(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-01-29
(45)【発行日】2024-02-06
(54)【発明の名称】線維芽細胞の製造方法及びＧ－ＣＳＦ陽性線維芽細胞集団
(51)【国際特許分類】
C12N 5/02 20060101AFI20240130BHJP
C12N 5/071 20100101ALI20240130BHJP
【ＦＩ】
C12N5/02
C12N5/071
【請求項の数】
6
(21)【出願番号】P 2021076105
(22)【出願日】2021-04-28
(62)【分割の表示】P 2020539572の分割
【原出願日】2019-08-29
(65)【公開番号】P2021118728
(43)【公開日】2021-08-12
【審査請求日】2022-08-29
(31)【優先権主張番号】P 2018160898
(32)【優先日】2018-08-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】516200404
【氏名又は名称】株式会社メトセラ
(74)【代理人】
【識別番号】110002860
【氏名又は名称】弁理士法人秀和特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】岩宮 貴紘
(72)【発明者】
【氏名】大杉 友之
(72)【発明者】
【氏名】鈴木 雅也
【審査官】田ノ上 拓自
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１６／００６２６２（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特許第６８８３９０４（ＪＰ，Ｂ２）
【文献】Experimental Biology and Medicine，2018年04月，Vol.243，p.601-612，DOI: 10.1177/1535370218761628
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １／００－７／０８
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＣＤ１０６陽性及びＣＤ９０陽性の成体心臓由来線維芽細胞を製造する方法であって、成体心臓由来線維芽細胞を、ＴＮＦ－α及びＩＬ－４の存在下で培養し、ＣＤ１０６陽性及びＣＤ９０陽性の線維芽細胞を増加させるステップ、
を含む、方法。
【請求項2】
ＣＤ１０６陽性及びＣＤ９０陽性の線維芽細胞を濃縮するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記濃縮が、抗ＣＤ１０６抗体及び／又は抗ＣＤ９０抗体を用いて行われる、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
Ｇ－ＣＳＦ陽性の成体心臓由来線維芽細胞を製造する方法であって、成体心臓由来線維芽細胞をＴＮＦ－α及びＩＬ－４の存在の下で培養し、Ｇ－ＣＳＦの発現量を向上させ、Ｇ－ＣＳＦ陽性の線維芽細胞を増加させるステップ、
を含む、方法。
【請求項5】
前記培養後に、Ｇ－ＣＳＦ陽性の線維芽細胞を濃縮するステップをさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記濃縮が、抗ＣＤ１０６抗体及び／又は抗ＣＤ９０抗体を用いて行われる、請求項５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、主として、ＣＤ１０６陽性及び／又はＣＤ９０陽性の線維芽細胞の製造方法に関し、更には、該線維芽細胞を含む心臓疾患治療用医薬組成物に関する。また、Ｇ－ＣＳＦ陽性線維芽細胞を含む細胞集団に関する。
【背景技術】
【0002】
線維芽細胞は、生体の様々な臓器に存在する間質細胞の１種である。臓器・組織の炎症・傷害に応じて、増殖因子やサイトカインの分泌、細胞外マトリックスの産生と分解を行い、多様な細胞間相互作用を介して臓器・組織の機能を調節し、微小環境の恒常性を維持する役割を担っている。一方で、線維症やがんなどの疾患においても、線維芽細胞は病的な微小環境を維持し、病気を進行させる側面も有する。一般的に、線維芽細胞は細胞質突起を多数保持した紡錘形の細胞として知られているが、その局在する臓器ごとに線維芽細胞が発現する遺伝子・タンパク質は大きく異なることが知られている（非特許文献１参照）。
【0003】
線維芽細胞に関しては、本発明者らは先に、Ｖａｓｃｕｌａｒ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ－１（ＶＣＡＭ－１、ＣＤ１０６）陽性である線維芽細胞を用いて、機能的な心臓細胞シートが得られることを見出している（特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【文献】国際公開第２０１６／００６２６２号
【文献】国際公開第２０１８／１５５６５１号
【非特許文献】
【0005】
【文献】Ｃｈａｎｇ, Ｈ. Ｙ. ｅｔ ａｌ. Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ, ｔｏｐｏｇｒａｐｈｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ, ａｎｄ ｐｏｓｉｔｉｏｎａｌｍｅｍｏｒｙ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９９， １２８７７－１２８８２ （２００２）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
特許文献１では、十分な細胞数のＣＤ１０６陽性線維芽細胞を得るために、ＣＤ１０６をマーカーとしたセルソーティングなどの手法を用いている。しかしながら線維芽細胞によっては、ＣＤ１０６陽性線維芽細胞の量（細胞数）が非常に少ないという問題があった。
【0007】
他方、本発明者らは心臓疾患を治療するための注射剤を開発し、特許出願をおこなっている（特許文献２参照）。この際、注射剤として有効な線維芽細胞は、ＣＤ１０６陽性であることに加え、ＣＤ９０陽性であることが好ましいこと、を見出している。
本発明は、ＣＤ１０６陽性及び／又はＣＤ９０陽性の線維芽細胞を製造する新たな方法を提供することを課題とする。
本発明は、ＣＤ１０６陽性及び／又はＣＤ９０陽性の線維芽細胞を製造する新たな方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明者らは上記課題を解決すべく検討を進め、腫瘍に対して出血性壊死を誘発させる因子として知られているＴＮＦ－α（Ｔｕｍｏｒ Ｎｅｃｒｏｓｉｓ Ｆａｃｔｏｒ－α）及びアレルギー惹起作用などが知られているＩＬ－４（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－４）
からなる群から選択される１以上の存在下、線維芽細胞を培養することで、ＣＤ１０６陽性、及び／又はＣＤ９０陽性の線維芽細胞が増加することを見出し、本発明を完成させた。
本発明は以下の第１の側面（発明Ａ）を含む。
からなる群から選択される１以上の存在下、線維芽細胞を培養することで、ＣＤ１０６陽性、及び／又はＣＤ９０陽性の線維芽細胞が増加することを見出し、本発明を完成させた。
本発明は以下の第１の側面（発明Ａ）を含む。
【0009】
（Ａ１）ＣＤ１０６陽性及び／又はＣＤ９０陽性の線維芽細胞を製造する方法であって、
線維芽細胞を、ＴＮＦ－α及びＩＬ－４からなる群から選択される１以上の存在下で培養し、ＣＤ１０６陽性及び／又はＣＤ９０陽性の線維芽細胞を増加させるステップ、
を含む、方法。
（Ａ２）培養される線維芽細胞が、成体から得られた線維芽細胞である、（Ａ１）に記載の方法。
（Ａ３）前記ＣＤ１０６陽性及び／又はＣＤ９０陽性の線維芽細胞が、ＣＤ１０６陽性及びＣＤ９０陽性である、（Ａ１）又は（Ａ２）に記載の方法。
（Ａ４）ＣＤ１０６陽性及び／又はＣＤ９０陽性の線維芽細胞を濃縮するステップ、を更に含む（Ａ１）～（Ａ３）のいずれかに記載の方法。
（Ａ５）前記濃縮が、抗ＣＤ１０６抗体及び／又は抗ＣＤ９０抗体を用いて行われる、（Ａ４）のいずれかに記載の方法。
線維芽細胞を、ＴＮＦ－α及びＩＬ－４からなる群から選択される１以上の存在下で培養し、ＣＤ１０６陽性及び／又はＣＤ９０陽性の線維芽細胞を増加させるステップ、
を含む、方法。
（Ａ２）培養される線維芽細胞が、成体から得られた線維芽細胞である、（Ａ１）に記載の方法。
（Ａ３）前記ＣＤ１０６陽性及び／又はＣＤ９０陽性の線維芽細胞が、ＣＤ１０６陽性及びＣＤ９０陽性である、（Ａ１）又は（Ａ２）に記載の方法。
（Ａ４）ＣＤ１０６陽性及び／又はＣＤ９０陽性の線維芽細胞を濃縮するステップ、を更に含む（Ａ１）～（Ａ３）のいずれかに記載の方法。
（Ａ５）前記濃縮が、抗ＣＤ１０６抗体及び／又は抗ＣＤ９０抗体を用いて行われる、（Ａ４）のいずれかに記載の方法。
【0010】
また、本発明は以下の第２の側面（発明Ｂ）を含む。
（Ｂ１）ＣＤ１０６陽性の成体線維芽細胞を含む、線維芽細胞を含む細胞集団。
（Ｂ２）線維芽細胞に対するＣＤ１０６陽性の成体線維芽細胞の割合（細胞数）が３．３６％以上であり、好ましくは５％以上であり、更に好ましくは前記線維芽細胞の７％以上がＣＤ９０陽性、ＣＤ１０６陽性、且つＧ－ＣＳＦ陽性である、（Ｂ１）に記載の細胞集団。
（Ｂ３）前記成体線維芽細胞が、ＣＤ１０６陽性かつＣＤ９０陽性である、（Ｂ１）又は（Ｂ２）に記載の細胞集団。
（Ｂ４）前記成体線維芽細胞が、ＴＮＦ－α及び／又はＩＬ－４によって刺激された成体線維芽細胞である、（Ｂ１）～（Ｂ３）のいずれかに記載の細胞集団。
（Ｂ５）（Ｂ１）～（Ｂ４）のいずれかに記載の細胞集団と薬学的に許容可能な賦形剤を含む、医薬組成物。
（Ｂ６）虚血性心疾患治療薬である、（Ｂ５）に記載の医薬組成物。
（Ｂ７）成体線維芽細胞が由来する臓器に投与するための、（Ｂ５）又は（Ｂ６）に記載の医薬組成物。
（Ｂ１）ＣＤ１０６陽性の成体線維芽細胞を含む、線維芽細胞を含む細胞集団。
（Ｂ２）線維芽細胞に対するＣＤ１０６陽性の成体線維芽細胞の割合（細胞数）が３．３６％以上であり、好ましくは５％以上であり、更に好ましくは前記線維芽細胞の７％以上がＣＤ９０陽性、ＣＤ１０６陽性、且つＧ－ＣＳＦ陽性である、（Ｂ１）に記載の細胞集団。
（Ｂ３）前記成体線維芽細胞が、ＣＤ１０６陽性かつＣＤ９０陽性である、（Ｂ１）又は（Ｂ２）に記載の細胞集団。
（Ｂ４）前記成体線維芽細胞が、ＴＮＦ－α及び／又はＩＬ－４によって刺激された成体線維芽細胞である、（Ｂ１）～（Ｂ３）のいずれかに記載の細胞集団。
（Ｂ５）（Ｂ１）～（Ｂ４）のいずれかに記載の細胞集団と薬学的に許容可能な賦形剤を含む、医薬組成物。
（Ｂ６）虚血性心疾患治療薬である、（Ｂ５）に記載の医薬組成物。
（Ｂ７）成体線維芽細胞が由来する臓器に投与するための、（Ｂ５）又は（Ｂ６）に記載の医薬組成物。
【0011】
本発明は以下の第３の側面（発明Ｃ）を含む。
（Ｃ１）Ｇ－ＣＳＦ陽性の線維芽細胞を製造する方法であって、
線維芽細胞をＴＮＦ－α及びＩＬ－４からなる群から選択される１以上の存在下で培養し、Ｇ－ＣＳＦの発現量を向上させ、Ｇ－ＣＳＦ陽性の線維芽細胞を増加させるステップ、
を含む、方法。
（Ｃ２）培養される線維芽細胞が、成体から得られた線維芽細胞である、（Ｃ１）に記載の方法。
（Ｃ３）前記培養後に、Ｇ－ＣＳＦ陽性の線維芽細胞を濃縮するステップをさらに含む、（Ｃ１）又は（Ｃ２）に記載の方法。
（Ｃ４）前記濃縮が、抗ＣＤ１０６抗体及び／又は抗ＣＤ９０抗体でソーティングするステップ、を含む、（Ｃ１）から（Ｃ３）のいずれかに記載の方法。
（Ｃ５）単離されたＣＤ１０６陽性及びＧ－ＣＳＦ陽性である線維芽細胞を含む、細胞集団。
（Ｃ６）線維芽細胞に対するＧ－ＣＳＦ陽性の線維芽細胞の割合（細胞数）が６．７５％以上である、（Ｃ５）に記載の細胞集団。
（Ｃ１）Ｇ－ＣＳＦ陽性の線維芽細胞を製造する方法であって、
線維芽細胞をＴＮＦ－α及びＩＬ－４からなる群から選択される１以上の存在下で培養し、Ｇ－ＣＳＦの発現量を向上させ、Ｇ－ＣＳＦ陽性の線維芽細胞を増加させるステップ、
を含む、方法。
（Ｃ２）培養される線維芽細胞が、成体から得られた線維芽細胞である、（Ｃ１）に記載の方法。
（Ｃ３）前記培養後に、Ｇ－ＣＳＦ陽性の線維芽細胞を濃縮するステップをさらに含む、（Ｃ１）又は（Ｃ２）に記載の方法。
（Ｃ４）前記濃縮が、抗ＣＤ１０６抗体及び／又は抗ＣＤ９０抗体でソーティングするステップ、を含む、（Ｃ１）から（Ｃ３）のいずれかに記載の方法。
（Ｃ５）単離されたＣＤ１０６陽性及びＧ－ＣＳＦ陽性である線維芽細胞を含む、細胞集団。
（Ｃ６）線維芽細胞に対するＧ－ＣＳＦ陽性の線維芽細胞の割合（細胞数）が６．７５％以上である、（Ｃ５）に記載の細胞集団。
【0012】
本発明は、更に以下の側面（発明Ｄ）を含む。
（Ｄ１）Ｇ－ＣＳＦ陽性の線維芽細胞を含む、心臓疾患を治療するための注射用組成物。（Ｄ２）前記注射用組成物中、線維芽細胞に対するＧ－ＣＳＦ陽性の線維芽細胞の割合（細胞数）が６．７５％以上である、（Ｄ１）に記載の注射用組成物。
（Ｄ３）Ｇ－ＣＳＦ陽性の線維芽細胞を含む線維芽細胞集団を準備するステップ、
該線維芽細胞集団を、壊死した心臓組織領域乃至はその周辺に注射、及び／又は冠動脈内に注入するステップ、を含む心臓疾患を治療する方法。
（Ｄ４）前記線維芽細胞集団中、線維芽細胞に対するＧ－ＣＳＦ陽性の線維芽細胞の割合（細胞数）が６．７５％以上である、（Ｄ３）に記載の方法。
（Ｄ１）Ｇ－ＣＳＦ陽性の線維芽細胞を含む、心臓疾患を治療するための注射用組成物。（Ｄ２）前記注射用組成物中、線維芽細胞に対するＧ－ＣＳＦ陽性の線維芽細胞の割合（細胞数）が６．７５％以上である、（Ｄ１）に記載の注射用組成物。
（Ｄ３）Ｇ－ＣＳＦ陽性の線維芽細胞を含む線維芽細胞集団を準備するステップ、
該線維芽細胞集団を、壊死した心臓組織領域乃至はその周辺に注射、及び／又は冠動脈内に注入するステップ、を含む心臓疾患を治療する方法。
（Ｄ４）前記線維芽細胞集団中、線維芽細胞に対するＧ－ＣＳＦ陽性の線維芽細胞の割合（細胞数）が６．７５％以上である、（Ｄ３）に記載の方法。
【発明の効果】
【0013】
本発明により、ＣＤ１０６陽性及び／又はＣＤ９０陽性線維芽細胞を製造する、新たな方法を提供することができる。更に、Ｇ－ＣＳＦ陽性の線維芽細胞集団を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【図1】ＴＮＦ－α添加における、成体心臓由来線維芽細胞のフローサイトメトリー解析図である。
【図2】（Ａ）は、ＩＬ－４添加における、成体心臓由来線維芽細胞のフローサイトメトリー解析図である。（Ｂ）は、ＩＬ－４濃度による成体心臓由来線維芽細胞のＣＤ１０６陽性細胞の割合（％）（Ｎ＝３）、（Ｃ）は、ＩＬ－４濃度による成体心臓由来線維芽細胞のＣＤ９０陽性細胞の割合（％）（Ｎ＝３）、（Ｄ）は、ＩＬ－４濃度による成体心臓由来線維芽細胞のＣＤ１０６陽性及びＣＤ９０陽性細胞の割合（％）（Ｎ＝３）、をそれぞれ示すグラフである。
【図3-1】（Ｂ）は、ＴＮＦ－α及びＩＬ－４の２剤添加における、成体心臓由来線維芽細胞のフローサイトメトリー解析図である。なお、（Ａ）はコントロールであり、いずれも添加していない。
【図3-2】ＴＮＦ－αとＩＬ－４の添加濃度における、（Ａ）ＣＤ１０６陽性細胞の割合、（Ｂ）ＣＤ９０陽性細胞の割合、（Ｃ）両陽性（ＤＰ：ダブルポジティブ）細胞の割合、を示すグラフである（Ｎ＝３）。
【図4-1】（Ａ）は、ＴＮＦ－α（５０ ｎｇ／ｍＬ）とＩＬ－４（２ ｎｇ／ｍＬ）の添加による、胎児心臓由来線維芽細胞（Ｆ－ＨＣＦ）及びｉＰＳ心筋細胞フラクション由来線維芽細胞（ｉ－ＨＣＦ）のフローサイトメトリー解析図である。Ｃｏｎｔｒｏｌは、ＴＮＦ－α（５０ ｎｇ／ｍＬ）とＩＬ－４（２ ｎｇ／ｍＬ）を添加していないＦ－ＨＣＦ及びｉ－ＨＣＦのフローサイトメトリー解析図を示す。
【図4-2】（Ｂ）は、ＴＮＦ－α（５０ｎｇ／ｍＬ）とＩＬ－４（２ｎｇ／ｍＬ）の添加による、Ｆ－ＨＣＦのＣＤ１０６及びＣＤ９０陽性細胞の割合（％）を示す（Ｎ＝１）。Ｃｏｎｔｒｏｌは、ＴＮＦ－α（５０ ｎｇ／ｍＬ）とＩＬ－４（２ ｎｇ／ｍＬ）を添加していないＦ－ＨＣＦのＣＤ１０６及びＣＤ９０陽性細胞の割合（％）を示す（Ｎ＝１）。（Ｃ）は、ＴＮＦ－α（５０ ｎｇ／ｍＬ）とＩＬ－４（２ ｎｇ／ｍＬ）の添加による、ｉ－ＨＣＦのＣＤ１０６及びＣＤ９０陽性細胞の割合（％）を示す（Ｎ＝１）。Ｃｏｎｔｒｏｌは、ＴＮＦ－α（５０ ｎｇ／ｍＬ）とＩＬ－４（２ ｎｇ／ｍＬ）を添加していないｉ－ＨＣＦのＣＤ１０６及びＣＤ９０陽性細胞の割合（％）を示す（Ｎ＝１）。
【図5】（Ａ）は胎児心臓由来ＣＤ１０６陰性線維芽細胞（Ｆ－ＶＮＣＦ）のフローサイトメトリー解析図である。（Ｂ）は胎児心臓由来ＣＤ１０６陽性線維芽細胞（Ｆ－ＶＣＦ）のフローサイトメトリー解析図である。（Ｃ）成体心臓由来線維芽細胞（Ａ－ＨＣＦ）のフローサイトメトリー解析図である。（Ｄ）ＴＮＦ－α（５０ｎｇ／ｍＬ）とＩＬ－４（２ｎｇ／ｍＬ）添加し培養したＡ－ＨＣＦ（ｕＡ－ＨＣＦ）のフローサイトメトリー解析図である。（Ｅ）ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ－ａｃｔｉｖａｔｅｄｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ（ＦＡＣＳ）により回収したＣＤ１０６及びＣＤ９０両陽性のｕＡ－ＨＣＦ細胞群（ｕＡ９０・１０６－ＨＣＦ）のフローサイトメトリー解析図である。図中囲ったゲート（Ｐ４）の細胞のみをＦＡＣＳで回収した。（Ｆ）各種の線維芽細胞におけるＧ－ＣＳＦ遺伝子発現量（β－ａｃｔｉｎのＦＰＫＭで標準化したＧ－ＣＳＦのＦＰＫＭ）を示すグラフである（Ｆ－ＶＣＦとＦ－ＶＮＣＦはＮ＝３、その他はＮ＝２）。（Ｇ）各種の線維芽細胞におけるＧ－ＣＳＦ遺伝子発現量（β－ａｃｔｉｎのＦＰＫＭで標準化したＧ－ＣＳＦのＦＰＫＭ ｆｏｌｄ ｉｎｃｒｅａｓｅ。Ｆ－ＶＣＦの値を１とした。）を示すグラフである（Ｆ－ＶＣＦとＦ－ＶＮＣＦはＮ＝３、その他はＮ＝２）。
【図6】各種の心臓線維芽細胞と共培養したｉＰＳ由来心筋細胞（ｉＰＳ－ＣＭ）のＫｉ６７・ｃａｒｄｉａｃ ｔｒｏｐｏｎｉｎ Ｔ（ｃＴｎＴ）両陽性細胞数を示すグラフである（Ｄａｙ１０、＊＊＊Ｐ＜０．０１）。ｕＡ９０－ＨＣＦは、ＣＤ９０を指標にセルソーティングを行ったＣＤ９０陽性のｕＡ－ＨＣＦ細胞群を指し、ｕＡ１０６－ＨＣＦは、ＣＤ１０６を指標にセルソーティングを行ったＣＤ１０６陽性のｕＡ－ＨＣＦ細胞群を指す。なお、Ａ－ＨＣＦと共培養したｉＰＳ－ＣＭのＫｉ６７・ｃＴｎＴ両陽性細胞数を１とした（Ｎ＝３）。
【図7-1】（Ａ）慢性心不全モデルラットに投与した線維芽細胞のフローサイトメトリー解析図である。（Ｂ）慢性心不全モデルラットに投与した線維芽細胞のＣＤ１０６陽性細胞の割合、ＣＤ９０陽性細胞の割合、両陽性（ＤＰ：ダブルポジティブ）細胞の割合を示すグラフである。
【図7-2】ラット心臓の心エコーイメージ（Ｍモード）である（図面代用写真）。
【図7-3】（Ａ）各種の心臓線維芽細胞によるラット心臓のＬＶＥＦ（％）の変遷を示すグラフである。（Ｂ）各種の心臓線維芽細胞の注射後４週のＬＶＥＦの増減割合を示すグラフである（ＬＶＥＦ（４Ｗ）－ＬＶＥＦ（０Ｗ）、＊＊Ｐ＜０．０５、Ａ－ＨＣＦとｕＡ－ＨＣＦ投与群はＮ＝４、ｕＡ９０－ＨＣＦ投与群はＮ＝３で実施）。（Ｃ）各種の心臓線維芽細胞によるラット心臓のＬＶＦＳ（％）の変遷を示すグラフである。（Ｄ）各種の心臓線維芽細胞の注射後４週のＬＶＦＳの増減割合を示すグラフである（ＬＶＦＳ（４Ｗ）－ＬＶＦＳ（０Ｗ）、＊＊Ｐ＜０．０５、Ａ－ＨＣＦとｕＡ－ＨＣＦ投与群はＮ＝４、ｕＡ９０－ＨＣＦ投与群はＮ＝３で実施）。
【図8】（Ａ）各種の線維芽細胞のフローサイトメトリー解析図である。（Ｂ）各種の線維芽細胞のＧ－ＣＳＦ陽性細胞の割合（％）を示すグラフである（＊＊＊Ｐ＜０．０１、Ｎ＝４）。ｕＡ９０・１０６－ＨＣＦは、ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ－ａｃｔｉｖａｔｅｄｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ（ＦＡＣＳ）により回収したＣＤ１０６及びＣＤ９０両陽性のｕＡ－ＨＣＦ細胞群である。図中囲ったゲート（Ｐ３）の細胞のみをＦＡＣＳで回収した。
【図9-1】各種の心臓線維芽細胞を投与したラット慢性心不全モデルの心エコー画像（Ｍモード）である（写真代用図面）。
【図9-2】（Ａ）各種の心臓線維芽細胞による慢性心不全ラットモデルのＬＶＥＦ（％）の変遷を示すグラフである（＊＊＊＊Ｐ＜０．０１ ｖｓ． Ａ－ＨＣＦ，＊＊＊Ｐ＜０．０５ ｖｓ． ｕＡ－ＨＣＦ，＊＊Ｐ＜０．０１ ｖｓ． Ｃｏｎｔｒｏｌ（培地（ｈｉｇｈ－ｇｌｕｃｏｓｅ ＤＭＥＭ＋１０％新生仔牛血清（ＮＢＣＳ））のみを投与した群）、Ｓｈａｍ（Ｃｏｎｔｒｏｌおよび細胞投与群と同様な開胸手術を行うが、虚血-再灌流処置を施さない偽手術群）はＮ＝６、ＣｏｎｔｒｏｌはＮ＝４、Ａ－ＨＣＦ投与群はＮ＝７、ｕＡ－ＨＣＦ投与群はＮ＝８、ｕＡ９０－ＨＣＦ投与群はＮ＝９で実施）。（Ｂ）各種の心臓線維芽細胞の注射１８週後のＬＶＥＦの増減差を示すグラフである（ＬＶＥＦ（１８Ｗ）－ＬＶＥＦ（０Ｗ），＊＊＊＊Ｐ＜０．０１ ｖｓ． Ａ－ＨＣＦ，＊＊＊Ｐ＜０．０１ ｖｓ． ｕＡ－ＨＣＦ，＊＊Ｐ＜０．０１ ｖｓ． Ｃｏｎｔｒｏｌ，＊Ｐ＜０．０５ ｖｓ． Ｃｏｎｔｒｏｌ）。（Ｃ）各種の心臓線維芽細胞による慢性心不全ラットモデルのＬＶＦＳ（％）の変遷を示すグラフである（＊＊＊＊Ｐ＜０．０１ ｖｓ． Ａ－ＨＣＦ，＊＊＊Ｐ＜０．０５ ｖｓ． ｕＡ－ＨＣＦ，＊＊Ｐ＜０．０１ ｖｓ． Ｃｏｎｔｒｏｌ）。（Ｄ）各種の心臓線維芽細胞の注射後１８週のＬＶＦＳの増減差を示すグラフである（ＬＶＦＳ（１８Ｗ）－ＬＶＦＳ（０Ｗ），＊＊＊＊Ｐ＜０．０１ ｖｓ． Ａ－ＨＣＦ，＊＊＊Ｐ＜０．０５ ｖｓ． ｕＡ－ＨＣＦ，＊＊Ｐ＜０．０１ ｖｓ． Ｃｏｎｔｒｏｌ）。
【発明を実施するための形態】
【0015】
以下、本発明について具体的実施形態を用いて詳細に説明するが、本発明は示された具体的実施形態にのみ限定されるものではない。
本発明の一実施形態は、ＣＤ１０６陽性（ＣＤ１０６＋とも表記する）及び／又はＣＤ９０陽性（ＣＤ９０＋とも表記する）の線維芽細胞を製造する方法であり、線維芽細胞と、ＴＮＦ－α及びＩＬ－４からなる群から選択される１以上の存在下で培養し、ＣＤ１０６陽性及び／又はＣＤ９０陽性の線維芽細胞を増加させるステップ、を含む。ＴＮＦ－α及びＩＬ－４からなる群から選択される１以上の存在下で培養することで、ＣＤ１０６＋及び／又はＣＤ９０＋の線維芽細胞を増加させた、線維芽細胞集団を製造することができる。
本発明の一実施形態は、ＣＤ１０６陽性（ＣＤ１０６＋とも表記する）及び／又はＣＤ９０陽性（ＣＤ９０＋とも表記する）の線維芽細胞を製造する方法であり、線維芽細胞と、ＴＮＦ－α及びＩＬ－４からなる群から選択される１以上の存在下で培養し、ＣＤ１０６陽性及び／又はＣＤ９０陽性の線維芽細胞を増加させるステップ、を含む。ＴＮＦ－α及びＩＬ－４からなる群から選択される１以上の存在下で培養することで、ＣＤ１０６＋及び／又はＣＤ９０＋の線維芽細胞を増加させた、線維芽細胞集団を製造することができる。
【0016】
本明細書では、「濃縮」とは、総細胞数における特定の細胞の数の比が増加する細胞の分離操作を意味する。但し本明細書中において「培養」は「濃縮」には含まれない。本明細書では、「単離」とは、ある成分を組織から分離されることを意味し、「精製」とは、ある成分を少なくとも１以上の他の成分から分離されることを意味する。
【0017】
本明細書では、「陽性」又は「ポジティブ」 とは、細胞が検出可能なレベルのマーカ
ーを発現することを意味する。
ーを発現することを意味する。
【0018】
本明細書では、「含む」とは、特定されていない第三成分を含んでいてもよいことを意味する。本明細書では、「からなる」とは、特定されていない第三成分を本質的に含まないことを意味する。本質的に含まないとは、製造過程で混入した技術的に除去できない程度の量の第三成分を含むことを除外しない意味で用いられる。
【0019】
線維芽細胞は、コラーゲンその他の細胞外マトリックスを産生する間質細胞の一種である。線維芽細胞は、体内では結合組織に存在し、その主要な構成成分となっている細胞種である。線維芽細胞は、間質細胞マーカーであるビメンチンおよびＤＤＲ２からなる群から選択される１以上が陽性であり得る。ある態様では、線維芽細胞は、心筋細胞特異的マーカーである心筋トロポニン、およびαアクチニンに対して陽性である細胞ではない。ある態様では、線維芽細胞は、ＶＥ－カドヘリンに陽性である細胞ではない。例えば、線維芽細胞は、血管内皮細胞ではない。例えば、線維芽細胞は、血管平滑筋細胞ではない。線維芽細胞は、筋線維芽細胞であり得、あるいは、筋線維芽細胞ではないこともできる。
線維芽細胞は、心臓組織に由来する線維芽細胞であり得、例えば、心臓組織から単離された線維芽細胞であり得る。線維芽細胞は、心外膜又は心内膜から単離された線維芽細胞であり得る。線維芽細胞は、胎児の心外膜又は心内膜から単離された線維芽細胞であり得る。線維芽細胞は、成体の心外膜又は心内膜から単離された線維芽細胞であり得る。線維芽細胞は、ビメンチンおよびＤＤＲ２からなる群から選択される１以上が陽性である、コラーゲン産生能を有する細胞であり得る。線維芽細胞は、本発明のすべての態様において、好ましくは、心臓組織に由来する線維芽細胞（以下、「心臓線維芽細胞」ということがある）であり得、例えば、心外膜又は心内膜から単離された線維芽細胞であり得る。
本発明の実施形態では、生体において線維芽細胞に分化するあらゆる細胞を線維芽細胞の材料として用いてもよい。
本発明の実施形態では、心臓に移植する目的で用いられる線維芽細胞は、好ましくは、心臓組織、心外膜又は心内膜に由来する線維芽細胞であり得る。
本発明の実施形態では、線維芽細胞は、濃縮、単離または精製された線維芽細胞であり
得る。
線維芽細胞は、心臓組織に由来する線維芽細胞であり得、例えば、心臓組織から単離された線維芽細胞であり得る。線維芽細胞は、心外膜又は心内膜から単離された線維芽細胞であり得る。線維芽細胞は、胎児の心外膜又は心内膜から単離された線維芽細胞であり得る。線維芽細胞は、成体の心外膜又は心内膜から単離された線維芽細胞であり得る。線維芽細胞は、ビメンチンおよびＤＤＲ２からなる群から選択される１以上が陽性である、コラーゲン産生能を有する細胞であり得る。線維芽細胞は、本発明のすべての態様において、好ましくは、心臓組織に由来する線維芽細胞（以下、「心臓線維芽細胞」ということがある）であり得、例えば、心外膜又は心内膜から単離された線維芽細胞であり得る。
本発明の実施形態では、生体において線維芽細胞に分化するあらゆる細胞を線維芽細胞の材料として用いてもよい。
本発明の実施形態では、心臓に移植する目的で用いられる線維芽細胞は、好ましくは、心臓組織、心外膜又は心内膜に由来する線維芽細胞であり得る。
本発明の実施形態では、線維芽細胞は、濃縮、単離または精製された線維芽細胞であり
得る。
【0020】
線維芽細胞の由来に制限はなく、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）及びＭｕｓｅ細胞等の多能性幹細胞や、間葉系幹細胞などの成体（体性）幹細胞を分化させて用いてもよい。また、動物（ヒトを含む）から採取したプライマリー細胞を用いてもよく、株化した細胞を用いてもよい。心外膜又は心内膜由来の線維芽細胞を用いることが好ましく、また、ヒト成体の心臓から得られた線維芽細胞であることが好ましいが、これらに限られない。
【0021】
上記において、線維芽細胞について述べたが、すべての態様において、線維芽細胞が、心臓組織に由来する線維芽細胞、および心外膜又は心内膜から単離された線維芽細胞でも同様である。以下実施例では、線維芽細胞として、心臓線維芽細胞を例示的に用いた実験において本発明を説明する。
【0022】
ＣＤ１０６は、ＶＣＡＭ－１（ＶＣＡＭ１）とも称され、血管内皮細胞等に発現する細胞接着分子として既知のタンパク質である。ＣＤ９０は、Ｔｈｙ－１（Ｔｈｙ１）とも称され、糖鎖に富むグリコシル－フォスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）結合型分子であり、また神経組織、結合組織など様々なストロマ細胞に発現するが、心筋細胞には発現しない。そのため、ＣＤ９０＋線維芽細胞は、心筋細胞を含まないことを示す。なおここでいう「ＣＤ９０＋線維芽細胞は、心筋細胞を含まない」とは、多少含まれていることは許容する概念であり、全細胞に対して５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、１％以下、０．５％以下、０．１％以下、０．０１％以下であってよい。
【0023】
ＣＤ１０６＋線維芽細胞のうち、ＣＤ９０＋線維芽細胞である割合（細胞数基準）は１％以上であってよく、１０％以上であってよく、２０％以上であってよく、３０％以上であってよく、４０％以上であってよく、５０％以上であってよく、６０％以上であってよく、７０％以上であってよく、８０％以上であってよく、９０％以上であってよく、９５％以上であってよく、９８％以上であってよく、１００％であってよい。
【0024】
線維芽細胞は、Ｃｏｎｎｅｘｉｎ４３陽性（Ｃｏｎｎｅｘｉｎ４３＋）線維芽細胞であってよい。
Ｃｏｎｎｅｘｉｎ４３は、血管の表面で動脈硬化性プラークとともに発現することや、心筋細胞のギャップジャンクションとして隣接する細胞と結合し、心臓の電気的な興奮を伝搬することが知られている膜貫通タンパク質である。Ｃｏｎｎｅｘｉｎ４３＋であることで、心臓組織内の電気的シグナルのやりとりが可能となり、心臓疾患に適用した際に、治療効果を改善させると本発明者らは考えている。
ＣＤ１０６＋線維芽細胞のうち、Ｃｏｎｎｅｘｉｎ４３＋線維芽細胞の割合（細胞数基準）は１％以上であってよく、１０％以上であってよく、２０％以上であってよく、３０％以上であってよく、４０％以上であってよく、５０％以上であってよく、６０％以上であってよく、７０％以上であってよく、８０％以上であってよく、９０％以上であってよく、９５％以上であってよく、９８％以上であってよく、１００％であってよい。
Ｃｏｎｎｅｘｉｎ４３は、血管の表面で動脈硬化性プラークとともに発現することや、心筋細胞のギャップジャンクションとして隣接する細胞と結合し、心臓の電気的な興奮を伝搬することが知られている膜貫通タンパク質である。Ｃｏｎｎｅｘｉｎ４３＋であることで、心臓組織内の電気的シグナルのやりとりが可能となり、心臓疾患に適用した際に、治療効果を改善させると本発明者らは考えている。
ＣＤ１０６＋線維芽細胞のうち、Ｃｏｎｎｅｘｉｎ４３＋線維芽細胞の割合（細胞数基準）は１％以上であってよく、１０％以上であってよく、２０％以上であってよく、３０％以上であってよく、４０％以上であってよく、５０％以上であってよく、６０％以上であってよく、７０％以上であってよく、８０％以上であってよく、９０％以上であってよく、９５％以上であってよく、９８％以上であってよく、１００％であってよい。
【0025】
線維芽細胞と、ＴＮＦ－α及びＩＬ－４からなる群から選択される１種以上の因子（以下、単に因子ともいう。）との接触の方法は特段限定されず、典型的には線維芽細胞を含む培地に因子を添加することであるが、これに限られない。複数の因子と接触させる場合には、それぞれ別々に線維芽細胞と接触させてもよく、同時に接触させてもよい。因子を同時に接触させる方法としては、一度複数因子を混合した後に線維芽細胞に添加してもよい。
【0026】
本実施形態では、因子を添加した培地で線維芽細胞を培養できることから、線維芽細胞
におけるＣＤ１０６及び／又はＣＤ９０の発現レベルを維持したまま線維芽細胞を培養できる。そのため、高いＣＤ１０６及び／又はＣＤ９０発現レベルの、線維芽細胞を製造することができる。
におけるＣＤ１０６及び／又はＣＤ９０の発現レベルを維持したまま線維芽細胞を培養できる。そのため、高いＣＤ１０６及び／又はＣＤ９０発現レベルの、線維芽細胞を製造することができる。
【0027】
これらの因子を培地（ｍＬ）に添加する場合、ＴＮＦ－αの添加量は特段限定されないが、通常０．１ｎｇ／ｍＬ以上であり、０．５ｎｇ／ｍＬ以上であってよく、１ｎｇ／ｍＬ以上であってよく、１０ｎｇ／ｍＬ以上であってよい。上限は特に限定されず、通常５００ｎｇ／ｍＬ以下であり、１００ｎｇ／ｍＬ以下であってよい。
また、ＩＬ－４の添加量は特段限定されないが、通常０．１ｎｇ／ｍＬ以上であり、０．５ｎｇ／ｍＬ以上であってよく、１ｎｇ／ｍＬ以上であってよい。上限は特に限定されず、通常１０ｎｇ／ｍＬ以下であり、５ｎｇ／ｍＬ以下であってよく、１ｎｇ／ｍＬ以下であってよい。
両因子を添加する場合には、添加するＴＮＦ－αとＩＬ－４の比（重量比）は、ＴＮＦ－α：ＩＬ－４で通常１００００：１～１：１であり、５００００：１～１０：１であってもよい。また、１：１～１：１００００であり、１：１０～１：５００００であってもよい。
また、ＩＬ－４の添加量は特段限定されないが、通常０．１ｎｇ／ｍＬ以上であり、０．５ｎｇ／ｍＬ以上であってよく、１ｎｇ／ｍＬ以上であってよい。上限は特に限定されず、通常１０ｎｇ／ｍＬ以下であり、５ｎｇ／ｍＬ以下であってよく、１ｎｇ／ｍＬ以下であってよい。
両因子を添加する場合には、添加するＴＮＦ－αとＩＬ－４の比（重量比）は、ＴＮＦ－α：ＩＬ－４で通常１００００：１～１：１であり、５００００：１～１０：１であってもよい。また、１：１～１：１００００であり、１：１０～１：５００００であってもよい。
【0028】
これらの因子と接触させた線維芽細胞を更に培養することで、ＣＤ１０６＋及び／又はＣＤ９０＋線維芽細胞を製造することができる。
線維芽細胞の培養は、ＣＤ１０６＋及び／又はＣＤ９０＋になり得る、またはその培養に適した条件下であれば特段限定されず、既知の細胞培養方法により行ってよい。
培養に用いられる培地は、培養する細胞の種類等により適宜設定可能であるが、たとえば、ＤＭＥＭ、α－ＭＥＭ、ＲＰＭＩ－１６４０、ＨＦＤＭ－１（＋）等が使用可能である。当該培地にＦＣＳやＦＢＳ等の栄養物質や増殖因子、サイトカイン、抗生物質等を添加してもよい。さらに、ＴＮＦ－α及び／又はＩＬ－４を含む培地で培養してもよい。
線維芽細胞の培養は、ＣＤ１０６＋及び／又はＣＤ９０＋になり得る、またはその培養に適した条件下であれば特段限定されず、既知の細胞培養方法により行ってよい。
培養に用いられる培地は、培養する細胞の種類等により適宜設定可能であるが、たとえば、ＤＭＥＭ、α－ＭＥＭ、ＲＰＭＩ－１６４０、ＨＦＤＭ－１（＋）等が使用可能である。当該培地にＦＣＳやＦＢＳ等の栄養物質や増殖因子、サイトカイン、抗生物質等を添加してもよい。さらに、ＴＮＦ－α及び／又はＩＬ－４を含む培地で培養してもよい。
【0029】
培養期間は、所望の細胞数となるまで、及び／又は所望の機能が備わるまで等の目的に応じて日数を適宜設定できる。例えば、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、２週間、１カ月、２カ月、３カ月、６カ月等の期間があげられる。
培養温度は、培養する細胞の種類に合わせて適宜設定可能であるが、例えば１０℃以上、１５℃以上、２０℃以上、２５℃以上、３０℃以上であってよく、また６０℃以下、５５℃以下、５０℃以下、４５℃以下、４０℃以下であってよい。
培養温度は、培養する細胞の種類に合わせて適宜設定可能であるが、例えば１０℃以上、１５℃以上、２０℃以上、２５℃以上、３０℃以上であってよく、また６０℃以下、５５℃以下、５０℃以下、４５℃以下、４０℃以下であってよい。
【0030】
培養した線維芽細胞は、回収ステップにより回収されてよい。回収ステップは、トリプシン等のプロテアーゼにより細胞を剥離して回収してよいが、温度応答性培養皿を使用して、温度変化により細胞を剥離させ、回収してもよい。また、抗ＣＤ９０抗体及び／又は抗ＣＤ１０６抗体を用いて、自動磁気細胞分離装置（例えばａｕｔｏＭＡＣＳ）で回収または濃縮してもよく、磁気細胞分離装置（例えばＭＡＣＳ）で回収または濃縮してもよく、閉鎖型磁気細胞分離装置（例えばＰｒｏｄｉｇｙ）で回収または濃縮してもよく、セルソータ（例えばＦＡＣＳ）で回収または濃縮してもよい。また、ＣＤ９０タンパク質及び／又はＣＤ１０６タンパク質コード遺伝子のプロモーター下に薬剤耐性遺伝子を導入し、薬剤でセレクションしてもよい。
【0031】
本実施形態の製造方法では、抗ＣＤ９０抗体を用いて、ＣＤ９０＋の線維芽細胞をソーティングするステップを含んでよく、抗ＣＤ１０６抗体を用いて、ＣＤ１０６＋の線維芽細胞をソーティングするステップを含んでよく、これら２つのステップを併せて含んでよい。ソーティングするステップは、どのタイミングで行ってもよい。上記因子との接触前でもよく、因子との接触後、培養前であってよく、培養後であってよい。
抗ＣＤ９０抗体及び抗ＣＤ１０６抗体は、既知のものを使用することが可能であり、市販品を入手して使用できる。抗ＣＤ９０抗体及び／又は抗ＣＤ１０６抗体を用いてソーテ
ィングすることで、線維芽細胞におけるＣＤ１０６＋及び／又はＣＤ９０＋線維芽細胞の割合を増加させ、心臓疾患治療効果の高いＣＤ１０６＋及び／又はＣＤ９０＋の線維芽細胞を得ることができる。
抗ＣＤ９０抗体及び抗ＣＤ１０６抗体は、既知のものを使用することが可能であり、市販品を入手して使用できる。抗ＣＤ９０抗体及び／又は抗ＣＤ１０６抗体を用いてソーテ
ィングすることで、線維芽細胞におけるＣＤ１０６＋及び／又はＣＤ９０＋線維芽細胞の割合を増加させ、心臓疾患治療効果の高いＣＤ１０６＋及び／又はＣＤ９０＋の線維芽細胞を得ることができる。
【0032】
本実施形態のＣＤ１０６＋及び／又はＣＤ９０＋線維芽細胞の製造方法により、ＣＤ１０６及び／又はＣＤ９０の発現が向上した線維芽細胞が得られ、当該線維芽細胞を含む線維芽細胞集団が本発明の別の実施形態である。特に、ＣＤ１０６＋及び／又はＣＤ９０＋成体線維芽細胞を含む線維芽細胞の細胞集団は、ＴＮＦ－α及び／又はＩＬ－４により刺激されることで、ＣＤ１０６及び／又はＣＤ９０の発現が向上しており、医薬組成物として好適に使用できる。
【0033】
細胞集団において、全線維芽細胞に対するＣＤ１０６＋の線維芽細胞の割合は特段限定されないが、細胞数基準で、３．３６％以上であってよく、５％以上であってよく、１０％以上であってよく、２０％以上であってよく、３０％以上であってよく、４０％以上であってよく、５０％以上であってよく、６０％以上であってよく、７０％以上であってよく、８０％以上であってよく、９０％以上であってよく、９５％以上であってよい。
【0034】
細胞集団において、全線維芽細胞に対するＣＤ９０＋の線維芽細胞の割合は特段限定されないが、細胞数基準で、５％以上であってよく、１０％以上であってよく、２０％以上であってよく、３０％以上であってよく、４０％以上であってよく、５０％以上であってよく、６０％以上であってよく、７０％以上であってよく、８０％以上であってよく、９０％以上であってよく、９５％以上であってよい。
【0035】
細胞集団において、全線維芽細胞に対するＣＤ１０６＋及びＣＤ９０＋の線維芽細胞の割合は特段限定されないが、細胞数基準で、５％以上であってよく、１０％以上であってよく、２０％以上であってよく、３０％以上であってよく、４０％以上であってよく、５０％以上であってよく、６０％以上であってよく、７０％以上であってよく、８０％以上であってよく、９０％以上であってよく、９５％以上であってよい。
【0036】
また、線維芽細胞と、ＴＮＦ－α及びＩＬ－４からなる群から選択される１種以上の因子との接触により、Ｇ－ＣＳＦ陽性の線維芽細胞を製造できることも、本発明者らは見出している。
Ｇ－ＣＳＦは心不全に伴う心筋細胞死を抑制し、心筋リモデリングの進行を抑制することが報告されている（Ｈａｒａｄａ，Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ｇ－ＣＳＦ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ｃａｒｄｉａｃ ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ ａｆｔｅｒ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ ｂｙ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｊａｋ－Ｓｔａｔ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ． Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１１，３０５－３１１（２００５））。また、心筋細胞の細胞増殖を促すことも明らかとなっている（Ｓｈｉｍｏｊｉ， Ｋ． ｅｔ ａｌ． Ｇ－ＣＳＦ Ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｔｈｅ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ ＩｎＶｉｖｏ ａｎｄ ｉｎ Ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ＥＳＣｓ ａｎｄ ｉＰＳＣｓ． Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ６，２２７－２３７（２０１０））。
Ｇ－ＣＳＦは心不全に伴う心筋細胞死を抑制し、心筋リモデリングの進行を抑制することが報告されている（Ｈａｒａｄａ，Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ｇ－ＣＳＦ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ｃａｒｄｉａｃ ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ ａｆｔｅｒ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ ｂｙ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｊａｋ－Ｓｔａｔ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ． Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１１，３０５－３１１（２００５））。また、心筋細胞の細胞増殖を促すことも明らかとなっている（Ｓｈｉｍｏｊｉ， Ｋ． ｅｔ ａｌ． Ｇ－ＣＳＦ Ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｔｈｅ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ ＩｎＶｉｖｏ ａｎｄ ｉｎ Ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ＥＳＣｓ ａｎｄ ｉＰＳＣｓ． Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ６，２２７－２３７（２０１０））。
【0037】
従って、本発明の別の形態としては、線維芽細胞と、ＴＮＦ－α及びＩＬ－４からなる群から選択される１以上とを接触させる接触ステップ、及び前記接触させた線維芽細胞を、Ｇ－ＣＳＦの発現を向上させる条件下で培養する培養ステップ、を含む、Ｇ－ＣＳＦ陽性の線維芽細胞を製造する方法である。
本実施形態の接触ステップ、及び培養ステップ等については、上記ＣＤ１０６＋及び／又はＣＤ９０＋線維芽細胞の製造方法に関する記載を援用できる。製造されたＧ－ＣＳＦ陽性の線維芽細胞は、抗ＣＤ９０抗体及び／又は抗ＣＤ１０６抗体を用いて、自動磁気細
胞分離装置（例えばａｕｔｏＭＡＣＳ）で濃縮してもよく、磁気細胞分離装置（例えばＭＡＣＳ）で濃縮してもよく、閉鎖型磁気細胞分離装置（例えばＰｒｏｄｉｇｙ）で濃縮してもよく、セルソータ（例えばＦＡＣＳ）で濃縮してもよい。また、Ｇ－ＣＳＦタンパク質コード遺伝子のプロモーター下に薬剤耐性遺伝子を導入し、薬剤でセレクションしてもよい。
本実施形態の接触ステップ、及び培養ステップ等については、上記ＣＤ１０６＋及び／又はＣＤ９０＋線維芽細胞の製造方法に関する記載を援用できる。製造されたＧ－ＣＳＦ陽性の線維芽細胞は、抗ＣＤ９０抗体及び／又は抗ＣＤ１０６抗体を用いて、自動磁気細
胞分離装置（例えばａｕｔｏＭＡＣＳ）で濃縮してもよく、磁気細胞分離装置（例えばＭＡＣＳ）で濃縮してもよく、閉鎖型磁気細胞分離装置（例えばＰｒｏｄｉｇｙ）で濃縮してもよく、セルソータ（例えばＦＡＣＳ）で濃縮してもよい。また、Ｇ－ＣＳＦタンパク質コード遺伝子のプロモーター下に薬剤耐性遺伝子を導入し、薬剤でセレクションしてもよい。
【0038】
本実施形態のＧ－ＣＳＦ陽性線維芽細胞の製造方法により、Ｇ－ＣＳＦ陽性線維芽細胞が得られ、当該Ｇ－ＣＳＦ陽性線維芽細胞を含む線維芽細胞集団もまた本発明の別の実施形態であり、医薬組成物として好適に使用できるほか、該Ｇ－ＣＳＦ陽性線維芽細胞を含む細胞集団を壊死した心臓組織領域乃至はその周辺に注射、及び／又は冠動脈内に注入するステップ、を含む心臓疾患を治療する方法にも適用できる。
【0039】
線維芽細胞を含む細胞集団において、全線維芽細胞に対するＧ－ＣＳＦ陽性線維芽細胞の割合は特段限定されないが、細胞数基準で、１％以上であってよく、５％以上であってよく、６．７５％以上であってよく、１０％以上であってよく、２０％以上であってよく、３０％以上であってよく、４０％以上であってよく、５０％以上であってよく、６０％以上であってよく、７０％以上であってよく、８０％以上であってよく、９０％以上であってよく、９５％以上であってよい。
【0040】
また、線維芽細胞においてＧ－ＣＳＦタンパク質をコードする遺伝子の発現量が、β－ａｃｔｉｎで標準化したＦＰＫＭが０．０１以上であってよく、０．０２以上であってよく、０．０３以上であってよく、０．０４以上であってよく、０．０５以上であってよく、０．１以上であってよい。
また、線維芽細胞においてＧ－ＣＳＦタンパク質をコードする遺伝子の発現量が、天然（生体）の線維芽細胞の発現レベルと比較して、１．１倍以上であってよく、２倍以上であってよく、５倍以上であってよく、１０倍以上であってよく、２０倍以上であってよく、５０倍以上であってよく、１００倍以上であってよく、２００倍以上であってよく、５００倍以上であってよい。
また、線維芽細胞においてＧ－ＣＳＦタンパク質をコードする遺伝子の発現量が、天然（生体）の線維芽細胞の発現レベルと比較して、１．１倍以上であってよく、２倍以上であってよく、５倍以上であってよく、１０倍以上であってよく、２０倍以上であってよく、５０倍以上であってよく、１００倍以上であってよく、２００倍以上であってよく、５００倍以上であってよい。
【0041】
また、Ｇ－ＣＳＦ陽性線維芽細胞は、ＣＤ１０６及び／又はＣＤ９０に陽性であってよく、線維芽細胞の割合（細胞数基準）は１％以上であってよく、１０％以上であってよく、２０％以上であってよく、３０％以上であってよく、４０％以上であってよく、５０％以上であってよく、６０％以上であってよく、７０％以上であってよく、８０％以上であってよく、９０％以上であってよく、９５％以上であってよく、９８％以上であってよく、１００％であってよい。
線維芽細胞を含む細胞集団において、ＣＤ１０６及び／又はＣＤ９０に陽性である線維芽細胞のうち、Ｇ－ＣＳＦ陽性である線維芽細胞の割合（細胞数基準）は、１％以上であってよく、３％以上であってよく、５％以上であってよく、１０％以上であってよく、２５％以上であってよく、５０％以上であってよい。
線維芽細胞を含む細胞集団において、ＣＤ１０６及び／又はＣＤ９０に陽性である線維芽細胞のうち、Ｇ－ＣＳＦ陽性である線維芽細胞の割合（細胞数基準）は、１％以上であってよく、３％以上であってよく、５％以上であってよく、１０％以上であってよく、２５％以上であってよく、５０％以上であってよい。
【0042】
特に、Ｇ－ＣＳＦ陽性、ＣＤ１０６陽性、且つＣＤ９０陽性である線維芽細胞は、線維芽細胞を含む細胞集団において、細胞数基準で１％以上であってよく、５％以上であってよく、７％以上であってよく、１０％以上であってよく、２０％以上であってよく、３０％以上であってよく、４０％以上であってよく、５０％以上であってよく、６０％以上であってよく、７０％以上であってよく、８０％以上であってよく、９０％以上であってよく、９５％以上であってよく、９８％以上であってよく、１００％であってよい。
【0043】
医薬組成物としての線維芽細胞の細胞集団は、線維芽細胞の細胞集団以外に、医薬組成物として生理学的に許容される他の成分を含有してもよい。
【0044】
本実施形態の医薬組成物は、心臓疾患患者に適用することで、その心臓の機能を改善することができる。本実施形態において心臓疾患は、心臓組織の障害、欠損、機能不全などに起因する疾患が含まれ、心不全、虚血性心疾患、心筋梗塞、心筋症、心筋炎、肥大型心筋症、拡張型心筋症などが例示されるが、これらに限られない。すなわち、本発明によれば、ＣＤ１０６＋及び／又はＣＤ９０＋線維芽細胞、或いはＧ－ＣＳＦ＋線維芽細胞を含む医薬組成物であって、心機能を改善することに用いるための、例えば、インビボで心筋を増殖させることに用いるための、及び／又は、心臓の駆出率を改善することに用いるための、医薬組成物が提供される。本発明によればまた、ＣＤ１０６＋及び／又はＣＤ９０＋線維芽細胞、或いはＧ－ＣＳＦ＋線維芽細胞を含む医薬組成物であって、心臓組織の線維化の進行を抑制することに用いるための医薬組成物が提供される。
【0045】
ＣＤ１０６＋及び／又はＣＤ９０＋線維芽細胞は、或いはＧ－ＣＳＦ＋線維芽細胞は、臓器の恒常性維持のためサイトカイン等を分泌して炎症反応を調整し、分泌されたサイトカイン・ケモカイン等が心筋組織の再生に適した微小環境を形成し、心筋細胞の増殖、心筋細胞の拍動調整をし得る。また、ＣＤ１０６＋及び／又はＣＤ９０＋線維芽細胞は、或いはＧ－ＣＳＦ＋線維芽細胞は、線維症の進行を抑制し得る。
【0046】
心臓疾患患者への、医薬組成物の適用方法の一例は、注射である。
医薬組成物を注射剤（注射用組成物）として用いる場合、注射剤には、ＣＤ１０６＋及び／又はＣＤ９０＋線維芽細胞、或いはＧ－ＣＳＦ＋線維芽細胞以外に、他の細胞や他の成分を含んでもよく、他の細胞を含む場合、注射剤に含まれる線維芽細胞全量に対し、ＣＤ１０６＋及び／又はＣＤ９０＋線維芽細胞、或いはＧ－ＣＳＦ＋線維芽細胞の割合は細胞数基準で０．０３％以上であってよく、０．１％以上であってよく、１％以上であってよく、２％以上であってよく、４％以上であってよく、５％以上であってよく、６．７５％以上であってよく、１０％以上であってよく、２０％以上であってよく、３０％以上であってよく、４０％以上であってよく、５０％以上であってよく、６０％以上であってよく、７０％以上であってよく、８０％以上であってよく、９０％以上であってよく、９５％以上であってよく、９８％以上であってよく、９９％以上であってよい。
また、注射剤とする場合、注射剤中に含まれるＣＤ１０６＋及び／又はＣＤ９０＋かつＧ－ＣＳＦ＋線維芽細胞数が１×１０６ｃeｌｌ以上であってよく、５×１０６ｃeｌｌ以上であってよく、１×１０７ｃeｌｌ以上であってよい。
注射用組成物に含まれるＣＤ１０６＋及び／又はＣＤ９０＋線維芽細胞は、或いはＧ－ＣＳＦ＋線維芽細胞は、他の細胞、例えば心筋細胞と共培養した細胞であってよい。
医薬組成物を注射剤（注射用組成物）として用いる場合、注射剤には、ＣＤ１０６＋及び／又はＣＤ９０＋線維芽細胞、或いはＧ－ＣＳＦ＋線維芽細胞以外に、他の細胞や他の成分を含んでもよく、他の細胞を含む場合、注射剤に含まれる線維芽細胞全量に対し、ＣＤ１０６＋及び／又はＣＤ９０＋線維芽細胞、或いはＧ－ＣＳＦ＋線維芽細胞の割合は細胞数基準で０．０３％以上であってよく、０．１％以上であってよく、１％以上であってよく、２％以上であってよく、４％以上であってよく、５％以上であってよく、６．７５％以上であってよく、１０％以上であってよく、２０％以上であってよく、３０％以上であってよく、４０％以上であってよく、５０％以上であってよく、６０％以上であってよく、７０％以上であってよく、８０％以上であってよく、９０％以上であってよく、９５％以上であってよく、９８％以上であってよく、９９％以上であってよい。
また、注射剤とする場合、注射剤中に含まれるＣＤ１０６＋及び／又はＣＤ９０＋かつＧ－ＣＳＦ＋線維芽細胞数が１×１０６ｃeｌｌ以上であってよく、５×１０６ｃeｌｌ以上であってよく、１×１０７ｃeｌｌ以上であってよい。
注射用組成物に含まれるＣＤ１０６＋及び／又はＣＤ９０＋線維芽細胞は、或いはＧ－ＣＳＦ＋線維芽細胞は、他の細胞、例えば心筋細胞と共培養した細胞であってよい。
【0047】
注射剤は、注射剤として生理学的に許容される他の成分を含有してもよい。このような他の成分としては、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、細胞保存液、細胞培養液、ハイドロゲル、細胞外マトリクス、凍結保存液等があげられる。
注射剤は、成体線維芽細胞が心臓組織に注射することで、例えば壊死した心臓組織領域、或いはその周辺、及び／又は冠動脈内、或いは静脈、動脈、リンパ節、リンパ管に注入することで、心臓疾患を治療することができる。また、前記成体線維芽細胞の由来として心臓疾患患者自身の組織を用いることで、自家移植を行ってもよい。
注射剤は、成体線維芽細胞が心臓組織に注射することで、例えば壊死した心臓組織領域、或いはその周辺、及び／又は冠動脈内、或いは静脈、動脈、リンパ節、リンパ管に注入することで、心臓疾患を治療することができる。また、前記成体線維芽細胞の由来として心臓疾患患者自身の組織を用いることで、自家移植を行ってもよい。
【0048】
また、線維芽細胞集団は、他の細胞の培養足場材料として使用してもよく、臓器または組織を形成すること、例えば、平面又は立体の細胞組織を構築するために使用してもよい。線維芽細胞集団は他の細胞、例えば心筋細胞を共培養した上で平面又は立体の組織としてもよいが、共培養しなくても平面又は立体の組織として有効に機能する。平面または立体の組織としては、例えば細胞シートや、セルファイバー、３Ｄプリンタにて形成された組織などが例示されるが、これらに限られない。
このような平面または立体の組織を壊死した心臓組織領域に適用することで、または人工臓器として壊死した心臓組織と交換することで、心臓疾患を治療することができる。
このような平面または立体の組織を壊死した心臓組織領域に適用することで、または人工臓器として壊死した心臓組織と交換することで、心臓疾患を治療することができる。
【実施例】
【0049】
以下に実施例を示し、本発明をより詳細に説明するが、これにより本発明の範囲が限定されるものではない。
＜動物と細胞と試薬＞
本研究で行った全ての動物実験のプロトコルは，ＬＳＩメディエンス（東京、日本）の倫理審査委員会の承認を受けた。なお、全ての動物に苦痛軽減措置を実施した。
細胞は、次のメーカーから購入した：ヒト成体心臓線維芽細胞（Ｌｏｎｚａ， Ｂａｓｅｌ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）；ヒト胎児心臓線維芽細胞（Ｃｅｌｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）；ヒトｉＰＳ細胞由来心筋細胞（ｉＰＳ－ＣＭ，マイオリッジ，京都，日本）。なお、ヒトｉＰＳ細胞由来心臓線維芽細胞は、ｉＰＳ－ＣＭから基材表面への接着性の違いにより単離した。
＜動物と細胞と試薬＞
本研究で行った全ての動物実験のプロトコルは，ＬＳＩメディエンス（東京、日本）の倫理審査委員会の承認を受けた。なお、全ての動物に苦痛軽減措置を実施した。
細胞は、次のメーカーから購入した：ヒト成体心臓線維芽細胞（Ｌｏｎｚａ， Ｂａｓｅｌ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）；ヒト胎児心臓線維芽細胞（Ｃｅｌｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）；ヒトｉＰＳ細胞由来心筋細胞（ｉＰＳ－ＣＭ，マイオリッジ，京都，日本）。なお、ヒトｉＰＳ細胞由来心臓線維芽細胞は、ｉＰＳ－ＣＭから基材表面への接着性の違いにより単離した。
【0050】
次の抗体は、免疫蛍光染色、フローサイトメトリー解析に使用した：ＢＶ４２１ マウス抗ヒトＣＤ１０６抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ， ＣＡ）；ＢＶ４２１ マウスＩｇＧ１；κアイソタイプコントロール（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）；ヒトＣＤ９０－ＰＥ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ， Ｂｅｒｇｉｓｃｈ
Ｇｌａｄｂａｃｈ， Ｇｅｒｍａｎｙ）；ＲＥＡコントロール（Ｓ）－ＰＥ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）；マウスモノクローナル抗カーディアックトロポニンＴ（ｃＴｎＴ） (Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ)；ウサギポリク
ローナル抗Ｋｉ６７（Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）；Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８溶液（同仁化学研究所，熊本，日本）；Ｍｓ ｍＡｂ ｔｏ Ｇ－ＣＳＦ（Ａｂｃａｍ）；ＡＰＣ Ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）。細胞質に局在するタンパク質の解析に関しては、蛍光顕微鏡での解析では、細胞を０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ. Ｌｏｕｉｓ, ＭＯ）で３０分間（室温）、細胞膜透過処理を実施し、免疫蛍光染色した。フローサイトメトリー解析においては、各種の線維芽細胞を０．１％サポニン（ナカライテスク，京都，日本）で１５分間（室温）、細胞膜透過処理を実施し、免疫蛍光染色した。
Ｇｌａｄｂａｃｈ， Ｇｅｒｍａｎｙ）；ＲＥＡコントロール（Ｓ）－ＰＥ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）；マウスモノクローナル抗カーディアックトロポニンＴ（ｃＴｎＴ） (Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ)；ウサギポリク
ローナル抗Ｋｉ６７（Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）；Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８溶液（同仁化学研究所，熊本，日本）；Ｍｓ ｍＡｂ ｔｏ Ｇ－ＣＳＦ（Ａｂｃａｍ）；ＡＰＣ Ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）。細胞質に局在するタンパク質の解析に関しては、蛍光顕微鏡での解析では、細胞を０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ. Ｌｏｕｉｓ, ＭＯ）で３０分間（室温）、細胞膜透過処理を実施し、免疫蛍光染色した。フローサイトメトリー解析においては、各種の線維芽細胞を０．１％サポニン（ナカライテスク，京都，日本）で１５分間（室温）、細胞膜透過処理を実施し、免疫蛍光染色した。
【0051】
＜セルソーティング＞
Ｆ－ＶＮＣＦ（ＣＤ１０６陰性胎児心臓由来線維芽細胞）、Ｆ－ＶＣＦ（ＣＤ１０６陽性胎児心臓由来線維芽細胞）、及びｕＡ１０６－ＨＣＦ（成体心臓由来線維芽細胞にＴＮＦ－αとＩＬ－４を添加し、ＣＤ９０とＣＤ１０６の陽性細胞の割合を向上させた後に、ＣＤ１０６を指標にセルソーティングしたＣＤ１０６陽性成体心臓由来線維芽細胞）は、ヒトＣＤ１０６（ＶＣＡＭ－１）－ビオチン（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）で一次免疫染色を実施し、抗ビオチンマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）で二次免疫染色した。ｕＡ９０－ＨＣＦ（成体心臓由来線維芽細胞にＴＮＦ－αとＩＬ－４を添加し、ＣＤ９０とＣＤ１０６の陽性細胞の割合を向上させた後に、ＣＤ９０を指標にセルソーティングしたＣＤ９０陽性成体心臓由来線維芽細胞）は、ヒトＣＤ９０－ビオチン（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）で一次免疫染色を実施し、抗ビオチンマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）で二次免疫染色した。染色した細胞は、ａｕｔｏＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）で、ＣＤ１０６及びＣＤ９０陽性細胞を回収した。
ＣＤ９０とＣＤ１０６の陽性細胞の割合の高い成体心臓線維芽細胞（ｕＡ９０・１０６－ＨＣＦ）は、成体心臓由来線維芽細胞にＴＮＦ－αとＩＬ－４を添加し、ＣＤ９０とＣＤ１０６の陽性細胞の割合を向上させた後に、ＢＶ４２１ マウス抗ヒトＣＤ１０６抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ， ＣＡ）；ＢＶ４２１ マウスＩｇＧ１；κアイソタイプコントロール（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）；ヒトＣＤ９０－ＰＥ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ， Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ， Ｇｅｒｍａｎｙ）；ＲＥＡコントロール（Ｓ）－ＰＥ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ
）で免疫染色を実施し、ＢＤ ＦＡＣＳ ＡＲＩＡＩＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でセルソーティングにより回収した。
Ｆ－ＶＮＣＦ（ＣＤ１０６陰性胎児心臓由来線維芽細胞）、Ｆ－ＶＣＦ（ＣＤ１０６陽性胎児心臓由来線維芽細胞）、及びｕＡ１０６－ＨＣＦ（成体心臓由来線維芽細胞にＴＮＦ－αとＩＬ－４を添加し、ＣＤ９０とＣＤ１０６の陽性細胞の割合を向上させた後に、ＣＤ１０６を指標にセルソーティングしたＣＤ１０６陽性成体心臓由来線維芽細胞）は、ヒトＣＤ１０６（ＶＣＡＭ－１）－ビオチン（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）で一次免疫染色を実施し、抗ビオチンマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）で二次免疫染色した。ｕＡ９０－ＨＣＦ（成体心臓由来線維芽細胞にＴＮＦ－αとＩＬ－４を添加し、ＣＤ９０とＣＤ１０６の陽性細胞の割合を向上させた後に、ＣＤ９０を指標にセルソーティングしたＣＤ９０陽性成体心臓由来線維芽細胞）は、ヒトＣＤ９０－ビオチン（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）で一次免疫染色を実施し、抗ビオチンマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）で二次免疫染色した。染色した細胞は、ａｕｔｏＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）で、ＣＤ１０６及びＣＤ９０陽性細胞を回収した。
ＣＤ９０とＣＤ１０６の陽性細胞の割合の高い成体心臓線維芽細胞（ｕＡ９０・１０６－ＨＣＦ）は、成体心臓由来線維芽細胞にＴＮＦ－αとＩＬ－４を添加し、ＣＤ９０とＣＤ１０６の陽性細胞の割合を向上させた後に、ＢＶ４２１ マウス抗ヒトＣＤ１０６抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ， ＣＡ）；ＢＶ４２１ マウスＩｇＧ１；κアイソタイプコントロール（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）；ヒトＣＤ９０－ＰＥ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ， Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ， Ｇｅｒｍａｎｙ）；ＲＥＡコントロール（Ｓ）－ＰＥ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ
）で免疫染色を実施し、ＢＤ ＦＡＣＳ ＡＲＩＡＩＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でセルソーティングにより回収した。
【0052】
＜フローサイトメトリー＞
免疫蛍光染色した細胞は１．０×１０６ ｃｅｌｌｓ／ｔｒｉａｌの濃度で調製し、フローサイトメーター（ＭＡＣＳＱｕａｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ １０，Ｍｉｌｔｅｎｙｉ
Ｂｉｏｔｅｃ）で解析した。ＦＳＣ－Ａ及びＳＳＣ－Ａで細胞領域を認識後、各種のマーカータンパク質に対する陽性細胞の割合（％、細胞数換算）を評価した。
免疫蛍光染色した細胞は１．０×１０６ ｃｅｌｌｓ／ｔｒｉａｌの濃度で調製し、フローサイトメーター（ＭＡＣＳＱｕａｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ １０，Ｍｉｌｔｅｎｙｉ
Ｂｉｏｔｅｃ）で解析した。ＦＳＣ－Ａ及びＳＳＣ－Ａで細胞領域を認識後、各種のマーカータンパク質に対する陽性細胞の割合（％、細胞数換算）を評価した。
【0053】
＜ＲＮＡ抽出とｍＲＮＡシーケンシング＞
各種の線維芽細胞から、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ， Ｖａｌｅｎｃｉａ， ＣＡ）を用いてＲＮＡを回収した。ＣＤ９０とＣＤ１０６の陽性細胞の割合が高い成体心臓線維芽細胞（ｕＡ９０・１０６－ＨＣＦ）は、成体心臓由来線維芽細胞にＴＮＦ－αとＩＬ－４を添加し、ＣＤ９０とＣＤ１０６陽性細胞の割合を向上させた後にＢＤ ＦＡＣＳ ＡＲＩＡＩＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でセルソーティングにより回収した。回収したＲＮＡの濃度と純度は、Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）とＮａｎｏＤｒｏｐ Ｏｎｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で解析した。ＲＩＮ値が７以上のＲＮＡ１μｇをライブラリー調製に使用した。次世代シーケンサ―用ライブラリーの調製は、ＮＥＢＮｅｘｔ Ｕｌｔｒａ
ＲＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ ｆｏｒ Ｉｌｌｕｍｉｎａのメーカープロトコルに沿って実施した。
各種の線維芽細胞から、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ， Ｖａｌｅｎｃｉａ， ＣＡ）を用いてＲＮＡを回収した。ＣＤ９０とＣＤ１０６の陽性細胞の割合が高い成体心臓線維芽細胞（ｕＡ９０・１０６－ＨＣＦ）は、成体心臓由来線維芽細胞にＴＮＦ－αとＩＬ－４を添加し、ＣＤ９０とＣＤ１０６陽性細胞の割合を向上させた後にＢＤ ＦＡＣＳ ＡＲＩＡＩＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でセルソーティングにより回収した。回収したＲＮＡの濃度と純度は、Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）とＮａｎｏＤｒｏｐ Ｏｎｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で解析した。ＲＩＮ値が７以上のＲＮＡ１μｇをライブラリー調製に使用した。次世代シーケンサ―用ライブラリーの調製は、ＮＥＢＮｅｘｔ Ｕｌｔｒａ
ＲＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ ｆｏｒ Ｉｌｌｕｍｉｎａのメーカープロトコルに沿って実施した。
【0054】
ｐｏｌｙ（Ａ）ｍＲＮＡの単離は、ＮＥＢＮｅｘｔ Ｐｏｌｙ（Ａ）ｍＲＮＡ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｍｏｄｕｌｅ（ＮＥＢ）とＲｉｂｏ－Ｚｅｒ ｒＲＮＡ ｒｅｍｏｖａｌ Ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用した。ｍＲＮＡフラグメンテーションとプライミングは、ＮＥＢＮｅｘｔ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ＢｕｆｆｅｒとＮＥＢＮｅｘｔ Ｒａｎｄｏｍ Ｐｒｉｍｅｒｓを使用した。
第１鎖ｃＤＮＡは、ＰｒｏｔｏＳｃｒｉｐｔ ＩＩ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅを用いて合成した。第２鎖ｃＤＮＡの合成はＳｅｃｏｎｄ Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘを使用した。ＡｘｙＰｒｅｐ Ｍａｇ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ（Ａｘｙｇｅｎ，ＵｎｉｏｎＣｉｔｙ, ＣＡ）で精製したｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ｃＤＮＡは、両端の修復と増幅産物の末端にｄＡを付加したのちＴＡクローニングを行うためにＥｎｄ Ｐｒｅｐ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘで処理した。Ａｄａｐｔｏｒ－ｌｉｇａｔｅｄ ＤＮＡのサイズはＡｘｙＰｒｅｐ Ｍａｇ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ（Ａｘｙｇｅｎ）を用いて３６０ｂｐまでのフラグメントを選択した。それぞれのサンプルは、Ｐ５及びＰ７プライマーを用いてＰＣＲで１１サイクル増幅させた。ＰＣＲ産物はＡｘｙＰｒｅｐ Ｍａｇ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ（Ａｘｙｇｅｎ）で洗浄し、Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で評価した。ＰＣＲ産物の定量はＱｕｂｉｔ２．０ Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ, Ｃａｒｌｓｂａｄ, ＣＡ）を用いた。
第１鎖ｃＤＮＡは、ＰｒｏｔｏＳｃｒｉｐｔ ＩＩ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅを用いて合成した。第２鎖ｃＤＮＡの合成はＳｅｃｏｎｄ Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘを使用した。ＡｘｙＰｒｅｐ Ｍａｇ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ（Ａｘｙｇｅｎ，ＵｎｉｏｎＣｉｔｙ, ＣＡ）で精製したｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ｃＤＮＡは、両端の修復と増幅産物の末端にｄＡを付加したのちＴＡクローニングを行うためにＥｎｄ Ｐｒｅｐ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘで処理した。Ａｄａｐｔｏｒ－ｌｉｇａｔｅｄ ＤＮＡのサイズはＡｘｙＰｒｅｐ Ｍａｇ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ（Ａｘｙｇｅｎ）を用いて３６０ｂｐまでのフラグメントを選択した。それぞれのサンプルは、Ｐ５及びＰ７プライマーを用いてＰＣＲで１１サイクル増幅させた。ＰＣＲ産物はＡｘｙＰｒｅｐ Ｍａｇ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ（Ａｘｙｇｅｎ）で洗浄し、Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で評価した。ＰＣＲ産物の定量はＱｕｂｉｔ２．０ Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ, Ｃａｒｌｓｂａｄ, ＣＡ）を用いた。
【0055】
シーケンシングはＩｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）で２×１５０ｂｐ ｐａｉｒｅｄ－ｅｎｄ（ＰＥ）ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎの条件で実施した。イメージ解析とベースコールはＨｉＳｅｑ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＨＣＳ）＋ＯＬＢ＋ＧＡＰｉｐｅｌｉｎｅ－１．６（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用した。シーシングはＧＥＮＥＷＩＺ（ＳｏｕｔｈＰｌａｉｎｆｉｅｌｄ, ＮＪ）で実施した。
【0056】
＜発現差異解析＞
発現差異解析はＤＥＳｅｑ Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ ｐａｃｋａｇｅを使用した。ｆａｌｓｅ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｒａｔｅ（ＦＤＲ）の補正はＢｅｎｊａｍｉｎｉ ａｎｄ Ｈｏｃｈｂｅｒｇ’ｓで行い、Ｐ－ｖａｌｕｅ＜０．０５を有意と見なした。
発現差異解析はＤＥＳｅｑ Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ ｐａｃｋａｇｅを使用した。ｆａｌｓｅ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｒａｔｅ（ＦＤＲ）の補正はＢｅｎｊａｍｉｎｉ ａｎｄ Ｈｏｃｈｂｅｒｇ’ｓで行い、Ｐ－ｖａｌｕｅ＜０．０５を有意と見なした。
【0057】
＜心筋細胞と線維芽細胞との共培養＞
細胞播種前に、３８４ｗｅｌｌプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、ｈｉｇｈ－ｇｌｕｃｏｓｅ ＤＭＥＭで１：３０に希釈したマトリゲル基底膜マトリックス（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）１００μＬ／ｗｅｌｌで、３７℃ １時間コーティングした。ｉＰＳ－ＣＭと線維芽細胞は、８：２の割合でＤＭＥＭ＋１０％新生仔牛血清（ＮＢＣＳ）で共培養した（心筋細胞＝１６，０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ：線維芽細胞＝４，０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）。
共培養開始後Ｄａｙ１０で細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、免疫蛍光染色を行った。染色サンプルは、ＩＮ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ２２００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）及びＩＮ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ Ｔｏｏｌｂｏｘ１．９２（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で解析した。
細胞播種前に、３８４ｗｅｌｌプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、ｈｉｇｈ－ｇｌｕｃｏｓｅ ＤＭＥＭで１：３０に希釈したマトリゲル基底膜マトリックス（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）１００μＬ／ｗｅｌｌで、３７℃ １時間コーティングした。ｉＰＳ－ＣＭと線維芽細胞は、８：２の割合でＤＭＥＭ＋１０％新生仔牛血清（ＮＢＣＳ）で共培養した（心筋細胞＝１６，０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ：線維芽細胞＝４，０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）。
共培養開始後Ｄａｙ１０で細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、免疫蛍光染色を行った。染色サンプルは、ＩＮ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ２２００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）及びＩＮ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ Ｔｏｏｌｂｏｘ１．９２（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で解析した。
【0058】
＜慢性心不全モデルラットの作製と心エコーの計測＞
ヌードラット（Ｆ３４４／Ｎ Ｊｃｌ－ｒｎｕ／ｒｎｕ，８週齢，雄）は日本クレア（東京，日本）から購入した。１週間の馴化後、動物は実験動物用吸入麻酔器（ソフトランダー（新鋭工業株式会社，埼玉，日本）を用いて、２％イソフルラン（麻酔補助剤；笑気：酸素＝７：３）にて吸入麻酔し、刈毛した。すばやく気管挿管を行い、そのまま０．５－２％イソフルラン（麻酔補助剤；笑気：酸素＝７：３）吸入麻酔ガスを人工呼吸器に接続して、麻酔を維持した。人工呼吸管理のもと、仰臥位に固定し、左第３肋骨から第５肋骨までの間で２～３本、肋軟骨の位置で縦方向に切断して開胸した。開創器により、術野を拡大後、心嚢膜を剥離して心臓を露出させた。左心房を持ち上げ、血管用糸付弱弯丸針（６－０：ネスコスーチャー）を用いて左心室の深さ約２ｍｍ、長さ４－５ｍｍに糸を通した。糸の両端を合わせてポリエチレンチューブで作製したスネアを通し、動脈クレンメを用いて糸を絞り（スネア法）冠動脈を３０分間虚血した。３０分後、再灌流させ、状態が安定したら、出血がない事を確認し、胸腔ドレナージを行い、筋層及び皮膚を縫合した。皮膚は、皮内縫合を行うが、通常縫合を行った場合には、術後状態を観察しながら抜糸を行った。モデル作製後１週間の細胞投与日前日に、超音波画像診断装置（Ｘａｒｉｏ ＳＳＡ－６６０Ａ，東芝メディカルシステムズ，栃木，日本）を用いて心エコーを測定した。左室駆出率（ＬＶＥＦ＝（ＬＶＩＤｄ３－ＬＶＩＤｓ３）／ＬＶＩＤｄ３）が５５％以下の個体を慢性心不全モデルとみなし、線維芽細胞の投与実験を行った。
ヌードラット（Ｆ３４４／Ｎ Ｊｃｌ－ｒｎｕ／ｒｎｕ，８週齢，雄）は日本クレア（東京，日本）から購入した。１週間の馴化後、動物は実験動物用吸入麻酔器（ソフトランダー（新鋭工業株式会社，埼玉，日本）を用いて、２％イソフルラン（麻酔補助剤；笑気：酸素＝７：３）にて吸入麻酔し、刈毛した。すばやく気管挿管を行い、そのまま０．５－２％イソフルラン（麻酔補助剤；笑気：酸素＝７：３）吸入麻酔ガスを人工呼吸器に接続して、麻酔を維持した。人工呼吸管理のもと、仰臥位に固定し、左第３肋骨から第５肋骨までの間で２～３本、肋軟骨の位置で縦方向に切断して開胸した。開創器により、術野を拡大後、心嚢膜を剥離して心臓を露出させた。左心房を持ち上げ、血管用糸付弱弯丸針（６－０：ネスコスーチャー）を用いて左心室の深さ約２ｍｍ、長さ４－５ｍｍに糸を通した。糸の両端を合わせてポリエチレンチューブで作製したスネアを通し、動脈クレンメを用いて糸を絞り（スネア法）冠動脈を３０分間虚血した。３０分後、再灌流させ、状態が安定したら、出血がない事を確認し、胸腔ドレナージを行い、筋層及び皮膚を縫合した。皮膚は、皮内縫合を行うが、通常縫合を行った場合には、術後状態を観察しながら抜糸を行った。モデル作製後１週間の細胞投与日前日に、超音波画像診断装置（Ｘａｒｉｏ ＳＳＡ－６６０Ａ，東芝メディカルシステムズ，栃木，日本）を用いて心エコーを測定した。左室駆出率（ＬＶＥＦ＝（ＬＶＩＤｄ３－ＬＶＩＤｓ３）／ＬＶＩＤｄ３）が５５％以下の個体を慢性心不全モデルとみなし、線維芽細胞の投与実験を行った。
【0059】
＜慢性心不全モデルラットへの線維芽細胞の投与＞
投与試験当日に凍結保存した各種の線維芽細胞を解凍し、ｈｉｇｈ－ｇｌｕｃｏｓｅ ＤＭＥＭ＋１０％ＮＢＣＳで希釈し、生存細胞数として、各個体につき、２．０×１０６ｃｅｌｌｓ／５０μＬの細胞懸濁液を投与した。Ａ－ＨＣＦとｕＡ－ＨＣＦ投与群はＮ＝４、ｕＡ９０－ＨＣＦ投与群はＮ＝３で実施した。動物は、モデル作製時と同一の手法で麻酔を維持し、人工呼吸管理のもと、梗塞巣の２ヶ所に分けて、３０Ｇ針付きカテーテルを用いて細胞懸濁液を５０μＬ全量投与した。状態が安定した後に、投与液の漏出及び出血がない事を確認し、胸腔ドレナージを行い、筋層及び皮膚を縫合した。皮膚は、皮内縫合を行うが、通常縫合を行った場合には、術後状態を観察しながら抜糸を行った。
投与試験当日に凍結保存した各種の線維芽細胞を解凍し、ｈｉｇｈ－ｇｌｕｃｏｓｅ ＤＭＥＭ＋１０％ＮＢＣＳで希釈し、生存細胞数として、各個体につき、２．０×１０６ｃｅｌｌｓ／５０μＬの細胞懸濁液を投与した。Ａ－ＨＣＦとｕＡ－ＨＣＦ投与群はＮ＝４、ｕＡ９０－ＨＣＦ投与群はＮ＝３で実施した。動物は、モデル作製時と同一の手法で麻酔を維持し、人工呼吸管理のもと、梗塞巣の２ヶ所に分けて、３０Ｇ針付きカテーテルを用いて細胞懸濁液を５０μＬ全量投与した。状態が安定した後に、投与液の漏出及び出血がない事を確認し、胸腔ドレナージを行い、筋層及び皮膚を縫合した。皮膚は、皮内縫合を行うが、通常縫合を行った場合には、術後状態を観察しながら抜糸を行った。
【0060】
＜心エコーによる慢性心不全モデルラットの心機能評価＞
線維芽細胞の投与を行った慢性心不全モデルラットは、２週間ごとに超音波画像診断装置（Ｘａｒｉｏ ＳＳＡ－６６０Ａ）を用いて心エコーを測定し、経過観察を行った。具体的には、動物の胸部をバリカンにて毛刈し、胸部にプローブを当てＭ－ｍｏｄｅで左室駆出率（ＬＶＥＦ＝（ＬＶＩＤｄ３－ＬＶＩＤｓ３／ＬＶＩＤｄ３）、左室内径短縮率（
ＬＶＦＳ＝（ＬＶＩＤｄ―ＬＶＩＤｓ）×１００／ＬＶＩＤｄ）を測定した。心機能値は、小数点以下１桁（小数点以下第２位を四捨五入する）で表す。
線維芽細胞の投与を行った慢性心不全モデルラットは、２週間ごとに超音波画像診断装置（Ｘａｒｉｏ ＳＳＡ－６６０Ａ）を用いて心エコーを測定し、経過観察を行った。具体的には、動物の胸部をバリカンにて毛刈し、胸部にプローブを当てＭ－ｍｏｄｅで左室駆出率（ＬＶＥＦ＝（ＬＶＩＤｄ３－ＬＶＩＤｓ３／ＬＶＩＤｄ３）、左室内径短縮率（
ＬＶＦＳ＝（ＬＶＩＤｄ―ＬＶＩＤｓ）×１００／ＬＶＩＤｄ）を測定した。心機能値は、小数点以下１桁（小数点以下第２位を四捨五入する）で表す。
【0061】
＜統計解析＞
心機能の評価は平均±ＳＥ（標準誤差）で表す。その他すべてのデータは平均±ＳＤ（標準偏差）で表す。２群間の有意差は、ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ－ｔｅｓｔで算出した。３群以上の変動差は一元配置分散分析により算出した。その後、３群間の有意差は、Ｔｕｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ Ｔｅｓｔにより算出した。０．０５より低いｐ値は有意に異なると見なした。すべての統計計算はＲソフトウエアを用いて行った。
心機能の評価は平均±ＳＥ（標準誤差）で表す。その他すべてのデータは平均±ＳＤ（標準偏差）で表す。２群間の有意差は、ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ－ｔｅｓｔで算出した。３群以上の変動差は一元配置分散分析により算出した。その後、３群間の有意差は、Ｔｕｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ Ｔｅｓｔにより算出した。０．０５より低いｐ値は有意に異なると見なした。すべての統計計算はＲソフトウエアを用いて行った。
【0062】
以下実施した実験結果を示す。
＜ＴＮＦ－αとＩＬ－４による心臓線維芽細胞のＣＤ１０６及びＣＤ９０発現率向上＞
成体心臓由来の線維芽細胞（Ａ－ＨＣＦ）に、ＴＮＦ－αを種々の濃度で添加し、ＨＦＤＭ－１（＋）培地で３日間培養を行った後、フローサイトメーターでＣＤ１０６陽性細胞の割合（％）及びＣＤ９０陽性細胞の割合（％）を評価した。結果を図１に示す。
また、成体心臓由来の線維芽細胞（Ａ－ＨＣＦ）に、ＩＬ－４を種々の濃度で添加し、ＨＦＤＭ－１（＋）培地で３日間培養を行った後、フローサイトメーターでＣＤ１０６陽性細胞の割合（％）及びＣＤ９０陽性細胞の割合（％）を評価した。結果を図２に示す。
これらの結果より、ＴＮＦ－α又はＩＬ－４の添加により、ＣＤ１０６陽性細胞の割合（％）及びＣＤ９０陽性細胞の割合（％）が向上することが理解される。
＜ＴＮＦ－αとＩＬ－４による心臓線維芽細胞のＣＤ１０６及びＣＤ９０発現率向上＞
成体心臓由来の線維芽細胞（Ａ－ＨＣＦ）に、ＴＮＦ－αを種々の濃度で添加し、ＨＦＤＭ－１（＋）培地で３日間培養を行った後、フローサイトメーターでＣＤ１０６陽性細胞の割合（％）及びＣＤ９０陽性細胞の割合（％）を評価した。結果を図１に示す。
また、成体心臓由来の線維芽細胞（Ａ－ＨＣＦ）に、ＩＬ－４を種々の濃度で添加し、ＨＦＤＭ－１（＋）培地で３日間培養を行った後、フローサイトメーターでＣＤ１０６陽性細胞の割合（％）及びＣＤ９０陽性細胞の割合（％）を評価した。結果を図２に示す。
これらの結果より、ＴＮＦ－α又はＩＬ－４の添加により、ＣＤ１０６陽性細胞の割合（％）及びＣＤ９０陽性細胞の割合（％）が向上することが理解される。
【0063】
次に、成体心臓由来の線維芽細胞（Ａ－ＨＣＦ）に、ＴＮＦ－αとＩＬ－４を２剤混合で添加し、ＨＦＤＭ－１（＋）培地で３日間培養を行った後、フローサイトメーターでＣＤ１０６陽性細胞の割合（％）及びＣＤ９０陽性細胞の割合（％）を評価した。結果を図３－１及び図３－２に示す。図３－１からは、Ａに示すコントロール（無添加）と比較して、Ｂに示すＴＮＦ－αとＩＬ－４の２剤を混合添加すると、ＣＤ１０６陽性細胞の割合（％）及びＣＤ９０陽性細胞の割合（％）が大きく向上することが理解される。
【0064】
更に、胎児心臓由来線維芽細胞（Ｆ－ＨＣＦ）とｉＰＳ細胞由来心臓線維芽細胞（ｉ－ＨＣＦ）にＴＮＦ－α（５０ｎｇ／ｍＬ）とＩＬ－４（２ｎｇ／ｍＬ）を２剤混合で添加し、ＨＦＤＭ－１（＋）培地で３日間培養を行った後、フローサイトメーターでＣＤ１０６陽性細胞の割合（％）及びＣＤ９０陽性細胞の割合（％）を評価した。結果を図４－１及び図４－２に示す。
図４－１及び図４－２からは、心臓線維芽細胞の由来が異なっても、ＴＮＦ－αとＩＬ－４の２剤を混合添加すると、ＣＤ１０６陽性細胞の割合（％）及びＣＤ９０陽性細胞の割合（％）が大きく向上することが理解される。
図４－１及び図４－２からは、心臓線維芽細胞の由来が異なっても、ＴＮＦ－αとＩＬ－４の２剤を混合添加すると、ＣＤ１０６陽性細胞の割合（％）及びＣＤ９０陽性細胞の割合（％）が大きく向上することが理解される。
【0065】
次に、Ｆ－ＨＣＦを抗ＣＤ１０６抗体でセルソーティングし、ＣＤ１０６及びＣＤ９０陽性細胞の割合を大きく向上させた線維芽細胞（Ｆ－ＶＣＦ）と、ＣＤ１０６陽性細胞の割合を大きく減少させた線維芽細胞（Ｆ－ＶＮＣＦ）をｃｏｎｔｒｏｌに、Ａ－ＨＣＦ、Ａ－ＨＣＦにＴＮＦ－α（５０ｎｇ／ｍＬ）とＩＬ－４（２ｎｇ／ｍＬ）を２剤混合で添加し、ＨＦＤＭ－１（＋）培地で３日間培養することでＣＤ１０６及びＣＤ９０の陽性細胞の割合を向上させた線維芽細胞（ｕＡ－ＨＣＦ）、ｕＡ－ＨＣＦからＣＤ１０６及びＣＤ９０両陽性細胞のみをセルソーティングにより回収した線維芽細胞（ｕＡ９０・１０６－ＨＣＦ）の遺伝子発現差異解析を実施した。その結果を図５に示す。図５からは、各種の心臓線維芽細胞でｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ ｃｏｌｏｎｙ－ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ（Ｇ－ＣＳＦ）タンパク質コード遺伝子の発現量が大きく異なることが明らかとなった。Ｆ－ＶＮＣＦとＦ－ＶＣＦ、Ａ－ＨＣＦのＧ－ＣＳＦ遺伝子発現量（β－ａｃｔｉｎのＦＰＫＭで標準化したＧ－ＣＳＦのＦＰＫＭ）はそれぞれ０．０００１７８、
０．０００１２５、０．０００５５３であったのに対し、ｕＡ－ＨＣＦは０．１０１４９６、ｕＡ９０・１０６－ＨＣＦは０．２２９０７２発現していることが明らかとなった。Ｆ－ＶＣＦの値を１に設定したところ、Ｆ－ＶＮＣＦとＡ－ＨＣＦのＧ－ＣＳＦ遺伝子発現量（β－ａｃｔｉｎのＦＰＫＭで標準化したＧ－ＣＳＦのＦＰＫＭ ｆｏｌｄ ｉｎｃｒｅａｓｅ）はそれぞれ１．４２、４．４１であったのに対し、ｕＡ－ＨＣＦは８１０．２１、ｕＡ９０・１０６－ＨＣＦは１８２８．６１発現していることが明らかとなった。
０．０００１２５、０．０００５５３であったのに対し、ｕＡ－ＨＣＦは０．１０１４９６、ｕＡ９０・１０６－ＨＣＦは０．２２９０７２発現していることが明らかとなった。Ｆ－ＶＣＦの値を１に設定したところ、Ｆ－ＶＮＣＦとＡ－ＨＣＦのＧ－ＣＳＦ遺伝子発現量（β－ａｃｔｉｎのＦＰＫＭで標準化したＧ－ＣＳＦのＦＰＫＭ ｆｏｌｄ ｉｎｃｒｅａｓｅ）はそれぞれ１．４２、４．４１であったのに対し、ｕＡ－ＨＣＦは８１０．２１、ｕＡ９０・１０６－ＨＣＦは１８２８．６１発現していることが明らかとなった。
【0066】
従って、ＴＮＦ－αとＩＬ－４の２剤をＡ－ＨＣＦに添加し、ＣＤ１０６及びＣＤ９０陽性細胞の割合を向上させることで、Ｇ－ＣＳＦはその発現量を大きく向上できることが明らかとなった。また、ｕＡ－ＨＣＦをセルソーティングし、ＣＤ９０及びＣＤ１０６の陽性細胞の割合を高めることで、Ｇ－ＣＳＦの発現量をさらに向上できることが分かった。先行研究から、Ｇ－ＣＳＦは心不全に伴う心筋細胞死を抑制し、心筋リモデリングの進行を抑制することが報告されており、また、心筋細胞の細胞増殖を促すことも明らかとなっている。本結果から、ＴＮＦ－αとＩＬ－４によってＧ－ＣＳＦの発現量を人為的に向上させたｕＡ－ＨＣＦ、ｕＡ９０－ＨＣＦ、ｕＡ１０６－ＨＣＦ、ｕＡ９０・１０６－ＨＣＦは、心筋細胞増殖能と心不全治療効果が高いことが示唆される。
【0067】
＜ＣＤ１０６及びＣＤ９０の発現レベルが向上した心臓線維芽細胞による、ヒトｉＰＳ細胞由来心筋細胞の増殖効果＞
ＴＮＦ－α（５０ｎｇ／ｍＬ）とＩＬ－４（２ｎｇ／ｍＬ）を２剤混合で添加し、ＨＦＤＭ－１（＋）培地で３日間培養することでＣＤ９０およびＣＤ１０６の陽性細胞の割合を向上させた心臓線維芽細胞を表１に記載の通り準備した。また、コントロールとして、ＴＮＦ－αとＩＬ－４を添加せずに培養した心臓線維芽細胞を準備した。
準備した、ＣＤ９０及びＣＤ１０６陽性細胞の割合が向上した心臓線維芽細胞を、抗ＣＤ９０抗体又はＣＤ１０６抗体でセルソーティングすることで、ＣＤ９０とＣＤ１０６両陽性（ＤＰ：ダブルポジティブ）の線維芽細胞を効率的に回収できた。
ＴＮＦ－α（５０ｎｇ／ｍＬ）とＩＬ－４（２ｎｇ／ｍＬ）を２剤混合で添加し、ＨＦＤＭ－１（＋）培地で３日間培養することでＣＤ９０およびＣＤ１０６の陽性細胞の割合を向上させた心臓線維芽細胞を表１に記載の通り準備した。また、コントロールとして、ＴＮＦ－αとＩＬ－４を添加せずに培養した心臓線維芽細胞を準備した。
準備した、ＣＤ９０及びＣＤ１０６陽性細胞の割合が向上した心臓線維芽細胞を、抗ＣＤ９０抗体又はＣＤ１０６抗体でセルソーティングすることで、ＣＤ９０とＣＤ１０６両陽性（ＤＰ：ダブルポジティブ）の線維芽細胞を効率的に回収できた。
【0068】
【表1】
【0069】
次に、表１に記載した各々の心臓線維芽細胞とｉＰＳ由来心筋細胞（ｉＰＳ－ＣＭ）を共培養し、心臓線維芽細胞による心筋増殖効果の評価を行った。ｉＰＳ－ＣＭは心筋細胞特異的マーカーであるカーディアックトロポニンＴ（ｃＴｎＴ）が９２．２２％陽性の細胞を使用した。各種の線維芽細胞とｉＰＳ－ＣＭとを１０日間共培養し、Ｋｉ６７とカーディアックトロポニンＴ（ｃＴｎＴ）両陽性の増殖状態にある心筋細胞数を計測した。結果を図６に示す。
図６より、Ａ－ＨＣＦと比較してＴＮＦ－αとＩＬ－４とを添加したｕＡ－ＨＣＦの共培養条件で増殖状態にある心筋細胞数の増加が認められ、ｕＡ９０－ＨＣＦ及びｕＡ１０６－ＨＣＦの共培養条件では有意に増殖状態にある心筋細胞数の増加が観察された。
図６より、Ａ－ＨＣＦと比較してＴＮＦ－αとＩＬ－４とを添加したｕＡ－ＨＣＦの共培養条件で増殖状態にある心筋細胞数の増加が認められ、ｕＡ９０－ＨＣＦ及びｕＡ１０６－ＨＣＦの共培養条件では有意に増殖状態にある心筋細胞数の増加が観察された。
【0070】
＜ＣＤ９０及びＣＤ１０６陽性細胞の割合を向上させた心臓線維芽細胞による、ラット慢性心不全の長期治療効果＞
上記虚血－再灌流により作製した慢性心不全モデルラットに、表１に示すＡ－ＨＣＦ、ｕＡ－ＨＣＦ、ｕＡ９０－ＨＣＦを注射器で心筋内投与し、各種の線維芽細胞によるラット心不全の治療効果を心エコーで評価した。ＳｈａｍはＮ＝６、ＣｏｎｔｒｏｌはＮ＝４、Ａ－ＨＣＦ投与群はＮ＝７、ｕＡ－ＨＣＦ投与群はＮ＝８、ｕＡ９０－ＨＣＦ投与群はＮ＝９で実施した。なお、作製した各種の線維芽細胞集団のＣＤ９０及びＣＤ１０６陽性細胞の割合をフローサイトメーターで評価したところ、Ａ－ＨＣＦはＣＤ９０及びＣＤ１０６両陽性の細胞（ＤＰ）が１．７７％であったのに対し、ｕＡ－ＨＣＦのＤＰは２１．３６％、ｕＡ９０－ＨＣＦのＤＰは６１．２５％であった。結果を図７－１、図７－２及び図７－３に示す。
図７－１、図７－２及び図７－３より、Ａ－ＨＣＦの投与では心不全の治療効果を認めることはできなかったが、ｕＡ－ＨＣＦとｕＡ９０－ＨＣＦは移植後４週でＬＶＥＦとＬＶＦＳを大きく改善できることが理解される。
また、各種の線維芽細胞によるＬＶＥＦとＬＶＦＳの増減割合（Ｄｅｌｔａ－ＬＶＥＦ，Ｄｅｌｔａ－ＬＶＦＳ）を比較解析したところ、ｕＡ－ＨＣＦとｕＡ９０－ＨＣＦはＤｅｌｔａ－ＬＶＥＦとＤｅｌｔａ－ＬＶＦＳを細胞移植前から向上させ、Ａ－ＨＣＦと比較してｕＡ９０－ＨＣＦはＤｅｌｔａ－ＬＶＥＦとＤｅｌｔａ－ＬＶＦＳを有意に改善できることが理解される。
上記虚血－再灌流により作製した慢性心不全モデルラットに、表１に示すＡ－ＨＣＦ、ｕＡ－ＨＣＦ、ｕＡ９０－ＨＣＦを注射器で心筋内投与し、各種の線維芽細胞によるラット心不全の治療効果を心エコーで評価した。ＳｈａｍはＮ＝６、ＣｏｎｔｒｏｌはＮ＝４、Ａ－ＨＣＦ投与群はＮ＝７、ｕＡ－ＨＣＦ投与群はＮ＝８、ｕＡ９０－ＨＣＦ投与群はＮ＝９で実施した。なお、作製した各種の線維芽細胞集団のＣＤ９０及びＣＤ１０６陽性細胞の割合をフローサイトメーターで評価したところ、Ａ－ＨＣＦはＣＤ９０及びＣＤ１０６両陽性の細胞（ＤＰ）が１．７７％であったのに対し、ｕＡ－ＨＣＦのＤＰは２１．３６％、ｕＡ９０－ＨＣＦのＤＰは６１．２５％であった。結果を図７－１、図７－２及び図７－３に示す。
図７－１、図７－２及び図７－３より、Ａ－ＨＣＦの投与では心不全の治療効果を認めることはできなかったが、ｕＡ－ＨＣＦとｕＡ９０－ＨＣＦは移植後４週でＬＶＥＦとＬＶＦＳを大きく改善できることが理解される。
また、各種の線維芽細胞によるＬＶＥＦとＬＶＦＳの増減割合（Ｄｅｌｔａ－ＬＶＥＦ，Ｄｅｌｔａ－ＬＶＦＳ）を比較解析したところ、ｕＡ－ＨＣＦとｕＡ９０－ＨＣＦはＤｅｌｔａ－ＬＶＥＦとＤｅｌｔａ－ＬＶＦＳを細胞移植前から向上させ、Ａ－ＨＣＦと比較してｕＡ９０－ＨＣＦはＤｅｌｔａ－ＬＶＥＦとＤｅｌｔａ－ＬＶＦＳを有意に改善できることが理解される。
【0071】
＜ヒト線維芽細胞のＧ－ＣＳＦ陽性細胞の割合並びにＴＮＦ－α及びＩＬ－４添加による、Ｇ－ＣＳＦ陽性細胞の割合の向上＞
ＴＮＦ－α（５０ｎｇ／ｍＬ）とＩＬ－４（２ｎｇ／ｍＬ）を２剤混合で添加し、ＨＦＤＭ－１（＋）培地で３日間培養することでＣＤ９０及びＣＤ１０６陽性細胞の割合を向上させた心臓線維芽細胞（ｕＡ－ＨＣＦ）を表２に記載の通り準備した。更に、抗ＣＤ９０抗体と抗ＣＤ１０６抗体でセルソーティングした心臓線維芽細胞（ｕＡ９０・１０６－ＨＣＦ）を準備した。また、コントロールとして、ＴＮＦ－αとＩＬ－４を添加せずに培養した心臓線維芽細胞（Ａ－ＨＣＦ）、胎児心臓由来ＣＤ１０６陰性線維芽細胞（Ｆ－ＶＮＣＦ）、胎児心臓由来ＣＤ１０６陽性線維芽細胞（Ｆ－ＶＣＦ）を準備した。
ＴＮＦ－α（５０ｎｇ／ｍＬ）とＩＬ－４（２ｎｇ／ｍＬ）を２剤混合で添加し、ＨＦＤＭ－１（＋）培地で３日間培養することでＣＤ９０及びＣＤ１０６陽性細胞の割合を向上させた心臓線維芽細胞（ｕＡ－ＨＣＦ）を表２に記載の通り準備した。更に、抗ＣＤ９０抗体と抗ＣＤ１０６抗体でセルソーティングした心臓線維芽細胞（ｕＡ９０・１０６－ＨＣＦ）を準備した。また、コントロールとして、ＴＮＦ－αとＩＬ－４を添加せずに培養した心臓線維芽細胞（Ａ－ＨＣＦ）、胎児心臓由来ＣＤ１０６陰性線維芽細胞（Ｆ－ＶＮＣＦ）、胎児心臓由来ＣＤ１０６陽性線維芽細胞（Ｆ－ＶＣＦ）を準備した。
【0072】
【表2】
【0073】
各種の線維芽細胞のＧ－ＣＳＦ陽性細胞の割合をフローサイトメトリーで評価したところ、Ｆ－ＶＮＣＦはＧ－ＣＳＦ陽性細胞の割合が９．０４％であったのに対し、Ｆ－ＶＣＦは４．３５％、Ａ－ＨＣＦは６．７５％、ｕＡ－ＨＣＦは２４．７０％、ｕＡ９０・１０６－ＨＣＦは９２．５０％だった（図８）。本結果から、天然に存在するＣＤ１０６陽性細胞（Ｆ－ＶＣＦ）はＧ－ＣＳＦ陽性細胞の割合が低く、ＴＮＦ－αとＩＬ－４に接触させ、人工的に製造したＣＤ１０６陽性及び／又はＣＤ９０陽性の心臓線維芽細胞は、ＣＤ１０６及び／又はＣＤ９０陽性細胞の割合率が向上するに応じて、Ｇ－ＣＳＦ陽性細胞の割合が向上することが明らかとなった。
【0074】
＜ＣＤ１０６及びＣＤ９０陽性細胞の割合を向上させた心臓線維芽細胞によるラット慢性心不全の長期治療効果＞
虚血－再灌流により作製した慢性心不全モデルラットに、Ａ－ＨＣＦ、ｕＡ－ＨＣＦ、ｕＡ９０－ＨＣＦを注射器で心筋内投与し、各種の線維芽細胞によるラット心不全の長期治療効果を心エコーで評価した。その結果、Ａ－ＨＣＦの投与では心不全の治療効果を認めることはできず、移植後１８週のＬＶＥＦは４４．１±２．８％を示し、ＬＶＦＳは１７．８±１．４％を示した（図９－１及び図９－２Ａ及びＣ）。更にＣＤ９０抗原を指標にセルソーティングを行ったｕＡ９０－ＨＣＦは、長期間（移植後１２週以降）でＬＶＥＦとＬＶＦＳの改善効果が認められ、移植後１８週のＬＶＥＦは６１．０±２．２％を示し、ＬＶＦＳは２７．２±１．４％を示した。
虚血－再灌流により作製した慢性心不全モデルラットに、Ａ－ＨＣＦ、ｕＡ－ＨＣＦ、ｕＡ９０－ＨＣＦを注射器で心筋内投与し、各種の線維芽細胞によるラット心不全の長期治療効果を心エコーで評価した。その結果、Ａ－ＨＣＦの投与では心不全の治療効果を認めることはできず、移植後１８週のＬＶＥＦは４４．１±２．８％を示し、ＬＶＦＳは１７．８±１．４％を示した（図９－１及び図９－２Ａ及びＣ）。更にＣＤ９０抗原を指標にセルソーティングを行ったｕＡ９０－ＨＣＦは、長期間（移植後１２週以降）でＬＶＥＦとＬＶＦＳの改善効果が認められ、移植後１８週のＬＶＥＦは６１．０±２．２％を示し、ＬＶＦＳは２７．２±１．４％を示した。
【0075】
また、各種の線維芽細胞の投与によるＬＶＥＦとＬＶＦＳの増減割合（Ｄｅｌｔａ－ＬＶＥＦ，Ｄｅｌｔａ－ＬＶＦＳ）を比較解析したところ、Ａ－ＨＣＦ投与群は，移植後１８週で、－６．９±２．６％のＤｅｌｔａ－ＬＶＥＦ値を示し、－３．５±１．３％のＤｅｌｔａ－ＬＶＦＳ値を示した（図９－２Ｂ及びＤ）。一方で、ｕＡ－ＨＣＦ投与群は移植後１８週で、－１．８±３．４％のＤｅｌｔａ－ＬＶＥＦ値を示し、－０．６±１．８％のＤｅｌｔａ－ＬＶＦＳ値を示した。また、ｕＡ９０－ＨＣＦ投与群は移植後１８週で、９．２±２．６％のＤｅｌｔａ－ＬＶＥＦ値を示し、５．６±１．６％のＤｅｌｔａ－ＬＶＦＳ値を示した。従って、ｕＡ９０－ＨＣＦは不全心筋の機能を長期に渡って、有意に改善できることが理解される。なお、主項目（ＬＶＥＦ，ＬＶＦＳ）の内訳と、副次項目（ＬＶＥＤＶ，ＬＶＥＳＶ，ＬＶＩＤｄ，ＬＶＩＤｓ，ＬＶＡＷｄ，ＬＶＰＷＴｄ，ＨＲ）の内訳は表３～１１に示した。
【0076】
【表3】
【0077】
【表4】
【0078】
【表5】
【0079】
【表6】
【0080】
【表7】
【0081】
【表8】
【0082】
【表9】
【0083】
【表10】
【0084】
【表11】
【図1】
【図2】
【図3-1】
【図3-2】
【図4-1】
【図4-2】
【図5】
【図6】
【図7-1】
【図7-2】
【図7-3】
【図8】
【図9-1】
【図9-2】
