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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B1)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-01-19
(45)【発行日】2024-01-29
(54)【発明の名称】バイオフィルムを破壊するための溶液及びその製造方法
(51)【国際特許分類】
C12N 1/00 20060101AFI20240122BHJP
C12N 1/20 20060101ALI20240122BHJP
A01N 59/02 20060101ALI20240122BHJP
A01P 1/00 20060101ALI20240122BHJP
【ＦＩ】
C12N1/00 Z
C12N1/20 Z
A01N59/02 Z
A01P1/00
【請求項の数】
3
(21)【出願番号】P 2023519523
(86)(22)【出願日】2022-12-02
(86)【国際出願番号】 JP2022044506
【審査請求日】2023-03-28
(31)【優先権主張番号】P 2022084640
(32)【優先日】2022-05-24
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【早期審査対象出願】
(73)【特許権者】
【識別番号】502191491
【氏名又は名称】株式会社オクト
(73)【特許権者】
【識別番号】508213001
【氏名又は名称】株式会社ミセラ
(74)【代理人】
【識別番号】100199369
【弁理士】
【氏名又は名称】玉井 尚之
(72)【発明者】
【氏名】田中 好郎
(72)【発明者】
【氏名】三浦 頡剛
【審査官】藤澤 雅樹
(56)【参考文献】
【文献】特開２０１４－１００７００（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２００８／０６５７３４（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２０１７－５００４０９（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１６－０１３５２０（ＪＰ，Ａ）
【文献】特許第６９６６８１８（ＪＰ，Ｂ２）
【文献】特開２０２１－１６５２８４（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １／００
Ａ０１Ｎ ５９／００
Ａ０１Ｐ １／００
Ａ６１Ｋ ３３／００
Ａ６１Ｐ ３１／００
Ａ０１Ｎ ４１／００
Ｃ０１Ｂ ４／００
Ｃ０１Ｂ １７／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
水（Ｈ２Ｏ）と重水素硫酸（Ｄ２ＳＯ４）からなり、ｐＨが０．５以上４．０以下の、バイオフィルムを破壊するための溶液。
【請求項2】
水（Ｈ２Ｏ）を用いて重水素硫酸（Ｄ２ＳＯ４）を希釈して、水（Ｈ２Ｏ）と重水素硫酸（Ｄ２ＳＯ４）からなり、ｐＨが０．５以上４．０以下の、バイオフィルムを破壊する
ための溶液を製造する方法。
【請求項3】
請求項１のバイオフィルムを破壊するための溶液を用いて、バイオフィルムを破壊する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
この発明は、バイオフィルムを破壊するための溶液及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【0002】
バイオフィルムは、基質に付着した細菌等が細胞外多糖類（ＥＰＳ，ｅｘｔｒａｃｅｌｌａｒ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）を分泌してできる細菌を取り囲む膜である。ＥＰＳは、細菌を守るバリヤーの役割、細菌が栄養分等を取り込む運搬経路の役割を果たし、環境変化や化学物質からバイオフィルム内部の細菌等を守る役割を果たしている。
【0003】
その高次構造体のマトリックスであるバイオフィルム内には、閉じこめられた細菌等のミクロコロニーが点在している。そのコロニーには、細菌をはじめ、真菌、藻類、原生動物など多種多様な微生物が存在しうる。バイオフィルム内の菌等の数が一定以上になると、バイオフィルム内の細菌等は、バイオフィルムから放出されて、さらに別の部位でバイオフィルムは広がっていき、汚染、感染は広がっていく。
【0004】
バイオフィルムは池とか川といった自然界の中や，建造物の排管の中といった環境中にも認められる。そして病院環境も例外ではない。バイオフィルムは環境以外の、人体の中でも形成され、特に医療の分野では慢性の難治性の感染症として関与し、医療上大きな問題となってきている
【0005】
細菌等によるバイオフィルムの形成によって、薬剤の効果の大幅な低下のみならず、細菌等自体が薬剤に耐える力を獲得することもある。この耐薬剤性を獲得するメカニズムは、バイオフィルムが形成されることによって、物理的に抗菌薬がバイオフィルム内に浸透しにくくなること、マトリックスと抗菌薬が結合し、薬剤の効力が低下することが考えられている。また、バイオフィルム内の深層部が低栄養、低酸素状態になることで細菌等自体が休眠状態になってしまうことなどが挙げられている。
【0006】
例えば、バイオフィルムを形成した緑膿菌では、抗生物質に対する耐性が浮遊細胞に比べて数百倍も上昇し、薬剤治療を困難にしている。また、歯科分野では、歯周ポケットに細菌がバイオフィルムを産出して、治療困難な歯周病の原因ともなっている。
【0007】
バイオフィルムの形成を阻害する薬剤の開発は進められてきた。バイオフィルムが一度形成されると、感染症等の治療が困難になることから、形成されたバイオフィルムを破壊する薬剤も開発されている。特許文献１に記載の発明は、アクネ菌が産出するバイオフィルムを破壊することを目的とし、イソプロピルメチルフェノール、サリチル酸、グリチルリチン酸、イブプロフェンピコノール、スルファジアジン及びそれらの塩、エタノール、レゾルシン、イオウ、及び過酸化ベンゾイルからなる群から選ばれた少なくとも１種のアクネ菌バイオフィルム破壊成分とするものである。
特許文献２に記載の発明は、嚢胞性線維症患者におけるバイオフィルムの破壊方法に関するもので、単離されたかまたは組換え型の組込み宿主因子（ＩＨＦ）ポリペプチド、またはそのそれぞれの断片もしくは等価物を用いている。
特許文献２に記載の発明は、嚢胞性線維症患者におけるバイオフィルムの破壊方法に関するもので、単離されたかまたは組換え型の組込み宿主因子（ＩＨＦ）ポリペプチド、またはそのそれぞれの断片もしくは等価物を用いている。
【0008】
これらのバイオフィルム破壊のための薬剤は、特定の細菌等によって産出されるバイオフィルムの特性を考慮して発明されたものである。特許文献３に記載のバイオフィルムを破壊するための薬剤は、口臭抑制のためのもので、炭酸水素ナトリウムと次亜塩素酸を必須成分とするものである。この薬剤は、バイオフィルムの表層に存在するウォーターチャンネルという細菌等の栄養源である血液成分が通過できる分子量の比較的小さな無機材料（分子量２００以内）の薬剤を用いることに特徴を有している。また、細菌等が多量に存在するバイオフィルムの中心部にはさらに小さなナノチャンネルという穴があり、分子量１００以下の超低分子量の消毒剤等しか通過できないとされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0009】
【文献】特開２０２１－１６５２８４号公報
【文献】特開２０２０－０３７５９５号公報
【文献】国際公開ＷＯ２０１０／００４６９９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
バイオフィルムは、多糖、たんぱく質、核酸、脂質など多種多様な成分から構成されており、バイオフィルムが産出される各成分の量や生化学的性質は、菌種や菌株によって異なってくる。上記特許文献１及び２は、各細菌等の特性やバイオフィルムの特性に応じてバイオフィルムを破壊することを特徴としているので、バイオフィルム全般に適用できないという問題がある。上記特許文献３は、バイオフィルムが一般的に有するウォーターチャンネルやナノチャンネルを通過して薬剤を送り込むという技術思想ではあるが、特許文献３の記載によると、次亜塩素酸を主成分とする液は、塩素濃度を数百ｐｐｍ程度にまで濃縮したものが必要であるため、使用後は直ちに洗い流さなければならない。
この発明の目的は、人体にやさしく、バイオフィルムを効果的に破壊する溶液とその製造方法を提供することである。
この発明の目的は、人体にやさしく、バイオフィルムを効果的に破壊する溶液とその製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0011】
本発明（１）は、水（Ｈ２Ｏ）と重水素硫酸（Ｄ２ＳＯ４）からなり、ｐＨが０．５以上４．０以下の、バイオフィルムを破壊するための溶液である。
【0012】
発明者らは、バイオフィルムの構造的特徴を研究し、バイオフィルム自体を効率的に破壊し、しかも人体にやさしい本発明の溶液を取得することに成功した。バイオフィルムである細胞外高分子物質（細胞外多糖類（ＥＰＳ））は、多糖類とタンパク質から成り、そのほか、ＤＮＡや脂質や腐植物質といった巨大分子も含んでいる。菌体外多糖は一般に、単糖類と非炭水化物の置換基で構成されている。
【0013】
重水素硫酸（Ｄ２ＳＯ４）を水（Ｈ２Ｏ）で希釈し、ｐＨを０．５以上２．０以下に調製された溶液は高い酸性の溶液であり、細胞外多糖類（ＥＰＳ）を酸化し、バイオフィルムのウォーターチャンネルやナノチャンネルを容易に通って内部の細胞外多糖類を分解する機能を有する。また、水素イオン濃度を高めて低ｐＨとする成分を重水素硫酸（Ｄ２ＳＯ４）とすることによって、人体にやさしく、バイオフィルムを効果的に破壊する溶液とすることができる。
【0014】
希釈されたｐＨの上限は、４．０以下が好ましく、３．０以下、２．０以下、１．９以下、１．８以下、１．７以下、１．６以下、１．５以下、１．４以下、１．３以下、１．２以下、１．１以下が順番により好ましい。本願のバイオフィルムを破壊する溶液は、ｐＨが小さければ小さいほど細胞外多糖類（ＥＰＳ）を分解する効能をより高く有するためである。ｐＨの下限は、０．５以上であれば有効にバイオフィルムを分解できるので好ましい。ｐＨの下限は、細胞に対する影響を考慮して、０．６以上、０．７以上、０．８以上、０．９以上、１．０以上が順番により好ましい。
【0015】
バイオフィルムの成分である多糖類は、グルコース等の単糖がいくつも連なった物質であり、この多糖類は、低ｐＨの溶液により酸化水分解というメカニズムで分解されうる。特に、ｐＨが２以下であれば多糖類は、その分解が効率的に行われる。また、重水素硫酸（Ｄ２ＳＯ４）とすることによって、細胞組織への副作用（ダメージ）が低減される。
【0016】
本発明（２）は、水（Ｈ２Ｏ）を用いて重水素硫酸（Ｄ２ＳＯ４）を希釈して、水（Ｈ２Ｏ）と重水素硫酸（Ｄ２ＳＯ４）からなり、ｐＨが０．５以上４．０以下のバイオフィルムを破壊するための溶液の製造方法である。
【0017】
本発明（２）のバイオフィルムを破壊するための溶液の製造方法は、水（Ｈ２Ｏ）を用いて重水素硫酸（Ｄ２ＳＯ４）のｐＨが０．５以上４．０以下となるように希釈調製するだけなので、製造方法が簡便である。
【発明の効果】
【0018】
本発明によれば、人体にやさしく、バイオフィルムを効果的に破壊する溶液とその製造方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0019】
【図1】バイオフィルム破壊液のｐＨを変化させて多糖類を分解する傾向を示す。
【図2】ハイビスカスの葉を用いた副作用の試験結果を示す。
【図3】ミュータンス菌を用いた実験１～３の写真を示す。
【図4】ミュータンス菌を用いた実験１の結果を示す。
【図5】ミュータンス菌を用いた実験２の結果を示す。
【図6】ミュータンス菌を用いた実験３の結果を示す。
【図7】Ｆｎ菌を用いた実験４の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【0020】
以下、図及び表を参照して、本発明の最良の実施形態を説明する。
本発明の殺菌用溶液は、水（Ｈ２Ｏ）を用いて重水素硫酸（Ｄ２ＳＯ４）のｐＨを調製して作られたものである。重水素硫酸（Ｄ２ＳＯ４）は、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．製のものを用いた。水（Ｈ２Ｏ）は、水道水を用いた。本発明のバイオフィルムを破壊するための溶液は、これら２つの物質から構成されるものであるが、ｐＨ値に影響を与えない、若しくは影響が少ない微量成分を添加してもよい。ｐＨの測定は、堀場製作所製のモデルＭＥＴＲＯ－５１を用いた。
本発明の殺菌用溶液は、水（Ｈ２Ｏ）を用いて重水素硫酸（Ｄ２ＳＯ４）のｐＨを調製して作られたものである。重水素硫酸（Ｄ２ＳＯ４）は、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．製のものを用いた。水（Ｈ２Ｏ）は、水道水を用いた。本発明のバイオフィルムを破壊するための溶液は、これら２つの物質から構成されるものであるが、ｐＨ値に影響を与えない、若しくは影響が少ない微量成分を添加してもよい。ｐＨの測定は、堀場製作所製のモデルＭＥＴＲＯ－５１を用いた。
【0021】
（ｐＨを変化させて多糖類を分解する実験）
実際の細胞外多糖類（ＥＰＳ）の代わりの多糖類として、水あめと植物性ゼリーを用いて、多糖類が本発明によってどのように分解されるのかを調べるための予備試験を行った。水あめは、加藤産業株式会社製のもの（商品名「Ｋａｎｐｙ 水あめ」）を用い、植物性ゼリーは、ＣＯＯＰ製（製造者：伊那食品工業株式会社）のもの（商品名「コープアガー」）を用いた。
実際の細胞外多糖類（ＥＰＳ）の代わりの多糖類として、水あめと植物性ゼリーを用いて、多糖類が本発明によってどのように分解されるのかを調べるための予備試験を行った。水あめは、加藤産業株式会社製のもの（商品名「Ｋａｎｐｙ 水あめ」）を用い、植物性ゼリーは、ＣＯＯＰ製（製造者：伊那食品工業株式会社）のもの（商品名「コープアガー」）を用いた。
【0022】
水あめは、デンプンを酸や糖化酵素で糖化して作られた粘液状の甘味料であり、ブドウ糖、麦芽糖、デキストリンなどの混合物で、主成分は麦芽糖である。コープアガーは、寒天を主原料とする植物性ゼリーの素である。コープアガーの原材料は、ブドウ糖、寒天、こんにゃく粉、増粘剤（ローカストビーンガム、キサンタンガム）、乳酸カルシュウムである。両原料共に基本原料は、多糖類である。
【0023】
水あめとコープアガーとを混合した試験品に、各種ｐＨ値に調製されたバイオフィルム破壊液等を加え、その混合液の粘度を測定した。粘度の測定は、リオン株式会社製の「ビスコテスタ（高粘度タイプ）ＶＴ－０６」を用いた。
【0024】
まず、水あめとコープアガーとを３４：５の比率で、ビーカー内で混合し、その粘度を、ビスコテスタ（高粘度タイプ）ＶＴ－０６で測定したところ、粘度は４６０ｄＰａ・Ｓであった。試験に供する水あめとコープアガーとの混合物（被試験体）重量を１５０ｇとして秤量して準備した。水（Ｈ２Ｏ）を用いて重水素硫酸（Ｄ２ＳＯ４）のｐＨを調製して準備した試験液のｐＨは、ｐＨ＝０．５、２．０、３．０、４．０、５．０、６．０であった。加えて、重水素硫酸（Ｄ２ＳＯ４）を加えていない水道水のままのｐＨ＝７．０の試験液も準備した。被試験体１５０ｇに試験液４ｃｃを加えて、ビスコテスタ（高粘度タイプ）ＶＴ－０６で測定したところ、下記表１の結果となった。試験を行ったときの室温は２５度Ｃ、湿度は６３％であった。
【0025】
【表1】
【0026】
図１は、表１の測定結果を折れ線グラフにしたものである。このグラフを見ると、ｐＨ６からｐＨが下がるにつれて粘度も下がっているのがわかる。この試験結果により、低ｐＨの溶液によって多糖類が酸化水分解されていることを明確に示している。ｐＨ＝０．５の場合は、ｐＨ＝７．０の場合に比べて、多糖類が分解されて、粘度が１／３近くにまで減少している。
【0027】
図２は、本バイオフィルム破壊液の安全性を調べた実験結果を示す。１枚のハイビスカスの葉を中央の葉脈を境にして左右に分割し、一方の葉表面にｐＨ＝０．５に調製した硫酸（Ｈ２ＳＯ４）を用いて濡らし、他方にｐＨ＝０．５に調製した重水素硫酸（Ｄ２ＳＯ４）を用いて濡らし、２０時間経過後を観察した。図２（Ａ）は、硫酸（Ｈ２ＳＯ４）を用いて濡らして２０時間経過後の葉表面の状態を示している。点線で囲んだ白く斑点状になっている部分は葉の細胞が死んでいる部分である。図２（Ｂ）は、重水素硫酸（Ｄ２ＳＯ４）を用いて濡らして２０時間経過後の葉表面の状態を示している。図２（Ａ）と比べて、点線で囲んだ白く斑点状になっている部分が大幅に少なく、本バイオフィルム破壊液の安全性が高いことを示している。
【0028】
図３～図６は、実際にストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）菌株を用いた実験結果を示している。ストレプトコッカス・ミュータンス菌は、通性嫌気性菌であり、グラム陽性の連鎖球菌である。不溶性、粘着性のあるグルカンを産出し歯の表面に粘着する。主に歯のう蝕の原因となる菌の一つである。培地は、ＴＨＢ（ＴＯＤＤ－ＨＥＷＩＴＴ ＢＲＯＴＨ）に２％（ｗ／ｖ）スクロースを添加したものを用いた。スクロースは、単糖であるグルコース（ブドウ糖）とフルクトース（果糖）がα－１，２－グリコシド結合した糖であり、二糖類の１種である。ＴＨＢはベクトン・ディッキンソン社製のものを用いた。スクロースは富士フイルム和光純薬社製「ＣＡＳＲＮ」を用いた。培養に用いたプレートは、Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃｓｈａＮｕｎｃｌｏｎ Ｄｅｌｔａ Ｓｕｒｆａｃｅ ９６ｗｅｌｌである。培養器は、ＰａｎａｓｏｎｉｃマルチガスインキュベーターＭＣＯ－５ＭＵＶ－ＰＪを用いた。培養は、３７度Ｃ，ＣＯ２ガス５％，Ｏ２ガス５％、Ｎ２ガス９０％の雰囲気下で行った。
【0029】
バイオフィルムの残存を測定する機器等について以下に説明する。染色は、０．１％の富士フイルム和光純薬株式会社製のクリスタルバイオレットを０．１％（ｗ／ｖ）となるように蒸留水に溶解したものを用いた。
撮影に用いた顕微鏡は、Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製のＥＶＯＳ ＸＬ ｃｏｒｅを用いた。吸光度測定器は、ＣＯＲＯＮＡ ＥＬＥＣＴＲＩＣ社ＳＨ－１０００ Ｌａｂを用いた。データ処理ソフトウェアは「ＳＦ６」とし、吸光度波長は、５９０ｎｍとした。
撮影に用いた顕微鏡は、Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製のＥＶＯＳ ＸＬ ｃｏｒｅを用いた。吸光度測定器は、ＣＯＲＯＮＡ ＥＬＥＣＴＲＩＣ社ＳＨ－１０００ Ｌａｂを用いた。データ処理ソフトウェアは「ＳＦ６」とし、吸光度波長は、５９０ｎｍとした。
【0030】
（「実験１：菌幡種と同時に添加」の手順）
ストレプトコッカス・ミュータンス菌を２％スクロース含有ＴＨＢで希釈し、細胞培養用プレート（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃｓｈａＮｕｎｃｌｏｎ Ｄｅｌｔａ Ｓｕｒｆａｃｅ ９６ｗｅｌｌ）に１００μｌ播種したものを１０個用意した。播種と同時に、重水素硫酸（Ｄ２ＳＯ４）を水（Ｈ２Ｏ）で希釈し、ｐＨ＝０．８、１．２、１．５、２．３、２．７、３．０、３．３、３．７、４．０に調製した試験液１００ｍｌを添加した。なお、播種した１０個のうち１個については、試験液は添加しなかった。
ストレプトコッカス・ミュータンス菌を２％スクロース含有ＴＨＢで希釈し、細胞培養用プレート（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃｓｈａＮｕｎｃｌｏｎ Ｄｅｌｔａ Ｓｕｒｆａｃｅ ９６ｗｅｌｌ）に１００μｌ播種したものを１０個用意した。播種と同時に、重水素硫酸（Ｄ２ＳＯ４）を水（Ｈ２Ｏ）で希釈し、ｐＨ＝０．８、１．２、１．５、２．３、２．７、３．０、３．３、３．７、４．０に調製した試験液１００ｍｌを添加した。なお、播種した１０個のうち１個については、試験液は添加しなかった。
【0031】
その後、マルチガスインキュベーターで２４時間培養してプレート底面にバイオフィルムを形成させた。培養後、プレートを蒸留水で洗浄し、０．１％クリスタルバイオレット溶液で１０分間染色した。染色後は再び蒸留水で洗浄し、乾燥させた後に明視野倒立顕微鏡で観察し写真を撮影した。
【0032】
その後、９９．５％エタノール１００μｌ（富士フイルム和光純薬株式会社製）でクリスタルバイオレットを抽出し、吸光度計グレーティングマイクロプレートリーダーを用いて５９０ｎｍの波長で吸光度を測定した。
【0033】
（「実験２：菌幡種２４時間後（バイオフィルム形成後）の培地に添加」の手順）
ストレプトコッカス・ミュータンス菌を２％スクロース含有ＴＨＢで希釈し、細胞培養用プレート（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社Ｎｕｎｃｌｏｎ Ｄｅｌｔａ Ｓｕｒｆａｃｅ ９６ｗｅｌｌ）に１００μｌ播種したものを１０個用意した。その後、マルチガスインキュベーターで２４時間培養してプレート底面にバイオフィルムを形成させた。
ストレプトコッカス・ミュータンス菌を２％スクロース含有ＴＨＢで希釈し、細胞培養用プレート（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社Ｎｕｎｃｌｏｎ Ｄｅｌｔａ Ｓｕｒｆａｃｅ ９６ｗｅｌｌ）に１００μｌ播種したものを１０個用意した。その後、マルチガスインキュベーターで２４時間培養してプレート底面にバイオフィルムを形成させた。
【0034】
重水素硫酸（Ｄ２ＳＯ４）を水（Ｈ２Ｏ）で希釈し、ｐＨ＝０．８、１．２、１．５、２．３、２．７、３．０、３．３、３．７、４．０に調製した試験液を、培養開始から２４時間後（バイオフィルム形成後）に、培地を取り除かず、培養系に添加した。さらに２４時間、マルチガスインキュベーターで培養した。培養後、プレートを蒸留水で洗浄し、０．１％クリスタルバイオレット溶液で１０分間染色した。染色後は再び蒸留水で洗浄し乾燥させた後に明視野倒立顕微鏡を用いて観察し、写真を撮影した。
【0035】
その後、９９．５％エタノール１００μｌ（富士フイルム和光純薬株式会社製）でクリスタルバイオレットを抽出し、吸光度計グレーティングマイクロプレートリーダーを用いて５９０ｎｍの波長で吸光度を測定した。
【0036】
（「実験３：菌幡種２４時間後（バイオフィルム形成後）の培地を置換」の手順）
ストレプトコッカス・ミュータンス菌を２％スクロース含有ＴＨＢで希釈し、細胞培養用プレート（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社Ｎｕｎｃｌｏｎ Ｄｅｌｔａ Ｓｕｒｆａｃｅ ９６ｗｅｌｌ）に１００μｌ播種したものを１０個用意した。その後、マルチガスインキュベーターで２４時間培養してプレート底面にバイオフィルムを形成させた。
ストレプトコッカス・ミュータンス菌を２％スクロース含有ＴＨＢで希釈し、細胞培養用プレート（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社Ｎｕｎｃｌｏｎ Ｄｅｌｔａ Ｓｕｒｆａｃｅ ９６ｗｅｌｌ）に１００μｌ播種したものを１０個用意した。その後、マルチガスインキュベーターで２４時間培養してプレート底面にバイオフィルムを形成させた。
【0037】
培養開始から２４時間後に、培地を除去し、プレートを蒸留水で洗浄した。重水素硫酸（Ｄ２ＳＯ４）を水（Ｈ２Ｏ）で希釈し、ｐＨ＝０．５、０．８、１．２、２．０、２．３、２．７、３．０、３．３、３．７に調製した試験液を、１００ｍｌずつ注入し、除去した培地を戻した。さらに２４時間、マルチガスインキュベーターで培養した。培養後、プレートを蒸留水で洗浄し、０．１％クリスタルバイオレット溶液で１０分間染色した。染色後は再び蒸留水で洗浄し乾燥させた後に明視野倒立顕微鏡を用いて観察し、写真を撮影した。
【0038】
図３の上段は、実験１のミュータンス菌幡種と同時に試験液を添加し、培養したものを染色・洗浄した写真である。色が濃いほどより多くのバイオフィルムが残存していることを示している。ｐＨ＝０．８、１．２、１．５の場合に白くなっており、バイオフィルム形成が大きく阻害・破壊されていることがわかる。
【0039】
図３の中段は、実験２のミュータンス菌幡種２４時間後（バイオフィルム形成後）の培地に試験液を添加し、さらに２４時間培養したものを染色・洗浄した写真である。図３の下段は、実験３のミュータンス菌幡種２４時間後（バイオフィルム形成後）の培地を試験液で置換し、さらに２４時間培養したものを染色・洗浄した写真である。これらの写真を見ると、ｐＨ値が小さいものほど色が薄くなっており、より多くのバイオフィルムが破壊されていりことがわかる。
【0040】
図４は、上記実験１で試験したサンプルの吸光度を測定した結果を示している。横軸がｐＨ値で、縦軸が吸光度で、ｐＨ値が２．３よりも小さくなると急激に吸光度が小さくなり、バイオフィルムがほとんど形成されていないという結果であった。下記表２は、実験１のｐＨと吸光度のデータである。
【表2】
【0041】
図５は、上記実験２で試験したサンプルの吸光度を測定した結果を示している。横軸がｐＨ値で、縦軸が吸光度で、ｐＨ値が３．０よりも小さくなると徐々に吸光度が小さくなり、ｐＨ１．５から小さくなると急激に小さくなっている。ｐＨが小さくなると、バイオフィルム破壊されていることを示している。下記表３は、実験２のｐＨと吸光度のデータである。
【表3】
【0042】
図６は、上記実験３で試験したサンプルの吸光度を測定した結果を示している。横軸がｐＨ値で、縦軸が吸光度で、ｐＨ値が２．３よりも小さくなると徐々に吸光度が小さくなり、ｐＨが０．５まで顕著な減少傾向が続いている。ｐＨが２．０よりも小さくなると、バイオフィルムが破壊されていることを明確に示している。下記表４は、実験３のｐＨと吸光度のデータである。
【表4】
【0043】
ミュータンス菌は、糖を栄養源として酸を産生することから、菌の密集した局所でｐＨ低下に耐えられるように耐酸性の性質がこのシステムにより活性化される。実験１～３に供したミュータンス菌は、酸性に対して抵抗力を有している。このようなシステムを有していないバイオフィルムを産出する菌が産出するバイオフィルムに対しては、当然に効果を有する。
【0044】
ミュータンス菌は、クオラムセンシングシステムを有しており、特に厳しい環境でも耐えられる耐性を有している。クオラムセンシングシステムとは、菌の数が一定数を超えたときに、その密度を感知して、シグナル伝達が起こり、菌の生息に都合の良い活性が起こるシステムである。
ミュータンス菌は、糖を栄養源として酸を産生することから、菌の密集した局所でｐＨ低下に耐えられるように耐酸性の性質がこのシステムで活性化される。また、菌の増殖に歯止めがかけられるように殺菌物質であるバクテリオンを産生し、菌量の調節を行う。
ミュータンス菌は、環境に適応するために遺伝子の取り込みが活性化され、厳しい環境でも生息できる性質を持つように変異しやすくする。
このように、ミュータンス菌では、低ｐＨ環境におかれても、このようなシステムを有しているため死滅させることが困難となり、ｐＨが０．５以上２．０以下という低いｐＨが必要となる。
ミュータンス菌は、糖を栄養源として酸を産生することから、菌の密集した局所でｐＨ低下に耐えられるように耐酸性の性質がこのシステムで活性化される。また、菌の増殖に歯止めがかけられるように殺菌物質であるバクテリオンを産生し、菌量の調節を行う。
ミュータンス菌は、環境に適応するために遺伝子の取り込みが活性化され、厳しい環境でも生息できる性質を持つように変異しやすくする。
このように、ミュータンス菌では、低ｐＨ環境におかれても、このようなシステムを有しているため死滅させることが困難となり、ｐＨが０．５以上２．０以下という低いｐＨが必要となる。
【0045】
一方、ミュータンス菌のこのような耐酸性を有しない菌であって、バイオフィルムを形成する菌も存在する。例えば、口腔内に常在するＦｎ菌（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ（フソバクテリウム・ヌクレアタム））である。この菌は、悪臭（口臭）の原因となる酪酸を生み出す菌で、歯周病の原因菌とされ、さらに近年、大腸においても発見され、大腸がんの原因菌とされている菌である。
この菌は、ミュータンス菌のようなクオラムセンシングシステムを有さないので、抗酸性はミュータンス菌よりも低く、ｐＨがミュータンス菌と比べて高いｐＨを有するバイオフィルム破壊液でもバイオフィルムを破壊することができる。
この菌は、ミュータンス菌のようなクオラムセンシングシステムを有さないので、抗酸性はミュータンス菌よりも低く、ｐＨがミュータンス菌と比べて高いｐＨを有するバイオフィルム破壊液でもバイオフィルムを破壊することができる。
【0046】
図７は、実際にＦｎ菌株を用いた実験結果を示している。培地は、ＴＨＢ（ＴＯＤＤ－ＨＥＷＩＴＴ ＢＲＯＴＨ）に２％（ｗ／ｖ）スクロースを添加したものを用いた。スクロースは、単糖であるグルコース（ブドウ糖）とフルクトース（果糖）がα－１，２－グリコシド結合した糖であり、二糖類の１種である。ＴＨＢはベクトン・ディッキンソン社製のものを用いた。スクロースは富士フイルム和光純薬社製「ＣＡＳＲＮ」を用いた。培養に用いたプレートは、Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃｓｈａＮｕｎｃｌｏｎ Ｄｅｌｔａ Ｓｕｒｆａｃｅ ９６ｗｅｌｌある。培養器は、ＰａｎａｓｏｎｉｃマルチガスインキュベーターＭＣＯ－５ＭＵＶ－ＰＪを用いた。培養は、３７度Ｃ，ＣＯ２ガス５％，Ｏ２ガス５％、Ｎ２ガス９０％の雰囲気下で行った。
【0047】
（「実験４：菌幡種と同時に添加」の手順）
Ｆｎ菌を２％スクロース含有ＴＨＢで希釈し、細胞培養用プレート（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃｓｈａＮｕｎｃｌｏｎ Ｄｅｌｔａ Ｓｕｒｆａｃｅ ９６ｗｅｌｌ）に１００μｌ播種したものを１０個用意した。播種と同時に、重水素硫酸（Ｄ２ＳＯ４）を水（Ｈ２Ｏ）で希釈し、ｐＨ＝０．５、２．０、３．０、４．０、５．０、６．０に調製した試験液１００ｍｌを添加した。なお、播種した７個のうち１個については、試験液は添加しなかった。
Ｆｎ菌を２％スクロース含有ＴＨＢで希釈し、細胞培養用プレート（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃｓｈａＮｕｎｃｌｏｎ Ｄｅｌｔａ Ｓｕｒｆａｃｅ ９６ｗｅｌｌ）に１００μｌ播種したものを１０個用意した。播種と同時に、重水素硫酸（Ｄ２ＳＯ４）を水（Ｈ２Ｏ）で希釈し、ｐＨ＝０．５、２．０、３．０、４．０、５．０、６．０に調製した試験液１００ｍｌを添加した。なお、播種した７個のうち１個については、試験液は添加しなかった。
【0048】
その後、マルチガスインキュベーターで２４時間培養してプレート底面にバイオフィルムを形成させた。培養後、プレートを蒸留水で洗浄し、０．１％クリスタルバイオレット溶液で１０分間染色した。染色後は再び蒸留水で洗浄し、乾燥させた。
【0049】
その後、９９．５％エタノール１００μｌ（富士フイルム和光純薬株式会社製）でクリスタルバイオレットを抽出し、吸光度計グレーティングマイクロプレートリーダーを用いて５９０ｎｍの波長で吸光度を測定した。
【0050】
図７は、上記実験４で試験したサンプルの吸光度を測定した結果を示している。横軸がｐＨ値で、縦軸が吸光度で、ｐＨ値が４．５よりも小さくなると、ｐＨが６．０のものと比べて吸光度が小さくなり、バイオフィルムが形成されにくくなるという結果であった。下記表５は、実験４のｐＨと吸光度のデータである。
【表5】
【0051】
実験１～実験４の結果からわかるように、ミュータンス菌のような抗酸性の強い菌に対しては、ｐＨが０．５～２，０に調整したバイオフィルム破壊液が好ましく、Ｆｎ菌のような抗酸性が高くない菌に対しては、ｐＨを４．０以下に調製したものでも効果があるので、対象となる菌の種類によってｐＨを調整すれば良い。
【0052】
実験１～実験４では、水と重水素硫酸の２成分によって構成されたバイオフィルムを破壊する溶液が用いられているが、他の成分、例えば界面活性剤、増粘剤、色素剤等の副成分を添加したものにおいても、主成分が水と重水素硫酸であり、ｐＨが０．５～４である限りバイオフィルムを破壊することができる。
【産業上の利用可能性】
【0053】
本発明のバイオフィルムを破壊するための溶液は、バイオフィルムを強力に破壊する機能を有することから、環境に発生するバイオフィルムのみならず、歯科分野や医科分野の治療に供することが出来る。また、医療分野に使用する医療機器に形成されたバイオフィルムを破壊して、より精密な洗浄に供することができる。
【要約】
【課題】人体にやさしく、基質に付着した細菌等が産出するバイオフィルムを効果的に破壊する溶液とその製造方法を提供する。
【解決手段】水（Ｈ２Ｏ）と重水素硫酸（Ｄ２ＳＯ４）からなり、ｐＨが０．５以上４．０以下の、バイオフィルムを破壊するための溶液である。このバイオフィルムを破壊する溶液は、浸透性がよいので、バイオフィルムを効率的に破壊することができる。また、そのバイオフィルムを破壊するための溶液は、水（Ｈ２Ｏ）を用いて重水素硫酸（Ｄ２ＳＯ４）のｐＨが０．５以上４．０以下となるように希釈調製することによって得られる。
【選択図】 図６
【解決手段】水（Ｈ２Ｏ）と重水素硫酸（Ｄ２ＳＯ４）からなり、ｐＨが０．５以上４．０以下の、バイオフィルムを破壊するための溶液である。このバイオフィルムを破壊する溶液は、浸透性がよいので、バイオフィルムを効率的に破壊することができる。また、そのバイオフィルムを破壊するための溶液は、水（Ｈ２Ｏ）を用いて重水素硫酸（Ｄ２ＳＯ４）のｐＨが０．５以上４．０以下となるように希釈調製することによって得られる。
【選択図】 図６
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】