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特許7426370ゲノムＤＮＡ断片の標的化された精製のための調製用電気泳動方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-01-24
(45)【発行日】2024-02-01
(54)【発明の名称】ゲノムＤＮＡ断片の標的化された精製のための調製用電気泳動方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/10 20060101AFI20240125BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20240125BHJP
【ＦＩ】
C12N15/10 112Z
C12N15/10 ZNA
C12N15/09 110
【請求項の数】
10
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2021215387
(22)【出願日】2021-12-29
(62)【分割の表示】P 2018545573の分割
【原出願日】2016-11-21
(65)【公開番号】P2022033247
(43)【公開日】2022-02-28
【審査請求日】2022-01-27
(31)【優先権主張番号】62/258,384
(32)【優先日】2015-11-20
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】597025806
【氏名又は名称】ワシントン・ユニバーシティ
【氏名又は名称原語表記】Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
(73)【特許権者】
【識別番号】511087383
【氏名又は名称】セージ サイエンス， インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(72)【発明者】
【氏名】ロビ デイビッド ミトラ
(72)【発明者】
【氏名】ジェフリー ミルブラント
(72)【発明者】
【氏名】エズラ エス． エイブラムス
(72)【発明者】
【氏名】トッド ジェイ． バーベラ
(72)【発明者】
【氏名】クリスチャン ボルズ ティー．
【審査官】井関 めぐみ
(56)【参考文献】
【文献】米国特許第０４６９５５４８（ＵＳ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１４／０６５５９６（ＷＯ，Ａ１）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
Ｃ１２Ｑ １／００－３／００
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
電気泳動カセットを使用して、目的のゲノムＤＮＡ領域の断片を単離するための方法であって、電気泳動カセットのゲルマトリックスの第１のウェルに、高分子量（ＨＭＷ）ＤＮＡを有する粒子を含有する試料をローディングするステップと；
前記カセットのゲルマトリックスの第２のウェルに溶解試薬をローディングするステップと；
前記ゲルマトリックスに対し、
前記粒子を溶解させ、前記粒子から前記ＨＭＷ ＤＮＡを放出させるように前記溶解試薬が前記第１のウェルへと送達され；
低分子量ＤＮＡおよび非ＤＮＡ粒子成分が前記第１のウェルから電気泳動により除かれ；かつ
前記ＨＭＷ ＤＮＡが、（＋）電極の近位側の前記第１のウェルの壁内に移動してそこに捕捉される
ように、電気泳動場を印加するステップと；
空にし、再充填するステップであって、前記第１のウェルを空にし、前記ＨＭＷ ＤＮＡ内の特定のＤＮＡ配列において切断するように構成されたカスタムＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９切断試薬を再充填して、サイズを低減した断片として前記ＤＮＡの規定されたセグメントを遊離させるステップと；
前記ＨＭＷ ＤＮＡの効率的な切断を可能にするのに適する温度で適する時間にわたって、前記カセットをインキュベートするステップと；
前記ゲルマトリックスを電気泳動場に供するステップであって、前記場が、前記ＤＮＡ断片を移動させ、これにより、実質的に不動のままである前記ＨＭＷ ＤＮＡの切断されていないＤＮＡから前記ＤＮＡ断片を分離するように構成されている、ステップと；
前記電気泳動により分離されたＤＮＡ断片を、前記ゲルマトリックスから単離するステップとを含む、方法。
【請求項2】
空にし、再充填するステップがさらに、前記第２のウェルを空にし、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９切断緩衝液を再充填することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記電気泳動により分離されたＤＮＡ断片を電気溶出により単離する、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記粒子が、懸濁液中に含有され、動物細胞、植物細胞、細菌細胞、真菌細胞、古細菌細胞、原生動物細胞からなる群から選択される無傷細胞、および無傷ウイルス粒子のうちの少なくとも１つを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記ゲルマトリックスが、アガロースヒドロゲルを、約０．２％～約５％（重量／容量）の間の濃度で含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記溶解試薬が、アニオン性界面活性剤を、０．０５％～１０％の間の濃度で含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記アニオン性界面活性剤が、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）である、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
前記ＨＭＷ ＤＮＡのサイズが、＞１０メガ塩基対の長さであり、前記サイズを低減したＤＮＡ断片のサイズが、＜２メガ塩基対の長さである、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記粒子が、懸濁液中に含有され、細菌細胞、植物細胞、または真菌細胞を含み、前記方法が、前記試料を封入した前記ゲルマトリックスを前記溶解試薬へと曝露する前に、前記ゲルマトリックスを、細胞壁を除去するように構成された他の酵素試薬処理に供するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項10】
前記ＤＮＡ断片を、緩衝液を含有する溶出モジュールへの電気溶出により、前記ゲルマトリックスから単離する、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１５年１１月２０日に出願された“Ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ”と題する米国仮特許出願番号第６２／２５８，３８４号に基づく優先権を主張しており、この仮特許出願の開示は、その全体が参考として本明細書中に援用される。
本出願は、２０１５年１１月２０日に出願された“Ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ”と題する米国仮特許出願番号第６２／２５８，３８４号に基づく優先権を主張しており、この仮特許出願の開示は、その全体が参考として本明細書中に援用される。
【背景技術】
【0002】
序論
全ゲノムシーケンシングの費用の高額さと、全ゲノム配列解析の複雑さとに起因して、大半の次世代シーケンシング実験は、いわゆる標的化されたシーケンシングの探索において、全てのタンパク質コード領域（全エクソームシーケンシング、「ＷＥＳ」）、または遺伝子の特異的サブセット（またはゲノム領域の特異的サブセット）など、標的化されたゲノム領域について検討しようとしている。バーコード処理されたシーケンシングアダプターを使用して、このような標的化されたシーケンシング実験を実行する場合、多くのこのような試料をプールし、単回のシーケンシングランで一緒にランし、これにより、試料シーケンシング費用を劇的に軽減することができる。この理由で、今日（および過去数年間にわたり）実施されているＮＧＳの大部分は、ＷＥＳまたは標的化されたシーケンシングである。
全ゲノムシーケンシングの費用の高額さと、全ゲノム配列解析の複雑さとに起因して、大半の次世代シーケンシング実験は、いわゆる標的化されたシーケンシングの探索において、全てのタンパク質コード領域（全エクソームシーケンシング、「ＷＥＳ」）、または遺伝子の特異的サブセット（またはゲノム領域の特異的サブセット）など、標的化されたゲノム領域について検討しようとしている。バーコード処理されたシーケンシングアダプターを使用して、このような標的化されたシーケンシング実験を実行する場合、多くのこのような試料をプールし、単回のシーケンシングランで一緒にランし、これにより、試料シーケンシング費用を劇的に軽減することができる。この理由で、今日（および過去数年間にわたり）実施されているＮＧＳの大部分は、ＷＥＳまたは標的化されたシーケンシングである。
【0003】
標的化されたシーケンシングライブラリーを調製するための、最も一般的な方法は、２つの一般的な戦略：１）ハイブリダイゼーション捕捉、または２）アンプリコンライブラリーの構築に集約される。
【0004】
ハイブリダイゼーション捕捉法では、標的にされたゲノムＤＮＡ断片を、一本鎖形態へと変性させ、溶液中で、ビオチンでタグ付けした一本鎖核酸プローブ（「ベイト」としてもまた公知である）とハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションの後、ビオチンでタグ付けしたハイブリッドを、アビジンまたはストレプトアビジンでコーティングしたマイクロ粒子（通例常磁性粒子）へと捕捉し、次いで、磁気または遠心分離による粒子の回収を介して、溶液相から、標的にされていないゲノムＤＮＡを分離する。
【0005】
ライブラリーの構築は、標的配列の捕捉に先行する場合もあり、これに後続する場合もある。技法の最も一般的な形態（例えば、Ａｇｉｌｅｎｔ ＳｕｒｅｓｅｌｅｃｔキットおよびＩｌｌｕｍｉｎａ Ｗｈｏｌｅ Ｅｘｏｍｅキット）では、ＤＮＡの断片化、末端修復、およびシーケンシングアダプターの付着を、ハイブリダイゼーション捕捉の前に実施する。しかし、一部の標的化されたシーケンシングのプロトコールでは、ハイブリダイゼーション捕捉が、ライブラリー構築に先行する（Wangら、BMC Genomics（２０１５年
）、１６巻：２１４頁；ＤＯＩ：１０．１１８６／ｓ１２８６４－０１５－１３７０－２）。
）、１６巻：２１４頁；ＤＯＩ：１０．１１８６／ｓ１２８６４－０１５－１３７０－２）。
【0006】
ハイブリダイゼーションプローブは、一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはこれらの類似体でありうる。ビオチニル化一本鎖ＲＮＡ捕捉プローブを、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける転写反応により、廉価に生成しうるように、捕捉プローブを、強力なＲＮＡポリメラーゼプロモーター（Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターなど）を含有するＤＮＡオリゴヌクレオチドとして設計することが簡便であると多くの研究者は考える。このような方法は、同じ標的化されたパネルを、多数の試料中で検討する必要がある場合に、特に有用である（Gnirkeら、Nature Biotechnology（２００９年）、２７巻：１８２頁）。
【0007】
アンプリコンライブラリー法では、シーケンシングのための標的領域を、まず、ＰＣＲにより増幅し、次いで、ＰＣＲ産物を、ＮＧＳライブラリーを構築するためのＤＮＡインプットとして使用する。この方法の最も一般的な例は、（例えば）Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のＡｍｐｌｉＳｅｑ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇキットである。ＰＣＲは、少量のインプット試料（１～１０ｎｇのインプットＤＮＡ）の使用を可能とするので、アンプリコンシーケンシング法は、臨床検査室で一般的である。
【0008】
標的化されたシーケンシングのいずれの方法も、比較的多数の核酸試薬：ハイブリッド体捕捉法におけるビオチニル化プローブ、またはアンプリコンシーケンシングの場合におけるＰＣＲプライマー対を必要とするという点で、一般的な欠点を有する。これは、とりわけ、ＩｌｌｕｍｉｎａまたはＩｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔなど、一般的なショートリードシーケンシング技術（典型的な生リードの長さ＜４００ｂｐ）を使用して、ゲノムＤＮＡの、長い、数キロベース（ｋｂ）の領域について検討する場合に重要である。関連する問題は、便利な多重フォーマットで必要とされる特異性／ストリンジェンシーを伴う、プローブまたはプライマーの、このような複雑なセットを使用するキットを、設計し、最適化することの複雑さである。
現行の標的化されたシーケンシング法に関する、別の困難は、ロングレンジのゲノム構造および再配列の研究、ならびにロングレンジのフェージングおよびハプロタイプ解析のために、それらを、極めて大きなＤＮＡ分子（１０ｋｂ～１桁の低い（ｌｏｗ ｓｉｇｌｅ）メガ塩基対（ｍｂ））へと適用することの困難である。例えば、ロングレンジのＰＣＲは、１０ｋｂを超える距離については信頼できず、大半の市販のＤＮＡ抽出法は、５０～１００ｋｂを超えるＤＮＡを、信頼できる形ではもたらさない。
現行の標的化されたシーケンシング法に関する、別の困難は、ロングレンジのゲノム構造および再配列の研究、ならびにロングレンジのフェージングおよびハプロタイプ解析のために、それらを、極めて大きなＤＮＡ分子（１０ｋｂ～１桁の低い（ｌｏｗ ｓｉｇｌｅ）メガ塩基対（ｍｂ））へと適用することの困難である。例えば、ロングレンジのＰＣＲは、１０ｋｂを超える距離については信頼できず、大半の市販のＤＮＡ抽出法は、５０～１００ｋｂを超えるＤＮＡを、信頼できる形ではもたらさない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0009】
【文献】Wangら、BMC Genomics（２０１５年）、１６巻：２１４頁；ＤＯＩ：１０．１１８６／ｓ１２８６４－０１５－１３７０－２
【文献】Gnirkeら、Nature Biotechnology（２００９年）、２７巻：１８２頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0010】
いくつかの実施形態の要旨
本開示の一部の実施形態では、ゲノムＤＮＡの特異的断片を単離するための方法が提示され、
・高分子量（ＨＭＷ）ＤＮＡを含有する試料を提供するステップと；
・試料を、ＨＭＷ ＤＮＡが極めて低い電気泳動移動度を有する、ゲルマトリックス内に封入するステップと；
・試料を封入したゲルマトリックスを、溶解試薬へと曝露して、ＨＭＷ ＤＮＡを、他の試料夾雑物から放出するステップと；
・試料夾雑物および溶解試薬を、ゲルマトリックスから除去し、ゲル内に封入された精製ＨＭＷ ＤＮＡを後に残すように、試料を封入したゲルマトリックスを、電気泳動場に供するステップと；
・精製ＤＮＡを封入したゲルマトリックスを、試料ＤＮＡ内の特異的ＤＮＡ配列において切断するよう構成されたＤＮＡクリベース試薬による処理に供し、これにより、サイズを低減した断片としての試料の、規定されたセグメントを遊離させるステップであって、遊離させた規定のＤＮＡ断片が、残余の、切断されていないＨＭＷの試料ＤＮＡより、はるかに大きな電気泳動移動度を有するステップと；
・特異的に切り出されたＤＮＡ断片を、残余の、切断されていないＨＭＷの試料ＤＮＡから物理的に分離するように、ゲルマトリックスを、電気泳動場に供するステップと；
・特異的に切り出され、電気泳動により分離されたＤＮＡ断片を、ゲルマトリックスから単離し、依然としてゲルマトリックス内に封入されている、ＨＭＷ ＤＮＡ試料の切断されていない残余をあとに残すステップと
を含む。
本開示の一部の実施形態では、ゲノムＤＮＡの特異的断片を単離するための方法が提示され、
・高分子量（ＨＭＷ）ＤＮＡを含有する試料を提供するステップと；
・試料を、ＨＭＷ ＤＮＡが極めて低い電気泳動移動度を有する、ゲルマトリックス内に封入するステップと；
・試料を封入したゲルマトリックスを、溶解試薬へと曝露して、ＨＭＷ ＤＮＡを、他の試料夾雑物から放出するステップと；
・試料夾雑物および溶解試薬を、ゲルマトリックスから除去し、ゲル内に封入された精製ＨＭＷ ＤＮＡを後に残すように、試料を封入したゲルマトリックスを、電気泳動場に供するステップと；
・精製ＤＮＡを封入したゲルマトリックスを、試料ＤＮＡ内の特異的ＤＮＡ配列において切断するよう構成されたＤＮＡクリベース試薬による処理に供し、これにより、サイズを低減した断片としての試料の、規定されたセグメントを遊離させるステップであって、遊離させた規定のＤＮＡ断片が、残余の、切断されていないＨＭＷの試料ＤＮＡより、はるかに大きな電気泳動移動度を有するステップと；
・特異的に切り出されたＤＮＡ断片を、残余の、切断されていないＨＭＷの試料ＤＮＡから物理的に分離するように、ゲルマトリックスを、電気泳動場に供するステップと；
・特異的に切り出され、電気泳動により分離されたＤＮＡ断片を、ゲルマトリックスから単離し、依然としてゲルマトリックス内に封入されている、ＨＭＷ ＤＮＡ試料の切断されていない残余をあとに残すステップと
を含む。
【0011】
一部の実施形態では、複数の、上記で言及したステップを含む同様の方法が提供される。
【0012】
一部の実施形態では、試料は、無傷細胞（例えば、動物細胞、植物細胞、細菌細胞、真菌細胞、古細菌細胞、原生動物細胞）または無傷ウイルス粒子の懸濁液を含む。
【0013】
一部の実施形態では、ゲルマトリックスは、アガロースヒドロゲルを、約０．２％～約５％（重量／容量）の間の濃度で含む。
【0014】
本発明の一部の実施形態では、溶解試薬は、アニオン性界面活性剤を、０．０５％～１０％の間の濃度で含む。本発明の一部の実施形態では、アニオン性界面活性剤は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）である。
【0015】
一部の実施形態では、試料の溶解により遊離させたＤＮＡのサイズは、＞１０メガ塩基対の長さであり、特異的クリベース試薬により放出したＤＮＡ断片のサイズは、＜２メガ塩基対の長さである。
【0016】
細菌細胞、植物細胞、または真菌細胞を利用する一部の実施形態では、さらなる酵素試薬処理を使用して、細胞溶解の前に細胞壁を除去する。
【0017】
一部の実施形態では、特異的クリベース試薬により特異的に放出されたＤＮＡ断片を、緩衝液を含有する溶出モジュールへの電気溶出により、ゲルマトリックスから単離する。
【0018】
一部の実施形態では、試料を封入し、試料ＤＮＡを精製するための、方法および装置が提供される。精製された封入試料ＤＮＡを酵素処理するための一般的な方法については、その全開示が、参照によってその全体において本明細書に組み込まれる、同時係属のＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０５５８３３号において記載されている。
【0019】
一部の実施形態では、ＤＮＡクリベース試薬は、１つまたは複数のＲＮＡによりガイドされるエンドヌクレアーゼ組成物を含む。例えば、１つのこのような組成物は、ガイドＲＮＡ－Ｃａｓ９複合体が、ゲノムＤＮＡ内の、使用者に指定された特異的部位で切断することを可能とする、ガイドＲＮＡを伴うＣａｓ９タンパク質を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム（下記を参照されたい）に基づく。
【0020】
他のＲＮＡによりガイドされるエンドヌクレアーゼ系、操作されたジンクフィンガーヌクレアーゼ、操作転写活性化因子様ヌクレアーゼ、および操作メガヌクレアーゼなど、他の配列特異的ＤＮＡクリベース試薬も、一部の実施形態と共に使用することができる（Zetscheら（２０１５年）、Cell、１６３巻：７５９頁；Hsu PDら（２０１４年）、Cell、１５７巻：１２６２頁；EsveltおよびWang（２０１３年）、Mol Syst Biol.、９巻：６４１頁；Stoddard BL（２０１１年）、Structure、１９巻：７頁；Urnov FDら（２０１０年）、Nat Rev Genet.、１１巻：６３６頁；BogdanoveおよびVoytas（２０１１年）
、Science、３３３巻：１８４３頁；Scharenberg AMら（２０１３年）、Curr Gene Ther.、１３巻（４号）：２９１頁）。
、Science、３３３巻：１８４３頁；Scharenberg AMら（２０１３年）、Curr Gene Ther.、１３巻（４号）：２９１頁）。
【0021】
Ｃａｓ９タンパク質とは、侵入するウイルスのＤＮＡ配列を分解する、細菌内の適応免疫系であるＣＲＩＳＰＲ（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔ）系の主要な構成要素である（Gasiunas, G.ら（２０１２年）、Proc Natl Acad Sci U S A.、１０９巻：Ｅ２５７９頁；Jinek, M.ら、Science、（２０１２年）、３３７巻：８１６頁）。Ｃａｓ
９とは、その結合特異性を達成するために、固有の機構を伴うＤＮＡエンドヌクレアーゼである。Ｃａｓ９は、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡと複合体を形成し、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡは、このタンパク質に対して、そのＲＮＡ配列と相補的なＤＮＡ配列に結合し、これを切断するように方向づける。内因性ＣＲＩＳＰＲ系では、複数のＲＮＡが、Ｃａｓ９を方向づけるように協同するが、近年では、単一のキメラｇＲＮＡにより方向づけられる、特異的ＤＮＡ配列へのＣａｓ９の結合が証明されている。以下では、そうでないことが指定されない限りにおいて、本発明者らは、キメラｇＲＮＡを、単に、ｇＲＮＡと称する。標的化されたエンドヌクレアーゼを設計することは、今や、オリゴヌクレオチドを注文することにまで簡便化されるので、Ｃａｓ９の発見は、このタンパク質の、ゲノム編集のための使用に対する、多大な関心を惹起している（Cong, L.ら、Science、（２０１３年）、３３９巻：８１９頁；Mali, P.ら（２０１３年）、Science、３３９巻：８２３頁）。Ｃａｓ９によるＤＮＡの切断は典型的に、ｉｎ ｖｉｖｏの細胞内で、Ｃａｓ９タンパク質およびガイドＲＮＡの両方を発現させることにより実施される。しかし、また、精製Ｃａｓ９タンパク質を、ｇＲＮＡと組み合わせ、ＤＮＡ鋳型を付加することにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＤＮＡ切断も達成することができる（Karvelisら（２０１３年）、Biochem
Soc Trans、４１巻：１４０１頁、ＰＭＩＤ：２４２５６２２７）。実際、ガイドＲＮＡ－Ｃａｓ９複合体は、使用者カスタマイズ型の制限酵素として用いられ、事実上任意の公知のＤＮＡ配列における切断またはこの近傍における切断を可能とする。このようにして、使用者は、試料ＤＮＡ内の、目的の特異的ＤＮＡ領域の周囲の領域内で切断するように、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９試薬の組合せを構成することができる。
９とは、その結合特異性を達成するために、固有の機構を伴うＤＮＡエンドヌクレアーゼである。Ｃａｓ９は、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡと複合体を形成し、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡは、このタンパク質に対して、そのＲＮＡ配列と相補的なＤＮＡ配列に結合し、これを切断するように方向づける。内因性ＣＲＩＳＰＲ系では、複数のＲＮＡが、Ｃａｓ９を方向づけるように協同するが、近年では、単一のキメラｇＲＮＡにより方向づけられる、特異的ＤＮＡ配列へのＣａｓ９の結合が証明されている。以下では、そうでないことが指定されない限りにおいて、本発明者らは、キメラｇＲＮＡを、単に、ｇＲＮＡと称する。標的化されたエンドヌクレアーゼを設計することは、今や、オリゴヌクレオチドを注文することにまで簡便化されるので、Ｃａｓ９の発見は、このタンパク質の、ゲノム編集のための使用に対する、多大な関心を惹起している（Cong, L.ら、Science、（２０１３年）、３３９巻：８１９頁；Mali, P.ら（２０１３年）、Science、３３９巻：８２３頁）。Ｃａｓ９によるＤＮＡの切断は典型的に、ｉｎ ｖｉｖｏの細胞内で、Ｃａｓ９タンパク質およびガイドＲＮＡの両方を発現させることにより実施される。しかし、また、精製Ｃａｓ９タンパク質を、ｇＲＮＡと組み合わせ、ＤＮＡ鋳型を付加することにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＤＮＡ切断も達成することができる（Karvelisら（２０１３年）、Biochem
Soc Trans、４１巻：１４０１頁、ＰＭＩＤ：２４２５６２２７）。実際、ガイドＲＮＡ－Ｃａｓ９複合体は、使用者カスタマイズ型の制限酵素として用いられ、事実上任意の公知のＤＮＡ配列における切断またはこの近傍における切断を可能とする。このようにして、使用者は、試料ＤＮＡ内の、目的の特異的ＤＮＡ領域の周囲の領域内で切断するように、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９試薬の組合せを構成することができる。
【0022】
最も一般的に使用されるＣａｓ９ヌクレアーゼは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ菌（ＳｐＣａｓ９）に由来し、適切な条件下で、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏのいずれにおいても、１００％近い効率で、ＤＮＡを特異的に切断する（Shalemら（２０１４年）、Science、３４３巻：８４頁、ＰＭＩＤ：２４３３６５７１；Wangら（２０１４年）、Science、３４３巻：８０頁、ＰＭＩＤ：２４３３６５６９）。ＳｐＣａｓ９は、ＲＮＡ内の２０ｎｔの配列であって、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と呼ばれる要求される５’ＮＧＧモチーフのすぐ上流の配列により、ＤＮＡ遺伝子座へと標的化される。この２０ｎｔのｇＲＮＡ配列は、ＳｐＣａｓ９タンパク質を、ＤＮＡ標的配列内のその相補体へと方向づける。この領域中の、ｇＲＮＡと標的ＤＮＡとの任意のミスマッチは、切断の効率を低減する。ＰＡＭに対して遠位で生じる単一のミスマッチは、ある程度許容される（Hsuら、Nat Biotechnol、３１巻：８２７頁、ＰＭＩＤ：２３８７３０８１）が、複数のミスマッチは、切断の効率の実質的な低減をもたらす。したがって、それらのＤＮＡ標的と、完全に相補的であり、ゲノム内の、他の全ての２０マーと、少なくとも２つまたは３つのミスマッチを有する標的化配列を伴うｇＲＮＡを構成することが、しばしば所望される。
【0023】
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける、ＤＮＡの、標的化された切断のために、ｇＲＮＡは通例、所望の２０ｎｔの標的化配列をコードするオリゴヌクレオチドを、Ｔ７プロモーターの下流の、ｇＲＮＡの定常領域を含有するプラスミドベクターへとクローニングすることにより調製する。次いで、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを伴う、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける転写反応を実施することにより、ｇＲＮＡを生成するのに、このプラスミドを使用することができる。次いで、結果として得られるｇＲＮＡを精製し、Ｃａｓ９タンパク質と複合体化させる。標的ＤＮＡを添加し、３７度で約１時間にわたり、切断反応を実施する。代替的に、ｇＲＮＡは、２０ｎｔの標的化配列と、隣接する定常領域とをコードするＤＮＡオリゴヌクレオチドを合成し、残りのｇＲＮＡの定常部分およびＴ７プロモーターを付加するように、メガプライマーＰＣＲまたはスティッチングＰＣＲを実施することにより作製することもできる。しばしば、多数の特異的遺伝子座でＤＮＡを切断することが所望される。これを達成するための、１つの効率的な方式は、マイクロアレイ上で、各々が、異なるｇＲＮＡ標的化配列をコードする、数百または数千のＤＮＡオリゴヌクレオチドを合成することである（Singh-Gassonら（１９９９年）、Nat Biotechnol、１７巻：９７４頁；Hughesら（２００１年）、Nat Biotechnol、１９巻：３４２頁）。次いで、このライブラリーを、Ｔ７プロモーターと、ｇＲＮＡの定常領域とを含有するプラスミドへとクローニングし、上記で記載したｇＲＮＡを生成する。代替的に、既に記載した、メガプライマーまたはスティッチングＰＣＲベースの戦略も使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【0024】
【0025】
【0026】
【0027】
【発明を実施するための形態】
【0028】
いくつかの実施形態の詳細な説明
図３Ａ～３Ｅは、ゲル電気泳動カセット（例えば、図１および２に例示される）を利用する、本開示の実施形態を例示する。図１は、市販の調製用電気泳動カセットおよびこのカセットを使用するサイズ選択工程についての概略図を示す。図１の左側では、試料核酸を、試料ウェルから、アガロースを充填した分離チャネルを通して、下方へと電気泳動させ、ここで、試料核酸は、サイズにより分離される。分離の後、分離電極をオフにし、溶出電極をオンにし、これにより、分離された核酸を、分離チャネルの右側の溶出モジュールのセットへと側方に、電気溶出させる。溶出させた核酸は、電気泳動緩衝液中に存在し、手動または自動のピペッティング手段を使用して、溶出モジュールから取り出すことができる。
図３Ａ～３Ｅは、ゲル電気泳動カセット（例えば、図１および２に例示される）を利用する、本開示の実施形態を例示する。図１は、市販の調製用電気泳動カセットおよびこのカセットを使用するサイズ選択工程についての概略図を示す。図１の左側では、試料核酸を、試料ウェルから、アガロースを充填した分離チャネルを通して、下方へと電気泳動させ、ここで、試料核酸は、サイズにより分離される。分離の後、分離電極をオフにし、溶出電極をオンにし、これにより、分離された核酸を、分離チャネルの右側の溶出モジュールのセットへと側方に、電気溶出させる。溶出させた核酸は、電気泳動緩衝液中に存在し、手動または自動のピペッティング手段を使用して、溶出モジュールから取り出すことができる。
【0029】
図１のカセットを、図２において示される通りに改変して、’８３３ ＰＣＴにおいて記載されている種類のカセットをもたらす。このカセットでは、試料ウェルを、試料ウェルの上流（すなわち、負の分離電極に対する近位側に対応する上流）の試薬ウェルと共に提供する。一部の実施形態では、試薬ウェルは、電気泳動による精製ステップの間に、試料ウェルが、試薬ウェルからの試薬により確実に完全に取り囲まれることを確実にするように、試料ウェルより容量が大きく、試料ウェルよりやや幅が広く深い。
【0030】
図３Ａ～３Ｅに示される、本開示の一部の実施形態に従う、例示的なワークフローは、以下の通りである（例示の簡略のため、図には、分離チャネルおよび溶出チャネルだけを示す）。図３Ａは、試料ローディングの直後のカセットを示す。試料は、細胞懸濁液であることが好ましい。好ましい試料の例は、全血、精製白血球、培養細胞の懸濁液、微生物の懸濁液、口腔内スワブから調製された細胞の懸濁液、および組織を単一細胞の懸濁液へと分散させるように、酵素的に処理された固形組織から調製された試料のうちのいずれかでありうる。試料細胞懸濁液は、細胞が、精製用電気泳動中に、浮揚したり、沈下したりしないように、等密度のローディング溶液中にロードすることが好ましい。
【0031】
図３Ａではまた、溶解試薬は、試薬ウェルにロードする。一部の実施形態では、試薬ウェルと、試料ウェルとは、物理的に隔離されており、ローディング中に混合することができない。一部の実施形態では、溶解試薬は、負に帯電した成分であって、ゲルマトリックスを通って、試料ウェルへと電気泳動しうる成分を含み、試料ウェルで、これらの成分は、試料ウェルの成分の混合または撹拌なしに、静かに、細胞を溶解させる。このように、溶解は、せん断を伴わずに生じ、まさにＨＭＷであるＤＮＡが生成される。好ましい溶解試薬は、ＳＤＳおよびサルコシルナトリウムなどのアニオン性界面活性剤、およびプロテイナーゼＫなど、界面活性剤耐性のプロテアーゼ、ＥＤＴＡおよびＥＧＴＡなどのキレート剤、ならびに上記の混合物を含む。
【0032】
試料ウェルおよび試薬ウェルへのローディングの後、分離電極を使用して、電気泳動場が印加され得る。電気泳動の初期相の間に、溶解試薬は、試料ウェルへと送達され、そこで、細胞を、粘性のせん断流を、ほとんどまたは全く伴わずに、迅速かつ静かに溶解させる。一部の実施形態では、タンパク質および他の細胞成分を、溶解試薬により、変性させ、かつ／または分解し、溶解試薬中のアニオン性界面活性剤により、負の電荷でコーティングする。結果として、このような夾雑物を、試料ウェルから、迅速に電気泳動させる。しかし、細胞溶解は急速かつ静穏であるので、細胞内のＤＮＡは、大部分が分解されないまま残り、分離ゲルカラムへは電気泳動しない大きなサイズ（＞１０メガ塩基であると推定される）である。ＨＭＷ ＤＮＡが、試料ウェルの下流の壁に捕捉され、界面活性剤ミセルおよび界面活性剤－タンパク質複合体が、ゲルの底部に捉えられた、精製用電気泳動の終点を、図３Ｂに、概略的に示す。
【0033】
ＤＮＡは、この精製ステップの間に、ゲルマトリックスに捉えられるようになるが、’８３３ ＰＣＴで記載されている、制限酵素、トランスポザーゼ、ポリメラーゼ、およびエクソヌクレアーゼなどのＤＮＡ修飾酵素によりプロセシング可能である。図３Ｃでは、試料ウェルおよび試薬ウェルを空にし、試薬ウェルに、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９切断緩衝液（下記の実施例を参照されたい）と適合性の緩衝液を再充填し、試料ウェルに、例えば、ＤＮＡシーケンシングによる、下流の解析のために、目的のＤＮＡ領域を取り囲む配列を切断するように構成されている、カスタムのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９切断試薬を再充填する。カセットを、ＨＭＷ ＤＮＡの効率的な切断を可能とするのに適する温度で、適する時間にわたりインキュベートする。放出されたＤＮＡを、試料ウェルの縁に捉えられたままである切断されていないＤＮＡから信頼できる形で分離しうるように、カスタマイズ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９試薬により放出されたＤＮＡ断片は約５メガ塩基未満のサイズであり、より好ましくは、約２メガ塩基未満のサイズであることが好ましい。
【0034】
図３Ｄでは、試料ＤＮＡの切断の後、試薬ウェルを空にし、精製試薬を再充填することができる。一部の実施形態では、精製試薬は、溶解試薬と同様または同一である。次いで、分離電極を活性化させることができる。したがって、次いで、溶解試薬を、試料ウェルを通して電気泳動させるのにつれて、Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ複合体を変性させ、かつ／または分解することができる。
【0035】
本発明の方法は、ロングレンジのゲノム解析に特に有用であることが予期されるが、方法は、小型(小さい)（本明細書では、「小型（小さい）」とは、約１０～約５０００ｂｐの長さを意味する）および大型（大きい）（本明細書では、「大型（大きい)」とは、５
０００ｂｐ～１桁の中程度の（ｍｉｄ－ｓｉｎｇｌｅ）メガ塩基対の長さを意味する）のＤＮＡ断片の両方に対する、標的にされた選択にも適用可能である。いずれの場合にも、各ゲノムＤＮＡ断片を、解析のために回収するように、カスタマイズ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９切断試薬の対を構成する。
０００ｂｐ～１桁の中程度の（ｍｉｄ－ｓｉｎｇｌｅ）メガ塩基対の長さを意味する）のＤＮＡ断片の両方に対する、標的にされた選択にも適用可能である。いずれの場合にも、各ゲノムＤＮＡ断片を、解析のために回収するように、カスタマイズ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９切断試薬の対を構成する。
【0036】
細胞壁を伴う細胞（例えば、細菌、真菌、および植物）を含む試料に対応する、一部の実施形態では、試料を、細胞壁を消化するように構成された酵素を含有する等張性試薬混合物中にロードし、これにより、元の試料細胞を、スフェロプラストへと変換する。一部のこのような実施形態では、試料ウェルへのロードを、電気泳動精製ステップの前に、溶解試薬を、試料ウェルへと拡散させる機会なくして、細胞壁の消化が、長時間にわたりなされるように、溶解試薬を試薬ウェルへと添加せずに行う。
【0037】
一部の実施形態では、例えば以下の項目が提供される：
（項目１）
ゲノムＤＮＡの断片を単離するための方法であって、
高分子量（ＨＭＷ）ＤＮＡを有する粒子を含有する試料を提供するステップと；
前記試料をゲルマトリックス内に封入するステップと；
試料を封入した前記ゲルマトリックスを、前記ＨＭＷ ＤＮＡを前記粒子から放出するように構成された溶解試薬へと曝露するステップと；
前記ＨＭＷ ＤＮＡが残留するように、前記ゲルマトリックスから、前記ＨＭＷ ＤＮＡを前記粒子、溶解試薬、および／または他の試料構成要素から取り出すように構成された電気泳動場に前記ゲルマトリックスを供することにより、前記試料の前記ＨＭＷ ＤＮＡを精製するステップと；
サイズを低減した断片としての前記ＤＮＡの、規定されたセグメントを遊離させるように、前記ゲルマトリックスを、前記ＨＭＷ ＤＮＡ内の特異的ＤＮＡ配列において切断するよう構成されたＤＮＡクリベース試薬に供するステップと；
前記ゲルマトリックスを、
前記ＤＮＡ断片を移動させ、これにより、実質的に不動のままである前記ＨＭＷ ＤＮＡの、切断されていないＤＮＡから分離するように構成された電気泳動場に供するステップと；
電気泳動により分離されたＤＮＡ断片を、前記ゲルマトリックスから単離するステップと
を含む方法。
（項目２）
前記ＨＭＷ ＤＮＡの切断されていない残余が、前記ゲルマトリックスに封入されたままである、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記粒子が、懸濁液中に含有され、動物細胞、植物細胞、細菌細胞、真菌細胞、古細菌細胞、原生動物細胞からなる群から選択される無傷細胞、および無傷ウイルス粒子のうちの少なくとも１つを含む、先行する項目のいずれかに記載の方法。
（項目４）
前記ゲルマトリックスが、アガロースヒドロゲルを、約０．２％～約５％（重量／容量）の間の濃度で含む、先行する項目のいずれかに記載の方法。
（項目５）
前記溶解試薬が、アニオン性界面活性剤を、０．０５％～１０％の間の濃度で含む、先行する項目のいずれかに記載の方法。
（項目６）
前記アニオン性界面活性剤が、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）である、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記ＨＭＷ ＤＮＡのサイズが、＞１０メガ塩基対の長さであり、前記ＤＮＡ断片のサイズが、＜２メガ塩基対の長さである、先行する項目のいずれかに記載の方法。
（項目８）
前記粒子が、細菌細胞、植物細胞、または真菌細胞を含む際に、前記ゲルマトリックスを、溶解の前に細胞壁を除去するように構成された他の酵素試薬処理に供するステップをさらに含む、項目３に記載の方法。
（項目９）
前記ＤＮＡ断片を、緩衝液を含有する溶出モジュールへの電気溶出により、前記ゲルマトリックスから単離する、先行する項目のいずれかに記載の方法。
（項目１０）
ＤＮＡクリベース試薬が、１つまたは複数のＲＮＡによりガイドされるエンドヌクレアーゼ組成物を含む、先行する項目のいずれかに記載の方法。
（項目１１）
前記ＲＮＡによりガイドされるエンドヌクレアーゼ組成物が、ガイドＲＮＡ－Ｃａｓ９複合体が、前記ＨＭＷ ＤＮＡの、使用者に指定された特異的部位で切断することを可能とするように構成されたガイドＲＮＡを伴うＣａｓ９タンパク質に基づく、項目１１に記載の方法。
（項目１２）
ゲノムＤＮＡの断片を単離するための方法であって、
高分子量（ＨＭＷ）ＤＮＡを含有する試料を提供するステップと；
前記試料をゲルマトリックス内に封入するステップと；
サイズを低減した断片としての前記ＨＭＷ ＤＮＡの、規定されたセグメントを遊離させるように、前記ゲルマトリックスを、前記ＨＭＷ ＤＮＡ内の特異的ＤＮＡ配列において切断するよう構成されたＤＮＡクリベース試薬に供するステップと；
前記ゲルマトリックスを、
前記ＤＮＡ断片を移動させ、これにより、実質的に不動のままである前記ＨＭＷ ＤＮＡの、切断されていないＤＮＡから分離するように構成された電気泳動場に供するステップと；
電気泳動により分離されたＤＮＡ断片を、前記ゲルマトリックスから単離するステップと
を含む方法。
（項目１３）
ゲノムＤＮＡの断片を単離するための方法であって、
高分子量（ＨＭＷ）ＤＮＡをゲルマトリックス内に封入するステップと；
サイズを低減した断片としての前記ＨＭＷ ＤＮＡの、規定されたセグメントを遊離させるように、前記ゲルマトリックスを、前記ＨＭＷ ＤＮＡ内の特異的ＤＮＡ配列において切断するよう構成されたＤＮＡクリベース試薬に供するステップと；
前記ゲルマトリックスを、
前記ＤＮＡ断片を移動させ、これにより、実質的に不動のままである前記ＨＭＷ ＤＮＡの、切断されていないＤＮＡから分離するように構成された電気泳動場に置くステップと；
電気泳動により分離されたＤＮＡ断片を、前記ゲルマトリックスから単離するステップと
を含む方法。
（項目１４）
項目１から１３のいずれかに記載の方法を実施するための装置またはシステム。
以下の実施例は、本開示の実施形態のうちの一部を例示し、裏書きする一助となるように提示されるものであり、限定的なものと考えるべきではない。
（項目１）
ゲノムＤＮＡの断片を単離するための方法であって、
高分子量（ＨＭＷ）ＤＮＡを有する粒子を含有する試料を提供するステップと；
前記試料をゲルマトリックス内に封入するステップと；
試料を封入した前記ゲルマトリックスを、前記ＨＭＷ ＤＮＡを前記粒子から放出するように構成された溶解試薬へと曝露するステップと；
前記ＨＭＷ ＤＮＡが残留するように、前記ゲルマトリックスから、前記ＨＭＷ ＤＮＡを前記粒子、溶解試薬、および／または他の試料構成要素から取り出すように構成された電気泳動場に前記ゲルマトリックスを供することにより、前記試料の前記ＨＭＷ ＤＮＡを精製するステップと；
サイズを低減した断片としての前記ＤＮＡの、規定されたセグメントを遊離させるように、前記ゲルマトリックスを、前記ＨＭＷ ＤＮＡ内の特異的ＤＮＡ配列において切断するよう構成されたＤＮＡクリベース試薬に供するステップと；
前記ゲルマトリックスを、
前記ＤＮＡ断片を移動させ、これにより、実質的に不動のままである前記ＨＭＷ ＤＮＡの、切断されていないＤＮＡから分離するように構成された電気泳動場に供するステップと；
電気泳動により分離されたＤＮＡ断片を、前記ゲルマトリックスから単離するステップと
を含む方法。
（項目２）
前記ＨＭＷ ＤＮＡの切断されていない残余が、前記ゲルマトリックスに封入されたままである、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記粒子が、懸濁液中に含有され、動物細胞、植物細胞、細菌細胞、真菌細胞、古細菌細胞、原生動物細胞からなる群から選択される無傷細胞、および無傷ウイルス粒子のうちの少なくとも１つを含む、先行する項目のいずれかに記載の方法。
（項目４）
前記ゲルマトリックスが、アガロースヒドロゲルを、約０．２％～約５％（重量／容量）の間の濃度で含む、先行する項目のいずれかに記載の方法。
（項目５）
前記溶解試薬が、アニオン性界面活性剤を、０．０５％～１０％の間の濃度で含む、先行する項目のいずれかに記載の方法。
（項目６）
前記アニオン性界面活性剤が、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）である、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記ＨＭＷ ＤＮＡのサイズが、＞１０メガ塩基対の長さであり、前記ＤＮＡ断片のサイズが、＜２メガ塩基対の長さである、先行する項目のいずれかに記載の方法。
（項目８）
前記粒子が、細菌細胞、植物細胞、または真菌細胞を含む際に、前記ゲルマトリックスを、溶解の前に細胞壁を除去するように構成された他の酵素試薬処理に供するステップをさらに含む、項目３に記載の方法。
（項目９）
前記ＤＮＡ断片を、緩衝液を含有する溶出モジュールへの電気溶出により、前記ゲルマトリックスから単離する、先行する項目のいずれかに記載の方法。
（項目１０）
ＤＮＡクリベース試薬が、１つまたは複数のＲＮＡによりガイドされるエンドヌクレアーゼ組成物を含む、先行する項目のいずれかに記載の方法。
（項目１１）
前記ＲＮＡによりガイドされるエンドヌクレアーゼ組成物が、ガイドＲＮＡ－Ｃａｓ９複合体が、前記ＨＭＷ ＤＮＡの、使用者に指定された特異的部位で切断することを可能とするように構成されたガイドＲＮＡを伴うＣａｓ９タンパク質に基づく、項目１１に記載の方法。
（項目１２）
ゲノムＤＮＡの断片を単離するための方法であって、
高分子量（ＨＭＷ）ＤＮＡを含有する試料を提供するステップと；
前記試料をゲルマトリックス内に封入するステップと；
サイズを低減した断片としての前記ＨＭＷ ＤＮＡの、規定されたセグメントを遊離させるように、前記ゲルマトリックスを、前記ＨＭＷ ＤＮＡ内の特異的ＤＮＡ配列において切断するよう構成されたＤＮＡクリベース試薬に供するステップと；
前記ゲルマトリックスを、
前記ＤＮＡ断片を移動させ、これにより、実質的に不動のままである前記ＨＭＷ ＤＮＡの、切断されていないＤＮＡから分離するように構成された電気泳動場に供するステップと；
電気泳動により分離されたＤＮＡ断片を、前記ゲルマトリックスから単離するステップと
を含む方法。
（項目１３）
ゲノムＤＮＡの断片を単離するための方法であって、
高分子量（ＨＭＷ）ＤＮＡをゲルマトリックス内に封入するステップと；
サイズを低減した断片としての前記ＨＭＷ ＤＮＡの、規定されたセグメントを遊離させるように、前記ゲルマトリックスを、前記ＨＭＷ ＤＮＡ内の特異的ＤＮＡ配列において切断するよう構成されたＤＮＡクリベース試薬に供するステップと；
前記ゲルマトリックスを、
前記ＤＮＡ断片を移動させ、これにより、実質的に不動のままである前記ＨＭＷ ＤＮＡの、切断されていないＤＮＡから分離するように構成された電気泳動場に置くステップと；
電気泳動により分離されたＤＮＡ断片を、前記ゲルマトリックスから単離するステップと
を含む方法。
（項目１４）
項目１から１３のいずれかに記載の方法を実施するための装置またはシステム。
以下の実施例は、本開示の実施形態のうちの一部を例示し、裏書きする一助となるように提示されるものであり、限定的なものと考えるべきではない。
【実施例】
【0038】
（実施例１）
ＨＬＡ遺伝子座から、長いＤＮＡ断片を単離するための、カスタムのＣａｓ９ ｇＲＮＡクリベース試薬
背景：ＨＬＡ分子は、クラスＩ（ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ）およびクラスＩＩ（ＨＬＡ－ＤＲＢ１／ＨＬＡ－ＤＲＢ３／ＨＬＡ－ＤＲＢ４／ＨＬＡ－ＤＲＢ５、ＨＬＡ－ＤＱＢ１、ＨＬＡ－ＤＰＢ１）遺伝子によりコードされる。これらの遺伝子は、Ｔ細胞受容体に対する多様なペプチドであって、Ｔ細胞の発生、自己寛容、および適応免疫を調節するペプチドをもたらす。ＨＬＡ分子は、免疫原性であり、同種移植設定において、細胞性免疫応答および体液性免疫応答の標的となり得るので、ＨＬＡ型解析は、移植のドナーとレシピエントとの間の免疫学的適合性を評価するための標準ケアとなっている。サンガーシーケンシングを使用して、一塩基の分解能におけるＨＬＡ型解析が実施されているが、これは、労働集約的で、費用がかかる。別個のハプロタイプのフェージングを必要とする一塩基変異体（ＳＮＶ）の数が多いため、シス／トランスの両義性が高頻度で生じるが、これは、配列特異的プライマーを伴うＰＣＲを含む、さらなる検査によらなければ解決することができない。ＩｌｌｕｍｉｎａおよびＩｏｎ－ｔｏｒｒｅｎｔを含む、いくつかの次世代シーケンシング（ＮＧＳ）技術は、ＨＬＡ型解析の費用を廉価としているが、数百塩基対を超える距離にわたり、ＳＮＶを直接フェージングすることは不可能である。Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＰａｃＢｉｏ）およびＯｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ製のシーケンサーなど、第三世代のシーケンサーは、廉価で、単一のＤＮＡ分子から、長いリードを得ることが可能である。これは、原理的には、ＨＬＡ遺伝子座のハプロタイプ分解型シーケンシングを可能とするが、現在のところ、ゲノムから、特異的な長いＤＮＡ断片を選択するための方法は確立されていない。これは、本出願の発明の方法により遂行することができる。そうするために、以下のステップを実施する。
ＨＬＡ遺伝子座から、長いＤＮＡ断片を単離するための、カスタムのＣａｓ９ ｇＲＮＡクリベース試薬
背景：ＨＬＡ分子は、クラスＩ（ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ）およびクラスＩＩ（ＨＬＡ－ＤＲＢ１／ＨＬＡ－ＤＲＢ３／ＨＬＡ－ＤＲＢ４／ＨＬＡ－ＤＲＢ５、ＨＬＡ－ＤＱＢ１、ＨＬＡ－ＤＰＢ１）遺伝子によりコードされる。これらの遺伝子は、Ｔ細胞受容体に対する多様なペプチドであって、Ｔ細胞の発生、自己寛容、および適応免疫を調節するペプチドをもたらす。ＨＬＡ分子は、免疫原性であり、同種移植設定において、細胞性免疫応答および体液性免疫応答の標的となり得るので、ＨＬＡ型解析は、移植のドナーとレシピエントとの間の免疫学的適合性を評価するための標準ケアとなっている。サンガーシーケンシングを使用して、一塩基の分解能におけるＨＬＡ型解析が実施されているが、これは、労働集約的で、費用がかかる。別個のハプロタイプのフェージングを必要とする一塩基変異体（ＳＮＶ）の数が多いため、シス／トランスの両義性が高頻度で生じるが、これは、配列特異的プライマーを伴うＰＣＲを含む、さらなる検査によらなければ解決することができない。ＩｌｌｕｍｉｎａおよびＩｏｎ－ｔｏｒｒｅｎｔを含む、いくつかの次世代シーケンシング（ＮＧＳ）技術は、ＨＬＡ型解析の費用を廉価としているが、数百塩基対を超える距離にわたり、ＳＮＶを直接フェージングすることは不可能である。Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＰａｃＢｉｏ）およびＯｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ製のシーケンサーなど、第三世代のシーケンサーは、廉価で、単一のＤＮＡ分子から、長いリードを得ることが可能である。これは、原理的には、ＨＬＡ遺伝子座のハプロタイプ分解型シーケンシングを可能とするが、現在のところ、ゲノムから、特異的な長いＤＮＡ断片を選択するための方法は確立されていない。これは、本出願の発明の方法により遂行することができる。そうするために、以下のステップを実施する。
【0039】
ＨＬＡ－Ａ遺伝子座から長い断片を切断するためのｇＲＮＡをコードするオリゴヌクレオチド：ＨＬＡ－Ａ遺伝子座の５’末端および３’末端を切断するように、ｇＲＮＡの標的化配列と、隣接する塩基とをコードするＤＮＡオリゴヌクレオチドを構成する。１つまたは複数のｇＲＮＡを、各末端へと標的化することができる（本実施例では、本発明者らは、２つを標的にする）。本実施例では、標的化配列および少量の定常ｇＲＮＡ配列を、ＩＤＴ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから取り寄せ、次いで、Ｔ７プロモーターの下流において、ｇＲＮＡの定常領域をコードする、ＤＲ２７４ベクター［ＰＭＩＤ：２３３６０９６４］へとクローニングした。結果として得られるプラスミドを、ＰＣＲ増幅し、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応を実施して、以下の配列：
5'ggNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTT、
［配列中、「Ｎ」は、ｇＲＮＡ標的化配列を表し、これらのＮに対して５’側にある、２つのｇは、Ｔ７による転写開始に必要とされる］を伴うｇＲＮＡを作製する。
5'ggNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTT、
［配列中、「Ｎ」は、ｇＲＮＡ標的化配列を表し、これらのＮに対して５’側にある、２つのｇは、Ｔ７による転写開始に必要とされる］を伴うｇＲＮＡを作製する。
【0040】
例えば、ＨＬＡ－Ａ遺伝子を標的にするために、本発明者らは、以下の標的化配列を使用する。ＨＬＡ－Ａの５’側のｇＲＮＡでは、
５ＨＬＡ－Ａ－ＴＳ１
ＡＧＧ ＰＡＭ配列のすぐ上流の、第６染色体のｃｈｒ６：２９，９４１，１８５－２９，９４１，２０４（全ての座標は、ヒト基準ゲノムアセンブリのバージョンＧＲＣｈ３８による）に存在する、５’－ＧＡＡＡＡＧＡＡＣＡＧＴＴＡＣＧＴＡＧＣ－３’。
５ＨＬＡ－Ａ－ＴＳ２
ＡＧＧ ＰＡＭのすぐ上流の、ｃｈｒ６：２９，９４１，０９６－２９，９４１，１１５に存在する、５’－ＣＣＡＧＡＡＧＣＴＴＣＡＣＡＡＧＡＣＣＧ－３’。標的部位である、５ＨＬＡ－Ａ－ＴＳ１および５ＨＬＡ－Ａ－ＴＳ２は、それぞれ、約１３５０および１４４０ｂｐだけ５’側において、コンセンサスのＨＬＡ－Ａコード始点（ｃｈｒ６：２９，９４２，５５３）に隣接するゲノム部位を切断するように構成する。
３ＨＬＡ－Ａ－ＴＳ１
ＧＧＧ ＰＡＭのすぐ上流の、ｃｈｒ６：２９９４９５２１－２９９４９５４０に存在する、５’－ＡＴＴＣＣＴＴＡＴＡＴＴＣＡＣＣＣＣＣＡ－３’。
３ＨＬＡ－Ａ－ＴＳ２
ＡＧＧ ＰＡＭのすぐ上流の、ｃｈｒ６：２９９４９５２０－２９９４９５３９に存在する、５’－ＣＡＴＴＣＣＴＴＡＴＡＴＴＣＡＣＣＣＣＣ－３’。
５ＨＬＡ－Ａ－ＴＳ１
ＡＧＧ ＰＡＭ配列のすぐ上流の、第６染色体のｃｈｒ６：２９，９４１，１８５－２９，９４１，２０４（全ての座標は、ヒト基準ゲノムアセンブリのバージョンＧＲＣｈ３８による）に存在する、５’－ＧＡＡＡＡＧＡＡＣＡＧＴＴＡＣＧＴＡＧＣ－３’。
５ＨＬＡ－Ａ－ＴＳ２
ＡＧＧ ＰＡＭのすぐ上流の、ｃｈｒ６：２９，９４１，０９６－２９，９４１，１１５に存在する、５’－ＣＣＡＧＡＡＧＣＴＴＣＡＣＡＡＧＡＣＣＧ－３’。標的部位である、５ＨＬＡ－Ａ－ＴＳ１および５ＨＬＡ－Ａ－ＴＳ２は、それぞれ、約１３５０および１４４０ｂｐだけ５’側において、コンセンサスのＨＬＡ－Ａコード始点（ｃｈｒ６：２９，９４２，５５３）に隣接するゲノム部位を切断するように構成する。
３ＨＬＡ－Ａ－ＴＳ１
ＧＧＧ ＰＡＭのすぐ上流の、ｃｈｒ６：２９９４９５２１－２９９４９５４０に存在する、５’－ＡＴＴＣＣＴＴＡＴＡＴＴＣＡＣＣＣＣＣＡ－３’。
３ＨＬＡ－Ａ－ＴＳ２
ＡＧＧ ＰＡＭのすぐ上流の、ｃｈｒ６：２９９４９５２０－２９９４９５３９に存在する、５’－ＣＡＴＴＣＣＴＴＡＴＡＴＴＣＡＣＣＣＣＣ－３’。
【0041】
３ＨＬＡ－Ａ－ＴＳ１と、３ＨＬＡ－Ａ－ＴＳ２とは、互いと重複し、約４０９０ｂｐだけ３’側において、ＨＬＡ－Ａのコンセンサスコード領域（ｃｈｒ６：２９，９４５，４５３）の終点に隣接する位置において、切断するように構成されている。
【0042】
これらのＨＬＡ－Ａ標的部位に由来する、標的にされたＣａｓ９切断産物は、約８３３０ｂｐ（５ＨＬＡ－Ａ－ＴＳ１～２ＨＬＡ－Ａ－ＴＳ１またはＨＬＡ－Ａ－ＴＳ２）および８４２０ｂｐ（５ＨＬＡ－Ａ－ＴＳ２～３ＨＬＡ－Ａ－ＴＳ１またはＨＬＡ－Ａ－ＴＳ２）の長さであると推測される。
【0043】
これらの標的化配列の各々を、ＤＲ２７４ベクター［ＰＭＩＤ：２３３６０９６４］へとクローニングするために、各標的化配列につき、２つのプライマーを取り寄せ、一緒にアニールさせた。これらのプライマーは、ｇＲＮＡの定常部分またはクローニングを容易とする隣接するＴ７プロモーターに由来する一部の配列を含み、以下：
5HLA-A-TS1F 5'-TAGG GAAAAGAACAGTTACGTAGC-3
5HLA-A-TS1R 5'-AAAC GCTACGTAACTGTTCTTTTC-3
5HLA-A-TS2F 5'-TAGG TTGAAAGCAGCAGAATTCTT-3
5HLA-A-TS2R 5'-AAAC AAGAATTCTGCTGCTTTCAA-3
3HLA-A-TS1F 5'-TAGG ATTCCTTATATTCACCCCCA-3
3HLA-A-TS1R 5'-AAAC TGGGGGTGAATATAAGGAAT-3
3HLA-A-TS2F 5'-TAGG TCTATCAACAAATTGCTAGG-3
3HLA-A-TS2R 5'-AAAC CCTAGCAATTTGTTGATAGA-3
の通りである。
5HLA-A-TS1F 5'-TAGG GAAAAGAACAGTTACGTAGC-3
5HLA-A-TS1R 5'-AAAC GCTACGTAACTGTTCTTTTC-3
5HLA-A-TS2F 5'-TAGG TTGAAAGCAGCAGAATTCTT-3
5HLA-A-TS2R 5'-AAAC AAGAATTCTGCTGCTTTCAA-3
3HLA-A-TS1F 5'-TAGG ATTCCTTATATTCACCCCCA-3
3HLA-A-TS1R 5'-AAAC TGGGGGTGAATATAAGGAAT-3
3HLA-A-TS2F 5'-TAGG TCTATCAACAAATTGCTAGG-3
3HLA-A-TS2R 5'-AAAC CCTAGCAATTTGTTGATAGA-3
の通りである。
【0044】
ｇＲＮＡをコードするオリゴヌクレオチドの、Ｔ７プロモーターを伴うベクターへのクローニング。プラスミドベクターであるＤＲ２７４を、ＢｓａＩで切断し、アガロースゲル上で精製し、Ｑｉａｇｅｎゲル精製キットを使用してクリーンナップした。１００ｕＭの、各ｇＲＮＡをコードするオリゴヌクレオチドを、以下の反応：
において、その相補体とアニールさせた。この反応物を、１００℃で、３～５分間にわたり加熱する。その後、ヒートブロックをオフにし、冷却させる。次いで、以下の反応：
を使用して、アニールさせたオリゴヌクレオチドをリン酸化させる。この反応物を、静かにボルテックスすることにより混合し、３７℃で３０分間にわたりインキュベートした。次に、以下の反応：
を使用して、アニールさせたリン酸化オリゴヌクレオチドを、Ｔ７プロモーターをコードするプラスミドへとライゲーションする。次に、１ｕｌのプラスミドミックスを、Ｅ．ｃｏｌｉへと形質転換し、アンピシリンを補充した、富栄養培地（ＬＢ）による寒天プレート上に播種した。Ａｍｐｒクローンを選択し、所望のガイドＲＮＡ配列を含有するプラスミドを、コロニーＰＣＲおよびサンガーシーケンシングにより検証した。適正なクローンを、１ｍｌのＬＢ＋ａｍｐ液体培地中、３７℃で、一晩にわたり増殖させ、Ｑｉａｇｅｎ
ＤＮＡ精製キットを使用してプラスミドを、培養物から単離する。
【表1】
【表2】
【表3】
ＤＮＡ精製キットを使用してプラスミドを、培養物から単離する。
【0045】
プラスミド鋳型からの、ｇＲＮＡのＰＣＲ増幅：プラスミド鋳型から、ｇＲＮＡを創出するために、プラスミドのＴ７プロモーターおよびｇＲＮＡ領域を、ＰＣＲにより増幅し、次いで、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応において、鋳型として使用する。ＰＣＲプライマーは、以下：フォワード４９８９：ＧＴＴＧＧＡＡＣＣＴＣＴＴＡＣＧＴＧＣＣ、リバース５００８：ＡＡＡＡＧＣＡＣＣＧＡＣＴＣＧＧＴＧの通りである。ＰＣＲ反応物を、以下：
の通りに準備する。この反応物を、以下の通り：９８℃で３０秒間の１サイクル、（９８℃で１０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で３０秒間×３５サイクル）、７２℃で５分間、４℃で無期限のサイクルにかけた。このＰＣＲは、３６９ｂｐのＰＣＲ断片をもたらし、次いで、これを、Ｑｉａｇｅｎカラムで精製する。
【表4】
【0046】
Ｍｍｅｓｓａｇｅ Ｍｍａｃｈｉｎｅ Ｔ７ ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写キット（ＡＭＢＩＯＮ型番１３４４）を使用するＲＮＡ合成反応：ＤＮＡ断片から、ｇＲＮＡを創出するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応を、以下：
の通りに実施する。ＲＮＡを回収するために、０．５ｕｌのＴｕｒｂｏ ＤＮアーゼ（２単位／ｕｌ）を添加し、３７℃で、１５分間にわたりインキュベートする。次いで、５０ｍＭのＥＤＴＡ ｐＨ８．０ ３０ｕｌを添加する。１５分間にわたり、８０℃へと加熱して、ＤＮアーゼを不活化させ、ＢＩＯ－ＲＡＤ Ｍｉｃｒｏ－Ｂｉｏ－ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎｓ（型番７３２－６２５０）を使用して、ＲＮＡを回収する。５００ｕｌのＴＥを満たすことにより、ｍｉｃｒｏ Ｂｉｏ－Ｓｐｉｎ Ｐ３０カラムを、ＴＥ中で平衡化させ、１０００ｇで、２分間にわたりスピンした。次いで、５０ｕｌの試料を、カラムへとロードし、１０００ｇで、４分間にわたりスピンする。試料を、約５０ｕｌ中で溶出させる。ＲＮＡの総収量を約１０ｕｇとするために、ｇＲＮＡは、約２００ｎｇ／ｕｌの濃度であるべきである。
【表5】
【0047】
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける、カスタムの機能的なＣａｓ９－ｇＲＮＡ複合体の再構成。活性なｇＲＮＡ－Ｃａｓ９複合体を形成するために、２．５ｕｌのｃａｓ９タンパク質（３．１８ｕｇ／ｕｌ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ型番Ｍ０３８６Ｍ（２０ｕＭのｃａｓ９タンパク質））を、１倍濃度のＮＥＢ緩衝液４合計８０ｕｌ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ；５０ｍＭの酢酸カリウム、２０ｍＭのトリス酢酸、１０ｍＭの酢酸Ｍｇ、１ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ７．９）中に、１０ｕｌのＲＮＡ（２０００ｎｇ）と混合する。３７℃で、１５分間にわたりプレインキュベートする。再構成されるｃａｓ９の濃度は、０．６３ｕＭ（０．１ｕｇ／ｕｌ）である。
【0048】
（実施例２）
本発明の電気泳動法を使用する、ヒトＨＬＡ遺伝子座からの、長いＤＮＡ断片の、標的化された切出しおよび回収。
本実施例では、’８３３ ＰＣＴにおいて記載されている調製用電気泳動システムであって、その例が、図２右においてもまた示される電気泳動システムを使用する。本実施例についての概略的ワークフローであって、例示を簡単にするために、分離用ゲルおよび溶出モジュールだけを示すワークフローを、図３Ａ～３Ｅに示す。０．５倍濃度のＫＢＢ緩衝液（５１ｍＭのトリス（塩基）、２９ｍＭのＴＡＰＳ（酸）、０．１ｍＭのＥＤＴＡ（酸）、ｐＨ８．７）中に、０．７５％のアガロースを含有する、本発明のカセットを使用する。試薬および試料ウェルの総容量は、それぞれ、３５０および９０ｕｌであった。
本発明の電気泳動法を使用する、ヒトＨＬＡ遺伝子座からの、長いＤＮＡ断片の、標的化された切出しおよび回収。
本実施例では、’８３３ ＰＣＴにおいて記載されている調製用電気泳動システムであって、その例が、図２右においてもまた示される電気泳動システムを使用する。本実施例についての概略的ワークフローであって、例示を簡単にするために、分離用ゲルおよび溶出モジュールだけを示すワークフローを、図３Ａ～３Ｅに示す。０．５倍濃度のＫＢＢ緩衝液（５１ｍＭのトリス（塩基）、２９ｍＭのＴＡＰＳ（酸）、０．１ｍＭのＥＤＴＡ（酸）、ｐＨ８．７）中に、０．７５％のアガロースを含有する、本発明のカセットを使用する。試薬および試料ウェルの総容量は、それぞれ、３５０および９０ｕｌであった。
【0049】
ＲＢＣの選択的溶解による、ヒトＷＢＣの、全血からの調製：全てのステップを、室温で実施する。１２ｍＬの全血（ＡＣＤ抗凝固剤）に、３６ｍＬの赤血球（ＲＢＣ）溶解緩衝液（１５５ｍＭの塩化アンモニウム；１０ｍＭのＮａＨＣＯ３；１ｍＭのＮａ２ＥＤＴＡ）を添加した。溶液を、３分間にわたりロッキングし、４００×ｇで、４分間にわたる遠心分離により、白血球を、ペレット化させた。ピンク色の上清をデカントし、２５ｍＬのＲＢＣ溶解緩衝液中でボルテックスすることにより、赤色のペレットを再懸濁させた。２回目のスピンおよびデカンテーションの後、ピンク色のペレットを、９００ｕＬのＲＢＣ溶解緩衝液中に再懸濁させた。
【0050】
Ｑｕｂｉｔによる、ＷＢＣ ＤＮＡ濃度の測定。Ｑｕｂｉｔ ＨＳアッセイ（Ｌｉｆｅ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用した。４０ｕＬのＷＢＣを、１６０ｕＬのＴＥ／５０ｍＭのＮａＣｌ／１％ＳＤＳと混合するのに続く、６５℃で３分間にわたるインキュベーションにより、ＷＢＣを溶解させた。ＴＥ（８００ｕＬ）を添加し、粘度を低減するためにボルテックスした後、販売元のプロトコールに従い、１または２．５ｕＬのＤＮＡを、１９９ｕＬのＱｕｂｉｔ試薬へと添加した。
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用した。４０ｕＬのＷＢＣを、１６０ｕＬのＴＥ／５０ｍＭのＮａＣｌ／１％ＳＤＳと混合するのに続く、６５℃で３分間にわたるインキュベーションにより、ＷＢＣを溶解させた。ＴＥ（８００ｕＬ）を添加し、粘度を低減するためにボルテックスした後、販売元のプロトコールに従い、１または２．５ｕＬのＤＮＡを、１９９ｕＬのＱｕｂｉｔ試薬へと添加した。
【0051】
カスタムのｇＲＮＡ－Ｃａｓ９試薬および調製用電気泳動による、ＨＬＡ断片の標的化された回収：精製ＷＢＣ（１０～１２ｕｇのゲノムＤＮＡを含有する）を、ＲＢＣ溶解緩衝液中のカセットの、空の試料ウェルへとロードした。ロードされた試料の総容量は、８０ｕｌであった。溶解緩衝液（１０ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭのＥＤＴＡ、３％のＳＤＳ、５％のグリセロール、それぞれ５０ｕｇ／ｍＬのブロモフェノールブルーおよびフェノールレッド）３２０ｕｌを、空の試薬ウェルへと添加した。図３Ａを参照されたい。
【0052】
分離電極を、１００Ｖで４０分間にわたり使用する、ＳａｇｅＥＬＦ計器（Ｓａｇｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．）内の電気泳動により、細胞溶解およびＤＮＡの精製を実行した。図３Ｂを参照されたい。
【0053】
精製用電気泳動の後、試薬ウェルおよび試料ウェルを空にした。試薬ウェルに、１倍濃度のＮＥＢ緩衝液４ ３２０ｕｌを再ロードした。試料ウェルに、実施例１で記載した、再構成されたカスタムのＣａｓ９－ｇＲＮＡ試薬混合物を、８０ｕｌの総容量中に、５ｐＭの濃度（Ｃａｓ９タンパク質の総濃度）で含有する、１倍濃度のＮＥＢ緩衝液＃４ ８０ｕｌを再ロードした。カセットを、３７℃で６０分間にわたりインキュベートして、固定化させたゲノムＤＮＡ内の、ＨＬＡ標的部位の切断を可能とした。図３Ｃを参照されたい。
【0054】
切断の後、試薬ウェルおよび試料ウェルを空にし、試薬ウェルに、０．５倍濃度のＫＢＢ＋３％のサルコシルナトリウム３２０ｕｌを再充填した。試料ウェルに、２００ｕｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫを、加えて含有する、８０ｕｌの同じ緩衝液を充填した。カセットを、３７℃で３０分間にわたりインキュベートして、Ｃａｓ９タンパク質試薬の消化を可能とした（図３Ｄを参照されたい）。
【0055】
消化の後で、カセットを、６０Ｖの連続場で１時間にわたるプログラムを使用する、分離モードのＳａｇｅＥＬＦ計器内で電気泳動させた。図３Ｅを参照されたい。
【0056】
分離用電気泳動の後、ＥＬＦ計器内で、５０Ｖの電圧を使用して、４５分間にわたり、電気溶出を実行する。溶出の終了時に、２５Ｖの場を、逆方向に、５秒間にわたり印加して、溶出させたＤＮＡを、溶出モジュールの限外濾過膜から放出する一助とした。手動または自動の液体取扱手段により、標的断片を、電気泳動緩衝液中の溶出モジュールから取り出した。（溶出および溶出モジュールからの回収は、図３Ａ～３Ｅに示されていない）。
【0057】
（実施例３）
ヒトタンパク質コード配列の標的化された単離（エクソン単離）のための、カスタムのｇＲＮＡ－Ｃａｓ９の構築
ガイドＲＮＡの設計。本発明者らは、全てのヒトエクソン（エクソンの各側の、一部の隣接する非エクソン配列と共に）を、２００～５００ｂｐの長さの断片へと切断するために、ｇＲＮＡを設計／構成した。ｇＲＮＡは、ＮＧＧ部位のすぐ５’側の、全てが２０ｂｐのＤＮＡ配列を検討することにより選び出し、次いで、エクソンを挟む対を、このセットから選択した。５００塩基対より長いエクソンについては、エクソン配列を、５００塩基対未満の長さの、２つまたはこれを超える断片へと切断するように、エクソンの内部のｇＲＮＡもまた構成した。オフ標的のゲノム部位において、正確なマッチ、または１もしくは２ｂｐのミスマッチを有するｇＲＮＡは廃棄する。
ヒトタンパク質コード配列の標的化された単離（エクソン単離）のための、カスタムのｇＲＮＡ－Ｃａｓ９の構築
ガイドＲＮＡの設計。本発明者らは、全てのヒトエクソン（エクソンの各側の、一部の隣接する非エクソン配列と共に）を、２００～５００ｂｐの長さの断片へと切断するために、ｇＲＮＡを設計／構成した。ｇＲＮＡは、ＮＧＧ部位のすぐ５’側の、全てが２０ｂｐのＤＮＡ配列を検討することにより選び出し、次いで、エクソンを挟む対を、このセットから選択した。５００塩基対より長いエクソンについては、エクソン配列を、５００塩基対未満の長さの、２つまたはこれを超える断片へと切断するように、エクソンの内部のｇＲＮＡもまた構成した。オフ標的のゲノム部位において、正確なマッチ、または１もしくは２ｂｐのミスマッチを有するｇＲＮＡは廃棄する。
【0058】
大規模の並列的なオリゴヌクレオチドの合成および増幅。ｇＲＮＡをコードするヌクレオチドのライブラリーは、Ｃｕｓｔｏｍ Ａｒｒａｙ（Ｂｏｔｈｅｌｌ、ＷＡ、ＵＳＡ）から取り寄せた。フォーマットは、
［配列中、「Ｎ」は、標的化配列を表し、下線を付した配列は、Ｔ７プロモーターである］である。このライブラリーを、以下のプライマー：フォワード：
およびリバース：５’ＡＡＡＡＡＧＣＡＣＣＧＡＣＴＣＧＧＴＧＣＣＡＣＴＴＴＴ－３’を伴うＰＣＲを実施することにより増幅する。ＰＣＲ産物を、１３４ｂｐであると予測し、ゲル精製する。
【化1】
【化2】
【0059】
Ｍｍｅｓｓａｇｅ Ｍｍａｃｈｉｎｅ Ｔ７（ＡＭＢＩＯＮ型番１３４４）を使用する、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によるｇＲＮＡの生成。ＤＮＡ断片から、ｇＲＮＡを創出するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける転写反応を、以下：
の通りに実施した。
【表6】
【0060】
ＲＮＡを回収するために、０．５ｕｌのＴｕｒｂｏ ＤＮアーゼ（２単位／ｕｌ）を添加し、３７℃で、１５分間にわたりインキュベートする。次いで、５０ｍＭのＥＤＴＡ ｐＨ８．０ ３０ｕｌを添加する。１５分間にわたり、８０℃へと加熱して、ＤＮアーゼを不活化させ、ＢＩＯ－ＲＡＤ Ｍｉｃｒｏ－Ｂｉｏ－ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎｓ（型番７３２－６２５０）を使用して、ＲＮＡを回収する。５００ｕｌのＴＥを満たすことにより、ｍｉｃｒｏ Ｂｉｏ－Ｓｐｉｎ Ｐ３０カラムを、ＴＥ中で平衡化させ、１０００ｇで、２分間にわたりスピンした。次いで、５０ｕｌの試料を、カラムへとロードし、１０００ｇで、４分間にわたりスピンする。試料を、約５０ｕｌ中で溶出させる。ＲＮＡの総収量を約１０ｕｇとするために、ｇＲＮＡライブラリーは、約２００ｎｇ／ｕｌの濃度であるべきである。
【0061】
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける、カスタムの機能的なＣａｓ９－ｇＲＮＡ複合体の再構成。ゲノムＤＮＡを切断するために、２．５ｕｌのｃａｓ９タンパク質（３．１８ｕｇ／ｕｌ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ型番Ｍ０３８６Ｍ（２０ｕＭのｃａｓ９タンパク質））を、１倍濃度のＮＥＢ緩衝液４合計８０ｕｌ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ；５０ｍＭの酢酸カリウム、２０ｍＭのトリス酢酸、１０ｍＭの酢酸Ｍｇ、１ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ７．９）中に、１０ｕｌのＲＮＡ（２０００ｎｇ）と混合する。３７℃で、１５分間にわたりプレインキュベートする。再構成されるｃａｓ９の濃度は、０．６３ｕＭ（０．１ｕｇ／ｕｌ）である。
【0062】
調製用電気泳動による、エクソンを含有するｇＤＮＡの、標的化された切出しおよび精製。全ゲノムＤＮＡの、ヒトＷＢＣからの精製を、実施例２で記載した通りに実行した。２つの点：
（１）切断ステップでは、より高濃度の、再構成されたｇＲＮＡ－Ｃａｓ９複合体：実施例２における、ＨＬＡ－Ａの場合に使用した８つの部位と比べて、約２０，０００倍というより大きな数の切断であって、全てのエクソン含有ＤＮＡを切り出すのに必要とされる切断を反映する濃度である、０．６３ｕＭの、再構成されたｇＲＮＡ－Ｃａｓ９複合体８０ｕｌを利用した点；
（２）調製用ゲルカセットでは、予測される２００～５００ｂｐの標的に対する、より良好なサイズ分解能のために、２％のアガロースゲル（実施例２で使用した０．７５％のゲルの代わりに）を利用した点
を除き、標的化された切出しもまた、実施例２で記載した通りに実行した。
（１）切断ステップでは、より高濃度の、再構成されたｇＲＮＡ－Ｃａｓ９複合体：実施例２における、ＨＬＡ－Ａの場合に使用した８つの部位と比べて、約２０，０００倍というより大きな数の切断であって、全てのエクソン含有ＤＮＡを切り出すのに必要とされる切断を反映する濃度である、０．６３ｕＭの、再構成されたｇＲＮＡ－Ｃａｓ９複合体８０ｕｌを利用した点；
（２）調製用ゲルカセットでは、予測される２００～５００ｂｐの標的に対する、より良好なサイズ分解能のために、２％のアガロースゲル（実施例２で使用した０．７５％のゲルの代わりに）を利用した点
を除き、標的化された切出しもまた、実施例２で記載した通りに実行した。
【0063】
（実施例４）
標的化されたゲノムのＤＮＡシーケンシングによる、転座切断点の特徴づけ
細胞遺伝学的研究は、特異的染色体再配列が、ヒト腫瘍と関連するという発見をもたらした。特異的ヒトがんにおける、最初の再現可能な染色体異常は、慢性骨髄性白血病と関連する、フィラデルフィア染色体であった。その後の分子的研究は、この再配列が、ｖ－ａｂｌがん遺伝子の相同体であるｃ－ａｂｌと、ｂｃｒ（切断点クラスター領域）と呼ばれる遺伝子とからなる、融合タンパク質をもたらすことを示した。このｂｃｒ－ａｂｌ融合タンパク質は、発がん性であり、Ｇｌｅｅｖｅｃと呼ばれる、大きな成功を収めた治療剤の標的である。
標的化されたゲノムのＤＮＡシーケンシングによる、転座切断点の特徴づけ
細胞遺伝学的研究は、特異的染色体再配列が、ヒト腫瘍と関連するという発見をもたらした。特異的ヒトがんにおける、最初の再現可能な染色体異常は、慢性骨髄性白血病と関連する、フィラデルフィア染色体であった。その後の分子的研究は、この再配列が、ｖ－ａｂｌがん遺伝子の相同体であるｃ－ａｂｌと、ｂｃｒ（切断点クラスター領域）と呼ばれる遺伝子とからなる、融合タンパク質をもたらすことを示した。このｂｃｒ－ａｂｌ融合タンパク質は、発がん性であり、Ｇｌｅｅｖｅｃと呼ばれる、大きな成功を収めた治療剤の標的である。
【0064】
今日では、多様な腫瘍と関連する、数千ではないにせよ、数百に及ぶ染色体転座が存在する。一般的な染色体切断部位は、第２染色体のｐ２３上に存在する、未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）をコードする遺伝子内で生じる。それは、多くの異なる腫瘍において、様々な異なる染色体へと転座する［ＰＭＩＤ：２３８１４０４３］。しかし、それは、染色体５ｑ３５のＡＬＫおよびヌクレオフォスミン（ＮＰＭ１）遺伝子を含む転座が観察される［ＰＭＩＤ：２５８６９２８５］、非ホジキンリンパ腫のサブセットにおいて、最も一般的に再配列される。この転座は、治療剤であるクリゾチニブの標的である、ＮＰＭ１－ＡＬＫ融合遺伝子の形成を可能とする［ＰＭＩＤ：２４４９１３０２］。これらの転座における正確な切断部位は、可変的な場合があるので、それゆえ従来型のＮＧＳにより検出することは困難である。配列解析のために、再配列された遺伝子座を含有する、大きなＤＮＡ断片を得ることができれば、煩瑣な細胞遺伝学的アッセイに対する必要が低減されるであろう。
【0065】
ＮＰＭ１－ＡＬＫ転座を含む長い断片を切断するｇＲＮＡをコードするオリゴヌクレオチド。この断片を単離するために、染色体５ｑ３５上の、ＮＰＭ１遺伝子の５’側と、染色体２ｐ２３上の、ＡＬＫ遺伝子に対する３’側とを切断するように、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡオリゴヌクレオチドを構成する。ＮＰＭ１－ＡＬＫ ｔ（２；５）転座を伴う細胞内では、これらのｇＲＮＡは、再配列された接合部を含有する大きな断片を切断するように、Ｃａｓ９を方向づける。２つまたはこれを超えるｇＲＮＡを、各末端を標的にして、指定された領域における切断と、ＮＰＭ１－ＡＬＫを含有する断片の切出しとを確保することができる。
【0066】
標的化配列をコードする短いオリゴヌクレオチドを、Ｔ７プロモーターの下流において、ｇＲＮＡの定常領域をコードする、ＤＲ２７４ベクター［ＰＭＩＤ：２３３６０９６４］へとクローニングする。ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける転写の後で、以下の配列：
5'ggNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTT、
［配列中、「Ｎ」は、ｇＲＮＡの標的化配列を表し、５’側のｇは、Ｔ７による転写に必要とされる］
を伴うｇＲＮＡを生成する。
5'ggNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTT、
［配列中、「Ｎ」は、ｇＲＮＡの標的化配列を表し、５’側のｇは、Ｔ７による転写に必要とされる］
を伴うｇＲＮＡを生成する。
【0067】
本実施例では、本発明者らは、以下の標的化配列を使用する。ＮＰＭ１の５’側のｇＲＮＡでは、
ＮＰＭ１－ＴＳ１
ＡＧＧ ＰＡＭ配列のすぐ上流で、ＮＰＭ１コード配列（ｃｈｒ５：１７１，３８７，９４９）の開始から、約９００ｂｐ上流にあり、多くのＮＰＭ１－ＡＬＫ間の切断点が生じる、９１０ｂｐ長のＮＰＭ１イントロン５（ｃｈｒ５：１７１，３９１，７９９）の開始から、約４７５０ｂｐ上流にある、ｃｈｒ５：１７１，３８７，０３１～１７１，３８７，０５０に存在する、５’ＣＡＡＧＴＣＡＣＣＣＧＣＴＴＴＣＴＴＴＣ３’。
ＮＰＭ１－ＴＳ２
ＡＧＧ ＰＡＭのすぐ上流で、ＮＰＭ１コード配列の開始から、約７５０ｂｐ上流にあり、ＮＰＭ１イントロン５の開始から、約４６００ｂｐ上流にある、ｃｈｒ５：１７１，３８７，１８５～１７１，３８７，２０４に存在する、５’ＧＡＣＴＴＴＧＧＡＧＡＴＧＴＴＴＴＣＴＣ３’。
ＡＬＫの３’側のｇＲＮＡでは、
ＡＬＫ－ＴＳ１
ＧＧＧ ＰＡＭのすぐ上流で、ＡＬＫコード配列（ｃｈｒ２：２９，１９３，２２５）の末端から、２９３０ｂｐ下流（３’側）にあり、多くのＮＰＭ１－ＡＬＫ間の切断点が生じる、１９４０ｂｐ長のＡＬＫイントロン１９の末端から、３３２４０ｂｐ下流（３’側）にある、ｃｈｒ２：２９，１９０，２７２～２９，１９０，２９１に存在する、５’－ＧＡＡＧＡＡＡＡＣＡＴＧＧＣＡＣＡＡＡＴ－３’。
ＡＬＫ－ＴＳ２
ＧＧＧ ＰＡＭのすぐ上流で、ＡＬＫコード配列の末端から、約２７００ｂｐ下流（３’側）にある、ｃｈｒ２：２９，１９０，５１８～２９，１９０，５３７に存在する、５’－ＣＡＡＴＧＧＧＴＣＡＧＡＴＡＡＣＴＣＡＡ－３’。
ＮＰＭ１－ＴＳ１
ＡＧＧ ＰＡＭ配列のすぐ上流で、ＮＰＭ１コード配列（ｃｈｒ５：１７１，３８７，９４９）の開始から、約９００ｂｐ上流にあり、多くのＮＰＭ１－ＡＬＫ間の切断点が生じる、９１０ｂｐ長のＮＰＭ１イントロン５（ｃｈｒ５：１７１，３９１，７９９）の開始から、約４７５０ｂｐ上流にある、ｃｈｒ５：１７１，３８７，０３１～１７１，３８７，０５０に存在する、５’ＣＡＡＧＴＣＡＣＣＣＧＣＴＴＴＣＴＴＴＣ３’。
ＮＰＭ１－ＴＳ２
ＡＧＧ ＰＡＭのすぐ上流で、ＮＰＭ１コード配列の開始から、約７５０ｂｐ上流にあり、ＮＰＭ１イントロン５の開始から、約４６００ｂｐ上流にある、ｃｈｒ５：１７１，３８７，１８５～１７１，３８７，２０４に存在する、５’ＧＡＣＴＴＴＧＧＡＧＡＴＧＴＴＴＴＣＴＣ３’。
ＡＬＫの３’側のｇＲＮＡでは、
ＡＬＫ－ＴＳ１
ＧＧＧ ＰＡＭのすぐ上流で、ＡＬＫコード配列（ｃｈｒ２：２９，１９３，２２５）の末端から、２９３０ｂｐ下流（３’側）にあり、多くのＮＰＭ１－ＡＬＫ間の切断点が生じる、１９４０ｂｐ長のＡＬＫイントロン１９の末端から、３３２４０ｂｐ下流（３’側）にある、ｃｈｒ２：２９，１９０，２７２～２９，１９０，２９１に存在する、５’－ＧＡＡＧＡＡＡＡＣＡＴＧＧＣＡＣＡＡＡＴ－３’。
ＡＬＫ－ＴＳ２
ＧＧＧ ＰＡＭのすぐ上流で、ＡＬＫコード配列の末端から、約２７００ｂｐ下流（３’側）にある、ｃｈｒ２：２９，１９０，５１８～２９，１９０，５３７に存在する、５’－ＣＡＡＴＧＧＧＴＣＡＧＡＴＡＡＣＴＣＡＡ－３’。
【0068】
図４は、ＮＰＭ１－ＡＬＫ融合再配列をもたらす、標的化部位、関連のあるコード領域、一部の一般的な切断点についての模式図（Morrisら（１９９４年）、Science、２６３
巻：１２８１頁；Duysterら（２００１年）、Oncogene、２０巻：５６２３頁）を示す。
巻：１２８１頁；Duysterら（２００１年）、Oncogene、２０巻：５６２３頁）を示す。
【0069】
融合のどちらかの末端における、代替的なｇＲＮＡ標的部位に起因する、断片サイズの可能な変動を考慮し、また、９１０ｂｐのＮＰＭ１イントロン５内および１９４０ｂｐのＡＬＫイントロン１９内の、転座切断点の位置の変動も考慮すると、ＮＭＰ１－ＡＬＫ融合遺伝子の、上記で記載した、カスタムのｇＲＮＡ－Ｃａｓ９複合体による消化は、３７．５ｋｂ～４０．８ｋｂの間の長さの断片をもたらすはずである。
【0070】
これらの標的化配列の各々を、ＤＲ２７４ベクターへとクローニングするために、各標的化配列につき、２つのプライマーを取り寄せ、一緒にアニールさせた。これらのプライマーは、ｇＲＮＡの定常部分またはクローニングを容易とする隣接するＴ７プロモーターに由来する一部の配列を含み、以下：
NPM1-TS1F 5'-TAGGCAAGTCACCCGCTTTCTTTC-3
NPM1-TS1R 5'-AAACGAAAGAAAGCGGGTGACTTG-3
NPM1-TS2F 5'-TAGGACTTTGGAGATGTTTTCTC-3
NPM1-TS2R 5'-AAACGAGAAAACATCTCCAAAGT-3
ALK-TS1F 5'-TAGGAGGGGCGCCCAATTTTGTCT-3
ALK-TS1R 5'-AAACAGACAAAATTGGGCGCCCCT-3
ALK-TS2F 5'-TAGGTCTATCAACAAATTGCTAGGAGG-3
ALK-TS2R 5'-AAAC CCTAGCAATTTGTTGATAGA-3
の通りである。
NPM1-TS1F 5'-TAGGCAAGTCACCCGCTTTCTTTC-3
NPM1-TS1R 5'-AAACGAAAGAAAGCGGGTGACTTG-3
NPM1-TS2F 5'-TAGGACTTTGGAGATGTTTTCTC-3
NPM1-TS2R 5'-AAACGAGAAAACATCTCCAAAGT-3
ALK-TS1F 5'-TAGGAGGGGCGCCCAATTTTGTCT-3
ALK-TS1R 5'-AAACAGACAAAATTGGGCGCCCCT-3
ALK-TS2F 5'-TAGGTCTATCAACAAATTGCTAGGAGG-3
ALK-TS2R 5'-AAAC CCTAGCAATTTGTTGATAGA-3
の通りである。
【0071】
ｇＲＮＡをコードするオリゴヌクレオチドの、Ｔ７プロモーターを伴うベクターへのクローニング。プラスミドベクターであるＤＲ２７４［ｒｅｆ］を、ＢｓａＩで切断し、アガロースゲル上で精製し、Ｑｉａｇｅｎゲル精製キットを使用してクリーンナップした。１００ｕＭの、各ｇＲＮＡをコードするオリゴヌクレオチドを、以下の反応：
において、その相補体とアニールさせた。この反応物を、１００℃で、３～５分間にわたり加熱する。その後、ヒートブロックをオフにし、冷却させる。次いで、以下の反応：
を使用して、アニールさせたオリゴヌクレオチドをリン酸化させる。この反応物を、静かにボルテックスすることにより混合し、３７℃で３０分間にわたりインキュベートした。
【表7】
【表8】
【0072】
次に、以下の反応：
を使用して、アニールさせたリン酸化オリゴヌクレオチドを、Ｔ７プロモーターをコードするプラスミドへとライゲーションする。
【表9】
【0073】
次に、１ｕｌのプラスミドミックスを、Ｅ．ｃｏｌｉへと形質転換し、アンピシリンを補充した、富栄養培地（ＬＢ）による寒天プレート上に播種した。Ａｍｐｒクローンを選択し、所望のガイドＲＮＡ配列を含有するプラスミドを、コロニーＰＣＲおよびサンガーシーケンシングにより検証した。適正なクローンを、１ｍｌのＬＢ＋ａｍｐ液体培地中、３７℃で、一晩にわたり増殖させ、Ｑｉａｇｅｎ ＤＮＡ精製キットを使用してプラスミドを、培養物から単離する。
【0074】
プラスミド鋳型からの、ｇＲＮＡのＰＣＲ増幅。プラスミド鋳型から、ｇＲＮＡを創出するために、プラスミドのＴ７プロモーターおよびｇＲＮＡ領域を、ＰＣＲにより増幅し、次いで、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応において、鋳型として使用する。ＰＣＲプライマーは、以下：フォワード４９８９：ＧＴＴＧＧＡＡＣＣＴＣＴＴＡＣＧＴＧＣＣ、リバース５００８：ＡＡＡＡＧＣＡＣＣＧＡＣＴＣＧＧＴＧの通りである。ＰＣＲ反応物を、以下：
の通りに準備する。この反応物を、以下の通り：９８℃で３０秒間の１サイクル、（９８℃で１０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で３０秒間×３５サイクル）、７２℃で５分間、４℃で無期限のサイクルにかける。このＰＣＲは、３６９ｂｐのＰＣＲ断片をもたらし、次いで、これを、Ｑｉａｇｅｎカラムで精製する。
【表10】
【0075】
Ｍｍｅｓｓａｇｅ Ｍｍａｃｈｉｎｅ Ｔ７ ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写キット（ＡＭＢＩＯＮ型番１３４４）を使用するＲＮＡ合成反応：ＤＮＡ断片から、ｇＲＮＡを創出するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応を、以下：
の通りに実施する。
【表11】
【0076】
ＲＮＡを回収するために、０．５ｕｌのＴｕｒｂｏ ＤＮアーゼ（２単位／ｕｌ）を添加し、３７℃で、１５分間にわたりインキュベートする。次いで、５０ｍＭのＥＤＴＡ ｐＨ８．０ ３０ｕｌを添加する。１５分間にわたり、８０℃へと加熱して、ＤＮアーゼを不活化させ、ＢＩＯ－ＲＡＤ Ｍｉｃｒｏ－Ｂｉｏ－ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎｓ（型番７３２－６２５０）を使用して、ＲＮＡを回収する。５００ｕｌのＴＥを満たすことにより、ｍｉｃｒｏ Ｂｉｏ－Ｓｐｉｎ Ｐ３０カラムを、ＴＥ中で平衡化させ、１０００ｇで、２分間にわたりスピンした。次いで、５０ｕｌの試料を、カラムへとロードし、１０００ｇで、４分間にわたりスピンする。試料を、約５０ｕｌ中で溶出させる。ＲＮＡの総収量を約１０ｕｇとするために、ｇＲＮＡは、約２００ｎｇ／ｕｌの濃度であるべきである。
【0077】
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける、カスタムの機能的なＣａｓ９－ｇＲＮＡ複合体の再構成。活性なｇＲＮＡ－Ｃａｓ９複合体を形成するために、２．５ｕｌのｃａｓ９タンパク質（３．１８ｕｇ／ｕｌ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ型番Ｍ０３８６Ｍ（２０ｕＭのｃａｓ９タンパク質））を、１倍濃度のＮＥＢ緩衝液４合計８０ｕｌ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ；５０ｍＭの酢酸カリウム、２０ｍＭのトリス酢酸、１０ｍＭの酢酸Ｍｇ、１ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ７．９）中に、１０ｕｌのＲＮＡ（２０００ｎｇ）と混合する。３７℃で、１５分間にわたりプレインキュベートする。再構成されるｃａｓ９の濃度は、０．６３ｕＭ（０．１ｕｇ／ｕｌ）である。
【0078】
調製用電気泳動による、ゲノムＮＰＭ１－ＡＬＫ融合断片の、標的化された切出しおよび精製：全ゲノムＤＮＡの、ヒトＷＢＣからの精製を、実施例２で記載した通りに実行した。ＮＰＭ１－ＡＬＫ転座特異的Ｃａｓ９標的化複合体を使用する、標的化された切出しもまた、実施例２で記載した通りに実行した。
【0079】
消化の後で、カセットを、６０Ｖの連続場で１時間のプログラムを使用する、分離モードのＳａｇｅＥＬＦ計器内で電気泳動させるのに続き、「Pippin Pulse User Manual
」（http://www.sagescience.com/product-support/pippin-pulse-support/）において記載されている、５～４３０ｋｂのＤＮＡを分離するための波形を使用して、８０Ｖで２時間にわたり、パルス化場電気泳動を行った。
」（http://www.sagescience.com/product-support/pippin-pulse-support/）において記載されている、５～４３０ｋｂのＤＮＡを分離するための波形を使用して、８０Ｖで２時間にわたり、パルス化場電気泳動を行った。
【0080】
分離用電気泳動の後、ＥＬＦ計器内で、５０Ｖの電圧を使用して、４５分間にわたり、電気溶出を実行する。溶出の終了時に、２５Ｖの電界を、逆方向に、５秒間にわたり印加して、溶出させたＤＮＡを、溶出モジュールの限外濾過膜から放出する一助とする。手動または自動の液体取扱手段により、標的断片を、電気泳動緩衝液中の溶出モジュールから取り出し得る溶出および溶出モジュールからの回収は、図３Ａ～３Ｅに示さない）。
【0081】
本出願の任意の箇所において提示される、特許、特許出願、論文、ウェブページ、書籍を含むがこれらに限定されない、刊行物または他の文献に対する、任意の参照および全ての参照は、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる。
【0082】
他の箇所で言及した通り、開示される実施形態は、例示的な目的だけで提示されるものであり、限定的なものではない。他の実施形態も可能であり、本開示の対象となるが、これらは、本明細書に含有される教示から明らかであろう。したがって、本開示の精神および範囲は、上記で記載した実施形態のうちのいずれかにより限定すべきものではなく、本開示により裏書きされる特許請求の範囲およびそれらの均等物だけに従い規定すべきものである。さらに、対象となる開示の実施形態は、開示される、他の任意の方法、組成物、システム、およびデバイスに由来する、任意の要素および全ての要素であって、生物学的試料（例えば、核酸要素および非核酸要素を含有する）から、核酸を単離することに対応する、任意の要素および全ての要素を含む要素をさらに含みうる、方法、組成物、システム、および装置／デバイスも含みうる。言い換えれば、開示される、１つまたは別の実施形態に由来する要素は、開示される他の実施形態に由来する要素と互換的でありうる。さらに、一部のさらなる実施形態は、本明細書で開示される、１つの特色および／または別の特色を、参照により組み込まれる素材において開示される、方法、組成物、システム、およびデバイス、ならびにそれらの１つまたは複数の特色と組み合わせることにより実現することもできる。加えて、開示される実施形態の、１つまたは複数の特色／要素を除去し、なおも、特許権取得可能な対象物を結果としてもたらす（かつ、したがって、対象となる開示の、なおさらなる実施形態を結果としてもたらす）こともできる。さらに、一部の実施形態は、先行技術の教示と比較して、１つのエレメント、構造、および／もしくはステップ、ならびに／または別のエレメント、構造、および／もしくはステップ（適切な場合）を特異的に欠く、方法、組成物、システム、およびデバイスに対応し、したがって、特許権取得可能な対象物を表し、先行技術と識別可能である（すなわち、このような実施形態を指向する特許請求の範囲は、先行技術による教示の、１つまたは複数の特色の欠如に言及する、否定的な限定を含有しうる）。
【0083】
核酸の加工について記載する場合、連結した、結合させた、接続する、付着させる、相互作用させるなどの用語は、そのような接合が、恒久的な場合であれ、潜在的に可逆的な場合であれ、言及される要素の接合を結果としてもたらす連結を指すと理解されたい。共有結合型の結合も形成されうるが、これらの用語は、共有結合の形成を必要とするものとしては読み取られないものとする。
【0084】
本明細書で定義および使用される全ての定義は、定義された用語の、辞書による定義、参照によって組み込まれる文献内の定義、および／または通常の意味を統御するものと理解されたい。
【0085】
そうでないことが明示的に指し示されない限りにおいて、本明細書および特許請求の範囲で使用される不定冠詞である「ある（ａ）」および「ある（ａｎ）」は、「少なくとも１つの」を意味するものと理解されたい。
【0086】
本明細書および特許請求の範囲で使用される「および／または」という語句は、このように接続された要素の「いずれかまたは両方」、すなわち、ある場合には、連言的に存在し、他の場合には、選言的に存在する要素を意味するものと理解されたい。「および／または」を伴って列挙される複数の要素は、同じ様式で、すなわち、このように接続された要素のうちの「１つまたは複数」と解釈されるものとする。「および／または」節により具体的に同定される要素以外の他の要素も、具体的に同定されるこれらの要素と関連する場合であれ、関連しない場合であれ、任意選択で存在しうる。したがって、非限定的な例として、「Ａおよび／またはＢ」に対する言及は、「～を含むこと」などのオープンエンドの表現と共に使用される場合、一実施形態では、Ａだけ（任意選択で、Ｂ以外の要素を含む）を指す場合もあり；別の実施形態では、Ｂだけ（任意選択で、Ａ以外の要素を含む）を指す場合もあり；さらに別の実施形態では、ＡおよびＢの両方（任意選択で、他の要素を含む）を指す場合もあるなどである。
【0087】
本明細書および特許請求の範囲で使用される、「または」は、上記で定義された「および／または」と同じ意味を有するものと理解されたい。例えば、リスト中の項目を区別する場合、「または」または「および／または」は、包含的である、すなわち、多数の要素または一連の要素のうちの少なくとも１つの要素の包含であるが、また、多数の要素または一連の要素のうちの１つを超える要素も含む包含であり、任意選択で、列挙されていないさらなる項目も含む包含と解釈されるものとする。多数の要素または一連の要素のうちのちょうど１つの要素の包含を指すのは、「～のうちの１つだけ」もしくは「～のうちのちょうど１つ」など、そうでないことが明確に指示される用語、または特許請求の範囲で使用される場合の「～からなること」に限られる。一般に、本明細書で使用される「または」という用語は、「いずれか」、「～のうちの１つ」、「～のうちの１つだけ」、または「～のうちのちょうど１つ」など、排他性の用語に先行される場合、排他的な代替法（すなわち、「一方または他方であり、両方ではない」）だけを指し示すと解釈されるものとする。特許請求の範囲で使用される場合の、「～から本質的になること」は、特許法の分野で使用される、その通常の意味を有するものとする。
【0088】
本明細書および特許請求の範囲で使用される、１つまたは複数の要素のリストに言及して使用される「少なくとも１つの」という語句は、要素のリスト内の要素のうちの任意の１つまたは複数から選択されるが、要素のリスト内で具体的に列挙される各要素およびあらゆる要素のうちの少なくとも１つを必ずしも含むわけではないが、要素のリスト内の要素の任意の組合せを必ずしも除外するわけでもない、少なくとも１つの要素を意味するものと理解されたい。この定義はまた、「少なくとも１つの」という語句が言及する要素のリスト内で具体的に同定される要素以外の要素が、具体的に同定されたこれらの要素と関連する場合であれ、関連しない場合であれ、任意選択で存在しうることも許容する。したがって、非限定的な例として、一実施形態では、「ＡおよびＢのうちの少なくとも１つ」（または、同義で、「ＡまたはＢのうちの少なくとも１つ」、または、同義で、「Ａおよび／またはＢのうちの少なくとも１つ」）とは、Ｂの存在を伴わず（かつ、任意選択で、Ｂ以外の要素を含み）、任意選択で、１つを超えるＡを含む、少なくとも１つのＡを指す場合もあり；別の実施形態では、Ａの存在を伴わず（かつ、任意選択で、Ａ以外の要素を含み）、任意選択で、１つを超えるＢを含む、少なくとも１つのＢを指す場合もあり；さらに別の実施形態では、任意選択で、１つを超えるＡを含む、少なくとも１つのＡ、および任意選択で、１つを超えるＢを含む（かつ、任意選択で、他の要素を含む）、少なくとも１つのＢを指す場合もあるなどである。
【0089】
特許請求の範囲ならびに上記の明細書では、「～を含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「～を含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「～を保有すること」、「～を有すること」、「～を含有すること」、「～を伴うこと」、「～を保持すること」、「～からなる」など、全ての移行句は、オープンエンドである、すなわち、「～を含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」を意味するものであり、「～に限定される」を意味するものではないものと理解されたい。移行句である「～からなること」および「～から本質的になること」だけは、それぞれ、「The United States Patent Office Manual of Patent Examining Procedures」、２１１１．０３節において示されている通り、クローズドの移行句またはセミクローズドの移行句であるものとする。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【配列表】