特許 7427585 多価ネコワクチン

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-01-26

(45)【発行日】2024-02-05

(54)【発明の名称】多価ネコワクチン

(51)【国際特許分類】

   A61K 39/125 20060101AFI20240129BHJP

   A61K 39/295 20060101ALI20240129BHJP

   A61K 39/265 20060101ALI20240129BHJP

   A61K 39/23 20060101ALI20240129BHJP

   A61K 39/118 20060101ALI20240129BHJP

   A61P 31/12 20060101ALI20240129BHJP

   A61P 31/04 20060101ALI20240129BHJP

   C12N 15/40 20060101ALN20240129BHJP

   C12N 15/86 20060101ALN20240129BHJP

   C12N 7/01 20060101ALN20240129BHJP

   C12N 15/48 20060101ALN20240129BHJP

   C07K 14/15 20060101ALN20240129BHJP

   C12N 7/04 20060101ALN20240129BHJP

【ＦＩ】

A61K39/125

A61K39/295

A61K39/265

A61K39/23

A61K39/118

A61P31/12 171

A61P31/04 171

C12N15/40 ZNA

C12N15/86 Z

C12N7/01

C12N15/48

C07K14/15

C12N7/04

【請求項の数】 11

(21)【出願番号】P 2020524411

(86)(22)【出願日】2018-11-05

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2021-02-22

(86)【国際出願番号】 EP2018080106

(87)【国際公開番号】W WO2019115090

(87)【国際公開日】2019-06-20

【審査請求日】2021-10-11

(31)【優先権主張番号】62/599,401

(32)【優先日】2017-12-15

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】510000976

【氏名又は名称】インターベット インターナショナル ベー． フェー．

(74)【代理人】

【識別番号】100114188

【弁理士】

【氏名又は名称】小野 誠

(74)【代理人】

【識別番号】100119253

【弁理士】

【氏名又は名称】金山 賢教

(74)【代理人】

【識別番号】100124855

【弁理士】

【氏名又は名称】坪倉 道明

(74)【代理人】

【識別番号】100129713

【弁理士】

【氏名又は名称】重森 一輝

(74)【代理人】

【識別番号】100137213

【弁理士】

【氏名又は名称】安藤 健司

(74)【代理人】

【識別番号】100143823

【弁理士】

【氏名又は名称】市川 英彦

(74)【代理人】

【識別番号】100183519

【弁理士】

【氏名又は名称】櫻田 芳恵

(74)【代理人】

【識別番号】100146318

【弁理士】

【氏名又は名称】岩瀬 吉和

(74)【代理人】

【識別番号】100127812

【弁理士】

【氏名又は名称】城山 康文

(72)【発明者】

【氏名】シュ，ジーチャン

(72)【発明者】

【氏名】ラフルール，ロンダ

(72)【発明者】

【氏名】ターピー，イアン

【審査官】大島 彰公

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１７／１０９０４５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特表２００７－５３７７６１（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２００４－５０７２４９（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２００３－５２７５８４（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２００８－５１２１３０（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ、Ａ６１Ｐ、Ｃ１２Ｎ、Ｃ０７Ｋ

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ネコカリシウイルス（ＦＣＶ）カプシドタンパク質またはその抗原性断片をコードするベネズエラウマ脳炎（ＶＥＥ）アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子と、
改変された生ネコウイルス性鼻気管炎ウイルス（ＦＶＲ）、改変された生ネコ汎白血球減少症ウイルス（ＦＰＬＶ）、改変された生クラミドフィラ・フェリス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｆｅｌｉｓ）およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される改変された生ネコ病原体と
を含み、
前記ＦＣＶカプシドタンパク質が、ＦＣＶ Ｆ９様カプシドタンパク質である、免疫原性組成物。

【請求項2】

強毒全身性ＦＣＶ（ＶＳ－ＦＣＶ）カプシドタンパク質またはその抗原性断片をコードする追加のＶＥＥアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子を更に含む、請求項１に記載の免疫原性組成物。

【請求項3】

ＦｅＬＶ糖タンパク質（ｇｐ８５）、ｇｐ８５の抗原性断片、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される抗原をコードする１つまたは複数の追加のＶＥＥアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子を含む、請求項１または２に記載の免疫原性組成物。

【請求項4】

前記ＶＥＥアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子が、ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）糖タンパク質（ｇｐ８５）、該ｇｐ８５の抗原性断片およびこれらの組み合わせから成る群から選択される抗原を更にコードする、請求項１、２または３に記載の免疫原性組成物。

【請求項5】

前記ＶＳ―ＦＣＶカプシドタンパク質が、配列番号２のアミノ酸配列との少なくとも９５％の同一性を含むアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の免疫原性組成物。

【請求項6】

前記ＦＣＶ Ｆ９様カプシドタンパク質が、配列番号４のアミノ酸配列との少なくとも９５％の同一性を含むアミノ酸配列を含む、請求項１、２、３または４に記載の免疫原性組成物。

【請求項7】

前記ＦｅＬＶ糖タンパク質（ｇｐ８５）が、配列番号６のアミノ酸配列との少なくとも９５％の同一性を含むアミノ酸配列を含む、請求項３または４に記載の免疫原性組成物。

【請求項8】

請求項１、２、３、４、５または６に記載の免疫原性組成物と、薬学的に許容される担体とを含む、ＦＣＶによる疾患の予防を助けるためのワクチン。

【請求項9】

強毒全身性ネコカリシウイルスＶＳ－ＦＣＶカプシドタンパク質およびＦＣＶ Ｆ９様カプシドタンパク質をコードするＶＥＥアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子と、
ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）糖タンパク質（ｇｐ８５）もしくは該ｇｐ８５の抗原性断片をコードするＶＥＥアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子と、
改変された生ネコウイルス性鼻気管炎ウイルス（ＦＶＲ）と、
改変された生ネコ汎白血球減少症ウイルス（ＦＰＬＶ）と、
改変された生クラミドフィラ・フェリス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｆｅｌｉｓ）と
を含む、ＦＣＶによる疾患の予防を助けるためのワクチン。

【請求項10】

非アジュバントワクチンである、請求項８または９に記載のワクチン。

【請求項11】

病原性ＦＣＶに対してネコを免疫する方法であって、免疫学的有効量の請求項８、９または１０に記載のワクチンを前記ネコに投与するステップを含む方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１７年１２月１５日に出願された米国仮特許出願第６２／５９９４０１号、２０１７年１２月８日に出願された米国仮特許出願第６２／５９６５０８号、２０１７年１１月６日に出願された米国仮特許出願第６２／５８２０５０号および２０１７年１１月６日に出願された米国仮特許出願第６２／５８１９５５号の米国特許法第１１９条（ｅ）の下での優先権を主張する。

【0002】

本発明は、新規なネコ用多価ワクチンに関する。多価ワクチンを単独でまたは他の防御剤と組み合わせて作製および使用する方法も提供される。

【背景技術】

【0003】

ネコ呼吸器疾患には、副鼻腔炎、結膜炎、流涙、唾液分泌および口腔潰瘍に代表される病気が含まれる。ネコの上気道疾患に関連する２つの最も一般的な病原体は、ネコカリシウイルス（ＦＣＶ）とネコヘルペスウイルス１型ウイルス（ＦＨＶ－１）としても知られているネコウイルス性鼻気管炎ウイルス（ＦＶＲ）である。これら２つのネコウイルスは、世界中の全てのネコ呼吸器疾患のおよそ８０％の原因であると考えられている。細菌であるクラミドフィラ・フェリス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｆｅｌｉｓ）は、ネコ呼吸器疾患でも役割を果たし得る第３の病原体である。したがって、これらの３つの病原体に対するワクチンが現在市販されている。

【0004】

ＦＶＲは、イヌヘルペスウイルス１に関連するアルファヘルペスウイルスであり、おそらくネコ呼吸器病原体の中で最も重要である。ＦＶＲは、極めて伝染性で、子ネコならびにネコで重篤な疾患を引き起こし得る大きなエンベロープＤＮＡウイルスである。したがって、ほとんどのネコは生涯を通じてＦＶＲに曝露される。市販のＮｏｂｉｖａｃ（登録商標）Ｆｅｌｉｎｅ－１ワクチンは、改変された生ネコウイルス性鼻気管炎ウイルスを含有している。

【0005】

ＦＣＶ感染の最も一般的な特徴および臨床徴候は、舌および口腔粘膜上の小胞（潰瘍）の発生であり、これは小さな個別の潰瘍として始まるが、舌の大部分に広がり、影響を及ぼし得る。感染したネコでは発熱もしばしば見られる。ＦＣＶの一定の株は、リンピング症候群（ｌｉｍｐｉｎｇ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）として知られているネコの疾患も引き起こし、これは発熱、関節と筋肉の痛み（リンピング）、および時折の舌／口腔潰瘍を特徴とする。さらに、ＦＣＶのいくつかの株は、感染したネコの慢性口内炎と関連付けられている。ＦＣＶに感染したネコは持続感染する可能性があり、長期間にわたって感染性ウイルスを排出し得る。

【0006】

ＦＣＶ分離株は抗原的に極めて可変性で、ＦＣＶ Ｆ９などのＦＣＶの古いワクチン株でワクチン接種されたネコの抗体は、現在の野外分離株全てを有効に中和するわけではない。さらに、全身性疾患および高い死亡率に関連する新たなＦＣＶ株が同定されている［米国特許第７４４９３２３号明細書参照］。これらの「強毒全身性（ｖｉｒｕｌｅｎｔ ｓｙｓｔｅｍｉｃ）」（ＶＳ－ＦＣＶ）分離株は、局所的発生の原因であり、現在のワクチンも、これらの株によって引き起こされる疾患からネコを防御するようには思われない。

【0007】

ＦＣＶは、３つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）からなる一本鎖のプラス鎖ＲＮＡゲノムを含む。ゲノムは３’末端がポリアデニル化され、５’末端がウイルスコードタンパク質によって結合されている。第１のオープンリーディングフレームは、単一ポリペプチドで発現されるウイルスプロテアーゼおよびＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードする。次いで、このポリペプチドはウイルスプロテアーゼによって翻訳後に切断される。第２のオープンリーディングフレームは、主カプシドタンパク質（すなわち、ＦＣＶカプシドタンパク質）をコードし、これはＡ－Ｆとして示される６つの領域を有する［Ｓｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，６０ Ａｍ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．：６５２－６５８（１９９９）］。領域Ａが切断されて、成熟カプシドタンパク質が産生される。ＯＲＦ２の領域Ｂ、ＤおよびＦはＦＣＶ分離株間で比較的保存されているが、領域ＣおよびＥは可変性であり、ＯＲＦ２の領域Ｅは主要なＢ細胞エピトープを含んでいる［Ｒａｄｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．，３８（２）Ｖｅｔ Ｒｅｓ．：３１９－３３５（２００７）参照］。ＯＲＦ３は、マイナーな構造タンパク質をコードする［Ｓｏｓｎｏｖｔｓｅｖ ａｎｄ Ｇｒｅｅｎ，２７７ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ：１９３－２０３（２０００）］。

【0008】

クラミドフィラ・フェリス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｆｅｌｉｓ）は、世界中のイエネコに特有の細菌である。クラミドフィラ・フェリス（Ｃ．ｆｅｌｉｓ）は、感染したネコの結膜炎症、鼻炎および呼吸器系の問題を引き起こし得る。クラミドフィラ・フェリス（Ｃ．ｆｅｌｉｓ）は、わずか約１０００個のタンパク質をコードする比較的小さなゲノムを有する。この細菌は、７５０００塩基対を含むプラスミドも含む。市販のＮｏｂｉｖａｃ（登録商標）Ｆｅｌｉｎｅ－１ワクチンは、改変された生クラミドフィラ・フェリス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｆｅｌｉｓ）を含有している。

【0009】

上記のネコ呼吸器疾患に関連する３つの病原体に加えて、ネコは通常、他の３つのウイルス：ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）、ネコ汎白血球減少症（ＦＰＶまたはＦＰＬＶ）、および狂犬病ウイルスに対してもワクチン接種される。ネコ白血病ウイルスは、イエネコに感染するレトロウイルスであり、世界中で重大な罹患率および死亡率をもたらしている。ＦｅＬＶは主に唾液を介して伝染するが、体液との接触を通して広がることも報告されている［Ｐａｃｉｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｖｅｔ Ｒｅｃ １１８：３８１－３８４（１９８６）ｄｏｉ：１０．１１３６／ｖｒ．１１８．１４．３８１；Ｌｅｖｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｆｅｌｉｎｅ Ｍｅｄ Ｓｕｒｇ １０：３００－３１６（２００８）ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｆｍｓ．２００８．０３．００２］。ＦｅＬＶ感染中に観察されるネコの臨床徴候には、細胞増殖性障害（リンパ系または骨髄性腫瘍）、細胞抑制性障害（免疫抑制、貧血、骨髄抑制に関連する感染性疾患）、炎症性障害、神経障害、流産、および腸炎が含まれる［Ｈｏｏｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｍ Ｖｅｔ Ｍｅｄ Ａｓｓｏｃ １９９：１２８７－１２９７（１９９１）；Ｌｅｖｙ ａｎｄ Ｃｒａｗｆｏｒｄ，Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，６ｔｈ ｅｄ （Ｅｔｔｉｎｇｅｒ ＳＪ， Ｆｅｌｄｍａｎ ＥＣ．， ｅｄｓ．）ＷＢ Ｓａｕｎｄｅｒｓ， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， ＰＡ．（２００５）］。抗原血症の有病率は、健康なネコの１～５％から罹患したネコの１５～３０％までさまざまである［Ｈｏｓｉｅ ｅｔ ａｌ．Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｒｅｃｏｒｄｓ，１２８：２９３－２９７（１９８９）；Ｂｒａｌｅｙ， Ｆｅｌｉｎｅ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ２２：２５－２９ （１９９４）；Ｍａｌｉｋ ｅｔ ａｌ．，Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｊｏｕｒｎａｌ ７５：３２３－３２７（１９９７）；Ａｒｊｏｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ３８：３４４８－３４４９（２０００）］。ＦｅＬＶはしばしば、付随する持続性ウイルス血症を伴う持続的な感染を確立し、しばしば宿主ネコの死につながる。

【0010】

ＦｅＬＶの一本鎖ＲＮＡゲノムは、３つの遺伝子のみ：（ｉ）エンベロープ糖タンパク質をコードするＥＮＶ遺伝子、（ｉｉ）ウイルスの主要な構造要素をコードするＧＡＧ遺伝子、および（ｉｉｉ）ＲＮＡポリメラーゼをコードするＰＯＬ遺伝子をコードする［Ｔｈｏｍｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７３：１８１９－１８２４（１９９２）］。ＦｅＬＶエンベロープ（ＥＮＶ）遺伝子は、１つまたは複数の細胞酵素によってタンパク質分解処理されて主要なエンベロープ糖タンパク質ｇｐ７０および関連する膜貫通タンパク質ｐ１５Ｅを産生するｇｐ８５前駆体タンパク質をコードする［ＤｅＮｏｒｏｎｈａ， ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８５：６１７－６２１（１９７８）；Ｎｕｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ８１：３６７５－３６７９ （１９８３）］。膜貫通タンパク質ｐ１５Ｅは、免疫抑制特性を有するガンマレトロウイルス間で保存されている配列を含む［Ｍａｔｈｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２７４：６８７－６８９（１９７８）］。近年、欧州医薬品庁の動物用医薬品委員会（ＣＶＭＰ）は、活性物質として大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）で発現されるＦｅＬＶサブグループＡのｇｐ７０表面糖タンパク質に由来する組換えｐ４５ ＦｅＬＶエンベロープ抗原を含むワクチンについて肯定的な意見を採用した。ＦｅＬＶエンベロープ糖タンパク質はＦｅＬＶ特異的細胞傷害性Ｔ細胞応答の標的であると同時に、中和抗体であり、したがってＦｅＬＶの主要な免疫原の１つである［Ｆｌｙｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６（５）：２３０６－２３１５（２００２）］。

【0011】

ネコ汎白血球減少症（ＦＰＶまたはＦＰＬＶ）は、しばしば致命的なネコの極めて伝染性のウイルス疾患である。汎白血球減少症という名称は、罹患した動物が示す白血球数（白血球）が少ないことに由来している。ＦＰＬＶは、リンパ組織、骨髄、腸上皮、および非常に幼い子ネコでは、網膜および小脳の活発に分裂している細胞に感染し、これらを破壊する。ウイルスは妊娠中のネコでも経胎盤的に広がり、胚吸収、胎子ミイラ化、死産または流産を引き起こし得る。感染したネコは、尿、便および鼻分泌物にウイルスを排出し、感受性ネコがこれらの分泌物または感染したネコのノミと接触すると、感受性ネコが感染する。ＦＰＬＶ感染による臨床徴候はまた、ネコジステンパーまたはネコパルボとして分類されている。

【0012】

ネコ汎白血球減少症ウイルスは、パルボウイルス科（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）のパルボウイルス属（Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）のメンバーである。したがって、ＦＰＬＶはミンク腸炎ウイルスおよびイヌ２型パルボウイルス（ＣＰＶ－２）と密接に関連している。ＦＰＬＶは、配列決定された一本鎖ＤＮＡゲノムを有する［Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎｎｏｕｎｃ．Ｍａｒ－Ａｐｒ；３（２）（２０１５）：ｅ０１５５６－１４参照］。市販のＮｏｂｉｖａｃ（登録商標）Ｆｅｌｉｎｅ－１ワクチンは、改変された生ネコ汎白血球減少症ウイルスを含有している。

【0013】

狂犬病は、ヒトおよび他の哺乳動物の脳の炎症をもたらす予防可能な人畜共通感染症である。臨床狂犬病は、典型的には狂暴性狂犬病または麻痺性狂犬病に分類される急性進行性脳炎である。狂暴性狂犬病は、不穏状態、被刺激性および攻撃性を特徴とする。麻痺性狂犬病は、過度の唾液分泌、深い努力性呼吸、麻痺、および最終的には昏睡を特徴とする。狂犬病の原因因子は狂犬病ウイルスであり、これはネコを含むほとんどの哺乳動物に感染することができ、野生動物および感受性飼育動物の貯蔵所を維持している。

【0014】

狂犬病ウイルスは、５つの構造タンパク質：核タンパク質（Ｎ）、リンタンパク質（Ｐ）、マトリックスタンパク質（Ｍ）、糖タンパク質（Ｇ）およびＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードするエンベロープＲＮＡウイルスである［Ｄｉｅｔｚｓｃｈｏｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １０：４２７－４３９（１９９１）］。糖タンパク質（Ｇ）は、ウイルス中和抗体を誘導する防御抗原と考えられている［Ｃｏｘ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ １６：７５４－７５９ （１９７７）］。この疾患に対抗するために、数種類の狂犬病ワクチンが製造されている。不活化細胞培養物由来全ウイルス死滅狂犬病ウイルスワクチンが、米国で最も一般的に使用されているワクチンである。これらの全ウイルス死滅狂犬病ウイルスワクチンは高レベルの抗原を必要とするため、アジュバントが必要である。残念ながら、このアジュバントの使用は、注射部位の反応性、過敏症、さらにはネコの注射部位肉腫の知覚されたリスクと関連している。近年、改変された生ワクチンが、野生動物の免疫化のための経口ワクチンベイトでうまく使用されている［Ｍａｈｌ ｅｔ ａｌ．，Ｖｅｔ Ｒｅｓ ４５（１）：７７（２０１４）］。さらに、糖タンパク質（Ｇ）を発現する組換えワクチンが、現在、ネコで使用するために米国で販売されている。核酸ワクチンも実験室研究で使用されているが、現在米国では認可されているものはない。

【0015】

いくつかのベクター戦略は、一定の病原体から防御する努力においてワクチンで長年にわたって使用されてきた。このようなベクター戦略の１つには、アルファウイルス由来のレプリコンＲＮＡ粒子（ＲＰ）の使用が含まれ［Ｖａｎｄｅｒ Ｖｅｅｎ，ｅｔ ａｌ．Ａｎｉｍ Ｈｅａｌｔｈ Ｒｅｓ Ｒｅｖ．１３（１）：１－９．（２０１２）ｄｏｉ：１０．１０１７／Ｓ１４６６２５２３１２００００１１；Ｋａｍｒｕｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．９１（Ｐｔ ７）：１７２３－１７２７（２０１０）］、これらはベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ）［Ｐｕｓｈｋｏ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２３９：３８９－４０１（１９９７）］、シンドビス（ＳＩＮ）［Ｂｒｅｄｅｎｂｅｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６７：６４３９－６４４６（１９９３）］およびセムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）［Ｌｉｌｊｅｓｔｒｏｍ ａｎｄ Ｇａｒｏｆｆ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）９：１３５６－１３６１（１９９１）］を含むいくつかの異なるアルファウイルスから開発された。ＲＰワクチンは、増殖不全アルファウイルスＲＮＡレプリコンを宿主細胞に送達し、インビボで（１または複数の）所望の抗原性導入遺伝子の発現をもたらす［Ｐｕｓｈｋｏ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２３９（２）：３８９－４０１（１９９７）］。ＲＰは、いくつかの従来のワクチン製剤と比較した場合、魅力的な安全性および有効性プロファイルを有する［Ｖａｎｄｅｒ Ｖｅｅｎ，ｅｔ ａｌ．Ａｎｉｍ Ｈｅａｌｔｈ Ｒｅｓ Ｒｅｖ．１３（１）：１－９．（２０１２）］。ＲＰプラットフォームは、病原性抗原をコードするために使用されており、ブタおよび家禽用のいくつかのＵＳＤＡ認可ワクチンの基礎となっている。

【0016】

特に、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子、特にベネズエラウマ脳炎（ＶＥＥ）アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、全身の抗ウイルス状態を触媒し、致命的なウイルス攻撃から防御する［Ｋｏｎｏｐｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，８３ （２９）：１２４３２－１２４４２（２００９）］、特に口蹄疫ウイルスに対する迅速な防御を誘導する［Ｓｅｇｕｎｄｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，８７（１０）：５４４７－５４６０（２０１３）］ことが報告されている。したがって、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は生ウイルスに対する自然免疫応答を増強するため、免疫応答に有害であると予想されるため、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子をワクチン中で改変生ウイルスと組み合わせるべきではないように思われる。

【0017】

本明細書中の任意の参考文献の引用は、このような参考文献が本出願に対する「先行技術」として利用可能であることの承認として解釈されるべきではない。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0018】

【文献】米国特許第７４４９３２３号明細書

【非特許文献】

【0019】

【文献】Ｓｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，６０ Ａｍ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．：６５２－６５８（１９９９）

【文献】Ｒａｄｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．，３８（２）Ｖｅｔ Ｒｅｓ．：３１９－３３５（２００７）

【文献】Ｓｏｓｎｏｖｔｓｅｖ ａｎｄ Ｇｒｅｅｎ，２７７ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ：１９３－２０３（２０００）

【文献】Ｐａｃｉｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｖｅｔ Ｒｅｃ １１８：３８１－３８４（１９８６）ｄｏｉ：１０．１１３６／ｖｒ．１１８．１４．３８１

【文献】Ｌｅｖｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｆｅｌｉｎｅ Ｍｅｄ Ｓｕｒｇ １０：３００－３１６（２００８）ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｆｍｓ．２００８．０３．００２

【文献】Ｈｏｏｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｍ Ｖｅｔ Ｍｅｄ Ａｓｓｏｃ １９９：１２８７－１２９７（１９９１）

【文献】Ｌｅｖｙ ａｎｄ Ｃｒａｗｆｏｒｄ，Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，６ｔｈ ｅｄ（Ｅｔｔｉｎｇｅｒ ＳＪ，Ｆｅｌｄｍａｎ ＥＣ．，ｅｄｓ．）ＷＢ Ｓａｕｎｄｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ．（２００５）

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【文献】Ｓｅｇｕｎｄｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，８７（１０）：５４４７－５４６０（２０１３）

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0020】

したがって、本発明は、１つまたは複数のネコ病原体からの１つまたは複数の抗原をコードするアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子を、１つまたは複数の改変された生ネコ病原体と共に含む免疫原性組成物を含む。本発明の免疫原性組成物の全てが、多価ワクチンにも使用され得る。このタイプの特定の実施形態では、ワクチン接種される対象がネコである。さらに特定の実施形態では、ワクチン接種される対象がイエネコである。本発明の免疫原性組成物およびワクチンを作製および使用する方法も提供される。

【0021】

特定の実施形態では、免疫原性組成物が、１つまたは複数のネコカリシウイルス（ＦＣＶ）抗原をコードするアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子と、改変された生ネコ病原体とを含む。他の実施形態では、免疫原性組成物が、１つまたは複数のネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）抗原をコードするアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子と、改変された生ネコ病原体とを含む。さらに他の実施形態では、免疫原性組成物が、１つまたは複数の狂犬病ウイルス抗原をコードするアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子と、改変された生ネコ病原体とを含む。一定の実施形態では、改変された生ネコ病原体が、ネコウイルス性鼻気管炎ウイルス（ＦＶＲ）である。他の実施形態では、改変された生ネコ病原体が、ネコ汎白血球減少症ウイルス（ＦＰＬＶ）である。さらに他の実施形態では、改変された生ネコ病原体が、改変された生クラミドフィラ・フェリス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｆｅｌｉｓ）である。さらに他の実施形態では、改変された生ネコ病原体が、改変された生Ｆ９様ネコカリシウイルス（ＦＣＶ Ｆ９様）である。さらに他の実施形態では、改変された生ネコ病原体が、改変された生ボルデテラ・ブロンキセプチカ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）である。本発明はさらに、これらのアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子と改変された生ネコ病原体の任意の組み合わせを含む免疫原性組成物を提供する。このタイプの具体的な実施形態では、免疫原性組成物が、ＦＣＶ抗原をコードするアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子、ＦｅＬＶ抗原をコードするアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子、改変された生ＦＶＲ、改変された生ＦＰＬＶ、および改変された生クラミドフィラ・フェリス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｆｅｌｉｓ）を含む。

【0022】

このタイプの一定の実施形態では、免疫原性組成物が、ＦＣＶカプシドタンパク質をコードするアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子を含む。さらに特定の実施形態では、ＦＣＶカプシドタンパク質がＦＣＶ Ｆ９様カプシドタンパク質である。他の実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子が、ＦＣＶ Ｆ９様カプシドタンパク質の抗原性断片をコードする。さらに他の実施形態では、ＦＣＶカプシドタンパク質が、強毒全身性ＦＣＶ（ＶＳ－ＦＣＶ）カプシドタンパク質である。さらに他の実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子が、ＶＳ－ＦＣＶカプシドタンパク質の抗原性断片をコードする。さらに他の実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子が、ＦＣＶ Ｆ９様カプシドタンパク質またはその抗原性断片とＶＳ－ＦＣＶカプシドタンパク質またはその抗原性断片の両方をコードする。

【0023】

他の実施形態では、免疫原性組成物が、ＶＳ－ＦＣＶカプシドタンパク質またはその抗原性断片をコードするアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子を含み、ＶＳ－ＦＣＶカプシドタンパク質が、配列番号２のアミノ酸配列との９５％以上の同一性を含むアミノ酸配列を含む。より具体的な実施形態では、ＶＳ－ＦＣＶカプシドタンパク質が、配列番号２のアミノ酸配列を含む。さらにより具体的な実施形態では、ＶＳ－ＦＣＶカプシドタンパク質が、配列番号１または配列番号１２のヌクレオチド配列によってコードされる。関連する実施形態では、本発明のアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子が、ＦＣＶ Ｆ９様カプシドタンパク質またはその抗原性断片をコードする。このタイプの具体的な実施形態では、ＦＣＶ Ｆ９様カプシドタンパク質が、配列番号４のアミノ酸配列との９５％以上の同一性を含むアミノ酸配列を含む。より具体的な実施形態では、ＦＣＶ Ｆ９様カプシドタンパク質が、配列番号４のアミノ酸配列を含む。このタイプのさらにより具体的な実施形態では、ＦＣＶ Ｆ９様カプシドタンパク質が、配列番号３または配列番号１３のヌクレオチド配列によってコードされる。

【0024】

関連する実施形態では、免疫原性組成物が、１つまたは複数のネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）抗原をコードするアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子を含む。一定の実施形態では、ＦｅＬＶ抗原がＦｅＬＶ糖タンパク質（例えば、ｇｐ８５）である。他の実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子が、ＦｅＬＶ ｇｐ８５の抗原性断片をコードする。このタイプのさらにより具体的な実施形態では、ＦｅＬＶ糖タンパク質の抗原性断片がＦｅＬＶ ｇｐ７０である。関連する実施形態では、ＦｅＬＶ糖タンパク質の抗原性断片がＦｅＬＶ ｇｐ４５である。このタイプのより具体的な実施形態では、ＦｅＬＶ ｇｐ８５が、配列番号６のアミノ酸配列との９５％以上の同一性を含むアミノ酸配列を含む。このタイプのより具体的な実施形態では、ＦｅＬＶ ｇｐ８５が、配列番号６のアミノ酸配列を含む。このタイプのさらにより具体的な実施形態では、ＦｅＬＶ ｇｐ８５が、配列番号５または配列番号１４のヌクレオチド配列によってコードされる。関連する実施形態では、ＦｅＬＶ ｇｐ７０が、配列番号８のアミノ酸配列との９５％以上の同一性を含むアミノ酸配列を含む。このタイプのより具体的な実施形態では、ＦｅＬＶ ｇｐ７０が、配列番号８のアミノ酸配列を含む。このタイプのさらにより具体的な実施形態では、ＦｅＬＶ ｇｐ７０が、配列番号７または配列番号１５のヌクレオチド配列によってコードされる。

【0025】

さらに他の実施形態では、免疫原性組成物が、狂犬病ウイルス糖タンパク質（Ｇ）をコードするアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子を含む。さらに他の実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子が、狂犬病ウイルスＧの抗原性断片をコードする。このタイプのより具体的な実施形態では、狂犬病ウイルスＧが、配列番号１０のアミノ酸配列との９５％以上の同一性を含むアミノ酸配列を含む。このタイプのなおさらに具体的な実施形態では、狂犬病ウイルスＧが、配列番号１０のアミノ酸配列を含む。このタイプのさらにより具体的な実施形態では、狂犬病ウイルスＧが、配列番号９または配列番号１６のヌクレオチド配列によってコードされる。

【0026】

特定の実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子が、ベネズエラウマ脳炎（ＶＥＥ）アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子である。このタイプのより具体的な実施形態では、ＶＥＥアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子が、ＴＣ－８３ ＶＥＥアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子である。他の実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子が、シンドビス（ＳＩＮ）アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子である。さらに他の実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子が、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子である。代替実施形態では、裸のＤＮＡベクターが、１つまたは複数のネコ病原体に由来する１つまたは複数の抗原をコードする。このタイプの特定の実施形態では、裸のＤＮＡベクターが、ＦＣＶカプシドタンパク質またはその抗原性断片をコードする。このタイプの具体的な実施形態では、裸のＤＮＡベクターが、ＶＳ－ＦＣＶカプシドタンパク質またはその抗原性断片をコードする。このタイプの他の実施形態では、裸のＤＮＡベクターがＦｅＬＶ ｇｐ８５またはその抗原性断片をコードする。

【0027】

一定の実施形態では、免疫原性組成物が、少なくとも１つの改変された生ネコ病原体と、１つまたは複数のＦＣＶカプシドタンパク質またはその抗原性断片、１つまたは複数のＦｅＬＶ糖タンパク質またはその抗原性断片、ならびに／あるいは１つまたは複数の狂犬病ウイルスＧタンパク質またはその抗原性断片をコードするアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子とを含むことができる。このタイプの特定の実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子が、ＶＳ－ＦＣＶカプシドタンパク質またはその抗原性断片とＦＣＶ Ｆ９様カプシドタンパク質またはその抗原性断片の両方をコードする。関連する実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子が、ＶＳ－ＦＣＶカプシドタンパク質またはその抗原性断片とＦｅＬＶ ｇｐ８５またはその抗原性断片の両方をコードする。他の実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子が、ＦＣＶ Ｆ９様カプシドタンパク質またはその抗原性断片とＦｅＬＶ ｇｐ８５またはその抗原性断片の両方をコードする。別の実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子が、ＶＳ－ＦＣＶカプシドタンパク質またはその抗原性断片と狂犬病ウイルスＧタンパク質またはその抗原性断片の両方をコードする。さらに他の実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子が、ＦＣＶ Ｆ９様カプシドタンパク質またはその抗原性断片と狂犬病ウイルスＧタンパク質またはその抗原性断片の両方をコードする。さらに他の実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子が、ＶＳ－ＦＣＶカプシドタンパク質またはその抗原性断片、ＦｅＬＶ ｇｐ８５またはその抗原性断片、および狂犬病ウイルスＧタンパク質またはその抗原性断片をコードする。別の実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子が、ＶＳ－ＦＣＶカプシドタンパク質またはその抗原性断片、ＦＣＶ Ｆ９様カプシドタンパク質またはその抗原性断片、およびＦｅＬＶ ｇｐ８５またはその抗原性断片をコードする。さらに他の実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子が、ＶＳ－ＦＣＶカプシドタンパク質またはその抗原性断片、ＦｅＬＶ ｇｐ８５またはその抗原性断片、狂犬病ウイルスＧタンパク質またはその抗原性断片、およびＦＣＶ Ｆ９様カプシドタンパク質またはその抗原性断片をコードする。さらに他の実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子が、ＦｅＬＶ ｇｐ８５またはその抗原性断片、および狂犬病ウイルスＧタンパク質またはその抗原性断片をコードする。さらに他の実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子が、ＦｅＬＶ ｇｐ８５またはその抗原性断片、ＦＣＶ Ｆ９様カプシドタンパク質またはその抗原性断片、および狂犬病ウイルスＧタンパク質またはその抗原性断片をコードする。

【0028】

したがって、本発明は、少なくとも１つの改変された生ネコ病原体と、複数のネコ病原体抗原をコードする本発明のいずれか１つまたは複数のアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子および／または単一ネコ病原体抗原をコードする本発明のいずれか１つまたは複数のアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子とを含む免疫原性組成物を提供する。特定の実施形態では、改変された生ネコ病原体が、改変された生ＦＶＲである。他の実施形態では、改変された生ネコ病原体が、改変された生ＦＰＬＶである。さらに他の実施形態では、改変された生ネコ病原体が、改変された生クラミドフィラ・フェリス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｆｅｌｉｓ）である。さらに他の実施形態では、改変された生ネコ病原体が、改変された生ＦＣＶ Ｆ９様である。さらに他の実施形態では、改変された生ネコ病原体が、改変された生ボルデテラ・ブロンキセプチカ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）である。特定の実施形態では、２つ以上の改変された生ネコ病原体が免疫原性組成物に含まれる。このタイプの具体的な実施形態では、免疫原性組成物が、改変された生ＦＶＲおよび改変された生クラミドフィラ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ）を含む。他の実施形態では、３つ以上の改変された生ネコ病原体が免疫原性組成物に含まれる。このタイプの具体的な実施形態では、免疫原性組成物が、改変された生ＦＶＲ、改変された生クラミドフィラ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ）を含み、改変された生ネコ病原体がＦＰＬＶである。さらに他の実施形態では、４つ以上の改変された生ネコ病原体が免疫原性組成物に含まれる。このタイプの具体的な実施形態では、免疫原性組成物が、改変された生ＦＶＲ、改変された生クラミドフィラ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ）、改変された生ＦＰＬＶ、および改変された生Ｆ９様ＦＣＶを含む。特定の実施形態では、免疫原性組成物中のアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子の全てが、ベネズエラウマ脳炎（ＶＥＥ）アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子である。さらにより具体的な実施形態では、免疫原性組成物中のＶＥＥアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子の全てが、ＴＣ－８３ ＶＥＥアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子である。

【0029】

さらなる実施形態では、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子が、他のネコ病原体に由来するタンパク質抗原（またはその抗原性断片）をコードし得る。このタイプの特定の実施形態では、タンパク質抗原が、ネコニューモウイルス（ＦＰＮ）に由来する。さらに他の実施形態では、タンパク質抗原が、ネコパルボウイルス（ＦＰＶ）に由来する。さらに他の実施形態では、タンパク質抗原が、ネコ伝染性腹膜炎ウイルス（ＦＩＰＶ）に由来する。さらに他の実施形態では、タンパク質抗原が、ネコ免疫不全ウイルスに由来する。さらに他の実施形態では、タンパク質抗原が、ボルナ病ウイルス（ＢＤＶ）に由来する。さらに他の実施形態では、タンパク質抗原が、ネコインフルエンザウイルスに由来する。さらに他の実施形態では、タンパク質抗原が、ネココロナウイルス（ＦＣｏＶ）に由来する。

【0030】

本発明はさらに、本発明のアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子を、本発明の１つまたは複数の改変された生（例えば、弱毒化）ネコ病原体と共に、死滅ネコ病原体と共に含む免疫原性組成物および／またはワクチン（多価ワクチン）を提供する。特定の実施形態では、免疫原性組成物が、死滅クラミドフィラ・フェリス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｆｅｌｉｓ）、および／または死滅ＦＶＲ、および／または死滅Ｆ９様ＦＣＶ、および／または死滅ＶＳ－ＦＣＶ、および／または死滅ＦｅＬＶ、および／または死滅ＦＰＬＶをさらに含み得る。一定の実施形態では、ワクチンが、免疫学的有効量の１つまたは複数のこれらの免疫原性組成物を含む。

【0031】

本発明は、本発明の免疫原性組成物を含むワクチンおよび多価ワクチンをさらに含む。特定の実施形態では、多価ワクチンが非アジュバントワクチンである。一定の実施形態では、ワクチンが、ＦＣＶ、および／またはＦｅＬＶ、および／またはＦＶＲ、および／またはＦＰＬＶ、および／または狂犬病ウイルス、および／またはクラミドフィラ・フェリス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｆｅｌｉｓ）による疾患の予防を助ける。関連する実施形態では、ネコがワクチンで免疫されると、ネコ対象で抗体が誘導される。本発明はさらに、本発明のアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子および裸のＤＮＡベクターの全てを含む。

【0032】

本発明はまた、ネコ病原体、例えばＦＣＶに対してネコを免疫する方法であって、免疫学的有効量の本発明のワクチンまたは多価ワクチンをネコに投与するステップを含む方法を提供する。特定の実施形態では、ワクチンが筋肉内注射を介して投与される。代替実施形態では、ワクチンが皮下注射を介して投与される。他の実施形態では、ワクチンが静脈内注射を介して投与される。さらに他の実施形態では、ワクチンが皮内注射を介して投与される。さらに他の実施形態では、ワクチンが経皮注射を介して投与される。さらに他の実施形態では、ワクチンが経口投与を介して投与される。さらに他の実施形態では、ワクチンが鼻腔内投与を介して投与される。具体的な実施形態では、ネコがイエネコである。

【0033】

本発明のワクチンおよび多価ワクチンは、プライマーワクチンおよび／またはブースターワクチンとして投与され得る。具体的な実施形態では、本発明のワクチンが、その後の投与を必要とせずに、単発ワクチン（１回用量）として投与される。一定の実施形態では、プライマーワクチンとブースターワクチンの両方の投与の場合、プライマーワクチンおよびブースターワクチンが、同一経路によって投与され得る。このタイプの一定の実施形態では、プライマーワクチンおよびブースターワクチンが共に皮下注射によって投与される。代替実施形態では、プライマーワクチンとブースターワクチンの両方の投与の場合、プライマーワクチンの投与がある経路によって実施され、ブースターワクチンが別の経路によって実施され得る。このタイプの一定の実施形態では、プライマーワクチンが皮下注射によって投与され、ブースターワクチンが経口投与され得る。

【0034】

本発明はさらに、ＦＣＶに対してネコを免疫する方法であって、免疫学的有効量の上記の本発明のワクチンをネコに注射するステップを含む方法を提供する。特定の実施形態では、ワクチンが、例えば、約１×１０^４～約１×１０^１０個のＲＰまたはそれ以上を含み得る。さらに特定の実施形態では、ワクチンが、約１×１０^５～約１×１０^９個のＲＰを含み得る。さらにより特定の実施形態では、ワクチンが、約１×１０^６～約１×１０^８個のＲＰを含み得る。特定の実施形態では、ネコがイエネコである。

【0035】

特定の実施形態では、本発明のワクチンが、０．０５ｍＬ～３ｍＬ用量で投与される。さらに特定の実施形態では、投与される用量が０．１ｍＬ～２ｍＬである。なおさらに特定の実施形態では、投与される用量が０．２ｍＬ～１．５ｍＬである。さらにより特定の実施形態では、投与される用量が０．３～１．０ｍＬである。なおさらに特定の実施形態では、投与される用量が０．４ｍＬ～０．８ｍＬである。

【0036】

本発明のこれらおよび他の態様は、以下の詳細な説明を参照することによってよりよく理解されよう。

【発明を実施するための形態】

【0037】

本発明は、安全で有効な多価ワクチンを提供する。特定の実施形態では、ワクチンが非アジュバントである。本発明のこの態様では、ワクチンがネコ注射部位肉腫を誘発しないが、それでもネコカリシウイルス（ＦＣＶ）および／またはネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）による感染、ならびにネコウイルス性鼻気管炎ウイルス（ＦＶＲ）、および／またはネコ汎白血球減少症ウイルス（ＦＰＬＶ）、および／または生クラミドフィラ・フェリス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｆｅｌｉｓ）による感染によって引き起こされる疾患からのワクチン接種ネコ（ｖａｃｃｉｎａｔｅｓ）の防御を助ける。

【0038】

アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子による自然免疫系の既知の増強にもかかわらず、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子と改変された生ウイルスの両方を含む本発明の多価ワクチンは、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子が改変された生ウイルスの免疫学的効果を有意に妨害することなく、予想外に安全で有効である。

【0039】

実際、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子、特にベネズエラウマ脳炎（ＶＥＥ）アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、全身の抗ウイルス状態を触媒し、致命的なウイルス攻撃から防御することが以前示された［Ｋｏｎｏｐｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，８３（２９）：１２４３２－１２４４２（２００９）］。さらに、ＶＥＥアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、口蹄疫ウイルスに対する迅速な防御を誘導することが報告されている［Ｓｅｇｕｎｄｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，８７（１０）：５４４７－５４６０（２０１３）］。したがって、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子と改変された生ウイルスの両方を含むワクチンは、改変された生ウイルスの免疫学的効果の実質的な阻害をもたらすと予測されただろう。しかしながら、驚くべきことに、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子の存在による自然免疫応答の増強は、付随する改変された生ウイルスによって誘導される免疫応答に有害ではないことが判明した。

【0040】

したがって、特定の態様では、本発明は、ＦＣＶカプシドタンパク質もしくはその抗原性断片および／またはＦｅＬＶ ｇｐ８５もしくはその抗原性断片をコードするアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子を、改変された生ネコＦＶＲ、および／または改変された生ＦＰＬＶ、および／または改変された生クラミドフィラ・フェリス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｆｅｌｉｓ）と共に含むワクチンを提供する。本発明のさらに別の態様では、ワクチンが、ＦＣＶカプシドタンパク質もしくはその抗原性断片および／またはＦｅＬＶ ｇｐ８５もしくはその抗原性断片をコードする裸のＤＮＡベクターを、改変された生ネコＦＶＲ、および／または改変された生ネコＦＰＬＶ、および／または改変された生クラミドフィラ・フェリス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｆｅｌｉｓ）と共に含む。

【0041】

本発明のワクチンは、アジュバントの非存在下でネコに投与することができ、依然としてＦＣＶに対するワクチン接種されたネコの防御を有効に助けることができる。

【0042】

本発明をより完全に理解するために、以下の定義が提供される。

【0043】

説明における便宜上の単数の用語の使用は、決してそのように限定することを意図するものではない。よって、例えば、「ポリペプチド（ａ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」を含む組成物への言及は、１つまたは複数のこのようなポリペプチドへの言及を含む。さらに、「アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子」への言及は、特に指示されない限り、複数のこのようなアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子への言及を含む。

【0044】

本明細書で使用される場合、「およそ」という用語は、「約」という用語と互換的に使用され、値が、指示される値の５０パーセント以内であることを示す、すなわち、１ミリリットル当たり「およそ」１×１０^８個のアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子を含有する組成物は、１ミリリットル当たり０．５×１０^８～１．５×１０^８個のアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子を含有する。

【0045】

本明細書で使用される場合、「ネコ」という用語は、ネコ科（Ｆｅｌｉｄａｅ）の任意のメンバーを指す。イエネコ、純血種および／または雑種の伴侶ネコ、ならびに野生または野生化したネコが全てネコである。

【0046】

本明細書で使用される場合、「レプリコン」という用語は、存在する場合に、細胞培養物または動物宿主で親ウイルスの増殖を成功させることができる１つまたは複数の要素（例えば、構造タンパク質のコード配列）を欠く改変されたＲＮＡウイルスゲノムを指す。適切な細胞状況では、レプリコンは自身を増幅し、１つまたは複数のサブゲノムＲＮＡ種を産生し得る。

【0047】

本明細書で使用される場合、「ＲＰ」と略される「アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子」という用語は、構造タンパク質、例えば、Ｐｕｓｈｋｏら［Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２３９（２）：３８９－４０１（１９９７）］によって記載されるように、同様にアルファウイルスに由来するカプシドおよび糖タンパク質にパッケージングされたアルファウイルス由来ＲＮＡレプリコンである。レプリコンはアルファウイルスの構造成分（例えば、カプシドおよび糖タンパク質）をコードしないため、ＲＰは（ヘルパープラスミドまたは類似の成分なしで）細胞培養物または動物宿主で増殖できない。

【0048】

「ＦＣＶ Ｆ９様」および「Ｆ９様ＦＣＶ」という用語は、相互におよび「古典的ＦＣＶ」という用語と互換的に使用され、本明細書で使用される場合、ＦＣＶ Ｆ９株が典型的代表と考えられるＦＣＶの古い、以前のユニバーサルワクチン株として特徴付けられ得るＦＣＶである。直接対照的に、強毒全身性「ＶＳ－ＦＣＶ」または本明細書で互換的に使用される「（ＶＳ）ＦＣＶ」と呼ばれるＦＣＶは、異常に毒性であり、ＦＣＶ Ｆ９様株の抗体によって中和できない新たなクラスのＦＣＶである［米国特許第７４４９３２３号明細書；Ｒａｄｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．，３８（２）Ｖｅｔ ｒｅｓ．３１９－３３５ （２００７）参照］。

【0049】

「由来する（ｏｒｉｇｉｎａｔｅ ｆｒｏｍ）」、「由来する（ｏｒｉｇｉｎａｔｅｓ ｆｒｏｍ）」および「由来する（ｏｒｉｇｉｎａｔｉｎｇ ｆｒｏｍ）」という用語は、所与のタンパク質抗原およびそれを天然でコードする病原体またはその病原体の株に関して互換的に使用され、本明細書で使用される場合、その所与のタンパク質抗原の非改変および／または切断アミノ酸配列が、その病原体またはその病原体の株によってコードされていることを意味する。病原体に由来するタンパク質抗原についての本発明の核酸構築物内のコード配列は、病原体または病原体の株（自然弱毒化株を含む）におけるそのタンパク質抗原の対応する配列に対して発現されたタンパク質抗原のアミノ酸配列の改変および／または切断をもたらすように遺伝子操作されたかもしれない。

【0050】

本明細書で使用される場合、「防御する」、または「防御を提供する」、または「防御免疫を誘発する」、「疾患の予防を助ける」、および「防御を助ける」という用語は、感染の兆候からの完全な防御を要しない。例えば、「防御を助ける」は、防御が、攻撃後、基礎となる感染の症状が少なくとも減少する、ならびに／あるいは根底にある細胞、生理学的もしくは生化学的原因または症状を引き起こす機序の１つまたは複数が減少するおよび／または排除されるように十分であることを意味することができる。この文脈で使用される「減少する」は、感染の生理学的状態だけでなく、感染の分子状態を含む、感染の状態に関連することを意味する。

【0051】

本明細書で使用される場合、「ワクチン」は、動物に投与すると、野生型微生物による感染から生じる疾患からの防御を最小限助けるのに十分強力な、すなわち、疾患の予防を助ける、および／または疾患を予防、改善もしくは治癒するのに十分強力な免疫応答を誘導する、典型的には水を含有する液体などの薬学的に許容される担体と組み合わせた１つまたは複数の抗原を含む、動物、例えばネコ（一定の実施形態では、ヒトを含むが、他の実施形態では、具体的にヒトではない）に施用するのに適した組成物である。

【0052】

本明細書中で使用される場合、多価ワクチンは、２つ以上の異なる抗原を含むワクチンである。このタイプの特定の実施形態では、多価ワクチンが、２つ以上の異なる病原体に対するレシピエントの免疫系を刺激する。

【0053】

「アジュバント」および「免疫刺激剤」という用語は、本明細書で互換的に使用され、免疫系の刺激を引き起こす１つまたは複数の物質として定義される。これに関連して、アジュバントは、１つまたは複数のワクチン抗原／分離株に対する免疫応答を増強するために使用される。したがって、「アジュバント」は、特定の抗原に対する免疫応答を非特異的に増加させ、したがって、任意の所与のワクチンに必要な抗原の量、および／またはの目的の抗原に対する十分な免疫応答を生成するために必要な注射の頻度を減少させる薬剤である。これに関連して、アジュバントは、１つまたは複数のワクチン抗原／分離株に対する免疫応答を増強するために使用される。例えば、アメリカ猫獣医師協会のネコワクチン接種ガイドラインは、非アジュバントＦｅＬＶワクチンの使用を提案している［ＡＡＦＰ Ｆｅｌｉｎｅ Ａｄｖｉｓｏｒｙ Ｐａｎｅｌ， １５：７８５－８０８ （２０１３）］。

【0054】

本明細書中で使用される場合、「非アジュバントワクチン」は、アジュバントを含有しないワクチンまたは多価ワクチンである。

【0055】

本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される」という用語は、修飾された名詞が医薬品での使用に適切であることを意味するために形容詞的に使用される。これが、例えば、医薬品ワクチンの賦形剤を説明するために使用される場合、これは、その賦形剤が組成物の他の成分と適合性であり、意図したレシピエント動物、例えばネコに不利に有害ではないとして特徴付ける。

【0056】

「非経口投与」は、皮下注射、粘膜下注射、静脈内注射、筋肉内注射、皮内注射および注入を含む。

【0057】

本明細書で使用される場合、特定のタンパク質（例えば、タンパク質抗原）に関する「抗原性断片」という用語は、抗原性である、すなわち、免疫グロブリン（抗体）またはＴ細胞抗原受容体などの免疫系の抗原認識分子と特異的に相互作用することができるそのタンパク質の断片である。例えば、ＦＣＶカプシドタンパク質の抗原性断片は、抗原性であるカプシドタンパク質の断片である。好ましくは、本発明の抗原性断片は、抗体および／またはＴ細胞受容体認識に対して免疫優性である。特定の実施形態では、所与のタンパク質抗原に関する抗原性断片が、完全長タンパク質の抗原性の少なくとも２５％を保持するそのタンパク質の断片である。好ましい実施形態では、抗原性断片が、完全長タンパク質の抗原性の少なくとも５０％を保持する。より好ましい実施形態では、抗原性断片が、完全長タンパク質の抗原性の少なくとも７５％を保持する。抗原性断片は、２０個のアミノ酸程度の小さなものである場合もあれば、その一方で、完全長タンパク質から１個のアミノ酸だけが失われている大きな断片である場合もある。特定の実施形態では、抗原性断片が、２５～１５０個のアミノ酸残基を含む。他の実施形態では、抗原性断片が、５０～２５０個のアミノ酸残基を含む。例えば、ＦｅＬＶの場合、ＦｅＬＶ ｇｐ４５糖タンパク質およびＦｅＬＶ ｇｐ７０糖タンパク質はＦｅＬＶ ｇｐ８５糖タンパク質の抗原性断片であるが、ＦＣＶの場合、ＦＣＶカプシドタンパク質の１つの抗原性断片がＯＲＦ２の領域Ｅを含む。

【0058】

本明細書で使用する場合、両方の配列のアミノ酸残基が同一である場合、１つのアミノ酸配列は第２のアミノ酸配列と１００％「同一」であるまたは１００％の「同一性」を有する。したがって、２つのアミノ酸配列のアミノ酸残基の５０％が同一である場合、あるアミノ酸配列は第２のアミノ酸配列と５０％「同一」である。配列比較は、所与のタンパク質、例えば比較されるタンパク質、またはポリペプチドの一部に含まれるアミノ酸残基の連続ブロックにわたって行われる。特定の実施形態では、２つのアミノ酸配列間の対応を変える可能性がある選択された欠失または挿入が考慮される。

【0059】

本明細書で使用する場合、ヌクレオチドおよびアミノ酸の配列同一性％は、アラインメント・デフォルト・パラメータおよび同一性についてのデフォルトパラメータと共にＣ， ＭａｃＶｅｃｔｏｒ（ＭａｃＶｅｃｔｏｒ， Ｉｎｃ．Ｃａｒｙ、ＮＣ ２７５１９）、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ（Ｉｎｆｏｒｍａｘ， Ｉｎｃ．ＭＤ）、Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｒｏｕｐ ＰＬＣ（１９９６）およびＣｌｕｓｔａｌ Ｗアルゴリズムを用いて決定することができる。これらの市販のプログラムを使用して、同一または類似のデフォルトパラメータを用いて配列類似性を決定することもできる。あるいは、例えば、デフォルトパラメータを使用するＧＣＧ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、ＧＣＧパッケージ用プログラムマニュアル、バージョン７、マディソン、ウィスコンシン州）パイルアッププログラムを使用して、デフォルトフィルター条件下でのＡｄｖａｎｃｅｄ Ｂｌａｓｔ検索を使用することができる。

【0060】

本明細書で使用される場合、「不活性化」微生物という用語は、「死滅」微生物という用語と互換的に使用される。本発明の目的のために、「不活性化」微生物は、動物で免疫応答を誘発することができるが、動物に感染することができない生物である。本発明の抗原（例えば、不活化ネコカリシウイルス）は、バイナリーエチレンイミン（ｂｉｎａｒｙ ｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ）、ホルマリン、β－プロピオラクトン、チメロサール、または熱からなる群から選択される因子によって不活化され得る。特定の実施形態では、本発明のＲＰと組み合わされた不活性化ネコカリシウイルス分離株が、バイナリーエチレンイミンによって不活性化される。

【0061】

本発明のアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、凍結乾燥され、滅菌水希釈剤で再水和され得る。他方、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子が個別に保存されているが、投与前に他のワクチン成分と混合することを意図している場合、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子をそれらの成分の安定化溶液、例えば高スクロース溶液中に保存することができる。

【0062】

本発明のワクチンは、静脈内、筋肉内、皮下、経口、鼻腔内、皮内および／または腹腔内ワクチン接種を含む任意の標準的な経路によって容易に投与することができる。当業者であれば、ワクチン組成物が、好ましくは各タイプのレシピエント動物および投与経路に対して適切に製剤化されることを理解するだろう。

【0063】

よって、本発明はまた、ネコ病原体に対してネコを免疫する方法を提供する。このような方法の１つは、ネコが適切な抗病原体抗体を産生するように、免疫学的有効量の本発明のワクチンをネコに注射するステップを含む。

【0064】

多価ワクチン
したがって、本発明は、少なくとも１つの改変された生ネコ病原体と、１つまたは複数のアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子とを含む多価ワクチンを提供する。例えば、タンパク質抗原またはその抗原性断片のコード配列、またはネコワクチンで有用なタンパク質抗原のこのようなコード配列の組み合わせを、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子（ＲＰ）に添加する、あるいは例えば、多価ワクチン中のＦＣＶカプシドタンパク質および／またはＦｅＬＶ糖タンパク質（ｇｐ８５）をコードするものと同じＲＰに組み合わせることができる。

【0065】

具体的な実施形態では、ワクチンが、少なくとも１つの改変された生ネコ病原体と、ＦＣＶ Ｆ９様カプシドタンパク質もしくはその抗原性断片、および／またはＶＳ－ＦＣＶカプシドタンパク質もしくはその抗原性断片をコードするアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子とを、ＦｅＬＶ ｇｐ８５またはその抗原性断片をコードする別のアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子と共に含む。他の実施形態では、ワクチンが、少なくとも１つの改変された生ネコ病原体と、ＶＳ－ＦＣＶカプシドタンパク質またはその抗原性断片をコードする１つのアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子と、ＦｅＬＶ ｇｐ８５またはその抗原性断片をコードする別のアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子と、さらにＦＣＶ Ｆ９様カプシドタンパク質またはその抗原性断片をコードする第３のアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子とを含む。さらに他の実施形態では、ワクチンが、少なくとも１つの改変された生ネコ病原体と、ＦＣＶ Ｆ９様カプシドタンパク質またはその抗原性断片、ＶＳ－ＦＣＶカプシドタンパク質またはその抗原性断片、およびＦｅＬＶ ｇｐ８５またはその抗原性断片をコードするアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子とを含む。

【0066】

１つまたは複数のこのようなタンパク質抗原が由来し得る病原体の例としては、ネコウイルス性鼻気管炎ウイルス（ＦＶＲ）、ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）、ネコ汎白血球減少症ウイルス（ＦＰＬ）、ネコヘルペスウイルス（ＦＨＶ）、他のＦＣＶ株、ネコパルボウイルス（ＦＰＶ）、ネコ伝染性腹膜炎ウイルス（ＦＩＰＶ）、ネコ免疫不全ウイルス、ボルナ病ウイルス（ＢＤＶ）、狂犬病ウイルス、ネコインフルエンザウイルス、イヌインフルエンザウイルス、鳥インフルエンザ、イヌニューモウイルス、ネコニューモウイルス、クラミドフィラ・フェリス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｆｅｌｉｓ）（ＦＫＡ クラミドフィラ・シタッシ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｐｓｉｔｔａｃｉ））、 ボルデテラ・ブロンキセプチカ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、およびバルトネラ属（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ）種（例えば、バルトネラ・ヘンセラ（Ｂ．ｈｅｎｓｅｌａｅ））が挙げられる。特定の実施形態では、これらのネコまたはイヌ病原体の１つまたは複数からのカプシドタンパク質または類似タンパク質のコード配列を、ＦＣＶ抗原と同じＲＰに挿入することができる。あるいは、またはそれと組み合わせて、これらのネコまたはイヌ病原体の１つまたは複数からのカプシドタンパク質または類似タンパク質のコード配列を、１つまたは複数の他のＲＰに挿入することができ、これをワクチンで、ＦＣＶ Ｆ９様カプシドタンパク質もしくはその抗原性断片および／またはＶＳ－ＦＣＶカプシドタンパク質もしくはその抗原性断片をコードするＲＰと組み合わせることができる。

【0067】

したがって、本発明は、１つまたは複数の本発明のアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子（ＲＰ）［例えば、ＶＳ－ＦＣＶカプシドタンパク質またはその抗原性断片］を１つまたは複数の改変された生（弱毒化）ウイルス分離株、例えば、ＦＣＶの生弱毒化古ワクチン株、例えば生弱毒化ＦＣＶ Ｆ９、および／または生弱毒化ネコヘルペスウイルス、および／または生弱毒化ネコパルボウイルス、および／または生弱毒化ネコ白血病ウイルス、および／または生弱毒化ネコ伝染性腹膜炎ウイルス、および／または生弱毒化ネコ免疫不全ウイルス、および／または生弱毒化ボルナ病ウイルス、および／または生弱毒化狂犬病ウイルス、および／または生弱毒化ネコインフルエンザウイルス、および／または生弱毒化イヌインフルエンザウイルス、および／または生弱毒化鳥インフルエンザ、および／または生弱毒化イヌニューモウイルス、および／または生弱毒化ネコニューモウイルスと共に含むワクチンを提供する。さらに、生弱毒化クラミドフィラ・フェリス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｆｅｌｉｓ）、および／または生弱毒化ボルデテラ・ブロンキセプチカ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、および／または生弱毒化バルトネラ属（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ）種（例えば、バルトネラ・ヘンセラ（Ｂ．ｈｅｎｓｅｌａｅ））もこのような多価ワクチンに含めることができる。

【0068】

さらに、１つまたは複数の本発明のアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子［例えば、ＶＳ－ＦＣＶカプシドタンパク質またはその抗原性断片をコードする］を含む本発明のワクチンは、１つまたは複数の改変された生ウイルス分離株と共に、１つまたは複数の死滅ウイルス分離株、例えば死滅ＦＣＶ株、および／または死滅ネコヘルペスウイルス、および／または死滅ネコパルボウイルス、および／または死滅ネコ白血病ウイルス、および／または死滅ネコ伝染性腹膜炎ウイルス、および／または死滅ネコ免疫不全ウイルス、および／または死滅ボルナ病ウイルス、および／または死滅狂犬病ウイルス、および／または死滅ネコインフルエンザウイルス、および／または死滅イヌインフルエンザウイルス、および／または死滅鳥インフルエンザウイルス、および／または死滅イヌニューモウイルス、および／または死滅ネコニューモウイルスをさらに含むことができる。さらに、クラミドフィラ・フェリス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｆｅｌｉｓ）、および／またはボルデテラ・ブロンキセプチカ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、および／または生弱毒化バルトネラ属（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ）種（例えば、バルトネラ・ヘンセラ（Ｂ．ｈｅｎｓｅｌａｅ））のバクテリンもこのような多価ワクチンに含めることができる。

【0069】

また、本明細書に開示される特定の構成、プロセスステップ、および材料は、いくぶん変化し得るので、本発明はこのような構成、プロセスステップ、および材料に限定されないことも理解されたい。また、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲およびその等価物によってのみ限定されるので、本明細書で使用される用語は特定の実施形態を説明することのみを目的としており、限定を意図するものではないことも理解されたい。

【表1】

【0070】

配列

【0071】

【0072】

【0073】

【0074】

【0075】

【0076】

【0077】

【0078】

【0079】

【0080】

【0081】

【0082】

【0083】

【0084】

【0085】

【0086】

【0087】

以下の実施例は、本発明のさらなる理解を提供するのに役立つが、本発明の有効な範囲を制限することを決して意味するものではない。

【0088】

［実施例］
［実施例１］
ＦＣＶカプシドタンパク質のコード配列のアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子への組み込み
導入
ＲＮＡウイルスは、遺伝子操作されたワクチン抗原をゲノムに導入するためのベクター媒体として使用されている。しかしながら、現在までのそれらの使用は、主にウイルス抗原をＲＮＡウイルスに組み込み、次いで、ウイルスをレシピエント宿主に導入することに限定されてきた。その結果、組み込まれたウイルス抗原に対する防御抗体が誘導される。アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、病原性抗原をコードするために使用されている。このようなアルファウイルスレプリコンプラットフォームは、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ）［Ｐｕｓｈｋｏ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２３９：３８９－４０１（１９９７）］、シンドビス（ＳＩＮ）［その内容全体がこれにより本明細書に組み込まれる、Ｂｒｅｄｅｎｂｅｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６７：６４３９－６４４６（１９９３）］およびセムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）［その内容全体がこれにより本明細書に組み込まれる、Ｌｉｌｊｅｓｔｒｏｍ ａｎｄ Ｇａｒｏｆｆ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （ＮＹ）９：１３５６－１３６１（１９９１）］を含むいくつかの異なるアルファウイルスから開発された。さらに、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、ブタおよび家禽用のいくつかのＵＳＤＡ認可ワクチンの基礎となっている。これらには、ブタ流行性下痢ワクチン、ＲＮＡ粒子（製品コード１９Ｕ５．Ｐ１）、ブタインフルエンザワクチン、ＲＮＡ（製品コード１９Ａ５．Ｄ０）、鳥インフルエンザワクチン、ＲＮＡ（製品コード１９Ｏ５．Ｄ０）、および処方製品、ＲＮＡ粒子（製品コード９ＰＰ０．００）が含まれる。

【0089】

アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子構築
ＲＰ－ＦＣＶ：
ＦＣＶカプシドタンパク質のアミノ酸配列を使用して、インシリコでコドン最適化（ネココドン使用）ヌクレオチド配列を作製した。最適化配列は、商用ベンダー（ＡＴＵＭ、Ｎｅｗａｒｋ、ＣＡ）によって合成ＤＮＡとして調製された。したがって、合成遺伝子を、それぞれＶＳ－ＦＣＶカプシドタンパク質およびＦＣＶ Ｆ９様カプシドタンパク質のアミノ酸配列に基づいて設計した。ＶＳ－ＦＣＶカプシドタンパク質のアミノ酸配列［配列番号２］、またはＦＣＶ Ｆ９様カプシドタンパク質の［配列番号４］をコードする構築物を、ネコについてコドン最適化し、隣接配列はアルファウイルスレプリコンプラスミドへのクローニングに適していた。

【0090】

ＦＣＶカプシドタンパク質を発現するよう設計されたＶＥＥレプリコンベクターは、以下の修正をして、以前記載されたように［その内容が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第９４４１２４７号明細書参照］構築した。ＴＣ－８３由来レプリコンベクター「ｐＶＥＫ」［米国特許第９４４１２４７号明細書に開示および記載されている］を、制限酵素ＡｓｃＩおよびＰａｃＩで消化した。ＦＣＶカプシド遺伝子のコドン最適化オープンリーディングフレームヌクレオチド配列を含み、５’隣接配列（５’－ＧＧＣＧＣＧＣＣＧＣＡＣＣ－３’）［配列番号１１］および３’隣接配列（５’－ＴＴＡＡＴＴＡＡ－３’）を有するＤＮＡプラスミドを、制限酵素ＡｓｃＩおよびＰａｃＩで同様に消化した。次いで、合成遺伝子カセットを消化したｐＶＥＫベクターにライゲートした。

【0091】

ＴＣ－８３ ＲＮＡレプリコン粒子（ＲＰ）の作製は、以前記載された方法［その内容が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第９４４１２４７号明細書および米国特許第８４６０９１３号明細書］に従って行った。手短に言えば、ｐＶＨＶレプリコンベクターＤＮＡおよびヘルパーＤＮＡプラスミドを、ＭｅｇａＳｃｒｉｐｔ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼおよびキャップアナログ（Ｐｒｏｍｅｇａ、マディソン、ＷＩ）を使用してインビトロ転写前に、ＮｏｔＩ制限酵素で直線化した。重要なことに、作製で使用されるヘルパーＲＮＡは、以前記載されたように［Ｋａｍｒｕｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．９１（Ｐｔ ７）：１７２３－１７２７（２０１０）］、ＶＥＥサブゲノムプロモーター配列を欠く。レプリコンおよびヘルパー成分の精製ＲＮＡを組み合わせ、Ｖｅｒｏ細胞の懸濁液と混合し、４ ｍｍキュベットで電気穿孔し、ＯｐｔｉＰｒｏ（登録商標）ＳＦＭ細胞培養培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ ＭＡ）に戻した。一晩のインキュベーション後、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子を、懸濁液をＺｅｔａＰｌｕｓ ＢｉｏＣａｐデプスフィルター（３Ｍ、Ｍａｐｌｅｗｏｏｄ、ＭＮ）に通過させ、５％スクロース（ｗ／ｖ）を含有するリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、最後に４００ｍＭ ＮａＣｌ緩衝液で保持ＲＰを溶出することによって、細胞および培地から精製した。溶出したＲＰを最終的な５％スクロース（ｗ／ｖ）に製剤化し、０．２２ミクロン膜フィルターに通過させ、保存用に一定分量に分注した。機能的ＲＰの力価を、感染したＶｅｒｏ細胞単層の免疫蛍光アッセイによって決定した。

【0092】

ＲＰ－ＦｅＬＶ：
ＦｅＬＶ ｇｐ８５のアミノ酸配列を使用して、インシリコでコドン最適化（ネココドン使用）ヌクレオチド配列を作製した。最適化配列は、商用ベンダー（ＡＴＵＭ、Ｎｅｗａｒｋ、ＣＡ）によって合成ＤＮＡとして調製された。したがって、ｇｐ８５のアミノ酸配列に基づいて合成遺伝子を設計した。構築物（ｇｐ８５＿ｗｔ）は野生型アミノ酸配列［配列番号２］であり、ネコについてコドン最適化し、隣接配列はアルファウイルスレプリコンプラスミドへのクローニングに適切であった。

【0093】

ＦｅＬＶ ｇｐ８５を発現するよう設計されたＶＥＥレプリコンベクターは、以下の修正をして、以前記載されたように［その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第９４４１２４７号明細書参照］構築した。ＴＣ－８３由来レプリコンベクター「ｐＶＥＫ」［米国特許第９４４１２４７号明細書に開示および記載されている］を、制限酵素ＡｓｃＩおよびＰａｃＩで消化した。ＦｅＬＶ ｇｐ８５遺伝子のコドン最適化オープンリーディングフレームヌクレオチド配列を含み、５’隣接配列（５’－ＧＧＣＧＣＧＣＣＧＣＡＣＣ－３’）［配列番号１１］および３’隣接配列（５’－ＴＴＡＡＴＴＡＡ－３’）を有するＤＮＡプラスミドを、制限酵素ＡｓｃＩおよびＰａｃＩで同様に消化した。次いで、合成遺伝子カセットを消化したｐＶＥＫベクターにライゲートし、得られたクローンの名前を「ｐＶＨＶ－ＦｅＬＶ ｇｐ８５」に変更した。「ｐＶＨＶ」ベクター命名法は、ｐＶＥＫのマルチクローニングサイトのＡｓｃＩおよびＰａｃＩ部位を介してクローニングされた導入遺伝子カセットを含むｐＶＥＫ由来レプリコンベクターを指すように選択した。

【0094】

ＴＣ－８３ ＲＮＡレプリコン粒子（ＲＰ）の作製は、以前記載された方法［その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第９４４１２４７号明細書および米国特許第８４６０９１３号明細書］に従って行った。手短に言えば、ｐＶＨＶレプリコンベクターＤＮＡおよびヘルパーＤＮＡプラスミドを、ＭｅｇａＳｃｒｉｐｔ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼおよびキャップアナログ（Ｐｒｏｍｅｇａ、マディソン、ＷＩ）を使用してインビトロ転写前に、ＮｏｔＩ制限酵素で直線化した。重要なことに、作製で使用されるヘルパーＲＮＡは、以前記載されたように［Ｋａｍｒｕｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．９１（Ｐｔ ７）：１７２３－１７２７（２０１０）］、ＶＥＥサブゲノムプロモーター配列を欠く。レプリコンおよびヘルパー成分の精製ＲＮＡを組み合わせ、Ｖｅｒｏ細胞の懸濁液と混合し、４ ｍｍキュベットで電気穿孔し、ＯｐｔｉＰｒｏ（登録商標）ＳＦＭ細胞培養培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ ＭＡ）に戻した。一晩のインキュベーション後、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子を、懸濁液をＺｅｔａＰｌｕｓ ＢｉｏＣａｐデプスフィルター（３Ｍ、Ｍａｐｌｅｗｏｏｄ、ＭＮ）に通過させ、５％スクロース（ｗ／ｖ）を含有するリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、最後に４００ｍＭ ＮａＣｌ緩衝液で保持ＲＰを溶出することによって、細胞および培地から精製した。溶出したＲＰを最終的な５％スクロース（ｗ／ｖ）に製剤化し、０．２２ミクロン膜フィルターに通過させ、保存用に一定分量に分注した。機能的ＲＰの力価を、感染したＶｅｒｏ細胞単層の免疫蛍光アッセイによって決定した。

【0095】

ＲＰ－ＲＶ
ベネズエラウマ脳炎ウイルスの非毒性ＴＣ－８３株のカプシドタンパク質および糖タンパク質とパッケージングされた狂犬病ウイルス（ＲＶ）からの狂犬病ウイルス糖タンパク質（Ｇ）をコードするアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子を含むワクチンを調製した。狂犬病ウイルスＧタンパク質のヌクレオチド配列を、ヒトについてコドン最適化した。得られた配列は、１００％のアミノ酸同一性を有しているにもかかわらず、生狂犬病ウイルス糖タンパク質（Ｇ）配列に対してわずか約８５％のヌクレオチド同一性しか有さない。ワクチンを、哺乳動物対象に投与される単一用量として、例えば、１２週以上のネコおよびイヌに皮下的に、あるいは初回投与とそれに続く１回または複数回のブースター投与を含む複数回用量で使用することができる。

【0096】

狂犬病糖タンパク質（Ｇ）のアミノ酸配列を使用して、インシリコでコドン最適化（ヒトコドン使用）ヌクレオチド配列を作製した。最適化配列は、商用ベンダー（ＡＴＵＭ、Ｎｅｗａｒｋ、ＣＡ）によって合成ＤＮＡとして調製された。したがって、狂犬病糖タンパク質のアミノ酸配列に基づいて合成遺伝子［配列番号９］を設計した。構築物（ＲＡＢＶ－Ｇ）は野生型アミノ酸配列［配列番号１０］であり、ヒトについてコドン最適化し、隣接配列はアルファウイルスレプリコンプラスミドへのクローニングに適切であった。

【0097】

狂犬病Ｇを発現するよう設計されたＶＥＥレプリコンベクターは、以下の修正をして、以前記載されたように［その内容が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第９４４１２４７号明細書参照］構築した。ＴＣ－８３由来レプリコンベクター「ｐＶＥＫ」［米国特許第９４４１２４７号明細書に開示および記載されている］を、制限酵素ＡｓｃＩおよびＰａｃＩで消化した。狂犬病Ｇ遺伝子のコドン最適化オープンリーディングフレームヌクレオチド配列を含み、５’隣接配列（５’－ＧＧＣＧＣＧＣＣＧＣＡＣＣ－３’）［配列番号１１］および３’隣接配列（５’－ＴＴＡＡＴＴＡＡ－３’）を有するＤＮＡプラスミドを、制限酵素ＡｓｃＩおよびＰａｃＩで同様に消化した。次いで、合成遺伝子カセットを消化したｐＶＥＫベクターにライゲートし、得られたクローンの名前を「ｐＶＨＶ－ＲＡＢＶ－Ｇ」に変更した。「ｐＶＨＶ」ベクター命名法は、ｐＶＥＫのマルチクローニングサイトのＡｓｃＩおよびＰａｃＩ部位を介してクローニングされた導入遺伝子カセットを含むｐＶＥＫ由来レプリコンベクターを指すように選択した。

【0098】

ＴＣ－８３ ＲＮＡレプリコン粒子（ＲＰ）の作製は、以前記載された方法［その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第９４４１２４７号明細書および米国特許第８４６０９１３号明細書］に従って行った。手短に言えば、ｐＶＨＶレプリコンベクターＤＮＡおよびヘルパーＤＮＡプラスミドを、ＭｅｇａＳｃｒｉｐｔ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼおよびキャップアナログ（Ｐｒｏｍｅｇａ、マディソン、ＷＩ）を使用してインビトロ転写前に、ＮｏｔＩ制限酵素で直線化した。重要なことに、作製で使用されるヘルパーＲＮＡは、以前記載されたように［Ｋａｍｒｕｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．９１（Ｐｔ ７）：１７２３－１７２７（２０１０）］、ＶＥＥサブゲノムプロモーター配列を欠く。レプリコンおよびヘルパー成分の精製ＲＮＡを組み合わせ、Ｖｅｒｏ細胞の懸濁液と混合し、４ ｍｍキュベットで電気穿孔し、ＯｐｔｉＰｒｏ（登録商標）ＳＦＭ細胞培養培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）に戻した。一晩のインキュベーション後、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子を、懸濁液をＺｅｔａＰｌｕｓ ＢｉｏＣａｐ（登録商標）デプスフィルター（３Ｍ、Ｍａｐｌｅｗｏｏｄ、ＭＮ）に通過させ、５％スクロース（ｗ／ｖ）を含有するリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、最後に４００ｍＭ ＮａＣｌ緩衝液で保持ＲＰを溶出することによって、細胞および培地から精製した。溶出したＲＰを最終的な５％スクロース（ｗ／ｖ）に製剤化し、０．２２ミクロン膜フィルターに通過させ、保存用に一定分量に分注した。機能的ＲＰの力価を、感染したＶｅｒｏ細胞単層の免疫蛍光アッセイによって決定した。

【0099】

［実施例２］
ネコにおける２つのＲＰ構築物と３つの改変された生画分とを含む混合ワクチンの安全性の評価
凍結乾燥された五価ネコ混合ワクチンの種々の製剤および再構成方法を、ネコにおけるそれらの安全性に関して評価した。五価ワクチンの望ましい提示は０．５ｍＬ用量であり、最適な製剤および充填方法は０．５ｍＬ充填である。安定剤は、１．１％ＮＺ－アミン（カゼイン酵素加水分解物）、１．１％ゼラチンおよび７．５％スクロースを含有し、提供される割合は最終濃度を表す。５つの画分を添加するための体積および最終的な効力の制約により、０．５ｍＬを超える体積が必要な場合は、製品を製剤化して１．０ｍＬまで充填し、０．５ｍＬの希釈剤で再構成することができる。これにより、投与用量の安定剤成分の濃度が２倍になる。これらの抗原を含むこのような濃縮用量の安定剤の安全性は、以前はネコで試験されていなかった。

【0100】

１．０ｍＬ充填／０．５ｍＬ再水和フォーマットがネコで安全でない場合、１．０ｍＬの希釈剤で再水和した１．０ｍＬ充填体積の第３の選択肢も試験した。ワクチンをブレンドし、次いで、凍結乾燥した。ワクチンは、１．１％ゼラチン、１．１％ＮＺアミンおよび７．５％スクロースを含有する安定剤中、ネコ白血病ウイルス糖タンパク質（ＲＰ－ＦｅＬＶ）をコードするアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子およびネコカリシウイルスカプシドタンパク質（ＲＰ－ＦＣＶ）をコードするアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子を、市販のワクチン、Ｎｏｂｉｖａｃ（登録商標）Ｆｅｌｉｎｅ－１の成分、すなわち、改変された生（ＭＬＶ）ネコ汎白血球減少症ウイルス（ＦＰＬ）、改変された生ネコウイルス性鼻気管炎ウイルス（ＦＶＲ）および改変された生クラミドフィラ・フェリス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｆｅｌｉｓ）と共に含有していた。以下の表１に記載されるように、五価ネコ混合ワクチンの種々の製剤を調製し、再構成した。

【表2】

【0101】

ワクチンを同用量の各抗原を含有するよう製剤化し（０．５ｍＬケークワクチンは２倍の各抗原の濃度で製剤化した）、安定剤を全ての製剤に一定の濃度で使用した（０．５ｍＬ希釈剤で再水和される１．０ｍＬケークワクチンは、再水和時に２倍の濃度の安定剤を含有していた）。

【0102】

実験ネコ対象を、７～８週齢（典型的には、ネココアワクチンの最小ワクチン接種年齢を有する）と、２１日後に再度、指示された体積のそれぞれの試験ワクチンでワクチン接種した。ネコを、啼鳴、刺痛、掻痒、噛みつき、ワクチンの注射時の突然の動き、または異常な反応（以下の表２および表３を参照）などの疼痛または不快感を示し得る試験ワクチンに対する反応について各ワクチン接種の直後に１５分間観察した。臨床評価は、ワクチン接種の４～６時間後、およびワクチン接種後３日間、毎日獣医師によって実施した。

【0103】

臨床評価は、注射部位の触診、触れると痛い、腫脹、発赤または膿瘍を含む任意の局所反応についての観察を含んでいた。ネコを、抑うつ、嗜眠、跛行、嘔吐、振戦、激越および下痢などの任意の全身反応についても観察した。体温も測定し、ワクチン接種の４～６時間後、および各ワクチン接種後２日間、毎日記録した。局所反応についての注射部位の触診をさらに各ワクチン接種の７日後～２１日後に週３回実施した。

【0104】

全てのワクチン製剤および再水和プロトコルが安全であることが分かった。ネコのいずれにも局所反応も全身反応も観察されなかった。２回目のワクチン接種の５時間後に体温１０３．６℃を示した処置群３（０．５ｍＬケーク／０．５ｍＬ希釈剤）の１匹のネコを除いて、全てのネコの各測定期間での体温は正常であった。したがって、五価ワクチンの３つの調製物全てが許容されることが分かった。

【表3】

【0105】

【表4】

【0106】

本発明は、本明細書に記載される具体的な実施形態によって範囲が限定されるべきではない。実際、本明細書に記載されるものに加えて、本発明の種々の修正が、前記説明から当業者には明らかになるだろう。このような修正は、添付の特許請求の範囲内にあることを意図している。

【0107】

さらに、核酸またはポリペプチドについて与えられる全ての塩基サイズまたはアミノ酸サイズ、および全ての分子量または分子質量値は近似値であり、説明のために提供されることを理解されたい。

【配列表】

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