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特許7422406マトリックスメタロプロテアーゼ－１アンチセンスオリゴヌクレオチド
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-01-18
(45)【発行日】2024-01-26
(54)【発明の名称】マトリックスメタロプロテアーゼ－１アンチセンスオリゴヌクレオチド
(51)【国際特許分類】
C12N 15/113 20100101AFI20240119BHJP
A61K 31/7125 20060101ALI20240119BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20240119BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240119BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20240119BHJP
A61Q 19/08 20060101ALI20240119BHJP
A61K 8/84 20060101ALI20240119BHJP
【ＦＩ】
C12N15/113 130Z
A61K31/7125 ZNA
A61K48/00
A61P43/00 111
A61P17/00
A61Q19/08
A61K8/84
【請求項の数】
6
(21)【出願番号】P 2020564534
(86)(22)【出願日】2019-05-03
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2021-09-13
(86)【国際出願番号】 KR2019005994
(87)【国際公開番号】W WO2019221570
(87)【国際公開日】2019-11-21
【審査請求日】2022-02-24
(31)【優先権主張番号】10-2018-0057352
(32)【優先日】2018-05-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
【前置審査】
(73)【特許権者】
【識別番号】519043383
【氏名又は名称】オリパス コーポレーション
(74)【代理人】
【識別番号】100102978
【弁理士】
【氏名又は名称】清水 初志
(74)【代理人】
【識別番号】100205707
【弁理士】
【氏名又は名称】小寺 秀紀
(74)【代理人】
【識別番号】100160923
【弁理士】
【氏名又は名称】山口 裕孝
(74)【代理人】
【識別番号】100119507
【弁理士】
【氏名又は名称】刑部 俊
(74)【代理人】
【識別番号】100142929
【弁理士】
【氏名又は名称】井上 隆一
(74)【代理人】
【識別番号】100148699
【弁理士】
【氏名又は名称】佐藤 利光
(74)【代理人】
【識別番号】100128048
【弁理士】
【氏名又は名称】新見 浩一
(74)【代理人】
【識別番号】100129506
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 智彦
(74)【代理人】
【識別番号】100114340
【弁理士】
【氏名又は名称】大関 雅人
(74)【代理人】
【識別番号】100121072
【弁理士】
【氏名又は名称】川本 和弥
(72)【発明者】
【氏名】ハン ソン－ヨン
(72)【発明者】
【氏名】ソン ギホ
(72)【発明者】
【氏名】ホン ミョンヒョ
(72)【発明者】
【氏名】オ ユリ
(72)【発明者】
【氏名】ホ ジュン－ソク
(72)【発明者】
【氏名】ジャン カン ウォン
【審査官】加藤 幹
(56)【参考文献】
【文献】米国特許出願公開第２００３／０１０５０４４（ＵＳ，Ａ１）
【文献】特表２０１１－５１８７７０（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１８／０２９５１７（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１８／０５１１７５（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１８／０６９７６４（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１８／１２２６１０（ＷＯ，Ａ１）
【文献】European Journal of Biochemistry，2001年，268，1888-1896
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ
Ａ６１Ｋ
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
式Ｉ：式中、
ｎが、１４であり；
式Ｉの化合物が、ヒトＭＭＰ－１プレｍＲＮＡ中の１６塩基のプレｍＲＮＡ配列
式Ｉの化合物が、ヒトＭＭＰ－１プレｍＲＮＡと完全に相補的であり；
Ｓ１、Ｓ２、・・・、Ｓｎ－１、Ｓｎ、Ｔ１、Ｔ２、・・・、Ｔｎ－１、およびＴｎが、水素であり；
ＸおよびＹが、独立して、水素（hydrido）、または置換もしくは非置換のアルキルオキシカルボニルを表し、置換もしくは非置換のアルキルオキシカルボニルは
Ｚが、アミノを表し；
Ｂ１、Ｂ２、・・・、Ｂｎ－１、およびＢｎが、アデニン、チミン、グアニン、シトシン、およびウラシルを含む天然核酸塩基、ならびに式ＩＩ、式ＩＩＩ、または式ＩＶ
Ｂ１、Ｂ２、・・・、Ｂｎ－１、およびＢｎのうち少なくとも４つが、式ＩＩ、式ＩＩＩ、または式ＩＶによって表される非天然核酸塩基から独立して選択され、
式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６が、水素であり；
Ｌ１が、右端が塩基性アミノ基に直接結合している、－（ＣＨ２）２－Ｏ－（ＣＨ２）２－、－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２）２－、－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２）３－、－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２）４－、または－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２）５－を表し、かつ、
Ｌ２およびＬ３が、右端が塩基性アミノ基に直接結合している、－（ＣＨ２）２－Ｏ－（ＣＨ２）２－、－（ＣＨ２）３－Ｏ－（ＣＨ２）２－、－（ＣＨ２）２－Ｏ－（ＣＨ２）３－、－（ＣＨ２）２－、－（ＣＨ２）３－、－（ＣＨ２）４－、－（ＣＨ２）５－、－（ＣＨ２）６－、－（ＣＨ２）７－、および－（ＣＨ２）８－から独立して選択される。
【請求項2】
以下に示されるペプチド核酸誘導体である、請求項１に記載のペプチド核酸誘導体、またはその薬学的に許容可能な塩：（Ｎ→C) Fethoc－TA(6)C－TCA(6)－CC(1O2)A(6)－TA(6)T－A(6)T－NH2
ここで、
Ａ、Ｔ、およびＣが、それぞれアデニン、チミン、およびシトシンの天然核酸塩基を有するペプチド核酸モノマーであり；
Ｃ（１Ｏ２）およびＡ（６）が、それぞれ、式ＶＩおよび式ＶＩＩ：
「Ｆｅｔｈｏｃ－」が、「［２－（９－フルオレニル）エチル－１－オキシ］カルボニル」の略語である。
【請求項3】
請求項１に記載のペプチド核酸誘導体またはその薬学的に許容可能な塩を含む、ヒトＭＭＰ－１遺伝子転写に関連する疾患または状態を治療するための薬学的組成物。
【請求項4】
請求項１に記載のペプチド核酸誘導体またはその薬学的に許容可能な塩を含む、ヒトＭＭＰ－１遺伝子転写に関連する疾患または状態を治療するための化粧品組成物。
【請求項5】
請求項１に記載のペプチド核酸誘導体またはその薬学的に許容可能な塩を含む、皮膚の老化を治療するための薬学的組成物。
【請求項6】
請求項１に記載のペプチド核酸誘導体またはその薬学的に許容可能な塩を含む、皮膚の老化を治療するための化粧品組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、マトリックスメタロプロテアーゼ－１によってもたらされる皮膚の老化を改善するための、ヒトマトリックスメタロプロテアーゼ－１プレｍＲＮＡを相補的にターゲッティングするペプチド核酸誘導体に関する。
【背景技術】
【0002】
老化の徴候は皮膚で最も目立つため、皮膚の老化は相当な関心を集めている。皮膚の老化に対する予防や治療は、生活の質において非常に重要であるため、既に高齢の者だけではなく若年層も、関連する健康食品、化粧品、医薬品、医療用品等に関心を持っている。皮膚の老化には２つの主なプロセスがある。１つは、加齢に伴う内因性または自然老化であり、もう１つは、日光への曝露、喫煙、および栄養失調などの外部要因によって発生する外因性老化である。
【0003】
皮膚への紫外線照射曝露は、マトリックスメタロプロテアーゼ－１（ＭＭＰ－１）の発現を促進し、真皮の主要な構造成分であるコラーゲンの分解促進を引き起こす。さらに、喫煙は皮膚にマトリックスメタロプロテアーゼ－１ ｍＲＮＡを誘導し、これは皮膚への紫外線照射曝露と同じ結果を引き起こす[J. Cosmetic Dermatology vol 6, 40-50 (2007)（非特許文献1）]。
【0004】
コラーゲンは、皮膚、血管、骨、歯、筋肉等、様々な結合組織における細胞外空間の主要な構造タンパク質である。コラーゲンは、ほとんどの組織および細胞の構造を支持する役割を果たしているため、その分解と変形は皮膚の老化に大きく影響を及ぼし得る[J. Pathol. vol 211, 241-251 (2007)（非特許文献2）]。
【0005】
マトリックスメタロプロテアーゼは、線維芽細胞、ケラチノサイト等で分泌される酵素であり、細胞外基質（ＥＣＭ）と基底膜（ＢＭ）のすべての種類を分解できる。ＭＭＰ－１（間質性コラゲナーゼ）、ＭＭＰ－２（ゼラチナーゼ）、ＭＭＰ－３（ストロメリシン）、ＭＭＰ－７（マトリリシン）、ＭＭＰ－８（好中球コラゲナーゼ）、およびＭＭＰ－１２（メタロエラスターゼ）等、２６種以上のマトリックスメタロプロテアーゼが同定されている[J. Biol. Chem. vol 277, 451-454 (2002)（非特許文献3）; J. Matrix. Biol. vol 15, 519-526 (1997)（非特許文献4）]。
【0006】
紫外線照射曝露や喫煙によって生成される活性酸素種が、マトリックスメタロプロテアーゼ－１の過剰発現の原因であると言われてきた。その意味で、ビタミンＡ（レチノール）、ビタミンＣ（アスコルビン酸）、ビタミンＥ（トコフェロール）、カロチノイド、フラボノイド、緑茶、セレニウム等の、抗酸化剤および抗酸化作用のある機能食品が皮膚の老化の治療のために開発されており、作用メカニズムについての研究が現在行われている[Int. J. Food Sci. Technol. vol 73, 989-996 (2005)（非特許文献5）; Kor. J. Aesthet. Cosmetol. vol 11, 649-654 (2013)（非特許文献6）; Int. J. Mol. Med. vol 38, 357-363 (2016)（非特許文献7）]。
【0007】
皮膚の老化におけるメタロプロテアーゼ－１の重要性を勘案すると、皮膚の老化状態を改善および防ぎ得る、メタロプロテアーゼ－１発現のメカニズムに基づいた医薬品または化粧品を開発することは非常に興味深く、必要である。
【0008】
プレｍＲＮＡ：遺伝情報は、ＤＮＡ（２－デオキシリボース核酸）上に保持されている。ＤＮＡは、転写されて核内でプレｍＲＮＡ（プレメッセンジャーリボ核酸）を生成する。哺乳動物プレｍＲＮＡは、通常エクソンとイントロンからなり、エクソンとイントロンは、下記に模式図的に提供されるように互いに相互連結される。エクソンおよびイントロンを下記の図に例示したようにナンバリングする。
【0009】
プレｍＲＮＡのスプライシング：プレｍＲＮＡは、下記の図において模式図的に要約される「スプライシング」と総称される、一連の複雑な反応によるイントロンの除去後にｍＲＮＡにプロセッシングされる[Ann. Rev. Biochem. 72(1), 291-336 (2003)（非特許文献8）; Nature Rev. Mol. Cell Biol. 6(5), 386-398 (2005)（非特許文献9）; Nature Rev. Mol. Cell Biol. 15(2), 108-１21 (2014)（非特許文献10）]。
【0010】
スプライシングは、プレｍＲＮＡとスプライシングアダブター因子との「スプライソソームＥ複合体」（すなわち、初期スプライソソーム複合体）の形成によって開始される。「スプライソソームＥ複合体」において、Ｕ１はエクソンＮとイントロンＮの接合部に結合し、Ｕ２ＡＦ３５はイントロンＮとエクソン（Ｎ＋１）の接合部に結合する。よって、エクソン／イントロンまたはイントロン／エクソンの接合部は、初期スプライソソーム複合体の形成に重要となる。「スプライソソームＥ複合体」は、Ｕ２と追加的に複合体を形成すると、「スプライソソームＡ複合体」へと変化する。「スプライソソームＡ複合体」は、イントロンを除去するまたは切り出す一連の複雑な反応を経て近接するエクソン同士を接合する。
【0011】
リボソームタンパク質合成：タンパク質は、ＤＮＡ（２－デオキシリボース核酸）によってコードされる。ＤＮＡは、細胞刺激に応答してまたは自発的に転写され、核でプレｍＲＮＡ（プレメッセンジャーリボ核酸）を生成する。プレｍＲＮＡのイントロンは、酵素によって切り出されてｍＲＮＡ（メッセンジャーリボ核酸）をもたらし、次いでｍＲＮＡは細胞質に移動する。細胞質において、リボソームと呼ばれる翻訳機構の複合体がｍＲＮＡに結合し、複合体はコードされた遺伝情報をｍＲＮＡに沿ってスキャンしながらタンパク質合成を行う[Biochemistry vol 41, 4503-4510 (2002)（非特許文献11）; Cancer Res. vol 48, 2659-2668 (1988)（非特許文献12）]。
【0012】
アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）：ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、およびプレｍＲＮＡを含む核酸に塩基配列特異的な様式で（すなわち相補的に）結合するオリゴヌクレオチドを、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）と称する。
【0013】
例えば、ＡＳＯが細胞質でｍＲＮＡに強く結合する場合、ＡＳＯは、ｍＲＮＡに沿ったリボソームタンパク質合成を阻害し得る。ＡＳＯは、そのターゲットタンパク質のリボソームタンパク質合成を阻害するために細胞質内に存在する必要がある。
【0014】
スプライシングのアンチセンス阻害：ＡＳＯが核でプレｍＲＮＡに強く結合する場合、ＡＳＯは、プレｍＲＮＡのｍＲＮＡへのスプライシングを阻害または調節することができる。ＡＳＯは、プレｍＲＮＡのｍＲＮＡへのスプライシングを阻害または調節するために、核内に存在する必要がある。そのようなスプライシングのアンチセンス阻害によって、ＡＳＯがターゲットにするエクソンを欠如したｍＲＮＡまたは複数のｍＲＮＡが生成される。そのような（複数の）ｍＲＮＡは、「スプライスバリアント」と称され、完全長ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質よりもさらに小さいタンパク質をコードする。
【0015】
基本的に、「スプライソソームＥ複合体」の形成の阻害によってスプライシングを妨げることができる。ＡＳＯが（５’→３’）エクソン－イントロンの接合部、すなわち「５’スプライス部位」に強く結合する場合、ＡＳＯはプレｍＲＮＡと因子Ｕ１との複合体の形成を阻止し、よって「スプライソソームＥ複合体」の形成を阻止する。同様に、ＡＳＯが（５’→３’）イントロン－エクソンの接合部、すなわち「３’スプライス部位」に強く結合する場合、「スプライソソームＥ複合体」は形成され得ない。
【0016】
３’スプライス部位および５’スプライス部位を下記の図において模式図的に例示する。
【0017】
非天然オリゴヌクレオチド：DNAまたはRNAオリゴヌクレオチドは、内因性ヌクレアーゼによる分解に感受性であり、その治療的有用性が制限される。今まで、多くのタイプの非天然の（自然発生でない）オリゴヌクレオチドが開発され、徹底的に研究されてきた[Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. vol 33, 533-540 (2006)（非特許文献13）]。これらの一部は、ＤＮＡおよびＲＮＡに比べて長期間の代謝安定性を示す。幾つかの典型的な非天然オリゴヌクレオチドの化学構造を下記に提供する。そのようなオリゴヌクレオチドは、予想通り、ＤＮＡまたはＲＮＡのように相補性核酸に結合する。
【0018】
ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド：ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド（ＰＴＯ）は、モノマー１つ当たり、骨格のホスフェート酸素原子中の一つが硫黄原子で置換されたＤＮＡ類似体である。このような小さい構造変化によって、ＰＴＯがヌクレアーゼによる分解に対して比較的抵抗性になった[Ann. Rev. Biochem. vol 54, 367-402 (1985（非特許文献14）)]。
【0019】
ＰＴＯおよびＤＮＡの骨格における構造的類似性を反映して、これらは共に、大部分の哺乳動物の細胞型における細胞膜の透過が十分ではない。しかし、ＤＮＡの輸送体を豊富に発現する一部の細胞型については、ＤＮＡおよびＰＴＯは良好な細胞透過を示す。全身投与されたＰＴＯは、肝臓および腎臓に分布し易いことが知られている[Nucleic Acids Res. vol 25, 3290-3296 (1997)（非特許文献15）]。
【0020】
インビトロでＰＴＯの細胞透過を促進するために、リポフェクションが広く用いられている。しかし、リポフェクションは、細胞膜を物理的に変化させ、細胞毒性を生じることから、長期間のインビボでの治療的使用には理想的ではないだろう。
【0021】
過去３０年にわたり、アンチセンスＰＴＯおよびＰＴＯバリアントが、癌、免疫学的障害、代謝疾患等を治療するのに臨床的に評価されてきた[Biochemistry vol 41, 4503-4510 (2002)（非特許文献16）; Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. vol 33, 533-540 (2006)（非特許文献17）]。そのようなアンチセンス薬物候補のうち多数は、１つにはＰＴＯの不十分な細胞透過のために、うまく開発できなかった。この不十分な細胞透過を克服するためには、ＰＴＯは治療的活性のために高用量で投与される必要がある。しかし、ＰＴＯは、血液凝固時間の増加、補体活性化、尿細管性腎症、クッパー細胞活性化、および、脾腫、リンパ過形成、単核細胞浸潤などの免疫刺激を含む、用量制限毒性と関連することが知られている[Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. vol 33, 533-540 (2006)（非特許文献17）]。
【0022】
多くのアンチセンスＰＴＯについて、肝臓や腎臓の寄与が大きな疾患において、十分な臨床活性を示すことが明らかになっている。ミポメルセンは、ＬＤＬコレステロール輸送に関与するタンパク質であるａｐｏＢ－１００の合成を阻害するＰＴＯ類似体である。ミポメルセンは、アテローム性動脈硬化患者において十分な臨床活性を表したが、これはミポメルセンが肝臓に選択的に分布することに起因する可能性が高い[Circulation vol 118(7), 743－753 (2008)（非特許文献18）]。ＩＳＩＳ－１１３７１５は、タンパク質チロシンホスファターゼ１Ｂ（ＰＴＰ１Ｂ）の合成を阻害するＰＴＯアンチセンス類似体であり、ＩＩ型糖尿病患者において治療活性を示すことが明らかになった[Curr. Opin. Mol. Ther. ｖol 6, 331-336 (2004)（非特許文献19）]。
【0023】
ロックド核酸：ロックド核酸（ＬＮＡ）においては、ＲＮＡまたはＤＮＡに対する結合親和性が増加するようにＲＮＡの骨格リボース環が構造的に制約を受けている。よって、ＬＮＡは高親和性ＤＮＡまたはＲＮＡ類似体と見なされ得る[Biochemistry ｖol 45, 7347-7355 (2006)（非特許文献20）]。
【0024】
ホスホロジアミデートモルホリノオリゴヌクレオチド：ホスホロジアミデートモルホリノオリゴヌクレオチド（ＰＭＯ）においては、ＤＮＡの骨格ホスフェートおよび２－デオキシリボースが、それぞれホスホロアミデートおよびモルホリンに置換されている[Appl. Microbiol. Biotechnol. vol 71, 575－586 (2006)（非特許文献21）]。ＤＮＡ骨格は負に荷電しているのに対し、ＰＭＯ骨格は荷電していない。よって、ＰＭＯとｍＲＮＡの間の結合は、これらの骨格間の静電気的反発がなく、ＤＮＡとｍＲＮＡの間の結合よりもさらに強い傾向がある。ＰＭＯはＤＮＡと構造的に非常に相違するため、ＰＭＯはＤＮＡまたはＲＮＡを認識する肝輸送体によって認識されないと言える。それにも拘らず、ＰＭＯは細胞膜を容易に透過できない。
【0025】
ペプチド核酸：ペプチド核酸（ＰＮＡ）は、単位骨格としてＮ－（２－アミノエチル）グリシンを有するポリペプチドであり、ニールセン博士（Ｄｒ．Ｎｉｅｌｓｅｎ）と同僚らによって発見された[Science vol 254, 1497-1500 (1991)（非特許文献22）]。ＰＮＡの化学構造および略記命名法を下記の図に例示する。ＤＮＡおよびＲＮＡのように、ＰＮＡもまた、相補性核酸に選択的に結合する[Nature (London) vol 365, 566-568 (1992)（非特許文献23）]。相補性核酸への結合において、ＰＮＡのＮ末端はＤＮＡまたはＲＮＡの「５’端」と同様なものと見なされ、ＰＮＡのＣ末端はＤＮＡまたはＲＮＡの「３’端」と同様なものと見なされる。
【0026】
ＰＭＯのように、ＰＮＡ骨格は荷電していない。よって、ＰＮＡとＲＮＡの間の結合は、ＤＮＡとＲＮＡの間の結合よりもさらに強い傾向がある。ＰＮＡは、化学構造においてＤＮＡと著しく相違するため、ＰＮＡはＤＮＡを認識する肝輸送体によって認識されないと言え、ＤＮＡまたはＰＴＯと異なる組織分布プロファイルを示す。しかし、ＰＮＡもまた、哺乳動物細胞膜の透過が十分ではない[Adv. Drug Delivery Rev. vol 55, 267-280, 2003（非特許文献24）]。
【0027】
ＰＮＡの膜透過性を改善させるための修飾核酸塩基：ＰＮＡは、陽イオン性脂質またはその均等物を付着させた修飾核酸塩基の導入によって、哺乳動物細胞膜に高度に透過性となった。そのような修飾核酸塩基の化学構造を下記に提供する。シトシン、アデニン、およびグアニンのそのような修飾核酸塩基は、予想通り、それぞれグアニン、チミン、およびシトシンと相補的にハイブリダイゼーションすることが明らかになった[PCT出願番号PCT/KR2009/001256（特許文献1）; EP2268607（特許文献2）; US8680253（特許文献3）]。
【0028】
ＰＮＡへのそのような修飾核酸塩基の組み込みは、リポフェクションの状況と類似している。リポフェクションによって、ホスフェート骨格を有するオリゴヌクレオチド分子は、リポフェクトアミンなどの陽イオン性脂質分子で囲まれ、そのようなリポフェクトアミン／オリゴヌクレオチド複合体は、裸のオリゴヌクレオチド分子に比べてかなり容易に膜を透過する傾向がある。
【0029】
それらのＰＮＡ誘導体は、良好な膜透過性に加え、相補性核酸に対して極めて高い親和性を有することが明らかになった。例えば、１１～1３塩基のＰＮＡ誘導体上への４～５個の修飾核酸塩基の導入は、相補性ＤＮＡとの二本鎖形成において２０℃以上のＴｍ増加を容易にもたらした。そのようなＰＮＡ誘導体は、単一塩基ミスマッチにも非常に影響を受けやすい。単一塩基ミスマッチは、修飾塩基の種類とＰＮＡ配列に応じて、１１～２２℃のＴｍ損失を招いた。
【0030】
低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）：低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、２０～２５塩基対の二本鎖ＲＮＡを指す[Microbiol. Mol. Biol. Rev. vol 67(4), 657-685 (2003)（非特許文献25）]。ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、何らかの形でタンパク質と相互作用して「RNA誘導サイレンシング複合体」（ＲＩＳＣ）を形成する。次いで、ＲＩＳＣはｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖に相補的なｍＲＮＡのある部分に結合する。ＲＩＳＣと複合体を形成したｍＲＮＡは切断を受ける。よって、ｓｉＲＮＡはそのターゲットｍＲＮＡの切断を触媒的に誘導し、結果的にｍＲＮＡによるタンパク質発現を阻害する。ＲＩＳＣは、そのターゲットｍＲＮＡ内の完全相補的配列に常に結合するわけではなく、これによりｓｉＲＮＡ治療法のオフターゲット効果に関連する懸念が生じる。ＤＮＡまたはＲＮＡ骨格を有する他のクラスのオリゴヌクレオチドのように、ｓｉＲＮＡは、細胞透過性が十分ではなく、よって良好な膜透過性を有するように適切に製剤化されるかまたは化学的に修飾されない限り、不十分なインビトロまたはインビボ治療活性を示す傾向がある。
【0031】
マトリックスメタロプロテアーゼ－１ ｓｉＲＮＡ：ヒトＭＭＰ－１のｍＲＮＡ内の１９塩基のＲＮＡ配列をターゲットにするＭＭＰ－１ ｓｉＲＮＡは、１００ｎＭでのリポフェクション後にヒト軟骨肉腫においてＭＭＰ－１ ｍＲＮＡおよびタンパク質の発現を阻害したことが報告された[J. Orthop. Res. ｖol 23, 1467-1474 (2005)（非特許文献26）]。この結果は、ＭＭＰ－１が関連する癌転移についての研究および癌治療の開発に有用であり得る。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0032】
【文献】PCT出願番号PCT/KR2009/001256
【文献】EP2268607
【文献】US8680253
【非特許文献】
【0033】
【文献】[J. Cosmetic Dermatology vol 6, 40-50 (2007)
【文献】J. Pathol. vol 211, 241-251 (2007)
【文献】J. Biol. Chem. vol 277, 451-454 (2002)
【文献】J. Matrix. Biol. vol 15, 519-526 (1997)
【文献】Int. J. Food Sci. Technol. vol 73, 989-996 (2005)
【文献】Kor. J. Aesthet. Cosmetol. vol 11, 649-654 (2013)
【文献】Int. J. Mol. Med. vol 38, 357-363 (2016)
【文献】Ann. Rev. Biochem. 72(1), 291-336 (2003)
【文献】Nature Rev. Mol. Cell Biol. 6(5), 386-398 (2005)
【文献】Nature Rev. Mol. Cell Biol. 15(2), 108-１21 (2014)
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【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0034】
抗酸化剤および抗酸化作用のある機能食品が、限られた効果で皮膚の老化の治療のために開発されており、作用メカニズムについての研究が現在進行中である。ＭＭＰ－１に関連するｓｉＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＭＭＰ－１のｍＲＮＡとタンパク質の発現を阻害することが報告されたが、ｓｉＲＮＡは、製造するには高価すぎる上、使用者の良好な服薬遵守のために経皮投与によって皮膚へ送達される必要がある。したがって、メタロプロテアーゼ－１の皮膚の老化における意義を考慮すると、メタロプロテアーゼ－１の発現のメカニズムに基づいて、皮膚の老化の症状を改善および防止し得る医薬品および化粧品を開発することは非常に興味深く、必要なことである。
【課題を解決するための手段】
【0035】
本発明は、式Ｉによって表されるペプチド核酸誘導体、またはその薬学的に許容可能な塩を提供する：
式中、
ｎは、１０と２１の間の整数であり；
式Ｉの化合物は、ヒトＭＭＰ－１プレｍＲＮＡ中の１６塩基のプレｍＲＮＡ配列
と１０塩基の相補的な重複を少なくとも有し；
式Ｉの化合物は、ヒトＭＭＰ－１プレｍＲＮＡと完全に相補的であるか、またはヒトＭＭＰ－１プレｍＲＮＡと１つもしくは２つのミスマッチを伴って部分的に相補的であり；
Ｓ１、Ｓ２、・・・、Ｓｎ－１、Ｓｎ、Ｔ１、Ｔ２、・・・、Ｔｎ－１、およびＴｎは、独立して、水素（ｈｙｄｒｉｄｏ）、重水素（ｄｅｕｔｅｒｉｄｏ）、置換もしくは非置換のアルキル、または置換もしくは非置換のアリールラジカルを表し；
ＸおよびＹは、独立して、水素、重水素、ホルミル［Ｈ－Ｃ（＝Ｏ）－］、アミノカルボニル［ＮＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－］、アミノチオカルボニル［ＮＨ２－Ｃ（＝Ｓ）－］、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のアルキルオキシ、置換もしくは非置換のアリールオキシ、置換もしくは非置換のアルキルアシル、置換もしくは非置換のアリールアシル、置換もしくは非置換のアルキルオキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニル、置換もしくは非置換のアルキルアミノカルボニル、置換もしくは非置換のアリールアミノカルボニル、置換もしくは非置換のアルキルアミノチオカルボニル、置換もしくは非置換のアリールアミノチオカルボニル、置換もしくは非置換のアルキルオキシチオカルボニル、置換もしくは非置換のアリールオキシチオカルボニル、置換もしくは非置換のアルキルスルホニル、置換もしくは非置換のアリールスルホニル、置換もしくは非置換のアルキルホスホニル、または置換もしくは非置換のアリールホスホニルラジカルを表し；
Ｚは、水素、重水素、ヒドロキシ、置換もしくは非置換のアルキルオキシ、置換もしくは非置換のアリールオキシ、置換もしくは非置換のアミノ、置換もしくは非置換のアルキル、または置換もしくは非置換のアリールラジカルを表し；
Ｂ１、Ｂ２、・・・、Ｂｎ－１、およびＢｎは、アデニン、チミン、グアニン、シトシン、およびウラシルを含む天然核酸塩基、ならびに非天然核酸塩基から独立して選択され；かつ、
Ｂ１、Ｂ２、・・・、Ｂｎ－１、およびＢｎのうち少なくとも４つは、置換または非置換のアミノラジカルが核酸塩基部分に共有結合している非天然核酸塩基から独立して選択される。
ｎは、１０と２１の間の整数であり；
式Ｉの化合物は、ヒトＭＭＰ－１プレｍＲＮＡ中の１６塩基のプレｍＲＮＡ配列
式Ｉの化合物は、ヒトＭＭＰ－１プレｍＲＮＡと完全に相補的であるか、またはヒトＭＭＰ－１プレｍＲＮＡと１つもしくは２つのミスマッチを伴って部分的に相補的であり；
Ｓ１、Ｓ２、・・・、Ｓｎ－１、Ｓｎ、Ｔ１、Ｔ２、・・・、Ｔｎ－１、およびＴｎは、独立して、水素（ｈｙｄｒｉｄｏ）、重水素（ｄｅｕｔｅｒｉｄｏ）、置換もしくは非置換のアルキル、または置換もしくは非置換のアリールラジカルを表し；
ＸおよびＹは、独立して、水素、重水素、ホルミル［Ｈ－Ｃ（＝Ｏ）－］、アミノカルボニル［ＮＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－］、アミノチオカルボニル［ＮＨ２－Ｃ（＝Ｓ）－］、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のアルキルオキシ、置換もしくは非置換のアリールオキシ、置換もしくは非置換のアルキルアシル、置換もしくは非置換のアリールアシル、置換もしくは非置換のアルキルオキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニル、置換もしくは非置換のアルキルアミノカルボニル、置換もしくは非置換のアリールアミノカルボニル、置換もしくは非置換のアルキルアミノチオカルボニル、置換もしくは非置換のアリールアミノチオカルボニル、置換もしくは非置換のアルキルオキシチオカルボニル、置換もしくは非置換のアリールオキシチオカルボニル、置換もしくは非置換のアルキルスルホニル、置換もしくは非置換のアリールスルホニル、置換もしくは非置換のアルキルホスホニル、または置換もしくは非置換のアリールホスホニルラジカルを表し；
Ｚは、水素、重水素、ヒドロキシ、置換もしくは非置換のアルキルオキシ、置換もしくは非置換のアリールオキシ、置換もしくは非置換のアミノ、置換もしくは非置換のアルキル、または置換もしくは非置換のアリールラジカルを表し；
Ｂ１、Ｂ２、・・・、Ｂｎ－１、およびＢｎは、アデニン、チミン、グアニン、シトシン、およびウラシルを含む天然核酸塩基、ならびに非天然核酸塩基から独立して選択され；かつ、
Ｂ１、Ｂ２、・・・、Ｂｎ－１、およびＢｎのうち少なくとも４つは、置換または非置換のアミノラジカルが核酸塩基部分に共有結合している非天然核酸塩基から独立して選択される。
【0036】
式Ｉの化合物は、ヒトＭＭＰ－１プレｍＲＮＡにおいて「エクソン５」のスキッピング（ｓｋｉｐｐｉｎｇ）を誘導し、「エクソン５」が欠如したヒトＭＭＰ－１ ｍＲＮＡスプライスバリアントをもたらし、よって、ヒトＭＭＰ－１プレｍＲＮＡを転写する遺伝子の機能的活性を阻害するのに有用である。
【0037】
「ｎは１０と２１の間の整数である」との条件は、文字通り、ｎは、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、および２０の整数の群から選択され得る整数であることを意味する。
【0038】
式ＩのＰＮＡ誘導体における天然または非天然核酸塩基の化学構造を、図１ａ～１ｃに例示する。本発明の天然の（すなわち自然発生の）または非天然の（自然発生ではない）核酸塩基は、図１ａ～１ｃに提供される核酸塩基を含むが、これらに限定されない。そのような非天然核酸塩基の提供は、許容可能な核酸塩基の多様性を例示するためのものであり、よって本発明の範囲を制限するものと解釈してはならない。
【0039】
式ＩのＰＮＡ誘導体を説明するために採用された置換基を、図２ａ～２ｅに例示する。図２ａは、置換または非置換のアルキルラジカルの例を提供する。置換または非置換のアルキルアシルおよび置換または非置換のアリールアシルラジカルを図２ｂに例示する。図２ｃは、置換または非置換のアルキルアミノ、置換または非置換のアリールアミノ、置換または非置換のアリール、置換または非置換のアルキルスルホニルまたはアリールスルホニル、および置換または非置換のアルキルホスホニルまたはアリールホスホニルラジカルについての例を表す。図２ｄは、置換もしくは非置換のアルキルオキシカルボニルまたはアリールオキシカルボニル、置換もしくは非置換のアルキルアミノカルボニルまたはアリールアミノカルボニルラジカルについての例を提供する。図２ｅには、置換または非置換のアルキルアミノチオカルボニル、置換または非置換のアリールアミノチオカルボニル、置換または非置換のアルキルオキシチオカルボニル、および置換または非置換のアリールオキシチオカルボニルラジカルについての例が提供される。そのような例示的な置換基の提供は、許容可能な置換基の多様性を例示するためのものであり、よって本発明の範囲を制限するものと解釈してはならない。当業者は、Ｎ末端またはＣ末端の置換基よりもオリゴヌクレオチド配列が、ターゲットプレｍＲＮＡにオリゴヌクレオチドが配列特異的に結合するための最も重要な因子であることを容易に理解できる。
【0040】
式Ｉの化合物は、従来技術［ＰＣＴ／ＫＲ２００９／００１２５６］において例示されたように、相補的なＤＮＡに強く結合する。式ＩのＰＮＡ誘導体とその完全長相補的ＤＮＡまたはＲＮＡとの二本鎖は、水性緩衝液中で確実に測定するには高すぎるＴｍ値を有する。式ＩのＰＮＡ化合物は、より短い長さの相補的ＤＮＡとも高いＴｍ値をもたらす。
【0041】
式Ｉの化合物は、ヒトＭＭＰ－１プレｍＲＮＡの「エクソン５」の５’スプライス部位に相補的に結合する［ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＧ＿０１１７４０］。１６塩基の配列
は、ヒトＭＭＰ－１プレｍＲＮＡの「エクソン５」と「イントロン５」の接合部にわたっており、「エクソン５」からの８塩基と「イントロン５」からの８塩基からなる。よって、この１６塩基のプレｍＲＮＡ配列は、[（５’→３’）ＣＡＵＡＵＡＵＧ┃ｇｕｇａｇｕａｕ]として慣習的に示すことができ、ここでエクソン配列およびイントロン配列は、それぞれ「大」文字および「小」文字で示され、エクソン－イントロン接合部は、「┃」によって表される。プレｍＲＮＡについての慣習的な表示は、ヒトＭＭＰ－１プレｍＲＮＡ中の「エクソン５」と「イントロン５」の接合部にわたっている、３０塩基の配列
によってさらに例示される。
【0042】
式Ｉの化合物は、ヒトＭＭＰ－１遺伝子から転写されたヒトＭＭＰ－１プレｍＲＮＡのターゲット５’スプライス部位に強く結合して、「スプライソソーム初期複合体」の形成を妨害し、「エクソン５」が欠如した（エクソン５スキッピング）ＭＭＰ－１ ｍＲＮＡスプライスバリアントを生成する。
【0043】
ＰＮＡ誘導体がＭＭＰ－１プレｍＲＮＡ中のターゲット５’スプライス部位と１つまたは２つのミスマッチを有する場合であっても、強力なＲＮＡ親和性によって、式Ｉの化合物は、ＭＭＰ－１「エクソン５」のスキッピングを誘導することが可能になる。同様に、式ＩのＰＮＡ誘導体は、ターゲットスプライス部位に１つまたは２つのＳＮＰ（単一ヌクレオチド多型）を有するＭＭＰ－１突然変異プレｍＲＮＡにおいても、ＭＭＰ－１「エクソン５」のスキッピングを依然として誘導することができる。
【0044】
式Ｉの化合物は、良好な細胞透過性を有し、従来技術［ＰＣＴ／ＫＲ２００９／００１２５６］に例示されたような「裸の」オリゴヌクレオチドとして細胞内に容易に送達され得る。よって、本発明の化合物は、ＭＭＰ－１プレｍＲＮＡにおいて「エクソン５」のスキッピングを誘導し、「裸の」オリゴヌクレオチドとしての式Ｉの化合物で処理した細胞においてＭＭＰ－１「エクソン５」が欠如したＭＭＰ－１ ｍＲＮＡスプライスバリアントをもたらす。式Ｉの化合物は、細胞においてターゲットエクソンのスキッピングを強力に誘導するために、細胞中への送達のための如何なる手段も製剤も必要としない。式Ｉの化合物は、フェムトモル濃度以下の、「裸の」オリゴヌクレオチドとしての本発明の化合物で処理した細胞においてＭＭＰ－１「エクソン５」のスキッピングを容易に誘導する。
【0045】
良好な細胞または膜透過性のおかげで、式ＩのＰＮＡ誘導体を「裸の」オリゴヌクレオチドとして局所的に投与して、皮膚においてＭＭＰ－１「エクソン５」のスキッピングを誘導できる。式Ｉの化合物は、意図された治療的または生物学的活性のために、ターゲット組織内への経皮送達を増加させるための製剤を必要としない。通常、式Ｉの化合物は水および共溶媒に溶解され、ピコモル濃度以下で局所または経皮投与されてターゲットの皮膚において所望の治療的または生物学的活性を発揮する。本発明の化合物は、局所的な治療活性を発揮するために、過度にまたは侵襲的に製剤化される必要はない。それでも、式ＩのＰＮＡ誘導体は、局所用クリームまたはローションとして化粧品成分または助剤と一緒に製剤化できる。そのような局所用の化粧品クリームまたはローションは、皮膚の老化の治療に有用であり得る。
【0046】
本発明の化合物は、１ａＭから１ｎＭ超までの範囲の治療的にまたは生物学的に有効な濃度で対象に局所投与することができ、この濃度は、投与スケジュール、対象の条件または状況等によって変わる。
【0047】
式ＩのＰＮＡ誘導体は、注射剤、点鼻薬、経皮吸収パッチなどを含むがこれらに限定されず、様々な製剤とすることができる。また、式ＩのＰＮＡ誘導体は治療的に有効な用量で対象に投与することができ、投与用量は、適応症、投与経路、投与スケジュール、対象の条件または状況等に応じて多様であり得る。
【0048】
式Ｉの化合物は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、塩酸、メタンスルホン酸、クエン酸、トリフルオロ酢酸等を含むがこれらに限定されない薬学的に許容可能な酸または塩基と組み合わせて使用できる。
【0049】
式ＩのＰＮＡ誘導体またはその薬学的に許容可能な塩は、クエン酸、塩酸、酒石酸、ステアリン酸、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エタノール、イソプロパノール、炭酸水素ナトリウム、蒸留水、保存剤等を含むがこれらに限定されない薬学的に許容可能な助剤と組み合わせて、対象に投与できる。
【0050】
関心対象となるのは、式ＩのＰＮＡ誘導体、またはその薬学的に許容可能な塩であり、
式中、
ｎは１０と２１の間の整数であり；
式Ｉの化合物は、ヒトＭＭＰ－１プレｍＲＮＡ中の１６塩基のプレｍＲＮＡ配列
と１０塩基の相補的な重複を少なくとも有し；
式Ｉの化合物は、ヒトＭＭＰ－１プレｍＲＮＡと完全に相補的であるか、または、ヒトＭＭＰ－１プレｍＲＮＡと１つもしくは２つのミスマッチを伴って部分的に相補的であり；
Ｓ１、Ｓ２、・・・、Ｓｎ－１、Ｓｎ、Ｔ１、Ｔ２、・・・、Ｔｎ－１、およびＴｎは、独立して、水素、重水素ラジカルを表し；
ＸおよびＹは、独立して、水素、重水素、ホルミル［Ｈ－Ｃ（＝Ｏ）－］、アミノカルボニル［ＮＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－］、アミノチオカルボニル［ＮＨ２－Ｃ（＝Ｓ）－］、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のアルキルオキシ、置換もしくは非置換のアリールオキシ、置換もしくは非置換のアルキルアシル、置換もしくは非置換のアリールアシル、置換もしくは非置換のアルキルオキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニル、置換もしくは非置換のアルキルアミノカルボニル、置換もしくは非置換のアリールアミノカルボニル、置換もしくは非置換のアルキルアミノチオカルボニル、置換もしくは非置換のアリールアミノチオカルボニル、置換もしくは非置換のアルキルオキシチオカルボニル、置換もしくは非置換のアリールオキシチオカルボニル、置換もしくは非置換のアルキルスルホニル、置換もしくは非置換のアリールスルホニル、置換もしくは非置換のアルキルホスホニル、または置換もしくは非置換のアリールホスホニルラジカルを表し；
Ｚは、水素、ヒドロキシ、置換もしくは非置換のアルキルオキシ、置換もしくは非置換のアリールオキシ、または置換もしくは非置換のアミノラジカルを表し；
Ｂ１、Ｂ２、・・・、Ｂｎ－１、およびＢｎは、アデニン、チミン、グアニン、シトシン、およびウラシルを含む天然核酸塩基、ならびに非天然核酸塩基から独立して選択され；かつ、
Ｂ１、Ｂ２、・・・、Ｂｎ－１、およびＢｎのうち少なくとも４つは、式ＩＩ、式ＩＩＩ、または式ＩＶ：
によって表される非天然核酸塩基から独立して選択され、
式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６は、水素および置換または非置換のアルキルラジカルから独立して選択され；
Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３は、式Ｖ：
によって表される、核酸塩基部分に塩基性アミノ基を共有結合する共有結合性リンカーであり、
式中、
Ｑ１およびＱｍは、置換または非置換のメチレン（－ＣＨ２－）ラジカルであり、Ｑｍは、塩基性アミノ基に直接結合しており；
Ｑ２、Ｑ３、・・・、およびＱｍ－１は、置換または非置換のメチレン、酸素（－Ｏ－）、硫黄（－Ｓ－）、および置換または非置換のアミノラジカル［－Ｎ（Ｈ）－または－Ｎ（置換基）－］から独立して選択され；かつ、
ｍは、１と１５の間の整数である。
式中、
ｎは１０と２１の間の整数であり；
式Ｉの化合物は、ヒトＭＭＰ－１プレｍＲＮＡ中の１６塩基のプレｍＲＮＡ配列
式Ｉの化合物は、ヒトＭＭＰ－１プレｍＲＮＡと完全に相補的であるか、または、ヒトＭＭＰ－１プレｍＲＮＡと１つもしくは２つのミスマッチを伴って部分的に相補的であり；
Ｓ１、Ｓ２、・・・、Ｓｎ－１、Ｓｎ、Ｔ１、Ｔ２、・・・、Ｔｎ－１、およびＴｎは、独立して、水素、重水素ラジカルを表し；
ＸおよびＹは、独立して、水素、重水素、ホルミル［Ｈ－Ｃ（＝Ｏ）－］、アミノカルボニル［ＮＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－］、アミノチオカルボニル［ＮＨ２－Ｃ（＝Ｓ）－］、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のアルキルオキシ、置換もしくは非置換のアリールオキシ、置換もしくは非置換のアルキルアシル、置換もしくは非置換のアリールアシル、置換もしくは非置換のアルキルオキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニル、置換もしくは非置換のアルキルアミノカルボニル、置換もしくは非置換のアリールアミノカルボニル、置換もしくは非置換のアルキルアミノチオカルボニル、置換もしくは非置換のアリールアミノチオカルボニル、置換もしくは非置換のアルキルオキシチオカルボニル、置換もしくは非置換のアリールオキシチオカルボニル、置換もしくは非置換のアルキルスルホニル、置換もしくは非置換のアリールスルホニル、置換もしくは非置換のアルキルホスホニル、または置換もしくは非置換のアリールホスホニルラジカルを表し；
Ｚは、水素、ヒドロキシ、置換もしくは非置換のアルキルオキシ、置換もしくは非置換のアリールオキシ、または置換もしくは非置換のアミノラジカルを表し；
Ｂ１、Ｂ２、・・・、Ｂｎ－１、およびＢｎは、アデニン、チミン、グアニン、シトシン、およびウラシルを含む天然核酸塩基、ならびに非天然核酸塩基から独立して選択され；かつ、
Ｂ１、Ｂ２、・・・、Ｂｎ－１、およびＢｎのうち少なくとも４つは、式ＩＩ、式ＩＩＩ、または式ＩＶ：
式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６は、水素および置換または非置換のアルキルラジカルから独立して選択され；
Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３は、式Ｖ：
式中、
Ｑ１およびＱｍは、置換または非置換のメチレン（－ＣＨ２－）ラジカルであり、Ｑｍは、塩基性アミノ基に直接結合しており；
Ｑ２、Ｑ３、・・・、およびＱｍ－１は、置換または非置換のメチレン、酸素（－Ｏ－）、硫黄（－Ｓ－）、および置換または非置換のアミノラジカル［－Ｎ（Ｈ）－または－Ｎ（置換基）－］から独立して選択され；かつ、
ｍは、１と１５の間の整数である。
【0051】
高い関心対象となるのは、式ＩのＰＮＡオリゴマー、またはその薬学的に許容可能な塩であり、
式中、
ｎは、１１と１６の間の整数であり；
式Ｉの化合物は、ヒトＭＭＰ－１プレｍＲＮＡ中の１６塩基のプレｍＲＮＡ配列
と１０塩基の相補的な重複を少なくとも有し；
式Ｉの化合物が、ヒトＭＭＰ－１プレｍＲＮＡと完全に相補的であり；
Ｓ１、Ｓ２、・・・、Ｓｎ－１、Ｓｎ、Ｔ１、Ｔ２、・・・、Ｔｎ－１、およびＴｎは、水素ラジカルであり；
ＸおよびＹは、独立して、水素、置換もしくは非置換のアルキルアシル、または置換もしくは非置換のアルキルオキシカルボニルラジカルを表し；
Ｚは、置換または非置換のアミノラジカルを表し；
Ｂ１、Ｂ２、・・・、Ｂｎ－１、およびＢｎは、アデニン、チミン、グアニン、シトシン、およびウラシルを含む天然核酸塩基、ならびに非天然核酸塩基から独立して選択され；
Ｂ１、Ｂ２、・・・、Ｂｎ－１、およびＢｎのうち少なくとも５つは、式ＩＩ、式ＩＩＩ、または式ＩＶによって表される非天然核酸塩基から独立して選択され；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６は、水素ラジカルであり；
Ｑ１およびＱｍは、メチレンラジカルであり、Ｑｍは、塩基性アミノ基に直接結合しており；
Ｑ２、Ｑ３、・・・、およびＱｍ－１は、メチレンおよび酸素ラジカルから独立して選択され；かつ、
ｍは、１と９の間の整数である。
式中、
ｎは、１１と１６の間の整数であり；
式Ｉの化合物は、ヒトＭＭＰ－１プレｍＲＮＡ中の１６塩基のプレｍＲＮＡ配列
式Ｉの化合物が、ヒトＭＭＰ－１プレｍＲＮＡと完全に相補的であり；
Ｓ１、Ｓ２、・・・、Ｓｎ－１、Ｓｎ、Ｔ１、Ｔ２、・・・、Ｔｎ－１、およびＴｎは、水素ラジカルであり；
ＸおよびＹは、独立して、水素、置換もしくは非置換のアルキルアシル、または置換もしくは非置換のアルキルオキシカルボニルラジカルを表し；
Ｚは、置換または非置換のアミノラジカルを表し；
Ｂ１、Ｂ２、・・・、Ｂｎ－１、およびＢｎは、アデニン、チミン、グアニン、シトシン、およびウラシルを含む天然核酸塩基、ならびに非天然核酸塩基から独立して選択され；
Ｂ１、Ｂ２、・・・、Ｂｎ－１、およびＢｎのうち少なくとも５つは、式ＩＩ、式ＩＩＩ、または式ＩＶによって表される非天然核酸塩基から独立して選択され；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６は、水素ラジカルであり；
Ｑ１およびＱｍは、メチレンラジカルであり、Ｑｍは、塩基性アミノ基に直接結合しており；
Ｑ２、Ｑ３、・・・、およびＱｍ－１は、メチレンおよび酸素ラジカルから独立して選択され；かつ、
ｍは、１と９の間の整数である。
【0052】
より高い関心対象となるのは、式ＩのＰＮＡ誘導体、またはその薬学的に許容可能な塩であり、
式中、
ｎは、１１と１６の間の整数であり；
式Ｉの化合物は、ヒトＭＭＰ－１プレｍＲＮＡ中の１６塩基のプレｍＲＮＡ配列
と１０塩基の相補的な重複を少なくとも有し；
式Ｉの化合物は，ヒトＭＭＰ－１プレｍＲＮＡと完全に相補的であり；
Ｓ１、Ｓ２、・・・、Ｓｎ－１、Ｓｎ、Ｔ１、Ｔ２、・・・、Ｔｎ－１、およびＴｎは、水素ラジカルであり；
Ｘは、水素ラジカルであり；
Ｙは、置換または非置換のアルキルオキシカルボニルラジカルであり；
Ｚは、置換または非置換のアミノラジカルであり；
Ｂ１、Ｂ２、・・・、Ｂｎ－１、およびＢｎは、アデニン、チミン、グアニン、シトシン、およびウラシルを含む天然核酸塩基、ならびに非天然核酸塩基から独立して選択され；
Ｂ１、Ｂ２、・・・、Ｂｎ－１、およびＢｎのうち少なくとも５つは、式ＩＩ、式ＩＩＩ、または式ＩＶによって表される非天然核酸塩基から独立して選択され；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６は、水素ラジカルであり；
Ｌ１は、右端が塩基性アミノ基に直接結合している、－（ＣＨ２）２－Ｏ－（ＣＨ２）２－、－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２）２－、－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２）３－、－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２）４－、または－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２）５－を表し；かつ、
Ｌ２およびＬ３は、右端が塩基性アミノ基に直接結合している、－（ＣＨ２）２－Ｏ－（ＣＨ２）２－、－（ＣＨ２）３－Ｏ－（ＣＨ２）２－、－（ＣＨ２）２－Ｏ－（ＣＨ２）３－、－（ＣＨ２）２－、－（ＣＨ２）３－、－（ＣＨ２）４－、－（ＣＨ２）５－、－（ＣＨ２）６－、－（ＣＨ２）７－、および－（ＣＨ２）８－から独立して選択される。
式中、
ｎは、１１と１６の間の整数であり；
式Ｉの化合物は、ヒトＭＭＰ－１プレｍＲＮＡ中の１６塩基のプレｍＲＮＡ配列
式Ｉの化合物は，ヒトＭＭＰ－１プレｍＲＮＡと完全に相補的であり；
Ｓ１、Ｓ２、・・・、Ｓｎ－１、Ｓｎ、Ｔ１、Ｔ２、・・・、Ｔｎ－１、およびＴｎは、水素ラジカルであり；
Ｘは、水素ラジカルであり；
Ｙは、置換または非置換のアルキルオキシカルボニルラジカルであり；
Ｚは、置換または非置換のアミノラジカルであり；
Ｂ１、Ｂ２、・・・、Ｂｎ－１、およびＢｎは、アデニン、チミン、グアニン、シトシン、およびウラシルを含む天然核酸塩基、ならびに非天然核酸塩基から独立して選択され；
Ｂ１、Ｂ２、・・・、Ｂｎ－１、およびＢｎのうち少なくとも５つは、式ＩＩ、式ＩＩＩ、または式ＩＶによって表される非天然核酸塩基から独立して選択され；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６は、水素ラジカルであり；
Ｌ１は、右端が塩基性アミノ基に直接結合している、－（ＣＨ２）２－Ｏ－（ＣＨ２）２－、－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２）２－、－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２）３－、－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２）４－、または－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２）５－を表し；かつ、
Ｌ２およびＬ３は、右端が塩基性アミノ基に直接結合している、－（ＣＨ２）２－Ｏ－（ＣＨ２）２－、－（ＣＨ２）３－Ｏ－（ＣＨ２）２－、－（ＣＨ２）２－Ｏ－（ＣＨ２）３－、－（ＣＨ２）２－、－（ＣＨ２）３－、－（ＣＨ２）４－、－（ＣＨ２）５－、－（ＣＨ２）６－、－（ＣＨ２）７－、および－（ＣＨ２）８－から独立して選択される。
【0053】
特に関心対象となるのは、以下に示される化合物（ＡＳＯ １、アンチセンスオリゴヌクレオチド１）である、式ＩのＰＮＡ誘導体またはその薬学的に許容可能な塩である：
（Ｎ→C) Fethoc－TA(6)C－TCA(6)－CC(1O2)A(6)－TA(6)T－A(6)T－NH2
ここで、
Ａ、Ｔ、およびＣは、それぞれアデニン、チミン、およびシトシンの天然核酸塩基を有するＰＮＡモノマーであり；
Ｃ（ｐＯｑ）およびＡ（ｐ）は、それぞれ、式ＶＩおよび式ＶＩＩ：
によって表される非天然核酸塩基を有するＰＮＡモノマーであり、
式中、ｐおよびｑは整数であり、ＡＳＯ １において、ｐは１または６であり、ｑは２であり；かつ、
「Ｆｅｔｈｏｃ－」は「［２－（９－フルオレニル）エチル－１－オキシ］カルボニル」の略語であり、「－ＮＨ２」は非置換のアミノ基の略語である。
（Ｎ→C) Fethoc－TA(6)C－TCA(6)－CC(1O2)A(6)－TA(6)T－A(6)T－NH2
ここで、
Ａ、Ｔ、およびＣは、それぞれアデニン、チミン、およびシトシンの天然核酸塩基を有するＰＮＡモノマーであり；
Ｃ（ｐＯｑ）およびＡ（ｐ）は、それぞれ、式ＶＩおよび式ＶＩＩ：
式中、ｐおよびｑは整数であり、ＡＳＯ １において、ｐは１または６であり、ｑは２であり；かつ、
「Ｆｅｔｈｏｃ－」は「［２－（９－フルオレニル）エチル－１－オキシ］カルボニル」の略語であり、「－ＮＨ２」は非置換のアミノ基の略語である。
【0054】
図３は、Ａ、Ｇ、Ｔ、Ｃ、Ｃ（ｐＯｑ）、Ａ（ｐ）、Ａ（ｐＯｑ）、Ｇ（ｐ）、およびＧ（ｐＯｑ）と略記されたＰＮＡモノマーの化学構造をまとめて明瞭に提供する。従来技術［ＰＣＴ／ＫＲ２００９／００１２５６］で論議されたように、Ｃ（ｐＯｑ）は、「グアニン」に対してハイブリダイズするため、「修飾シトシン」ＰＮＡモノマーと見なされる。Ａ（ｐ）およびＡ（ｐＯｑ）は、「チミン」に対してハイブリダイズするため、「修飾アデニン」ＰＮＡモノマーと捉えられる。
【0055】
そのようなＰＮＡ誘導体に使用される略語を例示するために、ＡＳＯ 1の化学構造を図4に提供する。
【0056】
ＡＳＯ １は、プレｍＲＮＡへの相補的な結合のためのＤＮＡ配列
と同等である。この１４塩基のＰＮＡは、ヒトＭＭＰ－１プレｍＲＮＡ中の「エクソン５」と「イントロン５」の接合部にわたっている３０塩基のＲＮＡ配列
内の「太字」かつ「下線」表示した１４塩基の配列と、１４塩基の相補的な重複を有する。
【0057】
いくつかの態様において、本発明は、本発明のペプチド核酸誘導体またはその薬学的に許容可能な塩を対象に投与することを含む、対象におけるヒトＭＭＰ－１遺伝子転写に関連する疾患または状態を治療する方法を提供する。
【0058】
いくつかの態様において、本発明は、本発明のペプチド核酸誘導体またはその薬学的に許容可能な塩を対象に投与することを含む、対象における皮膚の老化を治療する方法を提供する。
【0059】
いくつかの態様において、本発明は、本発明のペプチド核酸誘導体またはその薬学的に許容可能な塩を含む、ヒトＭＭＰ－１遺伝子転写に関連する疾患または状態を治療するための薬学的組成物を提供する。
【0060】
いくつかの態様において、本発明は、本発明のペプチド核酸誘導体またはその薬学的に許容可能な塩を含む、ヒトＭＭＰ－１遺伝子転写に関連する疾患または状態を治療するための化粧品組成物を提供する。
【0061】
いくつかの態様において、本発明は、本発明のペプチド核酸誘導体またはその薬学的に許容可能な塩を含む、皮膚の老化を治療するための薬学的組成物を提供する。
【0062】
いくつかの態様において、本発明は、本発明のペプチド核酸誘導体またはその薬学的に許容可能な塩を含む、皮膚の老化を治療するための化粧品組成物を提供する。
[本発明1001]
式Ｉ：
によって表されるペプチド核酸誘導体、またはその薬学的に許容可能な塩：
式中、
ｎが、10と21の間の整数であり；
式Ｉの化合物が、ヒトＭＭＰ－1プレｍＲＮＡ中の16塩基のプレｍＲＮＡ配列
と10塩基の相補的な重複を少なくとも有し；
式Ｉの化合物が、ヒトＭＭＰ－1プレｍＲＮＡと完全に相補的であるか、またはヒトＭＭＰ－1プレｍＲＮＡと1つもしくは2つのミスマッチを伴って部分的に相補的であり；
Ｓ 1 、Ｓ 2 、・・・、Ｓ ｎ－1 、Ｓ ｎ 、Ｔ 1 、Ｔ 2 、・・・、Ｔ ｎ－1 、およびＴ ｎ が、独立して、水素、重水素、置換もしくは非置換のアルキル、または置換もしくは非置換のアリールラジカルを表し；
ＸおよびＹが、独立して、水素（hydrido）、重水素(deuterido)、ホルミル［Ｈ－Ｃ（＝Ｏ）－］、アミノカルボニル［ＮＨ 2 －Ｃ（＝Ｏ）－］、アミノチオカルボニル［ＮＨ 2 －Ｃ（＝Ｓ）－］、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のアルキルオキシ、置換もしくは非置換のアリールオキシ、置換もしくは非置換のアルキルアシル、置換もしくは非置換のアリールアシル、置換もしくは非置換のアルキルオキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニル、置換もしくは非置換のアルキルアミノカルボニル、置換もしくは非置換のアリールアミノカルボニル、置換もしくは非置換のアルキルアミノチオカルボニル、置換もしくは非置換のアリールアミノチオカルボニル、置換もしくは非置換のアルキルオキシチオカルボニル、置換もしくは非置換のアリールオキシチオカルボニル、置換もしくは非置換のアルキルスルホニル、置換もしくは非置換のアリールスルホニル、置換もしくは非置換のアルキルホスホニル、または置換もしくは非置換のアリールホスホニルラジカルを表し；
Ｚが、水素、重水素、ヒドロキシ、置換もしくは非置換のアルキルオキシ、置換もしくは非置換のアリールオキシ、置換もしくは非置換のアミノ、置換もしくは非置換のアルキル、または置換もしくは非置換のアリールラジカルを表し；
Ｂ 1 、Ｂ 2 、・・・、Ｂ ｎ－1 、およびＢ ｎ が、アデニン、チミン、グアニン、シトシン、およびウラシルを含む天然核酸塩基、ならびに非天然核酸塩基から独立して選択され；かつ、
Ｂ 1 、Ｂ 2 、・・・、Ｂ ｎ－1 、およびＢ ｎ のうち少なくとも4つが、核酸塩基部分に共有結合している置換または非置換のアミノラジカルを有する非天然核酸塩基から独立して選択される。
[本発明1002]
ｎが、10と21の間の整数であり；
式Ｉの化合物が、ヒトＭＭＰ－1プレｍＲＮＡ中の16塩基のプレｍＲＮＡ配列
と10塩基の相補的な重複を少なくとも有し；
式Ｉの化合物が、ヒトＭＭＰ－1プレｍＲＮＡと完全に相補的であるか、またはヒトＭＭＰ－1プレｍＲＮＡと1つもしくは2つのミスマッチを伴って部分的に相補的であり；
Ｓ 1 、Ｓ 2 、・・・、Ｓ ｎ－1 、Ｓ ｎ 、Ｔ 1 、Ｔ 2 、・・・、Ｔ ｎ－1 、およびＴ ｎ が、独立して、水素、重水素ラジカルを表し；
ＸおよびＹが、独立して、水素、重水素、ホルミル［Ｈ－Ｃ（＝Ｏ）－］、アミノカルボニル［ＮＨ 2 －Ｃ（＝Ｏ）－］、アミノチオカルボニル［ＮＨ 2 －Ｃ（＝Ｓ）－］、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のアルキルオキシ、置換もしくは非置換のアリールオキシ、置換もしくは非置換のアルキルアシル、置換もしくは非置換のアリールアシル、置換もしくは非置換のアルキルオキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニル、置換もしくは非置換のアルキルアミノカルボニル、置換もしくは非置換のアリールアミノカルボニル、置換もしくは非置換のアルキルアミノチオカルボニル、置換もしくは非置換のアリールアミノチオカルボニル、置換もしくは非置換のアルキルオキシチオカルボニル、置換もしくは非置換のアリールオキシチオカルボニル、置換もしくは非置換のアルキルスルホニル、置換もしくは非置換のアリールスルホニル、置換もしくは非置換のアルキルホスホニル、または置換もしくは非置換のアリールホスホニルラジカルを表し；
Ｚが、水素、ヒドロキシ、置換もしくは非置換のアルキルオキシ、置換もしくは非置換のアリールオキシ、または置換もしくは非置換のアミノラジカルを表し；
Ｂ 1 、Ｂ 2 、・・・、Ｂ ｎ－1 、およびＢ ｎ が、アデニン、チミン、グアニン、シトシン、およびウラシルを含む天然核酸塩基、ならびに非天然核酸塩基から独立して選択され；
Ｂ 1 、Ｂ 2 、・・・、Ｂ ｎ－1 、およびＢ ｎ のうち少なくとも4つが、式ＩＩ、式ＩＩＩ、または式ＩＶ：
によって表される非天然核酸塩基から独立して選択され、
式中、
Ｒ 1 、Ｒ 2 、Ｒ 3 、Ｒ 4 、Ｒ 5 、およびＲ 6 が、水素および置換または非置換のアルキルラジカルから独立して選択され；
Ｌ 1 、Ｌ 2 、およびＬ 3 が、式Ｖ：
によって表される、核酸塩基部分に塩基性アミノ基を共有結合する共有結合性リンカーであり、
式中、
Ｑ 1 およびＱ ｍ が、置換または非置換のメチレン（－ＣＨ 2 －）ラジカルであり、Ｑ ｍ が、塩基性アミノ基に直接結合しており；
Ｑ 2 、Ｑ 3 、・・・、およびＱ ｍ－1 が、置換または非置換のメチレン、酸素（－Ｏ－）、硫黄（－Ｓ－）、および置換または非置換のアミノラジカル［－Ｎ（Ｈ）－または－Ｎ（置換基）－］から独立して選択され；かつ、
ｍが、1と15の間の整数である、
本発明1001のペプチド核酸誘導体、またはその薬学的に許容可能な塩。
[本発明1003]
ｎが、11と16の間の整数であり；
式Ｉの化合物が、ヒトＭＭＰ－1プレｍＲＮＡ中の16塩基のプレｍＲＮＡ配列
と10塩基の相補的な重複を少なくとも有し；
式Ｉの化合物が、ヒトＭＭＰ－1プレｍＲＮＡと完全に相補的であり；
Ｓ 1 、Ｓ 2 、・・・、Ｓ ｎ－1 、Ｓ ｎ 、Ｔ 1 、Ｔ 2 、・・・、Ｔ ｎ－1 、およびＴ ｎ が、水素ラジカルであり；
ＸおよびＹが、独立して、水素、置換もしくは非置換のアルキルアシル、または置換もしくは非置換のアルキルオキシカルボニルラジカルを表し；
Ｚが、置換または非置換のアミノラジカルを表し；
Ｂ 1 、Ｂ 2 、・・・、Ｂ ｎ－1 、およびＢ ｎ が、アデニン、チミン、グアニン、シトシン、およびウラシルを含む天然核酸塩基、ならびに非天然核酸塩基から独立して選択され；
Ｂ 1 、Ｂ 2 、・・・、Ｂ ｎ－1 、およびＢ ｎ のうち少なくとも5つが、式ＩＩ、式ＩＩＩ、または式ＩＶで表される非天然核酸塩基から独立して選択され；
Ｒ 1 、Ｒ 2 、Ｒ 3 、Ｒ 4 、Ｒ 5 、およびＲ 6 が、水素ラジカルであり；
Ｑ 1 およびＱ ｍ が、メチレンラジカルであり、Ｑ ｍ が、塩基性アミノ基に直接結合しており；
Ｑ 2 、Ｑ 3 、・・・、およびＱ ｍ－1 が、メチレンおよび酸素ラジカルから独立して選択され；かつ、
ｍが、1と9の間の整数である、
本発明1002のペプチド核酸誘導体、またはその薬学的に許容可能な塩。
[本発明1004]
ｎが、11と16の間の整数であり；
式Ｉの化合物が、ヒトＭＭＰ－1プレｍＲＮＡ中の16塩基のプレｍＲＮＡ配列
と10塩基の相補的な重複を少なくとも有し；
式Ｉの化合物が，ヒトＭＭＰ－1プレｍＲＮＡと完全に相補的であり；
Ｓ 1 、Ｓ 2 、・・・、Ｓ ｎ－1 、Ｓ ｎ 、Ｔ 1 、Ｔ 2 、・・・、Ｔ ｎ－1 、およびＴ ｎ が、水素ラジカルであり；
Ｘが、水素ラジカルであり；
Ｙが、置換または非置換のアルキルオキシカルボニルラジカルを表し；
Ｚが、置換もしくは非置換のアミノラジカルを表し；
Ｂ 1 、Ｂ 2 、・・・、Ｂ ｎ－1 、およびＢ ｎ が、アデニン、チミン、グアニン、シトシン、およびウラシルを含む天然核酸塩基、ならびに非天然核酸塩基から独立して選択され；
Ｂ 1 、Ｂ 2 、・・・、Ｂ ｎ－1 、およびＢ ｎ のうち少なくとも5つが、式ＩＩ、式ＩＩＩ、または式ＩＶによって表される非天然核酸塩基から独立して選択され；
Ｒ 1 、Ｒ 2 、Ｒ 3 、Ｒ 4 、Ｒ 5 、およびＲ 6 が、水素ラジカルであり；
Ｌ 1 が、右端が塩基性アミノ基に直接結合している、－（ＣＨ 2 ） 2 －Ｏ－（ＣＨ 2 ） 2 －、－ＣＨ 2 －Ｏ－（ＣＨ 2 ） 2 －、－ＣＨ 2 －Ｏ－（ＣＨ 2 ） 3 －、－ＣＨ 2 －Ｏ－（ＣＨ 2 ） 4 －、または－ＣＨ 2 －Ｏ－（ＣＨ 2 ） 5 －を表し、ここで；かつ、
Ｌ 2 およびＬ 3 が、右端が塩基性アミノ基に直接結合している、－（ＣＨ 2 ） 2 －Ｏ－（ＣＨ 2 ） 2 －、－（ＣＨ 2 ） 3 －Ｏ－（ＣＨ 2 ） 2 －、－（ＣＨ 2 ） 2 －Ｏ－（ＣＨ 2 ） 3 －、－（ＣＨ 2 ） 2 －、－（ＣＨ 2 ） 3 －、－（ＣＨ 2 ） 4 －、－（ＣＨ 2 ） 5 －、－（ＣＨ 2 ） 6 －、－（ＣＨ 2 ） 7 －、および－（ＣＨ 2 ） 8 －から独立して選択される、
本発明1003のペプチド核酸誘導体、またはその薬学的に許容可能な塩。
[本発明1005]
以下に示されるペプチド核酸誘導体である、本発明1004のペプチド核酸誘導体、またはその薬学的に許容可能な塩：
（Ｎ→C) Fethoc－TA(6)C－TCA(6)－CC(1O2)A(6)－TA(6)T－A(6)T－NH 2
ここで、
Ａ、Ｔ、およびＣが、それぞれアデニン、チミン、およびシトシンの天然核酸塩基を有するペプチド核酸モノマーであり；
Ｃ（ｐＯｑ）およびＡ（ｐ）が、それぞれ、式ＶＩおよび式ＶＩＩ：
によって表される非天然核酸塩基を有するペプチド核酸モノマーであり、
式中、
ｐおよびｑが、整数であり、ｐが1または6であり、ｑが2であり；かつ、
「Ｆｅｔｈｏｃ－」が、「［2－（9－フルオレニル）エチル－1－オキシ］カルボニル」の略語である。
[本発明1006]
本発明1001のペプチド核酸誘導体またはその薬学的に許容可能な塩の対象への投与を含む、ヒトＭＭＰ－1遺伝子転写に関連する疾患または状態を治療するための方法。
[本発明1007]
本発明1001のペプチド核酸誘導体またはその薬学的に許容可能な塩の対象への投与を含む、皮膚の老化を治療するための方法。
[本発明1008]
本発明1001のペプチド核酸誘導体またはその薬学的に許容可能な塩を含む、ヒトＭＭＰ－1遺伝子転写に関連する疾患または状態を治療するための薬学的組成物。
[本発明1009]
本発明1001のペプチド核酸誘導体またはその薬学的に許容可能な塩を含む、ヒトＭＭＰ－1遺伝子転写に関連する疾患または状態を治療するための化粧品組成物。
[本発明1010]
本発明1001のペプチド核酸誘導体またはその薬学的に許容可能な塩を含む、皮膚の老化を治療するための薬学的組成物。
[本発明1011]
本発明1001のペプチド核酸誘導体またはその薬学的に許容可能な塩を含む、皮膚の老化を治療するための化粧品組成物。
[本発明1001]
式Ｉ：
式中、
ｎが、10と21の間の整数であり；
式Ｉの化合物が、ヒトＭＭＰ－1プレｍＲＮＡ中の16塩基のプレｍＲＮＡ配列
式Ｉの化合物が、ヒトＭＭＰ－1プレｍＲＮＡと完全に相補的であるか、またはヒトＭＭＰ－1プレｍＲＮＡと1つもしくは2つのミスマッチを伴って部分的に相補的であり；
Ｓ 1 、Ｓ 2 、・・・、Ｓ ｎ－1 、Ｓ ｎ 、Ｔ 1 、Ｔ 2 、・・・、Ｔ ｎ－1 、およびＴ ｎ が、独立して、水素、重水素、置換もしくは非置換のアルキル、または置換もしくは非置換のアリールラジカルを表し；
ＸおよびＹが、独立して、水素（hydrido）、重水素(deuterido)、ホルミル［Ｈ－Ｃ（＝Ｏ）－］、アミノカルボニル［ＮＨ 2 －Ｃ（＝Ｏ）－］、アミノチオカルボニル［ＮＨ 2 －Ｃ（＝Ｓ）－］、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のアルキルオキシ、置換もしくは非置換のアリールオキシ、置換もしくは非置換のアルキルアシル、置換もしくは非置換のアリールアシル、置換もしくは非置換のアルキルオキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニル、置換もしくは非置換のアルキルアミノカルボニル、置換もしくは非置換のアリールアミノカルボニル、置換もしくは非置換のアルキルアミノチオカルボニル、置換もしくは非置換のアリールアミノチオカルボニル、置換もしくは非置換のアルキルオキシチオカルボニル、置換もしくは非置換のアリールオキシチオカルボニル、置換もしくは非置換のアルキルスルホニル、置換もしくは非置換のアリールスルホニル、置換もしくは非置換のアルキルホスホニル、または置換もしくは非置換のアリールホスホニルラジカルを表し；
Ｚが、水素、重水素、ヒドロキシ、置換もしくは非置換のアルキルオキシ、置換もしくは非置換のアリールオキシ、置換もしくは非置換のアミノ、置換もしくは非置換のアルキル、または置換もしくは非置換のアリールラジカルを表し；
Ｂ 1 、Ｂ 2 、・・・、Ｂ ｎ－1 、およびＢ ｎ が、アデニン、チミン、グアニン、シトシン、およびウラシルを含む天然核酸塩基、ならびに非天然核酸塩基から独立して選択され；かつ、
Ｂ 1 、Ｂ 2 、・・・、Ｂ ｎ－1 、およびＢ ｎ のうち少なくとも4つが、核酸塩基部分に共有結合している置換または非置換のアミノラジカルを有する非天然核酸塩基から独立して選択される。
[本発明1002]
ｎが、10と21の間の整数であり；
式Ｉの化合物が、ヒトＭＭＰ－1プレｍＲＮＡ中の16塩基のプレｍＲＮＡ配列
式Ｉの化合物が、ヒトＭＭＰ－1プレｍＲＮＡと完全に相補的であるか、またはヒトＭＭＰ－1プレｍＲＮＡと1つもしくは2つのミスマッチを伴って部分的に相補的であり；
Ｓ 1 、Ｓ 2 、・・・、Ｓ ｎ－1 、Ｓ ｎ 、Ｔ 1 、Ｔ 2 、・・・、Ｔ ｎ－1 、およびＴ ｎ が、独立して、水素、重水素ラジカルを表し；
ＸおよびＹが、独立して、水素、重水素、ホルミル［Ｈ－Ｃ（＝Ｏ）－］、アミノカルボニル［ＮＨ 2 －Ｃ（＝Ｏ）－］、アミノチオカルボニル［ＮＨ 2 －Ｃ（＝Ｓ）－］、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のアルキルオキシ、置換もしくは非置換のアリールオキシ、置換もしくは非置換のアルキルアシル、置換もしくは非置換のアリールアシル、置換もしくは非置換のアルキルオキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニル、置換もしくは非置換のアルキルアミノカルボニル、置換もしくは非置換のアリールアミノカルボニル、置換もしくは非置換のアルキルアミノチオカルボニル、置換もしくは非置換のアリールアミノチオカルボニル、置換もしくは非置換のアルキルオキシチオカルボニル、置換もしくは非置換のアリールオキシチオカルボニル、置換もしくは非置換のアルキルスルホニル、置換もしくは非置換のアリールスルホニル、置換もしくは非置換のアルキルホスホニル、または置換もしくは非置換のアリールホスホニルラジカルを表し；
Ｚが、水素、ヒドロキシ、置換もしくは非置換のアルキルオキシ、置換もしくは非置換のアリールオキシ、または置換もしくは非置換のアミノラジカルを表し；
Ｂ 1 、Ｂ 2 、・・・、Ｂ ｎ－1 、およびＢ ｎ が、アデニン、チミン、グアニン、シトシン、およびウラシルを含む天然核酸塩基、ならびに非天然核酸塩基から独立して選択され；
Ｂ 1 、Ｂ 2 、・・・、Ｂ ｎ－1 、およびＢ ｎ のうち少なくとも4つが、式ＩＩ、式ＩＩＩ、または式ＩＶ：
式中、
Ｒ 1 、Ｒ 2 、Ｒ 3 、Ｒ 4 、Ｒ 5 、およびＲ 6 が、水素および置換または非置換のアルキルラジカルから独立して選択され；
Ｌ 1 、Ｌ 2 、およびＬ 3 が、式Ｖ：
式中、
Ｑ 1 およびＱ ｍ が、置換または非置換のメチレン（－ＣＨ 2 －）ラジカルであり、Ｑ ｍ が、塩基性アミノ基に直接結合しており；
Ｑ 2 、Ｑ 3 、・・・、およびＱ ｍ－1 が、置換または非置換のメチレン、酸素（－Ｏ－）、硫黄（－Ｓ－）、および置換または非置換のアミノラジカル［－Ｎ（Ｈ）－または－Ｎ（置換基）－］から独立して選択され；かつ、
ｍが、1と15の間の整数である、
本発明1001のペプチド核酸誘導体、またはその薬学的に許容可能な塩。
[本発明1003]
ｎが、11と16の間の整数であり；
式Ｉの化合物が、ヒトＭＭＰ－1プレｍＲＮＡ中の16塩基のプレｍＲＮＡ配列
式Ｉの化合物が、ヒトＭＭＰ－1プレｍＲＮＡと完全に相補的であり；
Ｓ 1 、Ｓ 2 、・・・、Ｓ ｎ－1 、Ｓ ｎ 、Ｔ 1 、Ｔ 2 、・・・、Ｔ ｎ－1 、およびＴ ｎ が、水素ラジカルであり；
ＸおよびＹが、独立して、水素、置換もしくは非置換のアルキルアシル、または置換もしくは非置換のアルキルオキシカルボニルラジカルを表し；
Ｚが、置換または非置換のアミノラジカルを表し；
Ｂ 1 、Ｂ 2 、・・・、Ｂ ｎ－1 、およびＢ ｎ が、アデニン、チミン、グアニン、シトシン、およびウラシルを含む天然核酸塩基、ならびに非天然核酸塩基から独立して選択され；
Ｂ 1 、Ｂ 2 、・・・、Ｂ ｎ－1 、およびＢ ｎ のうち少なくとも5つが、式ＩＩ、式ＩＩＩ、または式ＩＶで表される非天然核酸塩基から独立して選択され；
Ｒ 1 、Ｒ 2 、Ｒ 3 、Ｒ 4 、Ｒ 5 、およびＲ 6 が、水素ラジカルであり；
Ｑ 1 およびＱ ｍ が、メチレンラジカルであり、Ｑ ｍ が、塩基性アミノ基に直接結合しており；
Ｑ 2 、Ｑ 3 、・・・、およびＱ ｍ－1 が、メチレンおよび酸素ラジカルから独立して選択され；かつ、
ｍが、1と9の間の整数である、
本発明1002のペプチド核酸誘導体、またはその薬学的に許容可能な塩。
[本発明1004]
ｎが、11と16の間の整数であり；
式Ｉの化合物が、ヒトＭＭＰ－1プレｍＲＮＡ中の16塩基のプレｍＲＮＡ配列
式Ｉの化合物が，ヒトＭＭＰ－1プレｍＲＮＡと完全に相補的であり；
Ｓ 1 、Ｓ 2 、・・・、Ｓ ｎ－1 、Ｓ ｎ 、Ｔ 1 、Ｔ 2 、・・・、Ｔ ｎ－1 、およびＴ ｎ が、水素ラジカルであり；
Ｘが、水素ラジカルであり；
Ｙが、置換または非置換のアルキルオキシカルボニルラジカルを表し；
Ｚが、置換もしくは非置換のアミノラジカルを表し；
Ｂ 1 、Ｂ 2 、・・・、Ｂ ｎ－1 、およびＢ ｎ が、アデニン、チミン、グアニン、シトシン、およびウラシルを含む天然核酸塩基、ならびに非天然核酸塩基から独立して選択され；
Ｂ 1 、Ｂ 2 、・・・、Ｂ ｎ－1 、およびＢ ｎ のうち少なくとも5つが、式ＩＩ、式ＩＩＩ、または式ＩＶによって表される非天然核酸塩基から独立して選択され；
Ｒ 1 、Ｒ 2 、Ｒ 3 、Ｒ 4 、Ｒ 5 、およびＲ 6 が、水素ラジカルであり；
Ｌ 1 が、右端が塩基性アミノ基に直接結合している、－（ＣＨ 2 ） 2 －Ｏ－（ＣＨ 2 ） 2 －、－ＣＨ 2 －Ｏ－（ＣＨ 2 ） 2 －、－ＣＨ 2 －Ｏ－（ＣＨ 2 ） 3 －、－ＣＨ 2 －Ｏ－（ＣＨ 2 ） 4 －、または－ＣＨ 2 －Ｏ－（ＣＨ 2 ） 5 －を表し、ここで；かつ、
Ｌ 2 およびＬ 3 が、右端が塩基性アミノ基に直接結合している、－（ＣＨ 2 ） 2 －Ｏ－（ＣＨ 2 ） 2 －、－（ＣＨ 2 ） 3 －Ｏ－（ＣＨ 2 ） 2 －、－（ＣＨ 2 ） 2 －Ｏ－（ＣＨ 2 ） 3 －、－（ＣＨ 2 ） 2 －、－（ＣＨ 2 ） 3 －、－（ＣＨ 2 ） 4 －、－（ＣＨ 2 ） 5 －、－（ＣＨ 2 ） 6 －、－（ＣＨ 2 ） 7 －、および－（ＣＨ 2 ） 8 －から独立して選択される、
本発明1003のペプチド核酸誘導体、またはその薬学的に許容可能な塩。
[本発明1005]
以下に示されるペプチド核酸誘導体である、本発明1004のペプチド核酸誘導体、またはその薬学的に許容可能な塩：
（Ｎ→C) Fethoc－TA(6)C－TCA(6)－CC(1O2)A(6)－TA(6)T－A(6)T－NH 2
ここで、
Ａ、Ｔ、およびＣが、それぞれアデニン、チミン、およびシトシンの天然核酸塩基を有するペプチド核酸モノマーであり；
Ｃ（ｐＯｑ）およびＡ（ｐ）が、それぞれ、式ＶＩおよび式ＶＩＩ：
式中、
ｐおよびｑが、整数であり、ｐが1または6であり、ｑが2であり；かつ、
「Ｆｅｔｈｏｃ－」が、「［2－（9－フルオレニル）エチル－1－オキシ］カルボニル」の略語である。
[本発明1006]
本発明1001のペプチド核酸誘導体またはその薬学的に許容可能な塩の対象への投与を含む、ヒトＭＭＰ－1遺伝子転写に関連する疾患または状態を治療するための方法。
[本発明1007]
本発明1001のペプチド核酸誘導体またはその薬学的に許容可能な塩の対象への投与を含む、皮膚の老化を治療するための方法。
[本発明1008]
本発明1001のペプチド核酸誘導体またはその薬学的に許容可能な塩を含む、ヒトＭＭＰ－1遺伝子転写に関連する疾患または状態を治療するための薬学的組成物。
[本発明1009]
本発明1001のペプチド核酸誘導体またはその薬学的に許容可能な塩を含む、ヒトＭＭＰ－1遺伝子転写に関連する疾患または状態を治療するための化粧品組成物。
[本発明1010]
本発明1001のペプチド核酸誘導体またはその薬学的に許容可能な塩を含む、皮膚の老化を治療するための薬学的組成物。
[本発明1011]
本発明1001のペプチド核酸誘導体またはその薬学的に許容可能な塩を含む、皮膚の老化を治療するための化粧品組成物。
【発明の効果】
【0063】
式ＩのＰＮＡ誘導体またはその薬学的に許容可能な塩を投与することにより、ヒトＭＭＰ－１遺伝子転写に関連する疾患または症状を治療することができる。
【0064】
式ＩのＰＮＡ誘導体またはその薬学的に許容可能な塩を投与することにより、皮膚の老化に関連する疾患または症状を治療することができる。
【図面の簡単な説明】
【0065】
【図1a】式Ｉのペプチド核酸誘導体のために選択し得る天然核酸塩基または非天然（修飾）核酸塩基の例である。
【図1b】式Ｉのペプチド核酸誘導体のために選択し得る天然核酸塩基または非天然（修飾）核酸塩基の例である。
【図1c】式Ｉのペプチド核酸誘導体のために選択し得る天然核酸塩基または非天然（修飾）核酸塩基の例である。
【図2a】式Ｉのペプチド核酸誘導体のために選択し得る置換基の例である。
【図2b】式Ｉのペプチド核酸誘導体のために選択し得る置換基の例である。
【図2c】式Ｉのペプチド核酸誘導体のために選択し得る置換基の例である。
【図2d】式Ｉのペプチド核酸誘導体のために選択し得る置換基の例である。
【図2e】式Ｉのペプチド核酸誘導体のために選択し得る置換基の例である。
【図3】天然または修飾核酸塩基を有するＰＮＡモノマーの化学構造である。
【図4】「ＡＳＯ １」の化学構造である。
【図5】本発明のＰＮＡ誘導体の合成に使用されたＦｍｏｃ－ＰＮＡモノマーの化学構造である。
【図6a】ＨＰＬＣ精製前の「ＡＳＯ １」のＣ１８逆相ＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図6b】ＨＰＬＣ精製後の「ＡＳＯ １」のＣ１８逆相ＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図7】Ｃ１８逆相分取ＨＰＬＣによって精製された「ＡＳＯ １」のＥＳＩ－ＴＯＦ質量スペクトルである。
【図8】「ＡＳＯ １」による、ＨＤＦにおけるＭＭＰ－１ ｍＲＮＡ形成の阻害（リアルタイムｑＰＣＲ）を示す。
【図9】aおよびbは、「ＡＳＯ １」による、ＨＤＦにおけるＭＭＰ－１タンパク質発現の阻害（ウエスタンブロットおよびタンパク質発現レベル変化のグラフ）を示す。
【図10】aおよびbは、「ＡＳＯ １」による、ＨＤＦにおけるコラーゲンタンパク質発現の増加（ウエスタンブロットおよびタンパク質発現レベル変化のグラフ）を示す。
【図11】aおよびbは、「ＡＳＯ １」による、細胞外液におけるＭＭＰ－１タンパク質発現の阻害（ウエスタンブロットおよびタンパク質発現レベル変化のグラフ）を示す。
【図12】aおよびbは、「ＡＳＯ １」による、細胞外液におけるコラーゲンタンパク質発現の増加（ウエスタンブロットおよびタンパク質発現レベル変化のグラフ）を示す。
【図13】「ＡＳＯ １」による、細胞外液におけるＭＭＰ－１タンパク質発現の阻害（ＥＬＩＳＡ）を示す。
【発明を実施するための形態】
【0066】
発明を実施するための最良の形態
ＰＮＡオリゴマーの調製のための一般的な方法
ＰＮＡオリゴマーを、軽微であるが然るべく改変した従来技術［ＵＳ６，１３３，４４４；ＷＯ９６／４０６８５］に開示された方法によってＦｍｏｃ化学に基づいた固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）によって合成した。この研究に使用された固体支持体は、ＰＣＡＳバイオマトリックスインコーポレイテッド（ＰＣＡＳ ＢｉｏＭａｔｒｉｘ Ｉｎｃ．）（カナダ、ケベック）から購入したＨ－リンクアミド－ケムマトリックス（Ｈ－Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ－ＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ）だった。修飾された核酸塩基を有するＦｍｏｃ－ＰＮＡモノマーを、従来技術［ＰＣＴ／ＫＲ２００９／００１２５６］に記載の通りにまたはこれを軽微に改変して合成した。修飾核酸塩基を有するそのようなＦｍｏｃ－ＰＮＡモノマー、および自然発生の核酸塩基を有するＦｍｏｃ－ＰＮＡモノマーを使用して、本発明のＰＮＡ誘導体を合成した。ＰＮＡオリゴマーをＣ１８逆相ＨＰＬＣ（０．１％ＴＦＡを有する水／アセトニトリルまたは水／メタノール）によって精製して、ＥＳＩ／ＴＯＦ／ＭＳを含む質量分析法によって特性決定した。
ＰＮＡオリゴマーの調製のための一般的な方法
ＰＮＡオリゴマーを、軽微であるが然るべく改変した従来技術［ＵＳ６，１３３，４４４；ＷＯ９６／４０６８５］に開示された方法によってＦｍｏｃ化学に基づいた固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）によって合成した。この研究に使用された固体支持体は、ＰＣＡＳバイオマトリックスインコーポレイテッド（ＰＣＡＳ ＢｉｏＭａｔｒｉｘ Ｉｎｃ．）（カナダ、ケベック）から購入したＨ－リンクアミド－ケムマトリックス（Ｈ－Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ－ＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ）だった。修飾された核酸塩基を有するＦｍｏｃ－ＰＮＡモノマーを、従来技術［ＰＣＴ／ＫＲ２００９／００１２５６］に記載の通りにまたはこれを軽微に改変して合成した。修飾核酸塩基を有するそのようなＦｍｏｃ－ＰＮＡモノマー、および自然発生の核酸塩基を有するＦｍｏｃ－ＰＮＡモノマーを使用して、本発明のＰＮＡ誘導体を合成した。ＰＮＡオリゴマーをＣ１８逆相ＨＰＬＣ（０．１％ＴＦＡを有する水／アセトニトリルまたは水／メタノール）によって精製して、ＥＳＩ／ＴＯＦ／ＭＳを含む質量分析法によって特性決定した。
【0067】
スキーム１は、本研究のＳＰＰＳにおいて採用された典型的なモノマー伸長サイクルを例示し、合成詳細を下記の通りに提供する。しかし、当業者にとっては、自動ペプチド合成機または手動ペプチド合成機上でそのようなＳＰＰＳ反応を有効に実行する際に、明らかに起こりうる小さな変更が多数ある。スキーム１の各反応段階を以下に簡単に提供する。
【0068】
［ＤｅＦｍｏｃ］ 樹脂を１．５ｍＬの２０％ピペリジン／ＤＭＦ中で７分間ボルテックスし、ＤｅＦｍｏｃ溶液をろ過して除去した。樹脂を１．５ｍＬのＭＣ、１．５ｍＬのＤＭＦ、１．５ｍＬのＭＣ、１．５ｍＬのＤＭＦ、および１．５ｍＬのＭＣで連続してそれぞれ３０秒間洗浄した。固体支持体上に生成された遊離アミンを、Ｆｍｏｃ－ＰＮＡモノマーとのカップリングに即時供した。
【0069】
［Ｆｍｏｃ－ＰＮＡモノマーとのカップリング］ 固体支持体上の遊離アミンを以下の通りにＦｍｏｃ－ＰＮＡモノマーとカップリングさせた。０．０４ｍｍｏｌのＰＮＡモノマー、０．０５ｍｍｏｌのＨＢＴＵ、および１０ｍｍｏｌのＤＩＥＡを１ｍＬ無水ＤＭＦ中で２分間インキュベートし、遊離アミンを有する樹脂に加えた。樹脂溶液を１時間ボルテックスし、反応媒体をろ過して除去した。次いで、樹脂を１．５ｍＬのＭＣ、１．５ｍＬのＤＭＦ、および１．５ｍＬのＭＣで連続してそれぞれ30秒間洗浄した。本発明に使用された修飾核酸塩基を有するＦｍｏｃ－ＰＮＡモノマーの化学構造を図６に提供する。図６に提供した修飾核酸塩基を有するＦｍｏｃ－ＰＮＡモノマーは、例として見なされるべきであり、よって、本発明の範囲を制限するものと見なしてはならない。当業者は、式ＩのＰＮＡ誘導体を合成するためのＦｍｏｃ－ＰＮＡモノマーにおける多数のバリエーションを容易に理解することができる。
【0070】
［キャッピング］ カップリング反応の後、反応しなかった遊離アミンを１．５ｍＬのキャッピング溶液（ＤＭＦ中の５％無水酢酸および６％２，６－ルチジン）中で５分間振盪させることによりキャッピングした。次いで、キャッピング溶液をろ過して除去し、１．５ｍＬのＭＣ、１．５ｍＬのＤＭＦ、および１．５ｍＬのＭＣで連続してそれぞれ３０秒間洗浄した。
【0071】
［Ｎ末端における「Ｆｅｔｈｏｃ－」ラジカルの導入］ 塩基性カップリング条件下で樹脂上の遊離アミンを「Ｆｅｔｈｏｃ－ＯＳｕ」と反応させることにより、「Ｆｅｔｈｏｃ－」ラジカルをＮ末端に導入した。「Ｆｅｔｈｏｃ－ＯＳｕ」［ＣＡＳ Ｎｏ．１７９３３７－６９－０、Ｃ２０Ｈ１７ＮＯ５、ＭＷ ３５１．３６]の化学構造は下記の通りに提供される。
【0072】
［樹脂からの切断］ 樹脂に結合したＰＮＡオリゴマーを、１．５ｍＬの切断溶液（トリフルオロ酢酸中の２．５％トリイソプロピルシランおよび２．５％水）中で３時間振盪させることにより、樹脂から切断した。樹脂をろ過して除去し、ろ液を減圧下で濃縮した。得られた残渣をジエチルエーテルで粉砕洗浄し、得られた沈殿物を、逆相ＨＰＬＣによる精製用にろ過して収集した。
【0073】
［ＨＰＬＣ分析および精製］ 樹脂からの切断に次いで、ＰＮＡ誘導体の粗生成物を、０．１％のＴＦＡを含有する水／アセトニトリルまたは水／メタノール（勾配方法）で溶離するＣ１８逆相ＨＰＬＣで精製した。図６ａおよび６ｂは、それぞれＨＰＬＣ精製前後の「ＡＳＯ １」についての例示的なＨＰＬＣクロマトグラムである。
【0074】
式ＩのＰＮＡ誘導体についての合成例
ヒトMMP-1プレｍＲＮＡ中の「エクソン５」の５’スプライス部位を相補的にターゲッティングするために、本発明のＰＮＡ誘導体を、上記に提供した合成方法に従いまたはこれを軽微に改変して製造した。ヒトMMP-1プレｍＲＮＡをターゲッティングするそのようなＰＮＡ誘導体の提供は、式ＩのＰＮＡ誘導体を例示するためのものであり、これを本発明の範囲を制限するものと解釈してはならない。
ヒトMMP-1プレｍＲＮＡ中の「エクソン５」の５’スプライス部位を相補的にターゲッティングするために、本発明のＰＮＡ誘導体を、上記に提供した合成方法に従いまたはこれを軽微に改変して製造した。ヒトMMP-1プレｍＲＮＡをターゲッティングするそのようなＰＮＡ誘導体の提供は、式ＩのＰＮＡ誘導体を例示するためのものであり、これを本発明の範囲を制限するものと解釈してはならない。
【0075】
（表１）ヒトMMP-1プレｍＲＮＡ中の「エクソン５」の５’スプライス部位を相補的にターゲッティングするＰＮＡ誘導体と質量分析法による構造特性決定データ
a)精密質量の理論値、b)精密質量の観測値。
【0076】
表１は、ヒトMMP-1遺伝子［ＮＣＢＩ参照配列：ＮＧ＿０１１７４０］から判読されたヒトMMP-1プレｍＲＮＡ中の「エクソン５」の５’スプライス部位を相補的にターゲッティングするＰＮＡ誘導体と、質量分析法による構造特性決定データを提供する。表１における本発明のペプチド核酸誘導体の提供は、式ＩのＰＮＡ誘導体を例示するためのものであり、これを本発明の範囲を制限するものと解釈してはならない。
【0077】
「ＡＳＯ １」は、ヒトMMP-1プレｍＲＮＡ中の「エクソン５」と「イントロン５」の接合部にわたっている３０塩基のＲＮＡ配列
内の「太字」かつ「下線」で表示した１４塩基の配列と、１４塩基の相補的重複を有する。よって、「ＡＳＯ １」はヒトMMP-1プレｍＲＮＡ内の「エクソン５」との７塩基の重複および「イントロン５」との７塩基の重複を有する。
【0078】
相補的ＤＮＡに対する「ＡＳＯ １」の結合親和性
Ｔｍ値を以下の通りにＵＶ／Ｖｉｓ分光計において測定した。１５ｍＬのポリプロピレンファルコンチューブ内の４ｍＬの水性緩衝液（ｐＨ７．１６、１０ｍＭのリン酸ナトリウム、１００ｍＭのＮａＣｌ）中の４μＭのＰＮＡオリゴマーおよび４μＭの１４塩基の相補的ＤＮＡの混合溶液を、１分間９０℃でインキュベートし、周囲温度まで徐々に冷却した。次いで、溶液を、気密式蓋が備えられた３ｍＬ石英ＵＶキュベットに移し、ＵＶ／可視分光光度計（Ａｇｉｌｅｎｔ ８４５３）において２６０ｎｍでのＴｍ測定に供した。キュベットの温度を１分当り０．５または１．０℃ずつ上げながら、２６０ｎｍでの吸光度の変化を記録した。吸光度対温度曲線から、吸光度の変化率が最も大きい温度をＰＮＡとＤＮＡとの融解温度Ｔｍ値として読み取った。Ｔｍ測定のための１４塩基の相補的ＤＮＡは、バイオニア（Ｂｉｏｎｅｅｒ）（www.bioneer.com、テジョン、大韓民国)から購入し、追加の精製をせずに使用した。
Ｔｍ値を以下の通りにＵＶ／Ｖｉｓ分光計において測定した。１５ｍＬのポリプロピレンファルコンチューブ内の４ｍＬの水性緩衝液（ｐＨ７．１６、１０ｍＭのリン酸ナトリウム、１００ｍＭのＮａＣｌ）中の４μＭのＰＮＡオリゴマーおよび４μＭの１４塩基の相補的ＤＮＡの混合溶液を、１分間９０℃でインキュベートし、周囲温度まで徐々に冷却した。次いで、溶液を、気密式蓋が備えられた３ｍＬ石英ＵＶキュベットに移し、ＵＶ／可視分光光度計（Ａｇｉｌｅｎｔ ８４５３）において２６０ｎｍでのＴｍ測定に供した。キュベットの温度を１分当り０．５または１．０℃ずつ上げながら、２６０ｎｍでの吸光度の変化を記録した。吸光度対温度曲線から、吸光度の変化率が最も大きい温度をＰＮＡとＤＮＡとの融解温度Ｔｍ値として読み取った。Ｔｍ測定のための１４塩基の相補的ＤＮＡは、バイオニア（Ｂｉｏｎｅｅｒ）（www.bioneer.com、テジョン、大韓民国)から購入し、追加の精製をせずに使用した。
【0079】
「ＡＳＯ １」は、１４塩基の相補的ＤＮＡとの二本鎖について７２．６７℃のＴｍ値を示した。
【実施例】
【0080】
式ＩのＰＮＡ誘導体の生物学的活性についての実施例
リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ ｑＰＣＲ）等を利用して、本発明のＰＮＡ誘導体のヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）におけるｉｎ ｖｉｔｒｏのＭＭＰ－１アンチセンス活性を評価した。この生物学的実施例は、式ＩのＰＮＡ誘導体の生物学的プロファイルを例示するための一例として示されるものであり、本発明の範囲を限定するものと解釈してはならない。
リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ ｑＰＣＲ）等を利用して、本発明のＰＮＡ誘導体のヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）におけるｉｎ ｖｉｔｒｏのＭＭＰ－１アンチセンス活性を評価した。この生物学的実施例は、式ＩのＰＮＡ誘導体の生物学的プロファイルを例示するための一例として示されるものであり、本発明の範囲を限定するものと解釈してはならない。
【0081】
実施例１．「ＡＳＯ １」による、ＨＤＦにおけるＭＭＰ－１ ｍＲＮＡ形成の阻害
以下に記載するとおり、「ＡＳＯ １」について、ＨＤＦにおけるＭＭＰ－１ ｍＲＮＡ形成をダウンレギュレートする能力をウエスタンブロッティングにより評価した。
以下に記載するとおり、「ＡＳＯ １」について、ＨＤＦにおけるＭＭＰ－１ ｍＲＮＡ形成をダウンレギュレートする能力をウエスタンブロッティングにより評価した。
【0082】
［細胞培養およびＡＳＯ処理］ ＨＤＦ細胞を、Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｋｉｔ－ｌｏｗ ｓｅｒｕｍ（ＡＴＣＣ ＰＣＳ－２０１－０４１）と１％ストレプトマイシン／ペニシリンを添加したＦｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＡＴＣＣ ＰＣＳ－２０１－０３０）中に維持し、３７℃、５％ ＣＯ２の条件下で増殖させた。６０ｍｍ培養皿中で２４時間安定化させたＨＤＦ細胞（３×１０５個）を、０（陰性対照）および１００ａＭ～１μＭの「ＡＳＯ １」と共に２４時間インキュベートした。
【0083】
［ＲＮＡ抽出およびｃＤＮＡ合成］ ＡＳＯで処理した細胞から、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｃａｔ．Ｎｏ．７１４１０６）を使用して製造業者の使用説明書に従い、全ＲＮＡを抽出し、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（商標）１ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ、Ｃａｔ．Ｎｏ．６１１０Ａ）を使用して４００ｎｇのＲＮＡからｃＤＮＡを調製した。ＰＣＲチューブ内の４００ｎｇのＲＮＡ、１μｌのランダムヘキサマー、および１μｌのｄＮＴＰ（１０ｍＭ）の混合物に、ＤＥＰＣ処理水を総量が１０μｌになるように加え、６５℃で５分間反応させた。反応混合物に１０μｌのＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴアーゼを添加し、３０℃で１０分間反応させた後、続いて４２℃で６０分間反応させることにより、ｃＤＮＡを合成した。
【0084】
［定量的リアルタイムＰＣＲ］ ヒトＭＭＰ－１ ｍＲＮＡの発現レベルを評価するために、Ｔａｑｍａｎプローブを利用して、合成されたｃＤＮＡでリアルタイムｑＰＣＲを行った。ＰＣＲチューブ内のｃＤＮＡ、Ｔａｑｍａｎプローブ、ＩＱ ｓｕｐｅｒｍｉｘ（ＢｉｏＲａｄ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１７０－８８６２）、およびヌクレアーゼフリー水の混合液を、ＣＦＸ９６ Ｔｏｕｃｈ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ｓｙｓｔｅｍ（ＢｉｏＲａｄ）を利用して以下のとおり特定されるサイクル条件に従い、反応させた：９５℃で３分間（初期変性）の後、９５℃で１０秒間（変性）、６０℃で３０秒間（アニーリング）、および７２℃で３０秒間（重合）の５０サイクル。１サイクル終了する毎に蛍光強度を測定し、ＰＣＲ結果を溶融曲線によって評価した。各遺伝子のしきい値サイクル数（Ｃｔ）をＧＡＰＤＨのＣｔで標準化した後、Ｃｔの変化を比較して分析した。
【0085】
［ＡＳＯによるＭＭＰ－１ ｍＲＮＡの減少］ 図８に示されるように、対照実験と比較して、減少したＭＭＰ－１ ｍＲＮＡの量は、それぞれ、「ＡＳＯ １」の１μＭ処理では６５％、「ＡＳＯ １」の１００ａＭ～１０ｎＭ処理では１０～１５％であった。
【0086】
実施例２．「ＡＳＯ １」による、ＨＤＦにおけるＭＭＰ－１タンパク質発現の阻害
以下に記載するとおり、「ＡＳＯ １」について、ＨＤＦにおけるＭＭＰ－１タンパク質をダウンレギュレートする能力をウエスタンブロッティングにより評価した。
以下に記載するとおり、「ＡＳＯ １」について、ＨＤＦにおけるＭＭＰ－１タンパク質をダウンレギュレートする能力をウエスタンブロッティングにより評価した。
【0087】
［ウエスタンブロッティング］ 実施例１と同様にＨＤＦ細胞を増殖させ、４８時間後、細胞を低温ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）で２回洗浄し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ ＮＰ－４０、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、および０．１％ ＳＤＳ、プロテアーゼ阻害剤中に溶解した。タンパク質は、ＢＣＡ溶液（Ｔｈｅｒｍｏ、Ｃａｔ．Ｎｏ．２３２２５）を用いて定量し、８％ ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルによって精製した。タンパク質をＰＶＤＦメンブレン（ポリビニリデンフルオライドメンブレン）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＩＰＶＨ０００１０）に移した後、スキムミルク緩衝液で１時間ブロッキングした。メンブレンを、１次抗体としての抗ＭＭＰ－１（ＳａｎｔａＣｒｕｚ、Ｃａｔ．Ｎｏ．５８３７７）および抗β－アクチン（Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ３８５４）でプローブし、２次抗体としてヤギ抗マウス（ＣＳＴ、Ｃａｔ．Ｎｏ．７０７６Ｖ）を使用した。化学発光シグナルを検出するためにＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（商標）Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ（ＰｉｅｒＡｃｅ、ＵＳＡ）を利用し、Ｇｅｌ Ｄｏｃシステム（ＡＴＴＯ）を使用することによりシグナル強度を測定した。各バンドのウエスタンブロッティングの結果を基に、ＭＭＰ－１の相対的な発現レベルをＩｍａｇｅ－Ｊプログラムで定量した。
【0088】
［ＡＳＯによる、ＭＭＰ－１タンパク質発現の阻害］ 図９ａおよび９ｂに示されるとおり、減少したＭＭＰ－１タンパク質発現レベルの量は、対照実験と比較して、「ＡＳＯ １」の１００ａＭ～１μＭ処理で２０～５０％であった。よって、「ＡＳＯ １」は、ＨＤＦにおいてＭＭＰ－１タンパク質発現をダウンレギュレートする能力を示すことが証明された。
【0089】
実施例３．「ＡＳＯ １」による、ＨＤＦにおけるコラーゲンタンパク質発現の増加
以下に記載するとおり、「ＡＳＯ １」について、ＭＭＰ－１タンパク質発現減少に関連してＨＤＦにおいてＩ型コラーゲンタンパク質発現をアップレギュレートする能力をウエスタンブロッティングにより評価した。
以下に記載するとおり、「ＡＳＯ １」について、ＭＭＰ－１タンパク質発現減少に関連してＨＤＦにおいてＩ型コラーゲンタンパク質発現をアップレギュレートする能力をウエスタンブロッティングにより評価した。
【0090】
［ウエスタンブロッティング］ 実施例１と同様にＨＤＦ細胞を増殖させ、４８時間後、細胞を低温ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）で２回洗浄し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ ＮＰ－４０、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、および０．１％ ＳＤＳ、プロテアーゼ阻害剤中に溶解した。タンパク質は、ＢＣＡ溶液（Ｔｈｅｒｍｏ、Ｃａｔ．Ｎｏ．２３２２５）を用いて定量し、８％ ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルによって精製した。タンパク質をＰＶＤＦメンブレン（ポリビニリデンフルオライドメンブレン）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＩＰＶＨ０００１０）に移した後、スキムミルク緩衝液で１時間ブロッキングした。メンブレンを、１次抗体としての抗ＭＭＰ－１（ＳａｎｔａＣｒｕｚ、Ｃａｔ．Ｎｏ．５８３７７）および抗β－アクチン（Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ３８５４）でプローブし、２次抗体としてウサギ抗ヤギ（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ、Ｃａｔ．Ｎｏ．２７６８）を使用した。化学発光シグナルを検出するためにＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（商標）Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ（ＰｉｅｒＡｃｅ、ＵＳＡ）を利用し、Ｇｅｌ Ｄｏｃシステム（ＡＴＴＯ）を使用することによりシグナル強度を測定した。各バンドのウエスタンブロッティングの結果を基に、ＭＭＰ－１の相対的な発現レベルをＩｍａｇｅ－Ｊプログラムで定量した。
【0091】
［ＡＳＯによる、Ｉ型コラーゲンタンパク質発現の増加］ 図１０ａおよび１０ｂに示されるとおり、増加したＩ型コラーゲンタンパク質発現レベルの量は、対照実験と比較して、「ＡＳＯ １」の１００ａＭ～１μＭ処理で３０％より多かった。よって、「ＡＳＯ １」によるＭＭＰ－１タンパク質発現の減少により、ＨＤＦにおいてＩ型コラーゲンタンパク質発現をアップレギュレートする能力を示すことが証明された。
【0092】
実施例４．「ＡＳＯ １」による、細胞外液におけるＭＭＰ－１タンパク質発現の阻害（ウエスタンブロッティング）
細胞において「ＡＳＯ １」によって誘導されるＭＭＰ－１タンパク質発現の減少は、結果的に細胞外に分泌されるＭＭＰ－１タンパク質の発現レベルに影響を及ぼし得る。その意味で以下に記載するとおり、「ＡＳＯ １」について、「ＡＳＯ－１」処理の４８時間後の細胞の培養液におけるＭＭＰ－１タンパク質発現をダウンレギュレートする能力をウエスタンブロッティングにより評価した。
細胞において「ＡＳＯ １」によって誘導されるＭＭＰ－１タンパク質発現の減少は、結果的に細胞外に分泌されるＭＭＰ－１タンパク質の発現レベルに影響を及ぼし得る。その意味で以下に記載するとおり、「ＡＳＯ １」について、「ＡＳＯ－１」処理の４８時間後の細胞の培養液におけるＭＭＰ－１タンパク質発現をダウンレギュレートする能力をウエスタンブロッティングにより評価した。
【0093】
［ウエスタンブロッティング］ 実施例１と同様にＨＤＦ細胞を増殖させ、４８時間後、回収した細胞培養液を８％ ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルによって精製した。分離されたタンパク質をＰＶＤＦメンブレン（ポリビニリデンフルオライドメンブレン）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＩＰＶＨ０００１０）に移した後、スキムミルク緩衝液で１時間ブロッキングした。メンブレンを、１次抗体としての抗ＭＭＰ－１（ＳａｎｔａＣｒｕｚ、Ｃａｔ．Ｎｏ．５８３７７）でプローブし、２次抗体としてヤギ抗マウス（ＣＳＴ、Ｃａｔ．Ｎｏ．７０７６Ｖ）を使用した。化学発光シグナルを検出するためにＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（商標）Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ（ＰｉｅｒＡｃｅ、ＵＳＡ）を利用し、Ｇｅｌ Ｄｏｃシステム（ＡＴＴＯ）を使用することによりシグナル強度を測定した。各バンドのウエスタンブロッティングの結果を基に、ＭＭＰ－１の相対的な発現レベルをＩｍａｇｅ－Ｊプログラムで定量した。
【0094】
［ＡＳＯによるＭＭＰ－１タンパク質発現の阻害］ 図１１ａおよび１１ｂに示されるとおり、細胞外液における減少したＭＭＰ－１タンパク質発現レベルの量は、対照実験と比較して、「ＡＳＯ １」の１００ｐＭ～１μＭ処理で１０～６０％であった。よって、「ＡＳＯ－１」は、細胞外液におけるＭＭＰ－１タンパク質発現をダウンレギュレートする能力を示すことが証明された。
【0095】
実施例５．「ＡＳＯ １」による、細胞外液におけるコラーゲンタンパク質発現の増加
「ＡＳＯ １」について、細胞外液におけるＩ型コラーゲンタンパク質発現をアップレギュレートする能力をウエスタンブロッティングにより評価した。
「ＡＳＯ １」について、細胞外液におけるＩ型コラーゲンタンパク質発現をアップレギュレートする能力をウエスタンブロッティングにより評価した。
【0096】
［ウエスタンブロッティング］ 実施例１と同様にＨＤＦ細胞を増殖させ、４８時間後、回収した細胞培養液を８％ ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルによって精製した。分離されたタンパク質をＰＶＤＦメンブレン（ポリビニリデンフルオライドメンブレン）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＩＰＶＨ０００１０）に移した後、スキムミルク緩衝液で１時間ブロッキングした。メンブレンを、１次抗体としての抗ＭＭＰ－１（ＳａｎｔａＣｒｕｚ、Ｃａｔ．Ｎｏ．５８３７７）でプローブし、ウサギ抗ヤギ（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ，Ｃａｔ．Ｎｏ．２７６８）を２次抗体として使用した。化学発光シグナルを検出するためにＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（商標）Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ（ＰｉｅｒＡｃｅ、ＵＳＡ）を利用し、Ｇｅｌ Ｄｏｃシステム（ＡＴＴＯ）を使用することによりシグナル強度を測定した。各バンドのウエスタンブロッティングの結果を基に、ＭＭＰ－１の相対的な発現レベルをＩｍａｇｅ－Ｊプログラムで定量した。
【0097】
［ＡＳＯによるＩ型コラーゲンタンパク質発現の増加］ 図１２ａおよび１２Ｂに示されるとおり、増加したＩ型コラーゲンタンパク質発現レベルの量は、対照実験と比較して、それぞれ、「ＡＳＯ １」の１ｐＭ処理で２０％、１μＭ処理で８０％であった。よって、ＨＤＦにおいて「ＡＳＯ １」によって誘導されたＭＭＰ－１タンパク質発現の減少により、細胞外液におけるＩ型コラーゲンタンパク質発現をアップレギュレートする能力を示すことが証明された。
【0098】
実施例６．「ＡＳＯ １」による、細胞外液におけるＭＭＰ－１タンパク質発現の阻害（ＥＬＩＳＡ）
細胞において「ＡＳＯ １」によって誘導されるＭＭＰ－１タンパク質発現の減少は、結果的に細胞外に分泌されるＭＭＰ－１タンパク質の発現レベルに影響を及ぼし得る。その意味で、以下に記載するとおり、「ＡＳＯ １」について、「ＡＳＯ－１」処理の４８時間後の細胞の培養液におけるＭＭＰ－１タンパク質発現をダウンレギュレートする能力を酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）により評価した。
細胞において「ＡＳＯ １」によって誘導されるＭＭＰ－１タンパク質発現の減少は、結果的に細胞外に分泌されるＭＭＰ－１タンパク質の発現レベルに影響を及ぼし得る。その意味で、以下に記載するとおり、「ＡＳＯ １」について、「ＡＳＯ－１」処理の４８時間後の細胞の培養液におけるＭＭＰ－１タンパク質発現をダウンレギュレートする能力を酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）により評価した。
【0099】
［ＥＬＩＳＡ］ 実施例１と同様にＨＤＦ細胞を増殖させ、４８時間後、回収した細胞培養液におけるＭＭＰ－１発現レベルを、ヒトＭＭＰ－１ ＥＬＩＳＡキット（ａｂｃａｍ、Ｃａｔ．Ｎｏ．ａｂ１００６０３）を用いて製造業者の使用説明書に従って、吸光度により評価した。
【0100】
［ＡＳＯによるＭＭＰ－１タンパク質発現の阻害］ 図１３に示されるとおり、減少したＭＭＰ－１タンパク質発現レベルの量は、対照実験と比較して、それぞれ、「ＡＳＯ－１」の１００ｐＭ～１０ｎＭ処理で１５～３０％、１μＭ処理で５０％であった。よって、「ＡＳＯ－１」は、細胞外液におけるＭＭＰ－１タンパク質発現をダウンレギュレートする能力を示すことが証明された。
【0101】
実施例７．式Ｉの化合物を含有する局所用セラムの調製（ｗ／ｗ％）
式Ｉの化合物、例えば「ＡＳＯ－１」を、対象に局所適用するためのセラムとして製剤化した。局所用セラムは以下に記載するとおり調製した。多くのバリエーションの局所用セラムが存在し得ることを考慮すると、この調製物は一例として見なされるべきものであり、本発明の範囲を制限するものと解釈されてはならない。
式Ｉの化合物、例えば「ＡＳＯ－１」を、対象に局所適用するためのセラムとして製剤化した。局所用セラムは以下に記載するとおり調製した。多くのバリエーションの局所用セラムが存在し得ることを考慮すると、この調製物は一例として見なされるべきものであり、本発明の範囲を制限するものと解釈されてはならない。
【0102】
パートＡとパートＢの混合物質を２５℃で、それぞれ別のビーカー中で溶解した。パートＡとパートＢを混合して、３，６００ｒｐｍホモジナイザーを２５℃で５分間使用することにより乳化した。乳化したパートＣを５０メッシュでろ過し、ろ液をパートＡとパートＢの混合物に加えた。得られた混合物を、３，６００ｒｐｍホモジナイザーを８０℃で５分間使用することにより乳化した。パートＤをパートＡ、Ｂ、およびＣの混合物に加えた後、得られた混合物を、２，５００ｒｐｍホモジナイザーを２５℃で３分間使用することにより乳化した。最後に均一分散と完全脱泡を確認する。
【0103】
実施例８．式Ｉの化合物を含有する局所用クリームの調製（ｗ／ｗ％）
式Ｉの化合物、例えば「ＡＳＯ １」を、対象に局所適用するためのクリームとして製剤化した。局所用クリームは以下に記載するとおり調製した。多くのバリエーションの局所用クリームが存在し得ることを考慮すると、この調製物は一例として見なされるべきものであり、本発明の範囲を制限するものと解釈されてはならない。
式Ｉの化合物、例えば「ＡＳＯ １」を、対象に局所適用するためのクリームとして製剤化した。局所用クリームは以下に記載するとおり調製した。多くのバリエーションの局所用クリームが存在し得ることを考慮すると、この調製物は一例として見なされるべきものであり、本発明の範囲を制限するものと解釈されてはならない。
【0104】
パートＡの物質を８０℃で、パートＢの物質を８５℃で、それぞれ別のビーカー中で溶解した。パートＡとパートＢを混合して、３，６００ｒｐｍホモジナイザーを８０℃で５分間使用することにより乳化した。パートＣとパートＤを、パートＡとパートＢの混合物に加えた後、得られた混合物を、３，６００ｒｐｍホモジナイザーを８０℃で５分間使用することにより乳化した。パートＥをパートＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤの混合物に３５℃で加えた後、得られた混合物を、３，６００ｒｐｍホモジナイザーを３５℃で３分間使用することにより乳化した。最後に２５℃での均一分散と完全脱泡を確認する。
【図1a】
【図1b】
【図1c】
【図2a】
【図2b】
【図2c】
【図2d】
【図2e】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6a】
【図6b】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【配列表】