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特許7428397免疫調節性Ｍ２単球を選択的に低減することによってがんを治療し、治療的免疫を増強するための方法および組成物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-01-29
(45)【発行日】2024-02-06
(54)【発明の名称】免疫調節性Ｍ２単球を選択的に低減することによってがんを治療し、治療的免疫を増強するための方法および組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 48/00 20060101AFI20240130BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240130BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240130BHJP
A61K 31/7125 20060101ALI20240130BHJP
A61K 35/13 20150101ALI20240130BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20240130BHJP
C12N 15/113 20100101ALN20240130BHJP
【ＦＩ】
A61K48/00
A61P35/00
A61P43/00 105
A61K31/7125 ZNA
A61K35/13
A61P37/04
C12N15/113 Z
【請求項の数】
32
(21)【出願番号】P 2021158687
(22)【出願日】2021-09-29
(62)【分割の表示】P 2018504082の分割
【原出願日】2016-04-11
(65)【公開番号】P2021193143
(43)【公開日】2021-12-23
【審査請求日】2021-10-27
(31)【優先権主張番号】62/145,758
(32)【優先日】2015-04-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】516241599
【氏名又は名称】トーマス・ジェファーソン・ユニバーシティ
(74)【代理人】
【識別番号】100105957
【弁理士】
【氏名又は名称】恩田 誠
(74)【代理人】
【識別番号】100068755
【弁理士】
【氏名又は名称】恩田 博宣
(74)【代理人】
【識別番号】100142907
【弁理士】
【氏名又は名称】本田 淳
(74)【代理人】
【識別番号】100152489
【弁理士】
【氏名又は名称】中村 美樹
(72)【発明者】
【氏名】アンドリューズ、デビッド ダブリュ．
(72)【発明者】
【氏名】フーパー、ダグラス シー．
【審査官】佐々木 大輔
(56)【参考文献】
【文献】米国特許第０６３３１５２６（ＵＳ，Ｂ１）
【文献】特表２００２－５２２５０６（ＪＰ，Ａ）
【文献】Cancer Research, 1994, Vol.54, No.18, pp.4848-4850
【文献】Cancer Immunol. Immunother. 2015.03, Vol.64, No.3, pp.299-309
【文献】J. Clin. Oncol., 2001,Vol.19, pp.2189-2200
【文献】Am. J. Cancer Res., 2013, Vol.3, No.1, pp.21-33
【文献】Cancer immunology, immunotherapy, 2015.04, Vol.64, No.4, pp.447-457, Epub.2015.01.13
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ４８／００
Ａ６１Ｋ ３５／００－３５／７６８
Ａ６１Ｋ ３１／３３－３３／４４
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
神経膠芽腫を患う対象におけるＭ２細胞の選択的低減における使用のための医薬組成物であって、インスリン様成長因子１受容体アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮ）を含み、前記ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮが配列番号１の配列を有し、前記ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮが、約０．０２５ｇ／ｋｇ～約０．２ｇ／ｋｇの範囲の用量で前記対象に投与され、
ａ）前記Ｍ２細胞が、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ２３、ＣＤ６４、ＣＤ６８、ＣＤ１６３、ＣＤ２０４およびＣＤ２０６からなる群から選択される１つ以上の細胞表面マーカを発現するＭ２マクロファージまたはＭ２単球である、または
ｂ）前記対象が循環中のＭ２細胞、腫瘍微小環境中のＭ２細胞、または、未分化単球をＭ２細胞へと極性化する血清を有する、医薬組成物。
【請求項2】
前記対象における前記Ｍ２細胞が、ＦＡＣＳによる測定によると、前記医薬組成物の前記対象への投与から約２４時間以内に少なくとも約４０％減少する、請求項１に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項3】
前記医薬組成物の投与が前記対象におけるＭ１細胞の数に影響しない、請求項１に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項4】
前記ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮが１つ以上のホスホロチオエート結合を含む、請求項１に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項5】
前記ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮが、修飾されたリン酸骨格を含む、請求項１に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項6】
前記ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮが、約０．０２５ｇ／ｋｇ、約０．０５ｇ／ｋｇ、約０．１ｇ／ｋｇ、約０．１５ｇ／ｋｇ、または約０．２ｇ／ｋｇの用量で前記対象に投与される、請求項１に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項7】
前記医薬組成物が前記対象における１型免疫を回復させる、請求項１に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項8】
前記ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮが約３７℃でヘアピンループ構造を形成しない、請求項１に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項9】
前記Ｍ２細胞が、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ２３、ＣＤ６４、ＣＤ６８、ＣＤ１６３、ＣＤ２０４およびＣＤ２０６からなる群から選択される１つ以上の細胞表面マーカを発現するＭ２マクロファージである、請求項１に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項10】
前記Ｍ２細胞が、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ２３、ＣＤ６４、ＣＤ６８、ＣＤ１６３、ＣＤ２０４およびＣＤ２０６からなる群から選択される１つ以上の細胞表面マーカを発現するＭ２単球である、請求項１に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項11】
前記Ｍ２細胞が、ＣＤ１６３を発現するＭ２マクロファージまたはＭ２単球である、請求項１に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項12】
前記対象が循環中のＭ２細胞、腫瘍微小環境中のＭ２細胞、または、未分化単球をＭ２細胞へと極性化する血清を有する、請求項１に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項13】
前記対象における前記神経膠芽腫の退縮を誘導する、請求項１に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項14】
前記対象における前記神経膠芽腫の産生の低下を引き起こす、請求項１３に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項15】
前記対象における前記神経膠芽腫の産生の除去を引き起こす、請求項１４に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項16】
経口、腹腔内、または静脈内投与のために製剤化される、請求項１に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項17】
前記医薬組成物が、前記対象に全身投与されるものであり、前記医薬組成物が、前記対象におけるＭ２細胞を選択的に除去する、請求項１に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項18】
対象のがん治療における使用のための医薬組成物であって、第１のインスリン様成長因子１受容体アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮ）を含み、前記第１のＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮが配列番号１の配列を有するとともに修飾されたリン酸骨格を有し、少なくとも１つの拡散チャンバが前記対象にさらに投与され、
前記拡散チャンバが、腫瘍細胞と、第２のインスリン様成長因子１受容体アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮ）とを含み、前記第２のＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮが、配列番号１の配列を有するとともに修飾されたリン酸骨格を有し、
前記医薬組成物が、前記対象に全身投与されるものである、医薬組成物。
【請求項19】
放射線療法が、前記医薬組成物の投与後に前記対象にさらに施される、請求項１８に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項20】
前記放射線療法は、内部源放射線療法、外部ビーム放射線療法、および全身ラジオアイソトープ放射線療法からなる群から選択される、請求項１９に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項21】
前記放射線療法が外部ビーム放射線療法である、請求項２０に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項22】
前記外部ビーム放射線療法が、γ線療法、Ｘ線療法、強度変調放射線療法（ＩＭＲＴ）、および画像誘導放射線療法（ＩＧＲＴ）からなる群から選択される、請求項２１に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項23】
前記外部ビーム放射線療法がγ線療法である、請求項２２に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項24】
前記腫瘍細胞が、照射された腫瘍細胞である、請求項１８に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項25】
前記拡散チャンバが、前記医薬組成物の全身投与の前に前記対象に投与される、請求項１８に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項26】
前記拡散チャンバが、前記医薬組成物の全身投与の後に前記対象に投与される、請求項１８に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項27】
前記腫瘍細胞および前記第２のＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮが、それぞれ照射されている、請求項１８に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項28】
前記拡散チャンバが、治療的に有効な期間、前記対象の腹直筋鞘に外科的に移植される、請求項１８に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項29】
前記修飾されたリン酸骨格が、前記少なくとも１つのＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮをヌクレアーゼ分解に対して耐性にする、請求項１８に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項30】
少なくとも１つのＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮが、１つ以上のホスホロチオエート結合を含む、請求項１８に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項31】
前記がんが、神経膠腫、神経膠芽腫、星状細胞腫、乳がん、頭頸部扁平上皮細胞がん、乳頭状腎細胞がんタイプ２、肺がん、膵がん、胆嚢がん、直腸がん、古典的ホジキンリンパ腫、卵巣がん、および結腸直腸がんからなる群から選択される、請求項１８に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項32】
前記がんが神経膠腫である、請求項３１に記載の使用のための医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、Ｍ２細胞を、インスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦ－１Ｒ）に特異的なアンチセンス核酸で標的化することによって選択的に低減することにより、がんを治療し、治療的免疫を増強するための方法および組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
単球は、骨髄における骨髄前駆細胞に由来する白血球の１種である。単球は骨髄から末梢血流に侵入し、後に組織へ遊走する。組織内で局所成長因子、炎症促進性サイトカイン、および微生物化合物への曝露後、単球はマクロファージおよび樹状細胞に分化する。単球前駆物質由来のマクロファージは、古典的に極性化された（Ｍ１）マクロファージおよび非古典的に活性化された（Ｍ２）マクロファージへの特異的分化を経る。通常、マクロファージは免疫系における３つの主な機能を果たす。これらは、食作用、抗原提示、およびサイトカイン提示である。さらに、特定タイプのがん（例えば、乳がん、星状細胞腫、頭頸部扁平上皮細胞がん、乳頭状腎細胞がんタイプＩＩ、肺がん、膵がん、胆嚢がん、直腸がん、神経膠腫、古典的ホジキンリンパ腫、卵巣がん、および結腸直腸がんなど）は、腫瘍内部のＭ２様マクロファージおよび末梢において循環する類似のＭ２単球のレベル上昇を呈する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0003】
がん治療における進歩にもかかわらず、これらのがんにおける予後は不良のままであり、例えば、化学療法、外部ビーム放射線、および密封小線源治療などの従来治療を用いてのこれらのがんを治療する試みは、無進行生存および全生存において周辺的な改善をもたらしているに過ぎない。したがって、当該技術分野ではかかるがんに対する新たな改善された治療を得る必要がある。
【課題を解決するための手段】
【0004】
一部の態様では、本開示は、有効量のインスリン様成長因子１受容体アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮ）を含む医薬組成物を提供し、対象の循環中のＭ２細胞、腫瘍微小環境中のＭ２細胞、または未分化単球をＭ２細胞へと極性化する血清を有する対象に医薬組成物を投与することにより、対象におけるＭ２細胞の数が低減される。
【0005】
他の態様では、本開示は、対象におけるＭ２細胞の選択的除去のための方法であって、対象に医薬組成物を有効量で全身投与するステップを含む、方法を提供する。
他の実施形態では、本開示は、Ｍ２細胞の数を低減することによってがんを治療する方法であって、がんを患う対象に医薬組成物を有効量で全身投与するステップを含む、方法を提供する。
他の実施形態では、本開示は、Ｍ２細胞の数を低減することによってがんを治療する方法であって、がんを患う対象に医薬組成物を有効量で全身投与するステップを含む、方法を提供する。
【0006】
さらに他の実施形態では、本開示は、対象における免疫応答を増強するための方法であって、対象に医薬組成物を有効量で全身投与するステップを含む、方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0007】
【図1】神経膠腫を有する患者の末梢におけるＣＤ１６３＋細胞の発現を示す図。単球のこのサブセットは腫瘍の存在によって開始され、この亜集団はその血管新生および免疫抑制性の性質に起因して腫瘍の成長および浸潤を支持する。神経膠腫のグレードは、Ｍ２単球マーカを有する細胞の蓄積および活性に関連する。この集団の腫瘍内部でのＭ２様ＣＤ１６３＋マクロファージおよび循環する末梢における類似のＭ２単球の存在はまた、任意の炎症促進性抗腫瘍ワクチンの方策を無効にする。ａ．ＷＨＯグレードＩＩＩ星状細胞腫内でのＣＤ１４＋細胞における増加を反映するフローサイトメトリーが示されている。ｂ．ＷＨＯグレードに従ってＣＤ１６３＋細胞のレベルを比較するグラフ表示。グレードＩＩＩおよびグレードＩＶの腫瘍は、正常対象またはＷＨＯグレードＩＩ星状細胞腫のいずれかと比べると、ＰＭＢＣにおける有意に異なる％単球を示す。
【図2a】細胞型による、インスリン様成長因子１受容体に特異的な標識されたアンチセンス核酸（ＩＦＧ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮ）の取り込みを示す図。神経膠腫患者における腫瘍および対応血液試料に由来するマクロファージ（ＣＤ１４＋）は、インスリン様成長因子１型受容体に特異的なアンチセンス（ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮ）を貪欲に取り込む。
【図2b】免疫型による、インスリン様成長因子１受容体に特異的な標識されたアンチセンス核酸（ＩＦＧ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮ）の取り込みを示す図。神経膠腫患者における腫瘍および対応血液試料に由来するマクロファージ（ＣＤ１４＋）は、インスリン様成長因子１型受容体に特異的なアンチセンス（ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮ）を貪欲に取り込む。
【図3a】インスリン様成長因子１受容体（ＩＦＧ－１Ｒ）の発現を伴う細胞のフローサイトメトリーを示す図。インビトロでＭ２細胞に極性化される正常な末梢単球は、ＩＧＦ－１Ｒを、Ｍ１極性化に誘導されるマクロファージと比べて過剰発現する。さらに、ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮは、用量依存的にＭ２亜集団における細胞死を選択的に誘導する。図３ａは、ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮが、Ｍ２マクロファージの除去を、これらの細胞が優勢な状況下でそれらの腫瘍促進効果が除去され得るとともに治療的なＴｈ１免疫が救済され得るように、選択的に標的化することを詳述する。白丸は分化された刺激されていない細胞を表し、黒丸は分化され、刺激された細胞を表す。
【図3b】インスリン様成長因子１受容体（ＩＦＧ－１Ｒ）の発現を伴う細胞のフローサイトメトリーを示す図。インビトロでＭ２細胞に極性化される正常な末梢単球は、ＩＧＦ－１Ｒを、Ｍ１極性化に誘導されるマクロファージと比べて過剰発現する。さらに、ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮは、用量依存的にＭ２亜集団における細胞死を選択的に誘導する。図３ｂは、マクロファージの極性化による、ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮで治療後での単球サブセット分布における差異を示す。
【図4】治療経過全体を通じての患者における腫瘍に関連したＣＤ１６３＋細胞の定量化を示す図。５４００倍視野の平均および標準偏差がアペリオ（Ａｐｅｒｉｏ）定量化によって測定された。１回目の手術、１回目の再発、２回目の再発、および剖検の４つの時点と、ｙ軸上にアペリオ（Ａｐｅｒｉｏ）ＣＤ１６３＋細胞が提供される。図４は、本明細書に開示される方法が、標準治療が奏効していない患者においてＣＤ１６３＋細胞を低減するのに有効であることを示す。
【図5】６つの継続的な多形神経膠芽腫標本におけるＩＧＦ－１Ｒについての免疫組織化学を示す図。すべての腫瘍がＩＧＦ－１Ｒの免疫反応性を示した。ＩＧＦ－１Ｒの免疫反応性は、腫瘍微小環境中での１つ以上のＩＧＦ－１Ｒを発現する細胞の存在を示し、がん治療における標的としてＩＧＦ－１Ｒを識別する。
【図6】ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮの２つの異なる配列ロットの質量分析を示す図。ａ－ｃ：ＤＷＡ配列のアヴェシア（Ａｖｅｃｉａ）ロット産物；ｄ－ｆ：ノーベル（ＮＯＢＥＬ）配列のＧｉｒｉｎｄｕｓロット産物；ａ，ｄ：凍結乾燥粉末形態でのＡＳ ＯＤＮの安定性；ｂ，ｅ：滅菌生理食塩水中の製剤；ｃ，ｆ：滅菌生理食塩水中の製剤。ＩＭＶ１１８ロット番号ＧＡＩ－０８－０６０－Ｓ３－Ｂ１の安定性結果は、最小の分解生成物が約３００Ｄａであることを示し、それ故、測定された質量スペクトルが５７０９±３００Ｄａの要件およびロット放出から現在までの貯蔵における許容できる安定性を満たす。アヴェシア（Ａｖｅｃｉａ）配列（ＤＷＡ）は、９年間にわたる安定性を示す。
【図7】循環ＣＤ６８＋ＣＤ１６３＋細胞が、動物において、ＧＬ２６１の中枢神経系への移植後に１用量のノーベル（ＮＯＢＥＬ）（配列番号１）の全身（腹腔内）投与を受けてから少なくとも１４日目に減少することを示す図。ノーベル（ＮＯＢＥＬ）は、開始メチオニンコドンから下流の６つのヌクレオチドで始まる、１８－ｍｅｒのホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドのＩＧＦ１－Ｒアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（ＡＳ ＯＤＮ）である。ノーベル（ＮＯＢＥＬ）は、フロースルー技術を用いての閉じた化学的カラム反応器を備えたシンセサイザー内で、十分に確立された方法論を用いることによる固相有機合成によって作製される。固体支持体上の各合成サイクルシークエンスは複数のステップからなり、それらは完全長オリゴヌクレオチドが確立されるまで順次実施される。次に、ノーベル（ＮＯＢＥＬ）は凍結乾燥され、スクリューキャップを有するＨＤＰＥ容器内にパッケージされ、次に－８０℃で貯蔵するため、５ｍＬのマイラー（Ｍｙｌａｒ）パウチ内部で真空ヒートシールされる。使用前、凍結乾燥粉末は１００ｍｇ／ｍＬの溶液が得られるまで生理食塩水に溶解される。得られた溶液は、０．２２μｍの膜フィルターを通して滅菌濾過される。－８０℃での貯蔵前、１ｍＬのアリコートがＵＳＰタイプ１（ＵＳＰ Ｔｙｐｅ １）ガラスバイアル内に満たされ、適切なゴム栓とアルミニウムキャップで密封される。 この実験においては、白血球がビオチン化抗マウスＣＤ１６３（ビオバイト（Ｂｉｏｒｂｙｔ））で染色され、洗浄され、二次ストレプトアビジン－ＡＰＣが添加された。２回の洗浄および固定の後、細胞は、透過処理され、抗マウスＣＤ６８－ＰＥで細胞内染色され、続いて、膜を閉じるため、パームバッファ（ｐｅｒｍ－ｂｕｆｆｅｒ）で２回洗浄され、最終ＰＢＳ洗浄が行われた。試料は、ミリポアグアバ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｇｕａｖａ）フローサイトメータ上を流れ、フロウジョ（ＦｌｏｗＪｏ）を用いて分析された。屠殺時に採取された試料は、ノーベル（ＮＯＢＥＬ）の腹腔内投与後のＷＢＣ集団における相当な変化を示す。ａ．ＰＢＳ腹腔内注射対照；ｂ．ノーベル（ＮＯＢＥＬ）腹腔内注射。
【図8】腫瘍産生前でのノーベル（ＮＯＢＥＬ）（配列番号１）単独の投与がＧＬ２６１細胞成長の開始を遅延させる上で有効であることを示す図。溶媒の腹腔内投与（ＰＢＳ）を受けたＣ５７およびＴｂｅｔノックアウト動物のそれぞれ６０％および１００％が腫瘍を発生させるのに対し、ノーベル（ＮＯＢＥＬ）の腹腔内投与後ではＣ５７およびＴｂｅｔノックアウトマウスのそれぞれ２０％および５０％が腫瘍を発生させる。有意性はログランク検定を用いて評価された（＊＝ｐ＜０．０５）。
【図9】シトシン－ホスホロチオエート－グアノシン－ＤＮＡがＢ細胞および形質細胞様樹状細胞（ＤＣ）上に発現されるＴＬＲ９を活性化することを示す図。
【図10】抗原提示細胞がＡＳ ＯＤＮを取り込み、増加した同時刺激分子を発現し、ＡＳ ＯＤＮ治療の前および後にＰＢＭＣにおいて諸レベルのＣＤ８０／８３／８６を発現することを示す図（ｍＤＣ、骨髄樹状細胞；ｐＤＣ、形質細胞様樹状細胞）。
【図11】ノーベル（ＮＯＢＥＬ）（配列番号１）が、中央値蛍光強度の低下によって判定される通り、単球由来樹状細胞（ＤＣ）を活性化することを示す図。未熟ＤＣは大量の蛍光タンパク質を貪食し、（より大きいバーによって示される）より高い蛍光強度をもたらす。（活性化された）成熟ＤＣは、エンドサイトーシスを下方制御し、結果として、取り込む蛍光タンパク質が減少し、（より小さいバーによって示される）低い蛍光強度を有する。単球由来樹状細胞のＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮによる治療は、著しい用量依存性の成熟応答を示す。
【図12】ＣｐＧモチーフ、５’Ｇ＊Ｇモチーフ、およびホスホロチオエート結合のすべてが樹状細胞にさらなる成熟刺激をもたらすことを示す図。ａ：未熟ＤＣは高度にエンドサイトーシスが亢進し、大量の蛍光タンパク質を貪食し（上パネル）、より高い蛍光強度をもたらす。ｂ：単球由来ＤＣが様々なＩＧＦ－１Ｒ／ＡＳ ＯＤＮ（１μｇ／ｍｌ）の存在下で２４時間インキュベートされた。ＬＰＳで治療されたＤＣ（１μｇ／ｍｌ）は、成熟における正の対照として機能した。未熟ＤＣは、大量の蛍光タンパク質を貪食し、（より大きいバーによって示される）より高い蛍光強度をもたらした。（活性化された）成熟ＤＣは、エンドサイトーシスを下方制御し、結果として、取り込む蛍光タンパク質が減少し、（より小さいバーによって示される）低い蛍光強度を有する。ＩＧＦ－１Ｒ／ＡＳ ＯＤＮ中に含まれるＣｐＧモチーフもまた、ＤＣに成熟刺激をもたらす（対照およびＬＮＡ ＤＣを参照）。ホスホロチオエート結合は、ＤＣにさらなる成熟刺激をもたらす（ノーベル（ＮＯＢＥＬ）ＤＣ）。５’Ｇ＊Ｇモチーフは、ＤＣに第３の成熟刺激をもたらす（ＤＷＡ ＰＴ ＤＣを参照）。試験されたオリゴマーは、配列番号１（ノーベル（ＮＯＢＥＬ））、配列番号１１（ＩＤＴ１２２０ホスホロチオエートＡＳ ＯＤＮ（ＩＤＴ１２２０））、配列番号１５（ＤＷＡホスホロチオエートＡＳ ＯＤＮ（ＤＷＡ ＰＴ））、配列番号１６（ＤＷＡ固定化核酸ＡＳ ＯＤＮ（ＬＮＡ））、および配列番号１７（ＤＷＡホスホジエステルＡＳ ＯＤＮ（ＤＷＡ対照））を含んだ。
【図13】ａ．ＤＷＡ配列が、５’側のヘアピンループ二次構造（影付きの挿入図）を３７℃で維持し、おそらくは標的化されたｍＲＮＡ配列との塩基対合に影響すること、ｂ．ノーベル（ＮＯＢＥＬ）（配列番号１）配列が、１８℃でＭＰを有する２つの交互の二次構造に対するＣｐＧモチーフの５’側のヘアピンループ（影付きの挿入図）を３７℃で有さず、標的化された塩基対合、ひいてはＣｐＧの可能性の増加を許容することを示す図。
【図14】ＧＬ２６１におけるノーベル（ＮＯＢＥＬ）（配列番号１）適定を示す図。細胞は増殖培地を有する９６ウェルプレート内に２０ｋ／ウェルで蒔かれ、４時間インキュベートされ（３７℃、５％ＣＯ２加湿）；増殖培地は除去され、所望されるＡＳ ＯＤＮ濃度を有する無血清オプティ－メム（Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ）（１００μＬ）が各ウェルに添加された。細胞はさらに２４時間培養液に戻された。ａ．ＧＬ２６１細胞内でのＩＧＦ－１Ｒの発現に対するノーベル（ＮＯＢＥＬ）適定の効果。ＩＧＦ－１Ｒコピー数に対するマイクロタイタープレート内の最終ｍｇ／ウェル（またはｍｇ／２０ｋ細胞）。細胞が蒔かれた。分散分析を用いて有意性が判定された（＊＝Ｐ＜０．０５；＊＊＝Ｐ＜０．００１）。ｂ．細胞が収集され、マウスＩＧＦ－１Ｒに特異的な抗体で染色され、フローサイトメータで分析された。中央値蛍光強度が最終ＡＳ ＯＤＮ濃度（ｍｇ／２０ｋ細胞）に対してプロットされる。ＩＧＦ－１Ｒの発現は、１ｍｇのノーベル（ＮＯＢＥＬ） ＡＳ ＯＤＮ／ウェルで治療されたＧＬ２６１細胞内（Ｐ＜０．００１）、および０．１ｍｇのノーベル（ＮＯＢＥＬ） ＡＳ ＯＤＮ／ウェルで治療された細胞内（Ｐ＜０．０５）で有意に低下した。
【図15】ヘキソキナーゼアイソタイプ２ ｍＲＮＡの下流での下方制御を評価するための定量ＲＴ－ＰＣＲの結果を示す図。ヒト神経膠腫株Ｕ１１８のノーベル（ＮＯＢＥＬ）（配列番号１）で治療された細胞内でのＬ１３、ＩＧＦ－１ＲおよびＨｅｘＩＩ遺伝子の発現が線形に相関する。異なる濃度でのノーベル（ＮＯＢＥＬ）で治療された、個別の培養下で検出されたＩＧＦ－１Ｒコピー数に対してプロットされるハウスキーピング遺伝子Ｌ１３（▼）およびヘキソキナーゼ２［ＨＥＸ］（■）に特異的なｍＲＮＡコピー数が示される。実線はＬ１３とＩＧＦ－１Ｒとの間の最良適合直線回帰線を表し、点線はＨｅｘ－ＩＩとＩＧＦ－１Ｒとの間の最良適合直線回帰線を表し、ここでｒ２は（１．０からの）直線性の度合い、Ｐは勾配の有意性を表す。
【図16】ＡＳ ＯＤＮ治療から２週間後、１０６個のＧＬ２６１細胞が注射されたＣ５７／Ｂ６マウスにおける累積的な腫瘍成長を示す図。ＡＳ ＯＤＮ群におけるすべてのマウスに、１０６個のノーベル（ＮＯＢＥＬ）（配列番号１）で治療されたＧＬ２６１（一晩のＡＳ ＯＤＮ治療、２０ｍｇ／５×１０６個のＧＬ２６１）が側腹に１回注射され、治療から２週間後、ＷＴ ＧＬ２６１が反対側の側腹に負荷された；ＡＳ ＯＤＮ／ＧＬ２６１混合群におけるマウスに、注射直前に非治療ＧＬ２６１細胞と混合されたノーベル（ＮＯＢＥＬ）（２０ｍｇ／５×１０６個のＧＬ２６１）が側腹に１回注射され、治療から２週間後、ＷＴ ＧＬ２６１が反対側の側腹に負荷された。腫瘍が治療後負荷（ＷＴ ＧＬ２６１）から発生した。
【図17】投与部位でのＧＬ２６１細胞とノーベル（ＮＯＢＥＬ）（配列番号１）との組み合わせが皮下モデルにおいて腫瘍形成を阻害することを示す図。
【図18】ノーベル（ＮＯＢＥＬ）（配列番号１）が放射線増感を誘導することを示す図。
【図19】安全性評価試験を示す図。ａ．試験における患者の全生存；ｂ．手術間の間隔に対する全生存；ｃ．２つの生存コホートでの生存プロトコル。患者９名が疾患進行で死亡した一方、１名が脳内出血、２名が敗血症で死亡した。全生存プロトコルは、より長期（Ｎ＝４）および短期（Ｎ＝８）の生存コホートに対して各々、４８．２週および９．２週であった（ログランク＝０．００２５）。ｃ．原因が疾患進行でない死亡を除外し、中央値生存は、より長期のコホート（Ｎ＝４）および短期コホート（Ｎ＝５）に対して各々、４８．２週および１０週であった（ログランク＝０．００４９）；ｄ．１つの異常値（長期コホート）を除外し、直線回帰は、生存プロトコルと登録時のリンパ球数との間で高い相関を示した（Ｒ２＝０．８，ｐ＝０．００２８）。
【図20a】解剖学的腫瘍のＸ線応答を示す図であり、短期生存コホートの例。Ｔ１２：Ａ－Ｄ；ＴＪ１０：Ｅ－Ｈ；Ａ，Ｅ：手術前のＴ１ガドリニウム増強された軸方向画像；Ｇ：Ｔ１－ガドリニウム増強された冠状画像；Ｃ：手術前の軸方向ＦＬＡＩＲ画像；Ｂ，Ｄ，Ｆ，Ｈ：各々の手術後３か月目の画像。
【図20b】解剖学的腫瘍のＸ線応答を示す図であり、より長期の生存コホートの例。ＴＪ０６：Ａ－Ｄ；ＴＪ０９：Ｅ－Ｈ。Ａ，Ｅ：手術前のＴ１ガドリニウム増強された軸方向画像；Ｃ，Ｆ：手術前の軸方向ＦＬＡＩＲ画像；Ｂ，Ｄ，Ｆ，Ｈ：各々の手術後３か月目の画像。
【図20c】解剖学的腫瘍のＸ線応答を示す図であり、短期生存コホートにおける腫瘍内の相対的脳血液量に対する見かけの拡散係数の関係。
【図20d】解剖学的腫瘍のＸ線応答を示す図であり、より長期の生存コホート。見かけの拡散係数（ＡＤＣ）と相対的脳血液量（ｒＣＢＶ）との間に高い相関がある（Ｒ２＝０．９６，ｐ＝０．０００５）。
【図20e】解剖学的腫瘍のＸ線応答を示す図であり、より長期の生存コホートにおけるサイトカイン応答の概要（Ｎ＝３）。
【図20f】患者ＴＪ０６において経時的にｒＣＢＶおよびＡＤＣに関連するときのＣＤ１６３＋細胞の減少の例を示す図。さらにｒＣＢＶに関連するときの、血清硝酸塩レベルとして反映される充血の薬剤である活性化一酸化窒素シンテターゼのアッセイ（Ｇｒｅｉｓｓアッセイ）。
【図21a】外植されたチャンバおよび病理学的標本の検査を示す図であり、ＴＪ０９からチャンバ外植されたチャンバの光学顕微鏡合成写真。左カラム：ＰＢＳチャンバ；右カラム：ワクチンチャンバ；上の行：膜外表面のＨ＆Ｅ染色；下の行：膜外表面のＣＤ１６３＋免疫染色。
【図21b】外植されたチャンバおよび病理学的標本の検査を示す図であり、ＣＤ１６３における免疫蛍光染色（赤）。ａ．初期切除時の患者ＴＪ１４の腫瘍内のＣＤ１６３＋ＴＡＭ；ｂ．ワクチン接種前の再発時の患者ＴＪ１４の腫瘍内のＣＤ１６３＋ＴＡＭ；ＣＤ１６３＋ＴＡＭは増加した；ｃ．２回目再発時の患者ＴＪ１４の腫瘍内のＣＤ１６３＋ＴＡＭ；腫瘍微小環境下でのＴＡＭの減少が認められ、ＣＤ１６３ ＴＡＭは血管のみと関連することが見出された；ｄ，ｅ，ｆ．各々、倍率を上げたもの。
【図21c】外植されたチャンバおよび病理学的標本の検査を示す図。治療ステージに応じたＣＤ１６３＋ＴＡＭのアペリオ（Ａｐｅｒｉｏ）免疫染色定量化（左２つのパネル）；両方の第Ｉ相試験では類似レベルであるが、剖検を受けた非診断・非処理患者では有意により低いレベルがさらに認められた（右パネル）。
【図22】治療後期間におけるワクチン接種誘発後の免疫エフェクター細胞変化およびサイトカイン／ケモカイン変化の連続的な測定を示す図；より長期の生存コホート（患者ＴＪ０３、ＴＪ１４、ＴＪ０６、ＴＪ０９）；短期生存コホートの例（他のすべての短期生存コホートについては患者ＴＪ１３、図２５を参照）。行：ａ．ＰＢＭＣ中のＷＢＣの相対量と比べてのＣＤ４およびＣＤ８の絶対数；ｂ．ＣＣＬ２１およびＣＸＣＬ１２のレベル；ｃ．相対Ｔ細胞数およびマクロファージ数の関係；ｄ．ＣＤ１４＋ＣＤ１６－マクロファージのＣＣＲ２およびＭＣＰ－１（ＣＣＬ２）との相対的割合の関係；ｅ．ワクチン接種後の推定上のＴｈ－１サイトカイン応答。
【図23】生存コホートによるＰＭＡ／イオノマイシン刺激後のａ．推定上のＴｈ－１サイトカイン；ｂ．Ｔｈ－２に関連したサイトカインにおける１４日目のサイトカインレベル（ｐｇ／ｍｌ）の概要を示す図。平均（チューキ）と独立ｔ検定の比較。ｐ＜．０５での有意性。ＴＪ０３は一貫して９５％ＣＩの外側の値を有する異常値として除外された。
【図24】解剖学的腫瘍のＸ線応答を示す図。ａおよびｃ：軸方向ガドリニウム増強Ｔ－１Ｗ画像；パネルａおよびｂ：患者ＴＪ０６、パネル４ｃおよびｄ、患者ＴＪ０７；ｂおよびｄ：同じ軸方向のレジストレーションでの遅延ＰＥＴ／ＣＴ画像。パネルｂでは、左側頭葉の大脳皮質リボンの右側頭葉と比べての正常な代謝亢進の欠如；前外側側頭葉における代謝亢進の小部分を含むフォトペニア（ｐｈｏｔｏｐｅｎｉａ）に注目のこと。（パネルａ）における増強の大部分は炎症として解釈される。ｄでは、代謝亢進と疾患進行として解釈されるパネルｃにおける増強の対応する容積の明確な相関に注目のこと。
【図25】供給源による平均サイトカインレベル（ｐｇ／ｍｌ）の比較を示す図（Ｃ－ｐ、ＰＢＳチャンバ；Ｃ－ｖ、ワクチンチャンバ；血清；ＳＮ、自家腫瘍細胞上清）。ＣＣＬ２１はワクチンチャンバにおいてＣ－ｐと血清の双方と比べて有意に上昇する。ＣＣＬ２０はＣ－ｖおよびＣ－ｐにおいて血清に対して有意に上昇し、ＣＣＬ１９はＣ－ｖにおいてＣ－ｐまたは血清に対して有意に上昇した。ＨＳＰ－７０は血清と比べて有意に上昇し、ＣＣＬ２は血清と比べて有意に上昇し、ＣＸＣＬ１２は血清においてＣ－ｐに対して有意に上昇した唯一のサイトカインである（＊ｐ＜０．０３５，＊＊ｐ＜０．０２５，＊＊＊ｐ＜０．０１５，†ｐ＜０．００４，††ｐ＜０．０００２，†††ｐ＜０．０００１）。
【図26a】外植されたチャンバおよび病理学的標本の検査を示す図であり、左パネル：初期診断時とワクチン接種前の再発時とにおける免疫陽性細胞／４００倍視野、ＣＤ１６３ ＴＡＭの数の平均の比較；右パネル：マッチドペア比較の平均差－１９．２％の増加、ｐ＜０．０００１。
【図26b】外植されたチャンバおよび病理学的標本の検査を示す図であり、左パネル：ワクチン接種前の再発時と剖検時とにおけるＣＤ１６３ ＴＡＭの数の平均の比較；右パネル：マッチドペア比較の平均差－２６．３５％の低下、ｐ＜０．０００１。
【図26c】外植されたチャンバおよび病理学的標本の検査を示す図であり、初期試験および現行試験からのパラフィン試料中と、非診断且つ非治療の神経膠芽腫から得られた６つの剖検標本中とにおけるＣＤ１６３ ＴＡＭの遡及的比較。
【図26d】外植されたチャンバおよび病理学的標本の検査を示す図であり、初期診断時、ワクチン接種前の再発時、および剖検時に得られたパラフィン切片中のＩＧＦ－１Ｒ＋細胞の評価。
【図27a】生存コホートによる免疫陽性細胞／４００倍視野検出ＣＤ１６３細胞の数の平均の比較；左パネル：診断時、長期対短期、ｐ＜０．０００２；右パネル：ワクチン接種誘発前の腫瘍切除時、長期対短期、ｐ＜０．０１２７。
【図27b】末梢と腫瘍関連マクロファージとの間の関係の直線回帰（Ｒ２＝０．９６，ｐ＝０．００４）。
【図28-1】短期生存コホート（各々、患者ＴＪ０１、ＴＪ０２、ＴＪ０７、ＴＪ０８、ＴＪ１０、ＴＪ１１、およびＴＪ１２）に対する治療後期間におけるワクチン接種誘発後の免疫エフェクター細胞変化およびサイトカイン／ケモカイン変化の連続的な測定を示す図。行：ａ．ＰＢＭＣ中のＷＢＣの相対量と比べてのＣＤ４およびＣＤ８の絶対数；ｂ．ＣＣＬ２１およびＣＸＣＬ１２のレベル；ｃ．相対Ｔ細胞数およびマクロファージ数の関係。
【図28-2】短期生存コホート（各々、患者ＴＪ０１、ＴＪ０２、ＴＪ０７、ＴＪ０８、ＴＪ１０、ＴＪ１１、およびＴＪ１２）に対する治療後期間におけるワクチン接種誘発後の免疫エフェクター細胞変化およびサイトカイン／ケモカイン変化の連続的な測定を示す図。行：ｄ．ＣＤ１４＋ＣＤ１６－マクロファージのＣＣＲ２およびＭＣＰ－１（ＣＣＬ２）との相対的割合の関係；ｅ．ワクチン接種後の推定上のＴｈ－１サイトカイン応答。
【図29A】大多数のＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮの取り込みが単球および好中球で生じることを示す図。
【図29B】ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮの取り込みはＭ１およびＭ２細胞において同様であるにもかかわらず、ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮの濃度を増加させると、ＩＧＦ－１Ｒの上方制御を伴うＭ２ ＣＤ１６３＋細胞のみの選択的除去を標的化することを示す図。
【図29C】ＣＤ１６３＋細胞のアポトーシス細胞死の速度がＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮの濃度と直接的に関係することを示す図。
【図30】がん患者血清中の正常な単球のインキュベーションによる単球のＭ２細胞への極性化を示す図。ａ．ＣＤ１６３＋マクロファージのＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮ（ノーベル（ＮＯＢＥＬ）、２５０μｇ）治療に対するＰＢＳ対照における平均の比較；ｂ．マッチドペア分析はＭ２細胞集団における高度に有意な減少を示す。
【図31】異なるがんを有する患者からの血清を用いる治療によりＭ２ ＣＤ１６３＋表現型へ極性化される単球がＣＤ１６３とＰＤＬ－１の双方の上方制御を示し、双方の症例にてＡＳ ＯＤＮによる治療がＣＤ１６３とＰＤＬ－１の双方をこの細胞集団を選択的に標的化することによってノックダウンすることを示す図。ａ．ＰＤＬ－１を発現するＣＤ１６３＋マクロファージのＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮ（ノーベル（ＮＯＢＥＬ）、２５０μｇ）治療に対するＰＢＳ対照における平均の比較；ｂ．マッチドペア分析は、ＰＤＬ－１の有意な減少として反映されるこの細胞集団における高度に有意な減少を示す。
【図32】ＩＬ－１０を用いる治療によりＭ２へ極性化される単球が、ＬＰＳ／ＩＦＮγを用いる治療によりＭ１へ極性化される単球よりも大幅に多くのグルタミン（ｇｌｎ）を産生し、それ故、腫瘍細胞の成長を促進する可能性がより高いことを示す図。正常なヒト単球は、ＬＰＳ／ＩＦＮγによる治療によりインビトロでＭ１に極性化され、ＭＣＳＦまたはＩＬ１０を用いる治療によりインビトロでＭ２に極性化された。ａ．は様々な時点で培地中に蓄積するグルタミンのレベル；ｂ．は２４時間の培養後に評価された細胞内グルタミンレベルを示す。
【図33】正常な個体と星状細胞腫患者との間での循環ＣＤ１６３＋単球における差異を示す図。パネルＡ：循環中に約６％のＣＤ１４＋単球とともに中間レベルのＣＤ１６３を有する正常な個体。がん患者において、単球の数が増加しかつ単球はより高レベルのＣＤ１６３を有するという２つの変化が認められる。他の細胞（赤ボックス）はＣＤ１６３を全く有しない。パネルＢ：正常な個体は感染などに起因して広範囲の単球を有し得る（パネルＢ、ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１４が陽性の細胞）が、これらは悪性星状細胞腫を有する患者において上昇する。パネルＣにおけるヒストグラムは、がん患者由来の単球がそのＣＤ１４単球上に対照細胞（赤色ヒストグラム）よりも高レベルのＣＤ１６３を有することを示す。
【図34-1】腫瘍浸潤性Ｍ２単球、野生型ＩＤＨ１状態、および未分化星状細胞腫患者におけるＭＲＩによるガドリニウム増強が、予後不良に関連したより侵襲性の腫瘍を明確にすることを示す図。ＩＤＨＲ１の突然変異Ｒ１３２Ｈ（Ａ）およびＣＤ１６３（Ｂ）について、ホルマリン固定されたパラフィン包埋組織が染色された。
【図34-2】ＦＬＡＩＲ（ＣおよびＤ、左パネル）およびガドリニウム増強されたＴ１荷重軸方向ＭＲＩ（ＣおよびＤ、右パネル）における代表的画像が、非増強でのＡＩＩＩ（ＩＤＨ１ Ｒ１３２Ｈ突然変異体グレードＩＩＩ）腫瘍（Ｃ）、および増強でのＡＩＩＩ－Ｇ（多形神経膠芽腫の特徴を有するＩＤＨ１野生型グレードＩＩＩ）腫瘍（Ｄ）について示される。
【図34-3】腫瘍浸潤性Ｍ２単球、野生型ＩＤＨ１状態、および未分化星状細胞患者におけるＭＲＩによるガドリニウム増強が、予後不良に関連したより侵襲性の腫瘍を明確にすることを示す図。患者は、こうした３つの上記パラメータ（Ａ－Ｄ）、特に、より侵襲性のＧＢＭに類似するＡＩＩＩおよびＡＩＩＩ－Ｇに基づいて、複数群に分割された（Ｅ、Ｆ、およびＧ）。パネルＥには、無作為に選択された増強ＭＲＩおよび非増強ＭＲＩでのＡＡ患者３８名におけるＩＤＨ１突然変異の存在（Ｒ１３２Ｈ＋）または不在（Ｒ１３２Ｈ－）についての結果が示される（ここでｎ．ｄ．は何も検出されないことを表す）。パネルＦには、切除された腫瘍標本におけるＣＤ１６３＋細胞含有物が、自動化細胞数計測システムを用いて数え上げられた上で、増強によって分別されたＡＡ標本について提示される。箱髭図が７５、５０、および２５パーセンタイルを示す一方、最大および最小データ値は上髭および下髭によって表される。群間の差の統計学的有意性は、マン・ホイットニー検定（＊＊＊，ｐ＜０．００１）によって評価された。
【図34-4】腫瘍浸潤性Ｍ２単球、野生型ＩＤＨ１状態、および未分化星状細胞腫患者におけるＭＲＩによるガドリニウム増強が、予後不良に関連したより侵襲性の腫瘍を明確にすることを示す図。パネルＧには、患者のカプラン・マイヤー生存曲線が、それらの腫瘍の侵襲性に基づいて分別されて提示される。群間の統計学的に有意な生存差（＊＊）は、ログランク（ｐ＝０．００１９）およびウィルコクソン検定（ｐ＝０．００８８）によって判定された。結果によると、ＩＤＨ Ｒ１３２Ｈ突然変異体グレードＩＩＩ星状細胞腫がガドリニウムで増強されることはまれであり、腫瘍組織内でのＣＤ１６３＋Ｍ２細胞の蓄積が血管完全性の損失に関連することが示される。
【図35】循環単球の数がＡＩＩＩおよびＡＩＩＩ－Ｇ患者において上昇し、Ｍ２マーカＣＤ１６３を上昇レベルで発現することを示す図。無作為に選択された未分化星状細胞腫（ＡＡ）患者（すなわち、ＷＨＯ組織学的判定基準により形態学的にグレードＩＩＩであると特徴づけられた星状細胞腫を有する患者）１８名および正常ドナー２４名から得られたＰＢＭＣがＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、およびＣＤ１６３に特異的な抗体で染色され、フローサイトメトリーによって評価された。フォワードスキャッター（ＦＳＣ）およびサイドスキャッター（ＳＳＣ）の特性がライブゲートを確立するために用いられ、単球がＣＤ１１ｂおよびＣＤ１４を発現する生細胞として規定された（パネルＡ）。ライブゲートにおける代表的な等高線図ならびに正常およびＡＡドナーから得られたＰＢＭＣにおけるＣＤ１１ｂおよびＣＤ１４陽性の分析がパネルＡに示され、ここで軸はログスケールで示され、数はゲートされた細胞の頻度を示す。パネルＢは、フローサイトメトリーによって測定された、ＡＩＩＩを有する患者１２名、ＡＩＩＩ－Ｇを有する患者６名、および正常な個体２４名から得られたＰＢＭＣにおけるＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１４＋単球の頻度を示す概要チャートである。正常な個体とＡＡ患者サブセットとの間の細胞百分率における差の統計学的有意性がスチューデントｔ検定によって評価された（＊＊，ｐ＜０．０１）。ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１４＋のゲートされた単球のＣＤ１６３染色における中央値蛍光強度（ＭＦＩ）が、パネルＣにおいてＡＩＩＩ、ＡＩＩＩ－Ｇ、および正常血液標本の代表的なヒストグラムプロットから重ねてある。軸はログスケールとして示される。異なるドナー群から得られたＰＢＭＣ試料中のゲートされた単球サブセットのＣＤ１６３染色におけるＭＦＩがパネルＤに示される。
【図36】星状細胞腫エキソソーム上の共通抗原に結合する、ＡＩＩＩおよびＡＩＩＩ－Ｇ患者血清中に存在する抗体が、アイソタイプ特性が異なることを示す図。３つの星状細胞腫患者の原発性腫瘍細胞株から単離されたエキソソームが９６ウェルプレート上にコーティングされ、初期手術前に収集された患者血清（１３ＡＩＩＩ、８ＡＩＩＩ－Ｇ）および正常対照血清（４）とともにインキュベートされた。結合抗体が蛍光結合全ＩｇＧ（パネルＡ）またはＩｇＧアイソタイプに特異的な二次抗体（パネルＢ）で検出され、抗体結合の程度がＭＦＩとして測定された。
【図37】Ｔｈ１およびＴｈ２免疫に一般に関連する可溶性因子がＡＩＩＩおよびＡＩＩＩ－Ｇ患者の血清中で各々上昇することを示す図。
【図38】白血球表現型マーカ、サイトカインおよびケモカイン受容体ならびにそれらのリガンドをコードする遺伝子のＰＢＭＣにおける発現のレベルがＡＩＩＩ患者とＡＩＩＩ－Ｇ患者との間で異なることを示す図。任意抽出されたＡＡ患者１７名から得られたＰＢＭＣにおける単球表現型マーカ（Ａ）、インターロイキン（Ｂ）、インターロイキン受容体（Ｃ）、ＣＣケモカイン（Ｄ）および受容体（Ｅ）、ならびにＣＸＣケモカイン（Ｆ）および受容体（Ｇ）における遺伝子のコピー数は、高スループット定量ＲＴ－ＰＣＲによって評価され、各試料中に存在するハウスキーピング遺伝子Ｌ１３ａのコピー数に正規化された。
【図39】ＡＩＩＩおよびＡＩＩＩ－Ｇ患者サブセットが、ＰＢＭＣにおける選択された免疫学的関連遺伝子の発現によって正確に区別され得ることを示す図。最初に、ＡＩＩＩおよびＡＩＩＩ－Ｇ患者のＰＢＭＣを最良に分別する遺伝子発現データを同定するため、判別分析が用いられた（パネルＡ）。次に、これらの遺伝子ＣＣＬ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ７、ＣＸＣＬ７、ＩＬ－１５、ＩＬ－３２、ＩＬ－１５Ｒ、ＩＬ－２１Ｒ、ＩＬ－２３Ｒ、ＩＬ－３１ＲＡ、およびＣＤ１６３のいずれが２つの患者コホートを区別するのに最も有効であるかを判定するため、主成分分析が用いられた（パネルＢ）。
【発明を実施するための形態】
【0008】
本開示は、Ｍ１細胞とＭ２細胞との間の決定的差異が、Ｍ２亜集団がＭ１亜集団よりも高レベルのインスリン様成長因子１型受容体（ＩＧＦ－１Ｒ）を産生する点であることを初めて示す。これはＩＧＦ－１ＲがＭ２細胞の極性化および生存において重要な役割を果たすことを示す。当然のことながら、本開示は、Ｍ１細胞とＭ２細胞の双方がＩＧＦ－１Ｒに特異的なアンチセンス核酸（ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮ）を貪欲に取り込むが、ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮが用量依存的にがん患者由来のＭ２細胞におけるＭ１細胞を上回る選択的低減を誘導することを示す。より重要なことには、本開示は、Ｍ２細胞の選択的低減がこれらの患者におけるがんの退縮をもたらすことを示す。したがって、本明細書は、ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮを全身投与することによって、患者におけるＭ２細胞の数を選択的に低減することにより、実行可能で効率的な特定のがんを治療する機構を初めて提供する。
【0009】
加えて、限定はされないが、神経膠腫、星状細胞腫、乳がん、頭頸部扁平上皮細胞がん、乳頭状腎細胞がんタイプＩＩ、肺がん、膵がん、胆嚢がん、直腸がん、古典的ホジキンリンパ腫、卵巣がん、および結腸直腸がんを含む特定タイプのがんを患う患者では、Ｍ２細胞は、腫瘍環境を２型免疫に対して免疫調節性にする。これは、１型免疫を抑制し、免疫療法的方策を退ける。それにより、Ｍ２細胞は治療的な抗腫瘍免疫の誘導を減弱させる。その結果、Ｔｈ１免疫を改善するように努める治療は、これらの患者の中に存在するＭ２細胞の観点で奏効しないかまたは有効性を低下させている。本開示は、Ｍ２亜集団を低減することがまた、がん患者における１型免疫を促進することを初めて示す。本開示は、Ｍ２細胞集団を標的化し、中和することにより、がん患者における１型の保護的な抗腫瘍免疫を生成する能力が回復され、それにより免疫療法的方策を用いる治療が促進されることを示す。
【0010】
さらにより重要なことには、本開示は、ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮの投与によるＭ２細胞の選択的低減が、がんの発症を遅延させるかまたはさらに対象におけるがんを予防するための機構をもたらすことを示す。したがって、Ｍ２細胞を選択的にノックダウンするためにＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮを用いることは、がん患者におけるがんの治療および予防のため、ならびに治療的免疫を増強するための新たな重要な免疫療法的手法を提供する。したがって、本開示は、免疫系についての新たな情報を提供し、種々のがんを有する患者における予後不良に関連する標的化されたＭ２細胞の除去を含む治療的介入を支持する。
【0011】
したがって、本開示は、Ｍ２細胞内でのＩＧＦ－１Ｒの発現を標的化する能力がある核酸を含む医薬組成物を提供する。本開示はまた、これらの細胞内でのＩＧＦ－１Ｒの発現を標的化することによるＭ２細胞の選択的低減のための方法を提供する。本開示は、患者におけるＭ２細胞内でのＩＧＦ－１Ｒの発現を標的化することによるがんを治療するための方法をさらに提供する。重要なことには、本発明の医薬組成物は、それを必要とする対象に全身投与されるときに有効である。医薬組成物の投与の容易性は、治療を促進し、患者コンプライアンスを高める。
【0012】
用語「選択的は、本明細書で用いられるとき、Ｍ２細胞に影響するがＭ１細胞に影響しない効果を指す。あるいは、それはＭ１細胞と比べてより広範囲までＭ２細胞に影響する効果を指してもよい。例えば、Ｍ２細胞の数における選択的低減は、Ｍ１細胞の数に影響しないか、またはＭ１細胞の数における低減と比べてより大きなＭ２細胞の数における低減を引き起こす。
【0013】
用語「ＩＧＦ－１Ｒの発現を標的化すること」または「ＩＧＦ－１Ｒの発現を標的化する」は、本明細書で用いられるとき、ＩＧＦ－１Ｒに結合するように設計された配列を有する核酸を投与することを指す。
【0014】
用語「Ｍ２細胞」は、本明細書で用いられるとき、対象の腫瘍内部に存在するＭ２マクロファージおよび／または対象の末梢において循環するＭ２単球を包含する。
用語「Ｍ１細胞」は、本明細書で用いられるとき、対象の組織内部に存在するＭ１マクロファージおよび／または対象の末梢において循環するＭ１単球を包含する。
用語「Ｍ１細胞」は、本明細書で用いられるとき、対象の組織内部に存在するＭ１マクロファージおよび／または対象の末梢において循環するＭ１単球を包含する。
【0015】
本明細書で用いられるとき、「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」などの用語は、文脈上特に明示されない限り、単数および複数の参照対象を含む。
本明細書で用いられるとき、用語「約」は、数値に先行するとき、１０％の範囲を足した値または引いた値を示す。例えば、「約１００」は９０および１１０を包含する。
本明細書で用いられるとき、用語「約」は、数値に先行するとき、１０％の範囲を足した値または引いた値を示す。例えば、「約１００」は９０および１１０を包含する。
【0016】
一部の実施形態では、本開示は、Ｍ２細胞内でのＩＧＦ－１Ｒの発現を標的化する核酸を有効量で含む医薬組成物を提供し、ここでがんを患う患者に医薬組成物を投与することにより、Ｍ２細胞の低減が引き起こされる。
【0017】
特定の実施形態では、本開示は、Ｍ２細胞内でのＩＧＦ－１Ｒの発現を標的化する能力がある核酸を有効量で含む医薬組成物を提供し、ここでがんを患う患者に医薬組成物を投与することにより、Ｍ２細胞内でのＩＧＦ－１Ｒの発現の下方制御が引き起こされる。他の実施形態では、本開示は、Ｍ２細胞内でのＩＧＦ－１Ｒの発現を標的化する能力がある核酸を有効量で含む医薬組成物を提供し、ここでがんを患う患者に医薬組成物を投与することにより、Ｍ２細胞内でのＩＧＦ－１Ｒ以外の遺伝子の発現の下方制御が引き起こされる。
【0018】
一部の実施形態では、核酸は細胞内でのＩＧＦ－１Ｒ経路下流の遺伝子の発現を下方制御する。特定の態様では、下流遺伝子はヘキソキナーゼ（ＨｅｘＩＩ）である。一部の実施形態では、核酸は細胞内でのハウスキーピング遺伝子の発現を下方制御する。一部の態様では、ハウスキーピング遺伝子はＬ１３である。
【0019】
一部の実施形態では、核酸は天然に存在する核酸である。他の実施形態では、核酸は天然に存在しない核酸である。特定の態様では、核酸は組換え的に作製される。一部の実施形態では、核酸は微生物内で組換え的に作製される。一部の態様では、核酸は細菌内で組換え的に作製される。他の実施形態では、核酸は哺乳類細胞株中で組換え的に作製される。さらに他の実施形態では、核酸は昆虫細胞株中で組換え的に作製される。
【0020】
特定の態様では、核酸は化学的に合成される。特定の実施形態では、核酸は固相有機合成により作製される。一部の態様では、核酸の合成は、フロースルー技術を用いて閉じた化学的カラムリアクターを備えたシンセサイザー内で行われる。一部の実施形態では、固体支持体上での各合成サイクルシーケンスは複数のステップからなり、それらは完全長核酸が得られるまで順次実施される。特定の実施形態では、核酸は液体形態で貯蔵される。他の実施形態では、核酸は貯蔵に先立ち凍結乾燥される。一部の態様では、凍結乾燥核酸は使用前に水に溶解される。他の実施形態では、凍結乾燥核酸は使用前に有機溶媒に溶解される。さらに他の実施形態では、凍結乾燥核酸は医薬組成物に製剤化される。一部の態様では、医薬組成物は液体医薬組成物である。他の態様では、医薬組成物は固体医薬組成物である。
【0021】
一部の実施形態では、核酸はＲＮＡである。他の実施形態では、核酸はＤＮＡである。さらに他の実施形態では、核酸はＲＮＡｉ分子である。さらなる実施形態では、核酸はオリゴヌクレオチドである。
【0022】
特定の実施形態では、核酸はアンチセンスオリゴマーである。一部の態様では、核酸はアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（ＡＳ ＯＤＮ）である。アンチセンスオリゴマーは、ワトソン・クリック塩基対律により標的化されたｍＲＮＡの相補配列に結合することによって、分子レベルで機能する。標的ｍＲＮＡの翻訳は、相補的らせんの間にハイブリダイゼーションが生じるとき、能動的機構および／または受動的機構により阻害される。受動的機構では、ｍＲＮＡと外因性ヌクレオチド配列との間のハイブリダイゼーションは、リボソーム複合体がメッセージを読み取ることを阻止する二本鎖形成をもたらす。能動的機構では、ハイブリダイゼーションがリボヌクレアーゼＨの結合を促進し、ＲＮＡを破壊するが、別の相補的ｍＲＮＡ標的とハイブリダイズするようにＡＳ ＯＤＮを無傷のままにする。一方もしくは双方の機構は、悪性表現型に寄与するかまたはそれを持続させるタンパク質の翻訳を阻害する。治療薬として、それらははるかにより選択的であり、結果として従来薬よりも有効かつ低毒性である。１つ以上のホスホロチオエート修飾の存在は、ヌクレアーゼ耐性を与えることによりオリゴマーを安定化させ、それによりその半減期を延長する。
【0023】
一部の実施形態では、核酸は修飾されたリン酸骨格を含む。特定の態様では、リン酸骨格修飾は、核酸をヌクレアーゼ分解に対してより耐性にする。特定の実施形態では、修飾は固定化核酸修飾である。他の実施形態では、修飾はホスホロチオエート結合である。特定の態様では、核酸は１つ以上のホスホロチオエート結合を含む。特定の実施形態では、ホスホロチオエート結合は、核酸をヌクレアーゼ切断に対してより耐性にする。一部の実施形態では、核酸は部分的にホスホロチオエート結合されてもよい。例えば、核酸の最大約１％、最大約３％、最大約５％、最大約１０％、最大約２０％、最大約３０％、最大約４０％、最大約５０％、最大約６０％、最大約７０％、最大約８０％、最大約９０％、最大約９５％、または最大約９９％がホスホロチオエート結合されてもよい。一部の実施形態では、核酸は完全にホスホロチオエート結合される。他の実施形態では、ホスホロチオエート結合はホスホジエステル結合と交替してもよい。特定の実施形態では、核酸は少なくとも１つの末端ホスホロチオエート一リン酸を有する。
【0024】
一部の実施形態では、核酸は１つ以上のＣｐＧモチーフを含む。他の実施形態では、核酸はＣｐＧモチーフを含まない。特定の態様では、１つ以上のＣｐＧモチーフがメチル化される。他の態様では、１つ以上のＣｐＧモチーフがメチル化されない。特定の実施形態では、核酸が対象に投与されるとき、１つ以上の非メチル化ＣｐＧモチーフが自然免疫応答を誘導する。一部の態様では、自然免疫応答は、非メチル化ＣｐＧ含有核酸のＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）への結合によって媒介される。一部の態様では、ＴＬＲはＴＬＲ９である。他の態様では、ＴＬＲの非メチル化ＣｐＧ含有核酸への結合がＴＬＲ９の活性化を引き起こす。特定の態様では、活性化されたＴＬＲ９がＢ細胞上で発現される。他の態様では、活性化されたＴＬＲが形質細胞様樹状細胞上で発現される。特定の態様では、ＴＬＲ９の活性化は、Ｂ細胞によるサイトカインの分泌により測定されてもよい。一態様では、サイトカインはＩＬ－６である。別の態様では、サイトカインはＩＬ－１０である。他の態様では、ＴＬＲ９の活性化は、形質細胞様樹状細胞によるサイトカインの分泌により測定されてもよい。一態様では、サイトカインはＩＦＮαである。別の態様では、サイトカインはＩＦＮβである。さらに別の態様では、サイトカインはＴＮＦαである。
【0025】
特定の実施形態では、核酸は少なくとも１つの末端修飾すなわち「キャップ」を含む。キャップは、５’および／または３’キャップ構造であってもよい。用語「キャップ」または「エンドキャップ」は、（末端リボヌクレオチドに対する）オリゴヌクレオチドのいずれかの末端に化学修飾を含み、かつ５’末端上の最後の２つのヌクレオチドと３’末端上の最後の２つのヌクレオチドとの間の結合における修飾を含む。キャップ構造は、標的配列または細胞機構との分子相互作用を損なうことなく、核酸のエキソヌクレアーゼに対する耐性を高めることがある。かかる修飾は、インビトロまたはインビボでのその増強される効力に基づいて選択されてもよい。キャップは、５’末端（５’キャップ）または３’末端（３’キャップ）に存在し得るかまたは両末端に存在し得る。特定の実施形態では、５’キャップおよび／または３’キャップは、ホスホロチオエート一リン酸、脱塩基残基（部分）、ホスホロチオエート結合、４’－チオヌクレオチド、炭素環式ヌクレオチド、ホスホロジチオエート結合、反転ヌクレオチドもしくは反転脱塩基部分（２’－３’もしくは３’－３’）、ホスホロジチオエート一リン酸、およびメチルホスホン酸部分から独立的に選択される。ホスホロチオエートまたはホスホロジチオエート結合（複数可）は、キャップ構造の一部である場合、一般に５’末端上の２つの末端ヌクレオチドと３’末端上の２つの末端ヌクレオチドとの間に位置づけられる。
【0026】
特定の実施形態では、核酸は細胞内での特異的遺伝子の発現を標的にする。一部の実施形態では、核酸は細胞内での１つ以上の成長因子の発現を標的にする。一部の実施形態では、成長因子はインスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦ－１Ｒ）である。ＩＧＦ－１Ｒは、インスリン受容体と７０％の相同性を共有するチロシンキナーゼ細胞表面受容体である。ＩＧＦ－１Ｒは、そのリガンド（ＩＧＦ－Ｉ、ＩＧＦ－ＩＩおよびインスリン）によって活性化されるとき、増殖、形質転換および細胞生存を含む広範な細胞機能を制御する。ＩＧＦ－１Ｒは、正常な増殖にとっての絶対条件ではないが、悪性組織内で生じることがある足場非依存性条件下での増殖にとって必須である。腫瘍におけるＩＧＦ－ＩＲの役割についてのレビューが、バセルガ（Ｂａｓｅｒｇａ）ら著、「ビタミンおよびホルモン（Ｖｉｔａｍｉｎｓ ａｎｄ Ｈｏｒｍｏｎｅｓ）」、１９９７年、５３、ｐ．６５－９８（その全体が参照により本明細書中に援用される）に提供されている。
【0027】
特定の実施形態では、核酸は、成長因子または成長因子受容体、例えばＩＧＦ－ＩＲなどのＤＮＡまたはＲＮＡに特異的なオリゴヌクレオチドである。
特定の実施形態では、細胞は哺乳類細胞である。他の実施形態では、細胞は、限定はされないが、単球、好中球、好酸球、好塩基球、白血球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、リンパ球、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、肥満細胞、およびマクロファージを含む、免疫系の細胞である。
特定の実施形態では、細胞は哺乳類細胞である。他の実施形態では、細胞は、限定はされないが、単球、好中球、好酸球、好塩基球、白血球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、リンパ球、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、肥満細胞、およびマクロファージを含む、免疫系の細胞である。
【0028】
特定の実施形態では、細胞はマクロファージである。特定の態様では、マクロファージはＭ２マクロファージである。特定の態様では、Ｍ２マクロファージは、限定はされないが、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ２３、ＣＤ６４、ＣＤ６８、ＣＤ１６３、ＣＤ２０４、ＣＤ２０６、および／または一般に当該技術分野で公知の他のＭ２マクロファージマーカを含む、１つ以上の細胞表面マーカを発現する。
【0029】
他の実施形態では、細胞は単球である。特定の態様では、単球はＭ２単球である。特定の態様では、Ｍ２単球は、限定はされないが、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ２３、ＣＤ６４、ＣＤ６８、ＣＤ１６３、ＣＤ２０４、ＣＤ２０６、および／または一般に当該技術分野で公知の他のＭ２単球マーカを含む、１つ以上の細胞表面マーカを発現する。
【0030】
特定の実施形態では、核酸は、任意の細胞内でのＩＧＦ－１Ｒの発現を下方制御する。他の実施形態では、核酸は、Ｍ２細胞内でのＩＧＦ－１Ｒの発現を下方制御する。特定の実施形態では、Ｍ２細胞内でのＩＧＦ－１Ｒの発現は、核酸で処理されていないＭ２細胞と比べて、少なくとも約１％、少なくとも約２％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％下方制御される。Ｍ２細胞内でのＩＧＦ－１Ｒの発現は、定量ＲＴ－ＰＣＲにより測定されてもよい。
【0031】
特定の態様では、Ｍ２細胞内でのＩＧＦ－１Ｒの発現は、核酸の対象への投与後、約１０分、約２０分、約３０分、約４０分、約５０分、約１時間、約２時間、約３時間、約６時間、約１２時間、約２４時間、約４８時間、または約７２時間以内に下方制御される。
【0032】
一部の実施形態では、Ｍ２細胞内でのＩＧＦ－１Ｒの発現は、対象において、１用量の核酸の投与を受けてから、少なくとも約１日間、少なくとも約２日間、少なくとも約３日間、少なくとも約４日間、少なくとも約５日間、少なくとも約６日間、少なくとも約７日間、少なくとも約８日間、少なくとも約９日間、少なくとも約１０日間、少なくとも約１１日間、少なくとも約１２日間、少なくとも約１３日間、少なくとも約１４日間、少なくとも約３週間、少なくとも約４週間、少なくとも約５週間、または少なくとも約６週間、下方制御が維持される。
【0033】
一部の態様では、Ｍ２細胞内でのＩＧＦ－１Ｒの発現の下方制御は、対象においてＭ１細胞と比べてのＭ２細胞の選択的低減を引き起こす。特定の態様では、Ｍ２細胞内でのＩＧＦ－１Ｒの発現を標的化することにより、対象においてＭ１細胞と比べてのＭ２細胞の選択的低減が引き起こされる。
【0034】
特定の実施形態では、対象におけるＭ２細胞は、Ｍ２細胞内でのＩＧＦ－１Ｒの発現を標的化する核酸での治療を必要とする対象、例えば治療前の対象と比べて、少なくとも約２％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％低減される。一部の実施形態では、対象におけるＭ２細胞は、少なくとも約４０％低減される。他の態様では、Ｍ２細胞集団は除去される。例えば、本発明の医薬組成物の投与後、Ｍ２細胞集団は、医薬組成物の投与前の集団の約１％、約２％、約５％、または約１０％であってもよい。対象におけるＭ２細胞は、ＦＡＣＳを用いて測定されてもよい。特定の態様では、治療後、Ｍ２細胞は除去される、すなわちＦＡＣＳにより検出不能である。
【0035】
特定の態様では、Ｍ２細胞の低減は、核酸の患者への投与後、約１０分以内、約２０分以内、約３０分以内、約４０分以内、約５０分以内、約１時間以内、約２時間以内、約３時間以内、約６時間以内、約１２時間以内、約２４時間以内、約４８時間後、または約７２時間後、認められる。
【0036】
一部の実施形態では、対象におけるＭ２細胞の低減は、１用量の核酸の投与を受けてから、少なくとも約１日間、少なくとも約２日間、少なくとも約３日間、少なくとも約４日間、少なくとも約５日間、少なくとも約６日間、少なくとも約７日間、少なくとも約８日間、少なくとも約９日間、少なくとも約１０日間、少なくとも約１１日間、少なくとも約１２日間、少なくとも約１３日間、少なくとも約１４日間、少なくとも約３週間、少なくとも約４週間、少なくとも約５週間、または少なくとも約６週間持続される。
【0037】
一部の実施形態では、ＩＧＦ－１Ｒの発現を標的化することにより、未分化単球がＭ２細胞に極性化されることが阻止される。他の実施形態では、Ｍ２細胞内でのＩＧＦ－１Ｒの発現を標的化することは、Ｍ２細胞がそのＭ２表現型および機能特性を失うか、または細胞死を経る原因になる。特定の実施形態では、細胞死は壊死である。他の実施形態では、細胞死はアポトーシスである。アポトーシスは、本発明の目的において、プログラム細胞死と規定され、限定はされないが原発性腫瘍および転移性腫瘍の退縮を含む。アポトーシスは、無数の生理学的過程および病理学的過程において重要な役割を果たす広範な現象であるプログラム細胞死である。それに対して、壊死は、種々の有害な条件および有毒物質に対する細胞の応答である偶発的な細胞死である。さらに他の実施形態では、Ｍ２細胞内でのＩＧＦ－１Ｒの発現を標的化することは、Ｍ２細胞が細胞周期停止を経る原因になる。
【0038】
特定の実施形態では、本発明の核酸は、ＩＧＦ－１Ｒに特異的なアンチセンスデオキシヌクレオチド（ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮ）である。ＩＧＦ－１Ｒの完全長コード配列は配列番号１９で示される。特定の態様では、核酸は、ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮに対して少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９８％、または１００％の同一性を有してもよい。百分率同一性は、デフォルトパラメータを用いるｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｃｌｕｓｔａｌｗ２／で利用可能なアライメントプログラムＣｌｕｓｔａｌＷ２を用いて算出され得る。
【0039】
特定の実施形態では、核酸は、ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかを含む、ＩＧＦ－１Ｒシグナル配列に相補的なヌクレオチド配列を含む。ＩＧＦ－１Ｒのシグナル配列は３０アミノ酸配列である。他の実施形態では、核酸は、ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかを含む、ＩＧＦ－１Ｒシグナル配列の一部に相補的なヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、核酸は、ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかを含む、ＩＧＦ－１Ｒのコドン１～３０９に相補的なヌクレオチド配列を含む。他の実施形態では、核酸は、ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかを含む、ＩＧＦ－１Ｒのコドン１～３０９の一部に相補的なヌクレオチド配列を含む。
【0040】
特定の実施形態では、核酸は、少なくとも約５ヌクレオチド長、少なくとも約１０ヌクレオチド長、少なくとも約１５ヌクレオチド長、少なくとも約２０ヌクレオチド長、少なくとも約２５ヌクレオチド長、少なくとも約３０ヌクレオチド長、少なくとも約３５ヌクレオチド長、少なくとも約４０ヌクレオチド長、少なくとも約４５ヌクレオチド長、または少なくとも約５０ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、核酸は約１５ヌクレオチド長～約２２ヌクレオチド長である。特定の態様では、核酸は約１８ヌクレオチド長である。
【0041】
特定の実施形態では、核酸は、１８℃で二次構造を形成するが、約３７℃で二次構造を形成しない。他の実施形態では、核酸は、約１８℃または約３７℃で二次構造を形成しない。さらに他の実施形態では、核酸は、任意の温度で二次構造を形成しない。他の実施形態では、核酸は、３７℃で二次構造を形成しない。特定の実施形態では、二次構造はヘアピンループ構造である。
【0042】
一部の態様では、核酸は、配列番号１～１４のいずれか、またはその断片を含む。特定の実施形態では、核酸は、配列番号１～１４のいずれか、またはその断片に対して、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９８％、または１００％の同一性を有してもよい。
【0043】
一部の態様では、核酸は、配列番号１～１４のいずれかからなる。特定の態様では、核酸は配列番号１である。配列番号１はノーベル（ＮＯＢＥＬ）と称される。ノーベル（ＮＯＢＥＬ）は、ホスホロチオエート骨格を有する１８－ｍｅｒオリゴデオキシヌクレオチドであり、ＩＧＦ－１Ｒ遺伝子におけるコドン２～７に相補的な配列である。したがって、ノーベル（ＮＯＢＥＬ）はＩＧＦ－１Ｒに特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮ）である。５’末端でのＩＧＦ－１Ｒ遺伝子の相補配列として誘導されるノーベル（ＮＯＢＥＬ）配列は、
５’－ＴＣＣＴＣＣＧＧＡＧＣＣＡＧＡＣＴＴ－３’
である。
５’－ＴＣＣＴＣＣＧＧＡＧＣＣＡＧＡＣＴＴ－３’
である。
【0044】
ノーベル（ＮＯＢＥＬ）は、安定な有効期間を有し、そのホスホロチオエート骨格に起因し、ヌクレアーゼ分解に対して耐性がある。ノーベル（ＮＯＢＥＬ）の投与は、当業者に公知のオリゴデオキシヌクレオチドの導入に関連した標準的方法のいずれかにおいて提供され得る。有利にも、ノーベル（ＮＯＢＥＬ）を含む本明細書で開示されるＡＳ ＯＤＮは、毒性をほとんどかまたは全く伴わずに投与され得る。マウス試験（尾静脈に４０μｇ）に基づいて（調整された）約２ｇ／ｋｇのレベルであっても、毒性上の課題を示さなかった。ノーベル（ＮＯＢＥＬ）は、当業者に公知の通常の手順に従って作製され得る。
【0045】
本明細書で開示される医薬組成物は、薬学的に許容できる担体または希釈剤に加えて核酸を含有し、例えば組成物は生理食塩水（０．９％塩化ナトリウム）を含有してもよい。
ヒト対象における核酸の用量は、約０．０２５ｇ／ｋｇ、約０．０５ｇ／ｋｇ、約０．１ｇ／ｋｇ、約０．１５ｇ／ｋｇ、または約０．２ｇ／ｋｇであってもよい。特定の態様では、核酸は、凍結乾燥粉末として供給され、投与前に再懸濁される。再懸濁されるとき、核酸の濃度は、約５０ｍｇ／ｍｌ、約１００ｍｇ／ｍｌ、約２００ｍｇ／ｍｌ、約５００ｍｇ／ｍｌ、約１０００ｍｇ／ｍｌ、またはそれらの量の間の範囲であってもよい。
ヒト対象における核酸の用量は、約０．０２５ｇ／ｋｇ、約０．０５ｇ／ｋｇ、約０．１ｇ／ｋｇ、約０．１５ｇ／ｋｇ、または約０．２ｇ／ｋｇであってもよい。特定の態様では、核酸は、凍結乾燥粉末として供給され、投与前に再懸濁される。再懸濁されるとき、核酸の濃度は、約５０ｍｇ／ｍｌ、約１００ｍｇ／ｍｌ、約２００ｍｇ／ｍｌ、約５００ｍｇ／ｍｌ、約１０００ｍｇ／ｍｌ、またはそれらの量の間の範囲であってもよい。
【0046】
特定の実施形態では、対象は動物である。他の態様では、対象はヒトである。一部の実施形態では、対象は疾患を患う。特定の態様では、疾患はがんである。特定の実施形態では、がんは、限定はされないが、乳がん、星状細胞腫、頭頸部扁平上皮細胞がん、乳頭状腎細胞がんタイプＩＩ、肺がん、膵がん、胆嚢がん、直腸がん、神経膠腫、古典的ホジキンリンパ腫、卵巣がん、および結腸直腸がんを含む。特定の態様では、がんは神経膠腫である。特定の態様では、患者は悪性神経膠腫を有する。特定の態様では、悪性神経膠腫は再発性悪性神経膠腫である。
【0047】
特定の実施形態では、核酸を用いる治療用の候補である対象は、その血液中の循環単球のレベルを測定することによって同定される。一部の実施形態では、候補は、健常対象と比べて増加した数の循環単球を有する。本明細書で用いられるとき、用語「健常対象」は、がんまたは任意の他の疾患を患っておらず、また本発明の核酸を用いる治療を必要としない対象を指す。一部の態様では、循環単球は、限定はされないが、ＣＤ１１ｂ＋、ＣＤ１４＋、ＣＤ１５＋、ＣＤ２３＋、ＣＤ６４＋、ＣＤ６８＋、ＣＤ１６３＋、ＣＤ２０４＋、またはＣＤ２０６＋単球を含む。特定の態様では、１つ以上の循環単球のレベルは、健常対象と比べて、少なくとも約１．３倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約１．８倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約９０倍、または少なくとも約１００倍上昇する。特定の実施形態では、１つ以上の循環単球のレベルは、健常対象と比べて約２倍上昇する。対象における循環単球のレベルは、蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）を用いて測定されてもよい。
【0048】
特定の態様では、対象は、健常対象と比べて増加した数の循環ＣＤ１４＋単球を有する。特定の態様では、循環ＣＤ１４＋単球のレベルは、健常対象と比べて、少なくとも約１．３倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約１．８倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約９０倍、または少なくとも約１００倍上昇する。特定の実施形態では、循環ＣＤ１４＋単球のレベルは健常対象と比べて約２倍上昇する。
【0049】
特定の実施形態では、循環ＣＤ１４＋単球は、健常対象と比べて上昇したレベルのＣＤ１６３を有する。一部の態様では、循環ＣＤ１４＋単球に対するＣＤ１６３のレベルは、健常対象と比べて、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約９０倍、または少なくとも約１００倍上昇する。特定の実施形態では、循環ＣＤ１４＋単球に対するＣＤ１６３のレベルは、健常対象と比べて約２倍上昇する。
【0050】
他の実施形態では、核酸を用いる治療用の候補である対象は、未分化単球をＭ２細胞へと極性化する血清を有する。特定の態様では、対象の血清と未分化単球とのインキュベーションにより、限定はされないが、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ２３、ＣＤ６４、ＣＤ６８、ＣＤ１６３、ＣＤ２０４、および／またはＣＤ２０６を含む、単球上の１つ以上の細胞表面マーカの発現が誘導される。他の態様では、対象の血清と未分化単球とのインキュベーションにより、単球上の１つ以上の細胞表面マーカの発現が、対象の血清とともにインキュベートされない単球と比べて増加する。特定の態様では、細胞表面マーカは、限定はされないが、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ２３、ＣＤ６４、ＣＤ６８、ＣＤ１６３、ＣＤ２０４、および／またはＣＤ２０６を含む。一部の態様では、１つ以上の表面マーカのレベルは、対象の血清とともにインキュベートされない未分化単球と比べて、少なくとも約１．３倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約１．８倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約９０倍、または少なくとも約１００倍上昇する。特定の実施形態では、１つ以上の表面マーカのレベルは、対象の血清とともにインキュベートされない未分化単球と比べて約２倍上昇する。対象の血清によって極性化される単球は、ＦＡＣＳを用いて測定されてもよい。
【0051】
さらに他の実施形態では、核酸を用いる治療用の候補である対象は、対象に対して腫瘍生検を実施することによって同定される。一部の実施形態では、対象由来の腫瘍は、単球の存在についてアッセイされる。特定の態様では、単球は、限定はされないが、ＣＤ１１ｂ＋、ＣＤ１４＋、ＣＤ１５＋、ＣＤ２３＋、ＣＤ６４＋、ＣＤ６８＋、ＣＤ１６３＋、ＣＤ２０４＋、またはＣＤ２０６＋単球を含む。腫瘍における単球の存在は、免疫組織化学を用いてアッセイされてもよい。
【0052】
特定の実施形態では、核酸を用いる治療用の候補である対象は、対象の全末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の約１０％超、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、または約５０％のＣＤ１６３＋Ｍ２細胞を示す。特定の態様では、対象は、対象の全ＰＢＭＣの約２０％を超えるＣＤ１６３＋Ｍ２細胞を示す。
【0053】
特定の実施形態では、核酸を用いる治療用の候補である対象は、ＷＨＯグレードＩＩ、ＷＨＯグレードＩＩＩ、またはＷＨＯグレードＩＶ腫瘍を患う。特定の態様では、対象は、ＷＨＯグレードＩＩ腫瘍を患う。一部の態様では、腫瘍は星状細胞腫である。特定の実施形態では、腫瘍は、グレードＩＩ星状細胞腫、ＡＩＩＩ（ＩＤＨ１ Ｒ１３２Ｈ突然変異体グレードＩＩＩ星状細胞腫）、ＡＩＩＩ－Ｇ（多形神経膠芽腫・星状細胞腫の特徴を有するＩＤＨ１野生型グレードＩＩＩ）、またはグレードＩＶ星状細胞腫から選択される。一部の態様では、グレードＩＶ星状細胞腫は、多形神経膠芽腫である。
【0054】
一部の実施形態では、核酸を用いる治療用の候補である対象は、特異的サイトカインセットのレベルを測定することによって同定される。一部の実施形態では、対象は、健常対象と比べて上昇したレベルのこれらのサイトカインを有する。他の実施形態では、対象は、腫瘍内に存在する特異的マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を検出することによって同定される。特定の実施形態では、対象は、健常対象と比べて上昇したレベルのこれらのｍｉＲＮＡを有する。
【0055】
一部の実施形態では、核酸は患者におけるがんの退縮を誘導する。他の実施形態では、核酸は患者におけるがんの縮小を誘導する。さらに他の実施形態では、核酸は患者におけるがんの除去を誘導する。
【0056】
一部の実施形態では、核酸は患者における神経膠腫腫瘍の退縮を誘導する。他の実施形態では、核酸は患者における神経膠腫腫瘍の縮小を誘導する。さらに他の実施形態では、核酸は患者における神経膠腫腫瘍の除去を誘導する。
【0057】
特定の実施形態では、核酸は医薬組成物に製剤化される。一部の態様では、医薬組成物は液体形態で製剤化される。他の態様では、医薬組成物は固体形態で製剤化される。特定の態様では、医薬組成物は経口投与用に製剤化される。特定の実施形態では、医薬組成物はカプセル剤の形態である。他の実施形態では、医薬組成物は錠剤の形態である。一部の態様では、錠剤は急速放出錠である。他の態様では、錠剤は徐放錠である。他の態様では、医薬組成物は腹腔内投与用に製剤化される。さらに他の態様では、医薬組成物は静脈内投与用に製剤化される。さらなる態様では、医薬組成物は筋肉内投与用に製剤化される。
【0058】
特定の実施形態では、医薬組成物は拡散チャンバ内に導入され、拡散チャンバは、治療的に有効な期間、対象の腹直筋鞘に外科的に移植される（例えば、米国特許第６，５４１，０３６号明細書を参照（その全体が参照により本明細書中に援用される））。
【0059】
考察の通り、本開示は、Ｍ２細胞（Ｍ１細胞でない）がＩＧＦ－１Ｒに特異的なアンチセンス核酸（ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮ）を貪欲に取り込み、ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮが用量依存的にがん患者由来のＭ２細胞におけるＭ１細胞を上回る選択的低減を誘導することを示す。より重要なことには、本開示は、Ｍ２細胞の選択的低減がこれらの患者におけるがんの退縮をもたらすことを示す。
【0060】
したがって、特定の実施形態では、がんを患う患者におけるＭ２細胞の選択的除去のための方法であって、患者に有効量の医薬組成物を投与するステップを含む、方法が提供される。
【0061】
他の実施形態では、Ｍ２細胞内でのＩＧＦ－１Ｒの発現を標的化することによってがんを治療する方法であって、がんを患う患者に有効量の医薬組成物を投与するステップを含む、方法が提供される。
【0062】
特定の実施形態では、がんを治療する方法は、併用療法をさらに含む。一部の実施形態では、併用療法は放射線療法を含む。他の実施形態では、併用療法は化学療法を含む。特定の態様では、放射線療法または化学療法は、患者に、医薬組成物の投与後に施される。特定の実施形態では、放射線療法または化学療法は、患者に、医薬組成物の投与から、少なくとも約１時間後、少なくとも約２時間後、少なくとも約３時間後、少なくとも約６時間後、少なくとも約１２時間後、少なくとも約２４時間後、少なくとも約４８時間後、少なくとも約７２時間後、少なくとも約４日後、少なくとも約５日後、少なくとも約６日後、少なくとも約７日後、少なくとも約８日後、少なくとも約９日後、少なくとも約１０日後、少なくとも約１１日後、少なくとも約１２日後、少なくとも約１３日後、少なくとも約１４日後、少なくとも約３週間後、少なくとも約４週間後、少なくとも約５週間後、または少なくとも約６週間後、施される。
【0063】
特定の態様では、医薬組成物は、放射線療法または化学療法の実施後、患者に投与される。特定の実施形態では、医薬組成物は、放射線療法または化学療法の実施から、少なくとも約１時間後、少なくとも約２時間後、少なくとも約３時間後、少なくとも約６時間後、少なくとも約１２時間後、少なくとも約２４時間後、少なくとも約４８時間後、少なくとも約７２時間後、少なくとも約４日後、少なくとも約５日後、少なくとも約６日後、少なくとも約７日後、少なくとも約８日後、少なくとも約９日後、少なくとも約１０日後、少なくとも約１１日後、少なくとも約１２日後、少なくとも約１３日後、少なくとも約１４日後、少なくとも約３週間後、少なくとも約４週間後、少なくとも約５週間後、または少なくとも約６週間後、患者に投与される。
【0064】
特定の実施形態では、放射線療法は、限定はされないが、内部源放射線療法、外部ビーム放射線療法、および全身放射性同位体放射線療法を含む。特定の態様では、放射線療法は外部ビーム放射線療法である。一部の実施形態では、外部ビーム放射線療法は、限定はされないが、γ線療法、Ｘ線療法、強度変調放射線療法（ＩＭＲＴ）、および画像誘導放射線療法（ＩＧＲＴ）を含む。特定の実施形態では、外部ビーム放射線療法はγ線療法である。
【0065】
特定の実施形態では、ＡＳ ＯＤＮは、手術前、例えば腫瘍量を低減するための手術前に投与されてもよい。例えば、ＡＳ ＯＤＮは、手術前２４時間以内、３６時間以内、４８時間以内または７２時間以内に投与されてもよい。特定の態様では、医薬組成物は、手術前の約４８～約７２時間に投与されてもよい。典型的には、かかる環境下で、投与は静脈内ボーラスを介する。
【0066】
考察の通り、限定はされないが、神経膠腫、星状細胞腫、乳がん、頭頸部扁平上皮細胞がん、乳頭状腎細胞がんタイプＩＩ、肺がん、膵がん、胆嚢がん、直腸がん、古典的ホジキンリンパ腫、卵巣がん、および結腸直腸がんを含む特定のがんを患う患者では、Ｍ２細胞は、腫瘍環境を２型免疫に対して免疫調節性にし、１型免疫を抑制する。それにより、Ｍ２細胞は治療的な抗腫瘍免疫の誘導を減弱させる。例えば、下の表１は、少なくとも一部には神経膠腫内のＭ２細胞によって引き起こされ得る、神経膠腫に起因した考えられる免疫調節をまとめる。
【0067】
【表1】
本発明の核酸を用いるかかるがん患者の治療の場合、Ｍ２細胞を除去または修飾することになり、それが腫瘍成長に対する直接的な阻害結果を有するとともに、免疫応答を促進することになる。さらに、特定の実施形態では、免疫を促進するため、核酸とワクチン接種を組み合わせてかかる患者を治療することが優先事項になる。したがって、特定の実施形態では、Ｍ２細胞を選択的に標的化するため、核酸が単独でまたはさらなる薬剤と組み合わせて提供されるような治療方法を提供することは有利である。これらの細胞の除去を通じて、腫瘍の発生および促進が軽減され、低減され、さらに免疫調節因子が修飾される。
【0068】
したがって、特定の実施形態では、がんを患う患者におけるＭ２細胞内でのＩＧＦ－１Ｒの発現を標的化することにより免疫応答を増強するための方法であって、有効量の医薬組成物を、がんを患う患者に投与するステップを含む、方法が提供される。
【0069】
併用療法
Ｍ２細胞における低減は、本明細書中でワクチン接種療法と称される抗腫瘍免疫応答の刺激に従って達成される場合がある。特定の実施形態では、ワクチン接種療法は、インビトロまたは生体外で培養された腫瘍細胞を、ある期間、例えば３～４８時間など、プロアポトーシス剤を添加した培地中に置くステップと、プロアポトーシス剤の任意の痕跡を除去するため、腫瘍細胞を緩衝液で洗浄するステップと、引き続き細胞を拡散チャンバに移す（次に対象に移植する）ステップと、を含む（例えば米国特許第６，５４１，０３６号明細書を参照（その全体が参照により本明細書中に援用される））。特定の実施形態では、拡散チャンバは、退縮が本発明の医薬組成物によって誘導される同じタイプの腫瘍に由来する腫瘍細胞を有する。他の実施形態では、拡散チャンバ内に置かれた腫瘍細胞は、退縮が誘導される腫瘍と異なるタイプである。
Ｍ２細胞における低減は、本明細書中でワクチン接種療法と称される抗腫瘍免疫応答の刺激に従って達成される場合がある。特定の実施形態では、ワクチン接種療法は、インビトロまたは生体外で培養された腫瘍細胞を、ある期間、例えば３～４８時間など、プロアポトーシス剤を添加した培地中に置くステップと、プロアポトーシス剤の任意の痕跡を除去するため、腫瘍細胞を緩衝液で洗浄するステップと、引き続き細胞を拡散チャンバに移す（次に対象に移植する）ステップと、を含む（例えば米国特許第６，５４１，０３６号明細書を参照（その全体が参照により本明細書中に援用される））。特定の実施形態では、拡散チャンバは、退縮が本発明の医薬組成物によって誘導される同じタイプの腫瘍に由来する腫瘍細胞を有する。他の実施形態では、拡散チャンバ内に置かれた腫瘍細胞は、退縮が誘導される腫瘍と異なるタイプである。
【0070】
特定の実施形態では、拡散チャンバは、本発明の医薬組成物を対象に全身投与する前に対象に移植される。他の実施形態では、拡散チャンバは、医薬組成物を全身投与した後に対象に移植される。さらに他の実施形態では、対象に移植された拡散チャンバはまた、医薬組成物を有する。一部の態様では、医薬組成物および自家腫瘍細胞（上記のようにインビトロまたは生体外で処理されたもの）を有する拡散チャンバは、対象に移植される。他の態様では、医薬組成物および対象由来の腫瘍細胞（上記のようにインビトロまたは生体外で処理されたもの）を有する拡散チャンバは、対象に移植される。特定の実施形態では、拡散チャンバを対象に移植することにより、対象におけるＭ２細胞の数が、医薬組成物が単独で投与される対象と比べてさらに低減される。
【0071】
一部の実施形態では、チャンバは対象の腹部に移植される。特定の実施形態では、拡散チャンバは、治療的に有効な期間、対象の腹直筋鞘に外科的に移植される。
一部の態様では、医薬組成物は、ワクチン接種療法の実施後、対象に投与される。特定の態様では、医薬組成物は、医薬組成物の投与から、少なくとも約１時間後、少なくとも約２時間後、少なくとも約３時間後、少なくとも約６時間後、少なくとも約１２時間後、少なくとも約２４時間後、少なくとも約４８時間後、少なくとも約７２時間後、少なくとも約４日後、少なくとも約５日後、少なくとも約６日後、少なくとも約７日後、少なくとも約８日後、少なくとも約９日後、少なくとも約１０日後、少なくとも約１１日後、少なくとも約１２日後、少なくとも約１３日後、少なくとも約１４日後、少なくとも約３週間後、少なくとも約４週間後、少なくとも約５週間後、または少なくとも約６週間後、対象に投与される。特定の実施形態では、ワクチン接種療法は、ワクチン接種療法の実施から少なくとも約４８時間後、対象に施される。
一部の態様では、医薬組成物は、ワクチン接種療法の実施後、対象に投与される。特定の態様では、医薬組成物は、医薬組成物の投与から、少なくとも約１時間後、少なくとも約２時間後、少なくとも約３時間後、少なくとも約６時間後、少なくとも約１２時間後、少なくとも約２４時間後、少なくとも約４８時間後、少なくとも約７２時間後、少なくとも約４日後、少なくとも約５日後、少なくとも約６日後、少なくとも約７日後、少なくとも約８日後、少なくとも約９日後、少なくとも約１０日後、少なくとも約１１日後、少なくとも約１２日後、少なくとも約１３日後、少なくとも約１４日後、少なくとも約３週間後、少なくとも約４週間後、少なくとも約５週間後、または少なくとも約６週間後、対象に投与される。特定の実施形態では、ワクチン接種療法は、ワクチン接種療法の実施から少なくとも約４８時間後、対象に施される。
【0072】
特定の態様では、ワクチン接種療法は、医薬組成物の投与後、対象に施される。特定の実施形態では、ワクチン接種療法は、医薬組成物の投与から、少なくとも約１時間後、少なくとも約２時間後、少なくとも約３時間後、少なくとも約６時間後、少なくとも約１２時間後、少なくとも約２４時間後、少なくとも約４８時間後、少なくとも約７２時間後、少なくとも約４日後、少なくとも約５日後、少なくとも約６日後、少なくとも約７日後、少なくとも約８日後、少なくとも約９日後、少なくとも約１０日後、少なくとも約１１日後、少なくとも約１２日後、少なくとも約１３日後、少なくとも約１４日後、少なくとも約３週間後、少なくとも約４週間後、少なくとも約５週間後、または少なくとも約６週間後、対象に施される。特定の実施形態では、ワクチン接種療法は、医薬組成物の投与から少なくとも約４８時間後、対象に施される。
【0073】
一部の実施形態では、免疫応答を増強するための方法は、ワクチン接種療法に引き続き、第２の医薬組成物を投与するステップを含む。特定の実施形態では、第２の医薬組成物は、ワクチン接種療法の実施から、少なくとも約１時間後、少なくとも約２時間後、少なくとも約３時間後、少なくとも約６時間後、少なくとも約１２時間後、少なくとも約２４時間後、少なくとも約４８時間後、少なくとも約７２時間後、少なくとも約４日後、少なくとも約５日後、少なくとも約６日後、少なくとも約７日後、少なくとも約８日後、少なくとも約９日後、少なくとも約１０日後、少なくとも約１１日後、少なくとも約１２日後、少なくとも約１３日後、少なくとも約１４日後、少なくとも約３週間後、少なくとも約４週間後、少なくとも約５週間後、または少なくとも約６週間後、対象に投与される。
【0074】
他の実施形態では、ワクチン接種療法は、第２の医薬組成物の投与後、対象に施される。特定の実施形態では、ワクチン接種療法は、第２の医薬組成物の投与から、少なくとも約１時間後、少なくとも約２時間後、少なくとも約３時間後、少なくとも約６時間後、少なくとも約１２時間後、少なくとも約２４時間後、少なくとも約４８時間後、少なくとも約７２時間後、少なくとも約４日後、少なくとも約５日後、少なくとも約６日後、少なくとも約７日後、少なくとも約８日後、少なくとも約９日後、少なくとも約１０日後、少なくとも約１１日後、少なくとも約１２日後、少なくとも約１３日後、少なくとも約１４日後、少なくとも約３週間後、少なくとも約４週間後、少なくとも約５週間後、または少なくとも約６週間後、対象に施される。
【0075】
特定の実施形態では、医薬組成物および第２の医薬組成物は同じである。他の実施形態では、医薬組成物および第２の医薬組成物は異なる。
典型的には、腫瘍細胞は移植前に照射される、例えば細胞は、約１Ｇｙ、約２Ｇｙ、約４Ｇｙ、約５Ｇｙ、約６Ｇｙ、約１０Ｇｙ、もしくは最大１５Ｇｙの量のγ線照射で治療されてもよい。特定の実施形態では、細胞は、少なくとも１回、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、または少なくとも５回照射されてもよい。
典型的には、腫瘍細胞は移植前に照射される、例えば細胞は、約１Ｇｙ、約２Ｇｙ、約４Ｇｙ、約５Ｇｙ、約６Ｇｙ、約１０Ｇｙ、もしくは最大１５Ｇｙの量のγ線照射で治療されてもよい。特定の実施形態では、細胞は、少なくとも１回、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、または少なくとも５回照射されてもよい。
【0076】
特定の実施形態では、Ｍ２細胞内でのＩＧＦ－１Ｒの発現を標的化することにより対象におけるがんを予防するかまたは遅延させるための方法であって、対象に有効量の医薬組成物を投与するステップを含む、方法が提供される。一部の実施形態では、対象は動物である。他の実施形態では、対象はヒトである。特定の態様では、ヒトは、がんのリスクを増加させる１つ以上の発癌物質に継続的に曝露されるという理由で、がんに罹りやすい。特定の態様では、これらの発癌物質として、限定はされないが、タバコ煙、タバコ、およびアスベストが挙げられる。他の態様では、ヒトは遺伝的にがんに罹りやすい。
【0077】
特定の実施形態では、Ｍ２細胞内でのＩＧＦ－１Ｒの発現を標的化することにより、対象における、限定はされないが、アルツハイマー病、炎症性腸疾患、２型糖尿病におけるインスリン抵抗性、および乾癬を含む疾患を治療するか、予防するか、または遅延させるための方法であって、対象に有効量の医薬組成物を投与するステップを含む、方法が提供される。
【0078】
（実施例）
実施例１：多形神経膠芽腫標本におけるＩＧＦ－１Ｒについての免疫組織化学
元の倍率は２００×（パネルＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）、４００×（パネルＥ）である。多形神経膠芽腫におけるＩＧＦ－１Ｒの発現との関連を評価するため、１８の継続的な神経膠芽腫症例を抗ＩＧＦ－１Ｒα（サンタクルーズ・バイオテクノロジー（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ））、サンタクルーズ、カリフォルニア州）で染色した。ＩＧＦ－１Ｒαについての免疫組織化学的分析を、通常のホルマリン固定パラフィン包埋切片に対して実施した（図５）。ターゲットリトリーバル（Ｔａｒｇｅｔ Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ）溶液（＃１６９９、ダコ・コーポレーション（Ｄａｋｏ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、カーピンテリア、カリフォルニア州）で強化された切片の蒸気熱で誘導したエピトープの回収に引き続き、自動化免疫染色（Ｄａｋｏ ａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒ、モデル＃ＬＶ－１、ダコ・コーポレーション（Ｄａｋｏ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））またはＩＧＦ－１Ｒα（サンタクルーズ・バイオテクノロジー（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、サンタクルーズ、カリフォルニア州）を、１：５００の希釈率で実施した。検出は、ウサギ二次抗体ＭＡＣＨ３ラビットＨＲＰ（ＭＡＣＨ３ Ｒａｂｂｉｔ ＨＲＰ）キット、バイオケア・メディカル（Ｂｉｏｃａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ））およびＡＢ溶液（色素原溶液中の３，３’－ジアミノベンジジン、ダコ・コーポレーション（Ｄａｋｏ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））を用いて行った。すべての腫瘍がＩＧＦ－１Ｒの免疫反応性を示した。
実施例１：多形神経膠芽腫標本におけるＩＧＦ－１Ｒについての免疫組織化学
元の倍率は２００×（パネルＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）、４００×（パネルＥ）である。多形神経膠芽腫におけるＩＧＦ－１Ｒの発現との関連を評価するため、１８の継続的な神経膠芽腫症例を抗ＩＧＦ－１Ｒα（サンタクルーズ・バイオテクノロジー（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ））、サンタクルーズ、カリフォルニア州）で染色した。ＩＧＦ－１Ｒαについての免疫組織化学的分析を、通常のホルマリン固定パラフィン包埋切片に対して実施した（図５）。ターゲットリトリーバル（Ｔａｒｇｅｔ Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ）溶液（＃１６９９、ダコ・コーポレーション（Ｄａｋｏ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、カーピンテリア、カリフォルニア州）で強化された切片の蒸気熱で誘導したエピトープの回収に引き続き、自動化免疫染色（Ｄａｋｏ ａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒ、モデル＃ＬＶ－１、ダコ・コーポレーション（Ｄａｋｏ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））またはＩＧＦ－１Ｒα（サンタクルーズ・バイオテクノロジー（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、サンタクルーズ、カリフォルニア州）を、１：５００の希釈率で実施した。検出は、ウサギ二次抗体ＭＡＣＨ３ラビットＨＲＰ（ＭＡＣＨ３ Ｒａｂｂｉｔ ＨＲＰ）キット、バイオケア・メディカル（Ｂｉｏｃａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ））およびＡＢ溶液（色素原溶液中の３，３’－ジアミノベンジジン、ダコ・コーポレーション（Ｄａｋｏ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））を用いて行った。すべての腫瘍がＩＧＦ－１Ｒの免疫反応性を示した。
【0079】
実施例２：ノーベル（ＮＯＢＥＬ）の原薬、製剤および安定性
上記の通り、ノーベル（ＮＯＢＥＬ）は、ホスホロチオエート骨格を有する１８－ｍｅｒオリゴデオキシヌクレオチドであり、開始メチオニンコドンから下流の６つのヌクレオチドで始まる、インスリン様成長因子１型受容体に特異的なアンチセンス（ＩＧＦ－１Ｒ
ＡＳ ＯＤＮ）に相当する。遊離酸における分子量は５７０８．７１ダルトンである。ナトリウム塩における分子量は６０８２．４０ダルトンである。５’末端でのＩＧＦ－１Ｒ遺伝子の相補配列として誘導されたノーベル（ＮＯＢＥＬ）の配列は、５’－ＴＣＣＴＣＣＧＧＡＧＣＣＡＧＡＣＴＴ－３’である。
上記の通り、ノーベル（ＮＯＢＥＬ）は、ホスホロチオエート骨格を有する１８－ｍｅｒオリゴデオキシヌクレオチドであり、開始メチオニンコドンから下流の６つのヌクレオチドで始まる、インスリン様成長因子１型受容体に特異的なアンチセンス（ＩＧＦ－１Ｒ
ＡＳ ＯＤＮ）に相当する。遊離酸における分子量は５７０８．７１ダルトンである。ナトリウム塩における分子量は６０８２．４０ダルトンである。５’末端でのＩＧＦ－１Ｒ遺伝子の相補配列として誘導されたノーベル（ＮＯＢＥＬ）の配列は、５’－ＴＣＣＴＣＣＧＧＡＧＣＣＡＧＡＣＴＴ－３’である。
【0080】
ノーベル（ＮＯＢＥＬ）は、フロースルー技術を用いての閉じた化学的カラム反応器を備えたシンセサイザー内で、十分に確立された方法論を用いる固相有機合成によって作製される。固体支持体上の各合成サイクルシークエンスは複数のステップからなり、それらは完全長オリゴヌクレオチドが確立されるまで順次実施される。凍結乾燥粉末である原薬は、スクリューキャップを有するＨＤＰＥ容器内にパッケージされ、次に－８０℃で貯蔵するため、５ｍＬのマイラー（Ｍｙｌａｒ）パウチ内部で真空ヒートシールされる。
【0081】
製剤は、１００ｍｇ／ｍＬの溶液が得られるまで生理食塩水に溶解された新しい原薬からなる。得られた溶液は、０．２２μｍの膜フィルターを通して滅菌濾過する。－８０℃での貯蔵前、１ｍＬのアリコートをＵＳＰタイプ１（ＵＳＰ Ｔｙｐｅ １）ガラスバイアル内に満たし、適切なゴム栓とアルミニウムキャップで密封する。この製剤は、滅菌した通常の生理食塩水中で再構成されるとき、２つの独立製剤において９年（最終試験日）にわたり安定であることが判明している（図６）。
【0082】
実施例３：マウスにおける毒性の前臨床的評価
この試験の目的は、試験物質ノーベル（ＮＯＢＥＬ）の、マウスに静脈内注射を介して単回用量として投与するときの毒性を評価することであり、可逆性、持続性、または効果出現の遅れを評価するため、投与後の約４８時間（３日目、中間屠殺）または約１４日間（１５日目、最終屠殺）、動物を観察した。この試験は、優良試験所基準に従い、食品医薬品局によって確立された基準を遵守して実施した。下表に示すように、雄および雌Ｃｒｌ：ＣＤ１（ＩＣＲ）マウスを数群に割り当て、諸用量を投与した。動物に、溶媒／希釈剤［注射用の０．９％塩化ナトリウム、ＵＳＰ（滅菌生理食塩水）］またはノーベル（ＮＯＢＥＬ）（滅菌生理食塩水中、１００ｍｇ／ｍＬとして提供）を１００μＬの容量で静脈内注射を介して尾静脈に１回投与した（表２を参照）。
この試験の目的は、試験物質ノーベル（ＮＯＢＥＬ）の、マウスに静脈内注射を介して単回用量として投与するときの毒性を評価することであり、可逆性、持続性、または効果出現の遅れを評価するため、投与後の約４８時間（３日目、中間屠殺）または約１４日間（１５日目、最終屠殺）、動物を観察した。この試験は、優良試験所基準に従い、食品医薬品局によって確立された基準を遵守して実施した。下表に示すように、雄および雌Ｃｒｌ：ＣＤ１（ＩＣＲ）マウスを数群に割り当て、諸用量を投与した。動物に、溶媒／希釈剤［注射用の０．９％塩化ナトリウム、ＵＳＰ（滅菌生理食塩水）］またはノーベル（ＮＯＢＥＬ）（滅菌生理食塩水中、１００ｍｇ／ｍＬとして提供）を１００μＬの容量で静脈内注射を介して尾静脈に１回投与した（表２を参照）。
【0083】
【表2】
毒性の評価は、死亡率、臨床的観察、体重、摂食量、ならびに臨床および解剖病理学に基づいた。すべての動物が、投与期間の３日目または１５日目のその予定された剖検まで生存した。摂食量における試験物質に関連した臨床的観察または変化は全く生じなかった。体重に対する統計学的に有意な効果は全く認められなかった。しかし、０．０４ｍｇ／マウスを与えた雄において、わずかな体重減少（対照の９３．８％）が投与期間の１５日目までに生じた。この傾向は、これらの雄において投与期間の早くも８日目に認められたが、身体状態または水分補給状態における臨床的変化が全く生じなかったことから、試験物質に関連しても有害でないと考えられた。０．０１ｍｇ／マウスを与えた雄かまたは雌においては、試験物質に関連した体重効果は全く認められなかった。
【0084】
ノーベル（ＮＯＢＥＬ）の投与は、臨床病理学的試験結果に対する効果を有しなかった。中間屠殺動物の中で、０．０１ｍｇ／マウスを与えた雌における肺重量、０．０１もしくは０．０４ｍｇ／マウスを与えた雄における精巣重量、および０．０４ｍｇ／マウスを与えた雄における胸腺重量はより高かった。最終屠殺動物の中で、０．０１もしくは０．０４ｍｇ／マウスを与えた雄における脳重量および０．０４ｍｇ／マウスを与えた雌における肺重量はより高かった。これらの臓器重量変化の中で相関性のある顕微鏡観察結果を有するものは全くなかった。試験物質の依存性は未知であった。ともかく重量差の中で有害と考えられるものは全くなかった。肉眼または顕微鏡観察結果の中で試験物質に関連すると考えられるものは全くなかった。
【0085】
結論として、雄および雌マウスへの単回静脈内ボーラス注射として、０、０．０１、または０．０４ｍｇ／マウスの用量レベルで投与するノーベル（ＮＯＢＥＬ）は、十分な耐容性があり、任意の臨床的観察、摂食量における変化、臨床病理学的変化、または肉眼的もしくは顕微鏡的変化と関連しなかった。体重における試験物質に関連した小さい変化ならびに試験物質との関係が定かでない脳および肺重量における増加は有害と考えられなかった。したがって、有害と全く認められない効果レベルは、０．０４ｍｇ／マウスであると考えられる。
【0086】
実施例４：Ｍ２（ＣＤ１６３＋）マクロファージの選択的ノックダウン
ノーベル（ＮＯＢＥＬ）は、ヒトとマウスの双方においてＣＤ１６３＋細胞を選択的にノックダウンする。悪性神経膠腫、ならびに限定はされないが、星状細胞腫、乳がん、頭頸部扁平上皮細胞がん、乳頭状腎細胞がんタイプＩＩ、肺がん、膵がん、胆嚢がん、直腸がん、古典的ホジキンリンパ腫、卵巣がん、および結腸直腸がんを含む種々の他のがんを有する患者に由来する血清は、単球を、低マイクロモル濃度でノーベル（ＮＯＢＥＬ）を吸収するＣＤ１６３＋表現型に分化させ、この表現型のノックダウンをもたらすことになる。
ノーベル（ＮＯＢＥＬ）は、ヒトとマウスの双方においてＣＤ１６３＋細胞を選択的にノックダウンする。悪性神経膠腫、ならびに限定はされないが、星状細胞腫、乳がん、頭頸部扁平上皮細胞がん、乳頭状腎細胞がんタイプＩＩ、肺がん、膵がん、胆嚢がん、直腸がん、古典的ホジキンリンパ腫、卵巣がん、および結腸直腸がんを含む種々の他のがんを有する患者に由来する血清は、単球を、低マイクロモル濃度でノーベル（ＮＯＢＥＬ）を吸収するＣＤ１６３＋表現型に分化させ、この表現型のノックダウンをもたらすことになる。
【0087】
Ｃ５７Ｂ／６マウスモデルでは、側腹への腫瘍接種から２０日後の腹腔内へのアンチセンス投与が、少なくとも１４日間、腫瘍誘導性のＣＤ１６３細胞のノックダウンをもたらした（図７参照）。ＧＬ２６１細胞は、Ｃ５７ＢＬ／６およびＴｂｅｔ－／－マウスの側腹に移植し、次に約２０日後、動物はＰＢＳまたは４ｍｇのノーベル（ＮＯＢＥＬ）単独のいずれかの全身性の腹腔内注射を受けた（図８）。１型および２型免疫の均衡における効果をＭ２細胞のノックダウンと区別するため、抗腫瘍１型免疫を開始してＧＬ２６１腫瘍を拒絶することのできないＴｂｅｔ－／－マウスが含められた。いずれの場合でも、触知可能な腫瘍の検出直前での単回用量のノーベル（ＮＯＢＥＬ）単独の投与が、かなりの期間、腫瘍の形成を遅延させた。腫瘍を成長させないＣ５７マウスの８０％およびＴｂｅｔノックアウトマウスの５０％で、長期生存もまた促された（図８）。ノーベル（ＮＯＢＥＬ）とＧＬ２６１細胞との混合が、インタクトな免疫系の不在下で腫瘍成長に対する効果をほとんど有することなく（モリン・ブルリュー（Ｍｏｒｉｎ－Ｂｒｕｒｅａｕ）ら著、キャンサー・イムノロジー・イムノセラピー（Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．）、第６４巻：ｐ．４４７－４５７（２０１５年））、Ｔｂｅｔマウスへの移植時でのノーベル（ＮＯＢＥＬ）とＧＬ２６１細胞との混合もまた、腫瘍成長に干渉することがない。ここでの重要な結論は、腫瘍免疫の誘導時でのＧＬ２６１に対するＩＧＦ－Ｒ１ ＡＳ ＯＤＮの効果が、しばらく後の腫瘍成長に対して作用する場合と区別される点である。抗原としての腫瘍と免疫刺激剤としてのノーベル（ＮＯＢＥＬ）との同時投与を必要とする場合がある一方で、抗原に対する応答と独立して全身効果を有する場合がある。Ｍ２細胞やおそらくは腫瘍成長の促進に関与する他の細胞のノックダウンは、レシピエント動物が治療的な１型応答を開始させることができないときであっても腫瘍成長を阻止するのに十分であることは明白である。データは、腫瘍微小環境からのＭ２細胞の減少によって、腫瘍細胞が繁栄できなくなることを示唆する。
【0088】
実施例５：ＩＧＲ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮの神経膠腫患者への投与
現行の試験から、本発明者は、以下の投与スケジュール：０．０２５ｇ／ｋｇ、０．０５ｇ／ｋｇ、０．１ｇ／ｋｇ、０．１５ｇ／ｋｇ、および０．２ｇ／ｋｇにおいて、再発性神経膠腫コホートの神経膠腫における投与に適した用量を決定した。
現行の試験から、本発明者は、以下の投与スケジュール：０．０２５ｇ／ｋｇ、０．０５ｇ／ｋｇ、０．１ｇ／ｋｇ、０．１５ｇ／ｋｇ、および０．２ｇ／ｋｇにおいて、再発性神経膠腫コホートの神経膠腫における投与に適した用量を決定した。
【0089】
上記用量の１つを受ける患者は、再発性神経膠腫を有し、かつ手術の４８～７２時間前に漸増するＩＧＦ－１Ｒの手術前静脈内ボーラス注入を受ける患者である。２回目のボーラス注入は、Ｍ２細胞集団の定量化に応じてさらに投与してもよい。この投与スケジュールは、限定はされないが、星状細胞腫、乳がん、頭頸部扁平上皮細胞がん、乳頭状腎細胞がんタイプＩＩ、肺がん、膵がん、胆嚢がん、直腸がん、古典的ホジキンリンパ腫、卵巣がん、および結腸直腸がんを含む他のがんについても有効である。
【0090】
実施例６：異なるＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮ配列
異なるＩＧＦ－１Ｒアンチセンス配列は、ノーベル（ＮＯＢＥＬ）配列（５’－ＴＣＣＴＣＣＧＧＡＧＣＣＡＧＡＣＴＴ－３’（配列番号１））の多様式効果の一部もしくは全部において生物活性がある。１８－ｍｅｒのノーベル（ＮＯＢＥＬ）配列は、ＩＧＦ－１Ｒ受容体の下方制御活性とＴＬＲアゴニスト活性の双方を有し、マウスにおけるさらなる実験によると、両方の活性がインビボでの抗腫瘍免疫活性にとって必要であることが示唆される。ＡＳ ＯＤＮ分子が抗腫瘍活性を有する一方、相補的なセンス配列は、やはりＣｐＧモチーフを有するにもかかわらず、抗腫瘍活性を有しない。ＩＧＦ－１Ｒエクソンの全オープンリーディングフレーム（４１０４塩基対）を調査し、ＩＤＴ１２２０を含む１０のさらなるＣｐＧモチーフを同定した（配列番号２～１１）（表３）。さらに、ＣｐＧモチーフを含まない幾つかのさらなるＩＧＦ－１Ｒアンチセンス配列（配列番号１２～１４）も同定した（表３）。
異なるＩＧＦ－１Ｒアンチセンス配列は、ノーベル（ＮＯＢＥＬ）配列（５’－ＴＣＣＴＣＣＧＧＡＧＣＣＡＧＡＣＴＴ－３’（配列番号１））の多様式効果の一部もしくは全部において生物活性がある。１８－ｍｅｒのノーベル（ＮＯＢＥＬ）配列は、ＩＧＦ－１Ｒ受容体の下方制御活性とＴＬＲアゴニスト活性の双方を有し、マウスにおけるさらなる実験によると、両方の活性がインビボでの抗腫瘍免疫活性にとって必要であることが示唆される。ＡＳ ＯＤＮ分子が抗腫瘍活性を有する一方、相補的なセンス配列は、やはりＣｐＧモチーフを有するにもかかわらず、抗腫瘍活性を有しない。ＩＧＦ－１Ｒエクソンの全オープンリーディングフレーム（４１０４塩基対）を調査し、ＩＤＴ１２２０を含む１０のさらなるＣｐＧモチーフを同定した（配列番号２～１１）（表３）。さらに、ＣｐＧモチーフを含まない幾つかのさらなるＩＧＦ－１Ｒアンチセンス配列（配列番号１２～１４）も同定した（表３）。
【0091】
【表3】
実施例７：ノーベル（ＮＯＢＥＬ）によるＴｏｌｌ様受容体９の活性化
侵入する病原体に対する免疫学的応答におけるフロントライン防御は、病原体構造と自然免疫系を活性化するＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）を含む一連の受容体との間の相互作用を含む。免疫系のこのアームは、細菌、ウイルス、真菌、および寄生虫を含む種々の病原体によって産生される一般的クラスの分子（それらのすべては侵入する病原体の生存にとって必須である）を認識する。これらの病原体に関連する分子パターン、すなわちＰＡＭＰＳは、免疫エフェクター細胞、特に樹状細胞において発現される病原体関連受容体（ｐａｔｈｏｇｅｎ ｒｅｌａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）、すなわちＰＲＲによって認識される。これらのＰＲＲは、１９９１年にニュスライン－フォルハルト（Ｎｕｓｓｌｅｉｎ－Ｖｏｌｈａｒｄ）によって最初に特徴づけられたショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）において特徴づけられたｔｏｌｌタンパク質に対する相同性に基づいて、Ｔｏｌｌ様受容体と称される（スタイン（Ｓｔｅｉｎ）ら著、セル（Ｃｅｌｌ）、第６５巻：ｐ．７２５－３５（１９９１））。ＴＬＲの活性化効果は、後続する適応免疫応答のタイプを指示するのに重要である。現在、公知のヒトＴＬＲが１０存在し、ＴＬＲ９が特に興味深い。ＴＬＲ９は、細菌およびウイルスに固有の非メチル化シトシン－グアノシン配列を含むＤＮＡの断片に結合する。ヒトＣｐＧジヌクレオチドは、常にメチル化され、免疫系に曝露される場合、自家ヒトＤＮＡを免疫寛容原性にする。非メチル化ＣｐＧモチーフは、特に好ましい隣接ヌクレオチド六量体配列内で入れ子状態であるとき、強力な自然免疫応答を誘導する（図９）。応答は、アンチセンス遺伝子翻訳を停止させる薬物濃度と比べると、１０００倍低めの濃度で認められる。
【0092】
ノーベル（ＮＯＢＥＬ）配列は、形質細胞様ＤＣとＢ細胞の双方を活性化させることが見出された。ＰＢＭＣを用いてのインビトロでのＡＳ ＯＤＮ取り込み実験を実施し、免疫細胞サブセットの活性化についてアッセイした。ＡＳ ＯＤＮの最高の取り込みが、エンドサイトーシス抗原提示細胞：単球、樹状細胞（ＤＣ）、およびＢ細胞において生じた一方、Ｔ細胞またはＮＫ細胞において無視できる程度の取り込みが認められた。ＡＳ ＯＤＮで処理された形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）、およびＢ細胞は、Ｔ細胞活性化において重要な同時刺激分子（ＣＤ８０、８３、および８６）の発現を増加させた。最高レベルのＡＳ ＯＤＮ取り込みを認めたにもかかわらず、ＣＤ８０、８３、および８６の発現レベルは、単球および骨髄樹状細胞において不変であった（図１０）。
【0093】
実施例８：ノーベル（ＮＯＢＥＬ）処理後の樹状細胞の活性化および成熟
単球由来樹状細胞のノーベル（ＮＯＢＥＬ）での処理は、著しい用量依存性の成熟応答を呈する（図１１）。未熟ＤＣがＣＤ１４＋ＰＢＭＣをｒＧＭ－ＣＳＦおよびｒＩＬ－４中で４日間培養することによって得られた。未熟ＤＣをノーベル（ＮＯＢＥＬ）で３６時間処理した。ＤＣ成熟における正の対照としてポリＩ：Ｃを用いた。処理したＤＣを収集し、蛍光タンパク質とともにインキュベートし、フローサイトメータを用いて分析した。高いエンドサイトーシス能力は、成熟シグナル時に迅速かつ劇的に低下する未熟ＤＣの特徴である。ノーベル（ＮＯＢＥＬ）処理により、ＤＣにおけるエンドサイトーシス能力が用量依存性様式で低下した。
単球由来樹状細胞のノーベル（ＮＯＢＥＬ）での処理は、著しい用量依存性の成熟応答を呈する（図１１）。未熟ＤＣがＣＤ１４＋ＰＢＭＣをｒＧＭ－ＣＳＦおよびｒＩＬ－４中で４日間培養することによって得られた。未熟ＤＣをノーベル（ＮＯＢＥＬ）で３６時間処理した。ＤＣ成熟における正の対照としてポリＩ：Ｃを用いた。処理したＤＣを収集し、蛍光タンパク質とともにインキュベートし、フローサイトメータを用いて分析した。高いエンドサイトーシス能力は、成熟シグナル時に迅速かつ劇的に低下する未熟ＤＣの特徴である。ノーベル（ＮＯＢＥＬ）処理により、ＤＣにおけるエンドサイトーシス能力が用量依存性様式で低下した。
【0094】
実施例９：最適なＡＳ ＯＤＮ配列
さらなるＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮ配列をスクリーニングするための指針として、標的化ｍＲＮＡ転写物の５’末端の配列は、ワトソン・クリック塩基対律に従ってｍＲＮＡ配列に結合する最高の可能性を有する。この生物学的活性は、体温で安定な５’ヘアピンループを形成する可能性がより高いＤＷＡ配列とは異なり、体温で線状分子をより高い確率で生成する好ましい配列に起因し得る（図１３）。上述の通り、生物学的活性は、体温で分子、理想的には線状分子の５’末端から到達可能である必要がある、標的化されたｍＲＮＡ配列および非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドへの到達可能性を含むことに起因し得る。これらの指針にもかかわらず、ＩＧＦ－１Ｒの下方制御する能力を有しないＤＷＡ配列は、ＤＣ成熟にてより優れているように思われた（図１２）。異なるＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮの生物学的活性を以下の表４にまとめる。
さらなるＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮ配列をスクリーニングするための指針として、標的化ｍＲＮＡ転写物の５’末端の配列は、ワトソン・クリック塩基対律に従ってｍＲＮＡ配列に結合する最高の可能性を有する。この生物学的活性は、体温で安定な５’ヘアピンループを形成する可能性がより高いＤＷＡ配列とは異なり、体温で線状分子をより高い確率で生成する好ましい配列に起因し得る（図１３）。上述の通り、生物学的活性は、体温で分子、理想的には線状分子の５’末端から到達可能である必要がある、標的化されたｍＲＮＡ配列および非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドへの到達可能性を含むことに起因し得る。これらの指針にもかかわらず、ＩＧＦ－１Ｒの下方制御する能力を有しないＤＷＡ配列は、ＤＣ成熟にてより優れているように思われた（図１２）。異なるＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮの生物学的活性を以下の表４にまとめる。
【0095】
【表4】
実施例１０：ＩＧＦ－１Ｒの下方制御：ノーベル（ＮＯＢＥＬ）の生物学的特異性および生物活性のまとめ
ＡＳ ＯＤＮ配列の生物学的特異性を評価するため、２つのアッセイを設計した。
【0096】
ａ．ＩＧＦ－１Ｒ ｍＲＮＡの下方制御を評価するための定量ＲＴ－ＰＣＲ－このアッセイは、細胞内ＩＧＦ－１Ｒ転写ｍＲＮＡとＡＳ ＯＤＮとの間のワトソン・クリック塩基対を確認するように設計した。ＧＬ２６１マウス細胞は、１０％ＦＢＳ、４ＭｍＬ－グルタミン（フィッシャー（Ｆｉｓｈｅｒ））、５０μｇ／ｍＬのゲンタマイシン（ギブコ（ＧＩＢＣＯ））および０．０５Ｍｍ ２－ＭＥ（シグマ（Ｓｉｇｍａ））を添加したＲＰＭＩ中に存在し、エヌシーアイ－フレデリックディーティーピー（ＮＣＩ－Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ ＤＴＰ）、ディーシーティーディー・チューモア・バンク・レポジトリー（ＤＣＴＤ Ｔｕｍｏｒ Ｂａｎｋ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ）（フレデリック、メリーランド州）から入手した。図１４に示すように、ＩＧＦ－１Ｒの発現は、１ｍｇのノーベル（ＮＯＢＥＬ） ＡＳ－ＯＤＮ／ウェル（Ｐ＜０．００１）で治療したＧＬ２６１細胞内、ならびに０．１ｍｇのノーベル（ＮＯＢＥＬ） ＡＳ ＯＤＮ／ウェル（Ｐ＜０．０５）で治療した細胞内で有意に低下した。
【0097】
ｂ．ヘキソキナーゼアイソタイプ２ｍＲＮＡの下流での下方制御を評価するための定量ＲＴ－ＰＣＲ－ＩＧＦ－１はがん細胞内でのヘキソキナーゼＲＮＡの発現を誘導する。ＡＳ－ＯＤＮ処理によるＩＧＦ－１Ｒの下方制御の結果としてＩＧＦ－１により低下したＩＧＦ－１Ｒの活性化がヘキソキナーゼ発現における同様の低下をもたらすはずであることが予測された。図１５に示すように、これはＩＧＦ－１Ｒ ｍＲＮＡにおける低下がヘキソキナーゼＩＩの下方制御と高度に相関した場合である。ＩＧＦ－１Ｒのコピー数における９０％の減少は、ヘキソキナーゼＩＩのコピー数における９０％の減少に対応した。Ｌ１３における７５％の減少として認められる場合、インビトロでＩＧＦ－１Ｒの阻害が成長速度および代謝を遅らせることから、ハウスキーピング遺伝子の下方制御もまた想定された。
【0098】
実施例１１：ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮの生物活性：ノーベル（ＮＯＢＥＬ）配列の腫瘍負荷に対するワクチン能を評価するためのマウス側腹モデル
Ｃ５７／ＢＬ６マウスは、ジャクソン・ラボラトリー（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（バーハーバー、メイン州）およびタコニック・ファームズ・インコーポレーテッド（Ｔａｃｏｎｉｃ Ｆａｒｍｓ，Ｉｎｃ．）から入手し、８～１０週齢を用いた。マウスは、イソフルランを含有するチャンバ内で麻酔し、１００μＬのＰＢＳ中、１０６個のＧＬ２６１を側腹に１ｍＬのビーディー・ファルコン（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ）シリンジおよび２１Ｇのビーディー（ＢＤ）針（フィッシャー（Ｆｉｓｈｅｒ））を用いて注射した。ＡＳ ＯＤＮ ＧＬ２６１細胞製剤を左側腹に注射する一方、２週間後、野生型ＧＬ２６１細胞を右側腹に注射した。マウスは、腫瘍産生について少なくとも週２回検査した。これらの試験においては、ＧＬ２６１細胞が類遺伝子マウスの側腹に置かれるとき、かかる動物の約５０％が介入の不在下で抗腫瘍細胞免疫を発生させることが想定される程度に免疫刺激性であることが周知であることは注目すべきである。図１６に見られるように、ＡＳ－ＯＤＮで治療されるＧＬ２６１細胞を伴う前処理では、ＷＴ ＧＬ２６１腫瘍成長が対照マウスにおける５３％から１３％に低下する一方、ＧＬ２６１ ＡＳ ＯＤＮ混合物（４ｍｇのノーベル（ＮＯＢＥＬ）／１０６個のＧＬ２６１）を伴う前処理では、ＷＴ ＧＬ２６１腫瘍が０％に低下した。興味深いことに、ＧＬ２６１とノーベル（ＮＯＢＥＬ）をマウスの反対の側腹に注射したとき、ワクチンの有効性は失われた（図１７）。これらのデータは、ＡＳ ＯＤＮで処理されるＧＬ２６１とアンチセンス分子が抗腫瘍応答に寄与するが、最も有効なワクチンが自家腫瘍細胞とＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮとの同時注射を含むことを示唆する。さらに興味深いことに、ＣｐＧモチーフ周囲のパリンドロームであるノーベル（ＮＯＢＥＬ）センス配列は抗腫瘍免疫の刺激時に有効でなく、これはＣｐＧモチーフの生物学的有効性がＣｐＧモチーフ単独を超えるＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮの生物活性に関連することを示唆している。
Ｃ５７／ＢＬ６マウスは、ジャクソン・ラボラトリー（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（バーハーバー、メイン州）およびタコニック・ファームズ・インコーポレーテッド（Ｔａｃｏｎｉｃ Ｆａｒｍｓ，Ｉｎｃ．）から入手し、８～１０週齢を用いた。マウスは、イソフルランを含有するチャンバ内で麻酔し、１００μＬのＰＢＳ中、１０６個のＧＬ２６１を側腹に１ｍＬのビーディー・ファルコン（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ）シリンジおよび２１Ｇのビーディー（ＢＤ）針（フィッシャー（Ｆｉｓｈｅｒ））を用いて注射した。ＡＳ ＯＤＮ ＧＬ２６１細胞製剤を左側腹に注射する一方、２週間後、野生型ＧＬ２６１細胞を右側腹に注射した。マウスは、腫瘍産生について少なくとも週２回検査した。これらの試験においては、ＧＬ２６１細胞が類遺伝子マウスの側腹に置かれるとき、かかる動物の約５０％が介入の不在下で抗腫瘍細胞免疫を発生させることが想定される程度に免疫刺激性であることが周知であることは注目すべきである。図１６に見られるように、ＡＳ－ＯＤＮで治療されるＧＬ２６１細胞を伴う前処理では、ＷＴ ＧＬ２６１腫瘍成長が対照マウスにおける５３％から１３％に低下する一方、ＧＬ２６１ ＡＳ ＯＤＮ混合物（４ｍｇのノーベル（ＮＯＢＥＬ）／１０６個のＧＬ２６１）を伴う前処理では、ＷＴ ＧＬ２６１腫瘍が０％に低下した。興味深いことに、ＧＬ２６１とノーベル（ＮＯＢＥＬ）をマウスの反対の側腹に注射したとき、ワクチンの有効性は失われた（図１７）。これらのデータは、ＡＳ ＯＤＮで処理されるＧＬ２６１とアンチセンス分子が抗腫瘍応答に寄与するが、最も有効なワクチンが自家腫瘍細胞とＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮとの同時注射を含むことを示唆する。さらに興味深いことに、ＣｐＧモチーフ周囲のパリンドロームであるノーベル（ＮＯＢＥＬ）センス配列は抗腫瘍免疫の刺激時に有効でなく、これはＣｐＧモチーフの生物学的有効性がＣｐＧモチーフ単独を超えるＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮの生物活性に関連することを示唆している。
【0099】
実施例１２：ノーベル（ＮＯＢＥＬ）は放射線増感能がある
Ｕ１１８細胞をノーベル（ＮＯＢＥＬ）（４ｍｇ／１０７個の細胞）の存在下または不在下で２４時間インキュベートした。細胞を収集し、照射し、クリック－イテドゥ（Ｃｌｉｃｋ－ｉＴｅｄｕ）試薬（１０μＭの最終濃度）の存在下で（新たなノーベル（ＮＯＢＥＬ）を伴う場合または伴わない場合）培養物に戻した。７２時間のインキュベーション後、製造業者のプロトコルに従って培養を展開した。図１８に示すように、ノーベル（ＮＯＢＥＬ） ＡＳ ＯＤＮは、５Ｇｙを超える等効果のプラトーを伴う１～１５Ｇｙの放射線量の範囲全体にわたり、Ｕ１１８ヒト神経膠芽腫細胞の放射線感受性を引き起こした。
Ｕ１１８細胞をノーベル（ＮＯＢＥＬ）（４ｍｇ／１０７個の細胞）の存在下または不在下で２４時間インキュベートした。細胞を収集し、照射し、クリック－イテドゥ（Ｃｌｉｃｋ－ｉＴｅｄｕ）試薬（１０μＭの最終濃度）の存在下で（新たなノーベル（ＮＯＢＥＬ）を伴う場合または伴わない場合）培養物に戻した。７２時間のインキュベーション後、製造業者のプロトコルに従って培養を展開した。図１８に示すように、ノーベル（ＮＯＢＥＬ） ＡＳ ＯＤＮは、５Ｇｙを超える等効果のプラトーを伴う１～１５Ｇｙの放射線量の範囲全体にわたり、Ｕ１１８ヒト神経膠芽腫細胞の放射線感受性を引き起こした。
【0100】
実施例１３：星状細胞腫の治療
ＷＨＯグレードＩＶ星状細胞腫（神経膠芽腫）は、１８か月の生存中央値を有する一様に致死性のある原発性頭蓋内悪性腫瘍である。良好な手術候補者であると判断された再発性神経膠芽腫と診断された患者１２名を治療に登録した。すべての患者では、手術、テモゾロミド化学療法および原体照射療法を含む標準治療が奏功していなかった。登録患者と彼らの疾患経過のまとめを表５に含める。すべての患者を、４０ｍｇ／日での皮下エノキサパリンで３か月にわたり治療した。
ＷＨＯグレードＩＶ星状細胞腫（神経膠芽腫）は、１８か月の生存中央値を有する一様に致死性のある原発性頭蓋内悪性腫瘍である。良好な手術候補者であると判断された再発性神経膠芽腫と診断された患者１２名を治療に登録した。すべての患者では、手術、テモゾロミド化学療法および原体照射療法を含む標準治療が奏功していなかった。登録患者と彼らの疾患経過のまとめを表５に含める。すべての患者を、４０ｍｇ／日での皮下エノキサパリンで３か月にわたり治療した。
【0101】
【表5】
自家腫瘍細胞からなる混合剤は、手術時に除去し、次にＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮで一晩処理した後、半透性チャンバに添加し、照射した。ワクチン製品では、配列５’－ＴＣＣＴＣＣＧＧＡＧＣＣＡＧＡＣＴＴ－３’を有する１８－ｍｅｒのＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮを用い、先行配列から下流に１つのフレームシフトを設け、その免疫刺激特性に基づき、各チャンバ（Ｃ－ｖ）に２μｇの外因性アンチセンスを付加した。プロトコルはまた、ＰＢＳを含有するチャンバ（Ｃ－ｐ）を含むように改訂した。最大で１０のチャンバを腹直筋鞘に移植した。ワクチン製剤のプレーティング段階中に得られる自家腫瘍細胞上清と外植されたチャンバ内容物を、探索研究を目的として急速冷凍した。
【0102】
試験目的は、安全性およびＸ線応答、例えば腫瘍相対的脳血液量（ｒＣＢＶ）、見かけの拡散係数（ＡＤＣ）、および９０分および２４０分での１８フルオロデオキシグルコースデュアルタイム画像取得を伴うＰＥＴ／ＣＴの評価を含んだ。探索目的は、多重分析（ルミネックス（Ｌｕｍｉｎｅｘ））を用いての、血清、チャンバ液および細胞培養物の中の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）およびケモカイン／サイトカインの経時的評価を含んだ。
【0103】
免疫学的評価
免疫パラメータのベースライン評価のため、血漿・白血球フェレーシスを手術の１週間前に実施した。血液はまた、先に述べられたように１、手術後に得た。血清と細胞画分とを遠心分離によって分離し、細胞を赤血球溶解緩衝液で処理し、白血球は、フローサイトメトリーによって定量化するか、または血清試料と同様、ＤＭＳＯ中に－８０℃で貯蔵した。フローサイトメトリーを、前述のように、イージーサイト８ＨＴ（ＥａｓｙＣｙｔｅ ８ＨＴ）（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））と、ヒトＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ２０、ＣＤ４５、ＣＤ５６、ＣＤ８０、ＣＤ８３、およびＣＤ８６（すべてがビーディー・バイオサイエンシーズ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）製）、およびＣＤ１６３（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）に特異的な蛍光的にコンジュゲートされたｍＡｂとを用いて実施した。収集後の分析は、フロウジョ（ＦｌｏｗＪｏ）ソフトウェア（トリースター・インコーポレーテッド（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ Ｉｎｃ）、アシュランド、オレゴン州）を用いて実施した。可溶性サイトカイン因子を、ルミネックス（Ｌｕｍｉｎｅｘ）ビーズアレイ（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）製のヒトサイトカイン／ケモカインパネルＩ、ＩＩ、およびＩＩＩ）を用いて定量化した。治療前と手術後にＴ細胞の多機能性を評価するため、患者および正常対照からのＰＢＭＣを、インビトロで１３－酢酸１２－ミリスチン酸ホルボール（ＰＭＡ）およびイオノマイシン（シグマ・アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ））で刺激し、培養液中に放出されたサイトカインおよびケモカインをルミネックス（Ｌｕｍｉｎｅｘ）によって定量化した。腫瘍組織切片を、ＩＧＦ－１Ｒ、ＣＤ１６３、ＣＤ１４、ＣＤ２０６、ＣＤ２０４、ＣＤ３、ＣＤ４、およびＣＤ８について免疫組織化学により評価した。可能であれば、免疫陽性細胞のアペリオ（Ａｐｅｒｉｏ）定量化を用いた。さもなければ、免疫染色は、熟練した神経病理学者（ＬＥＫ）により、０（染色なし）～６（強い拡散染色）の順序尺度を用いて定性的に評価した。
免疫パラメータのベースライン評価のため、血漿・白血球フェレーシスを手術の１週間前に実施した。血液はまた、先に述べられたように１、手術後に得た。血清と細胞画分とを遠心分離によって分離し、細胞を赤血球溶解緩衝液で処理し、白血球は、フローサイトメトリーによって定量化するか、または血清試料と同様、ＤＭＳＯ中に－８０℃で貯蔵した。フローサイトメトリーを、前述のように、イージーサイト８ＨＴ（ＥａｓｙＣｙｔｅ ８ＨＴ）（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））と、ヒトＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ２０、ＣＤ４５、ＣＤ５６、ＣＤ８０、ＣＤ８３、およびＣＤ８６（すべてがビーディー・バイオサイエンシーズ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）製）、およびＣＤ１６３（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）に特異的な蛍光的にコンジュゲートされたｍＡｂとを用いて実施した。収集後の分析は、フロウジョ（ＦｌｏｗＪｏ）ソフトウェア（トリースター・インコーポレーテッド（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ Ｉｎｃ）、アシュランド、オレゴン州）を用いて実施した。可溶性サイトカイン因子を、ルミネックス（Ｌｕｍｉｎｅｘ）ビーズアレイ（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）製のヒトサイトカイン／ケモカインパネルＩ、ＩＩ、およびＩＩＩ）を用いて定量化した。治療前と手術後にＴ細胞の多機能性を評価するため、患者および正常対照からのＰＢＭＣを、インビトロで１３－酢酸１２－ミリスチン酸ホルボール（ＰＭＡ）およびイオノマイシン（シグマ・アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ））で刺激し、培養液中に放出されたサイトカインおよびケモカインをルミネックス（Ｌｕｍｉｎｅｘ）によって定量化した。腫瘍組織切片を、ＩＧＦ－１Ｒ、ＣＤ１６３、ＣＤ１４、ＣＤ２０６、ＣＤ２０４、ＣＤ３、ＣＤ４、およびＣＤ８について免疫組織化学により評価した。可能であれば、免疫陽性細胞のアペリオ（Ａｐｅｒｉｏ）定量化を用いた。さもなければ、免疫染色は、熟練した神経病理学者（ＬＥＫ）により、０（染色なし）～６（強い拡散染色）の順序尺度を用いて定性的に評価した。
【0104】
手術前および手術後２日間の血清中のサイトカイン／ケモカイン、外植されたチャンバの内容物、および一晩腫瘍細胞培養物（ＳＮ）由来の上清のレベルはすべて、ルミネックス（Ｌｕｍｉｎｅｘ）により定量化した。ワクチンと制御チャンバの対から得られた膜は、免疫病理組織学的検査用にパラフィンで包埋した。
【0105】
安全性評価および臨床経過
記録された５４の重度有害事象の中で、ただ１つのＳＡＥは、血漿・白血球フェレーシスのために用いられる大腿ポートからの血栓を含むプロトコルに関連した。試験におけるＤＶＴの発生率は８．３％であった。患者９名が腫瘍増殖のために死亡したが、患者３名が頭蓋内出血および敗血症（カンジダ・グラブラータ（ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ））を含む他の原因で死亡した。５回の剖検を実施した。全患者は、臨床的指示に従い、術後期間内にステロイド中止または一日量維持がなされた。全生存中央値は９１．４週であり、初期手術と再発のための手術との間の間隔に高度に相関した。再発性腫瘍手術および自家細胞ワクチン接種の後、４８．２週および１０週の２つの有意に異なるプロトコルの生存コホートがそれぞれ、より長期の生存コホートおよび短期の生存コホートとして同定された（図１９ａ－ｃ）。１つの異常値（ＴＪ０３）を除去し、我々は、登録時のプロトコルの生存とリンパ球減少症の程度との間の有意な相関を記録した（図１９ｄ）。初期診断時とプロトコル登録時との値の比較によると、標準治療後、平均リンパ球数が有意に減少していた（６５％）ことが示された（８つの利用可能なペア試料、ｐ＝．０１２、対応ｔ検定）。登録時のリンパ球数とワクチン接種後の最終の利用可能なリンパ球数との間の有意差は全くなかった（データは示さず）。
記録された５４の重度有害事象の中で、ただ１つのＳＡＥは、血漿・白血球フェレーシスのために用いられる大腿ポートからの血栓を含むプロトコルに関連した。試験におけるＤＶＴの発生率は８．３％であった。患者９名が腫瘍増殖のために死亡したが、患者３名が頭蓋内出血および敗血症（カンジダ・グラブラータ（ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ））を含む他の原因で死亡した。５回の剖検を実施した。全患者は、臨床的指示に従い、術後期間内にステロイド中止または一日量維持がなされた。全生存中央値は９１．４週であり、初期手術と再発のための手術との間の間隔に高度に相関した。再発性腫瘍手術および自家細胞ワクチン接種の後、４８．２週および１０週の２つの有意に異なるプロトコルの生存コホートがそれぞれ、より長期の生存コホートおよび短期の生存コホートとして同定された（図１９ａ－ｃ）。１つの異常値（ＴＪ０３）を除去し、我々は、登録時のプロトコルの生存とリンパ球減少症の程度との間の有意な相関を記録した（図１９ｄ）。初期診断時とプロトコル登録時との値の比較によると、標準治療後、平均リンパ球数が有意に減少していた（６５％）ことが示された（８つの利用可能なペア試料、ｐ＝．０１２、対応ｔ検定）。登録時のリンパ球数とワクチン接種後の最終の利用可能なリンパ球数との間の有意差は全くなかった（データは示さず）。
【0106】
Ｘ線応答
解剖学的な腫瘍応答をスコア化した。例を図２０ａおよび図２０ｂに示す。標準ＭＲＩでの解剖学的改善は生存と相関しなかったが、追加的なイメージング判定基準は生存と相関した。４つの内の３つのより長期の生存コホート（ＴＪ０３、ＴＪ０６、およびＴＪ０９）は、増加する見かけの拡散係数（ＡＤＣ、図２０ｃ参照）に高度に相関するｒＣＢＶにおいて逆説的な増加を有した。これらの患者が、灌流データが疾患の進行を示唆しているにもかかわらず、腫瘍内部での細胞消失を反映するＡＤＣ値を有したことから、これは逆説的であると考えられた。ＴＪ０６の症例では、ＣＤ１６３＋マクロファージ集団における有意な持続的減少が、剖検の前に行った２回目のワクチン接種時に認められた（図２０ｄおよび下記参照）。これらの内の２つの症例で、炎症に合致するＰＥＴ／ＣＴ判定基準が認められ、これらの知見を実証している（図２４）。サイトカインプロットの概要は、これら３名の患者における炎症促進性過程を支持した（図２０ｅ）。
解剖学的な腫瘍応答をスコア化した。例を図２０ａおよび図２０ｂに示す。標準ＭＲＩでの解剖学的改善は生存と相関しなかったが、追加的なイメージング判定基準は生存と相関した。４つの内の３つのより長期の生存コホート（ＴＪ０３、ＴＪ０６、およびＴＪ０９）は、増加する見かけの拡散係数（ＡＤＣ、図２０ｃ参照）に高度に相関するｒＣＢＶにおいて逆説的な増加を有した。これらの患者が、灌流データが疾患の進行を示唆しているにもかかわらず、腫瘍内部での細胞消失を反映するＡＤＣ値を有したことから、これは逆説的であると考えられた。ＴＪ０６の症例では、ＣＤ１６３＋マクロファージ集団における有意な持続的減少が、剖検の前に行った２回目のワクチン接種時に認められた（図２０ｄおよび下記参照）。これらの内の２つの症例で、炎症に合致するＰＥＴ／ＣＴ判定基準が認められ、これらの知見を実証している（図２４）。サイトカインプロットの概要は、これら３名の患者における炎症促進性過程を支持した（図２０ｅ）。
【0107】
外植されたチャンバおよび病理標本の検査
外植されたチャンバは、構造的に無傷であり、トリパンブルー排除によると生細胞を全く含有しなかった。チャンバから得た膜の組織学的分析によると、ＣＤ１５＋好中球およびＣＤ１６３＋マクロファージがＣ－ｐおよびＣ－ｖチャンバの双方から得た膜の外表面をコーティングしているが、Ｃ－ｖ上で劇増することが示された（図３ａ）。チャンバ内容物は、被包細胞および周囲環境から内向きに拡散する因子の生成物を反映し、制御Ｃ－ｐチャンバは後者に対して制御した。Ｃ－ｖにおけるＣ－ｐと比べて上昇したケモカインは、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２０、およびＣＣＬ１９を含み、それらのいずれも血清レベルを超えて有意に上昇した。ＣＸＣＬ１２は、Ｃ－ｖおよび血清においてＣ－ｐと比べて上昇した（図２５および表６）。また、Ｃ－ｖにおけるＨＳＰ－７０およびグランザイムＢの血清と比べての有意な上昇が認められた（各々、３８２６ｐｇ／ｍｌ対３２７ｐｇ／ｍｌ、ｐ＝．００１５、および３７ｐｇ／ｍｌ対１２ｐｇ／ｍｌ、ｐ＝．０１）。これらの結果は、本明細書で開示される方法が抗がん効果を増強する炎症促進性免疫応答を誘導することを示す。
外植されたチャンバは、構造的に無傷であり、トリパンブルー排除によると生細胞を全く含有しなかった。チャンバから得た膜の組織学的分析によると、ＣＤ１５＋好中球およびＣＤ１６３＋マクロファージがＣ－ｐおよびＣ－ｖチャンバの双方から得た膜の外表面をコーティングしているが、Ｃ－ｖ上で劇増することが示された（図３ａ）。チャンバ内容物は、被包細胞および周囲環境から内向きに拡散する因子の生成物を反映し、制御Ｃ－ｐチャンバは後者に対して制御した。Ｃ－ｖにおけるＣ－ｐと比べて上昇したケモカインは、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２０、およびＣＣＬ１９を含み、それらのいずれも血清レベルを超えて有意に上昇した。ＣＸＣＬ１２は、Ｃ－ｖおよび血清においてＣ－ｐと比べて上昇した（図２５および表６）。また、Ｃ－ｖにおけるＨＳＰ－７０およびグランザイムＢの血清と比べての有意な上昇が認められた（各々、３８２６ｐｇ／ｍｌ対３２７ｐｇ／ｍｌ、ｐ＝．００１５、および３７ｐｇ／ｍｌ対１２ｐｇ／ｍｌ、ｐ＝．０１）。これらの結果は、本明細書で開示される方法が抗がん効果を増強する炎症促進性免疫応答を誘導することを示す。
【0108】
【表6】
剖検を通じた外科的介入由来のパラフィン切片は免疫組織化学分析のために利用可能であった。すべての評価可能な症例において、初期診断に対してワクチン接種時に有意に増加した腫瘍浸潤性ＣＤ１６３＋マクロファージの数が剖検時に有意に減少したことが認められた（図２１ｂおよび２６）。
【0109】
ＩＧＦ－１Ｒを発現する細胞のレベルは、初期診断から再発のための手術にかけて腫瘍組織全体を通して高かったが、剖検時には双方で有意に減少した。染色がアペリオ（Ａｐｅｒｉｏ）による免疫陽性細胞の定量化に対してあまりに拡散的であったため、定性的尺度を用いた。ワクチン接種前レベルとワクチン接種後レベルの比較によると、ＩＧＦ－１Ｒ陽性細胞の有意な減少が示された（図２１ｃおよび２６）。
【0110】
生存コホートを比較して、我々は、長期生存において短期生存コホートと比べて有意により低レベルのＣＤ１６３＋ＴＡＭを、両方の初期診断時（３．７％対５１．５％、ｐ．００７５）およびワクチン接種時（２６％対５３．９％、ｐ＝．０４０２）に認めた（図２７）。ＴＡＭのレベルは、短期生存コホートにおいて循環するＭ２細胞と高度に相関した（図Ｓ４ｂ）。幾つかのＣＤ３、ＣＤ４、またはＣＤ８細胞が、すべての連続的な対象試料を通じて認められた（データは示さず）。
【0111】
収集した試料中のケモカイン／サイトカイン含量
Ｃ－ｖにおけるサイトカイン／ケモカインでの任意の有意な増加が、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）または血清のいずれかにおけるそれらの存在の増加を反映し得ると仮定された。この問題へのさらなる洞察を得るため、腫瘍縮小術がこれらのサイトカインの血清レベルを低減するか否かを探索した。調査したすべての血清サイトカイン／ケモカインから２つの異常値を除外し、血清ＣＣＬ２１は、手術後２日目に有意に減少したが（表６）、これはＴＭＥからのＣＣＬ２１の産生を支持した。興味深いことに、Ｔ細胞のワクチン接種後レベルが、より長期生存の対象におけるＣＣＬ２１とＣＸＣＬ１２の双方のレベルと酷似する傾向があった（図４）。それに対して、短期生存コホートにおけるＴ細胞、単球またはサイトカインの間に関連するパターンが存在しないことを我々は認めた（図２８）。
Ｃ－ｖにおけるサイトカイン／ケモカインでの任意の有意な増加が、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）または血清のいずれかにおけるそれらの存在の増加を反映し得ると仮定された。この問題へのさらなる洞察を得るため、腫瘍縮小術がこれらのサイトカインの血清レベルを低減するか否かを探索した。調査したすべての血清サイトカイン／ケモカインから２つの異常値を除外し、血清ＣＣＬ２１は、手術後２日目に有意に減少したが（表６）、これはＴＭＥからのＣＣＬ２１の産生を支持した。興味深いことに、Ｔ細胞のワクチン接種後レベルが、より長期生存の対象におけるＣＣＬ２１とＣＸＣＬ１２の双方のレベルと酷似する傾向があった（図４）。それに対して、短期生存コホートにおけるＴ細胞、単球またはサイトカインの間に関連するパターンが存在しないことを我々は認めた（図２８）。
【0112】
ＳＮとＣ－ｖの双方において高いＣＣＬ２もまた、ワクチン接種後、血清中で有意に上昇し、このケモカインのＴＭＥ以外の供給源が示唆された。ＣＣＬ２の手術後血清レベル平均もまた、短期において長期生存コホートと比べて有意により高かった（３８１２ｐｇ／ｍｌ対１９７８ｐｇ／ｍｌ，ｐ＜．００７８）。
【0113】
初期ワクチン接種および再ワクチン接種の後、より長期生存の対象は、Ｔ細胞、単球、および炎症促進性ケモカイン／サイトカインの循環レベルの間で協調的変化を呈した。Ｔ細胞とマクロファージとの間および循環するＣＤ１４＋ＣＤ１６－マクロファージのＣＤ１６３＋サブセットとケモカインＣＣＬ２との間に逆相関が認められた。特定のサイトカインを示す表７を参照のこと。４名中３名の対象において、ＣＤ１６３＋細胞およびＣＣＲ２＋細胞の循環レベルもまた直接相関した（Ｒ２＝．６８，ｐ＝．０４３）。ワクチン接種後期間におけるより長期生存のコホートでは、有意により高いＣＤ４／ＣＤ８比が明白であった。
【0114】
【表7】
インビトロでのＴ細胞活性化
－７日目および１４日目に得られたＰＢＭＣ試料をＰＭＡ／イオノマイシンで非特異的に刺激し、ケモカイン／サイトカインレベルについて上清を評価した。リンパ球減少性が著しい１つの異常値（ＴＪ０３）を除外後、１４日目、２つの生存コホートにおける有意差を古典的Ｔｈ－１およびＴｈ－２応答に関連する６つの推定上のサイトカインについて認めた（図５および表８）。
【0115】
【表8】
実施例１４：Ｍ２細胞でのＩＧＦ－１Ｒの過剰発現に極性化された単球
ＩＬ－４およびＩＬ－１３による基準のＭ２分化によりＭ２極性化に誘導される未熟な未分化ヒト単球が、Ｍ１極性化に誘導されるマクロファージと比べてＩＧＦ－１Ｒを過剰発現させる。さらに、ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮによる治療は、極性化されたＭ２細胞の出現および既存のＭ２細胞の生存を選択的に遮断する（図２９）。これらの観察は、免疫系についての新たな情報を表し、種々のがんを有する患者における予後不良に関連したＭ２細胞の標的化された除去を含む治療的介入を支持する。図２９ａは、ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮの取り込みの大多数が単球および好中球の場合に生じることを示す。Ｍ１およびＭ２に分化されたマクロファージにおいてＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮの同様の取り込みが生じるが、ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮの濃度増加により、Ｍ２ ＣＤ１６３＋細胞の選択的除去が標的化され、ＩＧＦ－１Ｒのみが上方制御される（図２９ｂ）。ＣＤ１６３＋細胞のアポトーシス細胞死の速度は、ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮの濃度と直接的に関係する（図２９ｃ）。
【0116】
実施例１５：がん患者血清中の正常な単球のインキュベーションによるＭ２への単球の極性化
異なるタイプのがんを有する患者について、彼らの血清がＣＤ１６３＋分化の能力があるか否かを観察するための分析を実施した。図３０に示すように、頭頸部扁平上皮細胞がん（Ｎ＝２）、非小細胞肺がん（Ｎ＝２）、および前立腺がん（Ｎ＝５）に由来する血清と同時インキュベートした未分化単球からＣＤ１６３＋マクロファージ分化が認められた。すべての症例で、ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮによる治療により、この細胞集団がノックダウンされた。これにより、種々のがんを有する患者の血清中に存在する因子が、単球の、ＣＤ１６３および／または種々の他の表現型マーカ、例えばＣＤ２０４およびＣＤ２０６を差次的に発現するＭ２単球への分化を誘導するという確証が得られる。
異なるタイプのがんを有する患者について、彼らの血清がＣＤ１６３＋分化の能力があるか否かを観察するための分析を実施した。図３０に示すように、頭頸部扁平上皮細胞がん（Ｎ＝２）、非小細胞肺がん（Ｎ＝２）、および前立腺がん（Ｎ＝５）に由来する血清と同時インキュベートした未分化単球からＣＤ１６３＋マクロファージ分化が認められた。すべての症例で、ＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮによる治療により、この細胞集団がノックダウンされた。これにより、種々のがんを有する患者の血清中に存在する因子が、単球の、ＣＤ１６３および／または種々の他の表現型マーカ、例えばＣＤ２０４およびＣＤ２０６を差次的に発現するＭ２単球への分化を誘導するという確証が得られる。
【0117】
実施例１６：異なるがんを有する患者由来の血清を用いる治療によってＭ２ ＣＤ１６３＋表現型へ極性化される単球はＣＤ１６３とＰＤＬ－１の双方の上方制御を示す
図３１は、異なるがんを有する患者由来の血清を用いる治療によってＭ２ ＣＤ１６３＋表現型へ極性化される単球がＣＤ１６３とＰＤＬ－１の双方の上方制御を示し、いずれの症例でも、ＡＳ ＯＤＮを用いる治療により、ＣＤ１６３とＰＤＬ－１の双方がこの細胞集団を選択的に標的化することによってノックダウンされることを示す。図３１Ａは、ＰＢＳ対照に対するＰＤＬ－１を発現するＣＤ１６３＋マクロファージのＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮ（ノーベル（ＮＯＢＥＬ）、２５０μｇ）治療における手段の比較を示す。図３１Ｂは、マッチドペア分析により、ＰＤＬ－１の有意な減少として反映されるこの細胞集団の高度に有意な減少が示されることを示す。ＰＤＬ－１を過剰発現する細胞集団の除去により、阻害の供給源から細胞傷害性Ｔ細胞が放出され、それによりこれらのがん患者における１型免疫が回復される。
図３１は、異なるがんを有する患者由来の血清を用いる治療によってＭ２ ＣＤ１６３＋表現型へ極性化される単球がＣＤ１６３とＰＤＬ－１の双方の上方制御を示し、いずれの症例でも、ＡＳ ＯＤＮを用いる治療により、ＣＤ１６３とＰＤＬ－１の双方がこの細胞集団を選択的に標的化することによってノックダウンされることを示す。図３１Ａは、ＰＢＳ対照に対するＰＤＬ－１を発現するＣＤ１６３＋マクロファージのＩＧＦ－１Ｒ ＡＳ ＯＤＮ（ノーベル（ＮＯＢＥＬ）、２５０μｇ）治療における手段の比較を示す。図３１Ｂは、マッチドペア分析により、ＰＤＬ－１の有意な減少として反映されるこの細胞集団の高度に有意な減少が示されることを示す。ＰＤＬ－１を過剰発現する細胞集団の除去により、阻害の供給源から細胞傷害性Ｔ細胞が放出され、それによりこれらのがん患者における１型免疫が回復される。
【0118】
実施例１７：正常な個体と星状細胞腫患者との間での循環ＣＤ１６３＋単球における差異
正常な個体と星状細胞腫患者との間での循環ＣＤ１６３＋単球における差異について試験した。正常な個体は、その循環中での約６％のＣＤ１４＋単球とともに中間レベルのＣＤ１６３を示した（図３３Ａ）。がん患者において、単球の数が増加しかつ単球はより高レベルのＣＤ１６３を有するという２つの変化が認められる（図３３Ａ）。他の細胞（赤ボックス）はＣＤ１６３を全く有しない。正常な個体は感染などに起因して広範囲の単球を有し得る（図３３Ｂ、ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１４が陽性の細胞）が、これらは悪性星状細胞腫を有する患者において上昇する。図３３Ｃにおけるヒストグラムは、患者の単球が不定にもそのＣＤ１４単球上に対照細胞（赤色ヒストグラム）よりも高レベルのＣＤ１６３を有することを示す。
正常な個体と星状細胞腫患者との間での循環ＣＤ１６３＋単球における差異について試験した。正常な個体は、その循環中での約６％のＣＤ１４＋単球とともに中間レベルのＣＤ１６３を示した（図３３Ａ）。がん患者において、単球の数が増加しかつ単球はより高レベルのＣＤ１６３を有するという２つの変化が認められる（図３３Ａ）。他の細胞（赤ボックス）はＣＤ１６３を全く有しない。正常な個体は感染などに起因して広範囲の単球を有し得る（図３３Ｂ、ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１４が陽性の細胞）が、これらは悪性星状細胞腫を有する患者において上昇する。図３３Ｃにおけるヒストグラムは、患者の単球が不定にもそのＣＤ１４単球上に対照細胞（赤色ヒストグラム）よりも高レベルのＣＤ１６３を有することを示す。
【0119】
実施例１８：腫瘍浸潤性Ｍ２単球および野生型イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ＩＤＨ１）の状態は未分化星状細胞腫患者におけるＭＲＩによるガドリニウム増強および予後不良に関連する。
【0120】
腫瘍浸潤性Ｍ２単球、野生型ＩＤＨ１状態、および未分化星状細胞腫患者におけるＭＲＩによるガドリニウム増強は、予後不良に関連したより侵襲性の腫瘍を明確にする。ＩＤＨＲ１の突然変異Ｒ１３２Ｈ（Ａ）およびＣＤ１６３（Ｂ）を意図して、ホルマリン固定されたパラフィン包埋組織を染色した。ＦＬＡＩＲ（ＣおよびＤ、左パネル）およびガドリニウム増強されたＴ１荷重軸方向ＭＲＩ（ＣおよびＤ、右パネル）における代表的画像では、非増強でのＡＩＩＩ（ＩＤＨ１ Ｒ１３２Ｈ突然変異体グレードＩＩＩ）（Ｃ）腫瘍および増強でのＡＩＩＩ－Ｇ（多形神経膠芽腫の特徴を有するＩＤＨ１野生型グレードＩＩＩ）（Ｄ）腫瘍について示される。患者は、これら３つの上記パラメータ（Ａ～Ｄ）、具体的にはより侵襲性のＧＢＭに類似するＡＩＩＩおよびＡＩＩＩ－Ｇ（Ｅ、Ｆ、およびＧ）に基づいて数群に分割した。無作為に選択した増強ＭＲＩおよび非増強ＭＲＩでのＡＡ患者３８名におけるＩＤＨ１突然変異の存在（Ｒ１３２Ｈ＋）または不在（Ｒ１３２Ｈ－）についての結果をパネルＥに示す（ここでｎ．ｄ．は何も検出されないことを表す）。切除された腫瘍標本におけるＣＤ１６３＋細胞含有物は、自動化された細胞数計測システムを用いて数え上げた上で、パネルＦにて増強によって分別されたＡＡ標本について提示する。箱髭図が７５、５０、および２５パーセンタイルを示す一方、最大および最小データ値は上髭および下髭によって表す。群間の差の統計学的有意性は、マン・ホイットニー検定（＊＊＊，ｐ＜０．００１）によって評価した。彼らの腫瘍の侵襲性に基づいて分別された患者のカプラン・マイヤー生存曲線をパネルＧに提示する。群間の統計学的に有意な生存差（＊＊）は、ログランク（ｐ＝０．００１９）およびウィルコクソン検定（ｐ＝０．００８８）によって判定した。結果によると、ＩＤＨ Ｒ１３２Ｈ突然変異体グレードＩＩＩ星状細胞腫がガドリニウムで増強されることはまれであり、想定通り、腫瘍組織内でのＣＤ１６３＋Ｍ２細胞の蓄積が血管完全性の損失に関連することが示される。
【0121】
実施例１９：循環単球の数がＡＩＩＩおよびＡＩＩＩ－Ｇ患者において上昇し、Ｍ２マーカＣＤ１６３を上昇レベルで発現する。
無作為に選択したＷＨＯグレードＩＩＩ星状細胞腫患者１８名および正常ドナー２４名から得たＰＢＭＣをＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、およびＣＤ１６３に特異的な抗体で染色し、フローサイトメトリーによって評価した。フォワードスキャッター（ＦＳＣ）およびサイドスキャッター（ＳＳＣ）の特性を、ライブゲートを確立するために用い、単球をＣＤ１１ｂおよびＣＤ１４を発現する生細胞として規定した（図３５Ａ）。ライブゲートにおける代表的な等高線図ならびに正常およびＡＡドナーから得たＰＢＭＣにおけるＣＤ１１ｂおよびＣＤ１４陽性の分析を図３５Ａに示し、ここで軸はログスケールで示し、数はゲートされた細胞の頻度を示す。図３５Ｂは、フローサイトメトリーによって測定された、ＡＩＩＩを有する患者１２名、ＡＩＩＩ－Ｇを有する患者６名、および正常な個体２４名から得たＰＢＭＣにおけるＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１４＋単球の頻度を示す概要チャートである。正常な個体とＡＡ患者サブセットとの間の細胞百分率における差の統計学的有意性をスチューデントｔ検定によって評価した（＊＊，ｐ＜０．０１）。ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１４＋のゲートされた単球のＣＤ１６３染色における中央値蛍光強度（ＭＦＩ）が、図３５ＣにおいてＡＩＩＩ、ＡＩＩＩ－Ｇ、および正常血液標本の代表的なヒストグラムプロットから重ねてある。軸はログスケールとして示す。異なるドナー群から得たＰＢＭＣ試料中のゲートされた単球サブセットのＣＤ１６３染色におけるＭＦＩを図３５Ｄに示す。統計学的有意性は、分散分析により、続いてチューキーポストテストにより評価した（＊＊，ｐ＜０．０５）。ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１４＋単球が試験患者全員の循環中に同様に上昇したレベルで存在する一方、ＧＢＭ（多形神経膠芽腫；ＡＩＩＩ－Ｇ）により酷似するＡＩＩＩ腫瘍を有する患者の循環から得た細胞は、悪性度が低めのＡＩＩＩ腫瘍を有する患者および正常対象からの場合よりも高レベルのＣＤ１６３を進行性に発現する（図３５、ＣおよびＤ）。想定通り、循環単球における増加に起因して、グレードＩＩＩ星状細胞腫患者の血液中でのＣＤ３＋およびＣＤ２０＋リンパ球の頻度は正常な個体と比べて減少する。
無作為に選択したＷＨＯグレードＩＩＩ星状細胞腫患者１８名および正常ドナー２４名から得たＰＢＭＣをＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、およびＣＤ１６３に特異的な抗体で染色し、フローサイトメトリーによって評価した。フォワードスキャッター（ＦＳＣ）およびサイドスキャッター（ＳＳＣ）の特性を、ライブゲートを確立するために用い、単球をＣＤ１１ｂおよびＣＤ１４を発現する生細胞として規定した（図３５Ａ）。ライブゲートにおける代表的な等高線図ならびに正常およびＡＡドナーから得たＰＢＭＣにおけるＣＤ１１ｂおよびＣＤ１４陽性の分析を図３５Ａに示し、ここで軸はログスケールで示し、数はゲートされた細胞の頻度を示す。図３５Ｂは、フローサイトメトリーによって測定された、ＡＩＩＩを有する患者１２名、ＡＩＩＩ－Ｇを有する患者６名、および正常な個体２４名から得たＰＢＭＣにおけるＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１４＋単球の頻度を示す概要チャートである。正常な個体とＡＡ患者サブセットとの間の細胞百分率における差の統計学的有意性をスチューデントｔ検定によって評価した（＊＊，ｐ＜０．０１）。ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１４＋のゲートされた単球のＣＤ１６３染色における中央値蛍光強度（ＭＦＩ）が、図３５ＣにおいてＡＩＩＩ、ＡＩＩＩ－Ｇ、および正常血液標本の代表的なヒストグラムプロットから重ねてある。軸はログスケールとして示す。異なるドナー群から得たＰＢＭＣ試料中のゲートされた単球サブセットのＣＤ１６３染色におけるＭＦＩを図３５Ｄに示す。統計学的有意性は、分散分析により、続いてチューキーポストテストにより評価した（＊＊，ｐ＜０．０５）。ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１４＋単球が試験患者全員の循環中に同様に上昇したレベルで存在する一方、ＧＢＭ（多形神経膠芽腫；ＡＩＩＩ－Ｇ）により酷似するＡＩＩＩ腫瘍を有する患者の循環から得た細胞は、悪性度が低めのＡＩＩＩ腫瘍を有する患者および正常対象からの場合よりも高レベルのＣＤ１６３を進行性に発現する（図３５、ＣおよびＤ）。想定通り、循環単球における増加に起因して、グレードＩＩＩ星状細胞腫患者の血液中でのＣＤ３＋およびＣＤ２０＋リンパ球の頻度は正常な個体と比べて減少する。
【0122】
実施例２０：星状細胞腫エキソソーム上の共通抗原に結合する、ＡＩＩＩおよびＡＩＩＩ－Ｇ患者血清中に存在する抗体はアイソタイプ特性が異なる。
３つの星状細胞腫患者の原発性腫瘍細胞株から単離したエキソソームを９６ウェルプレート上にコーティングし、初期手術前に収集した患者血清（１３ＡＩＩＩ、８ＡＩＩＩ－Ｇ）および正常対照血清（４）とともにインキュベートした。結合抗体を蛍光結合全ＩｇＧ（図３６Ａ）またはＩｇＧアイソタイプに特異的な二次抗体（図３６Ｂ）で検出し、抗体結合の程度をＭＦＩとして測定した。データは、実施例１８に記載の箱髭図で個別対象からの値として示す。図３６Ａにおけるアスターリスクおよびバーは、分散分析、続いてダネット検定（ｐ＜０．０５）による判定としての正常な対照値と有意に異なる値を示す。図３６Ｂでは、分散分析およびチューキーポストテストにより正常対照値およびＡＩＩＩ患者値と統計学的に有意に異なるＡＩＩＩ－Ｇ患者から得た値の群が＊＊（ｐ＝０．００４）によって認められる。図３６Ａに示すように、これらのエキソソームと反応するＩｇＧ抗体もまた、グレードＩＩＩ星状細胞腫患者の大部分に由来する血清中に彼らの予後カテゴリーと無関係に存在する。しかし、アイソタイプに特異的な抗体を検出に用いるとき、我々は、Ｔｈ２関連ＩｇＧ２アイソタイプのエキソソーム結合抗体がＡＩＩＩ－Ｇにおいてより長寿命のＡＩＩＩ患者の場合と比べて有意に上昇することを認めた（図３６Ｂ）。ＩｇＧ１のレベルが後者の患者においてやや上昇する傾向があった一方、ＩｇＧ４のレベルはＡＩＩＩ－Ｇ患者においてやや上昇したものの、これらの差異のいずれも有意でなかった。
３つの星状細胞腫患者の原発性腫瘍細胞株から単離したエキソソームを９６ウェルプレート上にコーティングし、初期手術前に収集した患者血清（１３ＡＩＩＩ、８ＡＩＩＩ－Ｇ）および正常対照血清（４）とともにインキュベートした。結合抗体を蛍光結合全ＩｇＧ（図３６Ａ）またはＩｇＧアイソタイプに特異的な二次抗体（図３６Ｂ）で検出し、抗体結合の程度をＭＦＩとして測定した。データは、実施例１８に記載の箱髭図で個別対象からの値として示す。図３６Ａにおけるアスターリスクおよびバーは、分散分析、続いてダネット検定（ｐ＜０．０５）による判定としての正常な対照値と有意に異なる値を示す。図３６Ｂでは、分散分析およびチューキーポストテストにより正常対照値およびＡＩＩＩ患者値と統計学的に有意に異なるＡＩＩＩ－Ｇ患者から得た値の群が＊＊（ｐ＝０．００４）によって認められる。図３６Ａに示すように、これらのエキソソームと反応するＩｇＧ抗体もまた、グレードＩＩＩ星状細胞腫患者の大部分に由来する血清中に彼らの予後カテゴリーと無関係に存在する。しかし、アイソタイプに特異的な抗体を検出に用いるとき、我々は、Ｔｈ２関連ＩｇＧ２アイソタイプのエキソソーム結合抗体がＡＩＩＩ－Ｇにおいてより長寿命のＡＩＩＩ患者の場合と比べて有意に上昇することを認めた（図３６Ｂ）。ＩｇＧ１のレベルが後者の患者においてやや上昇する傾向があった一方、ＩｇＧ４のレベルはＡＩＩＩ－Ｇ患者においてやや上昇したものの、これらの差異のいずれも有意でなかった。
【0123】
実施例２１：Ｔｈ１およびＴｈ２免疫に一般に関連する可溶性因子はＡＩＩＩおよびＡＩＩＩ－Ｇ患者の血清中で各々上昇する
ガドリニウム増強ＭＲＩに基づいてＡＩＩＩ（ｎ＝１７）およびＡＩＩＩ－Ｇ（ｎ＝１３）サブセットに分離されたＡＡ患者由来の血清は、可溶性因子のレベルについてルミネックス（Ｌｕｍｉｎｅｘ）により評価した。個体標本における濃度は、実施例１８に記載のように箱髭図で示す。２群間の差の統計学的有意性をスチューデントｔ検定により評価した（＊＊＊＊，ｐ≦０．００１；＊＊，ｐ≦０．０１；＊，ｐ≦０．０５）。Ｔｈ２サイトカインＩＬ－１０およびＣＣＬ４の血清濃度は、ＧＢＭ特性を有するＡＩＩＩ腫瘍を有する患者において有意に上昇した一方、ＩＬ－９およびＴｈ１に関連したＩＬ－１２ Ｐ４０、ＣＸＣＬ１０、およびＦＬＴ３Ｌは残りのＡＩＩＩ患者において有意に上昇した（図３７）。
ガドリニウム増強ＭＲＩに基づいてＡＩＩＩ（ｎ＝１７）およびＡＩＩＩ－Ｇ（ｎ＝１３）サブセットに分離されたＡＡ患者由来の血清は、可溶性因子のレベルについてルミネックス（Ｌｕｍｉｎｅｘ）により評価した。個体標本における濃度は、実施例１８に記載のように箱髭図で示す。２群間の差の統計学的有意性をスチューデントｔ検定により評価した（＊＊＊＊，ｐ≦０．００１；＊＊，ｐ≦０．０１；＊，ｐ≦０．０５）。Ｔｈ２サイトカインＩＬ－１０およびＣＣＬ４の血清濃度は、ＧＢＭ特性を有するＡＩＩＩ腫瘍を有する患者において有意に上昇した一方、ＩＬ－９およびＴｈ１に関連したＩＬ－１２ Ｐ４０、ＣＸＣＬ１０、およびＦＬＴ３Ｌは残りのＡＩＩＩ患者において有意に上昇した（図３７）。
【0124】
実施例２２：白血球表現型マーカ、サイトカインおよびケモカイン受容体ならびにそれらのリガンドをコードする遺伝子のＰＢＭＣにおける発現のレベルはＡＩＩＩ患者とＡＩＩＩ－Ｇ患者との間で異なる。
【0125】
任意抽出したＡＡ患者１７名から得られたＰＢＭＣにおける単球表現型マーカ（図３８Ａ）、インターロイキン（図３８Ｂ）、インターロイキン受容体（図３８Ｃ）、ＣＣケモカイン（図３８Ｄ）および受容体（図３８Ｅ）、ならびにＣＸＣケモカイン（図３８Ｆ）および受容体（図３８Ｇ）における遺伝子のコピー数は、高スループット定量ＲＴ－ＰＣＲによって評価し、各試料中に存在するハウスキーピング遺伝子Ｌ１３ａのコピー数に正規化した。正規化されたコピー数に対して実施したＬＤＡを左側パネルに示す（各ドットは個別患者からのデータを表す）。個別のＡＩＩＩおよびＡＩＩＩ－Ｇ患者の分析の結果を表すドットは各々、青色および赤色に色付けする。各群に対する多変量平均は、平均の９５％信頼区間を表す、同様に色付けされた丸／楕円の中心での＋として示す。２つの患者コホートにおいて試験した各遺伝子における平均コピー数は各々、高発現レベル対低発現レベルに対応する赤色および緑色を用いたヒートマップとして付属する右側パネルに示し、また検出された遺伝子コピー数の範囲を関連のスケールバーにおいて示す。灰色ボックスは、検出可能な生成物を生成できなかった反応を表す。
【0126】
各マーカクラスの発現が２つの患者コホートを十分に分割し特徴づけるかを判定するため、線形判別分析（ＬＤＡ）を用いた。図３８Ａは、単球表現型マーカＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ６８、ＣＤ１６３、ＣＤ２０４、およびＣＤ２０６におけるＬＤＡの結果を示すとともに、対応する遺伝子発現レベルをヒートマップとして表す。ＡＩＩＩ－Ｇを有する患者から得たＰＢＭＣ試料中でのＣＤ１５、ＣＤ１６３およびＣＤ２０６に特異的なｍＲＮＡの発現レベルにおいて、従来のＡＩＩＩ腫瘍の場合と比べて中程度から高度な上昇（各々、８倍、３倍、５倍）が認められたが、後者におけるＣＤ１１ｂおよびＣＤ２０４転写物レベルにおいて認められた上昇はわずかであった（１．９倍）。単球表現型遺伝子の発現レベルのＬＤＡ分析によると、試験した１７の内の１４の症例が２つの患者コホートの内の一方に正確に分別された。フローサイトメトリーデータと一致するように、ＣＤ１６３が最も特徴的な表現型のｍＲＮＡマーカであることが判明した。２８のインターロイキン遺伝子について実施した類似のＬＤＡによると、１型関連サイトカインＩＬ－１５およびＩＬ－３２のみがＡＩＩＩ試料とＡＩＩＩ－Ｇ試料との間で有意に異なり（各々、ｐ＝０．０１１１およびｐ＝０．０１５２）、双方とも後者においてより低いという事実にもかかわらず、１００％の患者が彼らの適切なコホートに正確に分類された（図３８Ｂ）。他の遺伝子は、発現されないかまたは有意に異ならないレベルで発現されるかのいずれかであった。ＰＢＭＣにおける２２のインターロイキン受容体遺伝子ｍＲＮＡの痕跡の分析においても、ＡＩＩＩ患者とＡＩＩＩ－Ｇ患者との間で明確に区別された（図３８Ｃ）。これら遺伝子の大部分の転写物は、差次的に発現される場合、ＡＩＩＩ－ＧにおいてはＡＩＩＩ ＰＢＭＣの場合よりも低かった。特にＩＬ－２３ＲおよびＩＬ３１ＲＡは、ＡＩＩＩ試料中で有意により高レベルで発現された（各々、ｐ＝０．００５５およびｐ＝０．０３６０）。この分析に対してＰＢＭＣにおいて十分なレベルで発現された２１の内の１５のＣＣＬ遺伝子のｍＲＮＡレベルのＬＤＡでも、２つの患者コホートが区別された（図３８Ｄ）。発現増加における傾向は、ＡＩＩＩ試料中のＣＣＬ３、ＣＣＬ８、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２３およびＣＣＬ２８遺伝子において、またＡＩＩＩ－Ｇ試料中のＣＣＬ２、ＣＣＬ１１およびＣＣＬ１４遺伝子において検出された。しかし、利用可能な試料の場合、統計学的有意差はＣＣＬ３ ｍＲＮＡに限って得られ、それはＡＩＩＩにおいてＡＩＩＩ－ＧのＰＢＭＣと比べてより高レベルで存在した。ＣＣＲ遺伝子発現データのＬＤＡでも、患者が明確に区別された（図３８Ｅ）。大部分のＣＣＲ ｍＲＮＡにおいて、ＡＩＩＩ－Ｇ試料中でやや高めであったＣＣＲ４を除き、従来のＡＩＩＩ試料中で発現が高めの傾向があったが、有意に過剰発現したのはＣＣＲ１とＣＣＲ５の２つの遺伝子のみであった（各々、ｐ＝０．０２０６およびｐ＝０．０００３）。ＣＸＣＬ遺伝子発現データのＬＤＡによると、試験した１７の内の１５の症例が、ｍＲＮＡレベルにおける統計学的有意差がないにもかかわらず、異なる患者コホートに属するものとして正確に特徴づけられた（図３８Ｆ）。ＣＸＣＬ７（ＡＩＩＩ－Ｇ患者由来のＰＢＭＣにおいて上方制御された）に限り、ほぼ有意性のある差異が検出された（ｐ＝０．０６７３）。ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ１０、およびＣＸＣＬ１６転写物が従来のＡＩＩＩのＰＢＭＣにおいてより高レベルで検出されたが、ＡＩＩＩ－Ｇ試料との差異は有意でなかった。ＣＸＣケモカイン受容体の発現に基づくＬＤＡについては同等の結果が得られ、ここでは１７の内の１４のＡＡ症例が正確にサブグループ化された（図３８Ｇ）。ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ６、およびＣＸ３ＣＲ１転写物はＡＩＩＩ－Ｇにおいて過剰発現されることが見出されたが、有意レベルであるのはＣＸＣＲ３およびＣＸＣＲ６に限られた（各々、ｐ＝０．０１１１およびｐ＝０．０２０６）。古典的なＡＩＩＩ腫瘍を有する患者由来のＰＢＭＣにおいてＣＸＣＲ７のｍＲＮＡレベルのみが高めであったが、その差は分析試料の数の統計学的有意性に達しなかった。
【0127】
実施例２３：ＡＩＩＩおよびＡＩＩＩ－Ｇ患者サブセットは、ＰＢＭＣにおける選択された免疫学的関連遺伝子の発現によって正確に区別され得る
最初に、ＡＩＩＩおよびＡＩＩＩ－Ｇ患者のＰＢＭＣを最良に分別する、実施例２２に記載のように得られた遺伝子発現データを同定するため、判別分析を用いた（図３９Ａ）。次に、これらの遺伝子ＣＣＬ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ７、ＣＸＣＬ７、ＩＬ－１５、ＩＬ－３２、ＩＬ－１５Ｒ、ＩＬ－２１Ｒ、ＩＬ－２３Ｒ、ＩＬ－３１ＲＡ、およびＣＤ１６３のいずれが２つの患者コホートを区別するのに最も有効であるかを判定するため、主成分分析を用いた（図３９Ｂ）。判別および主成分プロットの双方は、各個体のＡＩＩＩおよびＡＩＩＩ－ＧのＰＢＭＣ標本に対する遺伝子に特異的な発現特性を用いて作成した（各々がドットの青色および赤色の色付けによって表される）。（Ａ）における緑色破線および（Ｂ）における緑色ベクトルは各々、基準および成分空間における遺伝子転写物の方向を表す。ＡＩＩＩ－Ｇ患者からのＡＩＩＩを最も確実に描写する遺伝子を同定するため、ＰＢＭＣからの検出可能なシグナルを用いて、９３すべての遺伝子のｍＲＮＡレベルに対してＬＤＡを実施した（図３９Ａ）。ＰＣＡ分析用に表９に詳述する１２の遺伝子を選択した（図３９Ｂ）。第１の主成分によって明示される全分散が３７％であった一方、第２の主成分は約２０％の全分散を明示した。ＰＣＡに基づき、Ｍ２マーカＣＤ１６３、炎症誘発性サイトカインＩＬ－３２、ならびに１型サイトカイン受容体ＩＬ－２１ＲおよびＩＬ－２３ＲのＰＢＭＣにおける発現レベルの評価は、異なるクラスのＡＩＩＩ腫瘍を有する患者間での明確な分別を得るのに十分である。
最初に、ＡＩＩＩおよびＡＩＩＩ－Ｇ患者のＰＢＭＣを最良に分別する、実施例２２に記載のように得られた遺伝子発現データを同定するため、判別分析を用いた（図３９Ａ）。次に、これらの遺伝子ＣＣＬ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ７、ＣＸＣＬ７、ＩＬ－１５、ＩＬ－３２、ＩＬ－１５Ｒ、ＩＬ－２１Ｒ、ＩＬ－２３Ｒ、ＩＬ－３１ＲＡ、およびＣＤ１６３のいずれが２つの患者コホートを区別するのに最も有効であるかを判定するため、主成分分析を用いた（図３９Ｂ）。判別および主成分プロットの双方は、各個体のＡＩＩＩおよびＡＩＩＩ－ＧのＰＢＭＣ標本に対する遺伝子に特異的な発現特性を用いて作成した（各々がドットの青色および赤色の色付けによって表される）。（Ａ）における緑色破線および（Ｂ）における緑色ベクトルは各々、基準および成分空間における遺伝子転写物の方向を表す。ＡＩＩＩ－Ｇ患者からのＡＩＩＩを最も確実に描写する遺伝子を同定するため、ＰＢＭＣからの検出可能なシグナルを用いて、９３すべての遺伝子のｍＲＮＡレベルに対してＬＤＡを実施した（図３９Ａ）。ＰＣＡ分析用に表９に詳述する１２の遺伝子を選択した（図３９Ｂ）。第１の主成分によって明示される全分散が３７％であった一方、第２の主成分は約２０％の全分散を明示した。ＰＣＡに基づき、Ｍ２マーカＣＤ１６３、炎症誘発性サイトカインＩＬ－３２、ならびに１型サイトカイン受容体ＩＬ－２１ＲおよびＩＬ－２３ＲのＰＢＭＣにおける発現レベルの評価は、異なるクラスのＡＩＩＩ腫瘍を有する患者間での明確な分別を得るのに十分である。
【0128】
【表9】
参照による援用
本明細書で参照されるすべての特許および出版物は、本明細書でそれら全体が参照により援用される。
【0129】
本明細書で考察される出版物は、あくまで本願の出願日に先立つそれらの開示を目的として提供される。本明細書中では、本開示が先行開示の理由からかかる出版物に先立つ権利が与えられないことの承認として決して解釈されるべきではない。
【図1】
【図2a】
【図2b】
【図3a】
【図3b】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20a】
【図20b】
【図20c】
【図20d】
【図20e】
【図20f】
【図21a】
【図21b】
【図21c】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26a】
【図26b】
【図26c】
【図26d】
【図27a】
【図27b】
【図28-1】
【図28-2】
【図29A】
【図29B】
【図29C】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33】
【図34-1】
【図34-2】
【図34-3】
【図34-4】
【図35】
【図36】
【図37】
【図38】
【図39】
【配列表】