特許7424998魚タンパク質加水分解物粉末および医薬としての使用のための前記粉末を含む組成物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-01-22
(45)【発行日】2024-01-30
(54)【発明の名称】魚タンパク質加水分解物粉末および医薬としての使用のための前記粉末を含む組成物
(51)【国際特許分類】
C12P 21/06 20060101AFI20240123BHJP
A23J 3/34 20060101ALI20240123BHJP
C12P 1/00 20060101ALI20240123BHJP
A61K 35/60 20060101ALI20240123BHJP
A61K 38/01 20060101ALI20240123BHJP
A61P 1/00 20060101ALI20240123BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20240123BHJP
A61P 1/04 20060101ALI20240123BHJP
A61P 25/28 20060101ALI20240123BHJP
A61P 25/16 20060101ALI20240123BHJP
A61P 21/04 20060101ALI20240123BHJP
A61P 25/18 20060101ALI20240123BHJP
A61P 9/10 20060101ALI20240123BHJP
A61P 39/06 20060101ALI20240123BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240123BHJP
C12N 9/48 20060101ALN20240123BHJP
【ＦＩ】
C12P21/06
A23J3/34
C12P1/00 A
A61K35/60
A61K38/01
A61P1/00
A61P25/00
A61P1/04
A61P25/28
A61P25/16
A61P21/04
A61P25/18
A61P9/10
A61P39/06
A61P43/00 111
C12N9/48
【請求項の数】
14
(21)【出願番号】P 2020570930
(86)(22)【出願日】2019-06-17
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2021-10-28
(86)【国際出願番号】 NO2019050125
(87)【国際公開番号】W WO2019245380
(87)【国際公開日】2019-12-26
【審査請求日】2022-05-20
(31)【優先権主張番号】62/687,665
(32)【優先日】2018-06-20
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】520494219
【氏名又は名称】ホフセス バイオケア アーエスアー
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】フラムローゼ， ボミ パテル
【審査官】西村 亜希子
(56)【参考文献】
【文献】中国特許出願公開第１０６２８２２８５（ＣＮ，Ａ）
【文献】特表２００３－５１１０９３（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開昭５８－１５８１３８（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開昭５１－８２７９１（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２００４／００３８３９１（ＵＳ，Ａ１）
【文献】米国特許第４４７３５８９（ＵＳ，Ａ）
【文献】FOOD RESEARCH INTERNATIONAL，2012年11月，VOL:49, NR:1，PAGE(S):92 - 98
【文献】PROCESS BIOCHEMISTRY，英国，ELSEVIER LTD，2016年11月11日，VOL:52，PAGE(S):149 - 158
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｐ
Ａ２３Ｊ
Ａ６１Ｋ
Ａ６１Ｐ
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
魚タンパク質加水分解物粉末を生成するための酵素加水分解プロセスであって、前記プロセスは、以下の連続する工程：ｉ）魚タンパク質材料に由来するすり潰した副生成物と水とを混合し、加熱する工程；
ｉｉ）エンドペプチダーゼ酵素を前記ｉ）の混合物に添加し、撹拌する工程；
ｉｉｉ）カルボキシペプチダーゼの形態にあるエキソペプチダーゼ酵素を、前記ｉｉ）の混合物に添加し、撹拌する工程；
ｉｖ）酵素加水分解を熱不活性化によって停止させる工程；
ｖ）魚加水分解物画分および残りの固体材料を、濾過によって分離する工程；ならびに
ｖｉ）前記魚加水分解物画分を濃縮および乾燥させて、魚タンパク質加水分解物粉末を得る工程、
を包含するプロセス。
【請求項2】
前記プロセスは、ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅに由来するプロテアーゼ酵素を、前記ｉｉｉ）の混合物に添加し、撹拌する工程という第３の加水分解工程をさらに包含する、請求項１に記載のプロセス。
【請求項3】
前記魚タンパク質材料は、魚類に由来する、請求項１に記載のプロセス。
【請求項4】
前記エンドペプチダーゼは、ペプシンまたはトリプシン、またはこれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項１に記載のプロセス。
【請求項5】
医薬としての使用のための、請求項１～４のいずれかに記載のプロセスによって得られ得る、魚タンパク質加水分解物粉末。
【請求項6】
請求項５に記載の魚タンパク質加水分解物粉末を、医薬としての使用のための少なくとも１種の薬理学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤を一緒に含む組成物。
【請求項7】
消化器系または中枢神経系の障害または疾患の予防または処置における使用のための、請求項５に記載の魚タンパク質加水分解物粉末または請求項６に記載の組成物。
【請求項8】
消化器系の障害または疾患の予防または処置における使用のための、請求項５に記載の魚タンパク質加水分解物粉末または請求項６に記載の組成物であって、前記消化器系の障害または疾患は、胃食道逆流症、胃腸炎、過敏性腸症候群、小腸結腸炎、セリアック病および直腸炎の疾患を含む群より選択される、魚タンパク質加水分解物粉末または組成物。
【請求項9】
中枢神経系の障害または疾患の予防または処置における使用のための、請求項５に記載の魚タンパク質加水分解物粉末または請求項６に記載の組成物であって、前記中枢神経系の障害または疾患は、神経変性疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、脳血管障害、脱髄疾患、および精神障害を含む群から選択される、魚タンパク質加水分解物粉末または組成物。
【請求項10】
酸化保護遺伝子の発現の改変による、消化器系または中枢神経系の障害または疾患の予防または処置における使用のための、請求項５に記載の魚タンパク質加水分解物粉末または請求項６に記載の組成物。
【請求項11】
酸化保護遺伝子の発現の改変による、消化器系または中枢神経系の障害または疾患の予防または処置における使用のための、請求項５に記載の魚タンパク質加水分解物粉末または請求項６に記載の組成物であって、前記酸化保護遺伝子は、赤血球系転写因子２関連転写因子２（Ｎｒｆ２）および調節される遺伝子セット内に存在する、魚タンパク質加水分解物粉末または組成物。
【請求項12】
酸化保護遺伝子の発現の改変による、消化器系または中枢神経系の障害または疾患の予防または処置における使用のための、請求項５に記載の魚タンパク質加水分解物粉末または請求項６に記載の組成物であって、前記酸化保護遺伝子は、アポリポプロテインＥ、サイトグロビン、好酸球ペルオキシダーゼ、フェリチン重鎖ポリペプチド１、グルタミン－システインリガーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ１、グルタチオンシンセターゼ、グルタチオントランスフェラーゼζ１、ヘムオキシゲナーゼ１、マンノース結合レクチン２、メチオニンスルホキシドレダクターゼＡ、一酸化窒素シンターゼ２、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈデヒドロゲナーゼキノン１、ペルオキシレドキシン５、セレノプロテインＳ、スーパーオキシドジスムターゼ１、アラキドン酸１２－リポキシゲナーゼ、エポキシドヒドロラーゼ２、ミクロソームグルタチオンＳトランスフェラーゼ３、ミエロペルオキシダーゼ、好中球サイトゾル因子１、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ、ペルオキシレドキシン１、プロスタグランジンエンドペルオキシドシンターゼ２、またはスルフィレドキシンである、魚タンパク質加水分解物粉末または組成物。
【請求項13】
前記魚タンパク質材料は、サケ類に由来する、請求項３に記載のプロセス。
【請求項14】
前記魚タンパク質材料は、ｓａｌｍｏ ｓａｌａｒに由来する、請求項１３に記載のプロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
発明の分野：
本発明は、魚タンパク質加水分解物粉末を生成するための酵素加水分解プロセスに関する。さらに、本発明は、このプロセスによって得られた魚タンパク質加水分解物粉末および医薬としての、好ましくは、消化器系および中枢神経系の酸化的損傷の予防または処置のための上記粉末を含む組成物の使用に関する。
本発明は、魚タンパク質加水分解物粉末を生成するための酵素加水分解プロセスに関する。さらに、本発明は、このプロセスによって得られた魚タンパク質加水分解物粉末および医薬としての、好ましくは、消化器系および中枢神経系の酸化的損傷の予防または処置のための上記粉末を含む組成物の使用に関する。
【0002】
本発明は、魚タンパク質加水分解物、ならびに種々の器官および組織において酸化的損傷に対する保護を提供するヒト酸化保護遺伝子の機能を調節することが意図されたその成分ペプチドに関する。より具体的には、本発明は、経口製剤へと組み込まれる、酸化保護遺伝子調節活性を有する１またはこれより多くのペプチド化合物に関する。本発明はまた、有効量の上記魚タンパク質加水分解物またはその成分ペプチドのうちの１もしくはこれより多くを経口摂取する工程を包含する、消化器系および中枢神経系を酸化的損傷から保護するための方法に関する。
【背景技術】
【0003】
発明の背景：
１またはこれより多くの酸化的ストレス関連遺伝子のアップレギュレート／ダウンレギュレートは、酸化的傷害に曝された組織に細胞保護を付与し得る考えられる機構として提唱されている。分子酸素は、ほぼ全ての真核生物の生存に必須であるが、生理学的条件下でのその処理は、代謝副生成物として、過酸化水素、スーパーオキシド、ペルオキシナイトライト、およびヒドロキシルラジカルのような活性酸素種（ＲＯＳ）を生成する。適切な防御機構の非存在下において、ＲＯＳおよび求電子剤の蓄積は、細胞膜およびＤＮＡの損傷、変異原性、組織の変性、早老、アポトーシス性細胞死およびがんをもたらす［Ｗａｒｄ， Ｊ． Ｆ． （１９９４） Ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ ｏｆ ＤＮＡ ｄａｍａｇｅ： ｒｅｌｅｖａｎｃｅ ｔｏ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ． Ｉｎｔ． Ｊ． Ｒａｄｉａｔ Ｂｉｏｌ． ６６， ４２７－４３２ ； Ｇｏｅｔｚ， Ｍ． Ｅ．， ａｎｄ Ｌｕｃｈ， Ａ． （２００８） Ｒｅａｃｔｉｖｅ ｓｐｅｃｉｅｓ： Ａ ｃｅｌｌ ｄａｍａｇｉｎｇ ｒｏｕｔ ａｓｓｉｓｔｉｎｇ ｔｏ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｓ． Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ． ２６６， ７３－８３ ； Ｓｔｒａｓｓｂｕｒｇ， Ｃ． Ｐ．， Ｍａｎｎｓ， Ｍ． Ｐ．， ａｎｄ Ｔｕｋｅｙ， Ｒ． Ｈ． （１９９７） Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｄｏｗｎ－Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＵＤＰ－Ｇｌｕｃｕｒｏｎｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ １Ａ Ｌｏｃｕｓ Ｉｓ ａｎ Ｅａｒｌｙ Ｅｖｅｎｔ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｌｉｖｅｒ ａｎｄ Ｂｉｌｉａｒｙ Ｃａｎｃｅｒ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５７， ２９７９－２９８５］。
１またはこれより多くの酸化的ストレス関連遺伝子のアップレギュレート／ダウンレギュレートは、酸化的傷害に曝された組織に細胞保護を付与し得る考えられる機構として提唱されている。分子酸素は、ほぼ全ての真核生物の生存に必須であるが、生理学的条件下でのその処理は、代謝副生成物として、過酸化水素、スーパーオキシド、ペルオキシナイトライト、およびヒドロキシルラジカルのような活性酸素種（ＲＯＳ）を生成する。適切な防御機構の非存在下において、ＲＯＳおよび求電子剤の蓄積は、細胞膜およびＤＮＡの損傷、変異原性、組織の変性、早老、アポトーシス性細胞死およびがんをもたらす［Ｗａｒｄ， Ｊ． Ｆ． （１９９４） Ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ ｏｆ ＤＮＡ ｄａｍａｇｅ： ｒｅｌｅｖａｎｃｅ ｔｏ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ． Ｉｎｔ． Ｊ． Ｒａｄｉａｔ Ｂｉｏｌ． ６６， ４２７－４３２ ； Ｇｏｅｔｚ， Ｍ． Ｅ．， ａｎｄ Ｌｕｃｈ， Ａ． （２００８） Ｒｅａｃｔｉｖｅ ｓｐｅｃｉｅｓ： Ａ ｃｅｌｌ ｄａｍａｇｉｎｇ ｒｏｕｔ ａｓｓｉｓｔｉｎｇ ｔｏ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｓ． Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ． ２６６， ７３－８３ ； Ｓｔｒａｓｓｂｕｒｇ， Ｃ． Ｐ．， Ｍａｎｎｓ， Ｍ． Ｐ．， ａｎｄ Ｔｕｋｅｙ， Ｒ． Ｈ． （１９９７） Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｄｏｗｎ－Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＵＤＰ－Ｇｌｕｃｕｒｏｎｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ １Ａ Ｌｏｃｕｓ Ｉｓ ａｎ Ｅａｒｌｙ Ｅｖｅｎｔ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｌｉｖｅｒ ａｎｄ Ｂｉｌｉａｒｙ Ｃａｎｃｅｒ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５７， ２９７９－２９８５］。
【0004】
この酸化的ストレスと闘うために、哺乳動物細胞は、酸化的ストレス事象の中和、ＲＯＳの低減および従って細胞生存の増大をもたらす多くの誘導性保護遺伝子活性化を発生させた［Ｄｈａｋｓｈｉｎａｍｏｏｒｔｈｙ， Ｓ．， Ｌｏｎｇ， Ｄ． Ｊ．， Ｊａｉｓｗａｌ， Ａ． Ｋ． （２０００） Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ Ｅｎｃｏｄｉｎｇ Ｅｎｚｙｍｅｓ Ｔｈａｔ Ｄｅｔｏｘｉｆｙ Ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃｓ ａｎｄ Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｓ． Ｃｕｒｒ． Ｔｏｐ． Ｃｅｌｌ Ｒｅｇｕｌ． ３６， ２０１－２１６ ； Ｊａｉｓｗａｌ， Ａ． Ｋ． （２０００） Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：ｑｕｉｎｏｎｅ ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅｓ． Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ Ｂｉｏｌ． Ｍｅｄ． ２９， ２５４－２６２］
抗酸化特性を有し、ＲＯＳを不活性化することができ、ＲＯＳで開始される反応を防止することができる酵素としては、スーパーオキシドジスムターゼ、カタラーゼ、およびグルタチオンペルオキシダーゼが挙げられる。それらは、「直接」フェーズ１抗酸化酵素（“ｄｉｒｅｃｔ” Ｐｈａｓｅ １ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｅｎｚｙｍｅｓ）といわれる群に属する［Ａｕｔｅｎ， Ｒ． Ｌ．， Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ， Ｍ． Ａ．， Ｏｕｒｙ， Ｔ． Ｄ．， Ｎｏｚｉｋ－Ｇｒａｙｃｋ， Ｅ．， ａｎｄ Ｗｈｏｒｔｏｎ， Ｍ． Ｈ． （２００６） Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ ｐｒｏｔｅｃｔｓ ｐｏｓｔｎａｔａｌ ａｌｖｅｏｌａｒ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｄｕｒｉｎｇ ｈｙｐｅｒｏｘｉａ． Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｌｕｎｇ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ２９０， Ｌ３２－４０］。
抗酸化特性を有し、ＲＯＳを不活性化することができ、ＲＯＳで開始される反応を防止することができる酵素としては、スーパーオキシドジスムターゼ、カタラーゼ、およびグルタチオンペルオキシダーゼが挙げられる。それらは、「直接」フェーズ１抗酸化酵素（“ｄｉｒｅｃｔ” Ｐｈａｓｅ １ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｅｎｚｙｍｅｓ）といわれる群に属する［Ａｕｔｅｎ， Ｒ． Ｌ．， Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ， Ｍ． Ａ．， Ｏｕｒｙ， Ｔ． Ｄ．， Ｎｏｚｉｋ－Ｇｒａｙｃｋ， Ｅ．， ａｎｄ Ｗｈｏｒｔｏｎ， Ｍ． Ｈ． （２００６） Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ ｐｒｏｔｅｃｔｓ ｐｏｓｔｎａｔａｌ ａｌｖｅｏｌａｒ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｄｕｒｉｎｇ ｈｙｐｅｒｏｘｉａ． Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｌｕｎｇ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ２９０， Ｌ３２－４０］。
【0005】
フェーズ２解毒（結合体化）酵素（Ｐｈａｓｅ ２ ｄｅｔｏｘｉｆｙｉｎｇ （ｃｏｎｊｕｇａｔｉｎｇ） ｅｎｚｙｍｅ）は、レドックスバランスおよびチオールホメオスタシスの維持におけるそれらの役割に基づく「間接」抗酸化剤（“ｉｎｄｉｒｅｃｔ” ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ）として分類される。それらは、生合成、チオールのリサイクルに寄与し、生体異物解毒のプロセスの間の還元／結合体化反応を通じて、酸化された反応性二次代謝産物（キノン、エポキシド、アルデヒド、およびペルオキシド）の排泄を促進する［Ｔａｌａｌａｙ， Ｐ．， Ｈｏｌｔｚｃｌａｗ， Ｗ． Ｄ．， ａｎｄ Ｄｉｎｋｏｖａ－Ｋｏｓｔｏｖａ， Ａ． Ｔ． （２００４） Ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ ｏｆ Ｐｈａｓｅ ２ ｇｅｎｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｉｌｅ ａｎｄ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｓｉｓ． Ａｄｖ． Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｇｕｌ． ４４， ３３５－３６７］。
【0006】
抗酸化能力を有するフェーズ２酵素としては、グルタチオンＳトランスフェラーゼアイソザイムおよびＮＡＤＰ（Ｈ）：キニンオキシドレダクターゼ（ＮＱＯ１）、グルタミルシステインリガーゼ（ＧＣＬＣ）、およびＵＤＰ－グルクロノシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）が挙げられる。
【0007】
酸化的ストレスを感知し、適切な防御遺伝子を活性化することを担うシグナル伝達経路は、哺乳動物においてまだ完全に理解されていない。転写因子である赤血球系転写因子２関連転写因子２（Ｎｒｆ２）は、ＲＯＳによって活性化され、酸化的ストレス遺伝子調節において重要な調節因子であるようである。Ｎｒｆ２は、ｂＺＩＰタンパク質のＣａｐ’ｎ’Ｃｏｌｌａｒファミリーのメンバーであり、その２０００超の標的遺伝子のプロモーターの中の抗酸化応答エレメント（ＡＲＥ）を認識する。正常な基底条件下で、Ｎｒｆ２は、そのインヒビターである細胞骨格関連タンパク質Ｋｅａｐ１に結合され、これは、そのプロテアソーム分解を促進することによってＮｒｆ２を抑制する［Ｉｔｏｈ， Ｋ．， Ｗａｋａｂａｙａｓｈｉ， Ｎ．， Ｋａｔｏｈ， Ｙ．， Ｉｓｈｉｉ， Ｔ．， Ｉｇａｒａｓｈｉ， Ｋ．， Ｅｎｇｅｌ， Ｊ． Ｄ．， ａｎｄ Ｙａｍａｍｏｔｏ， Ｍ． （１９９９） Ｋｅａｐ１ ｒｅｐｒｅｓｓｅｓ ｎｕｃｌｅａｒ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｂｙ Ｎｒｆ２ ｔｈｒｏｕｇｈ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ａｍｉｎｏ－ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｎｅｈ２ ｄｏｍａｉｎ． Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． １３， ７６－８６］。抗酸化剤による処置の際に、Ｎｒｆ２はＫｅａｐ１から放出され、核へと移動し、続いて、他の転写因子（例えば、Ｊｕｎおよびｓｍａｌｌ Ｍａｆ）とヘテロダイマー化し［Ｖｅｎｕｇｏｐａｌ， Ｒ．， ａｎｄ Ｊａｉｓｗａｌ， Ａ． Ｋ． （１９９８） Ｎｒｆ２ ａｎｄ Ｎｒｆ１ ｉｎ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｊｕｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｒｅｇｕｌａｔｅ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｄｅｔｏｘｉｆｙｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅｓ． Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １７， ３１４５－３１５６ ； Ｎｇｕｙｅｎ， Ｔ．， Ｓｈｅｒｒａｔｔ， Ｐ． Ｊ．， ａｎｄ Ｐｉｃｋｅｔｔ， Ｃ． Ｂ． （２００３） Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔ． Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｔｏｘｉｃｏｌ． ４３， ２３３－２６０］、抗酸化遺伝子のアップレギュレートを開始する。
【0008】
インビトロ遺伝子発現は、多くの疾患における抗酸化剤の役割を理解するために使用されている。遺伝子発現を使用して、健常喫煙者と比較して、ＣＯＰＤ（慢性閉塞性肺疾患）を有する被験体において２００の差次的に発言される酸化遺伝子を示し、インビボで観察された酸化応答遺伝子における顕著な変化は、同じドナーに由来する初代気管支上皮細胞を使用してインビトロで再現された［Ｐｉｅｒｒｏｕ， Ｓ．， Ｂｒｏｂｅｒｇ， Ｐ．， Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ， Ｒ．Ａ．， Ｐａｗｌｏｗｓｋｉ， Ｋ．， Ｖｉｒｔａｌａ， Ｒ．， Ｌｉｎｄｑｖｉｓｔ， Ｅ． （２００７） Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ Ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ Ｓｔｒｅｓｓ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｉｎ Ａｉｒｗａｙ Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌｓ ｏｆ Ｓｍｏｋｅｒｓ ｗｉｔｈ Ｃｈｒｏｎｉｃ Ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ Ｄｉｓｅａｓｅ． Ａｍ． Ｊ． ｏｆ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ａｎｄ Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｃａｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， １７５（６）， ５７７－５８７］。インビトロ遺伝子発現はまた、核の酸化的ＤＮＡ損傷が、加齢とともに増大するか否か、およびＨＣＥＣが、酸化的ストレスのそれらの発現およびＤＮＡ損傷シグナル伝達遺伝子を、加齢依存性様式においてアップレギュレートさせることによって、この損傷に応答するか否か、を理解するために、ヒト角膜内脾細胞（ＨＣＥＣ）において研究されている［Ｊｏｙｃｅ， Ｎ．Ｃ．， Ｈａｒｒｉｓ， Ｄ．Ｌ．， Ｚｈｕ， Ｃ．Ｃ． Ａｇｅ－Ｒｅｌａｔｅｄ Ｇｅｎｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｃｏｒｎｅａｌ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ ｔｏ Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ Ｓｔｒｅｓｓ ａｎｄ ＤＮＡ Ｄａｍａｇｅ （２０１１） Ｃｏｒｎｅａ， ５２（３）， １６４１－１６４９］。試験した８４の酸化保護遺伝子のうちの４つが、それらの発現において統計的に顕著な加齢関連の差異を示した。
【0009】
研究はまた、食事が酸化保護遺伝子の調節において役割を果たし得ることを示している。食品に応じて食事関連疾患の分子マーカーを同定することを目指す近年の研究は、ＲＮＡの容易に入手可能な供給源としてのインビトロシステムにおけるモデルとして末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を評価して、個別化肥満処置に関する遺伝子発現シグナチャーを見分けた。体重を減少させるための８週間の低カロリー食（ＬＣＤ）の前後にＰＢＭＣを肥満男性から集めた。上記ＬＣＤの前後に遺伝子発現における変化を、ｑＲＴ－ＰＣＲによって検証したところ、いくつかの特異的酸化的ストレスおよび炎症遺伝子における減少を示した［Ｃｒｕｊｅｉｒａｓ， Ａ．， Ｐａｒｒａ， Ｄ．， Ｍｉｌａｇｒｏ， Ｆ．， Ｇｏｙｅｎｅｃｈｅａ， Ｅ．， Ｌａｒｒａｒｔｅ， Ｅ．， Ｍａｒｇａｒｅｔｏ， Ｊ．， Ｍａｒｔｉｎｅｚ， Ａ． （２００８） Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ Ｓｔｒｅｓｓ ａｎｄ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｂｌｏｏｄ Ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ａ Ｌｏｗ－Ｃａｌｏｒｉｅ Ｄｉｅｔ： Ａ Ｎｕｔｒｉｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｓｔｕｄｙ． ＯＭＩＣＳ： Ａ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ， １２（４）， １－１２］。
【0010】
酸化保護遺伝子の調節は、特に、経口摂取されるタンパク質加水分解物および魚タンパク質加水分解物によっては報告されていない。生体異物の最初の侵入の主要部位として、口腔および消化管は、ＲＯＳ能力を有する広い範囲の化合物に連続して曝される。さらに粘膜代謝は、増大した毒性を有する代謝産物をもたらし得、口腔および消化管が酸化的代謝産物、化学的毒性、ならびに潜在的な壊死性大腸炎の感受性を増大させる。この酸化的損傷はまた、中枢神経系の一部としての神経組織における二次的効果として観察され得る。
【0011】
酸化保護遺伝子のアップレギュレーションは、潰瘍性大腸炎およびクローン病のような炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、ならびにパーキンソン病、多発性硬化症およびアルツハイマー病のようなＣＮＳ変性疾患の制御において、医学的処置とともに使用され得る、消化器系および中枢神経系に対して保護効果を付与し得る実行可能な生物学的標的である。
【0012】
よって、経口摂取される場合、種々の器官および組織の酸化保護のための摂取することによる処置を開発する必要性がなお存在する。本発明は、この必要性を満たし、さらに関連する利点を提供する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0013】
【文献】Ｗａｒｄ， Ｊ． Ｆ． （１９９４） Ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ ｏｆ ＤＮＡ ｄａｍａｇｅ： ｒｅｌｅｖａｎｃｅ ｔｏ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ． Ｉｎｔ． Ｊ． Ｒａｄｉａｔ Ｂｉｏｌ． ６６， ４２７－４３２
【文献】Ｇｏｅｔｚ， Ｍ． Ｅ．， ａｎｄ Ｌｕｃｈ， Ａ． （２００８） Ｒｅａｃｔｉｖｅ ｓｐｅｃｉｅｓ： Ａ ｃｅｌｌ ｄａｍａｇｉｎｇ ｒｏｕｔ ａｓｓｉｓｔｉｎｇ ｔｏ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｓ． Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ． ２６６， ７３－８３
【文献】Ｓｔｒａｓｓｂｕｒｇ， Ｃ． Ｐ．， Ｍａｎｎｓ， Ｍ． Ｐ．， ａｎｄ Ｔｕｋｅｙ， Ｒ． Ｈ． （１９９７） Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｄｏｗｎ－Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＵＤＰ－Ｇｌｕｃｕｒｏｎｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ １Ａ Ｌｏｃｕｓ Ｉｓ ａｎ Ｅａｒｌｙ Ｅｖｅｎｔ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｌｉｖｅｒ ａｎｄ Ｂｉｌｉａｒｙ Ｃａｎｃｅｒ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５７， ２９７９－２９８５
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0014】
発明の要旨
本発明は、種々の器官および組織における酸化的損傷に対して保護を提供する、ヒト酸化保護遺伝子の機能を調節することにおける経口使用のための魚タンパク質加水分解物粉末およびその成分ペプチドを提供する。本発明に従う魚タンパク質加水分解物粉末は、経口製剤に組み込まれる酸化保護遺伝子調節活性を有する１またはこれより多くのペプチド化合物を含む。
本発明は、種々の器官および組織における酸化的損傷に対して保護を提供する、ヒト酸化保護遺伝子の機能を調節することにおける経口使用のための魚タンパク質加水分解物粉末およびその成分ペプチドを提供する。本発明に従う魚タンパク質加水分解物粉末は、経口製剤に組み込まれる酸化保護遺伝子調節活性を有する１またはこれより多くのペプチド化合物を含む。
【0015】
本発明に従う魚タンパク質加水分解物粉末は、消化器系および中枢神経系を酸化的損傷から保護するための改善された有効性を有する。本発明に従う魚タンパク質加水分解物粉末を含む組成物は、ビタミンＥ、ビタミンＡ、ティーツリーオイル（ｔｒｅｅ ｔｅａ ｏｉｌ）、緑茶抽出物、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）およびフェルラ酸またはこれらの誘導体などから選択される抗酸化剤またはフリーラジカルスカベンジャーを必要に応じて含み得る。
【0016】
本発明に従う魚タンパク質加水分解物粉末を含む組成物は、このような調製における使用に適した食品グレードの受容可能な成分をさらに含み得、このような成分としては、矯味矯臭剤、乳化剤、界面活性剤、皮膚軟化剤、エッセンシャルオイル、ゲル化剤、保湿剤、着色剤などが挙げられ得る。
【0017】
さらに、本発明に従う魚タンパク質加水分解物粉末を含む組成物は、嚥下に困難があり得る乳児、幼児、成人および高齢の成人の経口送達を容易にする粉末または液剤の形態にあり得る。
【0018】
本発明はまた、消化器系および中枢神経系の、関係する器官および組織に対する酸化的損傷によって潜在的に引き起こされる疾患を処置するための方法を包含する。本発明に従う皮膚組成物は、有効量の魚タンパク質加水分解物またはその成分ペプチドのうちの１もしくはこれより多くを経口摂取することによって、上記消化器系および中枢神経系を酸化的損傷から保護するために使用され得る。
【発明を実施するための形態】
【0019】
発明の詳細な説明：
本発明を詳細に記載する前に、本明細書で使用される用語法が、特定の実施形態を記載する目的のために過ぎず、限定することを意図しないことは理解されるべきである。本明細書および添付の請求項において使用される場合、単数形「１つの、ある（ａ）」、「１つの、ある（ａｎ）」、および「上記、その、この（ｔｈｅ）」は、状況が別段明らかに示さなければ、複数形への言及を包含することは、注記されなければならない。
本発明を詳細に記載する前に、本明細書で使用される用語法が、特定の実施形態を記載する目的のために過ぎず、限定することを意図しないことは理解されるべきである。本明細書および添付の請求項において使用される場合、単数形「１つの、ある（ａ）」、「１つの、ある（ａｎ）」、および「上記、その、この（ｔｈｅ）」は、状況が別段明らかに示さなければ、複数形への言及を包含することは、注記されなければならない。
【0020】
用語「サケ類（ｓａｌｍｏｎｉｄｓ）」とは、本明細書で使用される場合、Ｓａｌｍｏｎｉｄａｅ科の任意の魚類を意味する。用語「魚タンパク質加水分解物（ｆｉｓｈ ｐｒｏｔｅｉｎ ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ）」とは、本明細書で使用される場合、任意の魚類生物またはその一部の酵素加水分解から形成され、得られたペプチドを意味する。用語「酵素加水分解（ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ）」とは、本明細書で使用される場合、天然のおよび人工の、固定されたかまたは遊離の、エンドおよびエキソの両方のプロテアーゼ酵素を使用して、成分アミノ酸、ペプチドおよびオリゴペプチドへとタンパク質を分解するプロセスを意味する。用語「エンドおよびエキソ（ｅｎｄｏ ａｎｄ ｅｘｏ）」とは、本明細書で使用される場合、それぞれ、内部のアミノ酸結合および末端のアミノ酸結合から、タンパク質を加水分解するプロテアーゼ酵素を意味する。用語、タンパク質加水分解物およびタンパク質加水分解物粉末は、本明細書中以降、交換可能に使用される。
【0021】
本発明によれば、経口使用のための、消化器系および中枢神経系を酸化的損傷から保護する魚タンパク質加水分解物粉末および上記粉末を含む組成物が提供される。
【0022】
上記魚タンパク質加水分解物は、１またはこれより多くの生体活性ペプチド化合物、特に、消化器系および中枢神経系に保護を付与する１またはこれより多くの酸化保護遺伝子の発現を調節し得る１またはこれより多くのペプチドを含む。
【0023】
容易に消化されかつ生体利用可能であるタンパク質を送達することにおけるタンパク質加水分解物の使用が、報告されている。しかし、酸化的損傷からの保護を具体的に増大させるこのようなタンパク質加水分解物の使用は、報告されていない。より具体的には、タンパク質加水分解物を介する、Ｎｒｆ２経路に存在するもののような酸化保護遺伝子を調節し得る、消化管への活性ペプチドの経口送達は、文献中に記載されていない。
【0024】
従って、本発明の一局面は、魚タンパク質加水分解物であって、酸化保護遺伝子（例えば、Ｎｒｆ２カスケードに見出されるもの）の調節を改変して、消化器系および中枢神経系の保護を提供し、その結果、上記加水分解物で処置されている被験体は、増強された有効性という最大の利益を得る魚タンパク質加水分解物を提供することに関する。
【0025】
本発明に従う加水分解物粉末または組成物は、粉末として調製され、水または任意の他の液体食品（例えば、ジュース、牛乳または発泡性飲料）中の溶液として経口送達される、１またはこれより多くのペプチドを含む魚タンパク質加水分解物を含む。
【0026】
当業者は、タンパク質加水分解物が、酸、塩基および酵素的な手段によって達成され得ること、およびその得られたタンパク質加水分解物が異なる特徴および成分を有することを認識している。さらに、酵素的手段による加水分解は、異なるペプチド成分をもたらし、これらは、元のタンパク質供給源および使用される酵素に依存する。本発明の目的に関しては、上記加水分解は、酵素加水分解に限定されず、上記タンパク質供給源は、魚に限定されず、上記酵素は、プロテアーゼ酵素に限定されない。好ましいタンパク質供給源は、ｓａｌｍｏｎｉｄ科の魚、特に、捌いて切り身にするプロセス後に生じるサケ（ｓａｌｍｏ ｓａｌａｒ）の切れ端、頭部、背骨、尾部および皮である。好ましい酵素は、微生物供給源から供給され、２００～１０００ｍｌ／ｇの間のＤＡＰＵ（界面活性剤アルカリプロテアーゼユニット（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｕｎｉｔｓ））数または１００，０００～５００，０００ＰＣ／ｇの間の測定値の天然プロテアーゼ活性を有するエンドおよびエキソプロテアーゼである。
【0027】
驚くべきことに、本発明に従う酵素加水分解プロセスは、魚タンパク質加水分解物および生物学的に活性である魚タンパク質加水分解物粉末を提供し、医薬として使用され得ることが見出された。
【0028】
従って、本発明の一局面は、魚タンパク質加水分解物粉末を生成するための酵素加水分解プロセスに関し、上記プロセスは、以下の連続する工程を包含する：
ｉ）すり潰した魚タンパク質材料と水とを混合し、加熱する工程；
ｉｉ）エンドペプチダーゼ酵素を上記ｉ）の混合物に添加し、撹拌する工程；
ｉｉｉ）カルボキシペプチダーゼの形態にあるエキソペプチダーゼ酵素を上記ｉｉ）の混合物に添加し、撹拌する工程；
ｉｖ）上記酵素加水分解を熱不活性化によって停止させる工程；
ｖ）上記魚加水分解物画分および残りの固体材料を、濾過によって分離する工程；ならびに
ｖｉ）上記魚加水分解物画分を濃縮および乾燥させて、魚タンパク質加水分解物粉末を得る工程。
ｉ）すり潰した魚タンパク質材料と水とを混合し、加熱する工程；
ｉｉ）エンドペプチダーゼ酵素を上記ｉ）の混合物に添加し、撹拌する工程；
ｉｉｉ）カルボキシペプチダーゼの形態にあるエキソペプチダーゼ酵素を上記ｉｉ）の混合物に添加し、撹拌する工程；
ｉｖ）上記酵素加水分解を熱不活性化によって停止させる工程；
ｖ）上記魚加水分解物画分および残りの固体材料を、濾過によって分離する工程；ならびに
ｖｉ）上記魚加水分解物画分を濃縮および乾燥させて、魚タンパク質加水分解物粉末を得る工程。
【0029】
上記魚タンパク質材料は、任意の魚、好ましくは、Ｓａｌｍｏｎｉｄ科、特に、サケ（ｓａｌｍｏ ｓａｌａｒ）の魚に由来し得る。上記タンパク質材料は、捌いて切り身にするプロセス後に生じる筋、切れ端、頭部、背骨、尾部および皮のような任意の魚材料またはこれらの任意の組み合わせであり得る。
【0030】
上記魚タンパク質材料のすり潰しは、任意の周知の手順によって行われ得る。すり潰した魚質量 対 水の比率は、重量で、１：０．５～１：５の範囲、好ましくは１：１にあり得る。
【0031】
使用されるエンドペプチダーゼ（第１の酵素）は、任意のエンドペプチダーゼまたはこれらの組み合わせであり得る。好ましいエンドペプチダーゼは、ペプシンおよびトリプシンまたはこれらの任意の組み合わせである。
【0032】
使用されるエキソペプチダーゼ（第２の酵素）は、カルボキシペプチダーゼの群から選択され、任意のカルボキシペプチダーゼまたはこれらの組み合わせが、使用され得る。添加されるエンドペプチダーゼおよびエキソペプチダーゼ酵素の量は、魚質量のうちの０．０５～１ ％ ｗｔ／ｗｔの範囲にあり得る。
【0033】
本発明に従うプロセスの一実施形態は、ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅに由来するプロテアーゼ酵素を、上記工程ｉｉｉ）の混合物に添加する第３の加水分解工程をさらに包含する。上記第３のプロテアーゼ酵素は、０．０１～０．１％ ｗｔ／ｗｔ 魚質量の比において添加され得る。
【0034】
上記酵素加水分解工程の温度は、上記選択される酵素が活性である都合の良い温度に調節される。好ましくは、上記加水分解工程、すなわち、工程ｉ）～ｉｖ）の温度範囲は、３５℃～６０℃、より好ましくは５０℃である。上記第１、第２および第３の酵素の作用の継続時間は、各々について１０～３０分間であり得る。上記加水分解物混合物を第１、第２および第３の酵素の連続的な添加に供することによって得られるタンパク質加水分解物は、嗜好性の高いかつ生物学的に活性な加水分解物を提供する。上記加水分解物混合物を第１および第２の酵素にのみ供することによって得られるタンパク質加水分解物は、嗜好性が低いが、それでもなお生物学的に活性な加水分解物を提供する。
【0035】
加水分解混合物が第１および第２の酵素にのみ供される場合に、一方または両方の酵素の作用時間は、延長される。一実施形態において、上記第１、第２および第３の酵素の作用時間は、それぞれ、３０分間、１５分間および１０分間である。
【0036】
別の実施形態において、上記第１および第２の酵素の作用時間は、それぞれ、３０分間および２５分間である。
【0037】
上記酵素加水分解は、熱不活性化によって停止される。すなわち、上記加水分解混合物の温度は、上記酵素がもはや活性でない温度へと上昇される。好ましくは、上記加水分解混合物は、８０℃～９５℃の範囲、より好ましくは８５℃の温度に加熱される。不活性化が十分であるためには、上記温度は、例えば、１５分間のような十分な時間にわたって不活性化温度で維持されなければならない。
【0038】
上記タンパク質加水分解物画分および残りの固体材料の分離は、任意の適切な濾過または遠心分離技術によって行われ得る。適切な例は、変動性のメッシュサイズを有する振動ふるいである。濾過後、上記魚タンパク質加水分解物画分を濃縮および乾燥して、最終の魚タンパク質加水分解物粉末を得る。任意の適切な濃縮および乾燥プロセスが使用され得る。例として、上記加水分解物画分は、従来のエバポレーター中で３０％ 乾燥物へと濃縮され、適切な最終の乾燥物含有量を得るためにスプレー乾燥される。好ましくは、上記魚タンパク質加水分解物粉末は、９５～９９％、よび好ましくは９８％の最終の乾燥物含有量を有する。
【0039】
上記酵素加水分解プロセスは、消泡剤または界面活性剤またはこれらの任意の組み合わせのような処理補助物質（ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ａｉｄ）をさらに含み得る。
【0040】
本発明の別の局面は、医薬としての使用のための、本発明に従うプロセスによって得られ得る魚タンパク質加水分解物粉末である。
【0041】
本発明に従って提供される魚タンパク質加水分解物粉末の利益は、上記粉末が、非ＧＭＯ微生物プロテアーゼ酵素を使用する酵素加水分解によって形成されることである。
【0042】
本発明の別の局面は、医薬としての使用のための少なくとも１種の薬理学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤と一緒に本発明に従う魚タンパク質加水分解物粉末を含む組成物に関する。
【0043】
一実施形態において、上記組成物は、動物源および植物源またはこれらの任意の組み合わせのさらなるタンパク質およびタンパク質加水分解物をさらに含む。
【0044】
別の実施形態において、上記組成物は、ビタミンＥ、ビタミンＡ、ティーツリーオイル、緑茶抽出物、ブチル化ヒドロキシルアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、またはこれらの任意の組み合わせから選択される抗酸化剤またはフリーラジカルスカベンジャーをさらに含む。
【0045】
なお別の実施形態において、上記組成物は、炭水化物、フレーバーおよび甘味料をさらに含む。
【0046】
なお別の実施形態において、上記組成物は、適切な保湿剤または乳化剤またはこれらの任意の組み合わせをさらに含む。
【0047】
驚くべきことに、本発明に従う酵素加水分解プロセスは、生物学的に活性なかつ医薬として使用され得る、魚タンパク質加水分解物および魚タンパク質加水分解物粉末を提供することが見出された。
【0048】
従って、本発明の一実施形態は、消化管の障害または疾患の予防または処置における使用のための、本発明に従う魚タンパク質加水分解物粉末または組成物であって、ここで消化器系の障害または疾患は、胃食道逆流症、胃腸炎、過敏性腸症候群、小腸結腸炎、セリアック病および直腸炎の疾患を含む群から選択されるもの
に関する。
に関する。
【0049】
本発明の別の実施形態は、神経系の障害または疾患の予防または処置における使用のための、本発明に従う魚タンパク質加水分解物粉末または組成物であって、ここで上記中枢神経系の障害または疾患は、神経変性疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、脳血管障害、脱髄疾患、および精神障害を含む群から選択されるものに関する。
【0050】
本発明の別の実施形態は、酸化保護遺伝子の発現を改変することによる、消化器系または中枢神経系の障害または疾患の予防または処置における使用のための、本発明に従う魚タンパク質加水分解物粉末または組成物に関する。
【0051】
本発明の別の実施形態は、酸化保護遺伝子の発現を改変することによる、消化器系または中枢神経系の障害または疾患の予防または処置における使用のための、本発明に従う魚タンパク質加水分解物粉末または組成物であって、ここで上記酸化保護遺伝子は、赤血球系転写因子２関連転写因子２（Ｎｒｆ２）および調節される遺伝子セット内に存在するものに関する。
【0052】
本発明の別の実施形態は、酸化保護遺伝子の発現を改変することによる、消化器系または中枢神経系の障害または疾患の予防または処置における使用のための、本発明に従う魚タンパク質加水分解物粉末または組成物であって、ここで上記酸化保護遺伝子は、アポリポプロテインＥ、サイトグロビン、好酸球ペルオキシダーゼ、フェリチン重鎖ポリペプチド１、グルタミン－システインリガーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ１、グルタチオンシンセターゼ、グルタチオントランスフェラーゼζ１、ヘムオキシゲナーゼ１、マンノース結合レクチン２、メチオニンスルホキシドレダクターゼＡ、一酸化窒素シンターゼ２、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈデヒドロゲナーゼキノン１、ペルオキシレドキシン５、セレノプロテインＳ、スーパーオキシドジスムターゼ１、アラキドン酸１２－リポキシゲナーゼ、エポキシドヒドロラーゼ２、ミクロソームグルタチオンＳトランスフェラーゼ３、ミエロペルオキシダーゼ、好中球サイトゾル因子１、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ、ペルオキシレドキシン１、プロスタグランジンエンドペルオキシドシンターゼ２、スルフィレドキシンであるものに関する。
【0053】
本発明の他の特長は、例示的実施形態の以下の説明の過程において明らかになる。以下の例示的実施形態は、本発明の例証のために与えられるに過ぎず、その限定であることは意図されない。
【実施例】
【0054】
実施例１ － 本発明に従う生物学的に活性な魚加水分解物粉末の調製
サケタンパク質加水分解物粉末を、捌いて切り身にした後のサケ（ｓａｌｍｏ ｓａｌａｒ）頭部および背骨の酵素加水分解によって生成する。１０００グラムのすり潰した頭部および背骨を、１０００ｍｌの水に添加し、その混合物を５０℃に加熱する。これに、１０ｇのエンドペプチダーゼ酵素 － ペプシン －を添加し、３０分間撹拌する。これに、１０ｇのエキソペプチダーゼ酵素 － カルボキシペプチダーゼ －をさらに添加し、１５分間撹拌する。これに、５グラムの酵素Ｆｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ（Ｒ）（ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅに由来するプロテアーゼ）をさらに添加し、その混合物を１０分間撹拌する。次いで、その混合物全体を、８５℃に加熱し、上記温度で１５分間維持し、濾過する。上記加水分解物画分を、従来のエバポレーター中で３０％ 乾燥物へと濃縮し、スプレー乾燥して、本発明に従う魚タンパク質加水分解物粉末を、本明細書中の実施例６～１１に示される生物学的有効性を有する淡黄色の自由流動粉末として得る。
サケタンパク質加水分解物粉末を、捌いて切り身にした後のサケ（ｓａｌｍｏ ｓａｌａｒ）頭部および背骨の酵素加水分解によって生成する。１０００グラムのすり潰した頭部および背骨を、１０００ｍｌの水に添加し、その混合物を５０℃に加熱する。これに、１０ｇのエンドペプチダーゼ酵素 － ペプシン －を添加し、３０分間撹拌する。これに、１０ｇのエキソペプチダーゼ酵素 － カルボキシペプチダーゼ －をさらに添加し、１５分間撹拌する。これに、５グラムの酵素Ｆｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ（Ｒ）（ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅに由来するプロテアーゼ）をさらに添加し、その混合物を１０分間撹拌する。次いで、その混合物全体を、８５℃に加熱し、上記温度で１５分間維持し、濾過する。上記加水分解物画分を、従来のエバポレーター中で３０％ 乾燥物へと濃縮し、スプレー乾燥して、本発明に従う魚タンパク質加水分解物粉末を、本明細書中の実施例６～１１に示される生物学的有効性を有する淡黄色の自由流動粉末として得る。
【0055】
実施例２ － 生物学的効果を有しない魚加水分解物粉末の調製
サケタンパク質加水分解物粉末を、使用されるエキソペプチダーゼが、カルボキシペプチダーゼの代わりにアミノペプチダーゼであることを除いて、上記の実施例１に示されるとおりに生成する。生物学的有効性を有しない粉末を得た（データは示さず）。
サケタンパク質加水分解物粉末を、使用されるエキソペプチダーゼが、カルボキシペプチダーゼの代わりにアミノペプチダーゼであることを除いて、上記の実施例１に示されるとおりに生成する。生物学的有効性を有しない粉末を得た（データは示さず）。
【0056】
詳細には； サケタンパク質加水分解物粉末を、捌いて切り身にした後のサケ（ｓａｌｍｏ ｓａｌａｒ）の頭部および背骨の酵素加水分解によって生成する。１０００グラムのすり潰した頭部および背骨を、１０００ｍｌの水に添加し、その混合物を５０℃に加熱する。これに、１０ｇのエンドペプチダーゼ酵素 － ペプシン －を添加し、３０分間撹拌する。これに、１０ｇのエキソペプチダーゼ酵素 － アミノペプチダーゼ －をさらに添加し、１５分間撹拌する。これに、５グラムの酵素Ｆｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ（Ｒ）をさらに添加し、その混合物を１０分間撹拌する。次いで、その混合物全体を、８５℃に加熱し、上記温度で１５分間維持し、濾過する。その水層を、従来のエバポレーター中で３０％ 乾燥物へと濃縮し、スプレー乾燥して、生物学的有効性を有しない粉末を得る。
【0057】
実施例３ － 生物学的効果を有しない魚加水分解物粉末の調製
サケタンパク質加水分解物粉末を、エキソペプチダーゼ（カルボキシペプチダーゼ）が、エンドペプチダーゼの前に添加されることを除いて、上記の実施例１に示されるとおりに生成する。生物学的有効性を有しない粉末を得た（データは示さず）。
サケタンパク質加水分解物粉末を、エキソペプチダーゼ（カルボキシペプチダーゼ）が、エンドペプチダーゼの前に添加されることを除いて、上記の実施例１に示されるとおりに生成する。生物学的有効性を有しない粉末を得た（データは示さず）。
【0058】
詳細には； サケタンパク質加水分解物粉末を、捌いて切り身にした後のサケ（ｓａｌｍｏ ｓａｌａｒ）頭部および背骨の酵素加水分解によって生成する。１０００グラムのすり潰した頭部および背骨を、１０００ｍｌの水に添加し、その混合物を５０℃に加熱する。これに、１０ｇのエキソペプチダーゼ酵素 － カルボキシペプチダーゼ－を添加し、３０分間撹拌する。これに、１０ｇのエンドペプチダーゼ酵素 － ペプシン －をさらに添加し、１５分間撹拌する。これに、５グラムの酵素Ｆｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ（Ｒ）をさらに添加し、その混合物を１０分間撹拌する。次いで、その混合物全体を、８５℃に加熱し、上記温度で１５分間維持し、濾過する。その水層を、従来のエバポレーター中で３０％ 乾燥物へと濃縮し、スプレー乾燥して、生物学的有効性を有しない粉末を得る。
【0059】
実施例４ － 本発明に従う生物学的に活性な魚加水分解物粉末の調製
サケタンパク質加水分解物粉末を、第３の酵素の添加を省略し、エキソペプチダーゼの作用時間を延長することを除いて、上記の実施例１に示されるとおりに生成する。本明細書中の実施例６～１１に示される生物学的有効性を有する粉末を得た。
サケタンパク質加水分解物粉末を、第３の酵素の添加を省略し、エキソペプチダーゼの作用時間を延長することを除いて、上記の実施例１に示されるとおりに生成する。本明細書中の実施例６～１１に示される生物学的有効性を有する粉末を得た。
【0060】
詳細には； サケタンパク質加水分解物粉末を、捌いて切り身にした後のサケ（ｓａｌｍｏ ｓａｌａｒ）の頭部および背骨の酵素加水分解によって生成する。１０００グラムのすり潰した頭部および背骨を、１０００ｍｌの水に添加し、その混合物を５０℃に加熱する。これに、１０ｇのエンドペプチダーゼ酵素 － ペプシン －を添加し、３０分間撹拌する。これに、１０ｇのエキソペプチダーゼ酵素 － カルボキシペプチダーゼ －をさらに添加し、２５分間撹拌する。次いで、その混合物全体を、８５℃に加熱し、上記温度で１５分間維持し、濾過する。その水層を、従来のエバポレーター中で３０％ 乾燥物へと濃縮し、スプレー乾燥して、本発明に従う魚タンパク質加水分解物粉末を、本明細書中の実施例６～１１に示される生物学的有効性を有する淡黄色の自由流動粉末として得る。
【0061】
実施例５ － 本発明に従う生物学的に活性な魚加水分解物粉末の調製
サケタンパク質加水分解物粉末を、使用されるエンドペプチダーゼ酵素が、ペプシンの代わりにトリプシンであることを除いて、上記の実施例１に示されるとおりに生成する。本明細書中の実施例６～１１に示される生物学的有効性を有する粉末を得た。
サケタンパク質加水分解物粉末を、使用されるエンドペプチダーゼ酵素が、ペプシンの代わりにトリプシンであることを除いて、上記の実施例１に示されるとおりに生成する。本明細書中の実施例６～１１に示される生物学的有効性を有する粉末を得た。
【0062】
詳細には； サケタンパク質加水分解物粉末を、捌いて切り身にした後のサケ（ｓａｌｍｏ ｓａｌａｒ）の頭部および背骨の酵素加水分解によって生成する。１０００グラムのすり潰した頭部および背骨を、１０００ｍｌの水に添加し、その混合物を５０℃に加熱する。これに、１０ｇのエンドペプチダーゼ酵素 － トリプシン －を添加し、３０分間撹拌する。これに、１０ｇのエキソペプチダーゼ酵素 － カルボキシペプチダーゼ －をさらに添加し、１５分間撹拌する。これに、５グラムの酵素Ｆｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ（Ｒ）をさらに添加し、その混合物を１０分間撹拌する。次いで、その混合物全体を、８５℃に加熱し、上記温度で１５分間維持し、濾過する。その水層を、従来のエバポレーター中で３０％ 乾燥物へと濃縮し、スプレー乾燥して、本明細書中の実施例６～１１に示される生物学的有効性を有する所望の粉末を得る。
【0063】
上記の実施例によって、驚くべきことに、上記加水分解酵素を添加する順番および上記酵素の性質が、生物学的に効率的な加水分解物粉末を得るために重要であることが示された。上記魚タンパク質材料は、エンドペプチダーゼに最初に供され、その後、カルボキシペプチダーゼの形態にあるエキソペプチダーゼに供される。上記エンドペプチダーゼの性質は、余り重要ではないことが示された。必要に応じて、上記加水分解物は、改善された嗜好性を有する加水分解物を得るために、ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅに由来する第３のプロテアーゼに供され得る。
【0064】
以下の実施例６～１１において、本発明に従うプロセスによって得られたサケタンパク質加水分解物粉末（本明細書中以降、ＳＰＨとして特定される）の生物学的活性を試験した。
【0065】
実施例６
本発明に従うサケタンパク質加水分解物粉末（ＳＰＨ）を、以下の実験において試験した。ＨＧＥＰｐ細胞（プールした初代ヒト歯肉上皮細胞）を、ＣｅｌｌｎＴｅｃ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｅｌｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＡＧから購入した。Ｔｈｅ ＲＮＥａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｃｒｏ Ｋｉｔ、ＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ Ｓｅｔ、ＲＴ２ Ｅａｓｙ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ Ｋｉｔ（ＤＮＡ ｇｅｎｅｒａｔｏｒ）およびＲＴ２ ＳＹＢＲ（登録商標） Ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒ ｑＰＣＲマスターミックスを、Ｑｉａｇｅｎ Ｎ．Ｖ．， ＵＳＡから購入した。Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ Ｓｔｒｅｓｓ ＲＴ２プロファイラーＰＣＲアレイ（８４種の保護遺伝子）を、Ｑｉａｇｅｎ Ｎ．Ｖ．， ＵＳＡから購入した。Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｉｎｃ．， ＵＳＡのＴｈｅ ｉＣｙｃｌｅｒ ＰＣＲシステムを、ＲＴ－ＰＣＲのために使用した。
本発明に従うサケタンパク質加水分解物粉末（ＳＰＨ）を、以下の実験において試験した。ＨＧＥＰｐ細胞（プールした初代ヒト歯肉上皮細胞）を、ＣｅｌｌｎＴｅｃ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｅｌｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＡＧから購入した。Ｔｈｅ ＲＮＥａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｃｒｏ Ｋｉｔ、ＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ Ｓｅｔ、ＲＴ２ Ｅａｓｙ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ Ｋｉｔ（ＤＮＡ ｇｅｎｅｒａｔｏｒ）およびＲＴ２ ＳＹＢＲ（登録商標） Ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒ ｑＰＣＲマスターミックスを、Ｑｉａｇｅｎ Ｎ．Ｖ．， ＵＳＡから購入した。Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ Ｓｔｒｅｓｓ ＲＴ２プロファイラーＰＣＲアレイ（８４種の保護遺伝子）を、Ｑｉａｇｅｎ Ｎ．Ｖ．， ＵＳＡから購入した。Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｉｎｃ．， ＵＳＡのＴｈｅ ｉＣｙｃｌｅｒ ＰＣＲシステムを、ＲＴ－ＰＣＲのために使用した。
【0066】
プールした初代ＨＧＥＰｐ細胞を、ＣｅｌｌｎＴｅｃによって提供されるＣｎＴ－Ｐｒｉｍｅ上皮培養培地の中で、ダルベッコのリン酸緩衝化生理食塩水（ＤＰＢＳ）中で希釈した３０ｍｇ／ｍｌ Ｉ型ラットテールコラーゲン（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を被覆した１００ｍｍペトリ皿上で増殖させた。２．５×１０４ 細胞／ｃｍ２の細胞密度を使用して、細胞単層を増殖させ、３７℃において一晩馴化した。
【0067】
上記ＨＧＥＰｐ細胞を、４×６０ｍｍ ＮｕｎｃＴＭ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅディッシュにおいて２．５×１０４ 細胞／ｃｍ２ 密度で増殖させた。ＳＰＨ １００ｍＭ ＤＭＳＯストック懸濁物を調製した。さらなる希釈物、２５μＭ／ｍｌ、５０μＭ／ｍｌ、および１００μＭ／ｍｌのＳＰＨを調製した。全ての投与液剤は、０．３％のＤＭＳＯ（これは、ＨＧＥＰｐ細胞に関して０．８％の最大寛容ＤＭＳＯ濃度未満である）を含んだ。
【0068】
ディッシュ細胞濃度を、２．５×１０５／ｍｌであるように選択して、両方の細胞株のコントロール曲線の直線部分内のＯＤ吸光度を得た。６枚のＨＧＥＰｐおよび細胞培養ディッシュを、２４時間、２５μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬおよび１００μｇ／ｍＬ濃度のＳＰＨとともに（二連で）３７℃において前処理した。各細胞株に関して１枚の細胞培養ディッシュを、２４時間、ＤＭＳＯブランク溶液で３７℃において前処理した。
【0069】
Ｔｈｅ ＲＮｅａｓｙ ＵＣＰ Ｍｉｃｒｏ Ｋｉｔを、両方のＨＧＥＰｐ処理細胞からｍＲＮＡを精製するために使用した。廃棄および洗浄処理後に、上記細胞を、遠心分離チューブ中で、１０００ ＲＰＭにおいて５分間遠心分離することによってペレット化した。上清を全て吸引によって注意深く除去し、細胞培地全てが完全に除去されていることを確実にした。３５０μｌ 緩衝液ＲＵＬＴを添加して、上記チューブから細胞ペレットを緩めるように注意を払うことによって上記細胞を破壊し、ボルテックスにかけて完全に混合し、ＲＮａｓｅ非含有シリンジに嵌めた２０ゲージ針に溶解物を５回通すことによって、その混合物をホモジナイズした。３５０μｌの７０％ エタノールを上記溶解物に添加し、ピペット操作することによって再び混合した。形成されている可能性のある任意の沈殿物を含むそのサンプルを、２ｍｌ 回収チューブに配置したＲＮｅａｓｙ ＵＣＰ ＭｉｎＥｌｕｔｅスピンカラムに移し、１０，０００ｒｐｍにおいて１５秒間遠心分離した。最後に、１６μｌ 超純水（ｕｌｔｒａ－ｃｌｅａｎ ｗａｔｅｒ）で溶離して、２０μｌ（４μｇ） ＲＮＡ溶離液を得た。
【0070】
上記の７つの処理の各々に由来するＲＮＡサンプルを、４０μｌの緩衝液ＧＥ２（ｇＤＮＡ排除緩衝液）およびＲＮａｓｅ非含有Ｈ２Ｏに添加して、最終容積６０μｌにした。３７℃において５分間インキュベートし、直ぐに氷上に２分間置いた。６２μｌのＢＣ５ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ Ｍｉｘを各６０μｌ ＲＮＡサンプルに最終容積１０２μｌになるように添加した。４２℃において正確に１５分間インキュベートし、直後に、９５℃において５分間加熱することによって反応を停止させた。サンプルは、ＰＣＲの準備ができている。
【0071】
ＲＴ－ＰＣＲを使用して、実施例３に示されるように、２５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌおよび１００μｇ／ｍｌのＳＰＨで２４時間前処理したＨＩＥＣ－６細胞において、酸化的ストレスに関する８４種の遺伝子の発現レベルを分析した。遺伝子発現を、Ｃｔ値を使用して比較し、その結果を、５種の共通する遺伝子（ＡＣＴＢ、Ｂ２Ｍ、ＧＡＰＤＨ、ＨＰＲＴ、およびＲＰＬ１３Ａ）の平均発現レベルに対して正規化して、ΔΔ Ｃｔ法を使用して計算した。
【0072】
試験遺伝子およびハウスキーピング遺伝子の９６ウェルアレイの選択を、以下に示す。
【0073】
抗酸化剤
グルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＰｘ）：
ＧＰＸ１、ＧＰＸ２、ＧＰＸ３、ＧＰＸ４、ＧＰＸ５、ＧＰＸ６、ＧＰＸ７、ＧＳＴＰ１、ＧＳＴＺ１。
ペルオキシレドキシン（ＴＰｘ）：
ＰＲＤＸ１、ＰＲＤＸ２、ＰＲＤＸ３、ＰＲＤＸ４、ＰＲＤＸ５、ＰＲＤＸ６。
他のペルオキシダーゼ：
ＣＡＴ、ＣＹＢＢ、ＣＹＧＢ、ＤＵＯＸ１、ＤＵＯＸ２、ＥＰＸ、ＬＰＯ、ＭＧＳＴ３、ＭＰＯ、ＰＴＧＳ１（ＣＯＸ１）、ＰＴＧＳ２（ＣＯＸ２）、ＰＸＤＮ、ＴＰＯ、ＴＴＮ。
他の抗酸化剤：
ＡＬＢ、ＡＰＯＥ、ＧＳＲ、ＭＴ３、ＳＯＤ１、ＳＯＤ３、ＳＲＸＮ１、ＴＸＮＲＤ１、ＴＸＮＲＤ２、ＶＩＭＰ。
グルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＰｘ）：
ＧＰＸ１、ＧＰＸ２、ＧＰＸ３、ＧＰＸ４、ＧＰＸ５、ＧＰＸ６、ＧＰＸ７、ＧＳＴＰ１、ＧＳＴＺ１。
ペルオキシレドキシン（ＴＰｘ）：
ＰＲＤＸ１、ＰＲＤＸ２、ＰＲＤＸ３、ＰＲＤＸ４、ＰＲＤＸ５、ＰＲＤＸ６。
他のペルオキシダーゼ：
ＣＡＴ、ＣＹＢＢ、ＣＹＧＢ、ＤＵＯＸ１、ＤＵＯＸ２、ＥＰＸ、ＬＰＯ、ＭＧＳＴ３、ＭＰＯ、ＰＴＧＳ１（ＣＯＸ１）、ＰＴＧＳ２（ＣＯＸ２）、ＰＸＤＮ、ＴＰＯ、ＴＴＮ。
他の抗酸化剤：
ＡＬＢ、ＡＰＯＥ、ＧＳＲ、ＭＴ３、ＳＯＤ１、ＳＯＤ３、ＳＲＸＮ１、ＴＸＮＲＤ１、ＴＸＮＲＤ２、ＶＩＭＰ。
【0074】
活性酸素種（ＲＯＳ）代謝
スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）：
ＳＯＤ１、ＳＯＤ２、ＳＯＤ３。
他のスーパーオキシド代謝遺伝子：
ＡＬＯＸ１２、ＣＣＳ、ＤＵＯＸ１、ＤＵＯＸ２、ＧＴＦ２Ｉ、ＭＴ３、ＮＣＦ１、ＮＣＦ２、ＮＯＳ２、ＮＯＸ４、ＮＯＸ５、ＰＲＥＸ１、ＵＣＰ２。
他の活性酸素種（ＲＯＳ）代謝遺伝子：
ＡＯＸ１、ＢＮＩＰ３、ＥＰＨＸ２、ＭＰＶ１７、ＳＦＴＰＤ。
酸化的ストレス応答遺伝子：
ＡＰＯＥ、ＡＴＯＸ１、ＣＡＴ、ＣＣＬ５、ＣＹＧＢ、ＤＨＣＲ２４、ＤＵＯＸ１、ＤＵＯＸ２、ＤＵＳＰ１、ＥＰＸ、ＦＯＸＭ１、ＦＴＨ１、ＧＣＬＣ、ＧＣＬＭ、ＧＰＸ１、ＧＰＸ２、ＧＰＸ３、ＧＰＸ４、ＧＰＸ５、ＧＰＸ６、ＧＰＸ７、ＧＳＲ、ＧＳＳ、ＨＭＯＸ１、ＨＳＰＡ１Ａ、ＫＲＴ１、ＬＰＯ、ＭＢＬ２、ＭＰＯ、ＭＳＲＡ、ＮＱＯ１、ＮＵＤＴ１、ＯＸＲ１、ＯＸＳＲ１、ＰＤＬＩＭ１、ＰＮＫＰ、ＰＲＤＸ２、ＰＲＤＸ５、ＰＲＤＸ６、ＰＲＮＰ、ＲＮＦ７、ＳＣＡＲＡ３、ＳＥＰＰ１、ＳＩＲＴ２、ＳＯＤ１、ＳＯＤ２、ＳＱＳＴＭ１、ＳＲＸＮ１、ＳＴＫ２５、ＴＰＯ、ＴＴＮ、ＴＸＮ、ＴＸＮＲＤ１、ＴＸＮＲＤ２、ＶＩＭＰ。
スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）：
ＳＯＤ１、ＳＯＤ２、ＳＯＤ３。
他のスーパーオキシド代謝遺伝子：
ＡＬＯＸ１２、ＣＣＳ、ＤＵＯＸ１、ＤＵＯＸ２、ＧＴＦ２Ｉ、ＭＴ３、ＮＣＦ１、ＮＣＦ２、ＮＯＳ２、ＮＯＸ４、ＮＯＸ５、ＰＲＥＸ１、ＵＣＰ２。
他の活性酸素種（ＲＯＳ）代謝遺伝子：
ＡＯＸ１、ＢＮＩＰ３、ＥＰＨＸ２、ＭＰＶ１７、ＳＦＴＰＤ。
酸化的ストレス応答遺伝子：
ＡＰＯＥ、ＡＴＯＸ１、ＣＡＴ、ＣＣＬ５、ＣＹＧＢ、ＤＨＣＲ２４、ＤＵＯＸ１、ＤＵＯＸ２、ＤＵＳＰ１、ＥＰＸ、ＦＯＸＭ１、ＦＴＨ１、ＧＣＬＣ、ＧＣＬＭ、ＧＰＸ１、ＧＰＸ２、ＧＰＸ３、ＧＰＸ４、ＧＰＸ５、ＧＰＸ６、ＧＰＸ７、ＧＳＲ、ＧＳＳ、ＨＭＯＸ１、ＨＳＰＡ１Ａ、ＫＲＴ１、ＬＰＯ、ＭＢＬ２、ＭＰＯ、ＭＳＲＡ、ＮＱＯ１、ＮＵＤＴ１、ＯＸＲ１、ＯＸＳＲ１、ＰＤＬＩＭ１、ＰＮＫＰ、ＰＲＤＸ２、ＰＲＤＸ５、ＰＲＤＸ６、ＰＲＮＰ、ＲＮＦ７、ＳＣＡＲＡ３、ＳＥＰＰ１、ＳＩＲＴ２、ＳＯＤ１、ＳＯＤ２、ＳＱＳＴＭ１、ＳＲＸＮ１、ＳＴＫ２５、ＴＰＯ、ＴＴＮ、ＴＸＮ、ＴＸＮＲＤ１、ＴＸＮＲＤ２、ＶＩＭＰ。
【0075】
酸素トランスポーター
ＣＹＧＢ、ＭＢ
ＣＹＧＢ、ＭＢ
【0076】
実施例７
本発明に従うサケタンパク質加水分解物粉末（ＳＰＨ）を、以下の実験において試験した。ＨＩＥＣ－６細胞（ヒト腸上皮細胞）を、ＡＴＣＣ， ＵＳＡから購入した。Ｔｈｅ ＲＮＥａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｃｒｏ Ｋｉｔ、ＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ Ｓｅｔ、ＲＴ２ Ｅａｓｙ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ Ｋｉｔ（ＤＮＡ ｇｅｎｅｒａｔｏｒ）およびＲＴ２ ＳＹＢＲ（登録商標） Ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒ ｑＰＣＲマスターミックスを、Ｑｉａｇｅｎ Ｎ．Ｖ．， ＵＳＡから購入した。Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ Ｓｔｒｅｓｓ ＲＴ２プロファイラーＰＣＲアレイ（８４種の保護遺伝子）を、Ｑｉａｇｅｎ Ｎ．Ｖ．， ＵＳＡから購入した。Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｉｎｃ．， ＵＳＡのＴｈｅ ｉＣｙｃｌｅｒ ＰＣＲシステムをＲＴ－ＰＣＲのために使用した。
本発明に従うサケタンパク質加水分解物粉末（ＳＰＨ）を、以下の実験において試験した。ＨＩＥＣ－６細胞（ヒト腸上皮細胞）を、ＡＴＣＣ， ＵＳＡから購入した。Ｔｈｅ ＲＮＥａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｃｒｏ Ｋｉｔ、ＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ Ｓｅｔ、ＲＴ２ Ｅａｓｙ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ Ｋｉｔ（ＤＮＡ ｇｅｎｅｒａｔｏｒ）およびＲＴ２ ＳＹＢＲ（登録商標） Ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒ ｑＰＣＲマスターミックスを、Ｑｉａｇｅｎ Ｎ．Ｖ．， ＵＳＡから購入した。Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ Ｓｔｒｅｓｓ ＲＴ２プロファイラーＰＣＲアレイ（８４種の保護遺伝子）を、Ｑｉａｇｅｎ Ｎ．Ｖ．， ＵＳＡから購入した。Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｉｎｃ．， ＵＳＡのＴｈｅ ｉＣｙｃｌｅｒ ＰＣＲシステムをＲＴ－ＰＣＲのために使用した。
【0077】
ＨＩＥＣ－６（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－３２６６）細胞を、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ、１０ｎｇ／ｍｌ 上皮成長因子（ＥＧＦ）および最終濃度４％までのウシ胎仔血清を有するＯｐｔｉＭＥＭ １低減血清培地（Ｇｉｂｃｏカタログ番号３１９８５）中、１００ｍｍペトリ皿上で増殖させた。細胞密度１×１０５ 細胞／ｃｍ２を使用して、細胞単層を増殖させ、３７℃において一晩馴化した。
【0078】
上記ＨＩＥＣ－６細胞を、４×６０ｍｍ ＮｕｎｃＴＭ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅディッシュ中で増殖させた。ＳＰＨ １００ｍＭ ＤＭＳＯストック懸濁物を調製した。２５μＭ／ｍｌ、５０μＭ／ｍｌ、および１００μＭ／ｍｌのＳＰＨのさらなる希釈物を調製した。全ての投与液剤は、０．３％のＤＭＳＯ（これは、ＨＩＥＣ－６細胞に関して０．８％の最大寛容ＤＭＳＯ濃度未満である）を含んだ。
【0079】
ディッシュ細胞濃度を、２．５×１０５／ｍｌであるように選択して、両方の細胞株のコントロール曲線の直線部分内のＯＤ吸光度を得た。次いで、６枚のＨＩＥＣ－６細胞培養ディッシュを、２４時間、２５μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬおよび１００μｇ／ｍＬ濃度のＳＰＨとともに（二連で）３７℃において前処理した。各細胞株に関して１枚の細胞培養ディッシュを、２４時間、ＤＭＳＯブランク溶液で３７℃において前処理した。
【0080】
Ｔｈｅ ＲＮｅａｓｙ ＵＣＰ Ｍｉｃｒｏ Ｋｉｔを、両方のＨＧＥＰｐ処理細胞からｍＲＮＡを精製するために使用した。廃棄および洗浄処理後に、上記細胞を、遠心分離チューブ中で、１０００ ＲＰＭにおいて５分間遠心分離することによってペレット化した。上清を全て吸引によって注意深く除去し、細胞培地全てが完全に除去されていることを確実にした。３５０μｌ 緩衝液ＲＵＬＴを添加して、上記チューブから細胞ペレットを緩めるように注意を払うことによって上記細胞を破壊し、ボルテックスにかけて完全に混合し、ＲＮａｓｅ非含有シリンジに嵌めた２０ゲージ針に溶解物を５回通すことによって、その混合物をホモジナイズした。３５０μｌの７０％ エタノールを上記溶解物に添加し、ピペット操作することによって再び混合した。形成されている可能性のある任意の沈殿物を含むそのサンプルを、２ｍｌ 回収チューブに配置したＲＮｅａｓｙ ＵＣＰ ＭｉｎＥｌｕｔｅスピンカラムに移し、１０，０００ｒｐｍにおいて１５秒間遠心分離した。最後に、１６μｌ 超純水で溶離して、２０μｌ（４μｇ） ＲＮＡ溶離液を得た。
【0081】
上記の７つの処理の各々に由来するＲＮＡサンプルを、４０μｌの緩衝液ＧＥ２（ｇＤＮＡ排除緩衝液）およびＲＮａｓｅ非含有Ｈ２Ｏに添加して、最終容積６０μｌにした。３７℃において５分間インキュベートし、直ぐに氷上に２分間置いた。６２μｌのＢＣ５ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ Ｍｉｘを各６０μｌ ＲＮＡサンプルに最終容積１０２μｌになるように添加した。４２℃において正確に１５分間インキュベートし、直後に、９５℃において５分間加熱することによって反応を停止させた。サンプルは、ＰＣＲの準備ができている。
【0082】
ＲＴ－ＰＣＲを使用して、実施例３に示されるように、２５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌおよび１００μｇ／ｍｌのＳＰＨで２４時間前処理したＨＩＥＣ－６細胞において、酸化的ストレスに関する８４種の遺伝子の発現レベルを分析した。遺伝子発現を、Ｃｔ値を使用して比較し、その結果を、５種の共通する遺伝子（ＡＣＴＢ、Ｂ２Ｍ、ＧＡＰＤＨ、ＨＰＲＴ、およびＲＰＬ１３Ａ）の平均発現レベルに対して正規化して、ΔΔ Ｃｔ法を使用して計算した。
【0083】
実施例８
アップレギュレートされた酸化的ストレス遺伝子
ＳＰＨでのＨＧＥＰｐ細胞の処理は、１６種のヒト酸化的ストレス関連遺伝子 － ＡＰＯＥ、ＣＹＧＢ、ＥＰＸ、ＦＴＨ１、ＧＣＬＣ、ＧＰＸ１、ＧＳＲ、ＧＳＴＺ１、ＨＭＯＸ１、ＭＢＬ２、ＭＳＲＡ、ＮＯＳ２、ＮＱＯ１、ＰＲＤＸ５、ＳＥＬＳ、ＳＯＤ１に関して２より高い倍率変化を有するアップレギュレーションを示した一方で、ＳＰＨでのＨＩＥＣ－６細胞の処理は、１００μＭ／ｍｌ ＳＰＨ濃度において１１種のヒト酸化的ストレス関連遺伝子 － ＡＰＯＥ、ＥＰＸ、ＦＴＨ１、ＧＣＬＣ、ＧＳＳ、ＨＭＯＸ１、ＭＢＬ２、ＮＯＳ２、ＮＱＯ１、ＰＲＤＸ５、ＳＯＤ１の２より高い倍率変化を有するアップレギュレーションを示した（表１および２）。上記ＤＭＳＯブランク処理は、上記アレイにおいていかなる遺伝子の調節におけるいかなる変化も示さなかった。１０種の遺伝子が、両方の細胞株において共通するアップレギュレーションを示した － ＡＰＯＥ、ＥＰＸ、ＦＴＨ１、ＧＣＬＣ、ＨＭＯＸ１、ＭＢＬ２、ＮＯＳ２、ＮＱＯ１、ＰＲＤＸ５、ＳＯＤ１。
表１ ＳＰＨ処理後のＨＧＥＰｐ細胞におけるアップレギュレートされた酸化的ストレス関連遺伝子
表２ ＳＰＨ処理後のＨＩＥＣ－６細胞においてアップレギュレートされた酸化的ストレス関連遺伝子
アップレギュレートされた酸化的ストレス遺伝子
ＳＰＨでのＨＧＥＰｐ細胞の処理は、１６種のヒト酸化的ストレス関連遺伝子 － ＡＰＯＥ、ＣＹＧＢ、ＥＰＸ、ＦＴＨ１、ＧＣＬＣ、ＧＰＸ１、ＧＳＲ、ＧＳＴＺ１、ＨＭＯＸ１、ＭＢＬ２、ＭＳＲＡ、ＮＯＳ２、ＮＱＯ１、ＰＲＤＸ５、ＳＥＬＳ、ＳＯＤ１に関して２より高い倍率変化を有するアップレギュレーションを示した一方で、ＳＰＨでのＨＩＥＣ－６細胞の処理は、１００μＭ／ｍｌ ＳＰＨ濃度において１１種のヒト酸化的ストレス関連遺伝子 － ＡＰＯＥ、ＥＰＸ、ＦＴＨ１、ＧＣＬＣ、ＧＳＳ、ＨＭＯＸ１、ＭＢＬ２、ＮＯＳ２、ＮＱＯ１、ＰＲＤＸ５、ＳＯＤ１の２より高い倍率変化を有するアップレギュレーションを示した（表１および２）。上記ＤＭＳＯブランク処理は、上記アレイにおいていかなる遺伝子の調節におけるいかなる変化も示さなかった。１０種の遺伝子が、両方の細胞株において共通するアップレギュレーションを示した － ＡＰＯＥ、ＥＰＸ、ＦＴＨ１、ＧＣＬＣ、ＨＭＯＸ１、ＭＢＬ２、ＮＯＳ２、ＮＱＯ１、ＰＲＤＸ５、ＳＯＤ１。
表１ ＳＰＨ処理後のＨＧＥＰｐ細胞におけるアップレギュレートされた酸化的ストレス関連遺伝子
【表1-1】
【表1-2】
【表2-1】
【表2-2】
【0084】
ダウンレギュレートされた酸化的ストレス遺伝子
ＳＰＨでのＨＧＥＰｐ細胞の処理は、９種のヒト酸化的ストレス関連遺伝子 － ＡＬＯＸ１２、ＥＰＨＸ２、ＭＧＳＴ３、ＭＰＯ、ＮＣＦ１、ＮＯＸ５、ＰＲＤＸ１、ＰＴＧＳ２、ＳＲＸＮ１の５０％未満の倍率変化を有するダウンレギュレーションを示した一方で、ＳＰＨでのＨＩＥＣ－６細胞の処理は、１００μＭ／ｍｌ ＳＰＨ濃度において７種のヒト酸化的ストレス関連遺伝子（ＡＬＯＸ１２、ＭＧＳＴ３、ＭＰＯ、ＮＣＦ１、ＮＯＸ５、ＰＴＧＳ２、ＳＲＸＮ１）に関して５０％未満の倍率変化を有するダウンレギュレーションを示した（表３および４）。７種の共通する遺伝子は、両方の細胞株においてダウンレギュレーションを示した － ＡＬＯＸ１２、ＭＧＳＴ３、ＭＰＯ、ＮＣＦ１、ＮＯＸ５、ＰＴＧＳ２、ＳＲＸＮ１。
表３ ＳＰＨ処理後のＨＧＥＰｐ細胞におけるダウンレギュレートされた酸化的ストレス関連遺伝子
表４ ＳＰＨ処理後のＨＩＥＣ－６細胞におけるダウンレギュレートされた酸化的ストレス関連遺伝子
ＳＰＨでのＨＧＥＰｐ細胞の処理は、９種のヒト酸化的ストレス関連遺伝子 － ＡＬＯＸ１２、ＥＰＨＸ２、ＭＧＳＴ３、ＭＰＯ、ＮＣＦ１、ＮＯＸ５、ＰＲＤＸ１、ＰＴＧＳ２、ＳＲＸＮ１の５０％未満の倍率変化を有するダウンレギュレーションを示した一方で、ＳＰＨでのＨＩＥＣ－６細胞の処理は、１００μＭ／ｍｌ ＳＰＨ濃度において７種のヒト酸化的ストレス関連遺伝子（ＡＬＯＸ１２、ＭＧＳＴ３、ＭＰＯ、ＮＣＦ１、ＮＯＸ５、ＰＴＧＳ２、ＳＲＸＮ１）に関して５０％未満の倍率変化を有するダウンレギュレーションを示した（表３および４）。７種の共通する遺伝子は、両方の細胞株においてダウンレギュレーションを示した － ＡＬＯＸ１２、ＭＧＳＴ３、ＭＰＯ、ＮＣＦ１、ＮＯＸ５、ＰＴＧＳ２、ＳＲＸＮ１。
表３ ＳＰＨ処理後のＨＧＥＰｐ細胞におけるダウンレギュレートされた酸化的ストレス関連遺伝子
【表3-1】
【表3-2】
【表4】
【0085】
用量依存性応答遺伝子
さらに２種のアップレギュレートされた遺伝子、ＨＧＥＰｐ細胞におけるＦＴＨ１およびＨＭＯＸ１、ならびに３種のアップレギュレートされた遺伝子、ＨＩＥＣ－６細胞におけるＡＰＯＥ、ＦＴＨ１およびＨＭＯＸ１は、２５μＭ／ｍｌおよび５０μＭ／ｍｌの２種の低用量のＳＰＨ処理において、用量依存性結果を示した。ＡＬＯＸ１２遺伝子は、ＨＧＥＰ細胞およびＨＩＥＣ－６細胞の両方において用量依存性ダウンレギュレーションを示した（表５）。他の遺伝子のいずれも、ＳＰＨ濃度を５０μＭ／ｍｌおよび２５μＭ／ｍｌに低減した場合に、アップレギュレーションにおける２より高い倍率変化も、ダウンレギュレーションにおける５０％未満の倍率変化も示さなかった。
表５ ＨＧＥＰ細胞およびＨＩＥＣ－６細胞の両方におけるＳＰＨ用量依存性遺伝子調節
実施例９
さらに２種のアップレギュレートされた遺伝子、ＨＧＥＰｐ細胞におけるＦＴＨ１およびＨＭＯＸ１、ならびに３種のアップレギュレートされた遺伝子、ＨＩＥＣ－６細胞におけるＡＰＯＥ、ＦＴＨ１およびＨＭＯＸ１は、２５μＭ／ｍｌおよび５０μＭ／ｍｌの２種の低用量のＳＰＨ処理において、用量依存性結果を示した。ＡＬＯＸ１２遺伝子は、ＨＧＥＰ細胞およびＨＩＥＣ－６細胞の両方において用量依存性ダウンレギュレーションを示した（表５）。他の遺伝子のいずれも、ＳＰＨ濃度を５０μＭ／ｍｌおよび２５μＭ／ｍｌに低減した場合に、アップレギュレーションにおける２より高い倍率変化も、ダウンレギュレーションにおける５０％未満の倍率変化も示さなかった。
表５ ＨＧＥＰ細胞およびＨＩＥＣ－６細胞の両方におけるＳＰＨ用量依存性遺伝子調節
【表5】
【0086】
正常な細胞成長および増殖には、鉄が要求される。しかし、過剰な鉄は潜在的に有害である。なぜならそれは、毒性の活性酸素種（ＲＯＳ）の形成を触媒し得るからである。従って、細胞は、細胞内鉄レベルを制御するために高度に調節された機構を進化させた。これらの中の主たるものは、鉄の隔離である。上記ＦＴＨ１遺伝子は、鉄の食事供給源から可溶性および非毒性状態にある遊離鉄を隔離する、ヒトにおける主要な細胞内鉄貯蔵タンパク質であるフェリチンの重鎖サブユニットをコードする。以前の研究から、フェリチンの両方のサブユニットの増大した合成が、酸化的ストレスに曝された場合に起こることが示されている。フェリチンＨまたはＬ過剰発現は、酸化チャレンジに応じて、ＲＯＳの蓄積を低減した。
【0087】
実施例３は、ＦＴＨ１のアップレギュレーションが、単独で酸化チャレンジに応じている必要はなく、サケタンパク質加水分解物に存在する特異的アクチベーターペプチドによって誘導され得ることを示す。ＦＴＨ１増大は、パーキンソン病のような神経学的障害の保護効果を生じることが示されている（Ｒｈｏｄｅｓ， Ｓ．Ｌ．， Ｒｉｔｚ， Ｂ． （２００８） Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｉｒｏｎ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｉｒｏｎ ｉｎ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｄｉｓｅａｓｅ， ３２（２）， １８３－１９５）。
【0088】
実施例１０
ＨＭＯＸ１遺伝子発現は、酸化的ストレスによって誘導され、細胞保護を付与するようである。得られたＨＯ１酵素は、ヘムの分解を触媒し、これはビリベルジン、第１鉄、および一酸化炭素を生じる。それは、α－メチレン架橋においてヘム環を開裂して、ビリベルジンを形成し、ビリベルジンは、ビリベルジンレダクターゼによってビリルビンに変換される。ヘムオキシゲナーゼ反応から放出された一酸化炭素はまた、血管緊張および一酸化窒素シンターゼの機能に影響を及ぼすことが示されている。
ＨＭＯＸ１遺伝子発現は、酸化的ストレスによって誘導され、細胞保護を付与するようである。得られたＨＯ１酵素は、ヘムの分解を触媒し、これはビリベルジン、第１鉄、および一酸化炭素を生じる。それは、α－メチレン架橋においてヘム環を開裂して、ビリベルジンを形成し、ビリベルジンは、ビリベルジンレダクターゼによってビリルビンに変換される。ヘムオキシゲナーゼ反応から放出された一酸化炭素はまた、血管緊張および一酸化窒素シンターゼの機能に影響を及ぼすことが示されている。
【0089】
実施例３において本発明において認められるとおりのＨＭＯＸ１のアップレギュレーションは、サケタンパク質加水分解物が、経腸的に与えられた場合、ＧＩ管において損傷を低減し、新生児腸炎症疾患、壊死性小腸結腸炎（ＮＥＣ）の処置に使用される能力を有することを示す。ＨＯ－１欠損症は、ＮＥＣ発生の増大をもたらすことが示されているが、ＨＯ－１誘導はＴｒｅｇ／Ｔｅｆｆ比を増大し、動物モデルにおいてＮＥＣ発生を防止した［Ｓｃｈｕｌｚ， Ｓ．， Ｃｈｉｓｈｏｌｍ， Ｋ．Ｍ．，， Ｚｈａｏ， Ｈ．， Ｋａｌｉｓｈ， Ｆ．， Ｙａｎｇ， Ｙ．， Ｗｏｎｇ， Ｒ．Ｊ．， Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ， Ｄ．Ｋ． （２０１５） Ｈｅｍｅ ｏｘｙｇｅｎａｓｅ－１ ｃｏｎｆｅｒｓ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ａｌｔｅｒｓ Ｔ－ｃｅｌｌ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｉｎ ａ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｎｅｏｎａｔａｌ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ． Ｐｅｄｉａｔｒ Ｒｅｓ． ７７（５）， ６４０－６４８］。
【0090】
実施例３におけるサケタンパク質加水分解物によって示されるとおりのＨＯ－１発現をアップレギュレートする能力が、心血管疾患、腎移植、壊死性小腸結腸炎のような他の多くの疾患において重要な保護因子であることもまた、研究によって示されている［Ｏｔｔｅｒｂｅｉｎ， Ｌ．Ｅ．， Ｓｏａｒｅｓ， Ｍ．Ｐ．， Ｙａｍａｓｈｉｔａ， Ｋ．， Ｂａｃｈ， Ｆ．Ｈ． （２００３） Ｈｅｍｅ ｏｘｙｇｅｎａｓｅ－１： ｕｎｌｅａｓｈｉｎｇ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｈｅｍｅ． Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２４（８）， ４４９－４５５］。
【0091】
実施例１１
メタボリックシンドロームは、以下の医学的状態： 異常な（中心性）肥満、血圧の上昇、絶食時血漿グルコースの上昇（または明らかな糖尿病（ｏｖｅｒｔ ｄｉａｂｅｔｅｓ））、高血清トリグリセリド、および低い高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）レベルのうち、少なくとも３／５がまとまって起こる場合に使用される用語である
メタボリックシンドロームは、以下の医学的状態： 異常な（中心性）肥満、血圧の上昇、絶食時血漿グルコースの上昇（または明らかな糖尿病（ｏｖｅｒｔ ｄｉａｂｅｔｅｓ））、高血清トリグリセリド、および低い高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）レベルのうち、少なくとも３／５がまとまって起こる場合に使用される用語である
【0092】
ＡＬＯＸ１２（リポキシゲナーゼタイプの酵素）は、ＡＬＯＸ１２遺伝子によってコードされ、ＡＡを、炎症性応答およびメタボリックシンドロームに関与する１５（Ｓ）－ＨＥＴＥ（ホルモン様自己分泌および傍分泌シグナル伝達因子）へと代謝するその能力によって特徴づけられる。上昇したＡＬＯＸ１２レベルは、１型糖尿病に、肥満性の糖尿病患者の白色脂肪組織の脂肪細胞に、ならびに活性酸素種および炎症の過剰生成に関係があるとされている［Ｋｕｈｎ， Ｈ．， Ｂａｎｔｈｉｙａ， Ｓ．， ｖａｎ Ｌｅｙｅｎ， Ｋ． （２０１５） Ｍａｍｍａｌｉａｎ ｌｉｐｏｘｙｇｅｎａｓｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｅｌｅｖａｎｃｅ． Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ （ＢＢＡ） － Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｌｉｐｉｄｓ． １８５１（４）， ３０８－３３０］。実施例３に認められるとおりのＳＰＨによるＡＬＯＸ１２およびその代謝産物のダウンレギュレーションを使用して、肥満、糖尿病、高血圧、および／またはメタボリックシンドロームの阻止に寄与し得る。
【0093】
よって、アミノ酸、ペプチド、オリゴペプチドを含む、本発明に従う魚タンパク質加水分解物粉末が、いくつかの酸化保護遺伝子（特に、ＦＴＨ１およびＨＭＯＸ１遺伝子）の顕著なアップレギュレーション、ならびにいくつかの炎症促進性遺伝子（特に、ＡＬＯＸ１２遺伝子）のダウンレギュレーションを示すことが認められ得る。その組み合わさった効果は、酸化的損傷からの保護を付与することが公知であり、本発明の魚タンパク質加水分解物が経口製剤として送達される場合、それは、消化器系および中枢神経系の障害（例えば、過敏性腸症候群、大腸炎、パーキンソン病、およびアルツハイマー病）からの保護を提供する。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
魚タンパク質加水分解物粉末を生成するための酵素加水分解プロセスであって、前記プロセスは、以下の連続する工程：
ｉ）魚タンパク質材料に由来するすり潰した副生成物と水とを混合し、加熱する工程；
ｉｉ）エンドペプチダーゼ酵素を前記ｉ）の混合物に添加し、撹拌する工程；
ｉｉｉ）カルボキシペプチダーゼの形態にあるエキソペプチダーゼ酵素を、前記ｉｉ）の混合物に添加し、撹拌する工程；
ｉｖ）前記酵素加水分解を熱不活性化によって停止させる工程；
ｖ）前記魚加水分解物画分および残りの固体材料を、濾過によって分離する工程；ならびに
ｖｉ）前記魚加水分解物画分を濃縮および乾燥させて、魚タンパク質加水分解物粉末を得る工程、
を包含するプロセス。
（項目２）
前記プロセスは、ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅに由来するプロテアーゼ酵素を、前記ｉｉｉ）の混合物に添加し、撹拌する工程という第３の加水分解工程をさらに包含する、項目１に記載のプロセス。
（項目３）
前記魚タンパク質材料は、魚類、好ましくはサケ類、より好ましくはｓａｌｍｏ ｓａｌａｒに由来する、項目１に記載のプロセス。
（項目４）
前記エンドペプチダーゼは、ペプシンまたはトリプシン、またはこれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、項目１に記載のプロセス。
（項目５）
医薬としての使用のための、項目１～４のいずれかに記載のプロセスによって得られ得る、魚タンパク質加水分解物粉末。
（項目６）
項目５に記載の魚タンパク質加水分解物粉末を、医薬としての使用のための少なくとも１種の薬理学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤を一緒に含む組成物。
（項目７）
消化器系または中枢神経系の障害または疾患の予防または処置における使用のための、項目５に記載の魚タンパク質加水分解物粉末または項目６に記載の組成物。
（項目８）
前記消化器系の障害または疾患は、胃食道逆流症、胃腸炎、過敏性腸症候群、小腸結腸炎、セリアック病および直腸炎の疾患を含む群より選択される、消化器系の障害または疾患の予防または処置における使用のための、項目５に記載の魚タンパク質加水分解物粉末または項目６に記載の組成物。
（項目９）
前記中枢神経系の障害または疾患は、神経変性疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、脳血管障害、脱髄疾患、および精神障害を含む群から選択される、神経系の障害または疾患の予防または処置における使用のための、項目５に記載の魚タンパク質加水分解物粉末または項目６に記載の組成物。
（項目１０）
酸化保護遺伝子の発現の改変による、消化器系または中枢神経系の障害または疾患の予防または処置における使用のための、項目５に記載の魚タンパク質加水分解物粉末または項目６に記載の組成物。
（項目１１）
前記酸化保護遺伝子は、赤血球系転写因子２関連転写因子２（Ｎｒｆ２）および調節される遺伝子セット内に存在する、酸化保護遺伝子の発現の改変による、消化器系または中枢神経系の障害または疾患の予防または処置における使用のための、項目５に記載の魚タンパク質加水分解物粉末または項目６に記載の組成物。
（項目１２）
前記酸化保護遺伝子は、アポリポプロテインＥ、サイトグロビン、好酸球ペルオキシダーゼ、フェリチン重鎖ポリペプチド１、グルタミン－システインリガーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ１、グルタチオンシンセターゼ、グルタチオントランスフェラーゼζ１、ヘムオキシゲナーゼ１、マンノース結合レクチン２、メチオニンスルホキシドレダクターゼＡ、一酸化窒素シンターゼ２、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈデヒドロゲナーゼキノン１、ペルオキシレドキシン５、セレノプロテインＳ、スーパーオキシドジスムターゼ１、アラキドン酸１２－リポキシゲナーゼ、エポキシドヒドロラーゼ２、ミクロソームグルタチオンＳトランスフェラーゼ３、ミエロペルオキシダーゼ、好中球サイトゾル因子１、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ、ペルオキシレドキシン１、プロスタグランジンエンドペルオキシドシンターゼ２、スルフィレドキシンである、酸化保護遺伝子の発現の改変による、消化器系または中枢神経系の障害または疾患の予防または処置における使用のための、項目５に記載の魚タンパク質加水分解物粉末または項目６に記載の組成物。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
魚タンパク質加水分解物粉末を生成するための酵素加水分解プロセスであって、前記プロセスは、以下の連続する工程：
ｉ）魚タンパク質材料に由来するすり潰した副生成物と水とを混合し、加熱する工程；
ｉｉ）エンドペプチダーゼ酵素を前記ｉ）の混合物に添加し、撹拌する工程；
ｉｉｉ）カルボキシペプチダーゼの形態にあるエキソペプチダーゼ酵素を、前記ｉｉ）の混合物に添加し、撹拌する工程；
ｉｖ）前記酵素加水分解を熱不活性化によって停止させる工程；
ｖ）前記魚加水分解物画分および残りの固体材料を、濾過によって分離する工程；ならびに
ｖｉ）前記魚加水分解物画分を濃縮および乾燥させて、魚タンパク質加水分解物粉末を得る工程、
を包含するプロセス。
（項目２）
前記プロセスは、ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅに由来するプロテアーゼ酵素を、前記ｉｉｉ）の混合物に添加し、撹拌する工程という第３の加水分解工程をさらに包含する、項目１に記載のプロセス。
（項目３）
前記魚タンパク質材料は、魚類、好ましくはサケ類、より好ましくはｓａｌｍｏ ｓａｌａｒに由来する、項目１に記載のプロセス。
（項目４）
前記エンドペプチダーゼは、ペプシンまたはトリプシン、またはこれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、項目１に記載のプロセス。
（項目５）
医薬としての使用のための、項目１～４のいずれかに記載のプロセスによって得られ得る、魚タンパク質加水分解物粉末。
（項目６）
項目５に記載の魚タンパク質加水分解物粉末を、医薬としての使用のための少なくとも１種の薬理学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤を一緒に含む組成物。
（項目７）
消化器系または中枢神経系の障害または疾患の予防または処置における使用のための、項目５に記載の魚タンパク質加水分解物粉末または項目６に記載の組成物。
（項目８）
前記消化器系の障害または疾患は、胃食道逆流症、胃腸炎、過敏性腸症候群、小腸結腸炎、セリアック病および直腸炎の疾患を含む群より選択される、消化器系の障害または疾患の予防または処置における使用のための、項目５に記載の魚タンパク質加水分解物粉末または項目６に記載の組成物。
（項目９）
前記中枢神経系の障害または疾患は、神経変性疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、脳血管障害、脱髄疾患、および精神障害を含む群から選択される、神経系の障害または疾患の予防または処置における使用のための、項目５に記載の魚タンパク質加水分解物粉末または項目６に記載の組成物。
（項目１０）
酸化保護遺伝子の発現の改変による、消化器系または中枢神経系の障害または疾患の予防または処置における使用のための、項目５に記載の魚タンパク質加水分解物粉末または項目６に記載の組成物。
（項目１１）
前記酸化保護遺伝子は、赤血球系転写因子２関連転写因子２（Ｎｒｆ２）および調節される遺伝子セット内に存在する、酸化保護遺伝子の発現の改変による、消化器系または中枢神経系の障害または疾患の予防または処置における使用のための、項目５に記載の魚タンパク質加水分解物粉末または項目６に記載の組成物。
（項目１２）
前記酸化保護遺伝子は、アポリポプロテインＥ、サイトグロビン、好酸球ペルオキシダーゼ、フェリチン重鎖ポリペプチド１、グルタミン－システインリガーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ１、グルタチオンシンセターゼ、グルタチオントランスフェラーゼζ１、ヘムオキシゲナーゼ１、マンノース結合レクチン２、メチオニンスルホキシドレダクターゼＡ、一酸化窒素シンターゼ２、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈデヒドロゲナーゼキノン１、ペルオキシレドキシン５、セレノプロテインＳ、スーパーオキシドジスムターゼ１、アラキドン酸１２－リポキシゲナーゼ、エポキシドヒドロラーゼ２、ミクロソームグルタチオンＳトランスフェラーゼ３、ミエロペルオキシダーゼ、好中球サイトゾル因子１、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ、ペルオキシレドキシン１、プロスタグランジンエンドペルオキシドシンターゼ２、スルフィレドキシンである、酸化保護遺伝子の発現の改変による、消化器系または中枢神経系の障害または疾患の予防または処置における使用のための、項目５に記載の魚タンパク質加水分解物粉末または項目６に記載の組成物。