特許 7429169 アズキ由来糖分解酵素阻害剤の製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-01-30

(45)【発行日】2024-02-07

(54)【発明の名称】アズキ由来糖分解酵素阻害剤の製造方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 36/48 20060101AFI20240131BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20240131BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240131BHJP

   A61K 31/7048 20060101ALI20240131BHJP

【ＦＩ】

A61K36/48

A61P3/10

A61P43/00 111

A61K31/7048

【請求項の数】 6

(21)【出願番号】P 2020134715

(22)【出願日】2020-08-07

(65)【公開番号】P2022030599

(43)【公開日】2022-02-18

【審査請求日】2022-10-07

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 第３６回三重大学定期記者懇談会にてアズキ由来糖代謝酵素阻害剤及びその製造方法に関する研究について公開（令和１年１０月３１日）

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｖｏｌｕｍｅ８４，Ｉｓｓｕｅ１１ Ｐａｇｅｓ ３１７２－３１７８にてアズキ由来糖代謝酵素阻害剤及びその製造方法に関する研究について公開（令和１年１０月１５日）

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 ２０１９年度日本食品科学工学会中部支部大会にてアズキ由来糖代謝酵素阻害剤及びその製造方法に関する研究について公開（令和１年１２月１４日）

(73)【特許権者】

【識別番号】390014904

【氏名又は名称】井村屋グループ株式会社

(73)【特許権者】

【識別番号】304026696

【氏名又は名称】国立大学法人三重大学

(74)【代理人】

【識別番号】100079050

【弁理士】

【氏名又は名称】後藤 憲秋

(74)【代理人】

【識別番号】100201879

【弁理士】

【氏名又は名称】加藤 大輝

(72)【発明者】

【氏名】中村 昌弘

(72)【発明者】

【氏名】近藤 修司

(72)【発明者】

【氏名】園 淳平

(72)【発明者】

【氏名】栗谷 健志

(72)【発明者】

【氏名】西尾 昌洋

(72)【発明者】

【氏名】梅川 逸人

【審査官】長部 喜幸

(56)【参考文献】

【文献】特開２００２－０２７９７９（ＪＰ，Ａ）

【文献】Journal of Food Science，2012年，Vol. 77，No. 9，p.C927-C933

【文献】日本栄養・食料学会誌，2009年，第６２巻第１号，３－１１ページ

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ ３６／００－３６／９０６８

Ａ６１Ｋ ３１／００－３１／８０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

水にアズキを浸漬して浸漬液を得る浸漬工程と、前記浸漬工程後に浸漬液と含水したアズキを分離し、浸漬液を回収する浸漬液回収工程と、回収した浸漬液を加熱する加熱工程とを行い、（＋）－カテキン ７－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノシドおよび（＋）－エピカテキン ７－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノシドを含有し、α－グルコシダーゼの酵素活性を阻害するアズキ由来糖分解酵素阻害剤の製造方法。

【請求項2】

前記浸漬工程における浸漬時間は、８～１２時間である請求項１に記載のアズキ由来糖分解酵素阻害剤の製造方法。

【請求項3】

前記浸漬工程におけるアズキの浸漬に使用する水の量は、アズキ重量と同量～２倍量である請求項１または２に記載のアズキ由来糖分解酵素阻害剤の製造方法。

【請求項4】

前記加熱工程における温度は、９０～１００℃である請求項１から３のいずれかに記載のアズキ由来糖分解酵素阻害剤の製造方法。

【請求項5】

前記加熱工程における加熱時間は、６０～１２０分間である請求項１から４のいずれかに記載のアズキ由来糖分解酵素阻害剤の製造方法。

【請求項6】

前記浸漬工程における浸漬時間は、８～１２時間であり、前記浸漬工程におけるアズキの浸漬に使用する水の量は、アズキ重量と同量～２倍量であり、前記加熱工程における温度は、９０～１００℃であり、前記加熱工程における加熱時間は、６０～１２０分間である請求項１に記載のアズキ由来糖分解酵素阻害剤の製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、アズキ由来糖分解酵素阻害剤の製造方法に関し、特に、糖の吸収に関与する糖分解酵素の活性阻害に有効に作用するアズキ由来抽出物の製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

アズキ（小豆：Ｖｉｇｎａ ａｎｇｕｌａｒｉｓ）は、主に煮熟（炊きあげ）による加熱により軟らかく加工され、赤飯等の料理の食材、あるいは、砂糖が加えられ「小倉あん」等の製菓用食材に加工され、古来より常食されてきた。アズキの果皮には、ポリフェノール、サポニン、さらには糖分子と結合した配糖体等も含有されていることが知られている。これらの成分は、アズキの煮汁、すなわち熱水抽出物からの分析を通じて、抗アレルギー活性、血糖降下活性、細胞接着阻害、高脂血症予防、骨代謝調節等の効果が報告されている（特許文献１等参照、非特許文献１、２、３、４、５等参照）。

【0003】

アズキに含有される成分をはじめとする天然物の内、特に糖代謝関連の成分、作用についての研究が進められている。特に、糖代謝の異常により血糖値の制御が困難となり、糖尿病の主要因となる。糖尿病が重症化すると、失明、末梢部位の壊死等を引き起こす。糖尿病は生活習慣病の一種であり、不規則な食生活、生活習慣の蓄積から発症が懸念される。そうすると、日常の食生活、生活習慣から対策を講ずることにより、発症を抑制できる可能性がある。

【0004】

この点を踏まえ、食品等に由来する天然物化合物に含有されるポリフェノールと糖代謝との関連性を示唆する知見が報告されている（非特許文献６、７等参照）。しかしながら、糖代謝と含有成分との具体的な関連性については未解明であった。その後、ポリフェノールのカテキン類と糖代謝酵素との関連性が報告されている（非特許文献８等参照）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【文献】特許第６０２３３９８号公報

【文献】特許第６０３１３２８号公報

【非特許文献】

【0006】

【文献】Ｔ．Ｉｔｏｈ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６８（１２），２４２１－２４２６（２００４）

【文献】Ｔ．Ｉｔｏｈ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６９（３），４４８－４５４（２００５）

【文献】Ｔ．Ｉｔｏｈ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ， ２５，１３４－１４１（２００９）

【文献】Ｔ．Ｉｔｏｈ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ， ２５，３１８－３２１（２００９）

【文献】Ｔ．Ｉｔｏｈ ｅｔ ａｌ．， Ｐｈｙｔｏｔｈｅｒ．Ｒｅｓ．，２６（７），１００３－１０１１（２０１２）

【文献】小嶋道之 他，日本食品科学工学会誌，第５４巻，第１号，５０－５３（２００７）

【文献】齊藤優介 他，日本食品科学工学会誌，第５４巻，第１２号，５６３－５６７（２００７）

【文献】Ｔａｅ Ｊｏｕｎｇ Ｈａ ｅｔ ａｌ．， Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２６６，４８３－４８９（２０１８）

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

一連の経緯を踏まえ、発明者は古来より常食されてきたアズキの種子に含有される成分について鋭意検討を重ねた結果、アズキ中のカテキン類が種類に応じて糖代謝（糖分解）に関連する酵素に作用する知見を得た。すなわち、アズキ中のカテキン類が糖代謝、高血糖の改善、予防に有効性を示す可能性を示唆する。

【0008】

本発明は前記の点に鑑みなされたものであり、アズキの種子に含有される成分を活用した糖分解酵素阻害剤の製造方法を提供する。

【課題を解決するための手段】

【0009】

上記目的を達成するものは、以下のものである。
（１）水にアズキを浸漬して浸漬液を得る浸漬工程と、浸漬液と含水したアズキを分離し、浸漬液を回収する浸漬液回収工程と、回収した浸漬液を加熱する加熱工程とを行い、（＋）－カテキン ７－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノシドおよび（＋）－エピカテキン ７－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノシドを含有し、α－グルコシダーゼの酵素活性を阻害するアズキ由来糖分解酵素阻害剤の製造方法。

【0010】

（２）前記浸漬工程における浸漬時間は、８～１２時間である上記（１）に記載のアズキ由来糖分解酵素阻害剤の製造方法。

【0011】

（３）前記浸漬工程におけるアズキの浸漬に使用する水の量は、アズキ重量と同量～２倍量である上記（１）または（２）に記載のアズキ由来糖分解酵素阻害剤の製造方法。

【0012】

（４）前記加熱工程における温度は、９０～１００℃である上記（１）から（３）のいずれかに記載のアズキ由来糖分解酵素阻害剤の製造方法。

【0013】

（５） 前記加熱工程における加熱時間は、６０～１２０分間である上記（１）から（４）のいずれかに記載のアズキ由来糖分解酵素阻害剤の製造方法。

【0014】

（６） 前記浸漬工程における浸漬時間は、８～１２時間であり、前記浸漬工程におけるアズキの浸漬に使用する水の量は、アズキ重量と同量～２倍量であり、前記加熱工程における温度は、９０～１００℃であり、前記加熱工程における加熱時間は、６０～１２０分間である上記（１）に記載のアズキ由来糖分解酵素阻害剤の製造方法。

【発明の効果】

【0016】

本発明は、水にアズキを浸漬して浸漬液を得る浸漬工程と、浸漬液と含水したアズキを分離し、浸漬液を回収する浸漬液回収工程と、回収した浸漬液を加熱する加熱工程とを行い、（＋）－カテキン ７－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノシドおよび（＋）－エピカテキン ７－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノシドを含有し、α－グルコシダーゼの酵素活性を阻害するアズキ由来糖分解酵素阻害剤の製造方法である。

【0017】

このため、（＋）－カテキン ７－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノシドおよび（＋）－エピカテキン ７－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノシドを含有するアズキ由来糖分解酵素阻害剤を製造できる。

【図面の簡単な説明】

【0018】

【図1】アズキ由来糖分解酵素阻害剤の調製を説明する概略工程図である。

【図2】抽出物の高速液体クロマトグラフィーのピークのチャートである。

【図3】Ｃ７ＧのＮＭＲスペクトルデータである。

【図4】Ｅ７ＧのＮＭＲスペクトルデータである。

【図5】カテキンのＮＭＲスペクトルデータである。

【図6】Ｃ７ＧとＥ７Ｇの高速液体クロマトグラフィーのピークのチャートである。

【発明を実施するための形態】

【0019】

実施形態のアズキ由来糖分解酵素阻害剤（糖分解調節アズキ由来抽出物）について、図１の概略工程図を用い、調製の過程を説明する。はじめに、未処理のアズキ〔小豆（Ａｄｚｕｋｉ ｂｅａｎｓ）：Ｖｉｇｎａ ａｎｇｕｌａｒｉｓ〕は、適宜水洗の後、水（実施形態においては超純水）に浸漬され、浸漬液が得られる（「浸漬工程」）。浸漬時間は季節の気温の変動を考慮して８ないし１２時間（８～１２時間）である。アズキの浸漬に使用する水の量は、アズキ重量と同量ないし２倍量（同量～２倍量）である。

【0020】

水への浸漬により生じた浸漬液は淡赤褐色を呈している。浸漬液と含水したアズキは分離（水切り）され浸漬液のみ回収される。通常、アズキの浸漬液（水浸漬液）は渋味等の雑味を除くため廃棄される。そして含水したアズキについては、その後加熱され、適量の砂糖等が添加されて製菓材料の一種である小倉あん等に加工される。実施形態のアズキ由来糖分解酵素阻害剤の着目点は、アズキのあんの製造に際して、一般的に廃棄されるアズキの浸漬液を出発点としていることである。

【0022】

浸漬液に対する７０ないし９０重量％のメタノール水溶液の添加は、後述する実施例における検出成分の相違に起因する。実施例における実験では、浸漬液に濃度勾配のメタノール（初期は０から徐々に１００とする）を添加してＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）に供した。そして、ピークの検出時のメタノールの濃度を規定した。

【0023】

さらに、分離工程に先立ち、浸漬液は加熱される（「加熱工程」）。浸漬液の加熱は煮沸温度であり、９０ないし１００℃（９０～１００℃）である。加熱時間は６０ないし１２０分間（６０～１２０分間）である。

【0024】

メタノール水溶液による分離により生じたメタノール上清は乾固され乾固物が得られる（「乾固工程」）。乾固により浸漬液に溶出した目的成分の粉末を得ることができる。こうして、加熱工程なしの乾固物（ａ）と加熱工程ありの乾固物（ｂ）の２系統が調製される。

【0025】

アズキの水浸漬液から調製された乾固物（ａ）及び乾固物（ｂ）には、式（１）の「（＋）－カテキン ７－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノシド」が共通して含有される。以降、当該カテキンを「Ｃ７Ｇ」と称する。Ｃ７Ｇの構造のカテキンは、植物由来の組成であり、アズキの水浸漬液における存在も確認された。

【0026】

【化1】

【0027】

加えて、加熱工程ありの乾固物（ｂ）については、式（２）の「（＋）－エピカテキン ７－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノシド」が含有される。以降、当該エピカテキンを「Ｅ７Ｇ」と称する。Ｅ７Ｇのエピカテキンは、後述実施例のＨＰＬＣによるピーク位置の分析から存在が確認された。Ｃ７ＧとＥ７Ｇは異性体の関係であり、Ｃ７Ｇが加熱を受けて一部の構造が変化しＥ７Ｇに至ったものと考えられる。

【0028】

【化2】

【0029】

一連の工程を踏まえてアズキの水浸漬液から調製された乾固物（乾固物（ａ）及び乾固物（ｂ））について、実施例のとおり、糖分解酵素の阻害の活性を示すことが見いだされた。従って、糖分解酵素の阻害活性の存在を根拠として、アズキの水浸漬由来の乾固物はアズキ由来糖分解酵素阻害剤として機能するといえる。

【0030】

糖代謝の作用機序については、概ね次のとおりである。ヒトが食事等により経口摂取した糖質（いわゆるデンプン、炭水化物）は、唾液、膵液中のα－アミラーゼによりまず二糖類に分解される。その後、二糖類は、小腸粘膜上皮細胞の刷子縁から分泌されるα－グルコシダーゼにより単糖類に分解され、小腸から吸収される。糖類の吸収後には、血糖値の急上昇となり、インシュリンの分泌と血糖値の急低下、さらには細胞内への過剰な糖の蓄積等の慢性疾患の原因となり得る。

【0031】

そのため、糖質の分解に関与するα－アミラーゼまたはα－グルコシダーゼの酵素活性を阻害することにより、最終産物である単糖の生成は低下し、血糖値の急上昇は抑制可能となり得る。現状、２型糖尿病の治療薬としてアカルボース（Ａｃａｒｂｏｓｅ）、ボグリボース（Ｖｏｇｌｉｂｏｓｅ）、ミグリトール（Ｍｉｇｌｉｔｏｌ）等が処方されている。そこで、前述のアズキ由来糖分解酵素阻害剤がこれらの治療薬、予防薬と同等に酵素活性阻害を発揮するとの実施例の知見から、糖尿病等の糖代謝の異常の予防に有効である。

【0032】

アズキ由来糖分解酵素阻害剤は、既存の糖尿病の治療薬と比較して、α－グルコシダーゼの酵素活性の阻害効果が高いことが見いだされる。さらに、アズキ由来糖分解酵素阻害剤に含有されるＣ７Ｇのカテキン及びＥ７Ｇのエピカテキンのカテキン類は、α－アミラーゼ及びα－グルコシダーゼの酵素活性を阻害する。特に、Ｅ７Ｇのエピカテキンはα－アミラーゼ及びα－グルコシダーゼに作用し、α－グルコシダーゼの酵素活性阻害の効果が高い。

【0033】

当該効果は新たな知見である。従前、カテキン類のポリフェノール、配糖体等による種々の薬理活性効果についてはある程度の関連性が報告されている。しかしながら、カテキン類の構造の相違により、酵素の種類毎に効果に差異が生じることが明らかとなった。従って、既存の２型糖尿病の治療薬の代替ないし補完の目的から、アズキ由来糖分解酵素阻害剤は極めて有望といえる。加えて、糖質由来の肥満改善への応用も期待される。

【0034】

アズキ由来糖代謝調節剤（糖代謝調節アズキ由来抽出物）を糖代謝異常、糖尿病の改善のための予防剤または治療剤として用いる場合、経口投与の剤型は錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、液剤等の適宜である。また、注射薬、座薬、点滴薬、スプレー薬、点鼻薬等とすることもできる。列記の薬剤においては、アズキ由来糖代謝調節剤を単独としても他の薬剤を加えて併用しても良い。

【0035】

本発明のアズキ由来糖代謝調節剤は、天然物であり、古くから食用されているアズキに由来する抽出物である。そのことから、アズキ由来糖代謝調節剤は常用する食品と馴染み良い。よって、新たにアズキ由来糖代謝調節剤を添加したアズキ由来糖代謝調節剤含有食品を作ることができる。

【0036】

アズキ由来糖代謝調節剤（糖代謝調節アズキ由来抽出物）を添加可能な食品は、具体的に、水ようかん、ようかん、小倉あん、どら焼き、アズキのムース、アイスクリーム、飴（キャンデー）、キャラメル、カスタードプディング、コーヒーゼリー、グミ、ババロア、マシュマロ、カステラ、ホットケーキ、クッキー、フルーツジュース、炭酸飲料等がある。さらにはサプリメントとなる錠剤等も挙げられる。

【0037】

列記のアズキ由来糖分解調節剤含有食品を製造するに際し、アズキ由来糖分解調節剤の含有量は、当該食品自体の味覚及び添加後の味の変化、他の添加成分、１回当たりの喫食量、喫食頻度、季節性、販売形態、さらに年齢、性別を加味した需要者層等を総合的に考慮して規定される。食品に添加するアズキ由来糖分解調節剤の量は自由であり、例えば０．０１重量％ないし５０重量％（０．０１重量％～５０重量％）としても良い。

【実施例】

【0038】

〔アズキ由来成分の抽出〕
原料となるアズキ（Ｖｉｇｎａ ａｎｇｕｌａｒｉｓ）に北海道産の小豆（品種：エリモショウズ）を用いた。所定量のアズキを軽く水洗し、アズキ重量と同重量の室温（およそ１５℃）の超純水し浸漬し１０時間静置した。浸漬後の浸漬液（上清）と含水したアズキとを分離した。浸漬液を２種類に取り分け、一方の浸漬液はそのままとした。他方の浸漬液を９０分間煮沸して室温に冷却した。こうして、アズキの水浸漬のみの浸漬液（以降、「上清（１）」と称する。）と、加熱済みの浸漬液（以降、「上清（２）」と称する。）の２種類を得た。上清（１）及び上清（２）はともに淡い紫褐色であった。

【0039】

〔ＨＰＬＣ分析〕
ＯＤＳカラム（ナカライテスク株式会社製，ＣＯＳＭＯＳＩＬ ５Ｃ１８－ＡＲ，４．６×１５０ｍｍ）を使用した。ＯＤＳカラムは分析に先立ちメタノールを通して平均化した。検出波長は２１０ｎｍとした。

【0040】

上清（１）または上清（２）のＨＰＬＣへの挿通（インジェクション）に際し、水（超純水）とメタノールの濃度勾配のメタノール水溶液を移動相に用いた（流速１ｍＬ／ｍｉｎ）。移動相の濃度勾配の制御にはＣＤＳ Ｌｉｔｅ（エル・エイソフト社製）を使用し８０分間記録した。

【0041】

移動相のグラジエントプログラムの条件は以下とした。
０ないし１５分目：超純水１００％を維持
１５ないし４５分目：超純水１００％からメタノール１００％に徐々に濃度上昇
４５ないし６０分目：メタノール１００％を維持
６０ないし７５分目：メタノール１００％から超純水１００％へ徐々に濃度降下
試料の挿通量は２μｇ（濃度０．２ｍｇ／ｍＬ，体積１０μＬ）ないし１０μｇ（濃度１ｍｇ／ｍＬ，体積１０μＬ）に調製した。

【0042】

図２はＨＰＬＣのピークチャートである。縦軸は検出電位（ｍＶ）、横軸はリテンションタイム（ｍｉｎ）である。「上段」のチャートは上清（１）のＨＰＬＣ検出結果であり、「下段」は上清（２）のＨＰＬＣ検出結果である。上段のリテンションタイムにピークＩとピークＩＩを検出した。。そして、下段のリテンションタイムにピークＩ、ピークＩＩ、ピークＩＩＩを検出した。

【0043】

上段の上清（１）のピークＩ及びＩＩに検出された成分と、下段の上清（２）のピークＩ、ＩＩ及びＩＩＩに検出された成分のそれぞれについて、対応するピークの位置に応じて単離し乾固した。

【0044】

〔糖分解酵素阻害作用の測定〕
はじめに上段の上清（１）（水浸漬）及び下段の上清（２）（水浸漬及び加熱）の両試料について、全体として（各成分を包含した状態として）、糖分解に関連する２種類の酵素活性に対する阻害効果を測定した。酵素として、α-アミラーゼ及びα-グルコシダーゼを使用した。

【0045】

・α－グルコシダーゼ活性阻害試験
α－グルコシダーゼ活性阻害試験に際し、９６ｗｅｌｌ（穴）プレートを使用し、酵母由来のα－グルコシダーゼを使用した。α－グルコシダーゼは０．２Ｕ／ｍＬに０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ６．７）により調製した。試験群には酵素溶液を５０μＬ／ｗｅｌｌ注入し、対照群にはリン酸緩衝液を５０μＬ／ｗｅｌｌ注入した。各ｗｅｌｌに対し、試料として０．００１ないし１０ｍｇ／ｍＬに調製した試料溶液をｗｅｌｌあたり５０μＬ添加した。３７℃、１０分間、事前インキュベートした後、１個のｗｅｌｌあたり２０μＬの基質溶液ＰＮＰＧ（ｐ－ニトロフェニル－β－Ｄ－グルコシド）溶液を添加し、３７℃、３０分間、インキュベートした。当該インキュベートの後、直ちに、１個のｗｅｌｌあたり１２０μＬの０．６Ｍ炭酸水素ナトリウム溶液を添加し、酵素反応を停止させた。反応停止後、すぐにプレートリーダー（ＡＷＡＲＥＮＥＳＳ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ Ｉｎｃ．製，ＣＨＲＯＭＡＴＥ ＭＯＤＥＬ４３００）を使用し、４０５ｎｍにおける吸光度を測定し、活性を算出した。なお、ＩＣ₅₀については以下の公式を用いた。結果は表１である。

【0046】

ＩＣ₅₀＝１０〔｛ｌｏｇ（Ａ／Ｂ）・（５０－Ｃ）・１／（Ｄ－Ｃ）｝
＋ｌｏｇ（Ｂ）〕
式中、Ａ：５０％を挟む２点のうち高い濃度
Ｂ：５０％を挟む２点のうち低い濃度
Ｃ：Ｂにおける阻害率
Ｄ：Ａにおける阻害率

【0047】

【表1】

【0048】

・α－アミラーゼ活性阻害試験
α－アミラーゼ活性阻害試験に際し、９６ｗｅｌｌ（穴）プレートを使用し、ブタ膵臓由来のα－アミラーゼを使用した。α－アミラーゼは０．６Ｕ／ｍＬに６０ｍＭの塩化ナトリウムを含む０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ６．７）により調製した。試験群には酵素溶液を５０μＬ／ｗｅｌｌ注入し、対照群には前出の塩化ナトリウムを含むリン酸緩衝液を５０μＬ／ｗｅｌｌ注入した。各ｗｅｌｌに対し、試料として０．００１ないし１０ｍｇ／ｍＬに調製した試料溶液をｗｅｌｌあたり５０μＬ添加した。３７℃、１０分間、事前インキュベートした後、１個のｗｅｌｌあたり２０μＬの基質溶液ＣＮＰ－Ｇ（２－クロロ－４－ニトロフェニル－α－Ｄ－マルトトリオシド）溶液を添加し、３７℃、３０分間、インキュベートした。当該インキュベートの後、直ちに、１個のｗｅｌｌあたり１２０μＬの０．６Ｍ炭酸水素ナトリウム溶液を添加し、酵素反応を停止させた。反応停止後、すぐにプレートリーダー（ＡＷＡＲＥＮＥＳＳ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ Ｉｎｃ．製，ＣＨＲＯＭＡＴＥ ＭＯＤＥＬ４３００）を使用し、４０５ｎｍにおける吸光度を測定し、活性を算出した。なお、ＩＣ₅₀については前出のα－グルコシダーゼ活性阻害試験と同じ公式を用いた。結果は表２である。

【0049】

【表2】

【0050】

〔糖分解酵素阻害作用の測定の考察〕
表１のα－グルコシダーゼ活性阻害試験の結果及び表２のα－アミラーゼ活性阻害試験より、いずれの酵素に対しても上清（１）（水浸漬）及び上清（２）（水浸漬及び加熱）はその濃度依存的に阻害活性を発揮した。従って、アズキの水浸漬液中に溶出した成分は、糖分解に関与する２種類の酵素に対して反応阻害を発揮することを確認した。

【0051】

〔溶出成分の構造決定〕
図２において、上段の上清（１）のピークＩ及びＩＩに検出された成分と、下段の上清（２）のピークＩ、ＩＩ及びＩＩＩに検出された成分のそれぞれについて、¹Ｈ－ＮＭＲを用い構造決定した。併せて、ＬＣ－ＭＳを用いて分子量を特定した。なお、¹Ｈ－ＮＭＲによる構造決定に際し、日本栄養・食糧学会誌，第６２巻，第１号，３－１１（２００９），堀他のスペクトルデータを参照した。構造帰属は表３のスペクトルデータを用いた。

【0052】

【表3】

【0053】

構造決定の結果、ピークＩＩの成分の構造はＣｏｍｐｏｕｎｄＩの「（＋）－カテキン ７－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノシド（Ｃ７Ｇ），ＭＷ：４５２」として構造決定した。Ｃ７ＧのＮＭＲのスペクトルは図３である。
ピークＩＩＩの成分の構造はＣｏｍｐｏｕｎｄＩＩの「（＋）－エピカテキン ７－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノシド（Ｅ７Ｇ），ＭＷ：４５２」として構造決定した。Ｅ７ＧのＮＭＲのスペクトルは図４である。
ピークＩの成分の構造はＣｏｍｐｏｕｎｄＩＩＩの「（＋）－カテキン，ＭＷ：２９０」として構造決定した。カテキンのＮＭＲのスペクトルは図５である。

【0054】

【化3】

【0055】

【化4】

【0056】

【化5】

【0057】

〔Ｃ７Ｇ，Ｅ７Ｇの糖分解酵素阻害作用の測定〕
アズキの水抽出物中はカテキンに加えてＣ７Ｇを含有し、さらに加熱後にＥ７Ｇも含有していることを確認した。そこで、Ｃ７ＧとＥ７Ｇの単独成分による糖分解酵素の阻害活性を測定した。測定手法は、前出のα－グルコシダーゼ活性阻害試験及びα－アミラーゼ活性阻害試験と同様とした。α－グルコシダーゼ活性阻害試験の結果は表４であり、α－アミラーゼ活性阻害試験の結果は表５である。

【0058】

【表4】

【0059】

【表5】

【0060】

〔Ｃ７Ｇ，Ｅ７Ｇの糖分解酵素阻害作用の測定の考察〕
Ｃ７Ｇ及びＥ７Ｇは、それぞれ単独においても糖分解に関与するα－アミラーゼとα－グルコシダーゼの両酵素に対しそれぞれ阻害活性を示すことが明らかとなった。また、Ｃ７ＧとＥ７Ｇは同様に濃度依存的ではあるものの、生化学的試験においてはＥ７Ｇの方がＣ７Ｇよりも酵素活性の阻害能力が高い傾向にある。

【0061】

〔Ｅ７Ｇの生成要因〕
前出の図２のＨＰＬＣのリテンションタイムのチャートより、上段の上清（１）と下段の上清（２）の相違は水浸漬のみか、水浸漬に加熱されていることである。ここで、Ｃ７ＧとＥ７Ｇは相互に同分子量であり、両分子は異性体の関係にある。そのため、Ｃ７Ｇが加熱されることにより、Ｃ７ＧからＥ７Ｇが生成するのかを確認した。

【0062】

分取したＣ７Ｇを超純水に溶解し（濃度０．０５ｍｇ／ｍＬ）、９０分間煮沸温度により加熱した。Ｃ７Ｇのみと、同Ｃ７Ｇの加熱後の２種類をＨＰＬＣにより検出した。ＯＤＳカラム（ナカライテスク株式会社製，ＣＯＳＭＯＳＩＬ ５Ｃ１８－ＡＲ，４．６×１５０ｍｍ）を使用した。ＯＤＳカラムは分析に先立ちメタノールを通して平均化した。検出波長は２１０ｎｍとした。

【0063】

Ｃ７Ｇのみと、同Ｃ７Ｇの加熱後の２種類のＨＰＬＣへの挿通（インジェクション量：１０μＬ）に際し、水（超純水）２０％とメタノール２０％のメタノール水溶液を移動相に用いた（流速１ｍＬ／ｍｉｎ）。ＨＰＬＣのリテンションタイムのピークは図６のチャートとなった。

【0064】

上段はＣ７Ｇのみの溶液のピークである。リテンションタイム３分を過ぎたあたりにＣ７Ｇのピークが存在する。下段はＣ７Ｇの加熱溶液のピークである。リテンションタイム３分を過ぎたあたりのＣ７Ｇのピークとともに、６分を過ぎたあたりにも別のピークが存在する。このピークを、単離したＥ７Ｇと比較検討を行った結果、Ｅ７Ｇであることが判明した。

【0065】

当該ＨＰＬＣの結果から、Ｃ７Ｇは加熱によりＥ７Ｇに変化することを確認した。さらに、Ｃ７Ｇの加熱とＥ７Ｇの生成との間において検量線を作成し、Ｃ７ＧからＥ７Ｇへの変化量を調べた。検量線から判断すると、Ｃ７Ｇの約２０％は加熱によりＥ７Ｇに変化したことが判明した。

【0066】

〔糖分解酵素阻害作用のまとめ〕
アズキを水に浸漬して得た抽出物として、上清（１）（乾固物（ａ））、上清（２）（乾固物（ｂ））、Ｃ７Ｇ、Ｅ７Ｇと、既存の２型糖尿病の治療薬としてアカルボース（Ａｃａｒｂｏｓｅ）のそれぞれについて、α－アミラーゼとα－グルコシダーゼの両酵素について５０％阻害濃度（ＩＣ₅₀）を求めた。既存薬のアカルボースを対照群としてアズキ抽出成分の良否を比較した。結果は表６である。

【0067】

【表6】

【0068】

アカルボースはα－アミラーゼに対して非常に強力に阻害活性を発揮している。これに対し、アズキ抽出成分の活性はアルカボースと比較して温和である。この中において、成分が単離されたＣ７ＧとＥ７Ｇは、単純な水抽出物、及びその加熱物と比較してより高い活性を示した。特に、生化学的試験においてはＥＧ７はＣ７Ｇと比較して阻害活性が高い。

【0069】

次にアカルボースのα－グルコシダーゼに対する阻害活性は、生化学的試験においてはアズキ抽出成分の全般に対してかなり劣る。さらに詳しく見ると、Ｃ７ＧとＥ７Ｇはα－グルコシダーゼに対し強力な阻害活性を有する。さらに、Ｅ７ＧはＣ７Ｇと比較してα－グルコシダーゼに対しより強力な阻害活性を有する傾向がある。

【0070】

このように、Ｅ７Ｇによるα－グルコシダーゼに対する阻害効果は初めての知見である。それゆえ、アズキの成分に由来する糖分解酵素、特にはα－グルコシダーゼの阻害効果は有用であり、アズキ由来糖分解酵素阻害剤として単独使用、もしくは既存薬との並行使用により、血糖値代謝異常、糖尿病等の予防、改善に大きく貢献することが期待できる。

【0071】

〔製剤例〕
アズキの水抽出物またはその加熱物であるアズキ由来糖分解酵素阻害剤を含有する薬剤を試作した。具体的には、アズキ由来糖分解酵素阻害剤は、乾固物（ａ）または乾固物（ｂ）、もしくは、Ｃ７ＧまたはＥ７Ｇの単独ないし混合物としても良い。左欄に組成、右欄に配合割合（重量パーセント表記）を開示する。むろん、剤型、配合量等は適宜である。

【0072】

〈製剤例１：錠剤〉
セルロース ３０．００
ステアリン酸カルシウム ２．５０
二酸化ケイ素 １．５０
デンプン粉末 ４９．４０
乳糖 １０．００
アズキ由来糖分解酵素阻害剤 ６．６０
（合計） １００．００

【0073】

〈製剤例２：カプセル剤〉
乳糖 ５０．００
アズキ由来糖分解酵素阻害剤 ５０．００
（合計） １００．００
上記の成分を公知のカプセル内に封入する。

【産業上の利用可能性】

【0074】

本発明のアズキの水抽出物またはその加熱物であるアズキ由来糖分解酵素阻害剤は、食品由来であるため、通常の食事から無理なく摂取が可能となる。また、有効成分を高めて薬剤とすることにより、糖代謝異常の改善に効果を有し予防、治療に有効な薬剤とすることができる。
（以上）

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】