特許 7424728 ＲＮＡ干渉のための長鎖の二本鎖ＲＮＡ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-01-22

(45)【発行日】2024-01-30

(54)【発明の名称】ＲＮＡ干渉のための長鎖の二本鎖ＲＮＡ

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/113 20100101AFI20240123BHJP

   A61K 31/7125 20060101ALI20240123BHJP

   A61K 31/713 20060101ALI20240123BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20240123BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240123BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240123BHJP

【ＦＩ】

C12N15/113 Z ZNA

A61K31/7125

A61K31/713

A61K48/00

A61P35/00

A61P43/00 111

C12N15/113 130Z

C12N15/113 140Z

【請求項の数】 10

(21)【出願番号】P 2019565074

(86)(22)【出願日】2018-02-12

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2020-03-19

(86)【国際出願番号】 IB2018000330

(87)【国際公開番号】W WO2018146557

(87)【国際公開日】2018-08-16

【審査請求日】2021-02-12

(31)【優先権主張番号】62/457,282

(32)【優先日】2017-02-10

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】520448843

【氏名又は名称】オリック パルマセゥティカルズ インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100084995

【弁理士】

【氏名又は名称】加藤 和詳

(72)【発明者】

【氏名】イ、ドン キ

【審査官】井関 めぐみ

(56)【参考文献】

【文献】米国特許出願公開第２０１４／０２８８１４８（ＵＳ，Ａ１）

【文献】米国特許出願公開第２０１４／０２４９３０４（ＵＳ，Ａ１）

【文献】Ui-Tei K et al.，“RNAi induced in mammalian and Drosophila cells via transfection of dimers and trimers of small interfering RNA.”，Journal of RNAi and gene silencing，2005年10月14日，Vol. 1, No. 2，p.79-87

【文献】FEBS Letters，2014年，Vol.588，P.1037-1043

【文献】nature biotechnology，2006年，Vol.24, No.5，P.559-565

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １５／１１３

Ａ６１Ｐ ４３／００

Ａ６１Ｋ ３１／７１３

Ａ６１Ｐ ３５／００

Ａ６１Ｋ ３１／７１２５

Ａ６１Ｋ ４８／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）メカニズムを介して遺伝子サイレンシングを誘発可能である長鎖の二本鎖ＲＮＡ（ｌｄＲＮＡ）及び医薬的に許容される担体を含む、医薬組成物であって、
前記長鎖の二本鎖ＲＮＡは２つの実質的に相補的なＲＮＡ鎖からなり、１又は複数の標的ｍＲＮＡに相補的な少なくとも１つのガイド配列を含み、
前記長鎖の二本鎖ＲＮＡのそれぞれは４０～６２ヌクレオチドの範囲内でありかつ３’末端にジヌクレオチドオーバーハングを有し、
前記長鎖の二本鎖ＲＮＡは１又は複数のホスホロチオエート結合を含み、
前記医薬組成物は自然免疫応答の誘導を阻害する、
前記医薬組成物。

【請求項2】

前記ＲＮＡ鎖はそれぞれ４０～５２ヌクレオチドの範囲内にある、請求項１に記載の医薬組成物。

【請求項3】

同一の標的ｍＲＮＡに相補的な２つ以上の８ｂｐ以上の配列を含む、請求項１に記載の医薬組成物。

【請求項4】

２以上の異なる標的ｍＲＮＡに相補的な２つ以上の８ｂｐ以上の配列を含む、請求項１に記載の医薬組成物。

【請求項5】

前記ｌｄＲＮＡの一末端が、前記標的ｍＲＮＡに相補的なアンチセンス配列の５’末端を含む、請求項１に記載の医薬組成物。

【請求項6】

前記標的ｍＲＮＡに相補的な前記配列が、８～５０ヌクレオチド長である配列から独立して選択される、請求項１に記載の医薬組成物。

【請求項7】

前記標的ｍＲＮＡがウイルスｍＲＮＡである、請求項１に記載の医薬組成物。

【請求項8】

前記標的ｍＲＮＡが、
がん細胞の成長及び生存に重要な複数の経路に関与している、
同一のシグナル伝達経路において機能する、又は
共通のシグナルから発する２以上のシグナル伝達経路で機能する、
請求項１に記載の医薬組成物。

【請求項9】

前記標的ｍＲＮＡが、酵素、転写因子、分泌シグナリングタンパク質、シグナル伝達タンパク質、キナーゼ若しくはホスファターゼ、細胞受容体若しくはイオンチャネル、又は分泌タンパク質をコードする、請求項１に記載の医薬組成物。

【請求項10】

前記自然免疫応答がＲＩＧ－Ｉによって媒介される、請求項１に記載の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【関連する出願の参照】

【0001】

本出願は、２０１７年２月１０日に出願された米国仮特許出願第６２／４５７，２８２号の利益及び優先権を主張し、その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【技術分野】

【0002】

本技術は、部分的に、遺伝子発現の阻害に有用な長鎖の二本鎖ＲＮＡに関する。

【0003】

本願には、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩ形式で提出された配列表が含まれており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０１８年２月１２日に作成された前述のＡＳＣＩＩコピーの名称はＯＬＸ－００３ＰＣ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔであり、サイズは８，１９２バイトである。

【背景技術】

【0004】

ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が相補的ヌクレオチド配列を持つ標的メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を中和することにより遺伝子発現を阻害する進化的に保存された生物学的プロセスである（Ｈａｎｎｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ４１８：２４４－２５１， ２００２）。前記ＲＮＡｉ経路は、Ｄｉｃｅｒエンドヌクレアーゼによって開始される。Ｄｉｃｅｒエンドヌクレアーゼは、長鎖のｄｓＲＮＡを、相補的塩基対１９個のヌクレオチドを持ち且つ２ヌクレオチドの３’オーバーハングを末端に持つ短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）断片に切断する。ｓｉＲＮＡは、２本の一本鎖ＲＮＡ、パッセンジャー鎖及びガイド鎖へと解く。前記ガイド鎖は、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体に組み込まれる（ＲＩＳＣ）。転写後の遺伝子サイレンシングは、前記ガイド鎖対のアンチセンス配列がｍＲＮＡ中の相補的配列に対合して、前記ＲＩＳＣ複合体の触媒成分であるＡｒｇｏｎａｕｔｅ ２（Ａｇｏ２）による切断を誘導する際に発生する。

【0005】

ＲＮＡｉは線虫及び節足動物で最初に発見された（Ｆｉｒｅ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ３９１：８０６－８１１， １９９８）。これらの門では、ＲＮＡｉは０．３～１ｋｂのｄｓＲＮＡで誘導される。このＲＮＡｉ過程は、免疫応答の活性化により哺乳類細胞では成立しなかった（Ｓｔａｒｋ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ６７：２２７－２６４， １９９８）。インターフェロン発現の誘導によって明示されるこの自然免疫の形態は、ウイルス感染症に通常関連するＲＮＡの形態に結合するパターン認識受容体によって媒介される。抗ウイルス応答の活性化を回避するために、哺乳類細胞のＲＮＡｉは、ダイサーの消化産物を模倣する合成２１ｍｅｒ ｓｉＲＮＡを使用して誘導されることが多い（Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ４１１：４９４－４９８， ２００１）。

【0006】

２５～３０塩基長のヌクレオチドのＲＮＡ二重鎖（ｄｕｐｌｅｘ）は、対応する従来の２１－ｍｅｒ ｓｉＲＮＡよりも１００倍強力になる可能性がある。これらの２５～３０ｂｐ二重鎖の増強された効力は、それらがダイサー基質であるという事実に起因し、ｓｉＲＮＡの産生をＲＩＳＣ複合体への取り込みに直接結びつけている（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２３：２２２－６， ２００５）。さらに長鎖のｄｓＲＮＡ二重鎖は、２つの異なる標的ｍＲＮＡ配列の発現を阻害し得る。アンチセンス配列の５’末端がｄｓＲＮＡのいずれかの末端に位置する場合、単一のｄｓＲＮＡ構造体による２つのｍＲＮＡの同時下方制御が最も効率的であった（Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌｓ ２７， ６８９－６９５， ２００９）。

【0007】

平滑末端ｄｓＲＮＡの長さを２７ｂｐに増やすと、免疫感受性Ｔ９８Ｇ細胞株でインターフェロン発現が誘導された（Ｍａｒｑｕｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２４：５５９－６５， ２００６）。このような観察により、より長鎖の干渉ＲＮＡの開発が妨げられた。

【発明の概要】

【0008】

複数のｍＲＮＡ又は複数のｍＲＮＡ領域を選択的に標的とすることが可能な構造体など、自然免疫応答の活性化を最小限に抑えた効率的な遺伝子サイレンシング構造体が必要である。本発明は、この目的及びその他の目的に対応する。

【図面の簡単な説明】

【0009】

【図1A】図１Ａは、長さが異なる様々な平滑末端ｄｓＲＮＡの２つの鎖の相補的ヌクレオチド配列（すなわち、長さが１９ｂｐ（上鎖は配列番号１、下鎖は配列番号２）、３８ｂｐ（上鎖は配列番号３、下鎖は配列番号４）、５０ｂｐ（上鎖は配列番号５、下鎖は配列番号６）、及び６０ｂｐ（上鎖は配列番号７、下鎖は配列番号８）である平滑末端ｄｓＲＮＡ）を示すグラフである。

【図1B】図１Ｂは、長さが異なる２ｂｐ ３’オーバーハングを持つ様々なｄｓＲＮＡの２つの鎖の相補的ヌクレオチド配列である（すなわち、長さが１９＋２（上鎖は、配列番号９、下鎖は配列番号１０）、３８＋２（上鎖は配列番号１１、下鎖は配列番号１２）、５０＋２（上鎖は配列番号１３、下鎖は配列番号１４）、及び６０＋２（上鎖は配列番号１５、下鎖は配列番号１６）であるｄｓＲＮＡ）。

【図1C】図１Ｃは、野生型ＲＡＷ ２６４．７細胞及びＲＡＷ ２６４．７ ＲＩＧ－Ｉノックアウト細胞で示されたｄｓＲＮＡによって活性化された抗ウイルス応答を示すグラフである。

【図2】図２は、３０、４０、５０、及び６０塩基対の長さのサバイビン遺伝子を標的とする平滑末端ｄｓＲＮＡによる相対的ＩＳＧ発現量と、野生型ＲＡＷ ２６４．７細胞、ＲＡＷ ２６４．７ ＲＩＧ－Ｉノックアウト細胞、及びＲＡＷ ２６４．７ ＭＤＡ５ノックアウト細胞における２ヌクレオチドの３’オーバーハングを持つサバイビン遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡの相対的ＩＳＧ発現を示す。

【図3】図３は、４０ｂｐ及び６０ｂｐの長さのサバイビン遺伝子を標的とする平滑末端ｄｓＲＮＡをトランスフェクトした細胞におけるＩＦＮ－β及びＩＦＩＴ１（ＩＳＧ５６）の遺伝子発現を示すグラフである。

【図4】図４は、サバイビンの従来のｓｉＲＮＡと比較して、３０ｂｐ、３０＋２、４０ｂｐ、４０＋２、５０ｂｐ、５０＋２、及び６０ｂｐを有するサバイビンを標的とするｄｓＲＮＡが標的サバイビンｍＲＮＡをノックダウンすることを示すグラフである。

【図5A】図５Ａは、サバイビンを標的とする４０＋２、５０＋２、及び６０＋２ｄｓＲＮＡのヌクレオチド配列を示す表である。

【図5B】図５Ｂは、ｄｓＲＮＡを標的とする３０ｂｐ、３０＋２、４０ｂｐ、４０＋２、５０ｂｐ、５０＋２、及び６０ｂｐのサバイビンのゲルバンドを示す画像である。

【図6A】図６Ａは、実施例１のルシフェラーゼ－ＧＦＰを標的とするｄｓＲＮＡのヌクレオチド配列を示す表である。

【図6B】図６Ｂは、実施例２のサバイビンを標的とするｄｓＲＮＡのヌクレオチド配列を示す表である（すなわち、３０ｂｐ、３０＋２、４０ｂｐ、４０＋２、５０ｂｐ、５０＋２、６０ｂｐ、及び６０＋２）。図６Ｂは、従来のサバイビンｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列も示す（ｓｉ－ｓｕｒｖｉｖｉｎ：ｓｉ－ｓｕｒ １９＋２）。

【発明を実施するための形態】

【0010】

本発明は、顕著な抗ウイルス応答を誘導することなく哺乳類細胞における遺伝子発現を阻害可能な長鎖の二本鎖ＲＮＡ（ｌｄＲＮＡ）、及びそれを使用した遺伝子サイレンシング方法を提供する。驚くべきことに、平滑３８－ｍｅｒ ｄｓＲＮＡはインターフェロン発現を強く誘導することが示されていたが、この細胞応答は、５０又は６０塩基対、及び所望により１又は複数の３’ジヌクレオチドオーバーハングを含む構築物を含め、平滑ｄｓＲＮＡの長さが増加した場合には観察されなかった。これらのより長い構築物は、効率的な遺伝子サイレンサーであり得、複数のｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ領域をサイレンシングする能力を提供し得る。

【0011】

実施形態によれば、ｌｄＲＮＡの各末端は平滑化されている場合もあれば、３’オーバーハングを持つ場合もある。一部のｌｄＲＮＡは両末端が平滑化されている。ダイサー切断事象のｓｉＲＮＡ産物は、両末端に２ヌクレオチドの３’オーバーハングを有する。これらの３’オーバーハングは、ＲＮＡヘリカーゼ活性を持つパターン認識受容体であるＲＩＧ－Ｉの認識を阻害する（Ｍａｒｑｕｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２４：５５９－６５， ２００６）。対照的に、一部のウイルスは平滑末端を有するｄｓＲＮＡを生成する。これらの外来ｄｓＲＮＡは、自然免疫に特徴的なインターフェロン及びその他の遺伝子の発現を誘導しうる。しかし、本発明の実施形態による様々なｌｄＲＮＡは、抗ウイルス応答の活性化をほとんどまたは全く引き起こさない。

【0012】

本発明の様々なｌｄＲＮＡは、少なくとも４０ｂｐ、少なくとも４５ｂｐ、少なくとも５０ｂｐ、少なくとも６０ｂｐ、少なくとも８０ｂｐ、又は少なくとも１００ｂｐの長さである二重鎖を含む。様々な実施形態では、前記ｌｄＲＮＡは、２００ｂｐ以下、１５０ｂｐ以下、又は１００ｂｐ以下の長さである二重鎖を含む。例えば、本発明の実施形態による様々なｌｄＲＮＡは、長さが４０～２００ｂｐ、４０～１５０ｂｐ、若しくは４０～１００ｂｐ、又は５０～２００ｂｐ、５０～１５０ｂｐ、若しくは５０～１００ｂｐである二重鎖を含む。いくつかの実施形態では、前記ｌｄＲＮＡは、長さが４０～８０ｂｐ、４５～８０ｂｐ、５０～８０ｂｐ、４０～６０ｂｐ、４５～６０ｂｐ、又は５０～６０ｂｐである二重鎖を含む。

【0013】

様々な実施形態では、前記二重鎖は、実質的に相補的な２本のＲＮＡ鎖を有する。いくつかの実施形態では、前記二重鎖は、完全な相補性を持つ標準塩基対のみを含む。いくつかの実施形態では、前記ＲＮＡは、１０個以下、又は５個以下（例えば、１、２、又は３個）のミスマッチ塩基又は非標準塩基対を含む（例えば、Ｇ：Ｕ塩基対）。

【0014】

いくつかの実施形態では、前記ｌｄＲＮＡの両末端は平滑化されている。いくつかの実施形態では、一方又は両方の末端は、３’末端のオーバーハングを含む。いくつかの実施形態では、前記オーバーハングは、ジヌクレオチドオーバーハング（例えば、ｄＴｄＴ）である。

【0015】

抗ウイルス（自然免疫）応答の誘導は、相対的インターフェロン活性化を測定することによって決定される。本発明の様々なｌｄＲＮＡは、細胞株における模擬トランスフェクションにより誘導される発現レベルの１５倍以下、１０倍以下、又は５倍以下のインターフェロン又はＩＲＦの発現を誘導する。前記細胞株として、野生型ＲＡＷ ２６４．７細胞、ＲＡＷ ２６４．７ ＲＩＧ－Ｉノックアウト細胞、及びＲＡＷ ２６４．７ ＭＤＡ５ノックアウト細胞が挙げられるが、これらに限定されない。

【0016】

本発明の様々なｌｄＲＮＡは、ＲＮＡｉ経路を介して標的遺伝子の発現を低下させう。これらのｌｄＲＮＡは、標的ｍＲＮＡに相補的である、少なくとも８ｂｐのガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、前記ｌｄＲＮＡは、単一ｍＲＮＡ内の異なるセグメントに相補的な、２，３，４、又はそれ以上のガイド配列を含む。他の実施形態では、本発明のｌｄＲＮＡは、２、３、４、又はそれ以上の異なる標的ｍＲＮＡに相補的なガイド配列を有する。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡに相補的な前記配列は、８～５０個の範囲内のヌクレオチド、８～４０個の範囲内のヌクレオチド、８～３０個の範囲内のヌクレオチド、又は８～２０個の範囲内のヌクレオチドである配列から独立して選択される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡに相補的な前記配列は、１５～５０個の範囲内のヌクレオチド、１５～４０個の範囲内のヌクレオチド、１５～３０個の範囲内のヌクレオチド、又は１５～２０個の範囲内のヌクレオチドである配列から独立して選択される。例えば、前記相補的配列は、約１５ｎｔ、約１６ｎｔ、約１７ｎｔ、約１８ｎｔ、約１９ｎｔ、又は約２０ｎｔであり得る。

【0017】

ｌｄＲＮＡにおける前記ガイド配列は、アンチセンス配列である。それらの配列は、５’非翻訳領域、開始部位、コード配列、停止部位、又は３’非翻訳領域のｍＲＮＡに結合しうる。優先的に、それらの配列は標的とされたｍＲＮＡ内のアクセス可能なセグメントに結合する。

【0018】

ｌｄＲＮＡは、２本の鎖が互いに相補的であり、反対方向に配向しているｄｓＲＮＡである。したがって、１つのＲＮＡ鎖の５’末端ともう一方ＲＮＡ鎖の３’末端は、ｌｄＲＮＡの同一末端に位置する。いくつかのｌｄＲＮＡは、ガイド配列を含み、前記ガイド配列の５’末端がｌｄＲＮＡの１つのＲＮＡ鎖の５’末端に位置する。他のｌｄＲＮＡは、２つのガイド配列を含み、前記２つのガイド配列の５’末端は２つのＲＮＡ鎖の５’末端に位置し、それぞれ互いに反対側のｌｄＲＮＡ末端に位置する。

【0019】

ｌｄＲＮＡのＲＮＡｉ活性は、ノーザンブロット法、定量的ｒｔＰＣＲ、及び当技術分野で周知の他の手法などの従来の方法を使用して、標的ｍＲＮＡレベルを測定することにより決定しうる。ｌｄＲＮＡにＲＮＡｉ活性がある場合、標的ｍＲＮＡレベルは低下する。ｌｄＲＮＡのＲＮＡｉ活性が標的とされたｍＲＮＡに特異的である場合、非標的とされていないｍＲＮＡのレベルは低下しない。あるいは、ＲＮＡｉ活性は、標的とされたｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の発現又は活性を定量化することにより間接的に測定可能である。タンパク質の発現及び活性は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）及び酵素アッセイなど、当技術分野で知られている従来の方法によって決定される。

【0020】

ｌｄＲＮＡのＲＮＡ鎖は、修飾された骨格、修飾されたヌクレオチド、及び／又は他の化学修飾を有してもよい。

【0021】

ｌｄＲＮＡの一方又は両方のＲＮＡ鎖のリン酸骨格は、１又は複数のホスホロチオエート結合で置換し得る。自然界に見られる標準的なＲＮＡ骨格は、ヌクレオチド間のホスホジエステル結合を含む。ホスホロチオエート結合修飾は、非架橋酸素の１つを硫黄原子で置き換えることにより、リン酸結合を変更させる。この変更により、前記ポリヌクレオチドの全体的な化学特性が変化する。特に、ホスホロチオエート結合の付加により、ポリヌクレオチド骨格をヌクレアーゼ分解に対して安定化し、細胞環境での半減期を効果的に延長することができる。ホスホロチオエート結合は、ｌｄＲＮＡの片方又は両方の鎖に組み込むことができる。いくつかの実施形態では、ｌｄＲＮＡの少なくとも約１％、２％、４％、８％、１６％、３２％又は約５０％のヌクレオチドが、ホスホロチオエート結合により結合される。

【0022】

ｌｄＲＮＡは、限定されるものではないが、シュードウリジン、Ｎ１－メチルシュードウリジン及び／又は５－メチルシチジンなどの非標準ヌクレオチドから合成可能である。そのようなヌクレオチドは、ｔｏｌｌ様受容体を介した自然免疫の活性化を低下させ得る。

【0023】

ｌｄＲＮＡは、ほぼすべてのｍＲＮＡを標的とするように設計しうる。例えば、様々なｌｄＲＮＡは、酵素、転写因子、シグナリングタンパク質、キナーゼ、ホスファターゼ、イオンチャネル、細胞質タンパク質、膜タンパク質、及び分泌タンパク質をコードするｍＲＮＡのレベルを低下させる。

【0024】

ｌｄＲＮＡは、ウイルスｍＲＮＡを標的とすることができる。いくつかの実施形態では、ｌｄＲＮＡの複数のガイド配列は、単一の標的ウイルスｍＲＮＡの異なるセグメントに相補的である。他の実施形態では、単一のｌｄＲＮＡ内のガイド配列は、２以上のウイルスｍＲＮＡ標的の配列に相補的である。

【0025】

様々なｌｄＲＮＡは、がん細胞の増殖及び／又は生存に重要な経路に関与するタンパク質をコードするｍＲＮＡを標的とする。そのようなタンパク質の発現を低下させると、がん細胞の成長又は生存が低減する。様々な実施形態では、本発明のｌｄＲＮＡは、がん細胞の成長及び／又は生存に重要な経路に関与するタンパク質の２以上のガイド配列を含む。本発明は又、がんに関与するｍＲＮＡのレベルを低下させるｌｄＲＮＡを用いてがん患者を治療する方法を提供する。

【0026】

様々なｌｄＲＮＡは、シグナル伝達タンパク質をコードするｍＲＮＡを標的とする。ｌｄＲＮＡは、シグナル伝達タンパク質をコードするｍＲＮＡの２以上の異なるセグメントを標的としうる。あるいは、単一の多機能ｌｄＲＮＡ内のガイド配列は、関連するシグナル伝達タンパク質をコードする２以上のｍＲＮＡを標的としうる。関連するシグナル伝達タンパク質は、同じシグナル伝達経路、並行するシグナル伝達経路、又は共通の起源から分岐するシグナル伝達経路において機能してもよい。多機能ｌｄＲＮＡは又、独立したシグナル伝達経路で作用するタンパク質をコードするｍＲＮＡを標的としてもよい。

【0027】

本発明は、本発明のｌｄＲＮＡを細胞、組織又は動物に投与することにより、標的遺伝子の発現を低下させる方法を含む。対象は、疾患又は状態の治療を必要とするか、疾患又は状態のリスクがあるヒト又は動物の被験体又は患者であり得る。前記組成物は、エクス・ビボ又はイン・ビボで投与可能である。

【0028】

哺乳類細胞はいずれも、ｄｓＤＮＡによる自然免疫の誘導に対して感受性又は非感受性のいずれであっても、ｌｄＲＮＡ治療に適している。例えば、ｌｄＲＮＡは免疫感受性Ｔ９８Ｇ膠芽腫細胞及び免疫非感受性ＨｅＬａがん細胞に投与可能である。両方の細胞タイプで標的遺伝子の発現を阻害することができ、インターフェロンの発現は、平滑末端３８ｂｐ ｄｓＲＮＡの投与後よりも、ｌｄＲＮＡ投与後の方が低くなる。ｌｄＲＮＡとの接触によりタンパク質を発現するように誘導可能な細胞型の非限定的な例には、ケラチノサイト、メラニン細胞、マクロファージ、肝細胞、肺細胞、線維芽細胞、平滑筋細胞、及びリンパ球（例えば、Ｂ細胞若しくはＴ細胞又はその前駆細胞）が挙げられる。さらに、ｌｄＲＮＡは、増生細胞、悪性細胞、及び幹細胞によるタンパク質発現を誘導しうる。様々な実施形態では、標的細胞は、抗原提示細胞、樹状細胞、マクロファージ、神経細胞、脾臓細胞、リンパ系細胞、肺細胞（例えば、肺胞細胞）、皮膚細胞（例えば、ケラチノサイト又は線維芽細胞）、内皮細胞、星状細胞、ミクログリア細胞、間葉系細胞、上皮細胞、又は造血細胞から選択される。

【0029】

ｌｄＲＮＡは、皮膚、網膜、肺、肝臓、心臓などを含む様々な組織に投与可能である。さらに、ｌｄＲＮＡは動物全体に全身投与可能である。全身投与は、免疫感受性細胞及び免疫抵抗性細胞の両方による取り込みに至ることが予想される。ｌｄＲＮＡは、他のｄｓＲＮＡよりも免疫原性が低いため、免疫感受性細胞を含む混合細胞集団に安全に投与可能である。

【0030】

様々な実施形態では、本発明のｌｄＲＮＡは、医薬製剤に組み込まれてもよい。医薬製剤の非限定的な例には、局所クリーム若しくは軟膏又は所望により安定化剤を含む水溶液若しくは緩衝液が含まれる。医薬製剤は、細胞及び組織による細胞取り込みを促進するためのビヒクルをさらに含んでもよい。

【0031】

医薬的に許容される担体又は希釈剤は、当業者に周知である。前記担体又は希釈剤は、様々な実施形態において、固体製剤用の固体担体若しくは希釈剤、液体製剤用の液体担体若しくは希釈剤、又はそれらの混合物であり得る。

【0032】

別の実施形態では、固体担体／希釈剤としては、ガム、デンプン（例えば、コーンスターチ、前ゲル化デンプン）、糖（例えば、乳糖、マンニトール、スクロース、デキストロース）、セルロース材料（例えば、微結晶セルロース）、アクリレート（例えば、ポリメチルアクリレート）、炭酸カルシウム、酸化マグネシウム、タルク、又はそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

【0033】

ある実施形態では、前記医薬組成物は、制御放出性組成物、すなわち、投与後一定期間にわたってｌｄＲＮＡが放出される組成物である。制御放出性又は持続放出性の組成物としては、親油性デポー（例えば、脂肪酸、ワックス、油）の製剤が含まれる。別の実施形態では、前記組成物は即時放出性組成物、すなわち、投与直後に化合物全体が放出される組成物である。

【0034】

ｌｄＲＮＡは、別の実施形態では、中和された医薬的に許容される塩形態として前記組成物に製剤化される。

【0035】

ｌｄＲＮＡを対象に投与する様式は、標的とされるｍＲＮＡ、標的細胞、治療される疾患又は状態、及び医薬製剤の形態に依存するであろうことを、当業者は理解するであろう。

【0036】

ｌｄＲＮＡは、当技術分野で公知の種々の方法により投与可能である。例えば、ｌｄＲＮＡは、吸入、静脈内注射、又は局所投与可能である。いくつかの実施形態では、前記ｌｄＲＮＡは、例えば皮下注射、皮内注射、筋肉内注射、眼内注射、腫瘍内注射、又は他の形態の非経口投与により、有効量で患者に投与される。

【0037】

いくつかの実施形態では、ｌｄＲＮＡは経口投与され、したがって、経口投与に適した形態で、すなわち固体又は液体製剤として製剤化される。適切な固体経口製剤には、錠剤、カプセル剤、丸剤、顆粒剤、ペレットなどが含まれる。適切な液体経口製剤には、溶液、懸濁液、分散液、エマルジョン、油などが含まれる。本発明の別の実施形態では、前記ｌｄＲＮＡはカプセルに製剤化される。本実施形態に従って、本発明の組成物は、活性化合物及び不活性担体又は希釈剤に加えて、硬ゼラチンカプセルを含む。

【0038】

別の実施形態では、前記ｌｄＲＮＡは体表面に局所的に投与されるため、局所投与に適した形に製剤化される。適切な局所製剤には、ゲル、軟膏、クリーム、ローション、液滴剤などが含まれる。局所投与の場合、組成物又はそれらの生理学的に許容される誘導体は、医薬的担体を含む又は含まない生理学的に許容される希釈剤中の溶液、懸濁液、又はエマルジョンとして調製及び適用される。

【0039】

別の実施形態では、前記ｌｄＲＮＡは、座薬、例えば、直腸座薬又は尿道座薬として投与される。別の実施形態では、前記医薬組成物は、ペレットの皮下移植により投与される。別の実施形態では、前記ペレットにより、ある期間にわたる薬剤の制御放出が提供される。

【0040】

様々な実施形態では、投与量は、１日量、１週間量、１か月量、又は１年量である。いくつかの実施形態では、用量は、単回用量であるか、前記組成物は少なくとも１０回投与される。いくつかの実施形態では、前記組成物は、１年あたり６回以上又は１２回以上、複数年の間投与される。

【0041】

本発明は、ｌｄＲＮＡを投与することにより、様々な疾患又は状態を治療する方法を提供する。前記ｌｄＲＮＡは、１又は複数の有害な標的遺伝子の発現を低下させ、それによって疾患又は状態を治療するものである。例えば、皮膚に影響を及ぼす疾患又は状態を、ｌｄＲＮＡで治療可能である。ｌｄＲＮＡでの治療に適した皮膚疾患又は状態としては、皮膚の白斑、色素沈着、又は瘢痕、アトピー性皮膚炎、乾癬、強皮症、脱毛又はしわの寄った皮膚が挙げられる。ｌｄＲＮＡは、線維症によって現れる疾患又は状態の治療にも投与可能である。ｌｄＲＮＡで治療し得る線維性疾患又は状態は、肝線維症、網膜線維症、及び肺線維症（例えば、特発性肺線維症など）である。ｌｄＲＮＡで治療しうる眼の状態としては、黄斑変性（ウェット型又はドライ型のＡＭＤ）が挙げられる。ｌｄＲＮＡで治療しうる炎症性疾患には、関節リウマチやクローン病が挙げられる。いくつかの実施形態では、前記状態は、神経因性疼痛である。いくつかの実施形態では、前記状態は、高コレステロール血症、アテローム性動脈硬化症、又は心臓病である。

【0042】

いくつかの実施形態では、前記ｌｄＲＮＡは、複数のｍＲＮＡを標的とする。例示的な標的には、ＣＴＧＦをコードするｍＲＮＡ及びＭＹＤ８８をコードするｍＲＮＡが含まれる。

【0043】

ｌｄＲＮＡは負に帯電した核酸ポリマーである。細胞の取り込みを促進するために、ｌｄＲＮＡは、核酸を細胞内に輸送するビヒクルとともに製剤化可能である。適切なビヒクルとしては、リン酸カルシウム、カチオン性脂質、カチオン性ポリマー、ポリエチレンイミン、及びタンパク質ベースのトランスフェクション試薬が挙げられる。

【0044】

いくつかの実施形態では、前記トランスフェクション試薬はリポソームを形成する。リポソームは、細胞内の安定性を高め、取り込み効率を高め、生物活性を向上させうる。リポソームは、細胞膜を構成する脂質と同様の方法で配置された脂質で構成される中空の球状小胞である。前記リポソームは、水溶性化合物を捕捉するための内部水性空間を有し、０．２ミクロンから数ミクロンの直径サイズの範囲であり得る。Ｌａｎｇｅｒ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７－１５３３ （１９９０）、Ｔｒｅａｔ ｅｔ ａｌ．， ｉｎ Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ， Ｌｏｐｅｚ－Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｆｉｄｌｅｒ （ｅｄｓ．）， Ｌｉｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐｐ． ３５３－３６５ （１９８９）、Ｌｏｐｅｚ－Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ， ｉｂｉｄ．， ｐｐ． ３１７－３２７）を参照。

【0045】

親油性部分を、ｌｄＲＮＡの１又は複数のヌクレオチドにコンジュゲートすることができる。前記親油性部分は、優先的に、ｌｄＲＮＡのＲＮＡ鎖の１つの５’末端に結合する。親油性部分の非限定的な例としては、コレステロール、トコフェロール、及びステアリン酸又はパルミチン酸などの１０個以上の炭素原子を有する長鎖脂肪酸が挙げられる。共有結合した親油性部分は、細胞へのｌｄＲＮＡの侵入を促進可能である。そのような方法は公知であり、例えば、ＰＣＴ／ＫＲ２０１３／００４４６３及びＵＳ２０１５／０１１１９４８に記載されており、それらはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0046】

特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が関係する一当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。一般に、本明細書で使用される命名法は周知であり、当技術分野で一般的に使用されている。

【実施例】

【0047】

実施例１：様々なｄｓＲＮＡに対する免疫応答
免疫応答を測定するために、ＲＡＷ ２６４．７細胞を、１０％ウシ胎児血清、１００μｇ／ｍｌノルモシン（Ｎｏｒｍｏｃｉｎ）（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社）、及び２００μｇ／ｍｌゼオシン（Ｚｅｏｃｉｎ）（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（Ｇｉｂｃｏ社）で増殖した。細胞を９６ウェルプレートに１．０ｘ１０^４細胞／ｃｍ^２の密度で播種し、抗生物質なしで２４時間培養した。ＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション剤（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を使用して、細胞に１０ｎＭ ｄｓＲＮＡをトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後と４８時間後に、上清の１０μｌアリコートを９６ウェル白色プレートにサンプリングした。５０μｌのＱｕａｎｔｉ－Ｌｕｃルシフェラーゼ基質（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社）を各ウェルに添加し、マイクロプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）を使用してプレートにおけるルシフェラーゼ活性を直ちに読み取った。

【0048】

平滑末端ｄｓＲＮＡを、１９、３８、５０、及び６０塩基対の長さで合成した（図１Ａ及び図６Ａ）。これらのｄｓＲＮＡに対する抗ウイルス応答を、相対ＩＲＦ活性度を測定することにより決定した（図１Ｃ）。予想通りに、３８ｂｐ ｄｓＲＮＡは強い抗ウイルス応答を誘導し、短い１９ｂｐ ｄｓＲＮＡは誘導しなかった。驚いたことに、５０ｂｐ ｄｓＲＮＡに対する抗ウイルス応答は、３８ｍｅｒに対する応答と比較して、＞８０％減少し、６０ｍｅｒではさらに低い応答が観察された。これらの抗ウイルス応答は全て、ＲＩＧ－Ｉノックアウト細胞では実質的に排除されており、ＲＩＧ－Ｉが平滑ｄｓＲＮＡを認識するｄｓＲＮＡセンサーであることが確認された。追加の試験では、陽性コントロールｐｏｌｙＩＣに対する抗ウイルス応答が示され、模擬処理された細胞では応答が示されなかった。さらに、ｄｓＲＮＡへの２ヌクレオチドの３’オーバーハングの付加（図１Ｂ及び図６Ａ）によっても、抗ウイルス応答が排除され、これは３’オーバーハングを有するｄｓＲＮＡによってＲＩＧ－１が活性化されないことを示す以前の研究と一致する（Ｍａｒｑｕｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２４：５５９－６５， ２００６）。

【0049】

実施例２：長鎖のｄｓＲＮＡの免疫応答とノックダウン効果
サバイビン遺伝子を標的とする平滑末端ｄｓＲＮＡを、３０、４０、５０、及び６０塩基対の長さで合成した（図６Ｂを参照）。２ヌクレオチドの３’オーバーハングｄｓＲＮＡも合成した（すなわち、３０＋２、４０＋２、５０＋２、及び６０＋２）。図５Ａ及び図６Ｂを参照。上記に開示されたサバイビンを標的とするｄｓＲＮＡの同定を図５Ｂに示す。これらのｄｓＲＮＡに対する抗ウイルス応答を、相対ＩＳＧ発現を測定することにより決定した（図２）。前記ｄｓＲＮＡを、野生型（ＷＴ）、ＲＩＧ－Ｉ陰性（ＲＩＧ－Ｉ（－／－））、又はＭＤＡ５陰性（ＭＤＡ５（－／－））であるＲＡＷ ２６４．７細胞で試験した。

【0050】

結果は、４０ｂｐ ｄｓＲＮＡ及び５０ｂｐ ｄｓＲＮＡにおいて、ある程度の免疫刺激（相対ＩＳＧ発現で測定）が発生したことを示す（図２）。しかしながら、従来の概念に反して、４０ｂｐ ｄｓＲＮＡ及び５０ｂｐ ｄｓＲＮＡは、６０ｂｐ ｄｓＲＮＡによって生成された相対ＩＳＧと比較して、より多くの相対ＩＳＧを発現した（図２）。

【0051】

４０＋２ ｌｄＲＮＡ、５０＋２ ｌｄＲＮＡ、及び６０ｂｐ ｌｄＲＮＡが示したＩＳＧ発現は、ごくわずかであった（図２）。このデータは、３’末端の２つのヌクレオチドＲＮＡのオーバーハングが（例：４０＋２及び５０＋２）、自然免疫系を効率的に回避することを示す（図２）。

【0052】

この結果により、ＲＩＧ－Ｉ欠損細胞（ＲＩＧ－Ｉ（－／－））がＩＳＧタンパク質の発現を誘導しないことも示され、これは、ＲＩＧ－Ｉが化学合成された長鎖のｄｓＲＮＡを認識するパターン認識受容体（ＰＲＲ）であることを意味する（図２）。

【0053】

図３は、ＩＦＮ－β及びＩＦＩＴ１（ＩＳＧ５６）遺伝子発現が６０ｂｐ ｄｓＲＮＡのトランスフェクションによって上方制御されないことを示す。この結果は、ＩＳＧ５４が６０ｂｐ ｄｓＲＮＡによって上方制御されない理由が、ＰＫＲによる翻訳阻害によるものではなく、６０ｂｐ ｄｓＲＮＡが自然免疫系を活性化しないためであることを示す。

【0054】

図４は、上記開示された３０ｂｐ、３０＋２、４０ｂｐ、４０＋２、５０ｂｐ、５０＋２、及び６０ｂｐのサバイビンを標的とするｄｓＲＮＡが、サバイビンに対する従来のｓｉＲＮＡと同じ有効性でサバイビン遺伝子発現をサイレンシングしうることを示す（ｓｉ－ｓｕｒ １９＋２）。

【0055】

均等物
以上本発明をその特定の実施形態に関連して説明したが、さらなる改変が可能であり、本出願が、一般に本発明の原理に従い、本開示からの逸脱を含む、本発明の任意の変形、使用、又は適応を網羅することを意図し、本発明が関係する技術分野内の既知の又は慣習的な慣行の範囲内で、添付の特許請求の範囲内において前述及び以下の本質的な特徴に適用され得るものであることは理解されよう。

【0056】

当業者は、本明細書に具体的に記載された特定の実施形態に対する多数の均等物を、通常の実験のみを使用して認識又は確認することが可能であろう。そのような均等物は、以下の特許請求の範囲に包含されることが意図される。
本発明の例示的な態様を以下に記載する。
＜１＞
４０塩基対以上の二本鎖長を有する２つの実質的に相補的なＲＮＡ鎖及び少なくとも１つのガイド配列を含む、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）メカニズムを介して遺伝子サイレンシングを誘発可能である長鎖の二本鎖ＲＮＡ（ｌｄＲＮＡ）。
＜２＞
１又は複数の修飾ヌクレオチドを含む、＜１＞に記載のｌｄＲＮＡ。
＜３＞
１又は複数のホスホロチオエート結合ヌクレオチドを含む、＜２＞に記載のｌｄＲＮＡ。
＜４＞
Ｔｏｌｌ様受容体によるＲＮＡ認識を抑制する１又は複数の修飾ヌクレオチドを含む、＜２＞又は＜３＞に記載のｌｄＲＮＡ。
＜５＞
前記修飾ヌクレオチドがシュードウリジンを含む、＜４＞に記載のｌｄＲＮＡ。
＜６＞
前記修飾ヌクレオチドが５－メチルシチジンを含む、＜４＞に記載のｌｄＲＮＡ。
＜７＞
前記修飾ヌクレオチドがＮ１－メチルシュードウリジンを含む、＜５＞に記載のｌｄＲＮＡ。
＜８＞
さらに親油性コンジュゲートを含む、＜１＞～＜７＞のいずれか一項に記載のｌｄＲＮＡ。
＜９＞
前記親油性コンジュゲートが、コレステロール、コレステン、コレスタン、コレスタジエン、胆汁酸、コール酸、デオキシコール酸、及びデヒドロコール酸から選択される、＜８＞に記載のｌｄＲＮＡ。
＜１０＞
前記親油性部分がコレステロールである、＜８＞に記載のｌｄＲＮＡ。
＜１１＞
前記親油性コンジュゲートが、ポリリボヌクレオチドの３’末端に結合している、＜８＞～＜１０＞のいずれか一項に記載のｌｄＲＮＡ。
＜１２＞
前記ｌｄＲＮＡの一方又は両方の末端が平滑化されている、＜１＞～＜１１＞のいずれか一項に記載のｌｄＲＮＡ。
＜１３＞
前記二本鎖長が４５ｂｐ以上である、＜１＞～＜１２＞のいずれか一項に記載のｌｄＲＮＡ。
＜１４＞
前記二本鎖長が５０ｂｐ以上である、＜１＞～＜１２＞のいずれか一項に記載のｌｄＲＮＡ。
＜１５＞
前記二本鎖長が６０ｂｐ以上である、＜１＞～＜１２＞のいずれか一項に記載のｌｄＲＮＡ。
＜１６＞
相対的ＩＲＦ活性化度が１０以下である、＜１＞～＜１５＞のいずれか一項に記載のｌｄＲＮＡ。
＜１７＞
相対的ＩＲＦ活性化度が５以下である、＜１＞～＜１５＞のいずれか一項に記載の前記ｌｄＲＮＡ。
＜１８＞
１又は複数のｍＲＮＡに相補的な１つ又は複数の８ｂｐ以上の配列を含む、＜１＞～＜１７＞のいずれか一項に記載のｌｄＲＮＡ。
＜１９＞
同一のｍＲＮＡに相補的な２つ以上の８ｂｐ以上の配列を含む、＜１８＞に記載のｌｄＲＮＡ。
＜２０＞
２以上の異なるｍＲＮＡに相補的な２つ以上の８ｂｐ以上の配列を含む、＜１８＞に記載のｌｄＲＮＡ。
＜２１＞
３以上の異なるｍＲＮＡに相補的な３つ以上の８ｂｐ以上の配列を含む、＜１８＞に記載のｌｄＲＮＡ。
＜２２＞
前記ｌｄＲＮＡの一末端が、ｍＲＮＡに相補的なアンチセンス配列の５’末端を含む、＜１＞～＜２１＞のいずれか一項に記載のｌｄＲＮＡ。
＜２３＞
前記ｌｄＲＮＡの両末端が、ｍＲＮＡに相補的なアンチセンス配列の５’末端を含む、＜１＞～＜２１＞のいずれか一項に記載のｌｄＲＮＡ。
＜２４＞
ｍＲＮＡに相補的な前記配列が、８～５０ヌクレオチド長である配列から独立して選択される、＜１８＞～＜２３＞のいずれか一項に記載のｌｄＲＮＡ。
＜２５＞
ｍＲＮＡに相補的な前記配列が、１５～５０ヌクレオチド長の範囲内の配列から独立して選択される、＜２４＞に記載のｌｄＲＮＡ。
＜２６＞
前記ｍＲＮＡがウイルスｍＲＮＡである、＜１８＞～＜２５＞のいずれか一項に記載のｌｄＲＮＡ。
＜２７＞
前記ｍＲＮＡが、がん細胞の成長及び生存に重要な複数の経路に関与している、＜１８＞～＜２５＞のいずれか一項に記載のｌｄＲＮＡ。
＜２８＞
前記ｍＲＮＡが同一のシグナル伝達経路において機能する、＜１８＞～＜２５＞のいずれか一項に記載のｌｄＲＮＡ。
＜２９＞
前記ｍＲＮＡが、共通のシグナルから発する２以上のシグナル伝達経路で機能する、＜９＞～＜２５＞のいずれか一項に記載のｌｄＲＮＡ。
＜３０＞
＜１＞～＜２９＞のいずれか一項に記載のｌｄＲＮＡ及び医薬的に許容される担体を含む、医薬組成物。
＜３１＞
ポリヌクレオチドの細胞への輸送を促進するビヒクルをさらに含む、＜３０＞に記載の組成物。
＜３２＞
前記ビヒクルが、リン酸カルシウム、カチオン性脂質、カチオン性ポリマー、ポリエチレンイミン又はタンパク質ベースのトランスフェクション試薬である、＜３１＞に記載の組成物。
＜３３＞
＜１＞～＜２９＞のいずれか一項に記載のｌｄＲＮＡ又は＜３０＞～＜３２＞のいずれか一項に記載の医薬組成物を、哺乳類の細胞、組織、又は動物に投与することを含む、１又は複数のｍＲＮＡのレベルを低下させる方法。
＜３４＞
前記細胞がｓｉＲＮＡ治療に対して免疫感受性である、＜３３＞に記載の方法。
＜３５＞
少なくとも１つのｍＲＮＡが酵素をコードする、＜３３＞に記載の方法。
＜３６＞
少なくとも１つのｍＲＮＡが、転写因子をコードする、＜３３＞に記載の方法。
＜３７＞
少なくとも１つのｍＲＮＡが、分泌シグナリングタンパク質をコードする、＜３３＞に記載の方法。
＜３８＞
少なくとも１つのｍＲＮＡがシグナル伝達タンパク質をコードする、＜３３＞に記載の方法。
＜３９＞
少なくとも１つのｍＲＮＡが、キナーゼ又はホスファターゼをコードする、＜３３＞に記載の方法。
＜４０＞
少なくとも１つのｍＲＮＡが、細胞受容体又はイオンチャネルをコードする、＜３３＞に記載の方法。
＜４１＞
少なくとも１つのｍＲＮＡが、分泌タンパク質をコードする、＜３３＞に記載の方法。
＜４２＞
前記ｌｄＲＮＡ組成物が局所投与される、＜３３＞～＜４１＞のいずれか一項に記載の方法。
＜４３＞
前記ｌｄＲＮＡ組成物が非経口投与により投与される、＜３３＞～＜４１＞のいずれか一項に記載の方法。
＜４４＞
前記ｌｄＲＮＡ組成物が吸入により投与される、＜３３＞～＜４１＞のいずれか一項に記載の方法。
＜４５＞
前記ｌｄＲＮＡ組成物が静脈内投与される、＜３３＞～＜４１＞のいずれか一項に記載の方法。
＜４６＞
疾患又は状態が皮膚に影響を与えるものである、＜３３＞～＜４５＞のいずれか一項に記載の方法。
＜４７＞
＜３０＞～＜３２＞のいずれか一項に記載のｌｄＲＮＡ組成物を対象へ投与することを含む、前記対象の細胞における１又は複数のｍＲＮＡの発現を低下させる方法。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図6A】

【図6B】

【配列表】

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