特許 7425403 生体試料分析方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-01-23

(45)【発行日】2024-01-31

(54)【発明の名称】生体試料分析方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/53 20060101AFI20240124BHJP

   G01N 33/543 20060101ALI20240124BHJP

   C12Q 1/06 20060101ALI20240124BHJP

【ＦＩ】

G01N33/53 S

G01N33/543 541A

C12Q1/06

【請求項の数】 5

(21)【出願番号】P 2020024511

(22)【出願日】2020-02-17

(65)【公開番号】P2021128129

(43)【公開日】2021-09-02

【審査請求日】2022-12-28

(73)【特許権者】

【識別番号】308036402

【氏名又は名称】株式会社ＪＶＣケンウッド

(74)【代理人】

【識別番号】100083806

【弁理士】

【氏名又は名称】三好 秀和

(74)【代理人】

【識別番号】100101247

【弁理士】

【氏名又は名称】高橋 俊一

(72)【発明者】

【氏名】辻田 公二

(72)【発明者】

【氏名】糸長 誠

【審査官】倉持 俊輔

(56)【参考文献】

【文献】特開２０１７－１３８１１２（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１９／０３９１７９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１３／０９４３０７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特開２０１７－４０５９５（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１９／０６８２６９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特表２０１６－５０２８６２（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１５／０６８７７２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】米国特許出願公開第２０１７／０００１１９７（ＵＳ，Ａ１）

【文献】中国特許出願公開第１１０５４０９６１（ＣＮ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１７／１２４０００（ＷＯ，Ａ１）

【文献】HE, F. et al.，Quantification of Exosome Based on a Copper-Mediated Signal Amplification Strategy，Analytical Chemistry，2018年06月12日，Vol.90，pp.8072-8079

【文献】ZONG, S. et al.，Facile detection of tumor-derived exosomes using magnetic nanobeads and SERS nanoprobes，Analytical Methods，2016年，Vol.8，pp.5001-5008

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｇ０１Ｎ ３３／５３，３３／５４３

Ｃ１２Ｑ １／０６，１／６８０６

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

第１の疾患に関連した第１の抗原と特異的に結合する第１の抗体を表面に固定した複数の第１のビーズを含む第１の緩衝液が注入された反応容器に、第２の疾患に関連した第２の抗原と特異的に結合する第２の抗体を表面に固定した複数の第２のビーズと、前記第１の抗原及び前記第２の抗原を表面に有する分析対象のエクソソームを含む生体試料とを注入して、前記第１のビーズと前記第２のビーズとが結合した前記分析対象のエクソソームを含む第２の緩衝液を生成し、
前記第２の緩衝液から、前記第１のビーズと前記第２のビーズとが結合した前記分析対象のエクソソームを回収し、
回収した前記第１のビーズと前記第２のビーズとが結合した前記分析対象のエクソソームから前記第１のビーズを切り離し、前記第２のビーズが結合した前記分析対象のエクソソームを回収し、
回収した前記第２のビーズが結合した前記分析対象のエクソソームを溶解処理して、前記第２のビーズと前記分析対象のエクソソームの内包物とに分離してそれぞれを回収し、
回収した前記分析対象のエクソソームの内包物を分析し、回収した前記第２のビーズの個数を計測する
生体試料分析方法。

【請求項2】

前記第１の抗体は、ハプテンを用いて前記第１のビーズに固定されており、
前記第１のビーズと前記第２のビーズとが結合した前記分析対象のエクソソームを含む第３の緩衝液にハプテンを添加することによって、前記第１のビーズを切り離す
請求項１に記載の生体試料分析方法。

【請求項3】

前記第１の抗体は、開裂可能なリンカーを用いて前記第１のビーズに固定されており、
前記第１のビーズと前記第２のビーズとが結合した前記分析対象のエクソソームを含む第３の緩衝液に前記リンカーの開裂試薬を添加することによって、前記第１のビーズを切り離す
請求項１に記載の生体試料分析方法。

【請求項4】

前記溶解処理に界面活性剤を用いる請求項１～３のいずれか１項に記載の生体試料分析方法。

【請求項5】

前記第１のビーズが磁性ビーズである請求項１～４のいずれか１項に記載の生体試料分析方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、生体試料に含まれているエクソソームの内包物を分析し、エクソソームの個数を計測する生体試料分析方法に関する。

【背景技術】

【0002】

特定の疾患と関連付けられている抗原をバイオマーカとして検出して分析することで、特定の疾患を発見したり、特定の疾患の治療の効果を検証したりすることが行われている。細胞から分泌され、血液等の各種の体液に含まれているエクソソームは、特定の疾患を発見するためのバイオマーカとして期待されている。

【0003】

エクソソームは脂質二重膜で覆われた微小な膜小胞であり、脂質二重膜には、ＣＤ９、ＣＤ６３等の各種の膜たんぱく質が存在する。人が特定の疾患に罹患すると、疾患に関連した膜たんぱく質が脂質二重膜の表面（エクソソームの表面）に発現しているエクソソームの量に影響することが知られている。エクソソームの表面に発現している疾患に関連した膜たんぱく質を抗原とし、疾患に関連した抗原を有するエクソソームの個数を計測することによって、人が特定の疾患に罹患しているか否かを発見できる可能性がある。

【0004】

エクソソームの内部には、ｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）及びＤＮＡ等の核酸、たんぱく質等の内包物が存在する。エクソソームの内包物も特定の疾患を発見するためのバイオマーカとして期待されている（特許文献１参照）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【文献】特開２０１８－１６３０４３号公報

【文献】特開２０１７－４０５９５号公報

【文献】特開２０１９－２１１３６６号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

従来においては、エクソソームを含む生体試料の検体を２つ用意し、一方の検体でエクソソームの内包物を分析し、他方の検体でエクソソームの個数を計測する。即ち、内包物を分析したエクソソームと、個数を計測したエクソソームとは同一のものではない。１つの検体で、エクソソームの内包物を分析し、エクソソームの個数を計測することが望まれる。

【0007】

本発明は、１つの生体試料で、エクソソームの内包物を分析し、かつ、エクソソームの個数を計測することができる生体試料分析方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明は、第１の疾患に関連した第１の抗原と特異的に結合する第１の抗体を表面に固定した複数の第１のビーズを含む第１の緩衝液が注入された反応容器に、第２の疾患に関連した第２の抗原と特異的に結合する第２の抗体を表面に固定した複数の第２のビーズと、前記第１の抗原及び前記第２の抗原を表面に有する分析対象のエクソソームを含む生体試料とを注入して、前記第１のビーズと前記第２のビーズとが結合した前記分析対象のエクソソームを含む第２の緩衝液を生成し、前記第２の緩衝液から、前記第１のビーズと前記第２のビーズとが結合した前記分析対象のエクソソームを回収し、回収した前記第１のビーズと前記第２のビーズとが結合した前記分析対象のエクソソームから前記第１のビーズを切り離し、前記第２のビーズが結合した前記分析対象のエクソソームを回収し、回収した前記第２のビーズが結合した前記分析対象のエクソソームを溶解処理して、前記第２のビーズと前記分析対象のエクソソームの内包物とに分離してそれぞれを回収し、回収した前記分析対象のエクソソームの内包物を分析し、回収した前記第２のビーズの個数を計測する生体試料分析方法を提供する。

【発明の効果】

【0009】

本発明の生体試料分析方法によれば、１つの生体試料で、エクソソームの内包物を分析し、かつ、エクソソームの個数を計測することができる。

【図面の簡単な説明】

【0010】

【図1A】一実施形態の生体試料分析方法を部分的に示すフローチャートである。

【図1B】図１Ａに続く、一実施形態の生体試料分析方法を部分的に示すフローチャートである。

【図2】一実施形態の生体試料分析方法で用いる磁性マイクロビーズを示す概念図である。

【図3】磁性マイクロビーズを含む緩衝液を注入した反応容器を示す概念図である。

【図4】シングルポジティブのエクソソーム及びダブルポジティブのエクソソームを含む生体試料の検体を示す概念図である。

【図5A】シングルポジティブのエクソソームの構造を示す概念図である。

【図5B】ダブルポジティブのエクソソームの構造を示す概念図である。

【図6】一実施形態の生体試料分析方法で用いる抗体ナノビーズを示す概念図である。

【図7】磁性マイクロビーズを含む緩衝液を注入した反応容器にダブルポジティブのエクソソームを含む検体及び抗体ナノビーズを注入して、ダブルポジティブのエクソソームを磁性マイクロビーズと抗体ナノビーズとでサンドイッチ捕捉した状態を示す概念図である。

【図8】図７に示す反応容器からダブルポジティブのエクソソームをサンドイッチ捕捉した磁性マイクロビーズ及び抗体ナノビーズ以外の不要物を除去した状態を示す概念図である。

【図9】図７に示す反応容器から不要物を分離する方法を示す図である。

【図10】ダブルポジティブのエクソソームをサンドイッチ捕捉した磁性マイクロビーズ及び抗体ナノビーズにおけるエクソソームを磁性マイクロビーズから切り離した状態を示す概念図である。

【図11】ハプテンを用いてエクソソームを磁性マイクロビーズから切り離す方法を示す図である。

【図12】リンカーを用いてエクソソームを磁性マイクロビーズから切り離す方法を示す図である。

【図13】磁性マイクロビーズと、ダブルポジティブのエクソソームを捕捉した抗体ナノビーズと、シングルポジティブのエクソソームとを分離して得られた磁性マイクロビーズを示す概念図である。

【図14】磁性マイクロビーズと、ダブルポジティブのエクソソームを捕捉した抗体ナノビーズと、シングルポジティブのエクソソームとを分離して得られた、ダブルポジティブのエクソソームを捕捉した抗体ナノビーズ及びシングルポジティブのエクソソームを示す概念図である。

【図15A】磁性マイクロビーズと抗体ナノビーズとを分離する方法の途中までの工程を示す図である。

【図15B】磁性マイクロビーズと抗体ナノビーズとを分離する方法の図１５Ａに続く工程を示す図である。

【図16】ダブルポジティブのエクソソームを捕捉した抗体ナノビーズと、シングルポジティブのエクソソームとを分離して得られた、ダブルポジティブのエクソソームを捕捉した抗体ナノビーズを示す概念図である。

【図17】ダブルポジティブのエクソソームを捕捉した抗体ナノビーズと、シングルポジティブのエクソソームとを分離して得られた、シングルポジティブのエクソソームを示す概念図である。

【図18】ダブルポジティブのエクソソームから抗体ナノビーズを切り離した状態を示す概念図である。

【図19】互いに切り離された、抗体ナノビーズとダブルポジティブのエクソソームとを分離して得られた抗体ナノビーズを示す概念図である。

【図20】互いに切り離された、抗体ナノビーズとダブルポジティブのエクソソームとを分離して得られたダブルポジティブのエクソソームを示す概念図である。

【図21】図１ＢのステップＳ１２２の具体的な抗体ナノビーズの個数の計測方法を示すフローチャートである。

【図22】抗体ナノビーズの個数の計測方法を示す図である。

【図23】ディスク基板に抗体ナノビーズを付着させるための極性官能基を形成した状態を示す概念図である。

【発明を実施するための形態】

【0011】

以下、一実施形態の生体試料分析方法について、添付図面を参照して説明する。本実施形態においては、１つのエクソソームの表面に２種類の特定の膜たんぱく質が発現しているダブルポジティブのエクソソームを捕捉して内包物を分析し、かつ、そのエクソソームの個数を計測することができる生体試料分析方法を例とする。

【0012】

図１Ａにおいて、オペレータは、ステップＳ１１にて、図２に示すように、磁性マイクロビーズ１０の表面に第１の疾患に関連した抗原と特異的に結合する複数の抗体１１を固定させる。図３に示すように、オペレータは、ステップＳ１２にて、反応容器２０に抗体１１が固定された多数の磁性マイクロビーズ１０を含む緩衝液２１（第１の緩衝液）を注入する。磁性マイクロビーズ１０の直径は３μｍ程度であり、直径はマイクロメートルオーダーであればよい。

【0013】

図４に示すように、オペレータは、容器３０に生体試料の検体３１を準備する。検体３１は、後述するシングルポジティブのエクソソーム３２ｓ及びダブルポジティブのエクソソーム３２ｗを含む。検体３１は血液等の任意の体液であって、エクソソーム３２ｓ及び３２ｗの他に、不要物である夾雑物３３及び３４を含む。シングルポジティブのエクソソーム３２ｓ及びダブルポジティブのエクソソーム３２ｗをエクソソーム３２と総称する。

【0014】

図５Ａに概念的に示すように、シングルポジティブのエクソソーム３２ｓは脂質二重膜３２０で覆われており、脂質二重膜３２０には、膜たんぱく質３２１～３２３が存在している。膜たんぱく質３２１はＣＤ９、膜たんぱく質３２２はＣＤ６３、膜たんぱく質３２３はＣＤ１４７である。ＣＤ９及びＣＤ６３は通常存在する膜たんぱく質であり、ＣＤ１４７は第１の疾患に関連した膜たんぱく質の一例である。このようにシングルポジティブのエクソソーム３２ｓは、１つのエクソソーム３２の表面に１種類の疾患に関連した膜たんぱく質（本実施形態においてはＣＤ１４７）が存在しているエクソソーム３２を指す。

【0015】

図５Ｂに概念的に示すように、ダブルポジティブのエクソソーム３２ｗは脂質二重膜３２０で覆われており、脂質二重膜３２０には、膜たんぱく質３２１～３２４が存在している。膜たんぱく質３２４はＨＥＲ２（ＣＤ３４０）である。ＨＥＲ２（ＣＤ３４０）は第２の疾患に関連した膜たんぱく質の一例である。このようにダブルポジティブのエクソソーム３２ｗは、１つのエクソソーム３２の表面に２種類の疾患に関連した膜たんぱく質（本実施形態においてはＣＤ１４７及びＨＥＲ２（ＣＤ３４０）の２つ）が存在しているエクソソーム３２を指す。以下、ＨＥＲ２（ＣＤ３４０）を通称名であるＨＥＲ２と称する。

【0016】

本実施形態においては、一例として、ＣＤ１４７及びＨＥＲ２の双方が表面に存在するダブルポジティブのエクソソーム３２ｗを分析対象のエクソソームとする。本実施形態においては、ＣＤ１４７を第１の疾患に関連した第１の抗原とし、ＨＥＲ２を第２の疾患に関連した第２の抗原としているが、これに限定されない。磁性マイクロビーズ１０の表面に固定されている抗体１１は、ＣＤ１４７と特異的に結合する第１の抗体である。

【0017】

エクソソーム３２の内部には、ｍｉＲＮＡ３２５及びＤＮＡ３２６等の核酸、及び図示していないたんぱく質等の内包物が存在する。

【0018】

図６に示すように、オペレータは、容器４０に、表面に複数の抗体５１が固定された抗体ナノビーズ５０を含む緩衝液４１を準備する。抗体ナノビーズ５０は磁性マイクロビーズ１０よりも格段に小径であって、直径は２００ｎｍ程度である。抗体ナノビーズ５０の直径は１μｍ未満であればよく、好ましくは１００ｎｍ～５００ｎｍである。抗体ナノビーズ５０の表面に固定されている抗体５１は、第２の疾患に関連した第２の抗原であるＨＥＲ２と特異的に結合する抗体（第２の抗体）である。

【0019】

図７に示すように、オペレータは、ステップＳ１３にて、エクソソーム３２を含む検体３１と、抗体ナノビーズ５０を含む緩衝液４１を順に（または同時に）反応容器２０に注入する。緩衝液２１と緩衝液４１とを混合した緩衝液を緩衝液２１とすると、反応容器２０内には、磁性マイクロビーズ１０と抗体ナノビーズ５０とでサンドイッチ捕捉されたダブルポジティブのエクソソーム３２ｗを含む緩衝液２１（第２の緩衝液）が生成される。この場合、サンドイッチ捕捉とは２つのビーズが１つのエクソソームに結合することを意味していることから、磁性マイクロビーズ１０と抗体ナノビーズ５０とが結合したエクソソーム３２ｗを含む第２の緩衝液が生成される、ということができる。このとき、オペレータは、反応容器２０を必要に応じて振盪し、所定時間待機する。

【0020】

図７において、ＣＤ１４７及びＨＥＲ２の双方が表面に存在しているダブルポジティブのエクソソーム３２ｗが磁性マイクロビーズ１０と抗体ナノビーズ５０とでサンドイッチ捕捉されている。ＨＥＲ２が存在していないシングルポジティブのエクソソーム３２ｓは磁性マイクロビーズ１０の抗体１１と結合する。しかしながら、シングルポジティブのエクソソーム３２ｓには抗体ナノビーズ５０は結合しないため、シングルポジティブのエクソソーム３２ｓは磁性マイクロビーズ１０と抗体ナノビーズ５０とでサンドイッチ捕捉されない。

【0021】

図７において、反応容器２０内には多数の磁性マイクロビーズ１０が存在しているが、理解を容易にするため、拡大した１つの磁性マイクロビーズ１０のみを示している。

【0022】

オペレータは、ステップＳ１４にて、エクソソーム３２を介して抗体ナノビーズ５０が連結された磁性マイクロビーズ１０と不要物とを磁気捕集または弱遠心分離等によって分離する。オペレータは、分離された磁性マイクロビーズ１０を洗浄する。磁性マイクロビーズ１０と連結していない抗体ナノビーズ５０、夾雑物３３及び３４は不要物である。なお、ステップＳ１３にて抗体ナノビーズ５０は過剰に注入されるから、不要物は主として磁性マイクロビーズ１０と連結していない抗体ナノビーズ５０である。ステップＳ１４の結果、図８に示す、エクソソーム３２を介して抗体ナノビーズ５０が連結された磁性マイクロビーズ１０を回収することができる。

【0023】

回収された磁性マイクロビーズ１０には抗体ナノビーズ５０が結合していないエクソソーム３２ｓも結合している。勿論、複数ある磁性マイクロビーズ１０の中には、抗体ナノビーズ５０が結合したエクソソーム３２ｗのみが結合している磁性マイクロビーズ１０もあれば、抗体ナノビーズ５０が結合していないエクソソーム３２ｓのみが結合している磁性マイクロビーズ１０もある。

【0024】

ところで、抗体ナノビーズ５０が磁性ナノビーズでなければ、磁性マイクロビーズ１０を磁気捕集することによって、磁性マイクロビーズ１０と、磁性マイクロビーズ１０と連結していない抗体ナノビーズ５０とを容易に分離することができる。後述するステップＳ２２にて磁性マイクロビーズ１０と連結している抗体ナノビーズ５０の個数を計測する際に、抗体ナノビーズ５０は磁性ナノビーズであることが好ましい。抗体ナノビーズ５０が磁性ナノビーズであったとしても、磁性マイクロビーズ１０と、非連結の抗体ナノビーズ５０とを分離することが可能である。

【0025】

具体的には、図９に示すようにして、磁性マイクロビーズ１０と非連結の抗体ナノビーズ５０とを分離することができる。図９において、（ａ）は、容器６０内に抗体ナノビーズ５０が連結された磁性マイクロビーズ１０と非連結の抗体ナノビーズ５０とを含む緩衝液２１を注入した状態である。図９の（ａ）は図７の状態に相当する。容器６０の底部に磁石を配置する磁気捕集または弱遠心分離によって、図９の（ｂ）に示すように、磁性マイクロビーズ１０と非連結の抗体ナノビーズ５０とを大方分離することができる。

【0026】

これは、磁性マイクロビーズ１０と抗体ナノビーズ５０との体積が約１０００倍異なるため、磁性マイクロビーズ１０は短時間で磁気捕集されるのに対し、抗体ナノビーズ５０は長時間かけないと磁気捕集されないからである。この磁気捕集の時間差を利用することによって、磁性マイクロビーズ１０と非連結の抗体ナノビーズ５０とを大方分離することができる。

【0027】

磁性マイクロビーズ１０を洗浄する工程において、図９の（ｂ）の主として磁性マイクロビーズ１０である沈殿物を回収して上清を除去して緩衝液２１を加えれば、図９の（ｃ）に示すように非連結の抗体ナノビーズ５０を大幅に減らすことができる。図９の（ｃ）に示す状態で磁気捕集すれば図９の（ｄ）となり、沈殿物を回収して上清を除去して緩衝液２１を加えれば、図９の（ｅ）に示すように非連結の抗体ナノビーズ５０をさらに大幅に減らすことができる。

【0028】

図９の（ｅ）に示す状態で磁気捕集すれば図９の（ｆ）となり、沈殿物を回収して上清を除去して緩衝液２１を加えれば、図９の（ｇ）に示すように抗体ナノビーズ５０が連結された磁性マイクロビーズ１０のみを分離することができる。図９の（ｇ）は図８の状態に相当する。沈殿物回収及び上清除去の回数は図９に示す回数に限定されない。

【0029】

図１０に示すように、オペレータは、ステップＳ１５にて、エクソソーム３２を磁性マイクロビーズ１０から切り離す処理を実行する。すると、抗体ナノビーズ５０が結合したダブルポジティブのエクソソーム３２ｗと、抗体ナノビーズ５０が結合していないシングルポジティブのエクソソーム３２ｓとが、磁性マイクロビーズ１０から切り離される。

【0030】

ステップＳ１５のエクソソーム３２を磁性マイクロビーズ１０から切り離す処理としては、以下のいずれかの方法を採用することができる。第１の方法として、図１１に示すハプテンを用いる方法がある。ハプテンとは、抗体と結合するが、分子量が小さいため単独で抗体産生を誘起する活性（免疫原性）を示さない物質である。ハプテンは、適当なたんぱく質と結合すると、免疫原性を有する完全抗原となる。

【0031】

図１１に示すように、磁性マイクロビーズ１０には抗体５１の代わりに抗ＤＮＰ抗体５２が固定されている。ＤＮＰとは2, 4-ジニトロフェノールであって、ハプテンの一例である。抗ＤＮＰ抗体５２には、ＤＮＰ５３が結合した抗体５４（以下、ＤＮＰ抗体５４）を介して、ダブルポジティブのエクソソーム３２ｗまたはシングルポジティブのエクソソーム３２ｓが結合されている。ＤＮＰ抗体５４はＣＤ１４７と特異的に結合する抗体である。

【0032】

この状態で抗ＤＮＰ抗体５２とＤＮＰ抗体５４との結合は平衡反応である。磁性マイクロビーズ１０と抗体ナノビーズ５０とでサンドイッチ捕捉されたエクソソーム３２ｗを含む緩衝液２１（第３の緩衝液）にＤＮＰ５３（ハプテン）を大過剰に添加すると、抗ＤＮＰ抗体５２と結合していたＤＮＰ抗体５４がＤＮＰ５３に入れ替わって、磁性マイクロビーズ１０と、抗体ナノビーズ５０と結合しているダブルポジティブのエクソソーム３２ｗ及びシングルポジティブのエクソソーム３２ｓとが切り離される。

【0033】

エクソソーム３２を磁性マイクロビーズ１０から切り離す第２の方法として、図１２に示す開裂可能なリンカー５５を用いる方法がある。磁性マイクロビーズ１０には、リンカー５５を介して抗体１１が固定されている。第２の方法を用いる場合、図８に示す磁性マイクロビーズ１０にはリンカー５５を介して抗体１１が固定され、抗体１１がエクソソーム３２と結合している。

【0034】

反応容器２０内の緩衝液２１（第３の緩衝液）にリンカー開裂試薬を添加すると、図１２に示すように、リンカー５５が開裂して、磁性マイクロビーズ１０と抗体１１とが切り離される。

【0035】

エクソソーム３２を磁性マイクロビーズ１０から切り離す第３の方法として、磁性マイクロビーズ１０にＷｈｏｌｅ抗体を用い、抗体ナノビーズ５０にＦａｂ抗体を用いてもよい。Ｗｈｏｌｅ抗体を酵素で分解及び消化すれば、エクソソーム３２を磁性マイクロビーズ１０から切り離すことができる。

【0036】

図１Ｂにおいて、オペレータは、ステップＳ１６にて、磁性マイクロビーズ１０と、ダブルポジティブのエクソソーム３２ｗと結合した抗体ナノビーズ５０及びシングルポジティブのエクソソーム３２ｓとを分離する。分離された磁性マイクロビーズ１０を洗浄すれば、図１３に示す磁性マイクロビーズ１０を回収することができる。図１３において、磁性マイクロビーズ１０のみを含む緩衝液２１は反応容器２０に注入されている。

【0037】

分離されたエクソソーム３２ｗと結合した抗体ナノビーズ５０及びエクソソーム３２ｓを洗浄すれば、図１４に示すエクソソーム３２ｗと結合した抗体ナノビーズ５０及びエクソソーム３２ｓを回収することができる。図１４において、エクソソーム３２ｗと結合した抗体ナノビーズ５０及びエクソソーム３２ｓを含む緩衝液２１は容器２２に注入されている。

【0038】

ステップＳ１６における磁性マイクロビーズ１０と、エクソソーム３２ｗと結合した抗体ナノビーズ５０及びエクソソーム３２ｓとの分離は、図９と同様に実行することができる。但し、ステップＳ１６の分離においては、上清を廃棄せず、上清に含まれるエクソソーム３２ｗと結合した抗体ナノビーズ５０及びエクソソーム３２ｓを回収する必要がある。

【0039】

具体的には、図１５Ａ及び図１５Ｂに示すようにして、磁性マイクロビーズ１０とエクソソーム３２ｗと結合した抗体ナノビーズ５０とを分離することができる。図１５Ａ及び図１５Ｂにおいてはエクソソーム３２ｓの図示を省略している。

【0040】

図１５Ａにおいて、（ａ）は、容器６１内に互いに分離した磁性マイクロビーズ１０と抗体ナノビーズ５０とを含む緩衝液２１を注入した状態である。図１６Ａの（ａ）は図１０の状態に相当する。容器６１の底部に磁石を配置する磁気捕集または弱遠心分離によって、図１５Ａの（ｂ）に示すように、磁性マイクロビーズ１０と抗体ナノビーズ５０とを大方分離することができる。

【0041】

図１５Ａの（ｂ）の主として磁性マイクロビーズ１０である沈殿物を回収して緩衝液２１を加えれば、図１５Ａの（ｃ）に示すように抗体ナノビーズ５０を大幅に減らすことができる。図１５Ａの（ｄ）に示すように、上清を容器６２に回収すれば、抗体ナノビーズ５０を多く含む緩衝液２１を得ることができる。図１５Ａの（ｃ）に示す状態で磁気捕集すれば図１５Ａの（ｅ）となる。

【0042】

図１５Ａの（ｅ）の主として磁性マイクロビーズ１０である沈殿物を回収して緩衝液２１を加えれば、図１５Ｂの（ｆ）に示すように抗体ナノビーズ５０をさらに減らすことができる。図１５Ｂの（ｇ）に示すように、上清を容器６３に回収すれば、抗体ナノビーズ５０を含む緩衝液２１を得ることができる。図１５Ｂの（ｆ）に示す状態で磁気捕集すれば図１５Ｂの（ｈ）となる。

【0043】

図１５Ｂの（ｈ）の磁性マイクロビーズ１０のみとなった沈殿物を回収して緩衝液２１を加えれば、図１５Ｂの（ｉ）に示すように抗体ナノビーズ５０を含まない磁性マイクロビーズ１０のみを含む緩衝液２１を得ることができる。図１５Ｂの（ｉ）は図１３の状態に相当する。図１５Ｂの（ｊ）に示すように、上清を容器６４に回収すれば、抗体ナノビーズ５０をわずかに含む緩衝液２１を得ることができる。

【0044】

図１５Ｂの（ｋ）に示すように、容器６２～６４全ての抗体ナノビーズ５０を合わせれば、磁性マイクロビーズ１０に結合していた、エクソソーム３２ｗと結合した全ての抗体ナノビーズ５０を回収することができる。このとき、エクソソーム３２ｓも回収することができる。図１５Ｂの（ｋ）は図１４の状態に相当する。沈殿物回収及び上清回収の回数は図１５Ａ及び図１５Ｂに示す回数に限定されない。

【0045】

図１Ｂにおいて、オペレータは、ステップＳ１７にて、エクソソーム３２ｗと結合した抗体ナノビーズ５０とエクソソーム３２ｓとを分離する。エクソソーム３２ｗと結合した抗体ナノビーズ５０とエクソソーム３２ｓとは、図１５Ａ及び図１５Ｂと同様の方法によって分離して個別に回収することができる。

【0046】

分離されたエクソソーム３２ｗと結合した抗体ナノビーズ５０を洗浄すれば、図１６に示すエクソソーム３２ｗと結合した抗体ナノビーズ５０を回収することができる。図１６において、エクソソーム３２ｗと結合した抗体ナノビーズ５０のみを含む緩衝液２１は容器２３に注入されている。分離されたエクソソーム３２ｓを洗浄すれば、図１７に示すエクソソーム３２ｓを回収することができる。図１７において、エクソソーム３２ｓのみを含む緩衝液２１は容器２４に注入されている。

【0047】

オペレータは、ステップＳ１８にて、エクソソーム３２ｓを溶解処理してエクソソーム３２ｓの内包物を分析する。エクソソーム３２ｓを含む緩衝液２１に界面活性剤を添加すると、エクソソーム３２ｓの脂質二重膜３２０が溶解処理されて破壊される。本実施形態においては、ダブルポジティブのエクソソーム３２ｗを分析することを主目的としているので、ステップＳ１８は省略されてもよい。

【0048】

オペレータは、ステップＳ１９にて、抗体ナノビーズ５０とエクソソーム３２ｗとを切り離す処理を実行する。一例として、図１６に示す緩衝液２１に界面活性剤を添加することによって、図１８に示すように、抗体ナノビーズ５０とエクソソーム３２ｗとを切り離すことができる。例えば、界面活性剤は２％の非イオン性界面活性剤であるTritonX-100溶液である。界面活性剤によってエクソソーム３２ｗの脂質二重膜３２０が溶解処理されるので、エクソソーム３２ｗが破壊されることによって抗体ナノビーズ５０とエクソソーム３２ｗとが切り離され、かつ、エクソソーム３２ｗの内包物が緩衝液２１中に放出される。図１８において、実際には各エクソソーム３２ｗは脂質二重膜３２０が破壊されて複数の内包物に分断される。

【0049】

オペレータは、ステップＳ２０にて、抗体ナノビーズ５０とエクソソーム３２ｗの内包物とを分離して個別に回収する。抗体ナノビーズ５０とエクソソーム３２ｗの内包物とは、図１５Ａ及び図１５Ｂと同様の方法によって分離することができる。

【0050】

分離された抗体ナノビーズ５０を洗浄すれば、図１９に示す抗体ナノビーズ５０を回収することができる。図１９において、抗体ナノビーズ５０のみを含む緩衝液２１は容器２４に注入されている。分離されたエクソソーム３２ｗの内包物を洗浄すれば、図２０に示すエクソソーム３２ｗの内包物を回収することができる。図２０においても、実際には各エクソソーム３２ｗは複数の内包物に分断されている。図２０において、エクソソーム３２ｗの内包物のみを含む緩衝液２１は容器２５に注入されている。

【0051】

オペレータは、ステップＳ２１にて、容器２５内のエクソソーム３２ｗの内包物を取り出して内包物を分析する。このとき、RT-PCR（Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction）分析、LC-MS（Liquid Chromatography - Mass Spectrometry）分析等の分析方法によって、内包物中のＤＮＡまたはタンパク質を解析することができる。また、オペレータは、ステップＳ２２にて、抗体ナノビーズ５０の個数を計測する。オペレータは、ステップＳ２１とステップＳ２２とを任意の順番で行えばよく、複数のオペレータによって同時に行ってもよい。ステップＳ１８とステップＳ２１とステップＳ２２との順番も任意である。オペレータがステップＳ２１及びＳ２２（または、ステップＳ１８、Ｓ２１及びＳ２２）を実行すれば、生体試料分析の処理が終了する。

【0052】

ステップＳ２２で個数が計測される抗体ナノビーズ５０はダブルポジティブのエクソソーム３２ｗと結合していたものであるから、ステップＳ２２では、ＣＤ１４７及びＨＥＲ２の双方が存在するエクソソーム３２ｗの個数が計測されることになる。ステップＳ２１で内包物が分析されるエクソソーム３２は、シングルポジティブのエクソソーム３２ｓを取り除いたダブルポジティブのエクソソーム３２ｗのみであり、ステップＳ２２で個数が計測されるエクソソーム３２ｗである。

【0053】

よって、内包物を分析したダブルポジティブのエクソソーム３２ｗと、個数を計測したダブルポジティブのエクソソーム３２ｗとは同一のものである。図４に示す１つの検体３１で、疾患に関連した膜たんぱく質であるＣＤ１４７及びＨＥＲ２の双方が存在するダブルポジティブのエクソソーム３２ｗの内包物を分析し、かつ、そのエクソソーム３２ｗの個数を計測することができる。

【0054】

図２１～図２３を用いて、図１ＢのステップＳ２２の具体的な抗体ナノビーズ５０の個数の計測方法を説明する。図２１において、オペレータは、ステップＳ２２１にて、図２２の（ａ）に示すように、抗体ナノビーズ５０に固定されている抗体５１と結合する抗体８２（第３の抗体）を固定させたディスク基板８１を準備する。抗体８２は一例としてGoat anti Mouse IgG抗体である。

【0055】

ディスク基板８１は円盤状であるのがよく、径方向に凹部８１Ｇと凸部８１Ｌとが交互に配置されているのがよい。凹部８１Ｇ及び凸部８１Ｌはスパイラル状または同心円状に形成されている。

【0056】

図２２の（ｂ）に示すように、オペレータは、複数の例えば円筒状の貫通穴が形成されたカートリッジ８３をディスク基板８１に装着する。すると、ディスク基板８１とカートリッジ８３とでウェル８３Ｗが形成される。図２２の（ｃ）に示すように、オペレータは、ステップＳ２２２にて、回収した抗体ナノビーズ５０を含む緩衝液２１を各ウェル８３Ｗに分注する。なお、カートリッジ８３は特許文献２に記載の構成を採用することができる。

【0057】

図２２の（ｄ）に示すように、オペレータは、ステップＳ２２３にて、振盪または磁気吸着によって、抗体ナノビーズ５０の抗体５１とディスク基板８１に固定された抗体８２とを結合させる。抗体ナノビーズ５０を磁性ナノビーズとして、ディスク基板８１の裏面側に磁石を配置すれば、抗体ナノビーズ５０がディスク基板８１の表面に引き寄せられる。これにより、ディスク基板８１に固定された抗体８２に抗体ナノビーズ５０の抗体５１が結合しやすくなる。

【0058】

オペレータは、ステップＳ２２４にて、ウェル８３Ｗ中の上清を排出し、ステップＳ２２５にて、ディスク基板８１を乾燥させる。図２２の（ｅ）に示すように、オペレータは、ステップＳ２２６にて、乾燥させたディスク基板８１を分析装置に装着して、分析装置でディスク基板８１に固定された抗体ナノビーズ５０の個数を計測する。分析装置は、ディスク基板８１に集光レンズ１０１によって集光したレーザビームを照射して抗体ナノビーズ５０の個数を計測する。なお、分析装置は特許文献３に記載の構成を採用することができる。

【0059】

図２３に示すように、ディスク基板８１に抗体８２を固定する代わりに、ディスク基板８１の表面を酸素プラズマ処理してカルボキシル基（COOH）等の極性官能基を形成してもよい。抗体ナノビーズ５０の抗体５１は極性官能基に吸着する。

【0060】

以上のように、本実施形態の生体試料分析方法によれば、１つの生体試料（検体３１）で、疾患に関連した２種類の抗原（膜たんぱく質）を含むダブルポジティブのエクソソーム３２ｗの内包物を分析し、かつ、そのエクソソーム３２ｗの個数を計測することができる。

【0061】

本発明は以上説明した本実施形態に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々変更可能である。本実施形態においては、第１のビーズを磁性マイクロビーズ１０、第２のビーズを抗体ナノビーズ５０としているが、第１のビーズと第２のビーズとは互いに分離可能な程度に大きさが異なればよい。第１のビーズをマイクロビーズ、第２のビーズをナノビーズとすると互いに容易に分離可能となるので、第１のビーズをマイクロビーズ、第２のビーズをナノビーズとすることが好ましい。

【0062】

第１のビーズは磁性ビーズであることが好ましいが、非磁性ビーズとすることも可能である。第１のビーズを磁性ビーズ、第２のビーズが非磁性ビーズとすれば、互いの分離が極めて容易となる。第２のビーズを磁性ビーズとすれば、第２のビーズをディスク基板８１に固定させやすくなる。第１のビーズを非磁性ビーズ、第２のビーズを磁性ビーズとしてもよい。第１のビーズ及び第２のビーズを磁性ビーズとしてもよい。

【符号の説明】

【0063】

１０ 磁性マイクロビーズ
１１ 抗体
２０ 反応容器
２１ 緩衝液
２２～２５，３０，４０，６０，６１～６５ 容器
３１ 検体
３２ｓ シングルポジティブのエクソソーム
３２ｗ ダブルポジティブのエクソソーム
５１，８２ 抗体
５２ 抗ＤＮＰ抗体
５３ ＤＮＰ
５４ 抗体（ＤＮＰ抗体）
５５ リンカー
８１ ディスク基板
８３ カートリッジ
８３Ｗ ウェル
１０１ 集光レンズ
３２０ 脂質二重膜
３２１～３２４ 膜たんぱく質（抗原）
３２５ ｍｉＲＮＡ
３２６ ＤＮＡ

【図1A】

【図1B】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15A】

【図15B】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】