(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-01-26
(45)【発行日】2024-02-05
(54)【発明の名称】卵を使用しないインフルエンザウイルスワクチンの作製
(51)【国際特許分類】
A61K 39/145 20060101AFI20240129BHJP
A61K 39/00 20060101ALI20240129BHJP
A61P 31/16 20060101ALI20240129BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20240129BHJP
C12N 7/04 20060101ALI20240129BHJP
C12N 7/02 20060101ALI20240129BHJP
【ＦＩ】
A61K39/145
A61K39/00 B
A61P31/16
A61P37/04
C12N7/04
C12N7/02
【請求項の数】
16
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2021215388
(22)【出願日】2021-12-29
(62)【分割の表示】P 2020028399の分割
【原出願日】2007-09-11
(65)【公開番号】P2022034076
(43)【公開日】2022-03-02
【審査請求日】2021-12-29
(31)【優先権主張番号】60/843,720
(32)【優先日】2006-09-11
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】60/936,279
(32)【優先日】2007-06-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】517323533
【氏名又は名称】セキラス ユーケー リミテッド
【氏名又は名称原語表記】Ｓｅｑｉｒｕｓ ＵＫ Ｌｉｍｉｔｅｄ
【住所又は居所原語表記】Ｐｏｉｎｔ， Ｌｅｖｅｌ ３， ２９ Ｍａｒｋｅｔ Ｓｔｒｅｅｔ， Ｍａｉｄｅｎｈｅａｄ， Ｂｅｒｋｓｈｉｒｅ， Ｅｎｇｌａｎｄ ＳＬ６ ８ＡＡ
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】セオドア エフ． ツァイ
(72)【発明者】
【氏名】ハイディ トルシェイム
【審査官】佐々木 大輔
(56)【参考文献】
【文献】特表２００５－５０２３５７（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０００－５０７４４８（ＪＰ，Ａ）
【文献】VIROLOGY，1997年，Vol.232，No.2，pp.345-350
【文献】Voeten, J.T., et al.，Characterization of high-growth reassortant influenza A viruses generated in MDCK cells cultured in serum-free medium，Vaccine，1999年，Vol.17, No.15-16，pp.1942-1950，http://dx.doi.org/10.1016/s0264-410x(98)00464-2
【文献】Palker, T., et al.，Protective efficacy of intranasal cold-adapted influenza A/New Caledonia/20/99 (H1N1) vaccines comprised of egg- or cell culture-derived reassortants，Virus Research，2004年，Vol.105, No.2，pp.183-194，doi:10.1016/j.virusres.2004.05.009
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ３９／００－３９／４４
Ｃ１２Ｎ ７／００－ ７／０８
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ワクチン製造のための再集合体インフルエンザシードウイルスを調製するための方法であって、（ｉ）患者サンプルを、無血清懸濁培養中で生育しているＭＤＣＫ細胞株とともにインキュベートして、前記ＭＤＣＫ細胞株を、ゲノムセグメントの第１の組を有するインフルエンザウイルスの第１の株に感染させることにより、前記患者サンプルから第１のインフルエンザウイルス株を単離するステップであって、前記第１の株が所望の赤血球凝集素をコードするＨＡセグメントを有する、ステップ；
（ｉｉ）前記ＭＤＣＫ細胞株を、ゲノムセグメントの第２の組を有するインフルエンザウイルスの第２の株に感染させるステップ；および
（ｉｉｉ）ワクチン製造のためのシードウイルスとして使用するための、ゲノムセグメントの前記第１の組からの少なくとも１つのセグメントと、ゲノムセグメントの前記第２の組からの少なくとも１つのセグメントとを有する再集合体インフルエンザウイルスを生成させるために、無血清懸濁培養中で生育しているＭＤＣＫ細胞株において、ステップ（ｉｉ）からの前記感染細胞を培養するステップ
を含み、
ただし、ゲノムセグメントの前記第１の組からの前記少なくとも１つのセグメントが、前記第１の株からの前記ＨＡセグメントを含む、方法。
【請求項2】
ゲノムセグメントの前記第１の組からの前記少なくとも１つのセグメントが、前記第１のインフルエンザウイルス株からのノイラミニダーゼセグメントを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記再集合体インフルエンザシードウイルスが、前記第１のインフルエンザウイルス株および第２のインフルエンザウイルスからのセグメントを、１：７、２：６、３：５、４：４、５：３、６：２または７：１の比で含む、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記ＭＤＣＫ細胞が非腫瘍形成性である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記ＭＤＣＫ細胞に重層培地が提供されない、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記ＭＤＣＫ細胞が、無タンパク質懸濁培養中で生育している、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記ＭＤＣＫ細胞がＭＤＣＫ３３０１６である、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記再集合体インフルエンザシードウイルスが、有効なシードロットを調製するために使用される、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
請求項１～８のいずれか一項に記載の方法に従って再集合体インフルエンザシードウイルスを調製するステップと、ワクチン製造のためのウイルスを提供するための生育のための細胞株を感染させるステップとを含む、ワクチンを製造するための方法。
【請求項10】
請求項１～８のいずれか一項に記載の方法によって調製された前記再集合体インフルエンザシードウイルスを単離するステップと、前記再集合体インフルエンザシードウイルスからワクチンを製造するステップとを含む、ワクチンを製造するための方法。
【請求項11】
ワクチンにおいて使用するためのインフルエンザウイルス抗原を調製するための方法であって、（ｉ）請求項１～８のいずれか一項に記載の方法によって、ＭＤＣＫ細胞において単離および生成された再集合体インフルエンザウイルスを受取るステップ；
（ｉｉ）細胞株にこのインフルエンザウイルスを感染させるステップ；および
（ｉｉｉ）インフルエンザウイルスを生成するために、ステップ（ｉｉ）からの前記感染細胞を培養するステップ
を含む、方法。
【請求項12】
ステップ（ｉ）で受け取った前記再集合体インフルエンザウイルスが、以下の特徴：（ａ）卵培養基で増殖されたことがない；
（ｂ）ＭＤＣＫ３３０１６細胞中で単離された；
（ｃ）血清含有培地中で生育する培養基で増殖されたことがない；
（ｄ）ＰＲ／８／３４インフルエンザウイルスからの６つより少ないウイルスセグメント、および／もしくはＡＡ／６／６０インフルエンザウイルスからの６つより少ないウイルスセグメントを有するインフルエンザＡウイルスであるか、または、ＡＡ／１／６６インフルエンザウイルスからの６つより少ないウイルスセグメントを有するインフルエンザＢウイルスである；
（ｅ）Ｓｉａ（α２，３）Ｇａｌ末端二糖を有するオリゴ糖よりもＳｉａ（α２，６）Ｇａｌ末端二糖を有するオリゴ糖に優先的に結合する赤血球凝集素を含む；および／または（ｇ）卵由来のウイルスとは異なるグリコシル化パターンを有する、赤血球凝集素を含む糖タンパク質を有する
のうち１つまたはそれ以上を有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
前記患者サンプルから単離される前記インフルエンザウイルス株が、Ｈ１Ｎ１またはＨ３Ｎ２インフルエンザＡ株またはインフルエンザＢ株から選択される、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
前記患者サンプルから単離される前記インフルエンザウイルス株が、Ｓｉａ（α２，３）Ｇａｌ末端二糖を有するオリゴ糖よりもＳｉａ（α２，６）Ｇａｌ末端二糖を有するオリゴ糖に優先的に結合する、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
前記方法により生成される前記インフルエンザウイルス株が、Ｓｉａ（α２，３）Ｇａｌ末端二糖を有するオリゴ糖よりもＳｉａ（α２，６）Ｇａｌ末端二糖を有するオリゴ糖に優先的に結合する、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
前記ワクチンが、２、３、４またはそれ以上のインフルエンザウイルス株からの赤血球凝集素（ＨＡ）抗原を含み、前記株がインフルエンザＡウイルスおよび／またはインフルエンザＢウイルスである、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本明細書において引用されるすべての文献は、その全体がここに引用により援用される。
【0002】
本発明は、インフルエンザウイルスに対する保護のためのワクチンの製造の技術分野に属する。
【背景技術】
【0003】
ヒトインフルエンザウイルス感染に対するシーズンワクチンを調製するための現行方法は、次のステップを含む［１、２（非特許文献１、非特許文献２）］：（ａ）流布しているウイルス株の単離；（ｂ）単離されたウイルスの抗原性および遺伝子の分析；（ｃ）来シーズンに用いるウイルス株の選択；（ｄ）再集合または逆遺伝学の使用による高生育のシード株の調製；（ｅ）ワクチン製造者へのシード株の放出；（ｆ）製造者によるその株の工業的生産に対する好適性の評価；および（ｇ）シード株の生育によるウイルスの生産、およびそのウイルスからのワクチン製造。
【0004】
この方法のステップ（ａ）から（ｅ）は、ＦＤＡおよび政府認可の国際インフルエンザセンターによって、典型的には世界保健機関の後援の下で行なわれる；ステップ（ｆ）および（ｇ）は、製造者自身によって行なわれる。
【0005】
ステップ（ｄ）では、本来ヒトに感染するために適合したウイルスを、工業的生育条件下で高力価に生育するウイルスに移行させる。インフルエンザＡウイルスに対しては、このステップは典型的に６：２再集合体株を生成するステップを含み、この再集合体株は（ｃ）で選択された株からのＨＡおよびＮＡをコードするゲノムセグメントと、鶏卵において効率良く生育する株からの残り６つのゲノムセグメントとを含み、この株は通常はＡ／ＰＲ／８／３４である。この再集合手順の後に、発育鶏卵中でこの株を繰り返し継代することによって、卵への順応および生育の増大を可能にする。インフルエンザＢウイルスに対しては、良好な生育特徴を有する先祖株は通常、再集合体の生成を試みることなく直接発育鶏卵中で繰り返し継代することによって得られる。
【0006】
よって、ワクチン製造者への放出前に行なわれるステップは、卵を通じてインフルエンザウイルスを継代するステップを含む。たとえステップ（ｇ）において製造者が卵ではなく細胞培養基上でウイルスを生育したとしても、ウイルスはステップ（ａ）における単離からステップ（ｅ）における製造者による受取りまでの間のいずれかの段階において、卵を通じて継代される。
【0007】
たとえばステップ（ａ）は、患者のサンプルに培養基を露出させて、サンプル中のあらゆるウイルスを培養基に感染させるステップを含む。次いで培養基は存在するウイルスの量を増幅でき、増幅されたウイルスはさらなる研究のために利用可能となる。このステップは卵または哺乳動物細胞において行なわれてもよい。一次単離に用いられることが公知の細胞は、ＭＲＣ－５細胞［３］、ベロ細胞［４、５］、ＭＤＣＫ細胞［６］、ＨｅｐＧ２細胞［７］、ＬＬＣ－ＭＫ２細胞［８］などを含む。しかし一般的には、インフルエンザワクチンの製造のための基準株を単離するために鶏卵が用いられ続けている。現行の手順にとって卵の使用は非常に重要であり、２００３～０４年のシーズンにおいて、ＦＤＡは最も適切なＨ３Ｎ２株（Ａ／Ｆｕｊｉａｎ／４１１／２００２）の使用を、この株が元々卵において単離されたものではなく［２（非特許文献２）、９］、かつ抗原性が類似した卵から単離された株が入手不可能であるという理由から拒絶したほどである。
【0008】
インフルエンザウイルス製造のさまざまな段階から卵の使用を排除することが以前から提案されてきた。
【0009】
参考文献１０（特許文献１）は、単離体または再集合体が鳥類の卵において継代されていなければ、（ｉ）継代された臨床的単離体の高生育株、または（ｉｉ）少なくとも１つの自然発生する哺乳動物のインフルエンザウイルス株に由来する再集合体のいずれかを用いて細胞培養物中でワクチンを生育すべきであると提案している。よって参考文献１０（特許文献１）に記載される方法は、選択された細胞培養物中での生育のためにすでに選択または操作されたシードウイルスから始まっている。
【0010】
参考文献１１（特許文献２）は、卵を通じて継代されたウイルスをＭＤＣＫ細胞を通じて継代されたウイルスと比較しているが、ワクチン製造に対しては前者を特定的に選択している。
【0011】
参考文献１２（非特許文献３）は、パンデミックインフルエンザワクチンに対するシードウイルスを、発育鶏卵を介さずに哺乳動物細胞培養物上で直接パンデミック株を増殖させることによって調製できることを示唆しているが、パンデミック間の（ｉｎｔｅｒ－ｐａｎｄｅｍｉｃ）製造のためには卵継代をする義務があると述べている。このように卵継代が義務的である理由は、卵継代が偶発的な物質（ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ ａｇｅｎｔｓ）に対する「フィルタ」の役割をすると考えられているためである：ヒトからの元々の臨床的単離と、ヒトへの投与のための最終的なワクチンとの間の、鳥類系における一連の継代は、哺乳動物型の偶発的な物質がインフルエンザウイルスとともに複製することを防ぐことを規制機関は受入れている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0012】
【文献】米国特許第6,344,354号明細書
【文献】米国特許第5,162,112号明細書
【非特許文献】
【0013】
【文献】Gerdil Vaccine(2003)21:1776-9
【文献】Palese Emerging Infectious Diseases(2006)12:61-65
【文献】Medema et al. Virus Res.(2004)103(1-2):9-15
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0014】
本発明は、卵の使用が低減され、好ましくは完全に回避されるような、インフルエンザワクチンの製造において有用なさらなる手順を提供することを目的とする。１つの特定の局面において、本発明はインフルエンザウイルスの単離において有用なさらなる改善された手順を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0015】
発明の開示
インフルエンザウイルス製造のさまざまな段階から卵の使用を排除することが従来から提案されてきたが、本発明はこれらの提案とはさまざまな局面において異なる。
本発明は例えば、以下の項目を提供する：
（項目１） ワクチン製造のためのインフルエンザシードウイルスを調製するための方法であって、
（ｉ）患者から直接得られたインフルエンザウイルスまたは一次単離体から得られたインフルエンザウイルスを細胞株に感染させるステップと；
（ｉｉ）ステップ（ｉ）において得られた該感染細胞株からのウイルスを少なくとも１回継代するステップと；
（ｉｉｉ）シードウイルスとして使用するためのインフルエンザウイルスを生成するためにステップ（ｉｉ）からの該感染細胞株を培養するステップと
を含み、ステップ（ｉ）において用いられる該インフルエンザウイルスはインフルエンザＢウイルスであるか、またはインフルエンザＡウイルスのＨ１もしくはＨ３株である、方法。
（項目２） ワクチン製造のためのインフルエンザシードウイルスを調製するための方法であって、
（ｉ）患者から直接得られたインフルエンザウイルスまたは一次単離体から得られたインフルエンザウイルスを細胞株に感染させるステップと；
（ｉｉ）ステップ（ｉ）において得られた該感染細胞株によって生成されたインフルエンザウイルスの少なくとも１つのウイルスＲＮＡセグメントのｃＤＮＡを調製し、該ｃＤＮＡを逆遺伝学手順に用いて、ステップ（ｉ）の該インフルエンザウイルスと同様の少なくとも１つのウイルスＲＮＡセグメントを有する新たなインフルエンザウイルスを調製するステップと；
（ｉｉｉ）細胞株に該新たなインフルエンザウイルスを感染させ、次いでシードウイルスとして使用するための該新たなインフルエンザウイルスを生成するために該細胞株を培養するステップと
を含む、方法。
（項目３） ステップ（ｉｉ）における継代は、ステップ（ｉ）において用いられたものと同じ型の細胞を介する、項目１に記載の方法。
（項目４） ステップ（ｉ）、（ｉｉ）または（ｉｉｉ）のいずれも卵におけるインフルエンザウイルスの生育または継代を含まない、項目１～３のいずれか１項に記載の方法。（項目５） 前記細胞株はヒト以外の哺乳動物細胞株である、項目１～４のいずれか１項に記載の方法。
（項目６） 前記細胞株はＭＤＣＫ細胞株である、項目１～５のいずれか１項に記載の方法。
（項目７） 前記シードウイルスは配列決定される、項目１～６のいずれか１項に記載の方法。
（項目８） 前記シードウイルスは抗血清を誘出するために用いられる、項目１～７のいずれか１項に記載の方法。
（項目９） 前記シードウイルスは有効なシードロットを調製するために用いられる、項目１～８のいずれか１項に記載の方法。
（項目１０） 前記シードウイルスはワクチン製造のために用いられる、項目１～９のいずれか１項に記載の方法。
（項目１１） 前記シードウイルスのゲノムはＰＲ／８／３４セグメントを有さない、項目１～１０のいずれか１項に記載の方法。
（項目１２） 前記シードウイルスは、Ｓｉａ（α２，３）Ｇａｌ末端二糖を有するオリゴ糖よりもＳｉａ（α２，６）Ｇａｌ末端二糖を有するオリゴ糖に優先的に結合する赤血球凝集素を有する、項目１～１１のいずれか１項に記載の方法。
（項目１３） ワクチン製造のためのインフルエンザウイルスを調製するための方法であって、
（ｉ）集団中に流布しているインフルエンザウイルスか、または集団中に流布しているインフルエンザウイルスを抗原的に代表する赤血球凝集素を有するインフルエンザウイルスを得るステップと；
（ｉｉ）ステップ（ｉ）において得られた該インフルエンザウイルスを細胞株に感染させるステップと；
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）において得られた該感染細胞株からのウイルスを少なくとも１回継代してシード株を生じさせるステップと；
（ｉｖ）インフルエンザウイルスを生成するためにステップ（ｉｉｉ）からの該シード株を培養するステップと
を含む、方法。
（項目１４） ワクチン製造のためのインフルエンザウイルスを調製するための方法であって、
（ｉ）集団中に流布しているインフルエンザウイルスか、または集団中に流布しているインフルエンザウイルスを抗原的に代表する赤血球凝集素を有するインフルエンザウイルスを得るステップと；
（ｉｉ）ステップ（ｉ）において得られた該インフルエンザウイルスを細胞株に感染させるステップと；
（ｉｉｉ）ステップ（ｉ）において得られた該感染細胞株によって生成されたインフルエンザウイルスの少なくとも１つのウイルスＲＮＡセグメントのｃＤＮＡを調製し、該ｃＤＮＡを逆遺伝学手順に用いて、ステップ（ｉ）の該インフルエンザウイルスと同様の少なくとも１つのウイルスＲＮＡセグメントを有するインフルエンザシードウイルスを調製するステップと；
（ｉｖ）細胞株に該インフルエンザシードウイルスを感染させ、次いでインフルエンザウイルスを生成するためにステップ（ｉｉｉ）からの該継代された細胞株を培養するステップと
を含む、方法。
（項目１５） インフルエンザウイルスワクチンを調製するための方法であって、項目１３または１４のステップ（ｉ）～（ｉｖ）と、次いで
（ｖ）ステップ（ｉｖ）において得られたウイルスを処理してワクチンを生じさせるステップと
を含む、方法。
（項目１６） ステップ（ｖ）は前記ウイルスを不活性化するステップを含む、項目１５に記載の方法。
（項目１７） 前記ワクチンは全ビリオンワクチンである、項目１６に記載の方法。
（項目１８） 前記ワクチンは分解ビリオンワクチンである、項目１６に記載の方法。
（項目１９） 前記ワクチンは表面抗原ワクチンである、項目１６に記載の方法。
（項目２０） 前記ワクチンはビロゾームのワクチンである、項目１６に記載の方法。
（項目２１） 前記ワクチンは、用量当り１０ｎｇ未満の残留宿主細胞ＤＮＡを含有する、項目１５～２０のいずれか１項に記載の方法。
（項目２２） 多価インフルエンザワクチンを作製するための方法であって、
複数の個別のインフルエンザウイルス株に対して項目１５～２１のいずれか１項に記載の方法を行なうステップと、
該個別のワクチンを混合して該多価インフルエンザワクチンを作製するステップと
を含む、方法。
（項目２３） 前記多価インフルエンザワクチンは、２つのインフルエンザＡウイルス株と、１つのインフルエンザＢウイルス株とを有する、項目２２に記載の方法。
（項目２４） 前記ワクチンは水銀を実質的に含まない、項目１５～２２のいずれか１項に記載の方法。
（項目２５） 前記ワクチンはアジュバントを含む、項目１５～２４のいずれか１項に記載の方法。
（項目２６） 動物から抗血清を調製するための方法であって、
（ｉ）精製したインフルエンザウイルス赤血球凝集素を該動物に投与するステップと；次いで
（ｉｉ）該赤血球凝集素を認識する抗体を含有する血清を該動物から回収するステップと
を含み、ステップ（ｉ）において用いられた該赤血球凝集素は細胞株中で生育されたウイルスからのものであることを特徴とする、方法。
（項目２７） 動物から抗血清を調製するための方法であって、
（ｉ）細胞株中でインフルエンザウイルスを生育するステップと；
（ｉｉ）ステップ（ｉ）において生育されたウイルスからの赤血球凝集素抗原を精製するステップと；
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）からの該精製赤血球凝集素を該動物に投与するステップと；次いで
（ｉｖ）該動物から該赤血球凝集素を認識する抗体を含有する血清を回収するステップと
を含む、方法。
（項目２８） 前記動物はヒツジである、項目２６または２７に記載の方法。
（項目２９） 前記抗血清をＳＲＩＤアッセイに好適なゲルと混合するさらなるステップを含む、項目２６～２８のいずれか１項に記載の方法。
（項目３０） 項目２６～２８のいずれか１項に記載の方法によって得られる、抗血清。（項目３１） 抗原基準材料を調製するための方法であって、
（ｉ）細胞株中でインフルエンザウイルスを生育するステップと；
（ｉｉ）ステップ（ｉ）において生育されたウイルスを精製するステップと；
（ｉｉｉ）該ウイルスを不活性化するステップであって、ここで、ステップ（ｉ）において用いられた該インフルエンザウイルスは卵中で生育されたことがないことを特徴とする、ステップと；
（ｉｖ）該不活性化されたウイルスを凍結乾燥するステップとを含む、方法。
（項目３２） 患者のサンプルからインフルエンザウイルスを単離するための方法であって、
該患者のサンプルがＭＤＣＫ細胞とともにインキュベートされるステップを含み、
該ＭＤＣＫ細胞は懸濁培養中で生育している、方法。
（項目３３） 患者のサンプルからインフルエンザウイルスを単離するための方法であって、
該患者のサンプルがＭＤＣＫ細胞とともにインキュベートされるステップを含み、
該ＭＤＣＫ細胞は無血清培地中で生育している、方法。
（項目３４） 患者のサンプルからインフルエンザウイルスを単離するための方法であって、
該患者のサンプルがＭＤＣＫ細胞とともにインキュベートされるステップを含み、
該ＭＤＣＫ細胞は無タンパク質培地中で生育している、方法。
（項目３５） 患者のサンプルからインフルエンザウイルスを単離するための方法であって、
該患者のサンプルが非腫瘍形成性のＭＤＣＫ細胞とともにインキュベートされるステップを含む、方法。
（項目３６） 患者のサンプルからインフルエンザウイルスを単離するための方法であって、
前記患者のサンプルがＭＤＣＫ細胞とともにインキュベートされるステップを含み、
前記ＭＤＣＫ細胞は重層培地に提供されない、方法。
（項目３７） 患者のサンプルからインフルエンザウイルスを単離するための方法であって、
該患者のサンプルがＭＤＣＫ細胞とともにインキュベートされるステップを含み、
該ＭＤＣＫ細胞は無血清懸濁培養中で生育している、方法。
（項目３８） 患者のサンプルからインフルエンザウイルスを単離するための方法であって、
該患者のサンプルがＭＤＣＫ細胞とともにインキュベートされるステップを含み、
該ＭＤＣＫ細胞は無タンパク質懸濁培養中で生育している、方法。
（項目３９） 患者のサンプルからインフルエンザウイルスを単離するための方法であって、
該患者のサンプルが非腫瘍形成性のＭＤＣＫ細胞とともにインキュベートされるステップを含み、
該ＭＤＣＫ細胞は懸濁培養中で生育している、方法。
（項目４０） 患者のサンプルからインフルエンザウイルスを単離するための方法であって、
該患者のサンプルが非腫瘍形成性のＭＤＣＫ細胞とともにインキュベートされるステップを含み、
該ＭＤＣＫ細胞は無血清懸濁培養中で生育している、方法。
（項目４１） 患者のサンプルからインフルエンザウイルスを単離するための方法であって、
該患者のサンプルが非腫瘍形成性のＭＤＣＫ細胞とともにインキュベートされるステップを含み、
該ＭＤＣＫ細胞は無タンパク質懸濁培養中で生育している、方法。
（項目４２） 項目３２～４１のいずれか１項に記載の方法によって単離された、インフルエンザウイルス。
（項目４３） 再集合体インフルエンザウイルスを調製するための方法であって、
（ｉ）ゲノムセグメントの第１の組を有するインフルエンザウイルスの第１の株と、ゲノムセグメントの第２の組を有するインフルエンザウイルスの第２の株との両方を細胞株に感染させるステップであって、該第１の株は所望の赤血球凝集素をコードするＨＡセグメントを有する、ステップ；
（ｉｉ）ステップ（ｉ）からの該感染細胞を培養して、ゲノムセグメントの該第１の組からの少なくとも１つのセグメントおよびゲノムセグメントの該第２の組からの少なくとも１つのセグメントを有するインフルエンザウイルスを生成するステップを含み、
ただし、ゲノムセグメントの該第１の組からの該少なくとも１つのセグメントが該第１の株からの該ＨＡセグメントを含む、方法。
（項目４４） ワクチンに使用するためのインフルエンザウイルス抗原を調製するための方法であって、
（ｉ）卵培養基で増殖されたことがないインフルエンザウイルスを受取るステップと；
（ｉｉ）該インフルエンザウイルスを細胞株に感染させるステップと；
（ｉｉｉ）インフルエンザウイルスを生成するためにステップ（ｉｉ）からの該感染細胞を培養するステップと
を含む、方法。
（項目４５） ワクチンに使用するためのインフルエンザウイルス抗原を調製するための方法であって、
（ｉ）ＭＤＣＫ３３０１６細胞中で単離されたインフルエンザウイルスを受取るステップと；
（ｉｉ）該インフルエンザウイルスを細胞株に感染させるステップと；
（ｉｉｉ）インフルエンザウイルスを生成するためにステップ（ｉｉ）からの該感染細胞を培養するステップと
を含む、方法。
（項目４６） ワクチンに使用するためのインフルエンザウイルス抗原を調製するための方法であって、
（ｉ）血清含有培地中で生育する培養基で増殖されたことがないインフルエンザウイルスを受取るステップと；
（ｉｉ）該インフルエンザウイルスを細胞株に感染させるステップと；
（ｉｉｉ）インフルエンザウイルスを生成するためにステップ（ｉｉ）からの該感染細胞を培養するステップと
を含む、方法。
（項目４７） ワクチンに使用するためのインフルエンザウイルス抗原を調製するための方法であって、
（ｉ）逆遺伝学技術を用いて生成されたインフルエンザウイルスを受取るステップと；
（ｉｉ）該インフルエンザウイルスを細胞株に感染させるステップと；
（ｉｉｉ）インフルエンザウイルスを生成するためにステップ（ｉｉ）からの該感染細胞を培養するステップと
を含む、方法。
（項目４８） ワクチンに使用するためのインフルエンザウイルス抗原を調製するための方法であって、
（ｉ）ＰＲ／８／３４インフルエンザウイルスからの６つより少ないウイルスセグメントを有するインフルエンザＡウイルスを受取るステップと；
（ｉｉ）該インフルエンザウイルスを細胞株に感染させるステップと；
（ｉｉｉ）インフルエンザウイルスを生成するためにステップ（ｉｉ）からの該感染細胞を培養するステップと
を含む、方法。
（項目４９） ワクチンに使用するためのインフルエンザウイルス抗原を調製するための方法であって、
（ｉ）ＡＡ／６／６０インフルエンザウイルスからの６つより少ないウイルスセグメントを有するインフルエンザＡウイルスを受取るステップと；
（ｉｉ）該インフルエンザウイルスを細胞株に感染させるステップと；
（ｉｉｉ）インフルエンザウイルスを生成するためにステップ（ｉｉ）からの該感染細胞を培養するステップと
を含む、方法。
（項目５０） ワクチンに使用するためのインフルエンザウイルス抗原を調製するための方法であって、
（ｉ）Ｓｉａ（α２，３）Ｇａｌ末端二糖を有するオリゴ糖よりもＳｉａ（α２，６）Ｇａｌ末端二糖を有するオリゴ糖に優先的に結合する赤血球凝集素を有するインフルエンザウイルスを受取るステップと；
（ｉｉ）該インフルエンザウイルスを細胞株に感染させるステップと；
（ｉｉｉ）インフルエンザウイルスを生成するためにステップ（ｉｉ）からの該感染細胞を培養するステップと
を含む、方法。
（項目５１） ワクチンに使用するためのインフルエンザウイルス抗原を調製するための方法であって、
（ｉ）鶏卵には見られない赤血球凝集素および／またはノイラミニダーゼグリコフォームを有するインフルエンザウイルスを受取るステップと；
（ｉｉ）該インフルエンザウイルスを細胞株に感染させるステップと；
（ｉｉｉ）インフルエンザウイルスを生成するためにステップ（ｉｉ）からの該感染細胞を培養するステップと
を含む、方法。
インフルエンザウイルス製造のさまざまな段階から卵の使用を排除することが従来から提案されてきたが、本発明はこれらの提案とはさまざまな局面において異なる。
本発明は例えば、以下の項目を提供する：
（項目１） ワクチン製造のためのインフルエンザシードウイルスを調製するための方法であって、
（ｉ）患者から直接得られたインフルエンザウイルスまたは一次単離体から得られたインフルエンザウイルスを細胞株に感染させるステップと；
（ｉｉ）ステップ（ｉ）において得られた該感染細胞株からのウイルスを少なくとも１回継代するステップと；
（ｉｉｉ）シードウイルスとして使用するためのインフルエンザウイルスを生成するためにステップ（ｉｉ）からの該感染細胞株を培養するステップと
を含み、ステップ（ｉ）において用いられる該インフルエンザウイルスはインフルエンザＢウイルスであるか、またはインフルエンザＡウイルスのＨ１もしくはＨ３株である、方法。
（項目２） ワクチン製造のためのインフルエンザシードウイルスを調製するための方法であって、
（ｉ）患者から直接得られたインフルエンザウイルスまたは一次単離体から得られたインフルエンザウイルスを細胞株に感染させるステップと；
（ｉｉ）ステップ（ｉ）において得られた該感染細胞株によって生成されたインフルエンザウイルスの少なくとも１つのウイルスＲＮＡセグメントのｃＤＮＡを調製し、該ｃＤＮＡを逆遺伝学手順に用いて、ステップ（ｉ）の該インフルエンザウイルスと同様の少なくとも１つのウイルスＲＮＡセグメントを有する新たなインフルエンザウイルスを調製するステップと；
（ｉｉｉ）細胞株に該新たなインフルエンザウイルスを感染させ、次いでシードウイルスとして使用するための該新たなインフルエンザウイルスを生成するために該細胞株を培養するステップと
を含む、方法。
（項目３） ステップ（ｉｉ）における継代は、ステップ（ｉ）において用いられたものと同じ型の細胞を介する、項目１に記載の方法。
（項目４） ステップ（ｉ）、（ｉｉ）または（ｉｉｉ）のいずれも卵におけるインフルエンザウイルスの生育または継代を含まない、項目１～３のいずれか１項に記載の方法。（項目５） 前記細胞株はヒト以外の哺乳動物細胞株である、項目１～４のいずれか１項に記載の方法。
（項目６） 前記細胞株はＭＤＣＫ細胞株である、項目１～５のいずれか１項に記載の方法。
（項目７） 前記シードウイルスは配列決定される、項目１～６のいずれか１項に記載の方法。
（項目８） 前記シードウイルスは抗血清を誘出するために用いられる、項目１～７のいずれか１項に記載の方法。
（項目９） 前記シードウイルスは有効なシードロットを調製するために用いられる、項目１～８のいずれか１項に記載の方法。
（項目１０） 前記シードウイルスはワクチン製造のために用いられる、項目１～９のいずれか１項に記載の方法。
（項目１１） 前記シードウイルスのゲノムはＰＲ／８／３４セグメントを有さない、項目１～１０のいずれか１項に記載の方法。
（項目１２） 前記シードウイルスは、Ｓｉａ（α２，３）Ｇａｌ末端二糖を有するオリゴ糖よりもＳｉａ（α２，６）Ｇａｌ末端二糖を有するオリゴ糖に優先的に結合する赤血球凝集素を有する、項目１～１１のいずれか１項に記載の方法。
（項目１３） ワクチン製造のためのインフルエンザウイルスを調製するための方法であって、
（ｉ）集団中に流布しているインフルエンザウイルスか、または集団中に流布しているインフルエンザウイルスを抗原的に代表する赤血球凝集素を有するインフルエンザウイルスを得るステップと；
（ｉｉ）ステップ（ｉ）において得られた該インフルエンザウイルスを細胞株に感染させるステップと；
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）において得られた該感染細胞株からのウイルスを少なくとも１回継代してシード株を生じさせるステップと；
（ｉｖ）インフルエンザウイルスを生成するためにステップ（ｉｉｉ）からの該シード株を培養するステップと
を含む、方法。
（項目１４） ワクチン製造のためのインフルエンザウイルスを調製するための方法であって、
（ｉ）集団中に流布しているインフルエンザウイルスか、または集団中に流布しているインフルエンザウイルスを抗原的に代表する赤血球凝集素を有するインフルエンザウイルスを得るステップと；
（ｉｉ）ステップ（ｉ）において得られた該インフルエンザウイルスを細胞株に感染させるステップと；
（ｉｉｉ）ステップ（ｉ）において得られた該感染細胞株によって生成されたインフルエンザウイルスの少なくとも１つのウイルスＲＮＡセグメントのｃＤＮＡを調製し、該ｃＤＮＡを逆遺伝学手順に用いて、ステップ（ｉ）の該インフルエンザウイルスと同様の少なくとも１つのウイルスＲＮＡセグメントを有するインフルエンザシードウイルスを調製するステップと；
（ｉｖ）細胞株に該インフルエンザシードウイルスを感染させ、次いでインフルエンザウイルスを生成するためにステップ（ｉｉｉ）からの該継代された細胞株を培養するステップと
を含む、方法。
（項目１５） インフルエンザウイルスワクチンを調製するための方法であって、項目１３または１４のステップ（ｉ）～（ｉｖ）と、次いで
（ｖ）ステップ（ｉｖ）において得られたウイルスを処理してワクチンを生じさせるステップと
を含む、方法。
（項目１６） ステップ（ｖ）は前記ウイルスを不活性化するステップを含む、項目１５に記載の方法。
（項目１７） 前記ワクチンは全ビリオンワクチンである、項目１６に記載の方法。
（項目１８） 前記ワクチンは分解ビリオンワクチンである、項目１６に記載の方法。
（項目１９） 前記ワクチンは表面抗原ワクチンである、項目１６に記載の方法。
（項目２０） 前記ワクチンはビロゾームのワクチンである、項目１６に記載の方法。
（項目２１） 前記ワクチンは、用量当り１０ｎｇ未満の残留宿主細胞ＤＮＡを含有する、項目１５～２０のいずれか１項に記載の方法。
（項目２２） 多価インフルエンザワクチンを作製するための方法であって、
複数の個別のインフルエンザウイルス株に対して項目１５～２１のいずれか１項に記載の方法を行なうステップと、
該個別のワクチンを混合して該多価インフルエンザワクチンを作製するステップと
を含む、方法。
（項目２３） 前記多価インフルエンザワクチンは、２つのインフルエンザＡウイルス株と、１つのインフルエンザＢウイルス株とを有する、項目２２に記載の方法。
（項目２４） 前記ワクチンは水銀を実質的に含まない、項目１５～２２のいずれか１項に記載の方法。
（項目２５） 前記ワクチンはアジュバントを含む、項目１５～２４のいずれか１項に記載の方法。
（項目２６） 動物から抗血清を調製するための方法であって、
（ｉ）精製したインフルエンザウイルス赤血球凝集素を該動物に投与するステップと；次いで
（ｉｉ）該赤血球凝集素を認識する抗体を含有する血清を該動物から回収するステップと
を含み、ステップ（ｉ）において用いられた該赤血球凝集素は細胞株中で生育されたウイルスからのものであることを特徴とする、方法。
（項目２７） 動物から抗血清を調製するための方法であって、
（ｉ）細胞株中でインフルエンザウイルスを生育するステップと；
（ｉｉ）ステップ（ｉ）において生育されたウイルスからの赤血球凝集素抗原を精製するステップと；
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）からの該精製赤血球凝集素を該動物に投与するステップと；次いで
（ｉｖ）該動物から該赤血球凝集素を認識する抗体を含有する血清を回収するステップと
を含む、方法。
（項目２８） 前記動物はヒツジである、項目２６または２７に記載の方法。
（項目２９） 前記抗血清をＳＲＩＤアッセイに好適なゲルと混合するさらなるステップを含む、項目２６～２８のいずれか１項に記載の方法。
（項目３０） 項目２６～２８のいずれか１項に記載の方法によって得られる、抗血清。（項目３１） 抗原基準材料を調製するための方法であって、
（ｉ）細胞株中でインフルエンザウイルスを生育するステップと；
（ｉｉ）ステップ（ｉ）において生育されたウイルスを精製するステップと；
（ｉｉｉ）該ウイルスを不活性化するステップであって、ここで、ステップ（ｉ）において用いられた該インフルエンザウイルスは卵中で生育されたことがないことを特徴とする、ステップと；
（ｉｖ）該不活性化されたウイルスを凍結乾燥するステップとを含む、方法。
（項目３２） 患者のサンプルからインフルエンザウイルスを単離するための方法であって、
該患者のサンプルがＭＤＣＫ細胞とともにインキュベートされるステップを含み、
該ＭＤＣＫ細胞は懸濁培養中で生育している、方法。
（項目３３） 患者のサンプルからインフルエンザウイルスを単離するための方法であって、
該患者のサンプルがＭＤＣＫ細胞とともにインキュベートされるステップを含み、
該ＭＤＣＫ細胞は無血清培地中で生育している、方法。
（項目３４） 患者のサンプルからインフルエンザウイルスを単離するための方法であって、
該患者のサンプルがＭＤＣＫ細胞とともにインキュベートされるステップを含み、
該ＭＤＣＫ細胞は無タンパク質培地中で生育している、方法。
（項目３５） 患者のサンプルからインフルエンザウイルスを単離するための方法であって、
該患者のサンプルが非腫瘍形成性のＭＤＣＫ細胞とともにインキュベートされるステップを含む、方法。
（項目３６） 患者のサンプルからインフルエンザウイルスを単離するための方法であって、
前記患者のサンプルがＭＤＣＫ細胞とともにインキュベートされるステップを含み、
前記ＭＤＣＫ細胞は重層培地に提供されない、方法。
（項目３７） 患者のサンプルからインフルエンザウイルスを単離するための方法であって、
該患者のサンプルがＭＤＣＫ細胞とともにインキュベートされるステップを含み、
該ＭＤＣＫ細胞は無血清懸濁培養中で生育している、方法。
（項目３８） 患者のサンプルからインフルエンザウイルスを単離するための方法であって、
該患者のサンプルがＭＤＣＫ細胞とともにインキュベートされるステップを含み、
該ＭＤＣＫ細胞は無タンパク質懸濁培養中で生育している、方法。
（項目３９） 患者のサンプルからインフルエンザウイルスを単離するための方法であって、
該患者のサンプルが非腫瘍形成性のＭＤＣＫ細胞とともにインキュベートされるステップを含み、
該ＭＤＣＫ細胞は懸濁培養中で生育している、方法。
（項目４０） 患者のサンプルからインフルエンザウイルスを単離するための方法であって、
該患者のサンプルが非腫瘍形成性のＭＤＣＫ細胞とともにインキュベートされるステップを含み、
該ＭＤＣＫ細胞は無血清懸濁培養中で生育している、方法。
（項目４１） 患者のサンプルからインフルエンザウイルスを単離するための方法であって、
該患者のサンプルが非腫瘍形成性のＭＤＣＫ細胞とともにインキュベートされるステップを含み、
該ＭＤＣＫ細胞は無タンパク質懸濁培養中で生育している、方法。
（項目４２） 項目３２～４１のいずれか１項に記載の方法によって単離された、インフルエンザウイルス。
（項目４３） 再集合体インフルエンザウイルスを調製するための方法であって、
（ｉ）ゲノムセグメントの第１の組を有するインフルエンザウイルスの第１の株と、ゲノムセグメントの第２の組を有するインフルエンザウイルスの第２の株との両方を細胞株に感染させるステップであって、該第１の株は所望の赤血球凝集素をコードするＨＡセグメントを有する、ステップ；
（ｉｉ）ステップ（ｉ）からの該感染細胞を培養して、ゲノムセグメントの該第１の組からの少なくとも１つのセグメントおよびゲノムセグメントの該第２の組からの少なくとも１つのセグメントを有するインフルエンザウイルスを生成するステップを含み、
ただし、ゲノムセグメントの該第１の組からの該少なくとも１つのセグメントが該第１の株からの該ＨＡセグメントを含む、方法。
（項目４４） ワクチンに使用するためのインフルエンザウイルス抗原を調製するための方法であって、
（ｉ）卵培養基で増殖されたことがないインフルエンザウイルスを受取るステップと；
（ｉｉ）該インフルエンザウイルスを細胞株に感染させるステップと；
（ｉｉｉ）インフルエンザウイルスを生成するためにステップ（ｉｉ）からの該感染細胞を培養するステップと
を含む、方法。
（項目４５） ワクチンに使用するためのインフルエンザウイルス抗原を調製するための方法であって、
（ｉ）ＭＤＣＫ３３０１６細胞中で単離されたインフルエンザウイルスを受取るステップと；
（ｉｉ）該インフルエンザウイルスを細胞株に感染させるステップと；
（ｉｉｉ）インフルエンザウイルスを生成するためにステップ（ｉｉ）からの該感染細胞を培養するステップと
を含む、方法。
（項目４６） ワクチンに使用するためのインフルエンザウイルス抗原を調製するための方法であって、
（ｉ）血清含有培地中で生育する培養基で増殖されたことがないインフルエンザウイルスを受取るステップと；
（ｉｉ）該インフルエンザウイルスを細胞株に感染させるステップと；
（ｉｉｉ）インフルエンザウイルスを生成するためにステップ（ｉｉ）からの該感染細胞を培養するステップと
を含む、方法。
（項目４７） ワクチンに使用するためのインフルエンザウイルス抗原を調製するための方法であって、
（ｉ）逆遺伝学技術を用いて生成されたインフルエンザウイルスを受取るステップと；
（ｉｉ）該インフルエンザウイルスを細胞株に感染させるステップと；
（ｉｉｉ）インフルエンザウイルスを生成するためにステップ（ｉｉ）からの該感染細胞を培養するステップと
を含む、方法。
（項目４８） ワクチンに使用するためのインフルエンザウイルス抗原を調製するための方法であって、
（ｉ）ＰＲ／８／３４インフルエンザウイルスからの６つより少ないウイルスセグメントを有するインフルエンザＡウイルスを受取るステップと；
（ｉｉ）該インフルエンザウイルスを細胞株に感染させるステップと；
（ｉｉｉ）インフルエンザウイルスを生成するためにステップ（ｉｉ）からの該感染細胞を培養するステップと
を含む、方法。
（項目４９） ワクチンに使用するためのインフルエンザウイルス抗原を調製するための方法であって、
（ｉ）ＡＡ／６／６０インフルエンザウイルスからの６つより少ないウイルスセグメントを有するインフルエンザＡウイルスを受取るステップと；
（ｉｉ）該インフルエンザウイルスを細胞株に感染させるステップと；
（ｉｉｉ）インフルエンザウイルスを生成するためにステップ（ｉｉ）からの該感染細胞を培養するステップと
を含む、方法。
（項目５０） ワクチンに使用するためのインフルエンザウイルス抗原を調製するための方法であって、
（ｉ）Ｓｉａ（α２，３）Ｇａｌ末端二糖を有するオリゴ糖よりもＳｉａ（α２，６）Ｇａｌ末端二糖を有するオリゴ糖に優先的に結合する赤血球凝集素を有するインフルエンザウイルスを受取るステップと；
（ｉｉ）該インフルエンザウイルスを細胞株に感染させるステップと；
（ｉｉｉ）インフルエンザウイルスを生成するためにステップ（ｉｉ）からの該感染細胞を培養するステップと
を含む、方法。
（項目５１） ワクチンに使用するためのインフルエンザウイルス抗原を調製するための方法であって、
（ｉ）鶏卵には見られない赤血球凝集素および／またはノイラミニダーゼグリコフォームを有するインフルエンザウイルスを受取るステップと；
（ｉｉ）該インフルエンザウイルスを細胞株に感染させるステップと；
（ｉｉｉ）インフルエンザウイルスを生成するためにステップ（ｉｉ）からの該感染細胞を培養するステップと
を含む、方法。
【0016】
シードウイルスの調製
本発明の第１の局面は、ワクチン製造のためのインフルエンザシードウイルスを調製するための方法を提供し、この方法は（ｉ）患者から直接得られたインフルエンザウイルスまたは一次単離体から得られたインフルエンザウイルスを細胞株に感染させるステップと；（ｉｉ）ステップ（ｉ）において得られた感染細胞株からのウイルスを少なくとも１回継代するステップと；（ｉｉｉ）インフルエンザウイルスを生成するためにステップ（ｉｉ）からの感染細胞を培養するステップとを含む。ステップ（ｉｉｉ）の培養物から精製されたインフルエンザウイルスは、シードウイルスとして使用できる。
本発明の第１の局面は、ワクチン製造のためのインフルエンザシードウイルスを調製するための方法を提供し、この方法は（ｉ）患者から直接得られたインフルエンザウイルスまたは一次単離体から得られたインフルエンザウイルスを細胞株に感染させるステップと；（ｉｉ）ステップ（ｉ）において得られた感染細胞株からのウイルスを少なくとも１回継代するステップと；（ｉｉｉ）インフルエンザウイルスを生成するためにステップ（ｉｉ）からの感染細胞を培養するステップとを含む。ステップ（ｉｉｉ）の培養物から精製されたインフルエンザウイルスは、シードウイルスとして使用できる。
【0017】
参考文献１２とは対照的に、ステップ（ｉ）において用いられるインフルエンザウイルスは、インフルエンザＢウイルスか、または非パンデミックのインフルエンザＡウイルス、すなわち現時点ではインフルエンザＡのＨ１Ｎ１またはＨ３Ｎ２株である。
【0018】
ステップ（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）のいずれも卵におけるウイルスの生育または継代を含まない。好ましくはこれらのステップのうち少なくとも２つ、理想的には３つのステップすべてが同じ細胞型の中で行なわれ、たとえばすべてがＭＤＣＫ細胞の中で行なわれる。
【0019】
ステップ（ｉｉ）における継代は典型的に次のステップを含む：細胞培養物中でインフルエンザウイルスを複製させるステップ；たとえば培養上清などから複製ウイルスを回収するステップ；および回収された複製ウイルスを未感染の細胞培養物に移すステップ。この方法を繰り返すことができる。少なくとも１回の継代の後、ステップ（ｉｉｉ）においてウイルスは複製され、ウイルスは回収されるが、このウイルスはさらなる継代のために未感染の培養物に移されるのではなく、シードウイルスとして用いられる。
【0020】
第１の局面とともに用いられる細胞株は、ヒトの細胞株ではないことが好ましい。ヒト細胞の使用を避けることによって、卵を使用しなくても偶発的な物質の「ろ過」を維持できる。ヒトとの密接な関係から、細胞株は霊長類の動物の細胞株でもないことが好ましく、たとえばベロ細胞（サルの腎臓に由来する）などではないことが好ましい。参考文献１０は、ワクチン製造の際にベロ細胞を使用することを提案しているが、この細胞は多くのヒトウイルスを許容するため、ステップ（ｉ）において用いられるインフルエンザウイルスサンプル中に存在するあらゆる他のヒトウイルスがインフルエンザウイルスと並行して生育でき、最終的なシードウイルスの汚染をもたらす。
【0021】
本発明の第１の局面とともに用いるための好ましい細胞株はイヌの細胞株、たとえばＭＤＣＫ細胞株（マディンダービーイヌ腎臓（Ｍａｄｉｎ Ｄａｒｂｙ ｃａｎｉｎｅ ｋｉｄｎｅｙ）などであり、参考文献１０の特定の教示とは相容れない。ＭＤＣＫ細胞のさらなる詳細を以下に示す。現在ＭＤＣＫ細胞は、偶発的な物質に対して鳥類の卵によって得られるのと同等の「ろ過」効果を示すことが見出されている。したがってこの発見に基づいて、調節のリスクを増すことなくＭＤＣＫ細胞を卵の代りに用いることができ、参考文献１３ではインフルエンザウイルスにおける卵継代がＭＤＣＫ培養の際に生育を有利にすることが報告されてはいるが、卵における生育が回避される。
【0022】
参考文献１４は、卵または細胞培養物中での継代を行なわずにヒトの患者から単離されたインフルエンザ株が、無血清培養物を含むＭＤＣＫ細胞培養物において効率よく生育できることを開示している。よってステップ（ｉ）における感染は、患者から直接得られた（例、咽頭のスワブなどからの）臨床的サンプルからのインフルエンザウイルスを用いてもよく、またはすでに一次単離されていたウイルスを用いてもよい。いくつかの状況において、ステップ（ｉ）に先立つ一次単離は卵で行なわれてもよいが、本発明とともに用いられることが好ましい一次単離体は、卵を使用することなく、たとえば哺乳動物細胞などにおいて得られたものである。一次単離に用いられることが公知の細胞は、ＭＲＣ－５細胞［３］、ベロ細胞［４、５］、ＭＤＣＫ細胞［６］、ＨｅｐＧ２細胞［７］、ＬＬＣ－ＭＫ２細胞［８］などを含むがこれらに限定されない。
【0023】
本発明がステップ（ｉ）において一次単離体を用いるとき、一次単離はステップ（ｉ）から（ｉｉｉ）と同じ細胞型において行なわれることが好ましい。ＭＤＣＫはインフルエンザウイルスの一次単離、継代および生育のいずれに対しても好適であることがすでに公知であるが、ＭＤＣＫ単離における改善点は以下に記載される。
【0024】
インフルエンザウイルス単離体の履歴に関する知識を最大化するためには、一次単離体を用いるよりも臨床的単離体から直接得られたウイルスを用いる方が好ましい。現行のインフルエンザ監視システムは病院での一次単離を伴い、対象となる株は国立および国際インフルエンザセンターに送られる。患者のサンプルを一次単離に使用することに加え、一般的にはサンプルの一部を取分けて（例、凍結によって）保存し、再単離のときに元の材料に戻れるようにする。こうした保存サンプルが利用可能であるときには、ステップ（ｉ）において一時単離体の代りに用いることができる。
【0025】
単離体の履歴が不明瞭であるとき、特に臨床的サンプルから直接得られたものでないウイルスから出発するときには、親ウイルスからの少なくとも１つのウイルスゲノムセグメントを有する新たなウイルス株を生成するために、ステップ（ｉ）および（ｉｉｉ）の間に逆遺伝学を用いることができる。ステップ（ｉ）および（ｉｉｉ）の間に逆遺伝学を用いることによって、ステップ（ｉ）で用いられたウイルス産物をステップ（ｉｉｉ）で用いられたウイルス産物から分離するため、ステップ（ｉ）の前に導入されたかもしれない偶発的な物質に対するフィルタとして作用できる。この態様で「フィルタ」として用いられることに加え、逆遺伝学技術は、たとえば再集合体の生成、コード配列の操作、特定のセグメントの置換など、他の理由のために用いられてもよい。さらなる詳細は、本発明の第２の局面に関連して以下に示される。
【0026】
インフルエンザウイルスの細胞培養とともに逆遺伝学を用いる
本発明の第２の局面は、ワクチン製造のためのインフルエンザシードウイルスを調製するための方法を提供し、この方法は（ｉ）患者から直接得られたインフルエンザウイルスまたは一次単離体から得られたインフルエンザウイルスを細胞株に感染させるステップと；（ｉｉ）ステップ（ｉ）において得られた感染細胞株によって生成されたインフルエンザウイルスの少なくとも１つのウイルスＲＮＡセグメントのｃＤＮＡを調製し、そのｃＤＮＡを逆遺伝学手順に用いて、ステップ（ｉ）のインフルエンザウイルスと同様の少なくとも１つのウイルスＲＮＡセグメントを有する新たなインフルエンザウイルスを調製するステップと；（ｉｉｉ）細胞株に新たなインフルエンザウイルスを感染させ、次いでその新たなインフルエンザウイルスを生成するために細胞株を培養するステップとを含む。
本発明の第２の局面は、ワクチン製造のためのインフルエンザシードウイルスを調製するための方法を提供し、この方法は（ｉ）患者から直接得られたインフルエンザウイルスまたは一次単離体から得られたインフルエンザウイルスを細胞株に感染させるステップと；（ｉｉ）ステップ（ｉ）において得られた感染細胞株によって生成されたインフルエンザウイルスの少なくとも１つのウイルスＲＮＡセグメントのｃＤＮＡを調製し、そのｃＤＮＡを逆遺伝学手順に用いて、ステップ（ｉ）のインフルエンザウイルスと同様の少なくとも１つのウイルスＲＮＡセグメントを有する新たなインフルエンザウイルスを調製するステップと；（ｉｉｉ）細胞株に新たなインフルエンザウイルスを感染させ、次いでその新たなインフルエンザウイルスを生成するために細胞株を培養するステップとを含む。
【0027】
ステップ（ｉ）において用いられるウイルスはあらゆるサブタイプのインフルエンザＡウイルスであっても、またはインフルエンザＢウイルスであってもよい。好ましいインフルエンザＡウイルスのサブタイプは、Ｈ１、Ｈ３およびＨ５である。
【0028】
ステップ（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）のいずれも卵におけるウイルスの生育または継代を含まない。好ましくはこれらのステップはすべて同じ細胞型の中で行なわれ、たとえばすべてがＭＤＣＫ細胞の中で行なわれる。
【0029】
本発明のこの第２の局面のさらなる特徴は、上記において第１の局面に対して記載されたものと同様である。すなわち、ＭＤＣＫ細胞の使用が好ましいことなどである。
【0030】
逆遺伝学技術については以下により詳細に説明される。ステップ（ｉｉ）において移されるゲノムセグメントはＨＡセグメントを含み、さらにＮＡセグメントおよび／または１つもしくはそれ以上のさらなるセグメントを含んでもよい。
【0031】
シードウイルス
本発明の第１および第２の局面は、シードウイルスを提供する。これらのシードウイルスはさまざまな態様で用いられ得る。
本発明の第１および第２の局面は、シードウイルスを提供する。これらのシードウイルスはさまざまな態様で用いられ得る。
【0032】
シードウイルスを特徴付けることによって、たとえばそれらの核酸および／またはタンパク質の配列を決定したり、他の株（例、流布している株）に対するそれらの抗原性の関係をチェックしたり、それらの免疫原性をチェックしたりできる。典型的には、ウイルスＨＡ遺伝子の配列を決定することによってＨＡアミノ酸配列を明らかにする。
【0033】
シードウイルスは抗血清を誘出するために用いられてもよい。
【0034】
シードウイルスはワクチン製造者に分配されてもよい。
【0035】
シードウイルスは将来的な使用のために保存されてもよい。
【0036】
シードウイルスは有効な（working）シードロットを調製するために用いられてもよい
。このシステムは、有効なシードロットによって日々の使用を行ないながら元のシードウイルスを安全に保存することを可能にする。有効なシードは必要とされるまで凍結されていてもよい。有効なシードロットの調製は、好ましくはシードウイルスの調製に用いられたのと同じ細胞型の細胞培養物中でウイルスを生育させるステップを含んでもよい。有効なシードロットの調製には卵における生育は用いられない。
。このシステムは、有効なシードロットによって日々の使用を行ないながら元のシードウイルスを安全に保存することを可能にする。有効なシードは必要とされるまで凍結されていてもよい。有効なシードロットの調製は、好ましくはシードウイルスの調製に用いられたのと同じ細胞型の細胞培養物中でウイルスを生育させるステップを含んでもよい。有効なシードロットの調製には卵における生育は用いられない。
【0037】
シードウイルスは、ワクチン製造に対してウイルスを提供するための生育のため、または診断テストの調製に用いるために、細胞株に感染させるために用いられてもよい。
【0038】
本発明のシードウイルスは、現行の卵由来のシードウイルスと多くの特徴を共有するが、さまざまな態様で異なっていてもよい。
【0039】
たとえば、以下により詳細に説明されるとおり、本発明の好ましいインフルエンザＡシードウイルスは、ＰＲ／８／３４インフルエンザウイルスからの６つより少ない（すなわち０、１、２、３、４または５つの）ウイルスセグメントを含む。
【0040】
卵を含まないワクチン製造
本発明の第３の局面は、ワクチン製造のためのインフルエンザウイルスを調製するための方法を提供し、この方法は（ｉ）集団中に流布しているインフルエンザウイルスか、または集団中に流布しているインフルエンザウイルスを抗原的に代表する赤血球凝集素を有するインフルエンザウイルスを得るステップと；（ｉｉ）ステップ（ｉ）において得られたインフルエンザウイルスを細胞株に感染させるステップと；（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）における感染細胞株から得られたウイルスを少なくとも１回継代してシード株を生じさせるステップと；（ｉｖ）インフルエンザウイルスを生成するためにステップ（ｉｉｉ）からのシード株を培養するステップとを含む。
本発明の第３の局面は、ワクチン製造のためのインフルエンザウイルスを調製するための方法を提供し、この方法は（ｉ）集団中に流布しているインフルエンザウイルスか、または集団中に流布しているインフルエンザウイルスを抗原的に代表する赤血球凝集素を有するインフルエンザウイルスを得るステップと；（ｉｉ）ステップ（ｉ）において得られたインフルエンザウイルスを細胞株に感染させるステップと；（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）における感染細胞株から得られたウイルスを少なくとも１回継代してシード株を生じさせるステップと；（ｉｖ）インフルエンザウイルスを生成するためにステップ（ｉｉｉ）からのシード株を培養するステップとを含む。
【0041】
第１および第２の局面が互いに異なる（上記を参照）のと同じ態様で、本発明の第４の局面は、ワクチン製造のためのインフルエンザウイルスを調製するための方法を提供し、この方法は（ｉ）集団中に流布しているインフルエンザウイルスか、または集団中に流布しているインフルエンザウイルスを抗原的に代表する赤血球凝集素を有するインフルエンザウイルスを得るステップと；（ｉｉ）ステップ（ｉ）において得られたインフルエンザウイルスを細胞株に感染させるステップと；（ｉｉｉ）ステップ（ｉ）において得られた感染細胞株によって生成されたインフルエンザウイルスの少なくとも１つのウイルスＲＮＡセグメントのｃＤＮＡを調製し、そのｃＤＮＡを逆遺伝学手順に用いて、ステップ（ｉ）のインフルエンザウイルスと同様の少なくとも１つのウイルスＲＮＡセグメントを有するインフルエンザシードウイルスを調製するステップと；（ｉｖ）細胞株にインフルエンザシードウイルスを感染させ、次いでインフルエンザウイルスを生成するためにステップ（ｉｉｉ）からの継代された細胞株を培養するステップとを含む。
【0042】
本発明は、インフルエンザウイルスワクチンを調製するための方法も提供し、この方法は第３または第４の局面のステップ（ｉ）から（ｉｖ）と、それに続く（ｖ）ステップ（ｉｖ）において得られたウイルスを処理してワクチンを生じさせるステップとを含む。ステップ（ｖ）において用いられる技術の詳細を以下に示す。
【0043】
ステップ（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）または（ｖ）のいずれも卵におけるウイルスの生育または継代を含まない。
【0044】
ステップ（ｉ）において用いられるウイルスはあらゆるサブタイプのインフルエンザＡウイルスであっても、またはインフルエンザＢウイルスであってもよい。好ましいインフルエンザＡウイルスのサブタイプは、Ｈ１、Ｈ３およびＨ５、たとえばＨ１Ｎ１またはＨ３Ｎ２などである。
【0045】
ステップ（ｉ）において用いられるウイルスは、その一次単離のときから卵において継代されておらず、好ましくは元々ウイルスを提供した患者からステップ（ｉ）の始まりまでの間のいかなる段階においても卵において継代されていない。
【0046】
「抗原的に表わす」という用語はインフルエンザワクチンの技術分野において、実際に集団内の広範な流布の中にはないかもしれないが、製造の目的のために便利であって、流布中の株から保護できる免疫応答を誘出するようなウイルス株を示すために用いられる。「抗原的に表わす」株によって誘出された血清は、たとえば血球凝集阻害アッセイなどにおいて、流布する株を阻害できる。
【0047】
ステップ（ｉ）は、いくつかの異なる株から始めて、さらなる使用のための株を選択するステップを含んでもよい。たとえばこのステップは、インフルエンザＡウイルスのいくつかの異なるＨ１Ｎ１株から始めて、さらなる使用のための株を選択するステップを含んでもよい。このステップは、インフルエンザＡウイルスのいくつかの異なるＨ３Ｎ２株から始めて、さらなる使用のための株を選択するステップを含んでもよい。このステップは、インフルエンザＢウイルスのいくつかの異なる株から始めて、さらなる使用のための株を選択するステップを含んでもよい。この選択は、たとえば流布中の最も一般的な株および／または最も病原性のある株を抗原的に代表する株を選択するなどのために、インフルエンザウイルスの含有物に対して株を選択するときにルーチン的に用いられる免疫学的および血清学的な基準に基づく。
【0048】
ステップ（ｉｉｉ）の後には、シードウイルスがステップ（ｉ）において得られた株を抗原的に代表することを確認するステップが続いてもよい。この検証ステップはステップ（ｉｖ）が始まる前に行なわれても、ステップ（ｉｖ）に並行して行なわれてもよい。
【0049】
本発明は、インフルエンザウイルスワクチンを調製するための方法も提供し、この方法は（ａ）第１の局面のステップ（ｉ）から（ｉｉｉ）または第２の局面のステップ（ｉ）から（ｉｖ）のいずれかを含む方法によって調製されたウイルスを得るステップと；（ｂ）このウイルスを処理してワクチンを生じさせるステップとを含む。
【0050】
したがって全体として、本発明の第３および第４の局面は、患者のサンプル（または一次単離体）からのインフルエンザワクチンの生成を可能にし、ワクチンを調製するために用いられるインフルエンザウイルスはいずれの段階でも卵を通じて継代されない。
【0051】
ウイルス再集合
本発明の第５の局面は、再集合体インフルエンザウイルスを調製するための方法を提供し、この方法は（ｉ）ゲノムセグメントの第１の組を有するインフルエンザウイルスの第１の株と、ゲノムセグメントの第２の組を有するインフルエンザウイルスの第２の株との両方を細胞株に感染させるステップを含み、ここで第１の株は所望の赤血球凝集素をコードするＨＡセグメントを有し、この方法はさらに（ｉｉ）ステップ（ｉ）からの感染細胞を培養して、ゲノムセグメントの第１の組からの少なくとも１つのセグメントおよびゲノムセグメントの第２の組からの少なくとも１つのセグメントを有するインフルエンザウイルスを生成するステップを含み、ここではゲノムセグメントの第１の組からのその少なくとも１つのセグメントが第１の株からのＨＡセグメントを含むことが前提となっている。よってこの方法は、少なくともＨＡセグメントを第１の株から第２の株に移すことによって、卵を用いることなく、第１または第２の株のいずれかからのウイルスゲノムセグメントの異なる集合を有する新たな再集合体株を生成できる。
本発明の第５の局面は、再集合体インフルエンザウイルスを調製するための方法を提供し、この方法は（ｉ）ゲノムセグメントの第１の組を有するインフルエンザウイルスの第１の株と、ゲノムセグメントの第２の組を有するインフルエンザウイルスの第２の株との両方を細胞株に感染させるステップを含み、ここで第１の株は所望の赤血球凝集素をコードするＨＡセグメントを有し、この方法はさらに（ｉｉ）ステップ（ｉ）からの感染細胞を培養して、ゲノムセグメントの第１の組からの少なくとも１つのセグメントおよびゲノムセグメントの第２の組からの少なくとも１つのセグメントを有するインフルエンザウイルスを生成するステップを含み、ここではゲノムセグメントの第１の組からのその少なくとも１つのセグメントが第１の株からのＨＡセグメントを含むことが前提となっている。よってこの方法は、少なくともＨＡセグメントを第１の株から第２の株に移すことによって、卵を用いることなく、第１または第２の株のいずれかからのウイルスゲノムセグメントの異なる集合を有する新たな再集合体株を生成できる。
【0052】
ステップ（ｉｉ）の培養物から精製されたインフルエンザウイルスは、本明細書の別の場所に記載されるとおりに用いられ得る。再集合体は第１の株よりも改善された生育特徴を示してもよい。
【0053】
この再集合体は、所望のノイラミニダーゼをコードする第１の株からのＮＡセグメントを含んでもよい。
【0054】
この再集合体は一般的に、第１の株および第２の株からのセグメントを１：７、２：６、３：５、４：４、５：３、６：２または７：１の比率で含む。典型的には株の大部分が第２の株からのものである。
【0055】
この方法は、インフルエンザＡウイルスとインフルエンザＢウイルスとの再集合体を生成するために用いられてもよい。いくつかの実施形態において、インフルエンザＡウイルスに対する第２の株はＰＲ／８／３４となるが、セグメントＮＰ、Ｍ、ＮＳ、ＰＡ、ＰＢ１またはＰＢ２のうち１、２、３、４または５つだけをＰＲ／８／３４と共有するその他の株を用いることも可能である。
【0056】
本発明は、第５の局面の再集合方法によって得ることのできるインフルエンザウイルスも提供する。本発明は、こうしたウイルスのワクチン製造における使用も提供する。
【0057】
ステップ（ｉ）または（ｉｉ）のいずれも卵におけるウイルスの生育、再集合または継代を含まない。本明細書の別の場所に記載されるとおり、再集合方法は、単離および継代に用いられるのと同じ細胞型（例、ＭＤＣＫ細胞）において便利に行なわれ得る。
【0058】
第１の株は、便利には患者から直接得られたインフルエンザウイルスまたは一次単離体から得られたインフルエンザウイルスであってもよい。
【0059】
ウイルス単離
上述のとおり、インフルエンザウイルス単離のために卵が用いられる傾向が強い。本発明の第６の局面は、代りにＭＤＣＫ細胞を用いる。いくつかの実施形態において、ＭＤＣＫ細胞は懸濁液中で生育される。他の実施形態において、ＭＤＣＫ細胞は無血清培地または無タンパク質培地中で生育される。他の実施形態において、ＭＤＣＫ細胞は非腫瘍形成性である。他の実施形態において、ＭＤＣＫ細胞は重層培地の存在下で生育されない。
上述のとおり、インフルエンザウイルス単離のために卵が用いられる傾向が強い。本発明の第６の局面は、代りにＭＤＣＫ細胞を用いる。いくつかの実施形態において、ＭＤＣＫ細胞は懸濁液中で生育される。他の実施形態において、ＭＤＣＫ細胞は無血清培地または無タンパク質培地中で生育される。他の実施形態において、ＭＤＣＫ細胞は非腫瘍形成性である。他の実施形態において、ＭＤＣＫ細胞は重層培地の存在下で生育されない。
【0060】
よって、本発明は患者のサンプルからインフルエンザウイルスを単離するための方法を提供し、この方法は患者のサンプルがＭＤＣＫ細胞とともにインキュベートされるステップを含み、ここでＭＤＣＫ細胞は懸濁培養中で生育している。
【0061】
加えて、本発明は患者のサンプルからインフルエンザウイルスを単離するための方法を提供し、この方法は患者のサンプルがＭＤＣＫ細胞とともにインキュベートされるステップを含み、ここでＭＤＣＫ細胞は無血清培地中で生育している。
【0062】
加えて、本発明は患者のサンプルからインフルエンザウイルスを単離するための方法を提供し、この方法は患者のサンプルがＭＤＣＫ細胞とともにインキュベートされるステップを含み、ここでＭＤＣＫ細胞は無タンパク質培地中で生育している。
【0063】
加えて、本発明は患者のサンプルからインフルエンザウイルスを単離するための方法を提供し、この方法は患者のサンプルが非腫瘍形成性のＭＤＣＫ細胞とともにインキュベートされるステップを含む。
【0064】
加えて、本発明は患者のサンプルからインフルエンザウイルスを単離するための方法を提供し、この方法は患者のサンプルがＭＤＣＫ細胞とともにインキュベートされるステップを含み、ここでＭＤＣＫ細胞は重層培地に提供されない。
【0065】
加えて、本発明は患者のサンプルからインフルエンザウイルスを単離するための方法を提供し、この方法は患者のサンプルがＭＤＣＫ細胞とともにインキュベートされるステップを含み、ここでＭＤＣＫ細胞は無血清懸濁培養中で生育している。
【0066】
加えて、本発明は患者のサンプルからインフルエンザウイルスを単離するための方法を提供し、この方法は患者のサンプルがＭＤＣＫ細胞とともにインキュベートされるステップを含み、ここでＭＤＣＫ細胞は無タンパク質懸濁培養中で生育している。
【0067】
加えて、本発明は患者のサンプルからインフルエンザウイルスを単離するための方法を提供し、この方法は患者のサンプルが非腫瘍形成性のＭＤＣＫ細胞とともにインキュベートされるステップを含み、ここでＭＤＣＫ細胞は懸濁培養中で生育している。
【0068】
加えて、本発明は患者のサンプルからインフルエンザウイルスを単離するための方法を提供し、この方法は患者のサンプルが非腫瘍形成性のＭＤＣＫ細胞とともにインキュベートされるステップを含み、ここでＭＤＣＫ細胞は無血清懸濁培養中で生育している。
【0069】
加えて、本発明は患者のサンプルからインフルエンザウイルスを単離するための方法を提供し、この方法は患者のサンプルが非腫瘍形成性のＭＤＣＫ細胞とともにインキュベートされるステップを含み、ここでＭＤＣＫ細胞は無タンパク質懸濁培養中で生育している。
【0070】
本発明は、これらの方法の１つによって単離されたインフルエンザウイルスも提供する。本発明は、こうしたウイルスのワクチン製造における使用も提供する。
【0071】
患者のサンプルとＭＤＣＫ細胞とのインキュベーションによって、一般的には、たとえばヒトインフルエンザウイルス、特にヒトインフルエンザＡウイルスなどのインフルエンザウイルスがＭＤＣＫ細胞に感染する。ウイルスは細胞中で複製でき、複製されたウイルスは次いで回収され得る。任意には、そのウイルスはたとえば検出、特徴付け、分析、シードウイルスの調製、操作などの下流の方法ステップにおいて用いられ得る。
【0072】
ＭＤＣＫ細胞における単離後、ウイルスはＭＤＣＫ細胞中で継代および／または生育されてもよい。代替案として、ウイルスは非ＭＤＣＫ細胞または卵または別の培養基中で継代および／または生育されてもよい。
【0073】
本発明の第６の局面は、ＭＤＣＫ細胞株の使用を含む。元のＭＤＣＫ細胞株はＡＴＣＣから入手可能だが、本発明の第６の局面はこの細胞株の誘導体を用いる。以下に示すとおり、これらの誘導体における単離は元のＭＤＣＫ細胞株における単離よりも優れていることが示されている。好適なＭＤＣＫ細胞およびそれらの特徴については、以下により詳細に考察する。
【0074】
たとえば、第６の局面のいくつかの実施形態は、懸濁培養において自発的に複製できるＭＤＣＫ細胞株を用いる。参考文献３０は、懸濁培養中での生育に適合されたＭＤＣＫ細胞株を開示しており、この細胞株（「ＭＤＣＫ３３０１６」）は第６の局面の方法に対して特に有用である。ＭＤＣＫ３３０１６は無血清培養物中で生育でき、重層培地を必要とすることなく生育できる。無血清培養を含む懸濁培養中で生育できる別のＭＤＣＫ細胞株は、「Ｂ－７０２」細胞株である［３６；下記を参照］。
【0075】
第６の局面とともに用いるための非腫瘍形成性ＭＤＣＫ細胞株は、参考文献３７に開示される細胞株、たとえば「ＭＤＣＫ－Ｓ」、「ＭＤＣＫ－ＳＦ１０１」、「ＭＤＣＫ－ＳＦ１０２」、および「ＭＤＣＫ－ＳＦ１０３」などを含む（下記を参照）。
【0076】
第６の局面のいくつかの実施形態において、ＭＤＣＫ細胞は無血清培地および／または無タンパク質培地中で生育する。
【0077】
いくつかの特定の先行技術の方法とは異なり、本発明の第６の局面は、インフルエンザウイルス単離の際に重層培地を用いる必要性を回避できる。
【0078】
上述のとおり、ウイルスはＭＤＣＫ細胞に露出される前に卵中で生育されないことが好ましい。加えて、上述のとおりＭＤＣＫ細胞中で生育されたウイルスはその後卵中で生育されないことが好ましい。
【0079】
第６の局面で用いられる患者のサンプルに対して、インフルエンザウイルス単離に用いられる臨床的サンプルはさまざまな形を取り得るが、典型的には以下を含むがそれらに限定されない呼吸分泌物を含む：直接的吸引物；うがい液；鼻洗浄液；鼻スワブ；咽喉スワブ；咽頭スワブなど。これらのサンプルは一般的に、インフルエンザウイルス感染が疑われる患者から取られ、その中にはインフルエンザウイルスの新たな株を保有する可能性のある患者が含まれる。
【0080】
第６の局面の方法によって単離されたインフルエンザウイルスは、ワクチン製造のためのインフルエンザシードウイルスを調製するために用いられてもよい。よって第６の局面の方法は、感染ＭＤＣＫ細胞株からのウイルスを少なくとも１回継代するさらなるステップを含んでもよい。次いでこの方法は、インフルエンザウイルスを生成するために感染細胞を培養するステップを含んでもよい。この培養ステップの後に精製されたインフルエンザウイルスは、本明細書の別の場所に記載されるとおり、シードウイルスとして用いられてもよい。
【0081】
第６の局面に従って単離されたウイルスは、逆遺伝学技術に対する供給源として用いられてもよい。つまり、第６の局面に従って単離されたインフルエンザウイルスの少なくとも１つのウイルスＲＮＡセグメントからｃＤＮＡが調製されてもよい。次いでこのｃＤＮＡを逆遺伝学手順に用いて、単離されたインフルエンザウイルスと同様の少なくとも１つのウイルスＲＮＡセグメントを有する新たなインフルエンザウイルスを調製してもよい。次いでこの新たなインフルエンザウイルスを用いて、たとえばさらなる培養などのために細胞株に感染させてもよい。
【0082】
本発明の第６の局面は、ヒトインフルエンザウイルスを含むあらゆる好適なインフルエンザウイルスを単離するために用いられてもよい。これらのインフルエンザウイルスは、インフルエンザＡウイルス、インフルエンザＢウイルスまたはインフルエンザＣウイルスであってもよい。インフルエンザＡウイルスが典型的であり、有用なインフルエンザＡウイルスサブタイプは、Ｈ１、Ｈ３およびＨ５である。
【0083】
現在のパンデミック間期におけるワクチンは、典型的に２つのインフルエンザＡ株（Ｈ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２）および１つのインフルエンザＢ株を含む。第６の局面は、こうした株を単離するために用いられても、またはたとえばＨ２、Ｈ５、Ｈ７またはＨ９サブタイプ株などのパンデミックウイルス株を単離するために用いられてもよい。一般的に、第６の局面は、ＨＡサブタイプＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５またはＨ１６のうち１つを有するインフルエンザＡウイルスを単離するために用いられてもよい。
【0084】
本発明の第６の局面に従って単離されたインフルエンザウイルスは、Ｓｉａ（α２，３）Ｇａｌ末端二糖を有するオリゴ糖よりもＳｉａ（α２，６）Ｇａｌ末端二糖を有するオリゴ糖に優先的に結合する赤血球凝集素を含んでもよい。有利なことに、本発明の単離方法は、ウイルスのＨＡ配列およびそのオリゴ糖優先性の安定な保持を助けることが見出されている。
【0085】
第６の局面に従って単離されたウイルスは、ワクチン製造および処置方法において用いられてもよい。よって本発明は、患者における免疫応答を高めるための薬の製造における、第６の局面に従って単離されたウイルスから調製された抗原の使用も提供する。
【0086】
受容体結合
ヒトインフルエンザウイルスはＳｉａ（α２，６）Ｇａｌ末端二糖（ガラクトースにα－２，６結合したシアル酸）を有する受容体オリゴ糖に結合するが、卵はその代わりにＳｉａ（α２，３）Ｇａｌ末端二糖を有する受容体オリゴ糖を有する。卵においてヒトインフルエンザウイルスを生育すると、赤血球凝集素にＳｉａ（α２，６）Ｇａｌ結合から離れてＳｉａ（α２，３）Ｇａｌ結合に向わせる選択圧力がかかる。
ヒトインフルエンザウイルスはＳｉａ（α２，６）Ｇａｌ末端二糖（ガラクトースにα－２，６結合したシアル酸）を有する受容体オリゴ糖に結合するが、卵はその代わりにＳｉａ（α２，３）Ｇａｌ末端二糖を有する受容体オリゴ糖を有する。卵においてヒトインフルエンザウイルスを生育すると、赤血球凝集素にＳｉａ（α２，６）Ｇａｌ結合から離れてＳｉａ（α２，３）Ｇａｌ結合に向わせる選択圧力がかかる。
【0087】
卵と同様に、ベロ細胞も主にＳｉａ（α２，３）Ｇａｌ受容体を発現する［１５］。これに対し、ＭＤＣＫ細胞およびＰＥＲ．Ｃ６細胞は、Ｓｉａ（α２，３）ＧａｌおよびＳｉａ（α２，６）Ｇａｌの両方を発現する。参考文献１６は、ＭＤＣＫ細胞のトランスフェクションによってα－２，６－シアリルトランスフェラーゼを過剰発現させることによって、Ｓｉａ（α２，６）Ｇａｌ結合の選択を有利にすることを報告している。しかし、こうした操作をしなくても、インフルエンザウイルスをＳｉａ（α２，３）Ｇａｌ結合に向わせることなくＭＤＣＫ細胞で生育させることは可能である。よって本発明は、Ｓｉａ（α２，３）ＧａｌおよびＳｉａ（α２，６）Ｇａｌの両方を発現する細胞を用いることができるが、Ｓｉａ（α２，３）Ｇａｌ末端二糖を有するオリゴ糖よりもＳｉａ（α２，６）Ｇａｌ末端二糖を有するオリゴ糖に優先的に結合するインフルエンザウイルスを生成できる。
【0088】
本発明の第１および第２の局面の好ましい実施形態において、ステップ（ｉ）における感染に用いられるインフルエンザウイルスは、Ｓｉａ（α２，３）Ｇａｌ末端二糖を有するオリゴ糖よりもＳｉａ（α２，６）Ｇａｌ末端二糖を有するオリゴ糖に優先的に結合する。この結合優先性がステップ（ｉｉ）およびステップ（ｉｉｉ）の間も保持されることによって、ステップ（ｉｉｉ）において生成されるインフルエンザウイルスは、Ｓｉａ（α２，３）Ｇａｌ末端二糖を有するオリゴ糖よりもＳｉａ（α２，６）Ｇａｌ末端二糖を有するオリゴ糖に優先的に結合する。
【0089】
本発明の第３および第４の局面の好ましい実施形態において、ステップ（ｉｉ）における感染に用いられるインフルエンザウイルスは、Ｓｉａ（α２，３）Ｇａｌ末端二糖を有するオリゴ糖よりもＳｉａ（α２，６）Ｇａｌ末端二糖を有するオリゴ糖に優先的に結合する。この結合優先性がステップ（ｉｉｉ）およびステップ（ｉｖ）の間も保持されることによって、ステップ（ｉｖ）において生成されるインフルエンザウイルスは、Ｓｉａ（α２，３）Ｇａｌ末端二糖を有するオリゴ糖よりもＳｉａ（α２，６）Ｇａｌ末端二糖を有するオリゴ糖に優先的に結合する。
【0090】
あるウイルスがＳｉａ（α２，３）Ｇａｌ末端二糖を有するオリゴ糖よりもＳｉａ（α２，６）Ｇａｌ末端二糖を有するオリゴ糖に優先的に結合するかどうかを定めるために、さまざまなアッセイが用いられてもよい。たとえば参考文献１７は、親和性定数の高感度な量的測定を与える、インフルエンザウイルス受容体結合活性に対する固相酵素結合アッセイを記載している。参考文献１８が用いた固相アッセイにおいては、２つの異なるシアル酸糖タンパク質に対するウイルスの結合が評価されており（オボムコイド、Ｓｉａ（α２，３）Ｇａｌ決定基を有する；およびブタα２－マクログロブリン、Ｓｉａ（α２，６）Ｇａｌ決定基である）、さらに記載されるアッセイにおいては、以下の２つの受容体類似物に対するウイルスの結合が評価されている：遊離シアル酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）および３’－シアリルラクトース（Ｎｅｕ５Ａｃα２－３Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ）。参考文献１９は、α２，３またはα２，６結合に対する受容体の優先性を明確に区別できる多糖アレイを用いたアッセイを報告している。参考文献２０は、Ｓｉａ（α２，６）ＧａｌまたはＳｉａ（α２，３）Ｇａｌのいずれかを含有するように酵素的に修飾されたヒト赤血球の凝集に基づいたアッセイを報告している。アッセイはそのタイプによって、ウイルス自体によって直接的に行なわれても、またはウイルスから精製された赤血球凝集素によって間接的に行なわれてもよい。
【0091】
基準材料
インフルエンザウイルスを製造するための現行の方法は、各株に対する基準試薬、すなわち（ｉ）抗ＨＡ血清および（ｉｉ）精製した全ビリオンの調製を伴う。これらの較正された試薬をＳＲＩＤアッセイに用いて、製造者によって生成されたバルク抗原におけるＨＡのレベルを定めることによって、製造者がバルクを希釈して用量当りの所望量のＨＡを有するワクチンを与えることを可能にする。
インフルエンザウイルスを製造するための現行の方法は、各株に対する基準試薬、すなわち（ｉ）抗ＨＡ血清および（ｉｉ）精製した全ビリオンの調製を伴う。これらの較正された試薬をＳＲＩＤアッセイに用いて、製造者によって生成されたバルク抗原におけるＨＡのレベルを定めることによって、製造者がバルクを希釈して用量当りの所望量のＨＡを有するワクチンを与えることを可能にする。
【0092】
基準株が卵を通じて継代され、生成株が卵における生育に対して最適化される現行の方法に対して、基準試薬中の血清および抗原はよく適合されている。しかし、血清は細胞培養において生成された抗原に対してあまり適合しない可能性があることが見出され、これはおそらく異なる系における選択圧力が異なるためと考えられる。基準血清と抗原との間の反応性が乏しいということは、ＨＡレベルが実際よりも低く評価されることを意味し、それによって（ｉ）所与のバルクからの用量が少なくなり、かつ（ｉｉ）ワクチン中のＨＡが過剰量になる。
【0093】
細胞培養に由来する抗原と卵由来の材料に対して生成された血清との適合の問題を克服するために、本発明は、卵に基づく生育に対して適応されていないウイルスに基づく基準材料を提供する。
【0094】
よって本発明は動物から抗血清を調製するための方法を提供し、この方法は（ｉ）精製したインフルエンザウイルス赤血球凝集素を動物に投与するステップと；次いで（ｉｉ）その赤血球凝集素を認識する抗体を含有する血清を動物から回収するステップとを含み、ステップ（ｉ）において用いられた赤血球凝集素は細胞株中で生育されたウイルスからのものであることを特徴とする。
【0095】
ステップ（ｉ）において用いられた赤血球凝集素は、好ましくは卵中で生育されたことがないウイルスからのものである。たとえばこの赤血球凝集素は、Ｓｉａ（α２，３）Ｇａｌ末端二糖を有するオリゴ糖よりもＳｉａ（α２，６）Ｇａｌ末端二糖を有するオリゴ糖に優先的に結合してもよい。
【0096】
抗血清を生成するために用いられる好ましい赤血球凝集素は、たとえばＭＤＣＫなどの哺乳動物細胞株（例、本明細書に記載される細胞株）中の生育物から得ることのできる多糖によってグリコシル化されている。
【0097】
抗血清はインフルエンザＡウイルスおよびインフルエンザＢウイルスに対して生成されてもよい。
【0098】
動物は好ましくは哺乳動物、たとえばヤギなど、またはより好ましくはヒツジである。抗血清は、ブロメラインによる処理によって精製ウイルスからＨＡを抽出した後、スクロース勾配上の沈降によって精製することによって、ヒツジにおいて便利に調製できる。用量約５０μｇの赤血球凝集素が、フロイントの完全アジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｄｊｕｖａｎｔ：ＦＣＡ）と組合されてヒツジの筋肉内に投与される。１０μｇ用量が２週間後に与えられてもよく、次いで１週間の間隔を置いて２－４回のさらなる用量が与えられてもよい。その後血清が回収されてもよい。使用前に血清は（例、アジ化ナトリウムを含有するＰＢＳ緩衝液で）希釈されて容器に充填されてもよい。この血清は、口蹄疫の規制を満たすために酸性のｐＨに晒されてもよい（例、ｐＨ５に２時間）。
【0099】
本発明は動物から抗血清を調製するための方法も提供し、この方法は（ｉ）細胞株中でインフルエンザウイルスを生育するステップと；（ｉｉ）ステップ（ｉ）において生育されたウイルスからの赤血球凝集素抗原を精製するステップと；（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）からの精製赤血球凝集素を動物に投与するステップと；次いで（ｉｖ）その動物から赤血球凝集素を認識する抗体を含有する血清を回収するステップとを含む。
【0100】
本発明は、これらの方法によって得ることができる抗血清も提供する。
【0101】
本発明は、この抗血清を含むゲルも提供する。すなわち、動物から抗血清を調製するための上述の方法は、抗血清をゲルと混合するさらなるステップを含んでもよい。このゲルはＳＲＩＤアッセイを行なうために好適であり、たとえばこのゲルはアガロースゲルである。
【0102】
抗血清の提供に加えて、本発明は抗原基準材料を提供する。すなわち、本発明は抗原基準材料を調製するための方法を提供し、この方法は（ｉ）細胞株中でインフルエンザウイルスを生育するステップと；（ｉｉ）ステップ（ｉ）において生育されたウイルスを精製するステップと；（ｉｉｉ）そのウイルスを不活性化するステップとを含み、ステップ（ｉ）において用いられたインフルエンザウイルスは卵中で生育されたことがないことを特徴とする。この方法は、（ｉｖ）不活性化されたウイルスを凍結乾燥するさらなるステップを含んでもよい。
【0103】
ステップ（ｉ）において用いられたウイルスは卵中で生育されたことがない。たとえば、このウイルスの赤血球凝集素は、Ｓｉａ（α２，３）Ｇａｌ末端二糖を有するオリゴ糖よりもＳｉａ（α２，６）Ｇａｌ末端二糖を有するオリゴ糖に優先的に結合してもよい。
【0104】
基準材料は卵由来の材料を含まない（例、オボアルブミンを含まず、オボムコイドを含まず、ニワトリＤＮＡを含まない）。この基準材料中の糖タンパク質は、ＭＤＣＫなどの哺乳動物細胞株（例、本明細書に記載される細胞株）中の生育物から得ることのできる多糖によってグリコシル化される。基準材料はインフルエンザＡウイルスおよびインフルエンザＢウイルスに対して生成されてもよい。
【0105】
基準材料は通常対にして用いられるため、本発明は（ｉ）これらの方法によって得ることができる抗血清と、（ｉｉ）これらの方法によって得ることができる抗原基準材料とを含むキットも提供する。
【0106】
本発明はキットを調製するための方法も提供し、この方法は（ｉ）上述のとおり抗血清を作成するステップと；（ｉｉ）上述のとおり抗原基準材料を作成するステップと；（ｉｉｉ）ステップ（ｉ）および（ｉｉ）の生成物を組合せてキットにするステップとを含む。
【0107】
この抗原および抗血清は、ＳＲＩＤアッセイにおける使用のために好適でありかつ意図されており、本発明はインフルエンザウイルス赤血球凝集素に対する単一放射状免疫拡散アッセイを提供し、このアッセイは、これらの方法によって得ることができる抗血清、および／またはこれらの方法によって得ることができる抗原基準材料を用いることを特徴とする。ＳＲＩＤアッセイは、抗血清を含むゲルを調製するステップと、（必要であれば水性培地中に再構成された）抗原基準材料をゲルに（典型的にはウェル内に）適用するステップと、次いで抗原をゲル中に放射状に拡散させるステップとを含む。この抗原は、使用前にＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ界面活性剤などの界面活性剤によって処理されてもよい。
【0108】
本発明の技術によって調製または単離されたウイルス（シードウイルスを含む）
本発明の好ましいインフルエンザＡウイルス（シードウイルス、ＭＤＣＫ細胞を用いて患者のサンプルから単離したウイルス、再集合体ウイルスなどを含む）は、ＰＲ／８／３４インフルエンザウイルスからの６つより少ない（すなわち０、１、２、３、４または５つの）ウイルスセグメントを含む。好ましくは、このウイルスはＰＲ／８／３４セグメントを含まない。いずれかのＰＲ／８／３４セグメント（単数または複数）が存在するとき、そのセグメントはＰＲ／８／３４ ＨＡセグメントを含まず、通常はＰＲ／８／３４ ＮＡセグメントを含まない。よって好ましいウイルスにおいては、セグメントＮＰ、Ｍ、ＮＳ、ＰＡ、ＰＢ１および／またはＰＢ２のうちの少なくとも１つがＰＲ／８／３４に由来しない。より好ましくは、セグメントＮＰ、Ｍ、ＰＡ、ＰＢ１および／またはＰＢ２のうちの少なくとも１つがＰＲ／８／３４に由来しない。よって本発明は、通常のＨＡおよびＮＡ抗原に、流布中の株を表わす１つまたはそれ以上のさらなるエピトープ含有抗原を加えることによって、既存のワクチンを改善できる。
本発明の好ましいインフルエンザＡウイルス（シードウイルス、ＭＤＣＫ細胞を用いて患者のサンプルから単離したウイルス、再集合体ウイルスなどを含む）は、ＰＲ／８／３４インフルエンザウイルスからの６つより少ない（すなわち０、１、２、３、４または５つの）ウイルスセグメントを含む。好ましくは、このウイルスはＰＲ／８／３４セグメントを含まない。いずれかのＰＲ／８／３４セグメント（単数または複数）が存在するとき、そのセグメントはＰＲ／８／３４ ＨＡセグメントを含まず、通常はＰＲ／８／３４ ＮＡセグメントを含まない。よって好ましいウイルスにおいては、セグメントＮＰ、Ｍ、ＮＳ、ＰＡ、ＰＢ１および／またはＰＢ２のうちの少なくとも１つがＰＲ／８／３４に由来しない。より好ましくは、セグメントＮＰ、Ｍ、ＰＡ、ＰＢ１および／またはＰＢ２のうちの少なくとも１つがＰＲ／８／３４に由来しない。よって本発明は、通常のＨＡおよびＮＡ抗原に、流布中の株を表わす１つまたはそれ以上のさらなるエピトープ含有抗原を加えることによって、既存のワクチンを改善できる。
【0109】
同様に、好ましいインフルエンザＡウイルスは、ＡＡ／６／６０インフルエンザウイルス（Ａ／Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ／６／６０）からの６つより少ない（すなわち０、１、２、３、４または５つの）ウイルスセグメントを含む。好ましくは、このウイルスはＡＡ／６／６０セグメントを含まない。いずれかのＡＡ／６／６０セグメント（単数または複数）が存在するとき、そのセグメントはＡＡ／６／６０ ＨＡセグメントを含まず、通常はＡＡ／６／６０ ＮＡセグメントを含まない。よって好ましいウイルスにおいては、セグメントＮＰ、Ｍ、ＮＳ、ＰＡ、ＰＢ１および／またはＰＢ２のうちの少なくとも１つがＡＡ／６／６０に由来しない。より好ましくは、セグメントＮＰ、Ｍ、ＰＡ、ＰＢ１および／またはＰＢ２のうちの少なくとも１つがＡＡ／６／６０に由来しない。
【0110】
好ましいインフルエンザＢウイルスは、ＡＡ／１／６６インフルエンザウイルス（Ｂ／Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ／１／６６）からの６つより少ない（すなわち０、１、２、３、４または５つの）ウイルスセグメントを含む。好ましくは、このウイルスはＡＡ／１／６６セグメントを含まない。いずれかのＡＡ／１／６６セグメント（単数または複数）が存在するとき、そのセグメントはＡＡ／１／６６ ＨＡセグメントを含まず、通常はＡＡ／１／６６ ＮＡセグメントを含まない。よって好ましいウイルスにおいては、セグメントＮＰ、Ｍ、ＮＳ、ＰＡ、ＰＢ１および／またはＰＢ２のうちの少なくとも１つがＡＡ／１／６６に由来しない。より好ましくは、セグメントＮＰ、Ｍ、ＰＡ、ＰＢ１および／またはＰＢ２のうちの少なくとも１つがＡＡ／１／６６に由来しない。
【0111】
本発明の好ましいインフルエンザウイルス（シードウイルス、ＭＤＣＫ細胞を用いて患者のサンプルから単離したウイルス、再集合体ウイルスなどを含む）は、Ｓｉａ（α２，３）Ｇａｌ末端二糖を有するオリゴ糖よりもＳｉａ（α２，６）Ｇａｌ末端二糖を有するオリゴ糖に優先的に結合する赤血球凝集素を含む。この結合優先性については上記により詳細に考察している。
【0112】
本発明の好ましいインフルエンザウイルス（シードウイルス、ＭＤＣＫ細胞を用いて患者のサンプルから単離したウイルス、再集合体ウイルスなどを含む）は、卵由来のウイルスとは異なるグリコシル化パターンを有する糖タンパク質（赤血球凝集素を含む）を含む。つまり、この糖タンパク質は鶏卵中で生育されたウイルスには見られないグリコフォームを含み、たとえば哺乳動物の糖結合を含む鳥類以外の糖結合を有してもよい。
【0113】
細胞株
本発明は、インフルエンザウイルスの複製を支持し、かつ卵の使用を回避する細胞株の使用を含む。この細胞株は典型的に、哺乳動物に由来する。由来となる好適な哺乳動物細胞は、ハムスター、ウシ、霊長類の動物（ヒトおよびサルを含む）、およびイヌの細胞を含むがこれらに限定されず、霊長類の動物の細胞の使用は好ましくない。さまざまな細胞型、たとえば腎臓細胞、線維芽細胞、網膜細胞、肺細胞などが用いられてもよい。好適なハムスター細胞の例は、ＢＨＫ２１またはＨＫＣＣという名前を有する細胞株である。好適なサル細胞は、たとえばアフリカミドリザル細胞、たとえばベロ細胞株のような腎臓細胞などである［２１－２２、２３］。好適なイヌ細胞は、たとえばＣＬＤＫおよびＭＤＣＫ細胞株のような腎臓細胞などである。
本発明は、インフルエンザウイルスの複製を支持し、かつ卵の使用を回避する細胞株の使用を含む。この細胞株は典型的に、哺乳動物に由来する。由来となる好適な哺乳動物細胞は、ハムスター、ウシ、霊長類の動物（ヒトおよびサルを含む）、およびイヌの細胞を含むがこれらに限定されず、霊長類の動物の細胞の使用は好ましくない。さまざまな細胞型、たとえば腎臓細胞、線維芽細胞、網膜細胞、肺細胞などが用いられてもよい。好適なハムスター細胞の例は、ＢＨＫ２１またはＨＫＣＣという名前を有する細胞株である。好適なサル細胞は、たとえばアフリカミドリザル細胞、たとえばベロ細胞株のような腎臓細胞などである［２１－２２、２３］。好適なイヌ細胞は、たとえばＣＬＤＫおよびＭＤＣＫ細胞株のような腎臓細胞などである。
【0114】
好適な細胞株は以下を含むが、それらに限定されない：ＭＤＣＫ；ＣＨＯ；ＣＬＤＫ；ＨＫＣＣ；２９３Ｔ；ＢＨＫ；ベロ；ＭＲＣ－５；ＰＥＲ．Ｃ６［２４］；ＦＲｈＬ２；ＷＩ－３８；その他。好適な細胞株は、たとえばアメリカンタイプセルカルチャー（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ：ＡＴＣＣ）コレクション［２５］、Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓ［２６］、またはＥｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）などから広く入手可能である。たとえば、ＡＴＣＣはさまざまな異なるベロ細胞をカタログ番号ＣＣＬ－８１、ＣＣＬ－８１．２、ＣＲＬ－１５８６およびＣＲＬ－１５８７の下で供給しており、ＭＤＣＫ細胞をカタログ番号ＣＣＬ－３４の下で供給している。ＰＥＲ．Ｃ６は、ＥＣＡＣＣから寄託番号９６０２２９４０の下で入手可能である。これらの細胞型のいずれも、本発明に従った生育、再集合および／または継代に使用できる。
【0115】
最も好ましい細胞株は、哺乳動物型のグリコシル化を伴う細胞株である。哺乳動物細胞株に対するそれより好ましくない代替物として、ウイルスは、カモ（例、カモ網膜）またはメンドリ、たとえばニワトリ胚線維芽細胞（ｃｈｉｃｋｅｎ ｅｍｂｒｙｏ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ：ＣＥＦ）などに由来する細胞株を含む鳥類の細胞株［例、参考文献２７－２８、２９］において生育されてもよいが、哺乳動物細胞を使用することはワクチンが鳥類のＤＮＡおよび卵タンパク質（オボアルブミンおよびオボムコイドなど）を含まないようにできることを意味するため、アレルギー誘発性が低減される。
【0116】
インフルエンザウイルスを生育するために最も好ましい細胞株は、マディンダービーイヌ腎臓に由来するＭＤＣＫ細胞株［３０－３１、３２、３３］である。元のＭＤＣＫ細胞株はＡＴＣＣからＣＣＬ－３４として入手可能であるが、この細胞株の誘導体が用いられてもよい。たとえば参考文献３０は、懸濁培養中での生育に対して適合されたＭＤＣＫ細胞株を開示する（「ＭＤＣＫ３３０１６」または「３３０１６－ＰＦ」、ＤＳＭ ＡＣＣ２２１９として寄託される；参考文献３４および３５も参照）。同様に、参考文献３６は、無血清培養物における懸濁中で生育するＭＤＣＫ由来の細胞株を開示する（「Ｂ－７０２」、ＦＥＲＭ ＢＰ－７４４９として寄託される）。参考文献３７は、「ＭＤＣＫ－Ｓ」（ＡＴＣＣ ＰＴＡ－６５００）、「ＭＤＣＫ－ＳＦ１０１」（ＡＴＣＣ ＰＴＡ－６５０１）、「ＭＤＣＫ－ＳＦ１０２」（ＡＴＣＣ ＰＴＡ－６５０２）、および「ＭＤＣＫ－ＳＦ１０３」（ＡＴＣＣ ＰＴＡ－６５０３）を含む非腫瘍形成性ＭＤＣＫ細胞を開示する。参考文献３８は、「ＭＤＣＫ．５Ｆ１」細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１２０４２）を含む、感染しやすいＭＤＣＫ細胞株を開示する。これらのＭＤＣＫ細胞株のいずれも本発明とともに使用できる。
【0117】
ウイルスは、付着性培養または懸濁における細胞において生育されてもよい。マイクロキャリア培養が用いられてもよい。いくつかの実施形態においては、細胞は懸濁における生育に対して適合されてもよい。
【0118】
好ましくは、細胞株は無血清培地および／または無タンパク質培地中で生育される。本発明の文脈において、ヒトまたは動物由来の血清からの添加剤を有さない培地は、無血清培地と呼ばれる。こうした培養において生育する細胞は当然その細胞自身のタンパク質を含有するが、無タンパク質培地とは、タンパク質、成長因子、その他のタンパク質添加剤および非血清タンパク質の排除（培地に加えないこと）によっても細胞の増加が起こるが、任意に（培地中に）ウイルスの生育に必要であり得るトリプシンまたは他のプロテアーゼなどのタンパク質を含むことができるような培地を意味することが理解される。
【0119】
インフルエンザウイルスの複製を支持する細胞株は、好ましくはウイルスの複製の際に３７℃よりも低い温度［３９］（例、３０～３６℃、または約３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃）で生育される。たとえば第６の局面において、ＭＤＣＫ細胞は、特にウイルスの複製の際に（単離ステップの前、最中または後に）これらの温度にて生育されてもよい。
【0120】
（たとえば、第６の局面に従って培養されたＭＤＣＫ細胞中でインフルエンザウイルスを生育するために）培養細胞中でインフルエンザウイルスを増殖させるための方法は通常、細胞の培養物に生育すべき株の接種材料を接種するステップと、感染した細胞を、たとえばウイルス力価または抗原発現などによって定められるウイルス増殖のための所望の期間培養するステップ（例、接種後２４時間から１６８時間）と、増殖したウイルスを集めるステップとを含む。培養細胞は、ウイルス（ＰＦＵまたはＴＣＩＤ５０によって測定される）対細胞の割合が１：５００から１：１、好ましくは１：１００から１：５、より好ましくは１：５０から１：１０となるように接種される。ウイルスは細胞の懸濁液に加えられるか、または細胞の単層に適用され、ウイルスは２５℃から４０℃、好ましくは２８℃から３７℃において、少なくとも６０分、通常は３００分未満、好ましくは９０分から２４０分の間、細胞に吸収される。感染した細胞培養物（例、単層）は、凍結－解凍によって、または採取された培養上清のウイルス含有量を増加させるための酵素作用によって除去されてもよい。採取された液体は、次いで不活性化されるか、または凍結保存される。培養細胞は、約０．０００１から１０、好ましくは０．００２から５、より好ましくは０．００１から２の感染多重度（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ：“ｍ．ｏ．ｉ”）にて感染されてもよい。さらにより好ましくは、細胞は約０．０１のｍ．ｏ．ｉにて感染される。感染細胞は感染後３０時間から６０時間で採取されてもよい。好ましくは、細胞は感染後３４時間から４８時間で採取される。さらにより好ましくは、細胞は感染後３８時間から４０時間で採取される。通常は、細胞培養の際にプロテアーゼ（典型的にはトリプシン）を加えることによってウイルスを放出させるが、このプロテアーゼは、たとえば接種前、接種と同時、または接種後など、培養中のあらゆる好適な段階で加えられてもよい［３９］。
【0121】
好ましい実施形態において、特にＭＤＣＫ細胞について、細胞株はマスター作用細胞バンクから４０回の分裂レベルを超えて継代されない。
【0122】
ウイルス接種材料およびウイルス培養物は、好ましくは単純性疱疹ウイルス、呼吸器系合胞体ウイルス、パラインフルエンザウイルス３、ＳＡＲＳコロナウイルス、アデノウイルス、ライノウイルス、レオウイルス、ポリオーマウイルス、ビルナウイルス、サーコウイルス、および／またはパルボウイルスを含まない（すなわちこれらのウイルスに対してテストされて、その混入に対する陰性の結果を与える）［４０］。同様に、第６の局面とともに用いられる好ましいＭＤＣＫ細胞株は、単純性疱疹ウイルス、呼吸器系合胞体ウイルス、パラインフルエンザウイルス３、ＳＡＲＳコロナウイルス、アデノウイルス、ライノウイルス、レオウイルス、ポリオーマウイルス、ビルナウイルス、サーコウイルス、および／またはパルボウイルスを含まない（すなわちこれらのウイルスに対してテストされて、その混入に対する陰性の結果を与える）。単純性疱疹ウイルスが存在しないことが特に好ましい。
【0123】
本発明とともに用いられるＭＤＣＫ細胞株は、好ましくはＧ４１８耐性に対するマーカを含有しない（参考文献１６を参照）。よってこの細胞株はＧ４１８処理に対して感受性であってもよい。
【0124】
本発明とともに用いられる細胞株は、逆遺伝学技術に必要であり得るものを除き、外因性プラスミドを含有しないことが好ましい（参考文献１６を参照）。
【0125】
逆遺伝学技術
上述したとおり、本発明は臨床的単離体または一次単離体とともに直接用いることができる。加えて、本発明は逆遺伝学技術を用いて生成されたものを含む再集合体株とともに用いることができる［例、４１－４２、４３、４４、４５］。逆遺伝学技術は、プラスミドのインビトロ操作を用いてウイルスセグメントの組合せを生成することによって、ウイルスセグメント中のコード配列または非コード配列の操作を促進したり、変異を導入したりなどできる。この技術は、インフルエンザＡウイルスおよびインフルエンザＢウイルスの両方に対して用いられ得る。
上述したとおり、本発明は臨床的単離体または一次単離体とともに直接用いることができる。加えて、本発明は逆遺伝学技術を用いて生成されたものを含む再集合体株とともに用いることができる［例、４１－４２、４３、４４、４５］。逆遺伝学技術は、プラスミドのインビトロ操作を用いてウイルスセグメントの組合せを生成することによって、ウイルスセグメント中のコード配列または非コード配列の操作を促進したり、変異を導入したりなどできる。この技術は、インフルエンザＡウイルスおよびインフルエンザＢウイルスの両方に対して用いられ得る。
【0126】
逆遺伝学は典型的に、（ａ）たとえばｐｏｌＩプロモータ、バクテリアＲＮＡポリメラーゼプロモータ、バクテリオファージポリメラーゼプロモータなどからの所望のウイルスＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ分子の発現、および（ｂ）たとえばｐｏｌＩＩプロモータなどからのウイルスタンパク質をコードするＤＮＡ分子の発現を含むことによって、細胞における両タイプのＤＮＡの発現によって、完全にインタクトの感染性ビリオンの集合がもたらされる。このＤＮＡはすべてのウイルスＲＮＡおよびタンパク質を与えることが好ましいが、ＲＮＡおよびタンパク質のいくつかを与えるためにヘルパーウイルスを用ることも可能である。各ウイルスＲＮＡを生成するために別個のプラスミドを用いるプラスミドに基づく方法が好ましく［４６－４７、４８］、これらの方法もウイルスタンパク質のすべてまたはいくつか（例、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡおよびＮＰタンパク質のみ）を発現するためのプラスミドの使用を含み、いくつかの方法においては１２種のプラスミドが用いられる。
【0127】
必要なプラスミドの数を低減させるために、最近のアプローチ［４９］では（ウイルスＲＮＡ合成のための）複数のＲＮＡポリメラーゼＩ転写カセットを同じプラスミド上に組合せ（例、１、２、３、４、５、６、７または８つすべてのインフルエンザＡ ｖＲＮＡセグメントをコードする配列）、複数のタンパク質をコードする領域をＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモータとともに別のプラスミド上に組合せる（例、１、２、３、４、５、６、７または８つすべてのインフルエンザＡ ｍＲＮＡ転写産物をコードする配列）。参考文献４９の方法の好ましい局面は、以下を含む：（ａ）単一プラスミド上のＰＢ１、ＰＢ２およびＰＡ ｍＲＮＡをコードする領域；および（ｂ）単一プラスミド上の８つすべてのｖＲＮＡをコードするセグメント。ＮＡおよびＨＡセグメントを１つのプラスミド上に含ませ、他の６つのセグメントを別のプラスミド上に含ませても事態を促進できる。
【0128】
ｐｏｌＩプロモータは種特異性を有するため、ＭＤＣＫ細胞において逆遺伝学を行なうときにはイヌｐｏｌＩプロモータ［５０］が用いられてもよい。ウイルスＲＮＡセグメントをコードするためにｐｏｌＩプロモータを用いる代わりに、バクテリオファージポリメラーゼプロモータを用いることが可能である［５１］。たとえば、ＳＰ６、Ｔ３またはＴ７ポリメラーゼに対するプロモータを便利に使用できる。ｐｏｌＩプロモータは種特異性を有するため、バクテリオファージポリメラーゼプロモータは多くの細胞型（例、ＭＤＣＫ）に対してより便利になり得るが、細胞を外因性ポリメラーゼ酵素をコードするプラスミドによってトランスフェクションする必要がある。
【0129】
他の技術においては、ウイルスＲＮＡおよび単一の鋳型からの発現可能なｍＲＮＡを同時にコードするために、デュアルｐｏｌＩおよびｐｏｌＩＩプロモータを用いることが可能である［５２、５３］。
【0130】
卵における生育のために用いられる株は通常ＰＲ／８／３４インフルエンザＡウイルスからの６つのＲＮＡセグメントを含む（ＨＡおよびＮセグメントはワクチン株からのものであり、つまり６：２再集合体である）が、本発明による卵の回避は、ＰＲ／８／３４セグメントをなくし得ることを意味する。よってインフルエンザＡウイルスは、ＰＲ／８／３４インフルエンザウイルスからの６つより少ない（すなわち０、１、２、３、４または５つの）ウイルスセグメントを含み得る。好ましいウイルスは、セグメントＮＰ、Ｍ、ＮＳ、ＰＡ、ＰＢ１および／またはＰＢ２のうち少なくとも１つがＰＲ／８／３４に由来しないウイルスである。ウイルスは、鳥インフルエンザウイルスに由来するＮＳセグメントを含んでもよい。
【0131】
本発明が逆遺伝学を用いるとき、供給源のインフルエンザウイルスからのウイルスＲＮＡセグメントを目的インフルエンザウイルスのゲノムに移すことが可能になる。よってこれら２つのウイルスは少なくとも１つの共通するウイルスＲＮＡセグメントを有する。ここでの「共通する」という用語は、全セグメントの同一コピーを意味するが、意味を広げて、コード領域および／または非コード領域に修飾を有する、セグメントの修飾コピーを意味してもよい。修飾がコード領域に行なわれるとき、その修飾はコードされるタンパク質の免疫原性および／または活性を実質的に変えない。よってＨＡセグメントは、患者に投与されたときに有効な抗ＨＡ抗体を誘出する能力を変えることなく、ＨＡ１／ＨＡ２切断部位の周囲で操作されてもよい。よって、たとえば鳥種におけるウイルスの病原性を高める決定要因（例、ＨＡ１／ＨＡ２切断部位の周囲の過度に塩基性の領域）を除去するために、第６の局面に従って単離されたウイルスの天然ＨＡを修飾するために逆遺伝学が用いられてもよい。
【0132】
ワクチン調製
現在、さまざまな形のインフルエンザウイルスワクチンが入手可能である（例、参考文献５４の第１７章および第１８章を参照）。一般的に、ワクチンは生ウイルスまたは不活性化ウイルスのいずれかに基づいている。不活性化ワクチンは、全ビリオン、「分解（ｓｐｌｉｔ）」ビリオン、または精製された表面抗原に基づいてもよい。インフルエンザ抗原は、ビロゾームの形で提供されてもよい。本発明は、これらのタイプのワクチンのいずれかを製造するときに使用できる。
現在、さまざまな形のインフルエンザウイルスワクチンが入手可能である（例、参考文献５４の第１７章および第１８章を参照）。一般的に、ワクチンは生ウイルスまたは不活性化ウイルスのいずれかに基づいている。不活性化ワクチンは、全ビリオン、「分解（ｓｐｌｉｔ）」ビリオン、または精製された表面抗原に基づいてもよい。インフルエンザ抗原は、ビロゾームの形で提供されてもよい。本発明は、これらのタイプのワクチンのいずれかを製造するときに使用できる。
【0133】
生ウイルスは、ＭｅｄＩｍｍｕｎｅのＦＬＵＭＩＳＴ（商標）製品（３価の生ウイルス）を含む。ワクチンは、ウイルスを好適な培養基上で生育させるステップと、次いでビリオンを含有する液体からビリオンを精製するステップとを含む方法によって調製される。たとえば、この液体は遠心分離によって浄化され、（例、スクロース、リン酸カリウム、およびグルタミン酸一ナトリウムを含有する）緩衝液によって安定化されてもよい。
【0134】
不活性化ウイルスが用いられるとき、ワクチンは全ビリオン、分解ビリオン、または精製された表面抗原（赤血球凝集素を含み、通常はノイラミニダーゼも含む）を含んでもよい。ウイルスを不活性化するための化学的手段は、以下の薬剤の１つまたはそれ以上の有効量による処理を含む：界面活性剤、ホルムアルデヒド、β－プロピオラクトン、メチレンブルー、ソラレン、カルボキシフラーレン（Ｃ６０）、バイナリーエチルアミン、アセチルエチレンイミン、またはそれらの組合せ。たとえばＵＶ光またはガンマ照射などの、ウイルス不活性化の非化学的方法は当該技術分野において公知である。
【0135】
ビリオンは、さまざまな方法によってウイルスを含有する液体から採取できる。たとえば、精製方法は、ビリオンを破壊するための界面活性剤を含む線形スクロース勾配溶液を用いたゾーン遠心法を含んでもよい。次いで抗原は、任意の希釈の後、膜分離法によって精製されてもよい。
【0136】
分解ビリオンは、精製したビリオンを界面活性剤（例、エチルエーテル、ポリソルベート８０、デオキシコール酸塩、トリ－Ｎ－ブチルリン酸、トリトンＸ－１００、トリトンＮ１０１、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ ＮＰ９など）で処理してサブビリオン調製物を生成することによって得られ、これは「ツイン－エーテル（Ｔｗｅｅｎ－ｅｔｈｅｒ）」分解方法を含む。インフルエンザウイルスを分解する方法は当該技術分野において周知であり、たとえば参考文献５５－５６、５７、５８、５９、６０などを参照されたい。ウイルスの分解は典型的に、ウイルス全体を破壊またはフラグメント化することによって行なわれ、分解剤の破壊濃度によって感染性または非感染性となる。破壊によってウイルスタンパク質の完全または部分的な可溶化がもたらされ、ウイルスの完全性を変える。好ましい分解剤は、非イオン性およびイオン性（例、カチオン性）の界面活性剤、たとえばアルキルグリコシド、アルキルチオグリコシド、アシル糖、スルホベタイン、ベタイン、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、Ｎ，Ｎ－ジアルキル－グルカミド、Ｈｅｃａｍｅｇ、アルキルフェノキシ－ポリエトキシエタノール、ＮＰ９、第四アンモニウム化合物、サルコシル、ＣＴＡＢ（セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ｃｅｔｙｌ ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅｓ））、トリ－Ｎ－ブチルリン酸、セタブロン、ミリスチルトリメチルアンモニウム塩、リポフェクチン、リポフェクタミン、およびＤＯＴ－ＭＡなど、オクチル－またはノニルフェノキシポリオキシエタノール（例、トリトン界面活性剤、たとえばトリトンＸ－１００またはトリトンＮ１０１など）、ポリオキシエチレンソルビタンエステル（ツイン界面活性剤）、ポリオキシエチレンエーテル、ポリオキシエチレンエステルなどである。有用な分解手順の１つは、デオキシコール酸ナトリウムおよびホルムアルデヒドの連続的な効果を用いており、分解は最初のビリオン精製の際に（例、スクロース密度勾配溶液の中で）起こり得る。よって分解方法は、ビリオン含有材料の浄化（非ビリオン材料を除去するため）と、採取したビリオンの濃縮（例、ＣａＨＰＯ４吸着などの吸着方法を用いる）と、非ビリオン材料からの全ビリオンの分離と、密度勾配遠心分離ステップにおける分解剤の使用によるビリオンの分解（例、デオキシコール酸ナトリウムなどの分解剤を含有するスクロース勾配を用いる）と、その後のろ過（例、限外ろ過）による望ましくない材料の除去とを含んでもよい。分解ビリオンは、リン酸ナトリウム緩衝等張食塩水に有用に再懸濁できる。ＢＥＧＲＩＶＡＣ（商標）、ＦＬＵＡＲＩＸ（商標）、ＦＬＵＺＯＮＥ（商標）、およびＦＬＵＳＨＩＥＬＤ（商標）製品は、分解ワクチンである。
【0137】
精製された表面抗原ワクチンは、インフルエンザ表面抗原赤血球凝集素を含み、典型的にはノイラミニダーゼも含む。これらのタンパク質を精製した形で調製するための方法は、当該技術分野において周知である。ＦＬＵＶＩＲＩＮ（商標）、ＡＧＲＩＰＰＡＬ（商標）およびＩＮＦＬＵＶＡＣ（商標）製品はサブユニットワクチンである。
【0138】
不活性化インフルエンザ抗原の別の形はビロゾーム［６１］（核酸を含まないウイルス様リポソーム粒子）である。ビロゾームは、インフルエンザウイルスを界面活性剤で可溶化した後にヌクレオカプシドを除去し、ウイルスの糖タンパク質を含有する膜を再構築することによって調製できる。ビロゾームを調製するための代替的な方法は、ウイルスの膜糖タンパク質を過剰量のリン脂質に加えて、膜内にウイルスタンパク質を有するリポソームを与えるステップを含む。本発明は、ＩＮＦＬＥＸＡＬ Ｖ（商標）およびＩＮＶＡＶＡＣ（商標）製品と同様にバルクビロゾームを保存するために用いられてもよい。
【0139】
インフルエンザウイルスは弱毒化されてもよい。インフルエンザウイルスは温度感受性であってもよい。インフルエンザウイルスは低温適応されてもよい。これら３つの特徴は、生ウイルスを抗原として用いるときに特に有用である。
【0140】
ＨＡは現行の不活性化インフルエンザワクチンにおける主な免疫原であり、ワクチン用量は、典型的にはＳＲＩＤによって測定されたＨＡレベルを参照して標準化される。既存のワクチンは典型的には１株当り約１５μｇのＨＡを含有するが、たとえば子供用、またはパンデミック状態のとき、またはアジュバントを使用するときなどには、もっと低用量のものが用いられてもよい。たとえば１／２（すなわち１株当り７．５μｇのＨＡ）、１／４および１／８などの部分的用量が用いられており［８１、８２］、より高い用量（例、３ｘまたは９ｘ用量［６２、６３］）も用いられている。よって、ワクチンはインフルエンザ１株当り０．１μｇから１５０μｇのＨＡ、好ましくは０．１μｇから５０μｇ、たとえば０．１～２０μｇ、０．１～１５μｇ、０．１～１０μｇ、０．１～７．５μｇ、０．５～５μｇなどを含んでもよい。特定の用量は、１株当りたとえば約４５、約３０、約１５、約１０、約７．５、約５、約３．８、約１．９、約１．５などを含む。
【0141】
生ワクチンに対する用量は、ＨＡ含有量ではなく、５０％組織培養感染量（ｍｅｄｉａｎ ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｏｓｅ：ＴＣＩＤ５０）によって測定され、１株当たり１０６から１０８（好ましくは１０６．５～１０７．５）のＴＣＩＤ５０が典型的である。
【0142】
本発明によって用いられる株は、野生型ウイルスにみられるような天然ＨＡを有するか、または修飾されたＨＡを有してもよい。たとえば、鳥種におけるウイルスの病原性を高める決定要因（例、ＨＡ１／ＨＡ２切断部位の周囲の過度に塩基性の領域）を除去するためにＨＡを修飾することが公知である。
【0143】
ワクチンに用いるインフルエンザウイルス株はシーズンごとに変わる。現在のパンデミック間期において、ワクチンは典型的に２つのインフルエンザＡ株（Ｈ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２）および１つのインフルエンザＢ株を含み、３価のワクチンが典型的である。本発明は、パンデミックウイルス株（すなわち、ワクチン受領者および一般的なヒト集団が免疫学上受けたことのない、特にインフルエンザＡウイルスの株）、たとえばＨ２、Ｈ５、Ｈ７またはＨ９サブタイプ株などを用いてもよく、パンデミック株に対するインフルエンザワクチンは１価であっても、パンデミック株によって補われた通常の３価ワクチンに基づいていてもよい。しかし、シーズンおよびワクチンに含まれる抗原の性質に依存して、本発明はＨＡサブタイプＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５またはＨ１６のうち１つまたはそれ以上に対する保護を行なってもよい。本発明は、インフルエンザＡウイルスのＮＡサブタイプＮ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８またはＮ９のうち１つまたはそれ以上に対する保護を行なってもよい。
【0144】
本発明の組成物は、パンデミック間株に対する免疫化に好適であるだけでなく、パンデミック株に対する免疫化に特に有用である。インフルエンザ株にパンデミック発生をもたらす可能性を与える特徴は以下のとおりである：（ａ）現在流布しているヒト株中の赤血球凝集素と比べて新しい赤血球凝集素を含むこと、すなわち１０年以上にわたってヒト集団において顕在化していないもの（例、Ｈ２）、またはヒト集団において過去にまったくみられなかったもの（例、Ｈ５、Ｈ６またはＨ９など、一般的に鳥集団においてのみ見出されたもの）であるために、ヒト集団はその株の赤血球凝集素を免疫学上受けたことがない；（ｂ）ヒト集団において水平に伝染できること；および（ｃ）ヒトに対して病原性であること。パンデミックインフルエンザに対する免疫化に対しては、たとえばＨ５Ｎ１株など、Ｈ５赤血球凝集素型を有するウイルスが好ましい。他に可能性のある株は、Ｈ５Ｎ３、Ｈ９Ｎ２、Ｈ２Ｎ２、Ｈ７Ｎ１およびＨ７Ｎ７、ならびにあらゆる他に出現するパンデミックな可能性のある株を含む。Ｈ５サブタイプ内では、ウイルスはＨＡクレード１、ＨＡクレード１’、ＨＡクレード２またはＨＡクレード３［６４］に入ってもよく、クレード１および３は特に関連がある。
【0145】
組成物に有用に含ませ得る抗原を有するその他の株は、抗ウイルス療法に耐性（例、オセルタミビル［６５］および／またはザナミビルに耐性）の株であり、耐性パンデミック株［６６］を含む。
【0146】
よって本発明の組成物は、インフルエンザＡウイルスおよび／またはインフルエンザＢウイルスを含む１つまたはそれ以上（例、１、２、３、４またはそれ以上）のインフルエンザウイルス株からの抗原を含んでもよい。ワクチンが２つ以上のインフルエンザの株を含むとき、異なる株は典型的に別々に生育され、ウイルスが採取されて抗原が調製された後に混合される。よって本発明の方法は、２つ以上のインフルエンザ株からの抗原を混合するステップを含んでもよい。２つのインフルエンザＡウイルス株および１つのインフルエンザＢウイルス株からの抗原を含む３価のワクチンが好ましい。
【0147】
本発明のいくつかの実施形態において、組成物は単一のインフルエンザＡ株からの抗原を含んでもよい。いくつかの実施形態において、組成物は２つのインフルエンザＡ株からの抗原を含んでもよいが、これら２つの株はＨ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２ではないものとする。いくつかの実施形態において、組成物は２つより多くのインフルエンザＡ株からの抗原を含んでもよい。
【0148】
本発明は、ワクチンに使用するためのインフルエンザウイルス抗原を調製するための方法を提供し、この方法は（ｉ）インフルエンザウイルスを受取るステップと；（ｉｉ）このインフルエンザウイルスを細胞株に感染させるステップと；（ｉｉｉ）インフルエンザウイルスを生成するためにステップ（ｉｉ）からの感染細胞を培養するステップとを含む。ステップ（ｉｉｉ）において得られるウイルスは、たとえば不活性化、調合などを含む方法などによってワクチンを調製するために用いられ得る。ステップ（ｉ）において受取られるインフルエンザウイルスは、以下の特徴のうち１つまたはそれ以上を有する：（ａ）卵培養基において増殖されたことがない；（ｂ）ＭＤＣＫ細胞、たとえばＭＤＣＫ３３０１６細胞および／または無血清培地中で生育するＭＤＣＫ細胞などにおいて単離された；（ｃ）血清を含有する培地中で生育する培養基において増殖されたことがない；（ｄ）逆遺伝学技術を用いて生成された；（ｅ）ＰＲ／８／３４インフルエンザウイルスからの６つより少ないウイルスセグメントを有するインフルエンザＡウイルス、および／もしくはＡＡ／６／６０インフルエンザウイルスからの６つより少ないウイルスセグメントを有するインフルエンザＡウイルスであるか、またはＡＡ／１／６６インフルエンザウイルスからの６つより少ないウイルスセグメントを有するインフルエンザＢウイルスである；（ｆ）Ｓｉａ（α２，３）Ｇａｌ末端二糖を有するオリゴ糖よりもＳｉａ（α２，６）Ｇａｌ末端二糖を有するオリゴ糖に優先的に結合する赤血球凝集素を含む；および／または（ｇ）卵由来のウイルスとは異なるグリコシル化パターンを有する糖タンパク質（赤血球凝集素を含む）を有する。よって、ステップ（ｉ）において受取られるインフルエンザウイルスは、本明細書の別の場所に記載されるとおりに得られたものであってもよい。
【0149】
宿主細胞ＤＮＡ
細胞株においてウイルスが生育されるときには、ＤＮＡのあらゆる腫瘍形成活性を最小化するために最終ワクチン中の残余細胞株ＤＮＡの量を最小化することが標準的に行なわれる。
細胞株においてウイルスが生育されるときには、ＤＮＡのあらゆる腫瘍形成活性を最小化するために最終ワクチン中の残余細胞株ＤＮＡの量を最小化することが標準的に行なわれる。
【0150】
よって、本発明に従って調製されるワクチン組成物は、用量当り１０ｎｇ未満（好ましくは１ｎｇ未満、より好ましくは１００ｐｇ未満）の残留宿主細胞ＤＮＡを含有することが好ましいが、極微量の宿主細胞ＤＮＡは存在し得る。
【0151】
０．２５ｍｌの体積当り＜１０ｎｇ（例、＜１ｎｇ、＜１００ｐｇ）の宿主細胞ＤＮＡを含有するワクチンのように、１５μｇの赤血球凝集素当り＜１０ｎｇ（例、＜１ｎｇ、＜１００ｐｇ）の宿主細胞ＤＮＡを含有するワクチンが好ましい。０．５ｍｌの体積当り＜１０ｎｇ（例、＜１ｎｇ、＜１００ｐｇ）の宿主細胞ＤＮＡを含有するワクチンのように、５０μｇの赤血球凝集素当り＜１０ｎｇ（例、＜１ｎｇ、＜１００ｐｇ）の宿主細胞ＤＮＡを含有するワクチンがより好ましい。
【0152】
あらゆる残留宿主細胞ＤＮＡの平均の長さは、５００ｂｐ未満、たとえば４００ｂｐ未満、３００ｂｐ未満、２００ｂｐ未満、１００ｂｐ未満などであることが好ましい。
【0153】
混入ＤＮＡは、たとえばクロマトグラフィなどの標準的な精製手順を用いて、ワクチン調製の際に除去できる。残留宿主細胞ＤＮＡの除去は、たとえばＤＮアーゼの使用などによるヌクレアーゼ処理によって向上できる。宿主細胞ＤＮＡの混入を低減させるための便利な方法が参考文献６７および６８に開示されており、この方法は２ステップ処理を含み、最初にＤＮアーゼ（例、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ）を使用し、このＤＮアーゼはウイルス生育の際に用いられてもよく、次いでカチオン性界面活性剤（例、ＣＴＡＢ）を使用し、この界面活性剤はビリオン破壊の際に用いられてもよい。β－プロピオラクトンなどのアルキル化剤による処理を用いて宿主細胞ＤＮＡが除去されてもよく、この処理は有利にはビリオンを不活性化するためにも用いられ得る［６９］。
【0154】
残留宿主細胞ＤＮＡの測定は現在では生物製剤に対するルーチン的規制要求であり、当業者の通常の能力の範囲内である。ＤＮＡを測定するために用いられるアッセイは、典型的には検証済みのアッセイとなる［７０、７１］。検証済みのアッセイの性能の特徴は数学的および定量可能に説明でき、その誤りの元となり得るものは同定される。このアッセイは一般的に、たとえば正確さ、精度、特異性などの特徴についてテストされる。一旦アッセイが（例、宿主細胞ＤＮＡの公知の標準量に対して）較正されテストされると、量的なＤＮＡ測定をルーチン的に行なうことができる。ＤＮＡ定量に対する３つの主な技術が用いられ得る：ハイブリダイゼーション法、たとえばサザンブロットまたはスロットブロットなど［７２］；免疫定量法、たとえばＴｈｒｅｓｈｏｌｄ（商標）システムなど［７３］；および定量的ＰＣＲ［７４］。これらの方法はすべて当業者によく知られるが、各方法の正確な特徴は問題の宿主細胞、たとえばハイブリダイゼーションのためのプローブの選択、増幅のためのプライマおよび／またはプローブの選択などに左右され得る。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＤｅｖｉｃｅｓからのＴｈｒｅｓｈｏｌｄ（商標）システムはピコグラムレベルの合計ＤＮＡに対する定量的アッセイであり、生物薬剤中の混入ＤＮＡのレベルをモニタするために用いられている［７３］。典型的なアッセイは、ビオチン化ｓｓＤＮＡ結合タンパク質と、ウレアーゼに結合した抗ｓｓＤＮＡ抗体と、ＤＮＡとの間の反応複合体の配列非特異的な形成を含む。すべてのアッセイ構成要素は、製造者から入手可能な完全な全ＤＮＡアッセイキットに含まれる。たとえばＡｐｐＴｅｃ（商標）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＢｉｏＲｅｌｉａｎｃｅ（商標）、Ａｌｔｈｅａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓなど、さまざまな商業的製造者が残留宿主細胞ＤＮＡを検出するための定量的ＰＣＲアッセイを提供している。参考文献７５に、ヒトウイルスワクチンの宿主細胞ＤＮＡ混入を測定するための化学ルミネセンスハイブリダイゼーションアッセイと、全ＤＮＡ Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ（商標）システムとの比較を見出すことができる。
【0155】
医薬組成物
本発明に従って製造されるワクチン組成物は、医薬的に許容できる。この組成物は通常、インフルエンザ抗原に加えて別の成分を含み、たとえば典型的に、１つまたはそれ以上の医薬担体および／または賦形剤を含む。以下に記載するとおり、アジュバントも含まれていてもよい。こうした成分の詳細な考察は参考文献７６にて得られる。
本発明に従って製造されるワクチン組成物は、医薬的に許容できる。この組成物は通常、インフルエンザ抗原に加えて別の成分を含み、たとえば典型的に、１つまたはそれ以上の医薬担体および／または賦形剤を含む。以下に記載するとおり、アジュバントも含まれていてもよい。こうした成分の詳細な考察は参考文献７６にて得られる。
【0156】
ワクチン組成物は一般的に水性の形である。
【0157】
ワクチン組成物は、チオメルサールまたは２－フェノキシエタノールなどの防腐剤を含んでもよい。しかし好ましくは、ワクチンは水銀の材料を実質的に含まない（すなわち５μｇ／ｍｌ未満）ようにすべきであり、たとえばチオメルサールは含まないようにすべきである［５９、７７］。水銀を含有しないワクチンがより好ましい。水銀化合物の代替物として、α－トコフェロールコハク酸塩が含まれてもよい［５９］。防腐剤を含まないワクチンは特に好ましい。
【0158】
張性を制御するために、ナトリウム塩などの生理的な塩を含むことが好ましい。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）が好ましく、１ｍｇ／ｍｌから２０ｍｇ／ｍｌが存在してもよい。存在してもよいその他の塩は、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、無水リン酸二ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウムなどを含む。
【0159】
ワクチン組成物が有するオスモル濃度は一般的に、２００ｍＯｓｍ／ｋｇから４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、好ましくは２４０～３６０ｍＯｓｍ／ｋｇであり、より好ましくは２９０～３１０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲内になる。オスモル濃度は予防接種によってもたらされる痛みに影響しないことが過去に報告されている［７８］が、オスモル濃度をこの範囲内に保つことがやはり好ましい。
【0160】
ワクチン組成物は１つまたはそれ以上の緩衝液を含んでもよい。典型的な緩衝液は以下を含む：リン酸緩衝液；トリス緩衝液；ホウ酸緩衝液；コハク酸緩衝液；ヒスチジン緩衝液（特に水酸化アルミニウムアジュバントとともに）；またはクエン酸緩衝液。緩衝液は典型的に、５～２０ｍＭの範囲で含まれる。
【0161】
ワクチン組成物のｐＨは一般的に５．０から８．１であり、より典型的には６．０から８．０、たとえば６．５から７．５、または７．０から７．８の間である。したがって本発明の方法は、包装前にバルクワクチンのｐＨを調節するステップを含んでもよい。
【0162】
ワクチン組成物は滅菌されていることが好ましい。ワクチン組成物は非発熱性であることが好ましく、たとえば用量当り＜１ＥＵ（エンドトキシン単位（ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ ｕｎｉｔ）、標準的な尺度）、好ましくは用量当り＜０．１ＥＵを含有する。ワクチン組成物はグルテンを含まないことが好ましい。
【0163】
本発明のワクチン組成物は界面活性剤を含んでもよく、たとえばポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（「ツイン」として公知）、オクトキシノール（たとえばオクトキシノール－９（トリトンＸ－１００）またはｔ－オクチルフェノキシポリエトキシエタノールなど）、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（「ＣＴＡＢ」）、またはデオキシコール酸ナトリウムなどを、特に分解または表面抗原ワクチンに対して含んでもよい。界面活性剤は極微量だけ存在していてもよい。よってワクチンは、オクトキシノール－１０およびポリソルベート８０の各々を１ｍｇ／ｍｌ未満含んでもよい。その他の極微量の残余成分は抗生物質（例、ネオマイシン、カナマイシン、ポリミキシンＢ）であってもよい。
【0164】
ワクチン組成物は、単一の免疫化のための材料を含んでも、複数の免疫化のための材料を含んでもよい（すなわち「マルチドーズ（ｍｕｌｔｉｄｏｓｅ）」キット）。マルチドーズ配置には防腐剤が含まれることが好ましい。マルチドーズ組成物に防腐剤を含ませることの代替案（またはそれに加えるもの）として、組成物は材料の取出しのための無菌アダプタを有する容器内に含有されてもよい。
【0165】
インフルエンザワクチンは典型的に約０．５ｍｌの用量体積で投与されるが、子供には半分の用量（すなわち約０．２５ｍｌ）が投与されてもよい。
【0166】
組成物およびキットは２℃から８℃で保存されることが好ましい。組成物およびキットは凍結されるべきではない。組成物およびキットに直接光が当らないようにされることが理想的である。
【0167】
アジュバント
本発明の組成物は有利にはアジュバントを含んでもよく、アジュバントは組成物を受けた患者において誘出される免疫応答（体液性および／または細胞性）を高めるために機能し得る。アジュバントをインフルエンザワクチンとともに使用することは以前に記載されている。参考文献７９および８０においては水酸化アルミニウムが用いられ、参考文献８１においては水酸化アルミニウムとリン酸アルミニウムとの混合物が用いられた。参考文献８２もアルミニウム塩アジュバントの使用を記載した。Ｃｈｉｒｏｎ ＶａｃｃｉｎｅｓからのＦＬＵＡＤ（商標）製品は、水中油型エマルジョンを含む。
本発明の組成物は有利にはアジュバントを含んでもよく、アジュバントは組成物を受けた患者において誘出される免疫応答（体液性および／または細胞性）を高めるために機能し得る。アジュバントをインフルエンザワクチンとともに使用することは以前に記載されている。参考文献７９および８０においては水酸化アルミニウムが用いられ、参考文献８１においては水酸化アルミニウムとリン酸アルミニウムとの混合物が用いられた。参考文献８２もアルミニウム塩アジュバントの使用を記載した。Ｃｈｉｒｏｎ ＶａｃｃｉｎｅｓからのＦＬＵＡＤ（商標）製品は、水中油型エマルジョンを含む。
【0168】
本発明とともに用いられ得るアジュバントは以下を含むが、それらに限定されない：
・カルシウム塩およびアルミニウム塩（またはそれらの混合物）を含む無機質含有組成物。カルシウム塩はリン酸カルシウム（例、参考文献８３に開示される「ＣＡＰ」粒子）を含む。アルミニウム塩は水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムなどを含み、これらの塩はあらゆる好適な形を取る（例、ゲル、結晶、アモルファスなど）。これらの塩に対する吸着が好ましい。無機質含有組成物は、金属塩の粒子として調合されてもよい［８４］。アルミニウム塩アジュバントについては以下により詳細に説明される。
・カルシウム塩およびアルミニウム塩（またはそれらの混合物）を含む無機質含有組成物。カルシウム塩はリン酸カルシウム（例、参考文献８３に開示される「ＣＡＰ」粒子）を含む。アルミニウム塩は水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムなどを含み、これらの塩はあらゆる好適な形を取る（例、ゲル、結晶、アモルファスなど）。これらの塩に対する吸着が好ましい。無機質含有組成物は、金属塩の粒子として調合されてもよい［８４］。アルミニウム塩アジュバントについては以下により詳細に説明される。
【0169】
・サイトカイン誘導剤（より詳細には下記を参照）。
【0170】
・サポニン［参考文献１１２の第２２章］。サポニンとは、広範囲の植物種の樹皮、葉、幹、根および花にさえも見出されるステロールグリコシドおよびトリテルペノイドグリコシドの異種群である。Ｑｕｉｌｌａｉａ ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａの木の樹皮からのサポニンは、アジュバントとして広く研究されている。サポニンは、Ｓｍｉｌａｘ ｏｒｎａｔａ（サルサパリラ）、Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌｌａ ｐａｎｉｃｕｌａｔａ（ブライズベール（ｂｒｉｄｅｓ ｖｅｉｌ））、およびＳａｐｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉａｎａｌｉｓ（カスミソウ）からも商業的に得ることができる。サポニンアジュバント調合物は、精製調合物、たとえばＱＳ２１など、および脂質調合物、たとえばＩＳＣＯＭなどを含む。ＱＳ２１はＳｔｉｍｕｌｏｎ（商標）として市販されている。サポニン組成物は、ＨＰＬＣおよびＲＰ－ＨＰＬＣを用いて精製されてきた。これらの技術を用いた特定の精製画分が同定されており、その画分はＱＳ７、ＱＳ１７、ＱＳ１８、ＱＳ２１、ＱＨ－Ａ、ＱＨ－ＢおよびＱＨ－Ｃを含む。好ましくは、サポニンはＱＳ２１である。ＱＳ２１の生成方法は、参考文献８５に開示される。サポニン調合物は、コレステロールなどのステロールをも含んでもよい［８６］。サポニンとコレステロールとの組合せを用いて、免疫刺激複合体（ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘｓ：ＩＳＣＯＭｓ）と呼ばれる一意の粒子を形成できる［参考文献１１２の第２３章］。典型的に、ＩＳＣＯＭはリン脂質、たとえばホスファチジルエタノールアミンまたはホスファチジルコリンなども含む。あらゆる公知のサポニンがＩＳＣＯＭに用いられてもよい。好ましくは、ＩＳＣＯＭはＱｕｉｌＡ、ＱＨＡおよびＱＨＣのうち１つまたはそれ以上を含む。ＩＳＣＯＭは参考文献８６－８７－８８にさらに記載されている。任意には、ＩＳＣＯＭには付加的な界面活性剤がなくてもよい［８９］。サポニンを主成分とするアジュバントの開発についての概説は、参考文献９０および９１に見出すことができる。
【0171】
・脂肪性アジュバント（以下のより詳細な記載を参照）。
【0172】
・バクテリアのＡＤＰリボシル化毒素（例、Ｅ．ｃｏｌｉ熱不安定性エンテロトキシン（ｈｅａｔ ｌａｂｉｌｅ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ）「ＬＴ」、コレラ毒素（ｃｈｏｌｅｒａ ｔｏｘｉｎ）「ＣＴ」、または百日咳毒素（ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ ｔｏｘｉｎ）「ＰＴ」）およびその無毒化した誘導体、たとえばＬＴ－Ｋ６３およびＬＴ－Ｒ７２として公知の変異体毒素など［９２］。無毒化したＡＤＰリボシル化毒素の粘膜アジュバントとしての使用は参考文献９３に、非経口アジュバントとしての使用は参考文献９４に記載されている。
【0173】
・生体接着剤および粘液接着剤、たとえばエステル化ヒアルロン酸ミクロスフェア［９５］、またはキトサンおよびその誘導体［９６］など。
【0174】
・生分解性かつ非毒性の材料（例、ポリ（α－ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリカプロラクトンなど）から形成された微粒子（すなわち直径約１００ｎｍから約１５０μｍ、より好ましくは直径約２００ｎｍから約３０μｍ、または直径約５００ｎｍから約１０μｍの粒子）であって、ポリ（ラクチド－コ－グリコリド）が好ましく、任意には（例、ＳＤＳによって）負に帯電した表面を有するように処理されるか、または（例、ＣＴＡＢなどのカチオン性界面活性剤によって）正に帯電した表面を有するように処理される。
【0175】
・リポソ－ム（参考文献１１２の第１３章および第１４章）。アジュバントとしての使用に好適なリポソーム調合物の例は、参考文献９７－９８、９９に記載される。
【0176】
・ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステル［１００］。こうした調合物は、ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤とオクトキシノールとの組合せ［１０１］およびポリオキシエチレンアルキルエーテルまたはエステル界面活性剤とオクトキシノールなどの少なくとも１つの付加的な非イオン性界面活性剤との組合せ［１０２］をさらに含む。好ましいポリオキシエチレンエーテルは以下の群から選択される：ポリオキシエチレン－９－ラウリルエーテル（ラウレス（ｌａｕｒｅｔｈ）９）、ポリオキシエチレン－９－ステオリルエーテル、ポリオキシエチレン－８－ステオリルエーテル、ポリオキシエチレン－４－ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン－３５－ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレン－２３－ラウリルエーテル。
【0177】
・ムラミルペプチド、たとえばＮ－アセチルムラミル－Ｌ－スレオニル－Ｄ－イソグルタミン（Ｎ－ａｃｅｔｙｌｍｕｒａｍｙｌ－Ｌ－ｔｈｒｅｏｎｙｌ－Ｄ－ｉｓｏｇｌｕｔａｍｉｎｅ）（「ｔｈｒ－ＭＤＰ」）、Ｎ－アセチル－ノルムラミル－Ｌ－アラニル－Ｄ－イソグルタミン（Ｎ－ａｃｅｔｙｌ－ｎｏｒｍｕｒａｍｙｌ－Ｌ－ａｌａｎｙｌ－Ｄ－ｉｓｏｇｌｕｔａｍｉｎｅ）（ｎｏｒ－ＭＤＰ）、Ｎ－アセチルグルコサミニル－Ｎ－アセチルムラミル－Ｌ－Ａｌ－Ｄ－イソグル－Ｌ－Ａｌａ－ジパルミトキシプロピルアミド（Ｎ－ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｓａｍｉｎｙｌ－Ｎ－ａｃｅｔｙｌｍｕｒａｍｙｌ－Ｌ－Ａｌ－Ｄ－ｉｓｏｇｌｕ－Ｌ－Ａｌａ－ｄｉｐａｌｍｉｔｏｘｙ ｐｒｏｐｙｌａｍｉｄｅ）（「ＤＴＰ－ＤＰＰ」または「Ｔｈｅｒａｍｉｄｅ（商標）」）、Ｎ－アセチルムラミル－Ｌ－アラニル－Ｄ－イソグルタミニル－Ｌ－アラニン－２－（１’－２’ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ヒドロキシホスホリルオキシ）－エチルアミン（Ｎ－ａｃｅｔｙｌｍｕｒａｍｙｌ－Ｌ－ａｌａｎｙｌ－Ｄ－ｉｓｏｇｌｕｔａｍｉｎｙｌ－Ｌ－ａｌａｎｉｎｅ－２－（１’－２’ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｏｘｙ）－ｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）（「ＭＴＰ－ＰＥ」）など。
【0178】
・第１のグラム陰性バクテリアから調製された外膜タンパク質プロテオソーム調製物と、第２のグラム陰性バクテリアに由来するリポ糖調製物との組合せであって、この外膜タンパク質プロテオソームとリポ糖調製物とが安定な非共有アジュバント複合体を形成する。こうした複合体は「ＩＶＸ－９０８」を含み、これはＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの外膜およびリポ多糖を含む複合体である。これらはインフルエンザワクチンに対するアジュバントとして用いられてきた［１０３］。
【0179】
・メチルイノシン５’－モノリン酸（Ｍｅｔｈｙｌ ｉｎｏｓｉｎｅ ５’－ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）（「ＭＩＭＰ」）［１０４］。
【0180】
・ポリヒドロキシル化ピロリジジン化合物［１０５］、たとえば次の式を有するものなど：
【0181】
【化1】
【0182】
・ガンマイヌリン［１０６］またはその誘導体、たとえばアルガムリン（ａｌｇａｍｍｕｌｉｎ）など。
【0183】
・ＣＤ１ｄリガンド、たとえばα－ガラクトシルセラミドなど。
【0184】
・ポリオキシドニウム（ｐｏｌｙｏｘｉｄｏｎｉｕｍ）ポリマー［１０７、１０８］またはその他のＮ－酸化ポリエチレン－ピペラジン誘導体。
【0185】
これらおよびその他のアジュバント活性物質について、参考文献１１２および１１３においてより詳細に考察されている。
【0186】
組成物は２つまたはそれ以上の上記アジュバントを含んでもよい。たとえば、組成物は有利には水中油型エマルジョンおよびサイトカイン誘導剤の両方を含んでもよい。なぜならこの組合せによって、インフルエンザワクチンによって誘出されるサイトカイン応答、たとえばインターフェロンγ応答などが改善するからであり、その改善はエマルジョンまたは薬剤のいずれかを単独で使用するときにみられるものよりもかなり大きい。
【0187】
組成物中の抗原およびアジュバントは、典型的には混合剤の中にある。
【0188】
水中油型エマルジョンアジュバント
水中油型エマルジョンは、インフルエンザウイルスワクチンのアジュバントに用いるために特に好適であることが見出されている。さまざまなこうしたエマルジョンが公知であり、それらは典型的に少なくとも１つの油と少なくとも１つの界面活性剤とを含み、それらの油および界面活性剤は生分解性（代謝性）であり、かつ生体適合性である。エマルジョン中の油の小滴は一般的に直径５μｍ未満であり、直径がミクロン以下となってもよく、こうした小さいサイズは安定なエマルジョンを提供するためのマイクロフルイダイザーによって得られる。２２０ｎｍ未満のサイズの小滴はフィルタ滅菌できるために好ましい。
水中油型エマルジョンは、インフルエンザウイルスワクチンのアジュバントに用いるために特に好適であることが見出されている。さまざまなこうしたエマルジョンが公知であり、それらは典型的に少なくとも１つの油と少なくとも１つの界面活性剤とを含み、それらの油および界面活性剤は生分解性（代謝性）であり、かつ生体適合性である。エマルジョン中の油の小滴は一般的に直径５μｍ未満であり、直径がミクロン以下となってもよく、こうした小さいサイズは安定なエマルジョンを提供するためのマイクロフルイダイザーによって得られる。２２０ｎｍ未満のサイズの小滴はフィルタ滅菌できるために好ましい。
【0189】
本発明は油、たとえば動物（魚など）または植物供給源からの油とともに用いられてもよい。植物油の供給源はナッツ、種子および穀物を含む。ピーナッツ油、大豆油、ココナッツ油、およびオリーブ油は、最も一般的に入手可能なナッツ油の例示である。たとえばホホバ豆から得られるホホバ油が用いられてもよい。種子油は、ベニバナ油、綿実油、ヒマワリ油、ゴマ油などを含む。穀物群のうちではトウモロコシ油が最も容易に入手可能であるが、他の穀類、たとえば小麦、オート麦、ライ麦、米、テフ、ライコムギなどの油が使用されてもよい。グリセロールと１，２－プロパンジオールとの６～１０炭素脂肪酸エステルは、種子油では自然発生しないが、ナッツおよび種子油から出発する適切な材料の加水分解、分離およびエステル化によって調製されてもよい。哺乳動物の乳からの脂肪および油は代謝性であるため、本発明の実施において用いられてもよい。動物供給源から純粋な油を得るために必要な、分離、精製、ケン化およびその他の手段のための手順は当該技術分野において周知である。ほとんどの魚は、容易に回収され得る代謝性の油を含有する。たとえば、タラ肝油、サメ肝油、および鯨ロウなどの鯨油は、本明細書において用いられ得る魚油のいくつかの例示である。いくつかの分岐鎖油は５炭素イソプレン構造単位で生化学的に合成されて、一般的にテルペノイドと呼ばれる。サメ肝油は、本明細書において特に好ましいスクアレン、２，６，１０，１５，１９，２３－ヘキサメチル－２，６，１０，１４，１８，２２－テトラコサヘキサエンとして公知の分岐鎖不飽和テルペノイドを含有する。スクアレンの飽和類似体であるスクアランも好ましい油である。スクアレンおよびスクアランを含む魚油は、商業的供給源から容易に入手可能であるし、当該技術分野において公知の方法によって得られてもよい。その他の好ましい油はトコフェロールである（下記を参照）。油の混合物が用いられてもよい。
【0190】
界面活性剤は、その「ＨＬＢ」（親水／親油平衡（ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｅ／ｌｉｐｏｐｈｉｌｅ ｂａｌａｎｃｅ））によって分類できる。本発明の好ましい界面活性剤のＨＬＢは少なくとも１０、好ましくは少なくとも１５、より好ましくは少なくとも１６である。本発明は、以下を含むがそれらに限定されない界面活性剤とともに用いられ得る：ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（通常はツインと呼ばれる）、特にポリソルベート２０およびポリソルベート８０；酸化エチレン（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｏｘｉｄｅ：ＥＯ）、酸化プロピレン（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｏｘｉｄｅ：ＰＯ）および／または酸化ブチレン（ｂｕｔｙｌｅｎｅ ｏｘｉｄｅ：ＢＯ）のコポリマー、ＤＯＷＦＡＸ（商標）の商品名で販売される、たとえば直鎖ＥＯ／ＰＯブロックコポリマーなど；オクトキシノール、反復するエトキシ（オキシ－１，２－エタンジイル（ｅｔｈａｎｅｄｉｙｌ））基の数が変動可能であり、オクトキシノール－９（トリトンＸ－１００、またはｔ－オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）は特に興味深い；（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ－６３０／ＮＰ－４０）；リン脂質、たとえばホスファチジルコリン（レシチン）など；ノニルフェノールエトキシレート、たとえばＴｅｒｇｉｔｏｌ（商標）ＮＰシリーズなど；ラウリルアルコール、セチルアルコール、ステアリルアルコール、およびオレイルアルコールに由来するポリオキシエチレン脂肪エーテル（ブリッジ（Ｂｒｉｊ）界面活性剤として公知）、たとえばトリエチレングリコールモノラウリルエーテル（ブリッジ３０）など；ならびにソルビタンエステル（通常スパン（ＳＰＡＮ）として公知）、たとえばソルビタントリオレアート（スパン８５）およびソルビタンモノラウレートなど。非イオン性界面活性剤が好ましい。エマルジョンに含ませるための好ましい界面活性剤は、ツイン８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート）、スパン８５（ソルビタントリオレアート）、レシチンおよびトリトンＸ－１００である。
【0191】
界面活性剤の混合物、たとえばツイン８０／スパン８５混合物などを用いることができる。ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート（ツイン８０）などのポリオキシエチレンソルビタンエステルと、ｔ－オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（トリトンＸ－１００）などのオクトキシノールとの組合せも好適である。別の有用な組合せは、ラウレス９と、ポリオキシエチレンソルビタンエステルおよび／またはオクトキシノールとを含む。
【0192】
界面活性剤の好ましい量（重量％）は次のとおりである：ポリオキシエチレンソルビタンエステル（ツイン８０など）が０．０１％から１％、特に約０．１％；オクチル－またはノニルフェノキシポリオキシエタノール（トリトンＸ－１００、または他のトリトンシリーズの界面活性剤など）が０．００１％から０．１％、特に０．００５％から０．０２％；ポリオキシエチレンエーテル（ラウレス９など）が０．１％から２０％、好ましくは０．１％から１０％、特に０．１％から１％または約０．５％。
【0193】
本発明とともに有用な特定の水中油型エマルジョンアジュバントは以下を含むが、それらに限定されない：
・スクアレン、ツイン８０およびスパン８５のミクロン以下のエマルジョン。体積によるエマルジョンの組成は、約５％のスクアレン、約０．５％のポリソルベート８０、および約０．５％のスパン８５であってもよい。重量でいうと、これらの比率は４．３％のスクアレン、０．５％のポリソルベート８０、および０．４８％のスパン８５となる。このアジュバントは「ＭＦ５９」として公知であり［１０９－１１０、１１１］、参考文献１１２の第１０章および参考文献１１３の第１２章により詳細に記載されている。ＭＦ５９エマルジョンは、有利にはクエン酸イオン、たとえば１０ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液などを含む。
・スクアレン、ツイン８０およびスパン８５のミクロン以下のエマルジョン。体積によるエマルジョンの組成は、約５％のスクアレン、約０．５％のポリソルベート８０、および約０．５％のスパン８５であってもよい。重量でいうと、これらの比率は４．３％のスクアレン、０．５％のポリソルベート８０、および０．４８％のスパン８５となる。このアジュバントは「ＭＦ５９」として公知であり［１０９－１１０、１１１］、参考文献１１２の第１０章および参考文献１１３の第１２章により詳細に記載されている。ＭＦ５９エマルジョンは、有利にはクエン酸イオン、たとえば１０ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液などを含む。
【0194】
・スクアレン、トコフェロール、およびツイン８０のエマルジョン。このエマルジョンはリン酸緩衝食塩水を含んでもよい。このエマルジョンはスパン８５（例、１％）および／またはレシチンも含んでもよい。これらのエマルジョンは、２％から１０％のスクアレンと、２％から１０％のトコフェロールと、０．３％から３％のツイン８０とを有してもよく、より安定なエマルジョンを提供するために、スクアレン：トコフェロールの重量比は好ましくは≦１である。スクアレンおよびツイン８０は、約５：２の体積比で存在してもよい。こうしたエマルジョンの１つは、ツイン８０をＰＢＳに溶解して２％溶液を与え、次いでこの溶液９０ｍｌを（５ｇのＤＬ－α－トコフェロールおよび５ｍｌのスクアレン）の混合物と混合し、次いで混合物をマイクロ流動化する（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｓｉｎｇ）ことによって作成できる。その結果得られるエマルジョンはミクロン以下の油小滴を有してもよく、たとえばその小滴の平均直径は１００ｎｍから２５０ｎｍ、好ましくは約１８０ｎｍであってもよい。
【0195】
・スクアレン、トコフェロール、およびトリトン界面活性剤（例、トリトンＸ－１００）のエマルジョン。このエマルジョンは３ｄ－ＭＰＬ（下記を参照）も含んでもよい。このエマルジョンはリン酸緩衝液を含有してもよい。
【0196】
・ポリソルベート（例、ポリソルベート８０）、トリトン界面活性剤（例、トリトンＸ－１００）、およびトコフェロール（例、α－トコフェロールコハク酸塩）を含むエマルジョン。このエマルジョンは、これら３つの成分を質量比約７５：１１：１０（例、７５０μｇ／ｍｌのポリソルベート８０、１１０μｇ／ｍｌのトリトンＸ－１００、および１００μｇ／ｍｌのα－トコフェロールコハク酸塩）で含んでもよく、これらの濃度には抗原からのこれらの成分の何らかの寄与が含まれるべきである。このエマルジョンはスクアレンも含んでもよい。このエマルジョンは３ｄ－ＭＰＬ（下記を参照）も含んでもよい。水相はリン酸緩衝液を含有してもよい。
【0197】
・スクアラン、ポリソルベート８０、およびポロキサマー４０１（「Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商標）Ｌ１２１」）のエマルジョン。このエマルジョンはｐＨ７．４のリン酸緩衝食塩水において調合できる。このエマルジョンはムラミルジペプチドに対する有用な送達ビヒクルであり、「ＳＡＦ－１」アジュバントにおいてスレオニル－ＭＤＰとともに用いられている［１１４］（０．０５～１％のＴｈｒ－ＭＤＰ、５％のスクアラン、２．５％のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｌ１２１および０．２％のポリソルベート８０）。「ＡＦ」アジュバントのように、Ｔｈｒ－ＭＤＰなしで用いることもできる［１１５］（５％のスクアラン、１．２５％のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｌ１２１および０．２％のポリソルベート８０）。マイクロ流動化が好ましい。
【0198】
・スクアレン、水性溶剤、ポリオキシエチレンアルキルエーテル親水性非イオン性界面活性剤（例、ポリオキシエチレン（１２）セトステアリルエーテル）、および疎水性非イオン性界面活性剤（例、ソルビタンエステルまたはマンニド（ｍａｎｎｉｄｅ）エステル、たとえばソルビタンモノオレアートまたは「スパン８０」など）を含むエマルジョン。このエマルジョンは好ましくは熱可逆性であり、および／または油小滴の少なくとも９０％（体積で）が２００ｎｍ未満のサイズである［１１６］。このエマルジョンはさらに、以下のうち１つまたはそれ以上を含んでもよい：アルジトール；凍結防止剤（例、糖、たとえばドデシルマルトシドおよび／またはスクロースなど）；および／またはアルキルポリグリコシド。こうしたエマルジョンは凍結乾燥されてもよい。
【0199】
・スクアレン、ポロキサマー１０５、およびＡｂｉｌ－Ｃａｒｅのエマルジョン［１１７］。補助されるワクチンにおけるこれらの成分の最終濃度（重量）は、５％のスクアレン、４％のポロキサマー１０５（ｐｌｕｒｏｎｉｃポリオール）、および２％のＡｂｉｌ－Ｃａｒｅ８５（Ｂｉｓ－ＰＥＧ／ＰＰＧ－１６／１６ ＰＥＧ／ＰＰＧ－１６／１６ジメチコーン；カプリル酸／カプリン酸トリグリセリド）である。
【0200】
・０．５～５０％の油と、０．１～１０％のリン脂質と、０．０５～５％の非イオン性界面活性剤とを有するエマルジョン。参考文献１１８に記載されるとおり、好ましいリン脂質成分は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、スフィンゴミエリン、およびカルジオリピンである。ミクロン以下の小滴サイズが有利である。
【0201】
・非代謝性の油（軽油など）と、少なくとも１つの界面活性剤（レシチン、ツイン８０またはスパン８０など）とのミクロン以下の水中油型エマルジョン。添加剤、たとえばＱｕｉｌＡサポニン、コレステロール、サポニン親油性結合体（たとえば参考文献１１９に記載されるＧＰＩ－０１００など、これは脂肪族アミンをグルクロン酸のカルボキシル基を介してデサシルサポニン（ｄｅｓａｃｙｌｓａｐｏｎｉｎ）に加えることによって生成される）、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド、および／またはＮ，Ｎ－ジオクタデシル－Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）プロパンジアミンなどが含まれてもよい。
【0202】
・鉱油、非イオン性親油性エトキシ化脂肪アルコール、および非イオン性親水性界面活性剤（例、エトキシ化脂肪アルコールおよび／またはポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレンブロックコポリマー）を含むエマルジョン[１２０]。
【0203】
・鉱油、非イオン性親水性エトキシ化脂肪アルコール、および非イオン性親油性界面活性剤（例、エトキシ化脂肪アルコールおよび／またはポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレンブロックコポリマー）を含むエマルジョン[１２０]。
【0204】
・サポニン（例、ＱｕｉｌＡまたはＱＳ２１）およびステロール（例、コレステロール）がらせん状のミセルとして結合しているエマルジョン[１２１]。
【0205】
エマルジョンは、送達の時に即座に抗原と混合されてもよい。すなわち、アジュバントと抗原とは、包装または分配されたワクチン中に別個に保存されて、使用時にすぐ最終調合物になるようにされていてもよい。一般的に抗原は水性の形であることによって、最終的に２つの液体を混合することによってワクチンが調製される。混合のための２つの液体の体積比は変動し得る（例、５：１から１：５）が、一般的には約１：１である。
【0206】
抗原とアジュバントとが混合された後、赤血球凝集素抗原は一般的に水溶液中に残るが、油／水界面の周囲に配されてもよい。一般的に、赤血球凝集素がエマルジョンの油相に入ったとしてもごくわずかである。
【0207】
組成物がトコフェロールを含むとき、α、β、γ、δ、εまたはζトコフェロールのいずれが用いられてもよいが、α－トコフェロールが好ましい。トコフェロールは、たとえば異なる塩および／または異性体などのいくつかの形を取り得る。塩は有機塩、たとえばコハク酸塩、酢酸塩、ニコチン酸塩などを含む。Ｄ－α－トコフェロールおよびＤＬ－α－トコフェロールのどちらも使用できる。トコフェロールは有利には、高齢の患者（例、６０歳またはそれ以上の年齢）における使用のためのワクチンに含まれる。なぜなら、ビタミンＥはこうした患者群における免疫応答に正の効果を有することが報告されているからである[１２２]。トコフェロールは酸化防止特性も有するため、エマルジョンの安定化を助けてもよい[１２３]。好ましいα－トコフェロールはＤＬ－α－トコフェロールであり、このトコフェロールの好ましい塩はコハク酸塩である。コハク酸塩はインビボにおいてＴＮＦ関連リガンドと協働することが見出されている。さらに、α－トコフェロールコハク酸塩はインフルエンザワクチンに適合し、水銀化合物の代替物として有用な防腐剤となることが公知である［５９］。
【0208】
サイトカイン誘導剤
本発明の組成物に含ませるためのサイトカイン誘導剤は、患者に投与されるときに免疫系を誘出して、インターフェロンおよびインターロイキンを含むサイトカインを放出させることができる。サイトカイン応答は、インフルエンザ感染に対する宿主の防御の初期の決定的な段階に伴うことが公知である［１２４］。好ましい薬剤は、以下のうち１つまたはそれ以上の放出を誘出できる：インターフェロン－γ；インターロイキン－１；インターロイキン－２；インターロイキン－１２；ＴＮＦ－α；ＴＮＦ－β；およびＧＭ－ＣＳＦ。好ましい薬剤は、Ｔｈ１型免疫応答、たとえばインターフェロン－γ、ＴＮＦ－α、インターロイキン－２などに関連するサイトカインの放出を誘出する。インターフェロン－γおよびインターロイキン－２の両方の刺激が好ましい。
本発明の組成物に含ませるためのサイトカイン誘導剤は、患者に投与されるときに免疫系を誘出して、インターフェロンおよびインターロイキンを含むサイトカインを放出させることができる。サイトカイン応答は、インフルエンザ感染に対する宿主の防御の初期の決定的な段階に伴うことが公知である［１２４］。好ましい薬剤は、以下のうち１つまたはそれ以上の放出を誘出できる：インターフェロン－γ；インターロイキン－１；インターロイキン－２；インターロイキン－１２；ＴＮＦ－α；ＴＮＦ－β；およびＧＭ－ＣＳＦ。好ましい薬剤は、Ｔｈ１型免疫応答、たとえばインターフェロン－γ、ＴＮＦ－α、インターロイキン－２などに関連するサイトカインの放出を誘出する。インターフェロン－γおよびインターロイキン－２の両方の刺激が好ましい。
【0209】
したがって、本発明の組成物を受けた結果として、患者のＴ細胞は、インフルエンザ抗原によって刺激されたときに、抗原特異的な態様で所望のサイトカインを放出する。たとえば、それらの患者の血液から精製されたＴ細胞は、インビトロでインフルエンザウイルス赤血球凝集素に露出されたときにγ－インターフェロンを放出する。末梢血単核細胞（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌｓ：ＰＢＭＣ）におけるこうした応答を測定するための方法は当該技術分野において公知であり、ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＳＰＯＴ、フローサイトメトリおよびリアルタイムＰＣＲを含む。たとえば、参考文献１２５が報告する研究においては、破傷風トキソイドに対する抗原特異的Ｔ細胞媒介免疫応答、特にγ－インターフェロン応答がモニタされ、ＥＬＩＳＰＯＴは抗原特異的ＴＴ誘導応答を自然応答と区別するための最も高感度の方法であるが、フローサイトメトリによる細胞質内のサイトカイン検出は再刺激効果を検出するための最も効率のよい方法であることが見出された。
【0210】
好適なサイトカイン誘導剤は、以下を含むがそれらに限定されない：
・免疫刺激性オリゴヌクレオチド、たとえばＣｐＧモチーフ（リン酸結合によってグアノシンに接続されるメチル化されていないシトシンを含有するジヌクレオチド配列）を含有するものなど、または２本鎖ＲＮＡ、またはパリンドローム配列を含有するオリゴヌクレオチド、またはポリ（ｄＧ）配列を含有するオリゴヌクレオチド。
・免疫刺激性オリゴヌクレオチド、たとえばＣｐＧモチーフ（リン酸結合によってグアノシンに接続されるメチル化されていないシトシンを含有するジヌクレオチド配列）を含有するものなど、または２本鎖ＲＮＡ、またはパリンドローム配列を含有するオリゴヌクレオチド、またはポリ（ｄＧ）配列を含有するオリゴヌクレオチド。
【0211】
・３－Ｏ－脱アシル化モノホスホリル脂質Ａ（３－Ｏ－ｄｅａｃｙｌａｔｅｄ ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ ｌｉｐｉｄ Ａ：「３ｄＭＰＬ」、「ＭＰＬ(商標)」としても公知）[１２６－１２７、１２８、１２９]。
【0212】
・イミダゾキノリン化合物、たとえばイミキモド（「Ｒ－８３７」）[１３０、１３１]、レシキモド（「Ｒ－８４８」）[１３２]、およびそれらの類似体；ならびにそれらの塩（例、塩酸塩）。免疫刺激性イミダゾキノリンに関するさらなる詳細は、参考文献１３３から１３４、１３５、１３６、１３７に見出される。
【0213】
・チオセミカルバゾン化合物、たとえば参考文献１３８に開示されるものなど。活性化合物に対する調合、製造およびスクリーニングの方法も参考文献１３８に記載されている。チオセミカルバゾンは、たとえばＴＮＦ－αなどのサイトカインの生成のためのヒト末梢血単核細胞の刺激に特に有効である。
【0214】
・トリプタントリン化合物、たとえば参考文献１３９に開示されるものなど。活性化合物に対する調合、製造およびスクリーニングの方法も参考文献１３９に記載されている。チオセミカルバゾンは、たとえばＴＮＦ－αなどのサイトカインの生成のためのヒト末梢血単核細胞の刺激に特に有効である。
【0215】
・ヌクレオシド類似体、たとえば：（ａ）イサトラビン（Ｉｓａｔｏｒａｂｉｎｅ）（ＡＮＡ－２４５；７－チア－８－オキソグアノシン）：
【0216】
【化2】
【0217】
【化3】
Ｒ３は不在、Ｈ、Ｃ１－６アルキル、置換されたＣ１－６アルキル、Ｃ６－１０アリール、置換されたＣ６－１０アリール、ヘテロシクリル、または置換されたヘテロシクリルであり；
Ｒ４およびＲ５の各々は独立に、Ｈ、ハロ、ヘテロシクリル、置換されたヘテロシクリル、－Ｃ（Ｏ）－Ｒｄ、Ｃ１－６アルキル、置換されたＣ１－６アルキルであるか、またはともに結合して次のＲ４－５のように５員環を形成し：
【0218】
【化4】
【0219】
【化5】
Ｘ１およびＸ２の各々は独立に、Ｎ、Ｃ、Ｏ、またはＳであり；
Ｒ８は、Ｈ、ハロ、－ＯＨ、Ｃ１－６アルキル、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ２－６アルキニル、－ＯＨ、－ＮＲａＲｂ、－（ＣＨ２）ｎ－Ｏ－Ｒｃ、－Ｏ－（Ｃ１－６アルキル）、－Ｓ（Ｏ）ｐＲｅ、または－Ｃ（Ｏ）－Ｒｄであり；
Ｒ９は、Ｈ、Ｃ１－６アルキル、置換されたＣ１－６アルキル、ヘテロシクリル、置換されたヘテロシクリル、またはＲ９ａであり、
ここでＲ９ａは次のとおりであり：
【0220】
【化6】
【0221】
【化7】
Ｒ１０およびＲ１１の各々は独立に、Ｈ、ハロ、Ｃ１－６アルコキシ、置換されたＣ１－６アルコキシ、－ＮＲａＲｂ、または－ＯＨであり；
ＲａおよびＲｂの各々は独立に、Ｈ、Ｃ１－６アルキル、置換されたＣ１－６アルキル、－Ｃ（Ｏ）Ｒｄ、Ｃ６－１０アリールであり；
各Ｒｃは独立に、Ｈ、リン酸、二リン酸、三リン酸、Ｃ１－６アルキル、または置換されたＣ１－６アルキルであり；
各Ｒｄは独立に、Ｈ、ハロ、Ｃ１－６アルキル、置換されたＣ１－６アルキル、Ｃ１－６アルコキシ、置換されたＣ１－６アルコキシ、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｃ１－６アルキル）、－ＮＨ（置換されたＣ１－６アルキル）、－Ｎ（Ｃ１－６アルキル）２、－Ｎ（置換されたＣ１－６アルキル）２、Ｃ６－１０アリール、またはヘテロシクリルであり；
各Ｒｅは独立に、Ｈ、Ｃ１－６アルキル、置換されたＣ１－６アルキル、Ｃ６－１０アリール、置換されたＣ６－１０アリール、ヘテロシクリル、または置換されたヘテロシクリルであり；
各Ｒｆは独立に、Ｈ、Ｃ１－６アルキル、置換されたＣ１－６アルキル、－Ｃ（Ｏ）Ｒｄ、リン酸、二リン酸、または三リン酸であり；
各ｎは独立に、０、１、２、または３であり；
各ｐは独立に、０、１、または２であり；または
（ｇ）（ａ）から（ｆ）のいずれかの医薬的に許容できる塩、（ａ）から（ｆ）のいずれかの互変異性体、またはその互変異性体の医薬的に許容できる塩。
【0222】
・ロキソリビン（７－アリル－８－オキソグアノシン）[１４３]。
【0223】
・以下を含む、参考文献１４４に開示される化合物：アシルピペラジン（Ａｃｙｌｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ）化合物、インドールジオン（Ｉｎｄｏｌｅｄｉｏｎｅ）化合物、テトラヒドライソキノリン（Ｔｅｔｒａｈｙｄｒａｉｓｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ：ＴＨＩＱ）化合物、ベンゾシクロジオン（Ｂｅｎｚｏｃｙｃｌｏｄｉｏｎｅ）化合物、アミノアザビニル（Ａｍｉｎｏａｚａｖｉｎｙｌ）化合物、アミノベンズイミダゾールキノリノン（Ａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｍｉｄａｚｏｌｅ ｑｕｉｎｏｌｉｎｏｎｅ：ＡＢＩＱ）化合物［１４５、１４６］、ヒドラプタルアミド（Ｈｙｄｒａｐｔｈａｌａｍｉｄｅ）化合物、ベンゾフェノン（Ｂｅｎｚｏｐｈｅｎｏｎｅ）化合物、イソキサゾール化合物、ステロール化合物、キナジリノン(Ｑｕｉｎａｚｉｌｉｎｏｎｅ)化合物、ピロール化合物［１４７］、アントラキノン化合物、キノキサリン化合物、トリアジン化合物、ピラザロピリミジン（Ｐｙｒａｚａｌｏｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ）化合物、およびベンザゾール化合物[１４８]。
【0224】
・参考文献１４９に開示される化合物。
【0225】
・アミノアルキルグルコサミニドリン酸塩の誘導体、たとえばＲＣ－５２９など[１５
０、１５１]。
０、１５１]。
【0226】
・ホスファゼン、たとえば参考文献１５２および１５３などに記載されるポリ[ジ（カルボキシラトフェノキシ）ホスファゼン]（ｐｏｌｙ[ｄｉ（ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｏｐｈｅｎｏｘｙ）ｐｈｏｓｐｈａｚｅｎｅ]：「ＰＣＰＰ」）など。
【0227】
・低分子免疫賦活剤（Ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｉｍｍｕｎｏｐｏｔｅｎｔｉａｔｏｒｓ：ＳＭＩＰｓ）、たとえば次のものなど：
Ｎ２－メチル－１－（２－メチルプロピル）－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－２，４－ジアミン
Ｎ２，Ｎ２－ジメチル－１－（２－メチルプロピル）－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－２，４－ジアミン
Ｎ２－エチル－Ｎ２－メチル－１－（２－メチルプロピル）－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－２，４－ジアミン
Ｎ２－メチル－１－（２－メチルプロピル）－Ｎ２－プロピル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－２，４－ジアミン
１－（２－メチルプロピル）－Ｎ２－プロピル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－２，４－ジアミン
Ｎ２－ブチル－１－（２－メチルプロピル）－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－２，４－ジアミン
Ｎ２－ブチル－Ｎ２－メチル－１－（２－メチルプロピル）－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－２，４－ジアミン
Ｎ２－メチル－１－（２－メチルプロピル）－Ｎ２－ペンチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－２，４－ジアミン
Ｎ２－メチル－１－（２－メチルプロピル）－Ｎ２－プロプ－２－エニル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－２，４－ジアミン
１－（２－メチルプロピル）－２－［（フェニルメチル）チオ］－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－４－アミン
１－（２－メチルプロピル）－２－（プロピルチオ）－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－４－アミン
２－［［４－アミノ－１－（２－メチルプロピル）－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－２－イル］（メチル）アミノ］エタノール
２－［［４－アミノ－１－（２－メチルプロピル）－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－２－イル］（メチル）アミノ］酢酸エチル
４－アミノ－１－（２－メチルプロピル）－１，３－ジヒドロ－２Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－２－オン
Ｎ２－ブチル－１－（２－メチルプロピル）－Ｎ４，Ｎ４－ビス（フェニルメチル）－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－２，４－ジアミン
Ｎ２－ブチル－Ｎ２－メチル－１－（２－メチルプロピル）－Ｎ４，Ｎ４－ビス（フェニルメチル）－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－２，４－ジアミン
Ｎ２－メチル－１－（２－メチルプロピル）－Ｎ４，Ｎ４－ビス（フェニルメチル）－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－２，４－ジアミン
Ｎ２，Ｎ２－ジメチル－１－（２－メチルプロピル）－Ｎ４，Ｎ４－ビス（フェニルメチル）－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－２，４－ジアミン
１－｛４－アミノ－２－［メチル（プロピル）アミノ］－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル｝－２－メチルプロパン－２－オール １－［４－アミノ－２－（プロピルアミノ）－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル］－２－メチルプロパン－２－オール
Ｎ４，Ｎ４－ジベンジル－１－（２－メトキシ－２－メチルプロピル）－Ｎ２－プロピル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－２，４－ジアミン。
Ｎ２－メチル－１－（２－メチルプロピル）－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－２，４－ジアミン
Ｎ２，Ｎ２－ジメチル－１－（２－メチルプロピル）－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－２，４－ジアミン
Ｎ２－エチル－Ｎ２－メチル－１－（２－メチルプロピル）－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－２，４－ジアミン
Ｎ２－メチル－１－（２－メチルプロピル）－Ｎ２－プロピル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－２，４－ジアミン
１－（２－メチルプロピル）－Ｎ２－プロピル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－２，４－ジアミン
Ｎ２－ブチル－１－（２－メチルプロピル）－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－２，４－ジアミン
Ｎ２－ブチル－Ｎ２－メチル－１－（２－メチルプロピル）－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－２，４－ジアミン
Ｎ２－メチル－１－（２－メチルプロピル）－Ｎ２－ペンチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－２，４－ジアミン
Ｎ２－メチル－１－（２－メチルプロピル）－Ｎ２－プロプ－２－エニル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－２，４－ジアミン
１－（２－メチルプロピル）－２－［（フェニルメチル）チオ］－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－４－アミン
１－（２－メチルプロピル）－２－（プロピルチオ）－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－４－アミン
２－［［４－アミノ－１－（２－メチルプロピル）－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－２－イル］（メチル）アミノ］エタノール
２－［［４－アミノ－１－（２－メチルプロピル）－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－２－イル］（メチル）アミノ］酢酸エチル
４－アミノ－１－（２－メチルプロピル）－１，３－ジヒドロ－２Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－２－オン
Ｎ２－ブチル－１－（２－メチルプロピル）－Ｎ４，Ｎ４－ビス（フェニルメチル）－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－２，４－ジアミン
Ｎ２－ブチル－Ｎ２－メチル－１－（２－メチルプロピル）－Ｎ４，Ｎ４－ビス（フェニルメチル）－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－２，４－ジアミン
Ｎ２－メチル－１－（２－メチルプロピル）－Ｎ４，Ｎ４－ビス（フェニルメチル）－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－２，４－ジアミン
Ｎ２，Ｎ２－ジメチル－１－（２－メチルプロピル）－Ｎ４，Ｎ４－ビス（フェニルメチル）－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－２，４－ジアミン
１－｛４－アミノ－２－［メチル（プロピル）アミノ］－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル｝－２－メチルプロパン－２－オール １－［４－アミノ－２－（プロピルアミノ）－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－１－イル］－２－メチルプロパン－２－オール
Ｎ４，Ｎ４－ジベンジル－１－（２－メトキシ－２－メチルプロピル）－Ｎ２－プロピル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－２，４－ジアミン。
【0228】
本発明において用いるためのサイトカイン誘導剤は、トル様受容体（Ｔｏｌｌ－Ｌｉｋｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：ＴＬＲ）のモジュレータおよび／またはアゴニストであってもよい。たとえば、それらのサイトカイン誘導剤は、ヒトＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、および／またはＴＬＲ９タンパク質の１つまたはそれ以上のアゴニストであってもよい。好ましい薬剤は、ＴＬＲ７（例、イミダゾキノリン）および／またはＴＬＲ９（例、ＣｐＧオリゴヌクレオチド）のアゴニストである。これらの薬剤は、内在的な免疫経路を活性化するために有用である。
【0229】
サイトカイン誘導剤は、組成物の生成の際のさまざまな段階において組成物に加えられてもよい。たとえば、サイトカイン誘導剤は抗原組成物内にあってもよく、次いでこの混合物が水中油型エマルジョンに加えられてもよい。代替的には、サイトカイン誘導剤は水中油型エマルジョン内にあってもよく、この場合には薬剤を乳化前にエマルジョン成分に加えても、乳化後にエマルジョンに加えてもよい。同様に、薬剤はエマルジョン小滴内にコアセルベートされてもよい。最終組成物内のサイトカイン誘導剤の場所および分布は、サイトカイン誘導剤の親水／親油特性に依存し、たとえば薬剤は水相、油相、および／または油－水界面に位置してもよい。
【0230】
サイトカイン誘導剤は、たとえば抗原（例、ＣＲＭ１９７）などの別個の薬剤に結合されてもよい。低分子に対する結合技術の一般的な概説は参考文献１５４に与えられている。代替的に、アジュバントは、たとえば疎水性またはイオン性相互作用などによって、付加的な薬剤に非共有的に関連付けられてもよい。
【0231】
２つの好ましいサイトカイン誘導剤は、（ａ）免疫刺激オリゴヌクレオチドおよび（ｂ）３ｄＭＰＬである。免疫刺激オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオアート修飾などのヌクレオチド修飾／類似体を含んでもよく、２本鎖であっても（ＲＮＡを除いて）１本鎖であってもよい。参考文献１５５、１５６および１５７は、可能な類似体置換、たとえば２’－デオキシ－７－デアザグアノシンによるグアノシンの置換などを開示する。参考文献１５８－１５９、１６０、１６１、１６２、１６３では、ＣｐＧオリゴヌクレオチドのアジュバント効果がさらに考察されている。ＣｐＧ配列はＴＬＲ９、たとえばモチーフＧＴＣＧＴＴまたはＴＴＣＧＴＴなどに向けられていてもよい［１６４］。ＣｐＧ配列はＴｈ１免疫応答を誘導するために特異的なもの、たとえばＣｐＧ－Ａ ＯＤＮ（オリゴデオキシヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ））などであってもよいし、Ｂ細胞応答を誘導するためにより特異的なもの、たとえばＣｐＧ－Ｂ ＯＤＮなどであってもよい。ＣｐＧ－Ａ ＯＤＮおよびＣｐＧ－Ｂ ＯＤＮは参考文献１６５－１６６、１６７において考察されている。好ましくはＣｐＧはＣｐＧ－Ａ ＯＤＮである。好ましくは、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは５’末端が受容体認識のために接近可能になるよう構成されている。任意には、２つのＣｐＧオリゴヌクレオチド配列の３’末端同士が付着して「イムノマー」を形成してもよい。たとえば参考文献１６４および１６８－１６９、１７０を参照されたい。有用なＣｐＧアジュバントはＣｐＧ７９０９であり、これはＰｒｏＭｕｎｅ（商標）（Ｃｏｌｅｙ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．）としても公知である。
【0232】
ＣｐＧ配列の使用の代替案として、またはそれに加えて、ＴｐＧ配列が用いられてもよい［１７１］。これらのオリゴヌクレオチドは非メチル化ＣｐＧモチーフを含まなくてもよい。
【0233】
免疫刺激オリゴヌクレオチドはピリミジンに富んでいてもよい。たとえば、免疫刺激オリゴヌクレオチドは２つ以上の連続的なチミジンヌクレオチド（例、ＴＴＴＴ、参考文献１７１に開示されるとおり）を含んでもよく、および／または＞２５％のチミジン（例、＞３５％、＞４０％、＞５０％、＞６０％、＞８０％など）を有するヌクレオチド組成を有してもよい。たとえば、免疫刺激オリゴヌクレオチドは２つ以上の連続的なシトシンヌクレオチド（例、ＣＣＣＣ、参考文献１７１に開示されるとおり）を含んでもよく、および／または＞２５％のシトシン（例、＞３５％、＞４０％、＞５０％、＞６０％、＞８０％など）を有するヌクレオチド組成を有してもよい。これらのオリゴヌクレオチドは非メチル化ＣｐＧモチーフを含まなくてもよい。
【0234】
免疫刺激オリゴヌクレオチドは典型的に少なくとも２０ヌクレオチドを含む。免疫刺激オリゴヌクレオチドは１００ヌクレオチドよりも少ないヌクレオチドを含んでもよい。
【0235】
３ｄＭＰＬ（３脱－Ｏ－アシル化モノホスホリル脂質Ａまたは３－Ｏ－脱アシル－４’－モノホスホリル脂質Ａとしても公知）は、モノホスホリル脂質Ａ中の還元末端グルコサミンの位置３が脱アシル化されたアジュバントである。３ｄＭＰＬは、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｍｉｎｎｅｓｏｔａのヘプトースのない変異体から調製されており、脂質Ａと化学的に類似しているが、酸に不安定なホスホリル基と塩基に不安定なアシル基とを欠いている。３ｄＭＰＬは単球／マクロファージ系統の細胞を活性化し、ＩＬ－１、ＩＬ－１２、ＴＮＦ－αおよびＧＭ－ＣＳＦを含むいくつかのサイトカインの放出を刺激する（参考文献１７２も参照）。３ｄＭＰＬの調製は元々参考文献１７３に記載されていた。
【0236】
３ｄＭＰＬは、アシル化が異なる（例、３、４、５または６つのアシル鎖を有する、これらは異なる長さであってもよい）複数の関連分子の混合物の形を取ってもよい。２つのグルコサミン（２－デオキシ－２－アミノ－グルコースとしても公知）単糖は、その２－位置（すなわち位置２および２’）の炭素がＮアシル化されており、３’位置にはＯ－アシル化もある。炭素２に付着する基は式－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ２－ＣＲ１Ｒ１’を有する。炭素２’に付着する基は式－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ２－ＣＲ２Ｒ２’を有する。炭素３’に付着する基は式－Ｏ－ＣＯ－ＣＨ２－ＣＲ３Ｒ３’を有する。代表的な構造は次のとおりである：
【0237】
【化8】
【0238】
基Ｒ１’、Ｒ２’およびＲ３’の各々は独立に、（ａ）－Ｈ；（ｂ）－ＯＨ；または（ｃ）－Ｏ－ＣＯ－Ｒ４であってもよく、ここでＲ４は－Ｈまたは－（ＣＨ２）ｍ－ＣＨ３のいずれかであり、ここでｍの値は好ましくは８から１６、より好ましくは１０、１２または１４である。２の位置において、ｍは好ましくは１４である。２’の位置において、ｍは好ましくは１０である。３’の位置において、ｍは好ましくは１２である。よって基Ｒ１’、Ｒ２’およびＲ３’は、好ましくはドデカン酸、テトラデカン酸またはヘキサデカン酸からの－Ｏ－アシル基である。
【0239】
Ｒ１’、Ｒ２’およびＲ３’のすべてが－Ｈであるとき、３ｄＭＰＬは３つのアシル鎖のみを有する（位置２、２’および３’の各々に１つ）。Ｒ１’、Ｒ２’およびＲ３’のうち２つだけが－Ｈであるとき、３ｄＭＰＬは４つのアシル鎖を有し得る。Ｒ１’、Ｒ２’およびＲ３’のうち１つだけが－Ｈであるとき、３ｄＭＰＬは５つのアシル鎖を有し得る。Ｒ１’、Ｒ２’およびＲ３’のいずれも－Ｈではないとき、３ｄＭＰＬは６つのアシル鎖を有し得る。本発明に従って用いられる３ｄＭＰＬアジュバントは、３つから６つのアシル鎖を有するこれらの形の混合物であってもよいが、その混合物中に６つのアシル鎖を有する３ｄＭＰＬを含ませることが好ましく、特にヘキサアシル鎖形が合計３ｄＭＰＬのうち重量で少なくとも１０％、たとえば≧２０％、≧３０％、≧４０％、≧５０％、またはそれ以上を占めることを確実にすることが好ましい。６つのアシル鎖を有する３ｄＭＰＬは最もアジュバント活性の形であることが見出されている。
【0240】
よって、本発明の組成物に含ませるために最も好ましい形の３ｄＭＰＬは、下に示す式（ＩＶ）を有する。
【0241】
混合物の形の３ｄＭＰＬが用いられるとき、本発明の組成物中の３ｄＭＰＬの量または濃度に対する言及は、混合物中の組合された３ｄＭＰＬ種を示す。
【0242】
水性の条件下では、３ｄＭＰＬは、たとえば直径＜１５０ｎｍまたは＞５００ｎｍなどの異なるサイズのミセル集合体または粒子を形成できる。これらのいずれかまたは両方を本発明とともに用いることができ、ルーチンアッセイによってより良い粒子を選択できる。本発明に従った使用には、より小さな粒子（例、３ｄＭＰＬの澄んだ水性懸濁液を与えるために十分なほど小さい）の方が優れた活性を有するために好ましい［１７４］。好ましい粒子の平均直径は２２０ｎｍ未満、より好ましくは２００ｎｍ未満または１５０ｎｍ未満または１２０ｎｍ未満であり、１００ｎｍ未満の平均直径を有してもよい。しかしほとんどの場合には、平均直径が５０ｎｍよりも小さくなることはない。これらの粒子は十分に小さいため、フィルタ滅菌に対して好適である。粒子直径は、平均粒子直径を明らかにする動的光散乱のルーチン技術によって推定できる。ある粒子の直径がｘｎｍであるといわれるとき、一般的にはこの平均値に関して粒子の分布が存在するが、粒子数の少なくとも５０％（例、≧６０％、≧７０％、≧８０％、≧９０％、またはそれ以上）はｘ±２５％の範囲内の直径を有する。
【0243】
３ｄＭＰＬは、有利には水中油型エマルジョンと組合せて用いられてもよい。実質的にすべての３ｄＭＰＬがエマルジョンの水相に位置してもよい。
【0244】
３ｄＭＰＬは単独で用いられても、１つまたはそれ以上のさらなる化合物と組合せて用いられてもよい。たとえば、ＱＳ２１サポニン［１７５］（水中油型エマルジョン中に含む［１７６］）、免疫刺激オリゴヌクレオチド、ＱＳ２１および免疫刺激オリゴヌクレオチドの両方、リン酸アルミニウム［１７７］、水酸化アルミニウム［１７８］、またはリン酸アルミニウムおよび水酸化アルミニウムの両方と、３ｄＭＰＬとを組合せて用いることが公知である。
【0245】
【化9】
本発明とともに用いられ得る脂肪アジュバントは、上述の水中油型エマルジョンを含み、さらにたとえば以下のものを含む：
・式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩの化合物、またはその塩：
【0246】
【化10】
【0247】
【化11】
【0248】
・カチオン性脂質と（通常は中性の）共脂質との調合物、たとえばアミノプロピル－ジメチル－ミリストールイルオキシ（ｍｙｒｉｓｔｏｌｅｙｌｏｘｙ）－プロパナミニウムブロミド－ジフィタノイルホスファチジル－エタノールアミン（「Ｖａｘｆｅｃｔｉｎ（商標）」）またはアミノプロピル－ジメチル－ビス－ドデシルオキシ－プロパナミニウムブロミド－ジオレオイルホスファチジル－エタノールアミン（「ＧＡＰ－ＤＬＲＩＥ：ＤＯＰＥ」）など。（±）－Ｎ－（３－アミノプロピル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，３－ビス（シン－９－テトラデセネイルオキシ）－１－プロパナミニウム塩を含有する調合物が好ましい［１８２］。
【0249】
・３－Ｏ－脱アシル化モノホスホリル脂質Ａ（上記を参照）。
【0250】
・リン酸を含有する非環式バックボーンに結合した脂質を含有する化合物、たとえばＴＬＲ４拮抗薬Ｅ５５６４など［１８３、１８４］：
【0251】
【化12】
水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムとして公知のアジュバントが用いられてもよい。これらの名前は従来からのものであるが、単に便宜上用いられているだけで、どちらも実在する化学化合物を正確に説明するものではない（例、参考文献１１２の第９章を参照）。本発明は、一般的にアジュバントとして用いられるあらゆる「水酸化物」または「リン酸塩」アジュバントを用いることができる。
【0252】
「水酸化アルミニウム」として公知のアジュバントは、典型的にはオキシ水酸化アルミニウム塩であり、これは通常少なくとも部分的に結晶質である。オキシ水酸化アルミニウムは式ＡｌＯ（ＯＨ）で表わすことができ、赤外線（ｉｎｆｒａｒｅｄ：ＩＲ）分光法によって、特に１０７０ｃｍ－１における吸着帯と、３０９０～３１００ｃｍ－１における強いショルダーとの存在によって、たとえば水酸化アルミニウムＡｌ（ＯＨ）３などの他のアルミニウム化合物と区別できる［参考文献１１２の第９章］。水酸化アルミニウムアジュバントの結晶化度は、半分の高さにおける回折帯の幅（ｗｉｄｔｈ ｏｆ ｔｈｅ ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ ｂａｎｄ ａｔ ｈａｌｆ ｈｅｉｇｈｔ：ＷＨＨ）によって反映され、結晶質の少ない粒子は晶子サイズがより小さいためにより大きな線の広がりを示す。ＷＨＨが増加するに従って表面積が増加し、ＷＨＨ値が高いアジュバントほど抗原吸着に対する容量が大きいことが示されている。繊維状の形態（例、透過型電子顕微鏡写真においてみられるような）は、水酸化アルミニウムアジュバントにとって典型的である。水酸化アルミニウムアジュバントのｐＩは典型的に約１１であり、すなわちこのアジュバント自体が生理的なｐＨにおいて正の表面電荷を有する。水酸化アルミニウムアジュバントに対しては、ｐＨ７．４における１ｍｇのＡｌ＋＋＋当り１．８～２．６ｍｇのタンパク質の吸着容量が報告されている。
【0253】
「リン酸アルミニウム」として公知のアジュバントは、典型的には水酸化リン酸アルミニウムであり、しばしば少量の硫酸塩も含有する（すなわち水酸化リン酸アルミニウム硫酸塩）。このアジュバントは沈殿によって得られてもよく、沈殿の際の反応条件および濃度は、塩の中の水酸基に対するリン酸の置換の程度に影響する。一般的に、水酸化リン酸塩の有するＰＯ４／Ａｌモル比は０．３から１．２である。水酸化リン酸塩は、水酸基の存在によって厳密なＡｌＰＯ４と区別できる。たとえば、３１６４ｃｍ－１におけるＩＲスペクトル帯（例、２００℃に加熱されたとき）は、構造的水酸基の存在を示す［参考文献１１２の第９章］。
【0254】
リン酸アルミニウムアジュバントのＰＯ４／Ａｌ３＋モル比は、一般的に０．３から１．２、好ましくは０．８から１．２、より好ましくは０．９５±０．１となる。リン酸アルミニウムは一般的に、特に水酸化リン酸塩に対してはアモルファスになる。典型的なアジュバントは、０．６ｍｇのＡｌ３＋／ｍｌにて含まれる０．８４から０．９２のＰＯ４／Ａｌモル比を有するアモルファス水酸化リン酸アルミニウムである。リン酸アルミニウムは一般的に粒子状になる（例、透過型電子顕微鏡写真においてみられるプレート様の形態）。粒子の典型的な直径は、あらゆる抗原吸着後に０．５～２０μｍ（例、約５～１０μｍ）の範囲である。リン酸アルミニウムアジュバントに対しては、ｐＨ７．４における１ｍｇのＡｌ＋＋＋当り０．７～１．５ｍｇのタンパク質の吸着容量が報告されている。
【0255】
リン酸アルミニウムの電荷ゼロ点（ｐｏｉｎｔ ｏｆ ｚｅｒｏ ｃｈａｒｇｅ：ＰＺＣ）は、水酸基に対するリン酸の置換の程度に反比例し、この置換の程度は、沈殿による塩の調製に対して用いられた反応物の反応条件および濃度に依存して変動し得る。ＰＺＣは、溶液中の遊離リン酸イオンの濃度を変えるか（より多くのリン酸＝より酸性のＰＺＣ）、またはヒスチジン緩衝液などの緩衝液を加える（ＰＺＣをもっと塩基性にする）ことによっても変えられる。本発明に従って用いられるリン酸アルミニウムは、一般的に４．０から７．０、より好ましくは５．０から６．５、たとえば約５．７のＰＺＣを有する。
【0256】
本発明の組成物を調製するために用いられるアルミニウム塩の懸濁液は、緩衝液（例、リン酸またはヒスチジンまたはトリス緩衝液）を含有してもよいが、これは常に必要なものではない。この懸濁液は好ましくは滅菌されており、発熱物質を含まない。懸濁液は遊離水性リン酸イオンを含んでもよく、それはたとえば１．０ｍＭから２０ｍＭ、好ましくは５ｍＭから１５ｍＭ、より好ましくは約１０ｍＭの濃度で存在してもよい。懸濁液は塩化ナトリウムも含んでいてもよい。
【0257】
本発明は、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムの両方の混合物を用いることができる［８１］。この場合にはリン酸アルミニウムが水酸化アルミニウムよりも多く存在してもよく、たとえば少なくとも２：１、たとえば≧５：１、≧６：１、≧７：１、≧８：１、≧９：１などの重量比で存在してもよい。
【0258】
患者に投与するための組成物中のＡｌ＋＋＋の濃度は、好ましくは１０ｍｇ／ｍｌ未満、たとえば≦５ｍｇ／ｍｌ、≦４ｍｇ／ｍｌ、≦３ｍｇ／ｍｌ、≦２ｍｇ／ｍｌ、≦１ｍｇ／ｍｌなどである。好ましい範囲は０．３ｍｇ／ｍｌから１ｍｇ／ｍｌである。最大０．８５ｍｇ／用量であることが好ましい。
【0259】
１つまたはそれ以上のアルミニウム塩アジュバントを含むことに加え、アジュバント成分は１つまたはそれ以上のさらなるアジュバントまたは免疫刺激剤を含んでもよい。こうした付加的な成分は、以下を含むがそれらに限定されない：３－Ｏ－脱アシル化モノホスホリル脂質Ａアジュバント（「３ｄ－ＭＰＬ」）；および／または水中油型エマルジョン。
【0260】
ワクチン組成物の包装
本発明の組成物（またはキット成分）に対する好適な容器は、水薬瓶、注射器（例、使い捨て注射器）、点鼻スプレーなどを含む。これらの容器は滅菌されるべきである。
本発明の組成物（またはキット成分）に対する好適な容器は、水薬瓶、注射器（例、使い捨て注射器）、点鼻スプレーなどを含む。これらの容器は滅菌されるべきである。
【0261】
組成物／成分が水薬瓶に入れられるとき、その水薬瓶は好ましくはガラスまたはプラスチック材料で作られる。好ましくは、水薬瓶は組成物が加えられる前に滅菌される。ラテックス過敏性の患者に伴う問題を避けるために、水薬瓶は好ましくはラテックスを含まないストッパで密閉され、すべての包装材料にラテックスが存在しないことが好ましい。水薬瓶は単一用量のワクチンを含んでもよいし、２回以上の用量、たとえば１０用量を含んでもよい（「マルチドーズ」水薬瓶）。好ましい水薬瓶は無色のガラスで作られる。
【0262】
水薬瓶はキャップ（例、ルアーロック）を有してもよく、そのキャップは、予め充填された注射器をキャップに挿入でき、注射器の内容物を水薬瓶の中に放出でき（例、中の凍結乾燥された材料を再構成するため）、水薬瓶の内容物を注射器の中に戻すことができるように適合される。注射器は水薬瓶から取出した後に、針を取付けて組成物を患者に投与できる。キャップがシールまたはカバーの内側に位置することによって、キャップに接近可能になる前にシールまたはカバーを除去する必要があることが好ましい。特にマルチドーズ水薬瓶に対して、水薬瓶はその内容物の無菌的な除去を可能にするキャップを有してもよい。
【0263】
成分が注射器中に包装されるとき、その注射器には針が取付けられていてもよい。針が取付けられていないときには、分離された針が組立および使用のために注射器とともに供給されてもよい。こうした針は被覆されていてもよい。安全針が好ましい。１インチ２３ゲージ、１インチ２５ゲージ、および５／８インチ２５ゲージの針が典型的である。注射器には剥ぎ取り式のラベルが与えられてもよく、そのラベルには内容物のロット番号、インフルエンザシーズンおよび使用期限が印刷されることによって、記録を容易にしてもよい。注射器の中のプランジャは、吸引の際にプランジャが誤って外れることを防ぐためのストッパを有することが好ましい。注射器はラテックスゴムキャップおよび／またはプランジャを有してもよい。使い捨て注射器は単一用量のワクチンを含有する。注射器は一般的に、針の取付の前に先端を密封するための先端キャップを有し、この先端キャップは好ましくはブチルゴムでできている。注射器と針とが分離して包装されるとき、針はブチルゴムシールドに適合されることが好ましい。好ましい注射器は、商品名「Ｔｉｐ－Ｌｏｋ」（商標）の下で販売されている注射器である。
【0264】
たとえば子供への送達を容易にするために、容器には半分の用量体積を示す印が付けられてもよい。たとえば、０．５ｍｌ用量を含有する注射器は、０．２５ｍｌの体積を示す印を有してもよい。
【0265】
ガラス容器（例、注射器または水薬瓶）が用いられるとき、ソーダ石灰ガラスよりもホウ珪酸ガラスでできた容器を用いる方が好ましい。
【0266】
キットまたは組成物は、たとえば投与のための指示、ワクチン内の抗原の詳細などのワクチンの詳細を含むリーフレットとともに（例、同じ箱の中に）包装されてもよい。その指示は、たとえば予防接種後にアナフィラキシー反応が起こった場合に容易に利用可能なアドレナリンの溶液を保持することなどの警告も含んでいてもよい。
【0267】
処置の方法、およびワクチンの投与
本発明は、本発明に従って製造されたワクチンを提供する。
本発明は、本発明に従って製造されたワクチンを提供する。
【0268】
本発明に従って製造されたワクチン組成物はヒト患者への投与に好適であり、本発明は患者における免疫応答を高める方法を提供し、この方法は本発明の組成物を患者に投与するステップを含む。
【0269】
本発明は、薬として使用するための本発明の組成物も提供する。
【0270】
本発明は、患者における免疫応答を高めるための薬の製造における、本発明に従って調製されたインフルエンザウイルス抗原の使用も提供する。
【0271】
これらの方法および使用によって高められる免疫応答は、一般的に抗体応答、好ましくは保護的抗体応答を含む。インフルエンザウイルス予防接種の後に抗体応答、中和能力および保護を評価するための方法は当該技術分野において周知である。ヒトにおける研究から、ヒトインフルエンザウイルスの赤血球凝集素に対する抗体力価は保護に相関する（約３０～４０の血清サンプル赤血球凝集阻害力価は、相同ウイルスによる感染からの約５０％の保護を与える）ことが示されている［１８５］。抗体応答は典型的に、赤血球凝集阻害、マイクロ中和、単一放射状免疫拡散（ｓｉｎｇｌｅ ｒａｄｉａｌ ｉｍｍｕｎｏｄｉｆｆｕｓｉｏｎ：ＳＲＩＤ）、および／または単一放射状溶血（ｓｉｎｇｌｅ ｒａｄｉａｌ ｈｅｍｏｌｙｓｉｓ：ＳＲＨ）によって測定される。これらのアッセイ技術は当該技術分野において周知である。
【0272】
本発明の組成物は、さまざまなやり方で投与できる。最も好ましい免疫化経路は（例、腕または脚への）筋内注射であるが、他の利用可能な経路には皮下注射、鼻腔内［１８６、１８７－１８８］、経口［１８９］、皮内［１９０、１９１］、経皮（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）［１９２］などが含まれる。
【0273】
本発明に従って調製されたワクチンは、子供および成人の両方を処置するために使用されてもよい。現在、インフルエンザワクチンは生後６ヵ月からの小児科および成人の免疫化における使用が推奨されている。よって患者は１歳未満、１～５歳、５～１５歳、１５～５５歳、または少なくとも５５歳であってもよい。このワクチンを受けることが好ましい患者は、高齢者（例、≧５０歳、≧６０歳、および好ましくは≧６５歳）、低年齢者（例、≦５歳）、入院患者、医療従事者、軍隊および軍事人員、妊婦、慢性疾患、免疫不全の患者、ワクチンを受ける前の７日以内に抗ウイルス化合物（例、オセルタミビルまたはザナミビル化合物；下記を参照）を摂取した患者、卵アレルギーの人、および海外旅行者である。しかし、このワクチンはこれらの群に対してのみ好適なのではなく、より一般的に集団に用いられてもよい。パンデミック株については、すべての年齢群への投与が好ましい。
【0274】
本発明の好ましい組成物は、効力に対するＣＰＭＰ基準のうちの１つ、２つまたは３つを満たす。成人（１８～６０歳）におけるその基準は次のとおりである：（１）≧７０％の血清防御；（２）≧４０％の血清変換；および／または（３）≧２．５倍のＧＭＴ増加。高齢者（＞６０歳）におけるその基準は次のとおりである：（１）≧６０％の血清防御；（２）≧３０％の血清変換；および／または（３）≧２倍のＧＭＴ増加。これらの基準は、少なくとも５０人の患者によるオープンラベル研究に基づいている。
【0275】
処置は、単一用量計画または複数用量計画によるものであってもよい。複数用量は、一次免疫化計画および／またはブースター免疫化計画において用いられてもよい。複数用量計画においては、さまざまな用量が同じ経路または異なる経路によって与えられてもよく、たとえば非経口の一次免疫化および粘膜のブースター免疫化、粘膜の一次免疫化および非経口のブースター免疫化などであってもよい。２回以上の用量（典型的には２用量）の投与は、免疫学的に未経験の患者において、たとえば過去にインフルエンザワクチンを受けたことがない人に対して、または新たなＨＡサブタイプに対する予防接種（パンデミック発生のときなど）のために、特に有用である。複数用量は典型的に、少なくとも１週間離して（例、約２週間、約３週間、約４週間、約６週間、約８週間、約１０週間、約１２週間、約１６週間など）投与される。
【0276】
本発明によって生成されるワクチンは、他のワクチンと実質的に同時に（例、同じ医学的診察、または医療専門家もしくは予防接種センターへの訪問の際に）患者に投与されてもよく、たとえば、麻疹ワクチン、耳下腺炎ワクチン、風疹ワクチン、ＭＭＲワクチン、水痘ワクチン、ＭＭＲＶワクチン、ジフテリアワクチン、破傷風ワクチン、百日咳ワクチン、ＤＴＰワクチン、複合Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ｂ型ワクチン、不活性化ポリオウイルスワクチン、Ｂ型肝炎ウイルスワクチン、髄膜炎菌複合ワクチン（たとえば４価のＡ－Ｃ－Ｗ１３５－Ｙワクチンなど）、呼吸器系合胞体ウイルスワクチン、肺炎双球菌複合ワクチンなどと実質的に同時に投与されてもよい。肺炎双球菌ワクチンおよび／または髄膜炎菌ワクチンと実質的に同時に投与することは、高齢の患者において特に有用である。
【0277】
同様に、本発明のワクチンは、抗ウイルス化合物、特にインフルエンザウイルスに対して活性の抗ウイルス化合物（例、オセルタミビルおよび／またはザナミビル）と実質的に同時に（例、同じ医学的診察、または医療専門家への訪問の際に）患者に投与されてもよい。これらの抗ウイルス物質は、ノイラミニダーゼ阻害剤、たとえば（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）－４－アセチルアミノ－５－アミノ－３（１－エチルプロポキシ）－１－シクロヘキセン－１－カルボン酸、または５－（アセチルアミノ）－４－［（アミノイミノメチル）－アミノ］－２，６－無水－３，４，５－トリデオキシ－Ｄ－グリセロ－Ｄ－ガラクトノン－２－エノン酸などを含み、それらのエステル（例、エチルエステル）および塩（例、リン酸塩）も含まれる。好ましい抗ウイルス物質は、（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）－４－アセチルアミノ－５－アミノ－３（１－エチルプロポキシ）－１－シクロヘキセン－１－カルボン酸、エチルエステル、リン酸塩（１：１）であり、これはリン酸オセルタミビル（タミフル（ＴＡＭＩＦＬＵ）（商標））としても公知である。
【0278】
一般
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を包含し、たとえばＸを「含む」組成物は、Ｘのみからなっていてもよいし、たとえばＸ＋Ｙなど、何か付加的なものを含んでいてもよい。
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を包含し、たとえばＸを「含む」組成物は、Ｘのみからなっていてもよいし、たとえばＸ＋Ｙなど、何か付加的なものを含んでいてもよい。
【0279】
「実質的に」という語は「完全に」を排除するものではなく、たとえばＹを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを完全に含まなくてもよい。必要なときには、「実質的に」という語を本発明の定義から削除してもよい。
【0280】
数値ｘに関係する「約」という用語は、たとえばｘ±１０％を意味する。
【0281】
特定的に述べられていない限り、２つまたはそれ以上の成分を混合するステップを含む方法は、混合のいかなる特定の順序も必要としない。よって複数の成分はあらゆる順序で混合され得る。３つの成分があるときには、２つの成分を互いに組合せることができ、次いでその組合せを第３の成分と組合せるなどしてもよい。
【0282】
細胞の培養において動物（特にウシ）の材料が用いられるときには、その材料は、伝染性海綿状脳症（ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅ ｓｐｏｎｇｉｆｏｒｍ ｅｎｃａｐｈａｌｏｐａｔｈｉｅｓ：ＴＳＥｓ）を含まない、特にウシ海綿状脳症（ｂｏｖｉｎｅ ｓｐｏｎｇｉｆｏｒｍ ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ：ＢＳＥ）を含まない供給源から得られるべきである。全体的には、動物由来の材料がまったく存在しないところで細胞を培養することが好ましい。
【0283】
ある化合物が組成物の部分として体に投与されるとき、その化合物は代替的に好適なプロドラッグによって置換されてもよい。
【図面の簡単な説明】
【0284】
【図1】臨床的試料からのインフルエンザウイルスの単離の手法を示す図である。
【図2】ＭＤＣＫ－３３０１６細胞において単離された９つのウイルスサンプルのＨＡ力価を比較する図である。各サンプルにおいて、左側の棒は継代２、右側の棒は継代５におけるものである。
【図3】３つの異なるＭＤＣＫ細胞型において生育された１０サンプルのインフルエンザウイルスのＨＡ力価を比較した図である。各サンプルに対して、３本の棒は次のとおりである：左、懸濁液中の３３０１６；中、付着性３３０１６；および右、ＣＣＬ－３４ ＭＤＣＫ細胞。
【図4】３つのウイルスのＳＮＡまたはＭＡＡレクチンへの結合を示す図である。図４Ａは元の単離体の結合を示し、図４ＢはＭＤＣＫ３３０１６細胞における生育後の結合を示し、図４Ｃは卵における生育後の結合を示す。
【発明を実施するための形態】
【0285】
患者のサンプルからのウイルス単離
２００６～２００７年の北半球のインフルエンザシーズン中に、子供および成人からインフルエンザＡおよび／またはＢウイルスサブタイプを含有する臨床的試料（鼻または咽喉のスワブ）を得た。赤血球凝集素（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ：ＨＡ）力価の決定、ポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ：ＰＣＲ）、およびウイルス滴定によって、無血清懸濁培養中で生育されたＭＤＣＫ３３０１６細胞株（ＤＳＭ ＡＣＣ２２１９）の感染性および信頼性を、確立されたＭＤＣＫ ＣＣＬ３４細胞株（ＡＴＣＣ）および鶏卵と比較した。
２００６～２００７年の北半球のインフルエンザシーズン中に、子供および成人からインフルエンザＡおよび／またはＢウイルスサブタイプを含有する臨床的試料（鼻または咽喉のスワブ）を得た。赤血球凝集素（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ：ＨＡ）力価の決定、ポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ：ＰＣＲ）、およびウイルス滴定によって、無血清懸濁培養中で生育されたＭＤＣＫ３３０１６細胞株（ＤＳＭ ＡＣＣ２２１９）の感染性および信頼性を、確立されたＭＤＣＫ ＣＣＬ３４細胞株（ＡＴＣＣ）および鶏卵と比較した。
【0286】
診断的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、２４８個のインフルエンザ陽性サンプルが同定された。ＭＤＣＫ３３０１６細胞株および鶏卵において、インフルエンザウイルスの複製および単離の信頼性および感染性を、以下の方法によって評価した：（ｉ）赤血球凝集素（ＨＡ）力価；（ｉｉ）ウイルス負荷測定のためのリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）；および（ｉｉｉ）ウイルス滴定。元の臨床的試料と、ＭＤＣＫ細胞および鶏卵における第２継代からの単離体とにおけるＨＡ遺伝子の配列決定を行なうことによって、細胞における複製精度を評価した。懸濁ＭＤＣＫ３３０１６細胞において生育された単離体から得られたウイルス力価を、プレートに付着させたＭＤＣＫ３３０１６細胞からのものと比較した。
【0287】
その結果、ＭＤＣＫ３３０１６懸濁細胞株の単離能力は、確立されたＭＤＣＫ ＣＣＬ３４細胞株よりも優れており、鶏卵のそれよりもかなり高いことが示された。ＭＤＣＫ３３０１６細胞におけるウイルスサンプルの継代後、どの単離体においてもアミノ酸置換は同定されなかった。それに対し、ほぼすべての卵継代ウイルスが、主にＨＡ１遺伝子中に１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含有していた。卵における継代の後に観察されるＨＡ遺伝子の抗体結合部位の変異によって、インフルエンザウイルスの抗原性が変わる可能性がある。
【0288】
急性呼吸器疾患の患者から得られた臨床的サンプルの５５％がインフルエンザ陽性と同定され、次のウイルス型を有した：７９％のＡ／Ｈ３Ｎ２；１２．５％のＡ／Ｈ１Ｎ１；１．６％のＢ、０．４％のＨ３／Ｂ、および６．５％の型不明。ＭＤＣＫ３３０１６細胞を用いて、臨床的試料からのウイルス単離ができた（図１）。これに対し、臨床的試料から卵に注入されたウイルスは、いずれも単離に成功しなかった。新たに調製されたニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）についても同様のネガティブな結果が得られた。卵におけるインフルエンザウイルスの単離および確立は、陽性ＨＡ力価を有するＭＤＣＫ３３０１６培養物の上清を用いたときにのみ可能であった。
【0289】
各細胞からの第１の採取物は、参照の目的のためにさらに卵に接種された。各アプローチを用いて成功したウイルス単離の数が図１の囲みの中に示されており、注入された異なるウイルス型の数も示されている。ＭＤＣＫ３３０１６細胞から単離された３つのウイルスサブタイプすべてが、卵における第２継代の後に妥当なＨＡ（＞３２）およびウイルス力価（＞１´１０６）を獲得し、どちらの力価もさらなる継代によって増加した（図２）。
【0290】
懸濁液中で生育するＭＤＣＫ３３０１６細胞は、３つのサブタイプすべてに対して臨床的スワブからのインフルエンザウイルスの単離に関して付着性細胞株（ＣＣＬ－３４）よりも優れていた。回収率（表１）によって示されるとおり、懸濁細胞株は陽性インフルエンザスワブ材料に対するより高い感度を示した。元の単離体に対するＭＤＣＫ３３０１６細胞および卵の異なる継代間のＨＡ配列が比較され（表２）、ＭＤＣＫ３３０１６細胞において単離されたインフルエンザＡ株には５継代後にも突然変異が見出されなかったのに対し、卵において単離されたインフルエンザＡ株は２継代後にＨＡタンパク質の抗体結合部位に突然変異を示した。ＭＤＣＫ３３０１６細胞または卵において単離されたインフルエンザＢ株に対する突然変異は見出されなかった。
【0291】
懸濁ＭＤＣＫ３３０１６細胞における単離体の複製後には、付着ＭＤＣＫ３３０１６細胞に比べて少なくとも１ｌｏｇレベル高いウイルス収率が見出された（図３）。
【0292】
よって、ＭＤＣＫ３３０１６懸濁細胞株は、鶏卵よりも大きい単離能力を提供するため、野生型インフルエンザ株の単離および複製に対する理想的な系である。
【0293】
さらに、複製精度が高いため、細胞に基づく単離体をヒトインフルエンザワクチンの生成に用いることによって、より確実なワクチンがもたらされ得る。流布中の野生型株とワクチンに含有される株との適合を改善することによって、ワクチンのインフルエンザに対するより大きな防御を提供できるはずである。
【0294】
結論として：（ａ）卵に比べ、ＭＤＣＫ３３０１６細胞ではすべてのウイルス株の単離に成功した；（ｂ）ＭＤＣＫ３３０１６細胞から単離されたウイルス株を卵においてうまく増殖させることができた；（ｃ）付着性細胞に比べて、懸濁液中で生育されたＭＤＣＫ３３０１６細胞の方が３つのインフルエンザウイルスサブタイプすべての回収率が優れている；および（ｄ）ＭＤＣＫ３３０１６細胞中で生育された単離体のいずれにおいても、元の材料と比べたときのＨＡ遺伝子の置換が存在しなかったが、卵においては第２継代後に存在した。よってＭＤＣＫ３３０１６懸濁細胞株は、臨床的単離体からの野生型インフルエンザウイルスを継代するための信頼性が高く、かつ野生型ウイルスの確実な特徴を保存するため、ヒトインフルエンザウイルスサブタイプの単離および増殖に対する非常に好適な培養基である。
【0295】
受容体結合
元の単離ウイルス、卵生育ウイルス、およびＭＤＣＫ生育ウイルスの受容体の優先性を調査した。研究には、２，３－シアリル結合（ＭＡＡ）もしくは２，６－シアリル結合（ＳＮＡ）を有するレクチン、または２，３－シアリルラクトース（２，３－ｓｉａｌｙｌｌａｃｔｏｓｅ：３－ＳＬ、卵受容体の類似体）および２，６－シアリル－Ｎ－アセチルラクトサミン（２，６－ｓｉａｌｙｌ－Ｎ－ａｃｅｔｙｌｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ：６－ＳＬＮ、ヒト受容体の類似体）シアリルグリコポリマーが用いられた[１９３]。
元の単離ウイルス、卵生育ウイルス、およびＭＤＣＫ生育ウイルスの受容体の優先性を調査した。研究には、２，３－シアリル結合（ＭＡＡ）もしくは２，６－シアリル結合（ＳＮＡ）を有するレクチン、または２，３－シアリルラクトース（２，３－ｓｉａｌｙｌｌａｃｔｏｓｅ：３－ＳＬ、卵受容体の類似体）および２，６－シアリル－Ｎ－アセチルラクトサミン（２，６－ｓｉａｌｙｌ－Ｎ－ａｃｅｔｙｌｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ：６－ＳＬＮ、ヒト受容体の類似体）シアリルグリコポリマーが用いられた[１９３]。
【0296】
図４は代表的な研究の結果を示す。ラベルされたピークは、ＳＮＡまたはＭＡＡレクチンへの結合を示す。元のウイルス（図４Ａ）およびＭＤＣＫ３３０１６にて生育されたウイルス（図４Ｂ）はＳＮＡおよびＭＡＡに対する明確なピークを有するが、卵生育ウイルス（図４Ｃ）ではＳＮＡおよびＭＡＡピークは実質的に重なり合っている。
【0297】
３－ＳＬおよび６－ＳＬＮを用いたさらなる実験において結合特異性も調べた。結果の１例を図５に示す。グラフの左側の結合は鳥受容体の優先性を示し、右側の結合はヒト受容体の優先性を示す。図５に見られるとおり、細胞単離ウイルスはヒト受容体を強く好む。
【0298】
図６は、卵または懸濁中で生育されたＭＤＣＫ３３０１６において２継代または５継代された後のシュトゥットガルト単離体（Ａ／Ｈ１Ｎ１）を用いたデータを示す。ＭＤＣＫ継代されたウイルスは６－ＳＬＮに対する強い優先性を示す。
【0299】
結論として、すべてのＭＤＣＫ生育された臨床的なヒトＡおよびＢウイルスは、このアッセイにおいてどちらにも結合しなかったいくつかの単離体を除き、３－ＳＬよりも６－ＳＬＮに結合する。元の臨床的単離体とは異なり、卵適合ウイルスは３－ＳＬに結合するか、または３－ＳＬにも６－ＳＬＮにも結合しない。
【0300】
卵における生育による変化
インフルエンザＡおよびＢウイルスのさまざまな株が、ＭＤＣＫ細胞において単離された後、以下の培養基の１つによって最大５回継代された：卵；ＭＤＣＫ細胞ＣＣＬ－３４；ＭＤＣＫ細胞３３０１６；ベロ細胞；またはＨＥＫ２９３－Ｔ細胞。各継代の後にウイルスのＨＡ遺伝子の配列が決定され、ＨＡ力価が測定された。
インフルエンザＡおよびＢウイルスのさまざまな株が、ＭＤＣＫ細胞において単離された後、以下の培養基の１つによって最大５回継代された：卵；ＭＤＣＫ細胞ＣＣＬ－３４；ＭＤＣＫ細胞３３０１６；ベロ細胞；またはＨＥＫ２９３－Ｔ細胞。各継代の後にウイルスのＨＡ遺伝子の配列が決定され、ＨＡ力価が測定された。
【0301】
いくつかの株（例、Ａ／Ｈ１Ｎ１／Ｂａｙｅｒｎ／７／９５）に対するＨＡ配列は、卵およびＭＤＣＫ３３０１６による継代の間安定であったが、他のものは安定ではなかった。たとえば、Ａ／Ｈ１Ｎ１／Ｎｏｒｄｒｈｅｉｎ Ｗｅｓｔｆａｌｅｎ／１／０５のＨＡ配列は、卵による２継代の後に抗体結合部位Ｄにおける変異Ｄ２０３Ｎを獲得し、さらに２継代の後にＲ３２９Ｋを付加的に獲得した。これに対し、ＭＤＣＫ３３０１６によって並行して継代されたウイルスにおいて、配列は変更されなかった。
【0302】
このＡ／Ｈ１Ｎ１／ＮＲＷ／１／０５株については、ベロ細胞によって培養されたときに生育がみられなかった。他の４つの培養基はこの株の生育を支持できたが、ＨＡ力価は変動した。たとえば、卵においては３２～２５６の力価がみられたが、２９３－Ｔ細胞はもっと低い力価（１６～３２）を与え、ＭＤＣＫ３３０１６はもっと高い力価（３２～５１２）を与えた。
【0303】
本発明は例示によってのみ説明されており、本発明の範囲および趣旨の範囲内で変更が加えられてもよいことが理解される。
【0304】
表１：ＭＤＣＫ３３０１６およびＡＴＣＣ（ＣＣＬ－３４）細胞株におけるインフルエンザ陽性サンプルの第１継代後の回収率
【0305】
【表1】
【0306】
表２：元の単離体に対するＭＤＣＫ３３０１６－ＰＦ細胞または卵における２継代または５継代後の赤血球凝集素配列の比較
【0307】
【表2】
＊元の単離体に対してＨＡ１配列のみ利用可能
＊＊Ｐ２（ＭＤＣＫ３３０１６）単離体に対する比較。
【0308】
参考文献（その内容は本明細書に引用により援用される）
【0309】
【化13】
【0310】
【化14】
【0311】
【化15】
【0312】
【化16】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
