特許 7426104 ＣＤ３０＋腫瘍の治療のためのＣＡＲ－ＣＤ３０Ｔ細胞

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-01-24

(45)【発行日】2024-02-01

(54)【発明の名称】ＣＤ３０＋腫瘍の治療のためのＣＡＲ－ＣＤ３０Ｔ細胞

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/62 20060101AFI20240125BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20240125BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20240125BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20240125BHJP

   C07K 14/725 20060101ALI20240125BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20240125BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240125BHJP

   C12N 15/85 20060101ALI20240125BHJP

   C12N 15/867 20060101ALI20240125BHJP

   C12N 15/861 20060101ALI20240125BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240125BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240125BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20240125BHJP

   A61K 35/12 20150101ALI20240125BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240125BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20240125BHJP

   C12P 21/08 20060101ALN20240125BHJP

   C12P 21/02 20060101ALN20240125BHJP

【ＦＩ】

C12N15/62 Z ZNA

C12N15/13

C12N15/12

C07K19/00

C07K14/725

C07K16/28

C12N15/63 Z

C12N15/85 Z

C12N15/867 Z

C12N15/861 Z

C12N5/10

A61K39/395 T

A61K48/00

A61K35/12

A61P35/00

A61P35/02

C12P21/08

C12P21/02 C

【請求項の数】 22

(21)【出願番号】P 2020571929

(86)(22)【出願日】2019-03-12

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2021-07-26

(86)【国際出願番号】 IT2019050053

(87)【国際公開番号】W WO2019175910

(87)【国際公開日】2019-09-19

【審査請求日】2021-12-15

(31)【優先権主張番号】102018000003464

(32)【優先日】2018-03-13

(33)【優先権主張国・地域又は機関】IT

(73)【特許権者】

【識別番号】520352377

【氏名又は名称】オスペダーレ ペディアトリコ バンビーノ ジェス

【氏名又は名称原語表記】ＯＳＰＥＤＡＬＥ ＰＥＤＩＡＴＲＩＣＯ ＢＡＭＢＩＮＯ ＧＥＳＵ’

(74)【代理人】

【識別番号】100107456

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 成人

(74)【代理人】

【識別番号】100211199

【弁理士】

【氏名又は名称】原田 さやか

(74)【代理人】

【識別番号】100162352

【弁理士】

【氏名又は名称】酒巻 順一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100123995

【弁理士】

【氏名又は名称】野田 雅一

(72)【発明者】

【氏名】デ アンジェリス， ビアジョ

(72)【発明者】

【氏名】クインタレッリ， コンチェッタ

(72)【発明者】

【氏名】カルーアナ， イグナチオ

(72)【発明者】

【氏名】ロカッテリ， フランコ

【審査官】田ノ上 拓自

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１７／０６６１２２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１６／１３４２８４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】中国特許出願公開第１０７７５９６９９（ＣＮ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１３／１５３３９１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】米国特許出願公開第２０１７／０３３４９６７（ＵＳ，Ａ１）

【文献】BMJ Open, 2016年，Vol.6，e013904 (p.1-7)，doi:10.1136/bmjopen-2016-013904

【文献】Molecular Therapy－Oncolytics, 2016年，Vol.3，16014 (p.1-7)，doi:10.1038/mto.2016.14

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０

Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００

Ｃ１２Ｎ ５／１０

Ａ６１Ｋ ３９／３９５

Ａ６１Ｋ ４８／００

Ａ６１Ｋ ３５／１２

Ａ６１Ｐ ３５／００

Ａ６１Ｐ ３５／０２

Ｃ１２Ｐ ２１／０８

Ｃ１２Ｐ ２１／０２

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

Ｎ末端からＣ末端までに、
ａ）シグナルペプチドであって、第１のリンカーにより以下に連結されている、シグナルペプチド、
ｂ）ＡＣ１０ ＶＬ配列：DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDFDGDSYMNWYQQKPGQPPKVLIYAASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQQSNEDPWTFGGGTKLEIK（配列番号２）及びＡＣ１０ ＶＨ配列：QIQLQQSGPEVVKPGASVKISCKASGYTFTDYYITWVKQKPGQGLEWIGWIYPGSGNTKYNEKFKGKATLTVDTSSSTAFMQLSSLTSEDTAVYFCANYGNYWFAYWGQGTQVTVSA（配列番号３）を含むか、又はこれらからなる、ＡＣ１０ハイブリドーマ由来の抗ＣＤ３０一本鎖抗体ドメインであって、前記ＡＣ１０ ＶＬ及びＶＨ配列が、第２のリンカーにより連結されている、抗ＣＤ３０一本鎖抗体ドメイン、
ｃ）ΔＣＤ３４：ELPTQGTFSNVSTNVS（配列番号４）である、追跡可能なマーカー、
ｄ）ヒンジＣＤ８α：PAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFA（配列番号７）、ヒンジＣＤ２８：IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP（配列番号８）、ヒンジＣＨ２－ＣＨ３：ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK（配列番号９）、及びヒンジＣＨ３：ESKYGPPCPSCPGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK（配列番号１０）からなる群から選択される、ヒンジ、
ｅ）ＣＤ２８ＴＭ：FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV（配列番号１３）、及びＣＤ８ａＴＭCDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT（配列番号１４）からなる群から選択される、膜貫通ドメイン、並びに
ｆ）ＣＤ２８細胞質配列RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS（配列番号２１）、ＯＸ４０配列RDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI（配列番号２４）及びＣＤ３ゼータ鎖：RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR（配列番号２３）を連結させることにより得られる配列からなる、共刺激シグナル伝達ドメイン
を含むか、又はこれからなるＣＤ３０キメラ抗原受容体。

【請求項2】

ＡＣ１０ ＶＬ及びＶＨ配列を連結させる第２のリンカーが、プロリンリッチな強固なリンカー、又はグリシンリッチな可動性リンカーからなる群から選択される、請求項１に記載のＣＤ３０キメラ抗原受容体。

【請求項3】

ＡＣ１０ ＶＨ配列及び追跡可能なマーカー配列が、第３のリンカーの配列ＧＳにより連結されている、請求項１又は２に記載のＣＤ３０キメラ抗原受容体。

【請求項4】

膜貫通ドメイン配列及び共刺激シグナル伝達ドメイン配列が、ＣＤ８ａ細胞質（ｃｙｔｏ）：LYCNHRN（配列番号２５）又はＥＦを含むか、又はこれからなる１つ又は複数のリンカーにより連結されている、請求項１～３のいずれか一項に記載のＣＤ３０キメラ抗原受容体。

【請求項5】

シグナルペプチドが、ＭＥＦＧＬＳＷＬＦＬＶＡＩＬＫＧＶＱＣ（配列番号１）を含むか、又はこれからなるシグナルペプチドである、請求項１～４のいずれか一項に記載のＣＤ３０キメラ抗原受容体。

【請求項6】

ａ）MEFGLSWLFLVAILKGVQC（配列番号１）を含むか、又はこれからなるシグナルペプチドであって、第１のリンカーにより以下に連結されている、シグナルペプチド、
ｂ）ＡＣ１０ ＶＬ配列：DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDFDGDSYMNWYQQKPGQPPKVLIYAASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQQSNEDPWTFGGGTKLEIK（配列番号２）及びＡＣ１０ ＶＨ配列：QIQLQQSGPEVVKPGASVKISCKASGYTFTDYYITWVKQKPGQGLEWIGWIYPGSGNTKYNEKFKGKATLTVDTSSSTAFMQLSSLTSEDTAVYFCANYGNYWFAYWGQGTQVTVSA（配列番号３）を含むか、又はこれらからなる、ＡＣ１０ハイブリドーマ由来の抗ＣＤ３０一本鎖抗体ドメインであって、前記ＡＣ１０ ＶＬ及びＶＨ配列が、第２のリンカー（Ｇ４Ｓ）２リンカー：GGGGSGGGG（配列番号１７）により連結されている、抗ＣＤ３０一本鎖抗体ドメイン、
ｃ）ΔＣＤ３４：ELPTQGTFSNVSTNVS（配列番号４）からなる追跡可能なマーカー、
ｄ）ヒンジＣＤ８αPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFA（配列番号７）、
ｅ）リンカーＣＤ８ａ細胞質（ｃｙｔｏ）：LYCNHRN（配列番号２５）を含むか、又はこれからなる１つ又は複数のリンカーにより、以下に連結されている膜貫通ドメインＣＤ８ａＴＭCDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT（配列番号１４）、
ｆ）ＣＤ２８細胞質配列：RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS（配列番号２１）、ＯＸ４０配列：RDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI（配列番号２４）、及びＣＤ３ゼータ鎖：RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR（配列番号２３）を連結させることにより得られる配列からなる、共刺激シグナル伝達ドメインである、請求項１～５のいずれか一項に記載のＣＤ３０キメラ抗原受容体。

【請求項7】

MEFGLSWLFLVAILKGVQCSRDIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDFDGDSYMNWYQQKPGQPPKVLIYAASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQQSNEDPWTFGGGTKLEIKGGGSGGGGQIQLQQSGPEVVKPGASVKISCKASGYTFTDYYITWVKQKPGQGLEWIGWIYPGSGNTKYNEKFKGKATLTVDTSSSTAFMQLSSLTSEDTAVYFCANYGNYWFAYWGQGTQVTVSAGSELPTQGTFSNVSTNVSPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNEFRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKIRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR（配列番号２７）からなる、請求項１～６のいずれか一項に記載のＣＤ３０キメラ抗原受容体。

【請求項8】

請求項１～７のいずれか一項に記載のＣＤ３０キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチド。

【請求項9】

ATGGAGTTTGGGCTCTCCTGGCTCTTCCTGGTCGCGATTCTGAAGGGGGTCCAGTGTTCACGAGATATCGTCCTGACTCAGAGTCCTGCCAGCCTGGCAGTCTCCCTGGGACAGAGAGCTACCATAAGTTGTAAAGCATCACAGTCTGTTGATTTCGATGGCGACAGCTATATGAATTGGTACCAGCAAAAACCCGGCCAGCCCCCGAAAGTTTTGATCTATGCAGCCTCTAACTTGGAAAGCGGCATTCCTGCGCGATTCAGTGGCAGCGGGAGTGGTACAGATTTCACCCTGAACATACACCCAGTCGAAGAGGAGGACGCAGCCACATATTACTGCCAACAATCTAACGAGGATCCATGGACTTTTGGGGGCGGCACTAAACTCGAAATCAAGGGCGGAGGTTCAGGCGGAGGAGGGCAGATTCAACTGCAGCAATCAGGACCCGAGGTGGTCAAACCAGGTGCCAGTGTCAAGATATCTTGCAAGGCATCCGGATATACATTTACCGACTATTACATTACCTGGGTCAAGCAGAAACCCGGGCAAGGACTTGAATGGATTGGATGGATCTACCCTGGTAGCGGCAACACCAAATACAACGAAAAGTTTAAAGGGAAGGCAACCCTGACTGTAGACACCTCCAGCTCCACAGCATTCATGCAGCTCTCCTCACTGACCTCCGAGGACACAGCAGTGTATTTCTGTGCTAATTACGGTAATTACTGGTTCGCCTATTGGGGCCAGGGAACCCAAGTGACCGTTTCAGCTGGATCCGAACTTCCTACTCAGGGGACTTTCTCAAACGTTAGCACAAACGTAAGTCCCGCCCCAAGACCCCCCACACCTGCGCCGACCATTGCTTCTCAACCCCTGAGTTTGAGACCCGAGGCCTGCCGGCCAGCTGCCGGCGGGGCCGTGCATACAAGAGGACTCGATTTCGCTTGCGACATCTACATCTGGGCTCCCCTCGCTGGCACCTGTGGGGTGCTGCTGCTGTCACTCGTGATCACCCTTTATTGCAACCATCGAAACGAATTCAGAAGTAAACGGTCAAGGCTTCTGCACAGCGATTATATGAATATGACACCAAGAAGACCTGGTCCAACCCGGAAACACTATCAGCCCTACGCGCCCCCTAGAGACTTCGCAGCATACCGCTCTCGCGATCAAAGACTCCCGCCCGATGCCCACAAACCCCCTGGCGGGGGCAGCTTTAGGACACCCATTCAAGAAGAGCAGGCAGACGCCCACAGCACCTTGGCCAAAATTAGAGTTAAATTCAGTAGAAGTGCGGATGCGCCTGCTTACCAGCAGGGCCAGAACCAACTGTACAATGAACTGAATCTCGGGCGCCGAGAAGAGTATGACGTCCTCGATAAGCGGAGGGGTAGGGATCCTGAAATGGGTGGGAAGCCAAGAAGAAAAAACCCCCAGGAAGGACTGTATAACGAACTTCAGAAGGACAAGATGGCAGAGGCCTACTCTGAGATTGGCATGAAAGGCGAACGACGGCGCGGTAAAGGTCATGACGGGCTGTACCAGGGCCTGTCCACAGCGACGAAGGACACTTACGACGCCCTGCACATGCAGGCACTCCCCCCCAGGTGA（配列番号４２）からなる、請求項８に記載のポリヌクレオチド。

【請求項10】

ＤＮＡベクター、ＲＮＡベクター、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター又は非ウイルスベクターである、請求項８又は９に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。

【請求項11】

請求項１０に記載のベクター又はプラスミドを含む、細胞。

【請求項12】

ＩＬ－７及びＩＬ－１５の両方が存在する培養条件下で得られる、請求項１１に記載の細胞。

【請求項13】

請求項８又は９に記載のポリヌクレオチド、又は請求項１０に記載のベクター、又は請求項１１又は１２に記載の細胞を、１つ又は複数の賦形剤及び／又はアジュバントとともに含む医薬組成物。

【請求項14】

医学的使用のための、請求項１３に記載の医薬組成物、又は請求項１～７のいずれか一項に記載のＣＤ３０キメラ抗原受容体、請求項８若しくは９に記載のポリヌクレオチド、請求項１０に記載のベクター若しくは請求項１１若しくは１２に記載の細胞を含む組成物。

【請求項15】

ＣＤ３０^＋がんの治療のための、請求項１３に記載の医薬組成物、又は請求項１～７のいずれか一項に記載のＣＤ３０キメラ抗原受容体、請求項８若しくは９に記載のポリヌクレオチド、請求項１０に記載のベクター若しくは請求項１１若しくは１２に記載の細胞を含む組成物。

【請求項16】

ＣＤ３０^＋がんがＬ４２８^－ＰＤｌ１^＋がんである、請求項１５に記載の医薬組成物又は組成物。

【請求項17】

Ｌ４２８^－ＰＤｌ１^＋がんがリンパ腫又は固形腫瘍から選択される、請求項１６に記載の医薬組成物又は組成物。

【請求項18】

リンパ腫が、ホジキン及び非ホジキンリンパ腫からなる群から選択される、請求項１７に記載の医薬組成物又は組成物。

【請求項19】

固形腫瘍が、筋線維芽細胞性肉腫、ラブドイド腫瘍、組織球性肉腫、胚性癌腫、腺癌、中皮腫、混合胚細胞腫瘍（ＧＣＴ）、非精上皮腫ＧＣＴ、頭頸部癌、卵黄嚢腫瘍、血管肉腫、下垂体腺腫、未分化胚細胞腫、奇形腫及び精上皮腫からなる群から選択される、請求項１７に記載の医薬組成物又は組成物。

【請求項20】

プロリンリッチな強固なリンカーが、マウスｉｇＧ３上部ヒンジ（ｍｌｇＧ３ＵＨ）：PKPSTPPGSS（配列番号１５）、及び（ｍｌｇＧ３ＵＨ）２：PKPSTPPGSSPKPSTPPGSS（配列番号１６）からなる群から選択される、請求項２に記載のＣＤ３０キメラ抗原受容体。

【請求項21】

グリシンリッチな可動性リンカーが、（Ｇ４Ｓ）２リンカー：GGGGSGGGG（配列番号１７）、（Ｇ４Ｓ）４リンカーGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS（配列番号１８）、Ｇ４ＳＧ２リンカーGGGGSGG（配列番号１９）及びＧ３ＳＧ４リンカー：GGGSGGGG（配列番号２０）からなる群から選択される、請求項２に記載のＣＤ３０キメラ抗原受容体。

【請求項22】

細胞の調製のためのプロセスの活性化ステップ、形質導入ステップ及び／又は増殖ステップの培養条件下でＩＬ－７及びＩＬ－１５の両方が存在する培養条件下で得られる、請求項１２に記載の細胞。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ＣＤ３０＋腫瘍の治療ためのＣＡＲ－ＣＤ３０Ｔ細胞に関する。特定には、本発明は、ＣＤ３０＋腫瘍、例えば、リンパ性悪性疾患、白血病、固形腫瘍の治療のための第３世代のＣＡＲ－ＣＲ３０Ｔ細胞に関する。

【背景技術】

【0002】

化学療法抵抗性又は複合的再発性の非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）又はホジキンリンパ腫（ＨＬ）を有するほとんどの患者の予後が、不良のままであることが知られている（１）。同種ＨＳＣＴ（アロＨＳＣＴ）は、種々の亜型のリンパ腫を有する患者を治癒する可能性を提供するが、移植関連死亡率は、高いままであり、慢性移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を含む長期続発症は、生活の質に対して実質的な負の作用を有し得る（２）。

【0003】

アロＨＳＣＴ後の再発性リンパ腫に対するＰＤ－１遮断は、高度に有効であるように思われるが、重度及び治療抵抗性ＧＶＨＤの急激な発症により複雑化されることが多い（３）。ＣＡＲ－Ｔ細胞は、このような患者のための新規の治療法として台頭している。

【0004】

ＣＤ３０（Ｋｉ－１）は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー８（ＴＮＦＲＳＦ８）に由来する細胞膜タンパク質であり、この正常な発現は、活性化Ｔ及びＢ細胞に限定される。腫瘍細胞では、ＣＤ３０の発現は、リンパ性悪性疾患（Ｔ細胞（４）又はＢ細胞系統（５）いずれかの、ホジキン及び非ホジキンリンパ腫、ＣＤ３０＋急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ））と最も一般的に関連している。ＣＤ３０の発現は、ほとんどの成人の非リンパ性悪性疾患においても報告されている。公表されたデータに基づくと、すべての固形腫瘍のうちの２４．５％がまた、ＣＤ３０＋であり、最も注目すべきは、胚細胞腫瘍（筋線維芽細胞性肉腫（９３％）、胚性癌腫（７７％）、中皮腫（７７％）、混合胚細胞腫瘍（ＧＣＴ）（６５％）、頭頸部癌（２４％）、卵黄嚢腫瘍（１８％）、血管肉腫（１４％）、下垂体腺腫（１１％）及び精上皮腫（６％））において、さらなる腫瘍のためのＣＤ３０を標的とした治療の可能性が高まっている（６）。

【0005】

初期ＨＬ患者の９０％が、従来の治療により治癒することができ、進行期の患者の７０％のみが、標準的治療方法により治癒する。再発性疾患を有するＨＬ患者では、半数のみが、標準的サルベージ療法により治癒する（７）。

【0006】

ホジキンリンパ腫（ＨＬ）及び未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）におけるモノクローナル抗体によるＣＤ３０の標的化は著明な臨床的成功をもたらしている。しかし、複合化抗体の毒素成分により主に媒介される有害事象により、多くの患者において治療の中止が生じる。ＣＤ３０特異性キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するＴ細胞によりＣＤ３０を標的化すると、副作用が減少し、抗腫瘍活性が増大し得る。

【0007】

ＣＡＲによりＣＤ３０を標的化する免疫療法的方法は、前臨床モデル（８、９）において有用であることが実証され、２つの異なる独立的臨床試験（１０、１１）において確認されているが、臨床的有用性は、最適ではなかった。

【0008】

第１世代抗ＣＤ３０ＣＡＲ Ｔ細胞は、１９９０年代に開発され、前臨床試験では、このような細胞がＣＤ３０発現ＨＬ細胞株をｉｎ ｖｉｔｒｏで溶解する能力を実証した（１２、１３）。実際、抗ＣＤ３０ＣＡＲにより形質導入されたエプスタイン・バーウイルス特異性細胞毒性Ｔ細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ並びにｉｎ ｖｉｖｏで、マウス異種移植モデルにおいて、ＣＤ３０＋がん細胞株に対する活性を有し、Ｔ細胞の持続性をｉｎ ｖｉｖｏで向上させることがわかっている（８）。

【0009】

注目すべきは、可溶性ＣＤ３０の存在は、細胞溶解を減弱せず、さらにＣＤ３０＋リンパ腫細胞を除去し、ＨＬ細胞から血中に流出したＣＤ３０が、抗ＣＤ３０ＣＡＲ Ｔ細胞の有効性をｉｎ ｖｉｖｏで阻害しないことを示唆した（１４）。

【0010】

第１の試験では、リンパ腫の一貫しない応答が観察され、患者の大多数が、ＣＡＲ Ｔ細胞を複数回注入後に安定状態を示すか、又は応答が全く観察されなかった。全体的に見て、リンパ節は、節外病変よりも良い応答を示し、肺病変の応答は、相対的に不良であると思われ、注入したＣＡＲ Ｔは、注入後６０日を超えて持続しなかった。注目すべきは、いくつかの臨床データ（１５、１６）により、ＣＡＲ－Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｖｏでの持続性が、治療した患者のより良いアウトカムに関連することが明らかに示された。表１にまとめるように、記載する第１の臨床試験では、著者は、ＡＪ８７８６０６．１ハイブリドーマに由来するＣＤ３０抗原に特異性の一本鎖断片可変（ｓｃＦｖ）配列である、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインとともにインフレームの、ヒトＣＤ１３７に由来する共刺激ドメインにより特徴づけられる、第２世代ＣＡＲを保有するレンチウイルスプラットフォームについて考察した（１０）。

【0011】

レンチウイルスベクターにより遺伝子修飾してＣＤ１３７共刺激ドメインを発現させた、抗ＣＤ３０ＣＡＲ Ｔ細胞のある第１の非盲検第Ｉ相臨床試験では、再発性又は難治性ホジキンリンパ腫に罹患している１８名の患者が参加した。１８名の患者は、原発性皮膚未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）を有する１名、及び３つの異なる亜型のホジキンリンパ腫を有する１７名を含み、このほとんどが結節硬化型であった。１３名の患者は、ＣＡＲ Ｔ細胞注入を１サイクル受け、５名は、２サイクル受けた。

【0012】

この試験の予備結果により、７名の部分寛解の達成及び６名の安定状態の達成が実証された。客観的応答は、３９％であった（１０）。

【0013】

第２の試験では、患者の大多数を、ＣＤ３０．ＣＡＲ Ｔ細胞の複数回注入により処置して過渡応答を達成し、注入から６週間後、ＣＤ３０．ＣＡＲ Ｔ細胞は、さらには検出されなかった。表１にまとめるように、この臨床試験では、著者は、ＨＲＳ３ハイブリドーマに由来するＣＤ３０抗原に特異性の一本鎖断片可変（ｓｃＦｖ）配列である、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインとともにインフレームの、ヒトＣＤ２８に由来する共刺激ドメインにより特徴づけられる、第２世代ＣＡＲを保有するレトロウイルスプラットフォームについて考察した。

【0014】

【表1】

【0015】

特定には、第２の臨床試験では、再発性／難治性ＨＬ又はＡＬＣＬを有する９名の患者は、ＣＤ２８共刺激エンドドメインをコードするＣＤ３０特異性ＣＡＲ（ＣＤ３０．ＣＡＲ－Ｔ）を発現させるようにレトロウイルスベクターにより遺伝子修飾した自己Ｔ細胞を注入した。注目すべきは、このような患者のうちの７名は、ブレンツキシマブ抵抗性疾患を有していた。この試験の予備結果により、９名のうち３名の完全寛解が実証され、３名が、一過的安定状態を有した。ＣＡＲ－Ｔ細胞の持続性は、この試験では、８週間未満であったが、腫瘍生検では、Ｔ細胞のリンパ腫部位への効率的輸送が示された（１１）。

【0016】

両臨床試験により、複数回のＣＤ３０．ＣＡＴ－Ｔ細胞注入は、耐容性が良いことが教示される。宿主のリンパ球を枯渇させた後にＣＡＲ－Ｔを注入すると、ＣＡＲ Ｔ細胞の増殖及びこれらの抗腫瘍活性のさらなる向上において有益である。さらに重要なことには、ＣＡＲ－Ｔ細胞の持続性は、臨床応答と相関する。

【0017】

このようなすべてのデータにより、ＣＤ３０．ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＨＬを有する患者において、安全であり、臨床応答を生じ得ることが示されるが、この治療のさらなる最適化は、ｉｎ ｖｉｖｏでの長期の持続性、及び特に、リンパ腫の再発において、高度な抗腫瘍制御を達成することが認められる。

【0018】

特定には、方法の最適化は、古典的ホジキンリンパ腫（ｃＨＬ）及び未分化大Ｔ細胞リンパ腫が、ほんのわずかな悪性のリード・シュテルンベルク及びホジキン細胞（ＨＲＳ）により、並びに炎症細胞の存在量により特徴づけられることを考慮すべきである。このような非悪性細胞は、腫瘍免疫回避に関与する、可溶性又は膜結合分子を産生する。その上、ＨＬ腫瘍は、腫瘍内を通行し蓄積するＴ細胞亜型に著しく影響するケモカイン環境を産生する（１７）。実際、ＨＲＳ細胞は、ヘルパーＴ（Ｔｈ２）細胞及び制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を誘引するケモカインＴＡＲＣ及びＭＤＣを産生し、これは、このようなケモカインの受容体であるＣＣＲ４を発現する。ＨＬを含む腫瘍におけるＴｒｅｇ（及びＴｈ２細胞）の存在量は、腫瘍部位に達することが可能な、わずかな細胞毒性エフェクターＴリンパ球の抗腫瘍活性を障害することにより、不適な免疫微小環境を形成する。ＣＤ３０特異性キメラ抗原受容体（ＣＡＲ－ＣＤ３０）に対してＣＣＲ４が強制発現すると、ＨＬにより産生されたＴＡＲＣの勾配に対してＣＡＲ－ＣＤ３０Ｔにより再度方向づけられたエフェクターＴリンパ球の遊走が促進される（９）。ＨＲＳ細胞は、高レベルのＰＤＬ１を発現することが多く、免疫抑制性ＩＬ－１０、ＴＧＦ－ベータ、ガレクチン１及びプロスタグランジンＥ２を産生し、これらは、Ｔ細胞エフェクター機能を阻害して、ＣＤ９５リガンドの誘導により、活性化Ｔｈ１及びＣＤ８＋Ｔ細胞のアポトーシスを誘導する。また、ＩＬ－１５が、Ｔ－ｒｅｇの存在下で、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）－ＣＴＬの生存、増殖、及びエフェクター機能を選択的に好むことが最近示されている（１８）。その上、Ｔ細胞の末梢組織への遊走を促進することが知られているケモカイン受容体である、ＣＸＣＲ４及びＣＸＣＲ３を高レベルで発現するＩＬ－７／ＩＬ－１５により、ＣＡＲ－ＣＤ３０Ｔ細胞が増殖することが最近示されている（１１）。

【0019】

その上、前臨床試験により、ＣＤ２８及び４－１ＢＢ共受容体を複合させる第３世代のＣＡＲ－Ｔ細胞が、ＣＤ２８シグナルドメインを保有する第２世代ＣＡＲ－Ｔ細胞と比較して、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの優れた活性化及び増殖能力を有し得ることが示され、両方の種類の細胞は、ＣＤ１９＋Ｂ細胞の除去においてｉｎ ｖｉｖｏで同等の有効性を示したが（１９）、このことは、ＣＡＲ．ＣＤ３０については、それまでに実証されていなかった。他のＣＡＲ－ＣＤ３０Ｔ細胞は、公知であり、例えば、国際公開第２０１７／０６６１２２号、国際公開第２０１６／１３４２８４号及び中国特許第１０７７５９６９９号に記載されているものが挙げられる。例えば、国際公開第２０１７／０６６１２２号では、ＩＬ２条件下で生成された、５Ｆ１１－２８Ｚ、ＡＣ１０－２８Ｚ及びＸｍＡｂ－２８Ｚ細胞を比較している。

【0020】

使用される、すべてのＣＡＲの形質導入効率が、高レベルであることが報告されているが、５Ｆ１１により、ＡＣ１０及びＸｍＡｂと比較して高い形質導入効率が得られ（表Ａ）、すなわち、細胞をＩＬ２により７日間増殖させる場合、ＡＣ１０（６１．９０％）又はＸｍＡｂ（６４．７０％）に対して、ＣＤ８＋ＣＡＲ（８０．７％）の形質導入が高い割合で得られる。加えて、ＣＤ３０＋腫瘍：ＳＵＤＨＬ－１、ＨＨ及びＢＶ１７３とのＣＡＲ－Ｔ細胞の共培養によるＩＦＮγ産生に関する機能性実験が記載されている。５Ｆ１１－２８Ｚ（ＩＬ２により増殖）は、ＢＶ１７３と共培養した場合、ＡＣ１０－２８Ｚと比較して高いＩＦＮγ産生を示した。すなわち、表Ｄ－１は、５Ｆ１１－２８Ｚが、３７８１ｐｇ／ｍｌのＩＦＮγを産生したが、ＡＣ１０－２８Ｚが、５３８ｐｇ／ｍｌのＩＦＮγを産生したことを示す。その上、５Ｆ１１－２８Ｚは、ＨＤＭＬ－２細胞株と共培養した場合、３５３４ｐｇ／ｍｌのＩＦＮγを産生した。

【0021】

したがって、上記を考慮すれば、公知のＣＡＲ ＣＤ３０Ｔ細胞の不利益を克服することが可能となる、さらなるＣＡＲ ＣＤ３０Ｔ細胞を提供する必要性は明らかである。

【発明の概要】

【0022】

本発明により、第３世代の２つの新規のＣＤ３０特異性キメラ抗原受容体（ＣＡＲ－ＣＤ３０）を、ここで提供する。特定には、次の２つの臨床グレードの第３世代ＣＡＲ ＣＤ３０ＳＦＧレトロウイルスベクターを提供する：
ＳＦＧ．ＣＡＲ．ＣＤ３０（ＡＣ１０）ΔＣＤ３４．ＣＤ８ａＴＭ．ＣＤ２８ｃｙｔｏ．４－１ＢＢ．ζ（２８．４－１ＢＢ．ζ）
ＳＦＧ．ＣＡＲ．ＣＤ３０（ＡＣ１０）ΔＣＤ３４．ＣＤ８ａＴＭ．ＣＤ２８ｃｙｔｏ．ＯＸ４０．ζ（２８．ＯＸ４０．ζ）
これらは、
これまでにＣＡＲ療法に適用されていなかった、ＡＣ１０ハイブリドーマ由来の一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、
遺伝子修飾Ｔ細胞の、ＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞分取）システムによる迅速な同定及び／又は細胞選別システムによる選択のための、追跡可能なマーカーである１６アミノ酸（ａａ）のみ（追跡可能なマーカーとして）のＣＤ３４に由来するエピトープ（ΔＣＤ３４）、
同様のＣＡＲの大部分に適用される免疫原性ＣＨ２－ＣＨ３マウス配列を回避するためのＣＤ８領域により代表されるヒンジ（２０）、
分子の安定化を向上させるためのＣＤ８の膜貫通ドメイン由来の膜貫通ドメイン、
両方がＣＤ３－ζ鎖にそれぞれ融合している、ＣＡＲ－ＣＤ３０ベクターに加えられた２つの共刺激ドメイン：ＣＤ２８（２１、２２）及びＯＸ４０（２３、２４）又はＣＤ２８及び４－１ＢＢ（２５）
を含む。したがって、２つのＳＦＧベクターは、単一の共刺激ドメイン（第１のベクターでは４－１ＢＢ及び第２のベクターではＯＸ４０）により識別することができる。

【0023】

両ＣＡＲ－ＣＤ３０では、領域、追跡可能なマーカー、共刺激ドメイン及びＣＤ３－ζ鎖は、コドン最適化して、効率的なタンパク質発現を向上させた。

【0024】

表２は、公知のＣＡＲ－ＣＤ３０と比較した、本発明によるＣＡＲ－ＣＤ３０の差異を示す。

【0025】

【表2】

【0026】

本発明によるＣＡＲ－ＣＤ３０の上記の配列は、公知のＣＡＲ－ＣＤ３０と比較して予想外の利点、例えば、レトロウイルスプラットフォーム及びＣＤ８ ＴＭドメインの使用により得られる、Ｔ細胞におけるより効率的で安定なＣＡＲ－ＣＤ３０発現、共刺激ドメインに依存する公知のＣＡＲ－ＣＤ３０Ｔ細胞のそれと比較して長期のｉｎ ｖｉｖｏでの持続性、免疫調節及び単一のあるＣＡＲ－ＣＤ３０Ｔ細胞の投与の存在下でさえも高い抗腫瘍活性を、ｓｃＦｖの抗原との親和性及び生成方法の選択、例えば、ＩＬ２に代わるＩＬ７／ＩＬ１５の使用の結果として、総じてもたらす。

【0027】

本明細書により記載するｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでの結果は、本発明による修飾ポリクローナルＣＤ３０ ＣＡＲ Ｔ細胞が、長期共培養で、ＣＤ３０＋腫瘍を非常に効率的に除去することが可能であったことを示す。本発明による生物学的生成物は、ｉｎ ｖｉｖｏでの異種移植モデルにおいて、ホジキン及び非ホジキンリンパ腫を除去し、長期免疫記憶を確立することを示す。

【0028】

さらに詳細には、両方のＳＦＧレトロウイルスベクターにより得られた上清は、活性化したＴ細胞を効率的に形質導入することが可能であり、非常に高レベルの形質導入を有した。ＣＤ３４に由来するエピトープを追跡可能なマーカーとして両構築物に導入すると、遺伝子修飾Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ３４＋）の追跡がｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでの異種移植マウスモデルにおいて容易となる。特に、２８．ＯＸ４０．ζ ＣＡＲ Ｔ細胞について、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの長期培養により示すように、ＩＬ２からＩＬ７／ＩＬ１５の組合せへの切替えにより、ＣＡＲ－ＣＤ３０Ｔ細胞の発現の安定性が向上する。実験では、ＩＬ７／ＩＬ１５の組合せは、Ｔ細胞増殖の動態を向上させ、特に、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの増殖の＋２０日後には著しく明白となる。

【0029】

ＩＬ７／ＩＬ１５によりＣＡＲ－ＣＤ３０Ｔ細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで１５日間培養すると、ＩＬ２によるＴ細胞の増殖に対して、エフェクターメモリー（ＥｆＭ）Ｔ細胞区画の優先的増殖が誘導される。＋１５日目のＣＡＲ－ＣＤ３０Ｔ細胞（ＩＬ２）を、その枯渇プロファイルについて評価すると、ＰＤ１及びＴＩＭ３の有意な基底発現が、特に、２８．ＯＸ４０．ζ Ｔ細胞において見出された。再曝露した腫瘍を２回目に根絶することが可能な、ｉｎ ｖｉｖｏでの異種移植実験モデルにおける長期免疫記憶が、初めて実証されている。

【0030】

ＩＬ２からＩＬ７／ＩＬ１５への切替えにより、両ＣＡＲ Ｔ細胞において、ＰＤ１発現が著しく減少するが、ＴＩＭ３がわずかに控えめに増加する。

【0031】

様々な著者により報告されているように、４．１ＢＢの存在は、ＣＡＲ Ｔ細胞の枯渇プロファイルを単独で低下させる（２６）。培養条件（ＩＬ７／ＩＬ１５）により、特に、２８．ＯＸ４０．ζＴ細胞において、ＰＤ１発現の減少が、さらに促進される。ＰＤＬ１＋腫瘍に対するＣＡＲ修飾Ｔ細胞の効力に関するＰＤ１の基底発現の役割を評価するために、ＰＤＬ１を永続的に形質導入したＬ４２８－ＰＤＬ１リンパ腫細胞株とＣＡＲ修飾Ｔ細胞を共培養したところ、ＣＡＲ修飾Ｔ細胞は、野生型（ＷＴ）Ｌ４２８細胞株に対して、低いエフェクター／標的比であっても、有意差が見られないことが示された。注目すべきは、ストレスを与えた長期共培養において、予想外にも、２８．ＯＸ４０．ζＴ細胞は、カルパス（Ｋａｒｐａｓ）２９９、低いエフェクター／標的比（１：８及び１：１６のＥ：Ｔ比）及びＨＤＭＬ－２に対して、２８．４－１ＢＢ．ζＴ細胞に関して、有意で優れた溶解活性を示す。

【0032】

本発明による結果は、ＩＬ２により増殖した（ＡＣ１０）２８．４－１ＢＢ．ζＴ細胞又は２８．ＯＸ４０．ζが、ＨＤＭＬ－２とともに培養した場合（エフェクター：標的比１：１）、約１０３０３±３３２１．６３ｐｇ／ｍｌ及び２９８７２．１７±８５７２．１８ｐｇ／ｍｌのＩＦＮγをそれぞれ産生し（図９Ｂ）、すなわち、３倍以上のＩＦＮγが、５Ｆ１１－２８Ｚにより産生されたことを明らかに示し、これは、国際公開第２０１７／０６６１２２号に記載されており、ＨＤＭＬ－２細胞株と共培養した場合、５Ｆ１１－２８Ｚは、３５３４ｐｇ／ｍｌのＩＦＮγを産生した。

【0033】

その上、２８．４－１ＢＢ．ζＴ細胞のＩＬ７／ＩＬ１５における増殖は、さらに高いＩＦＮγ産生：２１２７０．１７±１１６２１．２１ｐｇ／ｍｌを示す（図９Ｅ）。加えて、本発明による２８．ＯＸ４０．ζＴ細胞は、ＨＤＭＬ－２と共培養した場合、さらに高いＩＦＮγ産生：２９８７２．１７±８５７２．１８ｐｇ／ｍｌ（これらをＩＬ２で増殖させた場合（図９Ｂ））及び３４４４４．６７±１８８７２．６２ｐｇ／ｍｌ（これらをＩＬ７／ＩＬ１５で増殖させた場合）を示す（図９Ｅ）。

【0034】

また、本発明によるＣＡＲ－Ｔ細胞を、ＩＬ７及びＩＬ１５を含む条件下で調製する場合、ＩＬ２を含む条件下で調製したＣＡＲ Ｔ細胞と比較して、Ｔ細胞におけるＣＡＲ発現の高い長期安定性が、特定には、２８．ＯＸ４０．ζにより、得られることが観察された（図１Ｄ）。本発明の検出可能なＣＡＲの安定性により、ＣＡＲの安定な発現がＴ細胞の膜にもたらされる（図１Ｄ）。特定には、＋５、＋１５及び＋３０日におけるＣＤ８／ＣＤ４の形質導入率を評価した。＋５日目におけるＣＤ８のレベルは、ＣＤ４に対して低くなるが、ＣＤ８ ＣＡＲ＋のレベルは、ＣＤ８では、＋５日目から＋１５日目において経時的に上昇した（図１Ｅ～Ｆ）。加えて、図１Ｌ及び１Ｍに示すように、培養条件におけるＩＬ７／ＩＬ１５の存在により、ＩＬ２を含む条件と比較してＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖倍率が有意に上昇する。

【0035】

図２はまた、培養条件におけるＩＬ７／ＩＬ１５の存在が、ＣＡＲ－Ｔ細胞の枯渇プロファイルの低下に関して重要であることを示す。

【0036】

また、最大２４０日注入した２８．ＯＸ４０．ζＴ細胞の長期持続性を観察した（図１１）。

【0037】

加えて、本発明によれば、ＣＤ２８．ＯＸ４０共刺激ドメインを有するＣＡＲ．ＣＤ３０Ｔ細胞が、４．１ＢＢ共刺激ドメインを有するＣＡＲ．ＣＤ３０Ｔ細胞に対して、ＣＤ３０＋リンパ腫を最大４回、経時的に追加する間に（「ストレスを与えた」共培養）、カルパス２９９をより効率的に制御可能であることが見出された（図１３Ａ～Ｂ）。

【0038】

興味深いことには、ＣＡＲ＋陽性細胞の割合は、第１の腫瘍の曝露後に上昇し、２８．４－１ＢＢ．ζ Ｔ細胞及び２８．ＯＸ４０．ζ Ｔ細胞において、６１．７％±１８．４％及び７５．０％±１１．３％（０日目）から９３．４％±３．４％及び９３．５％±３．１％（＋５日）までそれぞれ上昇した（ｐ＝０．０４９及びｐ＝０．０２６）（図１３Ｃ）。さらに、引き続く腫瘍の再曝露により、遺伝子修飾Ｔ細胞の割合及び蛍光強度中央値（ＭＦＩ）は、２８．ＯＸ４０．ζ Ｔ細胞についてのみ、経時的に安定なままであった（図１３Ｃ～Ｄ）。

【0039】

その上、ＣＤ２８．ＯＸ４０共刺激ドメインを有するＣＡＲ．ＣＤ３０Ｔ細胞は、カルパス２９９腫瘍細胞株と共培養した場合、２８．４－１ＢＢ．ζに対して、有意に高い量のＩＦＮガンマ（図１３Ｅ）、ＩＬ－２（図１３Ｆ）及びＴＮＦアルファ（図１３Ｇ）を産生した。

【0040】

その上、両ＣＡＲ－ＣＤ３０Ｔ細胞は、線維形成性小脳髄芽腫ＤＡＯＹ（図５Ｄ及び図７Ｇ）、横紋筋肉腫ＲＤ腫瘍細胞株（図７Ｉ～Ｊ）及び胚性癌腫のように、固形ＣＤ３０＋腫瘍に対しても細胞毒性作用を示す。全体的に見て、このすべての結果により、本発明による構築物を使用してＣＤ３０＋腫瘍患者を効率的に治療することが可能であることが非常に妥当なものとなっている。

【0041】

したがって、本発明の目的は、Ｎ末端からＣ末端までに、
ａ）シグナルペプチド、例えば、MEFGLSWLFLVAILKGVQC（配列番号１）（ヌクレオチド識別番号ＡＢ７７６８３８．１及びタンパク質識別番号ＢＡＮ６３１３１．１）を含むか、又はこれからなるシグナルペプチドであって、第１のリンカーにより以下に連結されている、シグナルペプチド、
ｂ）ＡＣ１０ ＶＬ配列：DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDFDGDSYMNWYQQKPGQPPKVLIYAASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQQSNEDPWTFGGGTKLEIK（配列番号２）及びＡＣ１０ ＶＨ配列：QIQLQQSGPEVVKPGASVKISCKASGYTFTDYYITWVKQKPGQGLEWIGWIYPGSGNTKYNEKFKGKATLTVDTSSSTAFMQLSSLTSEDTAVYFCANYGNYWFAYWGQGTQVTVSA（配列番号３）を含むか、又はこれらからなる、ＡＣ１０ハイブリドーマ由来の抗ＣＤ３０一本鎖抗体ドメインであって、上記ＡＣ１０ ＶＬ及びＶＨ配列が、第２のリンカーにより連結されている、抗ＣＤ３０一本鎖抗体ドメイン、
ｃ）ΔＣＤ３４：ELPTQGTFSNVSTNVS（配列番号４）（ヌクレオチド識別番号ＡＢ２３８２３１．１及びタンパク質識別番号ＢＡＥ４６７４８．１）、ΔＣＤ１９：PEEPLVVKVEEGDNAVLQCLKGTSDGPTQQLTWSRESPLKPFLKLSLGLPGLGIHMRPLAIWLFIFNVSQQMGGFYLCQPGPPSEKAWQPGWTVNVEGSGELFRWNVSDLGGLGCGLKNRSSEGPSSPSGKLMSPKLYVWAKDRPEIWEGEPPCLPPRDSLNQSLSQDLTMAPGSTLWLSCGVPPDSVSRGPLSWTHVHPKGPKSLLSLELKDDRPARDMWVMETGLLLPRATAQDAGKYYCHRGNLTMSFHLEITARPVLWHWLLRTGGWK（配列番号５）（ヌクレオチド識別番号Ｍ２１０９７．１及びタンパク質識別番号ＡＡＡ３５５３３．１）、ＮＧＦＲ：KEACPTGLYTHSGECCKACNLGEGVAQPCGANQTVCEPCLDSVTFSDVVSATEPCKPCTECVGLQSMSAPCVEADDAVCRCAYGYYQDETTGRCEACRVCEAGSGLVFSCQDKQNTVCEECPDGTYSDEANHVDPCLPCTVCEDTERQLRECTRWADAECEEIPGRWITRSTPPEGSDSTAPSTQEPEAPPEQDLIASTVAGVVTTVMGSSQPVVTRGTTDN（配列番号６）（ヌクレオチド識別番号ＡＫ３１３６５４．１及びタンパク質識別番号ＢＡＧ３６４０８．１）、好ましくは、ΔＣＤ３４：ELPTQGTFSNVSTNVS（配列番号４）（ヌクレオチド識別番号ＡＢ２３８２３１．１及びタンパク質識別番号ＢＡＥ４６７４８．１）からなる群から選択される、追跡可能なマーカー、
ｄ）ヒンジＣＤ８α：PAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFA（配列番号７）（ヌクレオチド識別番号Ｍ１２８２８．１及びタンパク質識別番号ＡＡＢ０４６３７．１）、ヒンジＣＤ２８：IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP（配列番号８）（ヌクレオチド識別番号ＡＪ５１７５０４．１及びタンパク質識別番号ＣＡＤ５７００３．１）、ヒンジＣＨ２－ＣＨ３（ＵＮＩＰＲＯＴＫＢ：Ｐ０１８６１）：ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK（配列番号９）、ヒンジＣＨ３（ＵＮＩＰＲＯＴＫＢ：Ｐ０１８６１）：ESKYGPPCPSCPGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK（配列番号１０）、好ましくは、ヒンジＣＤ８α：PAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFA（配列番号７）（ヌクレオチド識別番号Ｍ１２８２８．１及びタンパク質識別番号ＡＡＢ０４６３７．１）からなる群から選択される、ヒンジ、
ｅ）ＣＤ２８ＴＭ：FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV（配列番号１３）（ヌクレオチド識別番号ＢＣ１１２０８５．１及びタンパク質識別番号ＡＡＩ１２０８６．１）、ＣＤ８ａＴＭ（配列番号１４）、好ましくは、ＣＤ８ａＴＭCDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT（配列番号１４）（ヌクレオチド識別番号ＮＭ＿００１７６８．６及びタンパク質識別番号ＮＰ＿００１７５９．３）からなる群から選択される、膜貫通ドメイン、並びに
ｆ）ＣＤ２８細胞質配列：RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS（配列番号２１）（ヌクレオチド識別番号ＡＦ２２２３４１．１及びタンパク質識別番号ＡＡＦ３３７９２．１）、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）配列：KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL（配列番号２２）（ヌクレオチド識別番号Ｕ０３３９７．１及びタンパク質識別番号ＡＡＡ５３１３３．１）、及びＣＤ３ゼータ鎖：RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR*（配列番号２３）（ヌクレオチド識別番号Ｊ０４１３２．１及びタンパク質識別番号ＡＡＡ６０３９４．１）を連結させることにより得られる配列、又はＣＤ２８細胞質配列RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS（配列番号２１）（ヌクレオチド識別番号ＡＦ２２２３４１．１及びタンパク質識別番号ＡＡＦ３３７９２．１）、ＯＸ４０配列RDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI（配列番号２４）（ヌクレオチド識別番号ＮＭ＿００３３２７．３及びタンパク質番号ＮＰ＿００３３１８．１）及びＣＤ３ゼータ鎖：RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR*（配列番号２３）（ヌクレオチド識別番号Ｊ０４１３２．１及びタンパク質識別番号ＡＡＡ６０３９４．１）を連結させることにより得られる配列からなる群から選択される、共刺激シグナル伝達ドメイン
を含むか、又はこれらからなる、ＣＤ３０キメラ抗原受容体分子である。

【0042】

上記のヒンジＣＤ８αは、配列PAPRPPTPAPT（配列番号１１）（スペーサー）及びIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFA（配列番号１２）（ヌクレオチド識別番号ＮＭ＿００１７６８．６及びタンパク質識別番号ＮＰ＿００１７５９．３）を含む。

【0043】

第１のリンカーは、２つ又は３つのアミノ酸のリンカー、例えば、ＳＲであり得る。

【0044】

ＡＣ１０ ＶＬ及びＶＨ配列を連結させる第２のリンカーは、プロリンリッチな強固なリンカー、例えば、マウスｉｇＧ３上部ヒンジ（ｍｌｇＧ３ＵＨ）：PKPSTPPGSS（配列番号１５）、（ｍｌｇＧ３ＵＨ）_２：PKPSTPPGSSPKPSTPPGSS（配列番号１６）、又はグリシンリッチな可動性リンカー、例えば、（Ｇ４Ｓ）２リンカー：GGGGSGGGG（配列番号１７）、（Ｇ４Ｓ）４リンカー：GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS（配列番号１８）、Ｇ４ＳＧ２リンカーGGGGSGG（配列番号１９）若しくはＧ３ＳＧ４リンカー：GGGSGGGG（配列番号２０）、好ましくは、GGGSGGGG（配列番号２０）からなる群から選択され得る。

【0045】

加えて、第３のリンカー、例えば、短い配列ＧＳは、ＡＣ１０ ＶＨ配列と追跡可能なマーカーとの間に使用することができる。

【0046】

１つ又は複数のリンカー（第４のリンカー）、例えば、ＣＤ８ａ細胞質（ｃｙｔｏ）：LYCNHRN（配列番号２５）（ヌクレオチド識別番号ＮＭ＿００１７６８．６及びタンパク質識別番号ＮＰ＿００１７５９．３）及びＥＦは、膜貫通ドメインと共刺激シグナル伝達ドメインの間に存在し得る。

【図面の簡単な説明】

【0047】

【図1-1】ＣＤ２８．ＯＸ４０又はＣＤ２８．４－１ＢＢ共刺激を有するＣＡＲ－ＣＤ３０Ｔ細胞が、最初の抗原刺激時に同様の形質導入レベル、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋分布、及びｉｎ ｖｉｔｒｏでの増殖を示す図である。（Ａ）２つのＣＡＲ－ＣＤ３０の発現カセットを模式図で示す。ＣＤ３０のｓｃＦｖをインフレームでＣＤ８ａＴＭ、ＣＤ２８細胞質部分、及び４－１ＢＢ（上図）又はＯＸ４０（下図）のいずれかにより代表される第２の共刺激ドメイン、並びにシグナル伝達ドメインＣＤ３ゼータ鎖（ζ）を用いてクローニングした。追跡可能なマーカーとして、ΔＣＤ３４を加えた。（Ｂ）フローサイトメトリー解析では、例となるドナーにおけるＣＤ３４発現（上パネル）によるＴ細胞の形質導入、陰性対照としての非形質導入（ＮＴ）Ｔ細胞（左パネル）、又はＣＡＲ．ＣＤ３０．ΔＣＤ３４．２８．４．１ＢＢ．ζを有する遺伝子修飾Ｔ細胞（２８．４．１ＢＢ．ζ）（中央パネル）及びＣＡＲ．ＣＤ３０．ΔＣＤ３４．ＣＤ２８．ＯＸ４０．ζを有する遺伝子修飾Ｔ細胞（２８．ＯＸ４０．ζ）（右パネル）のＩＬ２による増殖のレベルを示す。（Ｃ）Ｔ細胞の形質導入レベルはまた、ｓｃＦｖを効率的に結合させることが可能な、ビオチン化タンパク質Ｌにより確認した。（Ｄ～Ｆ）３つのパネルは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの３回の培養においてＦＡＣＳによりプロファイリングした陽性ＣＡＲ＋Ｔ細胞の割合の平均を示す。第１のパネルは、ＣＡＲ＋ＣＤ３＋発現を示し（Ｄ）、第２のパネル（Ｅ）は、ＣＡＲ＋ＣＤ４＋の亜集団を示し、最後のパネル（Ｆ）は、ＣＡＲ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を示す。ＩＬ２によるＴ細胞の増殖は、ＮＴ（白色の棒）、２８．４．１ＢＢ．ζ（横線を有する白色の棒）及び２８．ＯＸ４０．ζ（黒色の棒）、又はＩＬ７／ＩＬ１５による増殖は、ＮＴ（縦線を有する白色の棒）、２８．４．１ＢＢ．ζ（格子模様の棒）及び２８．ＯＸ４０．ζ（市松模様の棒）で示す。データは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養して５、１５及び３０日目の６名の健常ドナー（ＨＤ）からの平均±標準偏差（ＳＤ）として表す。（Ｇ～Ｈ）グラフは、トリパンブルー計数アッセイにより評価したＮＴ Ｔ細胞及びＣＡＲ－ＣＤ３０Ｔ細胞の、ＩＬ２による発現倍率、実線（Ｇ）又はＩＬ７／ＩＬ１５による発現倍率、点線（Ｈ）を示す。データは、６名のＨＤからの結果を表す。（Ｉ～Ｍ）ＮＴ Ｔ細胞（Ｉ）、２８．４．１ＢＢ．ζＴ細胞（Ｌ）及び２８．ＯＸ４０．ζＴ細胞（Ｍ）のｉｎ ｖｉｔｒｏでの長期増殖倍率によるサイトカイン使用の作用を示す。有意性は、アスタリスクにより表し、一方、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの培養における形質導入レベルの相違の有意性は、円で囲んだアスタリスクにより表した。^＊ｐ値≦０．０５であり、^＊＊ｐ値≦０．０１である。

【図1-2】ＣＤ２８．ＯＸ４０又はＣＤ２８．４－１ＢＢ共刺激を有するＣＡＲ－ＣＤ３０Ｔ細胞が、最初の抗原刺激時に同様の形質導入レベル、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋分布、及びｉｎ ｖｉｔｒｏでの増殖を示す図である。（Ａ）２つのＣＡＲ－ＣＤ３０の発現カセットを模式図で示す。ＣＤ３０のｓｃＦｖをインフレームでＣＤ８ａＴＭ、ＣＤ２８細胞質部分、及び４－１ＢＢ（上図）又はＯＸ４０（下図）のいずれかにより代表される第２の共刺激ドメイン、並びにシグナル伝達ドメインＣＤ３ゼータ鎖（ζ）を用いてクローニングした。追跡可能なマーカーとして、ΔＣＤ３４を加えた。（Ｂ）フローサイトメトリー解析では、例となるドナーにおけるＣＤ３４発現（上パネル）によるＴ細胞の形質導入、陰性対照としての非形質導入（ＮＴ）Ｔ細胞（左パネル）、又はＣＡＲ．ＣＤ３０．ΔＣＤ３４．２８．４．１ＢＢ．ζを有する遺伝子修飾Ｔ細胞（２８．４．１ＢＢ．ζ）（中央パネル）及びＣＡＲ．ＣＤ３０．ΔＣＤ３４．ＣＤ２８．ＯＸ４０．ζを有する遺伝子修飾Ｔ細胞（２８．ＯＸ４０．ζ）（右パネル）のＩＬ２による増殖のレベルを示す。（Ｃ）Ｔ細胞の形質導入レベルはまた、ｓｃＦｖを効率的に結合させることが可能な、ビオチン化タンパク質Ｌにより確認した。（Ｄ～Ｆ）３つのパネルは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの３回の培養においてＦＡＣＳによりプロファイリングした陽性ＣＡＲ＋Ｔ細胞の割合の平均を示す。第１のパネルは、ＣＡＲ＋ＣＤ３＋発現を示し（Ｄ）、第２のパネル（Ｅ）は、ＣＡＲ＋ＣＤ４＋の亜集団を示し、最後のパネル（Ｆ）は、ＣＡＲ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を示す。ＩＬ２によるＴ細胞の増殖は、ＮＴ（白色の棒）、２８．４．１ＢＢ．ζ（横線を有する白色の棒）及び２８．ＯＸ４０．ζ（黒色の棒）、又はＩＬ７／ＩＬ１５による増殖は、ＮＴ（縦線を有する白色の棒）、２８．４．１ＢＢ．ζ（格子模様の棒）及び２８．ＯＸ４０．ζ（市松模様の棒）で示す。データは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養して５、１５及び３０日目の６名の健常ドナー（ＨＤ）からの平均±標準偏差（ＳＤ）として表す。（Ｇ～Ｈ）グラフは、トリパンブルー計数アッセイにより評価したＮＴ Ｔ細胞及びＣＡＲ－ＣＤ３０Ｔ細胞の、ＩＬ２による発現倍率、実線（Ｇ）又はＩＬ７／ＩＬ１５による発現倍率、点線（Ｈ）を示す。データは、６名のＨＤからの結果を表す。（Ｉ～Ｍ）ＮＴ Ｔ細胞（Ｉ）、２８．４．１ＢＢ．ζＴ細胞（Ｌ）及び２８．ＯＸ４０．ζＴ細胞（Ｍ）のｉｎ ｖｉｔｒｏでの長期増殖倍率によるサイトカイン使用の作用を示す。有意性は、アスタリスクにより表し、一方、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの培養における形質導入レベルの相違の有意性は、円で囲んだアスタリスクにより表した。^＊ｐ値≦０．０５であり、^＊＊ｐ値≦０．０１である。

【図1-3】ＣＤ２８．ＯＸ４０又はＣＤ２８．４－１ＢＢ共刺激を有するＣＡＲ－ＣＤ３０Ｔ細胞が、最初の抗原刺激時に同様の形質導入レベル、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋分布、及びｉｎ ｖｉｔｒｏでの増殖を示す図である。（Ａ）２つのＣＡＲ－ＣＤ３０の発現カセットを模式図で示す。ＣＤ３０のｓｃＦｖをインフレームでＣＤ８ａＴＭ、ＣＤ２８細胞質部分、及び４－１ＢＢ（上図）又はＯＸ４０（下図）のいずれかにより代表される第２の共刺激ドメイン、並びにシグナル伝達ドメインＣＤ３ゼータ鎖（ζ）を用いてクローニングした。追跡可能なマーカーとして、ΔＣＤ３４を加えた。（Ｂ）フローサイトメトリー解析では、例となるドナーにおけるＣＤ３４発現（上パネル）によるＴ細胞の形質導入、陰性対照としての非形質導入（ＮＴ）Ｔ細胞（左パネル）、又はＣＡＲ．ＣＤ３０．ΔＣＤ３４．２８．４．１ＢＢ．ζを有する遺伝子修飾Ｔ細胞（２８．４．１ＢＢ．ζ）（中央パネル）及びＣＡＲ．ＣＤ３０．ΔＣＤ３４．ＣＤ２８．ＯＸ４０．ζを有する遺伝子修飾Ｔ細胞（２８．ＯＸ４０．ζ）（右パネル）のＩＬ２による増殖のレベルを示す。（Ｃ）Ｔ細胞の形質導入レベルはまた、ｓｃＦｖを効率的に結合させることが可能な、ビオチン化タンパク質Ｌにより確認した。（Ｄ～Ｆ）３つのパネルは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの３回の培養においてＦＡＣＳによりプロファイリングした陽性ＣＡＲ＋Ｔ細胞の割合の平均を示す。第１のパネルは、ＣＡＲ＋ＣＤ３＋発現を示し（Ｄ）、第２のパネル（Ｅ）は、ＣＡＲ＋ＣＤ４＋の亜集団を示し、最後のパネル（Ｆ）は、ＣＡＲ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を示す。ＩＬ２によるＴ細胞の増殖は、ＮＴ（白色の棒）、２８．４．１ＢＢ．ζ（横線を有する白色の棒）及び２８．ＯＸ４０．ζ（黒色の棒）、又はＩＬ７／ＩＬ１５による増殖は、ＮＴ（縦線を有する白色の棒）、２８．４．１ＢＢ．ζ（格子模様の棒）及び２８．ＯＸ４０．ζ（市松模様の棒）で示す。データは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養して５、１５及び３０日目の６名の健常ドナー（ＨＤ）からの平均±標準偏差（ＳＤ）として表す。（Ｇ～Ｈ）グラフは、トリパンブルー計数アッセイにより評価したＮＴ Ｔ細胞及びＣＡＲ－ＣＤ３０Ｔ細胞の、ＩＬ２による発現倍率、実線（Ｇ）又はＩＬ７／ＩＬ１５による発現倍率、点線（Ｈ）を示す。データは、６名のＨＤからの結果を表す。（Ｉ～Ｍ）ＮＴ Ｔ細胞（Ｉ）、２８．４．１ＢＢ．ζＴ細胞（Ｌ）及び２８．ＯＸ４０．ζＴ細胞（Ｍ）のｉｎ ｖｉｔｒｏでの長期増殖倍率によるサイトカイン使用の作用を示す。有意性は、アスタリスクにより表し、一方、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの培養における形質導入レベルの相違の有意性は、円で囲んだアスタリスクにより表した。^＊ｐ値≦０．０５であり、^＊＊ｐ値≦０．０１である。

【図2】遺伝子修飾ＣＡＲ－ＣＤ３０Ｔ細胞の枯渇プロファイルを示す図である。４名のＨＤの代表的なＣＤ３ Ｔ細胞の基底枯渇プロファイルを、ＩＬ２（左側）又はＩＬ７／ＩＬ１５（それぞれ、縦線を有する白色の棒はＮＴ、方眼模様の白色の棒はＣＡＲＧＤ２．２８－４１ＢＢζＴ細胞及びチェック模様の棒はＣＡＲＣＤ３０．２８－ＯＸ４０ζＴ細胞）のいずれかの存在下で１５日間増殖させた、ＮＴ（白色の棒）、２８．４－１ＢＢ．ζ（横線を有する白色の棒）又は２８．ＯＸ４０ζ（黒色の棒）のいずれかにより示す。アスタリスク（複数可）の周囲の円は、ＩＬ７／ＩＬ１５又はＩＬ２のいずれかの存在下で培養したＴ細胞の同一の集団間の比較のためのｐ値を示す。４名のＨＤからのデータは、平均±ＳＤとして表す。^＊ｐ値≦０．０５であり、^＊＊ｐ値≦０．０１である。

【図3-1】ＮＴ又はＣＡＲ－ＣＤ３０Ｔ細胞の基底増殖及び／又は増殖の誘導を示す図である。ＮＴ（Ａ）又はＣＡＲ－ＣＤ３０Ｔ細胞（Ｂ～Ｃ）について、修飾Ｔ細胞の安全なプロファイルに関するレトロウイルスの修飾又は培養条件の影響を評価するために、基底増殖又はサイトカイン若しくは／及び抗原特異的増殖を評価した。ゼロ日目に、Ｔ細胞を蛍光細胞染色ＣＦＳＥにより標識し、サイトカイン有／無で５日間播種するか、又は腫瘍細胞株ＣＤ３０陽性（カルパス２９９）若しくは腫瘍細胞株ＣＤ３０陰性（ＢＶ１７３）の存在下で共培養した。ＣＤ３＋（左側）、ＣＤ８＋（右側）及びＣＤ４＋Ｔ細胞（左側）の基底増殖又は増殖の誘導（ＣＦＳＥ色素希釈により測定）をＦＡＣＳ解析により評価した。

【図3-2】ＮＴ又はＣＡＲ－ＣＤ３０Ｔ細胞の基底増殖及び／又は増殖の誘導を示す図である。ＮＴ（Ａ）又はＣＡＲ－ＣＤ３０Ｔ細胞（Ｂ～Ｃ）について、修飾Ｔ細胞の安全なプロファイルに関するレトロウイルスの修飾又は培養条件の影響を評価するために、基底増殖又はサイトカイン若しくは／及び抗原特異的増殖を評価した。ゼロ日目に、Ｔ細胞を蛍光細胞染色ＣＦＳＥにより標識し、サイトカイン有／無で５日間播種するか、又は腫瘍細胞株ＣＤ３０陽性（カルパス２９９）若しくは腫瘍細胞株ＣＤ３０陰性（ＢＶ１７３）の存在下で共培養した。ＣＤ３＋（左側）、ＣＤ８＋（右側）及びＣＤ４＋Ｔ細胞（左側）の基底増殖又は増殖の誘導（ＣＦＳＥ色素希釈により測定）をＦＡＣＳ解析により評価した。

【図3-3】ＮＴ又はＣＡＲ－ＣＤ３０Ｔ細胞の基底増殖及び／又は増殖の誘導を示す図である。ＮＴ（Ａ）又はＣＡＲ－ＣＤ３０Ｔ細胞（Ｂ～Ｃ）について、修飾Ｔ細胞の安全なプロファイルに関するレトロウイルスの修飾又は培養条件の影響を評価するために、基底増殖又はサイトカイン若しくは／及び抗原特異的増殖を評価した。ゼロ日目に、Ｔ細胞を蛍光細胞染色ＣＦＳＥにより標識し、サイトカイン有／無で５日間播種するか、又は腫瘍細胞株ＣＤ３０陽性（カルパス２９９）若しくは腫瘍細胞株ＣＤ３０陰性（ＢＶ１７３）の存在下で共培養した。ＣＤ３＋（左側）、ＣＤ８＋（右側）及びＣＤ４＋Ｔ細胞（左側）の基底増殖又は増殖の誘導（ＣＦＳＥ色素希釈により測定）をＦＡＣＳ解析により評価した。

【図4】固形及び血液腫瘍細胞株におけるＣＤ３０及び／又はＰＤＬ１発現を示す図である。（Ａ～Ｄ）３つのリンパ腫細胞株：Ｌ４２８、ＨＤＭＬ２及びカルパス２９９における（Ａ）、５つの肉腫細胞株：ＲＤ、Ａ６７３、ＳＫ－ＥＳ－１、ＣＷ９０１９及びＣＴ－１０における（Ｂ）、２つの髄芽腫細胞株：ＤＡＯＹ及びＤ２８３における（Ｃ）、並びに２つの白血病細胞株：ＣＥＭ－Ｔ２及びＢＶ－１７３における（Ｄ）、ＣＤ３０＋及び／又はＰＤＬ１の恒常的発現の代表的ＦＡＣＳ解析を示す。最後の図は、Ｌ４２８－ＰＤＬ１リンパ腫細胞株を得るために、ＰＤＬ１のカセットを含むレトロウイルスベクターＳＦＧを用いて遺伝子修飾したリンパ腫細胞株Ｌ４２８のＦＡＣＳ解析を示す（Ｅ）。

【図5】ＩＬ２を有する完全ＣＴＬ培地中で増殖させ、２８．４－１ＢＢ又は２８．ＯＸ４０共刺激ドメインを用いて形質導入したＣＡＲ－ＣＤ３０Ｔ細胞が、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの実験において同等の短期細胞毒性作用を示す図である。ｉｎ ｖｉｔｒｏでの^５１Ｃｒ放出アッセイにより、ＣＤ３０＋リンパ腫（カルパス２９９細胞株（Ａ）、ＨＤＭＬ－２細胞株（Ｂ）及びＬ４２８細胞株（Ｃ））、ＣＤ３０＋髄芽腫ＤＡＯＹ（Ｄ）、並びにＣＤ３０陰性株、例えば、髄芽腫Ｄ２８３（Ｅ）及びリンパ腫ＢＶ１７３（Ｆ）における、ＮＴ Ｔ細胞（白色の円を有する線）、２８．４－１ＢＢ．ζＴ細胞（白色の四角を有する線）又は２８．ＯＸ４０．ζＴ細胞（黒色の円を有する線）の細胞溶解活性を評価する。アッセイは、最初の活性化及びＩＬ２存在下での増殖の後に１５日実施した。６名の健常ドナー（ＨＤ）からのデータは、平均±ＳＤとして表す。^＊ｐ値≦０．０５、^＊＊ｐ値≦０．０１、^＊＊＊ｐ値≦０．００１、及び^＊＊＊＊ｐ値≦０．０００１である。

【図6】ＩＬ７／ＩＬ１５を有する完全ＣＴＬ培地中で増殖させ、２８．４－１ＢＢ又は２８．ＯＸ４０共刺激ドメインを用いて形質導入したＣＡＲ－ＣＤ３０Ｔ細胞が、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの実験において同等の短期細胞毒性作用を示す図である。ｉｎ ｖｉｔｒｏでの^５１Ｃｒ放出アッセイにより、ＣＤ３０＋リンパ腫（カルパス２９９細胞株（Ａ）、ＨＤＭＬ－２細胞株（Ｂ）及びＬ４２８細胞株（Ｃ））、ＣＤ３０＋髄芽腫ＤＡＯＹ（Ｄ）、並びにＣＤ３０陰性株、例えば、髄芽腫Ｄ２８３（Ｅ）及びリンパ腫ＢＶ１７３（Ｆ）における、ＮＴ Ｔ細胞（白色の円を有する点線）、２８．４－１ＢＢ．ζＴ細胞（白色の四角を有する点線）及び２８．ＯＸ４０．ζＴ細胞（黒色の円を有する点線）の細胞溶解活性を評価する。アッセイは、最初の活性化及びＩＬ７／ＩＬ１５の存在下での増殖の後に１５日実施した。６名の健常ドナー（ＨＤ）からのデータは、平均±ＳＤとして表す。^＊ｐ値≦０．０５、^＊＊ｐ値≦０．０１、^＊＊＊ｐ値≦０．００１、及び^＊＊＊＊ｐ値≦０．０００１である。

【図7-1】ＣＤ３０＋腫瘍細胞株に対する両ＣＡＲ－ＣＤ３０Ｔ細胞の長期共培養により、これらの等しい特異性細胞毒性効力が、使用したサイトカインとは無関係に確認されることを示す図である。（Ａ～Ｊ）エフェクターＮＴ細胞（上パネル）、ＣＤ３０－ＣＡＲ Ｔ細胞：２８．４－１ＢＢζＴ細胞（中央パネル）及び２８－ＯＸ４０ζＴ細胞（下パネル）による、Ｅ／Ｔ比１：１での７日の共培養の後の残留腫瘍細胞（ＧＦＰ＋細胞として同定されたもの）（又はＤ２８３細胞のＣＤ４５－ＣＤ３－）の代表的ＦＡＣＳ解析を示す。（Ｋ～Ｌ）ＩＬ２（Ｋ）又はＩＬ７／ＩＬ１５（それぞれ、縦線を有する白色の棒はＮＴ、方眼模様の白色の棒はＣＡＲＧＤ２．２８－４１ＢＢζＴ細胞及びチェック模様の棒はＣＡＲＣＤ３０．２８－ＯＸ４０ζＴ細胞）（Ｌ）により増殖させた、ＮＴ（白色の棒）、ＣＡＲＧＤ２．２８－４１ＢＢζＴ細胞（横線を有する白色の棒）、及びＣＡＲＣＤ３０．２８－ＯＸ４０ζＴ細胞（黒色の棒）による、Ｅ／Ｔ非１：１での７日の共培養の後の残留する腫瘍細胞の平均の提示である。６名の健常ドナー（ＨＤ）からのデータは、平均±ＳＤとして表す。^＊ｐ値≦０．０５、^＊＊ｐ値≦０．０１、^＊＊＊ｐ値≦０．００１、及び^＊＊＊＊ｐ値≦０．０００１である。

【図7-2】ＣＤ３０＋腫瘍細胞株に対する両ＣＡＲ－ＣＤ３０Ｔ細胞の長期共培養により、これらの等しい特異性細胞毒性効力が、使用したサイトカインとは無関係に確認されることを示す図である。（Ａ～Ｊ）エフェクターＮＴ細胞（上パネル）、ＣＤ３０－ＣＡＲ Ｔ細胞：２８．４－１ＢＢζＴ細胞（中央パネル）及び２８－ＯＸ４０ζＴ細胞（下パネル）による、Ｅ／Ｔ比１：１での７日の共培養の後の残留腫瘍細胞（ＧＦＰ＋細胞として同定されたもの）（又はＤ２８３細胞のＣＤ４５－ＣＤ３－）の代表的ＦＡＣＳ解析を示す。（Ｋ～Ｌ）ＩＬ２（Ｋ）又はＩＬ７／ＩＬ１５（それぞれ、縦線を有する白色の棒はＮＴ、方眼模様の白色の棒はＣＡＲＧＤ２．２８－４１ＢＢζＴ細胞及びチェック模様の棒はＣＡＲＣＤ３０．２８－ＯＸ４０ζＴ細胞）（Ｌ）により増殖させた、ＮＴ（白色の棒）、ＣＡＲＧＤ２．２８－４１ＢＢζＴ細胞（横線を有する白色の棒）、及びＣＡＲＣＤ３０．２８－ＯＸ４０ζＴ細胞（黒色の棒）による、Ｅ／Ｔ非１：１での７日の共培養の後の残留する腫瘍細胞の平均の提示である。６名の健常ドナー（ＨＤ）からのデータは、平均±ＳＤとして表す。^＊ｐ値≦０．０５、^＊＊ｐ値≦０．０１、^＊＊＊ｐ値≦０．００１、及び^＊＊＊＊ｐ値≦０．０００１である。

【図7-3】ＣＤ３０＋腫瘍細胞株に対する両ＣＡＲ－ＣＤ３０Ｔ細胞の長期共培養により、これらの等しい特異性細胞毒性効力が、使用したサイトカインとは無関係に確認されることを示す図である。（Ａ～Ｊ）エフェクターＮＴ細胞（上パネル）、ＣＤ３０－ＣＡＲ Ｔ細胞：２８．４－１ＢＢζＴ細胞（中央パネル）及び２８－ＯＸ４０ζＴ細胞（下パネル）による、Ｅ／Ｔ比１：１での７日の共培養の後の残留腫瘍細胞（ＧＦＰ＋細胞として同定されたもの）（又はＤ２８３細胞のＣＤ４５－ＣＤ３－）の代表的ＦＡＣＳ解析を示す。（Ｋ～Ｌ）ＩＬ２（Ｋ）又はＩＬ７／ＩＬ１５（それぞれ、縦線を有する白色の棒はＮＴ、方眼模様の白色の棒はＣＡＲＧＤ２．２８－４１ＢＢζＴ細胞及びチェック模様の棒はＣＡＲＣＤ３０．２８－ＯＸ４０ζＴ細胞）（Ｌ）により増殖させた、ＮＴ（白色の棒）、ＣＡＲＧＤ２．２８－４１ＢＢζＴ細胞（横線を有する白色の棒）、及びＣＡＲＣＤ３０．２８－ＯＸ４０ζＴ細胞（黒色の棒）による、Ｅ／Ｔ非１：１での７日の共培養の後の残留する腫瘍細胞の平均の提示である。６名の健常ドナー（ＨＤ）からのデータは、平均±ＳＤとして表す。^＊ｐ値≦０．０５、^＊＊ｐ値≦０．０１、^＊＊＊ｐ値≦０．００１、及び^＊＊＊＊ｐ値≦０．０００１である。

【図8】ＣＡＲ－ＣＤ３０Ｔ細胞の機能活性の評価及び定量のための長期ストレス共培養を示す図である。（Ａ～Ｆ）ＩＬ２（Ａ～Ｃ）又はＩＬ７／ＩＬ１５（それぞれ、方眼模様の棒はＣＡＲＧＤ２．２８－４１ＢＢζＴ細胞、又はチェック模様の棒はＣＡＲＣＤ３０．２８－ＯＸ４０ζＴ細胞）（Ｄ～Ｆ）により増殖させた、ＣＡＲＧＤ２．２８－４１ＢＢζＴ細胞（横線を有する棒グラフ）、又はＣＡＲＣＤ３０．２８－ＯＸ４０ζＴ細胞（黒色の棒）による、低Ｅ／Ｔ比での７日の共培養の後のリンパ腫腫瘍細胞の腫瘍制御効率の評価を示す。腫瘍単独を白色の棒により示す。６名の健常ドナー（ＨＤ）からのデータは、平均±ＳＤとして表す。^＊ｐ値≦０．０５、^＊＊ｐ値≦０．０１、^＊＊＊ｐ値≦０．００１、及び^＊＊＊＊ｐ値≦０．０００１である。

【図9】ＣＤ３０＋腫瘍細胞と共培養したＣＡＲ－ＣＤ３０Ｔ細胞のＩＦＮガンマプロファイルを示す図である。（Ａ～Ｆ）エフェクター：標的共培養の２４時間後の特異的ＩＦＮγ産生を示す。図は、リンパ腫腫瘍細胞株による刺激後にＩＬ２（Ａ～Ｃ）又はＩＬ７／ＩＬ１５（Ｄ～Ｆ）により増殖させたＣＡＲ．ＣＤ３０Ｔ細胞のＩＦＮガンマ産生を示す。カルパス２９９（Ａ及びＤ）又はＨＤＭＬ－２（Ｂ及びＥ）と２４時間共培養したＣＡＲＣＤ３０．２８－ＯＸ４０ζＴ細胞は、ＣＡＲＧＤ２．２８－４１ＢＢζＴ細胞に対して、特に、低いエフェクター：標的比において、有意に高いレベルのＩＦＮガンマを産生する。ＣＡＲ－ＣＤ３０Ｔ細胞を腫瘍細胞株Ｌ４２８と共培養した場合、２つのＣＡＲの間で差異は観察されなかった（Ｃ及びＦ）。また、ＩＬ７／ＩＬ１５により増殖させたＣＡＲＣＤ３０．２８－ＯＸ４０ζＴ細胞は、Ｌ４２８腫瘍細胞株と共培養した場合（Ｆ）を除いて、ＣＤ３０＋腫瘍細胞と共培養した場合（Ｄ～Ｆ）、高レベルのＩＦＮガンマを産生する。

【図10】ＮＨＬカルパス２９９に対してＩＬ２の存在下で生成し、増殖させたＣＡＲ．ＣＤ３０Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｖｏでの活性を示す図である。（Ａ～Ｃ）ＩＬ２の存在下で生成し、増殖させた、ＮＴ、ＣＡＲＣＤ３０．２８．４－１ＢＢζ又はＣＡＲＣＤ３０．２８．ＯＸ４０ζＴ細胞で処置した、カルパス２９９－ＦＦ－Ｌｕｃ．ＧＦＰ細胞を全身的に担持するＮＳＧマウスのｉｎ ｖｉｖｏでの生物発光イメージングを示す。（Ａ）ｉｎ ｖｉｖｏでの実験の模式的モデルを示す。マウスは、カルパス２９９－ＦＦ－Ｌｕｃ．ＧＦＰ細胞をｉ．ｖ．により受ける。３日後、腫瘍の生物発光が安定すると、これらを３つのコホートに分割し、ＮＴ又は２つのＣＡＲ－ＣＤ３０Ｔ細胞のうちの１つで処置する。腫瘍の増殖は、ＩＶＩＳ評価により１４０日間、毎週評価した。（Ｂ）マウスの３つのコホートにおいて毎週測定した腫瘍増殖の生物発光イメージング、（Ｃ）ＮＴ（ＩＬ２）（白色の円を有する線、マウス８匹）、２８．４－１ＢＢζ（ＩＬ２）（白色の四角を有する線、マウス１０匹）及び２８．ＯＸ４０ζ（ＩＬ２）Ｔ細胞（黒色の四角を有する線、マウス１０匹）で処置した単一の各マウスの生物発光の提示である。（Ｄ）ＮＴ（ＩＬ２）（白色の円を有する線、マウス８匹）、２８．４－１ＢＢζ（ＩＬ２）（白色の四角を有する線、マウス１０匹）及び２８．ＯＸ４０ζ（ＩＬ２）Ｔ細胞（黒色の四角を有する線、マウス１０匹）で処置した腫瘍担持マウスのカプラン・マイヤー全生存（ＯＳ）解析を示す。^＊Ｐ値≦０．０５、^＊＊Ｐ値≦０．００１、^＊＊＊Ｐ値≦０．０００１である。ログ・ランク（マンテル・コックス）検定。

【図11】再曝露モデル：ＮＨＬマウスモデルにおける長期免疫記憶の確立を示す図である。（Ａ～Ｃ）＋１４０日目にカルパス２９９－ＦＦ－Ｌｕｃ．ＧＦＰ細胞０．２×１０^６にｉ．ｖ．により再曝露し、さらに１００日間経過観察した、治癒したＮＳＧマウスのｉｎ ｖｉｖｏでの生物発光イメージングを示す。（Ａ）ｉｎ ｖｉｖｏでの実験の模式的モデルを示す。マウスは、カルパス２９９－ＦＦ－Ｌｕｃ．ＧＦＰ細胞をｉ．ｖ．により２回：０日目及び１４０日目に受けた。３日目に、生物発光が安定すると、これらを３つのコホートに分割し、ＮＴ又は２つのＣＡＲ－ＣＤ３０Ｔ細胞のうちの１つで処置する。腫瘍の増殖は、ＩＶＩＳ評価により２４０日間、毎週評価した。１４０日目に、治癒したマウス及びマウスの新たなコホート（腫瘍移植の陽性対照（ＣＴＲマウス）として実験に加えた）をカルパス２９９－ＦＦ－Ｌｕｃ．ＧＦＰ細胞にｉ．ｖ．により再曝露した。（Ｂ）１４０日目から２４０日目まで毎週測定した腫瘍の増殖の生物発光イメージングを示す。（Ｃ）ＮＴ（白色の円を有する線、マウス８匹）、ＣＡＲＣＤ３０．２８．４－１ＢＢζ（白色の四角を有する線、マウス１０匹）及びＣＡＲＣＤ３０．２８．ＯＸ４０ζＴ細胞（黒色の四角を有する線、マウス１０匹）で処置した単一の各マウス、並びに１４０日目に第２の腫瘍移植の陽性対照として実験に加えたＣＴＲマウス（点線、マウス６匹）の生物発光の提示である。（Ｄ）＋３日に、ＮＴ（白色の円を有する線、マウス８匹）、ＣＡＲＣＤ３０．２８．４－１ＢＢζ（白色の四角を有する線、マウス１０匹）及びＣＡＲＣＤ３０．２８－ＯＸ４０ζＴ細胞（黒色の四角を有する線、マウス１０匹）で１回のみ処置し、＋１４０日目に第２の腫瘍に再曝露した腫瘍担持マウスのカプラン・マイヤー全生存（ＯＳ）解析を示す。ＣＴＲマウスの生存日数（白色の三角を有する点線、マウス６匹）を、１４０日目をゼロとして加えた。^＊Ｐ値≦０．０５、^＊＊Ｐ値≦０．０１、^＊＊＊Ｐ値≦０．００１、^＊＊＊＊Ｐ値≦０．０００１である。ログ・ランク（マンテル・コックス）検定。（Ｅ）第１の腫瘍に曝露後（＋６日目）及び第２の腫瘍の再曝露の前後（それぞれ１３２及び１８０日目）の指示日に流血させた、循環するヒトＴ細胞の図の提示である。ＮＴ（第１の線）、ＣＡＲＣＤ３０．２８－４１ＢＢζＴ細胞（第２の線）及びＣＡＲＣＤ３０．２８－ＯＸ４０ζ（第３の線）。

【図12-1】ＨＬ Ｌ４２８に対してＩＬ２又はＩＬ７／ＩＬ１５の存在下で生成し、増殖させたＣＡＲ．ＣＤ３０Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｖｏでの活性の評価を示す図である。（Ａ～Ｃ）ＩＬ２又はＩＬ７／ＩＬ１５の存在下でｉｎ ｖｉｔｒｏにより生成し増殖させた、ＮＴ、２８．ＯＸ４０ζ又は２８．４－１ＢＢζＴ細胞で６日目に処置した、Ｌ４２８－ＦＦ－Ｌｕｃ．ＧＦＰ細胞を全身的に担持するＮＳＧマウスのｉｎ ｖｉｖｏでの生物発光イメージングを示す。腫瘍の増殖は、ＩＶＩＳ評価により１６５日間、毎週評価した。（Ａ）ｉｎ ｖｉｖｏでの実験の模式的モデルを示す。マウスは、Ｌ４２８－ＦＦ－Ｌｕｃ．ＧＦＰ細胞２×１０^６をｉ．ｖ．により受け、６日後、生物発光が安定すると、これらを６つのコホートに分割し、ＮＴ又はＣＡＲ－ＣＤ３０Ｔ細胞で処置した。腫瘍の増殖は、ＩＶＩＳ評価により１６５日間、毎週評価した。（Ｂ）６日目から１６５日目まで毎週測定した腫瘍の増殖の生物発光イメージングを示す。（Ｃ）ＮＴ（ＩＬ２）Ｔ細胞（白色の円を有する線、マウス５匹）、２８．４－１ＢＢζ（ＩＬ２）Ｔ細胞（白色の四角を有する線、マウス５匹）、２８．ＯＸ４０ζ（ＩＬ２）Ｔ細胞（黒色の四角を有する線、マウス５匹）、ＮＴ（ＩＬ７／ＩＬ１５）Ｔ細胞（白色の円を有する点線、マウス５匹）、２８．４－１ＢＢζ（ＩＬ７／ＩＬ１５）Ｔ細胞（白色の四角を有する点線、マウス５匹）及び２８．ＯＸ４０ζ（ＩＬ７／ＩＬ１５）Ｔ細胞（黒色の四角を有する点線、マウス５匹）で処置した単一の各異種移植マウスの生物発光を示す。（Ｄ）ＮＴ（ＩＬ２）（白色の円を有する線）、２８．４－１ＢＢζ（ＩＬ２）（白色の四角を有する線）及びＣＡＲＣＤ３０．２８－ＯＸ４０ζ（ＩＬ２）（黒色の四角を有する線）、ＮＴ（ＩＬ７／ＩＬ１５）（白色の円を有する点線）、ＣＡＲＣＤ３０．２８．４－１ＢＢζ（ＩＬ７／ＩＬ１５）（白色の四角を有する点線）及びＣＡＲＣＤ３０．２８．ＯＸ４０ζ（ＩＬ７／ＩＬ１５）（黒色の四角を有する点線）で処置した腫瘍担持マウスのカプラン・マイヤー全生存（ＯＳ）解析を示す。^＊Ｐ値≦０．０５、^＊＊Ｐ値≦０．００１、^＊＊＊Ｐ値≦０．０００１である。ログ・ランク（マンテル・コックス）検定。（Ｅ）表により、ＩＬ２又はＩＬ７／ＩＬ１５により増殖させたＮＴ又はＣＡＲ－ＣＤ３０Ｔ細胞で処置したＬ４２８異種移植マウスのＯＳの有意性を表す。^＊Ｐ値≦０．０５及び^＊＊Ｐ値≦０．０１である。（Ｆ～Ｇ）＋６日目にヒトＮＴ又はＣＡＲ．ＣＤ３０Ｔ細胞で処置した、Ｌ４２８－ＦＦ－Ｌｕｃ．ＧＦＰ腫瘍細胞を全身的に担持するＮＳＧマウスにおいて循環するヒトＴ細胞の平均であり、ＣＤ４５＋ＣＤ３＋細胞の割合（Ｆ）及びＣＡＲ－ＣＤ３０Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ３４＋）の割合（Ｇ）のいずれかとして１５、３０、５６、８０、１００、１３０及び１６０日目に評価した。

【図12-2】ＨＬ Ｌ４２８に対してＩＬ２又はＩＬ７／ＩＬ１５の存在下で生成し、増殖させたＣＡＲ．ＣＤ３０Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｖｏでの活性の評価を示す図である。（Ａ～Ｃ）ＩＬ２又はＩＬ７／ＩＬ１５の存在下でｉｎ ｖｉｔｒｏにより生成し増殖させた、ＮＴ、２８．ＯＸ４０ζ又は２８．４－１ＢＢζＴ細胞で６日目に処置した、Ｌ４２８－ＦＦ－Ｌｕｃ．ＧＦＰ細胞を全身的に担持するＮＳＧマウスのｉｎ ｖｉｖｏでの生物発光イメージングを示す。腫瘍の増殖は、ＩＶＩＳ評価により１６５日間、毎週評価した。（Ａ）ｉｎ ｖｉｖｏでの実験の模式的モデルを示す。マウスは、Ｌ４２８－ＦＦ－Ｌｕｃ．ＧＦＰ細胞２×１０^６をｉ．ｖ．により受け、６日後、生物発光が安定すると、これらを６つのコホートに分割し、ＮＴ又はＣＡＲ－ＣＤ３０Ｔ細胞で処置した。腫瘍の増殖は、ＩＶＩＳ評価により１６５日間、毎週評価した。（Ｂ）６日目から１６５日目まで毎週測定した腫瘍の増殖の生物発光イメージングを示す。（Ｃ）ＮＴ（ＩＬ２）Ｔ細胞（白色の円を有する線、マウス５匹）、２８．４－１ＢＢζ（ＩＬ２）Ｔ細胞（白色の四角を有する線、マウス５匹）、２８．ＯＸ４０ζ（ＩＬ２）Ｔ細胞（黒色の四角を有する線、マウス５匹）、ＮＴ（ＩＬ７／ＩＬ１５）Ｔ細胞（白色の円を有する点線、マウス５匹）、２８．４－１ＢＢζ（ＩＬ７／ＩＬ１５）Ｔ細胞（白色の四角を有する点線、マウス５匹）及び２８．ＯＸ４０ζ（ＩＬ７／ＩＬ１５）Ｔ細胞（黒色の四角を有する点線、マウス５匹）で処置した単一の各異種移植マウスの生物発光を示す。（Ｄ）ＮＴ（ＩＬ２）（白色の円を有する線）、２８．４－１ＢＢζ（ＩＬ２）（白色の四角を有する線）及びＣＡＲＣＤ３０．２８－ＯＸ４０ζ（ＩＬ２）（黒色の四角を有する線）、ＮＴ（ＩＬ７／ＩＬ１５）（白色の円を有する点線）、ＣＡＲＣＤ３０．２８．４－１ＢＢζ（ＩＬ７／ＩＬ１５）（白色の四角を有する点線）及びＣＡＲＣＤ３０．２８．ＯＸ４０ζ（ＩＬ７／ＩＬ１５）（黒色の四角を有する点線）で処置した腫瘍担持マウスのカプラン・マイヤー全生存（ＯＳ）解析を示す。^＊Ｐ値≦０．０５、^＊＊Ｐ値≦０．００１、^＊＊＊Ｐ値≦０．０００１である。ログ・ランク（マンテル・コックス）検定。（Ｅ）表により、ＩＬ２又はＩＬ７／ＩＬ１５により増殖させたＮＴ又はＣＡＲ－ＣＤ３０Ｔ細胞で処置したＬ４２８異種移植マウスのＯＳの有意性を表す。^＊Ｐ値≦０．０５及び^＊＊Ｐ値≦０．０１である。（Ｆ～Ｇ）＋６日目にヒトＮＴ又はＣＡＲ．ＣＤ３０Ｔ細胞で処置した、Ｌ４２８－ＦＦ－Ｌｕｃ．ＧＦＰ腫瘍細胞を全身的に担持するＮＳＧマウスにおいて循環するヒトＴ細胞の平均であり、ＣＤ４５＋ＣＤ３＋細胞の割合（Ｆ）及びＣＡＲ－ＣＤ３０Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ３４＋）の割合（Ｇ）のいずれかとして１５、３０、５６、８０、１００、１３０及び１６０日目に評価した。

【図12-3】ＨＬ Ｌ４２８に対してＩＬ２又はＩＬ７／ＩＬ１５の存在下で生成し、増殖させたＣＡＲ．ＣＤ３０Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｖｏでの活性の評価を示す図である。（Ａ～Ｃ）ＩＬ２又はＩＬ７／ＩＬ１５の存在下でｉｎ ｖｉｔｒｏにより生成し増殖させた、ＮＴ、２８．ＯＸ４０ζ又は２８．４－１ＢＢζＴ細胞で６日目に処置した、Ｌ４２８－ＦＦ－Ｌｕｃ．ＧＦＰ細胞を全身的に担持するＮＳＧマウスのｉｎ ｖｉｖｏでの生物発光イメージングを示す。腫瘍の増殖は、ＩＶＩＳ評価により１６５日間、毎週評価した。（Ａ）ｉｎ ｖｉｖｏでの実験の模式的モデルを示す。マウスは、Ｌ４２８－ＦＦ－Ｌｕｃ．ＧＦＰ細胞２×１０^６をｉ．ｖ．により受け、６日後、生物発光が安定すると、これらを６つのコホートに分割し、ＮＴ又はＣＡＲ－ＣＤ３０Ｔ細胞で処置した。腫瘍の増殖は、ＩＶＩＳ評価により１６５日間、毎週評価した。（Ｂ）６日目から１６５日目まで毎週測定した腫瘍の増殖の生物発光イメージングを示す。（Ｃ）ＮＴ（ＩＬ２）Ｔ細胞（白色の円を有する線、マウス５匹）、２８．４－１ＢＢζ（ＩＬ２）Ｔ細胞（白色の四角を有する線、マウス５匹）、２８．ＯＸ４０ζ（ＩＬ２）Ｔ細胞（黒色の四角を有する線、マウス５匹）、ＮＴ（ＩＬ７／ＩＬ１５）Ｔ細胞（白色の円を有する点線、マウス５匹）、２８．４－１ＢＢζ（ＩＬ７／ＩＬ１５）Ｔ細胞（白色の四角を有する点線、マウス５匹）及び２８．ＯＸ４０ζ（ＩＬ７／ＩＬ１５）Ｔ細胞（黒色の四角を有する点線、マウス５匹）で処置した単一の各異種移植マウスの生物発光を示す。（Ｄ）ＮＴ（ＩＬ２）（白色の円を有する線）、２８．４－１ＢＢζ（ＩＬ２）（白色の四角を有する線）及びＣＡＲＣＤ３０．２８－ＯＸ４０ζ（ＩＬ２）（黒色の四角を有する線）、ＮＴ（ＩＬ７／ＩＬ１５）（白色の円を有する点線）、ＣＡＲＣＤ３０．２８．４－１ＢＢζ（ＩＬ７／ＩＬ１５）（白色の四角を有する点線）及びＣＡＲＣＤ３０．２８．ＯＸ４０ζ（ＩＬ７／ＩＬ１５）（黒色の四角を有する点線）で処置した腫瘍担持マウスのカプラン・マイヤー全生存（ＯＳ）解析を示す。^＊Ｐ値≦０．０５、^＊＊Ｐ値≦０．００１、^＊＊＊Ｐ値≦０．０００１である。ログ・ランク（マンテル・コックス）検定。（Ｅ）表により、ＩＬ２又はＩＬ７／ＩＬ１５により増殖させたＮＴ又はＣＡＲ－ＣＤ３０Ｔ細胞で処置したＬ４２８異種移植マウスのＯＳの有意性を表す。^＊Ｐ値≦０．０５及び^＊＊Ｐ値≦０．０１である。（Ｆ～Ｇ）＋６日目にヒトＮＴ又はＣＡＲ．ＣＤ３０Ｔ細胞で処置した、Ｌ４２８－ＦＦ－Ｌｕｃ．ＧＦＰ腫瘍細胞を全身的に担持するＮＳＧマウスにおいて循環するヒトＴ細胞の平均であり、ＣＤ４５＋ＣＤ３＋細胞の割合（Ｆ）及びＣＡＲ－ＣＤ３０Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ３４＋）の割合（Ｇ）のいずれかとして１５、３０、５６、８０、１００、１３０及び１６０日目に評価した。

【図13-1】長期ストレス共培養を示す図である。（Ａ）「ストレス共培養」の実験デザインを模式図で示す。形質導入後＋１５日目のＴ細胞を、カルパス２９９腫瘍細胞株と１：１のＥ／Ｔ比で接触させて（２４ウェルプレートに０．５Ｅ＋０６のＴ細胞対０．５Ｅ＋０６のカルパス２９９）共培養した。腫瘍細胞は、共培養して２０日目まで５日毎に投与した（Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶ投与）。各時点では、２４時間で上清を採取し、サイトカインＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ－２及びＩＬ－１０の存在について解析した。各投与の５日後、細胞を採取し、ＦＡＣＳにより解析した。（Ｂ）棒グラフは、腫瘍の各投与の５日後の培養における残留腫瘍の割合を示す。両ＣＡＲ．ＣＤ３０Ｔ細胞により、腫瘍の増殖が効率的に制御された。それにもかかわらず、２８－ＯＸ４０ζＴ細胞は、＋２０日目に腫瘍制御の向上を示した。（Ｃ）棒グラフは、共培養において各時点で存在する総ＣＤ３陽性Ｔ細胞に対するＣＡＲ陽性Ｔ細胞の割合を示す。両ＣＡＲ．ＣＤ３０分子の割合は、第１の共培養、すなわち、＋５日目の後に有意に増加した。腫瘍の再曝露は、２８．４－１ＢＢ．ζＴ細胞についてのみ、形質導入のレベルに負に影響し、一方、割合は、２８．ＯＸ４０．ζＴ細胞において、安定したままであった。（Ｄ）グラフは、２８．４－１ＢＢ．ζＴ細胞に対して（白色の棒）、２８．ＯＸ４０．ζＴ細胞において（黒色の棒）有意に高いＭＦＩ値を強調する。（Ｅ～Ｈ）サイトカインプロファイルを、腫瘍による刺激の２４時間後に採取した上清に対して実施したＥＬＬＡアッセイから得た。７名の健常ドナー（ＨＤ）からのデータは、平均±ＳＤとして表す。^＊ｐ値≦０．０５、^＊＊Ｐ値≦０．０１、^＊＊＊Ｐ値≦０．００１及び^＊＊＊＊≦０．０００１である。（Ｉ）ＣＡＲ．ＣＤ３０Ｔ細胞における記憶及び枯渇プロファイルの腫瘍による調節を示す。ＩＬ２又はＩＬ７／ＩＬ１５サイトカインの存在下で増殖させた、ＮＴ（白色の棒）、２８．４．１ＢＢ．ζ（横線の棒）又は２８．ＯＸ４０．ζ（黒色の棒）のいずれかのＣＤ３＋Ｔ細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで培養して＋１５日目の、ナイーブ、ＣＭ、ＥＭ及びＥＭＲＡサブセットの割合のフローサイトメトリー解析を示す。（Ｊ）長期に「ストレスを与えた」共培養により、２８．４－１ＢＢ．ζ及び２８．ＯＸ４０．ζの両Ｔ細胞において、ＥＭ及びＣＭ区画の選択が誘導されたが、ＮＴ Ｔ細胞においては、誘導されなかった。（Ｋ）ＩＬ２又はＩＬ７／ＩＬ１５サイトカインにより１５日間増殖させた、ＮＴ（白色の棒）、２８．４．１ＢＢ．ζ（横線の棒）又は２８．ＯＸ４０．ζ（黒色の棒）いずれかのＣＤ３＋Ｔ細胞の枯渇プロファイルを示す。同一の培養条件下で増殖させた、ＮＴ Ｔ細胞又はＣＡＲ－ＣＤ３０Ｔ細胞間の有意性は、黒色により表し、一方、ＩＬ２又はＩＬ７／ＩＬ１５の存在下で培養したＴ細胞の同一集団間の比較のため、円で囲んだアスタリスクは、ｐ値を示す。（Ｌ）長期に「ストレスを与えた」共培養により、両方の種類のＣＡＲ．ＣＤ３０Ｔ細胞において、特定には、ＰＤ１及びＴＩＭ３の、枯渇マーカーの上方制御が誘導されたが、このような分子の上方制御は、これらの溶解活性に干渉しなかった。４名のＨＤからのデータは、平均±ＳＤとして表す。^＊ｐ値≦０．０５、^＊＊ｐ値≦０．００１である。

【図13-2】長期ストレス共培養を示す図である。（Ａ）「ストレス共培養」の実験デザインを模式図で示す。形質導入後＋１５日目のＴ細胞を、カルパス２９９腫瘍細胞株と１：１のＥ／Ｔ比で接触させて（２４ウェルプレートに０．５Ｅ＋０６のＴ細胞対０．５Ｅ＋０６のカルパス２９９）共培養した。腫瘍細胞は、共培養して２０日目まで５日毎に投与した（Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶ投与）。各時点では、２４時間で上清を採取し、サイトカインＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ－２及びＩＬ－１０の存在について解析した。各投与の５日後、細胞を採取し、ＦＡＣＳにより解析した。（Ｂ）棒グラフは、腫瘍の各投与の５日後の培養における残留腫瘍の割合を示す。両ＣＡＲ．ＣＤ３０Ｔ細胞により、腫瘍の増殖が効率的に制御された。それにもかかわらず、２８－ＯＸ４０ζＴ細胞は、＋２０日目に腫瘍制御の向上を示した。（Ｃ）棒グラフは、共培養において各時点で存在する総ＣＤ３陽性Ｔ細胞に対するＣＡＲ陽性Ｔ細胞の割合を示す。両ＣＡＲ．ＣＤ３０分子の割合は、第１の共培養、すなわち、＋５日目の後に有意に増加した。腫瘍の再曝露は、２８．４－１ＢＢ．ζＴ細胞についてのみ、形質導入のレベルに負に影響し、一方、割合は、２８．ＯＸ４０．ζＴ細胞において、安定したままであった。（Ｄ）グラフは、２８．４－１ＢＢ．ζＴ細胞に対して（白色の棒）、２８．ＯＸ４０．ζＴ細胞において（黒色の棒）有意に高いＭＦＩ値を強調する。（Ｅ～Ｈ）サイトカインプロファイルを、腫瘍による刺激の２４時間後に採取した上清に対して実施したＥＬＬＡアッセイから得た。７名の健常ドナー（ＨＤ）からのデータは、平均±ＳＤとして表す。^＊ｐ値≦０．０５、^＊＊Ｐ値≦０．０１、^＊＊＊Ｐ値≦０．００１及び^＊＊＊＊≦０．０００１である。（Ｉ）ＣＡＲ．ＣＤ３０Ｔ細胞における記憶及び枯渇プロファイルの腫瘍による調節を示す。ＩＬ２又はＩＬ７／ＩＬ１５サイトカインの存在下で増殖させた、ＮＴ（白色の棒）、２８．４．１ＢＢ．ζ（横線の棒）又は２８．ＯＸ４０．ζ（黒色の棒）のいずれかのＣＤ３＋Ｔ細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで培養して＋１５日目の、ナイーブ、ＣＭ、ＥＭ及びＥＭＲＡサブセットの割合のフローサイトメトリー解析を示す。（Ｊ）長期に「ストレスを与えた」共培養により、２８．４－１ＢＢ．ζ及び２８．ＯＸ４０．ζの両Ｔ細胞において、ＥＭ及びＣＭ区画の選択が誘導されたが、ＮＴ Ｔ細胞においては、誘導されなかった。（Ｋ）ＩＬ２又はＩＬ７／ＩＬ１５サイトカインにより１５日間増殖させた、ＮＴ（白色の棒）、２８．４．１ＢＢ．ζ（横線の棒）又は２８．ＯＸ４０．ζ（黒色の棒）いずれかのＣＤ３＋Ｔ細胞の枯渇プロファイルを示す。同一の培養条件下で増殖させた、ＮＴ Ｔ細胞又はＣＡＲ－ＣＤ３０Ｔ細胞間の有意性は、黒色により表し、一方、ＩＬ２又はＩＬ７／ＩＬ１５の存在下で培養したＴ細胞の同一集団間の比較のため、円で囲んだアスタリスクは、ｐ値を示す。（Ｌ）長期に「ストレスを与えた」共培養により、両方の種類のＣＡＲ．ＣＤ３０Ｔ細胞において、特定には、ＰＤ１及びＴＩＭ３の、枯渇マーカーの上方制御が誘導されたが、このような分子の上方制御は、これらの溶解活性に干渉しなかった。４名のＨＤからのデータは、平均±ＳＤとして表す。^＊ｐ値≦０．０５、^＊＊ｐ値≦０．００１である。

【図13-3】長期ストレス共培養を示す図である。（Ａ）「ストレス共培養」の実験デザインを模式図で示す。形質導入後＋１５日目のＴ細胞を、カルパス２９９腫瘍細胞株と１：１のＥ／Ｔ比で接触させて（２４ウェルプレートに０．５Ｅ＋０６のＴ細胞対０．５Ｅ＋０６のカルパス２９９）共培養した。腫瘍細胞は、共培養して２０日目まで５日毎に投与した（Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶ投与）。各時点では、２４時間で上清を採取し、サイトカインＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ－２及びＩＬ－１０の存在について解析した。各投与の５日後、細胞を採取し、ＦＡＣＳにより解析した。（Ｂ）棒グラフは、腫瘍の各投与の５日後の培養における残留腫瘍の割合を示す。両ＣＡＲ．ＣＤ３０Ｔ細胞により、腫瘍の増殖が効率的に制御された。それにもかかわらず、２８－ＯＸ４０ζＴ細胞は、＋２０日目に腫瘍制御の向上を示した。（Ｃ）棒グラフは、共培養において各時点で存在する総ＣＤ３陽性Ｔ細胞に対するＣＡＲ陽性Ｔ細胞の割合を示す。両ＣＡＲ．ＣＤ３０分子の割合は、第１の共培養、すなわち、＋５日目の後に有意に増加した。腫瘍の再曝露は、２８．４－１ＢＢ．ζＴ細胞についてのみ、形質導入のレベルに負に影響し、一方、割合は、２８．ＯＸ４０．ζＴ細胞において、安定したままであった。（Ｄ）グラフは、２８．４－１ＢＢ．ζＴ細胞に対して（白色の棒）、２８．ＯＸ４０．ζＴ細胞において（黒色の棒）有意に高いＭＦＩ値を強調する。（Ｅ～Ｈ）サイトカインプロファイルを、腫瘍による刺激の２４時間後に採取した上清に対して実施したＥＬＬＡアッセイから得た。７名の健常ドナー（ＨＤ）からのデータは、平均±ＳＤとして表す。^＊ｐ値≦０．０５、^＊＊Ｐ値≦０．０１、^＊＊＊Ｐ値≦０．００１及び^＊＊＊＊≦０．０００１である。（Ｉ）ＣＡＲ．ＣＤ３０Ｔ細胞における記憶及び枯渇プロファイルの腫瘍による調節を示す。ＩＬ２又はＩＬ７／ＩＬ１５サイトカインの存在下で増殖させた、ＮＴ（白色の棒）、２８．４．１ＢＢ．ζ（横線の棒）又は２８．ＯＸ４０．ζ（黒色の棒）のいずれかのＣＤ３＋Ｔ細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで培養して＋１５日目の、ナイーブ、ＣＭ、ＥＭ及びＥＭＲＡサブセットの割合のフローサイトメトリー解析を示す。（Ｊ）長期に「ストレスを与えた」共培養により、２８．４－１ＢＢ．ζ及び２８．ＯＸ４０．ζの両Ｔ細胞において、ＥＭ及びＣＭ区画の選択が誘導されたが、ＮＴ Ｔ細胞においては、誘導されなかった。（Ｋ）ＩＬ２又はＩＬ７／ＩＬ１５サイトカインにより１５日間増殖させた、ＮＴ（白色の棒）、２８．４．１ＢＢ．ζ（横線の棒）又は２８．ＯＸ４０．ζ（黒色の棒）いずれかのＣＤ３＋Ｔ細胞の枯渇プロファイルを示す。同一の培養条件下で増殖させた、ＮＴ Ｔ細胞又はＣＡＲ－ＣＤ３０Ｔ細胞間の有意性は、黒色により表し、一方、ＩＬ２又はＩＬ７／ＩＬ１５の存在下で培養したＴ細胞の同一集団間の比較のため、円で囲んだアスタリスクは、ｐ値を示す。（Ｌ）長期に「ストレスを与えた」共培養により、両方の種類のＣＡＲ．ＣＤ３０Ｔ細胞において、特定には、ＰＤ１及びＴＩＭ３の、枯渇マーカーの上方制御が誘導されたが、このような分子の上方制御は、これらの溶解活性に干渉しなかった。４名のＨＤからのデータは、平均±ＳＤとして表す。^＊ｐ値≦０．０５、^＊＊ｐ値≦０．００１である。

【発明を実施するための形態】

【0048】

本発明の実施形態によれば、ＣＤ３０キメラ抗原受容体分子は、
ａ）MEFGLSWLFLVAILKGVQC（配列番号１）を含むか、又はこれからなるシグナルペプチドであって、第１のリンカーにより以下に連結されている、シグナルペプチド、
ｂ）ＡＣ１０ ＶＬ配列：DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDFDGDSYMNWYQQKPGQPPKVLIYAASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQQSNEDPWTFGGGTKLEIK（配列番号２）及びＡＣ１０ ＶＨ配列：QIQLQQSGPEVVKPGASVKISCKASGYTFTDYYITWVKQKPGQGLEWIGWIYPGSGNTKYNEKFKGKATLTVDTSSSTAFMQLSSLTSEDTAVYFCANYGNYWFAYWGQGTQVTVSA（配列番号３）を含むか、又はこれらからなる、ＡＣ１０ハイブリドーマ由来の抗ＣＤ３０一本鎖抗体ドメインであって、上記ＡＣ１０ ＶＬ及びＶＨ配列が、第２のリンカー（Ｇ４Ｓ）２リンカー：GGGGSGGGG（配列番号１７）により連結されている、抗ＣＤ３０一本鎖抗体ドメイン、
ｃ）ΔＣＤ３４：ELPTQGTFSNVSTNVS（配列番号４）を含むか、又はこれからなる追跡可能なマーカー、
ｄ）ヒンジＣＤ８αPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFA（配列番号７）、
ｅ）リンカーＣＤ８ａ細胞質（ｃｙｔｏ）：LYCNHRN（配列番号２５）を含むか、又はこれからなる１つ又は複数のリンカーにより、以下に連結されている膜貫通ドメインＣＤ８ａＴＭCDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT（配列番号１４）、
ｆ）ＣＤ２８細胞質配列RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS（配列番号２１）、ＯＸ４０配列RDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI（配列番号２４）及びＣＤ３ゼータ鎖：RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR*（配列番号２３）を連結させることにより得られる配列からなる共刺激シグナル伝達ドメイン
を含むか、又はこれらからなる。
或いは、本発明によるＣＤ３０キメラ抗原受容体分子は、
ａ）MEFGLSWLFLVAILKGVQC（配列番号１）を含むか、又はこれからなるシグナルペプチドであって、第１のリンカーにより以下に連結されている、シグナルペプチド、
ｂ）ＡＣ１０ ＶＬ配列：DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDFDGDSYMNWYQQKPGQPPKVLIYAASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQQSNEDPWTFGGGTKLEIK（配列番号２）及びＡＣ１０ ＶＨ配列：QIQLQQSGPEVVKPGASVKISCKASGYTFTDYYITWVKQKPGQGLEWIGWIYPGSGNTKYNEKFKGKATLTVDTSSSTAFMQLSSLTSEDTAVYFCANYGNYWFAYWGQGTQVTVSA（配列番号３）を含むか、又はこれらからなる、ＡＣ１０ハイブリドーマ由来の抗ＣＤ３０一本鎖抗体ドメインであって、上記ＡＣ１０ ＶＬ及びＶＨ配列が、第２のリンカー（Ｇ４Ｓ）２リンカー：GGGGSGGGG（配列番号１７）により連結されている、抗ＣＤ３０一本鎖抗体ドメイン、
ｃ）ΔＣＤ３４：ELPTQGTFSNVSTNVS（配列番号４）を含むか、又はこれからなる追跡可能なマーカー、
ｄ）ヒンジＣＤ８αPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFA（配列番号７）、
ｅ）ＣＤ８ａ細胞質（ｃｙｔｏ）：LYCNHRN（配列番号２５）を含むか、又はこれからなる１つ又は複数のリンカーにより、以下に連結されている膜貫通ドメインＣＤ８ａＴＭCDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT（配列番号１４）、
ｆ）ＣＤ２８細胞質配列：RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS（配列番号２１）、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）配列：KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL（配列番号２２）、及びＣＤ３ゼータ鎖：RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR*（配列番号２３）を連結させることにより得られる配列からなる、共刺激シグナル伝達ドメイン
を含むか、又はこれらからなる。

【0049】

本発明の好ましい実施形態によれば、ＣＤ３０キメラ抗原受容体分子は、MEFGLSWLFLVAILKGVQCSRDIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDFDGDSYMNWYQQKPGQPPKVLIYAASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQQSNEDPWTFGGGTKLEIKGGGSGGGGQIQLQQSGPEVVKPGASVKISCKASGYTFTDYYITWVKQKPGQGLEWIGWIYPGSGNTKYNEKFKGKATLTVDTSSSTAFMQLSSLTSEDTAVYFCANYGNYWFAYWGQGTQVTVSAGSELPTQGTFSNVSTNVSPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNEFRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR*（配列番号２６）である。

【0050】

すなわち、本明細書によりＳＦＧ．ＣＡＲ．ＣＤ３０（ＡＣ１０）ΔＣＤ３４．ＣＤ８ａＴＭ．ＣＤ２８ｃｙｔｏ．４－１ＢＢ．ζとも名付けられるこの配列は、次の配列：
シグナルペプチド
MEFGLSWLFLVAILKGVQC（配列番号１）（ヌクレオチド識別番号ＡＢ７７６８３８．１及びタンパク質識別番号ＢＡＮ６３１３１．１）
連結
ＳＲ（接続配列）
ＶＬ（ＡＣ１０）
DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDFDGDSYMNWYQQKPGQPPKVLIYAASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQQSNEDPWTFGGGTKLEIK（配列番号２）
フレックス
GGGSGGGG（Ｇ３ＳＧ４リンカー）（配列番号２０）
ＶＨ（ＡＣ１０）
QIQLQQSGPEVVKPGASVKISCKASGYTFTDYYITWVKQKPGQGLEWIGWIYPGSGNTKYNEKFKGKATLTVDTSSSTAFMQLSSLTSEDTAVYFCANYGNYWFAYWGQGTQVTVSA（配列番号３）
連結
ＧＳ（接続配列）
ΔＣＤ３４
ELPTQGTFSNVSTNVS（配列番号４）（ヌクレオチド識別番号ＡＢ２３８２３１．１及びタンパク質識別番号ＢＡＥ４６７４８．１）
ヒンジ（スペーサー）細胞外
PAPRPPTPAPT（スペーサー）（配列番号１１）
ヒンジ（ＣＤ８ａ）細胞外
IASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFA（配列番号１２）（ヌクレオチド識別番号ＮＭ＿００１７６８．６及びタンパク質識別番号ＮＰ＿００１７５９．３）
ＣＤ８ａ（ＴＭ）膜貫通
CDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT（配列番号１４）（ヌクレオチド識別番号ＮＭ＿００１７６８．６及びタンパク質識別番号ＮＰ＿００１７５９．３）
接続のＣＤ８ａ細胞質（ｃｙｔｏ）連結
LYCNHRN（配列番号２５）（ヌクレオチド識別番号ＮＭ＿００１７６８．６及びタンパク質識別番号ＮＰ＿００１７５９．３）
接続の連結
ＥＦ（接続配列）
ＣＤ２８ ｃｙｔｏ
RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS（配列番号２１）（ヌクレオチド識別番号ＡＦ２２２３４１．１及びタンパク質識別番号ＡＡＦ３３７９２．１）
４．１ＢＢ
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL（配列番号２２）（ヌクレオチド識別番号Ｕ０３３９７．１及びタンパク質識別番号ＡＡＡ５３１３３．１）
ＣＤ３ゼータ鎖
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR*（配列番号２３）（ヌクレオチド識別番号Ｊ０４１３２．１及びタンパク質識別番号ＡＡＡ６０３９４．１）
を含む。

【0051】

本発明のさらに好ましい実施形態によれば、ＣＤ３０キメラ抗原受容体は、MEFGLSWLFLVAILKGVQCSRDIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDFDGDSYMNWYQQKPGQPPKVLIYAASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQQSNEDPWTFGGGTKLEIKGGGSGGGGQIQLQQSGPEVVKPGASVKISCKASGYTFTDYYITWVKQKPGQGLEWIGWIYPGSGNTKYNEKFKGKATLTVDTSSSTAFMQLSSLTSEDTAVYFCANYGNYWFAYWGQGTQVTVSAGSELPTQGTFSNVSTNVSPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNEFRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKIRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR*（配列番号２７）である。

【0052】

すなわち、本明細書によりＳＦＧ．ＣＡＲ．ＣＤ３０（ＡＣ１０）ΔＣＤ３４．ＣＤ８ａＴＭ．ＣＤ２８ｃｙｔｏ．ＯＸ４０．ζとも名付けられるこの配列は、次の配列：
シグナルペプチド
MEFGLSWLFLVAILKGVQC（配列番号１）（ヌクレオチド識別番号ＡＢ７７６８３８．１及びタンパク質識別番号ＢＡＮ６３１３１．１）
連結
ＳＲ（接続配列）
ＶＬ（ＡＣ１０）
DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDFDGDSYMNWYQQKPGQPPKVLIYAASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQQSNEDPWTFGGGTKLEIK（配列番号２）
フレックス
GGGSGGGG（Ｇ３ＳＧ４リンカー）（配列番号２０）
ＶＨ（ＡＣ１０）
QIQLQQSGPEVVKPGASVKISCKASGYTFTDYYITWVKQKPGQGLEWIGWIYPGSGNTKYNEKFKGKATLTVDTSSSTAFMQLSSLTSEDTAVYFCANYGNYWFAYWGQGTQVTVSA（配列番号３）
連結
ＧＳ（接続配列）
ΔＣＤ３４
ELPTQGTFSNVSTNVS（配列番号４）（ヌクレオチド識別番号ＡＢ２３８２３１．１及びタンパク質識別番号ＢＡＥ４６７４８．１）
ヒンジ（スペーサー）細胞外
PAPRPPTPAPT（スペーサー）（配列番号１１）
ヒンジ（ＣＤ８ａ）細胞外
IASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFA（配列番号１２）（ヌクレオチド識別番号ＮＭ＿００１７６８．６及びタンパク質識別番号ＮＰ＿００１７５９．３）
ＣＤ８ａ（ＴＭ）膜貫通
CDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT（配列番号１４）（ヌクレオチド識別番号ＮＭ＿００１７６８．６及びタンパク質識別番号ＮＰ＿００１７５９．３）
接続のＣＤ８ａ細胞質（ｃｙｔｏ）連結
LYCNHRN（配列番号２５）（ヌクレオチド識別番号ＮＭ＿００１７６８．６及びタンパク質識別番号ＮＰ＿００１７５９．３）
接続の連結
ＥＦ（接続配列）
ＣＤ２８ ｃｙｔｏ
RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS（配列番号２１）（ヌクレオチド識別番号ＡＦ２２２３４１．１及びタンパク質識別番号ＡＡＦ３３７９２．１）
ＯＸ４０
RDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI（配列番号２４）（ヌクレオチド識別番号ＮＭ＿００３３２７．３及びタンパク質識別番号ＮＰ＿００３３１８．１）
ＣＤ３ゼータ鎖
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR*（配列番号２３）（ヌクレオチド識別番号Ｊ０４１３２．１及びタンパク質識別番号ＡＡＡ６０３９４．１）
を含む。

【0053】

また、本発明は、上記のＣＤ３０キメラ抗原受容体をコードするヌクレオチド配列に関する。

【0054】

本発明の実施形態によれば、ヌクレオチド配列は、ATGGAGTTTGGGCTCTCCTGGCTCTTCCTGGTCGCGATTCTGAAGGGGGTCCAGTGTTCACGAGATATCGTCCTGACTCAGAGTCCTGCCAGCCTGGCAGTCTCCCTGGGACAGAGAGCTACCATAAGTTGTAAAGCATCACAGTCTGTTGATTTCGATGGCGACAGCTATATGAATTGGTACCAGCAAAAACCCGGCCAGCCCCCGAAAGTTTTGATCTATGCAGCCTCTAACTTGGAAAGCGGCATTCCTGCGCGATTCAGTGGCAGCGGGAGTGGTACAGATTTCACCCTGAACATACACCCAGTCGAAGAGGAGGACGCAGCCACATATTACTGCCAACAATCTAACGAGGATCCATGGACTTTTGGGGGCGGCACTAAACTCGAAATCAAGGGCGGAGGTTCAGGCGGAGGAGGGCAGATTCAACTGCAGCAATCAGGACCCGAGGTGGTCAAACCAGGTGCCAGTGTCAAGATATCTTGCAAGGCATCCGGATATACATTTACCGACTATTACATTACCTGGGTCAAGCAGAAACCCGGGCAAGGACTTGAATGGATTGGATGGATCTACCCTGGTAGCGGCAACACCAAATACAACGAAAAGTTTAAAGGGAAGGCAACCCTGACTGTAGACACCTCCAGCTCCACAGCATTCATGCAGCTCTCCTCACTGACCTCCGAGGACACAGCAGTGTATTTCTGTGCTAATTACGGTAATTACTGGTTCGCCTATTGGGGCCAGGGAACCCAAGTGACCGTTTCAGCTGGATCCGAACTTCCTACTCAGGGGACTTTCTCAAACGTTAGCACAAACGTAAGTCCCGCCCCAAGACCCCCCACACCTGCGCCGACCATTGCTTCTCAACCCCTGAGTTTGAGACCCGAGGCCTGCCGGCCAGCTGCCGGCGGGGCCGTGCATACAAGAGGACTCGATTTCGCTTGCGACATCTACATCTGGGCTCCCCTCGCTGGCACCTGTGGGGTGCTGCTGCTGTCACTCGTGATCACCCTTTATTGCAACCATCGAAACGAATTCAGAAGTAAACGGTCAAGGCTTCTGCACAGCGATTATATGAATATGACACCAAGAAGACCTGGTCCAACCCGGAAACACTATCAGCCCTACGCGCCCCCTAGAGACTTCGCAGCATACCGCTCTAAGAGAGGGAGAAAAAAATTGCTCTATATTTTTAAACAACCATTTATGAGGCCCGTACAGACAACTCAGGAAGAGGATGGCTGTAGTTGCCGCTTCCCAGAGGAGGAGGAAGGAGGCTGCGAGTTGAGAGTTAAATTCAGTAGAAGTGCGGATGCGCCTGCTTACCAGCAGGGCCAGAACCAACTGTACAATGAACTGAATCTCGGGCGCCGAGAAGAGTATGACGTCCTCGATAAGCGGAGGGGTAGGGATCCTGAAATGGGTGGGAAGCCAAGAAGAAAAAACCCCCAGGAAGGACTGTATAACGAACTTCAGAAGGACAAGATGGCAGAGGCCTACTCTGAGATTGGCATGAAAGGCGAACGACGGCGCGGTAAAGGTCATGACGGGCTGTACCAGGGCCTGTCCACAGCGACGAAGGACACTTACGACGCCCTGCACATGCAGGCACTCCCCCCCAGGTGA（配列番号２８）である。

【0055】

すなわち、ＳＦＧ．ＣＡＲ．ＣＤ３０（ＡＣ１０）ΔＣＤ３４．ＣＤ８ａＴＭ．ＣＤ２８ｃｙｔｏ．４－１ＢＢ．ζとも名付けられる配列をコードする、このヌクレオチド配列は、次の配列：
シグナルペプチド
ATGGAGTTTGGGCTCTCCTGGCTCTTCCTGGTCGCGATTCTGAAGGGGGTCCAGTGTTCACGA（配列番号２９）（ヌクレオチド識別番号ＡＢ７７６８３８．１）
ＶＬ（ＡＣ１０）
GATATCGTCCTGACTCAGAGTCCTGCCAGCCTGGCAGTCTCCCTGGGACAGAGAGCTACCATAAGTTGTAAAGCATCACAGTCTGTTGATTTCGATGGCGACAGCTATATGAATTGGTACCAGCAAAAACCCGGCCAGCCCCCGAAAGTTTTGATCTATGCAGCCTCTAACTTGGAAAGCGGCATTCCTGCGCGATTCAGTGGCAGCGGGAGTGGTACAGATTTCACCCTGAACATACACCCAGTCGAAGAGGAGGACGCAGCCACATATTACTGCCAACAATCTAACGAGGATCCATGGACTTTTGGGGGCGGCACTAAACTCGAAATCAAG（配列番号３０）
フレックス
GGCGGAGGTTCAGGCGGAGGAGGG（Ｇ３ＳＧ４リンカー）（配列番号３１）
ＶＨ（ＡＣ１０）
GATATCGTCCTGACTCAGAGTCCTGCCAGCCTGGCAGTCTCCCTGGGACAGAGAGCTACCATAAGTTGTAAAGCATCACAGTCTGTTGATTTCGATGGCGACAGCTATATGAATTGGTACCAGCAAAAACCCGGCCAGCCCCCGAAAGTTTTGATCTATGCAGCCTCTAACTTGGAAAGCGGCATTCCTGCGCGATTCAGTGGCAGCGGGAGTGGTACAGATTTCACCCTGAACATACACCCAGTCGAAGAGGAGGACGCAGCCACATATTACTGCCAACAATCTAACGAGGATCCATGGACTTTTGGGGGCGGCACTAAACTCGAAATCAAG（配列番号３２）
連結（ＢａｍＨ１制限部位）
GGATCC（ＢａｍＨ１制限部位及び接続配列）（配列番号３３）
ΔＣＤ３４
GAACTTCCTACTCAGGGGACTTTCTCAAACGTTAGCACAAACGTAAGT（配列番号３４）（ヌクレオチド識別番号ＡＢ２３８２３１．１）
ヒンジ（ＣＤ８ａ）細胞外
CCCGCCCCAAGACCCCCCACACCTGCGCCGACCATTGCTTCTCAACCCCTGAGTTTGAGACCCGAGGCCTGCCGGCCAGCTGCCGGCGGGGCCGTGCATACAAGAGGACTCGATTTCGCT（配列番号３５）（ＮＭ＿００１７６８．６）
ＣＤ８ａ（ＴＭ）膜貫通
TGCGACATCTACATCTGGGCTCCCCTCGCTGGCACCTGTGGGGTGCTGCTGCTGTCACTCGTGATCACC（配列番号３６）（ＮＭ＿００１７６８．６）
接続のＣＤ８ａ細胞質（ｃｙｔｏ）連結
CTTTATTGCAACCATCGAAAC（配列番号３７）（ＮＭ＿００１７６８．６）
連結（ＥｃｏＲ１制限部位及び接続配列）
GAATTC（配列番号３８）
ＣＤ２８ ｃｙｔｏ
AGAAGTAAACGGTCAAGGCTTCTGCACAGCGATTATATGAATATGACACCAAGAAGACCTGGTCCAACCCGGAAACACTATCAGCCCTACGCGCCCCCTAGAGACTTCGCAGCATACCGCTCT（配列番号３９）（ＡＦ２２２３４．１）
４．１ＢＢ
AAGAGAGGGAGAAAAAAATTGCTCTATATTTTTAAACAACCATTTATGAGGCCCGTACAGACAACTCAGGAAGAGGATGGCTGTAGTTGCCGCTTCCCAGAGGAGGAGGAAGGAGGCTGCGAGTTG（配列番号４０）（Ｕ０３３９７．１）
ＣＤ３ゼータ鎖
AGAGTTAAATTCAGTAGAAGTGCGGATGCGCCTGCTTACCAGCAGGGCCAGAACCAACTGTACAATGAACTGAATCTCGGGCGCCGAGAAGAGTATGACGTCCTCGATAAGCGGAGGGGTAGGGATCCTGAAATGGGTGGGAAGCCAAGAAGAAAAAACCCCCAGGAAGGACTGTATAACGAACTTCAGAAGGACAAGATGGCAGAGGCCTACTCTGAGATTGGCATGAAAGGCGAACGACGGCGCGGTAAAGGTCATGACGGGCTGTACCAGGGCCTGTCCACAGCGACGAAGGACACTTACGACGCCCTGCACATGCAGGCACTCCCCCCCAGGTGA（配列番号４１）（Ｊ０４１３２．１）
を含む。

【0056】

本発明のさらなる実施形態によれば、ヌクレオチド配列は、ATGGAGTTTGGGCTCTCCTGGCTCTTCCTGGTCGCGATTCTGAAGGGGGTCCAGTGTTCACGAGATATCGTCCTGACTCAGAGTCCTGCCAGCCTGGCAGTCTCCCTGGGACAGAGAGCTACCATAAGTTGTAAAGCATCACAGTCTGTTGATTTCGATGGCGACAGCTATATGAATTGGTACCAGCAAAAACCCGGCCAGCCCCCGAAAGTTTTGATCTATGCAGCCTCTAACTTGGAAAGCGGCATTCCTGCGCGATTCAGTGGCAGCGGGAGTGGTACAGATTTCACCCTGAACATACACCCAGTCGAAGAGGAGGACGCAGCCACATATTACTGCCAACAATCTAACGAGGATCCATGGACTTTTGGGGGCGGCACTAAACTCGAAATCAAGGGCGGAGGTTCAGGCGGAGGAGGGCAGATTCAACTGCAGCAATCAGGACCCGAGGTGGTCAAACCAGGTGCCAGTGTCAAGATATCTTGCAAGGCATCCGGATATACATTTACCGACTATTACATTACCTGGGTCAAGCAGAAACCCGGGCAAGGACTTGAATGGATTGGATGGATCTACCCTGGTAGCGGCAACACCAAATACAACGAAAAGTTTAAAGGGAAGGCAACCCTGACTGTAGACACCTCCAGCTCCACAGCATTCATGCAGCTCTCCTCACTGACCTCCGAGGACACAGCAGTGTATTTCTGTGCTAATTACGGTAATTACTGGTTCGCCTATTGGGGCCAGGGAACCCAAGTGACCGTTTCAGCTGGATCCGAACTTCCTACTCAGGGGACTTTCTCAAACGTTAGCACAAACGTAAGTCCCGCCCCAAGACCCCCCACACCTGCGCCGACCATTGCTTCTCAACCCCTGAGTTTGAGACCCGAGGCCTGCCGGCCAGCTGCCGGCGGGGCCGTGCATACAAGAGGACTCGATTTCGCTTGCGACATCTACATCTGGGCTCCCCTCGCTGGCACCTGTGGGGTGCTGCTGCTGTCACTCGTGATCACCCTTTATTGCAACCATCGAAACGAATTCAGAAGTAAACGGTCAAGGCTTCTGCACAGCGATTATATGAATATGACACCAAGAAGACCTGGTCCAACCCGGAAACACTATCAGCCCTACGCGCCCCCTAGAGACTTCGCAGCATACCGCTCTCGCGATCAAAGACTCCCGCCCGATGCCCACAAACCCCCTGGCGGGGGCAGCTTTAGGACACCCATTCAAGAAGAGCAGGCAGACGCCCACAGCACCTTGGCCAAAATTAGAGTTAAATTCAGTAGAAGTGCGGATGCGCCTGCTTACCAGCAGGGCCAGAACCAACTGTACAATGAACTGAATCTCGGGCGCCGAGAAGAGTATGACGTCCTCGATAAGCGGAGGGGTAGGGATCCTGAAATGGGTGGGAAGCCAAGAAGAAAAAACCCCCAGGAAGGACTGTATAACGAACTTCAGAAGGACAAGATGGCAGAGGCCTACTCTGAGATTGGCATGAAAGGCGAACGACGGCGCGGTAAAGGTCATGACGGGCTGTACCAGGGCCTGTCCACAGCGACGAAGGACACTTACGACGCCCTGCACATGCAGGCACTCCCCCCCAGGTGA（配列番号４２）である。

【0057】

すなわち、ＳＦＧ．ＣＡＲ．ＣＤ３０（ＡＣ１０）ΔＣＤ３４．ＣＤ８ａＴＭ．ＣＤ２８ｃｙｔｏ．ＯＸ４０．ζとも名付けられる配列をコードする、このヌクレオチド配列は、次の配列：
シグナルペプチド
ATGGAGTTTGGGCTCTCCTGGCTCTTCCTGGTCGCGATTCTGAAGGGGGTCCAGTGTTCACGA（配列番号２９）（ＡＢ７７６８３８．１）
ＶＬ（ＡＣ１０）
GATATCGTCCTGACTCAGAGTCCTGCCAGCCTGGCAGTCTCCCTGGGACAGAGAGCTACCATAAGTTGTAAAGCATCACAGTCTGTTGATTTCGATGGCGACAGCTATATGAATTGGTACCAGCAAAAACCCGGCCAGCCCCCGAAAGTTTTGATCTATGCAGCCTCTAACTTGGAAAGCGGCATTCCTGCGCGATTCAGTGGCAGCGGGAGTGGTACAGATTTCACCCTGAACATACACCCAGTCGAAGAGGAGGACGCAGCCACATATTACTGCCAACAATCTAACGAGGATCCATGGACTTTTGGGGGCGGCACTAAACTCGAAATCAAG（配列番号３０）
フレックス
GGCGGAGGTTCAGGCGGAGGAGGG（Ｇ３ＳＧ４リンカー）（配列番号３１）
ＶＨ（ＡＣ１０）
GATATCGTCCTGACTCAGAGTCCTGCCAGCCTGGCAGTCTCCCTGGGACAGAGAGCTACCATAAGTTGTAAAGCATCACAGTCTGTTGATTTCGATGGCGACAGCTATATGAATTGGTACCAGCAAAAACCCGGCCAGCCCCCGAAAGTTTTGATCTATGCAGCCTCTAACTTGGAAAGCGGCATTCCTGCGCGATTCAGTGGCAGCGGGAGTGGTACAGATTTCACCCTGAACATACACCCAGTCGAAGAGGAGGACGCAGCCACATATTACTGCCAACAATCTAACGAGGATCCATGGACTTTTGGGGGCGGCACTAAACTCGAAATCAAG（配列番号３２）
連結（ＢａｍＨ１制限部位及び接続配列）
GGATCC（配列番号３３）
ΔＣＤ３４
GAACTTCCTACTCAGGGGACTTTCTCAAACGTTAGCACAAACGTAAGT（配列番号３４）（ＡＢ２３８２３１．１）
ヒンジ（ＣＤ８ａ）細胞外
CCCGCCCCAAGACCCCCCACACCTGCGCCGACCATTGCTTCTCAACCCCTGAGTTTGAGACCCGAGGCCTGCCGGCCAGCTGCCGGCGGGGCCGTGCATACAAGAGGACTCGATTTCGCT（配列番号３５）（ＮＭ＿００１７６８．６）
ＣＤ８ａ（ＴＭ）膜貫通
TGCGACATCTACATCTGGGCTCCCCTCGCTGGCACCTGTGGGGTGCTGCTGCTGTCACTCGTGATCACC（配列番号３６）（ＮＭ＿００１７６８．６）
接続のＣＤ８ａ細胞質（ｃｙｔｏ）連結
CTTTATTGCAACCATCGAAAC（配列番号３７）（ＮＭ＿００１７６８．６）
連結（ＥｃｏＲ１制限部位及び接続配列）
GAATTC（配列番号３８）
ＣＤ２８ ｃｙｔｏ
AGAAGTAAACGGTCAAGGCTTCTGCACAGCGATTATATGAATATGACACCAAGAAGACCTGGTCCAACCCGGAAACACTATCAGCCCTACGCGCCCCCTAGAGACTTCGCAGCATACCGCTCT（配列番号３９）（ＡＦ２２２３４１．１）
ＯＸ４０
CGCGATCAAAGACTCCCGCCCGATGCCCACAAACCCCCTGGCGGGGGCAGCTTTAGGACACCCATTCAAGAAGAGCAGGCAGACGCCCACAGCACCTTGGCCAAAATT（配列番号４３）（ＮＭ＿００３３２７．３）
ＣＤ３ゼータ鎖
AGAGTTAAATTCAGTAGAAGTGCGGATGCGCCTGCTTACCAGCAGGGCCAGAACCAACTGTACAATGAACTGAATCTCGGGCGCCGAGAAGAGTATGACGTCCTCGATAAGCGGAGGGGTAGGGATCCTGAAATGGGTGGGAAGCCAAGAAGAAAAAACCCCCAGGAAGGACTGTATAACGAACTTCAGAAGGACAAGATGGCAGAGGCCTACTCTGAGATTGGCATGAAAGGCGAACGACGGCGCGGTAAAGGTCATGACGGGCTGTACCAGGGCCTGTCCACAGCGACGAAGGACACTTACGACGCCCTGCACATGCAGGCACTCCCCCCCAGGTGA（配列番号４１）（Ｊ０４１３２．１）
を含む。

【0058】

また、本発明は、ＤＮＡベクター、ＲＮＡベクター、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター又は非ウイルスベクターである、上記のヌクレオチド配列を含む、ベクターに関する。

【0059】

加えて、本発明は、上記のベクター又はプラスミドを含む、細胞、例えば、Ｔ細胞、例えば、アルファ／ベータ及びガンマ／デルタＴ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫ－Ｔ細胞に関する。

【0060】

本発明の実施形態によれば、上記の細胞は、組換えヒトＩＬ－２の存在下で、又は組換えＩＬ－７及びＩＬ１５の組合せにより得られる。例えば、上記のインターロイキンは、細胞調製プロセスのステップ、例えば、活性化、形質導入及び増殖のうちの少なくとも１つ又はすべてに存在し得る。

【0061】

また、本発明は、ヌクレオチド配列、又はベクター、又は細胞、上記のすべてを、１つ又は複数の薬学的に許容される賦形剤及び／又はアジュバントとともに含む医薬組成物に関する。

【0062】

本発明のさらなる目的は、医学的使用のための、ＣＤ３０キメラ抗原受容体分子、ヌクレオチド配列、ベクター、細胞、医薬組成物、上記のすべてである。

【0063】

本発明のさらなる目的は、ＣＤ３０＋がん又は難治性／再発性疾患、例えば、リンパ腫、例えば、ホジキン及び非ホジキンリンパ腫、固形腫瘍、例えば、筋線維芽細胞性肉腫、ラブドイド腫瘍、組織球性肉腫、胚性癌腫、腺癌、中皮腫、混合胚細胞腫瘍（ＧＣＴ）、非精上皮腫ＧＣＴ、頭頸部癌、卵黄嚢腫瘍、血管肉腫、下垂体腺腫、未分化胚細胞腫、奇形腫若しくは精上皮腫の治療、例えば、診断における使用のための、ＣＤ３０キメラ抗原受容体分子、ヌクレオチド配列、ベクター、細胞、医薬組成物、上記のすべてである。その上、本発明はまた、図７Ｄの効力アッセイにより示すように、ＣＤ３０＋ＰＤＬ１＋腫瘍（Ｌ４２８－ＰＤＬ１）を治療するために使用することができる。

【0064】

加えて、本発明はまた、上記細胞、例えば、Ｔリンパ球の活性化（例えば、固定化ＯＫＴ３及び抗ＣＤ２８抗体による）、形質導入及び増殖の少なくとも１つ又はすべてのステップが、組換えヒトＩＬ－２の存在下で、又は組換えＩＬ－７及びＩＬ１５の組合せにより実行される、上記の細胞の調製のためのプロセスに関する。

【0065】

本発明は、例示的であるが非制限的な方法により、本発明の好ましい実施形態に従って、次の付属の図面への特定の参照によって記載する。

【実施例】

【0066】

実施例１：本発明によるＣＡＲ－ＣＤ３０のデザイン及びｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでの試験
材料及び方法
ＣＡＲ－ＣＤ３０プラスミド（構築物）のデザイン
臨床グレードの２つの「第三」世代レトロウイルスベクターＳＦＧをデザインした。これは、ＩｇＧ（ＡＣ１０）クラスのマウス抗体に由来し、コドン最適化ヒトＣＤ８ヒンジ膜貫通ドメインを介して、２つの共刺激ドメインＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）又はＯＸ４０及びＣＤ３－ζのコドン最適化シグナル伝達ドメインに連結した、抗ＣＤ３０一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）のカセットを有する（図１Ａ）。ＣＤ３０に特異性の一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）は、８アミノ酸のフレックス（２７）（短いリンカーペプチド）により、免疫グロブリン重鎖の１１７ａａ（ＶＨ）に接続された、免疫グロブリン軽鎖の可変領域（ＶＬ）の１１１アミノ酸（ａａ）の融合タンパク質である。特定には、ｓｃＦｖ ＡＣ１０は、１６ａａ（追跡可能なマーカーとして）のコドン最適化ＣＤ３４由来のエピトープを用いてインフレームでクローニングし、４０ａａのヒンジ（スペーサーとしての１１ａａに加えてコドン最適化ＣＤ８細胞外ドメインの２９ａａ）により連結して、３０ａａのコドン最適化ヒトＣＤ８膜貫通ドメイン（ＣＤ８ａＴＭ）に結合させる。シグナルは、ＣＤ３０ｓｃＦｖＡＣ１０の細胞外部分からＣＤ３－ζ鎖（１１３ａａ）の細胞内部分まで、２つの共刺激分子：
ＳＦＧ．ＣＡＲ．ＣＤ３０（ＡＣ１０）ΔＣＤ３４．ＣＤ８ａＴＭ．ＣＤ２８ｃｙｔｏ．４．１ＢＢ．ζレトロウイルスベクター（２８．４－１ＢＢ．ζ）
のＣＤ２８エンドドメイン（４１ａａ）及び４－１ＢＢエンドドメイン（４２ａａ）により実行する。

【0067】

共刺激分子４．１ＢＢからＯＸ４０（３６ａａ）への切替えにより、
ＳＦＧ．ＣＡＲ．ＣＤ３０（ＡＣ１０）ΔＣＤ３４．ＣＤ８ａＴＭ．ＣＤ２８ｃｙｔｏ．ＯＸ４０．ζレトロウイルスベクター（２８．ＯＸ４０．ζ）
を得ることが可能となる。
ｅＧＦＰホタルルシフェラーゼ細胞株の生成
ｅＧＦＰホタルルシフェラーゼをコードするレトロウイルスベクター（ｅＧＦＰ－ＦＦＬｕｃ）を選択された実験に使用して、ＣＤ３０＋腫瘍細胞：
非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）カルパス２９９、
ホジキンリンパ腫（ＨＬ）ＨＤＭＬ－２及びＬ４２８、
横紋筋肉腫ＲＤ、
線維形成性小脳髄芽腫ＤＡＯＹ
を標識した。
ｅＧＦＰホタルルシフェラーゼをコードするレトロウイルスベクター（ｅＧＦＰ－ＦＦＬｕｃ）を選択された実験に使用してＣＤ３０陰性対照：
前駆Ｂ細胞白血病ＢＶ１７３、
慢性骨髄性白血病Ｋ５６２、
を標識した。

【0068】

このような細胞株を、これまでに記載されているように（９）、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでの試験に使用した。

【0069】

細胞株
非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）カルパス２９９をＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから得た。ホジキンリンパ腫（ＨＬ）ＨＤＭＬ－２及びＬ４２８並びに前駆Ｂ細胞白血病Ｐｈ＋ＢＶ１７３をＤＳＭＺから得た。横紋筋肉腫ＲＤ、線維形成性小脳髄芽腫ＤＡＯＹ、慢性骨髄性白血病Ｋ５６２、髄芽腫Ｄ２８３及び胚性腎２９３Ｔ細胞株をＬＧＣ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ－ＡＴＣＣから得た。

【0070】

カルパス２９９、ＨＤＭＬ－２、Ｌ４２８、ＢＶ１７３及びＫ５６２細胞株は、ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ、米国）で培養することにより維持した。ＲＤ、ＤＡＯＹ腫瘍細胞株及び２９３Ｔ細胞は、ＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）、カールスバッド、ＣＡ）で培養することにより維持し、Ｄ２８３は、ＩＭＤＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、米国）で維持し、細胞株に１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ、ハイクローン（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ピッツバーグ、ＰＡ）及び２ｍＭのグルタマックス（ＧｌｕｔａＭａｘ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア、米国）を添加した。細胞は、３７℃の５％ＣＯ_２を含む加湿環境で維持した。すべての細胞株は、マイコプラズマについて、及び標的抗原の表面発現ついて、常に試験した。すべての細胞株は、認証済研究所「ＢＭＲ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ｓ．ｒ．ｌ．」におけるＳＴＲ解析により立証されていた。

【0071】

レトロウイルス上清
一過性レトロウイルス上清を、それぞれ２：３：３の比率のＭｏＭＬＶｇａｇ／ｐｏｌ発現プラスミドＰｅｑＰａｍ３（－ｅｎｖ）、ＲＤ１１４ｅｎｖ発現プラスミドＲＤＦ、及びＳＦＧベクター、総ＤＮＡ１０μｇとの２９３Ｔの共トランスフェクションにより生成した。トランスフェクションは、ジーンジュース（ＧｅｎｅＪｕｉｃｅ）試薬（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）により促進した。トランスフェクション後２及び３日に上清を採取し、濾過（０．４５ｍｍのフィルターを使用）、スナップフリーズし、５ｍｌのアリコートに－８０℃で保存した（２８）。
エフェクター細胞の単離、生成及び形質導入
ＯＰＢＧの施設内審査委員会（ＩＲＢ）により設定された規則に従って（倫理委員会認可Ｎ^ｏ９６９／２０１５ ｐｒｏｔ．Ｎ^ｏ６６９ＬＢ）サインされたインフォームドコンセントを得た後、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、リンパ球分離培地（Ｅｕｒｏｂｉｏ、仏国）を使用して、健常ドナー（ＯＰＢＧ病院、ローマ、伊国）から得た末梢血（ＰＢ）又は軟膜から単離した。Ｔリンパ球は、固定化したＯＫＴ３（１μｇ／ｍｌ、ｅ－Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．、サンディエゴ、ＣＡ、米国）及び抗ＣＤ２８（１μｇ／ｍｌ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、欧州）抗体を用いて、組換えヒトインターロイキン２（ＩＬ－２、１００Ｕ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ、米国）（２８）の存在下で、又は組換えヒトインターロイキン７（ＩＬ７、１０ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ、米国）（２９）及び組換えヒトインターロイキン１５（ＩＬ１５、５ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ）（１８、３０）の組合せにより活性化した。３日目に、組換えヒトレトロネクチン（ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ）（Ｔａｋａｒａ－Ｂｉｏ．Ｉｎｃ、日本）をプレコーティングした２４ウェルプレートにおいて、特異性レトロウイルス上清及び上記の特異性サイトカインを使用して、活性化Ｔ細胞に形質導入した。形質導入から５日目に、Ｔ細胞は、４５％のＲＰＭＩ １６４０を含む「ＣＴＬ完全培地」及び１０％のＦＢＳ及び２ｍＭのグルタマックスを添加した４５％のクリック（Ｃｌｉｃｋ’ｓ）培地（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｃｏ．、米国）で増殖させ、上記の特異性サイトカインを週に２回与えた。

【0072】

表現型の解析
細胞表面分子の発現を、フローサイトメトリーにより標準的方法を使用して判定した。次のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）：ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６２Ｅ、ＣＤ６２Ｐ、ＣＤ９５、ＣＤ１０６、ＣＤ１２７、ＣＤ１３７、ＣＤ１９７、ＣＤ２２３（Ｌａｇ３）、ＣＤ２７４（ＰＤＬ１）、ＣＤ２７９（ＰＤ１）及びＴＩＭ３を使用した。Ｔ細胞におけるＣＡＲ－ＣＤ３０の発現は、ｓｃＦｖに効率的に結合することが可能な、特異性抗ＣＤ３４＋（ＱＢＥＮｄ１０Ｖクローン）又はピアース組換えビオチン化タンパク質Ｌ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ）を使用して検出した。＋１５日目及び＋３０日目に、ＣＤ３特異性ｍＡｂ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及びアイソタイプ対照ｍＡｂ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に付随して使用される２４種の異なるＴＣＲ Ｖβ特異性ｍＡｂのパネル（ＩＯ ＴＥＳＴ Ｂｅｔａ Ｍａｒｋ ＴＣＲ－Ｖβレパトワキット、ＢＣ）を使用して、ＮＴ Ｔ細胞及びＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）－Ｖβレパトワを評価した（３１）。試料をＢＤ ＬＳＲフォルテッサ（Ｆｏｒｔｅｓｓａ）Ｘ－２０により解析した。フローサイトメトリープロファイルは、ＦＡＣＳディーバ（Ｄｉｖａ）ソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して解析した。各試料について、最低限２０，０００イベントを解析した。

【0073】

ＴＣＲ Ｖベータ（β）レパトワ
＋１５日目のＮＴ及びＣＡＲ修飾Ｔ細胞の間の相対ＴＣＲ Ｖβレパトワの分布を評価するために、ＩＯＴｅｓｔ（登録商標）Ｂｅｔａ Ｍａｒｋ Ｋｉｔ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用した。この方法では、フローサイトメトリーによるヒトＴリンパ球のＴＣＲ Ｖβレパトワの定量的判定のためにデザインされたマルチパラメータ解析ツールを使用する。

【0074】

ＣＦＳＥ希釈法アッセイ
ＣＡＲ－ＣＤ３０Ｔ細胞が、特異性抗原又はサイトカインの使用の存在下のみで増殖するかどうかを評価するために、フローサイトメトリー用セルトレース（ＣｅｌｌＴｒａｃｅ）（商標）ＣＦＳＥ細胞増殖キット（Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、Ｔ細胞を蛍光細胞染色色素カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で標識した。

【0075】

クロム放出アッセイ
形質導入したエフェクター細胞の細胞毒性活性を、これまでに記載されているように（９）、６時間のクロム放出アッセイを使用して評価した。標的細胞（カルパス２９９、ＨＤＭＬ－２、Ｌ４２８及びＢＶ－１７３）を放射性クロム（^５１Ｃｒ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、カタログ番号ＮＥＺ０３０Ｓ）で標識し、引き続いて洗浄した後、異なる比率で４時間ＣＡＲ Ｔ細胞と共培養した。共培養物上清をマイクロベータ^２２４５０マイクロプレートカウンター（Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ^２ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｃｏｕｎｔｅｒ）（Ｐｅｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で解析した。三つ組のウェルの特異的溶解の割合の平均を次のように算出した：［（実験放出－自然放出）／（最大放出－自然放出）］×１００。

【0076】

共培養アッセイ
共培養実験では、非形質導入対照（ＮＴ）及びＣＡＲ－ＣＤ３０Ｔリンパ球を１×１０^６細胞／ウェルで、指示するエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比により、２４ウェルプレートに播種した。３７℃で７日のインキュベーション後、腫瘍細胞及びＴ細胞を採取し、残留腫瘍細胞及びＴ細胞を、ＣＤ３発現（エフェクターＴ細胞）及びＧＦＰ又はＣＤ３０＋（腫瘍細胞株）に基づいて、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）解析により評価した。
酵素結合免疫吸着アッセイ及びサイトメトリー用ビーズアレイ
ＩＦＮガンマの生成を、特異的ＥＬＩＳＡにより市販のキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｐｅｐｒｏ－Ｔｅｃｈ、ロッキーヒル、ＮＪ）を使用して定量した。ＥＬＩＳＡにより試験した上清を共培養アッセイから採取した。

【0077】

ｉｎ ｖｉｖｏでの実験
ｉｎ ｖｉｖｏでの実験のすべては、国際的、ＥＵ及び国の倫理的要件に従い、伊国保健大臣により認可された（Ｎ^ｏ８８／２０１６－ＰＲ）。

【0078】

ｉｎ ｖｉｖｏでのＮＨＬマウスモデル（カルパス２９９）
６週齢のＮＳＧ（ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ ＩＩ２ｒｇｔｍ１Ｗｉｌ／ＳｚＪ株、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒより）マウスに、ＣＤ３０＋カルパス２９９－Ｆ－Ｌｕｃ．ＧＦＰ ０．２×１０^６を静脈内（ｉ．ｖ．）注射により移植した。３日後、腫瘍の光の放射が一貫して測定可能となると、マウスは、１０×１０６の対照（非形質導入、ＮＴ）リンパ球、又はＩＬ２若しくはＩＬ７／ＩＬ１５のカクテルにより１２～１５日間増殖させた、ＣＡＲ．ＣＤ３０．ΔＣＤ３４．２８．４．１ＢＢ．ζ（２８．４．１ＢＢ．ζ）若しくはＣＡＲ．ＣＤ３０．ΔＣＤ３４．ＣＤ２８．ＯＸ４０．ζ（２８．ＯＸ４０．ζ）のいずれかを用いて遺伝子修飾したＴ細胞をｉ．ｖ．注射により受けた。腫瘍の増殖は、ＩＶＩＳイメージングシステム（Ｘｅｎｏｇｅｎ）を使用して評価した。腫瘍のシグナルの強度は、総光子／ｓｅｃ／ｃｍ２／ｓｒ（ｐ／ｓ／ｃｍ２／ｓｒ）として測定した。５×１０^５ｐ／ｓｅｃ／ｃｍ２／ｓｒ未満の生物発光のシグナル（腫瘍を有しないマウスを測定）は、陰性と考えた。ｉｎ ｖｉｖｏでの実験は、１４０日間経過観察した。マウス末梢血において循環するＴ細胞を定期的に評価した。

【0079】

再曝露モデル：ＮＨＬマウスモデルにおける長期免疫記憶の確立
ＮＨＬ ＣＤ３０＋カルパス２９９－Ｆ－Ｌｕｃ．ＧＦＰ腫瘍細胞株を移植し、ある単一用量のＣＡＲ．ＣＤ３０Ｔ細胞で処置したマウスを１４０日間監視し、腫瘍の完全な根絶が（５×１０^５ｐ／ｓｅｃ／ｃｍ２／ｓｒ未満の生物発光シグナルにより）少なくとも７０日間観察された場合、治癒したと考えた。長期免疫記憶の確立を評価するために、＋１４０日目に、治癒したマウスをＣＤ３０＋カルパス２９９－Ｆ－Ｌｕｃ．ＧＦＰ腫瘍細胞株０．２×１０^６にｉ．ｖ．によって再曝露した。マウスを少なくともさらに１１０日間、経過観察した。対照マウス（ＣＴＲマウス）の新たなコホートを腫瘍移植の陽性対照として実験に加えた。ＣＤ３０＋腫瘍の再曝露前後にマウス末梢血において循環するＴ細胞を評価した。２５０日目にマウスを安楽死させた。

【0080】

ｉｎ ｖｉｖｏ ＨＬマウスモデル（Ｌ４２８）
６週齢のＮＳＧマウスにＣＤ３０＋Ｌ４２８－ＦＦ－Ｌｕｃ．ＧＦＰ ２×１０^６を静脈内（ｉ．ｖ．）注射により移植した。６日後、腫瘍の光の放射が一貫して測定可能となると、マウスは、１０×１０^６の対照（非形質導入、ＮＴ）リンパ球、又はＩＬ２若しくはＩＬ７／ＩＬ１５のカクテルにより１２～１５日間増殖させた、ＣＡＲ．ＣＤ３０．ΔＣＤ３４．２８．４．１ＢＢ．ζ（２８．４．１ＢＢ．ζ）若しくはＣＡＲ．ＣＤ３０．ΔＣＤ３４．ＣＤ２８．ＯＸ４０．ζ（２８．ＯＸ４０．ζ）のいずれかを用いて遺伝子修飾したＴ細胞を静脈内（ｉｖ）注射により受けた。腫瘍の増殖は、ＩＶＩＳイメージングシステム（Ｘｅｎｏｇｅｎ）を使用して評価した。

【0081】

統計学的解析
グラフパッドプリズム（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ）（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して統計学的評価を実施し、Ｐ値＜０．０５を生成する群間の差異は、有意であると考えた。

【0082】

多重比較解析が必要であった場合、反復測定ＡＮＯＶＡの後、ログ・ランク（マンテル・コックス）検定により統計学的有意性を評価して多重比較を行った。マウス生存データは、カプラン・マイヤー生存曲線を使用して解析し、フィッシャーの直接検定を使用して統計学的有意差を測定した。有用な試料は、解析から除外しなかった。動物は、腫瘍移植後であるがＴ細胞注入前に、これらが死亡した場合にのみ除外した。ｉｎ ｖｉｖｏでの試験においては、ランダム化も盲検も行わなかった。しかし、マウスは、対照又は遺伝子修飾Ｔ細胞の注入前に対照及び処置群の腫瘍シグナルに基づいて比較した。腫瘍の増殖を経時的に比較するために、生物発光シグナル強度を盲検法により収集した。生物発光シグナル強度を対数変換し、次いで、２標本ｔ検定を使用して比較した。腫瘍量の定量を目的とする病理学者の解析を盲検法により実施した。

【0083】

結果
ＣＡＲ－ＣＤ３０Ｔ細胞の生成、特性評価
ＩｇＧ（ＡＣ１０）のマウス抗体に由来する一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）をＣＤ２８とともにインフレームに、及び４－１ＢＢ又はＯＸ４０のいずれかにより代表される第２の共刺激ドメイン、並びにシグナル伝達ドメインＣＤ３ゼータ鎖（ζ）を含む、２つの強力な第３世代のＣＡＲ－ＣＤ３０（ＣＡＲ－ＣＤ３０）Ｔ細胞を生成した。選択可能なマーカーとして、図１Ａのリン糖タンパク質ＣＤ３４に由来する低分子（ΔＣＤ３４）を加えた。ＩＬ２、又はＩＬ７／ＩＬ１５のカクテルを有するＣＴＬ完全培地において増殖させた活性化Ｔ細胞（ＡＴＣ）を、６名の健常ドナーから確立し、ＣＡＲ．ＣＤ３０．ΔＣＤ３４．２８．４．１ＢＢ．ζ（２８．４．１ＢＢ．ζ）又はＣＡＲ．ＣＤ３０．ΔＣＤ３４．ＣＤ２８．ＯＸ４０．ζ（２８．ＯＸ４０．ζ）ＳＦＧベクターをそれぞれコードするレトロウイルス上清を形質導入した。陰性対照として、非形質導入（ＮＴ）ＡＴＣを並行して培養した。形質導入したＴ細胞は、フローサイトメトリーにより、代表的な図１Ｂに示すＣＤ３４抗体（クローンＱＢＥｎｄ１０）、又は代替的な図１Ｃのタンパク質Ｌ試薬（３２）を効率的に使用して検出した。図１Ｄに示すように、２８．ＯＸ４０．ζ又は２８．４．１ＢＢ．ζ構築物のいずれかにより形質導入したＴ細胞は、高レベルのＣＡＲ－ＣＤ３０を発現した。しかし、＋５日目に、形質導入のレベルは、２８．ＯＸ４０．ζ（ＩＬ２）をコードするベクターを用いてＩＬ２において形質導入したＴ細胞において、２８．４．１ＢＢ．ζ（ＩＬ２）に対して有意に高くなった（それぞれ８７．３％±５．１％対７６．１％±９．８％、ｐ＜０．０５、（平均±標準偏差（ＳＤ）は、他に明示しない限り、本明細書及び論文を通して表す））。同様の結果が、ＩＬ７／ＩＬ１５において形質導入したＴ細胞についても得られた。＋５日目に、形質導入のレベルは、２８．ＯＸ４０．ζ（ＩＬ７／ＩＬ１５）Ｔ細胞において（８４．１％±２．２％）、２８．４．１ＢＢ．ζ（ＩＬ７／ＩＬ１５）Ｔ細胞（７８．６％±３．９％）よりも同様に高くなった。ｐ＜０．０５。注目すべきは、ＩＬ２により増殖させた両ＣＤ３＋ＣＡＲ．ＣＤ３０Ｔ細胞において、形質導入のレベルが、＋１５日目に有意に低下し（それぞれ２８．ＯＸ４０．ζ（ＩＬ２）では６５．１％±１０．９％及び２８．４．１ＢＢ．ζ（ＩＬ２）では４９．２％±１３．３％、ｐ＜０．０５、青色のアスタリスク）、翌２週間も、少なくとも＋３０日目まで、さらに安定なままであった（２８．ＯＸ４０．ζ（ＩＬ２）及び２８．４．１ＢＢ．ζ（ＩＬ２）はそれぞれ７３．０％±６．４％対５５．９％±１８．１％）。使用する構築物の独立的なＩＬ７／ＩＬ１５の切替えにより、ＣＤ４＋及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞における安定性及び形質導入のレベルが有意に向上する。

【0084】

ＣＡＲ Ｔ細胞では、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋比は、図１Ｅにおいて（ＣＡＲ＋ＣＤ４＋）、毎週低下し、ＣＡＲ＋ＣＤ８＋では、図１Ｆの結果となる。＋１５日目に、両ＣＡＲ．ＣＤ３０Ｔ細胞におけるＣＤ８＋の優勢が得られた。ＮＴ Ｔ細胞についても同一の傾向が観察された。修飾Ｔ細胞の増殖率は、ＩＬ２（図１Ｇ）又はＩＬ７／ＩＬ１５（図１Ｈ）により培養した場合、ＮＴ Ｔ細胞から有意には変化しなかった。しかし、ＩＬ７／ＩＬ１５のカクテルにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの長期培養において、ＮＴ（図１Ｉ）及び形質導入Ｔ細胞（図１Ｌ及び１Ｍ）の増殖倍率が有意に上昇する。

【0085】

遺伝子修飾ＣＡＲ－ＣＤ３０Ｔ細胞の記憶及び枯渇プロファイル
特異性共刺激ドメイン及びサイトカインのＣＡＲ．ＣＤ３０Ｔ細胞区画に対する影響を評価するために、ＣＤ３＋ＣＡＲ－Ｔ細胞を、記憶マーカーの発現について特性評価した。培養の＋１５日目に、ＣＤ３／ＣＤ２８により刺激しＩＬ２で培養した後に生成した増殖Ｔ細胞の大部分は、エフェクターメモリー（ＥｆＭ）表現型を有し、ＮＴ及び２種類のＣＡＲ．ＣＤ３０Ｔ細胞の間の実質的な差異はなかった。しかし、ＩＬ７／ＩＬ１５の切替えにより、ＣＡＲ．ＣＤ３０Ｔ細胞のＥｆＭ及びターミナルエフェクター（ＥｆＴ）では、セントラルメモリー（ＣＭ）区画が有意に減少した。ｉｎ ｖｉｔｒｏでの培養の３０日後、ナイーブＣＡＲ．ＣＤ３０Ｔ細胞の有意な（ＩＬ２により培養したＴ細胞についてのみ）減少のみが認められた。

【0086】

また、ＣＡＲ＋Ｔ細胞により同時に発現した阻害性受容体のパターン（ＰＤ－１、ＬＡＧ３及びＴＩＭ３）を評価して、これらの枯渇状態を定義した（図２）。ｉｎ ｖｉｔｒｏでの培養の＋１５日目にＩＬ２による（２８．ＯＸ４０．ζ）をＴ細胞に形質導入した場合、ＰＤ１及びＴＩＭ３の有意な上方制御が、ＮＴ又はＣＡＲＣＤ３０．２８．４－１ＢＢ．ζＴ細胞に対して観察されていたことが認められた（図２）。注目すべきは、ＩＬ２からＩＬ７／ＩＬ１５への切替えにより、ＣＡＲＣＤ３０．２８．ＯＸ４０．ζＴ細胞においてＰＤ１の発現は、有意に減少したが（それぞれＩＬ２では１５．３３％±４．７５％及びＩＬ７／ＩＬ１５では７．９５％±４．９３％、ｐ＝０．００６）、ＴＩＭ３の発現は、上方制御された（それぞれＩＬ２では２．４５％±０．４１％及びＩＬ７／ＩＬ１５では７．２８％±１．２６％、ｐ＝０．００９）。ｉｎ ｖｉｔｒｏでの培養の＋３０日目に、ＮＴ及びＣＡＲＣＤ３０修飾Ｔ細胞の枯渇プロファイルを、ＰＤ１及びＴＩＭ３の発現により典型的に判定した。

【0087】

ＣＡＲ－ＣＤ３０Ｔ細胞の安全性プロファイル
修飾Ｔ細胞の安全性プロファイルに対するレトロウイルス修飾又は培養条件の影響を、ＮＴ又はＣＡＲ－ＣＤ３０Ｔ細胞について評価するために、基底増殖又はサイトカイン若しくは／及び抗原特異的増殖を評価した。ゼロ日目に、Ｔ細胞を蛍光細胞染色ＣＦＳＥにより標識し、サイトカイン有／無で５日間播種するか、又は腫瘍細胞株ＣＤ３０陽性（カルパス２９９）若しくは腫瘍細胞株ＣＤ３０陰性（ＢＶ１７３）の存在下で共培養した。ＣＤ３＋細胞だけでなく、ＣＤ８＋細胞及びＣＤ４＋細胞の基底増殖を評価した。

【0088】

ＮＴ Ｔ細胞は、ＣＦＳＥ色素希釈により示すように、ＩＬ２（５０Ｕ／ｍｌ）（図３Ａ－ＩＩ）又はＩＬ７（１０ｎｇ／ｍｌ）／ＩＬ１５（５ｎｇ／ｍｌ）（図３Ａ－ＩＩＩ）の組合せにより培養した場合にのみ増殖する。ＣＤ８＋細胞（Ａ中央パネル）による増殖が、優先的である。ＣＡＲ－ＣＤ３０Ｔ細胞とは対照的に、カルパス２９９細胞株の存在下（図３Ｂ－ＩＶ及び図３Ｃ－ＩＶ）であるが、ＢＶ１７３腫瘍細胞株の非存在下（図３Ｂ－Ｖ及び図３Ｃ－Ｖ）で、これらを共培養した場合、又はサイトカインなしで播種した場合（Ｂ－Ｉ及びＣ－Ｉ）にも特異的ＣＦＳＥ色素希釈を観察した。その上、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの培養の＋１５日目及び＋３０日目に、培養Ｔ細胞のポリクローナル増殖を評価するために、ＩＬ２又はＩＬ７／ＩＬ１５により増殖させた、ＮＴ及び両ＣＡＲ－ＣＤ３０Ｔ細胞の間のＴＣＲ Ｖβレパトワ分布の一致が存在するかどうかを判定した。最大３０日細胞を培養した場合であっても（データ非提示）、特異性クローンサイトカイン又は依存性ＣＡＲの有意な優先的増殖は、観察されなかった。

【0089】

ＣＡＲ－ＣＤ３０Ｔ細胞は、ＣＤ３０＋リンパ腫だけでなく、髄芽腫及び肉腫細胞株のような固形腫瘍をもｉｎ ｖｉｔｒｏで効率的に溶解する
次いで、ＣＤ３０＋ヒト腫瘍細胞株を殺傷するＣＡＲ－ＣＤ３０Ｔ細胞の能力を評価した。

【0090】

周知のように、細胞膜タンパク質ＣＤ３０は、図４Ａの２つのホジキンリンパ腫細胞株（ＨＤＭＬ－２、Ｌ４２８）のうちの２つ及び１つのＮＨＬ細胞株（カルパス２９９）のうちの１つにおいて発現した。興味深いＣＤ３０＋はまた、図４Ｂの５つの肉腫細胞株（ＣＤ３０陽性：ＲＤ及びＣＤ３０陰性：ＳＫ－ＥＳ－１、Ａ６７３、ＣＷ９０１９及びＣＴ－１０）のうちの１つ、図４Ｃの試験した２つの髄芽腫細胞株（ＣＤ３０陽性：ＤＡＯＹ及びＣＤ３０陰性；Ｄ２８３）のうちの１つ、及び１つのＴリンパ芽球細胞株Ｔ２（ＣＥＭ．Ｔ２は興味深いが、１つのＢ細胞白血病細胞株ＢＶ１７３は興味深くはない）（図４Ｄ）であった。

【0091】

その上、次のＣＤ３０＋腫瘍細胞株も、高レベルのＰＤＬ１を発現した（カルパス２９９及びＨＤＭＬ－２）。ＣＡＲＣＤ３０Ｔ細胞により殺傷されるＣＤ３０＋腫瘍細胞株の内因的抵抗性に対するＰＤＬ１の相対的影響を評価するために、図４Ｅのように、ＨＬ Ｌ４２８（ＰＤＬ１陰性）に形質導入してＰＤＬ１を安定に発現させた。

【0092】

^５１Ｃｒ放出アッセイでは、両ＣＡＲＣＤ３０Ｔ細胞は、ＣＤ３０＋リンパ腫、例えば、カルパス２９９（図５Ａ）、ＨＤＭＬ－２（図５Ｂ）、Ｌ４２８（図５Ｃ）を特異的に、高い効率で溶解可能であったが、ＣＤ３０白血病細胞株ＢＶ１７３（図５Ｆ）は、そうではなかった。注目すべきは、両ＣＡＲ－ＣＤ３０Ｔ細胞は、線維形成性小脳髄芽腫ＤＡＯＹをも殺傷することを示した（図５Ｄ）。固形腫瘍のＣＤ３０陰性対照として、髄芽腫Ｄ２８３（図５Ｅ）及び白血病細胞株ＢＶ１７３（図５Ｆ）を試験した。ＩＬ２からＩＬ７／ＩＬ１５のカクテルへの切替えにより、ＣＡＲ－ＣＤ３０Ｔ細胞の効力は向上しなかった（図６Ａ～Ｆ）。

【0093】

代表的ドナーにより示すように、エフェクター標的比１対１（Ｒ１：１）を使用した７日の長期共培養において、ＧＦＰ＋リンパ腫細胞株に対する両ＣＡＲ－ＣＤ３０Ｔ細胞の特異的及び同等の効力（図７Ａ～Ｄ）を観察した。注目すべきは、Ｌ４２８腫瘍細胞株におけるＰＤＬ１の発現は（図７Ｄ）、Ｌ４２８野生型（図７Ｃ）と比べて、両ＣＡＲ－ＣＤ３０Ｔ細胞に対するＬ４２８腫瘍細胞株の感受性に明白には影響しなかった。その上、有意な腫瘍制御がまた、他のＣＤ３０＋腫瘍細胞株、例えば、ＣＤ３０＋ＧＦＰ＋白血病細胞株（図７Ｅ）においては観察されたが、ＣＤ３０陰性ＢＶ１７３（図７Ｆ）においては観察されず、ＣＤ３０＋ＧＦＰ腫瘍ＤＡＯＹ髄芽腫細胞株（図７Ｇ）及びＣＤ３０＋ＲＤ肉腫細胞株（図７Ｉ）においては観察されたが、ＣＤ３０陰性ＣＤ４５陰性Ｄ２８３髄芽腫細胞株（図７Ｈ）においては観察されなかった。固形腫瘍において注目すべきは、２８．ＯＸ４０．ζは、２８．４．１ＢＢ．ζ（図７Ｇ及び７Ｉ）よりも有意に良好に殺傷するが、ＣＤ３０陰性ＳＫ－ＥＳ－１（図７Ｊ）においては、そうではなかった。このような結果は、ＩＬ２（図７Ｋ）又はＩＬ７／ＩＬ１５（図７Ｌ）により増殖させた６名の異なるドナーについて確認された。

【0094】

この試験では、サイトカイン培養条件は、標準的クロム細胞毒性アッセイ（図５～６）又は長期共培養（図７）により試験した場合、ＣＤ３０＋細胞に対するＣＡＲ－ＣＤ３０Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏでの特異的サイトカイン活性には影響しなかった。２つのＣＡＲ－ＣＤ３０Ｔ細胞間の溶解効力の真価を評価するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの長期共培養効力アッセイにストレスを与え、標的腫瘍細胞をＲ１：１からＲ１：３２へ増加した。注目すべきことには、低いエフェクター／標的比でのＣＡＲ．ＣＤ３０Ｔ細胞の活性により、カルパス２９９（Ｒ１：８及びＲ１：１６）及びＨＤＭＬ－２細胞株（Ｒ１：８、Ｒ１：１６及びＲ１：３２）については（それぞれ図８Ａ～Ｂ）、２８．ＯＸ４０．ζ（ＩＬ２）Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏでの腫瘍制御の有意な向上が示されたが、Ｌ４２８については、２８．ＯＸ４０．ζ（ＩＬ２）及び２８．４．１ＢＢ．ζ（ＩＬ２）の間の細胞溶解活性の有意な差異は、観察されなかった。

【0095】

ＣＡＲ－ＣＤ３０Ｔ細胞（ＩＬ７／ＩＬ１５）では、カルパス２９９及びＨＤＭＬ－２細胞株について、特に、低いエフェクター／標的比において、２８．ＯＸ４０．ζの優れた溶解活性が確認されたが、２８．４－１ＢＢ．ζに対して有意性には達することができない（それぞれ図８Ｄ及び８Ｆ）。

【0096】

全体的に見て、このようなデータにより、カルパス２９９及びＨＤＭＬ－２と共培養した場合、共培養効力アッセイから２４時間に採取した上清について評価した、特異的ＩＦＮガンマ産生に関して、２８．ＯＸ４０．ζ（ＩＬ７／ＩＬ１５）の優れたＣＤ３０＋特異的活性が確認された（図９Ａ～Ｂ及び９Ｄ～Ｅ）。両ＣＡＲ－ＣＤ３０Ｔ細胞は、ＣＤ３０＋腫瘍細胞株Ｌ４２８と共培養した場合、特異的で等しいレベルのＩＦＮガンマを産生する（図９Ｃ及び９Ｆ）。

【0097】

ＮＨＬマウスモデルにおける長期免疫記憶の確立
ＣＡＲ－ＣＤ３０Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｖｏでの有効性及び持続性を、ＮＨＬカルパス２９９－ＦＦ－Ｌｕｃ．ＧＦＰ腫瘍細胞株（図１０Ａ）に対して、異種移植モデルにおいて、免疫不全ＮＳＧマウスを使用して比較した。

【0098】

ＮＴ（ＩＬ２）Ｔ細胞で処置した群では、腫瘍の生物発光が、漸進的に増加したが（図１０Ｂ～Ｃ）、ＣＡＲ－ＣＤ３０Ｔ細胞（ＩＬ２）１０×１０^６で処置したマウスでは、生物発光シグナルの減少又は制御により測定した場合、有意な腫瘍制御が観察された。ＮＴ細胞（ＩＬ２）で処置したマウスの生存期間中央値は、４５．５日に達するのみであり、それぞれ２８．４．１ＢＢ．ζ（ＩＬ２）で処置したマウスの３０％及び２８．ＯＸ４０．ζ（ＩＬ２）で処置したマウスの６０％が、長期腫瘍制御を受ける（図１０Ｄ）。詳細には、２８．４．１ＢＢ．ζ（ＩＬ２）で処置したマウスの生存期間中央値は、５８日であり（ｐ＝０．０５）、２８．ＯＸ４０．ζ（ＩＬ２）で処置したマウスについては定義されなかった（ｐ＝０．０００２）（図１０Ｄ）。

【0099】

処置の１４０日後、治癒したマウス（０日目に２８．４．１ＢＢ．ζ（ＩＬ２）で処置したマウス３匹及び２８．ＯＸ４０．ζ（ＩＬ２）で処置したマウス６匹）を同一の腫瘍（０．２×１０^６）にｉ．ｖ．により再曝露し、さらに１００日間マウスを経過観察した。この実験設定では、新たなマウス６匹を陽性対照マウス（ＣＴＲマウス）として加え、これは、ＣＤ３０＋カルパス２９９－Ｆ－Ｌｕｃ．ＧＦＰを静脈内注射（ｉ．ｖ．）により受けた（図１１Ａ）。＋１４０日目に再注入したカルパス２９９－ＦＦ－Ｌｕｃ．ＧＦＰの生物発光の評価により、ＣＴＲマウス（白色の円を有する線）及び２８．４－１ＢＢ．ζ（ＩＬ２）処置マウス（白色の四角を有する線）における腫瘍の急速な増殖に気づいた（図１１Ｂ～Ｃ）。２８．ＯＸ４０．ζ（ＩＬ２）処置マウス（黒色の四角を有する線）とは対照的に、最初の４０日間の腫瘍の最初の増殖の後、６６．６７％（６匹のうち４匹）のマウスが、再曝露した腫瘍を２回目に根絶し、有意な生存利益を有した（図１０Ｄ）。長期免疫記憶の確立を確認するために、第１の腫瘍注入（＋６、＋５６、＋１０３及び＋１３２日目）及び第２の腫瘍注入（＋１８０、＋２２１及び＋２５４日目）の後に、処置したマウスにおいて血液を採取し、解析した。特定には、２８．ＯＸ４０．ζ（ＩＬ２）で処置したマウスでは、循環するＴ細胞の有意な増殖（図１１Ｅ）が、２８．４－１ＢＢ．ζ（ＩＬ２）（０．２７５％±０．１０９％）又はＮＴ（ＩＬ２）（０．３４７％±０．０７１％）で処置したマウスに対する、リンパ腫の注入（２．４９％±１．０３％、ｐ＜０．００５）と関連して観察された。興味深いことには、第１の腫瘍の根絶後、＋１３２日目に、ＣＡＲ－ＣＤ３０Ｔ細胞で処置したマウスのコホートにおける、循環するＴ細胞を評価し、それぞれ２８．ＯＸ４０．ζ（ＩＬ２）及び２８．４．１ＢＢ．ζ（ＩＬ２）について、たった０．０２２％±０．０２７％及び０．０９０％±０．１３５５％のＴ細胞を定量した。腫瘍再曝露後４０日（＋１８０日目）に、循環する２８．ＯＸ４０．ζ（ＩＬ２）Ｔ細胞の緩徐であるが著しい増殖（７．２１６％±１１．２５９％）が、２８．４．１ＢＢ．ζ（ＩＬ２）（０．０９３％±０．１２９％）に対して認識された。第２の腫瘍の完全な根絶により、循環する２８．ＯＸ４０．ζ（ＩＬ２）Ｔ細胞が、＋２５４日目に測定した場合、検出不可能な割合にまで同時に減少した（０．００１％±０．００１８％）。

【0100】

ＮＨＬマウスモデルにおけるＣＡＲ－ＣＤ３０Ｔ細胞の有効性及び持続性の評価
引き続いて、ＩＬ２又はＩＬ７／ＩＬ１５により１５日間増殖させたＣＡＲ－ＣＤ３０Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｖｏでの有効性におけるサイトカインの使用の影響を、さらに侵襲性のＨＬ Ｌ４２８に対して評価した。マウスは、－６日目に、Ｌ４２８－ＦＦ－Ｌｕｃ．ＧＦＰ細胞株２×１０^６をｉ．ｖ．により受け、腫瘍の光の放射が一貫して測定可能となると、マウスをＮＴ又は遺伝子修飾Ｔ細胞でｉ．ｖ．により処置した。循環するヒトＴ細胞の持続性を評価するために、＋１５、＋３０、＋５６、＋８０、＋１００、＋１３０、＋１６０日目に、処置したマウスの血液を採取した（図１２Ａ）。ＮＴ Ｔ細胞で処置したＨＬ腫瘍担持マウスにおけるＬ４２８細胞株の生物発光が、５０日未満で最大５ｌｏｇまで急速に増加し（図１２Ｂ及び図１２Ｃ）、マウスは病的状態により、死亡したか又は犠死させた。犠死させたマウスの臓器の肉眼による解析により、肝臓に優先的に存在する大量の腫瘍量が示された。２８．４－１ＢＢ．ζ（ＩＬ２）で処置したＨＬ腫瘍担持マウスは、ＮＴ（ＩＬ２）、ＮＴ（ＩＬ７／ＩＬ１５）で処置したＨＬ腫瘍担持マウス（それぞれ５２±９及び５８±１日）と比べて、中央値に対してわずかに有意に長く生存した（７９±１０日）（図１２Ｂ～Ｅ）。ＩＬ７／ＩＬ１５による切替えによって、２８．４－１ＢＢ．ζ（ＩＬ７／ＩＬ１５）の活性における細胞毒性は向上しなかった（図１２Ｂ～Ｄ）。２８．ＯＸ４０．ζ（ＩＬ２）で処置したＨＬ腫瘍担持マウスの生存の中央値は、ＮＴ（ＩＬ２）又は２８．４－１ＢＢ．ζ（ＩＬ２）で処置したマウスに対して、最大１３３±４日まで有意に上昇する。ＨＬ腫瘍担持マウスを２８．ＯＸ４０．ζ（ＩＬ７／ＩＬ１５）で処置した場合、生存の中央値は定義されず、２つの２８．ＯＸ４０．ζＣＡＲ Ｔ細胞で処置したマウス間の全生存のいかなる有意差も有しなかった（ｐ＝０．０８７６及び図１２Ｅ）。注入したＴ細胞の持続性を評価するために、Ｌ４２８腫瘍を担持するＮＳＧマウスにおける血液を循環するＴ細胞を定期的に監視し、実験の全期間においてＮＴ又は遺伝子修飾Ｔ細胞で処置した（図１２Ｆ）。また、ＮＴ Ｔ細胞で処置したマウスが、循環するヒトＣＤ４５＋ＣＤ３＋細胞の有意な増加を、＋５６日目に評価されたピークにより示したが（ＮＴ（ＩＬ２）及びＮＴ（ＩＬ７／ＩＬ１５）について、それぞれ２６．６９％±７．０２％及び５．９７％±９．６３％）、腫瘍制御は、観察されなかった。

【0101】

８０日目に、２８．４－１ＢＢ．ζ（ＩＬ２）で処置した唯一の生存したマウスにおいて、非常に多数の循環するヒトＴ細胞（ＣＤ４５^＋ＣＤ３^＋＝２０．５６％）を測定したが、形質導入のレベルは低かった（ＣＤ３^＋ＣＤ３４^＋＝４．５７％）。２８．ＯＸ４０．ζ（ＩＬ２）で処置したマウス全４匹とは対照的に、＋８０日目の循環するＴ細胞（ＣＤ４５^＋ＣＤ３^＋）は、平均で９．７９％±５．２４％であり（３．０８％～１５．３７％の範囲）、形質導入の安定なレベルは３４．２３％±５．８７％に等しかった。興味深いことには、２８．ＯＸ４０．ζ（ＩＬ７／ＩＬ１５）で処置したマウスにおいて、循環するＴ細胞のレベルの有意な減少（０．９２％±０．５６％、ｐ＝０．００６５）が、高い割合の形質導入Ｔ細胞（４１．８９％±２．２５％、ｐ＝０．０３００）とともに測定された。２８．ＯＸ４０．ζＣＡＲ Ｔ細胞で処置したマウスに注入した腫瘍の完全な根絶は、循環するＴ細胞の減少を伴った。循環するＣＡＲ－ＣＤ３０Ｔ細胞の割合は、最初の１００日の間、安定なままとなる。＋１６５日目に、循環する残留Ｔ細胞が、処置したマウス４匹のうちの２匹においてのみ見出された（０．０６％±０．０２％）。マウス全４匹は、この時点で、結果として治癒した。このマウス２匹では、図１２Ｇに示すように、ＣＡＲ－ＣＤ３０Ｔ細胞が、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋、例えば、ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ６２Ｌ＋として定義されるセントラルメモリー（ＣＭ）及びＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ６２Ｌとして定義されるエフェクターメモリー（ＥＭ）の間で等しく分布することを示す。

【0102】

実施例２：本発明によるＣＡＲ．ＣＤ３０Ｔ細胞（２８．ＯＸ４０．ζＴ細胞及び２８．４－１ＢＢ．ζＴ細胞）における記憶及び枯渇プロファイルの腫瘍調節
材料及び方法

【0103】

ストレス共培養アッセイ
ストレス共培養実験では、非形質導入（ＮＴ）対照及びＣＡＲ．ＣＤ３０Ｔリンパ球（２８．ＯＸ４０．ζＴ細胞及び２８．４－１ＢＢ．ζＴ細胞）を１×１０^６細胞／ウェルで、指示するエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比１：１により、２４ウェルプレートに播種した。腫瘍を２回以上加えた場合、ＣＡＲ．Ｔ細胞が腫瘍を除去することが可能な時間を評価するために、ゼロ、５、１０及び１５日目に腫瘍細胞をウェルに加えた。次いで、最大２０日共培養した場合のＣＤ３発現（エフェクターＴ細胞）及びＧＦＰ又はＣＤ３０＋（腫瘍細胞株）に基づくＦＡＣＳ解析により、残留腫瘍細胞及びＴ細胞の持続性を評価した。

【0104】

酵素結合レクチンアッセイ
Ｅ：Ｔ共培養した上清を２４時間で採取して、インターフェロンγ（ＩＦＮγ）、インターロイキン２（ＩＬ－２）、インターロイキン１０（ＩＬ－１０）及び腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ－α）のレベルを、ＥＬＬＡプロトコール（Ｒ ａｎｄ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ）を使用して評価した。

【0105】

結果
さらに複雑な異議におけるＣＡＲ．ＣＤ３０Ｔ細胞の溶解効率を評価するために、５日毎（共培養の０、＋５、＋１０及び＋１５日目）に腫瘍（カルパス２９９）を再曝露することにより、共培養条件に「ストレスを与えた」（図１３Ａ）。各時点において、一本鎖発現及び相対平均蛍光強度（ＭＦＩ）、記憶及び枯渇プロファイル並びに相対特異性サイトカイン産生、例えば、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ－２及びＩＬ－１０（共培養の１、＋６、＋１１及び＋１６日目）を評価することにより、残留腫瘍の割合及びＣＡＲ．ＣＤ３０Ｔ細胞の挙動を評価した。両ＣＡＲ．ＣＤ３０Ｔ細胞は、カルパス２９９への複数回の曝露後でさえも高い腫瘍制御を示した。＋５日目及び＋１０日目のそれらの間の溶解活性における有意差は観察されなかったが、２８．ＯＸ４０．ζＴ細胞は、＋２０日目に主な腫瘍制御を示した（２８．ＯＸ４０．ζでは８．６％±５．３％及び２８．４－１ＢＢζＴ細胞では２７．９％±２９．５％）（図１３Ｂ）。興味深いことには、両ＣＡＲ．ＣＤ３０分子の割合は、第１の共培養後に、２８．４－１ＢＢ．ζＴ細胞では６６．９％±１５．２３％（＋５日目）から９３．８％±１１．３％（１０日目）まで（ｐ＝０．０２２）及び２８．ＯＸ４０．ζＴ細胞では７４．９％±１１．３％（＋５日目）から９３．２％±１１．３％（＋１０日目）まで（ｐ＝０．００７）有意に上昇した。実際、次の腫瘍再曝露により、２８．４－１ＢＢ．ζＴ細胞についてのみ、９３．８％±３．０６％（＋１０日目）から６７．９％±３２．３３％（＋２０日目）まで形質導入のレベルが負に影響され、一方、２８．ＯＸ４０．ζＴ細胞においては、割合は、９３．２２％±２．７５％（＋１０日目）から９２．５３％±３．４５％（＋２０日目）までと安定なままであった（図１３Ｃ）。

【0106】

その上、２８．ＯＸ４０．ζＴ細胞のＭＦＩは、各時点において、２８．４－１ＢＢ．ζＴ細胞よりも有意に高くなった（０日目に１１２９４．８３±５８０４５３対２４００４±１１３６５．６、ｐ＝０．００６；５日目に１６８８３±６７０３．４７対４０６７１．２±１２１６２．２、ｐ＝０．００４；１０日目に７３８２．７５±４０４２．０１対２５３２９．７５±１４７４６．７６、ｐ＝０．０３７；１５日目に１１７２９．８３±１１１５８．６６対２９５５２．８３±２３４６４３．３２、ｐ＝０．０３５；＋２０日目に８３４４．５対２３８３４．８３±１１２７２．５５、ｐ＝０．００１）（図１３Ｄ）。

【0107】

さらに、サイトカインプロファイルにより、２８．ＯＸ４０．ζＴ細胞のプロモーター活性化が確認され、ストレス共培養の＋２０日目にも、２８．４－１ＢＢ．ζＴ細胞（２６９９．５４ｐｇ／ｍｌ±２５１７．１０ｐｇ／ｍｌ、ｐ＝０．０１２）と比較して、有意なＩＦＮγ産生（４７６８．８６ｐｇ／ｍｌ±３７０８．３４ｐｇ／ｍｌ）（図１３Ｅ）及び２８．４－１ＢＢ．ζＴ細胞（２９８３．４０ｐｇ／ｍｌ±２４９７．４８ｎｇ／ｍｌ、ｐ＝０．０１３）と比較して、ＴＮＦα産生（８４３９．３２ｐｇ／ｍｌ±６１８７．２７ｐｇ／ｍｌ）（図１３Ｆ）が生じた。

【0108】

さらに、ＩＬ２の産生におけるＣＡＲ．ＣＤ３０Ｔ細胞間の差異は、＋１０日目まで有意に異なり、これは、ＩＩ）番目の腫瘍曝露（２８．ＯＸ４０．ζＴ細胞では８４８０．８２Ｐｇ／ｍｌ±５０６５．７６Ｐｇ／ｍｌ）に、２８．４－１ＢＢ．ζＴ細胞（２７７８．６４ｐｇ／ｍｌ±３８５２．８２ｐｇ／ｍｌ、ｐ＝０．００６）と比較して対応する（図１３Ｇ）。腫瘍制御を評価する代替的方法は、サイトカインＩＬ－１０（カルパス２９９細胞株により産生される）の検出である。図１３Ｈに示すように、＋１０日目から、ＮＴ Ｔ細胞培養培地において検出されたＩＬ－１０のレベル（白色の棒）は、播種した腫瘍のみにおいて検出された量（横線の棒）と同様であり、一方、高いレベルのＩＬ－１０が、ＣＡＲ．ＣＤ３０Ｔ細胞との第１の共培養（Ｉ）番目の曝露）の２４時間後にのみ検出された（図１３Ｈ）。

【0109】

結果は、ＣＤ２８．ＯＸ４０共刺激ドメインを有するＣＡＲ．ＣＤ３０Ｔ細胞が、４．１ＢＢ共刺激ドメインに対して、ＣＤ３０＋リンパ腫を最大４回、経時的に追加する間に（「ストレス」共培養）、腫瘍をより効率的に制御することが可能であり、カルパス２９９腫瘍細胞株と共培養した場合に有意に高い量のＩＦＮガンマ、ＴＮＦアルファ及びＩＬ－２を産生したことを示す。

【0110】

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【図1-1】

【図1-2】

【図1-3】

【図2】

【図3-1】

【図3-2】

【図3-3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7-1】

【図7-2】

【図7-3】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12-1】

【図12-2】

【図12-3】

【図13-1】

【図13-2】

【図13-3】

【配列表】

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