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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-01-24
(45)【発行日】2024-02-01
(54)【発明の名称】ヌクレオチド配列の増幅方法及び配列決定方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/686 20180101AFI20240125BHJP
C12Q 1/6869 20180101ALI20240125BHJP
C12Q 1/6876 20180101ALI20240125BHJP
C12N 15/11 20060101ALN20240125BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/686 Z ZNA
C12Q1/6869 Z
C12Q1/6876 Z
C12N15/11 Z
【請求項の数】
5
(21)【出願番号】P 2021540769
(86)(22)【出願日】2020-08-14
(86)【国際出願番号】 JP2020030907
(87)【国際公開番号】W WO2021033648
(87)【国際公開日】2021-02-25
【審査請求日】2022-10-26
(31)【優先権主張番号】P 2019150535
(32)【優先日】2019-08-20
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】591222245
【氏名又は名称】国立感染症研究所長
(73)【特許権者】
【識別番号】503335179
【氏名又は名称】株式会社ファスマック
(74)【代理人】
【識別番号】110001047
【氏名又は名称】弁理士法人セントクレスト国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】斎藤 益満
(72)【発明者】
【氏名】百瀬 暖佳
(72)【発明者】
【氏名】和田 悠作
(72)【発明者】
【氏名】松平 崇弘
【審査官】西 賢二
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１５／１１１２０９（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特開２００４－２７５０３７（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２００６－１６６９０７（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２００２－５０２６０５（ＪＰ，Ａ）
【文献】LIU, Taian et al.，A tailing genome walking method suitable for genomes with high local GC content，Anal. Biochem.，2013年，Vol. 441，pp. 101-103
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｑ １／６８－１／６８９７
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）
ＰｕｂＭｅｄ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ヌクレオチド鎖中の特定配列に隣接する配列を増幅する方法であって、下記工程（１）～（６）を含み、（１）前記特定配列に第１のフォワードプライマーがアニールし、該プライマーを起点として伸長反応を行ない、前記隣接配列に対する相補的な配列を３’末端に含む相補鎖を合成する工程、
（２）工程（１）にて得られた相補鎖の３’末端に、第１のデオキシヌクレオチドを重合的に付加する工程、
（３）工程（２）にて付加された第１のデオキシヌクレオチドからなるポリデオキシヌクレオチド鎖の３’末端に、更に第２のデオキシヌクレオチドを重合的に付加する工程、
（４）工程（３）にて形成された１本鎖ＤＮＡ中の、前記相補鎖の３’末端と前記ポリデオキシヌクレオチド鎖との結合部位に、第１のリバースプライマーをアニールし、該プライマーを起点として伸長反応を行ない、２本鎖ＤＮＡを合成する工程、
（５）工程（４）にて合成された２本鎖ＤＮＡを鋳型とし、前記特定配列に対して相補的な第２のフォワードプライマーと、第１のリバースプライマーとを用いるポリメラーゼ連鎖反応を行なう工程、
（６）工程（５）にて得られた増幅産物を鋳型とし、前記特定配列に対して相補的な第３のフォワードプライマーと、第２のリバースプライマーとを用いるポリメラーゼ連鎖反応を更に行なう工程、
第２のフォワードプライマーは、特定配列において第１のフォワードプライマーよりも隣接配列により近く位置し、
第３のフォワードプライマーは、特定配列において第２のフォワードプライマーよりも隣接配列により近く位置し、
第１のリバースプライマーは、５’末端から順に、アダプタープライマー配列及び第３のデオキシヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーであり、
第２のリバースプライマーは、アダプタープライマー配列を３’末端に含むプライマーであり、
第１～３のデオキシヌクレオチドは、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシシチジン及びデオキシチミジンからなる４種から各々選択される１のデオキシヌクレオチドであり、
第２のデオキシヌクレオチドは、第１のデオキシヌクレオチドとは異なるデオキシヌクレオチドであり、
第３のデオキシヌクレオチドは、第１のデオキシヌクレオチドに対して相補的なデオキシヌクレオチドであり、かつ
アダプタープライマー配列は、第１のポリデオキシヌクレオチド鎖の３’末端に付加される第２のデオキシヌクレオチドからなるポリデオキシヌクレオチド鎖に対して相補的な配列ではない、方法。
【請求項2】
ヌクレオチド鎖中の特定配列に隣接する配列を決定する方法であって、請求項１に記載の方法により前記隣接配列を増幅する工程と、
増幅された隣接配列のシーケンス解析を行なう工程とを、含む方法。
【請求項3】
第１のリバースプライマーは、５’末端から順に、アダプタープライマー配列、第３のデオキシヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド、第４のデオキシヌクレオチド及び第５のデオキシヌクレオチドを含むプライマーであり、第４のデオキシヌクレオチドは、第３のデオキシヌクレオチド以外の３種からランダムに選択されるデオキシヌクレオチドであり、かつ
第５のデオキシヌクレオチドは、前記４種からランダムに選択されるデオキシヌクレオチドである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
前記特定配列は、ＤＮＡ鎖中に挿入されている外来遺伝子に由来する配列であり、前記隣接配列は、前記ＤＮＡ鎖中に挿入された外来遺伝子挿入に隣接するホストゲノム由来の配列である、請求項１～３のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
請求項１～４のうちのいずれか一項に記載の方法に用いられるためのキットであって、第１のフォワードプライマー、第２のフォワードプライマー、第３のフォワードプライマー、第１のリバースプライマー及び第２のリバースプライマーを含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ヌクレオチド配列の増幅方法及び配列決定方法に関する。より詳しくは、特定の配列に隣接する配列を増幅する方法、及びその配列を決定する方法に関し、例えば、ホストゲノムに挿入された外来ＤＮＡ（特定配列）の挿入部位の配列（隣接配列）を増幅し、その配列を決定する方法に関する。また例えば、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）等をコードするＲＮＡにおいて、定常領域の配列（特定配列）に隣接する可変領域の配列（隣接配列）を増幅し、その配列を決定する方法に関する。さらに、本発明はこれら方法を実施するためのキットに関する。
【背景技術】
【0002】
レトロウイルスベクターやレンチウイルスベクターを用いた遺伝子治療は、既に多くの実績を挙げており、更なる研究開発、臨床試験が多々進行中である。しかしながら、この治療方法においては、治療対象の染色体（ホストゲノム）上の意図しない位置にウイルスベクターが組み込まれることがある。この挿入が、癌遺伝子近傍や癌抑制遺伝子内に入るとがん化する恐れがある。レトロウイルスベクターを使用した先天性免疫不全症に対して行われた造血幹細胞を標的とする遺伝子治療の例でいうと、有効性が確認されている一方、９２人中１１人が白血病を発症しており、内１人が死亡するという事例がある。そのため、かかる遺伝子治療においては、安全性確保策として１５年間の被験者フォローが求められている。
【0003】
また、近年の遺伝子改変技術はゲノム編集の台頭に伴い加速的に発展している。しかしながら、標的部位に相同な配列間に外来ＤＮＡ等を挟んだものを導入し、相同組換えによって部位特異的に当該ＤＮＡ等を挿入するゲノム編集技術（所謂、ＳＤＮ－３）では、意図しない部位への前記ＤＮＡ等の導入（オフターゲット変異）が生じる等の問題があり、医療分野での利用には特に慎重を期すものである。
【0004】
そして、ＨＴＬＶ－１等のウイルスが関連する疾患においても、ホストゲノムへの挿入部位と病態との関連性が示唆されている。例えば、キャリアでは元々転写が不活性化されているゲノム領域にウイルス由来のＤＮＡが組み込まれている頻度が高い一方で、ウイルス関連疾患（ＡＴＬ等）の患者では、当該ＤＮＡが転写開始点近傍に組み込まれていることが知られている。そのため、ウイルス関連疾患の発症リスクを有効かつ適切に判定するにあたって、ホストゲノムへの挿入位置を適切に同定することは極めて重要である。
【0005】
このように、ウイルスベクターやゲノム編集技術を用いた遺伝子治療、ゲノム編集等による遺伝子改変技術、更にはウイルス関連疾患において、外来ＤＮＡのホストゲノム上への挿入部位を同定することが希求されている。
【0006】
しかしながら、外来ＤＮＡのホストゲノム上への挿入部位、特にランダムインテグレーションの位置は不明であり、その同定は難しい。原始的な方法としては全ゲノムを対象としたメイトペアシーケンスが挙げられるが、この方法は選択性がないため低感度であり、費用面で問題がある。また、外来ＤＮＡ挿入部位近傍のＤＮＡ配列の同定に関し、様々な方法が開発されており、例えば、ゲノムＤＮＡを断片化してライゲーションにより環状化し、外来ＤＮＡ特異的なオリゴヌクレオチドによりインバースＰＣＲを行う手法、その他Ｔａｉｌ－ＰＣＲ、ＬＡＭ－ＰＣＲ、ｎｒＬＡＭ－ＰＣＲ（特許文献１、非特許文献１）等が挙げられる。しかしながら、所要時間、操作性、効率、感度、費用の点において、不十分なものであった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0007】
【文献】国際公開第２０１２／１３８５４９号
【非特許文献】
【0008】
【文献】Ｐａｒｕｚｙｎｓｋｉ Ａ．ら、Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．、２０１０年８月、５巻、８号、１３７９～１３９５ページ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
本発明は、前記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、特定の配列に隣接する配列を増幅する方法を可能とする方法を提供することを目的とする。例えば、本発明は、ホストゲノムに挿入された外来ＤＮＡ（特定の配列）の挿入部位の配列（特定配列に隣接する配列）の増幅を可能とする方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明者らは、前記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、図１に示すような工程１～６を含む方法によって、ＤＮＡ鎖中の特定の配列に隣接する配列を増幅できることを見出した。
【0011】
従来の方法の中で最も所要時間が短いｎｒＬＡＭ－ＰＣＲにおいては、例えば非特許文献１に記載のとおり、特定の配列に隣接する配列の増幅産物を得るために３０時間以上も要する（非特許文献１、第１３９２ページ、「ＴＩＭＩＮＧ」において、Ｓｔｅｐｓ １－３，Ｌｉｎｅａｒ ＰＣＲ～Ｓｔｅｐｓ ３２ ａｎｄ ３３，Ｓｅｃｏｎｄ ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ＰＣＲ迄の累積時間は３２．５時間となっている）。しかしながら、前記方法によれば、図２に示すとおり約３時間で得ることができ、所要時間が短く、高効率性を有する。
【0012】
また、ｎｒＬＡＭ－ＰＣＲにおいては、例えば特許文献１及び非特許文献１に記載のとおり、精製工程においてビオチン及びストレプトアビジン等のヌクレオチド以外の物質を要し、コストがかかる。一方、前記方法においてはヌクレオチドのみからなるプライマーがあれば良いため、コストの上でも優れている。
【0013】
さらに、非特許文献１に記載のとおり、ｎｒＬＡＭ－ＰＣＲにおいてはリンカーライゲーション反応は１００％進行するわけではないため、感度が低い（非特許文献１、第１３７９ページ、右欄、第２４～２７行 参照）。一方、前記方法によれば、後述の実施例に示すとおり、ＨＴＬＶ－１が１コピー挿入された感染細胞のゲノムＤＮＡと非感染細胞のゲノムＤＮＡとを、所定のプロウイルス量になるように調整して混合したものを解析した場合に、プロウイルス量が０．０３２％という極僅かであっても特異的な増幅産物を得ることができ、感度高く隣接配列を検出できる。
【0014】
また、前記方法によれば、ＨＴＬＶ－１に限らず、ＨＩＶ－１、ＳＩＶ、ＨＢＶ及びアデノウイルスが各々挿入されたゲノムＤＮＡ、ゲノム編集においてオフターゲットが生じている細胞のゲノムＤＮＡ、遺伝子組換え植物細胞のゲノムＤＮＡのいずれにおいても、各外来ＤＮＡの挿入部位を特異的に増幅することができ、汎用性が高い。
【0015】
さらに、ＨＴＬＶ－１キャリア３検体のゲノムＤＮＡを用いて、独立して２回反応させ解析した場合でも、同様の増幅産物を得ることができ、再現性が高い。
【0016】
また、図１に示すような工程１～６を含む方法によれば、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）等をコードするＲＮＡ鎖において、定常領域の配列（特定配列）に隣接する可変領域の配列（隣接配列）を増幅し、その配列を決定できる。すなわち、ＤＮＡ鎖、ＲＮＡ鎖を問わず、当該ヌクレオチド鎖中の特定の配列に隣接する配列を増幅できる。
【0017】
本発明は、上記結果に基づくものであり、特定の配列に隣接する配列を増幅する方法、及びその配列を決定する方法に関する。また、本発明はこれら方法を実施するためのキットに関し、より具体的には以下の発明に関する。
＜１＞ ヌクレオチド鎖中の特定配列に隣接する配列を増幅する方法であって、下記工程（１）～（６）を含み、
（１）前記特定配列に第１のフォワードプライマーがアニールし、該プライマーを起点として伸長反応を行ない、前記隣接配列に対する相補的な配列を３’末端に含む相補鎖を合成する工程、
（２）工程（１）にて得られた相補鎖の３’末端に、第１のデオキシヌクレオチドを重合的に付加する工程、
（３）工程（２）にて付加された第１のデオキシヌクレオチドからなるポリデオキシヌクレオチド鎖の３’末端に、更に第２のデオキシヌクレオチドを重合的に付加する工程、
（４）工程（３）にて形成された１本鎖ＤＮＡ中の、前記相補鎖の３’末端と前記ポリデオキシヌクレオチド鎖との結合部位に、第１のリバースプライマーをアニールし、該プライマーを起点として伸長反応を行ない、２本鎖ＤＮＡを合成する工程、
（５）工程（４）にて合成された２本鎖ＤＮＡを鋳型とし、前記特定配列に対して相補的な第２のフォワードプライマーと、第１のリバースプライマーとを用いるポリメラーゼ連鎖反応を行なう工程、
（６）工程（５）にて得られた増幅産物を鋳型とし、前記特定配列に対して相補的な第３のフォワードプライマーと、第２のリバースプライマーとを用いるポリメラーゼ連鎖反応を更に行なう工程、
第２のフォワードプライマーは、特定配列において第１のフォワードプライマーよりも隣接配列により近く位置し、
第３のフォワードプライマーは、特定配列において第２のフォワードプライマーよりも隣接配列により近く位置し、
第１のリバースプライマーは、５’末端から順に、アダプタープライマー配列及び第３のデオキシヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーであり、
第２のリバースプライマーは、アダプタープライマー配列を３’末端に含むプライマーであり、
第１～３のデオキシヌクレオチドは、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシシチジン及びデオキシチミジンからなる４種から各々選択される１のデオキシヌクレオチドであり、
第２のデオキシヌクレオチドは、第１のデオキシヌクレオチドとは異なるデオキシヌクレオチドであり、かつ
第３のデオキシヌクレオチドは、第１のデオキシヌクレオチドに対して相補的なデオキシヌクレオチドである、方法。
＜２＞ ヌクレオチド鎖中の特定配列に隣接する配列を決定する方法であって、
＜１＞に記載の方法により前記隣接配列を増幅する工程と、
増幅された隣接配列のシーケンス解析を行なう工程とを、含む方法。
＜３＞ 第１のリバースプライマーは、５’末端から順に、アダプタープライマー配列、第３のデオキシヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド、第４のデオキシヌクレオチド及び第５のデオキシヌクレオチドを含むプライマーであり、
第４のデオキシヌクレオチドは、第３のデオキシヌクレオチド以外の３種からランダムに選択されるデオキシヌクレオチドであり、かつ
第５のデオキシヌクレオチドは、前記４種からランダムに選択されるデオキシヌクレオチドである、＜１＞又は＜２＞に記載の方法。
＜４＞ 前記特定配列は、ＤＮＡ鎖中に挿入されている外来遺伝子に由来する配列であり、前記隣接配列は、前記ＤＮＡ鎖中に挿入された外来遺伝子挿入に隣接するホストゲノム由来の配列である、＜１＞～＜３＞のうちのいずれか一項に記載の方法。
＜５＞ ＜１＞～＜４＞のうちのいずれか一項に記載の方法に用いられるためのキットであって、
第１のフォワードプライマー、第２のフォワードプライマー、第３のフォワードプライマー、第１のリバースプライマー及び第２のリバースプライマーを含む、キット。
＜１＞ ヌクレオチド鎖中の特定配列に隣接する配列を増幅する方法であって、下記工程（１）～（６）を含み、
（１）前記特定配列に第１のフォワードプライマーがアニールし、該プライマーを起点として伸長反応を行ない、前記隣接配列に対する相補的な配列を３’末端に含む相補鎖を合成する工程、
（２）工程（１）にて得られた相補鎖の３’末端に、第１のデオキシヌクレオチドを重合的に付加する工程、
（３）工程（２）にて付加された第１のデオキシヌクレオチドからなるポリデオキシヌクレオチド鎖の３’末端に、更に第２のデオキシヌクレオチドを重合的に付加する工程、
（４）工程（３）にて形成された１本鎖ＤＮＡ中の、前記相補鎖の３’末端と前記ポリデオキシヌクレオチド鎖との結合部位に、第１のリバースプライマーをアニールし、該プライマーを起点として伸長反応を行ない、２本鎖ＤＮＡを合成する工程、
（５）工程（４）にて合成された２本鎖ＤＮＡを鋳型とし、前記特定配列に対して相補的な第２のフォワードプライマーと、第１のリバースプライマーとを用いるポリメラーゼ連鎖反応を行なう工程、
（６）工程（５）にて得られた増幅産物を鋳型とし、前記特定配列に対して相補的な第３のフォワードプライマーと、第２のリバースプライマーとを用いるポリメラーゼ連鎖反応を更に行なう工程、
第２のフォワードプライマーは、特定配列において第１のフォワードプライマーよりも隣接配列により近く位置し、
第３のフォワードプライマーは、特定配列において第２のフォワードプライマーよりも隣接配列により近く位置し、
第１のリバースプライマーは、５’末端から順に、アダプタープライマー配列及び第３のデオキシヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーであり、
第２のリバースプライマーは、アダプタープライマー配列を３’末端に含むプライマーであり、
第１～３のデオキシヌクレオチドは、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシシチジン及びデオキシチミジンからなる４種から各々選択される１のデオキシヌクレオチドであり、
第２のデオキシヌクレオチドは、第１のデオキシヌクレオチドとは異なるデオキシヌクレオチドであり、かつ
第３のデオキシヌクレオチドは、第１のデオキシヌクレオチドに対して相補的なデオキシヌクレオチドである、方法。
＜２＞ ヌクレオチド鎖中の特定配列に隣接する配列を決定する方法であって、
＜１＞に記載の方法により前記隣接配列を増幅する工程と、
増幅された隣接配列のシーケンス解析を行なう工程とを、含む方法。
＜３＞ 第１のリバースプライマーは、５’末端から順に、アダプタープライマー配列、第３のデオキシヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド、第４のデオキシヌクレオチド及び第５のデオキシヌクレオチドを含むプライマーであり、
第４のデオキシヌクレオチドは、第３のデオキシヌクレオチド以外の３種からランダムに選択されるデオキシヌクレオチドであり、かつ
第５のデオキシヌクレオチドは、前記４種からランダムに選択されるデオキシヌクレオチドである、＜１＞又は＜２＞に記載の方法。
＜４＞ 前記特定配列は、ＤＮＡ鎖中に挿入されている外来遺伝子に由来する配列であり、前記隣接配列は、前記ＤＮＡ鎖中に挿入された外来遺伝子挿入に隣接するホストゲノム由来の配列である、＜１＞～＜３＞のうちのいずれか一項に記載の方法。
＜５＞ ＜１＞～＜４＞のうちのいずれか一項に記載の方法に用いられるためのキットであって、
第１のフォワードプライマー、第２のフォワードプライマー、第３のフォワードプライマー、第１のリバースプライマー及び第２のリバースプライマーを含む、キット。
【発明の効果】
【0018】
本発明によれば、短時間に効率良く、感度高く、低コストで、汎用性高く、また再現性良く、特定の配列に隣接する配列を増幅し、更にはその配列を決定することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【0019】
【図1】本発明の特定配列に隣接する配列を増幅する方法、及びその配列を決定する方法の一実施態様を示す、概略図である。
【図2】本発明の特定配列に隣接する配列を増幅する方法の実施における、各工程の所要時間の一例を示す、図である。
【図3】ＨＴＬＶ－１が１コピー挿入された感染細胞（ＴＬ－Ｏｍ１）のゲノムＤＮＡと、非感染細胞（Ｊｕｒｋａｔ）のゲノムＤＮＡとを、図中に示す各プロウイルス量（ＰＶＬ）になるように調整して混合したものを、本発明の方法により解析した結果を示す、ゲル電気泳動の写真である。
【図4】ＨＴＬＶ－１、ＨＩＶ－１、ＳＩＶ、ＨＢＶ及びアデノウイルスが各々挿入された生体試料及び感染細胞のゲノムＤＮＡ、ゲノム編集によってＬｏｘｐ配列が挿入されたマウス（ｉｄｌｒ－ｍＬＯ－４、ｉｄｌｒ－ｍＬＯ－５）のゲノムＤＮＡ、並びに遺伝子組換え植物（Ｂｔ１７６）のゲノムＤＮＡを、本発明の方法により解析した結果を示す、ゲル電気泳動の写真である。
【図5】ＨＴＬＶ－１キャリア３検体のゲノムＤＮＡ（図中、ＡＣ１～３）に関し本発明の方法により、ＨＴＬＶ－１挿入部位の増幅を独立して２回行った結果を示す、ゲル電気泳動の写真である。
【図6】デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）添加又は非添加にて、本発明にかかる工程２及び３（相補鎖３’末端のデオキシヌクレオチドの重合的付加）を行ない、工程５（第１のＰＣＲ）にて得られる増幅産物を、アガロースゲル電気泳動にて解析した結果を示す、ゲル電気泳動の写真である。
【図7】本発明において、第１のリバースプライマーについて、第４、第５のヌクレオチドを含むもの（Ｏｌｉｇｏ－ｄＴ－ＡＤ２）、第５のヌクレオチドを含まないもの（Ｏｌｉｇｏ－ｄＴ－ＡＤ３）、第４、第５のヌクレオチドを含まないもの（Ｏｌｉｇｏ－ｄＴ－ＡＤ４）を各々用い、工程４（２本鎖ＤＮＡの合成）を実施し、工程６（第２のＰＣＲ）にて得られる増幅産物を、アガロースゲル電気泳動にて解析した結果を示す、ゲル電気泳動の写真である。図中、各レーンに付記した破線（補助線）は、増幅産物の平均長の位置を示す。
【発明を実施するための形態】
【0020】
＜本発明の方法＞
本発明は、ヌクレオチド鎖中の特定配列に隣接する配列を増幅する方法であって、下記工程（１）～（６）を含む方法である。
（１）前記特定配列に第１のフォワードプライマーがアニールし、該プライマーを起点として伸長反応を行ない、前記隣接配列に対する相補的な配列を３’末端に含む相補鎖を合成する工程、
（２）工程（１）にて得られた相補鎖の３’末端に、第１のデオキシヌクレオチドを重合的に付加する工程、
（３）工程（２）にて付加された第１のデオキシヌクレオチドからなるポリデオキシヌクレオチド鎖の３’末端に、更に第２のデオキシヌクレオチドを重合的に付加する工程、
（４）工程（３）にて形成された１本鎖ＤＮＡ中の、前記相補鎖の３’末端と前記ポリデオキシヌクレオチド鎖との結合部位に、第１のリバースプライマーがアニールし、該プライマーを起点として伸長反応を行ない、２本鎖ＤＮＡを合成する工程、
（５）工程（４）にて合成された２本鎖ＤＮＡを鋳型とし、前記特定配列に対して相補的な第２のフォワードプライマーと、第１のリバースプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応を行なう工程、
（６）工程（５）にて得られた増幅産物を鋳型とし、前記特定配列に対して相補的な第３のフォワードプライマーと、第２のリバースプライマーとを用いるポリメラーゼ連鎖反応を更に行なう工程。
本発明は、ヌクレオチド鎖中の特定配列に隣接する配列を増幅する方法であって、下記工程（１）～（６）を含む方法である。
（１）前記特定配列に第１のフォワードプライマーがアニールし、該プライマーを起点として伸長反応を行ない、前記隣接配列に対する相補的な配列を３’末端に含む相補鎖を合成する工程、
（２）工程（１）にて得られた相補鎖の３’末端に、第１のデオキシヌクレオチドを重合的に付加する工程、
（３）工程（２）にて付加された第１のデオキシヌクレオチドからなるポリデオキシヌクレオチド鎖の３’末端に、更に第２のデオキシヌクレオチドを重合的に付加する工程、
（４）工程（３）にて形成された１本鎖ＤＮＡ中の、前記相補鎖の３’末端と前記ポリデオキシヌクレオチド鎖との結合部位に、第１のリバースプライマーがアニールし、該プライマーを起点として伸長反応を行ない、２本鎖ＤＮＡを合成する工程、
（５）工程（４）にて合成された２本鎖ＤＮＡを鋳型とし、前記特定配列に対して相補的な第２のフォワードプライマーと、第１のリバースプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応を行なう工程、
（６）工程（５）にて得られた増幅産物を鋳型とし、前記特定配列に対して相補的な第３のフォワードプライマーと、第２のリバースプライマーとを用いるポリメラーゼ連鎖反応を更に行なう工程。
【0021】
なお、第２のフォワードプライマーは、特定配列において第１のフォワードプライマーよりも隣接配列により近く位置し、第３のフォワードプライマーは、特定配列において第２のフォワードプライマーよりも隣接配列により近く位置する。
【0022】
第１のリバースプライマーは、５’末端から順に、アダプタープライマー配列及び第３のデオキシヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーであり、第２のリバースプライマーは、アダプタープライマー配列を３’末端に含むプライマーである。
【0023】
第１～３のデオキシヌクレオチドは、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシシチジン及びデオキシチミジンからなる４種から各々選択される１のデオキシヌクレオチドであり、第２のデオキシヌクレオチドは、第１のデオキシヌクレオチドとは異なるデオキシヌクレオチドであり、第３のデオキシヌクレオチドは、第１のデオキシヌクレオチドに対して相補的なデオキシヌクレオチドである。
【0024】
本発明の方法に供する「ヌクレオチド鎖」とは、後述の特定配列及びそれに隣接する配列（隣接配列）を含み得る限り、特に制限はないが、例えば、動物、植物のような生体（組織、細胞等）、培養細胞、食品、環境（土壌、排水等）等から単離されるヌクレオチドのポリマーである。また、本発明の方法に供するヌクレオチド鎖は、デオキシヌクレオチドのポリマー（ＤＮＡ鎖）であってもよく、リボヌクレオチドのポリマー（ＲＮＡ鎖）であってもよい。
【0025】
本発明の方法に供するヌクレオチド鎖の前記生体等からの単離は、任意の方法で行うことができる。例えば、界面活性剤（ＣＴＡＢ等）による溶解処理、音波処理、ガラスビーズを用いた振盪撹拌及びフレンチプレス等を用いる方法が挙げられる。ヌクレオチド鎖の精製は、例えば、フェノール抽出、クロマトグラフィー、イオン交換、ゲル電気泳動、密度に依存した遠心分離等により実施することが可能である。より具体的に、本発明の方法に供するヌクレオチド鎖としては、前記方法により単離したゲノムＤＮＡやＰＣＲフラグメントのような２本鎖核酸、全ＲＮＡ若しくはｍＲＮＡ、又はそれらＲＮＡから逆転写反応で調製されたｃＤＮＡのような１本鎖核酸が挙げられる。
【0026】
「特定配列」とは、その配列が既に特定されているものであれば特に制限はなく、例えば、宿主細胞のゲノムＤＮＡ（ホストゲノム）に挿入されている外来ＤＮＡ（外来遺伝子）が挙げられる。外来遺伝子としては、より具体的に、トランスジーン（例えば、遺伝子組換え等に用いられるノックイン遺伝子及びベクター、ゲノム編集（ＳＤＮ－３）のノックイン遺伝子）、ウイルスＤＮＡ（例えば、ＨＴＬＶ－１、ＨＩＶ、ＳＩＶ、ＨＢＶ、ＨＢＶ、ＭＣＶ、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス）、及びそれらの一部が挙げられる。また、本発明にかかる「特定配列」として、例えば、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）又は抗体等の抗原結合性ポリペプチドをコードするヌクレオチドにおいて、定常領域をコードする配列、及びその一部が挙げられる。
【0027】
「隣接配列」とは、前記特定配列の５’側と３’側の少なくとも一方に隣接している配列を意味する。例えば、前記外来遺伝子に隣接するホストゲノム由来の配列、前記定常領域をコードする配列に隣接する、ＴＣＲ等の可変領域をコードする配列が挙げられる。
【0028】
【0029】
（工程（１） 相補鎖の合成）
当該工程においては、前記特定配列に第１のフォワードプライマー（図中の「Ｆ１」）がアニールし、該プライマーを起点として前記特定配列から前記隣接配列への伸長反応を行ない、前記隣接配列に対する相補的な配列を３’末端に含む１本鎖ＤＮＡが合成される。
当該工程においては、前記特定配列に第１のフォワードプライマー（図中の「Ｆ１」）がアニールし、該プライマーを起点として前記特定配列から前記隣接配列への伸長反応を行ない、前記隣接配列に対する相補的な配列を３’末端に含む１本鎖ＤＮＡが合成される。
【0030】
「プライマー」は、鋳型ポリヌクレオチドに特異的にアニールすることができ、鋳型ポリヌクレオチドと相補的である伸長産物を産生するために、鋳型依存的ポリメラーゼの基質（起点）となる３’末端を提供するポリヌクレオチド分子を意味する。「伸長反応」は、アニールしたプライマーの３’末端への少なくとも１つの相補的ヌクレオチドの鋳型依存的組み込みを意味する。
【0031】
「相補的」とは、２つのポリヌクレオチドが互いにアニールする場合に、アデニン（Ａ）がチミン（Ｔ）又はウラシル（Ｕ）と対を形成し、グアニン（Ｇ）がシトシン（Ｃ）と対を形成する、これら塩基間の水素結合による塩基対形成選択性を意味する。さらに、本発明において「相補的」とは、対象のポリヌクレオチドの配列に対して、その全長又は一部にわたって少なくとも８０％の相補性（例えば８５％以上の相補性、好ましくは９０％以上の相補性（９１％、９２％、９３％、９４％）、より好ましくは９５％以上の相補性（９６％、９７％、９８％、９９％）、特に好ましくは１００％の相補性）を有することを意味する。
【0032】
工程（１）において合成される相補鎖の鎖長としては、前記隣接配列に対する相補的な配列を３’末端に含む長さであれば特に制限はなく、例えば、後述のシーケンス解析の各手法において解析可能な長さとすることもできる。より具体的に、イルミナ社による次世代シーケンス解析用ライブラリーに対応するためには、隣接配列に対する相補的な配列を、好ましくは２００～２０００ヌクレオチド、より好ましくは４００～１０００ヌクレオチドを含むほどの鎖長とすることもできる。
【0033】
工程（１）における、相補鎖の合成は、例えば、特定配列に相補的な第１のフォワードプライマーをヌクレオチド鎖にアニーリングさせ、当該プライマーを起点としてＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応を行う工程、当該工程によって合成された配列を含む２本鎖を熱変性により解離させ１本鎖とする工程、これら２工程からなるサイクルを繰り返すことによって行なうことができる。なお、本発明にかかるヌクレオチド鎖がＲＮＡ鎖である場合、前記ＤＮＡポリメラーゼとしてＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いることにより、伸長反応（逆転写反応）を行なうことができる。
【0034】
伸長反応を行う工程における温度としては、相補鎖が合成できる温度であれば特に制限はなく、当業者であれば適宜調整し得るが、好ましくは５０～８０℃であり、より好ましくは５０～７０℃である。その保持時間は特に限定されず、所望する相補鎖の鎖長、用いるＤＮＡポリメラーゼの種類等に応じて当業者であれば適宜設定することができ、例えば１０秒～２０分間である。また、伸長工程における温度は全てのサイクルで同一温度であっても良いし、異なっていても良い。
【0035】
熱変性工程における温度としては、２本鎖を解離できる温度であれば特に制限はなく、当業者であれば適宜調整し得るが、好ましくは８０～１００℃であるが、より好ましくは９０～９９℃であり、さらに好ましくは９４～９８℃である。また、その保持時間は特に限定されないが、好ましくは１秒～５分間、より好ましくは５秒～３分間、さらに好ましくは１０秒～２分間である。
【0036】
工程（１）における相補鎖形成において、サイクル数は、後述の工程において鋳型となり得る程度に増幅できる限り特に制限はなく、当業者であれば用いるＤＮＡポリメラーゼの種類等に応じて適宜調整し得るが、好ましくは１０～５０サイクルであり、より好ましくは１５～４０サイクルであり、さらに好ましくは２０～３０サイクルである。
【0037】
このような相補鎖合成における反応液には、当該合成を行うために必須な成分が含まれていれば、その組成は特に限定されない。反応液に含まれるものとしては、例えば、後述の第１のフォワードプライマー及び後述のＤＮＡポリメラーゼの他、デオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰ）等の基質、２価イオン（例えば、マグネシウムイオン、カルシウムイオン）及び１価イオン（例えば、ナトリウムイオン、カリウムイオン）、又はそれらを供するための塩（例えば、硫酸マグネシウム、酢酸マグネシウム、塩化マグネシウム）、並びに緩衝液（例えば、トリス塩酸バッファー、リン酸バッファー、ＨＥＰＥＳバッファー）が挙げられる。また、反応液には、これらに加え、溶媒（例えば、エタノール、メタノール、アセトン、ジメチルスルホキシド）、有機酸（例えば、ギ酸、酢酸、安息香酸）、界面活性剤（例えば、ＳＤＳ、ＴｒｉｔｏｎＸ－１００）、アミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、トリプトファン）、タンパク質（例えば、ＢＳＡ、ＤＮＡ結合タンパク質）、糖（例えば、グルコース、キシロース、ガラクトース）、還元剤（例えば、ＤＴＴ）、ベタイン等を、添加剤として含んでいてもよい。また、本発明にかかるヌクレオチド鎖がＲＮＡ鎖である場合、ＲＮＡの分解を抑制するために、リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）阻害剤を含んでいてもよく、さらにまた、逆転写反応の効率低下を抑制するために、逆転写反応補助試薬（例えば、ニッポンジーン社製、製品名：ＲＴｍａｔｅ（Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼで合成した９７６ヌクレオチドからなるＲＮＡ））を含んでいてもよい。
【0038】
また、このようにして合成された相補鎖は、下記工程（２）に供する前に、精製処理に供してもよい。精製処理としては、前記第１のプライマー等を除去できれば特に制限はなく、当業者であれば適宜公知の手法を用いて行なうことができる。公知の手法としては、フェノール／クロロホルム処理、イソプロパノール又はエタノールによる沈殿処理、カラムを用いた精製が挙げられる。当該カラムとしては、例えば、ＤＮＡ吸着カラム（カラムの担体としては、シリカゲル、ガラス等）、ゲル濾過カラム、陰イオン交換体、限外濾過カラムが挙げられる。また、かかるカラムには市販品も好適に用いられる。相補鎖（１本鎖ＤＮＡ）精製用の市販カラムとしては、例えば、Ｍｏｎａｒｃｈ ＰＣＲ＆ＤＮＡクリーンナップキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）、ｓｓＤＮＡ／ＲＮＡクリーン＆コンセントレーター（ＺＹＭＯ ＲＥＳＥＡＲＣＨ社製）、Ｅｌｕｔｉｐ－ｄ ＤＮＡ精製用ミニカラム（ＧＥヘルスケア株式会社製）が挙げられる。
【0039】
（工程（２） 相補鎖３’末端への第１のデオキシヌクレオチドの重合的付加）
当該工程においては、工程（１）にて単離された相補鎖の３’末端に、第１のデオキシヌクレオチドが重合的に付加される。
当該工程においては、工程（１）にて単離された相補鎖の３’末端に、第１のデオキシヌクレオチドが重合的に付加される。
【0040】
工程（２）において重合される第１のデオキシヌクレオチドは、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシシチジン及びデオキシチミジンからなる４種のうちのいずれかであれば特に制限はないが、重合的付加反応がより進行し易く、単位時間あたりに形成されるポリデオキシヌクレオチド鎖の鎖長が長くなり易いという観点から、また当該ポリデオキシヌクレオチド鎖と後述の第１のリバースプライマー（図１中の「Ｒ１」）とのアニーリング温度を比較的低く抑えることができるという観点から、好ましくは、デオキシアデノシン、デオキシシチジン又はデオキシチミジンであり、より好ましくはデオキシアデノシンである。
【0041】
また前記相補鎖の３’末端に重合的に付加される第１のデオキシヌクレオチドからなるポリデオキシヌクレオチド鎖（以下、「第１のポリデオキシヌクレオチド鎖」とも称する）の鎖長としては特に制限はないが、当該ポリデオキシヌクレオチド鎖と前記相補鎖の３’末端との結合部位に、後述の第１のリバースプライマー（図１中の「Ｒ１」）がより特異的にアニールし易くなるという観点から、好ましくは２０～３００ヌクレオチドである。
【0042】
相補鎖の３’末端への第１のデオキシヌクレオチドの重合的な付加は、例えば、ターミナルデオキシトランスフェラーゼを用い、そのＤＮＡの３’ＯＨ末端へのデオキシヌクレオチド重合反応を触媒する活性を利用することにより行なうことができる。
【0043】
かかる酵素反応の温度としては特に制限はなく、通常３０～４０℃、好ましくは３７℃である。また、その反応時間としては、所望する相補鎖の鎖長に応じて当業者であれば適宜設定することができるが、好ましくは５～４０分間で、より好ましくは１０～３０分間である。
【0044】
このような重合的付加における反応液には、当該付加を行うために必須な組成が含まれていれば、その組成は特に限定されない。反応液に含まれるものとしては、例えば、第１のデオキシヌクレオチド及びターミナルデオキシトランスフェラーゼの他、２価イオン（例えば、マンガンイオン、コバルトイオン、マグネシウムイオン）、又はそれらを供するための塩（例えば、塩化マンガン、塩化コバルト、塩化マグネシウム）及び緩衝液（例えば、ＨＥＰＥＳバッファー、トリス塩酸バッファー、リン酸バッファー）が挙げられる。また、反応液には、これらに加え、還元剤（例えば、ＤＴＴ）、タンパク質（例えば、ＢＳＡ、ＤＮＡ結合タンパク質）、溶媒（例えば、エタノール、メタノール、アセトン、ジメチルスルホキシド）、有機酸（例えば、ギ酸、酢酸、安息香酸）、界面活性剤（例えば、ＳＤＳ、ＴｒｉｔｏｎＸ－１００）、アミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、トリプトファン）、糖（例えば、グルコース、キシロース、ガラクトース）、ベタイン等を、添加剤として含んでいてもよい。
【0045】
（工程（３） 第１のポリデオキシヌクレオチド鎖３’末端への第２のデオキシヌクレオチドの重合的付加）
当該工程においては、工程（２）にて付加された第１のポリデオキシヌクレオチド鎖の３’末端に、更に第２のデオキシヌクレオチドが重合的に付加される。
当該工程においては、工程（２）にて付加された第１のポリデオキシヌクレオチド鎖の３’末端に、更に第２のデオキシヌクレオチドが重合的に付加される。
【0046】
工程（３）において重合される第２のデオキシヌクレオチドは、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシシチジン及びデオキシチミジンからなる４種のうちのいずれかであり、かつ第１のデオキシヌクレオチドとは異なるデオキシヌクレオチドであるが、重合的付加反応が進行し難く、単位時間あたりに形成されるポリデオキシヌクレオチド鎖の鎖長を調整し易いという観点から、好ましくは、デオキシグアノシンである。
【0047】
第１のポリデオキシヌクレオチド鎖の３’末端に付加される第２のデオキシヌクレオチドからなるポリデオキシヌクレオチド鎖（以下、「第２のポリデオキシヌクレオチド鎖」とも称する）の鎖長としては、後述の第１のリバースプライマー（図１中の「Ｒ１」）による非特異的な合成を抑制できる鎖長であれば特に制限はないが、好ましくは１～３００ヌクレオチドである。また、第２のポリデオキシヌクレオチド鎖においては、第２のデオキシヌクレオチド以外の他のデオキシヌクレオチドが含まれていてもよい。他のデオキシヌクレオチドとしては特に制限はないが、例えば、第１のデオキシヌクレオチドと同種のデオキシヌクレオチドが挙げられる。
【0048】
第１のポリデオキシヌクレオチド鎖の３’末端への第２のデオキシヌクレオチドの重合的な付加は、前記第１のデオキシヌクレオチド同様に、例えば、ターミナルデオキシトランスフェラーゼの酵素反応を利用することにより行なうことができる。
【0049】
かかる酵素反応の温度としては特に制限はなく、通常３０～４０℃、好ましくは３７℃である。また、その反応時間としては、所望する相補鎖の鎖長に応じて当業者であれば適宜設定することができるが、好ましくは２～４０分間で、より好ましくは５～３０分間、さらに好ましくは１０～２０分間である。
【0050】
また、このような重合的付加における反応液は、前記工程（２）における反応液に第２のデオキシヌクレオチドを添加することにより調製することができる。
【0051】
そして、このようにして前記相補鎖の３’末端に第１のポリデオキシヌクレオチド鎖を介して第２のポリデオキシヌクレオチド鎖が付加された１本鎖ＤＮＡは、ターミナルデオキシトランスフェラーゼの酵素活性を失活するために熱処理に供してもよい。かかる熱処理の条件としては、前記酵素が失活する条件であれば特に制限はないが、通常６０～９０℃（好ましくは７０～８０℃）にて、１分～１時間（好ましくは５～２０分間）インキュベートすることにより、前記酵素は失活され得る。
【0052】
（工程（４） ２本鎖ＤＮＡの合成）
当該工程においては、工程（３）にて形成された１本鎖ＤＮＡ中の、前記相補鎖の３’末端と第１のポリデオキシヌクレオチド鎖との結合部位に、第１のリバースプライマー（図１中の「Ｒ１」）をアニールさせ、該プライマーを起点として伸長反応を行なうことにより、２本鎖ＤＮＡが合成される。
当該工程においては、工程（３）にて形成された１本鎖ＤＮＡ中の、前記相補鎖の３’末端と第１のポリデオキシヌクレオチド鎖との結合部位に、第１のリバースプライマー（図１中の「Ｒ１」）をアニールさせ、該プライマーを起点として伸長反応を行なうことにより、２本鎖ＤＮＡが合成される。
【0053】
工程（４）において、２本鎖の合成は、例えば、熱変性処理後、第１のリバースプライマーを前記１本鎖ＤＮＡにアニーリングさせ、当該プライマーを起点としてＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応を行うことによって行なうことができる。
【0054】
当該工程において用いられる酵素としては、当該伸長反応を行なうことができる限り特に制限はないが、塩化コバルトの存在下でもその活性を奏するＤＮＡポリメラーゼが好ましい。塩化コバルトは、上述のとおり、ターミナルデオキシトランスフェラーゼによる重合的付加反応系に通常添加される塩であるため、当該塩存在下でも伸長反応を行えるＤＮＡポリメラーゼを用いることにより、上記工程（２）から工程（５）までを精製処理等を要することなくワンポットで行なうことができる。かかるＤＮＡポリメラーゼとしては、例えば、Ｑ５ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｑ５－高正確性ＤＮＡポリメラーゼ、Ｑ５－ホットスタート高正確性ＤＮＡポリメラーゼ等、いずれもＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）が挙げられる。
【0055】
熱変性工程における温度としては、前記１本鎖ＤＮＡの高次構造を変性できる温度であれば特に制限はなく、好ましくは３０～１００℃であるが、より好ましくは５０～９９℃である。その保持時間は特に限定されないが、例えば１秒～１０分間である。
【0056】
アニーリング工程における温度としては、第１のリバースプライマーと前記１本鎖ＤＮＡとのアニーリングが生じ、維持できる温度であれば特に制限はなく、非特異的な増幅産物を抑制するという観点から、好ましくは４０～８０℃であるが、より好ましくは４５～７０℃であり、さらに好ましくは５０～６５℃である。その保持時間は特に限定されないが、好ましくは３０秒～５分間、より好ましくは１～２分間である。また、アニーリング温度は同一温度であっても良いし、異なっていても良い。例えば、１０秒毎に数℃（２～３℃）ずつ下げる温度勾配を設けることにより、第１のリバースプライマーは、第１のポリデオキシヌクレオチド鎖を滑るように、その３‘末端に特異的にアニールし易くなる。
【0057】
伸長工程における温度としては、２本鎖が合成できる温度であれば特に制限はなく、当業者であれば適宜調整し得るが、好ましくは５０～８０℃であるが、より好ましくは６５～７５℃であり、特に好ましくは７２℃である。また、その保持時間は特に限定されないが、好ましくは１０秒～５分間、より好ましくは３０秒～２分間、特に好ましくは１分間である。なお、アニーリング温度は伸長工程における温度と同一温度であってもよいが、伸長工程における温度よりも高く設定することはしない。
【0058】
なお、かかる反応は、工程（１）における反応液と同様のものを用いることにより行なうことができる。また、伸長反応後は、ＤＮＡポリメラーゼの酵素活性を抑制し、２本鎖ＤＮＡ構造を維持するため、通常４℃にて維持される。
【0059】
（工程（５） 第１のポリメラーゼ連鎖反応）
当該工程においては、工程（４）にて合成された２本鎖ＤＮＡを鋳型とし、前記特定配列に対して相補的な第２のフォワードプライマー（図１中の「Ｆ２」）と、第１のリバースプライマー（図１中の「Ｒ１」）とを用いるポリメラーゼ連鎖反応が行なわれる。
当該工程においては、工程（４）にて合成された２本鎖ＤＮＡを鋳型とし、前記特定配列に対して相補的な第２のフォワードプライマー（図１中の「Ｆ２」）と、第１のリバースプライマー（図１中の「Ｒ１」）とを用いるポリメラーゼ連鎖反応が行なわれる。
【0060】
「ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）」は、温度変化を繰り返すことにより、標的ヌクレオチド配列を増幅させることを意味する。より具体的には、フォワードプライマー及びリバースプライマーを標的ヌクレオチド配列にアニーリングさせるための工程、次いで、前記プライマーを起点としてＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応を行う工程、当該工程によって合成された標的ヌクレオチド配列を含む２本鎖を熱変性により解離させ１本鎖とする工程、これら三工程からなるサイクルで、ＰＣＲは構成される。
【0061】
工程（５）におけるアニーリングの温度としては、前記アニーリングが生じ、維持できる温度であれば特に制限はなく、当業者であれば適宜調整し得るが、非特異的な増幅産物を抑制するという観点から、好ましくは５０～８０℃であるが、より好ましくは６０～７０℃である。また、その保持時間は特に限定されないが、好ましくは１～６０秒間である。なお、アニーリング温度はすべてのサイクルで同一温度であっても良いし、異なっていても良い。
【0062】
伸長反応を行う工程における温度としては、相補鎖が合成できる温度であれば特に制限はなく、好ましくは５０～８０℃であるが、より好ましくは６５～７５℃であり、特に好ましくは７２℃である。その保持時間は特に限定されないが、好ましくは１～６０秒間、より好ましくは１０～５０秒間、さらに好ましくは２０～４０秒間であり、特に好ましくは３０秒間である。また、伸長反応を行う工程における温度は全てのサイクルで同一温度であっても良いし、異なっていても良い。アニーリング温度はと伸長反応を行う工程における温度とは同一温度であってもよいが、伸長工程における温度よりも高く設定することはしない。
【0063】
熱変性工程における温度としては、２本鎖を解離できる温度であれば特に制限はなく、好ましくは８０～１００℃であるが、より好ましくは９５～９９℃であり、特に好ましくは９８℃である。その保持時間は特に限定されないが、好ましくは１～６０秒間、より好ましくは１０～５０秒間、さらに好ましくは２０～４０秒間であり、特に好ましくは３０秒である。
【0064】
工程（５）におけるＰＣＲにおいて、サイクル数は、後述の工程において鋳型となり得る程度に増幅できる限り特に制限はないが、好ましくは１０～４０サイクルであり、より好ましくは１５～３０サイクルであり、さらに好ましくは２０～２５サイクルである。
【0065】
なお、かかるＰＣＲは、工程（１）（工程（４））における反応液と同様のものを用いることにより行なうことができる。すなわち、工程（４）における反応後に、Ｆ２プライマーを添加し、上記温度変化を繰り返すことによって、工程（５）におけるＰＣＲを行なうことができる。
【0066】
このようにして得られる増幅産物は、下記工程（６）に供する前に、精製処理に供してもよい。精製処理としては、工程（１）に記載の精製処理と同様である。また、精製用カラムとしては市販品も好適に用いられ、かかるＰＣＲ増幅産物精製用カラムの市販品としては、例えば、ＡｍｐｕｒｅＸＰ（ベックマンコールター社製）、ＧｅｎＥｌｕｔｅ ＰＣＲクリーンナップキット（メルク社製）が挙げられる。
【0067】
また、下記工程（６）においては、精製処理を施さずとも、増幅産物を希釈して鋳型として用いてもよい。かかる希釈倍率としては特に制限はなく、当業者であれば適宜調整し得るが、通常１０～１０００倍、好ましくは１００～５００倍、より好ましくは２００～３００倍である。
【0068】
（工程（６） 第２のポリメラーゼ連鎖反応）
当該工程においては、工程（５）にて合成された増幅産物を鋳型とし、前記特定配列に対して相補的な第３のフォワードプライマー（図１中の「Ｆ３」）と、第２のリバースプライマー（図１中の「Ｒ２」）とを用いるＰＣＲが行なわれる。
当該工程においては、工程（５）にて合成された増幅産物を鋳型とし、前記特定配列に対して相補的な第３のフォワードプライマー（図１中の「Ｆ３」）と、第２のリバースプライマー（図１中の「Ｒ２」）とを用いるＰＣＲが行なわれる。
【0069】
ＰＣＲについては上述のとおりであるが、その条件については、例えば、工程（６）におけるアニーリング及び伸長反応における温度は同一とすることができる。かかる温度としては、工程（５）にて合成された増幅産物と、第３のフォワードプライマー又は第２のリバースプライマーとのアニーリングが生じ、さらに相補鎖が合成できる温度であれば特に制限はなく、当業者であれば適宜調整し得るが、非特異的な増幅産物を抑制するという観点から、好ましくは５０～８０℃であるが、より好ましくは６０～７０℃である。その保持時間は特に限定されないが、好ましくは５秒～２分間、より好ましくは１０秒～１分間、さらに好ましくは２０～４０秒間、特に好ましくは３０秒間である。なお、アニーリング及び伸長反応における温度は異なっていてもよいが、伸長工程における温度よりも高く設定することはしない。また、アニーリング温度及び／又は伸長反応における温度は全てのサイクルで同一温度であっても良いし、異なっていても良い。
【0070】
熱変性工程における温度としては、２本鎖を解離できる温度であれば特に制限はなく、当業者であれば適宜調整し得るが、好ましくは８０～１００℃であるが、より好ましくは９０～９９℃であり、さらに好ましくは９４～９８℃である。その保持時間は特に限定されないが、好ましくは１秒～５分間、より好ましくは５秒～３分間、さらに好ましくは１０秒～２分間である。
【0071】
工程（６）におけるＰＣＲにおいて、サイクル数は、後述の方法において検出できる程度又はシーケンス解析できる程度に増幅できる限り特に制限はないが、好ましくは１０～５０サイクルであり、より好ましくは２５～４０サイクルであり、さらに好ましくは３０～３５サイクルである。
【0072】
なお、かかるＰＣＲも、工程（４）及び工程（５）同様に、工程（１）における反応液と同様のものを用いることにより行なうことができる。
【0073】
そして、以上の工程を経ることにより、本発明によれば、図１に示すとおり、隣接配列を増幅することができる。なお、当該図において示されるように、隣接配列のみならず、特定配列の一部及び第１のポリデオキシヌクレオチド鎖の一部も併せて増幅される。また、ＰＣＲにおいて、鋳型ポリヌクレオチドとそれに対して相補的な配列を有する相補鎖は、両者の関係はあくまでも相対的なものに過ぎない。すなわち、相補鎖として合成された鎖は、再び鋳型として機能することができる。したがって、本発明において増幅又は後述の配列決定の対象となる隣接配列等には、当該配列のみならず、該配列の相補鎖も含まれる。
【0074】
本発明において増幅された隣接配列等の検出又は確認は、公知の手法を適宜用いることによって、当業者であれば行なうことができる、公知の手法としては、電気泳動法（例えば、アガロースゲル又はアクリルアミドゲルに増幅産物を展開する電気泳動法）、核酸クロマト法、インターカレーション法、クエンチャー媒介蛍光検出法、サザンブロッティングが挙げられる。
【0075】
（シーケンス解析）
上記工程を経て得られた増幅産物の配列を決定することにより、隣接配列を明らかにすることができる。かかる配列決定は、公知のシーケンス解析によって行なうことができる。例えば、増幅産物について、単離し、ベクター内にサブクローニングし、そしてサンガー配列決定法又は色素ターミネーター配列決定法を用いて配列決定することができる。また、次世代シーケンシング（ＮＧＳ；Ｎｅｘｔ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）又は１分子シーケンシング法に供することにより、サブクローニングステップを必要とせず、配列決定することができる。
上記工程を経て得られた増幅産物の配列を決定することにより、隣接配列を明らかにすることができる。かかる配列決定は、公知のシーケンス解析によって行なうことができる。例えば、増幅産物について、単離し、ベクター内にサブクローニングし、そしてサンガー配列決定法又は色素ターミネーター配列決定法を用いて配列決定することができる。また、次世代シーケンシング（ＮＧＳ；Ｎｅｘｔ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）又は１分子シーケンシング法に供することにより、サブクローニングステップを必要とせず、配列決定することができる。
【0076】
次世代シーケンシング法としては特に制限はないが、合成シーケンシング法（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ－ｂｙ－ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、例えば、イルミナ社製Ｓｏｌｅｘａゲノムアナライザー、Ｈｉｓｅｑ（登録商標）、Ｎｅｘｔｓｅｑ、Ｍｉｓｅｑ又はＭｉｎｉｓｅｑによるシーケンシング）、パイロシーケンシング法（例えば、ロッシュ・ダイアグノステックス（４５４）社製のシーケンサーＧＳＬＸ又はＦＬＸによるシーケンシング（所謂４５４シーケンシング））、リガーゼ反応シーケンシング法（例えば、ライフテクノロジー社製のＳｏｌｉＤ（登録商標）又は５５００ｘｌによるシーケンシング）が挙げられる。１分子シーケンシング法としては、例えば、パシフィック・バイオサイエンシズ・オブ・カリフォルニア社製のＰａｃＢｉｏ ＲＳ II又はＰａｃＢｉｏＳｅｑｕｅｌシステム、オックスフォード・ナノポアテクノロジーズ社製のＰｒｏｍｅｔｈＩＯＮ、ＧｒｉｄＩＯＮ又はＭｉｎＩＯＮ等が挙げられる。
【0077】
また、このように隣接配列を決定することにより、例えば、更に当該配列をＢＬＡＳＴ検索にかけることにより、特定配列である外来ＤＮＡが挿入されているホストゲノムの位置を決定することもできる。
【0078】
＜本発明のキット＞
上述のとおり、本発明によれば、上述のプライマーを用いた各反応を行なうことにより、特定の配列に隣接する配列を増幅し、さらには当該配列を決定することも可能となる。したがって、本発明は、上述の方法に用いられ、第１のフォワードプライマー、第２のフォワードプライマー、第３のフォワードプライマー、第１のリバースプライマー及び第２のリバースプライマーを含む、キットを提供する。
上述のとおり、本発明によれば、上述のプライマーを用いた各反応を行なうことにより、特定の配列に隣接する配列を増幅し、さらには当該配列を決定することも可能となる。したがって、本発明は、上述の方法に用いられ、第１のフォワードプライマー、第２のフォワードプライマー、第３のフォワードプライマー、第１のリバースプライマー及び第２のリバースプライマーを含む、キットを提供する。
【0079】
第１のフォワードプライマー、第２のフォワードプライマー及び第３のフォワードプライマーは、上述のとおり、前記特定配列に対して各々相補的な配列を有するプライマーであるが、図１に示すとおり、第２のフォワードプライマーは、第１のフォワードプライマーよりも隣接配列により近くに位置し、第３のフォワードプライマーは、第２のフォワードプライマーよりも隣接配列により近くに位置する。なお、「隣接配列により近い」とは、プライマー５’末端のアニーリング位置が隣接配列により近ければよく、フォワードプライマーのアニーリング領域間は一部重複するものであってもよい。アニーリングの位置としては特に制限はなく、特定配列情報に基づき当業者であれば適宜調整することができるが、第１～３のフォワードプライマーのアニーリング位置（各プライマー５’末端のアニーリング位置）は各々、特定配列と隣接配列との境界から、好ましくは１０００～２００ヌクレオチド、５００～８０ヌクレオチド及び３００～３０ヌクレオチドである。
【0080】
また、特定の配列が、ＬＴＲを有する外来ＤＮＡ由来の配列である場合には、ＬＴＲ領域内に第１のフォワードプライマーアニーリングしてしまうと、ＬＴＲ領域（５’ＬＴＲ及び３’ＬＴＲ）間に挟まれたウイルス由来のＤＮＡも増幅してしまう可能性があるという観点から、第１のフォワードプライマーはＬＴＲ領域外にアニーリングすることが望ましい。
【0081】
第１～３のフォワードプライマーの鎖長としては特に制限はないが、特定の配列に対して相補的な配列部分の長さが、好ましくは１８～２７ヌクレオチドであり、より好ましくは１８～２５ヌクレオチドである。
【0082】
第１～３のフォワードプライマーのｍｅｌｔｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（Ｔｍ）値は、好ましくは５７～７２℃であり、より好ましくは６２～７０℃であり、特に好ましくは６８℃である。
【0083】
なお、このような所望の鎖長及びＴｍ値を備えたプライマーは、当業者であれば、ＰＣＲプライマー設計ツールを用いることにより設計することができる。かかる設計ツールとしては、例えば、Ｐｒｉｍｅｒ３が挙げられる。
【0084】
第１のリバースプライマーは、５’末端から順に、アダプタープライマー配列及び第３のデオキシヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドを少なくともむプライマーである。上述のとおり、当該プライマーは、上記相補鎖の３’末端と第１のポリデオキシヌクレオチド鎖との結合部位にアニーリングするため、第１のデオキシヌクレオチドに対して相補的なデオキシヌクレオチドである第３のデオキシヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドを有する必要がある。また、後述の実施例において示すとおり、隣接配列に対する相補的な配列と第１のポリデオキシヌクレオチド鎖との結合部位により特異性高くアニーリングし易くなるという観点から、第１のリバースプライマーは、３’末端に更に第４のデオキシヌクレオチドを含むプライマー（すなわち、５’末端から順に、アダプタープライマー配列、第３のデオキシヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド及び第４のデオキシヌクレオチドを含むプライマー）であることが好ましく、３’側に更に第４のデオキシヌクレオチド及び第５のデオキシヌクレオチドを含むプライマー（すなわち、５’末端から順に、アダプタープライマー配列、第３のデオキシヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド、第４のデオキシヌクレオチド及び第５のデオキシヌクレオチドを含むプライマー）であることがより好ましい。
【0085】
なお、第４のデオキシヌクレオチドは、第３のデオキシヌクレオチド以外の３種からランダムに選択されるデオキシヌクレオチドであり、第５のデオキシヌクレオチドは、４種からランダムに選択されるデオキシヌクレオチドである。具体的には、第１～第５のデオキシヌクレオチドは、下記表１に示す関係となる。
【0086】
【表1】
【0087】
第３のデオキシヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドの鎖長としては、第１のポリデオキシヌクレオチド鎖に十分にアニールし得る長さであれば、特に制限はなく、当業者であれば含めるデオキシヌクレオチドの種類に応じて適宜調整し得るが、好ましくは５～３０ヌクレオチドであり、より好ましくは１０～２５ヌクレオチドである。なお、第４のデオキシヌクレオチド及び第５ヌクレオチドは、第１のリバースプライマーにおいて各々１ヌクレオチドずつ含まれる。
【0088】
第１のリバースプライマーは、更に５’側にアダプタープライマー配列を含む。また、第２のリバースプライマーも、アダプタープライマー配列を３’末端に含む。本発明において「アダプタープライマー配列」とは、少なくとも本発明にかかる特定の配列、第１のポリデオキシヌクレオチド鎖及び第２のポリデオキシヌクレオチド鎖に対して相補的な配列ではなく、更に、本発明に係るＤＮＡ鎖（例えば、外来ＤＮＡが挿入されているホストゲノム）に対して相補的な配列ではないことが好ましい。また、アダプタープライマー配列は、天然には存在しない配列であることがより好ましい。
【0089】
アダプタープライマー配列の鎖長としては、上述の第２のポリメラーゼ連鎖反応（工程（６））が十分に進行し得る長さであれば、特に制限はなく、当業者であれば適宜調整し得るが、好ましくは１８～２７ヌクレオチドであり、より好ましくは２０～２５ヌクレオチドであり、特に好ましくは２２ヌクレオチドである。アダプタープライマー配列のｍｅｌｔｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（Ｔｍ）値は、好ましくは５０～７２℃であり、より好ましくは５５～６８℃である。
【0090】
アダプタープライマー配列の好適な例を下記表２に示す。
【0091】
【表2】
【0092】
本発明においてプライマーを構成する「ヌクレオチド」は、通常、ＤＮＡであるが、塩基対結合を形成し得る限り、他の天然ヌクレオチド（ＲＮＡ）であってもよく、非天然ヌクレオチド（人工ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ）を含んでもよい。非天然ヌクレオチドとしては、例えば、ヘキシトール核酸（ＨＮＡ)、シクロヘキセン核酸（ＣｅＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、モルホリノ核酸、トリシクロ－ＤＮＡ（ｔｃＤＮＡ）、２’－Ｏ－メチル化核酸、２’－ＭＯＥ（２’－Ｏ－メトキシエチル）化核酸、２’－ＡＰ（２’－Ｏ－アミノプロピル）化核酸、２’－フルオロ化核酸、２’Ｆ‐アラビノ核酸（２'－Ｆ－ＡＮＡ）、ＢＮＡ（ＬＮＡ等の架橋化核酸（Ｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ））が挙げられる。
【0093】
本発明の「プライマー」は、標的ヌクレオチド配列にアニーリングし、ＤＮＡ複製の起点となるオリゴヌクレオチドであり、１種のヌクレオチドのみ（例えば、ＤＮＡのみ）で構成されるオリゴヌクレオチドであってもよく、複数種のヌクレオチド（例えば、ＤＮＡとＲＮＡ）から構成されるキメラオリゴヌクレオチドであってもよいが、好ましくはＤＮＡのみから構成されるオリゴヌクレオチドである。
【0094】
本発明のプライマーは、当業者であれば公知の方法を適宜選択することにより調製することができる。例えば、市販の核酸自動合成機（アプライドバイオシステムズ社製、べックマン社製等）を用いて合成し、次いで、得られるオリゴヌクレオチドを逆相カラム等を用いて精製することにより、プライマーを調製することができる。
【0095】
また、本発明のプライマーには、ＰＣＲによる増幅産物を検出等し易くするために、標識物質が結合していてもよい。「標識物質」としては、ヌクレオチドに結合することができ、化学的又は光学的方法に検出できるものであれば特に制限されることはなく、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、フィコエリスリン（Ｒ－ＰＥ）等の蛍光蛋白質、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、βガラクトシダーゼ（β－ｇａｌ）等の酵素、１２５Ｉ等の放射性同位元素、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）やローダミンイソチオシアネート（ＲＩＴＣ）等の蛍光色素、コロイド状金属、着色ラテックス等の呈色標識物質、アビジン、ビオチン、ＤＩＧ、抗ＤＩＧ抗体が挙げられる。なお、標識物質として酵素を用いる場合には、基質として、発色基質、蛍光基質、あるいは化学発光基質等を添加することにより、基質に応じて種々の検出を行うことができる。また、標識物質の結合は、プライマーを構成するヌクレオチドに直接結合していてもよく、他の物質を介して間接的に結合していてもよい。
【0096】
さらに、第３のフォワードプライマー及び第２のリバースプライマーには、後述の実施例に示すように、隣接する配列を決定するための配列（例えば、フローセル結合領域等の次世代シーケンサー用アダプター配列）を付加してもよい。
【0097】
また、本発明のキットには、上記プライマーの他、反応に用いる各種酵素を含めてもよい。かかる酵素としては、上記ＤＮＡポリメラーゼ、ターミナルデオキシトランスフェラーゼ（ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ）が挙げられる。
【0098】
「ＤＮＡポリメラーゼ」としては、標的ヌクレオチド配列に対してＤＮＡからなる相補鎖を合成する活性を有するもの（ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ）であればよく、常温性、中温姓、耐熱性のものであっても用いることができる。また、５’→３’エクソヌクレアーゼ活性、３’→５’エクソヌクレアーゼ活性（校正活性）及びＴｄＴ活性のうちの少なくとも１の活性を有するＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。
【0099】
本発明にかかる「ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ」としては、特に制限はないが、好ましくは耐熱性ＤＮＡポリメラーゼである。耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとしては、特に制限はなく、例えば、ＫＯＤポリメラーゼ（ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－Ｎｅｏ等、東洋紡株式会社製）、Ｑ５ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｑ５－高正確性ＤＮＡポリメラーゼ、Ｑ５－ホットスタート高正確性ＤＮＡポリメラーゼ等、いずれもＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）、ＥｘＴａｑポリメラーゼ（タカラバイオ株式会社製）が挙げられる。
【0100】
また、本発明にかかる「ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ」としては、特に制限はなく、例えば、レトロウイルス由来の逆転写酵素が挙げられる。より具体的には、変異型モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）逆転写酵素、トリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素、ラウス関連ウイルス（ＲＡＶ）逆転写酵素、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）逆転写酵素、又はそれらの変異体（例えば、ＭＭＬＶ逆転写酵素の変異体である、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）逆転写酵素（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製））が挙げられる。
【0101】
本発明のキットには、さらに上記反応に必要な物質を含んでいてもよい。かかる物質としては、上記反応液の組成（基質（ｄＮＴＰ）、上記イオン又はそれらを供するための塩、緩衝液、添加剤）が挙げられる。また、本発明のプライマーに標識物質を結合している場合には、当該標識物質を検出するための基質も前記キットに含まれ得る。さらに、検出方法によっては、ＰＣＲによる増幅産物を展開するための担体（例えば、電気泳動方法におけるゲル、核酸クロマト法におけるクロマト用試験紙）及び溶媒、蛍光物質（例えば、インターカレーション法におけるインターカレーター）、クエンチャー媒介蛍光検出法における蛍光物質及び消光物質が結合したプローブも、前記キットに適宜含まれる。さらに、増幅された配列を確認するための、ＤＮＡ分子量マーカー及び陽性コントロールも、前記キットに含めてもよい。また、配列決定に必要な物質、例えば、シーケンス用プライマー等を含めることもできる。さらにまた、本発明のキットには、その使用説明書が含まれる。
【実施例】
【0102】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【0103】
（ゲノムＤＮＡの調製）
特定の配列（ＨＴＬＶ－１由来のＤＮＡ等のトランスジーン）及びそれに隣接する配列（ホストゲノム由来の配列）を含むゲノムＤＮＡは、試料が末梢血白血球又は細胞株である場合には、キアゲン社製ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄ Ｍｉｎｉ ｋｉｔを用い添付の説明書に記載の方法に従って、試料がアデノウイルス、ラットの組織又はトウモロコシ Ｂｔ１７６種（ｈｔｔｐ：／／ｂｃｈ．ｃｂｄ．ｉｎｔ／ｄａｔａｂａｓｅ／ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ／？ｉｄ＝１０７２３）である場合には、アルカリ溶解液を用い常法にて、単離、調製した。
特定の配列（ＨＴＬＶ－１由来のＤＮＡ等のトランスジーン）及びそれに隣接する配列（ホストゲノム由来の配列）を含むゲノムＤＮＡは、試料が末梢血白血球又は細胞株である場合には、キアゲン社製ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄ Ｍｉｎｉ ｋｉｔを用い添付の説明書に記載の方法に従って、試料がアデノウイルス、ラットの組織又はトウモロコシ Ｂｔ１７６種（ｈｔｔｐ：／／ｂｃｈ．ｃｂｄ．ｉｎｔ／ｄａｔａｂａｓｅ／ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ／？ｉｄ＝１０７２３）である場合には、アルカリ溶解液を用い常法にて、単離、調製した。
【0104】
そして、得られたゲノムＤＮＡに、下記表３に示すとおり、ＲＮａｓｅＡ（タカラバイオ株式会社又は株式会社ニッポンジーン社製）を添加し、３７℃で１０分間インキュベーションし、ＲＮＡを失活、除去した。
【0105】
【表3】
【0106】
そして、図１に示す工程にて、特定の配列に隣接する配列の増幅を試みた。
【0107】
（工程１） 相補鎖の合成
トランスジーンとホストゲノムを含む１本鎖ＤＮＡの合成は、前記ゲノムＤＮＡを鋳型とし、トランスジーン特異的Ｆ１プライマーとＫＯＤ－Ｐｌｕｓ Ｎｅｏ反応液（東洋紡社製）とを、下記表４に示す組成になるよう混合し、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製、Ｖｅｒｉｔｉサーマルサイクラーを用い、下記表５に示す条件にて反応させた（所要時間：約４０分）。
トランスジーンとホストゲノムを含む１本鎖ＤＮＡの合成は、前記ゲノムＤＮＡを鋳型とし、トランスジーン特異的Ｆ１プライマーとＫＯＤ－Ｐｌｕｓ Ｎｅｏ反応液（東洋紡社製）とを、下記表４に示す組成になるよう混合し、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製、Ｖｅｒｉｔｉサーマルサイクラーを用い、下記表５に示す条件にて反応させた（所要時間：約４０分）。
【0108】
【表4】
【0109】
【表5】
【0110】
なお、各Ｆ１プライマー、後述の各Ｆ２プライマー及び各Ｆ３プライマーの配列は以下のとおりである。また、下記表６において「Ｃｏｍｍｏｎ」は、トランスジーンの種類を問わず、共通して用いられたプライマーであることを示す。「ＮＧＳ－Ｆ２」配列中の「ＮＮＮＮＮＮＮＮ」は、後述のイルミナ社次世代シーケンサーにおいて用いられるインデックスタグ（デュアルインデックス配列）を示す。
【0111】
【表6】
【0112】
合成された１本鎖ＤＮＡの精製とＦ１プライマーの除去は、Ｍｏｎａｒｃｈ ＰＣＲ＆ＤＮＡクリーンナップキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製、製品番号：Ｔ１０３０）を用いて行った。当該キットに付属のカラムに一旦結合させた１本鎖ＤＮＡの溶出は、９．２μＬの水を添加して行ない、結果８．２μＬのサンプルを回収した（所要時間：約１５分）。
【0113】
（工程２及び３） 相補鎖３’末端のポリＡＧテール化
精製された１本鎖ＤＮＡと、ターミナルデオキシトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）反応液（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）とｄＡＴＰを、下記表７に示す組成になるよう混合し、３７℃、２０分間反応させることによって、前記１本鎖ＤＮＡの３’末端のポリＡテーリングを行った。
精製された１本鎖ＤＮＡと、ターミナルデオキシトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）反応液（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）とｄＡＴＰを、下記表７に示す組成になるよう混合し、３７℃、２０分間反応させることによって、前記１本鎖ＤＮＡの３’末端のポリＡテーリングを行った。
【0114】
【表7】
【0115】
その後、下記表８に示す組成になるよう、ｄＧＴＰを加え、更に３７℃、１５分間反応させることによって、前記１本鎖ＤＮＡの３’末端にポリＡＧを付加した。
【0116】
【表8】
【0117】
その後、７５℃、１０分間の加熱処理を行なうことにより、ターミナルデオキシトランスフェラーゼの不活化を行った（所要時間：約４５分）。
【0118】
（工程４） ２本鎖ＤＮＡの合成
２本鎖ＤＮＡの合成は、前記工程３の反応液に、下記表９に示す組成になるよう、オリゴｄＴアダプタープライマー（配列番号：２及び４１）とＱ５ホットスタート高正確性ＤＮＡポリメラーゼ反応液（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）とを直接加え、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製Ｖｅｒｉｔｉサーマルサイクラーを用い、下記表１０に示すタッチダウン条件下で反応させた（所要時間：約５分）。なお、次の工程に移行するまで得られたサンプルは４℃にて維持した。
２本鎖ＤＮＡの合成は、前記工程３の反応液に、下記表９に示す組成になるよう、オリゴｄＴアダプタープライマー（配列番号：２及び４１）とＱ５ホットスタート高正確性ＤＮＡポリメラーゼ反応液（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）とを直接加え、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製Ｖｅｒｉｔｉサーマルサイクラーを用い、下記表１０に示すタッチダウン条件下で反応させた（所要時間：約５分）。なお、次の工程に移行するまで得られたサンプルは４℃にて維持した。
【0119】
【表9】
【0120】
【表10】
【0121】
なお、オリゴｄＴアダプタープライマー等の配列は以下のとおりである。また、下記表１１において「Ｃｏｍｍｏｎ」は、トランスジーンの種類を問わず、共通して用いられたプライマーであることを示す。また「ＮＧＳ－Ｒ２」配列中の「ＮＮＮＮＮＮＮＮ」は、後述のイルミナ社次世代シーケンサーにおいて用いられるインデックスタグ（デュアルインデックス配列）を示す。
【0122】
【表11】
【0123】
（工程５） 第１のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
２本鎖ＤＮＡの増幅は、工程４の反応液に、下記表１２に示す組成になるよう、トランスジーン特異的Ｆ２プライマーを直接加え、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製Ｖｅｒｉｔｉサーマルサイクラーを用い、下記表１３に示す条件にて反応させた（所要時間：約３５分）。
２本鎖ＤＮＡの増幅は、工程４の反応液に、下記表１２に示す組成になるよう、トランスジーン特異的Ｆ２プライマーを直接加え、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製Ｖｅｒｉｔｉサーマルサイクラーを用い、下記表１３に示す条件にて反応させた（所要時間：約３５分）。
【0124】
【表12】
【0125】
【表13】
【0126】
（工程６） 第２のＰＣＲ
工程５で増幅されたＤＮＡを１／２００希釈し、トランスジーン特異的Ｆ３プライマーとアダプタープライマー１（ＡＤＰ１－ＮＧＳ－Ｒ１）とＫＯＤ－Ｐｌｕｓ Ｎｅｏ反応液（東洋紡社製）を、下記表１４に示す組成になるよう混合し、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ、Ｖｅｒｉｔｉサーマルサイクラーを用い、下記表１５に示す条件にて反応させた（所要時間：約４０分）。
工程５で増幅されたＤＮＡを１／２００希釈し、トランスジーン特異的Ｆ３プライマーとアダプタープライマー１（ＡＤＰ１－ＮＧＳ－Ｒ１）とＫＯＤ－Ｐｌｕｓ Ｎｅｏ反応液（東洋紡社製）を、下記表１４に示す組成になるよう混合し、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ、Ｖｅｒｉｔｉサーマルサイクラーを用い、下記表１５に示す条件にて反応させた（所要時間：約４０分）。
【0127】
【表14】
【0128】
【表15】
【0129】
その後、ＡｍｐｕｒｅＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ ｃｏｕｌｔｅｒ社製）を用いてＤＮＡの精製及びプライマーの除去を行った。
【0130】
なお、以上の工程は、図２に示すとおり、３時間弱にて行なうことができた。
【0131】
（サンガーシーケンスによるＨＴＬＶ－１のクロナリティ解析）
上述の（工程６）にて得られた増幅産物をテンプレートとし、アダプター特異的なプライマー（Ｓａｎｇｅｒ ｓｅｑ ｐｒｉｍｅｒ）とＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（サーモフィッシャー社製）を用いてシーケンス反応を行い、３７３０Ｘｌ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ（サーモフィッシャー社製）に供与し、サンガーシーケンスを行った。
上述の（工程６）にて得られた増幅産物をテンプレートとし、アダプター特異的なプライマー（Ｓａｎｇｅｒ ｓｅｑ ｐｒｉｍｅｒ）とＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（サーモフィッシャー社製）を用いてシーケンス反応を行い、３７３０Ｘｌ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ（サーモフィッシャー社製）に供与し、サンガーシーケンスを行った。
【0132】
（ＮＧＳアダプターライブラリーの調製）
上述の（工程６）にて得られた増幅産物の配列決定、すなわちトランスジーン挿入部位の配列決定は、次世代シーケンス解析（ＮＧＳ）に供することにより行なった。
上述の（工程６）にて得られた増幅産物の配列決定、すなわちトランスジーン挿入部位の配列決定は、次世代シーケンス解析（ＮＧＳ）に供することにより行なった。
【0133】
下記表１６に示すとおり、工程６にて調製したＤＮＡ ２μＬをテンプレートとし、下記表１７に示す条件にて反応させることにより、Ｔａｉｌ－ＰＣＲ法により、イルミナ社の次世代シーケンサー用アダプター（インデックスタグ及びフローセル結合領域）を付加した増幅産物（ＮＧＳアダプターライブラリー）を調製した。また、その後、ＡｍｐｕｒｅＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ ｃｏｕｌｔｅｒ社製）を用いてＤＮＡの精製及びプライマーの除去を行った。
【0134】
【表16】
【0135】
【表17】
【0136】
調製したライブラリーは、ｉｌｌｕｍｉｎａ社のＭｉｓｅｑに供与し、シーケンスを行う。シーケンスにより得られた配列（リード）は、ＦＡＳＴＸ－Ｔｏｏｌキットによるプライマー配列と完全一致する配列の抽出、ｓｉｃｋｌｅによるプライマー配列のトリムと低精度配列の除去、ＵｓｅａｒｃｈによるＯＴＵクラスタリング（Ｉｄｅｎｔｉｔｙ ９７％）の工程を経て、ＢＬＡＳＴ＋でホモロジー検索を行った。
【0137】
（実施例１）
ＨＴＬＶ－１が１コピー挿入された感染細胞（ＴＬ－Ｏｍ１）のゲノムＤＮＡと、非感染細胞（Ｊｕｒｋａｔ）のゲノムＤＮＡとを、各プロウイルス量（ＰＶＬ）になるように調整して混合したものを、上述の方法にて解析した。
ＨＴＬＶ－１が１コピー挿入された感染細胞（ＴＬ－Ｏｍ１）のゲノムＤＮＡと、非感染細胞（Ｊｕｒｋａｔ）のゲノムＤＮＡとを、各プロウイルス量（ＰＶＬ）になるように調整して混合したものを、上述の方法にて解析した。
【0138】
その結果、図３に示すとおり、プロウイルス量が０．０３２％という極僅かであっても特異的なバンドを検出することができた。すなわち、本発明によれば、特定の配列（ＨＴＬＶ－１）に隣接する配列（ホストゲノムＤＮＡ）を特異的に増幅することができ、また感度高く検出できることが明らかになった。
【0139】
（実施例２）
各トランスジーン用プライマーを設計し、プライマーを替えた以外は、実施例１と同条件下で反応させ、解析した。その結果、図４に示すとおり、ＨＩＶ－１、ＳＩＶ、ＨＢＶ、アデノウイルス、ゲノム編集のオフターゲット遺伝子組換え植物のいずれにおいても、外来ＤＮＡの挿入部位を特異的に増幅することができることが明らかになった。したがって、本発明によれば、実施例１に示したＨＴＬＶ－１のみならず、汎用性高く、特定の配列（ＨＴＬＶ－１）に隣接する配列（ホストゲノムＤＮＡ）を特異的に増幅することができることが明らかになった。
各トランスジーン用プライマーを設計し、プライマーを替えた以外は、実施例１と同条件下で反応させ、解析した。その結果、図４に示すとおり、ＨＩＶ－１、ＳＩＶ、ＨＢＶ、アデノウイルス、ゲノム編集のオフターゲット遺伝子組換え植物のいずれにおいても、外来ＤＮＡの挿入部位を特異的に増幅することができることが明らかになった。したがって、本発明によれば、実施例１に示したＨＴＬＶ－１のみならず、汎用性高く、特定の配列（ＨＴＬＶ－１）に隣接する配列（ホストゲノムＤＮＡ）を特異的に増幅することができることが明らかになった。
【0140】
（実施例３）
ＨＴＬＶ－１キャリア３検体のゲノムＤＮＡを用いて、実施例１と同条件下で独立して２回反応させ、解析した。その結果、図５に示すとおり、キャリア３検体に関し、ＨＴＬＶ－１挿入部位の増幅を独立して２回行っても、同様なバンドパターンを得ることができた。また、図には示さないが、サンガーシーケンスによるクロナリティ解析、次世代シーケンスにおけるホモロジー検索の結果についても再現性の良いデータが得られた。したがって、本発明によれば、特定の配列（ＨＴＬＶ－１）に隣接する配列（ホストゲノムＤＮＡ）を特異的に、再現性良く増幅できることが明らかになった。
ＨＴＬＶ－１キャリア３検体のゲノムＤＮＡを用いて、実施例１と同条件下で独立して２回反応させ、解析した。その結果、図５に示すとおり、キャリア３検体に関し、ＨＴＬＶ－１挿入部位の増幅を独立して２回行っても、同様なバンドパターンを得ることができた。また、図には示さないが、サンガーシーケンスによるクロナリティ解析、次世代シーケンスにおけるホモロジー検索の結果についても再現性の良いデータが得られた。したがって、本発明によれば、特定の配列（ＨＴＬＶ－１）に隣接する配列（ホストゲノムＤＮＡ）を特異的に、再現性良く増幅できることが明らかになった。
【0141】
（実施例４）
第２のポリデオキシヌクレオチド鎖を付加することの技術的意義を明確にすべく、ＨＴＬＶ－１が１コピー挿入された感染細胞（ＴＬ－Ｏｍ１）のゲノムＤＮＡを対象として、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）非添加にて、工程２及び３（相補鎖３’末端のデオキシヌクレオチドの重合的付加）を行ない、工程５（第１のＰＣＲ）にて得られる増幅産物を、アガロースゲル電気泳動にて解析した。また、ｄＧＴＰを添加して工程２及び３を行ない、工程５にて得られる増幅産物と比較した。
第２のポリデオキシヌクレオチド鎖を付加することの技術的意義を明確にすべく、ＨＴＬＶ－１が１コピー挿入された感染細胞（ＴＬ－Ｏｍ１）のゲノムＤＮＡを対象として、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）非添加にて、工程２及び３（相補鎖３’末端のデオキシヌクレオチドの重合的付加）を行ない、工程５（第１のＰＣＲ）にて得られる増幅産物を、アガロースゲル電気泳動にて解析した。また、ｄＧＴＰを添加して工程２及び３を行ない、工程５にて得られる増幅産物と比較した。
【0142】
その結果、図６に示すとおり、ｄＧＴＰを添加しない場合、非特異的増幅産物由来のバンドが検出された。対して、ｄＧＴＰを添加した場合では、このバンドは検出されなかった。したがって、特定の配列に隣接する配列を特異的に増幅するためには、第２のポリデオキシヌクレオチド鎖を付加することが必要であることが明らかになった。
【0143】
（実施例５）
第１のリバースプライマーに第４、第５のヌクレオチドを含めることの技術的意義を明確にすべく、ＨＴＬＶ－１が多コピー挿入された感染細胞（ＳＬＢ１）のゲノムＤＮＡを対象として、第１のリバースプライマーについて、第４、第５のヌクレオチドを含むもの（Ｏｌｉｇｏ－ｄＴ－ＡＤ２）、第５のヌクレオチドを含まないもの（Ｏｌｉｇｏ－ｄＴ－ＡＤ３）、第４、第５のヌクレオチドを含まないもの（Ｏｌｉｇｏ－ｄＴ－ＡＤ４）を各々用い、工程４（２本鎖ＤＮＡの合成）を実施し、工程６（第２のＰＣＲ）にて得られる増幅産物を、アガロースゲル電気泳動にて解析した。
第１のリバースプライマーに第４、第５のヌクレオチドを含めることの技術的意義を明確にすべく、ＨＴＬＶ－１が多コピー挿入された感染細胞（ＳＬＢ１）のゲノムＤＮＡを対象として、第１のリバースプライマーについて、第４、第５のヌクレオチドを含むもの（Ｏｌｉｇｏ－ｄＴ－ＡＤ２）、第５のヌクレオチドを含まないもの（Ｏｌｉｇｏ－ｄＴ－ＡＤ３）、第４、第５のヌクレオチドを含まないもの（Ｏｌｉｇｏ－ｄＴ－ＡＤ４）を各々用い、工程４（２本鎖ＤＮＡの合成）を実施し、工程６（第２のＰＣＲ）にて得られる増幅産物を、アガロースゲル電気泳動にて解析した。
【0144】
その結果、図７に示すとおり、Ｏｌｉｇｏ－ｄＴ－ＡＤ２、Ｏｌｉｇｏ－ｄＴ－ＡＤ３、Ｏｌｉｇｏ－ｄＴ－ＡＤ４の順で反応産物の増幅長がより短鎖長側に収束していることが明らかになった。すなわち、第１のリバースプライマーは、第４及び／又は第５のヌクレオチドを含めることによって、増幅長の増大を伴う、第１のポリデオキシヌクレオチド鎖等への非特異的なアニーリングが抑制される一方で、当該プライマーは、隣接配列に対する相補的な配列と第１のポリデオキシヌクレオチド鎖との結合部位により特異性高くアニーリングしていることが明らかになった。このことから、第４及び／又は第５のヌクレオチドを第１のリバースプライマーに含めることは、特定の配列に隣接する配列を増幅する上で必要ではないが、特異性を高めるという観点から望ましいことが示唆される。
【0145】
（実施例６）
本発明の方法によれば、ＲＮＡ鎖を対象としても、その鎖中の特定配列に隣接する配列を増幅し、更にはその配列を決定することができることを、以下に示す方法にて確認した。すなわち、ヒトＴＣＲα（ＴＣＲＡ）及びＴＣＲβ（ＴＣＲＢ）をコードするＲＮＡにおいて、定常領域をコードする配列に隣接する、各可変領域をコードする配列を増幅し、それらの配列決定を試みた。
本発明の方法によれば、ＲＮＡ鎖を対象としても、その鎖中の特定配列に隣接する配列を増幅し、更にはその配列を決定することができることを、以下に示す方法にて確認した。すなわち、ヒトＴＣＲα（ＴＣＲＡ）及びＴＣＲβ（ＴＣＲＢ）をコードするＲＮＡにおいて、定常領域をコードする配列に隣接する、各可変領域をコードする配列を増幅し、それらの配列決定を試みた。
【0146】
なお、実施例６において用いた各プライマーの配列は表１８に示すとおりである。また各反応における温度制御には、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製、Ｖｅｒｉｔｉサーマルサイクラーを用いた。
【0147】
【表18】
【0148】
（ＲＮＡの調製）
成人Ｔ細胞白血病リンパ腫（ＡＴＬＬ）細胞株（ＨＴＬＶ－１が１コピー挿入された感染細胞（ＴＬ－Ｏｍ１））から、ＲＮＡ抽出・精製キット（Ｚｙｍｏ ｒｅｓｅａｒｃｈ社製、Ｑｕｉｃｋ－ＲＮＡ ｍｉｎｉｐｒｅｐ）を用い、その添付のプロトコールに沿って、トータルＲＮＡを調製した。
成人Ｔ細胞白血病リンパ腫（ＡＴＬＬ）細胞株（ＨＴＬＶ－１が１コピー挿入された感染細胞（ＴＬ－Ｏｍ１））から、ＲＮＡ抽出・精製キット（Ｚｙｍｏ ｒｅｓｅａｒｃｈ社製、Ｑｕｉｃｋ－ＲＮＡ ｍｉｎｉｐｒｅｐ）を用い、その添付のプロトコールに沿って、トータルＲＮＡを調製した。
【0149】
そして、図１に示す工程にて、ＴＣＲ可変領域をコードする配列の増幅を試みた。
【0150】
（工程１） 相補鎖の合成
定常領域と可変領域とをコードする１本鎖ＤＮＡを合成すべく、先ず、前記ＲＮＡを鋳型とし、下記表１９に示す組成になるよう混合した。なお、鋳型とするＲＮＡの添加量に応じ、全量が３．２５μＬになるよう、ＤＥＰＣ処理水の添加量を適宜調整した。
定常領域と可変領域とをコードする１本鎖ＤＮＡを合成すべく、先ず、前記ＲＮＡを鋳型とし、下記表１９に示す組成になるよう混合した。なお、鋳型とするＲＮＡの添加量に応じ、全量が３．２５μＬになるよう、ＤＥＰＣ処理水の添加量を適宜調整した。
【0151】
【表19】
【0152】
そして、前記ＲＮＡとＦ１プライマー等との混合液を、６５℃で５分間インキュベートした後、少なくとも１分間は氷上に静置し、ＲＮＡとＦ１プライマーとをアニーリングさせた。
【0153】
次に、下記表２０に示す組成の混合液を添加して、５４℃で１０分間インキュベートし、逆転写反応により、前記１本鎖ＤＮＡを合成した。
【0154】
【表20】
【0155】
合成された１本鎖ＤＮＡの精製とＦ１プライマーの除去は、Ｍｏｎａｒｃｈ ＰＣＲ＆ＤＮＡクリーンナップキットを用い、その付属の説明書に従って行った。そして、当該キットに付属のカラムに一旦結合させた１本鎖ＤＮＡの溶出は、９．２μＬの水を添加して行ない、結果約８．０μＬのサンプルを回収した。
【0156】
（工程２及び３） 相補鎖３’末端のポリＡＧテール化
精製された１本鎖ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）と、ターミナルデオキシトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）及びその反応バッファー（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）とｄＡＴＰを、下記表２１に示す組成になるよう混合し、３７℃、３０分間反応させることによって、前記１本鎖ＤＮＡの３’末端のポリＡテーリングを行った。
精製された１本鎖ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）と、ターミナルデオキシトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）及びその反応バッファー（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）とｄＡＴＰを、下記表２１に示す組成になるよう混合し、３７℃、３０分間反応させることによって、前記１本鎖ＤＮＡの３’末端のポリＡテーリングを行った。
【0157】
【表21】
【0158】
その後、下記表２２に示す組成になるよう、ｄＧＴＰを加え、更に３７℃、１５分間反応させることによって、前記１本鎖ＤＮＡの３’末端にポリＡＧを付加した。
【0159】
【表22】
【0160】
その後、７５℃、１０分間の加熱処理を行なうことにより、ターミナルデオキシトランスフェラーゼの不活化を行った。
【0161】
（工程４） ２本鎖ＤＮＡの合成
２本鎖ＤＮＡの合成は、前記工程３の反応液に、下記表２３に示す組成になるよう、オリゴｄＴアダプタープライマー（Ｏｌｉｇｏ－ｄＴ－ＡＤ２）とＱ５ホットスタート高正確性ＤＮＡポリメラーゼ反応液（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）とを直接加え、下記表２４に示すタッチダウン条件下で反応させた。なお、次の工程に移行するまで得られたサンプルは４℃にて維持した。
２本鎖ＤＮＡの合成は、前記工程３の反応液に、下記表２３に示す組成になるよう、オリゴｄＴアダプタープライマー（Ｏｌｉｇｏ－ｄＴ－ＡＤ２）とＱ５ホットスタート高正確性ＤＮＡポリメラーゼ反応液（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）とを直接加え、下記表２４に示すタッチダウン条件下で反応させた。なお、次の工程に移行するまで得られたサンプルは４℃にて維持した。
【0162】
【表23】
【0163】
【表24】
【0164】
（工程５） 第１のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
２本鎖ＤＮＡの増幅は、工程４の反応液に、下記表２５に示す組成になるよう、ＴＣＲＡ及びＴＣＲＢの各々の定常領域に特異的なＦ２プライマーミックスを直接加え、下記表２６に示す条件にて反応させた。
２本鎖ＤＮＡの増幅は、工程４の反応液に、下記表２５に示す組成になるよう、ＴＣＲＡ及びＴＣＲＢの各々の定常領域に特異的なＦ２プライマーミックスを直接加え、下記表２６に示す条件にて反応させた。
【0165】
【表25】
【0166】
【表26】
【0167】
（工程６） 第２のＰＣＲ
工程５で増幅されたＤＮＡを１／２００希釈し、ＴＣＲＡ及びＴＣＲＢの各々の定常領域に特異的なＦ３プライマーとアダプタープライマー１（ＡＤＰ１－ＮＧＳ－Ｒ１）とＫＯＤ－Ｐｌｕｓ Ｎｅｏ反応液（東洋紡社製）を、下記表２７に示す組成になるよう混合し、下記表２８に示す条件にて反応させた。
工程５で増幅されたＤＮＡを１／２００希釈し、ＴＣＲＡ及びＴＣＲＢの各々の定常領域に特異的なＦ３プライマーとアダプタープライマー１（ＡＤＰ１－ＮＧＳ－Ｒ１）とＫＯＤ－Ｐｌｕｓ Ｎｅｏ反応液（東洋紡社製）を、下記表２７に示す組成になるよう混合し、下記表２８に示す条件にて反応させた。
【0168】
【表27】
【0169】
【表28】
【0170】
その後、ＡｍｐｕｒｅＸＰを用いてＤＮＡの精製及びプライマーの除去を行った。
【0171】
（サンガーシーケンスによるＴＣＲレパトア解析）
上述の（工程６）にて得られた増幅産物をテンプレートとし、アダプター特異的なプライマー（Ｓａｎｇｅｒ ｓｅｑ ｐｒｉｍｅｒ）とＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（サーモフィッシャー社製）を用いてシーケンス反応を行い、３７３０Ｘｌ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ（サーモフィッシャー社製）に供与し、サンガーシーケンスを行った。そして、得られた各配列をＶ－ＱＵＥＳＴのデータベースに照合した。その結果、表２９及び３０に示すとおり、α遺伝子、β遺伝子の再構成結果を同定することができた（なお、表２９にヒトＴＣＲＡ遺伝子の再構成解析結果を示し、表３０にヒトＴＣＲＢ遺伝子の再構成解析結果を示す）。
上述の（工程６）にて得られた増幅産物をテンプレートとし、アダプター特異的なプライマー（Ｓａｎｇｅｒ ｓｅｑ ｐｒｉｍｅｒ）とＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（サーモフィッシャー社製）を用いてシーケンス反応を行い、３７３０Ｘｌ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ（サーモフィッシャー社製）に供与し、サンガーシーケンスを行った。そして、得られた各配列をＶ－ＱＵＥＳＴのデータベースに照合した。その結果、表２９及び３０に示すとおり、α遺伝子、β遺伝子の再構成結果を同定することができた（なお、表２９にヒトＴＣＲＡ遺伝子の再構成解析結果を示し、表３０にヒトＴＣＲＢ遺伝子の再構成解析結果を示す）。
【0172】
【表29】
【0173】
【表30】
【産業上の利用可能性】
【0174】
以上説明したように、本発明によれば、短時間に効率良く、感度高く、低コストで、汎用性高く、また再現性良く、特定の配列に隣接する配列を増幅し、更にはその配列を決定することが可能となる。
【0175】
したがって、本発明は、遺伝子治療、ゲノム編集等の遺伝子改変技術、更にはウイルス関連疾患における、外来ＤＮＡ（特定配列）のホストゲノム上への挿入部位（隣接配列）を同定する上で優れているため、遺伝子改変技術の安全性評価、ウイルス関連疾患の診断法及び治療法の開発等において極めて有用である。また、上述のとおり、ＴＣＲレパトア解析においても極めて有用である。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【配列表】