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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-01-24
(45)【発行日】2024-02-01
(54)【発明の名称】血中循環腫瘍細胞を含む試料を調製する方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6806 20180101AFI20240125BHJP
C12Q 1/6869 20180101ALI20240125BHJP
C12N 15/10 20060101ALI20240125BHJP
C12N 5/09 20100101ALI20240125BHJP
C12N 5/0784 20100101ALI20240125BHJP
C12N 5/0786 20100101ALI20240125BHJP
A61K 35/15 20150101ALI20240125BHJP
A61K 39/00 20060101ALI20240125BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20240125BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240125BHJP
G01N 33/50 20060101ALI20240125BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6806 Z ZNA
C12Q1/6869 Z
C12N15/10 100Z
C12N5/09
C12N5/0784
C12N5/0786
A61K35/15
A61K39/00 Z
A61K45/00
A61P35/00
G01N33/50 P
G01N33/50 Z
【請求項の数】
30
(21)【出願番号】P 2023515199
(86)(22)【出願日】2022-06-29
(86)【国際出願番号】 JP2022026036
(87)【国際公開番号】W WO2023277086
(87)【国際公開日】2023-01-05
【審査請求日】2023-03-06
(31)【優先権主張番号】P 2021108784
(32)【優先日】2021-06-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【早期審査対象出願】
【前置審査】
(73)【特許権者】
【識別番号】521288356
【氏名又は名称】ノバセラム株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100136629
【弁理士】
【氏名又は名称】鎌田 光宜
(74)【代理人】
【識別番号】100080791
【弁理士】
【氏名又は名称】高島 一
(74)【代理人】
【識別番号】100118371
【弁理士】
【氏名又は名称】▲駒▼谷 剛志
(72)【発明者】
【氏名】山下 直秀
【審査官】白井 美香保
(56)【参考文献】
【文献】米国特許出願公開第２０１４／０１５４７９９（ＵＳ，Ａ１）
【文献】特表２０１８－５１２３８０（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１８－５２７９３５（ＪＰ，Ａ）
【文献】LI, H. et al.，Detection of circulating tumor cells from cryopreserved human sarcoma peripheral blood mononuclear cells，Cancer Letters，2017年，Vol.403，p.216-223
【文献】ネオアンチゲン樹状細胞ワクチン療法説明文書 第１版，東京ミッドタウン先端医療研究所 インフォームドコンセント（説明と同意）基本方針 [オンライン]，2021年01月20日，インターネット：＜URL:https://saiseiiryo.mhlw.go.jp/published_plan/index/1/3＞，[検索日2022.09.13]
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００
Ｃ１２Ｎ １／００－７／０８
Ｃ１２Ｑ １／００－３／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡＰＬＵＳ／ＢＩＯＳＩＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
核酸増幅及び／または培養による増殖をせずに解析するための被験者由来の血中循環腫瘍細胞を含む試料を調製する方法であって、アフェレーシスを用いて該被験者から採取された末梢血単核球細胞から単球を単離する工程であって、前記アフェレーシスを行うアフェレーシス条件が、血中循環腫瘍細胞濃縮条件を含む、工程と、
単球を単離した該末梢血単核球細胞から、容器に接着した細胞を除去することにより単球を除去して血中循環腫瘍細胞を単離する工程と、
必要に応じて、該解析に必要な血中循環腫瘍細胞の純度を確認する工程と、
必要に応じて、該血中循環腫瘍細胞に対して、該解析のための前処理を行う工程とを含み、該試料が、該解析を行うことによって該被験者が有するネオアンチゲンを同定するためのものであり、該血中循環腫瘍細胞の単離がフローサイトメトリー分析して該血中循環腫瘍細胞を含む画分をソーティングすることを含む、方法。
【請求項2】
前記アフェレーシス条件が、スピルオーバーボリューム及び／またはバフィーコートボリュームを血中循環腫瘍細胞濃縮条件にすることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記アフェレーシス条件が、約９～約１２ｍｌのスピルオーバーボリューム、及び／または約７～約１０ｍｌのバフィーコートボリュームを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
前記血中循環腫瘍細胞が約１×１０
４
個以上であり、該末梢血単核球細胞からの前記単球の除去は、該末梢血単核球細胞をシャーレに播種しシャーレに付着した細胞を除去することによる、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
前記末梢血単核球細胞が約１×１０
７
個以上であり、該末梢血単核球細胞からの前記単球の除去は、該末梢血単核球細胞をシャーレに播種しシャーレに付着した細胞を除去することによる、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
さらに、前記血中循環腫瘍細胞を凍結する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
前記解析が、全エクソーム解析、全ゲノム解析、ＲＮＡ－Ｓｅｑ、シングルセルＲＮＡ－Ｓｅｑ、プロテオーム解析、およびトランスクリプトーム解析をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
さらに、前記血中循環腫瘍細胞からＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質を抽出する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項9】
前記ＤＮＡまたはＲＮＡが、少なくとも約１００ｐｇ抽出される、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
核酸増幅及び／または培養による増殖をせずに被験者由来の血中循環腫瘍細胞を解析することにより、該被験者が有するネオアンチゲンを同定する方法であって、アフェレーシスを用いて該被験者から採取された末梢血単核球細胞から単球を単離する工程であって、前記アフェレーシスを行うアフェレーシス条件が、血中循環腫瘍細胞濃縮
条件を含む、工程と、
単球を単離した該末梢血単核球細胞から、容器に接着した細胞を除去することにより単球を除去して血中循環腫瘍細胞を単離する工程であって、該単離がフローサイトメトリー分析して該血中循環腫瘍細胞を含む画分をソーティングすることを含む、工程と、
該血中循環腫瘍細胞を用いて解析を行う工程と
を含む、方法。
【請求項11】
前記アフェレーシス条件が、スピルオーバーボリューム及び／またはバフィーコートボリュームを血中循環腫瘍細胞濃縮条件にすることを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
前記アフェレーシス条件が、約９～約１２ｍｌのスピルオーバーボリューム、及び／または約７～約１０ｍｌのバフィーコートボリュームを含む、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項13】
前記血中循環腫瘍細胞が約１×１０
４
個以上であり、該末梢血単核球細胞からの前記単球の除去は、該末梢血単核球細胞をシャーレに播種しシャーレに付着した細胞を除去することによる、請求項１０に記載の方法。
【請求項14】
前記末梢血単核球細胞が約１×１０
７
個以上であり、該末梢血単核球細胞からの前記単球の除去は、該末梢血単核球細胞をシャーレに播種しシャーレに付着した細胞を除去することによる、請求項１０に記載の方法。
【請求項15】
さらに、前記血中循環腫瘍細胞を凍結する工程を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項16】
該解析が、全エクソーム解析、全ゲノム解析、ＲＮＡ－Ｓｅｑ、シングルセルＲＮＡ－Ｓｅｑ、プロテオーム解析、およびトランスクリプトーム解析をさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項17】
さらに、前記血中循環腫瘍細胞からＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質を抽出する工程を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項18】
さらに、前記ＤＮＡまたはＲＮＡからＤＮＡ／ＲＮＡシーケンスライブラリを作成する工程と、前記シーケンスライブラリの変異情報に基づき、ネオアンチゲンを同定する工程とを含み、前記血中循環腫瘍細胞の純度が少なくとも約２０％である、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
前記解析が、前記ＤＮＡの全エクソーム解析を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
前記解析が、さらに、前記血中循環腫瘍細胞のプロテオーム解析を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項21】
前記ＤＮＡまたはＲＮＡが、少なくとも約１００ｐｇ抽出される、請求項１７に記載の方法。
【請求項22】
被験者が有するネオアンチゲンおよび単球を用いた樹状細胞療法のための細胞を製造する方法であって、アフェレーシスを用いて該被験者から採取された末梢血単核球細胞から単球を単離する工程であって、前記アフェレーシスを行うアフェレーシス条件が、血中循環腫瘍細胞濃縮条件を含む、工程と、
単球を単離した該末梢血単核球細胞から、容器に接着した細胞を除去することにより単球を除去して血中循環腫瘍細胞を単離する工程であって、該単離がフローサイトメトリー分析して該血中循環腫瘍細胞を含む画分をソーティングすることを含む、工程と、
該血中循環腫瘍細胞からＤＮＡまたはＲＮＡを抽出し、ＤＮＡ／ＲＮＡシーケンスライブラリを作成する工程と、
該シーケンスライブラリの変異情報に基づき、ネオアンチゲンを同定する工程と、
該ネオアンチゲンを樹状細胞に導入する工程と
を含む、方法。
【請求項23】
前記アフェレーシス条件が、スピルオーバーボリューム及び／またはバフィーコートボリュームを血中循環腫瘍細胞濃縮条件にすることを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項24】
前記アフェレーシス条件が、約９～約１２ｍｌのスピルオーバーボリューム、及び／または約７～約１０ｍｌのバフィーコートボリュームを含む、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項25】
前記血中循環腫瘍細胞が約１×１０
４
個以上であり、該末梢血単核球細胞からの前記単球の除去は、該末梢血単核球細胞をシャーレに播種しシャーレに付着した細胞を除去することによる、請求項２２に記載の方法。
【請求項26】
前記末梢血単核球細胞が約１×１０
７
個以上であり、該末梢血単核球細胞からの前記単球の除去は、該末梢血単核球細胞をシャーレに播種しシャーレに付着した細胞を除去することによる、請求項２２に記載の方法。
【請求項27】
さらに、前記血中循環腫瘍細胞を凍結する工程を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項28】
前記ＤＮＡまたはＲＮＡが、少なくとも約１００ｐｇ抽出される、請求項２２に記載の方法。
【請求項29】
前記樹状細胞は、前記アフェレーシスによって前記被験者から得られたものであるか、または前記単球から誘導されるものである、請求項２２に記載の方法。
【請求項30】
さらに、前記単球を用いて前記樹状細胞を誘導する工程を含む、請求項２２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、増殖をせずに解析するための被験者由来の血中循環腫瘍細胞を含む試料を調製する方法、および増殖をせずに被験者由来の血中循環腫瘍細胞を解析する方法に関する。特に本開示は、被験者が有するネオアンチゲンを同定するための試料を調製する方法、およびその試料から被験者が有するネオアンチゲンを同定する方法、さらに被験者が有するネオアンチゲンを用いた樹状細胞療法のための細胞を製造する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
現在、免疫チェックポイント阻害剤の次世代の免疫療法としてネオアンチゲンを用いたがん免疫療法が注目されている。ネオアンチゲンはネオ抗原または新生抗原とも呼ばれ、がん細胞で起こる遺伝子変異により、新たに出現した変異抗原である。ネオアンチゲンは個々の患者によって異なるため、個別化医療への応用が期待されている。またがん組織内で新たに発生するネオアンチゲンは強力な免疫反応を引き起こすことが知られており、免疫チェックポイント阻害剤などのがん免疫療法と好相性であることも示唆されている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0003】
本発明者らは、ネオアンチゲン同定のための試料として従来必要とされている量の腫瘍組織を用いずに、患者の血液試料からネオアンチゲンを同定する手法を見出した。また本発明者らは、患者の血液試料からネオアンチゲン同定以外の解析に使用し得る試料を調製する手法を見出した。
【0004】
したがって、本開示は以下を提供する。
（項目Ｘ１）
核酸増幅及び／または培養による増殖をせずに解析するための被験者由来の血中循環腫瘍細胞を含む試料を調製する方法であって、
アフェレーシスを用いて該被験者から採取された末梢血単核球細胞から単球を単離する工程であって、前記アフェレーシスを行うアフェレーシス条件が、血中循環腫瘍細胞濃縮条件を含む、工程と、
単球を単離した該末梢血単核球細胞から、血中循環腫瘍細胞を単離する工程と、
必要に応じて、該解析に必要な血中循環腫瘍細胞の純度を確認する工程と、
必要に応じて、該血中循環腫瘍細胞に対して、該解析のための前処理を行う工程と
を含む、方法。
（項目Ｘ２）
前記アフェレーシス条件が、スピルオーバーボリューム及び／またはバフィーコートボリュームを血中循環腫瘍細胞濃縮条件にすることを含む、上記項目に記載の方法。
（項目Ｘ３）
前記アフェレーシス条件が、約９～約１２ｍｌのスピルオーバーボリューム、及び／または約７～約１０ｍｌのバフィーコートボリュームを含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｘ４）
前記血中循環腫瘍細胞を単離する工程は、モノクローナル抗体を用いて、またはサイズ分画によって行われる、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｘ５）
前記血中循環腫瘍細胞が約１×１０３個以上である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｘ６）
前記末梢血単核球細胞が約１×１０４個以上である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｘ７）
前記モノクローナル抗体が、抗ＥｐＣＡＭ抗体、抗Ｖｉｍｅｎｔｉｎ抗体、抗Ｎ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗Ｅ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ抗体、抗Ｄｅｓｍｏｇｌｅｉｎ－３抗体、抗Ｓｙｎｄｅｃａｎ－１抗体、抗ＣＤ９９抗体、抗ＣＤ８１抗体、及びＰＡＸ３抗体を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｘ８）
さらに、前記血中循環腫瘍細胞を凍結する工程を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｘ９）
前記解析が、全エクソーム解析、全ゲノム解析、ＲＮＡ－Ｓｅｑ、シングルセルＲＮＡ－Ｓｅｑ、プロテオーム解析、およびトランスクリプトーム解析を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｘ１０）
前記試料が、前記解析を行うことによって前記被験者が有するネオアンチゲンを同定するためのものである、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｘ１１）
さらに、前記血中循環腫瘍細胞からＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質を抽出する工程を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｘ１２）
前記ＤＮＡまたはＲＮＡが、少なくとも約１００ｐｇ抽出される、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｘ１３）
核酸増幅及び／または培養による増殖をせずに被験者由来の血中循環腫瘍細胞を解析する方法であって、
アフェレーシスを用いて該被験者から採取された末梢血単核球細胞から単球を単離する工程であって、前記アフェレーシスを行うアフェレーシス条件が、血中循環腫瘍細胞濃縮条件を含む、工程と、
単球を単離した該末梢血単核球細胞から、血中循環腫瘍細胞を単離する工程と、
該血中循環腫瘍細胞を用いて解析を行う工程と
を含む、方法。
（項目Ｘ１４）
前記アフェレーシス条件が、スピルオーバーボリューム及び／またはバフィーコートボリュームを血中循環腫瘍細胞濃縮条件にすることを含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｘ１５）
前記アフェレーシス条件が、約９～約１２ｍｌのスピルオーバーボリューム、及び／または約７～約１０ｍｌのバフィーコートボリュームを含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｘ１６）
前記血中循環腫瘍細胞を単離する工程は、モノクローナル抗体を用いて、またはサイズ分画によって行われる、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｘ１７）
前記血中循環腫瘍細胞が約１×１０３個以上である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｘ１８）
前記末梢血単核球細胞が約１×１０４個以上である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｘ１９）
前記モノクローナル抗体が、抗ＥｐＣＡＭ抗体、抗Ｖｉｍｅｎｔｉｎ抗体、抗Ｎ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗Ｅ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ抗体、抗Ｄｅｓｍｏｇｌｅｉｎ－３抗体、抗Ｓｙｎｄｅｃａｎ－１抗体、抗ＣＤ９９抗体、抗ＣＤ８１抗体、及びＰＡＸ３抗体を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｘ２０）
さらに、前記血中循環腫瘍細胞を凍結する工程を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｘ２１）
該解析が、全エクソーム解析、全ゲノム解析、ＲＮＡ－Ｓｅｑ、シングルセルＲＮＡ－Ｓｅｑ、プロテオーム解析、およびトランスクリプトーム解析を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｘ２２）
上記項目のいずれか一項に記載の方法によって前記被験者由来の前記血中循環腫瘍細胞を解析することにより、前記被験者が有するネオアンチゲンを同定する方法。
（項目Ｘ２３）
さらに、前記血中循環腫瘍細胞からＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質を抽出する工程を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｘ２４）
さらに、前記ＤＮＡまたはＲＮＡからＤＮＡ／ＲＮＡシーケンスライブラリを作成する工程と、
前記シーケンスライブラリの変異情報に基づき、ネオアンチゲンを同定する工程と
を含み、前記血中循環腫瘍細胞の純度が少なくとも約２０％である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｘ２５）
前記解析が、前記ＤＮＡの全エクソーム解析を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｘ２６）
前記解析が、さらに、前記血中循環腫瘍細胞のプロテオーム解析を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｘ２７）
前記ＤＮＡまたはＲＮＡが、少なくとも約１００ｐｇ抽出される、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｘ２８）
被験者が有するネオアンチゲンを用いた樹状細胞療法のための細胞を製造する方法であって、
アフェレーシスを用いて該被験者から採取された末梢血単核球細胞から単球を単離する工程であって、前記アフェレーシスを行うアフェレーシス条件が、血中循環腫瘍細胞濃縮条件を含む、工程と、
単球を単離した該末梢血単核球細胞から、血中循環腫瘍細胞を単離する工程と、
該血中循環腫瘍細胞からＤＮＡまたはＲＮＡを抽出し、ＤＮＡ／ＲＮＡシーケンスライブラリを作成する工程と、
該シーケンスライブラリの変異情報に基づき、ネオアンチゲンを同定する工程と、
該ネオアンチゲンを樹状細胞に導入する工程と
を含む、方法。
（項目Ｘ２９）
前記アフェレーシス条件が、スピルオーバーボリューム及び／またはバフィーコートボリュームを血中循環腫瘍細胞濃縮条件にすることを含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｘ３０）
前記アフェレーシス条件が、約９～約１２ｍｌのスピルオーバーボリューム、及び／または約７～約１０ｍｌのバフィーコートボリュームを含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｘ３１）
前記血中循環腫瘍細胞を単離する工程は、モノクローナル抗体を用いて、またはサイズ分画によって行われる、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｘ３２）
前記血中循環腫瘍細胞が約１×１０３個以上である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｘ３３）
前記末梢血単核球細胞が約１×１０４個以上である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｘ３４）
前記モノクローナル抗体が、抗ＥｐＣＡＭ抗体、抗Ｖｉｍｅｎｔｉｎ抗体、抗Ｎ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗Ｅ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ抗体、抗Ｄｅｓｍｏｇｌｅｉｎ－３抗体、抗Ｓｙｎｄｅｃａｎ－１抗体、抗ＣＤ９９抗体、抗ＣＤ８１抗体、及びＰＡＸ３抗体を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｘ３５）
さらに、前記血中循環腫瘍細胞を凍結する工程を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｘ３６）
前記ＤＮＡまたはＲＮＡが、少なくとも約１００ｐｇ抽出される、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｘ３７）
前記樹状細胞は、前記アフェレーシスによって前記被験者から得られたものであるか、または前記単球から誘導されるものである、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｘ３８）
核酸増幅及び／または培養による増殖をせずに血中循環腫瘍細胞を解析することにより被験者を治療または予防する方法であって、
アフェレーシスを用いて該被験者から採取された末梢血単核球細胞から単球を単離する工程であって、前記アフェレーシスを行うアフェレーシス条件が、血中循環腫瘍細胞濃縮条件を含む、工程と、
単球を単離した該末梢血単核球細胞から、血中循環腫瘍細胞を単離する工程と、
該血中循環腫瘍細胞を用いて解析を行う工程と、
該解析結果に基づいて、該被験者を治療または予防する工程と
を含む、方法。
（項目Ｘ３９）
該解析が、全エクソーム解析、全ゲノム解析、ＲＮＡ－Ｓｅｑ、シングルセルＲＮＡ－Ｓｅｑ、プロテオーム解析、およびトランスクリプトーム解析を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｘ１）
核酸増幅及び／または培養による増殖をせずに解析するための被験者由来の血中循環腫瘍細胞を含む試料を調製する方法であって、
アフェレーシスを用いて該被験者から採取された末梢血単核球細胞から単球を単離する工程であって、前記アフェレーシスを行うアフェレーシス条件が、血中循環腫瘍細胞濃縮条件を含む、工程と、
単球を単離した該末梢血単核球細胞から、血中循環腫瘍細胞を単離する工程と、
必要に応じて、該解析に必要な血中循環腫瘍細胞の純度を確認する工程と、
必要に応じて、該血中循環腫瘍細胞に対して、該解析のための前処理を行う工程と
を含む、方法。
（項目Ｘ２）
前記アフェレーシス条件が、スピルオーバーボリューム及び／またはバフィーコートボリュームを血中循環腫瘍細胞濃縮条件にすることを含む、上記項目に記載の方法。
（項目Ｘ３）
前記アフェレーシス条件が、約９～約１２ｍｌのスピルオーバーボリューム、及び／または約７～約１０ｍｌのバフィーコートボリュームを含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｘ４）
前記血中循環腫瘍細胞を単離する工程は、モノクローナル抗体を用いて、またはサイズ分画によって行われる、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｘ５）
前記血中循環腫瘍細胞が約１×１０３個以上である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｘ６）
前記末梢血単核球細胞が約１×１０４個以上である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｘ７）
前記モノクローナル抗体が、抗ＥｐＣＡＭ抗体、抗Ｖｉｍｅｎｔｉｎ抗体、抗Ｎ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗Ｅ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ抗体、抗Ｄｅｓｍｏｇｌｅｉｎ－３抗体、抗Ｓｙｎｄｅｃａｎ－１抗体、抗ＣＤ９９抗体、抗ＣＤ８１抗体、及びＰＡＸ３抗体を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｘ８）
さらに、前記血中循環腫瘍細胞を凍結する工程を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｘ９）
前記解析が、全エクソーム解析、全ゲノム解析、ＲＮＡ－Ｓｅｑ、シングルセルＲＮＡ－Ｓｅｑ、プロテオーム解析、およびトランスクリプトーム解析を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｘ１０）
前記試料が、前記解析を行うことによって前記被験者が有するネオアンチゲンを同定するためのものである、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｘ１１）
さらに、前記血中循環腫瘍細胞からＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質を抽出する工程を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｘ１２）
前記ＤＮＡまたはＲＮＡが、少なくとも約１００ｐｇ抽出される、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｘ１３）
核酸増幅及び／または培養による増殖をせずに被験者由来の血中循環腫瘍細胞を解析する方法であって、
アフェレーシスを用いて該被験者から採取された末梢血単核球細胞から単球を単離する工程であって、前記アフェレーシスを行うアフェレーシス条件が、血中循環腫瘍細胞濃縮条件を含む、工程と、
単球を単離した該末梢血単核球細胞から、血中循環腫瘍細胞を単離する工程と、
該血中循環腫瘍細胞を用いて解析を行う工程と
を含む、方法。
（項目Ｘ１４）
前記アフェレーシス条件が、スピルオーバーボリューム及び／またはバフィーコートボリュームを血中循環腫瘍細胞濃縮条件にすることを含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｘ１５）
前記アフェレーシス条件が、約９～約１２ｍｌのスピルオーバーボリューム、及び／または約７～約１０ｍｌのバフィーコートボリュームを含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｘ１６）
前記血中循環腫瘍細胞を単離する工程は、モノクローナル抗体を用いて、またはサイズ分画によって行われる、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｘ１７）
前記血中循環腫瘍細胞が約１×１０３個以上である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｘ１８）
前記末梢血単核球細胞が約１×１０４個以上である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｘ１９）
前記モノクローナル抗体が、抗ＥｐＣＡＭ抗体、抗Ｖｉｍｅｎｔｉｎ抗体、抗Ｎ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗Ｅ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ抗体、抗Ｄｅｓｍｏｇｌｅｉｎ－３抗体、抗Ｓｙｎｄｅｃａｎ－１抗体、抗ＣＤ９９抗体、抗ＣＤ８１抗体、及びＰＡＸ３抗体を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｘ２０）
さらに、前記血中循環腫瘍細胞を凍結する工程を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｘ２１）
該解析が、全エクソーム解析、全ゲノム解析、ＲＮＡ－Ｓｅｑ、シングルセルＲＮＡ－Ｓｅｑ、プロテオーム解析、およびトランスクリプトーム解析を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｘ２２）
上記項目のいずれか一項に記載の方法によって前記被験者由来の前記血中循環腫瘍細胞を解析することにより、前記被験者が有するネオアンチゲンを同定する方法。
（項目Ｘ２３）
さらに、前記血中循環腫瘍細胞からＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質を抽出する工程を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｘ２４）
さらに、前記ＤＮＡまたはＲＮＡからＤＮＡ／ＲＮＡシーケンスライブラリを作成する工程と、
前記シーケンスライブラリの変異情報に基づき、ネオアンチゲンを同定する工程と
を含み、前記血中循環腫瘍細胞の純度が少なくとも約２０％である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｘ２５）
前記解析が、前記ＤＮＡの全エクソーム解析を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｘ２６）
前記解析が、さらに、前記血中循環腫瘍細胞のプロテオーム解析を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｘ２７）
前記ＤＮＡまたはＲＮＡが、少なくとも約１００ｐｇ抽出される、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｘ２８）
被験者が有するネオアンチゲンを用いた樹状細胞療法のための細胞を製造する方法であって、
アフェレーシスを用いて該被験者から採取された末梢血単核球細胞から単球を単離する工程であって、前記アフェレーシスを行うアフェレーシス条件が、血中循環腫瘍細胞濃縮条件を含む、工程と、
単球を単離した該末梢血単核球細胞から、血中循環腫瘍細胞を単離する工程と、
該血中循環腫瘍細胞からＤＮＡまたはＲＮＡを抽出し、ＤＮＡ／ＲＮＡシーケンスライブラリを作成する工程と、
該シーケンスライブラリの変異情報に基づき、ネオアンチゲンを同定する工程と、
該ネオアンチゲンを樹状細胞に導入する工程と
を含む、方法。
（項目Ｘ２９）
前記アフェレーシス条件が、スピルオーバーボリューム及び／またはバフィーコートボリュームを血中循環腫瘍細胞濃縮条件にすることを含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｘ３０）
前記アフェレーシス条件が、約９～約１２ｍｌのスピルオーバーボリューム、及び／または約７～約１０ｍｌのバフィーコートボリュームを含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｘ３１）
前記血中循環腫瘍細胞を単離する工程は、モノクローナル抗体を用いて、またはサイズ分画によって行われる、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｘ３２）
前記血中循環腫瘍細胞が約１×１０３個以上である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｘ３３）
前記末梢血単核球細胞が約１×１０４個以上である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｘ３４）
前記モノクローナル抗体が、抗ＥｐＣＡＭ抗体、抗Ｖｉｍｅｎｔｉｎ抗体、抗Ｎ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗Ｅ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ抗体、抗Ｄｅｓｍｏｇｌｅｉｎ－３抗体、抗Ｓｙｎｄｅｃａｎ－１抗体、抗ＣＤ９９抗体、抗ＣＤ８１抗体、及びＰＡＸ３抗体を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｘ３５）
さらに、前記血中循環腫瘍細胞を凍結する工程を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｘ３６）
前記ＤＮＡまたはＲＮＡが、少なくとも約１００ｐｇ抽出される、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｘ３７）
前記樹状細胞は、前記アフェレーシスによって前記被験者から得られたものであるか、または前記単球から誘導されるものである、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｘ３８）
核酸増幅及び／または培養による増殖をせずに血中循環腫瘍細胞を解析することにより被験者を治療または予防する方法であって、
アフェレーシスを用いて該被験者から採取された末梢血単核球細胞から単球を単離する工程であって、前記アフェレーシスを行うアフェレーシス条件が、血中循環腫瘍細胞濃縮条件を含む、工程と、
単球を単離した該末梢血単核球細胞から、血中循環腫瘍細胞を単離する工程と、
該血中循環腫瘍細胞を用いて解析を行う工程と、
該解析結果に基づいて、該被験者を治療または予防する工程と
を含む、方法。
（項目Ｘ３９）
該解析が、全エクソーム解析、全ゲノム解析、ＲＮＡ－Ｓｅｑ、シングルセルＲＮＡ－Ｓｅｑ、プロテオーム解析、およびトランスクリプトーム解析を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
【0005】
また本開示は以下も提供する。
（項目１）
核酸増幅及び／または培養による増殖をせずに配列決定することにより、被験者が有するネオアンチゲンを同定するための試料を調製する方法であって、
アフェレーシスを用いて該被験者から採取された末梢血単核球細胞から単球を単離する工程であって、前記アフェレーシスを行うアフェレーシス条件が、血中循環腫瘍細胞濃縮条件を含む、工程と、
単球を単離した該末梢血単核球細胞から、血中循環腫瘍細胞を単離する工程と、
必要に応じて、ネオアンチゲンの同定に必要な血中循環腫瘍細胞の純度を確認する工程と、
該血中循環腫瘍細胞を、ネオアンチゲンを同定するための試料として提供し、及び／または該血中循環腫瘍細胞からＤＮＡ及び／またはＲＮＡを抽出する工程と
を含む、方法。
（項目２）
前記アフェレーシス条件が、スピルオーバーボリューム及び／またはバフィーコートボリュームを血中循環腫瘍細胞濃縮条件にすることを含む、上記項目に記載の方法。
（項目３）
前記アフェレーシス条件が、約９～約１２ｍｌのスピルオーバーボリューム、及び／または約７～約１０ｍｌのバフィーコートボリュームを含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目４）
前記血中循環腫瘍細胞を単離する工程は、モノクローナル抗体を用いて、またはサイズ分画によって行われる、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目５）
前記血中循環腫瘍細胞が約１×１０３個以上である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目６）
前記末梢血単核球細胞が約１×１０４個以上である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
前記モノクローナル抗体が、抗ＥｐＣＡＭ抗体、抗Ｖｉｍｅｎｔｉｎ抗体、抗Ｎ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗Ｅ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ抗体、抗Ｄｅｓｍｏｇｌｅｉｎ－３抗体、抗Ｓｙｎｄｅｃａｎ－１抗体、抗ＣＤ９９抗体、抗ＣＤ８１抗体、及びＰＡＸ３抗体を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目８）
さらに、前記血中循環腫瘍細胞を凍結する工程を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
前記ＤＮＡまたはＲＮＡが、少なくとも約１００ｐｇ抽出される、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ１）
核酸増幅及び／または培養による増殖をせずに配列決定することにより、被験者が有するネオアンチゲンを同定するための試料を調製する方法であって、
アフェレーシスを用いて該被験者から採取された末梢血単核球細胞から単球を単離する工程と、
単球を単離した該末梢血単核球細胞から、血中循環腫瘍細胞を単離する工程と、
必要に応じて、ネオアンチゲンの同定に必要な血中循環腫瘍細胞の純度を確認する工程と、
該血中循環腫瘍細胞を、ネオアンチゲンを同定するための試料として提供し、及び／または該血中循環腫瘍細胞からＤＮＡ及び／またはＲＮＡを抽出する工程と
を含む、方法。
（項目Ｂ１）
核酸増幅及び／または培養による増殖をせずに配列決定することにより、被験者が有するネオアンチゲンを同定する方法であって、
アフェレーシスを用いて該被験者から採取された末梢血単核球細胞から単球を単離する工程であって、前記アフェレーシスを行うアフェレーシス条件が、血中循環腫瘍細胞濃縮条件を含む、工程と、
単球を単離した該末梢血単核球細胞から、血中循環腫瘍細胞を単離する工程と、
該血中循環腫瘍細胞からＤＮＡ及び／またはＲＮＡを抽出し、ＤＮＡ／ＲＮＡシーケンスライブラリを作成する工程と、
該シーケンスライブラリの変異情報に基づき、ネオアンチゲンを同定する工程と
を含み、該血中循環腫瘍細胞の純度が少なくとも約２０％である、方法。
（項目Ｂ２）
前記アフェレーシス条件が、スピルオーバーボリューム及び／またはバフィーコートボリュームを血中循環腫瘍細胞濃縮条件にすることを含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｂ３）
前記アフェレーシス条件が、約９～約１２ｍｌのスピルオーバーボリューム、及び／または約７～約１０ｍｌのバフィーコートボリュームを含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｂ４）
前記血中循環腫瘍細胞を単離する工程は、モノクローナル抗体を用いて、またはサイズ分画によって行われる、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｂ５）
前記血中循環腫瘍細胞が約１×１０３個以上である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｂ６）
前記末梢血単核球細胞が約１×１０４個以上である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｂ７）
前記モノクローナル抗体が、抗ＥｐＣＡＭ抗体、抗Ｖｉｍｅｎｔｉｎ抗体、抗Ｎ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗Ｅ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ抗体、抗Ｄｅｓｍｏｇｌｅｉｎ－３抗体、抗Ｓｙｎｄｅｃａｎ－１抗体、抗ＣＤ９９抗体、抗ＣＤ８１抗体、及びＰＡＸ３抗体を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｂ８）
さらに、前記血中循環腫瘍細胞を凍結する工程を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｂ９）
前記ＤＮＡまたはＲＮＡが、少なくとも約１００ｐｇ抽出される、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｃ１）
被験者が有するネオアンチゲンを用いた樹状細胞療法のための細胞を製造する方法であって、
アフェレーシスを用いて該被験者から採取された末梢血単核球細胞から単球を単離する工程であって、前記アフェレーシスを行うアフェレーシス条件が、血中循環腫瘍細胞濃縮条件を含む、工程と、
単球を単離した該末梢血単核球細胞から、血中循環腫瘍細胞を単離する工程と、
該血中循環腫瘍細胞からＤＮＡ及び／またはＲＮＡを抽出し、ＤＮＡ／ＲＮＡシーケンスライブラリを作成する工程と、
該シーケンスライブラリの変異情報に基づき、ネオアンチゲンを同定する工程と、
該ネオアンチゲンを樹状細胞に導入する工程と
を含む、方法。
（項目Ｃ２）
前記アフェレーシス条件が、スピルオーバーボリューム及び／またはバフィーコートボリュームを血中循環腫瘍細胞濃縮条件にすることを含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｃ３）
前記アフェレーシス条件が、約９～約１２ｍｌのスピルオーバーボリューム、及び／または約７～約１０ｍｌのバフィーコートボリュームを含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｃ４）
前記血中循環腫瘍細胞を単離する工程は、モノクローナル抗体を用いて、またはサイズ分画によって行われる、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｃ５）
前記血中循環腫瘍細胞が約１×１０３個以上である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｃ６）
前記末梢血単核球細胞が約１×１０４個以上である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｃ７）
前記モノクローナル抗体が、抗ＥｐＣＡＭ抗体、抗Ｖｉｍｅｎｔｉｎ抗体、抗Ｎ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗Ｅ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ抗体、抗Ｄｅｓｍｏｇｌｅｉｎ－３抗体、抗Ｓｙｎｄｅｃａｎ－１抗体、抗ＣＤ９９抗体、抗ＣＤ８１抗体、及びＰＡＸ３抗体を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｃ８）
さらに、前記血中循環腫瘍細胞を凍結する工程を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｃ９）
前記ＤＮＡまたはＲＮＡが、少なくとも約１００ｐｇ抽出される、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｃ１０）
前記樹状細胞は、前記アフェレーシスによって前記被験者から得られたものであるか、または前記単球から誘導されるものである、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１）
核酸増幅及び／または培養による増殖をせずに配列決定することにより、被験者が有するネオアンチゲンを同定するための試料を調製する方法であって、
アフェレーシスを用いて該被験者から採取された末梢血単核球細胞から単球を単離する工程であって、前記アフェレーシスを行うアフェレーシス条件が、血中循環腫瘍細胞濃縮条件を含む、工程と、
単球を単離した該末梢血単核球細胞から、血中循環腫瘍細胞を単離する工程と、
必要に応じて、ネオアンチゲンの同定に必要な血中循環腫瘍細胞の純度を確認する工程と、
該血中循環腫瘍細胞を、ネオアンチゲンを同定するための試料として提供し、及び／または該血中循環腫瘍細胞からＤＮＡ及び／またはＲＮＡを抽出する工程と
を含む、方法。
（項目２）
前記アフェレーシス条件が、スピルオーバーボリューム及び／またはバフィーコートボリュームを血中循環腫瘍細胞濃縮条件にすることを含む、上記項目に記載の方法。
（項目３）
前記アフェレーシス条件が、約９～約１２ｍｌのスピルオーバーボリューム、及び／または約７～約１０ｍｌのバフィーコートボリュームを含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目４）
前記血中循環腫瘍細胞を単離する工程は、モノクローナル抗体を用いて、またはサイズ分画によって行われる、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目５）
前記血中循環腫瘍細胞が約１×１０３個以上である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目６）
前記末梢血単核球細胞が約１×１０４個以上である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
前記モノクローナル抗体が、抗ＥｐＣＡＭ抗体、抗Ｖｉｍｅｎｔｉｎ抗体、抗Ｎ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗Ｅ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ抗体、抗Ｄｅｓｍｏｇｌｅｉｎ－３抗体、抗Ｓｙｎｄｅｃａｎ－１抗体、抗ＣＤ９９抗体、抗ＣＤ８１抗体、及びＰＡＸ３抗体を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目８）
さらに、前記血中循環腫瘍細胞を凍結する工程を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
前記ＤＮＡまたはＲＮＡが、少なくとも約１００ｐｇ抽出される、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ１）
核酸増幅及び／または培養による増殖をせずに配列決定することにより、被験者が有するネオアンチゲンを同定するための試料を調製する方法であって、
アフェレーシスを用いて該被験者から採取された末梢血単核球細胞から単球を単離する工程と、
単球を単離した該末梢血単核球細胞から、血中循環腫瘍細胞を単離する工程と、
必要に応じて、ネオアンチゲンの同定に必要な血中循環腫瘍細胞の純度を確認する工程と、
該血中循環腫瘍細胞を、ネオアンチゲンを同定するための試料として提供し、及び／または該血中循環腫瘍細胞からＤＮＡ及び／またはＲＮＡを抽出する工程と
を含む、方法。
（項目Ｂ１）
核酸増幅及び／または培養による増殖をせずに配列決定することにより、被験者が有するネオアンチゲンを同定する方法であって、
アフェレーシスを用いて該被験者から採取された末梢血単核球細胞から単球を単離する工程であって、前記アフェレーシスを行うアフェレーシス条件が、血中循環腫瘍細胞濃縮条件を含む、工程と、
単球を単離した該末梢血単核球細胞から、血中循環腫瘍細胞を単離する工程と、
該血中循環腫瘍細胞からＤＮＡ及び／またはＲＮＡを抽出し、ＤＮＡ／ＲＮＡシーケンスライブラリを作成する工程と、
該シーケンスライブラリの変異情報に基づき、ネオアンチゲンを同定する工程と
を含み、該血中循環腫瘍細胞の純度が少なくとも約２０％である、方法。
（項目Ｂ２）
前記アフェレーシス条件が、スピルオーバーボリューム及び／またはバフィーコートボリュームを血中循環腫瘍細胞濃縮条件にすることを含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｂ３）
前記アフェレーシス条件が、約９～約１２ｍｌのスピルオーバーボリューム、及び／または約７～約１０ｍｌのバフィーコートボリュームを含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｂ４）
前記血中循環腫瘍細胞を単離する工程は、モノクローナル抗体を用いて、またはサイズ分画によって行われる、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｂ５）
前記血中循環腫瘍細胞が約１×１０３個以上である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｂ６）
前記末梢血単核球細胞が約１×１０４個以上である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｂ７）
前記モノクローナル抗体が、抗ＥｐＣＡＭ抗体、抗Ｖｉｍｅｎｔｉｎ抗体、抗Ｎ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗Ｅ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ抗体、抗Ｄｅｓｍｏｇｌｅｉｎ－３抗体、抗Ｓｙｎｄｅｃａｎ－１抗体、抗ＣＤ９９抗体、抗ＣＤ８１抗体、及びＰＡＸ３抗体を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｂ８）
さらに、前記血中循環腫瘍細胞を凍結する工程を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｂ９）
前記ＤＮＡまたはＲＮＡが、少なくとも約１００ｐｇ抽出される、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｃ１）
被験者が有するネオアンチゲンを用いた樹状細胞療法のための細胞を製造する方法であって、
アフェレーシスを用いて該被験者から採取された末梢血単核球細胞から単球を単離する工程であって、前記アフェレーシスを行うアフェレーシス条件が、血中循環腫瘍細胞濃縮条件を含む、工程と、
単球を単離した該末梢血単核球細胞から、血中循環腫瘍細胞を単離する工程と、
該血中循環腫瘍細胞からＤＮＡ及び／またはＲＮＡを抽出し、ＤＮＡ／ＲＮＡシーケンスライブラリを作成する工程と、
該シーケンスライブラリの変異情報に基づき、ネオアンチゲンを同定する工程と、
該ネオアンチゲンを樹状細胞に導入する工程と
を含む、方法。
（項目Ｃ２）
前記アフェレーシス条件が、スピルオーバーボリューム及び／またはバフィーコートボリュームを血中循環腫瘍細胞濃縮条件にすることを含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｃ３）
前記アフェレーシス条件が、約９～約１２ｍｌのスピルオーバーボリューム、及び／または約７～約１０ｍｌのバフィーコートボリュームを含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｃ４）
前記血中循環腫瘍細胞を単離する工程は、モノクローナル抗体を用いて、またはサイズ分画によって行われる、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｃ５）
前記血中循環腫瘍細胞が約１×１０３個以上である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｃ６）
前記末梢血単核球細胞が約１×１０４個以上である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｃ７）
前記モノクローナル抗体が、抗ＥｐＣＡＭ抗体、抗Ｖｉｍｅｎｔｉｎ抗体、抗Ｎ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗Ｅ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ抗体、抗Ｄｅｓｍｏｇｌｅｉｎ－３抗体、抗Ｓｙｎｄｅｃａｎ－１抗体、抗ＣＤ９９抗体、抗ＣＤ８１抗体、及びＰＡＸ３抗体を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｃ８）
さらに、前記血中循環腫瘍細胞を凍結する工程を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｃ９）
前記ＤＮＡまたはＲＮＡが、少なくとも約１００ｐｇ抽出される、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｃ１０）
前記樹状細胞は、前記アフェレーシスによって前記被験者から得られたものであるか、または前記単球から誘導されるものである、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
【0006】
本開示において、上記の１つまたは複数の特徴は、明示された組み合わせに加え、さらに組み合わせて提供され得ることが意図される。なお、本開示のさらなる実施形態および利点は、必要に応じて以下の詳細な説明を読んで理解すれば、当業者に認識される。
【0007】
なお、上記した以外の本開示の特徴及び顕著な作用・効果は、以下の発明の実施形態の項及び図面を参照することで、当業者にとって明確となる。
【発明の効果】
【0008】
本開示の方法によれば、非侵襲的に患者のネオアンチゲンを同定することができる。本開示の方法は、ネオアンチゲンを用いたがん免疫療法に役立てることができ、個別化医療や、さらには再生医療への展開も可能となる。
【図面の簡単な説明】
【0009】
【図4】図４は、本開示の一実施形態において単離した細胞のフローサイトメトリーによる分析結果を示す図である。NY肺がん（ステージ４）患者、CTC20-0065 大腸癌（ステージ４）患者、C-0107 卵巣癌（ステージ４）患者の結果を示す。
【図5】図５は、本開示の一実施形態において単離した細胞のフローサイトメトリーによる分析結果を示す図である。21-0062乳がん患者（術後）、CTC20-014すい臓がん（ステージ４）患者、C-0082 膵臓癌（ステージ４）患者の結果を示す。
【図6】図６は、本開示の一実施形態において単離した細胞のフローサイトメトリーによる分析結果を示す図である。21-0059 十二指腸乳頭部がん（ステージ４）患者、CTC 21-0052肺がん（ステージ４）患者の結果を示す。
【図7】図７は、本開示の一実施形態において単離した細胞のフローサイトメトリーによる分析結果を示す図である。CTC20-008肺癌（ステージ４）患者（治療奏功）、21-0060 大腸癌（術後）、21-0063 大腸癌（ステージ４）患者（高齢者）の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【0010】
以下、本開示を最良の形態を示しながら説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本開示の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
【0011】
以下に本明細書において特に使用される用語の定義および／または基本的技術内容を適宜説明する。
【0012】
本明細書において、「約」とは、後に続く数値の±１０％を意味する。
【0013】
本明細書において、「ネオアンチゲン」とは、ネオ抗原、新生抗原、腫瘍特異的変異抗原とも呼ばれ、腫瘍細胞内のタンパク質を変化させるＤＮＡ突然変異により発生する抗原をいう。ネオアンチゲンは、潜在的に、免疫系により、非自己として認知されうる。
【0014】
本明細書において、「アフェレーシス」とは、一般的には、体外循環によって対象の血液中から１種以上の血液成分（血漿成分、血小板、白血球などの細胞成分）を分離することをいう。体外循環により採血された血液をアフェレーシス血液という。本明細書においては、アフェレーシスによって、対象者の血液を体外循環させて血液成分分離装置に通し、末梢血単核球細胞を採取する。
【0015】
本明細書において、「バフィーコート」とは、全血を遠心分離で沈降させた後の赤血球と血漿の間の白色層をいう。全血は、遠心分離によって、軽比重成分（上清成分）である血漿（乏血小板血漿）と、重比重成分（沈降成分）である赤血球（濃厚赤血球）と、中比重成分であるバフィーコートとに分離される。バフィーコートには、白血球成分と多血小板血漿（血小板含有成分）が含まれる。また「バフィーコートボリューム」とは、採取するバフィーコートの量をいう。
【0016】
本明細書において、「スピルオーバー」とは、アフェレーシスにおいてバフィーコートが十分に濃縮された場合に、バフィーコートを採取するために、返血と採取の切り替えを行うことをいう。スピルオーバーによって余分な血小板およびリンパ球が除去され得る。また「スピルオーバーボリューム」とは、バフィーコートを採取段階に送り込む量をいう。
【0017】
本明細書において「血中循環腫瘍細胞濃縮条件」とは、アフェレーシス条件について言及するとき、アフェレーシスを行う特定の条件であって、その結果得られる区分に血中循環腫瘍細胞が濃縮される条件をいう。代表的には、血中循環腫瘍細胞濃縮条件は、スピルオーバーボリューム、バフィーコートボリューム、またはその組み合わせなどを挙げることができ、これらの値を特定の条件にすることで達成することができる。血中循環腫瘍細胞濃縮条件を達成するために、スピルオーバーボリュームは約５～約１５ｍｌであり得、好ましくは、約７～１４ｍｌ、さらに好ましくは約９～約１２ｍｌであることが有利であり得る。また血中循環腫瘍細胞濃縮条件を達成するためには、バフィーコートボリュームは、約５～約１５ｍｌであり得、好ましくは約６～約１２ｍｌ、さらに好ましくは、約７～約１０ｍｌであり得る。血中循環腫瘍細胞濃縮条件を達成するために、好ましくは、スピルオーバーボリュームおよびバフィーコートボリュームを上記好ましい条件の組み合わせにすることがさらに有利であり得る。
【0018】
本明細書において、「末梢血単核球細胞」とは、ＰＢＭＣとも呼ばれ、円形核を有する任意の末梢血細胞を指す。正常な末梢血単核球細胞は、リンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）および単球からなる。本開示において、末梢血単核球細胞成分にＣＴＣが実質的に含まれることが初めて見いだされた。
【0019】
本明細書において、「単球」とは、白血球の一種で、最も大きなタイプの白血球である。マクロファージや、樹状細胞に分化することができる細胞をいう。単球は、脊椎動物の自然免疫の一部としても、また適応免疫の過程にも影響をもつ。ヒトの血液には少なくとも３種類の単球が存在するといわれている。
【0020】
本明細書において、「血中循環腫瘍細胞」とは、ＣＴＣとも呼ばれ、原発腫瘍（原発巣）または転移腫瘍（転移巣）から血管内またはリンパ管内へと浸透した腫瘍細胞のうち、血液中を循環する循環腫瘍細胞をいう。ＣＴＣは、例えば、がん患者の末梢血流を循環する腫瘍細胞として存在する。ＣＴＣは、癌の検出及び進行において予測的及び予後的な機能をもつと考えられる血液ベースのマーカーである。多くの種類の癌が、ＣＴＣを生じさせることが知られている。ＣＴＣは、有核、ＣＤ４５陰性、及びサイトケラチン陽性の細胞であり、腫瘍マーカー、肉腫マーカー、骨肉腫マーカーの少なくとも１つが発現されている。全血からのＣＴＣの単離は、ＣＴＣが非常に少ないため、技術的に困難である。
【0021】
本明細書において、「樹状細胞」とは、ＤＣとも呼ばれ、ヒトにおいて細胞性免疫応答の開始および制御のため強力な抗原提示細胞をいう。樹状細胞は、Ｔ細胞の応答性特異的クローンとの相互作用時にその潜在的特性のどちらのセットを発現するかに依存して、免疫賦活性または免疫抑制性のいずれになる場合もあることから、Ｔ細胞媒介性免疫反応における非常に重要な中心的役割を果たすと考えられている。一般論として、未成熟樹状細胞は成熟樹状細胞よりも「免疫寛容原性」であり、一方、成熟樹状細胞はそれらの前駆体よりも「免疫原性」であると考えられている。樹状細胞は、単球およびＣＤ３４陽性細胞（骨髄細胞）からｅｘ ｖｉｖｏで生成される。
【0022】
本明細書において、「腫瘍」または「癌」は、特に限定されるものではないが、例えば、乳癌、消化器／胃腸癌、肛門癌、虫垂癌、肝外胆管癌、消化管カルチノイド腫瘍、結腸癌、食道癌、胆嚢癌、胃癌、胃腸間質腫瘍（ｇｉｓｔ）、島細胞腫、成人原発性肝癌、小児肝癌、膵臓癌、直腸癌、小腸癌及び胃癌；内分泌及び神経内分泌癌、例えば膵臓腺癌、副腎皮質癌、膵臓神経内分泌腫瘍、メルケル細胞癌、非小細胞肺神経内分泌腫瘍、小細胞肺神経内分泌腫瘍、副甲状腺癌、褐色細胞腫、下垂体部腫瘍及び甲状腺癌；眼球癌、例えば眼内黒色腫及び網膜芽腫；泌尿生殖器癌、例えば膀胱癌、腎臓（腎細胞）癌、陰茎癌、前立腺癌、移行細胞腎盂及び尿管癌、睾丸癌、尿道癌及びウィルムス腫瘍；胚細胞癌、例えば小児中枢神経系癌、小児頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、卵巣胚細胞腫瘍；婦人科癌、例えば子宮頸癌、子宮内膜癌、妊娠性絨毛腫瘍、上皮性卵巣癌、卵巣胚細胞腫瘍、子宮肉腫、膣癌及び外陰癌；頭部及び頸部癌、例えば下咽頭癌、喉頭癌、唇及び口腔癌、原発不明の転移性頸部扁平上皮癌、口腔癌、鼻咽腔癌、口腔咽頭癌、副鼻腔及び鼻腔癌、副甲状腺癌、咽頭癌、唾液腺癌及び咽喉癌；白血病、例えば成人急性リンパ性白血病、小児性急性リンパ性白血病、成人急性骨髄性白血病、小児性急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病及び有毛細胞白血病；多発性骨髄腫、例えば悪性プラズマ細胞；リンパ腫、例えばＡＩＤＳ－関連リンパ腫、皮膚ｔ－細胞リンパ腫、成人ホジキンリンパ腫、小児性ホジキンリンパ腫、妊娠中のホジキンリンパ腫、菌状息肉腫、成人非ホジキンリンパ腫、小児性非ホジキンリンパ腫、妊娠中の非ホジキンリンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫、セザリー症候群及びヴァルデンストレームマクログロブリン血症；筋骨格癌、例えばユーイング肉腫、骨肉腫及び骨の悪性線維性組織球腫、小児性横紋筋肉腫及び軟組織肉腫；神経癌、例えば成人脳腫瘍、小児性脳腫瘍、星細胞腫、脳幹グリオーマ、中枢神経系非定型奇形／横紋筋様腫瘍、中枢神経系胚芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、神経芽腫、原発性中枢神経系（ＣＮＳ）リンパ腫；呼吸器／胸部癌、例えば非小細胞肺癌、小細胞肺癌、悪性中皮腫、胸腺腫及び胸腺癌；並びに皮膚癌、例えばカポジ肉腫、黒色腫及び扁平細胞癌、原発不明癌を示す。
【0023】
本明細書において、「同定する」または「同定」は、ネオアンチゲンの存在を可視化することを示す。
【0024】
本明細書において、「単離する」または「単離」は、対象の試料中に存在する他の細胞種からＣＴＣなどの目的の細胞を物理的に分離することをいう。
【0025】
本明細書において、「全エクソーム解析」とは、全ゲノムのうち、エキソン配列のみを網羅的に解析する手法をいい、単に「エクソーム解析」ともいう。具体的には、ゲノムからエキソン領域を濃縮し、次世代シーケンサー（ＮＧＳ）などにより塩基配列を決定し、得られたリード配列を参照配列にマッピングした後、ＳＮＶを検出し、アノテーションの付与を行うことによってエキソン配列を解析することができる。「エクソーム解析」という場合には、ＤＮＡの特定領域のみを調べるターゲットシーケンスによって一部のエクソームのみを解析する場合が含まれる。
【0026】
本明細書において、「全ゲノム解析」とは、生体のゲノムを構成する全てのＤＮＡの塩基配列を解析する手法であり、得られた塩基の配列情報から変異の検出を行う。具体的には抽出したＤＮＡを断片化してライブラリを作製し、次世代シーケンサーを用いて塩基配列の決定（シーケンシング）を行う。その後バイオインフォマティックス解析により変異を検出する。本明細書で「ゲノム」という場合は、狭義のゲノム（生物が正常な生命活動を営むために必要な、最小限の遺伝子群を含む染色体の一組）のみならず、染色体を構成しないような遺伝情報をコードするものも含まれる。
【0027】
本明細書において、「ＲＮＡ－Ｓｅｑ」とは、ＲＮＡシーケンスまたはＲＮＡシーケンシングをいい、細胞中のｍＲＮＡやｍｉＲＮＡの配列を解読して、発現量の定量、新規転写配列の発見などを行う手法である。次世代シーケンサーを用いて取得したリード情報を解析することによって行われる。またシングルセルＲＮＡ－Ｓｅｑとは、シングルセルから得られたＲＮＡを用いてＲＮＡシーケンスを行う手法である。
【0028】
本明細書において、「プロテオーム解析」とは、遺伝子情報と細胞内で複雑に相互作用している多様なタンパク質との関係を明らかにする解析のことをいい、タンパク質の構造および機能を対象とした大規模な解析手法であって、タンパク質を網羅的に解析することができる。プロテオームとは、特定の細胞、器官および臓器の中で生産されているタンパク質全体のことであり、例えば、タンパク質を分離する技術である二次元電気泳動法は、分解能が高く、一度で数千種類のタンパク質を検出できるため、タンパク質等の生体サンプルの分離方法として使用することができる。
【0029】
本明細書において、「トランスクリプトーム解析」とは、特定の細胞生物学的な状況下において、１個あるいは増殖した、同様の分化状態にある生物の細胞中に存在する、全てのｍＲＮＡ（または、一次転写産物、トランスクリプト）を解析するものである。ｍＲＮＡは、その細胞が発生の過程で受けた細胞外からの影響の積み重ねによって色々と変化するため、現在の細胞の性質を詳細に解析することが可能となる。具体的には、マイクロアレイ等を用いて解析が行われる。例えば、比較対象となる細胞と比較して、血中循環腫瘍細胞に、がん細胞の無限増殖能、侵潤、転移、耐性、再発などに関与するｍＲＮＡや、変異したがん遺伝子に対応するｍＲＮＡや、変異したがん抑制遺伝子に対応するｍＲＮＡ、がん関連遺伝子に対するｍＲＮＡが多く存在する場合には、その血中循環腫瘍細胞の性質の特定が可能となる。
【0030】
（好ましい実施形態）
以下に本開示の好ましい実施形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本開示のよりよい理解のために提供されるものであり、本開示の範囲は以下の記載に限定されるべきでない。したがって、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本開示の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。また、本開示の以下の実施形態は単独でも使用されあるいはそれらを組み合わせて使用することができる。
以下に本開示の好ましい実施形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本開示のよりよい理解のために提供されるものであり、本開示の範囲は以下の記載に限定されるべきでない。したがって、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本開示の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。また、本開示の以下の実施形態は単独でも使用されあるいはそれらを組み合わせて使用することができる。
【0031】
核酸増幅及び／または培養による増殖をせずに配列決定することにより、被験者が有するネオアンチゲンを同定するための試料を調製する方法であって、アフェレーシスを用いて該被験者から採取された末梢血単核球細胞から単球を単離する工程であって、前記アフェレーシスを行うアフェレーシス条件が、血中循環腫瘍細胞濃縮条件を含む、工程と、単球を単離した該末梢血単核球細胞から、血中循環腫瘍細胞を単離する工程と、必要に応じて、ネオアンチゲンの同定に必要な血中循環腫瘍細胞の純度を確認する工程と、該血中循環腫瘍細胞を、ネオアンチゲンを同定するための試料として提供し、及び／または該血中循環腫瘍細胞からＤＮＡ及び/またはＲＮＡを抽出する工程とを含む、方法が提供される。本開示の方法においては、核酸増幅や培養増殖を行わないため、核酸増幅による増幅エラーや培養増殖における変異導入が生じることがなく、被験者由来の試料における悪性腫瘍の多様性をそのまま反映させることができる点で有利である。
【0032】
本開示の他の一局面において、核酸増幅及び／または培養による増殖をせずに配列決定することにより、被験者が有するネオアンチゲンを同定するための試料を調製する方法であって、アフェレーシスを用いて該被験者から採取された末梢血単核球細胞から単球を単離する工程と、単球を単離した該末梢血単核球細胞から、血中循環腫瘍細胞を単離する工程と、必要に応じて、ネオアンチゲンの同定に必要な血中循環腫瘍細胞の純度を確認する工程と、該血中循環腫瘍細胞を、ネオアンチゲンを同定するための試料として提供し、及び／または該血中循環腫瘍細胞からＤＮＡ及び／またはＲＮＡを抽出する工程とを含む、方法が提供される。
【0033】
また他の局面において、核酸増幅及び／または培養による増殖をせずに配列決定することにより、被験者が有するネオアンチゲンを同定する方法であって、アフェレーシスを用いて該被験者から採取された末梢血単核球細胞から単球を単離する工程であって、前記アフェレーシスを行うアフェレーシス条件が、血中循環腫瘍細胞濃縮条件を含む、工程と、単球を単離した該末梢血単核球細胞から、血中循環腫瘍細胞を単離する工程と、該血中循環腫瘍細胞からＤＮＡ及び／またはＲＮＡを抽出し、ＤＮＡ／ＲＮＡシーケンスライブラリを作成する工程と、該シーケンスライブラリの変異情報に基づき、ネオアンチゲンを同定する工程とを含み、該血中循環腫瘍細胞の純度が少なくとも約２０％である、方法が提供される。
【0034】
ネオアンチゲン同定のためには、通常、生検により、または手術過程に際して、約３０ｍｇの腫瘍組織が必要とされる。しかし、患者に対する生検や外科的手術は負担が大きく、ネオアンチゲンの同定のためだけの生検や手術は一般に現実的ではない。そのため、本開示の一実施形態においては、より少ない腫瘍組織、好ましくはアフェレーシスを用いて被験者から採取された末梢血単核球細胞を用いてネオアンチゲンを同定するための試料を調製することができる。一実施形態において、アフェレーシスの条件はスピルオーバーボリューム、及び／またはバフィーコートボリュームを血中循環腫瘍細胞濃縮条件にすることを含むことができる。一実施形態において、アフェレーシス条件は、約９～約１２ｍｌのスピルオーバーボリューム、及び／または約７～約１０ｍｌのバフィーコートボリュームを含むことができる。また一実施形態において、スピルオーバーボリュームおよびバフィーコートボリューム以外のアフェレーシス条件は、血中循環腫瘍細胞濃縮条件となるような条件であればどのような設定であってもよく、装置のデフォルト条件を用いることができる。
【0035】
また一実施形態において、アフェレーシスは、例えば遠心型血液成分分離装置（コムテック）を用いて行うことができ、血液を血小板、リンパ球、白血球、血漿等の血液成分に分離したり、血漿交換を行うことができる。一実施形態において、このような装置を用いて、末梢血単核球細胞を採取することができる。遠心型血液成分分離装置（コムテック）では、患者／供血者から連続的に全血を採血し、抗凝固処理及び除泡を行った後、遠心力を用いて主要な血液成分に分離する。分離の程度は、インターフェイスの位置、血流と遠心の速度によって決まる。また、その血液成分は、遠心器内で、サイズ、比重によって外側から赤血球－顆粒球－（単球、リンパ球、幹細胞）－血小板の順に分離され、最も内側に血漿が分離される。分離チャンバーには、種々の血液成分のための出口があり、採取を目的とする血液成分以外の成分は、ドリップチャンバー内で再び混合され、患者／供血者に返血される機構になっている。
【0036】
この装置の分離チャンバーの血液細胞の位置を決めるために、チャンバーに光の通過する一列の穴が付いており、その穴の列によりインターフェイスの境界(外側の細胞分画と
内側の血漿分画との境界)が光学的センサーにより自動的に検出される。
内側の血漿分画との境界)が光学的センサーにより自動的に検出される。
【0037】
遠心器の下部に光源があり、このランプから一列の穴に向かって投光され、この穴を通過する光をインターフェイスレシーバー(光学センサー)が不透明な細胞と透明な血漿との間の境界(インターフェイス)の位置を検出する。血漿の存在する部分は、光が通過するので、その穴がカウントされ、血球細胞の存在は、光が通過しないので穴がカウントされない。カウントされる穴の数によって、血液の分離程度が確認できる。即ち、チャンバー内の血液細胞の位置(いくつの穴が細胞によって光が遮られるか)を前もって装置で設定しておけば、実際の分離インターフェイスの位置と比較して、もし穴の数が少なければチャンバー内に血漿が蓄積され、インターフェイスを押し下げることができるように血漿ポンプが停止する。
【0038】
一実施形態において、蓄積した目的の血液成分は、スピルオーバーと呼ばれる、インターフェイスの位置を上昇する工程を経て、血漿の出口ポートを経由して、採取ポンプにより貯留バッグに集積する。
【0039】
遠心型血液成分分離装置（コムテック）の仕様を以下に示す。
１．遠心器
インナーローター回転速度：３００～２２００ｒｐｍ
アウターローター回転速度：１５０～１１００ｒｐｍ
最高回転速度：２２００ｒｐｍ
２．ポンプ
形式：ラインローラーポンプ
速度範囲：０．３～２１ｒｐｍ（採取ポンプ、血漿ポンプ、全血ポンプ、
ＡＣＤポンプ／循環ポンプ）
１～２８ｒｐｍ（ＡＣＤポンプ）
流速範囲 採血：１２．４～１２０ｍＬ／分
血漿：５．１２～８０ｍＬ／分
採取：１．７８～８０ｍＬ／分
抗凝固剤：１．７８～１７．５ｍＬ／分
３．プログラムの種類
Ｐｌｔ－５ｄ：両針法による５日間までの保存のための血小板の採取
Ｐｌｔ－５ｄ－ＳＮ：単針法による５日間までの保存のための血小板の採取
ＰＢＳＣ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ：末梢血幹細胞やリンパ球の分離
ＲＶ－ＰＢＳＣ：少量に濃縮された末梢血幹細胞の採取
ＢＭＳＣ：骨髄からの幹細胞の分離
Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ：顆粒球の採取
ＭＮＣ：単核球の採取
除去：血漿又は血漿とリンパ球の治療的除去
ＴＰＥ：治療的血漿交換
吸着：治療的血漿分離
ＲＢＣ：治療的赤血球交換及び除去
１．遠心器
インナーローター回転速度：３００～２２００ｒｐｍ
アウターローター回転速度：１５０～１１００ｒｐｍ
最高回転速度：２２００ｒｐｍ
２．ポンプ
形式：ラインローラーポンプ
速度範囲：０．３～２１ｒｐｍ（採取ポンプ、血漿ポンプ、全血ポンプ、
ＡＣＤポンプ／循環ポンプ）
１～２８ｒｐｍ（ＡＣＤポンプ）
流速範囲 採血：１２．４～１２０ｍＬ／分
血漿：５．１２～８０ｍＬ／分
採取：１．７８～８０ｍＬ／分
抗凝固剤：１．７８～１７．５ｍＬ／分
３．プログラムの種類
Ｐｌｔ－５ｄ：両針法による５日間までの保存のための血小板の採取
Ｐｌｔ－５ｄ－ＳＮ：単針法による５日間までの保存のための血小板の採取
ＰＢＳＣ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ：末梢血幹細胞やリンパ球の分離
ＲＶ－ＰＢＳＣ：少量に濃縮された末梢血幹細胞の採取
ＢＭＳＣ：骨髄からの幹細胞の分離
Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ：顆粒球の採取
ＭＮＣ：単核球の採取
除去：血漿又は血漿とリンパ球の治療的除去
ＴＰＥ：治療的血漿交換
吸着：治療的血漿分離
ＲＢＣ：治療的赤血球交換及び除去
【0040】
上記のような遠心型血液成分分離装置を用いて末梢血単核球細胞を採取する場合、患者の性別、身長、体重、ヘマトクリット値、白血球数などのデータを設定することができる。性別、身長、体重で患者の循環血液量を把握し、そのデータを基に適切な採血流量を設定する。また、ヘマトクリット値を設定することで、血漿ポンプの値を定めることができる。白血球数によって、どのくらい血液を処理すれば適切なバフィーコートが形成され、効率的に採取を行えるかを目的とした数値を計算することができる。また一実施形態において、血液採取の途中で効率的に細胞を回収するための数値「スピルオーバーボリューム」と、どのくらいの量の血液を採取するかを定める「バフィーコートボリューム」を設定することもできる。
【0041】
以下にコムテックを用いた場合の血液成分分離の工程を説明する。
まず装置の電源を入れ、専用ディスポーザブル血液回路（アフェレーシスセット）を装着する。分離チャンバーをチャンバーホルダーに装着した後、プライミングを実施する。一実施形態において、血液成分の分離は以下のようにして行うことができる。
（１）生食ラインを完全に脱気し、ディスプレイに従って分離前の準備を行う。
（２）（Ｃｏｎｔｉｎｕｅ）キーを押して、採血針を供血者に穿刺し、供血前サンプルを採取する。返血針を穿刺する。
（３）患者情報を入力する
（４）（Ｓｔａｒｔ）キーを押して分離を開始する。分離及び採血は自動的に行われ、目標設定値に達すると自動的に終了する。
まず装置の電源を入れ、専用ディスポーザブル血液回路（アフェレーシスセット）を装着する。分離チャンバーをチャンバーホルダーに装着した後、プライミングを実施する。一実施形態において、血液成分の分離は以下のようにして行うことができる。
（１）生食ラインを完全に脱気し、ディスプレイに従って分離前の準備を行う。
（２）（Ｃｏｎｔｉｎｕｅ）キーを押して、採血針を供血者に穿刺し、供血前サンプルを採取する。返血針を穿刺する。
（３）患者情報を入力する
（４）（Ｓｔａｒｔ）キーを押して分離を開始する。分離及び採血は自動的に行われ、目標設定値に達すると自動的に終了する。
【0042】
一実施形態において、コムテックを用いた場合、血液成分を分離した後、以下のようにして返血を行うこともできる。
（１）（Ｃｏｎｔｉｎｕｅ）キーを押して、生食ラインのクランプを開放し、供血者から採血ラインを外して返血前の準備を行う。（単針法の場合は採血ラインを外さない。）
（２）（Ｓｔａｒｔ）キーを押し、返血を開始する。返血は自動的に行われ、終了する。（３）返血終了後、（Ｓｔｏｐ）キーを押す。
（１）（Ｃｏｎｔｉｎｕｅ）キーを押して、生食ラインのクランプを開放し、供血者から採血ラインを外して返血前の準備を行う。（単針法の場合は採血ラインを外さない。）
（２）（Ｓｔａｒｔ）キーを押し、返血を開始する。返血は自動的に行われ、終了する。（３）返血終了後、（Ｓｔｏｐ）キーを押す。
【0043】
一実施形態において、スピルオーバーは、適宜条件を設定することができる。スピルオーバーボリュームは細胞の採取効率に大きく影響するため、効率的に細胞を回収することができるよう調節される。例えば、被験者の血液の状態によって変動させることができ、被験者におけるしびれの有無、体調などによって調整させることができる。一実施形態において、スピルオーバーボリュームは血中循環腫瘍細胞濃縮条件を達成するための値とすることができ、例えば、スピルオーバーボリュームは約５～約１５ｍｌ、好ましくは約７～１４ｍｌ、さらに好ましくは約９～約１２ｍｌとすることができる。
【0044】
一実施形態において、バフィーコートボリュームは、目的の細胞を採取することができるように適宜その量を設定することができる。一実施形態において、バフィーコートボリュームは血中循環腫瘍細胞濃縮条件を達成するための値とすることができ、例えば、バフィーコートボリュームは、約５～約１５ｍｌ、好ましくは約６～約１２ｍｌ、さらに好ましくは、約７～約１０ｍｌとすることができる。
【0045】
一実施形態において、血中循環腫瘍細胞濃縮条件を達成するために、スピルオーバーボリュームおよびバフィーコートボリュームは、上記条件を組み合わせて用いることもできる。
【0046】
一実施形態において、遠心型血液成分分離装置は、上記特定の装置に限られるものではなく、末梢血単核球細胞を採取することができるものであればよい。そのような遠心型血液成分分離装置としては、コムテック以外に、スペクトラ オプティア（テルモ社）などを用いることができる。
【0047】
以下にスペクトラ オプティアを用いた場合の血液成分分離の工程を説明する。
まず装置の電源を入れ、装置に血液回路を装着させ、回路のテストおよびプライミングを行う。その後、画面の指示に従って患者／ドナーを接続し、採血ラインと返血ラインのクランプを開き、血液成分の分離を行う。
まず装置の電源を入れ、装置に血液回路を装着させ、回路のテストおよびプライミングを行う。その後、画面の指示に従って患者／ドナーを接続し、採血ラインと返血ラインのクランプを開き、血液成分の分離を行う。
【0048】
一実施形態において、血液成分の分離中は画面に情報が表示されるため、常に患者／ドナーの状態をモニターし、また採取ポート、ＲＢＣインターフェース、採取ラインの濃度の監視を行うことができる。アラームが表示されたとき、または処理中に条件等を変更したい場合は画面の指示に従って調整し、運転を再開することができる。
【0049】
一実施形態において、スペクトラ オプティアを用いる場合には、以下のような成分分離工程を連続的に進めることができる。
（１）回路に付属の採血ラインに導入された患者／ドナーの全血は採血ポンプの働きにより、遠心分離器に装着された回路内のチャネル部に導入される。
（２）血液が凝固しないように一定比率で抗凝固剤が使用される。抗凝固された血液が、患者／ドナーへ返血される。
（３）遠心分離器の回転とともに回転してチャネル内の血液が成分毎に分離される。
（４）遠心分離を経た各成分は、血漿、血小板、赤血球の３ラインのチューブに分かれて遠心分離器より流出し、ポンプ動作により回路内のカセット部に入る。その後、バルブ動作により分岐部を経て、採取バッグ、又はカセット部に構成される返血リザーバーのいずれかに導入される。
（５）返血リザーバーに導かれた血液は返血ポンプの働きにより、返血ラインを経て患者／ドナーに返血される。尚、Ｅｘｃｈａｎｇｅセットにおいては、置換液が置換液／採取ポンプで、置換液ラインを通じてカセット内のリザーバーに導入され、患者に供給される。
（１）回路に付属の採血ラインに導入された患者／ドナーの全血は採血ポンプの働きにより、遠心分離器に装着された回路内のチャネル部に導入される。
（２）血液が凝固しないように一定比率で抗凝固剤が使用される。抗凝固された血液が、患者／ドナーへ返血される。
（３）遠心分離器の回転とともに回転してチャネル内の血液が成分毎に分離される。
（４）遠心分離を経た各成分は、血漿、血小板、赤血球の３ラインのチューブに分かれて遠心分離器より流出し、ポンプ動作により回路内のカセット部に入る。その後、バルブ動作により分岐部を経て、採取バッグ、又はカセット部に構成される返血リザーバーのいずれかに導入される。
（５）返血リザーバーに導かれた血液は返血ポンプの働きにより、返血ラインを経て患者／ドナーに返血される。尚、Ｅｘｃｈａｎｇｅセットにおいては、置換液が置換液／採取ポンプで、置換液ラインを通じてカセット内のリザーバーに導入され、患者に供給される。
【0050】
一実施形態において、上記各工程は安全装置で示した各安全機能によりモニターされることができ、安全機能に係る事態が発生した場合にその状況によって各機能が働くよう設計することができる。また各操作はタッチスクリーン式モニターで行うことができ、運転に必要な患者／ドナー情報や運転プログラムはこのスクリーンを通じて自動制御コンピューターに入力することができる。またイーサネットポートより外部の情報機器と通信を行うことができるが、患者／ドナー環境下でイーサーネットに電気機器を接続しない。
【0051】
本開示の一実施形態において、アフェレーシスによって単離した末梢血単核球細胞の個数は、単球や血中循環腫瘍細胞を単離するのに十分な量であればよく、例えば、少なくとも約１０個以上、約１×１０２個以上、約１×１０３個以上、約１×１０４個以上、約１×１０５個以上、約１×１０６個以上、約１×１０７個以上、または約１×１０８個以上とすることができる。
【0052】
一実施形態において、アフェレーシスに供する試料はネオアンチゲンを同定するために適した任意の試料であってもよく、例えば全血、骨髄、胸膜液、腹水、中心脊髄液、尿、唾液及び気管支洗浄液を含むことができる。一実施形態において、試料は血液であり、例えば全血又はその任意の画分若しくは成分である。本開示での使用に適した血液試料は、血液細胞又はその成分を含有することが知られる、例えば動脈、静脈、抹消組織、臍帯等の任意の供給源から抽出したものであり得る。例えば、アフェレーシスに供する試料は、周知かつ慣用の臨床的方法(例えば全血を吸引及び処理する手順)を用いて取得及び処理される。一つの態様において、例示的な方法は、癌患者からの末梢血の吸引であり得る。
【0053】
アフェレーシスによって得られたＰＢＭＣは主にＴリンパ球と単球とからなる。ＰＢＭＣからの単球の単離は本分野で公知の任意の技術を用いて行うことができるが、例えば本開示の一実施形態において、ＰＢＭＣを分離、播種し、血中循環腫瘍細胞やリンパ球が存在する浮遊細胞を含む上清を回収することで単球を単離することができる。
【0054】
本開示の一実施形態において、単球を単離した末梢血単核球細胞から、血中循環腫瘍細胞を単離することができる。ＰＢＭＣからの血中循環腫瘍細胞の単離は本分野で公知の任意の技術を用いて行うことができるが、例えば本開示の一実施形態において、浮遊細胞を含む上清として採取した分画から、モノクローナル抗体による単離、サイズ分画、または比重による分別などの手法によってＣＴＣを単離することができる。
【0055】
一実施形態において、単球を単離した末梢血単核球細胞からのＣＴＣの単離に用いるモノクローナル抗体は、例えば、抗ＥｐＣＡＭ抗体、抗Ｖｉｍｅｎｔｉｎ抗体、抗Ｎ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗Ｅ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ抗体、抗Ｄｅｓｍｏｇｌｅｉｎ－３抗体、抗Ｓｙｎｄｅｃａｎ－１抗体、抗ＣＤ９９抗体、抗ＣＤ８１抗体、及びＰＡＸ３抗体を含むことができる。一実施形態において、癌の種類に応じて、適切な抗体を適宜選択することができ、例えば、ＥｐＣＡＭ陰性のすい臓癌の場合にはＣＤ４５－ Ｖｉｍｅｎｔｉｎ＋やＣＤ４５－ Ｎ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ＋によって単離することができる。
【0056】
他の実施形態において、単球を単離した末梢血単核球細胞からのＣＴＣの単離は、セルサーチシステムや金属メッシュなどを用いたサイズ分画によって行うことができ、例えば、ＣＴＣ回収用フィルターキット（ＳｃｒｅｅＣｅｌｌ社）や、金属メッシュ（村田製作所）を用いることができる。一実施形態において、ＣＴＣ回収用フィルターキット（ＳｃｒｅｅＣｅｌｌ社）を用いた場合には、全血をフィルターに通す過程でＣＴＣをフィルター上に捕集することができる。抗体を使用しないため、ＥｐＣＡＭ（上皮細胞接着分子）の発現がほとんどないＥＭＴ（上皮間葉転換）化した細胞も捕集できる。他の実施形態において、金属メッシュ（村田製作所）を用いた場合には、適切なメッシュサイズを選択することで、捕捉する細胞と通過させる細胞とを選択することができるため、目的のＣＴＣのサイズに適したメッシュサイズを選択することにより、ＣＴＣだけを捕捉することができる。
【0057】
一実施形態において、単球を単離した末梢血単核球細胞からのＣＴＣの単離は、エリュートリエーターなどを用いて比重で分別することもできる。血液成分は密度が異なるため、全血から末梢血単核細胞とＣＴＣを分離するために密度遠心法（例えば、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ）（ＣＹＴＩＶＡ， Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ， ＭＡ， ＵＳＡ）を用いることもできる。他の実施形態において、密度勾配遠心分離システムと単核細胞の枯渇を高める多孔質バリアを結合させたシステムや、勾配遠心法に免疫親和性アプローチを取り入れ、不要なＰＢＭＣ細胞をサンプル中の赤血球に架橋し、イミュノロゼットを形成することで、ＣＴＣの分離効率を大幅に向上させることもできる。
【0058】
一実施形態において、モノクローナル抗体を用いてＣＴＣを単離する場合には、セルソーターを用いてＣＴＣとコントロール細胞（抗体陽性細胞）とをソーティングすることができる。例えば、セルソーター ＳＨ８００（ソニー）を用いることができ、その操作手順の一例は以下のとおりである。
【0059】
電源ＯＮ
・ＰＣモニター、キーボード、マウス
・コンプレッサー
・本体
・ＰＣ
＊本体のタンクに水が入っているか確認する。
＜ＰＣ画面＞
ＰＷ ： ｆｃｍ
デスクトップのソフト起動
↓
チップを登録（１００μｍ）
↓
ＮＥＸＴ→ＰＵＳＨ ＯＰＥＮ
↓
チップのドアオープン、古いチップがあれば捨てる
↓
ＣＨＩＰ ＩＮＳＥＲＴにチップ挿入 （文字が正面になる向き）
↓
ＮＥＸＴ
↓
レーザー設定、フィルター設定
↓
ＮＥＸＴ
↓
このままで少し待つ。セッティングが完了したら、ｓｕｃｃｅｓｆｕｌｌｙになる。→キャリブレーション（５ｍｌチューブにビーズを入れる）
↓
本体にビーズをセットして、Ｓｔａｒｔ （ｓｔａｎｄａｒｄ、□にはチェック入れない）
↓
このままで少し待つ。キャリブレーションが完了したら、ｓｕｃｃｅｓｆｕｌｌｙになる。
↓
ＯＫ
↓
テンプレートを開く（ＣＤ４５， ＥｐＣＡＭのテンプレート）
↓
Ｃｒｅａｔｅ ｎｅｗ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ
↓
少し流す。Ｓａｍｐｌｅ ｐｕｒｅｓｓｕｒｅ ５くらいで少し流して止める。
↓
流した画面を確認して、ゲートをかけてどこを採るか設定する。
↓
Ｌ，Ｒそれぞれに、採りたい区画と数を入力
Ｍｅｔｈｏｄ：２Ｗａｙ、Ｍｏｄｅ：Ｎｏｒｍａｌ
↓
採ってきた細胞を入れるチューブをセットしてドアを閉める（１５ｍｌチューブにＣＭＬ６ｍｌくらい）。
↓
Ｌｏａｄ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ
↓
チューブが奥にセットされる。
↓
Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔのファイル
↓
名前変更する
↓
流すサンプルをセット
↓
Ｓｔａｒｔ
↓
安定してきたら、Ｓｏｒｔ ｓｔａｒｔする。その際に、ｒｅｃｏｒｄもスタートする
↓
採りたい数まで到達した方はｓｏｒｔが止まる。サンプルが残り少なくなったら止める。
・ＰＣモニター、キーボード、マウス
・コンプレッサー
・本体
・ＰＣ
＊本体のタンクに水が入っているか確認する。
＜ＰＣ画面＞
ＰＷ ： ｆｃｍ
デスクトップのソフト起動
↓
チップを登録（１００μｍ）
↓
ＮＥＸＴ→ＰＵＳＨ ＯＰＥＮ
↓
チップのドアオープン、古いチップがあれば捨てる
↓
ＣＨＩＰ ＩＮＳＥＲＴにチップ挿入 （文字が正面になる向き）
↓
ＮＥＸＴ
↓
レーザー設定、フィルター設定
↓
ＮＥＸＴ
↓
このままで少し待つ。セッティングが完了したら、ｓｕｃｃｅｓｆｕｌｌｙになる。→キャリブレーション（５ｍｌチューブにビーズを入れる）
↓
本体にビーズをセットして、Ｓｔａｒｔ （ｓｔａｎｄａｒｄ、□にはチェック入れない）
↓
このままで少し待つ。キャリブレーションが完了したら、ｓｕｃｃｅｓｆｕｌｌｙになる。
↓
ＯＫ
↓
テンプレートを開く（ＣＤ４５， ＥｐＣＡＭのテンプレート）
↓
Ｃｒｅａｔｅ ｎｅｗ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ
↓
少し流す。Ｓａｍｐｌｅ ｐｕｒｅｓｓｕｒｅ ５くらいで少し流して止める。
↓
流した画面を確認して、ゲートをかけてどこを採るか設定する。
↓
Ｌ，Ｒそれぞれに、採りたい区画と数を入力
Ｍｅｔｈｏｄ：２Ｗａｙ、Ｍｏｄｅ：Ｎｏｒｍａｌ
↓
採ってきた細胞を入れるチューブをセットしてドアを閉める（１５ｍｌチューブにＣＭＬ６ｍｌくらい）。
↓
Ｌｏａｄ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ
↓
チューブが奥にセットされる。
↓
Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔのファイル
↓
名前変更する
↓
流すサンプルをセット
↓
Ｓｔａｒｔ
↓
安定してきたら、Ｓｏｒｔ ｓｔａｒｔする。その際に、ｒｅｃｏｒｄもスタートする
↓
採りたい数まで到達した方はｓｏｒｔが止まる。サンプルが残り少なくなったら止める。
【0060】
本開示の一実施形態において、ソーティングは以下の手順で行うことができる。
凍結細胞を３７℃で溶かす
↓
フィルター ファルコン 凝集細胞を除く
↓
３ｍｌ ＰＢＳ Ｂｕｆｆｅｒ （２ｍＭ ＥＤＴＡ，２％ＦＢＳ）
↓
遠心 １０００ｒｐｍ、２分、４℃
↓
細胞計数→遠心 １０００ｒｐｍ、２分、４℃
↓
抗体による染色
抗体濃度
ＣＤ４５ ＰＥ ５μｇ／ｍｌ
ＥｐＣＡＭ １０μｇ／ｍｌ
↓
氷上に３０分
↓
２ｍｌ ＰＢＳ Ｂｕｆｆｅｒ（２ｍＭ ＥＤＴＡ，２％ＦＢＳ）添加
↓
遠心 １０００ｒｐｍ、２分、４℃
↓
１ｍｌ ＰＢＳ Ｂｕｆｆｅｒ（２ｍＭ ＥＤＴＡ，２％ＦＢＳ）に懸濁
↓
フィルター、Ｔｕｂｅ
↓
ＣＭＬ ６ｍｌ
ＣＭＬ
１％ ＭＥＭ Ｎｏｎ－Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ１％ ＨＥＰＥＳ
１％ Ｓｏｄｉｕｍ Ｐｙｒｕｖａｔｅ
５０μＭ ２－ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ
１％ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ
１０％ ＦＣＳ（ＦＢＳ）
５００ｍｌ ＲＰＭＩ １６４０ ｍｅｄｉｕｍ
↓
ソーティング（ＣＤ４５ ＰＥ，ＥｐＣＡＭ ＦＩＴＣ）
↓
遠心 １８００ｒｐｍ、１０分、４℃
↓
懸濁 ＲＬＴ Ｂｕｆｆｅｒ ３５０μｌ
ＲＬＴ Ｂｕｆｆｅｒ：
Ｂｕｆｆｅｒ ＲＬＴ Ｐｌｕｓ （ＱＩＡＧＥＮ） １ｍｌ
β－ＭＥ １０μｌ
凍結細胞を３７℃で溶かす
↓
フィルター ファルコン 凝集細胞を除く
↓
３ｍｌ ＰＢＳ Ｂｕｆｆｅｒ （２ｍＭ ＥＤＴＡ，２％ＦＢＳ）
↓
遠心 １０００ｒｐｍ、２分、４℃
↓
細胞計数→遠心 １０００ｒｐｍ、２分、４℃
↓
抗体による染色
抗体濃度
ＣＤ４５ ＰＥ ５μｇ／ｍｌ
ＥｐＣＡＭ １０μｇ／ｍｌ
↓
氷上に３０分
↓
２ｍｌ ＰＢＳ Ｂｕｆｆｅｒ（２ｍＭ ＥＤＴＡ，２％ＦＢＳ）添加
↓
遠心 １０００ｒｐｍ、２分、４℃
↓
１ｍｌ ＰＢＳ Ｂｕｆｆｅｒ（２ｍＭ ＥＤＴＡ，２％ＦＢＳ）に懸濁
↓
フィルター、Ｔｕｂｅ
↓
ＣＭＬ ６ｍｌ
ＣＭＬ
１％ ＭＥＭ Ｎｏｎ－Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ１％ ＨＥＰＥＳ
１％ Ｓｏｄｉｕｍ Ｐｙｒｕｖａｔｅ
５０μＭ ２－ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ
１％ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ
１０％ ＦＣＳ（ＦＢＳ）
５００ｍｌ ＲＰＭＩ １６４０ ｍｅｄｉｕｍ
↓
ソーティング（ＣＤ４５ ＰＥ，ＥｐＣＡＭ ＦＩＴＣ）
↓
遠心 １８００ｒｐｍ、１０分、４℃
↓
懸濁 ＲＬＴ Ｂｕｆｆｅｒ ３５０μｌ
ＲＬＴ Ｂｕｆｆｅｒ：
Ｂｕｆｆｅｒ ＲＬＴ Ｐｌｕｓ （ＱＩＡＧＥＮ） １ｍｌ
β－ＭＥ １０μｌ
【0061】
本開示の一実施形態において、モノクローナル抗体やサイズ分画によって単離したＣＴＣの純度は、ネオアンチゲンの同定に必要な純度、またはＤＮＡまたはＲＮＡを抽出するのに十分な純度であればよく、例えば、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９７％などとすることができる。
【0062】
本開示の一実施形態において、モノクローナル抗体やサイズ分画によって単離したＣＴＣの個数は、ネオアンチゲンの同定に必要な量、またはＤＮＡまたはＲＮＡを抽出するのに十分な量であればよく、例えば、少なくとも約１０個以上、約１×１０２個以上、約１×１０３個以上、約１×１０４個以上、または約１×１０５個以上とすることができる。
【0063】
本開示の一実施形態において、末梢血単核球細胞から単離した血中循環腫瘍細胞を凍結することができる。この場合、血中循環腫瘍細胞はネオアンチゲンを同定するための試料として提供可能な品質、または血中循環腫瘍細胞からＤＮＡ及び／またはＲＮＡを抽出可能な品質に影響がない温度や時間で凍結保存することができ、例えば、液体窒素（－１９６℃）あるいは超低温槽（－８０℃）で約１年間以上の凍結保存が可能である。
【0064】
本開示の一実施形態において、末梢血単核球細胞から単離した血中循環腫瘍細胞からＤＮＡ及び／またはＲＮＡを抽出することができる。抽出されるＤＮＡまたはＲＮＡ量は、ＤＮＡ／ＲＮＡシーケンシングに使用できる量であればよく、例えば、少なくとも約１００ｐｇのＤＮＡ及び／またはＲＮＡを抽出することができる。他の実施形態において、ＤＮＡ及び／またはＲＮＡの抽出量は、少なくとも約２００ｐｇ、約５００ｐｇ、約８００ｐｇ、約１ｎｇ、約１０ｎｇ、約３０ｎｇ、約５０ｎｇ、約８０ｎｇ、約１００ｎｇ、約２００ｎｇとすることもできる。
【0065】
本開示の一実施形態において、ＤＮＡの抽出は例えば以下の手順で行うことができる。
ＱＩａｍｐ（登録商標）ＤＮＡ ＭｉｎｉによるＤＮＡ抽出
２０μｌ Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ ←１．５ｍｌ マイクロチューブ
↓
ＰＢＳ２００μｌで懸濁したサンプルをこのチューブに添加
↓
２００μｌ Ｂｕｆｆｅｒ ＡＬを添加 ボルテックスで十分に混和
↓
５６ ℃ １０分 インキュベート
↓
スピンダウンしてフタの内側についた溶液を回収
↓
１００% エタノール２００μｌ添加 ボルテックスで十分に混和
↓
ＱＩａｍｐ Ｍｉｎｉ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎにサンプルを添加
↓
フタを閉めて遠心 ６，０００ｇ, １分
↓
ろ液とコレクションチューブは捨て、新しいコレクションチューブを付ける
↓
５００μｌ Ｂｕｆｆｅｒ ＡＷ１ 添加
↓
フタを閉めて遠心 ６，０００ｇ, １分
↓
５００μｌ Ｂｕｆｆｅｒ ＡＷ２ 添加
↓
フタを閉めて遠心 １２，０００ｇ、３分
↓
ろ液を捨てて遠心 １２，０００ｇ、１分
↓
ＱＩａｍｐ Ｍｉｎｉ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎを新しい1.5ml マイクロチューブに移す
１００μｌ Ｂｕｆｆｅｒ ＡＥを添加、室温で１分 インキュベート
↓
遠心 ６，０００ｇ,１分
Ｏ．Ｄ測定し、抽出したＤＮＡは－８０℃ 保存
ＱＩａｍｐ（登録商標）ＤＮＡ ＭｉｎｉによるＤＮＡ抽出
２０μｌ Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ ←１．５ｍｌ マイクロチューブ
↓
ＰＢＳ２００μｌで懸濁したサンプルをこのチューブに添加
↓
２００μｌ Ｂｕｆｆｅｒ ＡＬを添加 ボルテックスで十分に混和
↓
５６ ℃ １０分 インキュベート
↓
スピンダウンしてフタの内側についた溶液を回収
↓
１００% エタノール２００μｌ添加 ボルテックスで十分に混和
↓
ＱＩａｍｐ Ｍｉｎｉ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎにサンプルを添加
↓
フタを閉めて遠心 ６，０００ｇ, １分
↓
ろ液とコレクションチューブは捨て、新しいコレクションチューブを付ける
↓
５００μｌ Ｂｕｆｆｅｒ ＡＷ１ 添加
↓
フタを閉めて遠心 ６，０００ｇ, １分
↓
５００μｌ Ｂｕｆｆｅｒ ＡＷ２ 添加
↓
フタを閉めて遠心 １２，０００ｇ、３分
↓
ろ液を捨てて遠心 １２，０００ｇ、１分
↓
ＱＩａｍｐ Ｍｉｎｉ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎを新しい1.5ml マイクロチューブに移す
１００μｌ Ｂｕｆｆｅｒ ＡＥを添加、室温で１分 インキュベート
↓
遠心 ６，０００ｇ,１分
Ｏ．Ｄ測定し、抽出したＤＮＡは－８０℃ 保存
【0066】
本開示の他の実施形態において、ＤＮＡの抽出は例えば以下の手順で行うことができる。
ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）Ｂｌｏｏｄ Ｌ（ＴＡＫＡＲＡ）によるＤＮＡ抽出
Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ： Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｂｕｆｆｅｒ ＰＢを加えて溶かす（－２０℃で保存）
Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ Ｂ５：１００％エタノールを加える
↓
サンプル（最大２×１０７ ｃｅｌｌｓ）細胞（ペレット状）を用いる
↓
ＰＢＳ ２ｍｌで溶かす
↓
１５０μｌ Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋを入れる
↓
２ｍｌ ＢＱ１ 激しくボルテックス（１０秒）
↓
５６℃ でインキュベーション１５分 ←ヒートブロックはあらかじめ温めておく
↓
２ｍｌ １００％エタノールを入れ、混ぜる
↓
ＤＮＡ結合
ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｂｌｏｏｄ Ｌ Ｃｏｌｕｍｎ ３ｍｌをサンプルにロード１回目 ４，５００ｇ遠心，３分，２５℃
↓
ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｂｌｏｏｄ Ｌ Ｃｏｌｕｍｎ ３ｍｌをサンプルにロード２回目 ４，５００ｇ遠心，５分，２５℃
↓
洗浄１回目
２ｍｌ ＢＱ２ ４，５００ｇ遠心， ２分， ２５℃
↓
洗浄２回目、Ｄｒｙ ｍｅｍｂｒａｎｅ
２ｍｌ ＢＱ２ ４，５００ｇ遠心， １０分， ２５℃
↓
ＤＮＡ抽出 新しい１５ｍｌチューブ ←Ｅｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ ＥＢを７０℃に温めておく
２００μｌ Ｂｕｆｆｅｒ ＢＥ （７０℃に予熱したもの） ２分， インキュベーション，室温
４，５００ｇ遠心， ２分，２５℃
↓
抽出したＤＮＡは－８０℃で保存
ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）Ｂｌｏｏｄ Ｌ（ＴＡＫＡＲＡ）によるＤＮＡ抽出
Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ： Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｂｕｆｆｅｒ ＰＢを加えて溶かす（－２０℃で保存）
Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ Ｂ５：１００％エタノールを加える
↓
サンプル（最大２×１０７ ｃｅｌｌｓ）細胞（ペレット状）を用いる
↓
ＰＢＳ ２ｍｌで溶かす
↓
１５０μｌ Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋを入れる
↓
２ｍｌ ＢＱ１ 激しくボルテックス（１０秒）
↓
５６℃ でインキュベーション１５分 ←ヒートブロックはあらかじめ温めておく
↓
２ｍｌ １００％エタノールを入れ、混ぜる
↓
ＤＮＡ結合
ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｂｌｏｏｄ Ｌ Ｃｏｌｕｍｎ ３ｍｌをサンプルにロード１回目 ４，５００ｇ遠心，３分，２５℃
↓
ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｂｌｏｏｄ Ｌ Ｃｏｌｕｍｎ ３ｍｌをサンプルにロード２回目 ４，５００ｇ遠心，５分，２５℃
↓
洗浄１回目
２ｍｌ ＢＱ２ ４，５００ｇ遠心， ２分， ２５℃
↓
洗浄２回目、Ｄｒｙ ｍｅｍｂｒａｎｅ
２ｍｌ ＢＱ２ ４，５００ｇ遠心， １０分， ２５℃
↓
ＤＮＡ抽出 新しい１５ｍｌチューブ ←Ｅｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ ＥＢを７０℃に温めておく
２００μｌ Ｂｕｆｆｅｒ ＢＥ （７０℃に予熱したもの） ２分， インキュベーション，室温
４，５００ｇ遠心， ２分，２５℃
↓
抽出したＤＮＡは－８０℃で保存
【0067】
一実施形態において、ＲＮＡの抽出は、本分野において公知のキットや手法を用いて行うことができ、例えば、Ｒｎｅａｓｙミニキット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いることができる。Ｒｎｅａｓｙミニキット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いる場合には、以下の手順でＲＮＡを抽出することができる。
【0068】
ｇＤＮＡ Ｅｌｉｍｉｎａｔｏｒ ｓｐｉｎ ｃｏｌｕｍに添加
↓
遠心 １００００ｇ、１分、２５℃
↓
遠心で落ちた液に７０％エタノール３５０μｌ添加
↓
その全量をＲｎｅａｓｙ Ｍｉｎ Ｅｌｕｔｅ ｓｐｉｎ ｃｏｌｕｍに添加
↓
遠心 １００００ｇ、１分、２５℃
↓
Ｂｕｆｆｅｒ ＲＷ１ ７００μｌ
↓
遠心 １００００ｇ、１分、２５℃
↓
Ｂｕｆｆｅｒ ＲＰＥ ５００μｌ
↓
遠心 １００００ｇ、１分、２５℃
↓
８０％エタノール ５００μｌ
↓
遠心 １００００ｇ、２分、２５℃
↓
乾燥 フタを開けて遠心 １２０００ｇ、５分、２５℃
↓
Ｒｎａｓｅ－ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ １４μｌ
↓
遠心 １２０００ｇ、１分、２５℃
↓
定量（ＮＡＮＯ ＤＲＯＰ ＯＮＥ， Ｔｈｅｒｍｏ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）
↓
遠心 １００００ｇ、１分、２５℃
↓
遠心で落ちた液に７０％エタノール３５０μｌ添加
↓
その全量をＲｎｅａｓｙ Ｍｉｎ Ｅｌｕｔｅ ｓｐｉｎ ｃｏｌｕｍに添加
↓
遠心 １００００ｇ、１分、２５℃
↓
Ｂｕｆｆｅｒ ＲＷ１ ７００μｌ
↓
遠心 １００００ｇ、１分、２５℃
↓
Ｂｕｆｆｅｒ ＲＰＥ ５００μｌ
↓
遠心 １００００ｇ、１分、２５℃
↓
８０％エタノール ５００μｌ
↓
遠心 １００００ｇ、２分、２５℃
↓
乾燥 フタを開けて遠心 １２０００ｇ、５分、２５℃
↓
Ｒｎａｓｅ－ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ １４μｌ
↓
遠心 １２０００ｇ、１分、２５℃
↓
定量（ＮＡＮＯ ＤＲＯＰ ＯＮＥ， Ｔｈｅｒｍｏ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）
【0069】
他の実施形態において、キアゾールおよびトリゾールを用いてＲＮＡを抽出する場合には、以下の手順を採用することができる。
凍結細胞を溶かす
↓
ＰＢＳ（２％ ＦＢＳ，２ｍＭ ＥＤＴＡ）３ｍｌに懸濁
↓
遠心 １０００ｒｐｍ、２分、４℃
↓
細胞数計測 １．９１×１０６細胞
↓
５００μｌずつ２本に分ける（１５ｍｌチューブ）
↓
遠心 １０００ｒｐｍ、２分、４℃
↓
ＱＩＡｚｏｌ Ｌｙｓｉｓ ｒｅａｇｅｎｔ ７００μｌ
ＴＲＩｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ ７００μｌ
それぞれに懸濁する
↓
クロロホルム １４０μｌ
↓
ボルテックス 白くなるまでよく混ぜる
↓
遠心 １２０００ｇ、１５分、４℃
↓
水層だけ取る（３００μｌ）
↓
１００％ エタノール 取った水層の１．５倍Ｖｏｌｕｍｅ（４５０μｌ）
↓
カラムに添加（２回に分けて添加）
↓
遠心 ８０００ｇ、１分、２５℃
↓
Ｂｕｆｆｅｒ ＲＷＴ ７００μｌ
↓
遠心 ８０００ｇ、１分、２５℃
↓
Ｂｕｆｆｅｒ ＲＰＥ ５００μｌ
↓
遠心 ８０００ｇ、１分、２５℃
↓
８０％ エタノール５００μｌ
↓
遠心 ８０００ｇ、２分、２５℃
↓
乾燥 １２０００ｇ、５分、２５℃
↓
エリューション Ｒｎａｓｅ ｆｒｅｅ Ｂｕｆｆｅｒ １４μｌ（ＣＴＣ２０－００１→２０μｌでエリューション）
↓
室温で２～３分おく
↓
遠心 １２０００ｇ、１分、２５℃
凍結細胞を溶かす
↓
ＰＢＳ（２％ ＦＢＳ，２ｍＭ ＥＤＴＡ）３ｍｌに懸濁
↓
遠心 １０００ｒｐｍ、２分、４℃
↓
細胞数計測 １．９１×１０６細胞
↓
５００μｌずつ２本に分ける（１５ｍｌチューブ）
↓
遠心 １０００ｒｐｍ、２分、４℃
↓
ＱＩＡｚｏｌ Ｌｙｓｉｓ ｒｅａｇｅｎｔ ７００μｌ
ＴＲＩｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ ７００μｌ
それぞれに懸濁する
↓
クロロホルム １４０μｌ
↓
ボルテックス 白くなるまでよく混ぜる
↓
遠心 １２０００ｇ、１５分、４℃
↓
水層だけ取る（３００μｌ）
↓
１００％ エタノール 取った水層の１．５倍Ｖｏｌｕｍｅ（４５０μｌ）
↓
カラムに添加（２回に分けて添加）
↓
遠心 ８０００ｇ、１分、２５℃
↓
Ｂｕｆｆｅｒ ＲＷＴ ７００μｌ
↓
遠心 ８０００ｇ、１分、２５℃
↓
Ｂｕｆｆｅｒ ＲＰＥ ５００μｌ
↓
遠心 ８０００ｇ、１分、２５℃
↓
８０％ エタノール５００μｌ
↓
遠心 ８０００ｇ、２分、２５℃
↓
乾燥 １２０００ｇ、５分、２５℃
↓
エリューション Ｒｎａｓｅ ｆｒｅｅ Ｂｕｆｆｅｒ １４μｌ（ＣＴＣ２０－００１→２０μｌでエリューション）
↓
室温で２～３分おく
↓
遠心 １２０００ｇ、１分、２５℃
【0070】
本開示の一局面において、被験者が有するネオアンチゲンを用いた樹状細胞療法のための細胞を製造する方法であって、アフェレーシスを用いて該被験者から採取された末梢血単核球細胞から単球を単離する工程であって、前記アフェレーシスを行うアフェレーシス条件が、血中循環腫瘍細胞濃縮条件を含む、工程と、単球を単離した該末梢血単核球細胞から、血中循環腫瘍細胞を単離する工程と、該血中循環腫瘍細胞からＤＮＡ及び／またはＲＮＡを抽出し、ＤＮＡ／ＲＮＡシーケンスライブラリを作成する工程と、該シーケンスライブラリの変異情報に基づき、ネオアンチゲンを同定する工程と、該ネオアンチゲンを樹状細胞に導入する工程とを含む、方法が提供される。
【0071】
本開示の一実施形態において、樹状細胞は、アフェレーシスによって被験者から得られたものであってもよく、または被験者から採取された末梢血単核球細胞から単離された単球から誘導されたものを利用することもできる。
【0072】
一実施形態において、凍結原料から樹状細胞製造を実施するにあたり、アフェレーシス原料の凍結保存・搬送、原料融解・洗浄・遠心分離、接着処理後の上清、浮遊細胞の除去、
樹状細胞誘導、樹状細胞成熟化・活性化などを行うことにより、樹状細胞療法のための樹状細胞とすることができる。
樹状細胞誘導、樹状細胞成熟化・活性化などを行うことにより、樹状細胞療法のための樹状細胞とすることができる。
【0073】
本開示の一実施形態において、アフェレーシスを用いて被験者から採取された末梢血単核球細胞から単球を単離し、単球除去後のＰＢＭＣからＣＴＣを採取し、このＣＴＣを用いて、ＣＴＣに発現しているネオアンチゲン蛋白を、ＣＴＣのプロテオーム解析により同定することもできる。
【0074】
この場合には、ネオアンチゲン同定のために、ＣＴＣと正常細胞からＤＮＡを抽出し、エクソーム解析を行い、その後ソフトウエアでネオアンチゲンを同定することができる。ＣＴＣに発現しているネオアンチゲン蛋白についてはＣＴＣのプロテオーム解析によって同定し、ＤＣ投与後の末梢血Ｔ細胞の解析には、レパトア解析とＥｌｉｓｐｏｔ解析を用いることができる。これにより、ＣＴＣを用いて同定したネオアンチゲンのペプチドをＤＣにパルスし、がん患者の末梢血にネオアンチゲン反応性Ｔ細胞を検出できるかどうかを確認する（図３）。
【0075】
プロテオーム解析については任意の手法によって解析することができ、ＣＴＣを用いて解析できるものであれば特に限られないが、例えば以下のような手法で行うことができる。
（１）約１０００個から数万個のＣＴＣ浮遊液を１０００～２０００ｃｐｍで１０～１５分遠心し細胞ペレットを作製する。細胞ペレットは－８０℃の低温槽あるいは液体窒素容器で保存する。
（２）界面活性剤、凍結融解、浸透圧ショック、のいずれかの方法でＣＴＣのペレットからタンパク質を抽出する。
（３）抽出したタンパク質を、高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）と三連四重極型質量分析計（ＭＳ／ＭＳ）を組合せた装置（液体クロマトグラフ質量分析計「Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ－Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ： ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ」）で分析する。これによりＣＴＣに発現しているタンパク質を同定する。
（１）約１０００個から数万個のＣＴＣ浮遊液を１０００～２０００ｃｐｍで１０～１５分遠心し細胞ペレットを作製する。細胞ペレットは－８０℃の低温槽あるいは液体窒素容器で保存する。
（２）界面活性剤、凍結融解、浸透圧ショック、のいずれかの方法でＣＴＣのペレットからタンパク質を抽出する。
（３）抽出したタンパク質を、高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）と三連四重極型質量分析計（ＭＳ／ＭＳ）を組合せた装置（液体クロマトグラフ質量分析計「Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ－Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ： ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ」）で分析する。これによりＣＴＣに発現しているタンパク質を同定する。
【0076】
本開示の一実施形態において、上記のようにして単離したＣＴＣを用いて、エクソーム解析を行うことができる。エクソーム解析については任意の手法によって解析することができ、ＣＴＣを用いて解析できるものであれば特に限られないが、例えば以下のような手法で行うことができる。
（１）ＣＴＣ及びコントロール細胞のｔｏｔａｌ ＤＮＡからＡｇｉｌｅｎｔ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ Ａｌｌ Ｅｘｏｎキットを用いて、全エクソームシーケンス解析用ライブラリを作製する。作製されたシーケンスライブラリの品質検査を、Ａｇｉｌｅｎｔ社ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎを用いて実施する。
（２）次いでシーケンシングをイルミナ社ＮｏｖａＳｅｑ ６０００により行う。
（３）シーケンシングで得られたリードを、ＧＥＭ（Ｍａｒｃｏ－Ｓｏｌａ、ｅｔ ａｌ、２０１２）を用いてマッピングする。マッピングはＳｕｂｒｅａｄ（Ｌｉａｏ、ｅｔ ａｌ、 ２０１３）、ＨＩＳＡＴ／ＨＩＳＡＴ２（Ｋｉｍ、ｅｔ ａｌ、２０１５）、あるいはＫＡＲＴ（Ｌｉｎ ａｎｄ Ｈｓｕ、２０１７）でも可能である。次にＨＴＳｅｑによりマップされたリード数をカウントし、遺伝子発現解析を実施する。マップ結果からＴｈｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｔｏｏｌｋｉｔ （ＧＡＴＫ）“ＨａｐｌｏｔｙｐｅＣａｌｌｅｒ”（Ｖｅｒｓｉｏｎ：４．０．１０．１）を用いてバリアントコールし、ｖｃｆファイルを作成する。
（１）ＣＴＣ及びコントロール細胞のｔｏｔａｌ ＤＮＡからＡｇｉｌｅｎｔ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ Ａｌｌ Ｅｘｏｎキットを用いて、全エクソームシーケンス解析用ライブラリを作製する。作製されたシーケンスライブラリの品質検査を、Ａｇｉｌｅｎｔ社ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎを用いて実施する。
（２）次いでシーケンシングをイルミナ社ＮｏｖａＳｅｑ ６０００により行う。
（３）シーケンシングで得られたリードを、ＧＥＭ（Ｍａｒｃｏ－Ｓｏｌａ、ｅｔ ａｌ、２０１２）を用いてマッピングする。マッピングはＳｕｂｒｅａｄ（Ｌｉａｏ、ｅｔ ａｌ、 ２０１３）、ＨＩＳＡＴ／ＨＩＳＡＴ２（Ｋｉｍ、ｅｔ ａｌ、２０１５）、あるいはＫＡＲＴ（Ｌｉｎ ａｎｄ Ｈｓｕ、２０１７）でも可能である。次にＨＴＳｅｑによりマップされたリード数をカウントし、遺伝子発現解析を実施する。マップ結果からＴｈｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｔｏｏｌｋｉｔ （ＧＡＴＫ）“ＨａｐｌｏｔｙｐｅＣａｌｌｅｒ”（Ｖｅｒｓｉｏｎ：４．０．１０．１）を用いてバリアントコールし、ｖｃｆファイルを作成する。
【0077】
本開示の一実施形態において、上記のようにして得られたＣＴＣは、ネオアンチゲン同定以外にも、種々の解析に使用することができる。したがって、本開示の他の局面において、核酸増幅及び／または培養による増殖をせずに解析するための被験者由来の血中循環腫瘍細胞を含む試料を調製する方法であって、アフェレーシスを用いて該被験者から採取された末梢血単核球細胞から単球を単離する工程であって、前記アフェレーシスを行うアフェレーシス条件が、血中循環腫瘍細胞濃縮条件を含む、工程と、単球を単離した該末梢血単核球細胞から、血中循環腫瘍細胞を単離する工程と、必要に応じて、該解析に必要な血中循環腫瘍細胞の純度を確認する工程と、必要に応じて、該血中循環腫瘍細胞に対して、該解析のための前処理を行う工程とを含む、方法が提供される。
【0078】
また本開示の他の局面において、核酸増幅及び／または培養による増殖をせずに被験者由来の血中循環腫瘍細胞を解析する方法であって、アフェレーシスを用いて該被験者から採取された末梢血単核球細胞から単球を単離する工程であって、前記アフェレーシスを行うアフェレーシス条件が、血中循環腫瘍細胞濃縮条件を含む、工程と、単球を単離した該末梢血単核球細胞から、血中循環腫瘍細胞を単離する工程と、該血中循環腫瘍細胞を用いて解析を行う工程とを含む、方法が提供される。
【0079】
一実施形態において、このような解析は、ＣＴＣを用いて行うことができるものであれば特に限られないが、例えば、全エクソーム解析、全ゲノム解析、ＲＮＡ－Ｓｅｑ、シングルセルＲＮＡ－Ｓｅｑ、プロテオーム解析、トランスクリプトーム解析を含むことができる。一実施形態において、本開示の方法によって調製される血中循環腫瘍細胞を含む試料は、上記のような解析を行うことによって、被験者が有するネオアンチゲンを同定するためのものとすることができる。一実施形態において、その他の解析に用いる場合にも、本明細書の他の箇所で説明した特徴を適宜採用することができる。
【0080】
また本開示の一実施形態において、目的の解析に応じて血中循環腫瘍細胞に対して適切な前処理をすることができ、また血中循環腫瘍細胞からＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質を抽出することもできる。このような抽出手段については特に限られるものではなく、目的の解析に使用できるような量や精度で抽出できるものである限り、周知の抽出技術を用いることができる。
【0081】
抽出されるＤＮＡまたはＲＮＡ量は、その後の解析に使用できる量であればよく、例えば、少なくとも約１００ｐｇのＤＮＡ及び／またはＲＮＡを抽出することができる。他の実施形態において、ＤＮＡ及び／またはＲＮＡの抽出量は、少なくとも約２００ｐｇ、約５００ｐｇ、約８００ｐｇ、約１ｎｇ、約１０ｎｇ、約３０ｎｇ、約５０ｎｇ、約８０ｎｇ、約１００ｎｇ、約２００ｎｇとすることもできる。
【0082】
一実施形態において、このようなＤＮＡまたはＲＮＡを用いてＤＮＡ／ＲＮＡシーケンスライブラリを作成することができる。例えばネオアンチゲンを同定する場合には、この
シーケンスライブラリの変異情報に基づき、ネオアンチゲンを同定することができる。
シーケンスライブラリの変異情報に基づき、ネオアンチゲンを同定することができる。
【0083】
一実施形態において、上記のとおり、ＣＴＣおよび正常細胞由来のＤＮＡを抽出してから、エクソーム解析を行い、またＣＴＣの一部をプロテオーム解析することによりネオアンチゲン蛋白を同定することも可能である。
【0084】
また本開示の他の局面において、核酸増幅及び／または培養による増殖をせずに血中循環腫瘍細胞を解析することにより被験者を治療または予防する方法であって、アフェレーシスを用いて該被験者から採取された末梢血単核球細胞から単球を単離する工程であって、前記アフェレーシスを行うアフェレーシス条件が、血中循環腫瘍細胞濃縮条件を含む、工程と、単球を単離した該末梢血単核球細胞から、血中循環腫瘍細胞を単離する工程と、該血中循環腫瘍細胞を用いて解析を行う工程と、該解析結果に基づいて、該被験者を治療または予防する工程とを含む、方法が提供される。
【0085】
一実施形態において、このような治療または予防する方法においては、本明細書の他の箇所で説明した特徴を適宜採用することができる。
【0086】
本明細書において「または」は、文章中に列挙されている事項の「少なくとも１つ以上」を採用できるときに使用される。「もしくは」も同様である。本明細書において「２つの値」の「範囲内」と明記した場合、その範囲には２つの値自体も含む。
本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
【0087】
以上、本開示を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本開示を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本開示を限定する目的で提供したのではない。従って、本開示の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例】
【0088】
以下においては、ネオアンチゲン樹状細胞の作製手順について説明する（図１）。
【0089】
（実施例１：アフェレーシスによる末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ：peripheral blood mononuclear cells）分画の採取）
アフェレーシスのための遠心型血液成分分離装置としては、コムテック（ＣＯＭ．ＴＥＣ）（登録商標）（フレゼニウスカービ）やスペクトラ オプティア（テルモ）等などがある。
アフェレーシスのための遠心型血液成分分離装置としては、コムテック（ＣＯＭ．ＴＥＣ）（登録商標）（フレゼニウスカービ）やスペクトラ オプティア（テルモ）等などがある。
【0090】
右手と左手の肘窩近くの太い静脈（この場所に無い場合は他の場所をさがす）に１８Ｇの針を１本ずつ刺し、片方を採血用、他方を返血用のルートとして確保する。両方のルートを遠心型血液成分分離装置に装着し、被験者（患者）よりＰＢＭＣを採取する。遠心型血液成分分離装置のプログラムは「ＭＮＣ：単核球の採取」を選択する。約１～３時間かけて１×１０８個～１×１０９個以上のＰＢＭＣを採取する。ＰＢＭＣには単球、リンパ球、循環癌細胞（ＣＴＣ）などが含まれ、赤血球、顆粒球、血小板はほとんど含まれない。ＰＢＭＣは一部の血漿とともに遠心型血液成分分離装置に装着された保存用バッグに保存される。
【0091】
ここでは、アフェレーシス条件が、約９～約１２ｍｌのスピルオーバーボリューム、及び／または約７～約１０ｍｌのバフィーコートボリュームが好ましいことが示される。本実施例においては、スピルオーバーボリュームを１０～１１ｍｌで調整し、バフィーコートボリュームを８ｍｌとし、その他の条件は装置における単核球採取用のデフォルト設定で実験を行った。
【0092】
（実施例２：ＰＢＭＣ分画からの樹状細胞の元となる単球の単離）
（１）ＰＢＭＣの分離と播種
複数の５０ｍｌの遠心管にフィコールを２０ｍｌ入れておく。保存用バッグのＰＢＭＣを含む溶液（２０～２５ｍＬ）を遠心管のフィコールに重層する。２０℃，５００Ｇ，３０分で遠心し、ＰＢＭＣが含まれるバフィーコートをピペットで採取して５０ｍｌ遠心管に入れる。ＰＢＳを加えて遠心、上清除去を３から５回繰り返す。最後にＡＩＭ培地を入れ４０ｍｌにする。ＰＢＭＣをサスペンドしたＡＩＭ培地を少量取り、細胞数を算出し、また血液像検査を行い単球の割合を計測する。これらの数値から得られた単球の総数を求める。
（１）ＰＢＭＣの分離と播種
複数の５０ｍｌの遠心管にフィコールを２０ｍｌ入れておく。保存用バッグのＰＢＭＣを含む溶液（２０～２５ｍＬ）を遠心管のフィコールに重層する。２０℃，５００Ｇ，３０分で遠心し、ＰＢＭＣが含まれるバフィーコートをピペットで採取して５０ｍｌ遠心管に入れる。ＰＢＳを加えて遠心、上清除去を３から５回繰り返す。最後にＡＩＭ培地を入れ４０ｍｌにする。ＰＢＭＣをサスペンドしたＡＩＭ培地を少量取り、細胞数を算出し、また血液像検査を行い単球の割合を計測する。これらの数値から得られた単球の総数を求める。
【0093】
最終の単球数が一つのシャーレに１～２×１０７個／６ｍｌとなるように、ＰＢＭＣをサスペンドしたＡＩＭ培地に必要量のＡＩＭ培地を加える。調整したＰＢＭＣを含むＡＩＭ培地を６ｍｌずつシャーレに播き、３０分間インキュベーターに入れる。顕微鏡で底面への細胞の付着を確認してから、上清を除去する。浮遊細胞を含む上清は遠心管に回収しておく。新しいＡＩＭ培地を６ｍｌ加えた後、インキュベーターに入れ、１６～２４時間培養する。
【0094】
（２）ＣＴＣを含む細胞分画の保存
（１）で得られた浮遊細胞を含む上清にはＣＴＣやリンパ球が存在する。この浮遊液の細胞数や生存率を確認する。浮遊液を遠心管に分注した後、遠心分離して上清を取り除く。１～３×１０７個の細胞に対し１ｍｌのセルバンカー（登録商標）を加えピペッティングする。細胞懸濁液をクライオチューブに分注し、ＣＴＣを単離する施設に輸送するまで－８０℃のディープフリーザーで凍結保存する。
（１）で得られた浮遊細胞を含む上清にはＣＴＣやリンパ球が存在する。この浮遊液の細胞数や生存率を確認する。浮遊液を遠心管に分注した後、遠心分離して上清を取り除く。１～３×１０７個の細胞に対し１ｍｌのセルバンカー（登録商標）を加えピペッティングする。細胞懸濁液をクライオチューブに分注し、ＣＴＣを単離する施設に輸送するまで－８０℃のディープフリーザーで凍結保存する。
【0095】
（３）単球の分化誘導
インキュベーターからシャーレを取り出し、培養上清を用いて培養面を洗浄する。洗浄後、洗浄液を除去し、１０ｍＬのＡＩＭ培地またはＰＢＳで洗浄し上清を除去する。最終濃度が５０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－４、５０ｎｇ／ｍｌのＧＭ－ＣＳＦを含有するＡＩＭ培地をシャーレ１枚につき６～８ｍＬずつ加える。その後インキュベーターに入れ、未熟樹状細胞誘導のため５日間培養する。
インキュベーターからシャーレを取り出し、培養上清を用いて培養面を洗浄する。洗浄後、洗浄液を除去し、１０ｍＬのＡＩＭ培地またはＰＢＳで洗浄し上清を除去する。最終濃度が５０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－４、５０ｎｇ／ｍｌのＧＭ－ＣＳＦを含有するＡＩＭ培地をシャーレ１枚につき６～８ｍＬずつ加える。その後インキュベーターに入れ、未熟樹状細胞誘導のため５日間培養する。
【0096】
培養後シャーレをインキュベーターから取り出す。培養上清を除去し、２ｍｌのＡＩＭ培地を添加する。シャーレの底面に張り付いている細胞を、セルスクレイパーを用いて剥離し、未熟樹状細胞懸濁液を遠心管に回収する。４℃，５００ｇ，５分で遠心した後、上清を除去してＡＩＭ培地を加える。複数のシャーレの細胞を一つの遠心管に４０ｍｌ程度にまとめる。未熟樹状細胞懸濁液の細胞数を計測しておく。
【0097】
未熟樹状細胞懸濁液を遠心して上清を捨て、最終細胞濃度が１～２×１０７個／６ｍｌになるように、成熟用培地（最終濃度が１０μｇ／ｍｌのピシバニール、５０ｎｇ／ｍｌのＰＧＥ２、２０μｇ／ｍｌのネオアンチゲンペプチドを含むＡＩＭ培地）を加える。細胞懸濁液を６～１２ｍｌずつシャーレに入れ、インキュベーターで１６～４８時間培養して成熟樹状細胞に誘導する。
【0098】
（４）成熟樹状細胞の回収と凍結保存
培養上清を用いて成熟樹状細胞のシャーレの培養面をピペッティングする。その後、細胞が含まれた培養液を遠心管に回収する。シャーレに１０ｍｌのＡＩＭ培地を加え培養面をピペッティングしてＡＩＭ培地を遠心管に回収する。これを２回繰り返した後、成熟樹状細胞の懸濁液を４℃，５００Ｇ，５分遠心して上清を除去する。２０ｍｌのＡＩＭ培地を加え、セルストレーナーをセットした遠心管に回収する。細胞数を計測した後、この遠心管を４℃，５００Ｇ，５分で遠心し、上清を除去する。最終細胞濃度が１×１０７個／ｍｌになるようにセルバンカー溶液にサスペンドし、クライオチューブに分注する。成熟樹状細胞を患者に接種するまで、クライオチューブは－８０℃のディープフリーザー、あるいは液体窒素タンクで保存する。
培養上清を用いて成熟樹状細胞のシャーレの培養面をピペッティングする。その後、細胞が含まれた培養液を遠心管に回収する。シャーレに１０ｍｌのＡＩＭ培地を加え培養面をピペッティングしてＡＩＭ培地を遠心管に回収する。これを２回繰り返した後、成熟樹状細胞の懸濁液を４℃，５００Ｇ，５分遠心して上清を除去する。２０ｍｌのＡＩＭ培地を加え、セルストレーナーをセットした遠心管に回収する。細胞数を計測した後、この遠心管を４℃，５００Ｇ，５分で遠心し、上清を除去する。最終細胞濃度が１×１０７個／ｍｌになるようにセルバンカー溶液にサスペンドし、クライオチューブに分注する。成熟樹状細胞を患者に接種するまで、クライオチューブは－８０℃のディープフリーザー、あるいは液体窒素タンクで保存する。
【0099】
（実施例３：ＣＴＣの単離）
凍結保存した単球を含まないＰＢＭＣ（ＰＢＭＣ Ｍｏｎｏ－）分画を、ドライアイスを入れたシッパーで解析施設に速やかに搬送する。解析施設では凍結状態で搬送されたＰＢＭＣ Ｍｏｎｏ－分画を解析するまでディープフリーザーあるいは液体窒素タンクで保存する。
凍結保存した単球を含まないＰＢＭＣ（ＰＢＭＣ Ｍｏｎｏ－）分画を、ドライアイスを入れたシッパーで解析施設に速やかに搬送する。解析施設では凍結状態で搬送されたＰＢＭＣ Ｍｏｎｏ－分画を解析するまでディープフリーザーあるいは液体窒素タンクで保存する。
【0100】
解析の際にはまず凍結細胞を３７℃で溶かし、フィルターを用いて凝集細胞を除く。残りの単離細胞を３ｍｌのＰＢＳ Ｂｕｆｆｅｒに浮遊させ、細胞数を計測する。ＣＴＣ採取用に用いるモノクローナル抗体は、抗ＥｐＣＡＭ抗体（上皮系細胞のマーカー）、抗Ｖｉｍｅｎｔｉｎ抗体、抗Ｎ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ抗体（上皮間葉転換、Mesenchymal Epithelial Transition：ＥＭＴのマーカー）、抗ＣＤ２０抗体（悪性リンパ腫のマーカー）
を含めた、癌腫あるいは肉腫に適切なものを１つ以上選択する。対照のリンパ球についてはＣＤ４５抗体を用いる。それぞれの抗体はＦＩＴＣやＰＥを含む蛍光物質でラベルしておく。抗体は５～１０μｇ／ｍｌ（０．１～１００μｇ）の濃度でＣＴＣに作用させる。その後セルソーター（ＳＯＮＹ ＳＨ８００）を用いてＣＴＣとコントロール細胞（ＣＤ４５陽性細胞）をソーティングする。
を含めた、癌腫あるいは肉腫に適切なものを１つ以上選択する。対照のリンパ球についてはＣＤ４５抗体を用いる。それぞれの抗体はＦＩＴＣやＰＥを含む蛍光物質でラベルしておく。抗体は５～１０μｇ／ｍｌ（０．１～１００μｇ）の濃度でＣＴＣに作用させる。その後セルソーター（ＳＯＮＹ ＳＨ８００）を用いてＣＴＣとコントロール細胞（ＣＤ４５陽性細胞）をソーティングする。
【0101】
ソーティングの例
ソート元細胞数：１×１０７細胞
ＰＢＳ Ｂｕｆｆｅｒ（２ｍＭ ＥＤＴＡ，２％ ＦＢＳ）…４８５μｌ
ＣＤ４５ ＰＥ（２００μｇ／ｍｌ）……………………………１０μｌ
ＥｐＣＡＭ ＦＩＴＣ （１ｍｇ／ｍｌ）………………………５μｌ
５００μｌ
ソート元細胞数：１×１０７細胞
ＰＢＳ Ｂｕｆｆｅｒ（２ｍＭ ＥＤＴＡ，２％ ＦＢＳ）…４８５μｌ
ＣＤ４５ ＰＥ（２００μｇ／ｍｌ）……………………………１０μｌ
ＥｐＣＡＭ ＦＩＴＣ （１ｍｇ／ｍｌ）………………………５μｌ
５００μｌ
【0102】
【0103】
ＤＮＡ抽出は以下のとおりに行った。
ＱＩａｍｐ（登録商標） ＤＮＡ ＭｉｎｉによるＤＮＡ抽出
２０μｌ Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋを１．５ｍｌマイクロチューブに入れる。ＰＢＳ２００μｌで懸濁したサンプルをこのチューブに添加する。さらに２００μｌ Ｂｕｆｆｅｒ ＡＬを添加しボルテックスで十分に混和する。５６℃で１０分間インキュベートし、その後スピンダウンしてフタの内側についた溶液を回収する。１００％ エタノールを２００μｌ添加し、ボルテックスで十分に混和する。ＱＩａｍｐ Ｍｉｎｉ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎにサンプルを添加し、フタを閉めて６，０００ｇで１分間遠心する。ろ液とコレクションチューブは捨て、新しいコレクションチューブをつける。５００μｌ Ｂｕｆｆｅｒ ＡＷ１を添加する。フタを閉めて６，０００ｇで１分間遠心する。５００μｌ Ｂｕｆｆｅｒ ＡＷ２を添加する。フタを閉めて１２，０００ｇで３分間遠心する。ろ液を捨てて１２，０００ｇで１分間遠心する。ＱＩａｍｐ Ｍｉｎｉ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎを新しい１．５ｍｌ マイクロチューブに移す。１００μｌ Ｂｕｆｆｅｒ ＡＥを添加して室温で１分間インキュベートする。６，０００ｇで１分間遠心する。Ｏ．Ｄを測定し、抽出したＤＮＡを－８０℃で保存する。
ＱＩａｍｐ（登録商標） ＤＮＡ ＭｉｎｉによるＤＮＡ抽出
２０μｌ Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋを１．５ｍｌマイクロチューブに入れる。ＰＢＳ２００μｌで懸濁したサンプルをこのチューブに添加する。さらに２００μｌ Ｂｕｆｆｅｒ ＡＬを添加しボルテックスで十分に混和する。５６℃で１０分間インキュベートし、その後スピンダウンしてフタの内側についた溶液を回収する。１００％ エタノールを２００μｌ添加し、ボルテックスで十分に混和する。ＱＩａｍｐ Ｍｉｎｉ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎにサンプルを添加し、フタを閉めて６，０００ｇで１分間遠心する。ろ液とコレクションチューブは捨て、新しいコレクションチューブをつける。５００μｌ Ｂｕｆｆｅｒ ＡＷ１を添加する。フタを閉めて６，０００ｇで１分間遠心する。５００μｌ Ｂｕｆｆｅｒ ＡＷ２を添加する。フタを閉めて１２，０００ｇで３分間遠心する。ろ液を捨てて１２，０００ｇで１分間遠心する。ＱＩａｍｐ Ｍｉｎｉ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎを新しい１．５ｍｌ マイクロチューブに移す。１００μｌ Ｂｕｆｆｅｒ ＡＥを添加して室温で１分間インキュベートする。６，０００ｇで１分間遠心する。Ｏ．Ｄを測定し、抽出したＤＮＡを－８０℃で保存する。
【0104】
抽出された４症例のＣＴＣのＤＮＡ
ＤＮＡの抽出はＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標） Ｂｌｏｏｄ Ｌ （ＴＡＫＡＲＡ）でも可能である。
ＤＮＡの抽出はＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標） Ｂｌｏｏｄ Ｌ （ＴＡＫＡＲＡ）でも可能である。
【0105】
採取されたそれぞれの細胞群は遠心して上清を除去した後、３５０μｌのＲＬＴバッファー溶液（Ｂｕｆｆｅｒ ＲＬＴ Ｐｌｕｓ （ＱＩＡＧＥＮ） １ｍｌ、β－ＭＥ（会社名カタログ番号）１０μｌ）にサスペンドする。
【0106】
（実施例４：ＣＴＣからのＲＮＡの抽出（ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ：ＱＩＡＧＥＮ））
ＣＴＣおよびＣＤ４５＋細胞が入ったＲＬＴバッファー溶液をgDNA Eliminator spin
columnに作用させ、遠心して採取した溶液に３５０μｌの７０％エタノールを添加する。その後Rneasy Min Elute spin columnに作用させ、遠心して採取した溶液にバッファーＲＷ１ ７００μｌ添加遠心する。その後、バッファーＲＰＥ ５００μｌ、８０％エタノール ５００μｌ、Ｒｎａｓｅ－ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ １４μｌでそれぞれＲＷ１と同様の処理を行い、最終的にＲＮＡを抽出する。ＲＮＡ量はNANO DROP ONE(Thermo SCIENTIFIC)を用いて測定する。
ＣＴＣおよびＣＤ４５＋細胞が入ったＲＬＴバッファー溶液をgDNA Eliminator spin
columnに作用させ、遠心して採取した溶液に３５０μｌの７０％エタノールを添加する。その後Rneasy Min Elute spin columnに作用させ、遠心して採取した溶液にバッファーＲＷ１ ７００μｌ添加遠心する。その後、バッファーＲＰＥ ５００μｌ、８０％エタノール ５００μｌ、Ｒｎａｓｅ－ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ １４μｌでそれぞれＲＷ１と同様の処理を行い、最終的にＲＮＡを抽出する。ＲＮＡ量はNANO DROP ONE(Thermo SCIENTIFIC)を用いて測定する。
【0107】
抽出されたＲＮＡの例を以下の表２に示す。
【表2】
【0108】
ＲＮＡ抽出は上記方法以外に、キアゾール、トリゾールを用いても可能である。またＣＴＣからは下記の方法でＤＮＡも抽出可能である。
【0109】
ＣＴＣから抽出したＤＮＡの全エクソーム解析は以下のようにして行った。
サンプル（ｔｏｔａｌ ＤＮＡ）
↓
エクソン領域の濃縮化、シーケンスライブラリ作製（Ａｇｉｌｅｎｔ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ Ａｌｌ Ｅｘｏｎ、ＩＤＴ ｘＧｅｎ社エクソームキット）
↓
シーケンシング（ＮｏｖａＳｅｑ ６０００システム、イルミナ社）
↓
マッピング（ＧＥＭ、Ｓｕｂｒｅａｄ、ＨＩＳＡＴ ／ ＨＩＳＡＴ２、ＫＡＲＴ）
↓
バリアントコール（ＧＡＴＡＣ）
↓
結果（ｖｃｆファイル作成）
サンプル（ｔｏｔａｌ ＤＮＡ）
↓
エクソン領域の濃縮化、シーケンスライブラリ作製（Ａｇｉｌｅｎｔ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ Ａｌｌ Ｅｘｏｎ、ＩＤＴ ｘＧｅｎ社エクソームキット）
↓
シーケンシング（ＮｏｖａＳｅｑ ６０００システム、イルミナ社）
↓
マッピング（ＧＥＭ、Ｓｕｂｒｅａｄ、ＨＩＳＡＴ ／ ＨＩＳＡＴ２、ＫＡＲＴ）
↓
バリアントコール（ＧＡＴＡＣ）
↓
結果（ｖｃｆファイル作成）
【0110】
ＣＴＣ及びコントロール細胞のｔｏｔａｌ ＤＮＡからＡｇｉｌｅｎｔ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ Ａｌｌ Ｅｘｏｎキットを用いて、全エクソームシーケンス解析用ライブラリを作製する。作製されたシーケンスライブラリの品質検査を、Ａｇｉｌｅｎｔ社ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎを用いて実施する。品質検査の結果、シーケンスライブラリが問題なく作製されたことを確認する。
【0111】
次いでシーケンシングをイルミナ社ＮｏｖａＳｅｑ ６０００により行う。
【0112】
引き続きマッピング、発現差異解析、バリアントコールを行う。シーケンスで得られたリードを、ＧＥＭ（Ｍａｒｃｏ－Ｓｏｌａ、ｅｔ ａｌ、２０１２）を用いてマッピングする。マッピングはＳｕｂｒｅａｄ（Ｌｉａｏ、ｅｔ ａｌ、 ２０１３）、ＨＩＳＡＴ ／ ＨＩＳＡＴ２（Ｋｉｍ、ｅｔ ａｌ、２０１５）、あるいはＫＡＲＴ（Ｌｉｎ ａｎｄ Ｈｓｕ、２０１７）でも可能である。次にＨＴＳｅｑによりマップされたリード数をカウントし、遺伝子発現解析を実施する。マップ結果からＴｈｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｔｏｏｌｋｉｔ （ＧＡＴＫ）“ＨａｐｌｏｔｙｐｅＣａｌｌｅｒ”（Ｖｅｒｓｉｏｎ：４．０．１０．１）を用いてバリアントコールし、ｖｃｆファイルを作成する。
【0113】
（実施例５：ＣＴＣから抽出したＲＮＡのシーケンス）
・ＲＮＡのシーケンスの流れ
サンプル（ｔｏｔａｌ ＲＮＡ）
↓
シーケンスライブラリ作製（NEB rRNA depletion and TruSeq Stranded mRNA library）
↓
シーケンシング（HiSeq2500, 50-base paired-end）
↓
リードのフィルタリング、トリミング（ｍｏｉｒａｉ）
↓
マッピング（ＳＴＡＲ）
↓
マッピング（ＨＴＳｅｑ，ｅｇｄｅＲ）
↓
バリアントコール（ＧＡＴＫ ＨａｐｌｏｔｙｐｅＣａｌｌｅｒ）
↓
結果（ｖｃｆファイル作成）
・ＲＮＡのシーケンスの流れ
サンプル（ｔｏｔａｌ ＲＮＡ）
↓
シーケンスライブラリ作製（NEB rRNA depletion and TruSeq Stranded mRNA library）
↓
シーケンシング（HiSeq2500, 50-base paired-end）
↓
リードのフィルタリング、トリミング（ｍｏｉｒａｉ）
↓
マッピング（ＳＴＡＲ）
↓
マッピング（ＨＴＳｅｑ，ｅｇｄｅＲ）
↓
バリアントコール（ＧＡＴＫ ＨａｐｌｏｔｙｐｅＣａｌｌｅｒ）
↓
結果（ｖｃｆファイル作成）
【0114】
ＣＴＣ及びコントロール細胞のｔｏｔａｌ ＲＮＡからＮＥＢ社 ｒＲＮＡ ｄｅｐｌｅｉｏｎ ｋｉｔを用いてリボゾーマルＲＮＡを除去したのち、イルミナ社TruSeq Stranded mRNA Sample Prep Kitを用いて、ＲＮＡ－Ｓｅｑライブラリを作製する。作製
されたシーケンスライブラリの品質検査をＡｇｉｌｅｎｔ社ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎを用いて実施し、ｑＰＣＲにより定量する。品質検査の結果、シーケンスライブラリが問題なく作製されたことを確認し、５－ｐｌｅｘ ＲＮＡ－Ｓｅｑライブラリを作製する。
されたシーケンスライブラリの品質検査をＡｇｉｌｅｎｔ社ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎを用いて実施し、ｑＰＣＲにより定量する。品質検査の結果、シーケンスライブラリが問題なく作製されたことを確認し、５－ｐｌｅｘ ＲＮＡ－Ｓｅｑライブラリを作製する。
【0115】
次いでシーケンシングとベースコーリングを行う。ＨｉＳｅｑ２５００のRapid Run Modeのフローセルを使用し、ｉｎｄｅｘ毎にリードを仕分ける。Ｔｏｔａｌ ｙｉｅｌｄ、Ｑ３０ともに問題ないことを確認する。
【0116】
引き続きマッピング、発現差異解析、バリアントコールを行う。シーケンスで得られたリードを、ＳＴＡＲを用いたｍｏｉｒａｉパイプライン(Hasegawa A et al, 2014)によりヒト標準配列ｈｇ３８にマッピングする。次にＨＴＳｅｑによりマップされたリード数をカウントし、ｅｄｇｅＲにより遺伝子発現解析を実施する。マップ結果からThe Genome Analysis Toolkit (GATK) "HaplotypeCaller" (Version:4.0.10.1)を用いてバ
リアントコールし、ｖｃｆファイルを作成する。
リアントコールし、ｖｃｆファイルを作成する。
【0117】
（実施例６：ｉｎ ｓｉｌｉｃｏでのネオアンチゲンの同定）
ＣＴＣとコントロール細胞のＲＮＡシーケンスのｖｃｆファイルによりｉｎ ｓｉｌｉｃｏでネオアンチゲンを同定し、その中からＴ細胞の反応があると予測されるものを選択する。解析にはＮｅｔＭＨＣ、ＭＨＣｆｌｕｒｒｙ、ＯｐｅｎＶａｘ、Ｎｅｏａｎｔｉｍｏｎを含むソフトウエアを使用する。選択されたネオアンチゲンのＨＬＡクラスＩ、及びクラスＩＩへの結合ペプチド構造を決定し、それぞれのＨＬＡに対する親和性を予測する。ＨＬＡ分子への親和性が高いペプチドを作製し（コスモバイオ株式会社、タカラバイオ株式会社などのペプチド合成会社に依頼）、ＩＩの（３）の樹状細胞に投与する。投与するペプチドはＨＬＡクラスＩペプチド、ＨＬＡクラスＩペプチド＋クラスＩＩペプチド、あるいはＨＬＡクラスＩとクラスＩＩを含むロングペプチドのいずれでも良い。
ＣＴＣとコントロール細胞のＲＮＡシーケンスのｖｃｆファイルによりｉｎ ｓｉｌｉｃｏでネオアンチゲンを同定し、その中からＴ細胞の反応があると予測されるものを選択する。解析にはＮｅｔＭＨＣ、ＭＨＣｆｌｕｒｒｙ、ＯｐｅｎＶａｘ、Ｎｅｏａｎｔｉｍｏｎを含むソフトウエアを使用する。選択されたネオアンチゲンのＨＬＡクラスＩ、及びクラスＩＩへの結合ペプチド構造を決定し、それぞれのＨＬＡに対する親和性を予測する。ＨＬＡ分子への親和性が高いペプチドを作製し（コスモバイオ株式会社、タカラバイオ株式会社などのペプチド合成会社に依頼）、ＩＩの（３）の樹状細胞に投与する。投与するペプチドはＨＬＡクラスＩペプチド、ＨＬＡクラスＩペプチド＋クラスＩＩペプチド、あるいはＨＬＡクラスＩとクラスＩＩを含むロングペプチドのいずれでも良い。
【0118】
Ｎｅｏａｎｔｉｍｏｎは東京大学医科学研究所で開発されたオープンプログラムであるが、環境（Ｍａｃ／Ｌｉｎｕｘ）において、がん細胞に特異的なネオアンチゲン同定のためのソフトウエアである。入力ファイルとして、変異解析プログラムにより作られたｖｃｆファイルを用いることが可能であり、一塩基変異（ＳＮＶ）や挿入欠失（Ｉｎｄｅｌ）、構造多型（ＳＶ）などから生成され得る変異ペプチド断片とＨＬＡの親和性を網羅的に計算し、抗原掲示能力の高いペプチド（ネオアンチゲン）を抽出することが可能である（https://github.com/hase62/Neoantimon）。
【0119】
以下の表３及び４に大腸癌症例におけるネオアンチゲンの同定結果を示す。
（１）体細胞変異
（２）同定されたネオアンチゲン（列Neoantigenに記載される配列ついて、上から順に配列番号１～２２）
（１）体細胞変異
【表3】
（２）同定されたネオアンチゲン（列Neoantigenに記載される配列ついて、上から順に配列番号１～２２）
【表4】
【0120】
（実施例７：パルス細胞の製造までのフロー）
ネオアンチゲン－ＤＣ製造工程フローを以下に示す。
ネオアンチゲン－ＤＣ製造工程フローを以下に示す。
【0121】
（Ａ）ショートペプチドの場合
5．凍結培地調製及び試薬類分注
5.1．凍結培地調製
5.1.1. ＤＣＭの総細胞数を基に凍結培地の必要量及び培地、ＤＭＳＯ、アルブミンの各使用量を算定する。
5.1.2. 遠心管に算定量の培地を量り取る。
5.1.3. 量り取った培地に算定量のＤＭＳＯを加え、５回以上転倒混和する。
5.1.4. 5.1.3.に算定量のアルブミンを加え、５回以上転倒混和する。
5.1.5. 調製した凍結培地と等量の培地を遠心管に量りとる。
5.1.6. 凍結培地及び培地を使用直前まで４℃設定の保冷庫で保管する。
5．凍結培地調製及び試薬類分注
5.1．凍結培地調製
5.1.1. ＤＣＭの総細胞数を基に凍結培地の必要量及び培地、ＤＭＳＯ、アルブミンの各使用量を算定する。
5.1.2. 遠心管に算定量の培地を量り取る。
5.1.3. 量り取った培地に算定量のＤＭＳＯを加え、５回以上転倒混和する。
5.1.4. 5.1.3.に算定量のアルブミンを加え、５回以上転倒混和する。
5.1.5. 調製した凍結培地と等量の培地を遠心管に量りとる。
5.1.6. 凍結培地及び培地を使用直前まで４℃設定の保冷庫で保管する。
【0122】
5.2. ＤＭＳＯ分注
ＤＭＳＯで溶解する抗原を使用する場合のみＤＭＳＯの分注を行う。ただし、既にＤＭＳＯ溶解済みの抗原（分注したもの等）を同時に使用する場合は本操作は不要。
5.2.1. 注射針を装着したシリンジを用いて、ＤＭＳＯを０．５ｍＬ程度サンプルチューブに量り取る。
5.2.2. 使用直前まで室温で保管する。
ＤＭＳＯで溶解する抗原を使用する場合のみＤＭＳＯの分注を行う。ただし、既にＤＭＳＯ溶解済みの抗原（分注したもの等）を同時に使用する場合は本操作は不要。
5.2.1. 注射針を装着したシリンジを用いて、ＤＭＳＯを０．５ｍＬ程度サンプルチューブに量り取る。
5.2.2. 使用直前まで室温で保管する。
【0123】
5.3. 生理食塩水及び蒸留水分注
生理食塩水及び蒸留水で溶解する抗原を使用する場合のみ分注を行う。ただし分注品を使用する場合、本操作は不要。
5.3.1. 生理食塩水及び蒸留水溶のボトルの蓋をアルコール綿で清拭し開封する。
5.3.2. 任意の量をサンプルチューブに量り取る。
5.3.2. 使用直前まで４℃設定の保冷庫で保管する。
生理食塩水及び蒸留水で溶解する抗原を使用する場合のみ分注を行う。ただし分注品を使用する場合、本操作は不要。
5.3.1. 生理食塩水及び蒸留水溶のボトルの蓋をアルコール綿で清拭し開封する。
5.3.2. 任意の量をサンプルチューブに量り取る。
5.3.2. 使用直前まで４℃設定の保冷庫で保管する。
【0124】
6. 手順
6.1. 成熟樹状細胞回収
6.1.1. ＤＣＭ終了からの経過時間が１２時間以上３６時間以内である事を確認する。
6.1.2. インキュベータからシャーレを取り出し、作業エリアに搬入する。
※シャーレの内１枚、又は観察用シャーレを検鏡する。検鏡した観察用シャーレは破棄する。
※シャーレは原則５枚１組として扱い、１組毎に全てのシャーレに対して下記6.1.3.～6.1.8.の操作を行う。
6.1.3. ピペットを用いて、シャーレ内の細胞を培養上清ごと５０ｍＬ遠心管に回収する。
ＤＣＭ時に各抗原でパルスを実施した細胞と、実施していない細胞で遠心管を分ける。
（以下作業、各細胞毎に遠心管を分け、混合しないようにする。）
6.1.4. ペットを用いて、５～１０ｍＬの培地でシャーレ底面を満遍なく洗浄し、５０ｍＬ遠心管に回収する。
6.1.5. ピペットを用いて、シャーレに培地を１～２ｍＬ分注する。
6.1.6. シャーレ底面に満遍なくセルスクレーパーをかける。
6.1.7. ピペットを用いて、シャーレから細胞懸濁液を５０ｍＬ遠心管に回収する。
6.1.8. ピペットを用いて、５～１０ｍＬの培地でシャーレ底面を満遍なく洗浄し、５０ｍＬ遠心管に回収する。
6.1.9. 上記6.1.8.の操作を必要回数行う。
6.1.10. 遠心分離する。
設定条件：５００Ｇ ５ｍｉｎ ４℃
6.1.11. 抗原パルスがある場合は手順「6.2.抗原パルス」、抗原パルスがない場合は手
順「6.3.細胞凍結」に進む。
6.1. 成熟樹状細胞回収
6.1.1. ＤＣＭ終了からの経過時間が１２時間以上３６時間以内である事を確認する。
6.1.2. インキュベータからシャーレを取り出し、作業エリアに搬入する。
※シャーレの内１枚、又は観察用シャーレを検鏡する。検鏡した観察用シャーレは破棄する。
※シャーレは原則５枚１組として扱い、１組毎に全てのシャーレに対して下記6.1.3.～6.1.8.の操作を行う。
6.1.3. ピペットを用いて、シャーレ内の細胞を培養上清ごと５０ｍＬ遠心管に回収する。
ＤＣＭ時に各抗原でパルスを実施した細胞と、実施していない細胞で遠心管を分ける。
（以下作業、各細胞毎に遠心管を分け、混合しないようにする。）
6.1.4. ペットを用いて、５～１０ｍＬの培地でシャーレ底面を満遍なく洗浄し、５０ｍＬ遠心管に回収する。
6.1.5. ピペットを用いて、シャーレに培地を１～２ｍＬ分注する。
6.1.6. シャーレ底面に満遍なくセルスクレーパーをかける。
6.1.7. ピペットを用いて、シャーレから細胞懸濁液を５０ｍＬ遠心管に回収する。
6.1.8. ピペットを用いて、５～１０ｍＬの培地でシャーレ底面を満遍なく洗浄し、５０ｍＬ遠心管に回収する。
6.1.9. 上記6.1.8.の操作を必要回数行う。
6.1.10. 遠心分離する。
設定条件：５００Ｇ ５ｍｉｎ ４℃
6.1.11. 抗原パルスがある場合は手順「6.2.抗原パルス」、抗原パルスがない場合は手
順「6.3.細胞凍結」に進む。
【0125】
6.2. 抗原パルス
ＤＣＭでパルスを実施していない細胞のみ行う。
6.2.1. 遠心分離終了後、上清を除去する。
6.2.2. タッピングでペレットを崩す。
6.2.3. ピペットを用いて、５～２０ｍＬの培地で遠心管の各細胞を１本の５０ｍＬ遠心管（以下「遠心管１」）にまとめる。
※遠心機に温度調節機能がない場合、遠心管１は低接着遠心管の使用が推奨される。
6.2.4. 細胞回収後の遠心管を培地で洗いながら遠心管１にまとめ、４０ｍＬ程度にメスアップする。（細胞懸濁液１）
※細胞数算定のため液量を量る。
6.2.5. ５回以上転倒混和した後、マイクロピペットを用いてマイクロチューブに５０μＬ採取する。
6.2.6. トリパンブルー染色液で２～２０倍に希釈し、血球計算盤を用いて生細胞数及び死細胞数をカウントする。
6.2.7. カウント数から総生細胞数を算出する。
6.2.8. 算出した総細胞数を基に、培地及び抗原の各使用量を算定する。
6.2.9. 抗原をパルスする際、２ｍｇ／ｍＬとなるよう指定の溶媒で溶解する。
6.2.10. 遠心管に算定量の培地を量り取る。（使用する抗原の種類数、準備する。）
6.2.11. 各量り取った培地から５ｍＬ程度採取し、算定量の各抗原を溶解する。
6.2.12. 6.2.11をシリンジフィルターに通して6.2.10.の培地に添加する（「以下ペプチド添加培地」）。
6.2.13. 細胞懸濁液１を、使用抗原の種類数に遠心管に分注し、遠心分離する。
設定条件：５００Ｇ ５ｍｉｎ ４℃
6.2.14. 遠心分離終了後、５０ｍＬ試験管に上清を回収する。
6.2.15. 回収した上清をサンプルチューブに１ｍＬ採取し、工程参考品とする。
（各遠心管から採取し、一つにまとめて良い）
6.2.16. タッピングでペレットを崩し、各ペプチド添加培地を加え懸濁する。
6.2.17. インキュベータに入れ、３０～６０分静置する。
設定条件：３７℃
6.2.18. 遠心分離する。
設定条件：５００Ｇ ５ｍｉｎ ４℃
ＤＣＭでパルスを実施していない細胞のみ行う。
6.2.1. 遠心分離終了後、上清を除去する。
6.2.2. タッピングでペレットを崩す。
6.2.3. ピペットを用いて、５～２０ｍＬの培地で遠心管の各細胞を１本の５０ｍＬ遠心管（以下「遠心管１」）にまとめる。
※遠心機に温度調節機能がない場合、遠心管１は低接着遠心管の使用が推奨される。
6.2.4. 細胞回収後の遠心管を培地で洗いながら遠心管１にまとめ、４０ｍＬ程度にメスアップする。（細胞懸濁液１）
※細胞数算定のため液量を量る。
6.2.5. ５回以上転倒混和した後、マイクロピペットを用いてマイクロチューブに５０μＬ採取する。
6.2.6. トリパンブルー染色液で２～２０倍に希釈し、血球計算盤を用いて生細胞数及び死細胞数をカウントする。
6.2.7. カウント数から総生細胞数を算出する。
6.2.8. 算出した総細胞数を基に、培地及び抗原の各使用量を算定する。
6.2.9. 抗原をパルスする際、２ｍｇ／ｍＬとなるよう指定の溶媒で溶解する。
6.2.10. 遠心管に算定量の培地を量り取る。（使用する抗原の種類数、準備する。）
6.2.11. 各量り取った培地から５ｍＬ程度採取し、算定量の各抗原を溶解する。
6.2.12. 6.2.11をシリンジフィルターに通して6.2.10.の培地に添加する（「以下ペプチド添加培地」）。
6.2.13. 細胞懸濁液１を、使用抗原の種類数に遠心管に分注し、遠心分離する。
設定条件：５００Ｇ ５ｍｉｎ ４℃
6.2.14. 遠心分離終了後、５０ｍＬ試験管に上清を回収する。
6.2.15. 回収した上清をサンプルチューブに１ｍＬ採取し、工程参考品とする。
（各遠心管から採取し、一つにまとめて良い）
6.2.16. タッピングでペレットを崩し、各ペプチド添加培地を加え懸濁する。
6.2.17. インキュベータに入れ、３０～６０分静置する。
設定条件：３７℃
6.2.18. 遠心分離する。
設定条件：５００Ｇ ５ｍｉｎ ４℃
【0126】
6.3. 細胞凍結
6.3.1. 遠心分離終了後、上清を除去する。
6.3.2. タッピングでペレットを除去する。
6.3.3. ピペットを用いて、各細胞を培地で洗いながらセルストレーナーをセットした５０ｍＬ遠心管にまとめ、４０ｍＬ程度にメスアップする（以下「細胞懸濁液２」）。
※細胞数算定のため液量を量る。
6.3.4. ５回以上転倒混和した後、マイクロピペットを用いてマイクロチューブに細胞懸濁液２を５０μＬ採取する。
6.3.5. トリパンブルー染色液で２～２０倍に希釈し、血球計算盤を用いて生細胞数及び死細胞数をカウントする。
6.3.6. カウント数から生細胞数を算出する。
6.3.7. 算出した総細胞数を基に、凍結本数及び培地並びに凍結培地使用量を算定する。6.3.8. 凍結保管用チューブを算定本数用意する。
6.3.9. 細胞懸濁液２を遠心分離する。
設定条件：５００Ｇ ５ｍｉｎ ４℃
6.3.10. 遠心分離終了後、５０ｍＬ遠心管に上清を回収する。
6.3.11. 回収した上清を安全性試験のために分注する。（各遠心管から採取し、一つに
まとめて良い）
6.3.12. タッピングでペレットを崩す。
6.3.13. 培地で細胞を懸濁し、6.3.7.で算定した「培地使用量」に合せる
6.3.14. 一番細胞数が多いワクチンから、フローサイトメトリー解析検体と製品参考品
の検体を採取する。マイクロピペットを用いて、6.3.13.の懸濁液を０．１ｍＬずつ２本
の凍結保管用チューブに採取し、それぞれに０．４ｍＬの培地、０．５ｍＬの凍結培地を加えて懸濁する。
6.3.15. 6.3.13.の懸濁液に、6.3.7.で算定した「凍結培地使用量」の凍結培地を添加し、緩やかにピペッティングして混和する。
6.3.16. 異物検査を実施する。
6.3.17. 凍結保管用チューブに１ｍＬずつ、全量を分注する。
6.3.18. バイセルに凍結保管用チューブを入れ、－８０℃設定のフリーザに静置する。
6.3.19. バイセルを－８０℃設定のフリーザに静置後、３時間以上３６時間以内に凍結
細胞を－１３５℃以下設定のフリーザ又は液体窒素保存容器に移動する。
6.3.1. 遠心分離終了後、上清を除去する。
6.3.2. タッピングでペレットを除去する。
6.3.3. ピペットを用いて、各細胞を培地で洗いながらセルストレーナーをセットした５０ｍＬ遠心管にまとめ、４０ｍＬ程度にメスアップする（以下「細胞懸濁液２」）。
※細胞数算定のため液量を量る。
6.3.4. ５回以上転倒混和した後、マイクロピペットを用いてマイクロチューブに細胞懸濁液２を５０μＬ採取する。
6.3.5. トリパンブルー染色液で２～２０倍に希釈し、血球計算盤を用いて生細胞数及び死細胞数をカウントする。
6.3.6. カウント数から生細胞数を算出する。
6.3.7. 算出した総細胞数を基に、凍結本数及び培地並びに凍結培地使用量を算定する。6.3.8. 凍結保管用チューブを算定本数用意する。
6.3.9. 細胞懸濁液２を遠心分離する。
設定条件：５００Ｇ ５ｍｉｎ ４℃
6.3.10. 遠心分離終了後、５０ｍＬ遠心管に上清を回収する。
6.3.11. 回収した上清を安全性試験のために分注する。（各遠心管から採取し、一つに
まとめて良い）
6.3.12. タッピングでペレットを崩す。
6.3.13. 培地で細胞を懸濁し、6.3.7.で算定した「培地使用量」に合せる
6.3.14. 一番細胞数が多いワクチンから、フローサイトメトリー解析検体と製品参考品
の検体を採取する。マイクロピペットを用いて、6.3.13.の懸濁液を０．１ｍＬずつ２本
の凍結保管用チューブに採取し、それぞれに０．４ｍＬの培地、０．５ｍＬの凍結培地を加えて懸濁する。
6.3.15. 6.3.13.の懸濁液に、6.3.7.で算定した「凍結培地使用量」の凍結培地を添加し、緩やかにピペッティングして混和する。
6.3.16. 異物検査を実施する。
6.3.17. 凍結保管用チューブに１ｍＬずつ、全量を分注する。
6.3.18. バイセルに凍結保管用チューブを入れ、－８０℃設定のフリーザに静置する。
6.3.19. バイセルを－８０℃設定のフリーザに静置後、３時間以上３６時間以内に凍結
細胞を－１３５℃以下設定のフリーザ又は液体窒素保存容器に移動する。
【0127】
（Ｂ）ロングペプチドの場合
5．試薬分注
5.1.ＤＭＳＯ分注
必要に応じて、ＤＭＳＯ分注を行う。
5.1.1. 注射針を装着したシリンジを用いてＤＭＳＯを適量サンプルチューブに量り取る。
5.1.2. 使用直前まで室温で保管する。
5．試薬分注
5.1.ＤＭＳＯ分注
必要に応じて、ＤＭＳＯ分注を行う。
5.1.1. 注射針を装着したシリンジを用いてＤＭＳＯを適量サンプルチューブに量り取る。
5.1.2. 使用直前まで室温で保管する。
【0128】
5.2.蒸留水または生理食塩水分注
必要に応じて、蒸留水または生理食塩水分注を行う。
5.2.1. 蒸留水または生理食塩水を適量サンプルチューブに量り取る。
5.2.2. 使用直前まで４℃設定の保冷庫で保管する。
必要に応じて、蒸留水または生理食塩水分注を行う。
5.2.1. 蒸留水または生理食塩水を適量サンプルチューブに量り取る。
5.2.2. 使用直前まで４℃設定の保冷庫で保管する。
【0129】
6. 手順
6.1. 未成熟樹状細胞回収
6.1.1. インキュベータからシャーレを取り出し、作業エリアに搬入する。
※ シャーレの内１枚、又は観察用シャーレを検鏡する。検鏡した観察用シャーレは破棄する。
※ シャーレは原則５枚１組として扱い、１組毎に全てのシャーレに対して下記6.1.2.～6.1.8.の操作を行う。
6.1.2. ピペットを用いて、シャーレ内の細胞を培養上清ごと５０ｍＬ遠心管に回収する。
6.1.3. ピペットを用いて、５～１０ｍＬの培地でシャーレ底面を満遍なく洗浄し、５０ｍＬ遠心管に回収する。
6.1.4. ピペットを用いて、シャーレに培地を１～２ｍＬ分注する。
6.1.5. シャーレ底面に満遍なくセルスクレーパーをかける。
6.1.6. ピペットを用いて、シャーレから細胞懸濁液を５０ ｍＬ遠心管に回収する。
6.1.7. ピペットを用いて、５～１０ｍＬの培地でシャーレ底面を満遍なく洗浄し、５０ｍＬ遠心管に回収する。
6.1.8. 上記6.1.7.の操作を必要回数行う。
6.1.9. 遠心分離する。
設定条件：５００Ｇ ５ｍｉｎ ４℃
6.1.10. 遠心分離終了後、上清を除去し、タッピングでペレットを崩す。
6.1.11. ピペットを用いて、５～２０ｍＬの培地で各遠心管の細胞を１本の５０ｍＬ遠
心管（以下「遠心管１」）にまとめる。
6.1.12. 細胞回収後の各遠心管を培地で洗いながら遠心管１にまとめ、４０ｍＬ程度に
メスアップする（以下「細胞懸濁液１」）。
※細胞数算定のため液量を量る。
6.1. 未成熟樹状細胞回収
6.1.1. インキュベータからシャーレを取り出し、作業エリアに搬入する。
※ シャーレの内１枚、又は観察用シャーレを検鏡する。検鏡した観察用シャーレは破棄する。
※ シャーレは原則５枚１組として扱い、１組毎に全てのシャーレに対して下記6.1.2.～6.1.8.の操作を行う。
6.1.2. ピペットを用いて、シャーレ内の細胞を培養上清ごと５０ｍＬ遠心管に回収する。
6.1.3. ピペットを用いて、５～１０ｍＬの培地でシャーレ底面を満遍なく洗浄し、５０ｍＬ遠心管に回収する。
6.1.4. ピペットを用いて、シャーレに培地を１～２ｍＬ分注する。
6.1.5. シャーレ底面に満遍なくセルスクレーパーをかける。
6.1.6. ピペットを用いて、シャーレから細胞懸濁液を５０ ｍＬ遠心管に回収する。
6.1.7. ピペットを用いて、５～１０ｍＬの培地でシャーレ底面を満遍なく洗浄し、５０ｍＬ遠心管に回収する。
6.1.8. 上記6.1.7.の操作を必要回数行う。
6.1.9. 遠心分離する。
設定条件：５００Ｇ ５ｍｉｎ ４℃
6.1.10. 遠心分離終了後、上清を除去し、タッピングでペレットを崩す。
6.1.11. ピペットを用いて、５～２０ｍＬの培地で各遠心管の細胞を１本の５０ｍＬ遠
心管（以下「遠心管１」）にまとめる。
6.1.12. 細胞回収後の各遠心管を培地で洗いながら遠心管１にまとめ、４０ｍＬ程度に
メスアップする（以下「細胞懸濁液１」）。
※細胞数算定のため液量を量る。
【0130】
6.2.細胞数計測
6.2.1. ５回以上転倒混和した後、マイクロピペットを用いてマイクロチューブに細胞懸濁液１を５０μＬ採取する。
6.2.2. トリパンブルー染色液で２～２０倍に希釈し、血球計算盤を用いて生細胞数及び死細胞数をカウントする。
6.2.3. カウント数から総生細胞数を算出する。
6.2.4. 所定の試薬を使用しない場合は手順「6.3.培地調製（フィルトレーション無）」、使用する場合は手順「6.4.培地調製（フィルトレーション有）」の操作で培地調製を行い、
手順「6.5.細胞播種」の操作を行う。ＰＧＥ２の場合は未滅菌のＰＧＥ２を使用する場合のみフィルトレーションを実施。
6.2.1. ５回以上転倒混和した後、マイクロピペットを用いてマイクロチューブに細胞懸濁液１を５０μＬ採取する。
6.2.2. トリパンブルー染色液で２～２０倍に希釈し、血球計算盤を用いて生細胞数及び死細胞数をカウントする。
6.2.3. カウント数から総生細胞数を算出する。
6.2.4. 所定の試薬を使用しない場合は手順「6.3.培地調製（フィルトレーション無）」、使用する場合は手順「6.4.培地調製（フィルトレーション有）」の操作で培地調製を行い、
手順「6.5.細胞播種」の操作を行う。ＰＧＥ２の場合は未滅菌のＰＧＥ２を使用する場合のみフィルトレーションを実施。
【0131】
6.3. 培地調製（フィルトレーション無）
6.3.1. 算出した総生細胞数を基に、シャーレ枚数並びに培地、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－４、ピシバニール、ＰＧＥ２の各使用量を算定する。
6.3.2. 遠心管に算定量の培地を量り取る。
6.3.3. マイクロピペットを用いて、算定量のＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－４、ピシバニール、ＰＧＥ２、を添加する（以下「調製培地」）。
6.3.1. 算出した総生細胞数を基に、シャーレ枚数並びに培地、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－４、ピシバニール、ＰＧＥ２の各使用量を算定する。
6.3.2. 遠心管に算定量の培地を量り取る。
6.3.3. マイクロピペットを用いて、算定量のＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－４、ピシバニール、ＰＧＥ２、を添加する（以下「調製培地」）。
【0132】
6.4. 培地調製（フィルトレーション有）
6.4.1. 算出した総生細胞数を基に、シャーレ枚数並びに培地、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－４、ピシバニール、ＰＧＥ２及び抗原の各使用量を算定する。
6.4.2. 抗原Ａをパルスする場合、２ｍｇ／ｍＬとなるようにＤＭＳＯで抗原Ａを溶解する。
6.4.3. 抗原Ｂをパルスする場合、２ｍｇ／ｍｌとなるように蒸留水または生理食塩水で抗原Ｂを溶解する。
6.4.4. 遠心管に培地を量り取る。
※ネオアンチゲンペプチドを２種類以上使用する場合は、医師の指示のもと適宜、別々の遠心管に培地を量り取り、6.4.5.から6.5.7.の操作を遠心管ごとに実施する。
また、ネオアンチゲンペプチドは本工程および次工程で使用する種類を考慮に入れる。
6.4.5. 量り取った培地から５ｍＬを採取し、算定量の抗原Ａ、抗原Ｂを添加する。
※２種類以上の抗原を使用する場合は、各抗原を別の培地に分注する。
※未滅菌のＰＧＥ２を使用する場合は、本工程で添加する。
6.4.6. マイクロピペットを用いて、6.4.4.の培地に算定量のＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－４、ピシバニール、ＰＧＥ２を添加する。
6.4.7. 6.4.5.をシリンジフィルターに通して6.4.6.の培地に添加する（以下「調製培地」）。
6.4.1. 算出した総生細胞数を基に、シャーレ枚数並びに培地、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－４、ピシバニール、ＰＧＥ２及び抗原の各使用量を算定する。
6.4.2. 抗原Ａをパルスする場合、２ｍｇ／ｍＬとなるようにＤＭＳＯで抗原Ａを溶解する。
6.4.3. 抗原Ｂをパルスする場合、２ｍｇ／ｍｌとなるように蒸留水または生理食塩水で抗原Ｂを溶解する。
6.4.4. 遠心管に培地を量り取る。
※ネオアンチゲンペプチドを２種類以上使用する場合は、医師の指示のもと適宜、別々の遠心管に培地を量り取り、6.4.5.から6.5.7.の操作を遠心管ごとに実施する。
また、ネオアンチゲンペプチドは本工程および次工程で使用する種類を考慮に入れる。
6.4.5. 量り取った培地から５ｍＬを採取し、算定量の抗原Ａ、抗原Ｂを添加する。
※２種類以上の抗原を使用する場合は、各抗原を別の培地に分注する。
※未滅菌のＰＧＥ２を使用する場合は、本工程で添加する。
6.4.6. マイクロピペットを用いて、6.4.4.の培地に算定量のＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－４、ピシバニール、ＰＧＥ２を添加する。
6.4.7. 6.4.5.をシリンジフィルターに通して6.4.6.の培地に添加する（以下「調製培地」）。
【0133】
6.5. 細胞播種
6.5.1. シャーレを算定枚数用意する。
6.5.2. 細胞懸濁液を遠心分離する。
設定条件：５００Ｇ ５ｍｉｎ ４℃
※医師の指示のもと適宜、ネオアンチゲンの種類に応じて細胞懸濁液を適当な本数の遠心管に分注する。
6.5.3. 遠心分離終了後、遠心管に上清を回収する。
6.5.4. 回収した上清をサンプルチューブに１ｍＬ採取し、工程参考品とする。
6.5.5. タッピングでペレットを崩し、調製培地を加え懸濁する。
6.5.6. ピペットを用いて、シャーレに６ｍＬずつ分注する。
※ 分注の際は十分ピペッティングを行う。
※ 観察用シャーレには２ｍＬ分注する。
6.5.7. シャーレをインキュベータに入れ、一晩（１２時間以上３６時間未満）静置する。
設定条件：３７℃ ＣＯ２濃度 ５．０％
6.5.1. シャーレを算定枚数用意する。
6.5.2. 細胞懸濁液を遠心分離する。
設定条件：５００Ｇ ５ｍｉｎ ４℃
※医師の指示のもと適宜、ネオアンチゲンの種類に応じて細胞懸濁液を適当な本数の遠心管に分注する。
6.5.3. 遠心分離終了後、遠心管に上清を回収する。
6.5.4. 回収した上清をサンプルチューブに１ｍＬ採取し、工程参考品とする。
6.5.5. タッピングでペレットを崩し、調製培地を加え懸濁する。
6.5.6. ピペットを用いて、シャーレに６ｍＬずつ分注する。
※ 分注の際は十分ピペッティングを行う。
※ 観察用シャーレには２ｍＬ分注する。
6.5.7. シャーレをインキュベータに入れ、一晩（１２時間以上３６時間未満）静置する。
設定条件：３７℃ ＣＯ２濃度 ５．０％
【0134】
以上のようにしてネオアンチゲンペプチドパルス樹状細胞が得られる。
・最終製剤化工程：
・細胞密度の調製（２×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）
細胞を培地に懸濁する。
・細胞凍結保存液との混合（１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）
細胞懸濁液（培地）と細胞凍結保存液を１：１で混合する。
使用時に２倍希釈するように調製濃度は濃く（２倍）で作成しておく。
０．１～１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞を０．５～１ｍＬ／ｔｕｂｅで凍結保存することも可能。
・クライオチューブ等への充填（１×１０７ｃｅｌｌｓ／１ｍＬ／ｔｕｂｅ）
上記細胞懸濁液をクライオチューブに分注する。
・クライオチューブ（凍結保存細胞）および添付融解剤（生理食塩水）のアンプルへのラベリング
・製剤の保存：凍結保存細胞（≦－８０℃）
生理食塩水（室温）
最終製剤（凍結保存細胞＋添付融解剤）が得られる。
・最終製剤化工程：
・細胞密度の調製（２×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）
細胞を培地に懸濁する。
・細胞凍結保存液との混合（１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）
細胞懸濁液（培地）と細胞凍結保存液を１：１で混合する。
使用時に２倍希釈するように調製濃度は濃く（２倍）で作成しておく。
０．１～１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞を０．５～１ｍＬ／ｔｕｂｅで凍結保存することも可能。
・クライオチューブ等への充填（１×１０７ｃｅｌｌｓ／１ｍＬ／ｔｕｂｅ）
上記細胞懸濁液をクライオチューブに分注する。
・クライオチューブ（凍結保存細胞）および添付融解剤（生理食塩水）のアンプルへのラベリング
・製剤の保存：凍結保存細胞（≦－８０℃）
生理食塩水（室温）
最終製剤（凍結保存細胞＋添付融解剤）が得られる。
【0135】
細胞をペレット化し、細胞凍結剤をそのまま添加する方法では以下のようにする。
Ａ：細胞凍結保存液にて細胞を懸濁する（１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）
Ｂ：クライオチューブに１ｍＬずつ細胞懸濁液を分注する（１×１０７ｃｅｌｌｓ／１ｍＬ／ｔｕｂｅ）
Ａ：細胞凍結保存液にて細胞を懸濁する（１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）
Ｂ：クライオチューブに１ｍＬずつ細胞懸濁液を分注する（１×１０７ｃｅｌｌｓ／１ｍＬ／ｔｕｂｅ）
【0136】
（実施例８：樹状細胞療法）
実施例７で製造したパルス樹状細胞を用いて樹状細胞療法を行う。
１）デキストラン１ｍＬに生理食塩水８ｍＬを加えた溶液（解凍用液）を作製する。
２）液体窒素下で凍結したＤＣ（１×１０７個／１ｍＬ）の入ったクライオバイアルを３７℃に加温したヒートブロックを用いて７割程度まで解凍する。
３）解凍用液を遠心管に一部分注し、残りの解凍用液でＤＣの入ったクライオバイアルを共洗いしながら遠心管に移す（総量１０ｍｌ）。
４）転倒混和後、カウント用サンプルとして５０μＬ採取し、トリパンブルー染色液で２倍希釈する。血球計算盤を用いて生細胞数及び死細胞数をカウントし、総細胞数、生細胞率を算出する。
５）遠心分離を行う（５００ｇ、５ｍｉｎ、４℃、アクセル・ブレーキ有）。遠心分離したら、上清除去後、タッピングでペレットを崩す。細胞懸濁液に生理食塩水を加えて約１３ｍＬにする。これを２回繰り返す。
６）凍結ＤＣワクチンを生理食塩水０．６～０．８ｍＬ程度で再懸濁し、シリンジ（インスリン自己注射用、３０Ｇ×１０ｍｍ、０．５ｍＬ）に移す。
７）腋窩リンパ節近傍、鼡径リンパ節近傍、あるいは病変が表皮に近い場合はその近傍に、数ヶ所に分けて皮下～皮内投与する。
実施例７で製造したパルス樹状細胞を用いて樹状細胞療法を行う。
１）デキストラン１ｍＬに生理食塩水８ｍＬを加えた溶液（解凍用液）を作製する。
２）液体窒素下で凍結したＤＣ（１×１０７個／１ｍＬ）の入ったクライオバイアルを３７℃に加温したヒートブロックを用いて７割程度まで解凍する。
３）解凍用液を遠心管に一部分注し、残りの解凍用液でＤＣの入ったクライオバイアルを共洗いしながら遠心管に移す（総量１０ｍｌ）。
４）転倒混和後、カウント用サンプルとして５０μＬ採取し、トリパンブルー染色液で２倍希釈する。血球計算盤を用いて生細胞数及び死細胞数をカウントし、総細胞数、生細胞率を算出する。
５）遠心分離を行う（５００ｇ、５ｍｉｎ、４℃、アクセル・ブレーキ有）。遠心分離したら、上清除去後、タッピングでペレットを崩す。細胞懸濁液に生理食塩水を加えて約１３ｍＬにする。これを２回繰り返す。
６）凍結ＤＣワクチンを生理食塩水０．６～０．８ｍＬ程度で再懸濁し、シリンジ（インスリン自己注射用、３０Ｇ×１０ｍｍ、０．５ｍＬ）に移す。
７）腋窩リンパ節近傍、鼡径リンパ節近傍、あるいは病変が表皮に近い場合はその近傍に、数ヶ所に分けて皮下～皮内投与する。
【0137】
（実施例９：プロテオーム解析）
本実施例では、ＣＴＣを採取したのち、ＣＴＣに発現しているネオアンチゲン蛋白を、ＣＴＣのプロテオーム解析により同定する。プロテオーム解析の手法は以下のとおりである。
（１）約１０００個から数万個のＣＴＣ浮遊液を１０００～２０００ｃｐｍで１０～１５分遠心し細胞ペレットを作製する。細胞ペレットは－８０℃の低温槽あるいは液体窒素容器で保存する。
（２）界面活性剤、凍結融解、浸透圧ショック、のいずれかの方法でＣＴＣのペレットからタンパク質を抽出する。
（３）抽出したタンパク質を、高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）と三連四重極型質量分析計（ＭＳ／ＭＳ）を組合せた装置（液体クロマトグラフ質量分析計「Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ－Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ： ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ」）で分析する。これによりＣＴＣに発現しているタンパク質を同定する。
本実施例では、ＣＴＣを採取したのち、ＣＴＣに発現しているネオアンチゲン蛋白を、ＣＴＣのプロテオーム解析により同定する。プロテオーム解析の手法は以下のとおりである。
（１）約１０００個から数万個のＣＴＣ浮遊液を１０００～２０００ｃｐｍで１０～１５分遠心し細胞ペレットを作製する。細胞ペレットは－８０℃の低温槽あるいは液体窒素容器で保存する。
（２）界面活性剤、凍結融解、浸透圧ショック、のいずれかの方法でＣＴＣのペレットからタンパク質を抽出する。
（３）抽出したタンパク質を、高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）と三連四重極型質量分析計（ＭＳ／ＭＳ）を組合せた装置（液体クロマトグラフ質量分析計「Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ－Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ： ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ」）で分析する。これによりＣＴＣに発現しているタンパク質を同定する。
【0138】
（実施例１０：種々の癌患者からのＣＴＣの単離）
種々の癌患者由来の末梢血単核球細胞を用いてＣＴＣを単離した。癌患者として、肺癌（ステージ４）、大腸癌（ステージ４）、卵巣癌（ステージ４）、乳癌、膵臓癌（ステージ４）、十二指腸乳頭部癌（ステージ４）、大腸癌（ステージ４）、肝臓癌、多発肝癌、前立腺癌（ステージ４）、食道癌の各患者由来のＰＢＭＣを使用した。ＰＢＭＣの採取、ＰＢＭＣからの単球の単離、ＣＴＣの単離の各手法については、実施例１～３と同様にして行った。
種々の癌患者由来の末梢血単核球細胞を用いてＣＴＣを単離した。癌患者として、肺癌（ステージ４）、大腸癌（ステージ４）、卵巣癌（ステージ４）、乳癌、膵臓癌（ステージ４）、十二指腸乳頭部癌（ステージ４）、大腸癌（ステージ４）、肝臓癌、多発肝癌、前立腺癌（ステージ４）、食道癌の各患者由来のＰＢＭＣを使用した。ＰＢＭＣの採取、ＰＢＭＣからの単球の単離、ＣＴＣの単離の各手法については、実施例１～３と同様にして行った。
【0139】
結果を図４～９に示した。図４～６に示したフローサイトメトリーの分析結果は、ＣＴＣが多く取れた症例であり、図７～９に示したフローサイトメトリーの分析結果は、ＣＴＣが少ない症例である。ＣＴＣが少ない症例では、治療が奏功している、あるいは手術で癌を完全切除した例となっている。
【0140】
（実施例１１：ＲＮＡシーケンス、またはエクソーム解析およびプロテオーム解析によるネオアンチゲンの同定）
種々の癌患者から単離したＣＴＣを用いて、ＲＮＡシーケンス、またはエクソーム解析によってネオアンチゲンを同定した。結果を以下の表５～１３に示した。ＲＮＡシーケンスについては実施例５と同様にして行った。表５～８がエクソーム解析によるネオアンチゲン同定の結果である。プロテオーム解析を加えることにより、蛋白として発現しているネオアンチゲンのみを絞り込んで同定することが可能となる。プロテオーム解析のかわりにＲＮＡシーケンスをエクソーム解析に組み合わせることによってもネオアンチゲンの絞り込み同定は可能である。表９～１２がＲＮＡシーケンスによるネオアンチゲン同定の結果である。
種々の癌患者から単離したＣＴＣを用いて、ＲＮＡシーケンス、またはエクソーム解析によってネオアンチゲンを同定した。結果を以下の表５～１３に示した。ＲＮＡシーケンスについては実施例５と同様にして行った。表５～８がエクソーム解析によるネオアンチゲン同定の結果である。プロテオーム解析を加えることにより、蛋白として発現しているネオアンチゲンのみを絞り込んで同定することが可能となる。プロテオーム解析のかわりにＲＮＡシーケンスをエクソーム解析に組み合わせることによってもネオアンチゲンの絞り込み同定は可能である。表９～１２がＲＮＡシーケンスによるネオアンチゲン同定の結果である。
【0141】
【表5】
同定されたネオアンチゲン（列Neoantigenに記載される配列ついて、上から順に配列番号２３～３８）
【0142】
【表6】
同定されたネオアンチゲン（列Neoantigenに記載される配列ついて、上から順に配列番号３９～４８）
【0143】
【表7】
同定されたネオアンチゲン（列Neoantigenに記載される配列ついて、上から順に配列番号４９～６４）
【0144】
【表8】
同定されたネオアンチゲン（列Neoantigenに記載される配列ついて、上から順に配列番号６５～７１）
【0145】
【表9】
同定されたネオアンチゲン（列Neoantigenに記載される配列ついて、上から順に配列番号７２～７８）
【0146】
【表10】
同定されたネオアンチゲン（列Neoantigenに記載される配列ついて、上から順に配列番号７９～８５）
【0147】
【表11】
同定されたネオアンチゲン（列Neoantigenに記載される配列ついて、上から順に配列番号８６～９６）
【0148】
【表12】
同定されたネオアンチゲン（列Neoantigenに記載される配列ついて、上から順に配列番号９７～９８）
【0149】
（実施例１２：ＣＴＣを用いた他の解析例～がん以外の疾患）
がん以外の疾患への適用例を説明する。
（１）ＣＴＣの遺伝子解析によりドライバー遺伝子を含めた種々の遺伝子変異が明らかになり、分子標的薬の選択が可能となる。
（２）（１）と同様に高頻度マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ－Ｈｉｇｈ）の検出も可能となり、免疫チェックポイント阻害薬の適応であるかを同定できる。
（３）トランスクリプトーム解析やシングルセルＲＮＡ－ｓｅｑと臨床データを合わせることにより、転移を起こしている（あるいは起こしやすい）症例と起こしていない（あるいは起こしにくい）症例でのＣＴＣの差異を明らかにすることができる。これにより症例の予後予測や転移の生じるメカニズムの解明につながる。
（４）メタボローム解析（メタボローム解析は対象とするサンプルに存在する代謝産物の全ての種類や濃度を網羅的に検出し、その結果を解析することを指し、メタボロミクスとも呼称される）を行うことにより、ＣＴＣの代謝特性が明らかなり、（３）の検討がより包括的に可能となる。
がん以外の疾患への適用例を説明する。
（１）ＣＴＣの遺伝子解析によりドライバー遺伝子を含めた種々の遺伝子変異が明らかになり、分子標的薬の選択が可能となる。
（２）（１）と同様に高頻度マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ－Ｈｉｇｈ）の検出も可能となり、免疫チェックポイント阻害薬の適応であるかを同定できる。
（３）トランスクリプトーム解析やシングルセルＲＮＡ－ｓｅｑと臨床データを合わせることにより、転移を起こしている（あるいは起こしやすい）症例と起こしていない（あるいは起こしにくい）症例でのＣＴＣの差異を明らかにすることができる。これにより症例の予後予測や転移の生じるメカニズムの解明につながる。
（４）メタボローム解析（メタボローム解析は対象とするサンプルに存在する代謝産物の全ての種類や濃度を網羅的に検出し、その結果を解析することを指し、メタボロミクスとも呼称される）を行うことにより、ＣＴＣの代謝特性が明らかなり、（３）の検討がより包括的に可能となる。
【0150】
（実施例１３：ＣＴＣを用いた他の解析例～健康状態の確認）
健康状態を確認する場合の適用例を説明する。
（１）ＣＴＣのエクソーム解析により、悪性腫瘍がレアバリアント変異によるかが検出できる。さらに、血縁者の検査を行うことにより同じ疾患が存在することが明らかになる場合があり、血縁者の早期診断・早期治療が可能となる。
（２）ネオアンチゲン同定の際にはＣＴＣに加え、正常細胞のＤＮＡも抽出できる。この正常ＤＮＡの全ゲノム解析あるいはＤＮＡチップ解析により、正常の生殖細胞系列のゲノム配列が決定できる。この配列を元に疾患に関わるレアバリアント変異だけでなくコモンバリアントのリスク計算が可能となる。悪性腫瘍以外の疾患に対する予防医療にも役立つ。
健康状態を確認する場合の適用例を説明する。
（１）ＣＴＣのエクソーム解析により、悪性腫瘍がレアバリアント変異によるかが検出できる。さらに、血縁者の検査を行うことにより同じ疾患が存在することが明らかになる場合があり、血縁者の早期診断・早期治療が可能となる。
（２）ネオアンチゲン同定の際にはＣＴＣに加え、正常細胞のＤＮＡも抽出できる。この正常ＤＮＡの全ゲノム解析あるいはＤＮＡチップ解析により、正常の生殖細胞系列のゲノム配列が決定できる。この配列を元に疾患に関わるレアバリアント変異だけでなくコモンバリアントのリスク計算が可能となる。悪性腫瘍以外の疾患に対する予防医療にも役立つ。
【0151】
（注記）
以上のように、本開示の好ましい実施形態を用いて本開示を例示してきたが、本開示は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願及び他の文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。本願は、日本国特許庁に２０２１年６月３０日に出願された特願２０２１－１０８７８４に対して優先権主張をするものであり、その内容はその全体があたかも本願の内容を構成するのと同様に参考として援用される。
以上のように、本開示の好ましい実施形態を用いて本開示を例示してきたが、本開示は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願及び他の文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。本願は、日本国特許庁に２０２１年６月３０日に出願された特願２０２１－１０８７８４に対して優先権主張をするものであり、その内容はその全体があたかも本願の内容を構成するのと同様に参考として援用される。
【産業上の利用可能性】
【0152】
本開示の方法によって、非侵襲的に患者のネオアンチゲンを同定することができ、ネオアンチゲンを用いたがん免疫療法の治験に有用である。また再生医療への展開や、細胞治療を中心とした新規医療の開発も期待できる。
【配列表フリーテキスト】
【0153】
配列番号１～２２：実施例６で同定したネオアンチゲン
配列番号２３～９８：実施例１１で同定したネオアンチゲン
配列番号２３～９８：実施例１１で同定したネオアンチゲン
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【配列表】