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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-01-29
(45)【発行日】2024-02-06
(54)【発明の名称】検体中の核酸を回収する方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6806 20180101AFI20240130BHJP
C12Q 1/6844 20180101ALI20240130BHJP
C12M 1/12 20060101ALN20240130BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6806 Z ZNA
C12Q1/6844 Z
C12M1/12
【請求項の数】
9
(21)【出願番号】P 2021179373
(22)【出願日】2021-11-02
(65)【公開番号】P2023068351
(43)【公開日】2023-05-17
【審査請求日】2023-08-16
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 ２０２０年（令和２年）１１月１４日～１６日 ｈｔｔｐｓ：／／ｓｉｔｅｓ．ｇｏｏｇｌｅ．ｃｏｍ／ｖｉｅｗ／ｅｄｎａ－ｐｏｐｅｃｏ－２０２０／にて発表
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 ２０２１年（令和３年）２月２６日 ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎａｒｏ．ｇｏ．ｊｐ／ｅｖｅｎｔ／ｌｉｓｔ／２０２１／０１／１３７４３０．ｈｔｍｌにて発表
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）令和２年度農林水産研究推進事業委託プロジェクト研究「農業被害をもたらす侵略的外来種の管理技術の開発」及び「果樹等の幼木期における安定生産技術の開発」産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願
【早期審査対象出願】
(73)【特許権者】
【識別番号】000116622
【氏名又は名称】愛知県
(74)【代理人】
【識別番号】110000109
【氏名又は名称】弁理士法人特許事務所サイクス
(72)【発明者】
【氏名】鈴木 良地
【審査官】平林 由利子
(56)【参考文献】
【文献】特開２００５－３０４５０４（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２００５－２１８３２１（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１１－５０２５３６（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｑ １／００－ ３／００
Ｃ１２Ｍ １／００－ ３／１０
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
水に懸濁したガラス繊維に検体中の核酸を吸着させる工程、及び核酸が吸着したガラス繊維を、微細な編み目構造を有するシートでろ過分離することにより回収する工程を含む、検体中の核酸を回収する方法であって、
微細な編み目構造を有するシートの目開きが、０．１８ｍｍ～０．２８ｍｍであり、
核酸を吸着させるためのガラス繊維の繊維長の分布が、繊維長５０μｍ以下が１０～６５％、繊維長５１μｍ以上３００μｍ以下が３０～６０％、繊維長３０１μｍ以上が５～４０％であり、
検体が環境水である、
方法。
【請求項2】
核酸が吸着したガラス繊維を、微細な編み目構造を有するシートでろ過分離することにより回収する工程を、（ａ）液体を流入するための開口部および液体を排出するための開口部を有する袋、及び
（ｂ）前記の液体を排出するための開口部に設置された、２つの円筒管に挟まれた微細な編み目構造を有するシート、
を有するサンプリングバッグを使用して実施する、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
複数個のサンプリングバッグを並列させて、複数個の検体を同時にろ過する、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
液体を排出するための開口部に吸引ポンプを連結させすることによって、ろ過時間を短縮させる、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項5】
核酸が吸着したガラス繊維を、微細な編み目構造を有するシートでろ過分離することにより回収する工程を、液体を流入するための開口部および液体を排出するための開口部を有する吸引カップと、前記の液体を排出するための開口部から排出される液体を受けるための容器とを含み、前記吸引カップと前記容器との間に、微細な編み目構造を有するシートが設置されているＤＮＡろ過器具を使用して実施する、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
複数個のＤＮＡろ過器具を並列させて、複数個の検体を同時にろ過する、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
液体を排出するための開口部に吸引ポンプを連結させすることによって、ろ過時間を短縮させる、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項8】
核酸を吸着させるためのガラス繊維が、ジルコニアビーズとともに振動数２５Ｈｚで５秒から１５秒粉砕したものである、請求項１から７の何れか一項に記載の方法。
【請求項9】
請求項１から８の何れか一項に記載の方法により検体中の核酸を回収する工程、及び回収した核酸を用いて、ＬＡＭＰ法によりＤＮＡの増幅を行う工程、
を含む、環境ＤＮＡの検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、環境水や土壌中に含まれるＤＮＡを簡易な装置でろ過分離および抽出する技術に関する。
【背景技術】
【0002】
環境ＤＮＡを環境水からろ過、分離、抽出する方法は、一般社団法人環境ＤＮＡ学会発行の環境ＤＮＡ調査・実験マニュアル（非特許文献１）に詳細が記載されている。非特許文献１のマニュアルでは、環境水１Ｌから環境ＤＮＡをろ過、分離する方法として、カートリッジ式のフィルターを用いる方法と、ガラス繊維ろ紙を用いる方法の２種類が定義されている。いずれの方法もリアルタイムＰＣＲ法または次世代シーケンサーによる分析を前提としており、ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）によりＤＮＡを抽出する。
【0003】
上記した環境ＤＮＡのろ過、分離法は、ＤＮＡやＲＮＡなどの核酸が、カオトロピックの塩の存在下でガラス、シリカゲル、石英ウール、シリカ、ガラス膜又はポリマーなどに吸着する原理を利用したものであり、この原理は一般的に広く知られている。この原理を利用したＤＮＡを抽出する方法としては、ガラス繊維またはガラス粉末を組み込んだカートリッジ式のフィルターによってＤＮＡを精製する方法（例えば、特許第３０４５９２２号公報）、電気泳動後のアガロースゲルからガラス粉末にＤＮＡを吸着させて回収する方法（例えば、特開昭５９－２２７７４４号公報）、ガラス粉末に生体試料のＤＮＡを吸着させて遠心分離により回収する方法（特開平０３－００７５８２号公報）などが報告されている。また、ＤＮＡをシリカ粒子等の懸濁液に吸着させ、メンブレンフィルター上で回収する方法（特許第２６８０４６２号公報及び特開平１０－１５５４８１号公報）も報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【文献】特許第３０４５９２２号公報
【文献】特開昭５９－２２７７４４号公報
【文献】特開平０３－００７５８２号公報
【文献】特許第２６８０４６２号公報
【文献】特開平１０－１５５４８１号公報
【非特許文献】
【0005】
【文献】一般社団法人環境ＤＮＡ学会（２０２０）環境ＤＮＡ調査・実験マニュアル ｖｅｒ．２．２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
上記した特許文献１～５に記載されているカオトロピック物質にＤＮＡを吸着させて回収する方法は、微量または少量のＤＮＡ溶液を対象としていることから、有機物を含む浮遊物に汚染された清浄ではない水を１Ｌ程度ろ過する必要がある一般的な環境ＤＮＡ分析には適用できない。
【0007】
環境水を対象とする「環境ＤＮＡ調査・実験マニュアル」（非特許文献１）に記載の方法においても、１Ｌを目詰まりさせることなくろ過することはしばしば困難である。同時に、これら従来の方法はいずれも施設の整った実験室で実施する必要があり、広範囲の環境ＤＮＡ調査の物理的な妨げとなっていた。そこで、環境水を実験施設に持ち帰ることなく、採水現場で多量の環境ＤＮＡのろ過分離を可能とする技術の開発が求められていた。
【0008】
本発明は、上述の課題を解決するためになされたものである。即ち、本発明は、簡易な装置で環境ＤＮＡをろ過分離および抽出する方法を提供することを解決すべき課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明者は上記課題を解決するために鋭意検討した結果、水に懸濁したガラス繊維に検体中の核酸を吸着させ、それらのガラス繊維を微細な編み目構造を有するシートで回収することにより、簡易に検体中の核酸をろ過及び分離できることを見出した。本発明によれば、以下の発明が提供される。
【0010】
＜１＞ 水に懸濁したガラス繊維に検体中の核酸を吸着させる工程、及び核酸が吸着したガラス繊維を、微細な編み目構造を有するシートでろ過分離することにより回収する工程を含む、検体中の核酸を回収する方法。
＜２＞ 核酸が吸着したガラス繊維を、微細な編み目構造を有するシートでろ過分離することにより回収する工程を、
（ａ）液体を流入するための開口部および液体を排出するための開口部を有する袋、及び
（ｂ）前記の液体を排出するための開口部に設置された、２つの円筒管に挟まれた微細な編み目構造を有するシート、
を有するサンプリングバッグを使用して実施する、＜１＞に記載の方法。
＜３＞ 複数個のサンプリングバッグを並列させて、複数個の検体を同時にろ過する、＜２＞に記載の方法。
＜４＞ 液体を排出するための開口部に吸引ポンプを連結させすることによって、ろ過時間を短縮させる、＜２＞又は＜３＞に記載の方法。
＜５＞ 核酸が吸着したガラス繊維を、微細な編み目構造を有するシートでろ過分離することにより回収する工程を、
液体を流入するための開口部および液体を排出するための開口部を有する吸引カップと、前記の液体を排出するための開口部から排出される液体を受けるための容器とを含み、前記吸引カップと前記容器との間に、微細な編み目構造を有するシートが設置されているＤＮＡろ過器具を使用して実施する、＜１＞に記載の方法。
＜６＞ 複数個のＤＮＡろ過器具を並列させて、複数個の検体を同時にろ過する、＜５＞に記載の方法。
＜７＞ 液体を排出するための開口部に吸引ポンプを連結させすることによって、ろ過時間を短縮させる、＜５＞又は＜６＞に記載の方法。
＜８＞ 微細な編み目構造を有するシートの目開きが、０．１８ｍｍ～０．２８ｍｍである、＜１＞から＜７＞の何れか一に記載の方法。
＜９＞ 核酸を吸着させるためのガラス繊維が、ジルコニアビーズとともに振動数２５Ｈｚで５秒から１５秒粉砕したものである、＜１＞から＜８＞の何れか一に記載の方法。
＜１０＞ 核酸を吸着させるためのガラス繊維の繊維長の分布が、繊維長５０μｍ以下が１０～６５％、繊維長５１μｍ以上３００μｍ以下が３０～６０％、繊維長３０１μｍ以上が５～４０％である、＜１＞から＜９＞の何れか一に記載の方法。
＜１１＞ ＜１＞から＜１０＞の何れか一に記載の方法により検体中の核酸を回収する工程、及び
回収した核酸を用いて、ＬＡＭＰ法によりＤＮＡの増幅を行う工程、
を含む、環境ＤＮＡの検出方法。
＜１２＞ （ａ）液体を流入するための開口部および液体を排出するための開口部を有する袋、及び
（ｂ）前記の液体を排出するための開口部に設置された、２つの円筒管に挟まれた微細な編み目構造を有するシート、
を有するサンプリングバッグ。
＜１３＞ 液体を流入するための開口部および液体を排出するための開口部を有する吸引カップと、前記の液体を排出するための開口部から排出される液体を受けるための容器とを含み、前記吸引カップと前記容器との間に、微細な編み目構造を有するシートが設置されているＤＮＡろ過器具。
＜２＞ 核酸が吸着したガラス繊維を、微細な編み目構造を有するシートでろ過分離することにより回収する工程を、
（ａ）液体を流入するための開口部および液体を排出するための開口部を有する袋、及び
（ｂ）前記の液体を排出するための開口部に設置された、２つの円筒管に挟まれた微細な編み目構造を有するシート、
を有するサンプリングバッグを使用して実施する、＜１＞に記載の方法。
＜３＞ 複数個のサンプリングバッグを並列させて、複数個の検体を同時にろ過する、＜２＞に記載の方法。
＜４＞ 液体を排出するための開口部に吸引ポンプを連結させすることによって、ろ過時間を短縮させる、＜２＞又は＜３＞に記載の方法。
＜５＞ 核酸が吸着したガラス繊維を、微細な編み目構造を有するシートでろ過分離することにより回収する工程を、
液体を流入するための開口部および液体を排出するための開口部を有する吸引カップと、前記の液体を排出するための開口部から排出される液体を受けるための容器とを含み、前記吸引カップと前記容器との間に、微細な編み目構造を有するシートが設置されているＤＮＡろ過器具を使用して実施する、＜１＞に記載の方法。
＜６＞ 複数個のＤＮＡろ過器具を並列させて、複数個の検体を同時にろ過する、＜５＞に記載の方法。
＜７＞ 液体を排出するための開口部に吸引ポンプを連結させすることによって、ろ過時間を短縮させる、＜５＞又は＜６＞に記載の方法。
＜８＞ 微細な編み目構造を有するシートの目開きが、０．１８ｍｍ～０．２８ｍｍである、＜１＞から＜７＞の何れか一に記載の方法。
＜９＞ 核酸を吸着させるためのガラス繊維が、ジルコニアビーズとともに振動数２５Ｈｚで５秒から１５秒粉砕したものである、＜１＞から＜８＞の何れか一に記載の方法。
＜１０＞ 核酸を吸着させるためのガラス繊維の繊維長の分布が、繊維長５０μｍ以下が１０～６５％、繊維長５１μｍ以上３００μｍ以下が３０～６０％、繊維長３０１μｍ以上が５～４０％である、＜１＞から＜９＞の何れか一に記載の方法。
＜１１＞ ＜１＞から＜１０＞の何れか一に記載の方法により検体中の核酸を回収する工程、及び
回収した核酸を用いて、ＬＡＭＰ法によりＤＮＡの増幅を行う工程、
を含む、環境ＤＮＡの検出方法。
＜１２＞ （ａ）液体を流入するための開口部および液体を排出するための開口部を有する袋、及び
（ｂ）前記の液体を排出するための開口部に設置された、２つの円筒管に挟まれた微細な編み目構造を有するシート、
を有するサンプリングバッグ。
＜１３＞ 液体を流入するための開口部および液体を排出するための開口部を有する吸引カップと、前記の液体を排出するための開口部から排出される液体を受けるための容器とを含み、前記吸引カップと前記容器との間に、微細な編み目構造を有するシートが設置されているＤＮＡろ過器具。
【発明の効果】
【0011】
本発明によれば、土壌懸濁水を含む環境水中のＤＮＡを目詰まりすることなく容易にろ過分離できる。このろ過物は市販の簡易な試薬でＤＮＡ抽出でき、こうして抽出されたＤＮＡはＰＣＲ法以外にもＬＡＭＰ法で分析可能である。これにより、環境ＤＮＡ分析をオンサイトで実施でき、分析効率が飛躍的に向上する。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【発明を実施するための形態】
【0013】
以下、本発明の実施の形態について、説明する。
本発明による検体中の核酸を回収する方法は、水に懸濁したガラス繊維に検体中の核酸を吸着させる工程、及び核酸が吸着したガラス繊維を、微細な編み目構造を有するシートでろ過分離することにより回収する工程を含む方法である。
本発明による検体中の核酸を回収する方法は、水に懸濁したガラス繊維に検体中の核酸を吸着させる工程、及び核酸が吸着したガラス繊維を、微細な編み目構造を有するシートでろ過分離することにより回収する工程を含む方法である。
【0014】
本発明においては、検体としては環境から採取した検体を使用することができる。環境とは、土壌、堆肥、汚泥、下水、河川、湖沼、海水、海底、昆虫、動物、及び植物の固体の組織内部及び表面、並びに、排泄物等、微生物の生育環境を意味する。環境から採取した検体とは、具体的には、土壌、堆肥、汚泥、下水、河川、湖沼、海水、海底、昆虫、動物、及び植物の固体の組織内部及び表面、並びに、排泄物等から採取された検体が挙げられる。
【0015】
具体的には、市販のガラス繊維ろ紙を少量の水中で破砕して懸濁し、それを検体に加えることで、検体中のＤＮＡをガラス繊維に吸着させる。その後、樹脂製または天然素材のガーゼ等の微細な編み目構造を有するシートをフィルターとして、ガラス繊維をろ過、回収する。
【0016】
微細な編み目構造を有するシートは、懸濁したガラス繊維を補足するだけの目開きがあればよく、先行技術でみられるようなメンブレンフィルターやガラス繊維ろ紙のような極微細な目開きである必要はない。逆に目開きが微細すぎるとろ過時に目詰まりを生じがちであるし、また、広すぎるとガラス繊維が捕捉されずに流出してしまい、回収できない。従って、適度な目開きのフィルターを用いることで池や川などの清浄でない水をろ過する場合でも、目詰まりすることはなくガラス繊維を捕捉、回収できる。
【0017】
微細な編み目構造を有するシートの目開きは、一般的には、０．０７ｍｍ～０．５０ｍｍあり、好ましくは０．１０ｍｍ～０．４０ｍｍであり、好ましくは０．１８ｍｍ～０．２８ｍｍである。
【0018】
核酸を吸着させるためのガラス繊維としては、ジルコニアビーズとともに振動数２５Ｈｚで５秒から１５秒粉砕したものを使用することが好ましい。
【0019】
核酸を吸着させるためのガラス繊維の繊維長の分布としては、好ましくは、繊維長５０μｍ以下が１０～６５％（より好ましくは１０～３０％）、繊維長５１μｍ以上３００μｍ以下が３０～６０％（より好ましくは５０～６０％）、繊維長３０１μｍ以上が５～４０％（より好ましくは１０～３０％）であることが好ましい。
【0020】
本発明では、河川水、池水、海水、など環境中の水に溶存するＤＮＡを現場で採取およびろ過する器具として、一例としては、以下の構成を採用することができる。検体を流入または排出するための開口部を備えた、およそ容量２リットル以下を目安としたポリエチレン製またはその他の合成樹脂製のサンプリングバックを用い、開口部に塩化ビニル製またはその他の合成樹脂製からなる円筒管を１個または複数個連結し、間にメッシュシートまたはガーゼまたはその他微細な編み目構造を有するシートを装着する。これを簡易ＤＮＡろ過用のサンプリングバッグとする。
【0021】
また、土壌懸濁水などの対象の検体が少量の場合は、上記のサンプリングバッグ以外にも市販のろ過瓶にメッシュシート等を介して重力ろ過することもできる。
【0022】
環境水を入れたサンプリングバックまたは土壌懸濁水などにあっては小容量の容器に、懸濁または溶解したガラス繊維を適量加えて混合する。添加するガラス繊維は、メーカー、規格は問わず、また、容器に少量の水と規定量のガラス繊維ろ紙を加えて、破砕用ビーズとともに激しく振ることで、繊維が切断されず懸濁させることができる。ガラス繊維を混合することで検体中のＤＮＡがガラス繊維に吸着保持されるため、サンプリングバッグを開口部が下部になるように保持することで、ガラス繊維以外の有機物を含む浮遊物がメッシュシートの網目を通過して排水され、ＤＮＡを吸着したガラス繊維を含むろ過物がメッシュシート上に堆積する。このとき、サンプリングバッグの側面に圧力を加えることで、ろ過時間を短縮することができる。
【0023】
この方法は、サンプリングバッグまたはフィルターをフック等による吊り下げまたは架台等に一定間隔で列状に並べることで、複数個の検体を同時にろ過することも可能である。
【0024】
また、サンプリングバッグの排水側にポンプを接続して吸引ろ過を行い、ろ過時間を短縮させることもできる。
【0025】
ろ過物は、例えばＭｉｇｈｔｙＰｒｅｐ ｒｅａｇｅｎｔ ｆｏｒ ＤＮＡ （Ｔａｋａｒａ）等の簡易ＤＮＡ抽出試薬でＤＮＡ抽出が可能である。
【0026】
上記で抽出されたＤＮＡは、核酸増幅反応に供することができる。
核酸増幅反応としては、当業者にとって公知の方法を用いることができ、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ法）が挙げられる。ＰＣＲ法においては、環境ＤＮＡを鋳型として、特定のプライマーセットを用いてＰＣＲを行うことにより増幅産物を得ることができる。ＰＣＲ法は、リアルタイムＰＣＲ法でもよい。
核酸増幅反応としては、当業者にとって公知の方法を用いることができ、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ法）が挙げられる。ＰＣＲ法においては、環境ＤＮＡを鋳型として、特定のプライマーセットを用いてＰＣＲを行うことにより増幅産物を得ることができる。ＰＣＲ法は、リアルタイムＰＣＲ法でもよい。
【0027】
また、核酸増幅反応としては、ＰＣＲ法だけではなく、特殊な分析装置を必要としない核酸増幅法であるｌｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＬＡＭＰ）法を行ってもよい。ＬＡＭＰ法は、標的遺伝子の配列から６つ～８つの領域を選んで組み合わせた４種類～６種類のプライマーを用いて、鎖置換反応を利用して増幅させる方法である。プライマーの設計によって、最初の増幅産物のプライマー結合部位にループ構造を生じるようになる。ループ部分は１本鎖なので、次のプライマーが結合できる。鎖置換活性の高い特殊なＤＮＡ合成酵素は、進行方向にある２本鎖ＤＮＡを解離しながら、自らの伸長反応を進めていく。最終的には、もとの標的配列の約整数倍の長さの増幅産物が１時間ほどの約６５℃の反応で蓄積する。したがって反応産物を電気泳動するとラダー状である。ＰＣＲ法と比較して、１本鎖から２本鎖への変性反応が必要なく、６０～７０℃の定温または６５℃前後の定温で反応が進行することから、サーマルサイクラーは不要である。また、増幅速度が速く、特異性も高いことから、反応液の白濁を見るだけでテンプレート（標的ＤＮＡ）が増えたかどうかを確認できる。
【0028】
以下に、ガラス繊維を用いたＤＮＡの採取・ろ過法の概要、フィールド等における環境水の採取・ろ過法、および土壌懸濁水のろ過法に分けて、図面に基づいて説明する。
【0029】
ガラス繊維を用いたＤＮＡの採取・ろ過法においては、図１に示す破砕して水に懸濁したガラス繊維を環境水１Ｌに加えて撹拌し、従来の水のろ過用フィルターホルダーなどにメッシュシートを固定し、ガラス繊維を混合した環境水を通水させてろ過し、メッシュシート上に堆積したガラス繊維（図２）を回収する。
【0030】
ガラス繊維の規格やメーカーは問わない。ガラス繊維の量は、実験の結果、５ｍｇ～２０ｍｇが望ましいことが明らかとなっている。また、ガラス繊維は破砕方法によっては繊維が短くなりすぎ、メッシュシートを通過して回収できない場合があるため、繊維が分断されすぎない程度に破砕し、さらにそれらを回収するのに適した目開きのメッシュシートを組み合わせる必要がある。
【0031】
図３は、（ａ）液体を流入するための開口部および液体を排出するための開口部を有する袋、及び（ｂ）前記の液体を排出するための開口部に設置された、２つの円筒管に挟まれた微細な編み目構造を有するシート、を有するサンプリングバッグの一例を示す。図３の装置は、キャップ付きサンプリングバッグ１、ホース２、シリコン栓３、キャップに装着する塩化ビニル製のアダプタ４ 、メッシュシート５ 、メッシュシート固定用の塩化ビニル製のアダプタ６から構成されている。図３のサンプリングバッグは、フィールド等における環境水の採取・ろ過法において使用することができる。
【0032】
キャップ付きサンプリングバッグ１は環境水と懸濁させたガラス繊維を混合するための容器である。採取した環境水１Ｌをサンプリングバック１に入れ、懸濁させたガラス繊維を加え、良く撹拌する。その後、ろ過用のアタッチメントを装着する。ろ過用のアタッチメントは次の通りである。すなわり、サンプリングバッグの開口部内径と一致する外径の水道用ホース２をシリコン栓３を介して、アダプタ４に接続する。メッシュシート５を被せ、さらにその上からアダプタ６でメッシュシートを固定する。装着後、サンプリングバッグとろ過用のアタッチメントを反転させ、環境水を重力ろ過する。環境水の濁りが酷い場合は、重力ろ過だけではろ過できないことが多いため、手でバックの側面を押さえて加圧しながら環境水を排出する。サンプリングバッグ内の環境水のおおよそを排出した後、手でバッグを押さえて、バッグおよびろ過用のアタッチメント内の環境水を完全に排出する。その後、アダプタ６をゆっくり外して、メッシュシートを取り出す。メッシュシート上には図３のように、ＤＮＡを含んだガラス繊維がフィルム状に堆積しており、それを滅菌したつまようじまたはピンセットなどで慎重に巻き取り、０．２ｍＬ～１．５ｍＬのＰＣＲチューブ等に入れる。ここまでがフィールド等における環境水の採取・ろ過法である。
【0033】
図４は、液体を流入するための開口部および液体を排出するための開口部を有する吸引カップと、前記の液体を排出するための開口部から排出される液体を受けるための容器とを含み、前記吸引カップと前記容器との間に、微細な編み目構造を有するシートが設置されているＤＮＡろ過器具の一例を示す。図４のＤＮＡろ過器具は、吸引カップ１１、メッシュシート１２、吸引瓶１３から構成されている。図４のＤＮＡろ過器具は、土壌懸濁水のろ過法において使用することができる。
【0034】
土壌を加えて撹拌した水にガラス繊維を適量加えてよく撹拌する。実験を重ねた結果、約１００ｍＬの水に土壌を０．５ｇ加えて良く撹拌し、約５ｍｇのガラス繊維を加えるとよいことが明らかとなっている。メッシュシートを挟んだ吸引カップを吸引瓶にセットし、ガラス繊維を加えた土壌懸濁水を注ぎ入れる。このとき、重力のみでろ過できるので、必ずしもポンプ等で吸引する必要はない。ろ過後に吸引カップを外してメッシュシートを回収する。その後は上述の方法と同様にしてフィルム状に堆積したＤＮＡを含むガラス繊維をＰＣＲチューブ等に入れる。
【0035】
以下の実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【0036】
＜１＞ガラス繊維の性状とそれを回収するためのメッシュシートの組み合わせ
添加するガラス繊維を効率良く回収できるメッシュシートの目開きを明らかにするために、はじめに、破砕方法の違いによるガラス繊維の性状（長さ）を計測した。ガラス繊維は（ＧＡ－５５、Ａｄｖａｎｔｅｃ）を用い、ガラス繊維１０ｍｇに１ｍｌのＤＷを加え、ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、約５ｍｍのジルコニアボールとともに振動数２５Ｈｚで５秒、１５秒、６０秒破砕した場合およびビニル袋内で手もみした場合の４通りの破砕を行い、その繊維長を光学顕微鏡で計測した。
添加するガラス繊維を効率良く回収できるメッシュシートの目開きを明らかにするために、はじめに、破砕方法の違いによるガラス繊維の性状（長さ）を計測した。ガラス繊維は（ＧＡ－５５、Ａｄｖａｎｔｅｃ）を用い、ガラス繊維１０ｍｇに１ｍｌのＤＷを加え、ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、約５ｍｍのジルコニアボールとともに振動数２５Ｈｚで５秒、１５秒、６０秒破砕した場合およびビニル袋内で手もみした場合の４通りの破砕を行い、その繊維長を光学顕微鏡で計測した。
【0037】
次に、目開きが１．０ｍｍ、０．２８ｍｍ、０．１８ｍｍ、０．０７ｍｍの４種類のメッシュシートを用いて、上記の破砕方法で調製したガラス繊維１０ｍｇを懸濁した水道水をろ過し、フィルター上に残ったガラス繊維の重量（ガラス繊維捕捉率）を測定した。実験は３回実施した。
【0038】
次に、目詰まりしないメッシュシートを選定するために、浮遊物の多い池の水１Ｌを上記の破砕方法で調製したガラス繊維およびメッシュシートの様々な組み合わせでろ過を行い、目詰まりの有無およびろ過時間を計測した。このときのろ過時間は５秒以内に連続して滴下が確認できなくなるまでの時間と定義した。ただし、目開き１．０ｍｍのフィルターはこれまでの実験から使用に適さないことが明らかだったため、対象から除外した。実験は３回実施した。
【0039】
＜２＞環境ＤＮＡの収量の比較（１）：ガラス繊維の調製法とメッシュシートの決定
５秒、１５秒、６０秒破砕したガラス繊維を使って、カワヒバリガイ飼育水に含まれるカワヒバリガイ環境ＤＮＡをろ過、分離し、ＤＮＡ抽出量を比較した。カワヒバリガイ飼育水は、カワヒバリガイ約５０匹を飼育している水量約６０Ｌの水を用いた。飼育水１Ｌに破砕懸濁したガラス繊維ＧＡ－５５を１０ｍｇ加え、良く撹拌した後に、０．２８ｍｍ、０．１８ｍｍ、０．０７ｍｍの３種類のメッシュシートでろ過し、ガラス繊維を回収した。ＭｉｇｈｔｙＰｒｅｐ Ｒｅａｇｅｎｔ ｆｏｒ ＤＮＡ（Ｔａｋａｒａ）でＤＮＡを抽出し、リアルタイムＰＣＲ装置ＣＦＸ９６（ＢｉｏＲａｄ）を用いて、カワヒバリガイ特異的ＰＣＲプライマー（Ｘｉａ ｅｔ ａｌ， ２０１８）によりＰＣＲを行い、カワヒバリガイ環境ＤＮＡを定量した。実験は３回実施した。
５秒、１５秒、６０秒破砕したガラス繊維を使って、カワヒバリガイ飼育水に含まれるカワヒバリガイ環境ＤＮＡをろ過、分離し、ＤＮＡ抽出量を比較した。カワヒバリガイ飼育水は、カワヒバリガイ約５０匹を飼育している水量約６０Ｌの水を用いた。飼育水１Ｌに破砕懸濁したガラス繊維ＧＡ－５５を１０ｍｇ加え、良く撹拌した後に、０．２８ｍｍ、０．１８ｍｍ、０．０７ｍｍの３種類のメッシュシートでろ過し、ガラス繊維を回収した。ＭｉｇｈｔｙＰｒｅｐ Ｒｅａｇｅｎｔ ｆｏｒ ＤＮＡ（Ｔａｋａｒａ）でＤＮＡを抽出し、リアルタイムＰＣＲ装置ＣＦＸ９６（ＢｉｏＲａｄ）を用いて、カワヒバリガイ特異的ＰＣＲプライマー（Ｘｉａ ｅｔ ａｌ， ２０１８）によりＰＣＲを行い、カワヒバリガイ環境ＤＮＡを定量した。実験は３回実施した。
【0040】
Xia Z, Zhan A, Gao Y, Zhang L, Haffner DG, MacIsaac HJ (2018) Early detection of a highly invasive bivalve based on environmental DNA (eDNA). Biol Invasions 20: 437-447. doi:org/10.1007/s10530-017-1545-7
【0041】
＜３＞環境ＤＮＡの収量の比較（２）：ガラス繊維の添加量の決定
ガラス繊維により環境水中のＤＮＡが吸着される効果を明らかにするために、カワヒバリガイ飼育水を用いて実験を行った。カワヒバリガイ飼育水は、カワヒバリガイ約２０匹を飼育している水量約６０Ｌの水を用いた。飼育水１Ｌに破砕時間１５秒で破砕懸濁させたガラス繊維ＧＡ－５５を５ｍｇ～５０ｍｇ加え、良く撹拌した後に、１００メッシュのステンレススクリーンを通過させて、ガラス繊維を取り除いた。その後、環境ＤＮＡ調査・実験マニュアル（一般社団法人環境ＤＮＡ学会）に基づいて飼育水中のカワヒバリガイ環境ＤＮＡをろ過・抽出した。すなわち、孔径０．７μｍのガラス繊維ＧＦ／Ｆ（Ｗｈａｔｍａｎ）を用いて吸引ろ過を行い、回収したＧＦ／ＦからＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ ｋｉｔによりＤＮＡを抽出した。リアルタイムＰＣＲ装置ＣＦＸ９６を用いて、カワヒバリガイ特異的ＰＣＲプライマー（Ｘｉａ ｅｔ ａｌ， ２０１８）によりＰＣＲを行い、カワヒバリガイ環境ＤＮＡを定量した。吸着ＤＮＡはガラス繊維を添加しなかった飼育水の抽出ＤＮＡから、ガラス繊維を添加した後に除去した飼育水の抽出ＤＭＡを差し引いて求め、吸着率を算出した。実験は４回実施した。
ガラス繊維により環境水中のＤＮＡが吸着される効果を明らかにするために、カワヒバリガイ飼育水を用いて実験を行った。カワヒバリガイ飼育水は、カワヒバリガイ約２０匹を飼育している水量約６０Ｌの水を用いた。飼育水１Ｌに破砕時間１５秒で破砕懸濁させたガラス繊維ＧＡ－５５を５ｍｇ～５０ｍｇ加え、良く撹拌した後に、１００メッシュのステンレススクリーンを通過させて、ガラス繊維を取り除いた。その後、環境ＤＮＡ調査・実験マニュアル（一般社団法人環境ＤＮＡ学会）に基づいて飼育水中のカワヒバリガイ環境ＤＮＡをろ過・抽出した。すなわち、孔径０．７μｍのガラス繊維ＧＦ／Ｆ（Ｗｈａｔｍａｎ）を用いて吸引ろ過を行い、回収したＧＦ／ＦからＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ ｋｉｔによりＤＮＡを抽出した。リアルタイムＰＣＲ装置ＣＦＸ９６を用いて、カワヒバリガイ特異的ＰＣＲプライマー（Ｘｉａ ｅｔ ａｌ， ２０１８）によりＰＣＲを行い、カワヒバリガイ環境ＤＮＡを定量した。吸着ＤＮＡはガラス繊維を添加しなかった飼育水の抽出ＤＮＡから、ガラス繊維を添加した後に除去した飼育水の抽出ＤＭＡを差し引いて求め、吸着率を算出した。実験は４回実施した。
【0042】
＜４＞各種ガラス繊維によるＰＣＲ法およびＬＡＭＰ法による環境ＤＮＡ検出
Ｗｈａｔｍａｎ社、ＡＤＶＡＮＴＥＣ社、アズワンの３つのメーカーから複数の規格のガラス繊維ろ紙を選び、それぞれ１０ｍｇを破砕時間１５秒で破砕懸濁してカワヒバリガイ飼育水１Ｌに添加した。図３に示す本発明の簡易ろ過法（メッシュシート 目開き０．１８ｍｍ）でガラス繊維を回収し、ＭｉｇｈｔｙＰｒｅｐ Ｒｅａｇｅｎｔ ｆｏｒ ＤＮＡでＤＮＡを抽出した。リアルタイムＰＣＲによりＣｔ値を測定するとともにカワヒバリガイ特異的なＬＡＭＰプライマーを用いてＬＡＭＰ反応を行った。カワヒバリガイ特異的ＬＡＭＰプライマーとして、ＧｅｎＢａｎｋから得たカワヒバリガイのｍｔＣＯＩ遺伝子配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＢ５２０６２７，ＤＱ２６４３９５，ＪＸ１７７０８７）を基に、ＰｒｉｍｅｒＥｘｐｌｏｒｅｒ Ｖｅｒ．５（ 栄研化学 http://primerexplorer.jp/）を用いて、Ｆ３、Ｂ３、ＦＩＰ、ＢＩＰおよびＦｌｏｏｐから構成されるプライマーセットを設計した（表１）。ＬＡＭＰ反応液は、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、１０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０、０．８Ｍ ｂｅｔａｉｎ（ＦＵＪＩＦＩＬＭ Ｗａｋｏ）、８ｍＭ ＭｇＳＯ４、１．４ｍＭ ｄＮＴＰｓ、０．２μＭ Ｆ３およびＢ３ プライマー、１．６ μＭ ＦＩＰ およびＢＩＰプライマー、０．８μＭ Ｆｌｏｏｐプライマー、８ｕｎｉｔｓ Ｂｓｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｎｉｐｐｏｎ Ｇｅｎｅ）を混合し、滅菌水およびＤＮＡ抽出液１ μｌを加えて、総量２０μｌとした。ＬＡＭＰ反応は、リアルタイム濁度計ＬＡ２００（Ｔｅｒａｍｅｃｓ）を用い、濁度が閾値０．１に達した時間を計測した。
Ｗｈａｔｍａｎ社、ＡＤＶＡＮＴＥＣ社、アズワンの３つのメーカーから複数の規格のガラス繊維ろ紙を選び、それぞれ１０ｍｇを破砕時間１５秒で破砕懸濁してカワヒバリガイ飼育水１Ｌに添加した。図３に示す本発明の簡易ろ過法（メッシュシート 目開き０．１８ｍｍ）でガラス繊維を回収し、ＭｉｇｈｔｙＰｒｅｐ Ｒｅａｇｅｎｔ ｆｏｒ ＤＮＡでＤＮＡを抽出した。リアルタイムＰＣＲによりＣｔ値を測定するとともにカワヒバリガイ特異的なＬＡＭＰプライマーを用いてＬＡＭＰ反応を行った。カワヒバリガイ特異的ＬＡＭＰプライマーとして、ＧｅｎＢａｎｋから得たカワヒバリガイのｍｔＣＯＩ遺伝子配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＢ５２０６２７，ＤＱ２６４３９５，ＪＸ１７７０８７）を基に、ＰｒｉｍｅｒＥｘｐｌｏｒｅｒ Ｖｅｒ．５（ 栄研化学 http://primerexplorer.jp/）を用いて、Ｆ３、Ｂ３、ＦＩＰ、ＢＩＰおよびＦｌｏｏｐから構成されるプライマーセットを設計した（表１）。ＬＡＭＰ反応液は、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、１０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０、０．８Ｍ ｂｅｔａｉｎ（ＦＵＪＩＦＩＬＭ Ｗａｋｏ）、８ｍＭ ＭｇＳＯ４、１．４ｍＭ ｄＮＴＰｓ、０．２μＭ Ｆ３およびＢ３ プライマー、１．６ μＭ ＦＩＰ およびＢＩＰプライマー、０．８μＭ Ｆｌｏｏｐプライマー、８ｕｎｉｔｓ Ｂｓｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｎｉｐｐｏｎ Ｇｅｎｅ）を混合し、滅菌水およびＤＮＡ抽出液１ μｌを加えて、総量２０μｌとした。ＬＡＭＰ反応は、リアルタイム濁度計ＬＡ２００（Ｔｅｒａｍｅｃｓ）を用い、濁度が閾値０．１に達した時間を計測した。
【0043】
【表1】
【0044】
＜５＞カワヒバリガイ環境ＤＮＡのＰＣＲ検出およびＬＡＭＰ検出の比較（室内実験）
カワヒバリガイ飼育水１Ｌを簡易ろ過法（ガラス繊維ろ紙ＧＡ－５５、添加量１０ｍｇ、１５秒破砕、０．１８ｍｍメッシュシート）と従来法（環境ＤＮＡ調査・実験マニュアル）でろ過し、前者についてはＭｉｇｈｔｙＰｒｅｐ Ｒｅａｇｅｎｔ ｆｏｒ ＤＮＡ で、後者についてはＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ ｋｉｔによりＤＮＡを抽出した。リアルタイムＰＣＲによりＣｔ値を測定するとともにカワヒバリガイ特異的なＬＡＭＰプライマーを用いてＬＡＭＰ反応を行い、リアルタイム濁度計ＬＡ２００を用いて反応時間を計測し、３０分以内に濁度が閾値０．１に達した場合を陽性とした。試験は２０回実施した。
カワヒバリガイ飼育水１Ｌを簡易ろ過法（ガラス繊維ろ紙ＧＡ－５５、添加量１０ｍｇ、１５秒破砕、０．１８ｍｍメッシュシート）と従来法（環境ＤＮＡ調査・実験マニュアル）でろ過し、前者についてはＭｉｇｈｔｙＰｒｅｐ Ｒｅａｇｅｎｔ ｆｏｒ ＤＮＡ で、後者についてはＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ ｋｉｔによりＤＮＡを抽出した。リアルタイムＰＣＲによりＣｔ値を測定するとともにカワヒバリガイ特異的なＬＡＭＰプライマーを用いてＬＡＭＰ反応を行い、リアルタイム濁度計ＬＡ２００を用いて反応時間を計測し、３０分以内に濁度が閾値０．１に達した場合を陽性とした。試験は２０回実施した。
【0045】
＜６＞カワヒバリガイ環境ＤＮＡのＰＣＲ検出およびＬＡＭＰ検出の比較（野外調査）
農業用水（枝下用水、愛知県豊田市）でそれぞれ約１ｋｍ離れた１０カ所の地点から１Ｌ採水し、簡易ろ過法（ガラス繊維ろ紙ＧＡ－５５、添加量１０ｍｇ、１５秒破砕、０．１８ｍｍメッシュシート）と従来法（環境ＤＮＡ調査・実験マニュアル）でろ過した。前述と同様の試薬を用いてＤＮＡを抽出し、リアルタイムＰＣＲ法およびＬＡＭＰ法で分析した。
農業用水（枝下用水、愛知県豊田市）でそれぞれ約１ｋｍ離れた１０カ所の地点から１Ｌ採水し、簡易ろ過法（ガラス繊維ろ紙ＧＡ－５５、添加量１０ｍｇ、１５秒破砕、０．１８ｍｍメッシュシート）と従来法（環境ＤＮＡ調査・実験マニュアル）でろ過した。前述と同様の試薬を用いてＤＮＡを抽出し、リアルタイムＰＣＲ法およびＬＡＭＰ法で分析した。
【0046】
＜７＞土壌懸濁水のDNA分析の比較
あらかじめＤＮＡ量が明らかなＬａｍｂｄａ ＤＮＡ（ＴＡＫＡＲＡ）を用いて、１０６ｃｏｐｉｅｓ／ｓｏｉｌに濃度調製して、黄色土および黒ぼく土０．５ｇに加えて混合した。これを１００ｍＬの滅菌水に加え、さらに懸濁させたガラス繊維５ｍｇ（１５秒破砕）を加えて良く撹拌し、図４に示すろ過分離を行う器具を用いてろ過し、回収したガラス繊維からＭｉｇｈｔｙＰｒｅｐ Ｒｅａｇｅｎｔ ｆｏｒ ＤＮＡ でＤＮＡを抽出した。同時に、市販の土壌ＤＮＡ抽出キットであるＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｓｏｉｌ（ＴＡＫＡＲＡ）で添付のプロトコルに従ってＤＮＡを抽出した。それぞれの抽出ＤＮＡについて、リアルタイムＰＣＲを用いてＬａｍｂｄａ ＤＮＡ検出用のＰＣＲプライマー（Boulter et al,2016）によりｑＰＣＲ反応を行い、ＤＮＡ回収率を求めた。
Boulter N, Suarez FG, Schibeci S, Sunderland T, Tolhurst O, Hunter T, Hodge G, Handelsman D, Simanainen U, Hendriks E, Duggan K (2016) A simple, accurate and universal method for quantification of PCR. BMC Biotechnology: 16:27. doi:10.1186/s12896-016-0256-y
あらかじめＤＮＡ量が明らかなＬａｍｂｄａ ＤＮＡ（ＴＡＫＡＲＡ）を用いて、１０６ｃｏｐｉｅｓ／ｓｏｉｌに濃度調製して、黄色土および黒ぼく土０．５ｇに加えて混合した。これを１００ｍＬの滅菌水に加え、さらに懸濁させたガラス繊維５ｍｇ（１５秒破砕）を加えて良く撹拌し、図４に示すろ過分離を行う器具を用いてろ過し、回収したガラス繊維からＭｉｇｈｔｙＰｒｅｐ Ｒｅａｇｅｎｔ ｆｏｒ ＤＮＡ でＤＮＡを抽出した。同時に、市販の土壌ＤＮＡ抽出キットであるＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｓｏｉｌ（ＴＡＫＡＲＡ）で添付のプロトコルに従ってＤＮＡを抽出した。それぞれの抽出ＤＮＡについて、リアルタイムＰＣＲを用いてＬａｍｂｄａ ＤＮＡ検出用のＰＣＲプライマー（Boulter et al,2016）によりｑＰＣＲ反応を行い、ＤＮＡ回収率を求めた。
Boulter N, Suarez FG, Schibeci S, Sunderland T, Tolhurst O, Hunter T, Hodge G, Handelsman D, Simanainen U, Hendriks E, Duggan K (2016) A simple, accurate and universal method for quantification of PCR. BMC Biotechnology: 16:27. doi:10.1186/s12896-016-0256-y
【0047】
＜８＞結果および考察
図５にガラス繊維（ＧＡ－５５）の破砕処理別の繊維長を示した。破砕時間が長いほど繊維が短くなること、および手もみが最も繊維が短いことが明らかとなった。なお、データは省略するが、ＧＡ－５５の他に、ＧＢ－１４０（Ａｄｖａｎｔｅｃ）、ＧＦ／Ａ（Ｗｈａｔｍａｎ）、ＧＦ／Ｄ（同）、ＧＦ／Ｆ（同）について、１５秒破砕後の繊維長を調査した結果、ＧＦ／Ｆの繊維が比較的長い傾向があったが、他には大きな差は見られなかった。
図５にガラス繊維（ＧＡ－５５）の破砕処理別の繊維長を示した。破砕時間が長いほど繊維が短くなること、および手もみが最も繊維が短いことが明らかとなった。なお、データは省略するが、ＧＡ－５５の他に、ＧＢ－１４０（Ａｄｖａｎｔｅｃ）、ＧＦ／Ａ（Ｗｈａｔｍａｎ）、ＧＦ／Ｄ（同）、ＧＦ／Ｆ（同）について、１５秒破砕後の繊維長を調査した結果、ＧＦ／Ｆの繊維が比較的長い傾向があったが、他には大きな差は見られなかった。
【0048】
図６にメッシュシート別のガラス繊維の捕捉率（％）の平均値を示した。１．０ｍｍのシートではガラス繊維がほぼ通過してしまい、捕捉率が低かった。またシートの目開きが小さいほど、多くのガラス繊維を捕捉できることが明らかとなった。しかし、手もみのガラス繊維は繊維が短すぎて、最小の０．０７ｍｍのシートでさえ流失する割合が高いことがわかった。
【0049】
図７に池水１Ｌのろ過に要する時間（秒）の平均値を示した。シートの目開きが小さいほど、ろ過時間が長く、０．０７ｍｍのシートでは５秒破砕のガラス繊維以外は目詰まりして計測できなかった。図５および図６に示した結果から、ガラス繊維は手もみは適さず、５秒から６０秒破砕すると良いこと、およびシートは０．２８ｍｍから０．１８ｍｍが適していることがわかった。
【0050】
図８にカワヒバリガイ環境ＤＮＡの定量結果（平均値）を示した。６０秒破砕したガラス繊維および０．０７ｍｍシートの組み合わせが最もＤＮＡ量が多く、また破砕時間が長い（繊維が短い）ほどＤＮＡ量が多い傾向がみられた。しかし、これまでの実験から０．０７ｍｍのシートでは目詰まりする可能性が高いこと、および０．２８ｍｍまたは０．１８ｍｍのシートでは６０秒破砕のガラス繊維の優位性が確認できないことから、ガラス繊維は５秒または１５秒破砕すると良いこと、およびシートは０．２８ｍｍから０．１８ｍｍが適していることがわかった。
【0051】
図９にガラス繊維の添加量ごとのＤＮＡ吸着効果の実験結果を示した。横軸はガラス繊維の添加量を、縦軸は吸着率の平均値を表している。添加量５０ｍｇの場合は平均で８３．７％のＤＮＡがガラス繊維に吸着されたことが明らかとなった。しかし、反復間のばらつきが大きく、差が認められたのは２０ｍｇと５０ｍｇの吸着率だけであり、その他では有意差はなかった。添加量を５０ｍｇとした場合は、その後に行うＭｉｇｈｔｙＰｒｅｐ Ｒｅａｇｅｎｔ ｆｏｒ ＤＮＡによるＤＮＡ抽出の工程において、試薬による反応が不十分となることが多かった。従って、本発明において添加するガラス繊維の量は、ＤＮＡ吸着率および抽出工程におけるハンドリングの観点から１０ｍｇ～２０ｍｇが適量であると考えられた。
【0052】
表２に実験で使用したガラス繊維の種類、価格およびカワヒバリガイ飼育水中の環境ＤＮＡをリアルタイムＰＣＲおよびＬＡＭＰ法で分析した結果を示した。リアルタイムＰＣＲの値はＣｔ値を、ＬＡＭＰ法の値はＬＡＭＰ反応により生じた濁度が閾値０．１に達した時間（分）を表している。この結果、リアルタイムＰＣＲ法もＬＡＭＰ法も供試した１０種類のガラス繊維の全てＤＮＡが検出され、Ｃｔ値または反応時間（分）に大きな差はなかった。このことから、添加するガラス繊維のメーカーや規格を問わず、ＤＮＡ吸着に使用できると考えられた。
【0053】
【表2】
【0054】
図１０に簡易ろ過法と従来法でろ過抽出したカワヒバリガイ飼育水中の環境ＤＮＡについて、リアルタイムＰＣＲ法およびＬＡＭＰ法で分析した結果を示した。簡易ろ過法で調製したＤＮＡをＬＡＭＰ分析した結果、２０検体中１９検体が陽性となり、陽性率が最も高かった。このことから簡易ろ過法でろ過抽出したＤＮＡはＬＡＭＰ分析に適していると考えられた。
【0055】
表３は、実施例における農業用水中のカワヒバリガイの環境ＤＮＡをリアルタイムＰＣＲ法およびＬＡＭＰ法で分析し、陽性率を比較した表である。簡易ろ過法で調製したＤＮＡはＬＡＭＰ分析では全て陽性となり、従来法で抽出したＤＮＡをＰＣＲ分析した場合と結果が完全に一致した。このことから前述の室内実験と同様に野外調査でも、簡易ろ過法でろ過抽出したＤＮＡはＬＡＭＰ分析に適していることが実証された。
【0056】
【表3】
【0057】
表４は、実施例における土壌に添加したＬａｍｂｄａ ＤＮＡを市販のキットとガラス繊維を用いた簡易ろ過法で抽出して、ＰＣＲ法で分析した結果を示した表である。簡易ろ過法で調製した場合のＤＮＡ回収率は、黄色土では３．８～４．２％、黒ぼく土では０．７～１．５％だったのに対し、ＮｕｃｌｅＳｐｉｎ ｓｏｉｌ抽出のＤＮＡ回収率は、それぞれ約１２．３％および１１％だった。簡易ろ過法のＤＮＡ回収率は市販のＤＮＡ抽出キットの約１／３～１／１６と低く、Ｃｔ値が３～４サイクル遅くなるものの、ＤＮＡ増幅産物のＴｍ値は市販抽出キットとほぼ一致しており、簡易ろ過法で土壌中のＤＮＡを抽出することは可能と考えられた。
【0058】
【表4】
【0059】
以上の実験結果から、ガラス繊維に水中のＤＮＡを吸着させてメッシュシート等で回収するという本発明の方法は、工程が極めて簡単であるだけでなく、その後のＤＮＡ抽出にＭｉｇｈｔｙＰｒｅｐ Ｒｅａｇｅｎｔ ｆｏｒ ＤＮＡに代表される簡易なＤＮＡ抽出試薬を利用でき、さらにこうして抽出したＤＮＡは遺伝子診断法として最も一般的なＰＣＲ法だけでなく、むしろＬＡＭＰ法での検出に適していることが明らかとなった。実施例では、環境水および土壌水を対象としたが、対象はこれらだけにとどまるものではない。例えば、空中に浮遊、飛散しているウイルス、花粉、胞子、微小昆虫、など、水に溶解されれば、その後の工程は環境水と同様に扱うことができると考えられる。従って、本発明は環境中の様々な生物相の分析に活用が期待できる。
【符号の説明】
【0060】
１ キャップ付きサンプリングバッグ
２ ホース
３ シリコン栓
４ 塩化ビニル製のアダプタ
５ メッシュシート
６ 塩化ビニル製のアダプタ
１１ 吸引カップ
１２ メッシュシート
１３ 吸引瓶
２ ホース
３ シリコン栓
４ 塩化ビニル製のアダプタ
５ メッシュシート
６ 塩化ビニル製のアダプタ
１１ 吸引カップ
１２ メッシュシート
１３ 吸引瓶
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【配列表】