パターンが期待できる。実際、成熟Ｔ細胞のすでに再構成済みの遺伝子座にＣＡＲ遺伝子を導入するという報告はある。一般に細胞はＴＣＲ遺伝子座を有している。しかし、Ｔ細胞以外の細胞ではＴＣＲ遺伝子座の遺伝子再構成が生じない。よってＴ細胞以外を細胞療法の材料に使う場合には、ＴＣＲ遺伝子座に外来のＴＣＲ／ＣＡＲ遺伝子を単に導入するだけでは発現しない。また、ＴＣＲ／ＣＡＲ遺伝子は多くの種類が使われるようになると期待されるが、その都度望む領域に正しくノックインするとなると時間とコストの問題が生じる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0007】
【文献】国際公開公報ＷＯ２０１６／０１０１５４
【文献】国際公開公報ＷＯ２０１４／１６５７０７
【文献】国際公開公報ＷＯ２０１６／０１０１５３
【文献】国際公開公報ＷＯ２０１６／０１０１５４
【文献】国際公開公報ＷＯ２０１６／０１０１５５
【非特許文献】
【0008】
【文献】Themeli et al., Nat Biotechnol.（2013）928-33
【文献】Gong Ying et al., Journal of Cell Biology (2015) 1481-1489
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
本願は外来のＴＣＲ遺伝子またはＣＡＲ遺伝子を安定に発現する細胞療法用の細胞を効率よく製造する方法を提供することを目的とする。本願はまた、ＲＭＣＥ法にてＴＣＲ遺伝子またはＣＡＲ遺伝子の「カセット」を導入するために用いられる、空カセットデッキを設定した細胞を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本願は、材料細胞のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）発現制御機構の制御下で発現されるよう、外来のＴＣＲまたはＣＡＲ遺伝子を導入する工程を含む、抗原レセプター遺伝子が導入された細胞の製造方法を提供する。
【0011】
一つの態様において、本願は材料細胞のＴＣＲ遺伝子のＣ領域のエンハンサーと、Ｖ領域のプロモーターの間に、両者の距離を縮めるように、外来のＴＣＲまたはＣＡＲ遺伝子を含む遺伝子を導入する工程を含む、抗原レセプター遺伝子が導入された細胞の製造方法を提供する。
【0012】
別の態様において、材料細胞ＴＣＲ遺伝子座のＣ領域のエンハンサーの上流へ、上流から順に外来のＶ領域のプロモーター、外来のＴＣＲまたはＣＡＲ遺伝子を含む遺伝子を、Ｖ領域のプロモーターとＣ領域のエンハンサーがその間に挟まれる遺伝子の発現制御機能を発揮するために十分近くなるよう導入する工程を含む、抗原レセプター遺伝子が導入された細胞の方法を提供する。
【0013】
更に別の態様において、材料細胞ＴＣＲ遺伝子座のＶ領域のプロモーターの下流へ、上流から順に外来のＴＣＲまたはＣＡＲ遺伝子、および外来のＣ領域のエンハンサーを含む遺伝子を、Ｖ領域のプロモーターとＣ領域のエンハンサーがその間に挟まれる遺伝子の発現制御機能を発揮するために十分近くなるよう導入する工程を含む方法を提供する。
【0014】
本発明はまた、材料細胞ゲノムＴＣＲ遺伝子座に、上流から順にＶ領域のプロモーター、第1の組換え酵素の標的配列に挟まれた第1の薬剤耐性遺伝子、第２の薬剤耐性遺伝子および第２の組換え酵素標的配列、およびＣ領域のエンハンサーを含む、抗原レセプター導入用材料細胞を提供する。
【0015】
本願はさらに、本願の方法により外来の抗原レセプター遺伝子がＴＣＲ遺伝子座に導入された細胞を、Ｔ細胞へと分化誘導する工程を含む、細胞療法用細胞の製造方法を提供する。
【発明の効果】
【0016】
本願の方法により、ＴＣＲやＣＡＲを発現する細胞を用いた細胞療法の材料として使える汎用性の高い細胞を作製することが可能となる。また、抗原レセプター導入用材料細胞には、外来のＴＣＲ遺伝子やＣＡＲ遺伝子を容易に導入することができ、また最終産物においてＴＣＲ／ＣＡＲ遺伝子の安定した発現が保証される。その結果として外来のＴＣＲやＣＡＲを発現する免疫療法用細胞を効率よく、かつ容易に作製することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【0017】
【図1】ＴＣＲαβの模式図およびＴＣＲβ座の遺伝子再構成の模式図を示す。図中、Pはプロモーターを、Eはエンハンサーを示す。V-DJ再構成において、組み替えによりエンハンサーとプロモーターが近づいて、TCRが発現する。
【図2】本願方法のコンセプトを示す図。図中、Pはプロモーターを、Eはエンハンサーを示す。
【図3-1】実施例の薬剤耐性遺伝子カセットベクターの構築手順を示す図。マウスホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）遺伝子のプロモーター（ｐＰＧＫ）を有するｐＢＲＢｌＩＩ－ＡｓｃＩ＿ＦＲＴＰＧＫｐａｃΔｔｋｐＡ＿ＡｓｃＩベクターを用いた。Ｐｒｉｍｅｒ１とＰｒｉｍｅｒ２（Ａ）は、ｐＢＲＭＣ１ＤＴＡｐＡベクター（Ｂ）の制限酵素切断部位の５’側のＤＮＡ配列である配列－１、３’側のＤＮＡ配列である配列－２と同一の配列を、それぞれもつ。得られるＰＣＲ産物はｐＢＲＭＣ１ＤＴＡｐＡベクターの配列－１、配列－２と同一の配列を両端にもつ。Gibson assembly法により、同一配列同士を介してベクターとＰＣＲ産物が結合し、（Ｃ）の構造となる。
【図3-2】ＥのＰＢ－ｆｌｏｘ（ＣＡＧ－ｍＣｈｅｒｒｙ－ＩＨ；ＴＲＥ３Ｇ－ｍｉＲ－１５５－ＬａｃＺａベクター、およびＦのｐＢＲＢｌＩＩ－ＡｓｃＩ＿ＦＲＴＰＧＫｐａｃΔｔｋｐＡ＿ＡｓｃＩベクターそれぞれから、ＰＧＫベクター（Ｄ）制限酵素切断部位の配列－３および配列－４と同一の配列部分をもつＰＣＲ産物を得た。Gibson assembly法により、同一配列を介してＤＮＡ断片同士を連結し、Ｇの薬剤耐性遺伝子カセットベクターを得た（Ｇ）。ＰＣＲ法で得たＤＮＡ断片の配列は、ベクターに連結後に確認した。
【図4】薬剤耐性遺伝子カセットノックイン用ターゲティングベクターの構築のための、５’および３’アームとプロモーターＤＮＡ断片の取得手順を示す図。ヒトＴＣＲβ遺伝子座Ｄβ２領域（Ａ）のＤＮＡ配列をもとに各プライマー（Ｐｒｉｍｅｒ５’－１（１）とＰｒｉｍｅｒ３’－１（２）およびＰｒｉｍｅｒ５’－２（３）とＰｒｉｍｅｒ３’－２（４））を設計し、薬剤耐性遺伝子ノックイン用ターゲティングベクター構築のために５’アームおよび３’アーム（図５）として用いるＤＮＡ断片を、ＰＣＲ法で得た。ヒトＴＣＲβ遺伝子座Ｖ領域（Ｂ、右側）のＤＮＡ配列をもとにプライマー（ＦおよびＲ）を設計し、同様にＶβ２０－１プロモーターＤＮＡ断片を得た。ベクターに連結後にＰＣＲで得たＤＮＡ断片の配列を確認し、その後の手順に用いた。
【図5】ＴＣＲβ遺伝子座Ｄβ２領域へ薬剤耐性遺伝子カセットをノックインするための、薬剤耐性遺伝子ノックイン用ターゲティングベクターの構築の手順を示す図。 薬剤耐性カセットベクター（A）を制限酵素で切断し、３’アームＤＮＡ断片（図４Ａ）をGibson assembly法で切断部位に導入した（B）。同様に、５’アームＤＮＡ断片とＶβ２０－１プロモーターＤＮＡ断片を導入した（C，D）。
【図6】相同組換えによるＪｕｒｋａｔ細胞ＴＣＲβ遺伝子座Ｄβ２領域への薬剤耐性カセットのノックイン手順を示す図。ヒトＴＣＲβ遺伝子座ＤＪ領域（上段）、薬剤耐性遺伝子ノックイン用ターゲティングベクター（ＫＩターゲティングベクター）（中段）および、相同組換え後のＴＣＲβ遺伝子座ＤＪ領域（下段）を模式図で示す。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９nは、２本鎖であるＤＮＡのそれぞれ１本を切断する（ニック）。ニックにより、相同組換えが促進される。相同組換えでは、ＫＩターゲティングベクターの５’アームと３’アーム部分が両アームに挟まれる部分と共に、ＴＣＲβ遺伝子座の中で５’アームと３’アームのそれぞれ対応する部分と入れ替わる。その結果、ＫＩターゲティングベクターの５’アームと３’アームに挟まれる部分のみが材料細胞のゲノムＤＮＡに導入された形になる（下段）。
【図7】ＴＣＲβ－ｐ２Ａ－ＴＣＲαベクター（ＴＣＲドナーベクター）構築手順の概略図。ｐＥＮＴＲ１Ａベクターの制限酵素切断部位の５’側の約１５ｂｐを配列－１、３’側の約１５ｂｐを配列－２とする（Ａ）。Ｐｒｉｍｅｒ１（Ｂ）は、ＴＣＲβの配列の一部と、配列－１と同一の配列、Ｐｒｉｍｅｒ４（Ｃ）は、ＴＣＲαの一部と配列－２と同一の配列をもつ。Ｐｒｉｍｅｒ２（Ｂ）とｐｒｉｍｅｒ３（Ｃ）はそれぞれ、ＴＣＲβの配列の一部とｐ２Ａ配列のほとんど、ＴＣＲαの配列の一部とｐ２Ａ配列の一部をもつ。ｐ２Ａ配列同士は16ｂｐの重なりを持つ（Ｄ）。ベクターとＰＣＲ産物を、Gibson assembly法により互いに重なる部分を介して連結して、ＴＣＲドナーベクターを得た（Ｅ）。ＰＣＲ法で得たＤＮＡ断片の配列は、ベクターに連結後に確認した。Ｐｒｉｍｅｒ２およびｐｒｉｍｅｒ４は、それぞれ、すべてのヒトＴＣＲβおよびＴＣＲαの増幅に使用できる。ａｔｔＬ１およびａｔｔＬ２は、ＴＣＲカセット交換ベクター作製（図８）に利用した。
【図8】カセット交換ベクターの構築におけるベクター骨格の作製手順の概略図。Ｆｒｔ配列とＰＧＫプロモーター配列が連続して位置するｐＢＲＢｌＩＩ－ＡｓｃＩ＿ＦＲＴＰＧＫｐａｃΔｔｋｐＡ＿ＡｓｃＩプラスミドベクターを鋳型に、ｐｒｉｍｅｒ１とｐｒｉｍｅｒ２でＰＣＲ反応を行った（Ａ）。Ｐｒｉｍｅｒ１（Ａ）は、ｆｒｔ配列の一部、制限酵素配列、ｌｏｘ２２７２および、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（－）べクター（Ｂ）の配列－１の部分と同一の配列をもち、ｐｒｉｍｅｒ２は、ＰＧＫプロモーター配列の一部、ｌｏｘＰ配列および、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（－）べクター（Ｂ）の配列－２と同一の配列をもつ。得られたＰＣＲ産物は、図３と同様に、制限酵素で切断したベクター（Ｂ）と、Gibson assembly法で連結した（Ｆｒｔ－ＰＧＫベクター）（Ｃ）。Ｆｒｔ－ＰＧＫベクター（Ｃ）を、ｐｒｉｍｅｒ１の内部に設計してあった制限酵素認識部位で切断し、そこに、制限酵素の切断端と相補的な切断端をもつＤＮＡ１を、ＤＮＡ結合酵素を用いて連結した（Ｅ）。再度、ｐｒｉｍｅｒ１内に設計してあった制限酵素認識部位で切断し、そこに、ＤＮＡ１と同様にＤＮＡ２を連結できる。この過程を複数回繰り返すことにより、ｌｏｘ２２７２配列とｆｒｔ配列との間に、任意のＤＮＡ断片を複数個導入できる。導入は、ＤＮＡ連結反応でもGibson assemblyでも可能である（Ｄ-Ｇ）。
【図9】カセット交換ベクターの構築におけるプレカセット交換ベクターの構築手順の概略図。ＣＳＩＶ－ＴＲＥ－ＲｆＡ－ＣＭＶ－ＫＴベクターから制限酵素ＮｈｅＩとＸｈｏＩによって切り出したａｔｔＲ１－ｃｃｄｂ－ａｔｔＲ２ＤＮＡを含むＲｆＡカセットを、図８Ｄ～図８Ｇの要領で、制限酵素ＮｈｅＩとＸｈｏＩによって切断したＦｔｒ－ＰＧＫべクター（Ａ）にＤＮＡリガーゼによって連結した（Ｂ）。図８Ｄ～図８Ｇの要領でＦｒｔ－ＰＧＫベクター（Ａ）を元に、ａｔｔＲ１－ｃｃｄｂ－ａｔｔＲ２ＤＮＡ断片（Ｂ）、ａｔｔＲ１－ｃｃｄｂ－ａｔｔＲ２ＤＮＡ断片とポリＡ付加配列（Ｄ）、ａｔｔＲ１－ｃｃｄｂ－ａｔｔＲ２ＤＮＡ断片、ポリＡ付加配列およびイントロン（Ｆ）が導入された、プレカセット交換ベクター１～３（Ｂ，Ｄ，Ｆ）を構築した。ポリＡ付加配列は、制限酵素を用いてプラスミドから得た（Ｃ）。イントロン配列は、前後に翻訳開始コドンを含まないエクソン部分をもつように、ＰＣＲ法により得た（Ｅ）。ＰＣＲ法で得たＤＮＡ断片の配列は、ベクターに連結後に確認した。
【図10】ＴＣＲカセット交換ベクターの作製手順の概略図。上段にプレカセット交換ベクター３、中段にＴＣＲドナーベクター、下段にＴＣＲカセット交換ベクターを示す。プレカセット交換ベクターとＴＣＲドナーベクターは、ａｔｔＲ１配列はａｔｔＬ１配列と、ａｔｔＲ２配列はａｔｔＬ２配列と組換えを起こし、それぞれで挟まれる部分が入れ替わる（下段）。ａｔｔＲ１（２）配列はａｔｔＬ１（２）配列との組換えでａｔｔＢ１（２）配列となる。
【図11】薬剤耐性遺伝子カセットとＴＣＲカセットの交換手順の概略図（ＴＣＲカセット交換Ｊｕｒｋａｔ細胞の作製）。相同組換え後のヒトＴＣＲβ遺伝子座ＤＪ領域（上段）、ＴＣＲカセット交換ベクター（中段）および、カセット交換後のヒトＴＣＲβ遺伝子座Ｄβ２領域（下段）を模式図で示す。ＴＣＲカセット交換ベクターとＣｒｅ発現ベクターを薬剤耐性遺伝子ＫＩ－Ｊｕｒｋａｔ細胞に共に導入すると、Ｃｒｅ組換え酵素がｌｏｘ２２７２同士、ｌｏｘＰ同士の組換えを促進する。その結果、ｌｏｘ２２７２配列とｌｏｘＰ配列で挟まれる部分の入れ替えが起こる（カセット交換）。カセット交換後、ピューロマイシン耐性遺伝子の発現が開始される。
【図12】外来性ＴＣＲ発現Ｊｕｒｋａｔ細胞の作製手順の概略図。ＴＣＲカセット交換後の細胞にＦＬＰを発現させた。ＦＬＰの作用によりｆｒｔ配列で挟まれた部分が欠失する。その結果、エンハンサー（Ｅｎｈ）が効率的にプロモーター（Ｖβ２０－１プロモーター）に作用し、下流の遺伝子（ＴＣＲ）が発現する。
【図13】実施例で得られた外来性ＴＣＲ発現Ｊｕｒｋａｔ細胞のＦＡＣＳによるＴＣＲおよびＣＤ３の細胞表面での発現量の解析結果。上段はＪｕｒｋａｔ細胞の野生型（ＷＴ）である。カセット交換後、ＦＬＰの発現のない細胞ではＴＣＲが発現しない（中段）。それに対し、カセット交換後にＦＬＰを発現させた細胞ではＴＣＲの発現が認められたがＴＣＲを発現しない集団の割合が高かった（下段）。
【図14】非ＦＬＰ組換え細胞のガンシクロビルによる除去手順の概略図。ＦＬＰによる組換えが成功した細胞ではガンシクロビルは作用しない（Ａ）。ＦＬＰ組換えが失敗した細胞ではガンシクロビルはｐｕｒｏｒΔＴＫによりリン酸化される。リン酸化されたガンシクロビルは、ＤＮＡ複製を阻害する。その結果、ＦＬＰ組換えに失敗した細胞は、ガンシクロビル存在下では増殖できず、細胞集団から取り除かれる（Ｂ）。
【図15】ＦＡＣＳによるＴＣＲおよびＣＤ３の細胞表面での発現量の解析結果。上段はＪｕｒｋａｔ細胞の野生型（ＷＴ）。カセット交換してＦＬＰの発現のない細胞はＴＣＲが発現しない（中段）。ＦＬＰを発現させた細胞ではＴＣＲの発現が認められ（下段）、ガンシクロビル選択により、図１３と比してＴＣＲを発現しない集団の割合が大幅に減少した。
【図16】(A)ヒトＴＣＲβ領域中のCRISPR/Cas9で切断される部位と、各プライマーの配列部位を示す。(B)薬剤耐性遺伝子ターゲティングベクターの模式図と各プライマーの配列部位を示す。(C)薬剤耐性遺伝子カセットのノックインを確認するための、それぞれのプライマーによるPCR産物の電気泳動写真。
【図17】薬剤耐性遺伝子カセットノックイン用ターゲティングベクターの構築のための、５’および３’アームとプロモーターＤＮＡ断片の取得手順を示す図。ヒトＴＣＲβ遺伝子座Vβ領域（Ａ）およびCβ2領域のＤＮＡ配列をもとに各プライマーを設計し、薬剤耐性遺伝子ノックイン用ターゲティングベクター構築のために５’アームおよび３’アーム（図１8）として用いるＤＮＡ断片を、ＰＣＲ法で得る。ベクターに連結後にＰＣＲで得たＤＮＡ断片の配列を確認し、その後の手順に用いる。
【図18】TCRβ遺伝子座のVβ20-1遺伝子とCβ2遺伝子が連結した領域へ薬剤耐性遺伝子カセットをノックインするための、薬剤耐性遺伝子ノックイン用ターゲティングベクターの構築の手順を示す図。薬剤耐性カセットベクターを制限酵素で切断し、３’アームＤＮＡ断片をGibson assembly法で切断部位に導入する。同様に、５’アームＤＮＡ断片を導入する。その結果、薬剤耐性遺伝子ノックイン用ターゲッティングベクターが得られる。
【図19】相同組換えによる、Ｊｕｒｋａｔ細胞TCRβ遺伝子座Vβ20-1遺伝子とCβ2遺伝子が連結した領域への薬剤耐性カセットのノックイン手順の概略図。V領域とC領域が連結したヒトＴＣＲβ遺伝子座（上段）、薬剤耐性遺伝子ノックイン用ターゲティングベクター（ＫＩターゲティングベクター）（中段）および、相同組換え後のＴＣＲβ遺伝子（下段）を模式図で示す。相同組換えでは、ＫＩターゲティングベクターの５’アームと３’アーム部分が両アームに挟まれる部分と共に、ＴＣＲβ遺伝子座の中で５’アームと３’アームのそれぞれ対応する部分と入れ替わる。その結果、ＫＩターゲティングベクターの５’アームと３’アームに挟まれる部分のみが材料細胞のゲノムＤＮＡに導入された形になる（下段）。
【図20】遺伝子再構成が起きていないヒトＴＣＲβ遺伝子座のＶβ２０－１遺伝子とＣβ２遺伝子間領域の除去を行う実施例３の概略図。上段はＴＣＲβ遺伝子座とＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ｎの標的部位を示す。標的部位は、Ｖβ２０－１遺伝子とＣβ２遺伝子にそれぞれ２箇所ずつ設けた（縦線）。下段は遺伝子間領域が除去された後のＴＣＲβ遺伝子座と連結部位。縦線は、Ｖβ２０－１遺伝子とＣβ２遺伝子の連結部位を示す。
【図21】実施例３の結果を示す。Ｖβ２０－１遺伝子とＣβ２遺伝子間の約１８０ｋｂｐの領域が除去された細胞株を単離した。図２１Ａは遺伝子導入していない細胞群（左）と導入した細胞群（右）のＦＡＣＳ解析の結果。遺伝子導入した細胞群でＥＧＦＰを高発現する細胞群をソーティングで分取した（丸で囲った部分）。図２１Ｂは１８０ｋｂｐの領域が除去された後のＴＣＲβ遺伝子座。矢印でｆｏｒｗａｒｄ、ｒｅｖｅｒｓｅの各プライマーを示す。縦線は、除去後の遺伝子間の連結部位。図２１Ｃは、各クローン細胞のゲノムＤＮＡを用いて行ったＰＣＲ反応物の電気泳動写真。図２１Ｄは、クローン＃１０のＰＣＲ反応物のＤＮＡ配列の一部（配列番号５1）。約１８０ ｋｂｐあった領域が６ｂｐになっている。下線（直線）部分：Ｖβ２０－１側配列、下線（波線）部分：Ｃβ２側配列。両者の間にはもともと約１８０ｋｂｐあったのが、６ｂｐとなった。
【図22】ヒトｉＰＳ細胞ＴＣＲβ遺伝子座Ｄβ２領域への薬剤耐性カセットデッキのノックイン実施例の概略図。
【図23】ｉＰＳ細胞上でのカセットテープ交換実施例の概略図。
【図24】ｉＰＳ細胞上でのカセット交換ＴＣＲ－ｉＰＳ細胞のＰｕｒｏｒΔＴＫ部位の欠損実施例。
【図25】カセット交換ＴＣＲ－ＫＩ－ｉＰＳ細胞からＴ細胞へ分化誘導してＣＴＬを得た。
【図27】Ｊｕｒｋａｔ－ＴＣＲ１細胞のヒトＴＣＲβ遺伝子ＤＪ領域の模式図。
【図28】Ｃｒｅ リコビナーゼによる ＴＣＲ 同士のカセット交換。ＴＣＲ１が組み込まれたＴＣＲβ遺伝子座ＤＪ領域（上段）、ＴＣＲ２カセット交換ベクター（中段）および、カセット交換後のヒトＴＣＲβ遺伝子座Ｄβ２領域（下段）を示す模式図。ＴＣＲ カセット交換ベクターと Ｃｒｅ 発現ベクターをＪｕｒｋａｔ－ＴＣＲ１細胞に共に導入すると、Ｃｒｅ 組換え酵素が ｌｏｘ２２７２ 同士、ｌｏｘＰ 同士の組み換えを促進する。その結果、ｌｏｘ２２７２ と ｌｏｘＰ で挟まれる部分の入れ替えが起こる（カセット交換）。カセット交換が起きた細胞ではＴＣＲ２が組み込まれた状態となる（Ｊｕｒｋａｔ－ＴＣＲ２）。
【図29】Ａ：ＴＣＲ２ （上段）あるいはＴＣＲ１（下段）遺伝子が組み込まれたＴＣＲβ遺伝子座Ｄβ２領域の模式図。ＰＣＲ反応に用いた４種類のプライマーの配置を示す。Ｂ：各プライマーの組み合わせにおけるＰＣＲ反応物の電気泳動による解析。ＰＣＲ１ はＴＣＲ２を導入された Ｊｕｒｋａｔ細胞、ＰＣＲ２はＪｕｒｋａｔ－ＴＣＲ１細胞 、そしてＰＣＲ３はＪｕｒｋａｔ－ＴＣＲ１細胞にＴＣＲ２カセット交換ベクターを導入した細胞の、それぞれのゲノムＤＮＡを用いて行なったＰＣＲ 反応の解析結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【0018】
本明細書および特許請求の範囲においては、数値が「約」の用語を伴う場合、その値の±１0％以内の範囲を含むことを意図する。例えば、「約２０」は、「１８～２２」を含むものとする。数値の範囲は、両端点の間の全ての数値および両端点の数値を含む。範囲に関する「約」は、その範囲の両端点に適用される。従って、例えば、「約２０～３０」は、「１８～３３」を含むものとする。
【0019】
ＴＣＲ遺伝子は、遺伝子再構成によりＶ領域の上流にあるプロモーター（Ｖプロモーター）とＣ領域の下流にあるエンハンサー（Ｃエンハンサー）が近接することによって発現するようになる。ＴＣＲβ遺伝子の再構成と発現の機構の概略を図１に示す。
【0020】
Ｔ細胞の再構成済ＴＣＲを外来の再構成済ＴＣＲ遺伝子またはＣＡＲ遺伝子（以下、まとめてＴＣＲ／ＣＡＲ遺伝子という）に置き換えれば、導入されたＴＣＲ／ＣＡＲ遺伝子はＴＣＲ遺伝子の発現制御機構下で発現される。しかしながら遺伝子再構成の起こっていない細胞のゲノムのＴＣＲ遺伝子座に単にＴＣＲ／ＣＡＲ遺伝子を導入するだけでは、本来のＴＣＲの発現制御機構は働かない。ＴＣＲの発現制御機構は、ＶプロモーターとＣエンハンサーが近づくことによって、初めて機動する。すなわち、本願はＶプロモーターとＣエンハンサーを近づけるような形で外来のＴＣＲ／ＣＡＲ遺伝子をノックインすることによって、材料細胞へ外来の抗原レセプター遺伝子を発現させる方法を提供する。
【0021】
本願において、「抗原レセプター遺伝子」は、ＴＣＲ遺伝子またはＣＡＲ遺伝子を意味する。外来のＴＣＲ遺伝子または外来のＣＡＲ遺伝子としては、特に限定されず、再構成されたＴＣＲ遺伝子として公知のもの、ＣＡＲ遺伝子として公知のものから適宜選択すればよい。または、細胞療法のターゲットとする抗原に対して特異的なＴ細胞からＴＣＲ遺伝子を公知の方法で増幅させて用いてもよいし、ターゲットとする抗原に対するＣＡＲ遺伝子を構築してもよい。
【0022】
「キメラ抗原受容体」あるいは「ＣＡＲ」という語は、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび抗原に結合したときＴ細胞を刺激するのに十分なＣＤ３ζ配列の細胞質配列を含む細胞質シグナル伝達ドメインおよび、所望により、抗原結合ドメインが抗原に結合したとき、Ｔ細胞の共刺激を提供する１以上(例えば、２、３または４)の共刺激性タンパク質の細胞質配列(例えば、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＩＣＯＳ、ＬＦＡ－１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ１６０、ＬＩＧＨＴ、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ３、ＣＤ２４４、ＣＤ８０、ＬＡＧ３、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３およびＣＤ８３に特異的に結合するリガンドの１以上の細胞質配列)を含む。
【0023】
本願においては、図２にその概略を示すようにＴＣＲ遺伝子座の遺伝子再構成が起こっていない、Ｔ細胞への分化誘導が可能な材料細胞に、外来のＴＣＲ／ＣＡＲ遺伝子を導入して、当該材料細胞のＴＣＲ遺伝子発現制御機構下で発現させる方法としては、以下の３種類の方法が挙げられる：
（１）材料細胞のＴＣＲ遺伝子のＣ領域のエンハンサーと、Ｖ領域のプロモーターの間に、両者の距離を縮めるように、外来のＴＣＲ／ＣＡＲ遺伝子を含む遺伝子を導入する（図２－１）。
（１）材料細胞のＴＣＲ遺伝子のＣ領域のエンハンサーと、Ｖ領域のプロモーターの間に、両者の距離を縮めるように、外来のＴＣＲ／ＣＡＲ遺伝子を含む遺伝子を導入する（図２－１）。
【0024】
（２）材料細胞ＴＣＲ遺伝子座のＣ領域のエンハンサーの上流へ、上流から順にＴＣＲ遺伝子座のＶ領域のプロモーター、外来のＴＣＲ／ＣＡＲ遺伝子を含む遺伝子を、Ｖ領域のプロモーターとＣ領域のエンハンサーがその間に挟まれる遺伝子の発現制御機能を発揮するために十分近くなるよう導入する（図２－２）。
【0025】
（３）材料細胞ＴＣＲ遺伝子座のＶ領域のプロモーターの下流へ、上流から順に外来のＴＣＲ／ＣＡＲ遺伝子、およびＴＣＲ遺伝子座のＣ領域のエンハンサーを含む遺伝子を、Ｖ領域のプロモーターとＣ領域のエンハンサーがその間に挟まれる遺伝子の発現制御機能を発揮するために十分近くなるよう導入する（図２－３）。
【0026】
本願において、「Ｖ領域のプロモーターとＣ領域のエンハンサーがその間に挟まれる遺伝子の発現制御機能を発揮するために十分近くなる」とは、Ｖ領域のプロモーターがＣ領域のエンハンサーの制御を受けさえすれば、両者の距離は特に制限されるものではない。外来のＴＣＲ／ＣＡＲ遺伝子を導入した後のＶ領域のプロモーターとＣ領域のエンハンサーの間の距離は例えば約８～５０ｋｂｐ、約１０～４０ｋｂｐ、約１２～３２ｋｂｐ、または約１４～２２ｋｂｐであることが例示される。
【0027】
本願の方法に用いられる材料細胞としてはＴＣＲ遺伝子座の再構成が起こっておらず、かつＴ細胞への分化誘導が可能な細胞が好適に用いられる。「ＴＣＲ遺伝子座の遺伝子再構成が起こっていない、Ｔ細胞への分化誘導が可能な細胞」としては、（１）ＴＣＲ遺伝子座の再構成が起こっていない細胞、（２）Ｔ細胞への分化誘導が可能な細胞、かつ（３）遺伝子改変の際の選択過程に耐え得る細胞であることの３つの要件を満たす必要がある。かかる細胞としては、多能性幹細胞、例えばＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞、並びに白血球幹細胞などが挙げられる。
【0028】
本明細書ならびに請求の範囲において多能性幹細胞とは、生体に存在する多くの細胞に分化可能である多能性を有し、かつ、自己増殖能を併せもつ幹細胞である。多能性幹細胞には、例えば胚性幹（ＥＳ）細胞、核移植により得られるクローン胚由来の胚性幹（ｎｔＥＳ）細胞、精子幹細胞（「ＧＳ細胞」）、胚性生殖細胞（「ＥＧ細胞」）、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、培養線維芽細胞や骨髄幹細胞由来の多能性細胞（Ｍｕｓｅ細胞）などが含まれる。ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞が好適に用いられる。特定のＨＬＡを有するヒト由来の細胞を用いて、治療法の細胞バンクを製造することを考慮すると、ｉＰＳ細胞を用いるのが好ましい。
【0029】
ｉＰＳ細胞としては、いずれの部位の体細胞から誘導されたものであってもよい。体細胞からｉＰＳ細胞を誘導する方法は公知であり、体細胞にヤマナカ因子を導入してｉＰＳ細胞を得ることができる（Takahashi and Yamanaka, Cell 126, 663-673 (2006）, Takahashi et al., Cell 131, 861-872(2007) and Grskovic et al., Nat. Rev. Drug Dscov. 10,915-929(2011)) 。ｉＰＳ細胞を誘導する際に用いる因子はヤマナカ因子に限らず、当業者に公知のいずれの因子、手段を用いてもよい。
【0030】
材料細胞への再構成済ＴＣＲ／ＣＡＲ遺伝子の導入は１回の操作で行っても、多段階で進めても良い。従来公知の組換え技術、例えば相同組換え技術、ゲノム編集技術、ＣｒｅやＦｌｉｐｐａｓｅなどのリコンビナーゼを組み合わせて用いる技術によって行うこともできる。
【0031】
外来のＴＣＲ／ＣＡＲがＴＣＲαとβのヘテロダイマーである場合、材料細胞ゲノム上のＴＣＲ／ＣＡＲ遺伝子を導入するＴＣＲ遺伝子座はＴＣＲαであっても良いし、ＴＣＲβであってもよい。ひとつの遺伝子の発現制御系下で、再構成済のＴＣＲα遺伝子とＴＣＲβ遺伝子の両方を導入してもよい。あるいは、ＴＣＲα座、ＴＣＲβ座それぞれにＴＣＲα遺伝子、ＴＣＲβ遺伝子を導入してもよい。
【0032】
本発明において、ＴＣＲ／ＣＡＲ遺伝子の導入にはカセットデッキ／カセットテープ方式をとることができる。テープの入れ替えには、Ｃｒｅ／ｌｏｘ、Ｆｌｉｐｐａｓｅ（ＦＬＰ）／Ｆｒｔなどの組換え酵素とその標的配列の組み合わせを用いたいわゆるRecombinase Mediated Cassette Exchange（ＲＭＣＥ）法を用いることができる。ＲＭＣＥ法においては、特定の標的配列に挟まれた目的遺伝子間のカセット交換反応を誘導する。カセットテープ部は適宜切り貼り用の配列を含むよう構築する。ＴＣＲ／ＣＡＲ遺伝子が入ったカセットを最初から材料細胞へ導入しても良いし、薬剤耐性遺伝子を含むカセットを最初に導入してカセットデッキを構築し、その後外来のＴＣＲ／ＣＡＲ遺伝子のカセットテープを導入しても良い。即ち、ＴＣＲ遺伝子座の生理的発現制御下にカセットデッキを組み込み、その上でこの方法により、１種類の材料細胞に色々な種類のＴＣＲ／ＣＡＲを導入することができる。
【0033】
ひとつの態様において本願は、材料細胞ゲノムのＴＣＲ遺伝子座に、上流から順にＴＣＲ遺伝子座Ｖ領域のプロモーター配列、薬剤耐性遺伝子あるいはレポーター遺伝子もしくは既知ＴＣＲまたはＣＡＲ遺伝子、ＴＣＲ遺伝子座Ｃ領域のエンハンサー配列を有する、外来抗原レセプター遺伝子を導入するための材料細胞を提供する。
【0034】
ここで、ＴＣＲ遺伝子座Ｖ領域のプロモーター配列と、薬剤耐性遺伝子あるいはレポーター遺伝子もしくは既知ＴＣＲまたはＣＡＲ遺伝子の間に、組換え酵素の標的配列（ｉ）を有し、薬剤耐性遺伝子あるいはレポーター遺伝子もしくは外来ＴＣＲまたはＣＡＲ遺伝子とＴＣＲ遺伝子座Ｃ領域のエンハンサー配列の間に（ｉ）と相違する組換え酵素の標的配列（ｉｉ）を有していてもよい。
【0035】
本態様において提供される外来抗原レセプター遺伝子を導入するための材料細胞には、薬剤耐性遺伝子、レポーター遺伝子もしくは既知ＴＣＲまたはＣＡＲ遺伝子と交換するように、外来のＴＣＲ／ＣＡＲ遺伝子を導入する（カセット交換）。カセット交換が成功したかどうかは、薬剤耐性遺伝子、レポーター遺伝子、既知ＴＣＲまたはＣＡＲ遺伝子を指標として選択される細胞を陰性コントロールとして選択することができる。薬剤耐性遺伝子の場合は、当該遺伝子が耐性を有する薬剤の存在下で培養することによって、外来ＴＣＲ／ＣＡＲ遺伝子とのカセット交換が生じていない細胞が選択される。レポーター遺伝子の場合は、当該遺伝子が発現する細胞を選択することによって、カセット交換の生じていない細胞を除去することができる。既知ＴＣＲまたはＣＡＲ遺伝子の場合には、当該遺伝子に特異的な抗体またはテトラマーを用いてカセット交換の生じていない細胞を除去することができる。
【0036】
外来抗原レセプター遺伝子を導入するための材料細胞としては、材料細胞に空のカセットが正しく導入されたことを確認し、次いで外来ＴＣＲ／ＣＡＲ遺伝子を導入し、さらに外来ＴＣＲ／ＣＡＲ遺伝子が正しく導入されたことを確認する、二段階の確認機構を有するものであってもよい。
【0037】
かかる二段階の確認機構を有する外来抗原レセプター遺伝子を導入するための材料細胞の一態様として本願は、材料細胞ゲノムのＴＣＲ遺伝子座に、上流からＴＣＲ遺伝子座のＶプロモーター配列、第１の組換え酵素の標的配列（ｉ）、材料細胞で発現可能なプロモーター配列、当該材料細胞で発現可能なプロモーター配列下で発現するよう連結された第１の薬剤耐性遺伝子、（ｉ）と相違する第１の組換え酵素の標的配列（ｉｉ）、第２の薬剤耐性遺伝子および第２の組換え酵素の標的配列およびＴＣＲ遺伝子座のＣ領域のエンハンサー配列を有する抗原レセプター遺伝子導入用材料細胞を提供する。
【0038】
本明細書および請求の範囲において「組換え酵素」とは部位特異的組換えを誘導する酵素であり、組換え酵素の標的配列とは組換え酵素によって認識され、二つの標的配列間で削除、組み込み、反転を誘導することができる配列をいう。組換え酵素とその標的配列の組み合わせとしては、ＣｒｅとｌｏｘＰおよびその誘導体、ＦＬＰとｆｒｔ、クロナーゼとａｔｔＢ／ａｔｔＰ／ａｔｔＬ／ａｔｔＲなどが例示される。
【0039】
本願の方法において第１の組換え酵素と第２の組換え酵素を用いる場合、用いられる第１の組換え酵素としては、複数の組換え標的配列について、各組換え標的配列特異的な組換えを誘導しうる酵素であり、例えば酵素としてＣｒｅ、標的配列としてｌｏｘＰ、ｌｏｘ２２７２、ｌｏｘ５１１、ｌｏｘＦａｓなどが例示される。Ｃｒｅの存在下で、それぞれ同一の標的配列間の組換えが促進される。かかる組換えによって、例えば材料細胞ゲノムにおいてｌｏｘ２２７２とｌｏｘＰに挟まれている配列を、ベクター上のｌｏｘ２２７２とｌｏｘＰに挟まれている配列と交換することができる。
【0040】
第２の組換え酵素とその標的配列の組み合わせとしては、第１の組換え酵素との交差反応性を有していないものであれば特に限定されず、例えばＦＬＰ／ｆｒｔの系が例示される。
【0041】
「ＴＣＲ遺伝子座のＣ領域のエンハンサー」および「ＴＣＲ遺伝子座のＶ領域のプロモーター」は、材料細胞由来の配列であっても、材料細胞と同種の動物の他の個体由来の細胞より取得した配列であっても、あるいは他種の動物由来の細胞より取得した配列であってもよい。
【0042】
材料細胞で発現可能なプロモーターとしては、材料細胞において連結された薬剤耐性遺伝子の発現を誘導可能なプロモーターであれば特に限定されない。例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターなどが例示されるが、これらに限定されない。マウスホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）遺伝子のプロモーター（ｐＰＧＫ）が例示される。
【0043】
薬剤耐性遺伝子としては、材料細胞でマーカーとして機能しうる公知の薬剤耐性遺伝子を用いればよく、例えばハイグロマイシン、ピューロマイシン、ネオマイシンなどに対する耐性遺伝子が例示される。第１と第２の薬剤耐性遺伝子を用いる場合、第１と第２の薬剤耐性遺伝子間の交差反応性が無ければ、その組み合わせについては特に限定されない。薬剤耐性遺伝子の下流には、好ましくはポリＡ配列をつなげる。
【0044】
第２の薬剤耐性遺伝子は好ましくはその下流に薬剤感受性遺伝子を有する融合遺伝子としたものが用いられる。薬剤感受性遺伝子とは、発現した場合に外から加える物質と反応して細胞のアポトーシスを誘導することができる遺伝子を意味する。かかる薬剤感受性遺伝子としては、公知のものを適宜選択して用いれば良く、特に限定されない。例えば単純ヘルペスウイルスや水痘帯状疱疹ウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子が例示される。かかる遺伝子を組み込んだ細胞へアポトーシスを誘導する薬剤としてはガンシクロビルが例示される。
【0045】
第２の薬剤耐性遺伝子は好ましくはカセット交換する前の発現を避けるために開始コドンを除去されたものである。
【0046】
続いて、抗原レセプター遺伝子導入用材料細胞を製造する方法を説明する。この材料細胞のＴＣＲ遺伝子座へいわゆる「空のカセット」を挿入するカセットデッキを作成する方法としては、図２－１、２－２および２－３の三種類が考えられる。ここで「空のカセット」に当たる配列は、薬剤耐性遺伝子あるいはレポーター遺伝子もしくは既知ＴＣＲまたはＣＡＲ遺伝子が例示される。これらの遺伝子は組換え酵素の標的配列（ｉ）および（ｉｉ）に挟まれていてもよい。あるいは、２段階の確認機構を有する抗原レセプター遺伝子導入用材料細胞の「空のカセット」としては、第１の組換え酵素の標的配列（ｉ）、材料細胞で発現可能なプロモーター配列、当該材料細胞で発現可能なプロモーター配列下で発現するよう連結された第１の薬剤耐性遺伝子、（ｉ）と相違する第１の組換え酵素の標的配列（ｉｉ）、第２の薬剤耐性遺伝子および第２の組換え酵素の標的配列を含む配列が例示される。
【0047】
図２－１）材料細胞ゲノムのＴＣＲ遺伝子座に存在するＶプロモーター配列とＣエンハンサー配列の間に、当該プロモーターとエンハンサーが近づくように、「空のカセット」を導入する。
【0048】
図２－２）材料細胞ゲノムのＴＣＲ遺伝子座に、上流から順にＴＣＲ遺伝子座のＶプロモーター配列および「空のカセット」を、Ｖプロモーター領域が材料細胞のＣエンハンサーと十分近づくように導入する。
【0049】
図２－３）材料細胞ゲノムのＴＣＲ遺伝子座のＶプロモーター領域の下流に、上流から順に「空のカセット」およびＴＣＲ遺伝子座のＣエンハンサー配列を、材料細胞上のＶプロモーター領域とＣエンハンサーが十分近づく様に導入する方法。
【0050】
以下、一例として図２－２の方法であって、「空のカセット」が第１の組換え酵素の標的配列（ｉ）、材料細胞で発現可能なプロモーター配列、当該材料細胞で発現可能なプロモーター配列下で発現するよう連結された第１の薬剤耐性遺伝子、（ｉ）と相違する第１の組換え酵素の標的配列（ｉｉ）、第２の薬剤耐性遺伝子および第２の組換え酵素の標的配列を含む配列である態様における方法を詳細に説明する。本態様は以下の工程
（ａ）上流から順に、ＴＣＲ遺伝子座のＶ領域プロモーター配列、および第１の組換え酵素の標的配列（ｉ）、材料細胞で発現可能なプロモーター配列、材料細胞で発現可能なプロモーター配列下で発現するよう連結された第１の薬剤耐性遺伝子、（ｉ）と相違する第１の組換え酵素の標的配列（ｉｉ）、第２の薬剤耐性遺伝子、および第２の組換え酵素の標的配列を含む薬剤耐性遺伝子カセットを含むベクターを準備する工程、
（ｂ）材料細胞へ（ａ）のベクター上のＶ領域プロモーター配列から第２の組換え酵素標的配列までを含む配列をノックインする工程、および
（ｃ）（ｂ）で得られた細胞を第１の薬剤耐性遺伝子が耐性を有する薬剤の存在下で培養する工程を含む、薬剤耐性遺伝子カセットのノックインに成功した細胞を選択する工程を含む、抗原レセプター遺伝子導入のための材料細胞の製造方法である。
（ａ）上流から順に、ＴＣＲ遺伝子座のＶ領域プロモーター配列、および第１の組換え酵素の標的配列（ｉ）、材料細胞で発現可能なプロモーター配列、材料細胞で発現可能なプロモーター配列下で発現するよう連結された第１の薬剤耐性遺伝子、（ｉ）と相違する第１の組換え酵素の標的配列（ｉｉ）、第２の薬剤耐性遺伝子、および第２の組換え酵素の標的配列を含む薬剤耐性遺伝子カセットを含むベクターを準備する工程、
（ｂ）材料細胞へ（ａ）のベクター上のＶ領域プロモーター配列から第２の組換え酵素標的配列までを含む配列をノックインする工程、および
（ｃ）（ｂ）で得られた細胞を第１の薬剤耐性遺伝子が耐性を有する薬剤の存在下で培養する工程を含む、薬剤耐性遺伝子カセットのノックインに成功した細胞を選択する工程を含む、抗原レセプター遺伝子導入のための材料細胞の製造方法である。
【0051】
本願において用いられるベクターとしては、遺伝子組換え用いられるベクターを適宜選択して用いればよく、例えばウイルス、プラスミド、人工染色体などのベクターが例示される。ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、センダイウイルスベクターなどが例示される。また、人工染色体ベクターとしては、例えばヒト人工染色体（ＨＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ、ＰＡＣ）などが含まれる。プラスミドとしては、哺乳動物細胞用プラスミドを使用しうる。目的に応じて市販のベクターを適宜選択して用いれば良い。
【0052】
薬剤耐性遺伝子カセットをノックインする材料細胞ゲノム上のＴＣＲ遺伝子座としては、αβＴ細胞を製造する場合には、ＴＣＲα遺伝子座またはＴＣＲβ遺伝子座を用いる。遺伝子導入に用いないＴＣＲαおよびβ遺伝子座は欠損させることが好ましい。特定遺伝子座の欠損は、公知の方法を適宜用いて行えば良く、公知のゲノム編集の技術、例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９やＴａｌｅｎを用いて行えば良い。
【0053】
本態様においては、まず
工程（ａ）
上流から順に、ＴＣＲ遺伝子座のＶ領域プロモーター配列、および第１の組換え酵素の標的配列（ｉ）、材料細胞で発現可能なプロモーター配列、材料細胞で発現可能なプロモーター配列下で発現するよう連結された第１の薬剤耐性遺伝子、第１の組換え酵素の標的配列（ｉｉ）、第２の薬剤耐性遺伝子、および第２の組換え酵素の標的配列を含む薬剤耐性遺伝子カセットをノックインするための「薬剤耐性遺伝子カセットノックイン用ターゲティングベクター」を準備する。本態様において、上流から順に第１の組換え酵素の標的配列（ｉ）、材料細胞で発現可能なプロモーター配列、材料細胞で発現可能なプロモーター配列下で発現するよう連結された第１の薬剤耐性遺伝子、（ｉ）と相違する第１の組換え酵素の標的配列（ｉｉ）、第２の薬剤耐性遺伝子、および第２の組換え酵素の標的配列を含む薬剤耐性遺伝子カセットを含むベクターを構築し、次いで薬剤耐性遺伝子カセットの上流にＶプロモーター配列を含むノックイン用ターゲティングベクターを構築する。
工程（ａ）
上流から順に、ＴＣＲ遺伝子座のＶ領域プロモーター配列、および第１の組換え酵素の標的配列（ｉ）、材料細胞で発現可能なプロモーター配列、材料細胞で発現可能なプロモーター配列下で発現するよう連結された第１の薬剤耐性遺伝子、第１の組換え酵素の標的配列（ｉｉ）、第２の薬剤耐性遺伝子、および第２の組換え酵素の標的配列を含む薬剤耐性遺伝子カセットをノックインするための「薬剤耐性遺伝子カセットノックイン用ターゲティングベクター」を準備する。本態様において、上流から順に第１の組換え酵素の標的配列（ｉ）、材料細胞で発現可能なプロモーター配列、材料細胞で発現可能なプロモーター配列下で発現するよう連結された第１の薬剤耐性遺伝子、（ｉ）と相違する第１の組換え酵素の標的配列（ｉｉ）、第２の薬剤耐性遺伝子、および第２の組換え酵素の標的配列を含む薬剤耐性遺伝子カセットを含むベクターを構築し、次いで薬剤耐性遺伝子カセットの上流にＶプロモーター配列を含むノックイン用ターゲティングベクターを構築する。
【0054】
次いで薬剤耐性遺伝子カセットの上流にＴＣＲ遺伝子座のＶプロモーターを含むターゲティングベクターを構築する。
【0055】
ＴＣＲ遺伝子座のＶ領域には、各Ｖ遺伝子につき１つのプロモーターが存在する。ＴＣＲ遺伝子座のＶ領域プロモーターとしては、特に限定されず適宜選択すればよい。例えばＴＣＲβ遺伝子座を用いる場合には、Ｖβ２０－１プロモーターを用いることが例示される。プロモーター配列は、Ｖ遺伝子の第１エクソン内の翻訳開始点直前から上流のプロモーター配列のＤＮＡ断片が得られるよう、プライマーを設計してＰＣＲで増幅することにより得ることができる。
【0056】
材料細胞ゲノムＴＣＲ遺伝子座における、外来のＴＣＲ／ＣＡＲ遺伝子を導入する位置を決めて、ターゲティングベクターを構築する。導入する位置としては、上流から順にＶプロモーターおよび外来のＴＣＲ／ＣＡＲ遺伝子を含む配列を導入した場合に、材料細胞由来のＣエンハンサーがＶプロモーターを活性化できる位置であればよい。
【0057】
具体的には材料細胞のＴＣＲβ遺伝子座に外来のＴＣＲ／ＣＡＲ遺伝子を導入する場合は、ＴＣＲβ遺伝子座の再構成が起こっていない状態で導入可能であり、かつエンハンサーに近い領域が好ましく、Ｄβ２の上流かつＣβ１の下流に導入することが例示される。材料細胞のＴＣＲα遺伝子座に外来のＴＣＲ／ＣＡＲ遺伝子を導入する場合は、ＴＣＲα遺伝子座の再構成が起こっていない状態で導入可能であり、かつエンハンサーに近い領域が好ましく、最上流のＪα遺伝子の上流かつ最下流のＶα遺伝子の下流に導入することが例示される。
【0058】
材料細胞ゲノムのＴＣＲ遺伝子座における導入する部位が決まれば、相同組換えができるように、導入部位の上流および下流の配列と相同な配列をそれぞれ５’アーム、３’アームとして導入する。この文脈において「相同な配列」としては、５’アーム、３’アームの配列がそれぞれ、相同組換えが生じる程度の相同性を有していれば良い。
【0059】
例えば、材料細胞のゲノムの再構成されていないＴＣＲβ遺伝子座に外来のＴＣＲ／ＣＡＲ遺伝子を導入する場合には、Ｄβ２遺伝子の約１１０ｂｐ上流からさらに上流約１．６ｋｂｐまでのＤＮＡ断片を５’アーム配列とし、Ｄβ２遺伝子の上流約５０ｂｐから下流に約１．６ｋｂｐ位置までのＤＮＡ断片を３’アーム配列として用いることが例示される。各５’アームおよび３’アームのＤＮＡ断片は、それぞれの配列を特異的に増幅可能なプライマーを用い、材料細胞のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲで増幅することにより得ることができる。
【0060】
すなわち、薬剤耐性遺伝子カセットノックイン用ターゲティングベクターとしては、上流から順に、材料細胞ゲノムのＴＣＲ遺伝子座内導入箇所の５’側と相同な配列（５’アーム）、ＴＣＲ遺伝子座Ｖ領域のプロモーター配列、第１の組換え酵素の標的配列（ｉ）、材料細胞で発現可能なプロモーター配列、材料細胞で発現可能なプロモーター配列下で発現するよう連結された第１の薬剤耐性遺伝子、（ｉ）と相違する第１の組換え酵素の標的配列（ｉｉ）、第２の薬剤耐性遺伝子および第２の組換え酵素の標的配列、材料細胞導入箇所の３’側と相同な配列（３’アーム）を含むベクターが例示される。各配列をＰＣＲにより増幅する際には、得られたＰＣＲ産物を薬剤耐性ベクターに導入するためのＤＮＡ配列が付加されるようにプライマーを設計する。得られたＰＣＲ産物を用い、例えばGibson assembly法など公知の方法や市販のキットを用いてベクターの構築を行えばよい。
【0061】
薬剤耐性遺伝子カセットノックイン用ターゲティングベクターはさらに、３’アームの下流側に材料細胞で発現可能なプロモーターとマーカーとなる遺伝子を含むものであってよい。かかるプロモーターとマーカーの組み合わせとしては、例えばＭＣ１プロモーターとジフテリア菌毒素遺伝子（ＤＴＡ）の組み合わせが例示される。
【0062】
工程（ｂ）
薬剤耐性遺伝子カセットノックイン用ターゲティングベクターを、材料細胞のＴＣＲ遺伝子座へ相同組換えによりノックインする。ノックインは公知の方法にて行えば良く、例えばエレクトロポレーション法により行うことができる。
薬剤耐性遺伝子カセットノックイン用ターゲティングベクターを、材料細胞のＴＣＲ遺伝子座へ相同組換えによりノックインする。ノックインは公知の方法にて行えば良く、例えばエレクトロポレーション法により行うことができる。
【0063】
相同組換えによるノックイン効率を高めるために、薬剤耐性カセットノックイン用ターゲティングベクターのノックインの前に、ノックイン箇所、例えば３’アームの開始部位(上流)近傍に二カ所の一本鎖切断(ニック)を導入することが好ましい。ニックの導入は公知の方法にて行えば良く、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９nシステムを採用することが例示される。
【0064】
工程（ｃ）
相同組換えに成功した材料細胞は、導入されたプロモーターの働きにより薬剤耐性遺伝子１が発現する。このため、相同組換えに成功した材料細胞を、薬剤耐性遺伝子１が耐性を有する薬剤の存在下で選択することができる。また、ターゲティングベクターの３’アームの下流にマーカー遺伝子を組み込んだ場合、５’アーム配列と３’アーム配列の薬剤耐性遺伝子カセットを含まない、いわゆる外側の部分が導入された材料細胞においては、マーカーとなる例えば細胞毒素が発現し、細胞は生存できない。よって、生存細胞を選択することによって、薬剤耐性カセットのノックインに成功した細胞を選択することができる。選択された材料細胞をさらにＰＣＲ法にて確認して、Ｖ領域プロモーターと薬剤耐性遺伝子カセットがノックインされている細胞のみを選択してもよい。
相同組換えに成功した材料細胞は、導入されたプロモーターの働きにより薬剤耐性遺伝子１が発現する。このため、相同組換えに成功した材料細胞を、薬剤耐性遺伝子１が耐性を有する薬剤の存在下で選択することができる。また、ターゲティングベクターの３’アームの下流にマーカー遺伝子を組み込んだ場合、５’アーム配列と３’アーム配列の薬剤耐性遺伝子カセットを含まない、いわゆる外側の部分が導入された材料細胞においては、マーカーとなる例えば細胞毒素が発現し、細胞は生存できない。よって、生存細胞を選択することによって、薬剤耐性カセットのノックインに成功した細胞を選択することができる。選択された材料細胞をさらにＰＣＲ法にて確認して、Ｖ領域プロモーターと薬剤耐性遺伝子カセットがノックインされている細胞のみを選択してもよい。
【0065】
得られた材料細胞のＶ領域プロモーターと薬剤耐性遺伝子カセットがノックインされたクローンは、本願の「材料細胞ゲノムのＴＣＲ遺伝子座に、上流からＴＣＲ遺伝子座のＶプロモーター配列、第１の組換え酵素の標的配列（ｉ）、材料細胞で発現可能なプロモーター配列、当該材料細胞で発現可能なプロモーター配列下で発現するよう連結された第１の薬剤耐性遺伝子、（ｉ）と相違する第１の組換え酵素の標的配列（ｉｉ）、第２の薬剤耐性遺伝子および第２の組換え酵素の標的配列およびＴＣＲ遺伝子座のＣ領域のエンハンサー配列を有するＴＣＲ／ＣＡＲ遺伝子ノックイン用材料細胞」として、用いることができる。
【0066】
上記は主に図２－２の態様に基づいて説明したが、他の２つの態様についても同様に実施できることは、当業者であれば理解する。即ち、材料細胞上のＶプロモーターを利用する場合、材料細胞上のＶプロモーターとＣエンハンサーの両方を利用する場合、構成にあわせて適宜薬剤耐性遺伝子カセットノックイン用のターゲティングベクターのコンストラクトを調製すればよい。
【0067】
図２－１の態様の具体例は実施例３で説明されている。材料細胞上のＶプロモーターとＣエンハンサーの両方を利用する場合には、Vプロモーターの少し下流およびCエンハンサーの少し上流、例えばＴＣＲβ遺伝子座の場合には、ＴＣＲVβ２０－１の翻訳開始点より30 bp ～ 80 bp下流の領域、およびＴＣＲＣβ２遺伝子エキソン1内において、それぞれ２カ所ずつ一本鎖切断（ニック）を導入してゲノムＤＮＡを切断することによって、２か所のニックの間の約180ｋｂｐ部分を除くことができる。その後、近づいたＶプロモーターとＣエンハンサーの間に薬剤耐性カセットをノックインしてＴＣＲ／ＣＡＲ遺伝子ノックイン用材料細胞を作成しても、あるいは直接外来のＴＣＲ／ＣＡＲ遺伝子を導入してもよい。
【0068】
図１７～１９に、材料細胞中のＴＣＲ遺伝子座中のＶプロモーターとＣエンハンサーの両方を利用した「材料細胞ゲノムのＴＣＲ遺伝子座に、上流からＴＣＲ遺伝子座のＶプロモーター配列、第１の組換え酵素の標的配列（ｉ）、材料細胞で発現可能なプロモーター配列、当該材料細胞で発現可能なプロモーター配列下で発現するよう連結された第１の薬剤耐性遺伝子、（ｉ）と相違する第１の組換え酵素の標的配列（ｉｉ）、第２の薬剤耐性遺伝子および第２の組換え酵素の標的配列およびＴＣＲ遺伝子座のＣ領域のエンハンサー配列を有するＴＣＲ／ＣＡＲ遺伝子ノックイン用材料細胞」を調製する方法の概略を示す。
【0069】
ＴＣＲ／ＣＡＲ遺伝子導入用材料細胞へ、外来のＴＣＲ／ＣＡＲ遺伝子を導入するには、以下の手順を行うことが例示される：
【0070】
（Ａ）上流から順に第１の組換え酵素の標的配列（ｉ）、外来のＴＣＲまたはＣＡＲ遺伝子、第２の組換え酵素の標的配列、材料細胞で発現可能なプロモーター配列、および第１の組換え酵素の標的配列（ｉｉ）を含む、ＴＣＲまたはＣＡＲ遺伝子カセット交換ベクターを準備する工程、
（Ｂ）ＴＣＲまたはＣＡＲ遺伝子カセット交換ベクターを、ＴＣＲ／ＣＡＲ遺伝子導入用材料細胞へ導入し、同時に第１の組換え酵素を適用して、材料細胞ゲノムに導入された薬剤耐性遺伝子カセットの第１の組換え酵素の標的配列（ｉ）（ｉｉ）に挟まれる部分を、ＴＣＲまたはＣＡＲ遺伝子カセット交換ベクターの第１の組換え酵素の標的配列（ｉ）（ｉｉ）に挟まれる配列と交換する工程、
（Ｃ）第２の薬剤耐性遺伝子が耐性を有する薬剤の存在下で培養する工程を含む、カセット交換に成功した細胞を選択する工程、
（Ｄ）第２の組換え酵素を（Ｃ）で選択された細胞に作用させて、第２の組換え酵素の標的配列で挟まれる第２の薬剤耐性遺伝子部分を除去する工程。
（Ｂ）ＴＣＲまたはＣＡＲ遺伝子カセット交換ベクターを、ＴＣＲ／ＣＡＲ遺伝子導入用材料細胞へ導入し、同時に第１の組換え酵素を適用して、材料細胞ゲノムに導入された薬剤耐性遺伝子カセットの第１の組換え酵素の標的配列（ｉ）（ｉｉ）に挟まれる部分を、ＴＣＲまたはＣＡＲ遺伝子カセット交換ベクターの第１の組換え酵素の標的配列（ｉ）（ｉｉ）に挟まれる配列と交換する工程、
（Ｃ）第２の薬剤耐性遺伝子が耐性を有する薬剤の存在下で培養する工程を含む、カセット交換に成功した細胞を選択する工程、
（Ｄ）第２の組換え酵素を（Ｃ）で選択された細胞に作用させて、第２の組換え酵素の標的配列で挟まれる第２の薬剤耐性遺伝子部分を除去する工程。
【0071】
工程（Ａ）
再構成済ＴＣＲまたはＣＡＲ遺伝子の導入にはまず、上流から順に第１の組換え酵素の標的配列（ｉ）、外来のＴＣＲ遺伝子またはＣＡＲ遺伝子、第２の組換え酵素の標的配列、材料細胞で発現可能なプロモーター配列、および第１の組換え酵素の標的配列（ｉｉ）を含む、ＴＣＲカセット交換ベクターを準備する。
再構成済ＴＣＲまたはＣＡＲ遺伝子の導入にはまず、上流から順に第１の組換え酵素の標的配列（ｉ）、外来のＴＣＲ遺伝子またはＣＡＲ遺伝子、第２の組換え酵素の標的配列、材料細胞で発現可能なプロモーター配列、および第１の組換え酵素の標的配列（ｉｉ）を含む、ＴＣＲカセット交換ベクターを準備する。
【0072】
以下、ＴＣＲαとＴＣＲβのヘテロダイマーを発現する遺伝子を導入するための、ＴＣＲカセット交換ベクターを例として説明する。
【0073】
本願の一態様としてＴＣＲαおよびＴＣＲβのヘテロダイマーを発現させる場合、再構成済のＴＣＲα遺伝子とＴＣＲβ遺伝子を自己開裂型の２Ａペプチドにてつないだ配列を用いてＴＣＲカセット交換ベクターを作成することが例示される。自己開裂型の２Ａペプチドをα鎖とβ鎖の間に置くことによって、ひとつの遺伝子の発現制御系下で２つの遺伝子両方を発現させることができる。
【0074】
２Ａペプチドとしてはｐ２Ａ、Ｔ２Ａ、Ｅ２Ａ、Ｆ２Ａなどを用いることができ、切断効率がよいと言われているｐ２Ａペプチドが好適に用いられる。また、ＴＣＲα遺伝子、ＴＣＲβ遺伝子の特にどちらを上流に導入しても良いが、下流側に導入したＴＣＲ遺伝子には好適にはポリＡ配列を連結する。
【0075】
ＴＣＲ遺伝子の上流には、イントロンが含まれていることが好ましい。イントロン配列は、スプライシングされて除去される配列に加え、スプライスドナー配列とスプライスアクセプター配列を含むものであればよく、例えばヒトポリペプチド鎖伸長因子α（ＥＦ１α）遺伝子のイントロン、あるいはニワトリβ－アクチン（ＣＡＧ）遺伝子プロモーターのイントロン部分が挙げられる。
【0076】
また、第２の薬剤耐性遺伝子が開始コドンを除いたものである場合には、ＴＣＲカセット交換ベクターの材料細胞で発現可能なプロモーター配列の直後、第１の組換え酵素の標的配列（ｉｉ）の直前に開始コドンを導入する。
【0077】
工程（Ｂ）
ＴＣＲ／ＣＡＲ導入用材料細胞へ、ＴＣＲカセット交換ベクターを導入し、同時に第１の組換え酵素を作用させる。第1の組換え酵素を作用させるには、例えば第1の組換え酵素発現ベクターとともに、ＴＣＲカセット交換ベクターを導入する。第１の組換え酵素発現ベクターの発現によって、薬剤耐性遺伝子カセット上の標的配列（ｉ）とＴＣＲカセット交換ベクター上の標的配列（ｉ）、薬剤耐性遺伝子カセット上の標的配列（ii）とＴＣＲカセット交換ベクター上の標的配列（ii）それぞれ同士の間での組換えが促進される。その結果、薬剤耐性遺伝子カセット上の第１の組換え酵素の標的配列（ｉ）と（ｉｉ）で挟まれる部分が、ＴＣＲカセット交換ベクター上の同配列部分で挟まれる部分と交換される。
ＴＣＲ／ＣＡＲ導入用材料細胞へ、ＴＣＲカセット交換ベクターを導入し、同時に第１の組換え酵素を作用させる。第1の組換え酵素を作用させるには、例えば第1の組換え酵素発現ベクターとともに、ＴＣＲカセット交換ベクターを導入する。第１の組換え酵素発現ベクターの発現によって、薬剤耐性遺伝子カセット上の標的配列（ｉ）とＴＣＲカセット交換ベクター上の標的配列（ｉ）、薬剤耐性遺伝子カセット上の標的配列（ii）とＴＣＲカセット交換ベクター上の標的配列（ii）それぞれ同士の間での組換えが促進される。その結果、薬剤耐性遺伝子カセット上の第１の組換え酵素の標的配列（ｉ）と（ｉｉ）で挟まれる部分が、ＴＣＲカセット交換ベクター上の同配列部分で挟まれる部分と交換される。
【0078】
工程（Ｃ）
カセット交換が生じた材料細胞においては、第２の薬剤耐性遺伝子が発現する。従って、第２の薬剤耐性遺伝子が耐性を有する薬剤の存在下でカセット交換後の材料細胞を培養することによって、カセット交換に成功した細胞を選択することができる。
カセット交換が生じた材料細胞においては、第２の薬剤耐性遺伝子が発現する。従って、第２の薬剤耐性遺伝子が耐性を有する薬剤の存在下でカセット交換後の材料細胞を培養することによって、カセット交換に成功した細胞を選択することができる。
【0079】
工程（Ｄ）
選択された細胞へ、第２の組換え酵素を作用させる。第２の組換え酵素を作用させるには、例えば第２の組換え酵素の発現ベクターを当該選択された細胞へ導入すればよい。
選択された細胞へ、第２の組換え酵素を作用させる。第２の組換え酵素を作用させるには、例えば第２の組換え酵素の発現ベクターを当該選択された細胞へ導入すればよい。
【0080】
第２の組換え酵素の発現により、第２の組換え酵素の標的配列に挟まれた領域が欠失する。第２の薬剤耐性遺伝子を薬剤感受性遺伝子と融合させた遺伝子を組み込んでいる場合は、薬剤感受性遺伝子、例えば細胞死誘導遺伝子活性化のトリガーとなる因子の存在下で材料細胞を培養することによって、第２の組換え酵素の標的配列に挟まれた領域の欠失に失敗した細胞を除去することができる。得られた細胞に確実にＴＣＲαとＴＣＲβ遺伝子が導入されたことをＰＣＲ法にて確認してもよい。上記方法で得られる細胞は材料細胞のＴＣＲβ遺伝子座からＴＣＲαおよびＴＣＲβの両方を発現する。
【0081】
外来のＴＣＲ／ＣＡＲ遺伝子が導入された材料細胞からＴ細胞への分化
Ｔ細胞以外の細胞のＴＣＲ遺伝子座では遺伝子再構成が起こらないため、ＴＣＲ遺伝子は発現することがない。従って遺伝子導入には再構成済ＴＣＲ遺伝子またはＣＡＲ遺伝子を用いる。材料細胞として多能性幹細胞等のＴ細胞以外の細胞を用いた場合、再構成済ＴＣＲ遺伝子またはＣＡＲ遺伝子を発現させるためには、Ｔ細胞へ分化させる必要があり、分化させたＴ細胞は細胞療法に用いることができる。多能性幹細胞のＴ細胞への分化誘導方法としては例えばTimmermans et al., Journal of Immunology, 2009, 182: 6879-6888、Nishimura T et al, 2013, Cell Stem Cell 114-126、WO 2013176197 A1、 WO 2011096482 A1およびWOに記載の方法が例示される。Ｒａｇ１遺伝子あるいはＲａｇ２遺伝子を欠失させることにより、ＴＣＲの再構成を抑制してもよい。Ｒａｇ１遺伝子とＲａｇ２遺伝子については、どちらか一方を欠失させるだけでよい。
Ｔ細胞以外の細胞のＴＣＲ遺伝子座では遺伝子再構成が起こらないため、ＴＣＲ遺伝子は発現することがない。従って遺伝子導入には再構成済ＴＣＲ遺伝子またはＣＡＲ遺伝子を用いる。材料細胞として多能性幹細胞等のＴ細胞以外の細胞を用いた場合、再構成済ＴＣＲ遺伝子またはＣＡＲ遺伝子を発現させるためには、Ｔ細胞へ分化させる必要があり、分化させたＴ細胞は細胞療法に用いることができる。多能性幹細胞のＴ細胞への分化誘導方法としては例えばTimmermans et al., Journal of Immunology, 2009, 182: 6879-6888、Nishimura T et al, 2013, Cell Stem Cell 114-126、WO 2013176197 A1、 WO 2011096482 A1およびWOに記載の方法が例示される。Ｒａｇ１遺伝子あるいはＲａｇ２遺伝子を欠失させることにより、ＴＣＲの再構成を抑制してもよい。Ｒａｇ１遺伝子とＲａｇ２遺伝子については、どちらか一方を欠失させるだけでよい。
【0082】
Ｔ細胞としては、ＣＤ３を発現し、ＣＤ４およびＣＤ８のいずれか１つを少なくとも発現する細胞である。治療目的により、ＣＤ８を発現するキラーＴ細胞、ＣＤ４を発現するヘルパーＴ細胞のいずれへ分化させてもよい。
【0083】
本願の方法で得られる細胞は、導入したＴＣＲまたはＣＡＲが特異的に結合する抗原を発現するがん、感染症、自己免疫疾患、アレルギーなどの免疫が関与する疾患の治療に用いることができる。本願の方法においては得られるＴ細胞を適当な媒体、例えば生理的食塩水やＰＢＳに懸濁して、材料細胞の由来するドナーと一定以上ＨＬＡが合致する患者の治療に用いる。ドナーと患者とのＨＬＡ型は、完全に一致する場合、ドナーがＨＬＡハプロタイプホモの場合には、少なくともその一方のＨＬＡハプロタイプが一致する場合が例示される。もちろん、患者本人の体細胞から誘導された多能性幹細胞を材料細胞として用いてもよい。患者への投与は経静脈的に行えばよい。
【0084】
例えばＨＬＡハプロタイプホモのドナー由来のｉＰＳ細胞群が、ドナーのＨＬＡ情報にひも付けて保存されているｉＰＳ細胞バンクから、治療対象者のＨＬＡの少なくとも一方が同一である細胞を選択して用いることができる。
【0085】
投与細胞数は特に限定されず、患者の年齢、性別、身長、体重、対象疾患、症状等に応じて適宜定めればよい。最適な投与細胞数は臨床試験により適宜決定すればよい。
【0086】
本願の方法により、抗原特異的Ｔ細胞、あるいは抗原特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞を誘導することができる。本願の方法はがん、感染症、自己免疫疾患、アレルギーなどいろいろな疾患を対照とした免疫細胞療法への応用が可能である。
【0087】
別の態様として、本願は遺伝子再構成済のＴ細胞（材料細胞）のＴＣＲ遺伝子のＶ領域のプロモーター配列とＣ領域のエンハンサー配列の間に、外来ＴＣＲαおよびＴＣＲβ遺伝子を導入する細胞療法用細胞の製造方法を提供する。外来ＴＣＲαおよびＴＣＲβ遺伝子は、材料細胞であるＴ細胞に発現しているＴＣＲαまたはＴＣＲβの何れか一方の発現制御系へ両者が発現するよう導入する。外来ＴＣＲαおよびＴＣＲβ遺伝子を導入しないＴＣＲ発現系は欠損させる。
【0088】
本態様においては、上記で説明した外来の抗原レセプター遺伝子を導入するための材料細胞をＴ前駆細胞またはＴ細胞へと分化誘導し、その後に外来のＴＣＲまたはＣＡＲ遺伝子を、ゲノム編集法あるいはRecombinase-mediated Cassette Exchange(RMCE)法にて該誘導されたＴ前駆細胞またはＴ細胞のゲノムＴＣＲ遺伝子座のＶ領域のプロモーター配列とＣ領域のエンハンサー配列の間に導入することが例示される。
【0089】
例えば外来の抗原レセプター遺伝子を導入するための材料細胞が既知ＴＣＲまたはＣＡＲ遺伝子を有している場合は、ゲノム編集法あるいはRecombinase-mediated Cassette Exchange(RMCE)法にて該誘導されたＴ前駆細胞またはＴ細胞の既知ＴＣＲまたはＣＡＲ遺伝子を外来ＴＣＲまたはＣＡＲ遺伝子と入れ替える工程、および既知のＴＣＲまたはＣＡＲ遺伝子に特異的な抗体またはテトラマーを用いて外来ＴＣＲまたはＣＡＲ遺伝子との入れ替えに成功していない細胞を除くことができる。
【0090】
以上、段階を分けて説明したが、本願はまた、（１）上流から順に、ＴＣＲ遺伝子座Ｖ領域のプロモーター配列、および第１の組換え酵素の標的配列（ｉ）、材料細胞で発現可能なプロモーター配列、材料細胞で発現可能なプロモーター配列下で発現するよう連結された第１の薬剤耐性遺伝子、（ｉ）と相違する第１の組換え酵素の標的配列（ｉｉ）、第２の薬剤耐性遺伝子、および第２の組換え酵素の標的配列を含む薬剤耐性遺伝子カセットを含むベクターを準備する工程、
（２）材料細胞ゲノムのＴＣＲ遺伝子座へ（１）の配列をノックインする工程、
（３）（２）で得られた細胞を第１の薬剤耐性遺伝子が耐性を有する薬剤の存在下で培養する工程を含む、薬剤耐性遺伝子カセットのノックインに成功した細胞を選択する工程、
（４）上流から順に第１の組換え酵素の標的配列（ｉ）、外来のＴＣＲまたはＣＡＲ遺伝子、第２の組換え酵素の標的配列、材料細胞で発現可能なプロモーター配列、および第１の組換え酵素の標的配列（ｉｉ）を含む、ＴＣＲまたはＣＡＲ遺伝子カセット交換ベクターを準備する工程、
（５）ＴＣＲまたはＣＡＲ遺伝子カセット交換ベクターを（３）で選択された薬剤耐性カセットがノックインされた材料細胞へ導入し、同時に第１の組換え酵素を作用させることによって、ＴＣＲまたはＣＡＲ遺伝子カセットベクターの第１の組換え酵素の標的配列（ｉ）（ｉｉ）に挟まれる配列と交換する工程、
（６）第２の薬剤耐性遺伝子が耐性を有する薬剤にて、カセット交換に成功した細胞を選択する工程、
（７）第２の組換え酵素を（６）で選択された細胞に作用させて、第２の組換え酵素の標的配列で挟まれる第２の薬剤耐性遺伝子部分を除去する工程
を含む外来のＴＣＲまたはＣＡＲ遺伝子が導入された細胞の製造方法を提供する。
（２）材料細胞ゲノムのＴＣＲ遺伝子座へ（１）の配列をノックインする工程、
（３）（２）で得られた細胞を第１の薬剤耐性遺伝子が耐性を有する薬剤の存在下で培養する工程を含む、薬剤耐性遺伝子カセットのノックインに成功した細胞を選択する工程、
（４）上流から順に第１の組換え酵素の標的配列（ｉ）、外来のＴＣＲまたはＣＡＲ遺伝子、第２の組換え酵素の標的配列、材料細胞で発現可能なプロモーター配列、および第１の組換え酵素の標的配列（ｉｉ）を含む、ＴＣＲまたはＣＡＲ遺伝子カセット交換ベクターを準備する工程、
（５）ＴＣＲまたはＣＡＲ遺伝子カセット交換ベクターを（３）で選択された薬剤耐性カセットがノックインされた材料細胞へ導入し、同時に第１の組換え酵素を作用させることによって、ＴＣＲまたはＣＡＲ遺伝子カセットベクターの第１の組換え酵素の標的配列（ｉ）（ｉｉ）に挟まれる配列と交換する工程、
（６）第２の薬剤耐性遺伝子が耐性を有する薬剤にて、カセット交換に成功した細胞を選択する工程、
（７）第２の組換え酵素を（６）で選択された細胞に作用させて、第２の組換え酵素の標的配列で挟まれる第２の薬剤耐性遺伝子部分を除去する工程
を含む外来のＴＣＲまたはＣＡＲ遺伝子が導入された細胞の製造方法を提供する。
【0091】
本発明はまた、所望のＴＣＲまたはＣＡＲ遺伝子が導入されたＴ細胞を効率的に作成する方法の一例として、下記工程を含む方法を提供する：
（１）上流から順に、ＴＣＲ遺伝子座Ｖ領域のプロモーター配列、および第１の組換え酵素の標的配列（ｉ）、材料細胞で発現可能なプロモーター配列、材料細胞で発現可能なプロモーター配列下で発現するよう連結された第１の薬剤耐性遺伝子、（ｉ）と相違する第１の組換え酵素の標的配列（ｉｉ）、第２の薬剤耐性遺伝子、および第２の組換え酵素の標的配列を含む薬剤耐性遺伝子カセットを含むベクターを準備する工程、
（２）材料細胞ゲノムのＴＣＲ遺伝子座へ（１）の配列をノックインする工程、
（３）（２）で得られた細胞を第１の薬剤耐性遺伝子が耐性を有する薬剤の存在下で培養する工程を含む、薬剤耐性遺伝子カセットのノックインに成功した細胞を選択する工程、
（４）上流から順に第１の組換え酵素の標的配列（ｉ）、外来の既知ＴＣＲまたはＣＡＲ遺伝子、第２の組換え酵素の標的配列、材料細胞で発現可能なプロモーター配列、および第１の組換え酵素の標的配列（ｉｉ）を含む、既知ＴＣＲまたはＣＡＲ遺伝子カセット交換ベクターを準備する工程、
（５）既知ＴＣＲまたはＣＡＲ遺伝子カセット交換ベクターを（３）で選択された薬剤耐性カセットがノックインされた材料細胞へ導入し、同時に第１の組換え酵素を作用させることによって、既知ＴＣＲまたはＣＡＲ遺伝子カセットベクターの第１の組換え酵素の標的配列（ｉ）（ｉｉ）に挟まれる配列と交換する工程、
（６）第２の薬剤耐性遺伝子が耐性を有する薬剤にて、カセット交換に成功した細胞を選択する工程、
を含む方法により既知ＴＣＲまたはＣＡＲ遺伝子が導入された細胞を得、さらに
（７）得られた細胞をＴ細胞へと分化誘導する工程、
（８）上流から順に第１の組換え酵素の標的配列（ｉ）、所望のＴＣＲまたはＣＡＲ遺伝子、第２の組換え酵素の標的配列、材料細胞で発現可能なプロモーター配列、および第１の組換え酵素の標的配列（ｉｉ）を含む、所望のＴＣＲまたはＣＡＲ遺伝子カセット交換ベクターを準備する工程、
（９）所望のＴＣＲまたはＣＡＲ遺伝子カセット交換ベクターを（７）で得られたＴ細胞へ導入し、同時に第１の組換え酵素を作用させることによって、所望のＴＣＲまたはＣＡＲ遺伝子カセットベクターの第１の組換え酵素の標的配列（ｉ）（ｉｉ）に挟まれる既知ＴＣＲまたはＣＡＲ遺伝子配列と交換する工程、および
（１０）第２の組換え酵素を（9）で得られた細胞に作用させて、第２の組換え酵素の標的配列で挟まれる第２の薬剤耐性遺伝子部分を除去する工程。
（１）上流から順に、ＴＣＲ遺伝子座Ｖ領域のプロモーター配列、および第１の組換え酵素の標的配列（ｉ）、材料細胞で発現可能なプロモーター配列、材料細胞で発現可能なプロモーター配列下で発現するよう連結された第１の薬剤耐性遺伝子、（ｉ）と相違する第１の組換え酵素の標的配列（ｉｉ）、第２の薬剤耐性遺伝子、および第２の組換え酵素の標的配列を含む薬剤耐性遺伝子カセットを含むベクターを準備する工程、
（２）材料細胞ゲノムのＴＣＲ遺伝子座へ（１）の配列をノックインする工程、
（３）（２）で得られた細胞を第１の薬剤耐性遺伝子が耐性を有する薬剤の存在下で培養する工程を含む、薬剤耐性遺伝子カセットのノックインに成功した細胞を選択する工程、
（４）上流から順に第１の組換え酵素の標的配列（ｉ）、外来の既知ＴＣＲまたはＣＡＲ遺伝子、第２の組換え酵素の標的配列、材料細胞で発現可能なプロモーター配列、および第１の組換え酵素の標的配列（ｉｉ）を含む、既知ＴＣＲまたはＣＡＲ遺伝子カセット交換ベクターを準備する工程、
（５）既知ＴＣＲまたはＣＡＲ遺伝子カセット交換ベクターを（３）で選択された薬剤耐性カセットがノックインされた材料細胞へ導入し、同時に第１の組換え酵素を作用させることによって、既知ＴＣＲまたはＣＡＲ遺伝子カセットベクターの第１の組換え酵素の標的配列（ｉ）（ｉｉ）に挟まれる配列と交換する工程、
（６）第２の薬剤耐性遺伝子が耐性を有する薬剤にて、カセット交換に成功した細胞を選択する工程、
を含む方法により既知ＴＣＲまたはＣＡＲ遺伝子が導入された細胞を得、さらに
（７）得られた細胞をＴ細胞へと分化誘導する工程、
（８）上流から順に第１の組換え酵素の標的配列（ｉ）、所望のＴＣＲまたはＣＡＲ遺伝子、第２の組換え酵素の標的配列、材料細胞で発現可能なプロモーター配列、および第１の組換え酵素の標的配列（ｉｉ）を含む、所望のＴＣＲまたはＣＡＲ遺伝子カセット交換ベクターを準備する工程、
（９）所望のＴＣＲまたはＣＡＲ遺伝子カセット交換ベクターを（７）で得られたＴ細胞へ導入し、同時に第１の組換え酵素を作用させることによって、所望のＴＣＲまたはＣＡＲ遺伝子カセットベクターの第１の組換え酵素の標的配列（ｉ）（ｉｉ）に挟まれる既知ＴＣＲまたはＣＡＲ遺伝子配列と交換する工程、および
（１０）第２の組換え酵素を（9）で得られた細胞に作用させて、第２の組換え酵素の標的配列で挟まれる第２の薬剤耐性遺伝子部分を除去する工程。
【実施例1】
【0092】
以下、実施例により本願をさらに詳細に説明する。なお、本願の実施例においては、Ｔ細胞株であるＪｕｒｋａｔ細胞を用いたが、Ｊｕｒｋａｔ細胞は、完全に再構成されていないＴＣＲ遺伝子座（D-J組換えまで）と、再構成済ＴＣＲ遺伝子座（VDJ組換え済）の両方を有している。本実施例では、再構成済ＴＣＲ遺伝子座を破壊したＪｕｒｋａｔ細胞を用いた。
【0093】
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子破壊Ｊｕｒｋａｔ細胞における、カセット交換法による外来性ＴＣＲの発現
【0094】
１）試薬・抗体等：
ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－Ｎｅｏ（Ｔｏｙｏｂｏ，ＫＯＤ－４０１）、Ａｍａｘａ（登録商標）Cell Line Nucleofector(登録商標）Kit V （Ｌｏｎｚａ，ＶＡＣＡ－１００３）、Gibson assembly master mix （New England Biolabs (NEB), E2611S）、 Ｇａｔｅｗａｙ （登録商標）ＬＲクロナーゼＴＭＩＩ酵素ミックス（Thermo Fisher Scientific, １１７９１－０２０）、Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ Ｂ Ｇｏｌｄ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ，ａｎｔ－ｈｇ－１）、ピューロマイシン二塩酸塩（Ｗａｋｏ，１６０－２３１５１）、ガンシクロビル（Ｗａｋｏ，０７８－０４４８１、ＰＥ／Ｃｙ７ anti-human ＴＣＲα／β（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，３０６７１９）、APC Mouse Anti-Human CD3 （ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，５５７５９７）を用いた。
また、ベクターとしてｐＢＲＢｌＩＩ－ＡｓｃＩ＿ＦＲＴＰＧＫｐａｃΔｔｋｐＡ＿ＡｓｃＩを用いた。
Ｊｕｒｋａｔ細胞は、ヒト白血病細胞由来のT細胞株である。ＴＣＲ遺伝子が放射線照射によって破壊された株（Ｊ．ＲＴ３－Ｔ３．５）を用いた（J. Exp. Med. 160. 1284-1299. 1984)。
ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－Ｎｅｏ（Ｔｏｙｏｂｏ，ＫＯＤ－４０１）、Ａｍａｘａ（登録商標）Cell Line Nucleofector(登録商標）Kit V （Ｌｏｎｚａ，ＶＡＣＡ－１００３）、Gibson assembly master mix （New England Biolabs (NEB), E2611S）、 Ｇａｔｅｗａｙ （登録商標）ＬＲクロナーゼＴＭＩＩ酵素ミックス（Thermo Fisher Scientific, １１７９１－０２０）、Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ Ｂ Ｇｏｌｄ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ，ａｎｔ－ｈｇ－１）、ピューロマイシン二塩酸塩（Ｗａｋｏ，１６０－２３１５１）、ガンシクロビル（Ｗａｋｏ，０７８－０４４８１、ＰＥ／Ｃｙ７ anti-human ＴＣＲα／β（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，３０６７１９）、APC Mouse Anti-Human CD3 （ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，５５７５９７）を用いた。
また、ベクターとしてｐＢＲＢｌＩＩ－ＡｓｃＩ＿ＦＲＴＰＧＫｐａｃΔｔｋｐＡ＿ＡｓｃＩを用いた。
Ｊｕｒｋａｔ細胞は、ヒト白血病細胞由来のT細胞株である。ＴＣＲ遺伝子が放射線照射によって破壊された株（Ｊ．ＲＴ３－Ｔ３．５）を用いた（J. Exp. Med. 160. 1284-1299. 1984)。
【0095】
２) 薬剤耐性遺伝子カセットベクターの構築
薬剤耐性カセットベクターとして、図３Ｇに示すような、Ｃｒｅ組換え酵素の認識配列であるｌｏｘ２２７２配列（５’－ＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＡＡＧＴＡＴＣＣＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴ－３’（配列番号１））、マウスのホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）遺伝子のプロモーター配列（ｐＰＧＫ）、その下流にハイグロマイシン耐性遺伝子（Ｈｙｇｒｏｒ）、ＰＧＫ遺伝子のポリアデニル化配列（ｐＡ）をつなげ、その下流にｌｏｘ２２７２とは異なるＣｒｅによる認識配列であるｌｏｘＰ配列（５’－ＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＧＣＡＴＡＣＡＴＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴ－３’（配列番号２））、ピューロマイシン耐性遺伝子とヘルペスウイルスチミジンキナーゼのキナーゼドメイン（ΔＴＫ）との融合遺伝子（ＰｕｒｏｒΔＴＫ）、ｐＡ配列、酵母の組換え酵素Ｆｌｉｐｐａｓｅ（ＦＬＰ）の認識配列であるｆｒｔ配列をつなげた形でプラスミドを構築した。
薬剤耐性カセットベクターとして、図３Ｇに示すような、Ｃｒｅ組換え酵素の認識配列であるｌｏｘ２２７２配列（５’－ＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＡＡＧＴＡＴＣＣＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴ－３’（配列番号１））、マウスのホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）遺伝子のプロモーター配列（ｐＰＧＫ）、その下流にハイグロマイシン耐性遺伝子（Ｈｙｇｒｏｒ）、ＰＧＫ遺伝子のポリアデニル化配列（ｐＡ）をつなげ、その下流にｌｏｘ２２７２とは異なるＣｒｅによる認識配列であるｌｏｘＰ配列（５’－ＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＧＣＡＴＡＣＡＴＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴ－３’（配列番号２））、ピューロマイシン耐性遺伝子とヘルペスウイルスチミジンキナーゼのキナーゼドメイン（ΔＴＫ）との融合遺伝子（ＰｕｒｏｒΔＴＫ）、ｐＡ配列、酵母の組換え酵素Ｆｌｉｐｐａｓｅ（ＦＬＰ）の認識配列であるｆｒｔ配列をつなげた形でプラスミドを構築した。
【0096】
まず、図３Ａに示すような、「ベクターとの同一配列（約１５ｂｐ）」-「ｌｏｘ２２７２配列」-「ＰＧＫプロモーター５’側の配列」からなるｐｒｉｍｅｒ１を設計した（図３Ａ）。Ｐｒｉｍｅｒ２を、「ベクターとの同一配列」-「ＰＧＫプロモーターの３’側の配列」のように設計し、ｐＢＲＢｌＩＩ－ＡｓｃＩ＿ＦＲＴＰＧＫｐａｃΔｔｋｐＡ＿ＡｓｃＩベクターを鋳型としてＰＣＲにより増幅を行った（図３Ａ）。次に図３Ｂに示すようにｐＢＲＭＣ１ＤＴＡｐＡベクターを制限酵素ＸｂａＩで切断した。ｐｒｉｍｅｒ１は制限酵素ＸｂａＩで切断したベクター部位の５’側配列－１と、ｐｒｉｍｅｒ２は３’側の約１５ｂｐの配列－２とそれぞれ同一のＤＮＡ配列をもつ（図３Ａ，Ｂ）。図３ＡおよびＢで示された、それぞれＰＣＲ産物と制限酵素ＸｂａＩで切断されたベクターを、Gibson assembly master mix (E2611S, New England Biolabs (NEB))により約１５ｂｐの同一配列を介して連結し、図３Ｃに示す構造のＰＧＫベクターを得た。Gibson assemblyはGibson assembly master mixのマニュアルに従い行った。
【0097】
次に図３ＥおよびＦに示すように、ＰＧＫベクター配列（図３Ｄ）と同一の部分配列－３およびハイグロイマシン耐性遺伝子の５’側の一部からなるｐｒｉｍｅｒ３（図３Ｅ）と、ＰＧＫベクター配列と同一の部分配列－４およびｆｒｔ配列の一部からなるｐｒｉｍｅｒ６（図３Ｆ）を設計した。ｐｒｉｍｅｒ４とｐｒｉｍｅｒ５（図３Ｅ，Ｆ）は、互いに相同となる配列をもち、ｐｒｉｍｅｒ４はｌｏｘＰ配列およびｐＡ配列の一部を、ｐｒｉｍｅｒ－２はピューロマイシン耐性遺伝子（開始コドンを含まない）の一部の配列をもつように設計した。ｐｒｉｍｅｒ３とｐｒｉｍｅｒ４を用いてＰＢ－ｆｌｏｘ（ＣＡＧ－ｍＣｈｅｒｒｙ－ＩＨ；ＴＲＥ３Ｇ－ｍｉＲ－１５５－ＬａｃＺａ）ベクターを鋳型としてＰＣＲにより増幅を行った（図３Ｅ）。
【0098】
同様にｐｒｉｍｅｒ５とｐｒｉｍｅｒ６を用いてｐＢＲＢｌＩＩ－ＡｓｃＩ＿ＦＲＴＰＧＫｐａｃΔｔｋｐＡ＿ＡｓｃＩベクターを鋳型としてＰＣＲにより増幅を行った（図３Ｆ）。次に図３ＣのＰＧＫベクターを制限酵素ＸｂａＩで切断し（図３Ｄ）、図３ＥおよびＦで生成されたＰＣＲ産物をGibson assembly法で連結し、薬剤耐性遺伝子カセットベクターを得た（図３Ｇ）。
プライマーの配列は以下の通りである。
Ｐｒｉｍｅｒ１：５’－ＧＣＧＧＴＧＧＣＧＧＣＣＧＣＴＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＡＡＧＴＡＴＣＣＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴＴＡＣＣＧＧＧＴＡＧＧＧＧＡＧＧＣＧＣＴＴ－３’（配列番号３），
ｐｒｉｍｅｒ２：５’－ＧＧＧＧＡＴＣＣＡＣＴＡＧＴＴＣＴＡＧＡＣＧＡＡＡＧＧＣＣＣＧＧＡＧＡＴＧＡＧＧＡ－３’（配列番号４），
ｐｒｉｍｅｒ３：５’－ＣＴＣＣＧＧＧＣＣＴＴＴＣＧＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＡＡＡＡＧＣＣＴＧＡＡＣＴＣＡＣＣ－３’（配列番号５），
ｐｒｉｍｅｒ４：５’－ＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＡＴＧＣＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴＣＡＡＣＴＡＴＧＡＡＡＣＡＴＴＡＴＣＡＴＡ－３’（配列番号６）
ｐｒｉｍｅｒ５：５’－ＡＴＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴＣＣＡＣＣＧＡＧＴＡＣＡＡＧＣＣＣＡＣＧＧＴＧ－３’（配列番号７），
ｐｒｉｍｅｒ６：５’－ＧＧＧＧＡＴＣＣＡＣＴＡＧＴＴＧＡＡＧＴＴＣＣＴＡＴＡＣＴＴＴＣＴＡＧＡ－３’（配列番号８）
プライマーの配列は以下の通りである。
Ｐｒｉｍｅｒ１：５’－ＧＣＧＧＴＧＧＣＧＧＣＣＧＣＴＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＡＡＧＴＡＴＣＣＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴＴＡＣＣＧＧＧＴＡＧＧＧＧＡＧＧＣＧＣＴＴ－３’（配列番号３），
ｐｒｉｍｅｒ２：５’－ＧＧＧＧＡＴＣＣＡＣＴＡＧＴＴＣＴＡＧＡＣＧＡＡＡＧＧＣＣＣＧＧＡＧＡＴＧＡＧＧＡ－３’（配列番号４），
ｐｒｉｍｅｒ３：５’－ＣＴＣＣＧＧＧＣＣＴＴＴＣＧＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＡＡＡＡＧＣＣＴＧＡＡＣＴＣＡＣＣ－３’（配列番号５），
ｐｒｉｍｅｒ４：５’－ＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＡＴＧＣＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴＣＡＡＣＴＡＴＧＡＡＡＣＡＴＴＡＴＣＡＴＡ－３’（配列番号６）
ｐｒｉｍｅｒ５：５’－ＡＴＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴＣＣＡＣＣＧＡＧＴＡＣＡＡＧＣＣＣＡＣＧＧＴＧ－３’（配列番号７），
ｐｒｉｍｅｒ６：５’－ＧＧＧＧＡＴＣＣＡＣＴＡＧＴＴＧＡＡＧＴＴＣＣＴＡＴＡＣＴＴＴＣＴＡＧＡ－３’（配列番号８）
【0099】
ＰＣＲは、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－Ｎｅｏ（ＫＯＤ－４０１，東洋紡）を用いて、1)９４℃，２分→2)９８℃，１０秒→3)５０～６０℃，３０秒→4)６８℃，２分で行い、２）～４）を３０～３５サイクルで行った。
【0100】
ピューロマイシン耐性遺伝子は、カセット交換する前の発現を避けるために開始コドンを除去した（ｐｒｉｍｅｒ５）。Ｆｒｔの下流には、ＭＣ１プロモーターとジフテリア菌毒素遺伝子（ＤＴＡ）を組み込んだ（図３Ｇ）。
【0101】
３）薬剤耐性遺伝子カセットノックイン用ターゲティングベクターの構築（１）
５’アームおよび３’アームとプロモーターＤＮＡ断片の取得
ヒトＴ細胞受容体β（ＴＣＲβ）Ｄβ２遺伝子（ＴＣＲＤβ２）の約１１０ｂｐ上流の位置からさらに上流約１．６ｋｂｐの位置までのＤＮＡ断片を５’アーム、ＴＣＲＤβ２の上流約５０ ｂｐの位置から下流に約１．６ｋｂｐの位置までのＤＮＡ断片を３’アームとした（図４Ａ）。各ＤＮＡ断片は、Ｊｕｒｋａｔ細胞のゲノムＤＮＡを鋳型として、下記のプライマーを用いてＰＣＲで増幅した。内在性のＶ遺伝子プロモーターとして、本例ではＴＣＲβＶ２０－１遺伝子のプロモーター（Ｖβ２０－１プロモーター）を用いた。Ｖβ２０－１プロモーターには、第一エクソン内の翻訳開始点直前から上流に約１．６ｋｂｐまでのＤＮＡ断片を、Ｊｕｒｋａｔ細胞のゲノムＤＮＡを鋳型として、下記のプライマーを用いてＰＣＲで増幅した。（図４Ｂ）。
５’アームおよび３’アームとプロモーターＤＮＡ断片の取得
ヒトＴ細胞受容体β（ＴＣＲβ）Ｄβ２遺伝子（ＴＣＲＤβ２）の約１１０ｂｐ上流の位置からさらに上流約１．６ｋｂｐの位置までのＤＮＡ断片を５’アーム、ＴＣＲＤβ２の上流約５０ ｂｐの位置から下流に約１．６ｋｂｐの位置までのＤＮＡ断片を３’アームとした（図４Ａ）。各ＤＮＡ断片は、Ｊｕｒｋａｔ細胞のゲノムＤＮＡを鋳型として、下記のプライマーを用いてＰＣＲで増幅した。内在性のＶ遺伝子プロモーターとして、本例ではＴＣＲβＶ２０－１遺伝子のプロモーター（Ｖβ２０－１プロモーター）を用いた。Ｖβ２０－１プロモーターには、第一エクソン内の翻訳開始点直前から上流に約１．６ｋｂｐまでのＤＮＡ断片を、Ｊｕｒｋａｔ細胞のゲノムＤＮＡを鋳型として、下記のプライマーを用いてＰＣＲで増幅した。（図４Ｂ）。
【0102】
ＰＣＲに用いた各プライマーにはそれぞれ、得られたＰＣＲ産物を薬剤耐性カセットベクターに導入する時に利用できるようなＤＮＡ配列が付加されている。その付加配列を介して前述のGibson assembly法を用いてベクター構築を行った。プライマー配列は以下の通りである。
【0103】
５’アーム（約１．６ｋｂｐ）取得用プライマー
Ｐｒｉｍｅｒ５’－１：５’－ＣＴＣＣＡＣＣＧＣＧＧＴＧＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＴＣＡＡＡＡＧＣＴＣＣＴＴＣＴＧＴＴＧＴ－３’（配列番号９）
Ｐｒｉｍｅｒ３’－１：５’－ＡＴＧＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＡＧＣＣＴＴＧＧＡＡＡＡＧＡＣＡＡＡＧＧＣＡＧＴ－３’（配列番号１０）
Ｐｒｉｍｅｒ５’－１：５’－ＣＴＣＣＡＣＣＧＣＧＧＴＧＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＴＣＡＡＡＡＧＣＴＣＣＴＴＣＴＧＴＴＧＴ－３’（配列番号９）
Ｐｒｉｍｅｒ３’－１：５’－ＡＴＧＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＡＧＣＣＴＴＧＧＡＡＡＡＧＡＣＡＡＡＧＧＣＡＧＴ－３’（配列番号１０）
【0104】
３’アーム（約１．６ｋｂｐ）取得用プライマー
Ｐｒｉｍｅｒ５’－２：５’－ＡＧＧＡＡＴＴＣＧＡＴＡＴＣＡＴＴＴＡＡＡＴＧＡＧＧＧＧＧＡＣＴＡＧＣＡＧＧＧＡＧＧＡ－３’ （配列番号１１）
Ｐｒｉｍｅｒ３’－２：５’－ＴＣＧＡＣＧＧＴＡＴＣＧＡＴＡＴＴＴＡＡＡＴＣＣＣＣＧＡＡＡＧＴＣＡＧＧＡＣＧＴＴＧ－３’（配列番号１２）
Ｐｒｉｍｅｒ５’－２：５’－ＡＧＧＡＡＴＴＣＧＡＴＡＴＣＡＴＴＴＡＡＡＴＧＡＧＧＧＧＧＡＣＴＡＧＣＡＧＧＧＡＧＧＡ－３’ （配列番号１１）
Ｐｒｉｍｅｒ３’－２：５’－ＴＣＧＡＣＧＧＴＡＴＣＧＡＴＡＴＴＴＡＡＡＴＣＣＣＣＧＡＡＡＧＴＣＡＧＧＡＣＧＴＴＧ－３’（配列番号１２）
【0105】
Ｖβ２０－１プロモーター（約１．６ｋｂｐ）取得用プライマー
Ｆ：５’－ＧＣＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＴＣＡＴＧＡＧＡＣＣＡＴＣＴＧＴＡＣＣＴＧ－３’ （配列番号１３）
Ｒ：５’－ＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴＡＧＣＴＡＧＴＣＴＴＣＣＧＴＧＡＴＧＧＣＣＴＣＡＣＡＣＣＡ－３’（配列番号１４）
Ｆ：５’－ＧＣＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＴＣＡＴＧＡＧＡＣＣＡＴＣＴＧＴＡＣＣＴＧ－３’ （配列番号１３）
Ｒ：５’－ＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴＡＧＣＴＡＧＴＣＴＴＣＣＧＴＧＡＴＧＧＣＣＴＣＡＣＡＣＣＡ－３’（配列番号１４）
【0106】
ＰＣＲは、Ｊｕｒｋａｔ細胞のゲノムＤＮＡを鋳型として用いて、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－Ｎｅｏで、１）９５℃，３分→２）９８℃，１０秒→３）５０～６０℃，３０秒→４）６８℃，１～３分で行い、２）～４）を３０～３５サイクル行った。
【0107】
４）薬剤耐性遺伝子カセットノックイン用ターゲティングベクターの構築ＩＩ
ＴＣＲβ遺伝子座Ｄβ２領域への薬剤耐性遺伝子カセットノックイン（ＫＩ）ターゲティングベクターの構築
ＴＣＲβ遺伝子座Ｄβ２領域への薬剤耐性遺伝子カセットノックイン（ＫＩ）ターゲティングベクターの構築
【0108】
薬剤耐性遺伝子カセット部位のｆｒｔ部分の外側（下流側）のベクター部分を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで切断し（図５，Ａ）、そこに、３’アームＤＮＡ断片を、Gibson assembly法を用いて、マニュアルに従い導入した（図５，Ｂ）。次に、薬剤カセットのｌｏｘ２２７２の外側（上流側）のベクター部分を制限酵素ＮｏｔＩで切断し（図５，Ｃ）そこに、５’アームＤＮＡ断片とＶβ２０－１プロモーターＤＮＡ断片をGibson assembly法を用いて、同時に導入した（図５，Ｄ）。
【0109】
得られた薬剤耐性遺伝子カセットノックイン（ＫＩ）用のターゲティングベクター（薬剤耐性遺伝子ＫＩターゲティングベクター、７）を以下で使用した。
【0110】
５）相同組換えによるＪｕｒｋａｔ細胞ＴＣＲβ遺伝子座Ｄβ２領域への薬剤耐性遺伝子カセットのノックイン
薬剤耐性遺伝子ノックイン（ＫＩ）－Ｊｕｒｋａｔ細胞の単離
薬剤耐性遺伝子ノックイン（ＫＩ）－Ｊｕｒｋａｔ細胞の単離
【0111】
すべての実験において細胞培養には以下の組成の培養液を用いた。ただし、薬剤で選択する場合には、以下の組成に、各薬剤を加えて培養した。
＊ペニシリン／ストレプトマイシン／Ｌ－グルタミン溶液の組成はペニシリン１０，０００Ｕ／ｍＬ，ストレプトマイシン１０，０００μｇ／ｍＬ，Ｌ－グルタミン２９．２ｍｇ／ｍＬであるため，最終濃度はそれぞれ１００Ｕ／ｍＬ，１００μｇ／ｍＬ，２９２μｇ／ｍＬとなる．
【表1】
【0112】
細胞へのべクター導入はエレクトロポレーション法を用いた。エレクトロポレーションは、Ａｍａｘａ（登録商標）ＣｅｌｌＬｉｎｅＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）ＫｉｔＶキットのマニュアルにしたがって実施した。キット付属の試薬に細胞とベクターを懸濁後、キット付属のキュベットに移し、ＡｍａｘａＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒＩＩ（Ｌｏｎｚａ）にセットして、機器内臓のプログラムＸ００１を用いてベクターを細胞に導入した。
【0113】
Ｔ細胞株であるＪｕｒｋａｔ細胞の、ＴＣＲβ遺伝子座のＤβ２遺伝子の約５０ｂｐ上流部位に（図６上段）、薬剤耐性遺伝子ＫＩターゲティングベクター（ＫＩターゲティングベクター）（図６中段）を用いてＶβ２０－１プロモーターおよび薬剤耐性遺伝子カセットを導入した。導入できた場合の模式図を図６下段に示す。
【0114】
相同組換えによるノックインの効率を高めるために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９nシステムによりＤβ２遺伝子の約５０ｂｐ上流部位に２カ所の一本鎖切断（ニック）を導入した。ＫＩターゲティングベクターを２つのニック導入用ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ｎベクター（下の材料参照）と共に、Ｊｕｒｋａｔ細胞株の亜種である、内在性のＴＣＲβ遺伝子の発現の損なわれたＪ．ＲＴ３－Ｔ３．５Ｊｕｒｋａｔ ｃｅｌｌｓ（以降Ｊｕｒｋａｔβ ｍｕｔａｎｔと記す）（J. Exp. Med. 160. 1284-1299. 1984）に導入した。
【0115】
相同組換えにより薬剤耐性遺伝子カセットをゲノムＤＮＡに取り込んだ細胞では、ＰＧＫプロモーターの作用により第１の薬剤耐性遺伝子であるハイグロマイシン耐性遺伝子が発現する（第２の薬剤耐性遺伝子であるピューロマイシン耐性遺伝子はここでは発現しない）（図６下段）。そのため、まず、２５０μｇ／ｍＬハイグロマイシン／培養液を用いて、薬剤耐性遺伝子カセットをゲノム中に取り込んだクローンを選択した（ポジティブセレクション）。
【0116】
一方、薬剤耐性遺伝子ＫＩターゲティングベクターの５’アーム配列と３’アーム配列の外側のベクター部分がランダムインテグレーションによりゲノムＤＮＡ内に取り込まれた細胞は、ジフテリア毒素（ＤＴＡ）（図３）が細胞内で生成されるため生存できず、取り除かれる（ネガティブセレクション）。次に、そのようにして選択された細胞（クローン）の中から、Ｖβ２０－１プロモーターからｆｒｔまでの薬剤耐性遺伝子カセット部分をＴＣＲＤβ２遺伝子座に取り込んだクローンをＰＣＲ法で同定した。以上により、Ｄβ２領域にＶβ２０－１プロモーターと薬剤耐性遺伝子カセットが導入されたクローン（薬剤耐性遺伝子ＫＩ－Ｊｕｒｋａｔ細胞）を選択した。
【0117】
材料
【表2】
【0118】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ｎベクターは、
Ａ：５’－ＣＡＣＣＧＡＧＧＴＴＡＧＴＣＴＧＡＣＴＧＴＧＴＧ－３’（配列番号１５），
Ｂ：５’－ＡＡＡＣＣＡＣＡＣＡＧＴＣＡＧＡＣＴＡＡＣＣＴＣ－３’ （配列番号１６）
Ｃ：５’－ＣＡＣＣＣＴＧＣＣＧＣＴＧＣＣＣＡＧＴＧＧＴＴＧ－３’ （配列番号１７）
Ｄ：５’－ＡＡＡＣＣＡＡＣＣＡＣＴＧＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＧ－３’ （配列番号１８）
のオリゴヌクレオチドをＡとＢ（ベクター１）、ＣとＤ（ベクター２）の組み合わせでアニールしたものを、制限酵素ＢｂｓＩで切断したプラスミドｐＸ４６０に導入して作製した。
Ａ：５’－ＣＡＣＣＧＡＧＧＴＴＡＧＴＣＴＧＡＣＴＧＴＧＴＧ－３’（配列番号１５），
Ｂ：５’－ＡＡＡＣＣＡＣＡＣＡＧＴＣＡＧＡＣＴＡＡＣＣＴＣ－３’ （配列番号１６）
Ｃ：５’－ＣＡＣＣＣＴＧＣＣＧＣＴＧＣＣＣＡＧＴＧＧＴＴＧ－３’ （配列番号１７）
Ｄ：５’－ＡＡＡＣＣＡＡＣＣＡＣＴＧＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＧ－３’ （配列番号１８）
のオリゴヌクレオチドをＡとＢ（ベクター１）、ＣとＤ（ベクター２）の組み合わせでアニールしたものを、制限酵素ＢｂｓＩで切断したプラスミドｐＸ４６０に導入して作製した。
【0119】
６）薬剤耐性遺伝子ＫＩ－Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるＴＣＲα遺伝子の破壊（ＴＣＲα－ＫＯ薬剤耐性遺伝子ＫＩ－Ｊｕｒｋａｔ細胞の作製）
ＴＣＲは、個々のＴ細胞のもつα鎖とβ鎖の固有の組み合わせにより、特定の抗原／ＨＬＡ複合体を特異的に認識する。本実施例では、後に細胞に導入するＴＣＲのα鎖とβ鎖の組み合わせを厳密に維持するために、内在性のＴＣＲα鎖遺伝子をＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムにより破壊した。
ＴＣＲは、個々のＴ細胞のもつα鎖とβ鎖の固有の組み合わせにより、特定の抗原／ＨＬＡ複合体を特異的に認識する。本実施例では、後に細胞に導入するＴＣＲのα鎖とβ鎖の組み合わせを厳密に維持するために、内在性のＴＣＲα鎖遺伝子をＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムにより破壊した。
【0120】
材料
【表3】
【0121】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターは、
Ｅ：５’－ＣＡＣＣＧＡＧＡＡＴＣＡＡＡＡＴＣＧＧＴＧＡＡＴ－３’（配列番号１９）
Ｆ：５’－ＡＡＡＣＡＴＴＣＡＣＣＧＡＴＴＴＴＧＡＴＴＣＴＣ－３’（配列番号２０）
のオリゴヌクレオチドＥとＦをアニールさせて、制限酵素ＢｂｓＩで切断したｐＸ３３０プラスミドに導入して作製した。
Ｅ：５’－ＣＡＣＣＧＡＧＡＡＴＣＡＡＡＡＴＣＧＧＴＧＡＡＴ－３’（配列番号１９）
Ｆ：５’－ＡＡＡＣＡＴＴＣＡＣＣＧＡＴＴＴＴＧＡＴＴＣＴＣ－３’（配列番号２０）
のオリゴヌクレオチドＥとＦをアニールさせて、制限酵素ＢｂｓＩで切断したｐＸ３３０プラスミドに導入して作製した。
【0122】
５）と同様に細胞にベクターを導入した。その後、単一のＪｕｒｋａｔ細胞の生存を促進するために、１ｗｅｌｌあたり１ｘ１０５個のＢ６マウス胸腺細胞を敷いた９６－ｗｅｌｌプレートに、１ｗｅｌｌあたり０．５個細胞となるように、ベクター導入細胞を播種した。３～４週間後にクローンを単離し、ゲノムＤＮＡを抽出後、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の標的部位を含むＤＮＡ領域をＰＣＲ法で増幅し、そのシークエンスを解読することにより、ＴＣＲα遺伝子を解析した。その結果、両遺伝子座でＴＣＲα遺伝子の破壊（フレームシフトがおこるような変異）が認められたクローンを単離した。これにより、ＴＣＲα－ＫＯ薬剤耐性遺伝子ＫＩ－Ｊｕｒｋａｔ細胞が樹立された。
使用したＰＣＲプライマーは、以下のとおりである。ＰＣＲ産物の配列の解析は、forward primerで行った。
Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ:５’－ＣＣＴＴＧＴＣＣＡＴＣＡＣＴＧＧＣＡＴＣ－３’(配列番号２１)
Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ:５’－ＡＡＡＧＴＣＡＧＡＴＴＴＧＴＴＧＣＴＣＣＡ－３’（配列番号２２）
使用したＰＣＲプライマーは、以下のとおりである。ＰＣＲ産物の配列の解析は、forward primerで行った。
Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ:５’－ＣＣＴＴＧＴＣＣＡＴＣＡＣＴＧＧＣＡＴＣ－３’(配列番号２１)
Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ:５’－ＡＡＡＧＴＣＡＧＡＴＴＴＧＴＴＧＣＴＣＣＡ－３’（配列番号２２）
【0123】
７）ＴＣＲβ－ｐ２Ａ－ＴＣＲαベクター（ＴＣＲドナーベクター）の構築
ＴＣＲはα鎖とβ鎖からなるヘテロ二量体であり、機能的なＴＣＲを発現させるにはα鎖とβ鎖の両方を発現させる必要がある。通常そのような場合は、α鎖とβ鎖の遺伝子をゲノム中の別々の位置に導入し発現させるが、本システムでは外来遺伝子をＴＣＲＤβ２領域のみに導入するので、２つの遺伝子を単一の部位から発現させなくてはならない。それを実現する方法としては、Internal ribosome entry site（ＩＲＥＳ）と、自己開裂型の２Ａペプチドの２つの方法が主に用いられている。ＩＲＥＳは１本のｍＲＮＡから２本のポリペプチドが出来るが、その２つの間で分子数に偏りがでる可能性がある。一方、２Ａペプチドは１本のｍＲＮＡから１本のポリペプチドが生成され、それが切断により２つの分子となるので、２つの分子数比は１対１となる。本実施例では、約２２アミノ酸からなる２Ａペプチドを利用することにより、α鎖とβ鎖遺伝子の両方をＴＣＲＤβ２領域より同時に発現させた。２Ａペプチドには何種類かあるが（ｐ２Ａ、Ｔ２Ａ、Ｅ２Ａ、Ｆ２Ａなど）、その中で切断効率がよいと言われているｐ２Ａペプチドを用いた。ｐ２Ａペプチドで連結したα鎖とβ鎖はＴＣＲα－ｐ２Ａ－ＴＣＲβあるいは、ＴＣＲβ－ｐ２Ａ－ＴＣＲαと記述する。
ＴＣＲはα鎖とβ鎖からなるヘテロ二量体であり、機能的なＴＣＲを発現させるにはα鎖とβ鎖の両方を発現させる必要がある。通常そのような場合は、α鎖とβ鎖の遺伝子をゲノム中の別々の位置に導入し発現させるが、本システムでは外来遺伝子をＴＣＲＤβ２領域のみに導入するので、２つの遺伝子を単一の部位から発現させなくてはならない。それを実現する方法としては、Internal ribosome entry site（ＩＲＥＳ）と、自己開裂型の２Ａペプチドの２つの方法が主に用いられている。ＩＲＥＳは１本のｍＲＮＡから２本のポリペプチドが出来るが、その２つの間で分子数に偏りがでる可能性がある。一方、２Ａペプチドは１本のｍＲＮＡから１本のポリペプチドが生成され、それが切断により２つの分子となるので、２つの分子数比は１対１となる。本実施例では、約２２アミノ酸からなる２Ａペプチドを利用することにより、α鎖とβ鎖遺伝子の両方をＴＣＲＤβ２領域より同時に発現させた。２Ａペプチドには何種類かあるが（ｐ２Ａ、Ｔ２Ａ、Ｅ２Ａ、Ｆ２Ａなど）、その中で切断効率がよいと言われているｐ２Ａペプチドを用いた。ｐ２Ａペプチドで連結したα鎖とβ鎖はＴＣＲα－ｐ２Ａ－ＴＣＲβあるいは、ＴＣＲβ－ｐ２Ａ－ＴＣＲαと記述する。
【0124】
ＴＣＲβ－ｐ２Ａ－ＴＣＲαは、以下のように構築した。ｐＥＮＴＲべクターは、Thermo Fisher Scientific社のＧａｔｅｗａｙシステムという遺伝子組換え系で用いられるエントリーベクターであり、λファージの組換え配列であるａｔｔＬ配列をもち、ａｔｔＲ配列とＬＲクロナーゼ組換え酵素の作用で組換えを生じる（図１０）。図７Ａに示すようにベクター（ｐＥＮＴＲ１ＡあるいはｐＥＮＴＲ３Ｃ：Ｇａｔｅｗａｙべクター、Thermo Fisher Scientific）を制限酵素（ＳａｌＩとＥｃｏＲＩの２カ所）で切断した。一方、ＴＣＲβ（図７Ｂ）、あるいはＴＣＲα（図７Ｃ）をもつプラスミドを鋳型にしてＰＣＲ法でそれぞれのＤＮＡ断片を作製した。Ｐｒｉｍｅｒ１（図７Ｂ）は、ＴＣＲβの配列の一部と、ベクター（図７Ａ）の制限酵素切断部位の５’側の１５ｂｐ（配列－１）と同一の配列をもち、Ｐｒｉｍｅｒ２は、ＴＣＲβの配列の一部と、ｐ２ＡペプチドのＤＮＡ配列約６６ｂｐのうち５４ｂｐをもつ。Ｐｒｉｍｅｒ３（図７Ｃ）は、ＴＣＲαの配列の一部とｐ２Ａ配列の２８ｂｐをもち、ｐｒｉｍｅｒ４は、ＴＣＲαの配列の一部と、ベクターの制限酵素切断部位の３’側の１５ｂｐ（配列－２）と同一の配列をもつ。制限酵素ＳａｌＩとＥｃｏＲＩで切断したｐＥＮＴＲ１Ａベクターと、ＴＣＲβ、ＴＣＲαそれぞれのＰＣＲ産物は、互いに重なる部分を介して（図７Ｄ）、Gibson assembly法で連結した（図７Ｅ）。
【0125】
べクターとしてｐＥＮＴＲ１ＡあるいはｐＥＮＴＲ３Ｃを使用し、かつそれらをＳａｌＩとＥｃｏＲＩで切断して用いる場合は、ｐｒｉｍｅｒ２およびｐｒｉｍｅｒ４はそれぞれ、全てのヒトＴＣＲβおよびＴＣＲαのベクターへのクローニングに使用できる。
【0126】
Ｐｒｉｍｅｒの配列は以下の通りで、ＰＣＲは、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－Ｎｅｏで、1) ９４℃，２ｍｉｎ→２）９８℃，１０ｓｅｃ→３）５０～６０℃，３０ｓｅｃ→４）６８℃，２ｍｉｎで行い、２）～４）を３０～３５サイクル行った。
Ｐｒｉｍｅｒ１：５’－ＡＡＧＧＡＡＣＣＡＡＴＴＣＡＧＴＣＧＡＣＣＡＣＣＡＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＴＣＴＧＣＴＧＣＴＴ－３’（配列番号２３）
Ｐｒｉｍｅｒ２：５’－ＣＴＣＣＴＣＣＡＣＧＴＣＴＣＣＡＧＣＣＴＧＣＴＴＣＡＧＣＡＧＧＣＴＧＡＡＧＴＴＡＧＴＡＧＣＴＣＣＧＣＴＴＣＣＧＣＣＴＣＴＧＧＡＡＴＣＣＴＴＴＣＴＣＴＴ－３’（配列番号２４）
Ｐｒｉｍｅｒ３：５’－ＴＧＧＡＧＡＣＧＴＧＧＡＧＧＡＧＡＡＣＣＣＴＧＧＡＣＣＴＡＴＧＡＴＧＡＴＡＴＣＣＴＴＧＡＧＡＧＴＴ－３’（配列番号２５）
Ｐｒｉｍｅｒ４：５’－ＴＣＧＡＧＴＧＣＧＧＣＣＧＣＧＡＡＴＴＣＴＣＡＧＣＴＧＧＡＣＣＡＣＡＧＣＣＧＣＡＧ－３’（配列番号２６）
Ｐｒｉｍｅｒ１：５’－ＡＡＧＧＡＡＣＣＡＡＴＴＣＡＧＴＣＧＡＣＣＡＣＣＡＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＴＣＴＧＣＴＧＣＴＴ－３’（配列番号２３）
Ｐｒｉｍｅｒ２：５’－ＣＴＣＣＴＣＣＡＣＧＴＣＴＣＣＡＧＣＣＴＧＣＴＴＣＡＧＣＡＧＧＣＴＧＡＡＧＴＴＡＧＴＡＧＣＴＣＣＧＣＴＴＣＣＧＣＣＴＣＴＧＧＡＡＴＣＣＴＴＴＣＴＣＴＴ－３’（配列番号２４）
Ｐｒｉｍｅｒ３：５’－ＴＧＧＡＧＡＣＧＴＧＧＡＧＧＡＧＡＡＣＣＣＴＧＧＡＣＣＴＡＴＧＡＴＧＡＴＡＴＣＣＴＴＧＡＧＡＧＴＴ－３’（配列番号２５）
Ｐｒｉｍｅｒ４：５’－ＴＣＧＡＧＴＧＣＧＧＣＣＧＣＧＡＡＴＴＣＴＣＡＧＣＴＧＧＡＣＣＡＣＡＧＣＣＧＣＡＧ－３’（配列番号２６）
【0127】
８）カセット交換ベクターの構築Ｉ：ベクター骨格の作製
Ｆｒｔ配列とＰＧＫプロモーター配列が互い近傍に位置するプラスミド（ｐＢＲＢｌＩＩ－ＡｓｃＩ＿ＦＲＴＰＧＫｐａｃΔｔｋｐＡ＿ＡｓｃＩ）を鋳型に用いて、ＰＣＲ法でｆｒｔ－ＰＧＫプロモーターＤＮＡ断片を増幅した（図８Ａ）。Ｐｒｉｍｅｒ１は、Ｆｒｔ配列の一部に加え、制限酵素ＮｈｅＩとＸｈｏＩの認識配列、ｌｏｘ２２７２配列、およびｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（－）ベクターの配列－１（図８Ｂ）と同一の配列をもち、ｐｒｉｍｅｒ２は、ＰＧＫプロモーター配列の一部に加え、ｌｏｘＰ配列、ベクターの配列－２と同一の配列をもつ（図８Ａ，Ｂ）。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（－）べクター（図８Ｂ）の配列－１と配列－２は制限酵素（ＫｐｎＩとＳａｃＩ）認識配列の外側である。Ｐｒｉｍｅｒ１とｐｒｉｍｅｒ２を用いて得られたＰＣＲ産物を、制限酵素ＫｐｎＩとＳａｃＩで切断したベクターとGibson assembly法で連結し、Ｆｒｔ－ＰＧＫベクターを作製した（図８Ｃ）。
Ｆｒｔ配列とＰＧＫプロモーター配列が互い近傍に位置するプラスミド（ｐＢＲＢｌＩＩ－ＡｓｃＩ＿ＦＲＴＰＧＫｐａｃΔｔｋｐＡ＿ＡｓｃＩ）を鋳型に用いて、ＰＣＲ法でｆｒｔ－ＰＧＫプロモーターＤＮＡ断片を増幅した（図８Ａ）。Ｐｒｉｍｅｒ１は、Ｆｒｔ配列の一部に加え、制限酵素ＮｈｅＩとＸｈｏＩの認識配列、ｌｏｘ２２７２配列、およびｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（－）ベクターの配列－１（図８Ｂ）と同一の配列をもち、ｐｒｉｍｅｒ２は、ＰＧＫプロモーター配列の一部に加え、ｌｏｘＰ配列、ベクターの配列－２と同一の配列をもつ（図８Ａ，Ｂ）。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（－）べクター（図８Ｂ）の配列－１と配列－２は制限酵素（ＫｐｎＩとＳａｃＩ）認識配列の外側である。Ｐｒｉｍｅｒ１とｐｒｉｍｅｒ２を用いて得られたＰＣＲ産物を、制限酵素ＫｐｎＩとＳａｃＩで切断したベクターとGibson assembly法で連結し、Ｆｒｔ－ＰＧＫベクターを作製した（図８Ｃ）。
【0128】
Ｆｒｔ－ＰＧＫベクター（図８Ｃ）を、ｐｒｉｍｅｒ１内に設計してあった制限酵素認識部位（ＮｈｅＩおよびＸｈｏＩ）で切断し、そこに、制限酵素の切断端と相補的な切断端をもつＤＮＡ１を、ＤＮＡリガーゼを用いて連結した（図８Ｅ）。再度、ｐｒｉｍｅｒ１内に設計してあった制限酵素認識部位の一方（ＮｈｅＩあるいはＸｈｏＩ）で切断し、そこに、ＤＮＡ１と同様にＤＮＡ２を連結する。この過程を繰り返すことにより、ｌｏｘ２２７２とｆｒｔとの間に、任意のＤＮＡ断片を複数個導入できる。導入は、ＤＮＡ連結反応でもGibson assemblyでも可能である。この方法を用いて、プレカセット交換ベクターを構築した（図９）。
【0129】
９）カセット交換ベクターの構築ＩＩ：プレカセット交換ベクターの構築
ａｔｔＲ１配列、クロラムフェニコール耐性遺伝子、ｃｃｄｂ遺伝子およびａｔｔＲ２配列からなる遺伝子カセット（ＲｆＡカセット）をＣＳＩＶ－ＴＲＥ－ＲｆＡ－ＣＭＶ－ＫＴベクターから制限酵素ＮｈｅＩとＸｈｏＩによって切り出し、図８Ｄ～図８Ｇの要領で、制限酵素ＮｈｅＩとＸｈｏＩによって切断したＦｔｒ－ＰＧＫべクター（図９Ａ）にＤＮＡリガーゼによって連結し、プレカセット交換ベクター１を構築した（図９Ｂ）。べクター（ｐＣＡＧ－ＥＧｘｘＦＰ）をＸｈｏＩで切断してウサギβ－ｇｌｏｂｉｎ遺伝子のポリＡ付加配列を単離し（図９Ｃ）、ＸｈｏＩで切断したプレカセット交換ベクター１に導入し、プレカセット交換ベクター２を構築した（図９Ｄ）。さらに、プレカセット交換ベクター２をＮｈｅＩで切断し、ＰＣＲ法で増幅したヒトポリペプチド鎖伸長因子α（ＥＦ１α）遺伝子の第一イントロン、あるいはニワトリβ－アクチン（ＣＡＧ）遺伝子プロモーターのイントロン部分（図９Ｅ）をGibson assembly法で連結した（図９Ｆ）。イントロンをｌｏｘ２２７２の直後にもつプレカセット交換べクターを、プレカセット交換べクター３とした。
ａｔｔＲ１配列、クロラムフェニコール耐性遺伝子、ｃｃｄｂ遺伝子およびａｔｔＲ２配列からなる遺伝子カセット（ＲｆＡカセット）をＣＳＩＶ－ＴＲＥ－ＲｆＡ－ＣＭＶ－ＫＴベクターから制限酵素ＮｈｅＩとＸｈｏＩによって切り出し、図８Ｄ～図８Ｇの要領で、制限酵素ＮｈｅＩとＸｈｏＩによって切断したＦｔｒ－ＰＧＫべクター（図９Ａ）にＤＮＡリガーゼによって連結し、プレカセット交換ベクター１を構築した（図９Ｂ）。べクター（ｐＣＡＧ－ＥＧｘｘＦＰ）をＸｈｏＩで切断してウサギβ－ｇｌｏｂｉｎ遺伝子のポリＡ付加配列を単離し（図９Ｃ）、ＸｈｏＩで切断したプレカセット交換ベクター１に導入し、プレカセット交換ベクター２を構築した（図９Ｄ）。さらに、プレカセット交換ベクター２をＮｈｅＩで切断し、ＰＣＲ法で増幅したヒトポリペプチド鎖伸長因子α（ＥＦ１α）遺伝子の第一イントロン、あるいはニワトリβ－アクチン（ＣＡＧ）遺伝子プロモーターのイントロン部分（図９Ｅ）をGibson assembly法で連結した（図９Ｆ）。イントロンをｌｏｘ２２７２の直後にもつプレカセット交換べクターを、プレカセット交換べクター３とした。
【0130】
ＥＦ１α遺伝子のイントロンおよびＣＡＧプロモーターのイントロン部分はそれぞれ、ヒトのゲノムＤＮＡとｐＣＡＧ－Ｃｒｅ－ＩＰべクターを鋳型にして、以下のプライマーを用いてＰＣＲ法により単離した。
ＥＦ１α遺伝子のイントロン：
Ｆ：５’－ＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴＣＧＣＴＡＧＣＧＧＴＴＴＧＣＣＧＣＣＡＧＡＡＣＡＣＡＧ－３’（配列番号２７）
Ｒ：５’－ＴＡＣＡＡＡＣＴＴＧＴＧＡＴＧＣＴＡＧＣＧＴＡＧＴＴＴＴＣＡＣＧＡＣＡＣＣＴＧＡ－３’（配列番号２８）
ＣＡＧプロモーター中のイントロン部分：
Ｆ：５’－ＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴＣＧＣＴＡＧＣＧＣＣＣＣＧＧＣＴＣＴＧＡＣＴＧＡＣＣＧ－３’（配列番号２９）
Ｒ：５’－ＴＡＣＡＡＡＣＴＴＧＴＧＡＴＧＣＴＡＧＣＧＡＣＡＧＣＡＣＡＡＴＡＡＣＣＡＧＣＡＣ－３’（配列番号３０）
ＰＣＲは、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－Ｎｅｏで、１）９５℃，３ｍｉｎ→２）９８℃，１０ｓｅｃ→３）５０～６０℃，３０ｓｅｃ→４）６８℃，１～３ｍｉｎで行い２）～４）を３０～３５サイクル行った。
ＥＦ１α遺伝子のイントロン：
Ｆ：５’－ＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴＣＧＣＴＡＧＣＧＧＴＴＴＧＣＣＧＣＣＡＧＡＡＣＡＣＡＧ－３’（配列番号２７）
Ｒ：５’－ＴＡＣＡＡＡＣＴＴＧＴＧＡＴＧＣＴＡＧＣＧＴＡＧＴＴＴＴＣＡＣＧＡＣＡＣＣＴＧＡ－３’（配列番号２８）
ＣＡＧプロモーター中のイントロン部分：
Ｆ：５’－ＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴＣＧＣＴＡＧＣＧＣＣＣＣＧＧＣＴＣＴＧＡＣＴＧＡＣＣＧ－３’（配列番号２９）
Ｒ：５’－ＴＡＣＡＡＡＣＴＴＧＴＧＡＴＧＣＴＡＧＣＧＡＣＡＧＣＡＣＡＡＴＡＡＣＣＡＧＣＡＣ－３’（配列番号３０）
ＰＣＲは、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－Ｎｅｏで、１）９５℃，３ｍｉｎ→２）９８℃，１０ｓｅｃ→３）５０～６０℃，３０ｓｅｃ→４）６８℃，１～３ｍｉｎで行い２）～４）を３０～３５サイクル行った。
【0131】
１０）カセット交換ベクターの構築III：ＴＣＲカセット交換ベクターの作製
プレカセット交換ベクター３（図９Ｆ，図１０上段）とＴＣＲドナーベクター（図７Ｅ，図１０中段）を混合して、ＧａｔｅｗａｙＲＬＲクロナーゼＴＭＩＩ酵素ミックス（Thermo Fisher Scientific，１１７９１－０２０）のマニュアルに従って反応を行った。この反応では、ａｔｔＲとａｔｔＬの間で組換えが起こり、ａｔｔＲ１とａｔｔＲ２で挟まれる部分とａｔｔＬ１とａｔｔＬ２で挟まれる部分が入れ替わる（図１０）。結果として、ＴＣＲカセット交換ベクター（図１０下段）を得た。本実施例では、ＣＡＧプロモーター由来のイントロンをもつプレカセット交換ベクター３を用いた。
プレカセット交換ベクター３（図９Ｆ，図１０上段）とＴＣＲドナーベクター（図７Ｅ，図１０中段）を混合して、ＧａｔｅｗａｙＲＬＲクロナーゼＴＭＩＩ酵素ミックス（Thermo Fisher Scientific，１１７９１－０２０）のマニュアルに従って反応を行った。この反応では、ａｔｔＲとａｔｔＬの間で組換えが起こり、ａｔｔＲ１とａｔｔＲ２で挟まれる部分とａｔｔＬ１とａｔｔＬ２で挟まれる部分が入れ替わる（図１０）。結果として、ＴＣＲカセット交換ベクター（図１０下段）を得た。本実施例では、ＣＡＧプロモーター由来のイントロンをもつプレカセット交換ベクター３を用いた。
【0132】
１１）ＴＣＲα－ＫＯ薬剤耐性遺伝子ＫＩ－Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるＴＣＲカセット交換（ＴＣＲカセット交換Ｊｕｒｋａｔ細胞の作製）
材料
材料
【表4】
【0133】
図１１に、相同組換え後のヒトＴＣＲβ遺伝子座Ｄβ２領域（空カセットデッキ：ｌｏｘ２２７２とｌｏｘＰで挟まれる領域）（上段）および、ＴＣＲカセット交換ベクター（中段）、そして、カセット交換後のＴＣＲβ遺伝子座（下段）を模式的に示す。カセット交換を引き起こすために、ＴＣＲα－ＫＯ薬剤耐性遺伝子ＫＩ－Ｊｕｒｋａｔ細胞にＴＣＲカセット交換ベクターおよびＣｒｅ発現ベクター（ｐＣＡＧ－ｎｌｓ－Ｃｒｅ）をエレクトロポレーション法により導入した。本実施例では、ＷＴ１抗原に対するＴＣＲ（ＫＭ＃３－３）の導入を試みた。Ｃｒｅとカセット交換ベクターの導入により、ｌｏｘ２２７２配列とｌｏｘＰ配列に挟まれる部分、すなわちハイグロマイシン耐性遺伝子と、ＴＣＲ遺伝子－ｆｒｔ－ＰＧＫプロモーターが、組換え酵素Ｃｒｅの作用により入れ替わる（カセット交換）。カセット交換前、ピューロマイシン耐性遺伝子はプロモーターおよび開始コドンが欠如しているため発現しない。それに対しカセット交換後は、ＰＧＫプロモーターがピューロマイシン耐性遺伝子の直前に位置するようになり、かつ、ｌｏｘＰの直前に配置した開始コドンがピューロマイシン耐性遺伝子と同一の翻訳読み枠で連結される。それにより、カセット交換が成功した細胞でのみ、ピューロマイシン耐性遺伝子の発現が開始される。０．２５μｇ／ｍＬピューロマイシン／培養液を用いて細胞を選択し、約一週間後、ピューロマイシン耐性を獲得した細胞（ＴＣＲカセット交換Ｊｕｒｋａｔ細胞）を得た。
【0134】
１２）ＴＣＲカセット交換Ｊｕｒｋａｔ細胞へのＦＬＰベクターの導入（外来性ＴＣＲ発現Ｊｕｒｋａｔ細胞の作製）
材料
材料
【表5】
【0135】
ＦＬＰ組換え酵素発現ベクター（ｐＣＡＧＧＳ－ＦＬＰｅ）を、ＴＣＲカセット交換Ｊｕｒｋａｔ細胞にエレクトロポレーション法で導入した。ＦＬＰはｆｒｔ配列を認識し、それらによって挟まれる領域を欠失させる。図１２に、カセット交換後のＴＣＲβ遺伝子座Ｄβ２領域（上段）と、ｆｒｔ配列で挟まれた部の欠失が起きたＴＣＲβ遺伝子座（下段）を示す。
【0136】
ＦＬＰ導入数日後、細胞をＴＣＲあるいはＣＤ３に対する蛍光標識抗体（ＰＥ／Ｃｙ７ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎＴＣＲα／β（３０６７１９，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）とＡＰＣーＭｏｕｓｅＡｎｔｉ－ＨｕｍａｎＣＤ３（５５７５９７，ＢＤＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ））で染色し、ＦＡＣＳにより解析することで、外来性ＴＣＲの発現量を評価した。生体内のＴ細胞では、ＴＣＲＶβ遺伝子のプロモーターはＴＣＲＣβ領域のエンハンサーによる調節を受ける。そのことから、ＴＣＲＶβ遺伝子のプロモーターの使用により、本実施例でも生理的条件下での状態と同様な発現制御を受けることが期待できる。ＦＬＰ導入後に、カセット交換によりＴＣＲβ遺伝子座に導入した外来性ＴＣＲの発現が実際に認められた（図１３）。Ｆｒｔ配列間の欠失が起き、結果としてエンハンサー（Ｅｎｈ）がプロモーター（ｐｒｏｍ）に効率良く作用出来るようになり、ＴＣＲが発現するようになったと考えられる。
【0137】
１３）非ＦＬＰ組換え細胞のガンシクロビルによる除去
図１３の結果では、ＴＣＲが発現する集団と発現しない集団が存在する。ＦＬＰの作用によりｆｒｔではさまれる領域が欠失した細胞と、欠失が起こらなかった細胞が混在していた可能性が考えられる。そこで、ガンシクロビルを用いて、欠失し損ねた細胞（ＦＬＰによる組換えが失敗した細胞）の除去を試みた。通常、Ｊｕｒｋａｔ細胞のようなヒトの細胞にはガンシクロビルは作用しない（図１４A）。それに対し、ＰｕｒｏｒΔＴＫが存在する細胞内ではガンシクロビルは、ΔＴＫによってリン酸化されると核酸のアナログとなって、その結果、ＤＮＡ複製を阻害して細胞増殖の停止、あるいは細胞死を引き起こす（図１４B）。１２μＭガンシクロビル／培養液で５日間培養した後ＴＣＲおよびＣＤ３の細胞膜上での発現をＦＡＣＳで解析した。その結果、ＴＣＲを発現しない細胞はほとんど認められなかった（図１５）。ＴＣＲを発現していなかった細胞集団は、ＦＬＰによる組換えが起きていなかったと考えられる。
図１３の結果では、ＴＣＲが発現する集団と発現しない集団が存在する。ＦＬＰの作用によりｆｒｔではさまれる領域が欠失した細胞と、欠失が起こらなかった細胞が混在していた可能性が考えられる。そこで、ガンシクロビルを用いて、欠失し損ねた細胞（ＦＬＰによる組換えが失敗した細胞）の除去を試みた。通常、Ｊｕｒｋａｔ細胞のようなヒトの細胞にはガンシクロビルは作用しない（図１４A）。それに対し、ＰｕｒｏｒΔＴＫが存在する細胞内ではガンシクロビルは、ΔＴＫによってリン酸化されると核酸のアナログとなって、その結果、ＤＮＡ複製を阻害して細胞増殖の停止、あるいは細胞死を引き起こす（図１４B）。１２μＭガンシクロビル／培養液で５日間培養した後ＴＣＲおよびＣＤ３の細胞膜上での発現をＦＡＣＳで解析した。その結果、ＴＣＲを発現しない細胞はほとんど認められなかった（図１５）。ＴＣＲを発現していなかった細胞集団は、ＦＬＰによる組換えが起きていなかったと考えられる。
【実施例2】
【0138】
ヒトｉＰＳ細胞ＴＣＲβ遺伝子座Ｄβ２領域への薬剤耐性遺伝子カセットのノックイン
【0139】
１）試薬・抗体等：
Stem Fit（登録商標） AK02N(TAKARA, AJ100)、Y-27632 (Wako, 257-00511)、Vitronectin (Thermo Fisher, A14700)、Hygromycin（Invivogen, ant-hg-1）、lipofectamine（登録商標）(Thermo Fisher, 11668027)、Opti-MEM（登録商標） (Thermo Fisher, 31985070)、KOD-FX (TOYOBO, KFX-101)を用いた。
ヒトｉＰＳ細胞としては、253G1（理研、ヒト皮膚細胞由来）を用いた。
２）相同組換えによるヒトiPS細胞ＴＣＲβ遺伝子座Ｄβ２領域への薬剤耐性遺伝子カセットのノックイン
薬剤耐性遺伝子ノックイン（ＫＩ）－iPS細胞の単離
Stem Fit（登録商標） AK02N(TAKARA, AJ100)、Y-27632 (Wako, 257-00511)、Vitronectin (Thermo Fisher, A14700)、Hygromycin（Invivogen, ant-hg-1）、lipofectamine（登録商標）(Thermo Fisher, 11668027)、Opti-MEM（登録商標） (Thermo Fisher, 31985070)、KOD-FX (TOYOBO, KFX-101)を用いた。
ヒトｉＰＳ細胞としては、253G1（理研、ヒト皮膚細胞由来）を用いた。
２）相同組換えによるヒトiPS細胞ＴＣＲβ遺伝子座Ｄβ２領域への薬剤耐性遺伝子カセットのノックイン
薬剤耐性遺伝子ノックイン（ＫＩ）－iPS細胞の単離
【0140】
すべての実験においてiPS細胞の培養にはヒトiPS細胞用培地であるStem Fit（登録商標） AK02N(TAKARA, AJ100)を用いた。Stem FitにはY-27632 (Wako, 257-00511) を終濃度10 μMになるように添加した。細胞を播種する際は、Vitronectin (Thermo Fisher, A14700) をコートした6-wellプレートを用いた。ただし、ハイグロマイシンで選択する場合には、Hygromycin（Invivogen, ant-hg-1）５０μｇ／ｍＬを加えて培養した。
【0141】
薬剤耐性遺伝子カセットノックイン用ターゲティングベクターを実施例1と同様の方法でデザインし、実施例1と同様にしてｉＰＳ細胞へ導入した。
細胞へのべクター導入はリポフェクション法を用いた。リポフェクションは、lipofectamine（登録商標）(Thermo Fisher, 11668027) のマニュアルにしたがって実施した。Opti-MEM（登録商標） (Thermo Fisher, 31985070)培地にベクターとlipofectamineを懸濁後、細胞と混合しベクターを細胞に導入した。
細胞へのべクター導入はリポフェクション法を用いた。リポフェクションは、lipofectamine（登録商標）(Thermo Fisher, 11668027) のマニュアルにしたがって実施した。Opti-MEM（登録商標） (Thermo Fisher, 31985070)培地にベクターとlipofectamineを懸濁後、細胞と混合しベクターを細胞に導入した。
【0142】
ヒトiPS細胞の、ＴＣＲβ遺伝子座のＤβ２遺伝子の約５０ｂｐ上流部位に（図６上段）、薬剤耐性遺伝子ＫＩターゲティングベクター（ＫＩターゲティングベクター）（図６中段）を用いてＶβ２０－１プロモーターおよび薬剤耐性遺伝子カセットを導入した。導入が成功した場合の模式図は図６下段に示される。
【0143】
相同組換えによるノックインの効率を高めるために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムによりＤβ２遺伝子の約５０ｂｐ上流部位に1カ所の二重鎖切断を導入した。ＫＩターゲティングベクターを１つの二重鎖切断導入用ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクター（下の材料参照）と共に、ヒトiPS細胞に導入した。
【0144】
相同組換えにより薬剤耐性遺伝子カセットをゲノムＤＮＡに取り込んだ細胞では、ＰＧＫプロモーターの作用により第１の薬剤耐性遺伝子であるハイグロマイシン耐性遺伝子が発現する（第２の薬剤耐性遺伝子であるピューロマイシン耐性遺伝子はここでは発現しない）（図６下段）。そのため、まず、５０μｇ／ｍＬハイグロマイシン／培養液を用いて、薬剤耐性遺伝子カセットをゲノム中に取り込んだクローンを選択した（ポジティブセレクション）。
【0145】
一方、薬剤耐性遺伝子ＫＩターゲティングベクターの５’アーム配列と３’アーム配列の外側のベクター部分がランダムインテグレーションによりゲノムＤＮＡ内に取り込まれた細胞は、ジフテリア毒素（ＤＴＡ）（図３）が細胞内で生成されるため生存できず、取り除かれる（ネガティブセレクション）。次に、そのようにして選択された細胞（クローン）の中から、Ｖβ２０－１プロモーターからｆｒｔまでの薬剤耐性遺伝子カセット部分をＴＣＲＤβ２遺伝子座に取り込んだクローンをＰＣＲ法で同定した。以上により、Ｄβ２領域にＶβ２０－１プロモーターと薬剤耐性遺伝子カセットが導入されたクローン（薬剤耐性遺伝子ＫＩ－iPS細胞）を選択した。
【0146】
材料
【表6】
【0147】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターは、
Ａ：５’－ＣＡＣＣＣＴＧＣＣＧＣＴＧＣＣＣＡＧＴＧＧＴＴＧ－３’ （配列番号３１）
Ｂ：５’－ＡＡＡＣＣＡＡＣＣＡＣＴＧＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＧ－３’ （配列番号３２）
のオリゴヌクレオチドをＡとＢの組み合わせでアニールしたものを、制限酵素ＢｂｓＩで切断したプラスミドｐＸ３３０に導入して作製した。
Ａ：５’－ＣＡＣＣＣＴＧＣＣＧＣＴＧＣＣＣＡＧＴＧＧＴＴＧ－３’ （配列番号３１）
Ｂ：５’－ＡＡＡＣＣＡＡＣＣＡＣＴＧＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＧ－３’ （配列番号３２）
のオリゴヌクレオチドをＡとＢの組み合わせでアニールしたものを、制限酵素ＢｂｓＩで切断したプラスミドｐＸ３３０に導入して作製した。
【0148】
ハイグロマイシン耐性クローンに対し、ノックインが成功しているか調べるためゲノムＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲを行なった。ＰＣＲはＫＯＤ－ＦＸ（ＴＯＹＯＢＯ， ＫＦＸ－１０１）を用いて、１）９４℃２分、→２）９８℃１０秒、→３）６０℃３０秒→４）６８℃５分で行い、２）～4）を３５サイクルで行った。ＰＣＲで用いたプライマーを以下に示す。
Primer Forward （１）５’－ＡＣＧＧＣＴＧＡＡＡＴＣＴＣＣＣＴＡＡＣＣＣ－３’（配列番号３３）
Primer Reverse （２）５’－ＴＡＣＴＴＣＣＡＴＴＴＧＴＣＡＣＧＴＣＣＴＧ－３’（配列番号３４）
Primer Forward （３）５’－ＣＣＴＧＣＴＧＣＡＡＣＴＴＡＣＣＴＣＣ－３’（配列番号３５）
Primer Reverse （４）５’－ＧＧＧＧＡＣＣＧＡＧＧＧＧＣＴＧＧＡＡＧ－３’（配列番号３６）
それぞれのプライマーの配列部位を図１６（Ａ）および（Ｂ）に示した。ＰＣＲ産物の電気泳動の結果を図１６（Ｃ）に示す。図１６（Ｃ）において、1、２、３はクローン番号を示す。２および３は正しくノックインに成功したクローンであることが確認できた。ポジティブコントロール（ＰＣ）はＫＩ－Ｊｕｒｋａｔ細胞、ＷＴｉＰＳはノックイン前のｉＰＳ細胞のゲノムＤＮＡをそれぞれ用いた。
Primer Forward （１）５’－ＡＣＧＧＣＴＧＡＡＡＴＣＴＣＣＣＴＡＡＣＣＣ－３’（配列番号３３）
Primer Reverse （２）５’－ＴＡＣＴＴＣＣＡＴＴＴＧＴＣＡＣＧＴＣＣＴＧ－３’（配列番号３４）
Primer Forward （３）５’－ＣＣＴＧＣＴＧＣＡＡＣＴＴＡＣＣＴＣＣ－３’（配列番号３５）
Primer Reverse （４）５’－ＧＧＧＧＡＣＣＧＡＧＧＧＧＣＴＧＧＡＡＧ－３’（配列番号３６）
それぞれのプライマーの配列部位を図１６（Ａ）および（Ｂ）に示した。ＰＣＲ産物の電気泳動の結果を図１６（Ｃ）に示す。図１６（Ｃ）において、1、２、３はクローン番号を示す。２および３は正しくノックインに成功したクローンであることが確認できた。ポジティブコントロール（ＰＣ）はＫＩ－Ｊｕｒｋａｔ細胞、ＷＴｉＰＳはノックイン前のｉＰＳ細胞のゲノムＤＮＡをそれぞれ用いた。
【実施例3】
【0149】
図２－１の態様、すなわち材料細胞のＴＣＲ遺伝子Ｃ領域のエンハンサーと、Ｖ領域のプロモーターの間の距離を縮めるように、外来のＴＣＲまたはＣＡＲ遺伝子を含む遺伝子を導入するためのカセットを導入する方法の実施例である。
実施例３では、遺伝子再構成の起きていないＴＣＲβ遺伝子座Ｖ領域のＶβ２０－１遺伝子からＴＣＲＣ領域のＣβ２遺伝子までの約１８０ｋｂｐにわたる領域を欠失させた細胞株を樹立した。樹立方法の概略を図２０に示す。材料細胞としてはJurkat細胞株の亜種で、再構成したＴＣＲβ遺伝子が変異によって発現しなくなったJ.RT3-T3.5 Jurkat 細胞株（以下Jurkat β mutant）（Ohashi et al, Science 316. 606-609. 1985）を用いた。
実施例３では、遺伝子再構成の起きていないＴＣＲβ遺伝子座Ｖ領域のＶβ２０－１遺伝子からＴＣＲＣ領域のＣβ２遺伝子までの約１８０ｋｂｐにわたる領域を欠失させた細胞株を樹立した。樹立方法の概略を図２０に示す。材料細胞としてはJurkat細胞株の亜種で、再構成したＴＣＲβ遺伝子が変異によって発現しなくなったJ.RT3-T3.5 Jurkat 細胞株（以下Jurkat β mutant）（Ohashi et al, Science 316. 606-609. 1985）を用いた。
【0150】
（１）ＴＣＲβ遺伝子座のＶβ２０－１領域およびＣβ２領域のゲノムＤＮＡ切断
Jurkat β mutant細胞のゲノムＤＮＡのＴＣＲＶβ２０－１遺伝子の翻訳開始点より30 bp ～ 80 bp下流の領域、およびＴＣＲＣβ２遺伝子エキソン1内において、それぞれ２カ所ずつ一本鎖切断（ニック）を導入してゲノムＤＮＡを切断した（図２０上段の縦線）。ゲノムＤＮＡの切断のため、４つのCRISPR/Cas9nベクター（下記材料参照）とＥＧＦＰ発現ベクターを共に、エレクトロポレーション法でJurkat β mutantに導入した。
Jurkat β mutant細胞のゲノムＤＮＡのＴＣＲＶβ２０－１遺伝子の翻訳開始点より30 bp ～ 80 bp下流の領域、およびＴＣＲＣβ２遺伝子エキソン1内において、それぞれ２カ所ずつ一本鎖切断（ニック）を導入してゲノムＤＮＡを切断した（図２０上段の縦線）。ゲノムＤＮＡの切断のため、４つのCRISPR/Cas9nベクター（下記材料参照）とＥＧＦＰ発現ベクターを共に、エレクトロポレーション法でJurkat β mutantに導入した。
【0151】
【表7】
【0152】
用いたCRISPR/Cas9nベクターは、以下の通りである：
Ｖβ２０－１側
Ａ：５’－ＣＡＣＣＧＧＴＡＧＡＡＧＧＡＧＧＣＴＴＡＴＡＣＣ－３’（配列番号37）
Ｂ：５’－ＡＡＡＣＧＧＴＡＴＡＡＧＣＣＴＣＣＴＴＣＴＡＣＣ－３’（配列番号38）
Ｃ：５’－ＣＡＣＣＧＧＧＴＧＧＧＣＡＴＧＴＧＣＧＴＧＴＧＴ－３’（配列番号39）
Ｄ：５’－ＡＡＡＣＡＣＡＣＡＣＧＣＡＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＣ－３’（配列番号40）
Ｃβ２側
Ｅ：５’－ＣＡＣＣＧＣＡＡＡＣＡＣＡＧＣＧＡＣＣＴＣＧＧＧＴ－３’（配列番号41）
Ｆ：５’－ＡＡＡＣＡＣＣＣＧＡＧＧＴＣＧＣＴＧＴＧＴＴＴＧＣ－３’（配列番号42）
Ｇ：５’－ＣＡＣＣＡＧＡＧＡＴＣＴＣＣＣＡＣＡＣＣＣＡＡＡ－３’（配列番号43）
Ｈ：５’－ＡＡＡＣＴＴＴＧＧＧＴＧＴＧＧＧＡＧＡＴＣＴＣＴ－３’ （配列番号44）
Ｖβ２０－１側
Ａ：５’－ＣＡＣＣＧＧＴＡＧＡＡＧＧＡＧＧＣＴＴＡＴＡＣＣ－３’（配列番号37）
Ｂ：５’－ＡＡＡＣＧＧＴＡＴＡＡＧＣＣＴＣＣＴＴＣＴＡＣＣ－３’（配列番号38）
Ｃ：５’－ＣＡＣＣＧＧＧＴＧＧＧＣＡＴＧＴＧＣＧＴＧＴＧＴ－３’（配列番号39）
Ｄ：５’－ＡＡＡＣＡＣＡＣＡＣＧＣＡＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＣ－３’（配列番号40）
Ｃβ２側
Ｅ：５’－ＣＡＣＣＧＣＡＡＡＣＡＣＡＧＣＧＡＣＣＴＣＧＧＧＴ－３’（配列番号41）
Ｆ：５’－ＡＡＡＣＡＣＣＣＧＡＧＧＴＣＧＣＴＧＴＧＴＴＴＧＣ－３’（配列番号42）
Ｇ：５’－ＣＡＣＣＡＧＡＧＡＴＣＴＣＣＣＡＣＡＣＣＣＡＡＡ－３’（配列番号43）
Ｈ：５’－ＡＡＡＣＴＴＴＧＧＧＴＧＴＧＧＧＡＧＡＴＣＴＣＴ－３’ （配列番号44）
【0153】
各オリゴヌクレオチドＡとＢ（ベクター１）、ＣとＤ（ベクター２）、ＥとＦ（ベクター３）、ＧとＨ（ベクター４）の組み合わせでアニールしたものを、制限酵素ＢｂｓＩで切断したプラスミドｐＸ４６０に挿入し、作製した。
【0154】
（２）Ｖβ２０－１遺伝子からＣβ２遺伝子までの約180 kbpにわたる領域が欠失した細胞の単離
CRISPR/Cas9nベクターが多く導入された細胞では、ゲノムの切断がより高効率で起こると期待できる。よって、ベクターを特に多く取り込んだ細胞群をソーティングにより選抜し、クローン化した。そのために、遺伝子導入から2日後に、遺伝子導入効率の指標となるEGFPの発現レベルが特に高い細胞群を、セルソーターを用いて直接、96-wellプレートに1 wellあたり1細胞となるよう播種して培養した（クローン化）（図２１Ａ）。Jurkat β mutant細胞の生存を維持するために、96-wellプレートには予め1 x 105個のB6マウス胸腺細胞を播種しておいた。培養開始4 ～5週間後に各クローンよりゲノムDNAを抽出して、Ｖβ２０－１領域とＣβ２領域が連結しているかPCR法により解析した。PCR法に用いたプライマーは下に示す。Forwardプライマーは、Ｖβ２０－１遺伝子翻訳開始点の約140 bp上流に、reverseプライマーはＣβ２遺伝子エキソン1の直後の配列に対応する（図１８Ｂ）。CRISPR/Cas9nベクターの導入により切断が予想される部位の近傍同士で連結が起きた場合、およそ500 bpのDNA断片がPCRで増幅される。PCR反応物を電気泳動で解析した結果、クローン＃１０、＃１１、＃１６および＃17でＶβ２０－１領域とＣβ２領域の連結が示唆された（図２１Ｃ）。クローン#10に関して、PCR法による増幅で得たDNA断片の配列を解析すると、Ｖβ２０－１領域とＣβ２領域が6 bpのDNAを介して連結していることが確認された（図２１Ｄ）。これにより、約180 kbpにわたる領域が欠失してＶβ２０－１領域とＣβ２領域が連結したJurkat β mutant株が樹立された。また、他のクローンでも、Ｖβ２０－１領域とＣβ２領域の連結が、ＤＮＡ配列の解析から確認された。
CRISPR/Cas9nベクターが多く導入された細胞では、ゲノムの切断がより高効率で起こると期待できる。よって、ベクターを特に多く取り込んだ細胞群をソーティングにより選抜し、クローン化した。そのために、遺伝子導入から2日後に、遺伝子導入効率の指標となるEGFPの発現レベルが特に高い細胞群を、セルソーターを用いて直接、96-wellプレートに1 wellあたり1細胞となるよう播種して培養した（クローン化）（図２１Ａ）。Jurkat β mutant細胞の生存を維持するために、96-wellプレートには予め1 x 105個のB6マウス胸腺細胞を播種しておいた。培養開始4 ～5週間後に各クローンよりゲノムDNAを抽出して、Ｖβ２０－１領域とＣβ２領域が連結しているかPCR法により解析した。PCR法に用いたプライマーは下に示す。Forwardプライマーは、Ｖβ２０－１遺伝子翻訳開始点の約140 bp上流に、reverseプライマーはＣβ２遺伝子エキソン1の直後の配列に対応する（図１８Ｂ）。CRISPR/Cas9nベクターの導入により切断が予想される部位の近傍同士で連結が起きた場合、およそ500 bpのDNA断片がPCRで増幅される。PCR反応物を電気泳動で解析した結果、クローン＃１０、＃１１、＃１６および＃17でＶβ２０－１領域とＣβ２領域の連結が示唆された（図２１Ｃ）。クローン#10に関して、PCR法による増幅で得たDNA断片の配列を解析すると、Ｖβ２０－１領域とＣβ２領域が6 bpのDNAを介して連結していることが確認された（図２１Ｄ）。これにより、約180 kbpにわたる領域が欠失してＶβ２０－１領域とＣβ２領域が連結したJurkat β mutant株が樹立された。また、他のクローンでも、Ｖβ２０－１領域とＣβ２領域の連結が、ＤＮＡ配列の解析から確認された。
【0155】
PCRプライマー：
Forwardプライマー:５’－ＧＴＣＡＴＧＧＧＣＡＡＡＧＡＴＴＡＣＣＡＣ－３’(配列番号45）
Reverseプライマー:５’－ＧＧＴＡＧＣＴＧＧＴＣＴＣＡＣＣＴＡＡＴＣ－３’（配列番号46）
Forwardプライマー:５’－ＧＴＣＡＴＧＧＧＣＡＡＡＧＡＴＴＡＣＣＡＣ－３’(配列番号45）
Reverseプライマー:５’－ＧＧＴＡＧＣＴＧＧＴＣＴＣＡＣＣＴＡＡＴＣ－３’（配列番号46）
【0156】
本実施例にて得られたＴＣＲ遺伝子Ｃ領域のエンハンサーと、Ｖ領域のプロモーターの間の距離を縮めるように改変された細胞の、Ｃ領域のエンハンサーと、Ｖ領域のプロモーターの間に一本鎖切断を導入し、外来のＴＣＲまたはＣＡＲ遺伝子を導入することにより、抗原レセプター遺伝子が導入された細胞を製造することができる。
【実施例4】
【0157】
１）ヒトｉＰＳ細胞ＴＣＲβ遺伝子座Ｄβ２領域への薬剤耐性カセットデッキのノックイン
ヒトｉＰＳ細胞（非Ｔ細胞由来、遺伝子再構成未）にカセットデッキ配列をリポフェクションでノックインし、薬剤選択後、コロニーピックアップによりクローニングを行なうことで枠型となるｉＰＳ細胞（カセットデッキノックインｉＰＳ細胞： ｃＫＩ－ｉＰＳＣ）を樹立した。
ヒトｉＰＳ細胞（非Ｔ細胞由来、遺伝子再構成未）にカセットデッキ配列をリポフェクションでノックインし、薬剤選択後、コロニーピックアップによりクローニングを行なうことで枠型となるｉＰＳ細胞（カセットデッキノックインｉＰＳ細胞： ｃＫＩ－ｉＰＳＣ）を樹立した。
【0158】
材料
【表8】
【0159】
全ての実験においてｉＰＳ細胞の培養にはＡＫ０３Ｎを用いた。シングルセルから培養を開始する場合はＹ－２７６３２（Ｗａｋｏ）を最終濃度１０μＭになるように添加した。細胞の培養には、ｉＭａｔｒｉｘ （ｎｉｐｐｉ）をコートした６ウェルプレートを用いた。
【0160】
１－１）ｉＰＳ細胞へのターゲットベクターのノックイン
ｉＰＳ細胞はリポフェクション実施前日にプレート上へ播種した。ｉＰＳ細胞へ、上記割合のＣｒｉｓｐｒ－ＣＡＳ９およびガイドＲＮＡ発現ベクターとノックイン用ターゲティングベクターとの混合物を、リポフェクションにて形質移入した。Ｏｐｔｉ－ＭＥＭとベクターと試薬を懸濁後、ｉＰＳ細胞上へ添加し、４－６時間後に培地交換を行った。
ｉＰＳ細胞はリポフェクション実施前日にプレート上へ播種した。ｉＰＳ細胞へ、上記割合のＣｒｉｓｐｒ－ＣＡＳ９およびガイドＲＮＡ発現ベクターとノックイン用ターゲティングベクターとの混合物を、リポフェクションにて形質移入した。Ｏｐｔｉ－ＭＥＭとベクターと試薬を懸濁後、ｉＰＳ細胞上へ添加し、４－６時間後に培地交換を行った。
【0161】
１－２）ハイグロマイシン薬剤選択
２日後よりハイグロマイシンを用いて下記の通りの最終濃度で薬剤選択を行なった。相同組換えにより薬剤耐性遺伝子カセットをゲノムＤＮＡに取り込んだ細胞では、ＰＧＫプロモーターの作用により第１の薬剤耐性遺伝子であるハイグロマイシン耐性遺伝子が発現する（第２の薬剤耐性遺伝子であるピューロマイシン耐性遺伝子はここでは発現しない）そのため、まず、ハイグロマイシン入り培養液を用いて、薬剤耐性遺伝子カセットをゲノム中に取り込んだクローンを選択した（ポジティブセレクション）。
２日後よりハイグロマイシンを用いて下記の通りの最終濃度で薬剤選択を行なった。相同組換えにより薬剤耐性遺伝子カセットをゲノムＤＮＡに取り込んだ細胞では、ＰＧＫプロモーターの作用により第１の薬剤耐性遺伝子であるハイグロマイシン耐性遺伝子が発現する（第２の薬剤耐性遺伝子であるピューロマイシン耐性遺伝子はここでは発現しない）そのため、まず、ハイグロマイシン入り培養液を用いて、薬剤耐性遺伝子カセットをゲノム中に取り込んだクローンを選択した（ポジティブセレクション）。
【0162】
Day 0: リポフェクション
Day 1: 培地交換
Day 2: ハイグロマイシン 25μg/ml
Day 3: ハイグロマイシン 40μg/ml
Day 4 - 6: ハイグロマイシン50μg/ml
Day 7: iPSCコロニーピックアップ
Day 1: 培地交換
Day 2: ハイグロマイシン 25μg/ml
Day 3: ハイグロマイシン 40μg/ml
Day 4 - 6: ハイグロマイシン50μg/ml
Day 7: iPSCコロニーピックアップ
【0163】
１－３）カセットノックインｉＰＳ細胞（ｃＫＩ）の樹立
薬剤選択後に残存したｉＰＳ細胞コロニーをピックアップ後に、５つのクローンを樹立した。各クローンからＤＮＡを採取し、目的のクローンを確認するためにＰＣＲを行なった。薬剤耐性遺伝子ＫＩターゲッティングベクターの５’アーム配列と３’アーム配列の外側のベクター部分がランダムインテグレーションによりゲノムＤＮＡ内に取り込まれた細胞は、ジフテリア毒素（ＤＴＡ）が細胞内で生成されるため生存できず、取り除かれる（ネガティブセレクション）。次に、そのようにして選択された細胞（クローン）の中から、Ｖβ２０－１プロモーターからｆｒｔまでの薬剤耐性遺伝子カセット部分をＴＣＲＤβ２遺伝子座に取り込んだクローンをＰＣＲ法で同定した。以上により、Ｄβ２領域にＶβ２０－１プロモーターと薬剤耐性遺伝子カセットが導入されたクローン（ｃＫＩ－ｉＰＳＣ）を選択した。
薬剤選択後に残存したｉＰＳ細胞コロニーをピックアップ後に、５つのクローンを樹立した。各クローンからＤＮＡを採取し、目的のクローンを確認するためにＰＣＲを行なった。薬剤耐性遺伝子ＫＩターゲッティングベクターの５’アーム配列と３’アーム配列の外側のベクター部分がランダムインテグレーションによりゲノムＤＮＡ内に取り込まれた細胞は、ジフテリア毒素（ＤＴＡ）が細胞内で生成されるため生存できず、取り除かれる（ネガティブセレクション）。次に、そのようにして選択された細胞（クローン）の中から、Ｖβ２０－１プロモーターからｆｒｔまでの薬剤耐性遺伝子カセット部分をＴＣＲＤβ２遺伝子座に取り込んだクローンをＰＣＲ法で同定した。以上により、Ｄβ２領域にＶβ２０－１プロモーターと薬剤耐性遺伝子カセットが導入されたクローン（ｃＫＩ－ｉＰＳＣ）を選択した。
【0164】
２）ｉＰＳ細胞上でのカセットテープ交換
１）で樹立したｃＫＩ－ｉＰＳＣのゲノム上で、第１の組み替え酵素を用いて、目的とする外来ＴＣＲをカセット交換する形で導入した。
材料
１）で樹立したｃＫＩ－ｉＰＳＣのゲノム上で、第１の組み替え酵素を用いて、目的とする外来ＴＣＲをカセット交換する形で導入した。
材料
【表9】
【0165】
全ての実験においてｉＰＳ細胞の培養にはＡＫ０３Ｎを用いた。シングルセルから培養を開始する場合はＹ－２７６３２（Ｗａｋｏ）を最終濃度１０ ｕＭになるように添加した。細胞を培養する際は、ｉＭａｔｒｉｘ （ｎｉｐｐｉ）をコートした６ウェルプレートを用いた。
【0166】
２－１）ｃＫＩ－ｉＰＳ細胞へ、上記割合のＣｒｅ発現ベクターとカセット交換ベクターとの混合物を、エレクトロポレーションにより形質移入した。ｃＫＩ－ｉＰＳ細胞を回収後、シングルセル化し、上記細胞数を、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭとベクターを混合して１００μｌとし、エレクトロポレーションを行なった。エレクトロポレーション後、直ちに６ウェルプレートに播種し、培養した。
【0167】
2-2)ピューロマイシン薬剤選択
１）で導入されたカセットベクターの下流には、２つ目のプロモーターがあり、交換に成功したｉＰＳ細胞はその下流のピューロマイシン耐性遺伝子がワークする。この機構により、ＴＣＲ／ＣＡＲカセット交換成功ｉＰＳ細胞はピューロマイシンに耐性を示す。そこで、薬剤を用い下記の最終濃度で選択した。薬剤開始は、エレクトロポレーション２日後にその細胞を回収し、細胞数を揃えて再播種した翌日より開始した。これは、ピューロマイシンを用いた薬剤選択が、ｉＰＳ細胞の場合は、その細胞密度により効きが著しくことなるからである。
１）で導入されたカセットベクターの下流には、２つ目のプロモーターがあり、交換に成功したｉＰＳ細胞はその下流のピューロマイシン耐性遺伝子がワークする。この機構により、ＴＣＲ／ＣＡＲカセット交換成功ｉＰＳ細胞はピューロマイシンに耐性を示す。そこで、薬剤を用い下記の最終濃度で選択した。薬剤開始は、エレクトロポレーション２日後にその細胞を回収し、細胞数を揃えて再播種した翌日より開始した。これは、ピューロマイシンを用いた薬剤選択が、ｉＰＳ細胞の場合は、その細胞密度により効きが著しくことなるからである。
【0168】
Day 0: エレクトロポレーション
Day 1: 培地交換
Day 2: 細胞再播種 5×104 cells /ウェル
Day 3: ピューロマイシン 180ng/ml
Day 4: ピューロマイシン 150ng/ml
Day 5-9: 培地交換
Day10: iPSCコロニーピックアップ
Day 1: 培地交換
Day 2: 細胞再播種 5×104 cells /ウェル
Day 3: ピューロマイシン 180ng/ml
Day 4: ピューロマイシン 150ng/ml
Day 5-9: 培地交換
Day10: iPSCコロニーピックアップ
【0169】
２－３）カセットテープ交換ｉＰＳ細胞（ｅｘＴＣＲ－ＫＩ－ｉＰＳＣ）の樹立
薬剤選択後に残存したｉＰＳ細胞コロニーをピックアップ後に、４つのクローンを樹立した。各クローンからＤＮＡを採取し、目的のクローンを確認するためにＰＣＲを行なった。５’アーム配列上流とカセットベクターのＣＡＧイントロン配列とを挟む５’側確認プライマーと３’アーム配列下流とのベクター内のＥＦ１αプロモーター上を挟む３’側確認プライマーを用いた。バンドをともに検出できた株をカセット交換ＴＣＲノックイン細胞（ｅｘＴＣＲ－ＫＩ－ｉＰＳＣ）として樹立した。
薬剤選択後に残存したｉＰＳ細胞コロニーをピックアップ後に、４つのクローンを樹立した。各クローンからＤＮＡを採取し、目的のクローンを確認するためにＰＣＲを行なった。５’アーム配列上流とカセットベクターのＣＡＧイントロン配列とを挟む５’側確認プライマーと３’アーム配列下流とのベクター内のＥＦ１αプロモーター上を挟む３’側確認プライマーを用いた。バンドをともに検出できた株をカセット交換ＴＣＲノックイン細胞（ｅｘＴＣＲ－ＫＩ－ｉＰＳＣ）として樹立した。
【0170】
３）Ｐｕｒｏ
ｒ
ΔＴＫ部位の欠損
２）で樹立したｅｘＴＣＲ－ＫＩ－ｉＰＳＣのゲノム上で、第２の組み替え酵素を用いて、ＰｕｒｏｒΔＴＫ部位を欠損させ、最終Ｔ細胞産ｉＰＳ細胞を完成させた。
材料
２）で樹立したｅｘＴＣＲ－ＫＩ－ｉＰＳＣのゲノム上で、第２の組み替え酵素を用いて、ＰｕｒｏｒΔＴＫ部位を欠損させ、最終Ｔ細胞産ｉＰＳ細胞を完成させた。
材料
【表10】
【0171】
全ての実験においてｉＰＳ細胞の培養にはＡＫ０３Ｎを用いた。シングルセルから培養を開始する場合はＹ－２７６３２（Ｗａｋｏ）を最終濃度１０ ｕＭになるように添加した。細胞を培養する際は、ｉＭａｔｒｉｘ （ｎｉｐｐｉ）をコートした６ウェルプレートを用いた。
【0172】
３－１） ｅｘＴＣＲ－ＫＩ－ｉＰＳ細胞へのＦＬＰプラスミドの形質移入およびｆｒｔに囲まれた領域の除去
細胞をシングルセル化し、上記細胞数を、ＯｐｔｉＭＥＭとプラスミドベクターと混合して１００μｌとし、エレクトロポレーションを行なった。エレクトロポレーション後、直ちに６ウェルプレートに播種し、培養した。
細胞をシングルセル化し、上記細胞数を、ＯｐｔｉＭＥＭとプラスミドベクターと混合して１００μｌとし、エレクトロポレーションを行なった。エレクトロポレーション後、直ちに６ウェルプレートに播種し、培養した。
【0173】
３－２）ガンシクロビル薬剤選択
２）で樹立されたカセットベクターの下流には、チミジンキナーゼがワークしており、ガンシクロビル（ＧＣＶ）が細胞内で有毒化するため、ＧＣＶとの共培養で細胞は死滅する。この機構を用いて、ＧＣＶ薬剤を用い下記の最終濃度で選択した。薬剤開始は、エレクトロポレーション２日後にその細胞を回収し、細胞数を揃えて再播種した翌日より開始した。これは、ＧＣＶ用いた薬剤選択が、ｉＰＳ細胞の場合は、その細胞密度により効きが著しくことなるからである。
２）で樹立されたカセットベクターの下流には、チミジンキナーゼがワークしており、ガンシクロビル（ＧＣＶ）が細胞内で有毒化するため、ＧＣＶとの共培養で細胞は死滅する。この機構を用いて、ＧＣＶ薬剤を用い下記の最終濃度で選択した。薬剤開始は、エレクトロポレーション２日後にその細胞を回収し、細胞数を揃えて再播種した翌日より開始した。これは、ＧＣＶ用いた薬剤選択が、ｉＰＳ細胞の場合は、その細胞密度により効きが著しくことなるからである。
【0174】
Day 0: エレクトロポレーション
Day 1: 培地交換
Day 2: 細胞再播種 1×105 cells /ウェル
Day 3-13: GCV 5μg/ml
Day 14: iPSCコロニーピックアップ
Day 1: 培地交換
Day 2: 細胞再播種 1×105 cells /ウェル
Day 3-13: GCV 5μg/ml
Day 14: iPSCコロニーピックアップ
【0175】
３－３） Ｐｕｒｏ
ｒ
ΔＴＫ部位の欠損のカセットテープ交換ｉＰＳ細胞（完成）の樹立
薬剤選択後に残存したｉＰＳ細胞コロニーをピックアップ後に、２つのクローンを樹立した。各クローンからＤＮＡを採取し、目的のクローンを確認するためにＰＣＲを行なった。除去部位にあるＥＦ１αプロモーター部位と３’ａｒｍ下流を挟むプライマーを用いて行ったＰＣＲの結果を図２４に示す。カセット交換に成功したＴＣＲ－ＫＩ－ｉＰＳ細胞では、ＰｕｒｏｒΔＴＫ部位のバンドが確認できなくなった。（図２４下、Ｂレーン）
薬剤選択後に残存したｉＰＳ細胞コロニーをピックアップ後に、２つのクローンを樹立した。各クローンからＤＮＡを採取し、目的のクローンを確認するためにＰＣＲを行なった。除去部位にあるＥＦ１αプロモーター部位と３’ａｒｍ下流を挟むプライマーを用いて行ったＰＣＲの結果を図２４に示す。カセット交換に成功したＴＣＲ－ＫＩ－ｉＰＳ細胞では、ＰｕｒｏｒΔＴＫ部位のバンドが確認できなくなった。（図２４下、Ｂレーン）
【実施例5】
【0176】
ＮＹ－ＥＳＯ１特異的ＴＣＲ－ＫＩ－ｉＰＳ細胞（完成形）からＴ細胞分化誘導して作製された再生ＣＴＬのがん細胞株の傷害活性
実施例４の方法でNY-ESO1特異的TCRをノックインしたiPS細胞を得た。得られたiPS細胞よりT細胞を分化誘導し、得られた再生CTLを用いてがん細胞株の殺傷能力を検証した。
NY-ESO1-TCR-KI-iPS細胞由来再生CTLは、実施例４の方法にてNY-EOS1特異的TCRをノックインして得たiPS細胞から誘導したCTL細胞である。NY-EOS1-KI-iPS細胞からのCTLの誘導は、WO 2017/179720（US20190161727)に記載の方法にて行った（本文献は引用により本願に含まれる）。すなわち、ｉＰＳ細胞をＣＤ４ＣＤ８ダブルポジティブ細胞であるＴ細胞前駆体へと誘導し、次いでＣＤ４ＣＤ８ダブルポジティブ細胞を単離する。単離されたＣＤ４ＣＤ８ダブルポジティブ細胞をさらにＣＤ８シングルポジティブ細胞へと誘導した。ＣＤ８抗原がＣＤ８α鎖とＣＤ８β鎖のヘテロ接合型であるＣＤ８シングルポジティブＴ細胞が得られた（図２５）。
参照用として、ＷＴ１－ＴｉＰＳ細胞由来再生ＣＴＬ細胞を用いた。該細胞はＷＴ１特異的ＴＣＲを有するＴ細胞からｉＰＳ細胞を誘導し、得られたｉＰＳ細胞から誘導されたＣＴＬ細胞である。抗原特異的ＴＣＲを有するＴ細胞からｉＰＳ細胞の誘導はWO 2016/010155(US20170267972)に記載の方法に準じた。抗原特異的ＴＣＲを有するｉＰＳ細胞から当該抗原特異性を維持したＣＴＬの誘導は、上記と同様の方法にて行った
実施例４の方法でNY-ESO1特異的TCRをノックインしたiPS細胞を得た。得られたiPS細胞よりT細胞を分化誘導し、得られた再生CTLを用いてがん細胞株の殺傷能力を検証した。
NY-ESO1-TCR-KI-iPS細胞由来再生CTLは、実施例４の方法にてNY-EOS1特異的TCRをノックインして得たiPS細胞から誘導したCTL細胞である。NY-EOS1-KI-iPS細胞からのCTLの誘導は、WO 2017/179720（US20190161727)に記載の方法にて行った（本文献は引用により本願に含まれる）。すなわち、ｉＰＳ細胞をＣＤ４ＣＤ８ダブルポジティブ細胞であるＴ細胞前駆体へと誘導し、次いでＣＤ４ＣＤ８ダブルポジティブ細胞を単離する。単離されたＣＤ４ＣＤ８ダブルポジティブ細胞をさらにＣＤ８シングルポジティブ細胞へと誘導した。ＣＤ８抗原がＣＤ８α鎖とＣＤ８β鎖のヘテロ接合型であるＣＤ８シングルポジティブＴ細胞が得られた（図２５）。
参照用として、ＷＴ１－ＴｉＰＳ細胞由来再生ＣＴＬ細胞を用いた。該細胞はＷＴ１特異的ＴＣＲを有するＴ細胞からｉＰＳ細胞を誘導し、得られたｉＰＳ細胞から誘導されたＣＴＬ細胞である。抗原特異的ＴＣＲを有するＴ細胞からｉＰＳ細胞の誘導はWO 2016/010155(US20170267972)に記載の方法に準じた。抗原特異的ＴＣＲを有するｉＰＳ細胞から当該抗原特異性を維持したＣＴＬの誘導は、上記と同様の方法にて行った
【0177】
（２）Ａ０２０１陽性かつNY-ESO1を発現する多発性骨髄腫細胞株Ｕ２６６に対する細胞障害活性の評価
Luciferase導入Ｕ２６６(多発性骨髄腫細胞株, NY-ESO1+, HLA-A02+)、Bright-Glo (Promega)およびGlomax (Promega)を用いた。
Ａ０２０１を有しかつNY-ESO-1を発現している多発性骨髄腫細胞株Ｕ２６６に対する、ＮＹ－ＥＳＯ１特異的ＴＣＲをノックインしたｉＰＳ細胞から誘導された、再生ＣＴＬの細胞障害活性を評価した。比較として、同細胞に対するWT1-TiPS細胞由来再生CTLの細胞障害活性を同時に調べた。再生ＣＴＬとＵ２６６細胞株を０：１、１：３、１：１、３：１、９：１の割合で混合後、３７℃５％ＣＯ２の環境下で６時間培養を行った。その後、Annexin V陽性細胞の割合で、細胞傷害活性を評価した。結果を図２６に示す。
NY-ESO1-TCR-KI-iPS細胞由来再生CTLは、U266細胞株に対して細胞数依存的に細胞傷害活性を示した。WT1-TiPS細胞由来再生CTL細胞にはそのような活性はほとんど認められなかった。
Luciferase導入Ｕ２６６(多発性骨髄腫細胞株, NY-ESO1+, HLA-A02+)、Bright-Glo (Promega)およびGlomax (Promega)を用いた。
Ａ０２０１を有しかつNY-ESO-1を発現している多発性骨髄腫細胞株Ｕ２６６に対する、ＮＹ－ＥＳＯ１特異的ＴＣＲをノックインしたｉＰＳ細胞から誘導された、再生ＣＴＬの細胞障害活性を評価した。比較として、同細胞に対するWT1-TiPS細胞由来再生CTLの細胞障害活性を同時に調べた。再生ＣＴＬとＵ２６６細胞株を０：１、１：３、１：１、３：１、９：１の割合で混合後、３７℃５％ＣＯ２の環境下で６時間培養を行った。その後、Annexin V陽性細胞の割合で、細胞傷害活性を評価した。結果を図２６に示す。
NY-ESO1-TCR-KI-iPS細胞由来再生CTLは、U266細胞株に対して細胞数依存的に細胞傷害活性を示した。WT1-TiPS細胞由来再生CTL細胞にはそのような活性はほとんど認められなかった。
【実施例6】
【0178】
Ｔ細胞中に存在する外来性に導入したＴ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子の、別のＴＣＲ遺伝子への交換
実施例１（図１１）と同様の方法により、薬剤耐性遺伝子カセットノックインベクターをTCRDβ2領域にノックインした後に、TCR1遺伝子を薬剤耐性遺伝子カセットと交換することで導入したJurkat細胞を得た。TCR1遺伝子として、WT1抗原を認識するTCR（KM#3-3）のα鎖とβ鎖をp2Aペプチド遺伝子で繋いだ合成遺伝子を用いた。図２７に本実施例のJurkat-TCR1細胞のTCRβ遺伝子座DJ領域の模式図を示す。
次いでJurkat-TCR1細胞のTCR1遺伝子を以下に示す方法で、TCR2遺伝子と入れ替えた。で、TCR2遺伝子はNYESO1抗原を認識するTCRのα鎖とβ鎖をp2Aペプチド遺伝子で繋いだ合成遺伝子である。
実施例１（図１１）と同様の方法により、薬剤耐性遺伝子カセットノックインベクターをTCRDβ2領域にノックインした後に、TCR1遺伝子を薬剤耐性遺伝子カセットと交換することで導入したJurkat細胞を得た。TCR1遺伝子として、WT1抗原を認識するTCR（KM#3-3）のα鎖とβ鎖をp2Aペプチド遺伝子で繋いだ合成遺伝子を用いた。図２７に本実施例のJurkat-TCR1細胞のTCRβ遺伝子座DJ領域の模式図を示す。
次いでJurkat-TCR1細胞のTCR1遺伝子を以下に示す方法で、TCR2遺伝子と入れ替えた。で、TCR2遺伝子はNYESO1抗原を認識するTCRのα鎖とβ鎖をp2Aペプチド遺伝子で繋いだ合成遺伝子である。
【0179】
Ｊｕｒｋａｔ－ＴＣＲ１細胞へのＴＣＲ２カセット交換ベクターとＣｒｅ発現ベクターの共導入および、Ｊｕｒｋａｔ細胞内におけるＴＣＲ１とＴＣＲ２の交換のＰＣＲ法による確認
材料
材料
【表11】
【0180】
図２８に、ＴＣＲ１が組み込まれたＴＣＲβ遺伝子座ＤＪ領域（上段）および、ＴＣＲ２カセット交換ベクター（中段）、そして、カセット交換後のＴＣＲβ遺伝子座（下段）を模式的に示す。カセット交換を誘導するため、Ｊｕｒｋａｔ－ＴＣＲ１細胞にＴＣＲ２カセット交換ベクターおよびＣｒｅ発現ベクター（pCAG-nls-Cre）をエレクトロポレーション法により導入した。組換え酵素Ｃｒｅとカセット交換ベクターの導入により、ｌｏｘ２２７２配列とｌｏｘＰ配列に挟まれる部分、すなわちＴＣＲ１－ｆｒｔ－ＰＧＫプロモーターと、ＴＣＲ２遺伝子－ｆｒｔ－ＰＧＫプロモーターが、組換え酵素Ｃｒｅの作用により入れ替わる（カセット交換）ことが予想される（図２８）。
【0181】
遺伝子導入５日後に細胞よりゲノムＤＮＡを抽出して、ＴＣＲ２への交換が起きたかＰＣＲ法を用いて解析した（図２９）。また、ＰＣＲ反応の対照実験として、薬剤耐性遺伝子との間でのカセット交換でＮＹＥＳＯ１－ＴＣＲ（ＴＣＲ２）あるいはＫＭ＃３－３－ＴＣＲ（ＴＣＲ１）を導入したＪｕｒｋａｔ細胞のゲノムＤＮＡをＰＣＲ反応に用いた（図２９Ｂ， ＰＣＲ１およびＰＣＲ２）。プライマー１はＴＣＲ２遺伝子に、プライマー２とプライマー３はＤＪ領域に、プライマー４はＴＣＲ１遺伝子の配列に、それぞれ対応する（図２９Ａ）。ＰＣＲは、ＫＯＤ－ＦＸ （Ｔｏｙｏｂｏ， ＫＦＸ－１０１）を用いて、９４℃， ２ ｍｉｎ→９８℃， １０ ｓｅｃ， ６１℃， ３０ ｓｅｃ， ６８℃， ３ ｍｉｍを３０ ～ ３５サイクルで行った。ＰＣＲ法に用いたプライマーの配列は以下に示す。
【0182】
プライマー１とプライマー２を用いてＰＣＲ反応を行い、その反応物の１０倍希釈物を用いて、プライマー１とプライマー３を用いてＰＣＲを行なった。ＴＣＲ１からＴＣＲ２への交換反応が起きていれば、約４ ｋｂのＤＮＡ断片が増幅されることが予想される。電気泳動での解析の結果、ＴＣＲ２への交換反応を示すバンドが認められた（図３Ｂ， ＰＣＲ３）。一方、プライマー４とプライマー２を用いてＰＣＲ反応を行った場合、ＴＣＲ１遺伝子の増幅が予想される。ＰＣＲ２ではＴＣＲ１遺伝子の増幅が認められ、また、ＰＣＲ３でも認められた（図３Ｂ）。ＰＣＲ３の結果より、一部の細胞ではＴＣＲ１からＴＣＲ２への交換反応が起きたが、そのほかでは起きなかったと考えられる。
以上より、Ｔ細胞株Ｊｕｒｋａｔ細胞中で、外来性に導入されたＴＣＲ遺伝子が、別のＴＣＲ遺伝子と交換可能であることが示された。
以上より、Ｔ細胞株Ｊｕｒｋａｔ細胞中で、外来性に導入されたＴＣＲ遺伝子が、別のＴＣＲ遺伝子と交換可能であることが示された。
【0183】
ＰＣＲプライマー：
プライマー１， ５’－ＧＧＣＡＧＣＴＡＣＡＴＣＣＣＴＡＣＣＴＴ－３’ （配列番号47）
プライマー２， ５’－ＣＣＡＣＴＴＴＧＣＴＧＴＣＴＴＧＧＣＣＴＴ－３’（配列番号48）
プライマー３， ５’－ＡＡＴＣＡＴＣＧＴＧＣＣＣＴＣＣＣＧＣＴＡ－３’（配列番号49）
プライマー４， ５’－ＴＣＡＧＣＣＡＣＣＴＡＣＣＴＣＴＧＴＧＴ－３’（配列番号50）
プライマー１， ５’－ＧＧＣＡＧＣＴＡＣＡＴＣＣＣＴＡＣＣＴＴ－３’ （配列番号47）
プライマー２， ５’－ＣＣＡＣＴＴＴＧＣＴＧＴＣＴＴＧＧＣＣＴＴ－３’（配列番号48）
プライマー３， ５’－ＡＡＴＣＡＴＣＧＴＧＣＣＣＴＣＣＣＧＣＴＡ－３’（配列番号49）
プライマー４， ５’－ＴＣＡＧＣＣＡＣＣＴＡＣＣＴＣＴＧＴＧＴ－３’（配列番号50）
【図1】
【図2】
【図3-1】
【図3-2】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【配列表】