特許 7425783 形質転換微生物、及びポリヒドロキシアルカン酸の製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-01-23

(45)【発行日】2024-01-31

(54)【発明の名称】形質転換微生物、及びポリヒドロキシアルカン酸の製造方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20240124BHJP

   C12N 15/52 20060101ALI20240124BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240124BHJP

   C12P 7/62 20220101ALI20240124BHJP

【ＦＩ】

C12N15/09 Z ZNA

C12N15/52 Z

C12N1/21

C12P7/62

【請求項の数】 8

(21)【出願番号】P 2021501777

(86)(22)【出願日】2020-01-29

(86)【国際出願番号】 JP2020003155

(87)【国際公開番号】W WO2020174987

(87)【国際公開日】2020-09-03

【審査請求日】2022-11-18

(31)【優先権主張番号】P 2019036007

(32)【優先日】2019-02-28

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】000000941

【氏名又は名称】株式会社カネカ

(74)【代理人】

【識別番号】110000556

【氏名又は名称】弁理士法人有古特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】有川 尚志

(72)【発明者】

【氏名】佐藤 俊輔

【審査官】福間 信子

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１８／０２１０４６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１８／２１６７２６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】UniProtKB, Accession No. Q0K961，H16-A2365 gene，[online]，Last modified: October 3，2006，[retrieved on 2020.03.23]，<URL: https://www.uniprot.org/uniprot/Q0K961>

【文献】佐藤 俊輔ほか，微生物による生分解性ポリマーPHBH製造法の開発，生物工学会誌，2019年02月25日，Vol. 97，No. 2，pp. 66-74

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子を有し、Ａ２３６５遺伝子の発現が強化された、カプリアビダス・ネカトールの形質転換微生物。

【請求項2】

請求項１に記載の形質転換微生物を、炭素源の存在下で培養する工程を含む、ポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。

【請求項3】

炭素源が、油脂あるいは脂肪酸を含有する、請求項２に記載のポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。

【請求項4】

炭素源が、糖を含有する、請求項２に記載のポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。

【請求項5】

炭素源が、二酸化炭素を含有する、請求項２に記載のポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。

【請求項6】

ポリヒドロキシアルカン酸が、２種以上のヒドロキシアルカン酸の共重合体である、請求項２～５のいずれか１項に記載のポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。

【請求項7】

前記ポリヒドロキシアルカン酸が、３－ヒドロキシヘキサン酸をモノマーユニットとして含有する共重合体である、請求項６に記載のポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。

【請求項8】

前記ポリヒドロキシアルカン酸が、３－ヒドロキシ酪酸と３－ヒドロキシヘキサン酸との共重合体である、請求項７に記載のポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ポリヒドロキシアルカン酸を生産可能な形質転換微生物、及び、当該形質転換微生物を用いたポリヒドロキシアルカン酸の製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

環境問題、食糧問題、健康及び安全に対する意識の高まり、天然又は自然志向の高まりなどを背景に、微生物を利用した物質製造（発酵生産、バイオ変換など）の意義及び重要性が益々高まっており、タンパク質医薬品や遺伝子治療用の核酸などの製造にも、微生物による物質生産が応用されている。例えば、酵母やバクテリアなどの微生物を利用したエタノール、酢酸、医療用タンパク質の生産などが活発に産業応用されている。

【0003】

その一例として、生分解性プラスチックとしての産業利用が期待されているポリヒドロキシアルカン酸（以下、ＰＨＡともいう）の微生物による生産が挙げられる（非特許文献１を参照）。ＰＨＡは、多くの微生物種の細胞にエネルギー蓄積物質として産生、蓄積される熱可塑性ポリエステルであり、生分解性を有している。現在、環境への意識の高まりから非石油由来のプラスチックが注目されるなか、特に、微生物が菌体内に産生、蓄積するＰＨＡは、自然界の炭素循環プロセスに取り込まれることから生態系への悪影響が小さいと予想されており、その実用化が切望されている。微生物を利用したＰＨＡ生産では、例えば、カプリアビダス属細菌に炭素源として糖、植物油脂や脂肪酸を与え、細胞内にＰＨＡを蓄積させることでＰＨＡを生産することが知られている（非特許文献２及び３を参照）。

【0004】

しかしながら、微生物を利用した物質生産においては、目的生産物の分離回収工程が煩雑となり、生産コストが高くなることが問題になるケースがある。従って、目的生産物の分離回収効率を向上させることは、生産コストの低減のための大きな課題である。

【0005】

非特許文献４には、カプリアビダス属細菌においてフェイシンタンパク質をコードする遺伝子ｐｈａＰ１を破壊することで、非破壊の場合より大粒子径のＰＨＡを蓄積したことが報告されており、これを目的生産物の分離回収効率を改善する方法として採用することが考えられる。しかし、該ｐｈａＰ１破壊株はＰＨＡ蓄積量が著しく減少することが示されており、工業生産に適したものではなかった。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0006】

【文献】Ａｎｄｅｒｓｏｎ ＡＪ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．，１２，１０２－１０５（１９９０）

【文献】Ｓａｔｏ Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．，１２０（３），２４６－２５１（２０１５）

【文献】Ｉｎｓｏｍｐｈｕｎ Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔａｂ．Ｅｎｇ．，２７，３８－４５（２０１５）

【文献】Ｐｏｔｔｅｒ Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１５１（Ｐｔ ３），８２５－８３３（２００５）

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

ＰＨＡは微生物細胞内において粒子状に蓄積される。微生物細胞内に蓄積されたＰＨＡを生分解性プラスチックとして利用するためには、細胞を破砕してＰＨＡ粒子を取り出し、他の細胞成分から分離し、回収する。分離回収の手法は、大きくは有機溶媒系による方法と水系による方法に分けられるが、有機溶媒の使用は高環境負荷、高コストとなるため、工業的には水系による方法が好ましい。水系による方法では、例えば、ＰＨＡ粒子を含む細胞破砕液から、遠心分離機や分離膜等によってＰＨＡ粒子を分離することができる。このような場合、分離回収の効率はＰＨＡ粒子の大きさに依存することになる。即ち、微生物細胞内に蓄積されたＰＨＡ粒子が大きいほど、遠心分離機や分離膜等を用いた分離回収を容易に実施でき、生産コストの低減につながる。

【0008】

本発明は、上記現状に鑑み、大粒子径のＰＨＡを蓄積可能な形質転換微生物、及び、当該形質転換微生物を用いたＰＨＡの製造方法を提供することを課題とする。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明者らは鋭意検討した結果、カプリアビダス属細菌において機能未知とされているＡ２３６５遺伝子（例えば配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子）の発現を強化することで、工業的に望ましいＰＨＡ蓄積量を維持しながら、微生物細胞内に蓄積されるＰＨＡの粒子径を拡大できることを見出し、本発明に至った。

【0010】

すなわち本発明は、ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子を有し、Ａ２３６５遺伝子の発現が強化された、形質転換微生物に関する。前記形質転換微生物は、カプリアビダス属に属することが好ましく、カプリアビダス・ネカトールの形質転換微生物であることがより好ましい。
また本発明は、前記形質転換微生物を、炭素源の存在下で培養する工程を含む、ポリヒドロキシアルカン酸の製造方法にも関する。炭素源は、油脂あるいは脂肪酸を含有してもよく、また、糖を含有してもよく、二酸化炭素を含有してもよい。ポリヒドロキシアルカン酸は、２種以上のヒドロキシアルカン酸の共重合体であることが好ましく、３－ヒドロキシヘキサン酸をモノマーユニットとして含有する共重合体であることがより好ましく、３－ヒドロキシ酪酸と３－ヒドロキシヘキサン酸との共重合体であることがさらに好ましい。

【発明の効果】

【0011】

本発明によれば、大粒子径のＰＨＡを蓄積可能な形質転換微生物、及び、当該形質転換微生物を用いたＰＨＡの製造方法を提供することができる。本発明によると、微生物細胞内に大粒子径のＰＨＡ粒子が蓄積されるため、細胞破砕後に細胞成分からのＰＨＡの分離回収が容易となり、生産コストの低減を実現することができる。

【発明を実施するための形態】

【0012】

以下、本発明の実施形態を詳細に説明する。
本発明に係る形質転換微生物は、ＰＨＡ合成酵素遺伝子を有し、Ａ２３６５遺伝子の発現が強化された、形質転換微生物である。

【0013】

（微生物）
本発明に係る形質転換微生物は、ＰＨＡ合成酵素遺伝子を有し、かつ、Ａ２３６５遺伝子の発現が強化されるように形質転換された微生物である（以下、Ａ２３６５遺伝子発現強化株ともいう）。本発明に係る形質転換微生物の宿主は、ＰＨＡ合成酵素遺伝子を有する微生物であれば特に限定されない。当該細菌としては、例えば、ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）属、カプリアビダス（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ）属、ワウテルシア（Ｗａｕｔｅｒｓｉａ）属、アエロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）属、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属等に属する細菌類が好ましい例として挙げられる。安全性及びＰＨＡ生産性の観点から、より好ましくはラルストニア属、カプリアビダス属、アエロモナス属、ワウテルシア属に属する細菌であり、さらに好ましくはカプリアビダス属又はアエロモナス属に属する細菌であり、さらにより好ましくはカプリアビダス属に属する微生物であり、特に好ましくはカプリアビダス・ネカトール（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ）である。

【0014】

本発明に係る形質転換微生物の宿主は、ＰＨＡ合成酵素遺伝子を本来的に有する野生株であってもよいし、そのような野生株を人工的に突然変異処理して得られる変異株や、あるいは、遺伝子工学的手法により外来のＰＨＡ合成酵素遺伝子が導入された菌株であってもよい。外来のＰＨＡ合成酵素遺伝子を導入する方法は特に限定されず、宿主の染色体上に遺伝子を直接挿入または置換する方法、宿主が保有するメガプラスミド上に遺伝子を直接挿入または置換する方法、あるいはプラスミド、ファージ、ファージミドなどのベクター上に遺伝子を配置して導入する方法などが選択でき、これらの方法のうち２つ以上を併用しても良い。導入遺伝子の安定性を考慮すると、好ましくは、宿主の染色体上または宿主が保有するメガプラスミド上に遺伝子を直接挿入または置換する方法であり、より好ましくは、宿主の染色体上に遺伝子を直接挿入または置換する方法である。

【0015】

（ＰＨＡ合成酵素遺伝子）
ＰＨＡ合成酵素遺伝子としては特に限定されないが、ラルストニア属、カプリアビダス属、ワウテルシア属、アルカリゲネス属、アエロモナス属、シュードモナス属、ノルカディア属、クロモバクテリウム属に類する生物に由来するＰＨＡ合成酵素遺伝子や、それらの改変体などが挙げられる。前記改変体としては、１以上のアミノ酸残基が欠失、付加、挿入、又は置換されたＰＨＡ合成酵素をコードする塩基配列などを用いることができる。例えば、配列番号２～６のいずれかに記載のアミノ酸配列で示されるポリペプチドをコードする塩基配列を有する遺伝子、及び、該アミノ酸配列に対して８５％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列で示され、かつＰＨＡ合成酵素活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列を有する遺伝子などが挙げられる。上記配列相同性としては好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、特に好ましくは９９％以上である。

【0016】

（ＰＨＡ）
本発明のＡ２３６５遺伝子発現強化株が生産するＰＨＡの種類としては、微生物が生産し得るＰＨＡである限り特に限定されないが、炭素数４～１６の３－ヒドロキシアルカン酸から選択される１種のモノマーの単独重合体、炭素数４～１６の３－ヒドロキシアルカン酸から選択される１種のモノマーとその他のヒドロキシアルカン酸（例えば、炭素数４～１６の２－ヒドロキシアルカン酸、４－ヒドロキシアルカン酸、５－ヒドロキシアルカン酸、６－ヒドロキシアルカン酸など）の共重合体、及び、炭素数４～１６の３－ヒドロキシアルカン酸から選択される２種以上のモノマーの共重合体が好ましい。例えば、３－ヒドロキシ酪酸（略称：３ＨＢ）のホモポリマーであるＰ（３ＨＢ）、３ＨＢと３－ヒドロキシ吉草酸（略称：３ＨＶ）の共重合体Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＶ）、３ＨＢと３－ヒドロキシヘキサン酸（略称：３ＨＨ）の共重合体Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨ）（略称：ＰＨＢＨ）、３ＨＢと４－ヒドロキシ酪酸（略称：４ＨＢ）の共重合体Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－４ＨＢ）、乳酸（略称：ＬＡ）を構成成分として含むＰＨＡ、例えば３ＨＢとＬＡの共重合体Ｐ（ＬＡ－ｃｏ－３ＨＢ）などが挙げられるが、これらに限定されない。この中でも、ポリマーとしての応用範囲が広いという観点から、ＰＨＢＨが好ましい。なお、生産されるＰＨＡの種類は、目的に応じて、使用する微生物の保有するあるいは別途導入されたＰＨＡ合成酵素遺伝子の種類や、その合成に関与する代謝系の遺伝子の種類、培養条件などによって適宜選択しうる。

【0017】

（Ａ２３６５遺伝子）
本発明で発現が強化されるＡ２３６５遺伝子は、配列番号１に記載のアミノ酸配列で示されるポリペプチド（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ ＩＤ Ｑ０Ｋ９６１）、及び、該アミノ酸配列に対して８５％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列で示されるポリペプチドをコードする塩基配列を有する遺伝子である。上記配列相同性としては好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、特に好ましくは９９％以上である。なお、Ａ２３６５遺伝子が有する機能は未だ報告されていない。

【0018】

（遺伝子発現強化）
本発明における遺伝子発現の強化とは、対象遺伝子の発現が強化されていない菌株と比較して、対象遺伝子の転写量または対象遺伝子のコードするポリペプチドの発現量が増加している状態を指す。その増加量は特に限定されないが、対象遺伝子の発現が強化されていない菌株と比較して１倍超であればよく、好ましくは１．１倍以上、より好ましくは１．２倍以上、さらに好ましくは１．５倍以上、さらにより好ましくは２倍以上の増加である。

【0019】

本発明において、Ａ２３６５遺伝子の発現を強化する方法は特に限定されないが、対象遺伝子を宿主に導入する方法、宿主がゲノムＤＮＡ上に元来有する対象遺伝子の発現量を増強する方法、またはその両方を選択することができる。

【0020】

対象遺伝子を宿主に導入する方法としては特に限定されないが、宿主の染色体上に対象遺伝子を直接挿入または置換する方法、宿主が保有するメガプラスミド上に対象遺伝子を直接挿入または置換する方法、あるいはプラスミド、ファージ、ファージミドなどのベクター上に対象遺伝子を配置して導入する方法などが選択でき、これらの方法のうち２つ以上を併用しても良い。

【0021】

導入遺伝子の安定性を考慮すると、好ましくは、宿主の染色体上または宿主が保有するメガプラスミド上に対象遺伝子を直接挿入または置換する方法であり、より好ましくは、宿主の染色体上に対象遺伝子を直接挿入または置換する方法である。導入する遺伝子を確実に発現させるために、対象遺伝子が、宿主が元来有する「遺伝子発現調節配列」の下流に位置するように導入するか、または、対象遺伝子が、外来の「遺伝子発現調節配列」の下流に位置する形で導入することが好ましい。本発明における「遺伝子発現調節配列」とは、その遺伝子の転写量を制御する塩基配列（例えばプロモーター配列）、及び／または、その遺伝子から転写されたメッセンジャーＲＮＡの翻訳量を調節する塩基配列（例えばシャイン・ダルガノ配列）を含むＤＮＡ配列である。「遺伝子発現調節配列」としては、自然界に存在する任意の塩基配列を利用することもできるし、人工的に構築または改変された塩基配列を利用しても良い。

【0022】

また、宿主がゲノムＤＮＡ上に元来有する対象遺伝子の発現量を増強する方法としては特に限定されないが、対象遺伝子の上流に位置する「遺伝子発現調節配列」を改変する方法、対象遺伝子の上流に外来の「遺伝子発現調節配列」を導入する方法、あるいは、対象遺伝子及び／またはその周辺の塩基配列を改変することにより、転写されたメッセンジャーＲＮＡの安定性を向上させる方法などが挙げられる。

【0023】

「遺伝子発現調節配列」に含まれるプロモーター配列やシャイン・ダルガノ配列としては、例えば、配列番号７～１３のいずれかに示される塩基配列、または、これら塩基配列の一部を含む塩基配列などが挙げられるが、特に限定されない。

【0024】

ゲノムＤＮＡの少なくとも一部の置換、欠失、挿入及び／又は付加は、当業者に周知の方法により行うことができる。代表的な方法としてはトランスポゾンと相同組換えの機構を利用した方法（Ohman et al., J. Bacteriol., 162:1068-1074 (1985)）や、相同組換えの機構によって起こる部位特異的な組み込みと第二段階の相同組換えによる脱落を原理とした方法（Noti et al., Methods Enzymol., 154:197-217 (1987)）などがある。また、Bacillus subtilis由来のsacB遺伝子を共存させて、第二段階の相同組換えによって遺伝子が脱落した微生物株をスクロース耐性株として容易に単離する方法（Schweizer, Mol. Microbiol., 6:1195-1204 (1992)、Lenz et al., J. Bacteriol., 176:4385-4393 (1994)）も利用することができる。さらに別の方法として、標的ＤＮＡを改変するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムによるゲノム編集技術（Y. Wang et al., ACS Synth Biol. 2016, 5(7):721-732）も利用することができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムでは、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は改変すべきゲノムＤＮＡの塩基配列の一部に結合しうる配列を有しており、Ｃａｓ９を標的に運ぶ役割をもつ。

【0025】

細胞へのベクターの導入方法としても特に限定されないが、例えば、塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法、ポリエチレングリコール法、スフェロプラスト法等が挙げられる。

【0026】

本発明のＡ２３６５遺伝子発現強化株を培養することで、菌体内にＰＨＡを蓄積させることができる。本発明のＡ２３６５遺伝子発現強化株を培養する方法としては、常法の微生物培養法に従うことができ、適切な炭素源が存在する培地中で培養を行なえばよい。培地組成、炭素源の添加方法、培養スケール、通気攪拌条件や、培養温度、培養時間などは特に限定されない。炭素源は、連続的に、または間欠的に培地に添加することが好ましい。

【0027】

培養時の炭素源としては、本発明のＡ２３６５遺伝子発現強化株が資化可能であればどのような炭素源でも使用可能である。特に限定されないが、例えば、グルコース、フルクトース、シュークロースなどの糖類；パーム油やパーム核油（これらを分別した低融点分画であるパームオレイン、パームダブルオレイン、パーム核油オレインなども含む）、コーン油、やし油、オリーブ油、大豆油、菜種油、ヤトロファ油などの油脂やその分画油類、あるいはその精製副産物；ラウリン酸、オレイン酸、ステアリン酸、パルミチン酸、ミリンスチン酸などの脂肪酸やそれらの誘導体、あるいはグリセロール等が挙げられる。また、本発明のＡ２３６５遺伝子発現強化株が二酸化炭素、一酸化炭素、メタン、メタノール、エタノールなどのガスやアルコール類を利用可能である場合、これらを炭素源として使用することもできる。

【0028】

本発明におけるＰＨＡの製造では、上記炭素源、炭素源以外の栄養源である窒素源、無機塩類、その他の有機栄養源を含む培地を用いて、前記微生物を培養することが好ましい。下記に限定されないが、窒素源としては、例えば、アンモニア；塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩；ペプトン、肉エキス、酵母エキス等が挙げられる。無機塩類としては、例えば、リン酸２水素カリウム、リン酸水素２ナトリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム等が挙げられる。その他の有機栄養源としては、例えば、グリシン、アラニン、セリン、スレオニン、プロリン等のアミノ酸、ビタミンＢ１、ビタミンＢ１２、ビタミンＣ等のビタミン等が挙げられる。

【0029】

培養を適切な時間行なって菌体内にＰＨＡを蓄積させた後、周知の方法を用いて菌体からＰＨＡを回収する。回収方法については特に限定されないが、例えば、培養終了後、培養液から遠心分離機等で菌体を分離し、乾燥させた後、乾燥菌体から、クロロホルム等の有機溶剤を用いてＰＨＡを抽出し、このＰＨＡを含んだ有機溶剤溶液から濾過等によって細胞成分を除去し、その濾液にメタノールやヘキサン等の貧溶媒を加えてＰＨＡを沈殿させ、濾過や遠心分離によって上澄み液を除去し、乾燥させてＰＨＡを回収することができる。また、界面活性剤やアルカリ、酵素などを用いてＰＨＡ以外の細胞成分を水に溶解させた後、濾過や遠心分離によってＰＨＡ粒子を水相から分離し乾燥させて回収することもできる。本発明により製造され得る大粒径のＰＨＡは、このような水系による分離回収が容易に実施できるため好ましい。

【実施例】

【0030】

以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明は、これら実施例に限定されるものではない。なお全体的な遺伝子操作は、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ （１９８９））に記載されているように行うことができる。また、遺伝子操作に使用する酵素、クローニング宿主等は、市場の供給者から購入し、その説明に従い使用することができる。なお、酵素としては、遺伝子操作に使用できるものであれば特に限定されない。

【0031】

（製造例）Ａ２３６５遺伝子発現強化株の作製
まず、Ａ２３６５遺伝子発現用プラスミドｐＣＵＰ２－ｔｒｃ－Ａ２３６５の作製を行った。作製は以下のように行った。

【0032】

合成オリゴＤＮＡを用いたＰＣＲにより、カプリアビダス・ネカトールＨ１６株のゲノムＤＮＡを鋳型として、Ａ２３６５遺伝子配列を有するＤＮＡ断片（配列番号１４）を得た。このＤＮＡ断片を制限酵素ＭｕｎＩおよびＳｐｅＩで消化し、得られたＤＮＡ断片を、国際公開２００７／０４９７１６号に記載のプラスミドベクターｐＣＵＰ２をＭｕｎＩおよびＳｐｅＩで切断したものと連結して、プラスミドベクターｐＣＵＰ２－Ａ２３６５を得た。

【0033】

さらに、合成オリゴＤＮＡを用いたＰＣＲにより、大腸菌に由来するプロモーター配列を有するＤＮＡ断片（配列番号１５）を得た。このＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＭｕｎＩで消化し、得られたＤＮＡ断片を、プラスミドベクターｐＣＵＰ２－Ａ２３６５をＭｕｎＩで切断したものと連結した。得られたプラスミドベクターから、Ａ２３６５遺伝子配列がプロモーター配列の下流側に位置する向きで連結されたプラスミドベクターを選別し、Ａ２３６５遺伝子発現用プラスミドベクターｐＣＵＰ２－ｔｒｃ－Ａ２３６５とした。

【0034】

次に、Ａ２３６５遺伝子発現用プラスミドベクターｐＣＵＰ２－ｔｒｃ－Ａ２３６５をＫＮＫ－００５株に導入して、Ａ２３６５遺伝子発現強化株を得た。ＫＮＫ００５株は、カプリアビダス・ネカトールＨ１６株の染色体上にアエロモナス・キャビエ由来のＰＨＡ合成酵素遺伝子（配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子）が導入された形質転換体であり、米国特許第７３８４７６６号明細書に記載の方法に準じて作成することができる。

【0035】

プラスミドベクターの細胞への導入は以下のように電気導入によって行った。遺伝子導入装置はＢｉｏｒａｄ社製のジーンパルサーを用い、キュベットは同じくＢｉｏｒａｄ社製のｇａｐ０．２ｃｍを用いた。キュベットに、コンピテント細胞４００μｌと発現ベクター２０μｌを注入してパルス装置にセットし、静電容量２５μＦ、電圧１．５ｋＶ、抵抗値８００Ωの条件で電気パルスをかけた。パルス後、キュベット内の菌液をＮｕｔｒｉｅｎｔＢｒｏｔｈ培地（ＤＩＦＣＯ社製）で３０℃、３時間振とう培養し、選択プレート（ＮｕｔｒｉｅｎｔＡｇａｒ培地（ＤＩＦＣＯ社製）、カナマイシン１００ｍｇ／Ｌ）で、３０℃にて２日間培養して、生育してきたＡ２３６５遺伝子発現強化株を取得した。

【0036】

（比較例）ＫＮＫ－００５株によるＰＨＡ生産
下記の条件でＫＮＫ－００５株を用いた培養検討を行なった。

【0037】

（培地）
種母培地の組成は１ｗ／ｖ％ Ｍｅａｔ－ｅｘｔｒａｃｔ、１ｗ／ｖ％ Ｂａｃｔｏ－Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、０．２ｗ／ｖ％ Ｙｅａｓｔ－ｅｘｔｒａｃｔ、０．９ｗ／ｖ％ Ｎａ_２ＨＰＯ_４・１２Ｈ_２Ｏ 、０．１５ｗ／ｖ％ ＫＨ_２ＰＯ_４、（ｐＨ６．８）とした。

【0038】

前培養培地の組成は１．１ｗ／ｖ％ Ｎａ_２ＨＰＯ_４・１２Ｈ_２Ｏ、０．１９ｗ／ｖ％ＫＨ_２ＰＯ_４、１．２９ ｗ／ｖ％（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４ 、０．１ｗ／ｖ％ ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、２．５ｗ／ｖ％ パームオレインオイル、０．５ｖ／ｖ％ 微量金属塩溶液（０．１Ｎ塩酸に１．６ｗ／ｖ％ ＦｅＣｌ_３・６Ｈ_２Ｏ、１ｗ／ｖ％ ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ、０．０２ｗ／ｖ％ ＣｏＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ、０．０１６ｗ／ｖ％ ＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ、０．０１２ｗ／ｖ％ ＮｉＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏを溶かしたもの）とした。炭素源としてパームオレインオイルを１０ｇ／Ｌの濃度で一括添加した。

【0039】

ＰＨＡ生産培地の組成は０．３８５ｗ／ｖ％ Ｎａ_２ＨＰＯ_４・１２Ｈ_２Ｏ、０．０６７ｗ／ｖ％ ＫＨ_２ＰＯ_４、０．２９１ｗ／ｖ％（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、０．１ｗ／ｖ％ ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、０．５ｖ／ｖ％ 微量金属塩溶液（０．１Ｎ塩酸に１．６ｗ／ｖ％ ＦｅＣｌ_３・６Ｈ_２Ｏ、１ｗ／ｖ％ ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ、０．０２ｗ／ｖ％ ＣｏＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ、０．０１６ｗ／ｖ％ ＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ、０．０１２ｗ／ｖ％ ＮｉＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏを溶かしたもの）とした。

【0040】

（ＰＨＡ蓄積量割合の測定方法）
ＰＨＡ蓄積量の割合は次のように測定した。遠心分離によって培養液から菌体を回収、エタノールで洗浄、凍結乾燥し、乾燥菌体を取得し、重量を測定した。得られた乾燥菌体１ｇに１００ｍｌのクロロホルムを加え、室温で一昼夜攪拌して、菌体内のＰＨＡを抽出した。菌体残渣をろ別後、エバポレーターで総容量が３０ｍｌになるまで濃縮後、９０ｍｌのヘキサンを徐々に加え、ゆっくり攪拌しながら、１時間放置した。析出したＰＨＡをろ別後、５０℃で３時間真空乾燥した。乾燥ＰＨＡの重量を測定し、乾燥菌体量に対してＰＨＡ蓄積量が占める割合を算出した。

【0041】

（ＰＨＡ粒子径の測定方法）
ＰＨＡ粒子径は次のように測定した。培養後の培養液を６５℃で６０分間処理し、菌体細胞不活化を行った後、３．３ｗ／ｖ％ ドデシル硫酸ナトリウム水溶液により１５０倍に希釈し、超音波破砕によりＰＨＡ抽出液を得た。超音波破砕にはＳＭＴ社製超音波分散機ＵＨ?６００を用い、最大出力で４０秒、４回の処理を行った。得られたＰＨＡ抽出液をレーザー回折・散乱式粒子径分布測定装置（Ｍｉｃｒｏｔｒａｃ ＭＴ３３００ＥＸＩＩ）により解析し、ＰＨＡ粒子の体積平均径（ＭＶ）を測定した。測定は標準的な設定（粒子透過性：透過、粒子屈折率：１．８１、粒子形状：非球形、溶媒屈折率：１．３３３）で行った。

【0042】

（ＰＨＡ生産培養）
ＰＨＡ生産培養は次のように行った。まず、ＫＮＫ－００５株のグリセロールストック（５０μｌ）を種母培地（１０ｍｌ）に接種して２４時間培養し種母培養を行なった。次に種母培養液を、１．８Ｌの前培養培地を入れた３Ｌジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ製ＭＤＬ－３００型）に１．０ｖ／ｖ％接種した。運転条件は、培養温度３３℃、攪拌速度５００ｒｐｍ、通気量１．８Ｌ／ｍｉｎとし、ｐＨは６．７～６．８の間でコントロールしながら２８時間培養し、前培養を行なった。ｐＨコントロールには１４％水酸化アンモニウム水溶液を使用した。

【0043】

次に、前培養液を、２．５ＬのＰＨＡ生産培地を入れた５Ｌジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ製ＭＤＳ－Ｕ５０型）に５．０ｖ／ｖ％接種した。運転条件は、培養温度３３℃、攪拌速度４２０ｒｐｍ、通気量２．１Ｌ／ｍｉｎとし、ｐＨは６．７～６．８の間でコントロールした。ｐＨコントロールには２５％水酸化アンモニウム水溶液を使用した。炭素源は断続的に添加した。炭素源としてはパームオレインオイルを使用した。培養は、乾燥菌体量に対するＰＨＡ蓄積量の割合が９０％程度に達するまで行った。ＰＨＡ蓄積量の割合およびＰＨＡ粒子径は前述のように測定した。結果を表１に示す。

【0044】

（実施例）Ａ２３６５遺伝子発現強化株によるＰＨＡ生産
比較例と同様の条件でＡ２３６５遺伝子発現強化株を用いた培養検討を行なった。ＰＨＡ蓄積量の割合およびＰＨＡ粒子径の測定結果を表１に示す。

【0045】

培養検討の結果、Ａ２３６５遺伝子発現強化株によって生産されたＰＨＡの粒子径は、Ａ２３６５遺伝子の発現を強化していない株（ＫＮＫ－００５株）によって生産されたＰＨＡの粒子径と比較して、増大が認められた。

【0046】

なお、比較例および実施例の培養検討によって生産されたＰＨＡはＰＨＢＨであることをＨＰＬＣ分析にて確認した。

【0047】

【表1】

【配列表】

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