特許 7423682 変異カプシドを有するアデノ随伴ウイルスビリオン及びその使用方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-01-19

(45)【発行日】2024-01-29

(54)【発明の名称】変異カプシドを有するアデノ随伴ウイルスビリオン及びその使用方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/864 20060101AFI20240122BHJP

   C12N 15/35 20060101ALI20240122BHJP

   C12N 7/01 20060101ALI20240122BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20240122BHJP

   C07K 14/015 20060101ALI20240122BHJP

   A61P 27/02 20060101ALI20240122BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20240122BHJP

【ＦＩ】

C12N15/864 100Z

C12N15/35 ZNA

C12N7/01

C07K19/00

C07K14/015

A61P27/02

A61K35/76

【請求項の数】 20

(21)【出願番号】P 2022076635

(22)【出願日】2022-05-06

(62)【分割の表示】P 2019504750の分割

【原出願日】2017-07-27

(65)【公開番号】P2022115988

(43)【公開日】2022-08-09

【審査請求日】2022-06-03

(31)【優先権主張番号】62/368,929

(32)【優先日】2016-07-29

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】506115514

【氏名又は名称】ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア

【氏名又は名称原語表記】Ｔｈｅ Ｒｅｇｅｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ

(73)【特許権者】

【識別番号】502409813

【氏名又は名称】ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア

(74)【代理人】

【識別番号】100114557

【弁理士】

【氏名又は名称】河野 英仁

(74)【代理人】

【識別番号】100078868

【弁理士】

【氏名又は名称】河野 登夫

(72)【発明者】

【氏名】シャファー，デイビッド，ヴイ．

(72)【発明者】

【氏名】フラネリー，ジョン，ジー．

(72)【発明者】

【氏名】ベルトラン，ウィリアム，エー．

(72)【発明者】

【氏名】バーン，リア，シー．

(72)【発明者】

【氏名】バイセル，メイケ

【審査官】福澤 洋光

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１４－５１８６１４（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１４／２００９１０（ＷＯ，Ａ２）

【文献】EMBO molecular medicine，Vol.6, No.9，2014年，pp.1175-1190

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １／００－１５／９０

Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００

ＣＡ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンであって、
ａ）対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質と比較してカプシドタンパク質ＧＨループに異種ペプチドの挿入断片を含むＡＡＶ２カプシドタンパク質ＶＰ１であって、前記異種ペプチドは，アミノ酸配列ＰＤＳＴＴＲＳと、アミノ酸Ｐの前のＮ末端における２アミノ酸長リンカー及びアミノ酸Ｓの後のＣ末端における１アミノ酸長リンカーとを含み、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含む対照ＡＡＶビリオンによる網膜細胞に対する感染力と比較して、前記網膜細胞に対する感染力を増加させる、ＡＡＶ２カプシドタンパク質ＶＰ１と、
ｂ）異種遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸と
を含む、ｒＡＡＶビリオン。

【請求項2】

前記ｒＡＡＶビリオンは、対応する親ＡＡＶ２カプシドタンパク質ＶＰ１を含む対照ＡＡＶビリオンによる網膜細胞に対する感染力と比較して、少なくとも５倍増加した感染力を前記網膜細胞に対して示す、ならびに／または、
内顆粒層、外顆粒層、光受容体層、神経節細胞層、及び網膜色素上皮のうちの１つまたは複数に対して前記ｒＡＡＶビリオンが示す局在性は、内顆粒層、外顆粒層、光受容体層、神経節細胞層、または網膜色素上皮に対する対応する親ＡＡＶ２カプシドタンパク質ＶＰ１を含むＡＡＶビリオンによる局在性度合と比較して、少なくとも５倍増加している、
請求項１に記載のｒＡＡＶビリオン。

【請求項3】

前記挿入断片は、ＡＡＶ２のＶＰ１のアミノ酸５７０及びアミノ酸６１１に対応するアミノ酸の間に存する、請求項１または２に記載のｒＡＡＶビリオン。

【請求項4】

前記挿入断片は、ＡＡＶ２のＶＰ１のアミノ酸５８７及びアミノ酸５８８の間に存する、請求項３に記載のｒＡＡＶビリオン。

【請求項5】

前記異種遺伝子産物は、
ａ）干渉ＲＮＡまたはアプタマーである、
ｂ）ポリペプチド、任意には、神経保護ポリペプチド、抗血管新生ポリペプチド、抗アポトーシスポリペプチド、もしくは網膜細胞の機能を増進するポリペプチド、または、ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼである、または、
ｃ）ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡである、
請求項１～４のいずれか１項に記載のｒＡＡＶビリオン。

【請求項6】

前記異種遺伝子産物は、グリア細胞由来神経栄養因子、線維芽細胞増殖因子２、ニュールツリン、毛様体神経栄養因子、神経成長因子、脳由来神経栄養因子、上皮増殖因子、ロドプシン、Ｘ連鎖アポトーシス抑制物質、レチノスキシン、ＲＰＥ６５、網膜色素変性症ＧＴＰａｓｅ相互作用タンパク質－１、ペリフェリン、ペリフェリン－２、ロドプシン、ＲｄＣＶＦ、網膜色素変性症ＧＴＰａｓｅ調節因子（ＲＰＧＲ）、またはソニックヘッジホッグである、請求項１～４のいずれか１項に記載のｒＡＡＶビリオン。

【請求項7】

前記異種ペプチドは、約１２個～２０個のアミノ酸の長さを有する、請求項１～６のいずれか１項に記載のｒＡＡＶビリオン。

【請求項8】

ａ）請求項１～７のいずれか１項に記載のｒＡＡＶビリオンと、
ｂ）医薬的に許容可能な賦形剤と
を含む、医薬組成物。

【請求項9】

個体の網膜細胞へ遺伝子産物を送達する方法に使用のための請求項１～７のいずれか１項に記載の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオン。

【請求項10】

眼疾患を治療する方法に使用のための請求項１～７のいずれか１項に記載の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオン。

【請求項11】

前記眼疾患は、緑内障、網膜色素変性症、黄斑変性、網膜分離症、レーバー先天黒内障、糖尿病性網膜症、色覚異常（ａｃｈｒｏｍｏｔｏｐｓｉａ）、または色覚異常（ｃｏｌｏｒ ｂｌｉｎｄｎｅｓｓ）である、請求項１０に記載のｒＡＡＶビリオン。

【請求項12】

対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質と比較してカプシドタンパク質ＧＨループに異種ペプチドの挿入断片を含むアデノ随伴ウイルス２（ＡＡＶ２）カプシドタンパク質ＶＰ１をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸であって、
前記異種ペプチドは，アミノ酸配列ＰＤＳＴＴＲＳと、アミノ酸Ｐの前のＮ末端における２アミノ酸長リンカー及びアミノ酸Ｓの後のＣ末端における１アミノ酸長リンカーとを含んでおり、
前記カプシドタンパク質は、ＡＡＶビリオンに存在するとき、網膜細胞に対する前記ＡＡＶビリオンの感染力を増加させる、
単離された核酸。

【請求項13】

前記挿入断片は、ＡＡＶ２のＶＰ１のアミノ酸５７０及びアミノ酸６１１に対応するアミノ酸の間に存する、請求項１２に記載の単離された核酸。

【請求項14】

前記挿入断片は、ＡＡＶ２のＶＰ１のアミノ酸５８７及びアミノ酸５８８の間に存する、請求項１３に記載の単離された核酸。

【請求項15】

前記異種ペプチドは、約１２個～２０個のアミノ酸の長さを有する、請求項１２～１４のいずれか１項に記載の単離された核酸。

【請求項16】

請求項１２～１５のいずれか１項に記載の単離された核酸を含む、単離された遺伝子改変宿主細胞。

【請求項17】

アデノ随伴ウイルス２（ＡＡＶ２）カプシドタンパク質ＶＰ１であって、
前記ＡＡＶ２カプシドタンパク質ＶＰ１は、異種ペプチドの挿入断片をＧＨループに含んでおり、
前記異種ペプチドは、アミノ酸配列ＰＤＳＴＴＲＳと、アミノ酸Ｐの前のＮ末端における２アミノ酸長リンカー及びアミノ酸Ｓの後のＣ末端における１アミノ酸長リンカーとを含んでおり、
前記カプシドタンパク質は、ＡＡＶビリオンに存在するとき、網膜細胞に対する前記ＡＡＶビリオンの感染力を増加させる、
ＡＡＶ２カプシドタンパク質。

【請求項18】

前記挿入断片は、ＡＡＶ２のＶＰ１のアミノ酸５７０及びアミノ酸６１１に対応するアミノ酸の間に存する、請求項１７に記載のＡＡＶ２カプシドタンパク質。

【請求項19】

前記挿入断片は、ＡＡＶ２のＶＰ１のアミノ酸５８７及びアミノ酸５８８の間に存する、請求項１８に記載のＡＡＶ２カプシドタンパク質。

【請求項20】

前記異種ペプチドは、約１２個～２０個のアミノ酸の長さを有する、請求項１７～１９のいずれか１項に記載のＡＡＶ２カプシドタンパク質。

【発明の詳細な説明】

【背景技術】

【0001】

光受容体は、網膜において視覚情報の受容及び処理を最初に行うニューロンであり、光情報伝達を介して可視電磁放射線を過分極応答に変換する。遺伝性網膜疾患の圧倒的大多数においてこうした細胞が失われる結果となり、この喪失は、直接的（ロドプシンタンパク質のフォールディングに影響する優性変異など）または間接的（網膜色素上皮（ＲＰＥ）におけるレチナールリサイクリング経路に影響する劣性変異など）に生じる。

【0002】

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅファミリー及びＤｅｐｅｎｄｏｖｉｒｕｓ属に属しており、そのメンバーの複製を促進するには、アデノウイルスなどのヘルパーウイルスを同時感染させる必要があり、ヘルパーが存在しない場合、ＡＡＶは、潜伏感染を確立する。ビリオンは、ｒｅｐ及びｃａｐという２つのオープンリーディングフレームを有する４．９ｋｂの一本鎖ＤＮＡゲノムを包含する２５ｎｍの正二十面体カプシドから構成される。非構造遺伝子であるｒｅｐは、ウイルスの複製に必須の４つの制御タンパク質をコードし、一方、ｃａｐは、６０量体のカプシドシェルへと会合する３つの構造タンパク質（ＶＰ１－３）をコードする。このウイルスカプシドによって、細胞表面受容体結合、エンドサイトーシス、細胞内移動、及び核におけるアンパッケージングを含めて、ウイルス形質導入の生物学的障壁の多くを克服するＡＡＶベクターの能力が媒介される。

【発明の概要】

【0003】

本開示は、改変カプシドタンパク質を有する組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ビリオンを提供し、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ビリオンは、野生型ＡＡＶと比較して、網膜細胞に対して高い感染力を示し、ｒＡＡＶビリオンは、異種核酸を含む。本開示は、個体の網膜細胞への遺伝子産物の送達方法、及び眼疾患の治療方法をさらに提供する。本開示は、ｒＡＡＶビリオンを提供し、内顆粒層、外顆粒層、光受容体層、神経節細胞層、及び網膜色素上皮のうちの１つまたは複数に対してｒＡＡＶビリオンが示す局在性は、内顆粒層、外顆粒層、光受容体層、神経節細胞層、または網膜色素上皮に対する対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによる局在性度合と比較して、少なくとも５倍増加している。

【図面の簡単な説明】

【0004】

【図1】親ＡＡＶと比較して眼球細胞（例えば、網膜細胞）に対する感染力が増加したＡＡＶ変異体の開発に使用した指向性進化法を示す模式図である。

【図2】緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）－バーコードコンストラクトを含むＡＡＶ変異体のディープシークエンシングを示す模式図である。

【図3】１８のメンバーを含むＡＡＶ変異体ライブラリーによる、神経節細胞層、内顆粒層、光受容体層、及び網膜色素上皮（ＲＰＥ）層における細胞の感染を示す。

【図4】ＡＡＶ２カプシドタンパク質ＶＰ１のアミノ酸配列を示す。アミノ酸５８７及びアミノ酸５８８（ＮＰ）は、下線付きの太字で示される。

【図5】さまざまなＡＡＶ血清型のＡＡＶカプシドタンパク質ＶＰ１のアミノ酸５７０～６１０に対応するアミノ酸配列を示す。

【図6A】ＡＡＶカプシドタンパク質ループＩＶ（ＧＨループ）領域のアミノ酸配列のアライメントを示す。挿入部位は、下線付きの太字で示される。ＡＡＶ１：配列番号３５、ＡＡＶ６：配列番号３６、ＡＡＶ３：配列番号３７、ＡＡＶ２：配列番号３８、ＡＡＶ８：配列番号３９、ＡＡＶ８．１：配列番号４０、ＡＡＶ８ｒｈ８：配列番号４１、ＡＡＶ１０：配列番号４２、ＡＡＶ７：配列番号４３、ＡＡＶ９：配列番号４４、ＡＡＶ９．１：配列番号４５、ＡＡＶ５：配列番号４６である。

【図6B】ＡＡＶカプシドタンパク質ループＩＶ（ＧＨループ）領域のアミノ酸配列のアライメントを示す。挿入部位は、下線付きの太字で示される。ＡＡＶ１：配列番号３５、ＡＡＶ６：配列番号３６、ＡＡＶ３：配列番号３７、ＡＡＶ２：配列番号３８、ＡＡＶ８：配列番号３９、ＡＡＶ８．１：配列番号４０、ＡＡＶ８ｒｈ８：配列番号４１、ＡＡＶ１０：配列番号４２、ＡＡＶ７：配列番号４３、ＡＡＶ９：配列番号４４、ＡＡＶ９．１：配列番号４５、ＡＡＶ５：配列番号４６である。

【図6C】ＡＡＶカプシドタンパク質ループＩＶ（ＧＨループ）領域のアミノ酸配列のアライメントを示す。挿入部位は、下線付きの太字で示される。ＡＡＶ１：配列番号３５、ＡＡＶ６：配列番号３６、ＡＡＶ３：配列番号３７、ＡＡＶ２：配列番号３８、ＡＡＶ８：配列番号３９、ＡＡＶ８．１：配列番号４０、ＡＡＶ８ｒｈ８：配列番号４１、ＡＡＶ１０：配列番号４２、ＡＡＶ７：配列番号４３、ＡＡＶ９：配列番号４４、ＡＡＶ９．１：配列番号４５、ＡＡＶ５：配列番号４６である。

【図7-1】例示の異種遺伝子産物のアミノ酸配列を示す。

【図7-2】例示の異種遺伝子産物のアミノ酸配列を示す。

【図7-3】例示の異種遺伝子産物のアミノ酸配列を示す。

【図7-4】例示の異種遺伝子産物のアミノ酸配列を示す。

【図7-5】例示の異種遺伝子産物のアミノ酸配列を示す。

【図7-6】例示の異種遺伝子産物のアミノ酸配列を示す。

【図7-7】例示の異種遺伝子産物のアミノ酸配列を示す。

【図7-8】例示の異種遺伝子産物のアミノ酸配列を示す。

【図7-9】例示の異種遺伝子産物のアミノ酸配列を示す。

【図7-10】例示の異種遺伝子産物のアミノ酸配列を示す。

【図7-11】例示の異種遺伝子産物のアミノ酸配列を示す。

【図7-12】例示の異種遺伝子産物のアミノ酸配列を示す。

【図7-13】例示の異種遺伝子産物のアミノ酸配列を示す。

【図7-14】例示の異種遺伝子産物のアミノ酸配列を示す。

【図7-15】例示の異種遺伝子産物のアミノ酸配列を示す。

【図7-16】例示の異種遺伝子産物のアミノ酸配列を示す。

【図8A】例示のガイドＲＮＡ依存性エンドヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。

【図8B】例示のガイドＲＮＡ依存性エンドヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。

【図8C】例示のガイドＲＮＡ依存性エンドヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。

【発明を実施するための形態】

【0005】

定義
「網膜細胞」という用語は、網膜を構成する任意の細胞型（網膜神経節細胞、アマクリン細胞、水平細胞、双極細胞、光受容体細胞（杆体及び錐体を含む）、ミュラーグリア細胞、アストロサイト（例えば、網膜アストロサイト）、ならびに網膜色素上皮など）を本明細書で指し得る。

【0006】

「ＡＡＶ」は、アデノ随伴ウイルスの略称であり、ウイルス自体またはその派生体を指すために使用され得る。この用語は、別に必要な場合を除き、すべてのサブタイプ、ならびに天然起源の形態と組換え形態との両方を包含する。「ｒＡＡＶ」という略称は、組換えアデノ随伴ウイルスを指すと共に、組換えＡＡＶベクター（または「ｒＡＡＶベクター」）も指す。「ＡＡＶ」という用語は、ＡＡＶ１型（ＡＡＶ－１）、ＡＡＶ２型（ＡＡＶ－２）、ＡＡＶ３型（ＡＡＶ－３）、ＡＡＶ４型（ＡＡＶ－４）、ＡＡＶ５型（ＡＡＶ－５）、ＡＡＶ６型（ＡＡＶ－６）、ＡＡＶ７型（ＡＡＶ－７）、ＡＡＶ８型（ＡＡＶ－８）、ＡＡＶ９型（ＡＡＶ－９）、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、霊長類ＡＡＶ、非霊長類ＡＡＶ、及びヒツジＡＡＶを含む。「霊長類ＡＡＶ」は、霊長類から単離されたＡＡＶを指し、「非霊長類ＡＡＶ」は、非霊長類の哺乳類から単離されたＡＡＶを指し、「ウシＡＡＶ」は、ウシ哺乳類（例えば、雌ウシ）から単離されたＡＡＶを指すなどである。

【0007】

本明細書で使用される「ｒＡＡＶベクター」は、ＡＡＶ起源ではないポリヌクレオチド配列（すなわち、ＡＡＶに対して異種のポリヌクレオチド）、典型的には、細胞の遺伝子形質転換のための目的配列を含むＡＡＶベクターを指す。一般に、異種ポリヌクレオチドは、少なくとも１つ、一般には２つのＡＡＶ末端逆位反復配列（ＩＴＲ）と隣接する。ｒＡＡＶベクターという用語は、ｒＡＡＶベクター粒子とｒＡＡＶベクタープラスミドとの両方を包含する。

【0008】

「ＡＡＶウイルス」または「ＡＡＶウイルス粒子」または「ｒＡＡＶベクター粒子」は、少なくとも１つのＡＡＶカプシドタンパク質から構成されるウイルス粒子（典型的には、野生型ＡＡＶのカプシドタンパク質のすべてによるもの）、及びカプシドを形成したポリヌクレオチドｒＡＡＶベクターを指す。粒子が異種ポリヌクレオチド（すなわち、野生型ＡＡＶゲノム以外のポリヌクレオチド（哺乳類細胞に送達されるべき導入遺伝子など））を含むのであれば、その粒子は、典型的には、「ｒＡＡＶベクター粒子」または単に「ｒＡＡＶベクター」と称される。したがって、ｒＡＡＶ粒子の産生は、必然的にｒＡＡＶベクターの産生を伴い、したがって、ベクターは、ｒＡＡＶ粒子に内包される。

【0009】

「パッケージング」は、ＡＡＶ粒子の構築及びカプシド形成が生じる一連の細胞内事象を指す。

【0010】

ＡＡＶの「ｒｅｐ」遺伝子及び「ｃａｐ」遺伝子は、アデノ随伴ウイルスの複製タンパク質及びカプシド形成タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を指す。ＡＡＶのｒｅｐ及びｃａｐは、本明細書ではＡＡＶ「パッケージング遺伝子」と称される。

【0011】

ＡＡＶのための「ヘルパーウイルス」は、哺乳類細胞によるＡＡＶ（例えば、野生型ＡＡＶ）の複製及びパッケージングを可能にするウイルスを指す。ＡＡＶのためのそのようなヘルパーウイルスは、当該技術分野においてさまざまなものが知られており、こうしたヘルパーウイルスには、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、及びポックスウイルス（ワクシニアなど）が含まれる。アデノウイルスは、多くの異なる亜群を含むが、亜群Ｃのアデノウイルス５型が最も一般に使用される。ヒト、非ヒト哺乳類、及び鳥を起源とするアデノウイルスが多く知られており、ＡＴＣＣなどの寄託機関から利用可能である。ヘルペスファミリーのウイルスには、例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）及びエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、ならびにサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）及び仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）が含まれ、これらもまた、ＡＴＣＣなどの寄託機関から利用可能である。

【0012】

「ヘルパーウイルス機能（複数可）」は、ヘルパーウイルスゲノムにコードされ、ＡＡＶの複製及びパッケージングを（本明細書に記載の複製及びパッケージングのための他の要件と併せて）可能にする機能（複数可）を指す。本明細書で使用される「ヘルパーウイルス機能」は、多くの方法で提供され得るものであり、こうした方法には、ヘルパーウイルスを提供することによるもの、または例えば、必要な機能（複数可）をコードするポリヌクレオチド配列を産生細胞にトランスで提供することによるものが含まれる。

【0013】

「感染性」のウイルスまたはウイルス粒子は、そのウイルス種が指向する細胞への送達能力を有するポリヌクレオチド要素を含むものである。この用語は、ウイルスが何らかの複製能力を有することを必ずしも暗示するものではない。本明細書で使用される「感染性」のウイルスまたはウイルス粒子は、標的細胞に接近することができ、標的細胞に感染することができ、かつ標的細胞において異種核酸を発現することができるものである。したがって、「感染力」は、ウイルス粒子が標的細胞に接近し、標的細胞に感染し、かつ標的細胞において異種核酸を発現する能力を指す。感染力は、インビトロの感染力またはインビボの感染力を指し得る。感染性ウイルス粒子の数を数えるためのアッセイは、本開示の他の箇所及び当該技術分野において説明されている。ウイルスの感染力は、総ウイルス粒子に対する感染性ウイルス粒子の比率として示すことができる。総ウイルス粒子は、ウイルスゲノム（ｖｇ）のコピー数として示すことができる。細胞においてウイルス粒子が異種核酸を発現する能力は、「形質導入」と称すことができる。細胞においてウイルス粒子が異種核酸を発現する能力は、多くの手法を使用してアッセイすることができ、こうした手法には、マーカー遺伝子の評価（緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）アッセイ（例えば、ウイルスは、ＧＦＰをコードするヌクレオチド配列を含む）などであり、ＧＦＰアッセイでは、ウイルス粒子が感染した細胞においてＧＦＰが産生し、検出及び／または測定される）、あるいは産生タンパク質の測定（例えば、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によるもの）が含まれる。ウイルスの感染力は、総ウイルス粒子に対する感染性ウイルス粒子の比率として示すことができる。総ウイルス粒子に対する感染性ウイルス粒子の比率の決定方法は、当該技術分野において知られている。例えば、Ｇｒａｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１１：Ｓ３３７（ＴＣＩＤ５０感染力価アッセイについて記載される）、及びＺｏｌｏｔｕｋｈｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．６：９７３を参照のこと。

【0014】

「複製能力を有する」ウイルス（例えば、複製能力を有するＡＡＶ）は、感染性であり、それに加えて、感染細胞において複製される能力も有する（すなわち、ヘルパーウイルスまたはヘルパーウイルス機能が存在する場合）、表現型的に野生型のウイルスを指す。ＡＡＶの場合、複製能力を有するには、一般に、機能性のＡＡＶパッケージング遺伝子が存在することが必要である。一般に、本明細書に記載のｒＡＡＶベクターは、１つまたは複数のＡＡＶパッケージング遺伝子を欠いていることから、哺乳類細胞（特に、ヒト細胞）における複製能力を有さない。典型的には、そのようなｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶパッケージング遺伝子と新たなｒＡＡＶベクターとの間の組換えによって複製能力を有するＡＡＶが生じる可能性を最小化するために、いずれのＡＡＶパッケージング遺伝子配列も欠いている。多くの実施形態では、本明細書に記載のｒＡＡＶベクター調製物は、複製能力を有する何らかのＡＡＶ（ｒｃＡＡＶ（ＲＣＡとも称される））が存在するとしても、ほとんど含まないものである（例えば、１０² 個のｒＡＡＶ粒子当たりｒｃＡＡＶが約１個未満であるか、１０⁴ 個のｒＡＡＶ粒子当たりｒｃＡＡＶが約１個未満であるか、１０⁸ 個のｒＡＡＶ粒子当たりｒｃＡＡＶが約１個未満であるか、１０¹²個のｒＡＡＶ粒子当たりｒｃＡＡＶが約１個未満であるか、またはｒｃＡＡＶが存在しない）。

【0015】

「ポリヌクレオチド」という用語は、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドまたはそれらの類似体を含めて、任意の長さのポリマー形態のヌクレオチドを指す。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチド及びヌクレオチド類似体などの改変ヌクレオチドを含み得、非ヌクレオチド要素が割り込んで存在し得る。ヌクレオチド構造に対する改変は、存在するのであれば、ポリマーが構築される前または後に施され得る。本明細書で使用されるポリヌクレオチドという用語は、二本鎖分子及び一本鎖分子を互換的に指す。別段の記載または必要がない限り、本明細書に記載の発明の実施形態でポリヌクレオチドであるものはいずれも、二本鎖形態と、二本鎖形態を構成することが知られるか、または二本鎖形態を構成すると予想される２つの相補一本鎖形態のそれぞれとの両方を包含する。

【0016】

ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、別のポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対してある特定の「配列同一性」パーセントを有し、このことは、アライメントをとって２つの配列を比較すると、その割合の塩基またはアミノ酸が同一であることを意味する。配列類似性は、多くの異なる様式で決定することができる。配列同一性を決定するために、ワールドワイドウェブを介してｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／で利用可能なＢＬＡＳＴを含めて、方法及びコンピュータープログラムを使用して配列のアライメントをとることができる。別のアライメントアルゴリズムはＦＡＳＴＡであり、ＦＡＳＴＡは、Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃの完全所有子会社）から提供されるＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）パッケージにおいて利用可能である。他のアライメント手法は、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２６６：Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ（１９９６），ｅｄ．Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，ａ ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｈａｒｃｏｕｒｔ Ｂｒａｃｅ ＆ Ｃｏ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡに記載されている。配列中にギャップを許容するアライメントプログラムが特に目的とするものである。Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎは、配列アライメントにおいてギャップを許容するアルゴリズムの１つの型である。Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７０：１７３－１８７（１９９７）を参照のこと。また、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈのアライメント方法を使用するＧＡＰプログラムも配列のアライメントに利用することができる。Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３－４５３（１９７０）を参照のこと。

【0017】

配列同一性の決定にＳｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎの局所的相同性アルゴリズムを使用するＢｅｓｔＦｉｔプログラム（Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２：４８２－４８９（１９８１））は目的とするものである。ギャップ生成ペナルティは、一般には、１～５の範囲となり、通常は、２～４の範囲となり、多くの実施形態では、３となる。ギャップ延長ペナルティは、一般には、約０．０１～０．２０の範囲となり、多くの場合、０．１０となる。プログラムは、比較すべき入力配列によって決定されるデフォルトのパラメーターを有する。好ましくは、配列同一性は、プログラムによって決定されるデフォルトのパラメーターを使用して決定される。このプログラムは、Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡから提供されるＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）パッケージからも利用可能である。

【0018】

別の目的プログラムは、ＦａｓｔＤＢアルゴリズムである。ＦａｓｔＤＢは、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．１２７－１４９，１９８８，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃにおいて説明されている。配列同一性パーセントは、下記のパラメーターに基づいてＦａｓｔＤＢによって計算される.

【0019】

不一致ペナルティ：１．００、ギャップペナルティ：１．００、ギャップサイズペナルティ：０．３３、及び連結ペナルティ：３０．０。

【0020】

「遺伝子」は、少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含み、転写及び翻訳された後の特定のタンパク質をコードする能力を有するポリヌクレオチドを指す。

【0021】

本明細書で使用される「ガイドＲＮＡ」という用語は、ｉ）ガイドＲＮＡ依存性エンドヌクレアーゼ（例えば、クラス２のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（ＩＩ型、Ｖ型、またはＶＩ型のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼなど））に結合し、ＲＮＡ依存性エンドヌクレアーゼを活性化する「アクチベーター」ヌクレオチド配列と、ｉｉ）標的核酸とハイブリッド形成するヌクレオチド配列を含む「ターゲッター」ヌクレオチド配列とを含むＲＮＡを指す。「アクチベーター」ヌクレオチド配列と「ターゲッター」ヌクレオチド配列とは、別々のＲＮＡ分子（例えば、「デュアルガイドＲＮＡ」）に存在し得るか、または同一のＲＮＡ分子（シングルガイドＲＮＡ）に存在し得る。

【0022】

「低分子干渉（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ）ＲＮＡ」または「短分子干渉（ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ）ＲＮＡ」またはｓｉＲＮＡは、目的遺伝子（「標的遺伝子」）に標的化されたＲＮＡ二重鎖のヌクレオチドである。「ＲＮＡ二重鎖」は、１つのＲＮＡ分子の２つの領域の間で相補的な対ができることよって形成される構造を指す。ｓｉＲＮＡは、そのｓｉＲＮＡの二重鎖部分のヌクレオチド配列が、標的とする遺伝子のヌクレオチド配列に相補的であるという点において、遺伝子に「標的化」されている。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡの二重鎖は、３０個未満のヌクレオチドの長さを有する。いくつかの実施形態では、二重鎖は、２９個のヌクレオチド、２８個のヌクレオチド、２７個のヌクレオチド、２６個のヌクレオチド、２５個のヌクレオチド、２４個のヌクレオチド、２３個のヌクレオチド、２２個のヌクレオチド、２１個のヌクレオチド、２０個のヌクレオチド、１９個のヌクレオチド、１８個のヌクレオチド、１７個のヌクレオチド、１６個のヌクレオチド、１５個のヌクレオチド、１４個のヌクレオチド、１３個のヌクレオチド、１２個のヌクレオチド、１１個のヌクレオチド、または１０個のヌクレオチドの長さを有し得る。いくつかの実施形態では、二重鎖は、１９～２５個のヌクレオチドの長さを有する。ｓｉＲＮＡのＲＮＡ二重鎖部分は、ヘアピン構造の一部であり得る。ヘアピン構造は、二重鎖部分に加えて、二重鎖を形成する２つの配列の間に位置するループ部分を含み得る。ループの長さは異なり得る。いくつかの実施形態では、ループは、５つのヌクレオチド、６つのヌクレオチド、７つのヌクレオチド、８つのヌクレオチド、９つのヌクレオチド、１０個のヌクレオチド、１１個のヌクレオチド、１２個のヌクレオチド、または１３個のヌクレオチドの長さを有する。ヘアピン構造は、３’または５’にオーバーハング部分も含み得る。いくつかの実施形態では、オーバーハングは、３’または５’のオーバーハングであり、０個のヌクレオチド、１つのヌクレオチド、２つのヌクレオチド、３つのヌクレオチド、４つのヌクレオチド、または５つのヌクレオチドの長さを有する。

【0023】

本明細書で使用される「マイクロＲＮＡ」という用語は、任意の型の干渉ＲＮＡを指し、こうした干渉ＲＮＡには、限定はされないが、内在性のマイクロＲＮＡ及び人工的なマイクロＲＮＡ（例えば、合成ｍｉＲＮＡ）が含まれる。内在性のマイクロＲＮＡは、ゲノムに天然にコードされ、ｍＲＮＡの生産的な利用を調節する能力を有する低分子ＲＮＡである。人工的なマイクロＲＮＡは、内在性のマイクロＲＮＡ以外の任意の型のＲＮＡ配列であって、ｍＲＮＡの活性を調節する能力を有するＲＮＡ配列であり得る。マイクロＲＮＡ配列は、こうした配列のいずれか１つまたは複数から構成されるＲＮＡ分子であり得る。マイクロＲＮＡ（または「ｍｉＲＮＡ」）配列は、Ｌｉｍ，ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１７，９９１－１００８、Ｌｉｍ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９９，１５４０，Ｌｅｅ ａｎｄ Ａｍｂｒｏｓｅ，２００１，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９４，８６２、Ｌａｕ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９４，８５８－８６１、Ｌａｇｏｓ－Ｑｕｉｎｔａｎａ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１２，７３５－７３９、Ｌａｇｏｓ－Ｑｕｉｎｔａｎａ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９４，８５３－８５７、及びＬａｇｏｓ－Ｑｕｉｎｔａｎａ ｅｔ ａｌ．，２００３，ＲＮＡ，９，１７５－１７９などの刊行物において説明されている。マイクロＲＮＡの例には、より大きなＲＮＡの断片である任意のＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｔＲＮＡ、ｓｎｃＲＮＡ、ｔｎｃＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｍＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｎＲＮＡもしくは他の非コード低分子ＲＮＡである任意のＲＮＡが含まれる。例えば、米国特許出願第２００５０２７２９２３号、第２００５０２６６５５２号、第２００５０１４２５８１号、及び第２００５００７５４９２号を参照のこと。「マイクロＲＮＡ前駆体」（または「プレｍｉＲＮＡ」）は、そこに組み込まれたマイクロＲＮＡ配列を有するステムループ構造を有する核酸を指す。「成熟マイクロＲＮＡ」（または「成熟ｍｉＲＮＡ」）には、マイクロＲＮＡ前駆体（「プレｍｉＲＮＡ」）から切断されたマイクロＲＮＡ、または合成されたマイクロＲＮＡ（例えば、無細胞系によって実験室で合成されたもの）が含まれ、こうしたマイクロＲＮＡの長さは、約１９個のヌクレオチド～約２７個のヌクレオチドであり、例えば、成熟マイクロＲＮＡの長さは、１９ｎｔ、２０ｎｔ、２１ｎｔ、２２ｎｔ、２３ｎｔ、２４ｎｔ、２５ｎｔ、２６ｎｔ、または２７ｎｔであり得る。成熟マイクロＲＮＡは、標的ｍＲＮＡに結合し、その標的ｍＲＮＡの翻訳を阻害することができる。

【0024】

ポリヌクレオチドに適用される「組換え」は、そのポリヌクレオチドが、クローニング、制限段階または核酸連結段階、及び天然に見られるポリヌクレオチドとは異なるコンストラクトが得られる他の手順のさまざまな組み合わせの産物であることを意味する。組換えウイルスは、組換えポリヌクレオチドを含むウイルス粒子である。これらの用語は、それぞれ元のポリヌクレオチドコンストラクトの複製物、及び元のウイルスコンストラクトの子孫を含む。

【0025】

「制御要素」または「制御配列」は、ポリヌクレオチドの複製、二重化、転写、スプライシング、翻訳、または分解を含めて、ポリヌクレオチドの機能的な調節に寄与する分子の相互作用に関与するヌクレオチド配列である。こうした調節は、プロセスの頻度、速度、または特異性に影響し得るものであり、本質的に増進または抑制であり得る。当該技術分野において知られる制御要素には、例えば、転写調節配列（プロモーター及びエンハンサーなど）が含まれる。プロモーターは、ある特定の条件下で、ＲＮＡポリメラーゼと結合し、通常はそのプロモーターの下流（３’方向）に位置するコード領域の転写を開始する能力を有するＤＮＡ領域である。

【0026】

「動作的に連結された（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」または「機能可能なように連結された（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」は、遺伝要素の並置を指し、こうした要素は、予測される様式でそれらが機能することが可能になる関係性にある。例えば、プロモーターは、そのプロモーターがコード配列の転写開始に役立つのであれば、そのコード領域に動作的に連結されている。この機能関係が維持される限り、プロモーターとコード領域との間に介在残基が存在してもよい。

【0027】

「発現ベクター」は、目的ポリペプチドをコードする領域を含むベクターであり、意図される標的細胞におけるタンパク質の発現を生じさせるために使用される。標的におけるタンパク質の発現を促進するために、発現ベクターもまた、コード領域に動作的に連結された制御要素を含む。制御要素と、発現のために制御要素が機能可能なように連結される１つまたは複数の遺伝子との組み合わせは、「発現カセット」と称されることがあり、その多くが知られており、当該技術分野において利用可能であるか、または当該技術分野において利用可能な要素から容易に構築することができる。

【0028】

「異種」は、それが比較される実体のその他の部分のものとは遺伝子型が異なる実体に由来することを意味する。例えば、異なる種に由来するプラスミドまたはベクターに遺伝子工学手法によって導入されたポリヌクレオチドは、異種ポリヌクレオチドである。その天然のコード配列から取り出され、それが天然に連結状態で見られないコード配列に動作的に連結されたプロモーターは、異種プロモーターである。したがって、例えば、異種遺伝子産物をコードする異種核酸を含むｒＡＡＶは、天然起源の野生型ＡＡＶには通常は含まれない核酸を含むｒＡＡＶであり、コードされる異種遺伝子産物は、天然起源の野生型ＡＡＶによって通常はコードされない遺伝子産物である。別の例として、カプシドタンパク質のＧＨループに挿入された異種ペプチドを含む変異ＡＡＶカプシドタンパク質は、天然起源の野生型ＡＡＶには通常は含まれないペプチド挿入断片を含む変異ＡＡＶカプシドタンパク質である。

【0029】

「遺伝子改変（ｇｅｎｅｔｉｃ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ）」及び「遺伝子改変（ｇｅｎｅｔｉｃ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」という用語（ならびにそれらの文法的異形）は、遺伝要素（例えば、ポリヌクレオチド）が有糸分裂または減数分裂以外によって細胞に導入されるプロセスを指すために本明細書で互換的に使用される。こうした要素は、細胞に対して異種であり得るか、または細胞に既に存在する要素の追加コピーもしくは改善バージョンであり得る。遺伝子改変は、例えば、当該技術分野において知られる任意のプロセスを介して組換えプラスミドまたは他のポリヌクレオチドで細胞に遺伝子導入することによって生じ得、こうしたプロセスは、電気穿孔、リン酸カルシウム沈殿、またはポリヌクレオチド－リポソーム複合体との接触などである。遺伝子改変は、例えば、ＤＮＡウイルスもしくはＲＮＡウイルスまたはウイルスベクターでの形質導入または感染によっても生じ得る。遺伝要素は、細胞の染色体またはミニ染色体に導入されることが一般的であるが、細胞及びその子孫の表現型及び／または遺伝子型が変わる改変はいずれも、この用語に含まれる。

【0030】

細胞をインビトロで長期培養する間、遺伝子配列がその機能の発揮に利用可能であるならば、その細胞は、その配列で「安定的に」改変、形質導入、遺伝子改変、または形質転換されていると言われる。一般に、そのような細胞は、その改変細胞の子孫にも遺伝可能な遺伝子改変が導入されているという点において、「遺伝的」に改変（遺伝子改変）されている。

【0031】

「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すために本明細書で互換的に使用される。これらの用語は、改変されたアミノ酸ポリマーも包含し、こうした改変は、例えば、ジスルフィド結合形成、糖鎖付加、脂質付加、リン酸化、または標識要素との複合化である。抗血管新生ポリペプチド、神経保護ポリペプチド、及び同様のものなどのポリペプチドは、哺乳類対象への遺伝子産物の送達という文脈、及びその組成物において述べられるとき、それぞれのインタクトなポリペプチド、またはインタクトなタンパク質の所望の生化学的機能を保持するその任意の断片もしくは遺伝子操作された誘導体を指す。同様に、抗血管新生ポリペプチドをコードする核酸、神経保護ポリペプチドをコードする核酸、及び哺乳類対象への遺伝子産物の送達において使用するための他のそのような核酸（レシピエント細胞に送達されるべき「導入遺伝子」と称され得る）に対する参照は、インタクトなポリペプチドまたは所望の生化学的機能を有する任意の断片もしくは遺伝子操作された誘導体をコードするポリヌクレオチドを含む。

【0032】

「単離された」プラスミド、核酸、ベクター、ウイルス、ビリオン、宿主細胞、または他の物質は、その物質もしくは類似の物質が天然に生じる場所、またはその最初の調製起源の場所にも存在し得る他の成分の少なくともいくつかが含まれないようにした、その物質の調製物を指す。したがって、例えば、単離された物質は、供給源の混合物からそれを濃縮するための精製手法を使用して調製され得る。濃縮は、溶液の体積当たりの重量などの絶対的基準に基づいて測定することができるか、または供給源の混合物に存在し、干渉する可能性を有する第２の物質と関連付けて測定することができる。本発明の実施形態の濃縮が進むと、単離がより一層進む。単離されたプラスミド、核酸、ベクター、ウイルス、宿主細胞、または他の物質は、精製された実施形態のいくつかでは、例えば、純度が約８０％～約９０％、純度が少なくとも約９０％、純度が少なくとも約９５％、純度が少なくとも約９８％、または純度が少なくとも約９９％以上である。

【0033】

本明細書で使用される「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」、「治療（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」という用語、及び同様のものは、所望の薬理的及び／または生理学的作用を得ることを指す。こうした作用は、疾患もしくはその症状を完全もしくは部分的に予防するという観点から予防的であり得、及び／または疾患及び／または疾患に起因する有害作用を部分的もしくは完全に治癒させるという観点から治療的であり得る。本明細書で使用される「治療（Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、哺乳類、具体的にはヒトにおける疾患の任意の治療を包含し、（ａ）疾患に罹り易くあるか、または疾患を患うリスクがあり得るが、疾患を有するとはまだ診断されていない対象における疾患の発症予防と、（ｂ）疾患の抑制、すなわちその発症の抑止と、（ｃ）疾患の軽減、すなわち疾患の退縮誘起とを含む。

【0034】

「個体」、「宿主」、「対象」、及び「患者」という用語は、本明細書で互換的に使用され、哺乳類を指し、こうした哺乳類には、限定はされないが、ヒト及び非ヒト霊長類（サル及びヒトを含む）、哺乳類の運動競技動物（例えば、ウマ、ラクダなど）、哺乳類の家畜（例えば、ヒツジ、ヤギ、雌ウシなど）、哺乳類のペット（イヌ、ネコなど）、ならびにげっ歯類（例えば、マウス、ラットなど）が含まれる。場合によっては、個体は、ヒトである。

【0035】

本発明の追加説明の前に、本発明は、記載される特定の実施形態に限定されず、したがって、こうした実施形態は、当然異なり得ると理解されることになる。本明細書で使用される専門用語は、特定の実施形態の説明のみを目的としており、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることになるため、本明細書で使用される専門用語による限定は意図されないとも理解されることになる。

【0036】

値の範囲が与えられる場合、文脈上明確に示されない限り、その範囲の上限値と下限値との間に存在する、下限値の１０分の１の単位までの各介在値と、その記載範囲の任意の他の記載値または介在値と、が本発明に包含されると理解される。こうしたより小さな範囲の上限値及び下限値は、そのより小さな範囲に独立して含まれ得るものであり、こうした上限値及び下限値もまた、本発明に包含され、記載範囲において具体的に除外される任意の限界値の対象になる。記載範囲が限界値の１つまたは両方を含む場合、そうした含まれる限界値のどちらか一方または両方を除外した範囲もまた、本発明に含まれる。

【0037】

別段の定義がない限り、本明細書で使用される専門用語及び科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味と同一の意味を有する。本発明の実施または試験においては、本明細書に記載のものと同様または同等の任意の方法及び材料を使用することもできるが、ここでは、好ましい方法及び材料が記載される。本明細書で言及される刊行物はすべて、その刊行物が関連付けて引用される方法及び／または材料を開示及び説明するために、参照によって本明細書に組み込まれる。

【0038】

文脈上明確に示されない限り、本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」という単数形は、複数の参照対象を含むことに留意されなくてはならない。したがって、例えば、「ＡＡＶカプシド」に対する参照は、複数のそのようなカプシドを含み、「ＡＡＶビリオン」に対する参照は、１つまたは複数のＡＡＶビリオン、及び当業者に知られるその同等形態に対する参照を含むなどである。特許請求の範囲は、任意選択の要素はいずれも除外して起草され得ることにさらに留意されたい。したがって、この記載は、請求要素の記載と関連する「単に」、「のみ」、及び同様のものなどの排他的用語の使用、または「負の」限定の使用のための先行的根拠として働くことが意図される。

【0039】

本発明のある特定の特徴は、明確化するために別々の実施形態と関連して記載されるが、単一の実施形態において組み合わせても提供され得ると理解される。逆に、本発明のさまざまな特徴は、簡略化するために単一の実施形態と関連して記載されるが、別々に提供されるか、または任意の適切な部分的な組み合わせにおいても提供され得る。本発明に関する実施形態の組み合わせはすべて、本発明によって明確に包含され、それぞれ及びあらゆる組み合わせが個別かつ明示的に開示される場合と同様に本明細書に開示される。さらに、さまざまな実施形態及びそれらの要素の部分的な組み合わせもすべて、本発明によって明確に包含され、それぞれ及びあらゆるそのような部分的な組み合わせが個別かつ明示的に本明細書に開示される場合と同様に本明細書に開示される。

【0040】

本明細書で議論される刊行物は、単に、本出願の出願日より前にその開示内容が提供されているにすぎない。先行発明であるという理由によって本発明がそのような刊行物に先行する権利を有さないことを承認するものとして本明細書の記載内容が解釈されることには全くならない。さらに、提供される刊行物の日付は実際の刊行日とは異なり得るものであり、実際の刊行日は個別に確認する必要があり得る。

【0041】

本開示は、改変カプシドタンパク質を有する組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ビリオンを提供し、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ビリオンは、野生型ＡＡＶと比較して、網膜細胞に対して高い感染力を示し、ｒＡＡＶビリオンは、異種核酸を含む。ｒＡＡＶビリオンは、網膜細胞に対する対応する野生型ＡＡＶの感染力と比較して、網膜細胞に対して高い感染力を示す。網膜細胞は、光受容体（例えば、杆体、錐体）、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）、ミュラー細胞（ミュラーグリア細胞）、アストロサイト（例えば、網膜アストロサイト）、双極細胞、アマクリン細胞、水平細胞、または網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞であり得る。本開示は、個体の網膜細胞への遺伝子産物の送達方法、及び眼疾患の治療方法をさらに提供する。本開示は、改変カプシドタンパク質を有するｒＡＡＶビリオンを提供し、内顆粒層、外顆粒層、光受容体層、神経節細胞層、及び網膜色素上皮のうちの１つまたは複数に対してｒＡＡＶビリオンが示す局在性は、内顆粒層、外顆粒層、光受容体層、神経節細胞層、または網膜色素上皮に対する対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによる局在性度合と比較して、少なくとも５倍増加しており、ｒＡＡＶビリオンは、異種核酸を含む。

【0042】

変異ＡＡＶカプシドポリペプチド
本開示は、変異ＡＡＶカプシドタンパク質を提供する。本開示の変異ＡＡＶカプシドタンパク質は、親ＡＡＶカプシドタンパク質の表面露出（例えば、溶媒露出）部分における挿入部位に５つのアミノ酸～２０個のアミノ酸の長さの異種ペプチド挿入断片を含み、その結果、変異カプシドタンパク質は、ＡＡＶビリオンに存在するとき、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによる網膜細胞に対する感染力と比較して、網膜細胞に対する感染力を増加させる。他の場合では、網膜細胞は、ミュラー細胞である。他の網膜細胞には、アマクリン細胞、双極細胞、及び水平細胞が含まれる。「約５つのアミノ酸～約２０個のアミノ酸の挿入断片」は、本明細書ではペプチド挿入断片（例えば、異種ペプチド挿入断片）とも称される。「対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質」は、ペプチド挿入断片を含まない同一のＡＡＶ血清型のＡＡＶカプシドタンパク質を指す。多くの場合、変異ＡＡＶカプシドは、５つのアミノ酸～２０個のアミノ酸（例えば、５つ～７つ、７つ～１０個、１０個～１２個、１２個～１５個、または１５個～２０個のアミノ酸）の長さの単一の異種ペプチド挿入断片を含む。

【0043】

挿入部位は、ＡＡＶカプシドタンパク質のＧＨループまたはループＩＶに位置し、例えば、ＡＡＶカプシドタンパク質のＧＨループまたはループＩＶの溶媒露出部分に位置する。ＡＡＶカプシドのＧＨループ／ループＩＶについては、例えば、ｖａｎ Ｖｌｉｅｔ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１４：８０９、Ｐａｄｒｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９：５０４７、及びＳｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１５：１９５５を参照のこと。例えば、挿入部位は、図６Ａ～６Ｃに示されるＡＡＶカプシドタンパク質のアミノ酸４１１～６５０の間であり得る。例えば、挿入部位は、図５に示される、ＡＡＶ２のアミノ酸５７０～６１１の間、ＡＡＶ１のアミノ酸５７１～６１２の間、ＡＡＶ５のアミノ酸５６０～６０１の間、ＡＡＶ６のアミノ酸５７１～６１２の間、ＡＡＶ７のアミノ酸５７２～６１３の間、ＡＡＶ８のアミノ酸５７３～６１４の間、ＡＡＶ９のアミノ酸５７１～６１２の間、またはＡＡＶ１０のアミノ酸５７３～６１４の間であり得る。場合によっては、挿入部位は、ＡＡＶ２のカプシドタンパク質のアミノ酸５８８とアミノ酸５８９との間であるか、または異なる血清型のＡＡＶにおける対応する挿入部位である。場合によっては、挿入部位は、ＡＡＶ２のカプシドタンパク質のアミノ酸５８７とアミノ酸５８８との間であるか、または異なる血清型のＡＡＶにおける対応する挿入部位である。

【0044】

場合によっては、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質と比較して、約５つのアミノ酸～約２０個のアミノ酸（例えば、５つ～７つ、７つ～１０個、１０個～１２個、１２個～１５個、または１５個～２０個のアミノ酸）の長さの異種ペプチドが、カプシドタンパク質のＧＨループまたはループＩＶの挿入部位に挿入される。例えば、挿入部位は、ＡＡＶ２のアミノ酸５８７とアミノ酸５８８との間であるか、または別のＡＡＶ血清型のカプシドサブユニットの対応位置であり得る。挿入部位５８７／５８８は、ＡＡＶ２のカプシドタンパク質に基づくものであることに留意されるべきである。５つのアミノ酸～約２０個のアミノ酸（例えば、５つ～７つ、７つ～１０個、１０個～１２個、１２個～１５個、または１５個～２０個のアミノ酸）の長さの異種ペプチドが、ＡＡＶ２以外のＡＡＶ血清型（例えば、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９など）の対応部位に挿入され得る。さまざまなＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質のアミノ酸配列の比較に基づけば、「ＡＡＶ２のアミノ酸５８７～５８８に対応する」挿入部位が任意の所与のＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質のどこに位置することになるのかを当業者であれば分かるであろう。さまざまなＡＡＶ血清型における、ＡＡＶ２のカプシドタンパク質ＶＰ１のアミノ酸５７０～６１１（図４を参照のこと）に対応する配列が図５に示される。例えば、ＡＡＶ１についてはＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿０４９５４２、ＡＡＶ５についてはＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＤ１３７５６、ＡＡＶ６についてはＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＢ９５４５９、ＡＡＶ７についてはＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＹＰ＿０７７１７８、ＡＡＶ８についてはＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＹＰ＿０７７１８０、ＡＡＶ９についてはＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＳ９９２６４、及びＡＡＶ１０についてはＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＴ４６３３７を参照のこと。

【0045】

例えば、挿入部位は、ＡＡＶ２のアミノ酸５８７とアミノ酸５８８との間、ＡＡＶ１のアミノ酸５９０とアミノ酸５９１との間、ＡＡＶ５のアミノ酸５７５とアミノ酸５７６との間、ＡＡＶ６のアミノ酸５９０とアミノ酸５９１との間、ＡＡＶ７のアミノ酸５８９とアミノ酸５９０との間、ＡＡＶ８のアミノ酸５９０とアミノ酸５９１との間、ＡＡＶ９のアミノ酸５８８とアミノ酸５８９との間、またはＡＡＶ１０のアミノ酸５８８とアミノ酸５８９との間であり得る。挿入部位は、図５において下線付きで示され、アミノ酸の番号付けは、図５に示される番号付けに基づく。

【0046】

いくつかの実施形態では、対象カプシドタンパク質は、図６Ａ～６Ｃに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、５つ～２０個のアミノ酸（例えば、５つ～７つ、７つ～１０個、１０個～１２個、１２個～１５個、または１５個～２０個のアミノ酸）の長さの異種ペプチド挿入断片を有するＧＨループを含む。

【0047】

挿入ペプチド
上記のように、約５つのアミノ酸～約２０個のアミノ酸の長さの異種ペプチドが、ＡＡＶカプシドのＧＨループに挿入される。場合によっては、挿入ペプチドは、５つのアミノ酸～２０個のアミノ酸の長さを有する。場合によっては、挿入ペプチドは、７つのアミノ酸～１５個のアミノ酸の長さを有する。場合によっては、挿入ペプチドは、９つのアミノ酸～１５個のアミノ酸の長さを有する。場合によっては、挿入ペプチドは、９つのアミノ酸～１２個のアミノ酸の長さを有する。挿入ペプチドは、５つのアミノ酸、６つのアミノ酸、７つのアミノ酸、８つのアミノ酸、９つのアミノ酸、１０個のアミノ酸、１１個のアミノ酸、１２個のアミノ酸、１３個のアミノ酸、１４個のアミノ酸、１５個のアミノ酸、１６個のアミノ酸、１７個のアミノ酸、１８個のアミノ酸、１９個のアミノ酸、または２０個のアミノ酸の長さを有する。場合によっては、挿入ペプチドは、７つのアミノ酸の長さを有する。場合によっては、挿入ペプチドは、８つのアミノ酸の長さを有する。場合によっては、挿入ペプチドは、９つのアミノ酸の長さを有する。場合によっては、挿入ペプチドは、１０個のアミノ酸の長さを有する。場合によっては、挿入ペプチドは、１１個のアミノ酸の長さを有する。場合によっては、挿入ペプチドは、１２個のアミノ酸の長さを有する。場合によっては、挿入ペプチドは、１３個のアミノ酸の長さを有する。場合によっては、挿入ペプチドは、１４個のアミノ酸の長さを有する。場合によっては、挿入ペプチドは、１５個のアミノ酸の長さを有する。

【0048】

ペプチド挿入断片は、場合によっては、式Ｉ：Ｘ₁ Ｘ₂ Ｘ₃ Ｘ₄ Ｘ₅ Ｘ₆ Ｘ₇ Ｘ₈ Ｘ₉ Ｘ₁₀のペプチドであって、式中、Ｘ₁ が、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、またはＧｌｎであり、Ｘ₂ が、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、またはＶａｌであり、Ｘ₃ が、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ、Ａｒｇ、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、またはＴｙｒであり、Ｘ₄ が、存在するのであれば、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、またはＡｒｇであり、Ｘ₅ が、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、またはＴｙｒであり、Ｘ₆ が、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ、またはＩｌｅであり、Ｘ₇ が、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、またはＣｙｓであり、Ｘ₈ が、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｉｌｅ、またはＡｓｎであり、Ｘ₉ が、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、またはＡｌａであり、Ｘ₁₀が、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ａｓｐ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、またはＭｅｔである。

【0049】

式Ｉのペプチド挿入断片には、限定はされないが、（１）ＬＡＫＤＡＴＫＮＡ（配列番号４７）、（２）ＰＡＨＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号４８）、（３）ＬＡＨＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号４９）、（４）ＬＡＴＴＳＱＮＫＰＡ（配列番号５０）、（５）ＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡ（配列番号５１）、（６）ＩＡＲＧＶＡＰＳＳＡ（配列番号５２）、（７）ＬＡＰＤＳＴＴＲＳＡ（配列番号５３）、（８）ＬＡＫＧＴＥＬＫＰＡ（配列番号５４）、（９）ＬＡＩＩＤＡＴＫＮＡ（配列番号５５）、（１０）ＬＡＶＤＧＡＱＲＳＡ（配列番号５６）、（１１）ＰＡＰＱＤＴＴＫＫＡ（配列番号５７）、（１２）ＬＰＨＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号５８）、（１３）ＬＡＫＤＡＴＫＴＩＡ（配列番号５９）、（１４）ＬＡＫＱＱＳＡＳＴＡ（配列番号６０）、（１５）ＬＡＫＳＤＱＳＫＰＡ（配列番号６１）、（１６）ＬＳＨＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号６２）、（１７）ＬＡＡＮＱＰＳＫＰＡ（配列番号６３）、（１８）ＬＡＶＳＤＳＴＫＡＡ（配列番号６４）、（１９）ＬＡＡＱＧＴＡＫＫＰＡ（配列番号６５）、（２０）ＬＡＰＤＱＴＴＲＮＡ（配列番号６６）、（２１）ＬＡＡＳＤＳＴＫＡＡ（配列番号６７）、（２２）ＬＡＰＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号６８）、（２３）ＬＡＫＡＤＥＴＲＰＡ（配列番号６９）、（２４）ＬＡＨＱＤＴＡＫＮＡ（配列番号７０）、（２５）ＬＡＨＱＤＴＫＫＮＡ（配列番号７１）、（２６）ＬＡＨＱＤＴＴＫＨＡ（配列番号７２）、（２７）ＬＡＨＱＤＴＴＫＫＡ（配列番号７３）、（２８）ＬＡＨＱＤＴＴＲＮＡ（配列番号７４）、（２９）ＬＡＨＱＤＴＴＮＡ（配列番号７５）、（３０）ＬＡＨＱＧＴＴＫＮＡ（配列番号７６）、（３１）ＬＡＨＱＶＴＴＫＮＡ（配列番号７７）、（３２）ＬＡＩＳＤＱＳＫＰＡ（配列番号７８）、（３３）ＬＡＤＡＴＫＴＡ（配列番号７９）、（３４）ＬＡＫＤＴＴＫＮＡ（配列番号８０）、（３５）ＬＡＫＳＤＱＳＲＰＡ（配列番号８１）、（３６）ＬＡＰＱＤＴＫＫＮＡ（配列番号８２）、（３７）ＬＡＴＳＤＳＴＫＡＡ（配列番号８３）、（３８）ＬＡＶＤＧＳＱＲＳＡ（配列番号８４）、（３９）ＬＰＩＳＤＱＴＫＨＡ（配列番号８５）、（４０）ＬＰＫＤＡＴＫＴＩＡ（配列番号８６）、（４１）ＬＰＰＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号８７）、（４２）ＰＡＰＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号８８）、（４３）ＱＡＨＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号８９）、（４４）ＬＡＨＥＴＳＰＲＰＡ（配列番号９０）、（４５）ＬＡＫＳＴＳＴＡＰＡ（配列番号９１）、（４６）ＬＡＤＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号９２）、（４７）ＬＡＥＳＤＱＳＫＰＡ（配列番号９３）、（４８）ＬＡＨＫＤＴＴＫＮＡ（配列番号９４）、（４９）ＬＡＨＫＴＱＱＫＭ（配列番号９５）、（５０）ＬＡＨＱＤＴＴＥＮＡ（配列番号９６）、（５１）ＬＡＨＱＤＴＴＩＮＡ（配列番号９７）、（５２）ＬＡＨＱＤＴＴＫＫＴ（配列番号９８）、（５３）ＬＡＨＱＤＴＴＫＮＤ（配列番号９９）、（５４）ＬＡＨＱＤＴＴＫＮＴ（配列番号１００）、（５５）ＬＡＨＱＤＴＴＫＮＶ（配列番号１０１）、（５６）ＬＡＨＱＤＴＴＫＴＭ（配列番号１０２）、（５７）ＬＡＨＱＮＴＴＫＮＡ（配列番号１０３）、（５８）ＬＡＨＲＤＴＴＫＮＡ（配列番号１０４）、（５９）ＬＡＩＳＤＱＴＮＨＡ（配列番号１０５）、（６０）ＬＡＫＱＫＳＡＳＴＡ（配列番号１０６）、（６１）ＬＡＫＳＤＱＣＫＰＡ（配列番号１０７）、（６２）ＬＡＫＳＤＱＳＫＰＤ（配列番号１０８）、（６３）ＬＡＫＳＤＱＳＮＰＡ（配列番号１０９）、（６４）ＬＡＫＳＹＱＳＫＰＡ（配列番号１１０）、（６５）ＬＡＮＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号１１１）、（６６）ＬＡＰＱＮＴＴＫＮＡ（配列番号１１２）、（６７）ＬＡＰＳＳＩＱＫＰＡ（配列番号１１３）、（６８）ＬＡＱＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号１１４）、（６９）ＬＡＹＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号１１５）、（７０）ＬＤＨＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号１１６）、（７１）ＬＤＨＱＤＴＴＫＳＡ（配列番号１１７）、（７２）ＬＧＨＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号１１８）、（７３）ＬＰＨＱＤＴＴＫＮＤ（配列番号１１９）、（７４）ＬＰＨＱＤＴＴＫＮＴ（配列番号１２０）、（７５）ＬＰＨＱＤＴＴＮＮＡ（配列番号１２１）、（７６）ＬＴＨＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号１２２）、（７７）ＬＴＫＤＡＴＫＴＩＡ（配列番号１２３）、（７８）ＬＴＰＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号１２４）、及び（７９）ＬＶＨＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号１２５）が含まれる。

【0050】

ペプチド挿入断片は、場合によっては、式ＩＩ：Ｘ₁ Ｘ₂ Ｘ₃ Ｘ₄ Ｘ₅ Ｘ₆ Ｘ₇ Ｘ₈ Ｘ₉ Ｘ₁₀のペプチドであって、式中、Ｘ₁ が、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、またはＰｒｏであり、Ｘ₂ が、Ａｌａ、Ｐｒｏ、またはＳｅｒであり、Ｘ₃ が、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ、Ａｒｇ、またはＡｌａであり、Ｘ₄ が、存在するのであれば、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、またはＡｓｎであり、Ｘ₅ が、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、またはＡｌａであり、Ｘ₆ が、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、またはＰｒｏであり、Ｘ₇ が、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、またはＡｌａであり、Ｘ₈ が、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、またはＴｈｒであり、Ｘ₉ が、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、またはＡｌａであり、Ｘ₁₀が、Ａｌａである。

【0051】

式ＩＩのペプチド挿入断片には、限定はされないが、（１）ＬＡＫＤＡＴＫＮＡ（配列番号４７）、（２）ＰＡＨＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号４８）、（３）ＬＡＨＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号４９）、（４）ＬＡＴＴＳＱＮＫＰＡ（配列番号５０）、（５）ＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡ（配列番号５１）、（６）ＩＡＲＧＶＡＰＳＳＡ（配列番号５２）、（７）ＬＡＰＤＳＴＴＲＳＡ（配列番号５３）、（８）ＬＡＫＧＴＥＬＫＰＡ（配列番号５４）、（９）ＬＡＩＩＤＡＴＫＮＡ（配列番号５５）、（１０）ＬＡＶＤＧＡＱＲＳＡ（配列番号５６）、（１１）ＰＡＰＱＤＴＴＫＫＡ（配列番号５７）、（１２）ＬＰＨＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号５８）、（１３）ＬＡＫＤＡＴＫＴＩＡ（配列番号５９）、（１４）ＬＡＫＱＱＳＡＳＴＡ（配列番号６０）、（１５）ＬＡＫＳＤＱＳＫＰＡ（配列番号６１）、（１６）ＬＳＨＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号６２）、（１７）ＬＡＡＮＱＰＳＫＰＡ（配列番号６３）、（１８）ＬＡＶＳＤＳＴＫＡＡ（配列番号６４）、（１９）ＬＡＡＱＧＴＡＫＫＰＡ（配列番号６５）、（２０）ＬＡＰＤＱＴＴＲＮＡ（配列番号６６）、（２１）ＬＡＡＳＤＳＴＫＡＡ（配列番号６７）、（２２）ＬＡＰＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号６８）、（２３）ＬＡＫＡＤＥＴＲＰＡ（配列番号６９）、（２４）ＬＡＨＱＤＴＡＫＮＡ（配列番号７０）、（２５）ＬＡＨＱＤＴＫＫＮＡ（配列番号７１）、（２６）ＬＡＨＱＤＴＴＫＨＡ（配列番号７２）、（２７）ＬＡＨＱＤＴＴＫＫＡ（配列番号７３）、（２８）ＬＡＨＱＤＴＴＲＮＡ（配列番号７４）、（２９）ＬＡＨＱＤＴＴＮＡ（配列番号７５）、（３０）ＬＡＨＱＧＴＴＫＮＡ（配列番号７６）、（３１）ＬＡＨＱＶＴＴＫＮＡ（配列番号７７）、（３２）ＬＡＩＳＤＱＳＫＰＡ（配列番号７８）、（３３）ＬＡＤＡＴＫＴＡ（配列番号７９）、（３４）ＬＡＫＤＴＴＫＮＡ（配列番号８０）、（３５）ＬＡＫＳＤＱＳＲＰＡ（配列番号８１）、（３６）ＬＡＰＱＤＴＫＫＮＡ（配列番号８２）、（３７）ＬＡＴＳＤＳＴＫＡＡ（配列番号８３）、（３８）ＬＡＶＤＧＳＱＲＳＡ（配列番号８４）、（３９）ＬＰＩＳＤＱＴＫＨＡ（配列番号８５）、（４０）ＬＰＫＤＡＴＫＴＩＡ（配列番号８６）、（４１）ＬＰＰＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号８７）、及び（４２）ＰＡＰＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号８８）が含まれる。

【0052】

式ＩＩのペプチドには、限定はされないが、（１）ＬＡＫＤＡＴＫＮＡ（配列番号４７）、（２）ＰＡＨＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号４８）、（３）ＬＡＨＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号４９）、（４）ＬＡＴＴＳＱＮＫＰＡ（配列番号５０）、（５）ＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡ（配列番号５１）、（６）ＩＡＲＧＶＡＰＳＳＡ（配列番号５２）、（７）ＬＡＰＤＳＴＴＲＳＡ（配列番号５３）、（８）ＬＡＫＧＴＥＬＫＰＡ（配列番号５４）、（９）ＬＡＩＩＤＡＴＫＮＡ（配列番号５５）、（１０）ＬＡＶＤＧＡＱＲＳＡ（配列番号５６）、（１１）ＰＡＰＱＤＴＴＫＫＡ（配列番号５７）、（１２）ＬＰＨＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号５８）、（１３）ＬＡＫＤＡＴＫＴＩＡ（配列番号５９）、（１４）ＬＡＫＱＱＳＡＳＴＡ（配列番号６０）、（１５）ＬＡＫＳＤＱＳＫＰＡ（配列番号６１）、（１６）ＬＳＨＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号６２）、（１７）ＬＡＡＮＱＰＳＫＰＡ（配列番号６３）、及び（１８）ＬＡＶＳＤＳＴＫＡＡ（配列番号６４）が含まれる。場合によっては、ペプチド挿入断片は、（１）ＬＡＫＤＡＴＫＮＡ（配列番号４７）である。場合によっては、ペプチド挿入断片は、（２）ＰＡＨＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号４８）である。場合によっては、ペプチド挿入断片は、（３）ＬＡＨＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号４９）である。場合によっては、ペプチド挿入断片は、（４）ＬＡＴＴＳＱＮＫＰＡ（配列番号５０）である。場合によっては、ペプチド挿入断片は、（５）ＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡ（配列番号５１）である。場合によっては、ペプチド挿入断片は、（６）ＩＡＲＧＶＡＰＳＳＡ（配列番号５２）である。場合によっては、ペプチド挿入断片は、（７）ＬＡＰＤＳＴＴＲＳＡ（配列番号５３）である。場合によっては、ペプチド挿入断片は、（８）ＬＡＫＧＴＥＬＫＰＡ（配列番号５４）である。場合によっては、ペプチド挿入断片は、（９）ＬＡＩＩＤＡＴＫＮＡ（配列番号５５）である。場合によっては、ペプチド挿入断片は、（１０）ＬＡＶＤＧＡＱＲＳＡ（配列番号５６）である。場合によっては、ペプチド挿入断片は、（１１）ＰＡＰＱＤＴＴＫＫＡ（配列番号５７）である。場合によっては、ペプチド挿入断片は、（１２）ＬＰＨＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号５８）である。場合によっては、ペプチド挿入断片は、（１３）ＬＡＫＤＡＴＫＴＩＡ（配列番号５９）である。場合によっては、ペプチド挿入断片は、（１４）ＬＡＫＱＱＳＡＳＴＡ（配列番号６０）である。場合によっては、ペプチド挿入断片は、（１５）ＬＡＫＳＤＱＳＫＰＡ（配列番号６１）である。場合によっては、ペプチド挿入断片は、（１６）ＬＳＨＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号６２）である。場合によっては、ペプチド挿入断片は、（１７）ＬＡＡＮＱＰＳＫＰＡ（配列番号６３）である。場合によっては、ペプチド挿入断片は、（１８）ＬＡＶＳＤＳＴＫＡＡ（配列番号６４）である。

【0053】

ペプチド挿入断片は、場合によっては、式ＩＩＩ：Ｘ₁ Ｘ₂ Ｘ₃ Ｘ₄ Ｘ₅ Ｘ₆ Ｘ₇ Ｘ₈ Ｘ₉ Ｘ₁₀のペプチドであって、式中、Ｘ₁ が、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、またはＰｒｏであり、Ｘ₂ が、Ａｌａ、Ｐｒｏ、またはＳｅｒであり、Ｘ₃ が、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ、Ａｒｇ、またはＡｌａであり、Ｘ₄ が、存在するのであれば、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、またはＡｓｎであり、Ｘ₅ が、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、またはＡｌａであり、Ｘ₆ が、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、またはＰｒｏであり、Ｘ₇ が、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、またはＡｌａであり、Ｘ₈ が、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、またはＴｈｒであり、Ｘ₉ が、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、またはＡｌａであり、Ｘ₁₀が、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｖａｌ、またはＭｅｔである。

【0054】

式ＩＩＩのペプチド挿入断片には、限定はされないが、（１）ＬＡＫＤＡＴＫＮＡ（配列番号４７）、（２）ＰＡＨＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号４８）、（３）ＬＡＨＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号４９）、（６）ＩＡＲＧＶＡＰＳＳＡ（配列番号５２）、（７）ＬＡＰＤＳＴＴＲＳＡ（配列番号５３）、（８）ＬＡＫＧＴＥＬＫＰＡ（配列番号５４）、（９）ＬＡＩＩＤＡＴＫＮＡ（配列番号５５）、（１０）ＬＡＶＤＧＡＱＲＳＡ（配列番号５６）、（１１）ＰＡＰＱＤＴＴＫＫＡ（配列番号５７）、（１２）ＬＰＨＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号５８）、（１３）ＬＡＫＤＡＴＫＴＩＡ（配列番号５９）、（１４）ＬＡＫＱＱＳＡＳＴＡ（配列番号６０）、（１６）ＬＳＨＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号６２）、（１７）ＬＡＡＮＱＰＳＫＰＡ（配列番号６３）、（１８）ＬＡＶＳＤＳＴＫＡＡ（配列番号６４）、（１９）ＬＡＡＱＧＴＡＫＰＡ（配列番号６５）、（２０）ＬＡＰＤＱＴＴＲＮＡ（配列番号６６）、（２４）ＬＡＨＱＤＴＡＫＮＡ（配列番号７０）、（２５）ＬＡＨＱＤＴＫＫＮＡ（配列番号７１）、（２６）ＬＡＨＱＤＴＴＫＨＡ（配列番号７２）、（２７）ＬＡＨＱＤＴＴＫＫＡ（配列番号７３）、（２８）ＬＡＨＱＤＴＴＲＮＡ（配列番号７４）、（２９）ＬＡＨＱＤＴＴＴＮＡ（配列番号７５）、（３０）ＬＡＨＱＧＴＴＫＮＡ（配列番号７６）、（２１）ＬＡＡＳＤＳＴＫＡＡ（配列番号６７）、（２２）ＬＡＰＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号６８）、（３１）ＬＡＨＱＶＴＴＫＮＡ（配列番号７７）、（３３）ＬＡＫＤＡＴＫＴＡ（配列番号７９）、（３４）ＬＡＫＤＴＴＫＮＡ（配列番号８０）、（３６）ＬＡＰＱＤＴＫＫＮＡ（配列番号８２）、（３７）ＬＡＴＳＤＳＴＫＡＡ（配列番号８３）、（３８）ＬＡＶＤＧＳＱＲＳＡ（配列番号８４）、（４１）ＬＰＰＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号８７）、（４２）ＰＡＰＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号８８）、（５２）ＬＡＨＱＤＴＴＫＫＴ（配列番号９８）、（５３）ＬＡＨＱＤＴＴＫＮＤ（配列番号９９）、（５４）ＬＡＨＱＤＴＴＫＮＴ（配列番号１００）、（５５）ＬＡＨＱＤＴＴＫＮＶ（配列番号１０１）、（５６）ＬＡＨＱＤＴＴＫＴＭ（配列番号１０２）、（７３）ＬＰＨＱＤＴＴＫＮＤ（配列番号１１９）、及び（７４）ＬＰＨＱＤＴＴＫＮＴ（配列番号１２０）が含まれる。

【0055】

ペプチド挿入断片は、場合によっては、式ＩＶ：Ｘ₁ Ｘ₂ Ｘ₃ Ｘ₄ Ｘ₅ Ｘ₆ Ｘ₇ Ｘ₈ Ｘ₉ Ｘ₁₀のペプチドであって、式中、Ｘ₁ が、Ｌｅｕであり、Ｘ₂ が、Ａｌａであり、Ｘ₃ が、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、またはＶａｌであり、Ｘ₄ が、存在するのであれば、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、またはＧｌｙであり、Ｘ₅ が、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、またはＧｌｎであり、Ｘ₆ が、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｇｌｎ、またはＳｅｒであり、Ｘ₇ が、ＴｈｒまたはＳｅｒであり、Ｘ₈ が、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、またはＡｒｇであり、Ｘ₉ が、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、またはＳｅｒであり、Ｘ₁₀が、Ａｌａである。

【0056】

式ＩＶのペプチド挿入断片には、限定はされないが、（１）ＬＡＫＤＡＴＫＮＡ（配列番号４７）、（３）ＬＡＨＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号４９）、（７）ＬＡＰＤＳＴＴＲＳＡ（配列番号５３）、（１５）ＬＡＫＳＤＱＳＫＰＡ（配列番号６１）、（２０）ＬＡＰＤＱＴＴＲＮＡ（配列番号６６）、（２２）ＬＡＰＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号６８）、（２８）ＬＡＨＱＤＴＴＲＮＡ（配列番号７４）、（３２）ＬＡＩＳＤＱＳＫＰＡ（配列番号７８）、（３４）ＬＡＫＤＴＴＫＮＡ（配列番号８０）、及び（３５）ＬＡＫＳＤＱＳＲＰＡ（配列番号８１）が含まれる。

【0057】

ペプチド挿入断片は、場合によっては、式Ｖ：Ｘ₁ Ｘ₂ Ｘ₃ Ｘ₄ Ｘ₅ Ｘ₆ Ｘ₇ Ｘ₈ Ｘ₉ Ｘ₁₀のペプチドであって、式中、Ｘ₁ が、Ｌｅｕであり、Ｘ₂ が、Ａｌａであり、Ｘ₃ が、ＬｙｓまたはＨｉｓであり、Ｘ₄ が、存在するのであれば、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、またはＧｌｙであり、Ｘ₅ が、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、またはＧｌｎであり、Ｘ₆ が、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｇｌｎ、またはＳｅｒであり、Ｘ₇ が、ＴｈｒまたはＳｅｒであり、Ｘ₈ が、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、またはＡｒｇであり、Ｘ₉ が、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、またはＳｅｒであり、Ｘ₁₀が、Ａｌａである。

【0058】

式Ｖのペプチド挿入断片には、限定はされないが、（１）ＬＡＫＤＡＴＫＮＡ（配列番号４７）、（１５）ＬＡＫＳＤＱＳＫＰＡ（配列番号５１）、（３４）ＬＡＫＤＴＴＫＮＡ（配列番号８０）、及び（３５）ＬＡＫＳＤＱＳＲＰＡ（配列番号８１）が含まれる。

【0059】

ペプチド挿入断片は、場合によっては、式ＶＩ：Ｘ₁ Ｘ₂ Ｘ₃ Ｘ₄ Ｘ₅ Ｘ₆ Ｘ₇ Ｘ₈ Ｘ₉ Ｘ₁₀のペプチドであって、式中、Ｘ₁ が、Ｌｅｕであり、Ｘ₂ が、Ａｌａであり、Ｘ₃ が、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｉｌｅ、またはＬｅｕであり、Ｘ₄ が、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｌｙｓ、またはＰｒｏであり、Ｘ₅ が、Ａｓｐ、Ｐｒｏ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、またはＡｒｇであり、Ｘ₆ が、Ｉｌｅ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｙｒ、Ａｓｐ、またはＧｌｕであり、Ｘ₇ が、Ｘ７は、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ａｌａ、またはＬｙｓであり、Ｘ₈ が、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ａｒｇ、またはＡｓｐであり、Ｘ₉ が、Ｐｒｏ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、またはＳｅｒであり、Ｘ₁₀が、Ａｌａである。

【0060】

式ＶＩのペプチドには、限定はされないが、（８０）ＬＡＫＡＮＱＮＴＰＡ（配列番号１２６）、（８１）ＬＡＴＴＰＩＴＫＰＡ（配列番号１２７）、（８２）ＬＡＴＴＰＩＡＫＰＡ（配列番号１２８）、（８３）ＬＡＩＥＤＨＴＫＳＡ（配列番号１２９）、（８４）ＬＡＱＳＥＨＱＲＰＡ（配列番号１３０）、（８５）ＬＡＫＳＰＮＫＤＮＡ（配列番号１３１）、（８６）ＬＡＮＱＤＹＴＫＴＡ（配列番号１３２）、（８７）ＬＡＮＳＴＤＱＴＲＡ（配列番号１３３）、（８８）ＬＡＬＧＥＴＴＲＰＡ（配列番号１３４）、（８９）ＬＡＮＳＴＥＱＴＲＡ（配列番号１３５）、（９０）ＬＡＱＡＤＴＴＫＮＡ（配列番号１３６）、（９１）ＬＡＳＫＤＩＴＫＴＡ（配列番号１３７）、及び（９２）ＬＡＳＰＲＨＮＫＫＣ（配列番号１３８）が含まれる。

【0061】

場合によっては、ペプチド挿入断片は、式ＶＩＩ：ＬＡＨＱＤＴＴＫＸ₁ Ｘ₂ Ｘ₃ （配列番号１４８）のペプチドであって、式中、Ｘ₁ が、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、またはＨｉｓであり、Ｘ₂ が、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、またはＡｓｐであり、Ｘ₃ が、存在するのであれば、Ａｌａである。式ＶＩＩのペプチドには、限定はされないが、（２６）ＬＡＨＱＤＴＴＫＨＡ（配列番号７２）、（２７）ＬＡＨＱＤＴＴＫＫＡ（配列番号７３）、（５２）ＬＡＨＱＤＴＴＫＫＴ（配列番号９８）、（５３）ＬＡＨＱＤＴＴＫＮＤ（配列番号９９）、（５４）ＬＡＨＱＤＴＴＫＮＴ（配列番号１００）、（５５）ＬＡＨＱＤＴＴＫＮＶ（配列番号１０１）、（５６）ＬＡＨＱＤＴＴＫＴＭ（配列番号１０２）、及び（９３）ＬＡＨＱＤＴＴＫＴＩＡ（配列番号１３９）が含まれる。

【0062】

場合によっては、ペプチド挿入断片は、式ＶＩＩＩ：ＬＡＸ₁ ＱＸ₂ ＴＸ₃ Ｘ₄ Ｘ₅ Ｘ₆ （配列番号１４９）のペプチドであって、式中、Ｘ₁ が、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ａｓｐ、またはＨｉｓであり、Ｘ₂ が、ＧｌｙまたはＡｓｐであり、Ｘ₃ が、Ａｌａ、Ｔｈｒ、またはＬｙｓであり、Ｘ₄ が、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、またはＴｈｒであり、Ｘ₅ が、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、またはＴｈｒであり、Ｘ₆ が、存在するのであれば、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｖａｌ、またはＭｅｔである。式ＶＩＩＩのペプチドには、限定はされないが、（９４）ＬＡＡＱＧＴＡＮＬ（配列番号１４０）、（２２）ＬＡＰＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号６８）、（４６）ＬＡＤＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号９２）、（２４）ＬＡＨＱＤＴＡＫＮＡ（配列番号７０）、（２５）ＬＡＨＱＤＴＫＫＮＡ（配列番号７１）、（２６）ＬＡＨＱＤＴＴＫＨＡ（配列番号７２）、（２７）ＬＡＨＱＤＴＴＫＫＡ（配列番号７３）、（２８）ＬＡＨＱＤＴＴＲＮＡ（配列番号７４）、（２９）ＬＡＨＱＤＴＴＴＮＡ（配列番号７５）、（５０）ＬＡＨＱＤＴＴＥＮＡ（配列番号９６）、（５１）ＬＡＨＱＤＴＴＩＮＡ（配列番号９７）、（５２）ＬＡＨＱＤＴＴＫＫＴ（配列番号９８）、（５３）ＬＡＨＱＤＴＴＫＮＤ（配列番号９９）、（５４）ＬＡＨＱＤＴＴＫＮＴ（配列番号１００）、（５５）ＬＡＨＱＤＴＴＫＮＶ（配列番号１０１）、及び（５６）ＬＡＨＱＤＴＴＫＴＭ（配列番号１０２）が含まれる。

【0063】

場合によっては、ペプチド挿入断片は、式ＩＸ：Ｘ₁ ＡＸ₂ Ｘ₃ ＤＸ₄ ＴＫＸ₅ Ａ（配列番号１５０）のペプチドであって、式中、Ｘ₁ が、ＶａｌまたはＬｅｕであり、Ｘ₂ が、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｈｉｓ、またはＡｓｐであり、Ｘ₃ が、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、またはＧｌｎであり、Ｘ₄ が、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、またはＴｈｒであり、Ｘ₅ が、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、またはＬｙｓである。式ＩＸのペプチドには、限定はされないが、（９５）ＶＡＩＥＤＨＴＫＳＡ（配列番号１４１）、（１８）ＬＡＶＳＤＳＴＫＡＡ（配列番号６４）、（４６）ＬＡＤＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号９２）、（４８）ＬＡＨＫＤＴＴＫＮＡ（配列番号９４）、（２６）ＬＡＨＱＤＴＴＫＨＡ（配列番号７２）、及び（２７）ＬＡＨＱＤＴＴＫＫＡ（配列番号７３）が含まれる。

【0064】

場合によっては、ペプチド挿入断片は、式Ｘ：Ｘ₁ Ｘ₂ Ｘ₃ ＡＸ₄ ＱＸ₅ ＴＸ₆ ＫＮＡ（配列番号１５１）のペプチドであって、式中、Ｘ₁ が、存在するのであれば、Ｌｅｕであり、Ｘ₂ が、存在するのであれば、Ａｌａであり、Ｘ₃ が、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、またはＰｒｏであり、Ｘ₄ が、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、またはＴｙｒであり、Ｘ₅ が、Ａｓｎ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、またはＡｓｐであり、Ｘ₆ が、ＰｒｏまたはＴｈｒである。式Ｘのペプチドには、限定はされないが、（９６）ＬＡＫＡＮＱＮＴＰＫＮＡ（配列番号１４２）、（５７）ＬＡＨＱＮＴＴＫＮＡ（配列番号１０３）、（６６）ＬＡＰＱＮＴＴＫＮＡ（配列番号１１２）、（６９）ＬＡＹＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号１１５）、（３０）ＬＡＨＱＧＴＴＫＮＡ（配列番号７６）、（３１）ＬＡＨＱＶＴＴＫＮＡ（配列番号７７）、及び（４２）ＰＡＰＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号８８）が含まれる。

【0065】

場合によっては、ペプチド挿入断片は、ＬＡＨＱＤＴＴＫＫＸ（配列番号１４３）であり、式中、Ｘは、任意のアミノ酸である。場合によっては、ペプチド挿入断片は、ＬＡＨＱＤＴＴＫＫＸ（配列番号１４３）であり、式中、Ｘは、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｖａｌ、またはＭｅｔである。場合によっては、ペプチド挿入断片は、（２７）ＬＡＨＱＤＴＴＫＫＡ（配列番号７３）である。場合によっては、ペプチド挿入断片は、（５２）ＬＡＨＱＤＴＴＫＫＴ（配列番号９８）である。場合によっては、ペプチド挿入断片は、ＬＡＨＱＤＴＴＫＫＤ（配列番号１４４）である。場合によっては、ペプチド挿入断片は、ＬＡＨＱＤＴＴＫＫＶ（配列番号１４５）である。場合によっては、ペプチド挿入断片は、ＬＡＨＱＤＴＴＫＫＭ（配列番号１４６）である。

【0066】

場合によっては、ペプチド挿入断片は、（８８）ＬＡＬＧＥＴＴＲＰＡ（配列番号１３４）ではない。場合によっては、ペプチド挿入断片は、ＬＧＥＴＴＲＰ（配列番号１４７）ではない。

【0067】

適切なペプチド挿入断片には、限定はされないが、（１）ＬＡＫＤＡＴＫＮＡ（配列番号４７）、（２）ＰＡＨＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号４８）、（３）ＬＡＨＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号４９）、（４）ＬＡＴＴＳＱＮＫＰＡ（配列番号５０）、（５）ＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡ（配列番号５１）、（６）ＩＡＲＧＶＡＰＳＳＡ（配列番号５２）、（７）ＬＡＰＤＳＴＴＲＳＡ（配列番号５３）、（８）ＬＡＫＧＴＥＬＫＰＡ（配列番号５４）、（９）ＬＡＩＩＤＡＴＫＮＡ（配列番号５５）、（１０）ＬＡＶＤＧＡＱＲＳＡ（配列番号５６）、（１１）ＰＡＰＱＤＴＴＫＫＡ（配列番号５７）、（１２）ＬＰＨＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号５８）、（１３）ＬＡＫＤＡＴＫＴＩＡ（配列番号５９）、（１４）ＬＡＫＱＱＳＡＳＴＡ（配列番号６０）、（１５）ＬＡＫＳＤＱＳＫＰＡ（配列番号６１）、（１６）ＬＳＨＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号６２）、（１７）ＬＡＡＮＱＰＳＫＰＡ（配列番号６３）、（１８）ＬＡＶＳＤＳＴＫＡＡ（配列番号６４）、（１９）ＬＡＡＱＧＴＡＫＫＰＡ（配列番号６５）、（２０）ＬＡＰＤＱＴＴＲＮＡ（配列番号６６）、（２１）ＬＡＡＳＤＳＴＫＡＡ（配列番号６７）、（２２）ＬＡＰＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号６８）、（２３）ＬＡＫＡＤＥＴＲＰＡ（配列番号６９）、（２４）ＬＡＨＱＤＴＡＫＮＡ（配列番号７０）、（２５）ＬＡＨＱＤＴＫＫＮＡ（配列番号７１）、（２６）ＬＡＨＱＤＴＴＫＨＡ（配列番号７２）、（２７）ＬＡＨＱＤＴＴＫＫＡ（配列番号７３）、（２８）ＬＡＨＱＤＴＴＲＮＡ（配列番号７４）、（２９）ＬＡＨＱＤＴＴＮＡ（配列番号７５）、（３０）ＬＡＨＱＧＴＴＫＮＡ（配列番号７６）、（３１）ＬＡＨＱＶＴＴＫＮＡ（配列番号７７）、（３２）ＬＡＩＳＤＱＳＫＰＡ（配列番号７８）、（３３）ＬＡＤＡＴＫＴＡ（配列番号７９）、（３４）ＬＡＫＤＴＴＫＮＡ（配列番号８０）、（３５）ＬＡＫＳＤＱＳＲＰＡ（配列番号８１）、（３６）ＬＡＰＱＤＴＫＫＮＡ（配列番号８２）、（３７）ＬＡＴＳＤＳＴＫＡＡ（配列番号８３）、（３８）ＬＡＶＤＧＳＱＲＳＡ（配列番号８４）、（３９）ＬＰＩＳＤＱＴＫＨＡ（配列番号８５）、（４０）ＬＰＫＤＡＴＫＴＩＡ（配列番号８６）、（４１）ＬＰＰＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号８７）、（４２）ＰＡＰＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号８８）、（４３）ＱＡＨＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号８９）、（４４）ＬＡＨＥＴＳＰＲＰＡ（配列番号９０）、（４５）ＬＡＫＳＴＳＴＡＰＡ（配列番号９１）、（４６）ＬＡＤＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号９２）、（４７）ＬＡＥＳＤＱＳＫＰＡ（配列番号９３）、（４８）ＬＡＨＫＤＴＴＫＮＡ（配列番号９４）、（４９）ＬＡＨＫＴＱＱＫＭ（配列番号９５）、（５０）ＬＡＨＱＤＴＴＥＮＡ（配列番号９６）、（５１）ＬＡＨＱＤＴＴＩＮＡ（配列番号９７）、（５２）ＬＡＨＱＤＴＴＫＫＴ（配列番号９８）、（５３）ＬＡＨＱＤＴＴＫＮＤ（配列番号９９）、（５４）ＬＡＨＱＤＴＴＫＮＴ（配列番号１００）、（５５）ＬＡＨＱＤＴＴＫＮＶ（配列番号１０１）、（５６）ＬＡＨＱＤＴＴＫＴＭ（配列番号１０２）、（５７）ＬＡＨＱＮＴＴＫＮＡ（配列番号１０３）、（５８）ＬＡＨＲＤＴＴＫＮＡ（配列番号１０４）、（５９）ＬＡＩＳＤＱＴＮＨＡ（配列番号１０５）、（６０）ＬＡＫＱＫＳＡＳＴＡ（配列番号１０６）、（６１）ＬＡＫＳＤＱＣＫＰＡ（配列番号１０７）、（６２）ＬＡＫＳＤＱＳＫＰＤ（配列番号１０８）、（６３）ＬＡＫＳＤＱＳＮＰＡ（配列番号１０９）、（６４）ＬＡＫＳＹＱＳＫＰＡ（配列番号１１０）、（６５）ＬＡＮＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号１１１）、（６６）ＬＡＰＱＮＴＴＫＮＡ（配列番号１１２）、（６７）ＬＡＰＳＳＩＱＫＰＡ（配列番号１１３）、（６８）ＬＡＱＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号１１４）、（６９）ＬＡＹＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号１１５）、（７０）ＬＤＨＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号１１６）、（７１）ＬＤＨＱＤＴＴＫＳＡ（配列番号１１７）、（７２）ＬＧＨＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号１１８）、（７３）ＬＰＨＱＤＴＴＫＮＤ（配列番号１１９）、（７４）ＬＰＨＱＤＴＴＫＮＴ（配列番号１２０）、（７５）ＬＰＨＱＤＴＴＮＮＡ（配列番号１２１）、（７６）ＬＴＨＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号１２２）、（７７）ＬＴＫＤＡＴＫＴＩＡ（配列番号１２３）、（７８）ＬＴＰＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号１２４）、（７９）ＬＶＨＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号１２５）、（８０）ＬＡＫＡＮＱＮＴＰＡ（配列番号１２６）、（８１）ＬＡＴＴＰＩＴＫＰＡ（配列番号１２７）、（８２）ＬＡＴＴＰＩＡＫＰＡ（配列番号１２８）、（８３）ＬＡＩＥＤＨＴＫＳＡ（配列番号１２９）、（８４）ＬＡＱＳＥＨＱＲＰＡ（配列番号１３０）、（８５）ＬＡＫＳＰＮＫＤＮＡ（配列番号１３１）、（８６）ＬＡＮＱＤＹＴＫＴＡ（配列番号１３２）、（８７）ＬＡＮＳＴＤＱＴＲＡ（配列番号１３３）、（８８）ＬＡＬＧＥＴＴＲＰＡ（配列番号１３４）、（８９）ＬＡＮＳＴＥＱＴＲＡ（配列番号１３５）、（９０）ＬＡＱＡＤＴＴＫＮＡ（配列番号１３６）、（９１）ＬＡＳＫＤＩＴＫＴＡ（配列番号１３７）、（９２）ＬＡＳＰＲＨＮＫＫＣ（配列番号１３８）、（９３）ＬＡＨＱＤＴＴＫＴＩＡ（配列番号１３９）、（９４）ＬＡＡＱＧＴＡＮＬ（配列番号１４０）、（９５）ＶＡＩＥＤＨＴＫＳＡ（配列番号１４１）、及び（９６）ＬＡＫＡＮＱＮＴＰＫＮＡ（配列番号１４２）が含まれる。

【0068】

場合によっては、ペプチド挿入断片は、（１１）ＰＡＰＱＤＴＴＫＫＡ（配列番号５７）である。場合によっては、ペプチド挿入断片は、（７）ＬＡＰＤＳＴＴＲＳＡ（配列番号５３）である。

【0069】

いくつかの実施形態では、対象ｒＡＡＶビリオンカプシドは、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質と比較して、約５つのアミノ酸～約２０個のアミノ酸の挿入断片（例えば、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、または２０個のアミノ酸（例えば、９つのアミノ酸、１０個のアミノ酸、１１個のアミノ酸、または１２個のアミノ酸））がＧＨループまたはループＩＶに存在する以外は、他のアミノ酸置換、アミノ酸挿入、またはアミノ酸欠失のいずれも含まない。他の実施形態では、対象ｒＡＡＶビリオンカプシドは、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質と比較して約５つのアミノ酸～約２０個のアミノ酸の挿入断片（例えば、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、または２０個のアミノ酸（例えば、９つのアミノ酸、１０個のアミノ酸、１１個のアミノ酸、または１２個のアミノ酸））がＧＨループまたはループＩＶに存在することに加えて、親ＡＡＶカプシドタンパク質と比較して１つ～約２５個のアミノ酸挿入、アミノ酸欠失、またはアミノ酸置換を含む。例えば、いくつかの実施形態では、対象ｒＡＡＶビリオンカプシドは、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質と比較して約５つのアミノ酸～約２０個のアミノ酸の挿入断片（例えば、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、または２０個のアミノ酸（例えば、９つのアミノ酸、１０個のアミノ酸、１１個のアミノ酸、または１２個のアミノ酸））がＧＨループまたはループＩＶに存在することに加えて、親ＡＡＶカプシドタンパク質と比較して１つ～約５つ、約５つ～約１０個、約１０個～約１５個、約１５個～約２０個、または約２０個～約２５個のアミノ酸挿入、アミノ酸欠失、またはアミノ酸置換を含む。

【0070】

場合によっては、対象ｒＡＡＶビリオンカプシドは、Ｙ２７３Ｆ、Ｙ４４４Ｆ、Ｙ５００Ｆ、及びＹ７３０Ｆのアミノ酸置換のうちの１つ、２つ、３つ、または４つを含まない。

【0071】

場合によっては、対象変異カプシドポリペプチドは、上記の挿入ペプチドに加えて、Ｙ２７３Ｆ、Ｙ４４４Ｆ、Ｙ５００Ｆ、及びＹ７３０Ｆのアミノ酸置換のうちの１つ、２つ、３つ、または４つを含む。

【0072】

場合によっては、対象ｒＡＡＶビリオンカプシドは、キメラカプシドであり、例えば、カプシドは、第１のＡＡＶ血清型のＡＡＶカプシドの一部と、第２血清型のＡＡＶカプシドの一部とを含み、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質と比較して、約５つのアミノ酸～約２０個のアミノ酸の挿入断片（例えば、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、または２０個のアミノ酸（例えば、９つのアミノ酸、１０個のアミノ酸、１１個のアミノ酸、または１２個のアミノ酸））をＧＨループまたはループＩＶに含む。

【0073】

いくつかの実施形態では、対象ｒＡＡＶビリオンは、図４に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むカプシドタンパク質を含み、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質と比較して、約５つのアミノ酸～約２０個のアミノ酸の挿入断片（例えば、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、または２０個のアミノ酸（例えば、９つのアミノ酸、１０個のアミノ酸、１１個のアミノ酸、または１２個のアミノ酸））をＧＨループまたはループＩＶに含む。いくつかの実施形態では、対象ｒＡＡＶビリオンは、図４に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むカプシドタンパク質を含み、図４に示されるアミノ酸配列と比較したときのアミノ酸５８７とアミノ酸５８８との間、または対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質と比較したときの対応部位に、約５つのアミノ酸～約２０個のアミノ酸の挿入断片（例えば、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、または２０個のアミノ酸（例えば、９つのアミノ酸、１０個のアミノ酸、１１個のアミノ酸、または１２個のアミノ酸））を含む。

【0074】

いくつかの実施形態では、対象ｒＡＡＶビリオンは、図５に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、約５つのアミノ酸～約２０個のアミノ酸の挿入断片（例えば、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、または２０個のアミノ酸（例えば、９つのアミノ酸、１０個のアミノ酸、１１個のアミノ酸、または１２個のアミノ酸））を太字の下線付きアミノ酸の間に含むＧＨループを含むカプシドタンパク質を含む。

【0075】

いくつかの実施形態では、対象ｒＡＡＶビリオンは、図６Ａ～６Ｃに示されるアミノ酸配列のいずれか１つに対して少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＡＡＶ２のアミノ酸５８７とアミノ酸５８８との間、または別のＡＡＶ遺伝子型と比較したときの対応部位に約５つのアミノ酸～約２０個のアミノ酸の挿入断片（例えば、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、または２０個のアミノ酸（例えば、９つのアミノ酸、１０個のアミノ酸、１１個のアミノ酸、または１２個のアミノ酸））を含むカプシドタンパク質を含む。場合によっては、対応する挿入部位は、図６Ｂに太字の下線付き文字で示される部位である。

【0076】

対象ｒＡＡＶビリオンは、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによる網膜細胞に対する感染力と比較して、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍超増加した感染力を網膜細胞に対して示す。

【0077】

場合によっては、対象ｒＡＡＶビリオンは、硝子体内注射を介して投与されると、硝子体内注射を介して投与されたときの対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによる網膜細胞に対する感染力と比較して、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍超増加した感染力を網膜細胞に対して示す。

【0078】

いくつかの実施形態では、対象ｒＡＡＶビリオンは、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによる光受容体（杆体または錐体）細胞に対する感染力と比較して、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍超増加した感染力を光受容体細胞に対して示す。

【0079】

いくつかの実施形態では、対象ｒＡＡＶビリオンは、硝子体内注射を介して投与されると、硝子体内注射を介して投与されたときの対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによる光受容体（杆体または錐体）細胞に対する感染力と比較して、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍超増加した感染力を光受容体細胞に対して示す。

【0080】

いくつかの実施形態では、対象ｒＡＡＶビリオンは、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによるＲＧＣに対する感染力と比較して、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍超増加した感染力をＲＧＣに対して示す。

【0081】

いくつかの実施形態では、対象ｒＡＡＶビリオンは、硝子体内注射を介して投与されると、硝子体内注射を介して投与されたときの対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによるＲＧＣに対する感染力と比較して、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍超増加した感染力をＲＧＣに対して示す。

【0082】

いくつかの実施形態では、対象ｒＡＡＶビリオンは、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによるＲＰＥ細胞に対する感染力と比較して、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍超増加した感染力をＲＰＥ細胞に対して示す。

【0083】

いくつかの実施形態では、対象ｒＡＡＶビリオンは、硝子体内注射を介して投与されると、硝子体内注射を介して投与されたときの対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによるＲＰＥ細胞に対する感染力と比較して、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍超増加した感染力をＲＰＥ細胞に対して示す。

【0084】

いくつかの実施形態では、対象ｒＡＡＶビリオンは、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによるミュラー細胞に対する感染力と比較して、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍超増加した感染力をミュラー細胞に対して示す。

【0085】

いくつかの実施形態では、対象ｒＡＡＶビリオンは、硝子体内注射を介して投与されると、硝子体内注射を介して投与されたときの対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによるミュラー細胞に対する感染力と比較して、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍超増加した感染力をミュラー細胞に対して示す。

【0086】

いくつかの実施形態では、対象ｒＡＡＶビリオンは、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによる双極細胞に対する感染力と比較して、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍超増加した感染力を双極細胞に対して示す。

【0087】

いくつかの実施形態では、対象ｒＡＡＶビリオンは、硝子体内注射を介して投与されると、硝子体内注射を介して投与されたときの対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによる双極細胞に対する感染力と比較して、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍超増加した感染力を双極細胞に対して示す。

【0088】

いくつかの実施形態では、対象ｒＡＡＶビリオンは、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによるアマクリン細胞に対する感染力と比較して、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍超増加した感染力をアマクリン細胞に対して示す。

【0089】

いくつかの実施形態では、対象ｒＡＡＶビリオンは、硝子体内注射を介して投与されると、硝子体内注射を介して投与されたときの対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによるアマクリン細胞に対する感染力と比較して、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍超増加した感染力をアマクリン細胞に対して示す。

【0090】

いくつかの実施形態では、対象ｒＡＡＶビリオンは、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによる水平細胞に対する感染力と比較して、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍超増加した感染力を水平細胞に対して示す。

【0091】

いくつかの実施形態では、対象ｒＡＡＶビリオンは、硝子体内注射を介して投与されると、硝子体内注射を介して投与されたときの対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによる水平細胞に対する感染力と比較して、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍超増加した感染力を水平細胞に対して示す。

【0092】

いくつかの実施形態では、対象ｒＡＡＶビリオンは、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによる網膜アストロサイトに対する感染力と比較して、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍超増加した感染力を網膜アストロサイトに対して示す。

【0093】

いくつかの実施形態では、対象ｒＡＡＶビリオンは、硝子体内注射を介して投与されると、硝子体内注射を介して投与されたときの対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによる網膜アストロサイトに対する感染力と比較して、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍超増加した感染力を網膜アストロサイトに対して示す。

【0094】

場合によっては、対象ｒＡＡＶビリオンは、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンが内境界膜（ＩＬＭ）を通過する能力と比較して、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍超増加したＩＬＭ通過能力を示す。

【0095】

場合によっては、対象ｒＡＡＶビリオンは、硝子体内注射を介して投与されると、硝子体内注射を介して投与されたときの対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンのＩＬＭ通過能力と比較して、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍超増加したＩＬＭ通過能力を示す。

【0096】

対象ｒＡＡＶビリオンは、ＩＬＭを通過することができると共に、ミュラー細胞、アマクリン細胞などを含めて、細胞層を通過することで光受容体細胞及びまたはＲＰＥ細胞に到達することもできる。例えば、対象ｒＡＡＶビリオンは、硝子体内注射を介して投与されると、ＩＬＭを通過することができると共に、ミュラー細胞、アマクリン細胞などを含めて、細胞層を通過することで光受容体細胞及びまたはＲＰＥ細胞に到達することもできる。

【0097】

場合によっては、対象ｒＡＡＶビリオンは、硝子体内に注射されると、硝子体内に注射されたときの対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含む対照ＡＡＶビリオンによるＩＬＭを通過した局在性度合と比較して、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍超増加したＩＬＭ通過局在性を示す。例えば、場合によっては、対象ｒＡＡＶビリオンは、硝子体内に注射されると、硝子体内に注射されたときの対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含む対照ＡＡＶビリオンによる網膜色素上皮（ＲＰＥ）層への局在性度合と比較して、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍超増加したＲＰＥ局在性を示す。別の例として、場合によっては、対象ｒＡＡＶビリオンは、硝子体内に注射されると、硝子体内に注射されたときの対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含む対照ＡＡＶビリオンによる光受容体（ＰＲ）層への局在性度合と比較して、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍超増加したＰＲ層局在性を示す。別の例として、場合によっては、対象ｒＡＡＶビリオンは、硝子体内に注射されると、硝子体内に注射されたときの対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含む対照ＡＡＶビリオンによる内顆粒層への局在性度合と比較して、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍超増加した内顆粒層局在性を示す。別の例として、場合によっては、対象ｒＡＡＶビリオンは、硝子体内に注射されると、硝子体内に注射されたときの対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含む対照ＡＡＶビリオンによる外顆粒層への局在性度合と比較して、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍超増加した外顆粒層局在性を示す。別の例として、場合によっては、対象ｒＡＡＶビリオンは、硝子体内に注射されると、硝子体内に注射されたときの対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含む対照ＡＡＶビリオンによる神経節細胞層への局在性度合と比較して、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍超増加した神経節細胞層局在性を示す。

【0098】

いくつかの実施形態では、対象ｒＡＡＶビリオンは、網膜細胞に選択的に感染し、例えば、対象ｒＡＡＶビリオンは、非網膜細胞（例えば、眼の外側の細胞）と比較して、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、５０倍、または５０倍超の特異性を伴って網膜細胞に感染する。例えば、いくつかの実施形態では、対象ｒＡＡＶビリオンは、網膜細胞に選択的に感染し、例えば、対象ｒＡＡＶビリオンは、非網膜細胞（例えば、眼の外側の細胞）と比較して、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、５０倍、または５０倍超の特異性を伴って網膜細胞に感染する。

【0099】

いくつかの実施形態では、対象ｒＡＡＶビリオンは、光受容体細胞に選択的に感染し、例えば、対象ｒＡＡＶビリオンは、眼に存在する非光受容体細胞（例えば、網膜神経節細胞、ミュラー細胞など）と比較して、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、５０倍、または５０倍超の特異性を伴って光受容体細胞に感染する。

【0100】

いくつかの実施形態では、対象ｒＡＡＶビリオンは、硝子体内注射を介して投与されると、硝子体内注射を介して投与されたときの対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによる光受容体細胞に対する感染力と比較して、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍超増加した感染力を光受容体細胞に対して示す。

【0101】

遺伝子産物
対象ｒＡＡＶビリオンは、遺伝子産物（異種遺伝子産物）をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸を含む。場合によっては、遺伝子産物は、ポリペプチドである。場合によっては、遺伝子産物は、ＲＮＡである。遺伝子産物がＲＮＡである場合、場合によっては、ＲＮＡ遺伝子産物は、ポリペプチドをコードする。場合によっては、本開示のｒＡＡＶビリオンは、単一の異種遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む単一の異種核酸を含む。場合によっては、本開示のｒＡＡＶビリオンは、２つの異種遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む単一の異種核酸を含む。場合によっては、本開示のｒＡＡＶビリオンは、２つの異種核酸を含み、それぞれが、異種遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む。

【0102】

いくつかの実施形態では、遺伝子産物は、干渉ＲＮＡである。いくつかの実施形態では、遺伝子産物は、アプタマーである。いくつかの実施形態では、遺伝子産物は、ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、遺伝子産物は、遺伝子機能を部位特異的にノックダウンする部位特異的ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、遺伝子産物は、標的核酸を改変するＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼである。

【0103】

干渉ＲＮＡ
遺伝子産物が干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）である場合、適切なＲＮＡｉには、細胞におけるアポトーシス因子または血管新生因子のレベルを低減するＲＮＡｉが含まれる。例えば、ＲＮＡｉは、細胞におけるアポトーシスを誘導または促進する遺伝子産物のレベルを低減するｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡであり得る。その遺伝子産物がアポトーシスを誘導または促進する遺伝子は、本明細書で「アポトーシス促進遺伝子」と称され、そうした遺伝子の産物（ｍＲＮＡ、タンパク質）は、「アポトーシス促進遺伝子産物」と称される。アポトーシス促進遺伝子産物には、例えば、Ｂａｘ遺伝子産物、Ｂｉｄ遺伝子産物、Ｂａｋ遺伝子産物、及びＢａｄ遺伝子産物が含まれる。例えば、米国特許第７，８４６，７３０号を参照のこと。

【0104】

干渉ＲＮＡは、血管新生産物を標的とするものでもあり得、こうした血管新生産物は、例えば、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）（例えば、Ｃａｎｄ５であり、例えば、米国特許公開第２０１１／０１４３４００号、米国特許公開第２００８／０１８８４３７号、及びＲｅｉｃｈ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｍｏｌ．Ｖｉｓ．９：２１０を参照のこと）、ＶＥＧＦ受容体－１（ＶＥＧＦＲ１）（例えば、Ｓｉｒｎａ－０２７であり、例えば、Ｋａｉｓｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ａｍ．Ｊ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．１５０：３３、及びＳｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１３：２２５を参照のこと）、またはＶＥＧＦ受容体－２（ＶＥＧＦＲ２）（Ｋｏｕ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．４４：１５０６４）である。米国特許第６，６４９，５９６号、第６，３９９，５８６号、第５，６６１，１３５号、第５，６３９，８７２号、及び第５，６３９，７３６号、ならびに米国特許第７，９４７，６５９号及び第７，９１９，４７３号も参照のこと。

【0105】

アプタマー
遺伝子産物がアプタマーである場合、目的アプタマーの例には、ＶＥＧＦを標的とするアプタマーが含まれる。例えば、Ｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ５：１２３、及びＬｅｅ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０２：１８９０２を参照のこと。例えば、ＶＥＧＦアプタマーは、５’－ｃｇｃａａｕｃａｇｕｇａａｕｇｃｕｕａｕａｃａｕｃｃｇ－３’というヌクレオチド配列（配列番号／／）を含み得る。血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）特異的アプタマー（例えば、Ｅ１００３０）もまた使用に適しており、例えば、Ｎｉ ａｎｄ Ｈｕｉ（２００９）Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｉｃａ ２２３：４０１、及びＡｋｉｙａｍａ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０７：４０７）を参照のこと。

【0106】

ポリペプチド
遺伝子産物がポリペプチドである場合、ポリペプチドは、一般に、網膜細胞の機能を増進するポリペプチドであり、例えば、杆体光受容体細胞もしくは錐体光受容体細胞、網膜神経節細胞、ミュラー細胞、双極細胞、アマクリン細胞、水平細胞、または網膜色素上皮細胞の機能を増進するポリペプチドである。ポリペプチドの例には、神経保護ポリペプチド（例えば、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、ニューロトロフィン－４（ＮＴ４）、神経成長因子（ＮＧＦ）、及びニュールツリン（ＮＴＮ））、抗血管新生ポリペプチド（例えば、可溶性ＶＥＧＦ受容体、ＶＥＧＦ結合抗体、ＶＥＧＦ結合抗体断片（例えば、単鎖抗ＶＥＧＦ抗体）、エンドスタチン、タムスタチン、アンジオスタチン、可溶性Ｆｌｔポリペプチド（Ｌａｉ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１２：６５９）、可溶性Ｆｌｔポリペプチドを含むＦｃ融合タンパク質（例えば、Ｐｅｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１６：１０を参照のこと）、色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）、可溶性Ｔｉｅ－２受容体など）、組織メタロプロテアーゼ阻害物質－３（ＴＩＭＰ－３）、光応答性オプシン（例えば、ロドプシン）、抗アポトーシスポリペプチド（例えば、Ｂｃｌ－２、Ｂｃｌ－Ｘｌ、ＸＩＡＰ）、ならびに同様のものが含まれる。適切なポリペプチドには、限定はされないが、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、線維芽細胞増殖因子、線維芽細胞増殖因子２、ニュールツリン（ＮＴＮ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、ニューロトロフィン－４（ＮＴ４）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ、例えば、図７Ｂに示されるアミノ酸配列（配列番号１１）の約２００個のアミノ酸～２４７個のアミノ酸の連続区間に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド）、上皮増殖因子、ロドプシン、Ｘ連鎖アポトーシス抑制物質、及びソニックヘッジホッグが含まれる。

【0107】

適切な光応答性オプシンには、例えば、米国特許公開第２００７／０２６１１２７号（例えば、チャネルロドプシン－２、ＣｈＲ２、Ｃｈｏｐ２）、米国特許公開第２００１／００８６４２１号、米国特許公開第２０１０／００１５０９５号、米国特許公開第２０１６／０００２３０２号、米国特許公開第２０１３／０３４７１３７号、米国特許公開第２０１３／００１９３２５号、及びＤｉｅｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１４：３８７に記載の光応答性オプシンが含まれる。Ｔｈｙａｇａｒａｊａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３０（２６）：８７４５－８７５８、Ｌａｇａｌｉ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１１（６）：６６７－６７５、Ｄｏｒｏｕｄｃｈｉ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．１９（７）：１２２０－１２２９、Ｈｅｎｒｉｋｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｊ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ Ｖｉｓ．Ｒｅｓ．９：３７４、Ｔｏｍｉｔａ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２２：１４３４を参照のこと。

【0108】

適切なポリペプチドには、光開口型イオンチャネルポリペプチドが含まれる。例えば、Ｇａｕｂ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １１１：Ｅ５５７４を参照のこと。例えば、適切なポリペプチドは、光開口型イオンチャネル型グルタミン酸受容体（ＬｉＧｌｕＲ）である。光異性化可能な化合物の存在下で網膜神経節細胞及びオン型双極細胞においてＬｉＧｌｕＲが発現すると、細胞が光応答性となる。ＬｉＧｌｕＲは、Ｌ４３９Ｃ置換を含む。Ｃａｐｏｒａｌｅ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．１９：１２１２－１２１９、Ｖｏｌｇｒａｆ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．２：４７－５２、及びＧｏｒｏｓｔｉｚａ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１０４：１０８６５－１０８７０を参照のこと。光異性化可能な化合物には、例えば、４６０ｎｍで効率が最大となるマレイミド－アゾベンゼン－グルタミン酸０（ＭＡＧ０₄₆₀ ）が含まれる。ＭＡＧ０₄₆₀ は、下記の構造を有する。

【0109】

【化1】

【0110】

適切なポリペプチドには、レチノスキシン（例えば、図７Ａに示されるアミノ酸配列（配列番号１０）の約２００個のアミノ酸～２２４個のアミノ酸の連続区間に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド）も含まれる。適切なポリペプチドには、例えば、網膜色素変性症ＧＴＰａｓｅ調節因子（ＲＰＧＲ）相互作用タンパク質－１（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｑ９６ＫＮ７、Ｑ９ＥＰＱ２、及びＱ９ＧＬＭ３を参照のこと）（例えば、図７Ｆに示されるアミノ酸配列（配列番号１５）の、約１１５０個のアミノ酸～約１２００個のアミノ酸の連続区間または約１２００個のアミノ酸～１２８６個のアミノ酸の連続区間に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド）、ペリフェリン－２（Ｐｒｐｈ２）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿０００３１３（例えば、図７Ｄに示されるアミノ酸配列（配列番号１３）の約３００個のアミノ酸～３４６個のアミノ酸の連続区間に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド）、及びＴｒａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １０：７３３を参照のこと）、ペリフェリン（例えば、図７Ｅに示されるアミノ酸配列（配列番号１４）の約４００個のアミノ酸～約４７０個のアミノ酸の連続区間に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド）、網膜色素上皮特異的タンパク質（ＲＰＥ６５）（例えば、図７Ｃに示されるアミノ酸配列（配列番号１２）の約２００個のアミノ酸～２４７個のアミノ酸の連続区間に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＣ３９６６０、及びＭｏｒｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：３０８８を参照のこと）、杆体由来錐体生存因子（ｒｏｄ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｃｏｎｅ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｆａｃｔｏｒ）（ＲｄＣＶＦ）（例えば、図７Ｈ、図７Ｉ、及び図７Ｊのいずれか１つに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド）、全脈絡膜萎縮（例えば、図７Ｇに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド）、網膜色素変性症ＧＴＰａｓｅ調節因子（ＲＰＧＲ）（例えば、図７Ｓ～７Ｖのうちの１つに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド）、ならびに同様のものが含まれる。例えば、場合によっては、適切なＲＰＧＲポリペプチドは、図７Ｓに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の例として、場合によっては、適切なＲＰＧＲポリペプチドは、図７Ｔに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。例えば、場合によっては、適切なＲＰＧＲポリペプチドは、図７Ｕに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。例えば、場合によっては、適切なＲＰＧＲポリペプチドは、図７Ｖに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0111】

適切なポリペプチドには、ＣＨＭ（全脈絡膜萎縮（Ｒａｂエスコートタンパク質１（ＲＥＰ１）））（欠損または欠失すると全脈絡膜萎縮が生じるポリペプチド）（例えば、Ｄｏｎｎｅｌｌｙ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．３：１０１７、及びｖａｎ Ｂｏｋｈｏｖｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．３：１０４１を参照のこと）、ならびにクランブス（Ｃｒｕｍｂｓ）相同体１（ＣＲＢ１）（欠損または欠失すると、レーバー先天黒内障及び網膜色素変性症が生じるポリペプチド）（例えば、ｄｅｎ Ｈｏｌｌａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２３：２１７、及びＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＣＡＭ２３３２８を参照のこと）も含まれる。例えば、適切なＲＥＰ１ポリペプチドは、図７Ｇに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸を含み得る。

【0112】

適切なポリペプチドには、杆体ｃＧＭＰ特異的３’，５’－環状ホスホジエステラーゼサブユニットアルファ（ＰＤＥ６α）、杆体ｃＧＭＰ特異的３’，５’－環状ホスホジエステラーゼサブユニットベータアイソフォーム１（ＰＤＥ６βアイソフォーム１）、杆体ｃＧＭＰ特異的３’，５’－環状ホスホジエステラーゼサブユニットベータアイソフォーム２（ＰＤＥ６βアイソフォーム２）、杆体ｃＧＭＰ特異的３’，５’－環状ホスホジエステラーゼサブユニットベータアイソフォーム３（ＰＤＥ６βアイソフォーム３）が含まれる。例えば、適切なＰＤＥ６αポリペプチドは、図７Ｋに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸を含み得る。別の例として、適切なＰＤＥ６β６アイソフォーム１ポリペプチドは、図７Ｌに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸を含み得る。別の例として、適切なＰＤＥ６β６アイソフォーム２ポリペプチドは、図７Ｍに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸を含み得る。別の例として、適切なＰＤＥ６β６アイソフォーム３ポリペプチドは、図７Ｎに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸を含み得る。

【0113】

適切なポリペプチドには、欠損または欠失すると色覚異常が生じるポリペプチドも含まれ、そのようなポリペプチドには、例えば、錐体光受容体ｃＧＭＰ開口型チャネルサブユニットアルファ（ＣＮＧＡ３）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿００１２８９、及びＢｏｏｉｊ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ １１８：１６０－１６７を参照のこと）、錐体光受容体ｃＧＭＰ開口型陽イオンチャネルベータサブユニット（ＣＮＧＢ３）（例えば、Ｋｏｈｌ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｅｕｒ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ．１３（３）：３０２を参照のこと）、グアニンヌクレオチド結合タンパク質（Ｇタンパク質）、アルファ形質導入活性ポリペプチド２（ＧＮＡＴ２）（ＡＣＨＭ４）、ならびにＡＣＨＭ５、ならびに欠損または欠失するとさまざまな形態の色覚異常が生じるポリペプチド（例えば、Ｌ－オプシン、Ｍ－オプシン、及びＳ－オプシン）が含まれる。Ｍａｎｃｕｓｏ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｎａｔｕｒｅ ４６１（７２６５）：７８４－７８７を参照のこと。

【0114】

例えば、適切なＣＮＧＡ３（ＡＣＨＭ２としても知られる）アイソフォーム１ポリペプチドは、図７Ｏに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸を含み得る。別の例として、適切なＣＮＧＡ３（ＡＣＨＭ２としても知られる）アイソフォーム２ポリペプチドは、図７Ｐに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸を含み得る。

【0115】

別の例として、適切なＣＮＧＢ３（ＡＣＨＭ３としても知られる）ポリペプチドは、図７Ｑに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸を含み得る。別の例として、ＧＮＡＴ２（ＡＣＨＭ４としても知られる）は、図７Ｒに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸を含み得る。

【0116】

部位特異的エンドヌクレアーゼ
場合によっては、目的の遺伝子産物は、遺伝子機能を部位特異的にノックダウンする部位特異的エンドヌクレアーゼであり、例えば、エンドヌクレアーゼは、網膜疾患と関連する対立遺伝子をノックアウトする。例えば、野生型であるときに網膜の構造タンパク質であり、及び／または正常な網膜機能を提供する遺伝子の欠陥コピーを優性対立遺伝子がコードする場合、部位特異的エンドヌクレアーゼは、その欠陥対立遺伝子を標的とし、その欠陥対立遺伝子をノックアウトすることができる。場合によっては、部位特異的エンドヌクレアーゼは、ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼである。

【0117】

欠陥対立遺伝子のノックアウトに加えて、部位特異的ヌクレアーゼは、欠陥対立遺伝子によってコードされるタンパク質の機能性コピーをコードするドナーＤＮＡを用いた相同組換えを促進するためにも使用することができる。したがって、例えば、対象ｒＡＡＶビリオンは、欠陥対立遺伝子をノックアウトする部位特異的エンドヌクレアーゼの送達にも使用することができると共に、欠陥対立遺伝子の機能性コピーを送達することで欠陥対立遺伝子を修復し、それによって機能性の網膜タンパク質（例えば、機能性レチノスキシン、機能性ＲＰＥ６５、機能性ペリフェリンなど）を産生させるためにも使用することができる。例えば、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ ４７５：２１７を参照のこと。いくつかの実施形態では、対象ｒＡＡＶビリオンは、部位特異的エンドヌクレアーゼをコードする異種ヌクレオチド配列と、欠陥対立遺伝子の機能性コピーをコードする異種ヌクレオチド配列とを含み、機能性コピーは、機能性の網膜タンパク質をコードする。機能性の網膜タンパク質には、例えば、レチノスキシン、ＲＰＥ６５、網膜色素変性症ＧＴＰａｓｅ調節因子（ＲＧＰＲ）相互作用タンパク質－１、ペリフェリン、ペリフェリン－２、ＲｄＣＶＦ、及び同様のものが含まれる。

【0118】

使用に適した部位特異的エンドヌクレアーゼには、例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、メガヌクレアーゼ、及び転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）が含まれ、そのような部位特異的エンドヌクレアーゼは、非天然起源のものであり、特定の遺伝子を標的とするように改変される。そのような部位特異的ヌクレアーゼは、ゲノム内の特定の位置を切断するように操作することができ、その後、非相同末端結合によって切断が修復され、これと同時に、いくつかのヌクレオチドの挿入または欠失が生じ得る。そのとき、そのような部位特異的エンドヌクレアーゼ（「ＩＮＤＥＬ」とも称される）によって、タンパク質がフレームから外れ、遺伝子が効率的にノックアウトされる。例えば、米国特許公開第２０１１／０３０１０７３号を参照のこと。適切な部位特異的エンドヌクレアーゼには、操作メガヌクレアーゼ再操作ホーミングエンドヌクレアーゼが含まれる。適切なエンドヌクレアーゼには、Ｉ－Ｔｅｖｌヌクレアーゼが含まれる。適切なメガヌクレアーゼには、Ｉ－Ｓｃｅ１（例えば、Ｂｅｌｌａｉｃｈｅ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５２：１０３７を参照のこと）、及びＩ－Ｃｒｅ１（例えば、Ｈｅａｔｈ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ Ｓｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ４：４６８を参照のこと）が含まれる。

【0119】

ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼ
場合によっては、遺伝子産物は、ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼである。場合によっては、遺伝子産物は、ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含むＲＮＡである。場合によっては、遺伝子産物は、ガイドＲＮＡであり、例えば、シングルガイドＲＮＡである。場合によっては、遺伝子産物は、１）ガイドＲＮＡ、及び２）ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼである。ガイドＲＮＡは、ａ）ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼに結合するタンパク質結合領域と、ｂ）標的核酸に結合する領域とを含み得る。ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼは、本明細書で「ゲノム編集ヌクレアーゼ」とも称される。

【0120】

適切なゲノム編集ヌクレアーゼの例は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、クラス２のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（ＩＩ型、Ｖ型、またはＶＩ型のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼなど））である。したがって、ゲノム標的化組成物は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、クラス２のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（ＩＩ型、Ｖ型、またはＶＩ型のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼなど））を含み得る。場合によっては、ゲノム標的化組成物は、クラス２のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼを含む。場合によっては、ゲノム標的化組成物は、クラス２のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９タンパク質）を含む。場合によっては、ゲノム標的化組成物は、クラス２のＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃｐｆ１タンパク質、Ｃ２ｃ１タンパク質、またはＣ２ｃ３タンパク質）を含む。場合によっては、ゲノム標的化組成物は、クラス２のＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃ２ｃ２タンパク質）を含む。

【0121】

場合によっては、ゲノム編集ヌクレアーゼは、異種ポリペプチド（「融合パートナー」とも称される）に融合した融合タンパク質である。場合によっては、ゲノム編集ヌクレアーゼは、細胞内局在化を生じさせるアミノ酸配列（融合パートナー）に融合され、すなわち、融合パートナーは、細胞内局在化配列（例えば、核へと標的指向化するための１つまたは複数の核局在化シグナル（ＮＬＳ）、２つ以上のＮＬＳ、３つ以上のＮＬＳなど）である。

【0122】

場合によっては、ゲノム編集エンドヌクレアーゼは、ＩＩ型のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓｅエンドヌクレアーゼである。場合によっては、ゲノム編集エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ポリペプチドである。Ｃａｓ９タンパク質は、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡのタンパク質結合セグメントとそれが結合することによって標的核酸配列（例えば、染色体配列または染色体外配列（例えば、エピソーム配列、ミニサークル配列、ミトコンドリア配列、葉緑体配列など））内の標的部位へと導かれる（例えば、標的部位で安定化する）。場合によっては、Ｃａｓ９ポリペプチドは、図８Ａに示されるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または９９％超のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。場合によっては、本開示の組成物または方法において使用されるＣａｓ９ポリペプチドは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓのＣａｓ９（ｓａＣａｓ９）ポリペプチドである。場合によっては、ｓａＣａｓ９ポリペプチドは、図８Ｂに示されるｓａＣａｓ９のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0123】

場合によっては、適切なＣａｓ９ポリペプチドは、高忠実度（ＨＦ）のＣａｓ９ポリペプチドである。Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｎａｔｕｒｅ ５２９：４９０を参照のこと。例えば、図８Ａに示されるアミノ酸配列のアミノ酸Ｎ４９７、アミノ酸Ｒ６６１、アミノ酸Ｑ６９５、及びアミノ酸Ｑ９２６は、例えば、アラニンで置換される。例えば、ＨＦＣａｓ９ポリペプチドは、図８Ａに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得、アミノ酸Ｎ４９７、アミノ酸Ｒ６６１、アミノ酸Ｑ６９５、及びアミノ酸Ｑ９２６は、例えば、アラニンで置換される。

【0124】

場合によっては、適切なＣａｓ９ポリペプチドは、改変されたＰＡＭ特異性を示す。例えば、Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｎａｔｕｒｅ ５２３：４８１を参照のこと。

【0125】

場合によっては、ゲノム編集エンドヌクレアーゼは、Ｖ型のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼである。場合によっては、Ｖ型のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃｐｆ１タンパク質である。場合によっては、Ｃｐｆ１タンパク質は、図８Ｃに示されるＣｐｆ１のアミノ酸配列に対して少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0126】

クラス２のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９タンパク質、Ｖ型またはＶＩ型のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質、Ｃｐｆ１タンパク質など）に結合し、標的核酸内の特定の位置へと複合体を標的指向化する核酸は、本明細書で「ガイドＲＮＡ」または「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓガイド核酸」または「ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ」と称される。ガイドＲＮＡは、標的指向性セグメントを含むことによって複合体（ＲＮＰ複合体）に標的特異性を付与し、標的指向性セグメントは、ガイド配列（本明細書で標的指向性配列とも称される）を含み、ガイド配列は、標的核酸の配列に相補的なヌクレオチド配列である。

【0127】

場合によっては、ガイドＲＮＡは、「アクチベーター」及び「ターゲッター」という２つの別々の核酸分子を含み、本明細書で「デュアルガイドＲＮＡ」、「二重分子ガイドＲＮＡ」、「二分子ガイドＲＮＡ」、または「ｄｇＲＮＡ」と称される。場合によっては、ガイドＲＮＡは、１つの分子（例えば、クラス２のいくつかのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質については、対応するガイドＲＮＡは、単一の分子であり、場合によっては、アクチベーターとターゲッターとは、例えば介在ヌクレオチドを介して、互いに共有結合で連結される）であり、ガイドＲＮＡは、「シングルガイドＲＮＡ」、「単一分子ガイドＲＮＡ」、「一分子ガイドＲＮＡ」、または単に「ｓｇＲＮＡ」と称される。

【0128】

遺伝子産物がＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼであるか、またはＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼとガイドＲＮＡとの両方である場合、遺伝子産物は、標的核酸を改変することができる。場合によっては、例えば、標的核酸が欠陥対立遺伝子に有害な変異（例えば、網膜細胞の標的核酸における有害な変異）を含む場合、ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼ／ガイドＲＮＡ複合体は、有害な変異を修正するヌクレオチド配列を含むドナー核酸（例えば、欠陥対立遺伝子によってコードされるタンパク質の機能性コピーをコードするヌクレオチド配列を含むドナー核酸）と共に、有害な変異の修正（例えば、相同組換え修復（ＨＤＲ）を介するもの）に使用することができる。

【0129】

場合によっては、遺伝子産物は、ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼ及び２つの別々のｓｇＲＮＡであり、２つの別々のｓｇＲＮＡは、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を介して標的核酸を欠失させる。

【0130】

本開示は、個体の網膜細胞における標的核酸の改変方法を提供し、標的核酸は、有害な変異を含み、方法は、本開示のｒＡＡＶビリオンを（例えば、眼内投与、硝子体内投与などによって）個体に投与することを含み、ｒＡＡＶビリオンは、ｉ）ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ）をコードするヌクレオチド配列と、ｉｉ）標的核酸に相補的なヌクレオチド配列を含むｓｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列と、ｉｉｉ）有害な変異を修正するヌクレオチド配列を含むドナー鋳型ＤＮＡをコードするヌクレオチド配列とを含む異種核酸を含む。ｒＡＡＶビリオンが投与されると、ＨＤＲによって標的核酸における有害な変異が修正される。

【0131】

本開示は、個体の網膜細胞における標的核酸の改変方法を提供し、標的核酸は、有害な変異を含み、方法は、本開示のｒＡＡＶビリオンを（例えば、眼内投与、硝子体内投与などによって）個体に投与することを含み、ｒＡＡＶビリオンは、ｉ）ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ）をコードするヌクレオチド配列と、ｉｉ）標的核酸における第１の配列に相補的なヌクレオチド配列を含む第１のｓｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列と、ｉｉｉ）標的核酸における第２の配列に相補的なヌクレオチド配列を含む第２のｓｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列とを含む異種核酸を含む。ｒＡＡＶビリオンが投与されると、ＮＨＥＪによって標的核酸における有害な変異が除去される。

【0132】

調節配列
場合によっては、目的の遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は、転写制御要素に機能可能なように連結される。例えば、場合によっては、目的の遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は、構成的プロモーターに機能可能なように連結される。他の場合では、目的の遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は、誘導性プロモーターに機能可能なように連結される。場合によっては、目的の遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は、組織特異的または細胞型特異的な調節要素に機能可能なように連結される。例えば、場合によっては、目的の遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は、網膜細胞特異的プロモーターに機能可能なように連結される。例えば、場合によっては、目的の遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は、光受容体特異的調節要素（例えば、光受容体特異的プロモーター）に機能可能なように連結され、例えば、光受容体細胞において機能可能なように連結された遺伝子を選択的に発現させる調節要素に機能可能なように連結される。適切な光受容体特異的調節要素には、例えば、ロドプシンプロモーター、ロドプシンキナーゼプロモーター（Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．４４：４０７６）、ベータホスホジエステラーゼ遺伝子プロモーター（Ｎｉｃｏｕｄ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．９：１０１５）、網膜色素変性症遺伝子プロモーター（前出のＮｉｃｏｕｄ ｅｔ ａｌ．（２００７））、受容体間レチノイド結合タンパク質（ＩＲＢＰ）遺伝子エンハンサー（前出のＮｉｃｏｕｄ ｅｔ ａｌ．（２００７））、ＩＲＢＰ遺伝子プロモーター（Ｙｏｋｏｙａｍａ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｅｘｐ Ｅｙｅ Ｒｅｓ．５５：２２５）が含まれる。

【0133】

医薬組成物
本開示は、ａ）上記の対象ｒＡＡＶビリオンと、ｂ）医薬的に許容可能な担体、希釈剤、賦形剤、または緩衝剤とを含む医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態では、医薬的に許容可能な担体、希釈剤、賦形剤、または緩衝剤は、ヒトにおける使用に適したものである。

【0134】

そのような賦形剤、担体、希釈剤、及び緩衝剤には、過度の毒性を伴うことなく投与することができる任意の医薬物質が含まれる。医薬的に許容可能な賦形剤には、限定はされないが、水、生理食塩水、グリセロール、及びエタノールなどの液体が含まれる。医薬的に許容可能な塩をそこに含めることができ、こうした医薬的に許容可能な塩は、例えば、鉱酸塩（塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩、及び同様のものなど）、ならびに有機酸塩（酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩、及び同様のものなど）である。さらに、そのような媒体には、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質、及び同様のものなどの補助物質が存在し得る。医薬的に許容可能な賦形剤は、当該技術分野においてさまざまなものが知られており、それらを本明細書で詳細に述べる必要はない。医薬的に許容可能な賦形剤は、さまざまな刊行物において十分に記載されており、こうした刊行物には、例えば、Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ（２０００）“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，”２０ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ（１９９９）Ｈ．Ｃ．Ａｎｓｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，７^th ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ、及びＨａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ（２０００）Ａ．Ｈ．Ｋｉｂｂｅ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，３^rd ｅｄ．Ａｍｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃが含まれる。

【0135】

網膜細胞への遺伝子産物の送達方法、及び治療方法
本開示は、個体の網膜細胞への遺伝子産物の送達方法を提供し、方法は、上記の対象ｒＡＡＶビリオンを個体に投与することを含む。遺伝子産物は、上記のポリペプチドもしくは干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、及び同様のもの）、アプタマー、または部位特異的エンドヌクレアーゼ（例えば、ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼ）であり得る。網膜細胞への遺伝子産物の送達によって、網膜疾患が治療され得る。網膜細胞は、光受容体、網膜神経節細胞、ミュラー細胞、双極細胞、アマクリン細胞、水平細胞、または網膜色素上皮細胞であり得る。場合によっては、網膜細胞は、光受容体細胞（例えば、杆体細胞または錐体細胞）である。

【0136】

本開示は、網膜細胞における標的核酸の改変方法を提供し、方法は、網膜細胞を、１）ガイドＲＮＡに結合するＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸を含む本開示のｒＡＡＶビリオン、及び２）ガイドＲＮＡと接触させることを含む。本開示は、網膜細胞における標的核酸の改変方法を提供し、方法は、網膜細胞を本開示のｒＡＡＶビリオンと接触させることを含み、ｒＡＡＶビリオンは、ｉ）ガイドＲＮＡに結合するＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼと、ｉｉ）ガイドＲＮＡとをコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸を含む。場合によっては、方法は、網膜細胞をドナー鋳型ＤＮＡと接触させることを含む。場合によっては、ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ポリペプチドである。場合によっては、ガイドＲＮＡは、シングルガイドＲＮＡである。

【0137】

本開示は、眼疾患（例えば、網膜疾患）の治療方法を提供し、方法は、それを必要とする個体に対して上記の対象ｒＡＡＶビリオンを有効量で投与することを含む。対象ｒＡＡＶビリオンは、眼内注射、硝子体内注射、または任意の他の簡便な投与様式もしくは投与経路によって投与することができる。他の簡便な投与様式または投与経路には、例えば、静脈内のもの、鼻腔内のものなどが含まれる。

【0138】

「治療的に有効な量」は、実験及び／または臨床試験を介して決定することができる比較的広い範囲に含まれることになる。例えば、インビボの注射、すなわち、眼への直接注射については、治療的に有効な用量は、約１０⁶ ～約１０¹⁵個のオーダーのｒＡＡＶビリオンとなり、例えば、約１０⁸ ～１０¹²個のオーダーのｒＡＡＶビリオンとなる。インビトロの形質導入については、細胞に送達されるべき有効量のｒＡＡＶビリオンは、約１０⁸ ～約１０¹³個のオーダーのｒＡＡＶビリオンとなる。他の有効な投与量は、用量反応曲線を確立する日常的な試験を介して当業者が容易に確立することができる。

【0139】

いくつかの実施形態では、所望のレベルの遺伝子発現を達成するために複数回の投与（例えば、２回、３回、４回、またはそれを超える回数の投与）が用いられ得る。場合によっては、複数回の投与は、さまざまな間隔（例えば、毎日、毎週、１ヶ月に２回、毎月、３ヶ月ごと、６ヶ月ごと、毎年など）で実施される。場合によっては、複数回の投与は、１ヶ月～２ヶ月、２ヶ月～４ヶ月、４ヶ月～８ヶ月、８ヶ月～１２ヶ月、１年～２年、２年～５年、または５年超の期間にわたって実施される。

【0140】

対象の方法を使用して治療することができる眼疾患には、限定はされないが、急性斑状視神経網膜症、ベーチェット病、脈絡膜血管新生、糖尿病性ぶどう膜炎、ヒストプラスマ症、黄斑変性（急性黄斑変性、非滲出性加齢黄斑変性、及び滲出性加齢黄斑変性など）、浮腫（黄斑浮腫、嚢胞様黄斑浮腫、及び糖尿病性黄斑浮腫など）、多巣性脈絡膜炎、後眼部または後眼部位に影響する眼外傷、眼腫瘍、網膜障害（網膜中心静脈閉塞症、糖尿病性網膜症（増殖性糖尿病性網膜症を含む）、増殖性硝子体網膜症（ＰＶＲ）、網膜動脈閉塞性疾患、網膜剥離、ぶどう膜網膜疾患、交感性眼炎など）、フォークト・小柳・原田（ＶＫＨ）症候群、ぶどう膜滲出、眼のレーザー治療によって生じるか、または影響を受ける後眼の病状、光線力学的治療によって生じるか、または影響を受ける後眼の病状、光凝固、放射線網膜症、網膜上膜障害、網膜静脈分枝閉塞症、前部虚血性視神経症、非網膜症糖尿病性網膜機能不全、網膜分離症、網膜色素変性症、緑内障、アッシャー症候群、錐体－杆体ジストロフィー、シュタルガルト病（黄色斑眼底）、遺伝性黄斑変性、脈絡網膜変性、レーバー先天黒内障、先天性停止性夜盲症、全脈絡膜萎縮、バルデ・ビードル症候群、斑状毛細血管拡張症、レーベル遺伝性視神経症、未熟児網膜症、色覚の障害（色覚異常、１型２色覚、２型２色覚、及び３型２色覚を含む）、ならびにビエッティ（Ｂｉｅｔｔｉ）結晶状ジストロフィーが含まれる。

【0141】

核酸及び宿主細胞
本開示は、上記の対象変異アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸を提供し、変異ＡＡＶカプシドタンパク質は、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質と比較して約５つのアミノ酸～約２０個のアミノ酸の挿入断片をＧＨループまたはループＩＶに含み、変異カプシドタンパク質は、ＡＡＶビリオンに存在するとき、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによる網膜細胞に対する感染力と比較して、網膜細胞に対する感染力を増加させる。対象の単離された核酸は、ＡＡＶベクターであり得、例えば、組換えＡＡＶベクターであり得る。

【0142】

挿入ペプチド
対象核酸によってコードされる変異ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＡＡＶカプシドのＧＨループに挿入された約５つのアミノ酸～約２０個のアミノ酸の長さの挿入ペプチドを有する。挿入ペプチドは、５つのアミノ酸、６つのアミノ酸、７つのアミノ酸、８つのアミノ酸、９つのアミノ酸、１０個のアミノ酸、１１個のアミノ酸、１２個のアミノ酸、１３個のアミノ酸、１４個のアミノ酸、１５個のアミノ酸、１６個のアミノ酸、１７個のアミノ酸、１８個のアミノ酸、１９個のアミノ酸、または２０個のアミノ酸の長さを有する。適切な挿入ペプチドは、上記のものである。適切な挿入ペプチドには、上記の式Ｉ～Ｘのいずれか１つのペプチドが含まれる。

【0143】

対象組換えＡＡＶベクターは、上記の対象組換えＡＡＶビリオンを生成するために使用することができる。したがって、本開示は、適切な細胞に導入されると対象組換えＡＡＶビリオンを産生することができる組換えＡＡＶベクターを提供する。

【0144】

本発明は、宿主細胞をさらに提供し、こうした宿主細胞は、例えば、対象核酸を含む単離された（遺伝子改変）宿主細胞である。対象宿主細胞は、単離された細胞であり得、例えば、インビトロで培養された細胞である。対象宿主細胞は、以下の対象ｒＡＡＶビリオンの産生に有用である。対象宿主細胞が対象ｒＡＡＶビリオンの産生に使用される場合、対象宿主細胞は、「パッケージング細胞」と称される。いくつかの実施形態では、対象宿主細胞は、対象核酸で安定的に遺伝子改変される。他の実施形態では、対象宿主細胞は、対象核酸で一過性に遺伝子改変される。

【0145】

対象核酸は、確立された手法を使用して安定的または一過性に宿主細胞に導入され、こうした手法には、限定はされないが、電気穿孔、リン酸カルシウム沈殿、リポソーム介在型遺伝子導入、及び同様のものが含まれる。安定な形質転換を行うために、対象核酸は、一般に、選択可能マーカーをさらに含むことになり、こうした選択可能マーカーは、例えば、いくつかのよく知られた選択可能マーカー（ネオマイシン耐性及び同様のものなど）のいずれかである。

【0146】

対象宿主細胞は、さまざまな細胞のいずれかに対象核酸を導入することによって生成され、対象核酸が導入されるこうした細胞は、例えば、哺乳類細胞（例えば、マウス細胞及び霊長類細胞（例えば、ヒト細胞）を含む）である。適切な哺乳類細胞には、限定はされないが、初代細胞及び細胞株が含まれ、適切な細胞株には、限定はされないが、２９３細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、３Ｔ３マウス線維芽細胞、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２線維芽細胞、ＣＨＯ細胞、及び同様のものが含まれる。適切な宿主細胞の例には、限定はされないが、例えば、ＨｅＬａ細胞（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）番号ＣＣＬ－２）、ＣＨＯ細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ９６１８、ＣＣＬ６１、ＣＲＬ９０９６）、２９３細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ－１５７３）、Ｖｅｒｏ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ－１６５８）、Ｈｕｈ－７細胞、ＢＨＫ細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ１０）、ＰＣ１２細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１７２１）、ＣＯＳ細胞、ＣＯＳ－７細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１６５１）、ＲＡＴ１細胞、マウスＬ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬＩ．３）、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１５７３）、ＨＬＨｅｐＧ２細胞、及び同様のものが含まれる。対象宿主細胞は、Ｓｆ９細胞などの昆虫細胞（ＡＡＶを産生する）に感染させるためにバキュロウイルスを使用して調製することもできる（例えば、米国特許第７，２７１，００２号、米国特許出願第１２／２９７，９５８号を参照のこと）。

【0147】

いくつかの実施形態では、対象の遺伝子改変宿主細胞は、上記の変異ＡＡＶカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸に加えて、１つまたは複数のＡＡＶｒｅｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む。他の実施形態では、対象宿主細胞は、ｒＡＡＶベクターをさらに含む。ｒＡＡＶビリオンは、対象宿主細胞を使用して生成することができる。ｒＡＡＶビリオンの生成方法は、例えば、米国特許公開第２００５／００５３９２２号及び米国特許公開第２００９／０２０２４９０号に記載されている。

【0148】

本開示の非限定的な態様の例
上述した本発明の対象の態様は、実施形態を含めて、単独で有利であるか、または１つもしくは複数の他の態様もしくは実施形態と組み合わせることで有利であり得る。前述した説明を限定するものではないが、本開示のある特定の非限定的な態様が１～３４の番号を付けて以下に提供される。本開示を読めば当業者には明らかであろうが、個別に番号付けされた態様はそれぞれ、先行または後続の個別に番号付けされた態様のいずれかと共に使用または組み合わせることができる。これは、態様のすべてのそのような組み合わせを支援することを意図するものであり、以下に明示的に提供される態様の組み合わせに限定されるものではない。

【0149】

１．組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンであって、ａ）対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質と比較して約５つのアミノ酸～約２０個のアミノ酸の長さを有する異種ペプチドの挿入断片をカプシドタンパク質ＧＨループに含み、前記対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含む対照ＡＡＶビリオンによる網膜細胞に対する感染力と比較して、前記網膜細胞に対する感染力を増加させる、変異ＡＡＶカプシドタンパク質と、ｂ）異種遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸とを含む、ｒＡＡＶビリオン。
２．前記対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含む対照ＡＡＶビリオンによる網膜細胞に対する感染力と比較して、少なくとも５倍増加した感染力を前記網膜細胞に対して示す、態様１に記載のｒＡＡＶビリオン。
３．前記対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによる網膜細胞に対する感染力と比較して、少なくとも１０倍増加した感染力を前記網膜細胞に対して示す、態様１に記載のｒＡＡＶビリオン。
４．内顆粒層、外顆粒層、光受容体層、神経節細胞層、及び網膜色素上皮のうちの１つまたは複数に対して前記ｒＡＡＶビリオンが示す局在性は、内顆粒層、外顆粒層、光受容体層、神経節細胞層、または網膜色素上皮に対する前記対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによる局在性度合と比較して、少なくとも５倍増加している、態様１～３のいずれか１つに記載のｒＡＡＶビリオン。
５．前記挿入部位が、ＡＡＶ２のＶＰ１のアミノ酸５７０及びアミノ酸６１１に対応するアミノ酸の間であるか、または別のＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質の対応位置である、態様１～４のいずれか１つに記載のｒＡＡＶビリオン。

【0150】

６．前記挿入部位が、ＡＡＶ２のＶＰ１のアミノ酸５８７及びアミノ酸５８８に対応するアミノ酸の間に位置するか、または別のＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質の対応位置に位置する、態様１～５のいずれか１つに記載のｒＡＡＶビリオン。
７．遺伝子産物は、干渉ＲＮＡまたはアプタマーである、態様１～６のいずれか１つに記載のｒＡＡＶビリオン。
８．前記遺伝子産物は、ポリペプチドである、態様１～６のいずれか１つに記載のｒＡＡＶビリオン。
９．前記ポリペプチドは、神経保護ポリペプチド、抗血管新生ポリペプチド、または網膜細胞の機能を増進するポリペプチドである、態様８に記載のｒＡＡＶビリオン。
１０．前記ポリペプチドは、ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼである、態様８に記載のｒＡＡＶビリオン。

【0151】

１１．前記ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ポリペプチドである、態様１０に記載のｒＡＡＶビリオン。
１２．前記遺伝子産物は、ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡである、態様１０に記載のｒＡＡＶビリオン。
１３．ＧＨループに挿入される前記異種ペプチドは、式Ｉ～Ｘのいずれか１つのものである、態様１～１２のいずれか１つに記載のｒＡＡＶビリオン。
１４．前記異種ペプチドは、式Ｉ：Ｘ₁ Ｘ₂ Ｘ₃ Ｘ₄ Ｘ₅ Ｘ₆ Ｘ₇ Ｘ₈ Ｘ₉ Ｘ₁₀のペプチドであって、式中、Ｘ₁ が、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、またはＧｌｎであり、Ｘ₂ が、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、またはＶａｌであり、Ｘ₃ が、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ、Ａｒｇ、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、またはＴｙｒであり、Ｘ₄ が、存在するのであれば、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、またはＡｒｇであり、Ｘ₅ が、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、またはＴｙｒであり、Ｘ₆ が、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ、またはＩｌｅであり、Ｘ₇ が、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、またはＣｙｓであり、Ｘ₈ が、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｉｌｅ、またはＡｓｎであり、Ｘ₉ が、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、またはＡｌａであり、Ｘ₁₀が、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ａｓｐ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、またはＭｅｔである、態様１～１２のいずれか１つに記載のｒＡＡＶビリオン。
１５．前記異種ペプチドは、下記のアミノ酸配列のうちの１つを含む、態様１４に記載のｒＡＡＶビリオン。
（１）ＬＡＫＤＡＴＫＮＡ（配列番号４７）、（２）ＰＡＨＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号４８）、（３）ＬＡＨＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号４９）、（４）ＬＡＴＴＳＱＮＫＰＡ（配列番号５０）、（５）ＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡ（配列番号５１）、（６）ＩＡＲＧＶＡＰＳＳＡ（配列番号５２）、（７）ＬＡＰＤＳＴＴＲＳＡ（配列番号５３）、（８）ＬＡＫＧＴＥＬＫＰＡ（配列番号５４）、（９）ＬＡＩＩＤＡＴＫＮＡ（配列番号５５）、（１０）ＬＡＶＤＧＡＱＲＳＡ（配列番号５６）、（１１）ＰＡＰＱＤＴＴＫＫＡ（配列番号５７）、（１２）ＬＰＨＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号５８）、（１３）ＬＡＫＤＡＴＫＴＩＡ（配列番号５９）、（１４）ＬＡＫＱＱＳＡＳＴＡ（配列番号６０）、（１５）ＬＡＫＳＤＱＳＫＰＡ（配列番号６１）、（１６）ＬＳＨＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号６２）、（１７）ＬＡＡＮＱＰＳＫＰＡ（配列番号６３）、（１８）ＬＡＶＳＤＳＴＫＡＡ（配列番号６４）、（１９）ＬＡＡＱＧＴＡＫＫＰＡ（配列番号６５）、（２０）ＬＡＰＤＱＴＴＲＮＡ（配列番号６６）、（２１）ＬＡＡＳＤＳＴＫＡＡ（配列番号６７）、（２２）ＬＡＰＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号６８）、（２３）ＬＡＫＡＤＥＴＲＰＡ（配列番号６９）、（２４）ＬＡＨＱＤＴＡＫＮＡ（配列番号７０）、（２５）ＬＡＨＱＤＴＫＫＮＡ（配列番号７１）、（２６）ＬＡＨＱＤＴＴＫＨＡ（配列番号７２）、（２７）ＬＡＨＱＤＴＴＫＫＡ（配列番号７３）、（２８）ＬＡＨＱＤＴＴＲＮＡ（配列番号７４）、（２９）ＬＡＨＱＤＴＴＮＡ（配列番号７５）、（３０）ＬＡＨＱＧＴＴＫＮＡ（配列番号７６）、（３１）ＬＡＨＱＶＴＴＫＮＡ（配列番号７７）、（３２）ＬＡＩＳＤＱＳＫＰＡ（配列番号７８）、（３３）ＬＡＤＡＴＫＴＡ（配列番号７９）、（３４）ＬＡＫＤＴＴＫＮＡ（配列番号８０）、（３５）ＬＡＫＳＤＱＳＲＰＡ（配列番号８１）、（３６）ＬＡＰＱＤＴＫＫＮＡ（配列番号８２）、（３７）ＬＡＴＳＤＳＴＫＡＡ（配列番号８３）、（３８）ＬＡＶＤＧＳＱＲＳＡ（配列番号８４）、（３９）ＬＰＩＳＤＱＴＫＨＡ（配列番号８５）、（４０）ＬＰＫＤＡＴＫＴＩＡ（配列番号８６）、（４１）ＬＰＰＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号８７）、（４２）ＰＡＰＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号８８）、（４３）ＱＡＨＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号８９）、（４４）ＬＡＨＥＴＳＰＲＰＡ（配列番号９０）、（４５）ＬＡＫＳＴＳＴＡＰＡ（配列番号９１）、（４６）ＬＡＤＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号９２）、（４７）ＬＡＥＳＤＱＳＫＰＡ（配列番号９３）、（４８）ＬＡＨＫＤＴＴＫＮＡ（配列番号９４）、（４９）ＬＡＨＫＴＱＱＫＭ（配列番号９５）、（５０）ＬＡＨＱＤＴＴＥＮＡ（配列番号９６）、（５１）ＬＡＨＱＤＴＴＩＮＡ（配列番号９７）、（５２）ＬＡＨＱＤＴＴＫＫＴ（配列番号９８）、（５３）ＬＡＨＱＤＴＴＫＮＤ（配列番号９９）、（５４）ＬＡＨＱＤＴＴＫＮＴ（配列番号１００）、（５５）ＬＡＨＱＤＴＴＫＮＶ（配列番号１０１）、（５６）ＬＡＨＱＤＴＴＫＴＭ（配列番号１０２）、（５７）ＬＡＨＱＮＴＴＫＮＡ（配列番号１０３）、（５８）ＬＡＨＲＤＴＴＫＮＡ（配列番号１０４）、（５９）ＬＡＩＳＤＱＴＮＨＡ（配列番号１０５）、（６０）ＬＡＫＱＫＳＡＳＴＡ（配列番号１０６）、（６１）ＬＡＫＳＤＱＣＫＰＡ（配列番号１０７）、（６２）ＬＡＫＳＤＱＳＫＰＤ（配列番号１０８）、（６３）ＬＡＫＳＤＱＳＮＰＡ（配列番号１０９）、（６４）ＬＡＫＳＹＱＳＫＰＡ（配列番号１１０）、（６５）ＬＡＮＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号１１１）、（６６）ＬＡＰＱＮＴＴＫＮＡ（配列番号１１２）、（６７）ＬＡＰＳＳＩＱＫＰＡ（配列番号１１３）、（６８）ＬＡＱＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号１１４）、（６９）ＬＡＹＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号１１５）、（７０）ＬＤＨＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号１１６）、（７１）ＬＤＨＱＤＴＴＫＳＡ（配列番号１１７）、（７２）ＬＧＨＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号１１８）、（７３）ＬＰＨＱＤＴＴＫＮＤ（配列番号１１９）、（７４）ＬＰＨＱＤＴＴＫＮＴ（配列番号１２０）、（７５）ＬＰＨＱＤＴＴＮＮＡ（配列番号１２１）、（７６）ＬＴＨＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号１２２）、（７７）ＬＴＫＤＡＴＫＴＩＡ（配列番号１２３）、（７８）ＬＴＰＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号１２４）、及び（７９）ＬＶＨＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号１２５）。

【0152】

１６．前記異種ペプチドは、式ＩＩ：Ｘ₁ Ｘ₂ Ｘ₃ Ｘ₄ Ｘ₅ Ｘ₆ Ｘ₇ Ｘ₈ Ｘ₉ Ｘ₁₀のペプチドであって、式中、Ｘ₁ が、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、またはＰｒｏであり、Ｘ₂ が、Ａｌａ、Ｐｒｏ、またはＳｅｒであり、Ｘ₃ が、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ、Ａｒｇ、またはＡｌａであり、Ｘ₄ が、存在するのであれば、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、またはＡｓｎであり、Ｘ₅ が、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、またはＡｌａであり、Ｘ₆ が、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、またはＰｒｏであり、Ｘ₇ が、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、またはＡｌａであり、Ｘ₈ が、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、またはＴｈｒであり、Ｘ₉ が、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、またはＡｌａであり、Ｘ₁₀が、Ａｌａである、態様１～１２のいずれか１つに記載のｒＡＡＶビリオン。
１７．前記ペプチドは、下記のアミノ酸配列のうちの１つを含む、態様１６に記載のｒＡＡＶビリオン。
（１）ＬＡＫＤＡＴＫＮＡ（配列番号４７）、（２）ＰＡＨＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号４８）、（３）ＬＡＨＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号４９）、（４）ＬＡＴＴＳＱＮＫＰＡ（配列番号５０）、（５）ＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡ（配列番号５１）、（６）ＩＡＲＧＶＡＰＳＳＡ（配列番号５２）、（７）ＬＡＰＤＳＴＴＲＳＡ（配列番号５３）、（８）ＬＡＫＧＴＥＬＫＰＡ（配列番号５４）、（９）ＬＡＩＩＤＡＴＫＮＡ（配列番号５５）、（１０）ＬＡＶＤＧＡＱＲＳＡ（配列番号５６）、（１１）ＰＡＰＱＤＴＴＫＫＡ（配列番号５７）、（１２）ＬＰＨＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号５８）、（１３）ＬＡＫＤＡＴＫＴＩＡ（配列番号５９）、（１４）ＬＡＫＱＱＳＡＳＴＡ（配列番号６０）、（１５）ＬＡＫＳＤＱＳＫＰＡ（配列番号６１）、（１６）ＬＳＨＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号６２）、（１７）ＬＡＡＮＱＰＳＫＰＡ（配列番号６３）、（１８）ＬＡＶＳＤＳＴＫＡＡ（配列番号６４）、（１９）ＬＡＡＱＧＴＡＫＫＰＡ（配列番号６５）、（２０）ＬＡＰＤＱＴＴＲＮＡ（配列番号６６）、（２１）ＬＡＡＳＤＳＴＫＡＡ（配列番号６７）、（２２）ＬＡＰＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号６８）、（２３）ＬＡＫＡＤＥＴＲＰＡ（配列番号６９）、（２４）ＬＡＨＱＤＴＡＫＮＡ（配列番号７０）、（２５）ＬＡＨＱＤＴＫＫＮＡ（配列番号７１）、（２６）ＬＡＨＱＤＴＴＫＨＡ（配列番号７２）、（２７）ＬＡＨＱＤＴＴＫＫＡ（配列番号７３）、（２８）ＬＡＨＱＤＴＴＲＮＡ（配列番号７４）、（２９）ＬＡＨＱＤＴＴＮＡ（配列番号７５）、（３０）ＬＡＨＱＧＴＴＫＮＡ（配列番号７６）、（３１）ＬＡＨＱＶＴＴＫＮＡ（配列番号７７）、（３２）ＬＡＩＳＤＱＳＫＰＡ（配列番号７８）、（３３）ＬＡＤＡＴＫＴＡ（配列番号７９）、（３４）ＬＡＫＤＴＴＫＮＡ（配列番号８０）、（３５）ＬＡＫＳＤＱＳＲＰＡ（配列番号８１）、（３６）ＬＡＰＱＤＴＫＫＮＡ（配列番号８２）、（３７）ＬＡＴＳＤＳＴＫＡＡ（配列番号８３）、（３８）ＬＡＶＤＧＳＱＲＳＡ（配列番号８４）、（３９）ＬＰＩＳＤＱＴＫＨＡ（配列番号８５）、（４０）ＬＰＫＤＡＴＫＴＩＡ（配列番号８６）、（４１）ＬＰＰＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号８７）、及び（４２）ＰＡＰＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号８８）。
１８．前記ペプチドは、下記のアミノ酸配列のうちの１つを含む、態様１６に記載のｒＡＡＶビリオン。
（１）ＬＡＫＤＡＴＫＮＡ（配列番号４７）、（２）ＰＡＨＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号４８）、（３）ＬＡＨＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号４９）、（４）ＬＡＴＴＳＱＮＫＰＡ（配列番号５０）、（５）ＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡ（配列番号５１）、（６）ＩＡＲＧＶＡＰＳＳＡ（配列番号５２）、（７）ＬＡＰＤＳＴＴＲＳＡ（配列番号５３）、（８）ＬＡＫＧＴＥＬＫＰＡ（配列番号５４）、（９）ＬＡＩＩＤＡＴＫＮＡ（配列番号５５）、（１０）ＬＡＶＤＧＡＱＲＳＡ（配列番号５６）、（１１）ＰＡＰＱＤＴＴＫＫＡ（配列番号５７）、（１２）ＬＰＨＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号５８）、（１３）ＬＡＫＤＡＴＫＴＩＡ（配列番号５９）、（１４）ＬＡＫＱＱＳＡＳＴＡ（配列番号６０）、（１５）ＬＡＫＳＤＱＳＫＰＡ（配列番号６１）、（１６）ＬＳＨＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号６２）、（１７）ＬＡＡＮＱＰＳＫＰＡ（配列番号６３）、及び（１８）ＬＡＶＳＤＳＴＫＡＡ（配列番号６４）。
１９．ａ）態様１～１８のいずれか１つに記載の組換えアデノ随伴ウイルスビリオンと、ｂ）医薬的に許容可能な賦形剤とを含む、医薬組成物。
２０．個体の網膜細胞へ遺伝子産物を送達する方法であって、態様１～１８のいずれか１つに記載の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンを前記個体に投与することを含む、方法。

【0153】

２１．前記遺伝子産物は、ポリペプチドである、態様２０に記載の方法。
２２．前記遺伝子産物は、低分子干渉ＲＮＡまたはアプタマーである、態様２０に記載の方法。
２３．前記ポリペプチドは、神経保護因子、抗血管新生ポリペプチド、抗アポトーシス因子、または網膜細胞の機能を増進するポリペプチドである、態様２１に記載の方法。
２４．前記ポリペプチドは、グリア細胞由来神経栄養因子、線維芽細胞増殖因子２、ニュールツリン、毛様体神経栄養因子、神経成長因子、脳由来神経栄養因子、上皮増殖因子、ロドプシン、Ｘ連鎖アポトーシス抑制物質、レチノスキシン、ＲＰＥ６５、網膜色素変性症ＧＴＰａｓｅ相互作用タンパク質－１、ペリフェリン、ペリフェリン－２、ロドプシン、ＲｄＣＶＦ、網膜色素変性症ＧＴＰａｓｅ調節因子（ＲＰＧＲ）、またはソニックヘッジホッグである、態様２１に記載の方法。
２５．前記ポリペプチドは、ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼである、態様２１に記載の方法。

【0154】

２６．眼疾患を治療する方法であって、治療を必要とする個体に対して態様１～１８のいずれか１つに記載の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンを有効量で投与することを含む、方法。
２７．前記投与は、眼内注射によるものである、態様２６に記載の方法。
２８．前記投与は、硝子体内注射によるものである、態様２６に記載の方法。
２９．前記眼疾患は、緑内障、網膜色素変性症、黄斑変性、網膜分離症、レーバー先天黒内障、糖尿病性網膜症、色覚異常（ａｃｈｒｏｍｏｔｏｐｓｉａ）、または色覚異常（ｃｏｌｏｒ ｂｌｉｎｄｎｅｓｓ）である、態様２６に記載の方法。
３０．変異アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸であって、前記変異ＡＡＶカプシドタンパク質が、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質と比較して約５つのアミノ酸～約２０個のアミノ酸の挿入断片をカプシドタンパク質ＧＨループに含み、前記変異カプシドタンパク質が、ＡＡＶビリオンに存在するとき、網膜細胞に対する前記ＡＡＶビリオンの感染力を増加させ、前記アミノ酸挿入断片が、天然のＡＡＶカプシドのＧＨループに存在し、前記挿入断片が、式Ｉ～Ｘのいずれか１つのペプチドである、核酸。

【0155】

３１．前記挿入部位が、ＡＡＶ２のアミノ酸５８７とアミノ酸５８８との間、ＡＡＶ１のアミノ酸５９０とアミノ酸５９１との間、ＡＡＶ５のアミノ酸５７５とアミノ酸５７６との間、ＡＡＶ６のアミノ酸５９０とアミノ酸５９１との間、ＡＡＶ７のアミノ酸５８９とアミノ酸５９０との間、ＡＡＶ８のアミノ酸５９０とアミノ酸５９１との間、ＡＡＶ９のアミノ酸５８８とアミノ酸５８９との間、またはＡＡＶ１０のアミノ酸５８８とアミノ酸５８９との間である、態様３０に記載の核酸。
３２．態様３０または態様３１に記載の核酸を含む、単離された遺伝子改変宿主細胞。
３３．約５つのアミノ酸～約２０個のアミノ酸の挿入断片を含む変異アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質であって、前記アミノ酸挿入断片が、天然のＡＡＶカプシドのＧＨループに存在し、前記挿入断片が、式Ｉ～Ｘのいずれか１つのペプチドである、変異ＡＡＶカプシドタンパク質。
３４．態様１～３３のいずれかでは、ＧＨループに挿入される前記異種ペプチドは、式Ｉ～Ｘのうちの１つであり得、
式Ｉは、Ｘ₁ Ｘ₂ Ｘ₃ Ｘ₄ Ｘ₅ Ｘ₆ Ｘ₇ Ｘ₈ Ｘ₉ Ｘ₁₀であって、式中、Ｘ₁ が、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、またはＧｌｎであり、Ｘ₂ が、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、またはＶａｌであり、Ｘ₃ が、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ、Ａｒｇ、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、またはＴｙｒであり、Ｘ₄ が、存在するのであれば、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、またはＡｒｇであり、Ｘ₅ が、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、またはＴｙｒであり、Ｘ₆ が、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ、またはＩｌｅであり、Ｘ₇ が、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、またはＣｙｓであり、Ｘ₈ が、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｉｌｅ、またはＡｓｎであり、Ｘ₉ が、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、またはＡｌａであり、Ｘ₁₀が、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ａｓｐ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、またはＭｅｔであり、
式ＩＩは、Ｘ₁ Ｘ₂ Ｘ₃ Ｘ₄ Ｘ₅ Ｘ₆ Ｘ₇ Ｘ₈ Ｘ₉ Ｘ₁₀であって、式中、Ｘ₁ が、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、またはＰｒｏであり、Ｘ₂ が、Ａｌａ、Ｐｒｏ、またはＳｅｒであり、Ｘ₃ が、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ、Ａｒｇ、またはＡｌａであり、Ｘ₄ が、存在するのであれば、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、またはＡｓｎであり、Ｘ₅ が、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、またはＡｌａであり、Ｘ₆ が、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、またはＰｒｏであり、Ｘ₇ が、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、またはＡｌａであり、Ｘ₈ が、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、またはＴｈｒであり、Ｘ₉ が、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、またはＡｌａであり、Ｘ₁₀が、Ａｌａであり、
式ＩＩＩは、Ｘ₁ Ｘ₂ Ｘ₃ Ｘ₄ Ｘ₅ Ｘ₆ Ｘ₇ Ｘ₈ Ｘ₉ Ｘ₁₀であって、式中、Ｘ₁ が、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、またはＰｒｏであり、Ｘ₂ が、Ａｌａ、Ｐｒｏ、またはＳｅｒであり、Ｘ₃ が、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ、Ａｒｇ、またはＡｌａであり、Ｘ₄ が、存在するのであれば、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、またはＡｓｎであり、Ｘ₅ が、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、またはＡｌａであり、Ｘ₆ が、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、またはＰｒｏであり、Ｘ₇ が、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、またはＡｌａであり、Ｘ₈ が、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、またはＴｈｒであり、Ｘ₉ が、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、またはＡｌａであり、Ｘ₁₀が、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｖａｌ、またはＭｅｔであり、
式ＩＶは、Ｘ₁ Ｘ₂ Ｘ₃ Ｘ₄ Ｘ₅ Ｘ₆ Ｘ₇ Ｘ₈ Ｘ₉ Ｘ₁₀であって、式中、Ｘ₁ が、Ｌｅｕであり、Ｘ₂ が、Ａｌａであり、Ｘ₃ が、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、またはＶａｌであり、Ｘ₄ が、存在するのであれば、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、またはＧｌｙであり、Ｘ₅ が、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、またはＧｌｎであり、Ｘ₆ が、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｇｌｎ、またはＳｅｒであり、Ｘ₇ が、ＴｈｒまたはＳｅｒであり、Ｘ₈ が、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、またはＡｒｇであり、Ｘ₉ が、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、またはＳｅｒであり、Ｘ₁₀が、Ａｌａであり、
式Ｖは、Ｘ₁ Ｘ₂ Ｘ₃ Ｘ₄ Ｘ₅ Ｘ₆ Ｘ₇ Ｘ₈ Ｘ₉ Ｘ₁₀であって、式中、Ｘ₁ が、Ｌｅｕであり、Ｘ₂ が、Ａｌａであり、Ｘ₃ が、ＬｙｓまたはＨｉｓであり、Ｘ₄ が、存在するのであれば、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、またはＧｌｙであり、Ｘ₅ が、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、またはＧｌｎであり、Ｘ₆ が、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｇｌｎ、またはＳｅｒであり、Ｘ₇ が、ＴｈｒまたはＳｅｒであり、Ｘ₈ が、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、またはＡｒｇであり、Ｘ₉ が、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、またはＳｅｒであり、Ｘ₁₀が、Ａｌａであり、
式ＶＩは、Ｘ₁ Ｘ₂ Ｘ₃ Ｘ₄ Ｘ₅ Ｘ₆ Ｘ₇ Ｘ₈ Ｘ₉ Ｘ₁₀であって、式中、Ｘ₁ が、Ｌｅｕであり、Ｘ₂ が、Ａｌａであり、Ｘ₃ が、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｉｌｅ、またはＬｅｕであり、Ｘ₄ が、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｌｙｓ、またはＰｒｏであり、Ｘ₅ が、Ａｓｐ、Ｐｒｏ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、またはＡｒｇであり、Ｘ₆ が、Ｉｌｅ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｙｒ、Ａｓｐ、またはＧｌｕであり、Ｘ₇ が、Ｘ７は、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ａｌａ、またはＬｙｓであり、Ｘ₈ が、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ａｒｇ、またはＡｓｐであり、Ｘ₉ が、Ｐｒｏ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、またはＳｅｒであり、Ｘ₁₀が、Ａｌａであり、
式ＶＩＩは、ＬＡＨＱＤＴＴＫＸ₁ Ｘ₂ Ｘ₃ （配列番号１４８）であって、式中、Ｘ₁ が、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、またはＨｉｓであり、Ｘ₂ が、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、またはＡｓｐであり、Ｘ₃ が、存在するのであれば、Ａｌａであり、
式ＶＩＩＩは、ＬＡＸ₁ ＱＸ₂ ＴＸ₃ Ｘ₄ Ｘ₅ Ｘ₆ （配列番号１４９）であって、式中、Ｘ₁ が、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ａｓｐ、またはＨｉｓであり、Ｘ₂ が、ＧｌｙまたはＡｓｐであり、Ｘ₃ が、Ａｌａ、Ｔｈｒ、またはＬｙｓであり、Ｘ₄ が、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、またはＴｈｒであり、Ｘ₅ が、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、またはＴｈｒであり、Ｘ₆ が、存在するのであれば、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｖａｌ、またはＭｅｔであり、
式ＩＸは、Ｘ₁ ＡＸ₂ Ｘ₃ ＤＸ₄ ＴＫＸ₅ Ａ（配列番号１５０）であって、式中、Ｘ₁ が、ＶａｌまたはＬｅｕであり、Ｘ₂ が、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｈｉｓ、またはＡｓｐであり、Ｘ₃ が、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、またはＧｌｎであり、Ｘ₄ が、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、またはＴｈｒであり、Ｘ₅ が、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、またはＬｙｓであり、
式Ｘは、Ｘ₁ Ｘ₂ Ｘ₃ ＡＸ₄ ＱＸ₅ ＴＸ₆ ＫＮＡ（配列番号１５１）であって、式中、Ｘ₁ が、存在するのであれば、Ｌｅｕであり、Ｘ₂ が、存在するのであれば、Ａｌａであり、Ｘ₃ が、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、またはＰｒｏであり、Ｘ₄ が、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、またはＴｙｒであり、Ｘ₅ が、Ａｓｎ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、またはＡｓｐであり、Ｘ₆ が、ＰｒｏまたはＴｈｒである。

【実施例】

【0156】

以下の実施例は、本発明の実施方法及び使用方法が当業者に完全に開示及び説明されるように示され、本発明者らが自身の発明であると見なすものの範囲の限定は意図されず、また、以下の実験が、実施実験のすべてであるか、または唯一の実施実験であると示すことも意図されない。使用される数字（例えば、量、温度など）に関して正確性を確保するための努力はなされているが、いくらかの実験上の誤差及び偏差は考慮されるべきである。別段の記載がない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏度であり、圧力は大気圧または大気圧付近である。標準的な省略形を使用することができ、例えば、ｂｐ（塩基対（複数可））、ｋｂ（キロベース（複数可））、ｐｌ（ピコリットル（複数可））、ｓまたはｓｅｃ（秒（複数可））、ｍｉｎ（分（複数可））、ｈまたはｈｒ（時間（複数可））ａａ（アミノ酸（複数可））、ｋｂ（キロベース（複数可））、ｂｐ（塩基対（複数可））、ｎｔ（ヌクレオチド（複数可））、ｉ．ｍ．（筋肉内の（筋肉内に））、ｉ．ｐ．（腹腔内の（腹腔内に））、ｓ．ｃ．（皮下の（皮下に））、及び同様のものを使用することができる。

【0157】

実施例１：ＡＡＶカプシド変異体を有するＡＡＶビリオンの生成及び特徴付け
大型動物の眼では、強力かつ複雑な障壁によってＡＡＶによる汎網膜感染が阻止されるが、インビボの反復スクリーニング法を使用することで、この障壁を克服することができるカプシド変異体を有するＡＡＶを創出した。イヌは、網膜変性疾患の重要な前臨床モデルであり、その眼のサイズ及び構造はヒトと類似しており、多くの型の網膜疾患がさまざまなイヌの種で天然に生じる。このスクリーニング法を使用することで、イヌの網膜において汎網膜感染を生じさせる能力を有する９６個のＡＡＶ変異体を同定した。ディープシークエンシングを使用することで、イヌ網膜において、スクリーニングしたＡＡＶ変異体のプールに由来するこうした変異体のうちの１８個の変異体の能力を定量化した。硝子体内注射の後に網膜細胞におけるウイルスのＤＮＡ及びｍＲＮＡのレベルに基づいて感染力を定量化した。こうした変異体は、大型動物及びヒトの眼における多種多様な遺伝子送達方針に使用することができるものである。

【0158】

ＡＡＶカプシド上の表面露出位置に無作為の２１ヌクレオチドの挿入断片（５’側の６ヌクレオチドのリンカーと３’側の３ヌクレオチドのリンカーとに挟まれた状態のもの）を含むペプチドディスプレイライブラリーを創出した。それぞれのウイルスゲノムが、そのゲノムがコードするカプシドタンパク質シェルの中に封入されるようにウイルスのパッケージングを生じさせた。したがって、選択を介して同定された機能的な改善を、ウイルスカプシドに内含されるゲノム配列と結び付けることができる。このライブラリーから、インビボの反復スクリーニング選択プロセスを使用することで、硝子体からイヌ網膜に感染する能力を有する変異体を同定した（図１）。力価が１０¹³～１０¹⁴ウイルスゲノム／ｍＬ（ｖｇ／ｍＬ）のウイルスを含む約２５０μＬをラウンドごとにイヌの眼に注射した。注射から三週間後、眼球を摘出し、網膜の中央領域及び周辺領域から網膜のパンチ試料を採取した。網膜組織からＲＰＥ細胞を分離し、組織は凍結させた。その後、網膜細胞からＤＮＡを採取し、単離した試料からポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）でｃａｐ遺伝子を増幅させた。ｃａｐ遺伝子は、次のＡＡＶパッケージングに使用した。

【0159】

図１は、イヌ網膜ＡＡＶ変異体の開発に使用した指向性進化法を示す。ペプチドディスプレイライブラリーを創出し、ＡＡＶベクターへのパッケージングの後、硝子体内注射を介してイヌの眼に注射した。反復ラウンドの選択を実施することで、ベクターのプールからＡＡＶ変異体を陽性に選択した。３ラウンドの選択の後、１ラウンドのエラープローンＰＣＲを実施し、その後、複数ラウンドの選択を追加実施した。

【0160】

５ラウンドの選択の後、Ｉｌｌｕｍｉｎａディープシークエンシングを使用することで、ＡＡＶ変異体のライブラリーにおける変異体の相対量を示し、この相対量がラウンドを経るごとに増加した変異体を同定した。ウイルスライブラリー内で示したものが増加するということは、陽性選択が生じており、硝子体からイヌ網膜に感染する能力が存在することを示している。インビボのスクリーニングに向けて、約１０⁷ 個の変異体のライブラリーから上位９６個の変異体を選択した。これら上位９６個の変異体は、表１に示される。

【0161】

表１
ペプチド番号 配列番号
LAKDATKNA 1 47
PAHQDTTKNA 2 48
LAHQDTTKNA 3 49
LATTSQNKPA 4 50
LAISDQTKHA 5 51
IARGVAPSSA 6 52
LAPDSTTRSA 7 53
LAKGTELKPA 8 54
LAIIDATKNA 9 55
LAVDGAQRSA 10 56
PAPQDTTKKA 11 57
LPHQDTTKNA 12 58
LAKDATKTIA 13 59
LAKQQSASTA 14 60
LAKSDQSKPA 15 61
LSHQDTTKNA 16 62
LAANQPSKPA 17 63
LAVSDSTKAA 18 64
LAAQGTAKPA 19 65
LAPDQTTRNA 20 66
LAASDSTKAA 21 67
LAPQDTTKNA 22 68
LAKADETRPA 23 69
LAHQDTAKNA 24 70
LAHQDTKKNA 25 71
LAHQDTTKHA 26 72
LAHQDTTKKA 27 73
LAHQDTTRNA 28 74
LAHQDTTTNA 29 75
LAHQGTTKNA 30 76
LAHQVTTKNA 31 77
LAISDQSKPA 32 78
LAKDATKTA 33 79
LAKDTTKNA 34 80
LAKSDQSRPA 35 81
LAPQDTKKNA 36 82
LATSDSTKAA 37 83
LAVDGSQRSA 38 84
LPISDQTKHA 39 85
LPKDATKTIA 40 86
LPPQDTTKNA 41 87
PAPQDTTKNA 42 88
QAHQDTTKNA 43 89
LAHETSPRPA 44 90
LAKSTSTAPA 45 91
LADQDTTKNA 46 92
LAESDQSKPA 47 93
LAHKDTTKNA 48 94
LAHKTQQKM 49 95
LAHQDTTENA 50 96
LAHQDTTINA 51 97
LAHQDTTKKT 52 98
LAHQDTTKND 53 99
LAHQDTTKNT 54 100
LAHQDTTKNV 55 101
LAHQDTTKTM 56 102
LAHQNTTKNA 57 103
LAHRDTTKNA 58 104
LAISDQTNHA 59 105
LAKQKSASTA 60 106
LAKSDQCKPA 61 107
LAKSDQSKPD 62 108
LAKSDQSNPA 63 109
LAKSYQSKPA 64 110
LANQDTTKNA 65 111
LAPQNTTKNA 66 112
LAPSSIQKPA 67 113
LAQQDTTKNA 68 114
LAYQDTTKNA 69 115
LDHQDTTKNA 70 116
LDHQDTTKSA 71 117
LGHQDTTKNA 72 118
LPHQDTTKND 73 119
LPHQDTTKNT 74 120
LPHQDTTNNA 75 121
LTHQDTTKNA 76 122
LTKDATKTIA 77 123
LTPQDTTKNA 78 124
LVHQDTTKNA 79 125
LAKANQNTPA 80 126
LATTPITKPA 81 127
LATTPIAKPA 82 128
LAIEDHTKSA 83 129
LAQSEHQRPA 84 130
LAKSPNKDNA 85 131
LANQDYTKTA 86 132
LANSTDQTRA 87 133
LALGETTRPA 88 134
LANSTEQTRA 89 135
LAQADTTKNA 90 136
LASKDITKTA 91 137
LASPRHNKKC 92 138
LAHQDTTKTIA 93 139
LAAQGTANL 94 140
VAIEDHTKSA 95 141
LAKANQNTPKNA 96 142

【0162】

ハイスループットシークエンシングを使用し、表１に示される９６個の変異体のうちの上位１８個の変異体について、イヌ網膜に対する感染能力をさらに定量化した。表２は、さらなる定量化に向けて選択した上位１８個の変異体を示す。

【0163】

表２
LAKDATKNA (配列番号47) LAPDSTTRSA (配列番号53) LAKDATKTIA (配列番号59)
PAHQDTTKNA (配列番号48) LAKGTELKPA (配列番号54) LAKQQSASTA (配列番号60)
LAHQDTTKNA (配列番号49) LAIIDATKNA (配列番号55) LAKSDQSKPA (配列番号61)
LATTSQNKPA (配列番号50) LAVDGAQRSA (配列番号56) LSHQDTTKNA (配列番号62)
LAISDQTKHA (配列番号51) PAPQDTTKKA (配列番号57) LAANQPSKPA (配列番号63)
IARGVAPSSA (配列番号52) LPHQDTTKNA (配列番号58) LAVSDSTKAA (配列番号64)

【0164】

１８個の変異体は、ＧＦＰの発現を誘導する遍在性ＣＡＧプロモーターと共にパッケージングした。ＧＦＰのｃＤＮＡを特有の２５塩基対のバーコード識別子に融合させた。１８個の変異体はそれぞれ、特有のＧＦＰバーコードと共にパッケージングした。パッケージングされた変異体を等しい比で混合し、網膜に注射した。その際、ＡＡＶ２ベースの対照ベクター（天然起源の親血清型に相当する負の対照）の注射も併せて実施した。注射の後、光受容体及びＲＰＥ細胞からＤＮＡ及びｍＲＮＡを採取した。ＤＮＡ及びｍＲＮＡのレベルを定量化することで、イヌ由来のベクターが網膜にＤＮＡを送達し、導入遺伝子発現を引き起こす能力を決定した（図２）。

【0165】

図２は、ＧＦＰ－バーコードコンストラクトを含む変異体のディープシークエンシングを示す。タグ付きＧＦＰのｃＤＮＡ及びｍＲＮＡをディープシークエンシングすることによってイヌ由来の変異体によるイヌ網膜の感染を定量化した。

【0166】

凍結網膜切片を用いて共焦点顕微鏡を使用し、１８のメンバーを含むライブラリーの発現を画像化した。網膜内の網膜細胞及び網膜外の光受容体が、１８のメンバーを含むライブラリーの標的となったことがＧＦＰの発現によって示された（図３）。

【0167】

図３は、１８のメンバーを含むイヌ由来のＡＡＶ変異体ライブラリーが神経節細胞層、内顆粒層、光受容体層、及びＲＰＥ層における細胞に感染することを示す。

【0168】

試験した上位１８個の変異体の中で、２個の変異体では、ＤＮＡ及びｍＲＮＡが最高レベルで回収された。ＤＮＡが最高レベルで回収された変異体は、約５８８－ＰＡＰＱＤＴＴＫＫＡという挿入配列（配列番号５７）を有するものであった。最高レベルのｍＲＮＡ発現が得られた変異体は、約５８８－ＬＡＰＤＳＴＴＲＳＡという挿入配列（配列番号５３）を有するものであった。

【0169】

本発明をその特定の実施形態に関して説明してきたが、本発明の真の趣旨及び範囲から逸脱することなく、さまざまな変更を実施でき、同等形態での置き換えを実施できることを当業者は理解されたい。さらに、特定の状況、材料、物質の組成物、プロセス、１つまたは複数のプロセス段階が本発明の目的、趣旨、及び範囲に適合するように、多くの改変を実施することができる。そのような改変はすべて、本明細書に添付される特許請求の範囲に含まれることが意図される。

【0170】

相互参照
本出願は、２０１６年７月２９日出願の米国仮特許出願第６２／３６８，９２９号の利益を主張し、当該出願は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。

【0171】

連邦による支援を受けた研究に関する記載
本発明は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）によって付与された契約／助成金第ＥＹ０２２９７５号、第ＥＹ０１８２４１号、及び第ＥＹ０６８５５号の下、政府の支援を得てなされたものである。政府は、本発明に対して一定の権利を有する。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図7-1】

【図7-2】

【図7-3】

【図7-4】

【図7-5】

【図7-6】

【図7-7】

【図7-8】

【図7-9】

【図7-10】

【図7-11】

【図7-12】

【図7-13】

【図7-14】

【図7-15】

【図7-16】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【配列表】

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