特許 7426995 リアルタイム比色核酸増幅アッセイを実施するための方法および装置

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-01-25

(45)【発行日】2024-02-02

(54)【発明の名称】リアルタイム比色核酸増幅アッセイを実施するための方法および装置

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/6844 20180101AFI20240126BHJP

   C12M 1/34 20060101ALI20240126BHJP

   G01N 21/78 20060101ALI20240126BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/6844 Z ZNA

C12M1/34 Z

G01N21/78 Z

【請求項の数】 24

(21)【出願番号】P 2021523643

(86)(22)【出願日】2019-10-31

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-01-17

(86)【国際出願番号】 EP2019079845

(87)【国際公開番号】W WO2020089399

(87)【国際公開日】2020-05-07

【審査請求日】2022-10-13

(31)【優先権主張番号】18203833.1

(32)【優先日】2018-10-31

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】522391730

【氏名又は名称】バイオピクス・ディーエヌエイ・テクノロジー・ピー・シー

(74)【代理人】

【識別番号】100118902

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 修

(74)【代理人】

【識別番号】100106208

【弁理士】

【氏名又は名称】宮前 徹

(74)【代理人】

【識別番号】100196508

【弁理士】

【氏名又は名称】松尾 淳一

(74)【代理人】

【識別番号】100188374

【弁理士】

【氏名又は名称】一宮 維幸

(72)【発明者】

【氏名】パパダキス，ゲオルギオス

(72)【発明者】

【氏名】ギゼリ，エレクトラ

(72)【発明者】

【氏名】パンタジス，アレクサンドロス

【審査官】大久保 元浩

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１４－５０４７３１（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１２／１５７６８５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】J. AGRIC. FOOD CHEM.，2013年，61，11338-11346

【文献】MOL. BIOCHEM. PARASITOL.，2016年，210，10-12

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｑ

Ｇ０１Ｎ

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

半透明または透明材料製の反応チューブ（１８）に含まれる液体試料においてリアルタイム比色等温核酸増幅アッセイを実施するための方法であって、
前記反応チューブ（１８）の底部（２）を加熱素子（１０）と熱接触させることによって前記液体試料を加熱するステップと、
前記反応チューブ（１８）の側壁（３）を通して前記アッセイのパラメーターを視覚的にモニタリングするステップと
を含む、方法。

【請求項2】

前記加熱素子（１０）の方へ前記反応チューブ（１８）に圧力を加えるステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記反応チューブ（１８）によって前記加熱素子（１０）に加えられる圧力が０．４ＭＰａ～１５ＭＰａである、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記反応チューブ（１８）によって前記加熱素子（１０）に加えられる圧力が１ＭＰａ～１０ＭＰａである、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

前記反応チューブ（１８）によって前記加熱素子（１０）に加えられる圧力が１ＭＰａ～３ＭＰａである、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

前記反応チューブ（１８）の長手軸が、前記加熱素子（１０）に対して６０～１２０度の角度を形成する、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

前記反応チューブ（１８）の長手軸が、前記加熱素子（１０）に対して９０度の角度を形成する、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

前記加熱素子（１０）と熱接触している前記反応チューブ（１８）の面積が最大で１２ｍｍ^２である、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

前記加熱素子（１０）と熱接触している前記反応チューブ（１８）の面積が最大で６ｍｍ^２である、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記加熱素子（１０）と熱接触している前記反応チューブ（１８）の面積が最大で３ｍｍ^２である、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

前記反応チューブ（１８）が透明材料製である、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

前記モニタリングするステップがデジタルカメラによって実行される、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

前記核酸増幅アッセイがループ介在等温増幅アッセイである、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法に従ってリアルタイム比色等温核酸増幅アッセイを実施するための装置であって、
加熱素子（１０）と、
半透明または透明材料製であり、反応チューブ（１８）の底部（２）が前記加熱素子（１０）と熱接触するように配置される前記反応チューブ（１８）と、
前記反応チューブ（１８）の側壁（３）を通して画像を記録することができるように配置されるデジタルカラーカメラと、
前記デジタルカラーカメラによって得られた画像を処理し、前記画像の赤色、緑色および青色チャネルデータのうちの１つまたは複数を処理し、それによって前記アッセイのパラメーターを得るように構成される処理ユニットと
を含む、装置。

【請求項15】

前記加熱素子（１０）の方へ前記反応チューブ（１８）に圧力を加えるための手段（１５、１６）をさらに含む、請求項１４に記載の装置。

【請求項16】

前記反応チューブ（１８）によって前記加熱素子（１０）に加えられる圧力が０．４ＭＰａ～１５ＭＰａである、請求項１４または１５に記載の装置。

【請求項17】

前記反応チューブ（１８）によって前記加熱素子（１０）に加えられる圧力が１ＭＰａ～１０ＭＰａである、請求項１６に記載の装置。

【請求項18】

前記反応チューブ（１８）によって前記加熱素子（１０）に加えられる圧力が１ＭＰａ～３ＭＰａである、請求項１７に記載の装置。

【請求項19】

前記反応チューブ（１８）が透明材料製である、請求項１４から１８のいずれか一項に記載の装置。

【請求項20】

前記加熱素子（１０）と熱接触している前記反応チューブ（１８）の面積が最大で１２ｍｍ^２である、請求項１４から１９のいずれか一項に記載の装置。

【請求項21】

前記加熱素子（１０）と熱接触している前記反応チューブ（１８）の面積が最大で６ｍｍ^２である、請求項２０に記載の装置。

【請求項22】

前記加熱素子（１０）と熱接触している前記反応チューブ（１８）の面積が最大で３ｍｍ^２である、請求項２１に記載の装置。

【請求項23】

前記反応チューブ（１８）の長手軸が、前記加熱素子（１０）に対して６０～１２０度の角度を形成する、請求項１４から２２のいずれか一項に記載の装置。

【請求項24】

前記反応チューブ（１８）の長手軸が、前記加熱素子（１０）に対して９０度の角度を形成する、請求項２３に記載の装置。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、リアルタイム比色核酸増幅アッセイにおける実施およびモニタリングに関する。

【背景技術】

【0002】

分子組成の観点から生物を理解することは、核酸増幅および定量に主に基づく、ますます迅速で正確な診断試験の設計をもたらした。それはまた、試料が採取されるかまたは患者が処置される場所において実際の診断アッセイを行うことである分子診断の新たな傾向ももたらした（「ポイントオブニード（ｐｏｉｎｔ－ｏｆ－ｎｅｅｄ）」試験）。ポイントオブニード試験では、核酸増幅および定量に主に基づく、ますます迅速で正確な診断アッセイの設計は、現在、ヘルスケア、農業／食品安全性、研究などにおいて非常に多くの用途を有する新たに発生した分野である。最も普及しているアッセイの１つはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）であり、それは数回の熱サイクルで特定の標的を指数関数的に増幅させるポリメラーゼ酵素を利用する。各サイクルは３つのステップを含む；１．二本鎖ＤＮＡ変性のために９２～９８℃での加熱；２．５０～６５℃での特異的プライマーアニーリング；および３．７２℃でのポリメラーゼによる鎖伸長。高速で正しい生成物形成のための必要条件である効率的な加熱は、典型的に加熱素子上に置かれる、加熱（金属）ブロックへの反応容器（典型的にエッペンドルフチューブ）の浸漬によって達成される。ＰＣＲは、実験室ベースの核酸検出におけるゴールデンスタンダードであり、エンドポイントおよび定量的リアルタイム検出の両方に適しているが、ポイントオブケア（ｐｏｉｎｔ－ｏｆ－ｃａｒｅ）または現場ベースの用途（ｆｉｅｌｄ ｂａｓｅｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）には理想的ではない。これは、ＰＣＲが、高価であり、および／または使用者と共にあちこちに動かすのが困難である、高度な温度制御および光学（蛍光）モニタリングのための機器を必要とするためである。１つの代替のＤＮＡ増幅法である、ループ介在等温増幅（ＬＡＭＰ）は、増幅のために１つの温度（６５℃）のみを必要とし、色変化（比色）によりＤＮＡの視覚的検出を達成することができるので、ポイントオブケア（ＰＯＣ）用途には理想的であると考えられている。ＬＡＭＰ増幅比色設定では、反応容器はＰＣＲに使用されるものと同様の加熱ブロック内に設置される。ＬＡＭＰ比色法の現在の形式はエンドポイント測定のみに基づく。しかしながら、これには２つの大きな欠点がある；第一に、色変化は多くの場合、裸眼で識別することが困難であり得、第二に、エンドポイント測定は、多くの重要な用途では不適切であり得る定性試験（イエスまたはノー）として使用され得る。現在のところ、これらの問題を克服する利用可能な解決策は存在しない。

【0003】

上記の障害を克服し、リアルタイム比色核酸増幅を可能にする、以前に解決された重要な特徴は、プロセスが反応の効率的な加熱と同時に合わせて行われている間に溶液の色変化をモニタリングする手段／方法を発明することに関連する。現在使用されている形式の全ては、加熱ブロック内への反応容器の浸漬に基づき、これは必要とされる高温での効率的な増幅を可能にする。このことは、検査および検出などの視覚的モニタリングが容器の上部によってのみ達成され得ることを意味する。しかしながら、増幅反応の間、容器は加熱されるので、液体試料の一部は蒸気に変化し、反応容器の上部からのリアルタイム比色モニタリングについての可能性をいくらか妨げる。この理由のために、ＬＡＭＰ比色法の現在の形式は、試料を室温に冷却させた後のエンドポイント測定のみに基づく。このことは、現在の形式では、リアルタイム比色モニタリングを行うことができないことを意味する。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0004】

本発明者らは、そうしなければ定性的な比色核酸増幅アッセイ、例えばＬＡＭＰアッセイを、定量的および典型的にはリアルタイムの手順に変換する方法を開発した。これを達成するために、本発明者らは、リアルタイム比色核酸増幅アッセイを実施するための方法および装置を開発した。本発明の１つの重要な態様は、試料を加熱ブロック内に浸漬しない液体試料の加熱である。これは、試料を含有する反応チューブの底部を加熱素子と熱接触させることによって達成される。この方法は、反応チューブの側壁を通して容器の内容物の視覚化を可能にするので視覚モニタリングを容易にする。本発明はさらに、上記の加熱方法を使用すること、および例えばカメラによる視覚モニタリングを使用することによって比色核酸増幅アッセイをモニタリングするための方法を提供する。

【0005】

さらに、本発明は、リアルタイム比色核酸増幅アッセイを実施するための装置を提供する。

【図面の簡単な説明】

【0006】

【図1】反応チューブの異なる部分および反応チューブの底部のフットプリントを示す図である。

【図2】本発明による装置の概略図を示す図である。

【図3】本発明による装置の実施形態を示す図である。

【図4】本発明による装置における反応チューブの配置を示す図である。

【図5】本発明に従って実施され、指示着色物質としてフェノールレッドおよびヒドロキシルナフトールブルー（ＨＮＢ）を使用したＬＡＭＰアッセイの実験データを示す図である。

【図6】本発明に従って実施され、異なる量の圧力下で指示着色物質としてフェノールレッドを使用したＬＡＭＰアッセイの実験データを示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0007】

核酸増幅アッセイでは、液体試料は典型的に、エッペンドルフチューブとしばしば呼ばれる反応チューブに含有される。典型的に、このようなチューブは、ポリプロピレン（ｐｏｌｙｐｒｏｐｅｌｅｎｅ）などのポリマー材料製であり、１０μｌ～２００μｌの体積を有する。市販のエッペンドルフチューブと同様の反応チューブは、他の光学的に透明／半透明な材料および３Ｄプリントを使用して製造され得る。

【0008】

従来技術のシステムでは、必要な温度に液相を加熱するために、チューブは加熱ブロック内に浸漬される。
本発明者らはここで、驚くべきことに、加熱ブロック内への容器の浸漬は効率的な増幅に必要ではないこと、および液相は、液相を含有するチューブの底部を加熱素子と熱接触させることによって加熱され得ることを見出した。

【0009】

本発明によれば、「チューブの上部」または「反応チューブの上部」は開口部であり、その開口部を通して液体試料がチューブに充填される。「チューブの底部」または「反応チューブの底部」は、チューブの上部と反対側にあるチューブの部分である。図１ａは、反応チューブの上部（１）、底部（２）および側壁（３）を示す。

【0010】

本発明によれば、反応チューブは加熱素子の表面上に直接置かれ得る。さらに、加熱素子は熱伝導材料製の表面を含むことができ、その表面上に反応チューブが置かれ得る。加熱素子は典型的に抵抗加熱器またはペルチェ素子である。

【0011】

好ましくは、加熱素子上に設置される場合、チューブの長手軸は、６０～１２０度である、加熱素子に対する角度を形成する。より好ましくは、角度は実質的に直角である。
効率的な核酸増幅アッセイのために、液相の効率的な加熱が最も重要な必要条件の１つである。従来技術は、液相の効率的な加熱のために、反応チューブの多くの面積が加熱体と熱接触しなければならないことを教示している。この理由のために、反応チューブは、チューブのほぼ全体を囲み、チューブの底部および側壁と熱接触する金属ブロック内に浸漬されなければならない。このことは、従来技術が、効率的な加熱のために、チューブのほぼ全面が加熱体と熱接触しなければならないことを教示していることを意味する。ここで、効率的な加熱が、チューブの底部、すなわちチューブの非常に小さな部分のみを加熱素子と熱接触させることによって達成され得ることが予想外に見出された。

【0012】

好ましくは、加熱素子と熱接触しているチューブの面積は最大で１２ｍｍ^２である。より好ましくは、加熱素子と熱接触しているチューブの面積は最大で６ｍｍ^２である。さらにより好ましくは、加熱素子と熱接触しているチューブの面積は最大で３ｍｍ^２である。加熱素子と熱接触しているチューブの面積は、図１ｂに示すように、チューブの底部のフットプリントを確立することによって決定され得る。最初に、チューブの底部が、例えばマーカーで着色され、次いでチューブは１枚の紙（４）に押し付けられて、チューブの底部の円形のフットプリント（５）が得られる。フットプリントの面積は加熱素子と熱接触しているチューブの面積である。

【0013】

本発明者らはまた、驚くべきことに、本発明の加熱方法の有効性および効率が、加熱素子の方へチューブに圧力を加えることによって増加し得ることを見出した。例えば、これを行うことによって、増幅反応が始まる前に必要とされる時間が大幅に短縮される。この態様は、特に、アッセイが可能な限り短時間で実行されなければならない、ポイントオブケア用途において非常に重要である。好ましくは、チューブによって加熱素子に加えられる圧力が０．４ＭＰａ～１５ＭＰａになるように反応チューブに圧力が加えられる。より好ましくは、チューブによって加熱素子に加えられる圧力は１ＭＰａ～１０ＭＰａである。さらにより好ましくは、チューブによって加熱素子に加えられる圧力は１ＭＰａ～３ＭＰａである。圧力は、当業者に周知である異なる手段によって調整され得る。例えば、圧力は、チューブに異なる重量を加えることによって、またはねじのシステムを使用することによって、または磁石のシステムを使用することによって調整され得る。圧力は当業者に周知の方法によって決定され得る。例えば、圧力は、チューブによって加熱素子に加えられる垂直抗力を測定し、次いで上記のように加熱素子と接触しているチューブの面積を測定し、最後に垂直抗力の値を面積で割ることによって計算され得る。

【0014】

核酸増幅アッセイは、例えば、転写介在増幅、核酸配列ベースの増幅、ＲＮＡ技術の鎖介在増幅、鎖置換増幅、ローリングサークル増幅、ＬＡＭＰ、等温多重置換増幅、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅、ヘリカーゼ依存性増幅、シングルプライマー等温増幅、および環状ヘリカーゼ依存性増幅などの等温増幅アッセイであってもよい。好ましくは、アッセイはＬＡＭＰアッセイである。

【0015】

本発明の加熱方法の有効性は、チューブが加熱ブロック内に浸漬される、従来技術の方法のものと同じである。他方で、本発明の加熱方法は、液相を加熱するのに必要とされるエネルギーの量が少ないので、エネルギー消費に対して、より高い効率を提供する。

【0016】

本発明の加熱方法の別の利点は、チューブが半透明または透明材料製である場合、チューブの内容物を、チューブの上部からだけでなく、より重要なことに側壁を通して見ることができることである。このことは、比色ＬＡＭＰアッセイにおける色変化などの、アッセイのパラメーターの視覚モニタリングが、アッセイの実施の間に可能になることを意味する。このことは、増幅反応の間の試料の蒸発がモニタリングを妨げないためである。したがって、本発明の加熱方法はアッセイのリアルタイムモニタリングを可能にする。

【0017】

したがって、本発明の別の態様は、リアルタイム比色核酸増幅アッセイを実施するための方法であって、液相を含有するチューブの底部を加熱素子と熱接触させることによって液相を加熱するステップと、アッセイのパラメーターのリアルタイム視覚モニタリングを利用するステップとを含む、方法である。

【0018】

視覚モニタリングは、使用者の眼によるモニタリングおよびカメラによるモニタリングを含む。好ましくは、モニタリングはカメラによって実行される。
好ましい実施形態によれば、本発明は、着色物質の形成、反応、または色の変化に起因する液体試料の色の変化をリアルタイムでモニタリングするためにデジタルカラーカメラが使用される方法を提供する。

【0019】

この好ましい実施形態によれば、方法は、液体試料の１つまたは複数の画像を記録するためにデジタルカラーカメラを使用し、各画像について、画像から得られた赤色チャネルデータ、緑色チャネルデータおよび青色チャネルデータのうちの１つまたは複数を処理し、それによってアッセイのパラメーターを得るステップを含む。

【0020】

エンドポイントアッセイでは、方法は典型的に単一画像の記録および処理を含む。方法が複数の画像から得られたデータを記録し、処理するステップを含む場合、一連の画像はビデオを形成することができる。

【0021】

アッセイのパラメーターは、例えば、検体の存在もしくはその量またはＬＡＭＰなどの核酸増幅反応の効率であってもよい。
着色物質は、アッセイの間に、その色を形成するか、または消費するか、または変化させる物質を含む。色の変化は、例えば、ｐＨの変化に応答して、または化学反応に応答して発生し得る。色の変化は、ある色から別の色への変化、またはある色から透明への変化、もしくはその逆を含んでもよい。

【0022】

核酸増幅アッセイに使用される着色物質の例には、ヒドロキシナフトールブルー（ＨＮＢ）、フェノールレッド、カルセイン、クリスタルバイオレット、ＳＹＢＲグリーンＩ、クレゾールレッド、ニュートラルレッド、ｍ－クレゾールパープル、金ナノ粒子、ポリジアセチレン（ＰＤＡ）リポソームおよび当業者に周知の他の物質が含まれる。

【0023】

画像の記録および／または画像から得られたデータの処理は、カラーモード変換、画像較正およびガンマ補正のうちの１つまたは複数などの、１つまたは複数の画像処理ステップを含んでもよい。

【0024】

典型的に、画像はピクセルを含み、処理ステップは、画像のピクセルから赤色、緑色および青色のうちの１つまたは複数の光のレベル、例えばその強度を抽出し、それによってそれぞれ赤色、緑色および青色チャネルデータのうちの１つまたは複数を得るステップを含む。記録された光のレベル（例えば、強度）は画像のピクセルで表され得る。レベルは、強度、例えば、カメラのチャネルによって記録された強度であってもよい。レベルは、ＲＧＢカラー値、例えば、８ビット、１６ビット、２４ビットまたは３２ビットであってもよい。

【0025】

典型的に、デジタルカメラによって記録された画像のピクセルは、画像の異なる色成分を各々表す要素を含む。色成分は典型的に、それぞれ赤色、緑色および青色チャネルに対応する、赤色、緑色および青色であるが、カメラは記録することができ、ならびに／または画像は、属性として明度、彩度および色相を使用するＣＩＥＣＡＭ０２などの異なるカラーモデルに従ったデータを使用して保存され得る。

【0026】

画像は液相の領域のマルチピクセル画像であってもよい。画像は、例えば、光ファイバー、またはカラーチャネルごとの光ファイバーを使用して得ることができる、液相の領域のシングルピクセル画像であってもよい。画像は、例えば、コンピューター画面上に、または画像を表示する当業者に公知の任意の他の様式で表示され得る。

【0027】

本発明の処理ステップは、例えば、数学演算を実行することによって赤色チャネルデータ、緑色チャネルデータおよび青色チャネルデータのうちの１つまたは複数から値を計算するステップを含んでもよい。

【0028】

好ましくは、処理ステップは、赤色チャネルデータ、緑色チャネルデータおよび青色チャネルデータの３つのうちの２つの間の差を計算するステップを含む。より好ましくは、処理ステップは、赤色チャネルデータと緑色チャネルデータとの間の差、または青色チャネルデータと緑色チャネルデータとの間の差を計算するステップを含む。

【0029】

液相のビデオ画像記録はデジタルカメラを使用して行われることが可能である。次いでこのようなビデオ画像記録は、例えばハードウェアプロセッサを使用して、その構成画像に分解され得る。ビデオ画像はリアルタイムで液相アッセイをモニタリングすることを可能にし得る。

【0030】

本発明の別の態様は本発明の方法を実施するための装置である。したがって、本発明は、リアルタイム比色核酸増幅アッセイを実施するための装置であって、
加熱素子と、
半透明または透明材料製であり、チューブの底部が加熱素子と熱接触するように配置される反応チューブと、
反応チューブの側壁を通して画像を記録することができるように配置されるデジタルカラーカメラと、
デジタルカラーカメラによって得られた画像を処理し、画像の赤色、緑色および青色チャネルデータのうちの１つまたは複数を処理し、それによってアッセイのパラメーターを得るように構成される処理ユニットと
を含む、装置を提供する。

【0031】

好ましくは、装置は、加熱素子の方へ反応チューブに圧力を加えるための手段をさらに含む。
本発明による装置の概略図は図２に示される。核酸増幅は、チューブの底部のみが加熱素子と熱接触するように加熱素子（１０）上に置かれる反応チューブ（１８）内で実行される。カメラ（１３）は、反応チューブの側壁を通して画像を記録することができるように配置される。カメラ（１３）の出力は、プロセッサ（２３）および画像データを保存するためのメモリ（２４）ならびにプロセッサによって実行されるコンピュータープログラムを有するコンピューターなどの処理ユニット（２２）に送られる。処理ユニット（２２）は、図２に示されるように、別個のユニットであってもよいか、またはカメラもしくはカメラを含む他のデバイスの一体的な構成要素であってもよい。

【0032】

図３は、比色ＬＡＭＰアッセイなどの核酸増幅アッセイを実施し、モニタリングするために使用され得る本発明による装置の実施形態を示す。
装置は、メインスイッチ（８）および電源ソケット（９）を含むメインハウジングユニット（６）を含む。それは、加熱素子ホルダ（１１）を介してメインハウジングユニット（６）に取り付けられる加熱素子（１０）をさらに含む。メインハウジングユニット（６）は、カメラモジュール（１３）を受容するためのカメラホルダ（１２）、および反応チューブの内容物を照射するためのＬＥＤライト（１４）をさらに含む。メインハウジング（６）は、カメラによって記録された画像を処理するためのマイクロプロセッサおよび電子ボード（図示せず）をさらに含む。

【0033】

装置は、メインハウジングユニット（６）の対応する大きな磁石（１６）と係合し、メインハウジングユニット（６）に設置された場合、カバー（７）をその意図される位置に固定する、４つの大きな磁石（１５）を含むカバー（７）をさらに含む。

【0034】

装置は、反応チューブ（１８）を受容するためのスロットを含む反応チューブホルダ（１７）をさらに含む。反応チューブ（１８）は半透明材料製である。反応チューブホルダ（１７）は、アッセイの間の色変化のモニタリングを容易にする、チューブ（１８）に面する側に白色を有する背景壁（１９）をさらに含む。

【0035】

アッセイの実施のために、液体試料が、対応するスロットに設置される反応チューブ（１８）に添加される。反応チューブホルダ（１７）は、反応チューブ（１８）の底部が加熱素子（１０）と熱接触するように加熱素子（１０）上に設置される（図４ａ）。これにより、カメラは、チューブの側壁を通して液相を可視化することができる（図４ｂ）。カバー（７）は、カバーの大きな磁石（１５）を、メインハウジングユニット（６）の大きな磁石（１６）と係合することによってその位置に固定される。それによって、反応チューブホルダ（１７）は、カバー（７）の対応する小さな磁石（２１）と係合する小さな磁石（２０）によってその位置に固定される。チューブ（１８）の底部によって加熱素子（１０）に与えられる圧力は、カバー（７）およびメインハウジングユニット（６）上の大きな磁石（１５）および（１６）のサイズおよび／または数を変更することによって調整され得る。

【0036】

デジタルカメラは、アッセイの間、画像を記録し、その画像は処理ユニットに送られる。処理ユニットは、赤色チャネルと緑色チャネルとの間、または青色チャネルと緑色チャネルとの間の差を計算するように構成される。これらの値の経時変化は液相の色の変化を計算するために処理される。

【実施例】

【0037】

実施例１
ＰＢＳ緩衝液中に再懸濁した細菌細胞を９５℃で１分間溶解した。サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）侵入遺伝子ｉｎｖＡを、２つのアウター（Ｆ３およびＢ３）、２つのインナー（ＦＩＰおよびＢＩＰ）および２つのループ（Ｌｏｏｐ－ＦおよびＬｏｏｐ－Ｂ）である、６個のプライマーのセットによって標的化した。
ＦＩＰ：ＧＡＣＧＡＣＴＧＧＴＡＣＴＧＡＴＣＧＡＴＡＧＴＴＴＴＴＣＡＡＣＧＴＴＴＣＣＴＧＣＧＧ
ＢＩＰ：ＣＣＧＧＴＧＡＡＡＴＴＡＴＣＧＣＣＡＣＡＣＡＡＡＡＣＣＣＡＣＣＧＣＣＡＧＧ
Ｆ３：ＧＧＣＧＡＴＡＴＴＧＧＴＧＴＴＴＡＴＧＧＧＧ
Ｂ３：ＡＡＣＧＡＴＡＡＡＣＴＧＧＡＣＣＡＣＧＧ
Ｌｏｏｐ Ｆ：ＧＡＣＧＡＡＡＧＡＧＣＧＴＧＧＴＡＡＴＴＡＡＣ
Ｌｏｏｐ Ｂ：ＧＧＧＣＡＡＴＴＣＧＴＴＡＴＴＧＧＣＧＡＴＡＧ
総体積２５μｌのＬＡＭＰ試薬ミックスは、１２．５μｌの標準物または比色ＷａｒｍＳｔａｒｔ ２×Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）を含有し、これは、着色物質としてフェノールレッド、１．８μＭのＦＩＰおよびＢＩＰ、０．１μＭのＦ３およびＢ３、０．４μＭのＬｏｏｐ－ＦおよびＬｏｏｐ－Ｂ、ならびにＰＢＳ中の１μｌの溶解細胞を使用する。反応は、図３～４に示した装置に設置した反応チューブ内で実行した。アッセイのモニタリングは、装置のデジタルカメラによってチューブの内容物の画像を記録することによって実行した。

【0038】

実施例２
実施例１から得られた画像を以下のように処理する。
第１に、上記のように液相の一連の画像を得る。カメラからの元の赤色（Ｒ）、緑色（Ｇ）および青色（Ｂ）チャネルを、例えば、ガンマ補正、色調整などを含む、画像処理に供することができる。第２に、赤色、緑色および青色チャネルデータを各画像の１つまたは複数のピクセルから抽出する。

【0039】

第３のステップでは、赤色、緑色および青色チャネルの各々に関して、各時点で、赤色、緑色および青色チャネルの初期値を差し引いて、ゼロから開始するデータを得る。差し引かれる値は、最初の時点でのそれぞれ、赤色、緑色または青色の値であり得るが、典型的に、いくつかの初期時点からの値が平均化されてもよいか、または曲線がプロットされてもよく、時間ゼロ軸切片が計算され、差し引かれる。

【0040】

次に、チャネルの２つの間の差を計算する。フェノールレッドを用いた以下のプロトコルの例の場合、緑色の値と青色の値との間の差を計算する（すなわち、以前のステップから得た青色の値を緑色の値から差し引く）。これは各時点で行われる。ＨＮＢを用いると、緑色の値と赤色の値との間の差を計算する。

【0041】

次に、差を任意選択によりプロットし、次いで分析して、アッセイの１つまたは複数のパラメーターを決定する。計算した差の値が閾値を超えて増加する時間を使用して、例えば対照（既知の濃度の検体との１つもしくは複数の反応の並行測定および／または予め保存したデータであり得る）を参照して、検体の存在または量を決定することができる。また、経時的な差の値の変化を分析して、増幅反応の効率を確立し、また、例えば、開始時間に戻す外挿によって、検体の量の推定を改善することもできる。

【0042】

図５は、２つの異なる着色物質；ｐＨ指示薬であるフェノールレッドおよび金属結合指示薬であるＨＮＢを使用した２つの陽性（感染／１０個の細菌の存在）試料のＬＡＭＰ増幅のリアルタイムモニタリングの比較からの結果を示す。液相の画像は、アッセイが進行するにつれて時間の関数として自動的に記録され、分析されている。緑色のチャネルと青色のチャネルとの間、または緑色のチャネルと赤色のチャネルとの間の差が、各場合、計算される。アッセイの間、反応チューブによって加熱素子に加えられた圧力は２ＭＰａであった。

【0043】

図５は、フェノールレッドまたはＨＮＢカラー指示薬を使用した１０個の細菌のＬＡＭＰ増幅の間のリアルタイム曲線を示す。緑色のチャネルと青色のチャネルとの間の差はフェノールレッド指示薬について計算され、一方、緑色のピクセルと赤色のピクセルとの間の差はＨＮＢについて使用される。プロットは、どちらの場合も、反応の１５分目よりも前に陽性シグナルを観察することができることを示す。したがって、検体（この場合、サルモネラ細胞）が存在するか否かを決定することができ、所定の時間での差の大きさを使用して、例えば１つまたは複数の対照と比較して検体の量を決定することができる。

【0044】

実施例３
この実施例は、実施例２の画像処理方法を使用することによって陰性（非感染／サルモネラの非存在）試料に対する陽性（感染／サルモネラの存在）試料の比較からの第２のセットの結果を例示する。この場合に使用されている着色物質はフェノールレッドである。液相の画像は、アッセイが進行するときの時間の関数として記録されている。緑色チャネルと青色チャネルとの間の差が計算される。

【0045】

図６ａは、図３～４に示した装置に設置された反応チューブ内で実行したサルモネラ細胞（陽性対陰性試料）のリアルタイム比色ＬＡＭＰ検出を示す。チューブによって加熱素子に加えられた圧力は０．４ＭＰａであった。陽性曲線の色の変化は２３分から始まる。３０分に測定した最大色変化（色指数単位）は１７単位である。

【0046】

図６ｂは、以前の段落において説明したものと同じ様式で実行したサルモネラ細胞（陽性対陰性試料）のリアルタイム比色ＬＡＭＰ検出の例を示す。しかしながら、この場合、チューブによって加熱素子に加えられた圧力は２ＭＰａであった。陽性曲線の色の変化は１７分から始まる。３０分に測定した最大色変化（色指数単位）は２８単位である。指数関数的増幅アッセイの場合、６分早く検出すると、感度が１～２桁向上し得る。
発明の態様
［態様１］半透明または透明材料製の反応チューブ（１８）に含まれる液体試料においてリアルタイム比色核酸増幅アッセイを実施するための方法であって、
前記反応チューブ（１８）の底部（２）を加熱素子（１０）と熱接触させることによって前記液体試料を加熱するステップと、
前記反応チューブ（１８）の側壁（３）を通して前記アッセイのパラメーターを視覚的にモニタリングするステップと
を含む、方法。
［態様２］前記加熱素子（１０）の方へ前記反応チューブ（１８）に圧力を加えるステップをさらに含む、態様１に記載の方法。
［態様３］前記反応チューブ（１８）によって前記加熱素子（１０）に加えられる圧力が０．４ＭＰａ～１５ＭＰａである、態様２に記載の方法。
［態様４］前記反応チューブ（１８）によって前記加熱素子（１０）に加えられる圧力が１ＭＰａ～１０ＭＰａである、態様３に記載の方法。
［態様５］前記反応チューブ（１８）によって前記加熱素子（１０）に加えられる圧力が１ＭＰａ～３ＭＰａである、態様４に記載の方法。
［態様６］前記反応チューブ（１８）の長手軸が、前記加熱素子（１０）に対して６０～１２０度の角度を形成する、態様１から５のいずれかに記載の方法。
［態様７］前記反応チューブ（１８）の長手軸が、前記加熱素子（１０）に対して９０度の角度を形成する、態様６に記載の方法。
［態様８］前記加熱素子（１０）と熱接触している前記反応チューブ（１８）の面積が最大で１２ｍｍ^２である、態様１から７のいずれかに記載の方法。
［態様９］前記加熱素子（１０）と熱接触している前記反応チューブ（１８）の面積が最大で６ｍｍ^２である、態様８に記載の方法。
［態様１０］前記加熱素子（１０）と熱接触している前記反応チューブ（１８）の面積が最大で３ｍｍ^２である、態様９に記載の方法。
［態様１１］前記反応チューブ（１８）が透明材料製である、態様１から１０のいずれかに記載の方法。
［態様１２］前記モニタリングするステップがデジタルカメラによって実行される、態様１から１１のいずれかに記載の方法。
［態様１３］前記核酸増幅アッセイが等温核酸増幅アッセイである、態様１から１２のいずれかに記載の方法。
［態様１４］前記核酸増幅アッセイがループ介在等温増幅アッセイである、態様１３に記載の方法。
［態様１５］態様１から１４のいずれかに記載の方法に従ってリアルタイム比色核酸増幅アッセイを実施するための装置であって、
加熱素子（１０）と、
半透明または透明材料製であり、反応チューブ（１８）の底部（２）が前記加熱素子（１０）と熱接触するように配置される前記反応チューブ（１８）と、
前記反応チューブ（１８）の側壁（３）を通して画像を記録することができるように配置されるデジタルカラーカメラと、
前記デジタルカラーカメラによって得られた画像を処理し、前記画像の赤色、緑色および青色チャネルデータのうちの１つまたは複数を処理し、それによって前記アッセイのパラメーターを得るように構成される処理ユニットと
を含む、装置。
［態様１６］前記加熱素子（１０）の方へ前記反応チューブ（１８）に圧力を加えるための手段（１５、１６）をさらに含む、態様１５に記載の装置。
［態様１７］前記反応チューブ（１８）によって前記加熱素子（１０）に加えられる圧力が０．４ＭＰａ～１５ＭＰａである、態様１５または１６に記載の装置。
［態様１８］前記反応チューブ（１８）によって前記加熱素子（１０）に加えられる圧力が１ＭＰａ～１０ＭＰａである、態様１７に記載の装置。
［態様１９］前記反応チューブ（１８）によって前記加熱素子（１０）に加えられる圧力が１ＭＰａ～３ＭＰａである、態様１８に記載の装置。
［態様２０］前記反応チューブ（１８）が透明材料製である、態様１５から１９のいずれかに記載の装置。
［態様２１］前記加熱素子（１０）と熱接触している前記反応チューブ（１８）の面積が最大で１２ｍｍ^２である、態様１５から２０のいずれかに記載の装置。
［態様２２］前記加熱素子（１０）と熱接触している前記反応チューブ（１８）の面積が最大で６ｍｍ^２である、態様２１に記載の装置。
［態様２３］前記加熱素子（１０）と熱接触している前記反応チューブ（１８）の面積が最大で３ｍｍ^２である、態様２２に記載の装置。
［態様２４］前記反応チューブ（１８）の長手軸が、前記加熱素子（１０）に対して６０～１２０度の角度を形成する、態様１５から２３のいずれかに記載の装置。
［態様２５］前記反応チューブ（１８）の長手軸が、前記加熱素子（１０）に対して９０度の角度を形成する、態様２４に記載の装置。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】