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特許7429294骨格筋前駆細胞及びその精製方法、筋原性疾患を治療するための組成物、並びに骨格筋前駆細胞を含む細胞群の製造方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-01-30
(45)【発行日】2024-02-07
(54)【発明の名称】骨格筋前駆細胞及びその精製方法、筋原性疾患を治療するための組成物、並びに骨格筋前駆細胞を含む細胞群の製造方法
(51)【国際特許分類】
C12N 5/077 20100101AFI20240131BHJP
C12N 5/0775 20100101ALI20240131BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240131BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20240131BHJP
A61P 21/00 20060101ALI20240131BHJP
A61P 21/04 20060101ALI20240131BHJP
A61K 35/34 20150101ALI20240131BHJP
A61K 35/545 20150101ALN20240131BHJP
【ＦＩ】
C12N5/077
C12N5/0775 ZNA
C12N5/10
C12N15/12
A61P21/00
A61P21/04
A61K35/34
A61K35/545
【請求項の数】
20
(21)【出願番号】P 2022536398
(86)(22)【出願日】2021-07-13
(86)【国際出願番号】 JP2021026344
(87)【国際公開番号】W WO2022014604
(87)【国際公開日】2022-01-20
【審査請求日】2022-10-24
(31)【優先権主張番号】P 2020120226
(32)【優先日】2020-07-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】504132272
【氏名又は名称】国立大学法人京都大学
(73)【特許権者】
【識別番号】000000033
【氏名又は名称】旭化成株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100099759
【弁理士】
【氏名又は名称】青木 篤
(74)【代理人】
【識別番号】100123582
【弁理士】
【氏名又は名称】三橋 真二
(74)【代理人】
【識別番号】100108903
【弁理士】
【氏名又は名称】中村 和広
(74)【代理人】
【識別番号】100142387
【弁理士】
【氏名又は名称】齋藤 都子
(74)【代理人】
【識別番号】100135895
【弁理士】
【氏名又は名称】三間 俊介
(74)【代理人】
【識別番号】100197169
【弁理士】
【氏名又は名称】柴田 潤二
(72)【発明者】
【氏名】櫻井 英俊
(72)【発明者】
【氏名】趙 明明
(72)【発明者】
【氏名】加藤 弘毅
(72)【発明者】
【氏名】田積 充年
【審査官】山本 匡子
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１６／１０８２８８（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２０２０－５１９３１１（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２０１５／０２９９６５９（ＵＳ，Ａ１）
【文献】特表２０２０－５００５１２（ＪＰ，Ａ）
【文献】ALEXANDER , MS. et al.，CD82 Is a Marker for Prospective Isolation of Human Muscle Satellite Cells and Is Linked to Muscular Dystrophies，Cell Stem Cell，2016年12月01日，Vol.19, No.6，p.800-807，doi: 10.1016/j.stem.2016.08.006
【文献】SAKAI-TAKEMURA, F. et al.，Premyogenic progenitors derived from human pluripotent stem cells expand in floating culture and differentiate into transplantable myogenic progenitors，Sci Rep.，2018年04月26日，8(1)6555，doi: 10.1038/s41598-018-24959-y
【文献】櫻井 英俊，筋疾患に対する他家細胞移植治療製剤の開発，日本医療研究開発機構 医療分野研究成果展開事業 産学連携医療イノベーション創出プログラム セットアップスキーム（ACT-MS）事後評価報告書，2020年08月26日，http://tokkyo.shinsakijuhttps://www.amed.go.jp/content/000070938.pdf
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００－９０
Ｃ１２Ｎ ５／００－２８
Ｃ１２Ｑ
ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＣＡＰＬＵＳ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｐａｘ７陽性であり、細胞表面においてＣＤ１４６（ＭＣＡＭ）が陽性であり、かつＣＤ５７が陰性である骨格筋前駆細胞を３０％以上含む細胞群を含む、筋原性疾患を治療するための組成物。
【請求項2】
前記骨格筋前駆細胞が多能性幹細胞由来である、請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
前記多能性幹細胞が、ＥＳ細胞、ｎｔＥＳ細胞及びｉＰＳ細胞からなる群から選択される、請求項２に記載の組成物。
【請求項4】
前記骨格筋前駆細胞が、培養系において、ミオシン重鎖（ＭＨＣ）陽性の骨格筋細胞に分化し、さらに多核の骨格筋細胞へ成熟し得る、請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項5】
生体における適用部位において、線維化を誘発しないことを特徴とする、請求項１～４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項6】
前記筋原性疾患が、筋ジストロフィーである、請求項１～５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項7】
医薬的に許容され得る担体を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項8】
骨格筋前駆細胞を精製する方法であって、骨格筋前駆細胞を含む細胞集団から、細胞表面において、ＣＤ１４６（ＭＣＡＭ）が陽性であり、かつ、ＣＤ５７が陰性である細胞群を回収する工程、
を含む、方法。
【請求項9】
前記細胞群が、Ｐａｘ７陽性の骨格筋前駆細胞を３０％以上含む、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
前記工程が、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）法又は磁気細胞選別（ＭＡＣＳ）法によって実施される、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項11】
前記細胞集団が多能性幹細胞由来である、請求項８～１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項12】
前記多能性幹細胞が、ＥＳ細胞、ｎｔＥＳ細胞及びｉＰＳ細胞からなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
請求項８～１２のいずれか一項に記載の方法に使用するためのキットであって、ＣＤ１４６（ＭＣＡＭ）に特異的に結合する結合剤、及びＣＤ５７に特異的に結合する結合剤を含む、キット。
【請求項14】
骨格筋前駆細胞を含む細胞群を製造する方法であって、骨格筋前駆細胞を含む細胞集団から、細胞表面において、ＣＤ１４６（ＭＣＡＭ）が陽性であり、かつ、ＣＤ５７が陰性である細胞群を回収する工程
を含む、方法。
【請求項15】
前記細胞群が、Ｐａｘ７陽性の骨格筋前駆細胞を３０％以上含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
前記工程が、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）法又は磁気細胞選別（ＭＡＣＳ）法によって実施される、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項17】
前記細胞集団が多能性幹細胞由来である、請求項１４～１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
前記多能性幹細胞が、ＥＳ細胞、ｎｔＥＳ細胞及びｉＰＳ細胞からなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
請求項１４～１８のいずれか一項に記載の方法に使用するためのキットであって、ＣＤ１４６（ＭＣＡＭ）に特異的に結合する結合剤、及びＣＤ５７に特異的に結合する結合剤を含む、キット。
【請求項20】
請求項１５に記載の方法によって得られる骨格筋前駆細胞を含む細胞群を含む、筋原性疾患を治療するための組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、骨格筋前駆細胞及びそれを含む筋原性疾患を治療するための組成物に関する。また、本発明は、骨格筋前駆細胞を精製する方法及び骨格筋前駆細胞を含む細胞群を製造する方法に関する。本願は、２０２０年７月１３日に出願された日本国特許出願第２０２０－１２０２２６号に基づく優先権を主張するものであり、ここに参照することによって、その全体が本明細書中へ組み込まれるものとする。
【背景技術】
【0002】
胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や、体細胞へ未分化細胞特異的遺伝子を導入することで得られる人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）などの多能性を有する細胞が報告されて以来、筋原性疾患の治療方法、とりわけ、筋ジストロフィーの治療方法として、これらの多能性幹細胞から分化誘導された骨格筋前駆細胞を移植する治療法が注目されている。
【0003】
これまで、多能性幹細胞から骨格筋前駆細胞を分化誘導する方法として、（１）単一のヒトＥＳ細胞を浮遊培養により増殖させた細胞を無血清培養液中で接着培養した後、ＣＤ７３陽性細胞を単離しさらに培養した後、ＮＣＡＭ陽性細胞を単離し増殖する方法（非特許文献１）、（２）５－Ａｚａｃｙｔｉｄｉｎｅ（脱メチル化剤）で処理したヒトＥＳ細胞を浮遊培養して胚様体を形成させた後、さらに接着培養する方法（非特許文献２）、（３）多能性幹細胞を浮遊培養し、次いで接着培養を行い、その後解離して再び接着培養を行う方法（特許文献１）、（４）ＴＧＦ－β阻害剤、ＧＳＫ３β阻害剤、ＨＧＦ、ｂＦＧＦ及びＩＧＦ１を含む培養液中で、多能性幹細胞を培養する方法（特許文献２）などが知られている。現在、これらの方法によって誘導された骨格筋前駆細胞を臨床応用するための研究が行われている。
【0004】
多能性幹細胞から骨格筋前駆細胞を分化誘導した場合、未分化の多能性幹細胞や、骨格筋前駆細胞以外の細胞が、分化誘導後の細胞集団に含まれるため、臨床に用いるためには目的の骨格筋前駆細胞の収率と純度を上げる精製方法が必要となる。多能性幹細胞から分化誘導した骨格筋前駆細胞を精製する方法として、その細胞表面マーカーであるＣＤ８２及びＣＤ５７を利用し、ＣＤ８２陽性かつＣＤ５７陰性の細胞を単離する方法が知られている（非特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【文献】特表２０１３－５２７７４６号公報
【文献】国際公開第２０１６／１０８２８８号
【非特許文献】
【0006】
【文献】Ｂａｒｂｅｒｉ Ｔ， ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ Ｍｅｄ． １３：６４２－８， ２００７
【文献】Ｚｈｅｎｇ ＪＫ， ｅｔ ａｌ． Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ． １６：７１３－２２， ２００６
【文献】Ｍａｔｔｈｅｗ Ｓ． Ａｌｅｘａｎｄｅｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ １９， １， ２０１６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明の目的は、臨床応用に適した品質を有する、骨格筋前駆細胞、及びその精製方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明者らは、上記の課題を解決すべく、鋭意研究を重ねた結果、特定の細胞表面マーカーを用いた精製法により、臨床応用に適した品質を有する骨格筋前駆細胞の収率及び純度を高めることに成功した。また、本発明者らは、そのような方法により得られた骨格筋前駆細胞又はそれを含む組成物が、生体における適用部位において、損傷した筋線維を再生しかつ線維化を誘発しないという極めて顕著な効果を発揮するということを見出し、本発明を完成するに至った。
【0009】
すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］ Ｐａｘ７陽性であり、細胞表面においてＣＤ１４６（ＭＣＡＭ）が陽性であり、かつＣＤ５７が陰性である骨格筋前駆細胞。
［２］ 多能性幹細胞由来である、項目１に記載の骨格筋前駆細胞。
［３］ 前記多能性幹細胞が、ＥＳ細胞、ｎｔＥＳ細胞及びｉＰＳ細胞からなる群から選択される、項目２に記載の骨格筋前駆細胞。
［４］ 培養系において、ミオシン重鎖（ＭＨＣ）陽性の骨格筋細胞に分化し、さらに多核の骨格筋細胞へ成熟し得る、項目１～３のいずれか一項に記載の骨格筋前駆細胞。
［１］ Ｐａｘ７陽性であり、細胞表面においてＣＤ１４６（ＭＣＡＭ）が陽性であり、かつＣＤ５７が陰性である骨格筋前駆細胞。
［２］ 多能性幹細胞由来である、項目１に記載の骨格筋前駆細胞。
［３］ 前記多能性幹細胞が、ＥＳ細胞、ｎｔＥＳ細胞及びｉＰＳ細胞からなる群から選択される、項目２に記載の骨格筋前駆細胞。
［４］ 培養系において、ミオシン重鎖（ＭＨＣ）陽性の骨格筋細胞に分化し、さらに多核の骨格筋細胞へ成熟し得る、項目１～３のいずれか一項に記載の骨格筋前駆細胞。
【0010】
［５］ 項目１～４のいずれか一項に記載の骨格筋前駆細胞を含む細胞群を含む、筋原性疾患を治療するための組成物。
［６］ 前記細胞群が、前記骨格筋前駆細胞を３０％以上含む、項目５に記載の組成物。
［７］ 生体における適用部位において、線維化を誘発しないことを特徴とする、項目５又は６に記載の組成物。
［８］ 前記細胞群が多能性幹細胞由来である、項目５～７のいずれか一項に記載の組成物。
［９］ 前記多能性幹細胞が、ＥＳ細胞、ｎｔＥＳ細胞及びｉＰＳ細胞からなる群から選択される、項目８に記載の組成物。
［１０］ 前記筋原性疾患が、筋ジストロフィーである、項目５～９のいずれか一項に記載の組成物。
［１１］ 医薬的に許容され得る担体を含む、項目５～１０のいずれか一項に記載の組成物。
［６］ 前記細胞群が、前記骨格筋前駆細胞を３０％以上含む、項目５に記載の組成物。
［７］ 生体における適用部位において、線維化を誘発しないことを特徴とする、項目５又は６に記載の組成物。
［８］ 前記細胞群が多能性幹細胞由来である、項目５～７のいずれか一項に記載の組成物。
［９］ 前記多能性幹細胞が、ＥＳ細胞、ｎｔＥＳ細胞及びｉＰＳ細胞からなる群から選択される、項目８に記載の組成物。
［１０］ 前記筋原性疾患が、筋ジストロフィーである、項目５～９のいずれか一項に記載の組成物。
［１１］ 医薬的に許容され得る担体を含む、項目５～１０のいずれか一項に記載の組成物。
【0011】
［１２］ 骨格筋前駆細胞を精製する方法であって、
骨格筋前駆細胞を含む細胞集団から、細胞表面において、ＣＤ１４６（ＭＣＡＭ）が陽性であり、かつ、ＣＤ５７が陰性である細胞群を回収する工程、
を含む、方法。
［１３］ 前記細胞群が、Ｐａｘ７陽性の骨格筋前駆細胞を３０％以上含む、項目１２に記載の方法。
［１４］ 前記工程が、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）法又は磁気細胞選別（ＭＡＣＳ）法によって実施される、項目１２又は１３に記載の方法。
［１５］ 前記細胞集団が多能性幹細胞由来である、項目１２～１４のいずれか１項に記載の方法。
［１６］ 前記多能性幹細胞が、ＥＳ細胞、ｎｔＥＳ細胞及びｉＰＳ細胞からなる群から選択される、項目１５に記載の方法。
骨格筋前駆細胞を含む細胞集団から、細胞表面において、ＣＤ１４６（ＭＣＡＭ）が陽性であり、かつ、ＣＤ５７が陰性である細胞群を回収する工程、
を含む、方法。
［１３］ 前記細胞群が、Ｐａｘ７陽性の骨格筋前駆細胞を３０％以上含む、項目１２に記載の方法。
［１４］ 前記工程が、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）法又は磁気細胞選別（ＭＡＣＳ）法によって実施される、項目１２又は１３に記載の方法。
［１５］ 前記細胞集団が多能性幹細胞由来である、項目１２～１４のいずれか１項に記載の方法。
［１６］ 前記多能性幹細胞が、ＥＳ細胞、ｎｔＥＳ細胞及びｉＰＳ細胞からなる群から選択される、項目１５に記載の方法。
【0012】
［１７］ 項目１２～１６のいずれか一項に記載の方法に使用するためのキットであって、ＣＤ１４６（ＭＣＡＭ）に特異的に結合する結合剤、及びＣＤ５７に特異的に結合する結合剤を含む、キット。
【0013】
［１８］ 骨格筋前駆細胞を含む細胞群を製造する方法であって、
骨格筋前駆細胞を含む細胞集団から、細胞表面において、ＣＤ１４６（ＭＣＡＭ）が陽性であり、かつ、ＣＤ５７が陰性である細胞群を回収する工程
を含む、方法。
［１９］ 前記細胞群が、Ｐａｘ７陽性の骨格筋前駆細胞を３０％以上含む、項目１８に記載の方法。
［２０］ 前記工程が、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）法又は磁気細胞選別（ＭＡＣＳ）法によって実施される、項目１８又は１９に記載の方法。
［２１］ 前記細胞集団が多能性幹細胞由来である、項目１８～２０のいずれか一項に記載の方法。
［２２］ 前記多能性幹細胞が、ＥＳ細胞、ｎｔＥＳ細胞及びｉＰＳ細胞からなる群から選択される、項目２１に記載の方法。
骨格筋前駆細胞を含む細胞集団から、細胞表面において、ＣＤ１４６（ＭＣＡＭ）が陽性であり、かつ、ＣＤ５７が陰性である細胞群を回収する工程
を含む、方法。
［１９］ 前記細胞群が、Ｐａｘ７陽性の骨格筋前駆細胞を３０％以上含む、項目１８に記載の方法。
［２０］ 前記工程が、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）法又は磁気細胞選別（ＭＡＣＳ）法によって実施される、項目１８又は１９に記載の方法。
［２１］ 前記細胞集団が多能性幹細胞由来である、項目１８～２０のいずれか一項に記載の方法。
［２２］ 前記多能性幹細胞が、ＥＳ細胞、ｎｔＥＳ細胞及びｉＰＳ細胞からなる群から選択される、項目２１に記載の方法。
【0014】
［２３］ 項目１８～２２のいずれか一項に記載の方法に使用するためのキットであって、ＣＤ１４６（ＭＣＡＭ）に特異的に結合する結合剤、及びＣＤ５７に特異的に結合する結合剤を含む、キット。
【0015】
［２４］ 項目１８～２２のいずれか一項に記載の方法によって得られる骨格筋前駆細胞を含む細胞群。
【0016】
［２５］ 筋原性疾患の治療に使用するための細胞群であって、前記細胞群が、Ｐａｘ７陽性であり、細胞表面においてＣＤ１４６（ＭＣＡＭ）が陽性であり、かつＣＤ５７が陰性である骨格筋前駆細胞を含む、細胞群。
【0017】
［２６］ 筋原性疾患を治療するための医薬の製造における細胞群の使用であって、
前記細胞群が、Ｐａｘ７陽性であり、細胞表面においてＣＤ１４６（ＭＣＡＭ）が陽性であり、かつＣＤ５７が陰性である骨格筋前駆細胞を含む、使用。
前記細胞群が、Ｐａｘ７陽性であり、細胞表面においてＣＤ１４６（ＭＣＡＭ）が陽性であり、かつＣＤ５７が陰性である骨格筋前駆細胞を含む、使用。
【0018】
［２７］ 筋原性疾患を罹患する対象を治療する方法であって、
Ｐａｘ７陽性であり、細胞表面においてＣＤ１４６（ＭＣＡＭ）が陽性であり、かつＣＤ５７が陰性である骨格筋前駆細胞を含む細胞群を、それを必要とする対象に投与すること、を含む、方法。
Ｐａｘ７陽性であり、細胞表面においてＣＤ１４６（ＭＣＡＭ）が陽性であり、かつＣＤ５７が陰性である骨格筋前駆細胞を含む細胞群を、それを必要とする対象に投与すること、を含む、方法。
【発明の効果】
【0019】
本発明により提供される、骨格筋前駆細胞は、生体における適用部位において、線維化を誘発せずに筋原性疾患を罹患する対象を治療することを可能とする。
【図面の簡単な説明】
【0020】
【図1】Ｐａｘ７の発現と連携して蛍光タンパク質Ｖｅｎｕｓを発現するヒトｉＰＳ細胞（ｓ０１－Ｐａｘ７－Ｖｅｎｕｓ）を分化誘導して得た骨格筋前駆細胞を含む細胞集団からＦＡＣＳ解析によりＰａｘ７陽性ＣＤ５７陰性細胞およびＰａｘ７陰性細胞を選別した後、ＲＮＡ－ｓｅｑにより遺伝子の発現量を測定した結果である。
【図2】Ｐａｘ７の発現と連携して蛍光タンパク質Ｖｅｎｕｓを発現するヒトｉＰＳ細胞（ｓ０１－Ｐａｘ７－Ｖｅｎｕｓ）を分化誘導して得た骨格筋前駆細胞を含む細胞集団からＦＡＣＳ解析により選別したＰａｘ７陽性細胞における細胞表面タンパク質の発現を解析した結果である。（ａ）はＣＤ２０７、（ｂ）はＦＧＦＲ４および（ｃ）はＭＣＡＭに対する抗体で解析した。
【図3】ヒトｉＰＳ細胞を分化誘導して得た骨格筋前駆細胞を含む細胞集団からＦＡＣＳによりＣＤ５７陽性細胞、ＭＣＡＭ陽性ＣＤ５７陰性細胞およびＭＣＡＭ陰性ＣＤ５７陰性細胞を選別した後、遺伝子の発現量を定量した結果である。（ａ）はＰａｘ７遺伝子の結果、（ｂ）はＭｙｏＤ遺伝子の結果、（ｃ）はＴＦＡＰ２Ａ遺伝子の結果、（ｄ）はＰＤＧＦＲα遺伝子の結果を示す。データはバルク（選別前）での発現量に対する比率で算出し、平均±ＳＥで示す。
【図4a】ヒトｉＰＳ細胞を分化誘導して得た骨格筋前駆細胞を含む細胞集団からＦＡＣＳによりＣＤ５７陽性細胞、ＭＣＡＭ陽性ＣＤ５７陰性細胞およびＭＣＡＭ陰性ＣＤ５７陰性細胞を選別し、筋管細胞へ分化誘導後にＭｙｏｓｉｎ Ｈｅａｖｙ Ｃｈａｉｎ（ＭＨＣ）の発現を観察および定量した結果である。（ａ）は明視野およびＭＨＣ抗体による免疫染色の結果である。
【図4b】ヒトｉＰＳ細胞を分化誘導して得た骨格筋前駆細胞を含む細胞集団からＦＡＣＳによりＣＤ５７陽性細胞、ＭＣＡＭ陽性ＣＤ５７陰性細胞およびＭＣＡＭ陰性ＣＤ５７陰性細胞を選別し、筋管細胞へ分化誘導後にＭｙｏｓｉｎ Ｈｅａｖｙ Ｃｈａｉｎ（ＭＨＣ）の発現を観察および定量した結果である。（ｂ）は図４ａから算出したＭＨＣ陽性細胞の比率を定量した結果である。データは平均±ＳＥで示す。
【図5】ヒトｉＰＳ細胞を分化誘導して得た骨格筋前駆細胞を含む細胞集団からＦＡＣＳによりＣＤ８２陽性ＣＤ５７陰性細胞およびＭＣＡＭ陽性ＣＤ５７陰性細胞を選別した後、重度免疫不全を併せ持つ筋ジストロフィー（ＤＭＤ／ＮＳＧ）マウスの腓腹筋へ移植した４週後の組織像の結果である。（ａ）は移植部位におけるジストロフィン（緑色）、ラミニンα２（白色）、ラミンＡ／Ｃ（赤色）および細胞核（青色）の免疫染色像を示す。（ｂ）はジストロフィン陽性筋線維数を示す。
【図6】ヒトｉＰＳ細胞を分化誘導して得た骨格筋前駆細胞を含む細胞集団からＦＡＣＳによりＣＤ８２陽性ＣＤ５７陰性細胞もしくはＭＣＡＭ陽性ＣＤ５７陰性細胞を選別した後、重度免疫不全を併せ持つ筋ジストロフィー（ＤＭＤ／ＮＳＧ）マウスの腓腹筋へ移植した４週後の組織像の結果である。上段はラミンＡ／Ｃ（緑色）、ラミニンα２（白色）の免疫染色像、下段がＨＥ染色像を示す。
【図7a】ヒトｉＰＳ細胞を分化誘導して得た骨格筋前駆細胞を含む細胞集団からＦＡＣＳによりＣＤ８２陽性ＣＤ５７陰性細胞もしくはＭＣＡＭ陽性ＣＤ５７陰性細胞を選別した後、重度免疫不全を併せ持つ筋ジストロフィー（ＤＭＤ／ＮＳＧ）マウスの腓腹筋へ移植した４週後の組織像の結果である。（ａ）の上段はラミンＡ／Ｃ（緑色）、ラミニンα２（白色）の免疫染色像、下段はＳｉｒｉｕｓ Ｒｅｄ染色像を示す。
【発明を実施するための形態】
【0021】
本発明を以下に詳細に説明する。
【0022】
特段の定義がない限り、本明細書で使用する用語（技術的用語および科学的用語）は、当業者が一般に理解している用語と同一の意味を有する。
【0023】
本発明は、骨格筋前駆細胞及びそれを含む筋原性疾患を治療するための組成物、骨格筋前駆細胞を精製する方法、骨格筋前駆細胞を含む細胞群を製造する方法及び筋原性疾患を罹患する対象を治療する方法に関する。
【0024】
本明細書において、「骨格筋」とは、成熟筋を意味し、筋繊維すなわち多核細胞である筋細胞を含む。また、本明細書において、一般的な骨格筋前駆細胞を指す文脈において用いられる「骨格筋前駆細胞」とは、成熟した筋細胞へは至っていないもののその前段階にある細胞であって、筋細胞へ選択的に分化し得る能力を有する細胞を意味するが、骨芽細胞や脂肪細胞などの他の中胚葉細胞への分化能を全く有しないことを意味するものではなく、場合によっては、筋細胞以外の細胞への分化能を有している細胞も骨格筋前駆細胞に包含され得る。一般的に、骨格筋前駆細胞は、特定の遺伝子の発現によって特徴づけられ、例えば、ＭｙｏＤ、Ｍｙｆ５、Ｐａｘ７、Ｍｙｏｇｅｎｉｎ、ミオシン重鎖（ＭＨＣ）、ＮＣＡＭ、Ｄｅｓｍｉｎ、ＳｋＭＡｃｔ、Ｍ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｆｇｆｒ４およびＶＣＡＭＥ１などのマーカー遺伝子の発現を検出することによって同定可能である。骨格筋前駆細胞のうち、本発明で使用され得る骨格筋前駆細胞は、少なくとも、Ｐａｘ７陽性であり、細胞表面においてＣＤ１４６（ＭＣＡＭ）が陽性であり、かつＣＤ５７が陰性であるという特徴を有しており、生体に適用した場合、その適用部位において線維化を誘発しないという極めて優れた効果を発揮する。また、本発明の骨格筋前駆細胞は、培養系において、ミオシン重鎖（ＭＨＣ）陽性の骨格筋細胞に分化し、さらに多核の骨格筋細胞へ成熟し得る。従って、本発明の骨格筋前駆細胞を移植した場合、被移植組織において、効率的に骨格筋細胞へと成熟し、治療効果を発揮し得る。
【0025】
本発明に含まれる骨格筋前駆細胞は、特に断りがない限り、骨格筋幹細胞および／またはサテライト細胞を含んでいる。
【0026】
本明細書において、「骨格筋幹細胞」とは、自己複製能を有し、骨格筋の損傷時には筋芽細胞への分化・増殖し、傷んだ筋線維に融合して修復する性質を有する細胞をいい、成熟した筋肉に見られる「サテライト細胞」も骨格筋幹細胞に含まれる。「骨格筋幹細胞」及び「サテライト細胞」は、その発現マーカーとしてＰａｘ７が発現することが知られている。
【0027】
本発明において、表面マーカーとして用いられる「ＣＤ１４６」とは、メラノーマ細胞接着分子（ＭＣＡＭ）または細胞表面糖タンパク質ＭＵＣ１８としても知られる細胞接着分子をいう（本明細書中、「ＣＤ１４６」、「ＭＣＡＭ」又は「ＣＤ１４６（ＭＣＡＭ）」として記載され、いずれも同義で用いられる。）。ヒトにおいて、ＣＤ１４６はＭＣＡＭ遺伝子によってコードされており、例えば、ヒトＣＤ１４６のｍＲＮＡ及びアミノ酸の配列は、ＧｅｎＢａｎｋデータベース及びＧｅｎＰｅｐｔデータベースにおいて、受入番号ＮＭ＿００６５００及びＮＰ＿００６４９１として提供されているが、これらに限定されない。
【0028】
本明細書において、「細胞表面においてＣＤ１４６（ＭＣＡＭ）が陽性である細胞」（「ＣＤ１４６陽性細胞」ともいう。）とは、細胞表面においてＣＤ１４６特異的結合剤（例えば、抗ＣＤ１４６抗体）と反応する細胞をいい、公知の免疫学的手法（例えば、抗ＣＤ１４６抗体を用いたフローサイトメトリーによる検出法）により同定することができる。従って、ＣＤ１４６陽性細胞とは、野生型ＣＤ１４６を細胞表面に発現する細胞のみならず、抗ＣＤ１４６抗体と反応する変異型ＣＤ１４６を細胞表面に発現する細胞も包含する。
【0029】
本発明において、表面マーカーとして用いられる「ＣＤ５７」とは、Ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｇａｌａｃｔｏｓｙｌｘｙｌｏｓｙｌｐｒｏｔｅｉｎ ３－ｂｅｔａ－ｇｌｕｃｕｒｏｎｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ １（Ｂ３ＧＡＴ１）またはＬＥＵ７としても知られる酵素であり、Ｂ３ＧＡＴ１遺伝子によってコードされている細胞表面タンパク質である。例えば、ヒトＣＤ５７のｍＲＮＡ及びアミノ酸の配列は、ＧｅｎＢａｎｋデータベース及びＧｅｎＰｅｐｔデータベースにおいて、受入番号ＮＭ＿０１８６４４、ＮＭ＿０５４０２５又はＮＭ＿００１３６７９７３、並びにＮＰ＿０６１１１４、ＮＰ＿４７３３６６及びＮＰ＿００１３５４９０２として提供されているが、これらに限定されない。
【0030】
本明細書において、「細胞表面においてＣＤ５７が陰性である細胞」（「ＣＤ５７陽性細胞」ともいう。）とは、細胞表面においてＣＤ５７特異的結合剤（例えば、抗ＣＤ５７抗体）と反応しない細胞をいい、公知の免疫学的手法（例えば、抗ＣＤ５７抗体を用いたフローサイトメトリーによる検出法）により同定することができる。従って、ＣＤ５７陰性細胞とは、野生型ＣＤ５７を細胞表面に発現しない細胞のみならず、抗ＣＤ５７抗体と反応する変異型ＣＤ５７を細胞表面に発現しない細胞も包含する。
【0031】
本明細書において、「Ｐａｘ７」とは、骨格筋前駆細胞、特に、骨格筋幹細胞（サテライト細胞）のマーカーとして知られる転写因子である。例えば、ヒトＰａｘ７のｍＲＮＡ及びアミノ酸の配列は、ＧｅｎＢａｎｋデータベース及びＧｅｎＰｅｐｔデータベースにおいて、受入番号ＮＭ＿０１３９４５、ＮＭ＿００１１３５２５４又はＮＭ＿００２５８４、並びにＮＰ＿００１１２８７２６、ＮＰ＿００２５７５又はＮＰ＿０３９２３６として提供されているが、これらに限定されない。本発明の骨格筋前駆細胞における「Ｐａｘ７」の発現は、公知の遺伝子発現検出手法を用いて定量することが可能である。
【0032】
従来、多能性幹細胞から分化誘導された骨格筋前駆細胞を含む細胞集団から、骨格筋前駆細胞を精製する方法として、細胞表面にＣＤ８２が発現し、細胞表面にＣＤ５７が発現していないＣＤ８２陽性ＣＤ５７陰性細胞を選択する方法が用いられていた。しかしながら、この方法により精製された骨格筋前駆細胞は、Ｐａｘ７陽性細胞の収率と純度が不十分であり、また、骨格筋前駆細胞以外の細胞が多く混入することから、多くの症例の被移植組織において線維化するなどの問題があった。しかしながら、本発明により提供される骨格筋前駆細胞、又はそれを含む細胞群は、生体における適用部位において、線維化を誘発しないという優れた特徴を有する。
【0033】
一実施態様において、本発明は、Ｐａｘ７陽性であり、細胞表面においてＣＤ１４６（ＭＣＡＭ）が陽性であり、かつＣＤ５７が陰性である骨格筋前駆細胞を含む細胞群を含む、筋原性疾患を治療するための組成物を提供する。
【0034】
本発明の組成物に含まれる骨格筋前駆細胞を含む細胞群は、骨格筋前駆細胞と共に他の種類の細胞を含んだ細胞群であってもよい。一実施態様において、本発明に含まれる細胞群に対する骨格筋前駆細胞は、３０％以上含まれることが好ましく、例えば、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、又は１００％含まれる。
【0035】
一実施態様において、本発明の組成物に含まれる骨格筋前駆細胞は、培養系において、ミオシン重鎖（ＭＨＣ）陽性の骨格筋細胞に分化し、さらに多核の骨格筋細胞へ成熟する能力を有する。従って、本発明の組成物を移植した場合、被移植組織において、効率的に骨格筋細胞へと成熟し、治療効果を発揮し得る。
【0036】
本発明に用いられ得る骨格筋前駆細胞又は骨格筋前駆細胞を含む細胞群は、多能性幹細胞由来であってもよい。
【0037】
本発明で使用可能な多能性幹細胞は、生体に存在するすべての細胞に分化可能である多能性を有し、かつ、増殖能をも併せもつ幹細胞であり、それには、以下のものに限定されないが、例えば、胚性幹（ＥＳ）細胞、精子幹（ＧＳ）細胞、胚性生殖（ＥＧ）細胞、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、核移植により得られるクローン胚由来の胚性幹（ｎｔＥＳ）細胞、Ｍｕｓｅ細胞などが含まれる。好ましい多能性幹細胞は、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞およびｎｔＥＳ細胞であり、筋原性疾患治療に用いるという観点から、より好ましくは、ヒトＥＳ細胞、ヒトｉＰＳ細胞であり、さらに好ましくは、ヒトｉＰＳ細胞である。
【0038】
（Ａ）胚性幹細胞
ＥＳ細胞は、ヒトやマウスなどの哺乳動物の初期胚（例えば胚盤胞）の内部細胞塊から樹立された、多能性と自己複製による増殖能を有する幹細胞である。
ＥＳ細胞は、ヒトやマウスなどの哺乳動物の初期胚（例えば胚盤胞）の内部細胞塊から樹立された、多能性と自己複製による増殖能を有する幹細胞である。
【0039】
ＥＳ細胞は、受精卵の８細胞期、桑実胚後の胚である胚盤胞の内部細胞塊に由来する胚由来の幹細胞であり、成体を構成するあらゆる細胞に分化する能力、いわゆる分化多能性と、自己複製による増殖能とを有している。ＥＳ細胞は、マウスで１９８１年に発見され（Ｍ．Ｊ． Ｅｖａｎｓ ａｎｄ Ｍ．Ｈ． Ｋａｕｆｍａｎ（１９８１）， Ｎａｔｕｒｅ ２９２：１５４－１５６）、その後、ヒト、サルなどの霊長類でもＥＳ細胞株が樹立された（Ｊ．Ａ． Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９８）， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５－１１４７； Ｊ．Ａ． Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９２：７８４４－７８４８；Ｊ．Ａ． Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９６）， Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ．， ５５：２５４－２５９； Ｊ．Ａ． Ｔｈｏｍｓｏｎ ａｎｄ Ｖ．Ｓ． Ｍａｒｓｈａｌｌ（１９９８）， Ｃｕｒｒ． Ｔｏｐ． Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ．， ３８：１３３－１６５）。
【0040】
ＥＳ細胞は、対象動物の受精卵の胚盤胞から内部細胞塊を取出し、内部細胞塊を線維芽細胞のフィーダー上で培養することによって樹立することができる。また、継代培養による細胞の維持は、白血病抑制因子（ｌｅｕｋｅｍｉａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ（ＬＩＦ））、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ｂＦＧＦ））などの物質を添加した培養液を用いて行うことができる。ヒトおよびサルのＥＳ細胞の樹立と維持の方法については、例えばＵＳＰ５，８４３，７８０； Ｔｈｏｍｓｏｎ ＪＡ， ｅｔ ａｌ．（１９９５）， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ Ｓ Ａ． ９２：７８４４－７８４８； Ｔｈｏｍｓｏｎ ＪＡ， ｅｔ ａｌ．（１９９８）， Ｓｃｉｅｎｃｅ． ２８２：１１４５－１１４７； Ｈ． Ｓｕｅｍｏｒｉ ｅｔ ａｌ．（２００６）， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．， ３４５：９２６－９３２； Ｍ． Ｕｅｎｏ ｅｔ ａｌ．（２００６）， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， １０３：９５５４－９５５９； Ｈ． Ｓｕｅｍｏｒｉ ｅｔ ａｌ．（２００１）， Ｄｅｖ． Ｄｙｎ．， ２２２：２７３－２７９；Ｈ． Ｋａｗａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．（２００２）， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９９：１５８０－１５８５；Ｋｌｉｍａｎｓｋａｙａ Ｉ， ｅｔ ａｌ．（２００６）， Ｎａｔｕｒｅ． ４４４：４８１－４８５などに記載されている。
【0041】
ＥＳ細胞作製のための培養液として、例えば０．１ｍＭ ２－メルカプトエタノール、０．１ｍＭ 非必須アミノ酸、２ｍＭ Ｌ－グルタミン酸、２０％ ＫＳＲおよび４ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦを補充したＤＭＥＭ／Ｆ－１２培養液を使用し、３７℃、２％ ＣＯ２／９８％ 空気の湿潤雰囲気下でヒトＥＳ細胞を維持することができる（Ｏ． Ｆｕｍｉｔａｋａ ｅｔ ａｌ．（２００８）， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， ２６：２１５－２２４）。また、ＥＳ細胞は、３～４日おきに継代する必要があり、このとき、継代は、例えば１ｍＭ ＣａＣｌ２および２０％ ＫＳＲを含有するＰＢＳ中の０．２５％ トリプシンおよび０．１ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼＩＶを用いて行うことができる。
【0042】
ＥＳ細胞の選択は、一般に、アルカリホスファターゼ、Ｏｃｔ－３／４、Ｎａｎｏｇなどの遺伝子マーカーの発現を指標にしてＲｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ法で行うことができる。特に、ヒトＥＳ細胞の選択では、ＯＣＴ－３／４、ＮＡＮＯＧ、ＥＣＡＤなどの遺伝子マーカーの発現を指標とすることができる（Ｅ． Ｋｒｏｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００８）， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２６：４４３－４５２）。
【0043】
ヒトＥＳ細胞株は、例えばＷＡ０１（Ｈ１）およびＷＡ０９（Ｈ９）は、ＷｉＣｅｌｌ Ｒｅｓｅｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから、ＫｈＥＳ－１、ＫｈＥＳ－２およびＫｈＥＳ－３は、京都大学再生医科学研究所（京都、日本）から入手可能である。
【0044】
（Ｂ）精子幹細胞
精子幹細胞は、精巣由来の多能性幹細胞であり、精子形成のための起源となる細胞である。この細胞は、ＥＳ細胞と同様に、種々の系列の細胞に分化誘導可能であり、例えばマウス胚盤胞に移植するとキメラマウスを作出できるなどの性質をもつ（Ｍ． Ｋａｎａｔｓｕ－Ｓｈｉｎｏｈａｒａ ｅｔ ａｌ．（２００３） Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ．， ６９：６１２－６１６； Ｋ． Ｓｈｉｎｏｈａｒａ ｅｔ ａｌ．（２００４）， Ｃｅｌｌ， １１９：１００１－１０１２）。神経膠細胞系由来神経栄養因子（ｇｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ（ＧＤＮＦ））を含む培養液で自己複製可能であるし、またＥＳ細胞と同様の培養条件下で継代を繰り返すことによって、精子幹細胞を得ることができる（竹林正則ら（２００８），実験医学，２６巻，５号（増刊），４１～４６頁，羊土社（東京、日本））。
精子幹細胞は、精巣由来の多能性幹細胞であり、精子形成のための起源となる細胞である。この細胞は、ＥＳ細胞と同様に、種々の系列の細胞に分化誘導可能であり、例えばマウス胚盤胞に移植するとキメラマウスを作出できるなどの性質をもつ（Ｍ． Ｋａｎａｔｓｕ－Ｓｈｉｎｏｈａｒａ ｅｔ ａｌ．（２００３） Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ．， ６９：６１２－６１６； Ｋ． Ｓｈｉｎｏｈａｒａ ｅｔ ａｌ．（２００４）， Ｃｅｌｌ， １１９：１００１－１０１２）。神経膠細胞系由来神経栄養因子（ｇｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ（ＧＤＮＦ））を含む培養液で自己複製可能であるし、またＥＳ細胞と同様の培養条件下で継代を繰り返すことによって、精子幹細胞を得ることができる（竹林正則ら（２００８），実験医学，２６巻，５号（増刊），４１～４６頁，羊土社（東京、日本））。
【0045】
（Ｃ）胚性生殖細胞
胚性生殖細胞は、胎生期の始原生殖細胞から樹立される、ＥＳ細胞と同様な多能性をもつ細胞であり、ＬＩＦ、ｂＦＧＦ、幹細胞因子（ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｆａｃｔｏｒ）などの物質の存在下で始原生殖細胞を培養することによって樹立しうる（Ｙ． Ｍａｔｓｕｉ ｅｔ ａｌ．（１９９２）， Ｃｅｌｌ， ７０：８４１－８４７； Ｊ．Ｌ． Ｒｅｓｎｉｃｋ ｅｔ ａｌ．（１９９２）， Ｎａｔｕｒｅ， ３５９：５５０－５５１）。
胚性生殖細胞は、胎生期の始原生殖細胞から樹立される、ＥＳ細胞と同様な多能性をもつ細胞であり、ＬＩＦ、ｂＦＧＦ、幹細胞因子（ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｆａｃｔｏｒ）などの物質の存在下で始原生殖細胞を培養することによって樹立しうる（Ｙ． Ｍａｔｓｕｉ ｅｔ ａｌ．（１９９２）， Ｃｅｌｌ， ７０：８４１－８４７； Ｊ．Ｌ． Ｒｅｓｎｉｃｋ ｅｔ ａｌ．（１９９２）， Ｎａｔｕｒｅ， ３５９：５５０－５５１）。
【0046】
（Ｄ）人工多能性幹細胞
人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞は、特定の初期化因子を、ＤＮＡまたはタンパク質の形態で体細胞に導入することによって作製することができる、ＥＳ細胞とほぼ同等の特性、例えば分化多能性と自己複製による増殖能を有する体細胞由来の人工の幹細胞である（Ｋ． Ｔａｋａｈａｓｈｉ ａｎｄ Ｓ． Ｙａｍａｎａｋａ（２００６） Ｃｅｌｌ， １２６：６６３－６７６； Ｋ． Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．（２００７）， Ｃｅｌｌ， １３１：８６１－８７２； Ｊ． Ｙｕ ｅｔ ａｌ．（２００７）， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ３１８：１９１７－１９２０； Ｎａｋａｇａｗａ， Ｍ．ら，Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２６：１０１－１０６（２００８）；国際公開ＷＯ ２００７／０６９６６６）。初期化因子は、ＥＳ細胞に特異的に発現している遺伝子、その遺伝子産物もしくはｎｏｎ－ｃｏｒｄｉｎｇ ＲＮＡまたはＥＳ細胞の未分化維持に重要な役割を果たす遺伝子、その遺伝子産物もしくはｎｏｎ－ｃｏｒｄｉｎｇ ＲＮＡ、あるいは低分子化合物によって構成されてもよい。初期化因子に含まれる遺伝子として、例えば、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５、Ｓｏｘ１７、Ｋｌｆ４、Ｋｌｆ２、ｃ－Ｍｙｃ、Ｎ－Ｍｙｃ、Ｌ－Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、Ｆｂｘ１５、ＥＲａｓ、ＥＣＡＴ１５－２、Ｔｃｌ１、ｂｅｔａ－ｃａｔｅｎｉｎ、Ｌｉｎ２８ｂ、Ｓａｌｌ１、Ｓａｌｌ４、Ｅｓｒｒｂ、Ｎｒ５ａ２、Ｔｂｘ３等が例示され、これらの初期化因子は、単独で用いても良く、組み合わせて用いても良い。初期化因子の組み合わせとしては、ＷＯ２００７／０６９６６６、ＷＯ２００８／１１８８２０、ＷＯ２００９／００７８５２、ＷＯ２００９／０３２１９４、ＷＯ２００９／０５８４１３、ＷＯ２００９／０５７８３１、ＷＯ２００９／０７５１１９、ＷＯ２００９／０７９００７、ＷＯ２００９／０９１６５９、ＷＯ２００９／１０１０８４、ＷＯ２００９／１０１４０７、ＷＯ２００９／１０２９８３、ＷＯ２００９／１１４９４９、ＷＯ２００９／１１７４３９、ＷＯ２００９／１２６２５０、ＷＯ２００９／１２６２５１、ＷＯ２００９／１２６６５５、ＷＯ２００９／１５７５９３、ＷＯ２０１０／００９０１５、ＷＯ２０１０／０３３９０６、ＷＯ２０１０／０３３９２０、ＷＯ２０１０／０４２８００、ＷＯ２０１０／０５０６２６、ＷＯ２０１０／０５６８３１、ＷＯ２０１０／０６８９５５、ＷＯ２０１０／０９８４１９、ＷＯ２０１０／１０２２６７、ＷＯ２０１０／１１１４０９、ＷＯ ２０１０／１１１４２２、ＷＯ２０１０／１１５０５０、ＷＯ２０１０／１２４２９０、ＷＯ２０１０／１４７３９５、ＷＯ２０１０／１４７６１２、Ｈｕａｎｇｆｕ Ｄ， ｅｔ ａｌ．（２００８）， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， ２６： ７９５－７９７、Ｓｈｉ Ｙ， ｅｔ ａｌ．（２００８）， Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ， ２： ５２５－５２８、Ｅｍｉｎｌｉ Ｓ， ｅｔ ａｌ．（２００８）， Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ． ２６：２４６７－２４７４、Ｈｕａｎｇｆｕ Ｄ， ｅｔ ａｌ．（２００８）， Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２６：１２６９－１２７５、Ｓｈｉ Ｙ， ｅｔ ａｌ．（２００８）， Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ， ３， ５６８－５７４、Ｚｈａｏ Ｙ， ｅｔ ａｌ．（２００８）， Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ， ３：４７５－４７９、Ｍａｒｓｏｎ Ａ，（２００８）， Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ， ３， １３２－１３５、Ｆｅｎｇ Ｂ， ｅｔ ａｌ．（２００９）， Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １１：１９７－２０３、Ｒ．Ｌ． Ｊｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（２００９）， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈ．， ２７：４５９－４６１、Ｌｙｓｓｉｏｔｉｓ ＣＡ， ｅｔ ａｌ．（２００９）， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． １０６：８９１２－８９１７、Ｋｉｍ ＪＢ， ｅｔ ａｌ．（２００９）， Ｎａｔｕｒｅ． ４６１：６４９－６４３、Ｉｃｈｉｄａ ＪＫ， ｅｔ ａｌ．（２００９）， Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ． ５：４９１－５０３、Ｈｅｎｇ ＪＣ， ｅｔ ａｌ．（２０１０）， Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ． ６：１６７－７４、Ｈａｎ Ｊ， ｅｔ ａｌ．（２０１０）， Ｎａｔｕｒｅ． ４６３：１０９６－１００、Ｍａｌｉ Ｐ， ｅｔ ａｌ．（２０１０）， Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ． ２８：７１３－７２０に記載の組み合わせが例示される。
人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞は、特定の初期化因子を、ＤＮＡまたはタンパク質の形態で体細胞に導入することによって作製することができる、ＥＳ細胞とほぼ同等の特性、例えば分化多能性と自己複製による増殖能を有する体細胞由来の人工の幹細胞である（Ｋ． Ｔａｋａｈａｓｈｉ ａｎｄ Ｓ． Ｙａｍａｎａｋａ（２００６） Ｃｅｌｌ， １２６：６６３－６７６； Ｋ． Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．（２００７）， Ｃｅｌｌ， １３１：８６１－８７２； Ｊ． Ｙｕ ｅｔ ａｌ．（２００７）， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ３１８：１９１７－１９２０； Ｎａｋａｇａｗａ， Ｍ．ら，Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２６：１０１－１０６（２００８）；国際公開ＷＯ ２００７／０６９６６６）。初期化因子は、ＥＳ細胞に特異的に発現している遺伝子、その遺伝子産物もしくはｎｏｎ－ｃｏｒｄｉｎｇ ＲＮＡまたはＥＳ細胞の未分化維持に重要な役割を果たす遺伝子、その遺伝子産物もしくはｎｏｎ－ｃｏｒｄｉｎｇ ＲＮＡ、あるいは低分子化合物によって構成されてもよい。初期化因子に含まれる遺伝子として、例えば、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５、Ｓｏｘ１７、Ｋｌｆ４、Ｋｌｆ２、ｃ－Ｍｙｃ、Ｎ－Ｍｙｃ、Ｌ－Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、Ｆｂｘ１５、ＥＲａｓ、ＥＣＡＴ１５－２、Ｔｃｌ１、ｂｅｔａ－ｃａｔｅｎｉｎ、Ｌｉｎ２８ｂ、Ｓａｌｌ１、Ｓａｌｌ４、Ｅｓｒｒｂ、Ｎｒ５ａ２、Ｔｂｘ３等が例示され、これらの初期化因子は、単独で用いても良く、組み合わせて用いても良い。初期化因子の組み合わせとしては、ＷＯ２００７／０６９６６６、ＷＯ２００８／１１８８２０、ＷＯ２００９／００７８５２、ＷＯ２００９／０３２１９４、ＷＯ２００９／０５８４１３、ＷＯ２００９／０５７８３１、ＷＯ２００９／０７５１１９、ＷＯ２００９／０７９００７、ＷＯ２００９／０９１６５９、ＷＯ２００９／１０１０８４、ＷＯ２００９／１０１４０７、ＷＯ２００９／１０２９８３、ＷＯ２００９／１１４９４９、ＷＯ２００９／１１７４３９、ＷＯ２００９／１２６２５０、ＷＯ２００９／１２６２５１、ＷＯ２００９／１２６６５５、ＷＯ２００９／１５７５９３、ＷＯ２０１０／００９０１５、ＷＯ２０１０／０３３９０６、ＷＯ２０１０／０３３９２０、ＷＯ２０１０／０４２８００、ＷＯ２０１０／０５０６２６、ＷＯ２０１０／０５６８３１、ＷＯ２０１０／０６８９５５、ＷＯ２０１０／０９８４１９、ＷＯ２０１０／１０２２６７、ＷＯ２０１０／１１１４０９、ＷＯ ２０１０／１１１４２２、ＷＯ２０１０／１１５０５０、ＷＯ２０１０／１２４２９０、ＷＯ２０１０／１４７３９５、ＷＯ２０１０／１４７６１２、Ｈｕａｎｇｆｕ Ｄ， ｅｔ ａｌ．（２００８）， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， ２６： ７９５－７９７、Ｓｈｉ Ｙ， ｅｔ ａｌ．（２００８）， Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ， ２： ５２５－５２８、Ｅｍｉｎｌｉ Ｓ， ｅｔ ａｌ．（２００８）， Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ． ２６：２４６７－２４７４、Ｈｕａｎｇｆｕ Ｄ， ｅｔ ａｌ．（２００８）， Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２６：１２６９－１２７５、Ｓｈｉ Ｙ， ｅｔ ａｌ．（２００８）， Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ， ３， ５６８－５７４、Ｚｈａｏ Ｙ， ｅｔ ａｌ．（２００８）， Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ， ３：４７５－４７９、Ｍａｒｓｏｎ Ａ，（２００８）， Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ， ３， １３２－１３５、Ｆｅｎｇ Ｂ， ｅｔ ａｌ．（２００９）， Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １１：１９７－２０３、Ｒ．Ｌ． Ｊｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（２００９）， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈ．， ２７：４５９－４６１、Ｌｙｓｓｉｏｔｉｓ ＣＡ， ｅｔ ａｌ．（２００９）， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． １０６：８９１２－８９１７、Ｋｉｍ ＪＢ， ｅｔ ａｌ．（２００９）， Ｎａｔｕｒｅ． ４６１：６４９－６４３、Ｉｃｈｉｄａ ＪＫ， ｅｔ ａｌ．（２００９）， Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ． ５：４９１－５０３、Ｈｅｎｇ ＪＣ， ｅｔ ａｌ．（２０１０）， Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ． ６：１６７－７４、Ｈａｎ Ｊ， ｅｔ ａｌ．（２０１０）， Ｎａｔｕｒｅ． ４６３：１０９６－１００、Ｍａｌｉ Ｐ， ｅｔ ａｌ．（２０１０）， Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ． ２８：７１３－７２０に記載の組み合わせが例示される。
【0047】
上記初期化因子には、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤［例えば、バルプロ酸（ＶＰＡ）、トリコスタチンＡ、酪酸ナトリウム、ＭＣ １２９３、Ｍ３４４等の低分子阻害剤、ＨＤＡＣに対するｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ（例、ＨＤＡＣ１ ｓｉＲＮＡ Ｓｍａｒｔｐｏｏｌ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ＨｕＳＨ ２９ｍｅｒ ｓｈＲＮＡ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ ａｇａｉｎｓｔ ＨＤＡＣ１（ＯｒｉＧｅｎｅ）等）等の核酸性発現阻害剤など］、ＭＥＫ阻害剤（例えば、ＰＤ１８４３５２、ＰＤ９８０５９、Ｕ０１２６、ＳＬ３２７およびＰＤ０３２５９０１）、Ｇｌｙｃｏｇｅｎ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｋｉｎａｓｅ－３阻害剤（例えば、ＢｉｏおよびＣＨＩＲ９９０２１）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば、５－ａｚａｃｙｔｉｄｉｎｅ）、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば、ＢＩＸ－０１２９４等の低分子阻害剤、Ｓｕｖ３９ｈｌ、Ｓｕｖ３９ｈ２、ＳｅｔＤＢｌおよびＧ９ａに対するｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ等の核酸性発現阻害剤など）、Ｌ－ｃｈａｎｎｅｌ ｃａｌｃｉｕｍ ａｇｏｎｉｓｔ（例えばＢａｙｋ８６４４）、酪酸、ＴＧＦβ阻害剤またはＡＬＫ５阻害剤（例えば、ＬＹ３６４９４７、ＳＢ４３１５４２、６１６４５３およびＡ－８３－０１）、ｐ５３阻害剤（例えばｐ５３に対するｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ）、ＡＲＩＤ３Ａ阻害剤（例えば、ＡＲＩＤ３Ａに対するｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ）、ｍｉＲ－２９１－３ｐ、ｍｉＲ－２９４、ｍｉＲ－２９５およびｍｉｒ－３０２などのｍｉＲＮＡ、Ｗｎｔ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ（例えばｓｏｌｕｂｌｅ Ｗｎｔ３ａ）、神経ペプチドＹ、プロスタグランジン類（例えば、プロスタグランジンＥ２およびプロスタグランジンＪ２）、ｈＴＥＲＴ、ＳＶ４０ＬＴ、ＵＴＦ１、ＩＲＸ６、ＧＬＩＳｌ、ＰＩＴＸ２、ＤＭＲＴＢｌ等の樹立効率を高めることを目的として用いられる因子も含まれており、本明細書においては、これらの樹立効率の改善目的にて用いられた因子についても初期化因子と別段の区別をしないものとする。
【0048】
初期化因子は、タンパク質の形態の場合、例えばリポフェクション、細胞膜透過性ペプチド（例えば、ＨＩＶ由来のＴＡＴおよびポリアルギニン）との融合、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入してもよい。
【0049】
一方、ＤＮＡの形態の場合、例えば、ウイルス、プラスミド、人工染色体などのベクター、リポフェクション、リポソーム、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入することができる。ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター（以上、Ｃｅｌｌ， １２６， ｐｐ．６６３－６７６， ２００６； Ｃｅｌｌ， １３１， ｐｐ．８６１－８７２，２００７； Ｓｃｉｅｎｃｅ， ３１８， ｐｐ．１９１７－１９２０，２００７）、アデノウイルスベクター（Ｓｃｉｅｎｃｅ， ３２２， ９４５－９４９，２００８）、アデノ随伴ウイルスベクター、センダイウイルスベクター（ＷＯ ２０１０／００８０５４）などが例示される。また、人工染色体ベクターとしては、例えばヒト人工染色体（ＨＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ、ＰＡＣ）などが含まれる。プラスミドとしては、哺乳動物細胞用プラスミドを使用しうる（Ｓｃｉｅｎｃｅ， ３２２：９４９－９５３，２００８）。ベクターには、核初期化物質が発現可能なように、プロモーター、エンハンサー、リボゾーム結合配列、ターミネーター、ポリアデニル化サイトなどの制御配列を含むことができるし、さらに、必要に応じて、薬剤耐性遺伝子（例えばカナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子など）、チミジンキナーゼ遺伝子、ジフテリアトキシン遺伝子などの選択マーカー配列、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、βグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、ＦＬＡＧなどのレポーター遺伝子配列などを含むことができる。また、上記ベクターには、体細胞への導入後、初期化因子をコードする遺伝子もしくはプロモーターとそれに結合する初期化因子をコードする遺伝子を共に切除するために、それらの前後にＬｏｘＰ配列を有してもよい。
【0050】
また、ＲＮＡの形態の場合、例えばリポフェクション、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入しても良く、分解を抑制するため、５－メチルシチジンおよびｐｓｅｕｄｏｕｒｉｄｉｎｅ（ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を取り込ませたＲＮＡを用いても良い（Ｗａｒｒｅｎ Ｌ，（２０１０） Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ． ７：６１８－６３０）。
【0051】
ｉＰＳ細胞誘導のための培養液としては、例えば、１０～１５％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２またはＤＭＥ培養液（これらの培養液にはさらに、ＬＩＦ、ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ、ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ、Ｌ－グルタミン、非必須アミノ酸類、β－メルカプトエタノールなどを適宜含むことができる。）または市販の培養液［例えば、マウスＥＳ細胞培養用培養液（ＴＸ－ＷＥＳ培養液、トロンボＸ社）、霊長類ＥＳ細胞培養用培養液（霊長類ＥＳ／ｉＰＳ細胞用培養液、リプロセル社）、無血清培地（ｍＴｅＳＲ、Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）］などが含まれる。
【0052】
培養法の例としては、例えば、３７℃、５％ ＣＯ２存在下にて、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭまたはＤＭＥＭ／Ｆ１２培養液上で体細胞と初期化因子とを接触させ約４～７日間培養し、その後、細胞をフィーダー細胞（例えば、マイトマイシンＣ処理ＳＴＯ細胞、ＳＮＬ細胞等）上にまきなおし、体細胞と初期化因子の接触から約１０日後からｂＦＧＦ含有霊長類ＥＳ細胞培養用培養液で培養し、該接触から約３０～約４５日またはそれ以上ののちにｉＰＳ様コロニーを生じさせることができる。
【0053】
あるいは、３７℃、５％ ＣＯ２存在下にて、フィーダー細胞（例えば、マイトマイシンＣ処理ＳＴＯ細胞、ＳＮＬ細胞等）上で１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培養液（これにはさらに、ＬＩＦ、ペニシリン／ストレプトマイシン、ピューロマイシン、Ｌ－グルタミン、非必須アミノ酸類、β－メルカプトエタノールなどを適宜含むことができる。）で培養し、約２５～約３０日またはそれ以上ののちにＥＳ様コロニーを生じさせることができる。望ましくは、フィーダー細胞の代わりに、初期化される体細胞そのものを用いる（Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｋ， ｅｔ ａｌ．（２００９）， ＰＬｏＳ Ｏｎｅ． ４：ｅ８０６７またはＷＯ２０１０／１３７７４６）、もしくは細胞外基質（例えば、Ｌａｍｉｎｉｎ－５（ＷＯ２００９／１２３３４９）およびマトリゲル（ＢＤ社））を用いる方法が例示される。
【0054】
この他にも、血清を含有しない培地を用いて培養する方法も例示される（Ｓｕｎ Ｎ， ｅｔ ａｌ．（２００９）， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ． １０６：１５７２０－１５７２５）。さらに、樹立効率を上げるため、低酸素条件（０．１％以上、１５％以下の酸素濃度）によりｉＰＳ細胞を樹立しても良い（Ｙｏｓｈｉｄａ Ｙ， ｅｔ ａｌ．（２００９）， Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ． ５：２３７－２４１またはＷＯ２０１０／０１３８４５）。
【0055】
上記培養の間には、培養開始２日目以降から毎日１回新鮮な培養液と培養液交換を行う。また、核初期化に使用する体細胞の細胞数は、限定されないが、培養ディッシュ１００ｃｍ２あたり約５×１０３～約５×１０６細胞の範囲である。
【0056】
ｉＰＳ細胞は、形成したコロニーの形状により選択することが可能である。一方、体細胞が初期化された場合に発現する遺伝子（例えば、Ｏｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ）と連動して発現する薬剤耐性遺伝子をマーカー遺伝子として導入した場合は、対応する薬剤を含む培養液（選択培養液）で培養を行うことにより樹立したｉＰＳ細胞を選択することができる。また、マーカー遺伝子が蛍光タンパク質遺伝子の場合は蛍光顕微鏡で観察することによって、発光酵素遺伝子の場合は発光基質を加えることによって、また発色酵素遺伝子の場合は発色基質を加えることによって、ｉＰＳ細胞を選択することができる。
【0057】
本明細書中で使用する「体細胞」なる用語は、卵子、卵母細胞、ＥＳ細胞などの生殖系列細胞または分化全能性細胞を除くあらゆる動物細胞（好ましくは、ヒトを含む哺乳動物細胞）をいう。体細胞には、非限定的に、胎児（仔）の体細胞、新生児（仔）の体細胞、および成熟した健全なもしくは疾患性の体細胞のいずれも包含されるし、また、初代培養細胞、継代細胞、および株化細胞のいずれも包含される。具体的には、体細胞は、例えば（１）神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞（体性幹細胞）、（２）組織前駆細胞、（３）リンパ球、上皮細胞、内皮細胞、筋肉細胞、線維芽細胞（皮膚細胞等）、毛細胞、肝細胞、胃粘膜細胞、腸細胞、脾細胞、膵細胞（膵外分泌細胞等）、脳細胞、肺細胞、腎細胞および脂肪細胞等の分化した細胞などが例示される。
【0058】
本発明において、体細胞を採取する由来となる哺乳動物個体は特に制限されないが、好ましくはヒトである。得られるｉＰＳ細胞がヒトの再生医療用途に使用される場合には、拒絶反応が起こらないという観点から、患者本人またはＨＬＡの型が同一もしくは実質的に同一である他人から体細胞を採取することが特に好ましい。ここでＨＬＡの型が「実質的に同一」とは、免疫抑制剤などの使用により、該体細胞由来のｉＰＳ細胞から分化誘導することにより得られた細胞を患者に移植した場合に移植細胞が生着可能な程度にＨＬＡの型が一致していることをいう。例えば、主たるＨＬＡ（例えば、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－ＢおよびＨＬＡ－ＤＲの３遺伝子座、あるいはＨＬＡ－Ｃを加えた４遺伝子座）が同一である場合などが挙げられる（以下同じ）。
【0059】
（Ｅ）核移植により得られたクローン胚由来のＥＳ細胞
ｎｔＥＳ細胞は、核移植技術によって作製されたクローン胚由来のＥＳ細胞であり、受精卵由来のＥＳ細胞とほぼ同じ特性を有している（Ｔ． Ｗａｋａｙａｍａ ｅｔ ａｌ．（２００１）， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２９２：７４０－７４３； Ｓ． Ｗａｋａｙａｍａ ｅｔ ａｌ．（２００５）， Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ．， ７２：９３２－９３６； Ｊ． Ｂｙｒｎｅ ｅｔ ａｌ．（２００７）， Ｎａｔｕｒｅ， ４５０：４９７－５０２）。すなわち、未受精卵の核を体細胞の核と置換することによって得られたクローン胚由来の胚盤胞の内部細胞塊から樹立されたＥＳ細胞がｎｔ ＥＳ（ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｆｅｒ ＥＳ）細胞である。ｎｔ ＥＳ細胞の作製のためには、核移植技術（Ｊ．Ｂ． Ｃｉｂｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．（１９９８）， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， １６：６４２－６４６）とＥＳ細胞作製技術（上記）との組み合わせが利用される（若山清香ら（２００８），実験医学，２６巻，５号（増刊），４７～５２頁）。核移植においては、哺乳動物の除核した未受精卵に、体細胞の核を注入し、数時間培養することで初期化することができる。
ｎｔＥＳ細胞は、核移植技術によって作製されたクローン胚由来のＥＳ細胞であり、受精卵由来のＥＳ細胞とほぼ同じ特性を有している（Ｔ． Ｗａｋａｙａｍａ ｅｔ ａｌ．（２００１）， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２９２：７４０－７４３； Ｓ． Ｗａｋａｙａｍａ ｅｔ ａｌ．（２００５）， Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ．， ７２：９３２－９３６； Ｊ． Ｂｙｒｎｅ ｅｔ ａｌ．（２００７）， Ｎａｔｕｒｅ， ４５０：４９７－５０２）。すなわち、未受精卵の核を体細胞の核と置換することによって得られたクローン胚由来の胚盤胞の内部細胞塊から樹立されたＥＳ細胞がｎｔ ＥＳ（ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｆｅｒ ＥＳ）細胞である。ｎｔ ＥＳ細胞の作製のためには、核移植技術（Ｊ．Ｂ． Ｃｉｂｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．（１９９８）， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， １６：６４２－６４６）とＥＳ細胞作製技術（上記）との組み合わせが利用される（若山清香ら（２００８），実験医学，２６巻，５号（増刊），４７～５２頁）。核移植においては、哺乳動物の除核した未受精卵に、体細胞の核を注入し、数時間培養することで初期化することができる。
【0060】
（Ｆ）Ｍｕｌｔｉｌｉｎｅａｇｅ－ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ Ｓｔｒｅｓｓ Ｅｎｄｕｒｉｎｇ ｃｅｌｌｓ（Ｍｕｓｅ細胞）
Ｍｕｓｅ細胞は、ＷＯ２０１１／００７９００に記載された方法にて製造された多能性幹細胞であり、詳細には、線維芽細胞または骨髄間質細胞を長時間トリプシン処理、好ましくは８時間または１６時間トリプシン処理した後、浮遊培養することで得られる多能性を有した細胞であり、ＳＳＥＡ－３およびＣＤ１０５が陽性である。
Ｍｕｓｅ細胞は、ＷＯ２０１１／００７９００に記載された方法にて製造された多能性幹細胞であり、詳細には、線維芽細胞または骨髄間質細胞を長時間トリプシン処理、好ましくは８時間または１６時間トリプシン処理した後、浮遊培養することで得られる多能性を有した細胞であり、ＳＳＥＡ－３およびＣＤ１０５が陽性である。
【0061】
一実施態様において、本発明に用いられ得る骨格筋前駆細胞又は骨格筋前駆細胞を含む細胞群は、対象、またはＨＬＡの型が同一もしくは実質的に同一である他人から採取した体細胞を用いて誘導したｉＰＳ細胞から分化させた骨格筋前駆細胞又は骨格筋前駆細胞を含む細胞群であってもよい。
【0062】
本発明が治療し得る筋原性疾患としては、例えば、筋ジストロフィー（例、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー型筋ジストロフィー、先天性筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、筋緊張性筋ジストロフィー等）、先天性ミオパチー、遠位型ミオパチー、ミトコンドリアミオパチーなどの遺伝性ミオパチー、多発性筋炎、皮膚筋炎、重症筋無力症などの非遺伝性ミオパチー筋ジストロフィー、糖原病、周期性四肢麻痺、が例示される。より好ましい治療対象は、筋ジストロフィーである。
【0063】
一実施態様において、本発明の組成物は、常套手段にしたがって医薬的に許容され得る担体と混合するなどして注射剤、懸濁剤、点滴剤等の非経口製剤として製造されてもよい。当該非経口製剤に含まれ得る医薬上許容される担体としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ－ソルビトール、Ｄ－マンニトール、塩化ナトリウムなど）などの注射用の水性液を挙げることができる。本発明の組成物は、例えば、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩酸リドカイン、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、安息香酸ナトリウム、塩化ベンザルコニウム、など）、酸化防止剤（例えば、アスコルビン酸、エデト酸ナトリウムなど）などと配合しても良い。
【0064】
一実施態様において、本発明の組成物を水性懸濁液として製剤化する場合、上記水性液に約１．０×１０５～約１．０×１０９細胞／ｍＬとなるように、骨格筋前駆細胞を懸濁させればよい。このようにして得られる製剤は、安定で低毒性であるので、ヒトなどの哺乳動物に対して安全に投与することができる。投与方法は特に限定されないが、好ましくは注射もしくは点滴投与であり、静脈内投与、動脈内投与、筋肉内投与（患部局所投与）などが挙げられる。本発明の剤の投与量は、投与対象、治療標的部位、症状、投与方法などにより差異はあるが、通常、ＤＭＤ患者（体重６０ｋｇとして）においては、例えば、筋肉内投与（患部局所投与）の場合、１回につき骨格筋前駆細胞量として約１．０×１０５～約１．０×１０９細胞を約１０～約２０箇所に分け、約１ヶ月以上の間隔を空け、約１～約４回投与するのが好都合である。
【0065】
一実施態様において、本発明は、筋原性疾患を罹患する対象を治療する方法であって、
Ｐａｘ７陽性であり、細胞表面においてＣＤ１４６（ＭＣＡＭ）が陽性であり、かつＣＤ５７が陰性である骨格筋前駆細胞を含む細胞群を、それを必要とする対象に投与すること、を含む、方法を提供する。
Ｐａｘ７陽性であり、細胞表面においてＣＤ１４６（ＭＣＡＭ）が陽性であり、かつＣＤ５７が陰性である骨格筋前駆細胞を含む細胞群を、それを必要とする対象に投与すること、を含む、方法を提供する。
【0066】
また、一実施態様において、本発明は、筋原性疾患の治療に使用するための細胞群であって、前記細胞群が、Ｐａｘ７陽性であり、細胞表面においてＣＤ１４６（ＭＣＡＭ）が陽性であり、かつＣＤ５７が陰性である骨格筋前駆細胞を含む、細胞群を提供する。
【0067】
また、一実施態様において、本発明は、筋原性疾患を治療するための骨格筋前駆細胞を含む細胞群を製造するための使用であって、
前記細胞群が、Ｐａｘ７陽性であり、細胞表面においてＣＤ１４６（ＭＣＡＭ）が陽性であり、かつＣＤ５７が陰性である骨格筋前駆細胞を含む、使用を提供する。
前記細胞群が、Ｐａｘ７陽性であり、細胞表面においてＣＤ１４６（ＭＣＡＭ）が陽性であり、かつＣＤ５７が陰性である骨格筋前駆細胞を含む、使用を提供する。
【0068】
＜多能性幹細胞から骨格筋前駆細胞を分化誘導する方法＞
本発明で用いられ得る骨格筋前駆細胞、又は骨格筋前駆細胞を含む細胞集団は、例えば、国際公開第２０１６／１０８２８８号に記載の方法によって得られる骨格筋前駆細胞又は骨格筋前駆細胞を含む細胞集団を用いることができるが、この方法に限定されない。なお、国際公開第２０１６／１０８２８８号は、参照により本明細書に援用される。
本発明で用いられ得る骨格筋前駆細胞、又は骨格筋前駆細胞を含む細胞集団は、例えば、国際公開第２０１６／１０８２８８号に記載の方法によって得られる骨格筋前駆細胞又は骨格筋前駆細胞を含む細胞集団を用いることができるが、この方法に限定されない。なお、国際公開第２０１６／１０８２８８号は、参照により本明細書に援用される。
【0069】
例えば、多能性細胞から骨格筋前駆細胞を分化誘導する方法は、下記の工程（１）と（２Ａ）または（２Ｂ）とを含む方法を用いることができる。
【0070】
（１）多能性幹細胞をＴＧＦ－β阻害剤とＧＳＫ３β阻害剤を含む培養液中で培養する工程；
（２Ａ）（１）の工程で得られた細胞を、ＨＧＦを含み、さらにＩＧＦ１を含んでもよい培養液中で培養する工程；
（２Ｂ）（１）の工程で得られた細胞を、
（ｉ）ＩＧＦ１、ＨＧＦおよびｂＦＧＦを含む培養液中、
（ｉｉ）ＩＧＦ１を含む培養液中、および
（ｉｉｉ）ＩＧＦ１およびＨＧＦを含む培養液中
で順次培養する工程
（２Ａ）（１）の工程で得られた細胞を、ＨＧＦを含み、さらにＩＧＦ１を含んでもよい培養液中で培養する工程；
（２Ｂ）（１）の工程で得られた細胞を、
（ｉ）ＩＧＦ１、ＨＧＦおよびｂＦＧＦを含む培養液中、
（ｉｉ）ＩＧＦ１を含む培養液中、および
（ｉｉｉ）ＩＧＦ１およびＨＧＦを含む培養液中
で順次培養する工程
【0071】
多能性細胞から骨格筋前駆細胞を分化誘導する方法はまた、前記工程（１）から（２Ａ）または（２Ｂ）に加えて、工程（３）（２Ａ）または（２Ｂ）の工程で得られた細胞を、ＴＧＦ－β阻害剤、ＩＧＦ１および血清を含む培養液中で培養する工程を含む方法を用いることができる。
【0072】
多能性細胞から骨格筋前駆細胞を分化誘導する方法について、下記に詳述する。
【0073】
工程（１）：多能性幹細胞をＴＧＦ－β阻害剤とＧＳＫ３β阻害剤を含む培養液中で培養する工程
工程（１）は、多能性幹細胞をＴＧＦ－β阻害剤とＧＳＫ３β阻害剤を含む培養液中で培養する工程である。本工程（１）において用いる培養液は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えば、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ １９９培地、Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＥＭＥＭ）培地、αＭＥＭ培地、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）培地、Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２培地、ＲＰＭＩ １６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、ＳｔｅｍＰｒｏ３４（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＲＰＭＩ－ｂａｓｅ ｍｅｄｉｕｍ、およびこれらの混合培地などが包含される。本工程（１）において、好ましくは、ＩＭＤＭ培地およびＨａｍ’ｓ Ｆ１２培地の混合培地である。
工程（１）は、多能性幹細胞をＴＧＦ－β阻害剤とＧＳＫ３β阻害剤を含む培養液中で培養する工程である。本工程（１）において用いる培養液は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えば、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ １９９培地、Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＥＭＥＭ）培地、αＭＥＭ培地、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）培地、Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２培地、ＲＰＭＩ １６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、ＳｔｅｍＰｒｏ３４（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＲＰＭＩ－ｂａｓｅ ｍｅｄｉｕｍ、およびこれらの混合培地などが包含される。本工程（１）において、好ましくは、ＩＭＤＭ培地およびＨａｍ’ｓ Ｆ１２培地の混合培地である。
【0074】
基礎培地には、血清が含有されていてもよいし、あるいは無血清でもよい。必要に応じて、例えば、アルブミン、トランスフェリン、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）（ＥＳ細胞培養時のＦＢＳの血清代替物）、Ｎ２サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｂ２７サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、脂肪酸、インスリン、セレン（亜セレン酸ナトリウム）、コラーゲン前駆体、微量元素、２－メルカプトエタノール（２ＭＥ）、チオールグリセロールなどの１つ以上の血清代替物を含んでもよいし、脂質、アミノ酸、Ｌ－グルタミン、Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類などの１つ以上の物質も含有し得る。本工程（１）において、好ましい基礎培地は、アルブミン、トランスフェリン、脂肪酸、インスリン、セレンおよびチオールグリセロールを添加したＩＭＤＭ培地およびＨａｍ’ｓ Ｆ１２培地の混合培地である。
【0075】
本発明において、ＴＧＦβ阻害剤は、ＴＧＦβの受容体への結合からＳＭＡＤへと続くシグナル伝達を阻害する物質である限り特に限定されないが、例えば、ＴＧＦβの受容体であるＡＬＫファミリーへの結合を阻害する物質、ＡＬＫファミリーによるＳＭＡＤのリン酸化を阻害する物質などが挙げられる。本発明において、ＴＧＦβ阻害剤は、例えば、Ｌｅｆｔｙ－１（ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．として、マウス：ＮＭ＿０１００９４、ヒト：ＮＭ＿０２０９９７が例示される）、ＳＢ４３１５４２、ＳＢ２０２１９０（以上、Ｒ．Ｋ．Ｌｉｎｄｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃａｎｃｅｒ，２００３， ２：２０）、ＳＢ５０５１２４（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、 ＮＰＣ３０３４５ 、ＳＤ０９３、ＳＤ９０８、ＳＤ２０８（Ｓｃｉｏｓ）、ＬＹ２１０９７６１、ＬＹ３６４９４７、ＬＹ５８０２７６（Ｌｉｌｌｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、Ａ－８３－０１（ＷＯ２００９／１４６４０８）およびこれらの誘導体などが例示される。
【0076】
本工程（１）で使用されるＴＧＦβ阻害剤は、好ましくは、ＳＢ４３１５４２であり得る。
【0077】
培地中におけるＳＢ４３１５４２の濃度は、特に限定されないが、１μＭ以上５０μＭ以下が好ましく、例えば、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ、１１μＭ、１２μＭ、１３μＭ、１４μＭ、１５μＭ、１６μＭ、１７μＭ、１８μＭ、１９μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭ、４５μＭ、５０μＭであるがこれらに限定されない。より好ましくは、２μＭ以上１０μＭ以下であり、特に好ましくは５μＭである。
【0078】
本発明において、ＧＳＫ－３β阻害剤は、ＧＳＫ－３βタンパク質のキナーゼ活性（例えば、βカテニンに対するリン酸化能）を阻害する物質として定義され、既に多数のものが知られているが、例えば、ＧＳＫ－３β阻害剤として最初に見出されたＬｉｔｈｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＬｉＣｌ）、インジルビン誘導体であるＢＩＯ（別名、ＧＳＫ－３β阻害剤ＩＸ；６－ブロモインジルビン３’－オキシム）、マレイミド誘導体であるＳＢ２１６７６３（３－（２，４－ジクロロフェニル）－４－（１－メチル－１Ｈ－インドール－３－イル）－１Ｈ－ピロール－２，５－ジオン）、フェニルαブロモメチルケトン化合物であるＧＳＫ－３β阻害剤ＶＩＩ（４－ジブロモアセトフェノン）、細胞膜透過型のリン酸化ペプチドであるＬ８０３－ｍｔｓ（別名、ＧＳＫ－３βペプチド阻害剤；Ｍｙｒ－Ｎ－ＧＫＥＡＰＰＡＰＰＱＳｐＰ－ＮＨ２）および高い選択性を有するＣＨＩＲ９９０２１（６－［２－［４－（２，４－Ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）－５－（４－ｍｅｔｈｙｌ－１Ｈ－ｉｍｉｄａｚｏｌ－２－ｙｌ）ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ－２－ｙｌａｍｉｎｏ］ｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ］ｐｙｒｉｄｉｎｅ－３－ｃａｒｂｏｎｉｔｒｉｌｅ）が挙げられる。これらの化合物は、例えばＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ社やＢｉｏｍｏｌ社等から市販されており容易に利用することが可能であるが、他の入手先から入手してもよく、あるいはまた自ら作製してもよい。
【0079】
本工程（１）で使用されるＧＳＫ－３β阻害剤は、好ましくは、ＣＨＩＲ９９０２１であり得る。
【0080】
培地中におけるＣＨＩＲ９９０２１の濃度は、特に限定されないが、好ましくは、ＧＳＫ－３β阻害において使用される濃度である１μＭよりも高い濃度が使用され、例えば、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭ、４５μＭ、５０μＭ等であるがこれらに限定されない。より好ましくは、５μＭ以上（例えば、５μＭ以上５０μＭ以下、好ましくは５μＭ以上１０μＭ以下）である。
【0081】
本工程（１）において、培養期間は、１０日以上３０日以下が例示され、例えば、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日などであり得て、好ましくは、１６日から２１日の間、より好ましくは１６日である。
【0082】
工程（２Ａ）：ＨＧＦを含み、さらにＩＧＦ１を含んでもよい培養液中で培養する工程
本工程（２Ａ）は、前記工程（１）で得られた細胞を、ＨＧＦを含み、さらにＩＧＦ１を含んでもよい培養液中で培養する工程である。本工程（２Ａ）において用いる培養液は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えば、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ １９９培地、Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＥＭＥＭ）培地、αＭＥＭ培地、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）培地、Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２培地、ＲＰＭＩ １６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、ＳｔｅｍＰｒｏ３４（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＲＰＭＩ－ｂａｓｅ ｍｅｄｉｕｍ、ＳＦ－Ｏ３培地（エーディア株式会社）およびこれらの混合培地などが包含される。本工程（２Ａ）において、好ましくは、ＳＦ－Ｏ３培地が用いられる。
本工程（２Ａ）は、前記工程（１）で得られた細胞を、ＨＧＦを含み、さらにＩＧＦ１を含んでもよい培養液中で培養する工程である。本工程（２Ａ）において用いる培養液は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えば、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ １９９培地、Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＥＭＥＭ）培地、αＭＥＭ培地、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）培地、Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２培地、ＲＰＭＩ １６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、ＳｔｅｍＰｒｏ３４（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＲＰＭＩ－ｂａｓｅ ｍｅｄｉｕｍ、ＳＦ－Ｏ３培地（エーディア株式会社）およびこれらの混合培地などが包含される。本工程（２Ａ）において、好ましくは、ＳＦ－Ｏ３培地が用いられる。
【0083】
基礎培地には、血清が含有されていてもよいし、あるいは無血清でもよい。必要に応じて、例えば、アルブミン、トランスフェリン、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）（ＥＳ細胞培養時のＦＢＳの血清代替物）、Ｎ２サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｂ２７サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、脂肪酸、インスリン、セレン（亜セレン酸ナトリウム）、コラーゲン前駆体、微量元素、２－メルカプトエタノール（２ＭＥ）、チオールグリセロールなどの１つ以上の血清代替物を含んでもよいし、脂質、アミノ酸、Ｌ－グルタミン、Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類などの１つ以上の物質も含有し得る。本工程（２）において、好ましい基礎培地は、アルブミンおよび２－メルカプトエタノールを添加したＳＦ－Ｏ３培地である。
【0084】
本工程（２Ａ）で使用する培地中におけるＨＧＦの濃度は、特に限定されないが、１ｎｇ／ｍｌ以上１００ｎｇ／ｍｌ以下が好ましく、例えば、１ｎｇ／ｍｌ、２ｎｇ／ｍｌ、３ｎｇ／ｍｌ、４ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、６ｎｇ／ｍｌ、７ｎｇ／ｍｌ、８ｎｇ／ｍｌ、９ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１５ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、３５ｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、４５ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、７０ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、９０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌであるがこれらに限定されない。より好ましくは、１ｎｇ／ｍｌ以上５０ｎｇ／ｍｌ以下であり、さらに好ましくは１０ｎｇ／ｍｌである。
【0085】
本工程（２Ａ）では、ＨＧＦに加えて、さらにＩＧＦ１を含有する培養液中で培養を行うことが好ましい。本工程（２Ａ）で使用する培地中におけるＩＧＦ１の濃度は、特に限定されないが、１ｎｇ／ｍｌ以上１００ｎｇ／ｍｌ以下が好ましく、例えば、１ｎｇ／ｍｌ、２ｎｇ／ｍｌ、３ｎｇ／ｍｌ、４ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、６ｎｇ／ｍｌ、７ｎｇ／ｍｌ、８ｎｇ／ｍｌ、９ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１５ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、３５ｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、４５ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、７０ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、９０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌであるがこれらに限定されない。より好ましくは、１ｎｇ／ｍｌ以上５０ｎｇ／ｍｌ以下であり、さらに好ましくは１０ｎｇ／ｍｌである。
【0086】
本工程（２Ａ）において、培養期間は、１日以上４０日以下が例示され、例えば、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、３１日、３２日、３３日、３４日、３５日、３６日、３７日、３８日、３９日、４０日などであり得て、好ましくは、２０日である。
【0087】
工程（２Ｂ）：（ｉ）ＩＧＦ１、ＨＧＦおよびｂＦＧＦを含む培養液中、（ｉｉ）ＩＧＦ１を含む培養液中、および（ｉｉｉ）ＩＧＦ１およびＨＧＦを含む培養液中で順次培養する工程
本工程（２Ｂ）は、前記工程（１）で得られた細胞を、
（ｉ）ＩＧＦ１、ＨＧＦおよびｂＦＧＦを含む培養液中、
（ｉｉ）ＩＧＦ１を含む培養液中、および
（ｉｉｉ）ＩＧＦ１およびＨＧＦを含む培養液中
で順次培養する工程である。本工程は前期工程（２Ａ）の代わりに行われる工程である。以下、サブ工程（ｉ）～（ｉｉｉ）について順に説明する。
本工程（２Ｂ）は、前記工程（１）で得られた細胞を、
（ｉ）ＩＧＦ１、ＨＧＦおよびｂＦＧＦを含む培養液中、
（ｉｉ）ＩＧＦ１を含む培養液中、および
（ｉｉｉ）ＩＧＦ１およびＨＧＦを含む培養液中
で順次培養する工程である。本工程は前期工程（２Ａ）の代わりに行われる工程である。以下、サブ工程（ｉ）～（ｉｉｉ）について順に説明する。
【0088】
サブ工程（ｉ）：ＩＧＦ１、ＨＧＦおよびｂＦＧＦを含む培養液中で培養する工程
本サブ工程（ｉ）において用いる培養液は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えば、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ １９９培地、Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＥＭＥＭ）培地、αＭＥＭ培地、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）培地、Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２培地、ＲＰＭＩ １６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、ＳｔｅｍＰｒｏ３４（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＲＰＭＩ－ｂａｓｅ ｍｅｄｉｕｍ、ＳＦ－Ｏ３培地（エーディア株式会社）およびこれらの混合培地などが包含される。本サブ工程（ｉ）において、好ましくは、ＳＦ－Ｏ３培地が用いられる。
本サブ工程（ｉ）において用いる培養液は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えば、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ １９９培地、Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＥＭＥＭ）培地、αＭＥＭ培地、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）培地、Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２培地、ＲＰＭＩ １６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、ＳｔｅｍＰｒｏ３４（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＲＰＭＩ－ｂａｓｅ ｍｅｄｉｕｍ、ＳＦ－Ｏ３培地（エーディア株式会社）およびこれらの混合培地などが包含される。本サブ工程（ｉ）において、好ましくは、ＳＦ－Ｏ３培地が用いられる。
【0089】
基礎培地には、血清が含有されていてもよいし、あるいは無血清でもよい。必要に応じて、例えば、アルブミン、トランスフェリン、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）（ＥＳ細胞培養時のＦＢＳの血清代替物）、Ｎ２サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｂ２７サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、脂肪酸、インスリン、セレン（亜セレン酸ナトリウム）、コラーゲン前駆体、微量元素、２－メルカプトエタノール（２ＭＥ）、チオールグリセロールなどの１つ以上の血清代替物を含んでもよいし、脂質、アミノ酸、Ｌ－グルタミン、Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類などの１つ以上の物質も含有し得る。本サブ工程（ｉ）において、好ましい基礎培地は、アルブミンおよび２－メルカプトエタノールを添加したＳＦ－Ｏ３培地である。
【0090】
本サブ工程（ｉ）で使用する培地中におけるＩＧＦ１の濃度は、特に限定されないが、１ｎｇ／ｍｌ以上１００ｎｇ／ｍｌ以下が好ましく、例えば、１ｎｇ／ｍｌ、２ｎｇ／ｍｌ、３ｎｇ／ｍｌ、４ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、６ｎｇ／ｍｌ、７ｎｇ／ｍｌ、８ｎｇ／ｍｌ、９ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１５ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、３５ｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、４５ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、７０ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、９０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌであるがこれらに限定されない。より好ましくは、１ｎｇ／ｍｌ以上５０ｎｇ／ｍｌ以下であり、さらに好ましくは１０ｎｇ／ｍｌである。
【0091】
本サブ工程（ｉ）で使用する培地中におけるＨＧＦの濃度は、特に限定されないが、１ｎｇ／ｍｌ以上１００ｎｇ／ｍｌ以下が好ましく、例えば、１ｎｇ／ｍｌ、２ｎｇ／ｍｌ、３ｎｇ／ｍｌ、４ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、６ｎｇ／ｍｌ、７ｎｇ／ｍｌ、８ｎｇ／ｍｌ、９ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１５ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、３５ｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、４５ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、７０ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、９０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌであるがこれらに限定されない。より好ましくは、１ｎｇ／ｍｌ以上５０ｎｇ／ｍｌ以下であり、さらに好ましくは１０ｎｇ／ｍｌである。
【0092】
本サブ工程（ｉ）で使用する培地中におけるｂＦＧＦの濃度は、特に限定されないが、１ｎｇ／ｍｌ以上１００ｎｇ／ｍｌ以下が好ましく、例えば、１ｎｇ／ｍｌ、２ｎｇ／ｍｌ、３ｎｇ／ｍｌ、４ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、６ｎｇ／ｍｌ、７ｎｇ／ｍｌ、８ｎｇ／ｍｌ、９ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１５ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、３５ｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、４５ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、７０ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、９０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌであるがこれらに限定されない。より好ましくは、１ｎｇ／ｍｌ以上５０ｎｇ／ｍｌ以下であり、さらに好ましくは１０ｎｇ／ｍｌである。
【0093】
本サブ工程（ｉ）において、培養期間は、１日以上１０日以下が例示され、例えば、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日などであり得て、好ましくは、４日である。
【0094】
サブ工程（ｉｉ）：ＩＧＦ１を含む培養液中で培養する工程
本サブ工程（ｉｉ）は、前記サブ工程（ｉ）で得られた細胞を、ＩＧＦ１を含む培養液中で培養する工程である。本サブ工程（ｉｉ）において用いる培養液は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えば、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ １９９培地、Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＥＭＥＭ）培地、αＭＥＭ培地、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）培地、Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２培地、ＲＰＭＩ １６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、ＳｔｅｍＰｒｏ３４（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＲＰＭＩ－ｂａｓｅ ｍｅｄｉｕｍ、ＳＦ－Ｏ３培地およびこれらの混合培地などが包含される。本サブ工程（ｉｉ）において、好ましくは、ＳＦ－Ｏ３培地が用いられる。
本サブ工程（ｉｉ）は、前記サブ工程（ｉ）で得られた細胞を、ＩＧＦ１を含む培養液中で培養する工程である。本サブ工程（ｉｉ）において用いる培養液は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えば、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ １９９培地、Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＥＭＥＭ）培地、αＭＥＭ培地、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）培地、Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２培地、ＲＰＭＩ １６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、ＳｔｅｍＰｒｏ３４（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＲＰＭＩ－ｂａｓｅ ｍｅｄｉｕｍ、ＳＦ－Ｏ３培地およびこれらの混合培地などが包含される。本サブ工程（ｉｉ）において、好ましくは、ＳＦ－Ｏ３培地が用いられる。
【0095】
基礎培地には、血清が含有されていてもよいし、あるいは無血清でもよい。必要に応じて、例えば、アルブミン、トランスフェリン、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）（ＥＳ細胞培養時のＦＢＳの血清代替物）、Ｎ２サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｂ２７サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、脂肪酸、インスリン、セレン（亜セレン酸ナトリウム）、コラーゲン前駆体、微量元素、２－メルカプトエタノール（２ＭＥ）、チオールグリセロールなどの１つ以上の血清代替物を含んでもよいし、脂質、アミノ酸、Ｌ－グルタミン、Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類などの１つ以上の物質も含有し得る。本サブ工程（ｉｉ）において、好ましい基礎培地は、アルブミンおよび2-メルカプトエタノールを添加したSF-O3培地である。
【0096】
本サブ工程（ｉｉ）で使用される培地中におけるＩＧＦ１の濃度は、特に限定されないが、１ｎｇ／ｍｌ以上１００ｎｇ／ｍｌ以下が好ましく、例えば、１ｎｇ／ｍｌ、２ｎｇ／ｍｌ、３ｎｇ／ｍｌ、４ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、６ｎｇ／ｍｌ、７ｎｇ／ｍｌ、８ｎｇ／ｍｌ、９ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１５ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、３５ｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、４５ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、７０ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、９０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌであるがこれらに限定されない。より好ましくは、１ｎｇ／ｍｌ以上５０ｎｇ／ｍｌ以下であり、さらに好ましくは１０ｎｇ／ｍｌである。
【0097】
本サブ工程（ｉｉ）において、培養期間は、１日以上１０日以下が例示され、例えば、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日などであり得て、好ましくは、３日である。
【0098】
サブ工程（ｉｉｉ）：ＩＧＦ１およびＨＧＦを含む培養液中で培養する工程
本サブ工程（ｉｉｉ）は、前記サブ工程（ｉｉ）で得られた細胞を、ＩＧＦ１およびＨＧＦを含む培養液中で培養する工程である。本サブ工程（ｉｉｉ）において用いる培養液は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えば、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ １９９培地、Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＥＭＥＭ）培地、αＭＥＭ培地、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）培地、Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２培地、ＲＰＭＩ １６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、ＳｔｅｍＰｒｏ３４（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＲＰＭＩ－ｂａｓｅ ｍｅｄｉｕｍ、ＳＦ－Ｏ３培地およびこれらの混合培地などが包含される。本サブ工程（ｉｉｉ）において、好ましくは、ＳＦ－Ｏ３培地が用いられる。
本サブ工程（ｉｉｉ）は、前記サブ工程（ｉｉ）で得られた細胞を、ＩＧＦ１およびＨＧＦを含む培養液中で培養する工程である。本サブ工程（ｉｉｉ）において用いる培養液は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えば、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ １９９培地、Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＥＭＥＭ）培地、αＭＥＭ培地、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）培地、Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２培地、ＲＰＭＩ １６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、ＳｔｅｍＰｒｏ３４（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＲＰＭＩ－ｂａｓｅ ｍｅｄｉｕｍ、ＳＦ－Ｏ３培地およびこれらの混合培地などが包含される。本サブ工程（ｉｉｉ）において、好ましくは、ＳＦ－Ｏ３培地が用いられる。
【0099】
基礎培地には、血清が含有されていてもよいし、あるいは無血清でもよい。必要に応じて、例えば、アルブミン、トランスフェリン、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）（ＥＳ細胞培養時のＦＢＳの血清代替物）、Ｎ２サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｂ２７サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、脂肪酸、インスリン、セレン（亜セレン酸ナトリウム）、コラーゲン前駆体、微量元素、２－メルカプトエタノール（２ＭＥ）、チオールグリセロールなどの１つ以上の血清代替物を含んでもよいし、脂質、アミノ酸、Ｌ－グルタミン、Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類などの１つ以上の物質も含有し得る。本サブ工程（ｉｉｉ）において、好ましい基礎培地は、アルブミンおよび２－メルカプトエタノールを添加したＳＦ－Ｏ３培地である。
【0100】
本サブ工程（ｉｉｉ）で使用される培地中におけるＩＧＦ１の濃度は、特に限定されないが、１ｎｇ／ｍｌ以上１００ｎｇ／ｍｌ以下が好ましく、例えば、１ｎｇ／ｍｌ、２ｎｇ／ｍｌ、３ｎｇ／ｍｌ、４ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、６ｎｇ／ｍｌ、７ｎｇ／ｍｌ、８ｎｇ／ｍｌ、９ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１５ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、３５ｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、４５ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、７０ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、９０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌであるがこれらに限定されない。より好ましくは、１ｎｇ／ｍｌ以上５０ｎｇ／ｍｌ以下であり、さらに好ましくは１０ｎｇ／ｍｌである。
【0101】
本サブ工程（ｉｉｉ）で使用される培地中におけるＨＧＦの濃度は、特に限定されないが、１ｎｇ／ｍｌ以上１００ｎｇ／ｍｌ以下が好ましく、例えば、１ｎｇ／ｍｌ、２ｎｇ／ｍｌ、３ｎｇ／ｍｌ、４ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、６ｎｇ／ｍｌ、７ｎｇ／ｍｌ、８ｎｇ／ｍｌ、９ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１５ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、３５ｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、４５ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、７０ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、９０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌであるがこれらに限定されない。より好ましくは、１ｎｇ／ｍｌ以上５０ｎｇ／ｍｌ以下であり、さらに好ましくは１０ｎｇ／ｍｌである。
【0102】
本サブ工程（ｉｉｉ）において、培養期間は、７日以上２０日以下が例示され、例えば、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日などであり得て、好ましくは、１４日である。
【0103】
工程（３）：ＴＧＦ－β阻害剤、ＩＧＦ１および血清を含む培養液中で培養する工程
本工程（３）は、前記工程（２Ａ）または（２Ｂ）で得られた細胞を、ＴＧＦ－β阻害剤、ＩＧＦ１および血清を含む培養液中で培養する工程である。本工程（３）において用いる培養液は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えば、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ １９９培地、Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＥＭＥＭ）培地、αＭＥＭ培地、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）培地、Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２培地、ＲＰＭＩ １６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、ＳｔｅｍＰｒｏ３４（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＲＰＭＩ－ｂａｓｅ ｍｅｄｉｕｍおよびこれらの混合培地などが包含される。本工程（３）において、好ましくは、ＤＭＥＭ培地が用いられる。
本工程（３）は、前記工程（２Ａ）または（２Ｂ）で得られた細胞を、ＴＧＦ－β阻害剤、ＩＧＦ１および血清を含む培養液中で培養する工程である。本工程（３）において用いる培養液は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えば、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ １９９培地、Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＥＭＥＭ）培地、αＭＥＭ培地、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）培地、Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２培地、ＲＰＭＩ １６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、ＳｔｅｍＰｒｏ３４（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＲＰＭＩ－ｂａｓｅ ｍｅｄｉｕｍおよびこれらの混合培地などが包含される。本工程（３）において、好ましくは、ＤＭＥＭ培地が用いられる。
【0104】
基礎培地には、血清が含有されていてもよいし、あるいは無血清でもよい。必要に応じて、例えば、アルブミン、トランスフェリン、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）（ＥＳ細胞培養時のＦＢＳの血清代替物）、Ｎ２サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｂ２７サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、脂肪酸、インスリン、セレン（亜セレン酸ナトリウム）、コラーゲン前駆体、微量元素、２－メルカプトエタノール（２ＭＥ）、チオールグリセロールなどの１つ以上の血清代替物を含んでもよいし、脂質、アミノ酸、Ｌ－グルタミン、Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類などの１つ以上の物質も含有し得る。本工程（３）において、好ましい基礎培地は、血清、Ｌ－グルタミンおよび２－メルカプトエタノールを添加したＤＭＥＭ培地である。本工程（３）において用いる血清は、ウマ血清であり、基礎培地中の濃度は、１から１０％、より好ましくは、２％である。
【0105】
本工程（３）で使用するＴＧＦβ阻害剤は、前記と同様のものを用いることができるが、好ましくは、ＳＢ４３１５４２であり得る。本工程（３）で使用される培地中におけるＳＢ４３１５４２の濃度は、特に限定されないが、５００ｎＭ以上５０μＭ以下が好ましく、例えば、５００ｎＭ、６００ｎＭ、７００ｎＭ、８００ｎＭ、９００ｎＭ、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭ、４５μＭ、５０μＭであるがこれらに限定されない。より好ましくは、１μＭ以上２０μＭ以下であり、さらに好ましくは５μＭである。
【0106】
本工程（３）で使用される培地中におけるＩＧＦ１の濃度は、特に限定されないが、１ｎｇ／ｍｌ以上１００ｎｇ／ｍｌ以下が好ましく、例えば、１ｎｇ／ｍｌ、２ｎｇ／ｍｌ、３ｎｇ／ｍｌ、４ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、６ｎｇ／ｍｌ、７ｎｇ／ｍｌ、８ｎｇ／ｍｌ、９ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１５ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、３５ｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、４５ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、７０ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、９０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌであるがこれらに限定されない。より好ましくは、１ｎｇ／ｍｌ以上５０ｎｇ／ｍｌ以下であり、さらに好ましくは１０ｎｇ／ｍｌである。
【0107】
本工程（３）において、培養期間は、９日以上５０日以下が例示され、好ましくは、２０日以上５０日以下、３０日以上５０日以下である。例えば、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、３１日、３２日、３３日、３４日、３５日、３６日、３７日、３８日、３９日、４０日、４１日、４２日、４３日、４４日、４５日、４６日、４７日、４８日、４９日、５０日などが挙げられる。
【0108】
＜骨格筋前駆細胞を精製する方法及び骨格筋前駆細胞を含む細胞群を製造する方法＞
一実施態様において、本発明は、骨格筋前駆細胞を精製する方法であって、
骨格筋前駆細胞を含む細胞集団から、細胞表面において、ＣＤ１４６（ＭＣＡＭ）が陽性であり、かつ、ＣＤ５７が陰性である細胞群を回収する工程、
を含む、方法を提供する。
一実施態様において、本発明は、骨格筋前駆細胞を精製する方法であって、
骨格筋前駆細胞を含む細胞集団から、細胞表面において、ＣＤ１４６（ＭＣＡＭ）が陽性であり、かつ、ＣＤ５７が陰性である細胞群を回収する工程、
を含む、方法を提供する。
【0109】
また、一実施態様において、本発明は、骨格筋前駆細胞を含む細胞群を製造する方法であって、
骨格筋前駆細胞を含む細胞集団から、細胞表面において、ＣＤ１４６（ＭＣＡＭ）が陽性であり、かつ、ＣＤ５７が陰性である細胞群を回収する工程
を含む、方法を提供する。
骨格筋前駆細胞を含む細胞集団から、細胞表面において、ＣＤ１４６（ＭＣＡＭ）が陽性であり、かつ、ＣＤ５７が陰性である細胞群を回収する工程
を含む、方法を提供する。
【0110】
本明細書において、「骨格筋前駆細胞を含む細胞集団」は、本発明の方法を適用する前の細胞集団であって、本発明の方法を適用することによって得られる「骨格筋前駆細胞を含む細胞群」と区別するために本明細書において用いられる。本発明において、「骨格筋前駆細胞を含む細胞集団」は、多能性幹細胞由来、例えば、ＥＳ細胞、ｎｔＥＳ細胞及びｉＰＳ細胞からなる群から選択される多能性幹細胞由来であってもよい。
【0111】
骨格筋前駆細胞を含む細胞集団から、細胞表面において、ＣＤ１４６（ＭＣＡＭ）が陽性であり、かつ、ＣＤ５７が陰性である細胞群を回収する工程は、細胞表面において、ＣＤ１４６（ＭＣＡＭ）が陽性であり、かつ、ＣＤ５７が陰性である細胞を特異的に選択して回収可能である方法を適用すればよい。例えば、ＣＤ１４６（ＭＣＡＭ）に特異的に結合する結合剤と、ＣＤ５７に特異的に結合する結合剤とを用いて、実施することが可能である。
【0112】
本明細書において、「特異的に結合する結合剤」とは、目的のタンパク質の少なくとも一部分に選択的に結合する物質であり、例えば、抗体、リガンド、又はアプタマーなどを含む。一実施態様において、本発明で使用され得る結合剤は、ＣＤ１４６（ＭＣＡＭ）及びＣＤ５７特異的結合剤である。
【0113】
一実施態様において、本発明で使用される結合剤としての「抗体」は、目的のタンパク質に結合するポリクローナル抗体、モノクローナル抗体またはその結合フラグメントであってもよい。本明細書において、「結合フラグメント」とは、例えば、単量体Ｆａｂフラグメント、単量体Ｆａｂ’フラグメント、または二量体Ｆ（ａｂ）’２フラグメント、又は単鎖抗体分子（ｓｃＦｖ）を包含する。
【0114】
一実施態様において、本発明で使用される結合剤としての「アプタマー」とは、目的の分子に特異的に結合し得るに結合する能力を持つ合成ＤＮＡ、ＲＮＡ分子又はその合成類似体をいう。本発明に用いられるアプタマーは、例えば、ＳＥＬＥＸ法を用い、目的のタンパク質（例えば、ＣＤ１４６又ＣＤ５７）への結合を、インビトロで反復して選択することにより得ることができる（Ｔｕｅｒｋ Ｃ．，Ｇｏｌｄ Ｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９０，２４９（４９６８），５０５－５１０；Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ ＡＤ，Ｓｚｏｓｔａｋ ＪＷ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９９０，３４６（６２８７）：８１８－８２２；米国特許第６，８６７，２８９号明細書；米国特許第５，５６７，５８８号明細書；米国特許第６，６９９，８４３号明細書を参照）。
【0115】
一実施態様において、本発明で使用される結合剤としての「リガンド」とは、目的のタンパク質に特異的に結合し得るタンパク質であり、本発明に用いられる特異的結合剤として、以下に限定されないが、例えばＣＤ１４６（ＭＣＡＭ）に対するリガンドであるＧａｌｅｃｔｉｎ－１、Ｌａｍｉｎｉｎ－４１１又はｎｅｔｒｉｎ－１や、ＣＤ５７のリガンドであるＣＤ６２Ｌ又はＣＤ６２Ｐ等を用いることができる。
【0116】
一実施態様において、細胞表面において、ＣＤ１４６（ＭＣＡＭ）が陽性であり、かつ、ＣＤ５７が陰性である細胞群を回収する工程は、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）法又は磁気細胞選別（ＭＡＣＳ）法を用いることができる。
【0117】
本明細書において、蛍光活性化細胞選別法とは、非常に細い流液中に細胞粒子を高速度で流し、レーザー光を照射して、粒子が発生する蛍光(細胞が予め蛍光標識された場合)、散乱光などの光を測定する方法であり、さらにセルソーターを備えた装置を用いると、目的の細胞を単離することができる。従って、本発明の細胞群を回収する工程が、蛍光活性化細胞選別法である場合、任意の蛍光物質で標識された結合剤が用いられ得る。
【0118】
本明細書において、磁気細胞選別（ＭＡＣＳ）法とは、結合剤を担持した磁気ビーズを用いて、目的の細胞を磁石で捕捉することにより分別する手法である。従って、本発明の細胞群を回収する工程が、磁気細胞選別法である場合、磁気ビーズに担持された結合剤が用いられ得る。
【0119】
本発明の方法を実施することによって得られる骨格筋前駆細胞を含む細胞群は、生体における適用部位において、線維化を誘発せずに筋原性疾患を罹患する対象を治療することができる。また、本発明の方法を、骨格筋前駆細胞を含む細胞集団、例えば、骨格筋前駆細胞を含む、多能性幹細胞由来の細胞集団に実施した場合は、Ｐａｘ７陽性の骨格筋前駆細胞を３０％以上含む細胞群が得られ、これにより、生体における適用部位において、線維化を誘発せずに筋原性疾患を罹患する対象を治療するができる。
【0120】
一実施態様において、本発明は、上記の骨格筋前駆細胞を精製する方法、又は骨格筋前駆細胞を含む細胞群を製造する方法に使用するためのキットであって、ＣＤ１４６（ＭＣＡＭ）に特異的に結合する結合剤、及びＣＤ５７に特異的に結合する結合剤を含む、キットを提供する。本発明のキットは、さらに、上記方法の実施に必要な構成要素を適宜含み得、例えば、マグネット（例えばＭＡＣＳ法の場合）、洗浄バッファー、及び／又は当該キットの取り扱い説明書等が含まれるものであってもよい。
【0121】
一実施態様において、本発明は、上記の骨格筋前駆細胞を精製する方法、又は骨格筋前駆細胞を含む細胞群を製造する方法によって得られる骨格筋前駆細胞を含む細胞群を提供する。
【0122】
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明がこれらに限定されないことは言うまでもない。
【実施例】
【0123】
１．実験材料及び方法
１－１．多能性幹細胞の培養
ヒトｉＰＳ細胞（ＷＪ１４－ｓ０１、Ｆｆ－ＷＪｓ５１３）は、京都大学の山中教授より供与されたものを、Ｅａｓｙ ｉＭａｔｒｉｘ－５１１ ｓｉｌｋ（Ｎｉｐｐｉ）コートした培養容器上でＳｔｅｍＦｉｔ ＡＫ０２Ｎ培地（ＡＪＩＮＯＭＯＴＯ） で培養した。
１－１．多能性幹細胞の培養
ヒトｉＰＳ細胞（ＷＪ１４－ｓ０１、Ｆｆ－ＷＪｓ５１３）は、京都大学の山中教授より供与されたものを、Ｅａｓｙ ｉＭａｔｒｉｘ－５１１ ｓｉｌｋ（Ｎｉｐｐｉ）コートした培養容器上でＳｔｅｍＦｉｔ ＡＫ０２Ｎ培地（ＡＪＩＮＯＭＯＴＯ） で培養した。
【0124】
ＷＪ１４－ｓ０１を常法に従って相同組換えによりＰａｘ７遺伝子座の開始コドンの５’側へＮＬＳ－Ｖｅｎｕｓ－Ｔ２Ａ配列を連結させ、Ｐａｘ７の発現と連携してＶｅｎｕｓを発現するｉＰＳ細胞株（ｓ０１－Ｐａｘ７－Ｖｅｎｕｓ）を作製した。
【0125】
１－２．ヒトｉＰＳ細胞から骨格筋幹細胞群への分化誘導
ヒトｉＰＳ細胞から骨格筋前駆細胞群への分化誘導は次の通り行った（国際特許ＷＯ２０１６／１０８２８８を参照）。
ヒトｉＰＳ細胞から骨格筋前駆細胞群への分化誘導は次の通り行った（国際特許ＷＯ２０１６／１０８２８８を参照）。
【0126】
工程（１ａ）［Ｄａｙ０－１４］
ＭａｔｒｉＧｅｌでコートした培養容器上で５μＭ ＳＢ４３１５４２および１０μＭ ＣＨＩＲ９９０２１を添加したＣＤＭｉ基本培地（１％ Ａｌｂｕｍｉｎ ｆｒｏｍ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ（ＳＩＧＭＡ）、１％ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ Ｍｉｘｅｄ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ナカライテスク）、１％ ＣＤ Ｌｉｐｉｄ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１％ Ｉｎｓｕｌｉｎ－Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ－Ｓｅｌｅｎｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、４５０μＭ １－Ｔｈｉｏｇｌｙｃｅｒｏｌ（ＳＩＧＭＡ）を添加したＩＭＤＭ（１×） Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（＋）Ｌ－Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（＋） ２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とＦ－１２（１×） Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ（Ｈａｍ）（＋）Ｌ－Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を１：１で混合した培地）を添加し培養した。７、１４日目に通常の方法にて継代した。
ＭａｔｒｉＧｅｌでコートした培養容器上で５μＭ ＳＢ４３１５４２および１０μＭ ＣＨＩＲ９９０２１を添加したＣＤＭｉ基本培地（１％ Ａｌｂｕｍｉｎ ｆｒｏｍ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ（ＳＩＧＭＡ）、１％ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ Ｍｉｘｅｄ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ナカライテスク）、１％ ＣＤ Ｌｉｐｉｄ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１％ Ｉｎｓｕｌｉｎ－Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ－Ｓｅｌｅｎｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、４５０μＭ １－Ｔｈｉｏｇｌｙｃｅｒｏｌ（ＳＩＧＭＡ）を添加したＩＭＤＭ（１×） Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（＋）Ｌ－Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（＋） ２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とＦ－１２（１×） Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ（Ｈａｍ）（＋）Ｌ－Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を１：１で混合した培地）を添加し培養した。７、１４日目に通常の方法にて継代した。
【0127】
工程（１ｂ）［Ｄａｙ１５－１６］
工程（１ａ）で得られた細胞の培地をＣＤＭｉ基本培地に交換し、培養を続けた。
工程（１ａ）で得られた細胞の培地をＣＤＭｉ基本培地に交換し、培養を続けた。
【0128】
工程（２ａ）［Ｄａｙ１７－２０］
工程（１ｂ）で得られた細胞の培地を０．２％ ＢＳＡ（ＳＩＧＭＡ）、２００μＭ ２－Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、１０ｎｇ／ｍＬ ＩＧＦ－１（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、１０ｎｇ／ｍＬ ＨＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）および１０ｎｇ／ｍＬ ｂＦＧＦ（オリエンタルバイオ）を添加したＳＦ－Ｏ３培地に交換し、培養を続けた。
工程（１ｂ）で得られた細胞の培地を０．２％ ＢＳＡ（ＳＩＧＭＡ）、２００μＭ ２－Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、１０ｎｇ／ｍＬ ＩＧＦ－１（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、１０ｎｇ／ｍＬ ＨＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）および１０ｎｇ／ｍＬ ｂＦＧＦ（オリエンタルバイオ）を添加したＳＦ－Ｏ３培地に交換し、培養を続けた。
【0129】
工程（２ｂ）［Ｄａｙ２１－２３］
工程（２ａ）で得られた細胞の培地を０．２％ ＢＳＡ（ＳＩＧＭＡ）、２００μＭ ２－Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、１０ｎｇ／ｍＬ ＩＧＦ－１（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を添加したＳＦ－Ｏ３培地に交換し、培養を続けた。
工程（２ａ）で得られた細胞の培地を０．２％ ＢＳＡ（ＳＩＧＭＡ）、２００μＭ ２－Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、１０ｎｇ／ｍＬ ＩＧＦ－１（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を添加したＳＦ－Ｏ３培地に交換し、培養を続けた。
【0130】
工程（２ｃ）［Ｄａｙ２４－３７］
工程（２ｂ）で得られた細胞の培地を０．２％ ＢＳＡ（ＳＩＧＭＡ）、２００μＭ ２－Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、１０ｎｇ／ｍＬ ＩＧＦ－１（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）および１０ｎｇ／ｍＬ ＨＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を添加したＳＦ－Ｏ３培地に交換し、培養を続けた。
工程（２ｂ）で得られた細胞の培地を０．２％ ＢＳＡ（ＳＩＧＭＡ）、２００μＭ ２－Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、１０ｎｇ／ｍＬ ＩＧＦ－１（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）および１０ｎｇ／ｍＬ ＨＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を添加したＳＦ－Ｏ３培地に交換し、培養を続けた。
【0131】
工程（３）［Ｄａｙ３８－］
工程（２ｃ）で得られた細胞の培地を２％ Ｈｏｒｓｅ Ｓｅｒｕｍ、１％ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ Ｍｉｘｅｄ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、２００μＭ ２－Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、５μＭ ＳＢ４３１５４２および１０ｎｇ／ｍＬ ＩＧＦ－１を添加した培地に交換し、Ｄａｙ８０程度までは培養した。
工程（２ｃ）で得られた細胞の培地を２％ Ｈｏｒｓｅ Ｓｅｒｕｍ、１％ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ Ｍｉｘｅｄ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、２００μＭ ２－Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、５μＭ ＳＢ４３１５４２および１０ｎｇ／ｍＬ ＩＧＦ－１を添加した培地に交換し、Ｄａｙ８０程度までは培養した。
【0132】
１－３．ＦＡＣＳ解析と選別
上述の方法により骨格筋前駆細胞へ分化誘導した細胞を単一細胞へ分散後に抗体と反応させ、ＢＤ ＦＡＣＳ Ａｒｉａ Ｆｕｓｉｏｎ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｅｒ（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）にて解析および選別を行った。抗体はＡＰＣ標識抗ヒト／マウスＣＤ２０７抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＢＶ６５０標識抗ヒトＦＧＦＲ４抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＡＰＣ標識抗ヒトＭＣＡＭ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＰＥ標識抗ヒトＣＤ５７抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびＡｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ ６４７標識抗ヒトＣＤ８２抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を用いた。
上述の方法により骨格筋前駆細胞へ分化誘導した細胞を単一細胞へ分散後に抗体と反応させ、ＢＤ ＦＡＣＳ Ａｒｉａ Ｆｕｓｉｏｎ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｅｒ（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）にて解析および選別を行った。抗体はＡＰＣ標識抗ヒト／マウスＣＤ２０７抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＢＶ６５０標識抗ヒトＦＧＦＲ４抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＡＰＣ標識抗ヒトＭＣＡＭ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＰＥ標識抗ヒトＣＤ５７抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびＡｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ ６４７標識抗ヒトＣＤ８２抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を用いた。
【0133】
ｓ０１－Ｐａｘ７－Ｖｅｎｕｓ細胞を用いたＰａｘ７陽性細胞の解析および選別はＶｅｎｕｓを指標として行った。
【0134】
１－４．ＲＮＡ抽出、ｃＤＮＡ合成、定量ＰＣＲ
細胞からｍＲＮＡをＲｅｌｉａｐｒｅｐ ＲＮＡ Ｃｅｌｌ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ） で抽出し、ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ ｑＰＣＲ ＲＴ Ｋｉｔ（東洋紡）を用いてｃＤＮＡを合成した。定量ＰＣＲはｃＤＮＡ、ＰｏｗｅｒＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ） およびプライマーを用いてＳｔｅｐＯｎｅ ＰｌｕｓリアルタイムＰＣＲシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）により実施した。
細胞からｍＲＮＡをＲｅｌｉａｐｒｅｐ ＲＮＡ Ｃｅｌｌ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ） で抽出し、ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ ｑＰＣＲ ＲＴ Ｋｉｔ（東洋紡）を用いてｃＤＮＡを合成した。定量ＰＣＲはｃＤＮＡ、ＰｏｗｅｒＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ） およびプライマーを用いてＳｔｅｐＯｎｅ ＰｌｕｓリアルタイムＰＣＲシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）により実施した。
【0135】
【表1】
【0136】
１－５．筋管細胞への分化誘導
ｉＭａｔｒｉｘ－５１１コートした培養容器上で２％ Ｈｏｒｓｅ Ｓｅｒｕｍ、１％ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ Ｍｉｘｅｄ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、２００μＭ ２－Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、５μＭ ＳＢ４３１５４２および１０ｎｇ／ｍＬ ＩＧＦ－１を添加した培地で細胞を３日間培養した。
ｉＭａｔｒｉｘ－５１１コートした培養容器上で２％ Ｈｏｒｓｅ Ｓｅｒｕｍ、１％ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ Ｍｉｘｅｄ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、２００μＭ ２－Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、５μＭ ＳＢ４３１５４２および１０ｎｇ／ｍＬ ＩＧＦ－１を添加した培地で細胞を３日間培養した。
【0137】
１－６．筋管細胞の免疫染色と計測
筋管細胞へ分化誘導した細胞を２％ パラホルムアルデヒドで固定後、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｏｎｅ（ナカライテスク）でブロッキングした。一次抗体はマウス抗ミオシン重鎖（ＭＨＣ）抗体（１：８００、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を、二次抗体はＡｌｅｘａ５６８標識抗マウスＩｇＧ抗体（１：５００、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を、核染色は１μｇ／ｍＬのＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ）を用いた。画像はオールインワン蛍光顕微鏡ＢＺ－Ｘ７００（Ｋｅｙｅｎｃｅ）で撮影し、Ｈｙｂｒｉｄ ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｋｅｙｅｎｃｅ）を用いてＭＨＣ陽性のＤＡＰＩの数を計測し、陽性率を算出した。
筋管細胞へ分化誘導した細胞を２％ パラホルムアルデヒドで固定後、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｏｎｅ（ナカライテスク）でブロッキングした。一次抗体はマウス抗ミオシン重鎖（ＭＨＣ）抗体（１：８００、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を、二次抗体はＡｌｅｘａ５６８標識抗マウスＩｇＧ抗体（１：５００、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を、核染色は１μｇ／ｍＬのＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ）を用いた。画像はオールインワン蛍光顕微鏡ＢＺ－Ｘ７００（Ｋｅｙｅｎｃｅ）で撮影し、Ｈｙｂｒｉｄ ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｋｅｙｅｎｃｅ）を用いてＭＨＣ陽性のＤＡＰＩの数を計測し、陽性率を算出した。
【0138】
１－７．移植実験
重度免疫不全マウスＮＳＧ（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ＩＬ２Ｒγｎｕｌｌ）とジストロフィンを発現しないＤＭＤｎｕｌｌマウスを交配させた６－８週齢のＤＭＤ／ＮＳＧマウスを用いた。マウスの後肢腓腹筋に８×１０５個のＣＤ８２陽性ＣＤ５７陰性細胞もしくはＭＣＡＭ陽性ＣＤ５７陰性細胞を注入した。移植後２８日目に腓腹筋を採材し、凍結切片を作製した。
重度免疫不全マウスＮＳＧ（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ＩＬ２Ｒγｎｕｌｌ）とジストロフィンを発現しないＤＭＤｎｕｌｌマウスを交配させた６－８週齢のＤＭＤ／ＮＳＧマウスを用いた。マウスの後肢腓腹筋に８×１０５個のＣＤ８２陽性ＣＤ５７陰性細胞もしくはＭＣＡＭ陽性ＣＤ５７陰性細胞を注入した。移植後２８日目に腓腹筋を採材し、凍結切片を作製した。
【0139】
１－８．組織切片の染色
腓腹筋の凍結切片を４％パラホルムアルデヒドで固定後、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｏｎｅ（ナカライテスク）でブロッキングした。一次抗体は抗ジストロフィン抗体（１：５００、ａｂｃａｍ）、抗ラミンＡ／Ｃ抗体（１：２００、Ｌｅｉｃａ）および抗ラミニンα２抗体（１：５０、ＡＬＥＸＩＳ）を、二次抗体はＡｌｅｘ４８８標識抗マウスＩｇＧ２ｂ抗体、Ａｌｅｘ５６８標識抗マウスＩｇＧ１抗体およびＡｌｅｘ６４７標識抗ラットＩｇＧ抗体を核染色は１μｇ／ｍＬのＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ）を用いた。
腓腹筋の凍結切片を４％パラホルムアルデヒドで固定後、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｏｎｅ（ナカライテスク）でブロッキングした。一次抗体は抗ジストロフィン抗体（１：５００、ａｂｃａｍ）、抗ラミンＡ／Ｃ抗体（１：２００、Ｌｅｉｃａ）および抗ラミニンα２抗体（１：５０、ＡＬＥＸＩＳ）を、二次抗体はＡｌｅｘ４８８標識抗マウスＩｇＧ２ｂ抗体、Ａｌｅｘ５６８標識抗マウスＩｇＧ１抗体およびＡｌｅｘ６４７標識抗ラットＩｇＧ抗体を核染色は１μｇ／ｍＬのＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ）を用いた。
【0140】
ＨＥ染色はヘマトキシリン（Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ）、エオシン（Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ）を用いて実施した。
【0141】
Ｓｉｒｉｕｓ Ｒｅｄ染色はＰｉｃｒｏｓｉｒｉｕｓ Ｒｅｄ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて実施した。画像はオールインワン蛍光顕微鏡ＢＺ－Ｘ７００（Ｋｅｙｅｎｃｅ）で撮影し、Ｈｙｂｒｉｄ ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｋｅｙｅｎｃｅ）を用いてコラーゲンの染色面積を計測し、線維化面積の比率を算出した。
【0142】
１－９．ＲＮＡシークエンス
細胞からｍＲＮＡをＲｅｌｉａｐｒｅｐ ＲＮＡ Ｃｅｌｌ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で抽出後、ＴｒｕＳｅｑ Ｓｔｒａｎｄ ｍＲＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いて作製したｃＤＮＡライブラリーをＮｅｘｔＳｅｑ ５００／５５０ ｖ２．５ ｋｉｔでシークエンスを行った。シークエンスの結果をＢＣＬ２ＦＡＳＴＱ Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ １．８．４を用いてＦＡＳＴＱ形式に変換後、ＲＰＭＫｆｏｒｇｅｎｅｓを用いて定量した。定量結果をＧｅｎｅｓｐｒｉｎｇ ＧＸ １３ ｓｏｆｔｗａｒｅにより解析した。
細胞からｍＲＮＡをＲｅｌｉａｐｒｅｐ ＲＮＡ Ｃｅｌｌ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で抽出後、ＴｒｕＳｅｑ Ｓｔｒａｎｄ ｍＲＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いて作製したｃＤＮＡライブラリーをＮｅｘｔＳｅｑ ５００／５５０ ｖ２．５ ｋｉｔでシークエンスを行った。シークエンスの結果をＢＣＬ２ＦＡＳＴＱ Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ １．８．４を用いてＦＡＳＴＱ形式に変換後、ＲＰＭＫｆｏｒｇｅｎｅｓを用いて定量した。定量結果をＧｅｎｅｓｐｒｉｎｇ ＧＸ １３ ｓｏｆｔｗａｒｅにより解析した。
【0143】
２．結果
２－１．骨格筋幹細胞マーカーの探索
Ｐａｘ７の発現と連携して蛍光タンパク質Ｖｅｎｕｓを発現するヒトｉＰＳ細胞（ｓ０１－Ｐａｘ７－Ｖｅｎｕｓ）を分化誘導して得た骨格筋前駆細胞群からＰａｘ７陽性ＣＤ５７陰性細胞およびＰａｘ７陰性細胞を選別し、ＲＮＡシークエンスにより遺伝子の発現量を測定した。Ｐａｘ７陽性ＣＤ５７陰性細胞で遺伝子の発現量が多く、タンパク質が細胞膜に局在しているマーカー候補としてＣＤ２０７、ＦＧＦＲ４およびＭＣＡＭを見出した（図１）。
２－１．骨格筋幹細胞マーカーの探索
Ｐａｘ７の発現と連携して蛍光タンパク質Ｖｅｎｕｓを発現するヒトｉＰＳ細胞（ｓ０１－Ｐａｘ７－Ｖｅｎｕｓ）を分化誘導して得た骨格筋前駆細胞群からＰａｘ７陽性ＣＤ５７陰性細胞およびＰａｘ７陰性細胞を選別し、ＲＮＡシークエンスにより遺伝子の発現量を測定した。Ｐａｘ７陽性ＣＤ５７陰性細胞で遺伝子の発現量が多く、タンパク質が細胞膜に局在しているマーカー候補としてＣＤ２０７、ＦＧＦＲ４およびＭＣＡＭを見出した（図１）。
【0144】
次にＰａｘ７陽性細胞のＣＤ２０７、ＦＧＦＲ４およびＭＣＡＭの陽性率を検討した。その結果、９８％のＰａｘ７陽性細胞がＭＣＡＭ陽性であった（図２）。
【0145】
次にｉＰＳ細胞を分化誘導して得た骨格筋前駆細胞群からＰａｘ７陽性細胞をＭＣＡＭで選別した時の純度と収率を検討した。ＭＣＡＭ陽性ＣＤ５７陰性細胞中のＰａｘ７陽性細胞の純度と収率はそれぞれ５６％、７６％であった。これまでに報告されている骨格筋前駆細胞を選別する細胞表面マーカーＣＤ８２（Ｍａｔｔｈｅｗ Ｓ． Ａｌｅｘａｎｄｅｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ １９， １， ２０１６）を用いた場合に比べて大幅に改善していた（表２）。
【0146】
【表2】
【0147】
２－２．ＭＣＡＭ陽性ＣＤ５７陰性細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏでの表現型
ヒトｉＰＳ細胞を分化誘導して得た骨格筋前駆細胞群からＣＤ５７陽性細胞、ＭＣＡＭ陽性ＣＤ５７陰性細胞およびＭＣＡＭ陰性ＣＤ５７陰性細胞を選別後、Ｐａｘ７、ＭｙｏＤ、ＴＦＡＰ２ＡおよびＰＤＧＦＲα遺伝子の発現量を定量した。骨格筋前駆細胞マーカーのＰａｘ７や骨格筋細胞マーカーのＭｙｏＤはＭＣＡＭ陽性ＣＤ５７陰性細胞で発現が高かった。一方、骨格筋以外の細胞マーカーであるＴＦＡＰ２Ａ（神経提細胞マーカー）、ＰＤＧＦＲα（間葉系幹細胞マーカー）はＭＣＡＭ陽性ＣＤ５７陰性細胞で発現が低かった（図３）。
ヒトｉＰＳ細胞を分化誘導して得た骨格筋前駆細胞群からＣＤ５７陽性細胞、ＭＣＡＭ陽性ＣＤ５７陰性細胞およびＭＣＡＭ陰性ＣＤ５７陰性細胞を選別後、Ｐａｘ７、ＭｙｏＤ、ＴＦＡＰ２ＡおよびＰＤＧＦＲα遺伝子の発現量を定量した。骨格筋前駆細胞マーカーのＰａｘ７や骨格筋細胞マーカーのＭｙｏＤはＭＣＡＭ陽性ＣＤ５７陰性細胞で発現が高かった。一方、骨格筋以外の細胞マーカーであるＴＦＡＰ２Ａ（神経提細胞マーカー）、ＰＤＧＦＲα（間葉系幹細胞マーカー）はＭＣＡＭ陽性ＣＤ５７陰性細胞で発現が低かった（図３）。
【0148】
次にヒトｉＰＳ細胞を分化誘導して得た骨格筋前駆細胞群からＣＤ５７陽性細胞、ＭＣＡＭ陽性ＣＤ５７陰性細胞およびＭＣＡＭ陰性ＣＤ５７陰性細胞を選別後、筋管細胞への分化能を検討した。ＭＣＡＭ陽性ＣＤ５７陰性細胞はＭＨＣで染色される筋管細胞に分化し、ＭＨＣ陽性率は約８０％であった（図４）
【0149】
２－３．ＭＣＡＭ陽性ＣＤ５７陰性細胞の移植試験
ＣＤ８２陽性ＣＤ５７陰性細胞およびＭＣＡＭ陽性ＣＤ５７陰性細胞のＤＭＤ／ＮＳＧマウスに対する移植の効果を検討した。移植４週後の組織切片でジストロフィンに対する免疫染色を行い移植細胞の生着能および筋再生能を評価した。ＣＤ８２陽性ＣＤ５７陰性細胞およびＭＣＡＭ陽性ＣＤ５７陰性細胞のいずれの細胞を移植した場合でも宿主の筋線維と融合が認められ、ジストロフィン陽性筋線維数は同程度であった（図５）。
ＣＤ８２陽性ＣＤ５７陰性細胞およびＭＣＡＭ陽性ＣＤ５７陰性細胞のＤＭＤ／ＮＳＧマウスに対する移植の効果を検討した。移植４週後の組織切片でジストロフィンに対する免疫染色を行い移植細胞の生着能および筋再生能を評価した。ＣＤ８２陽性ＣＤ５７陰性細胞およびＭＣＡＭ陽性ＣＤ５７陰性細胞のいずれの細胞を移植した場合でも宿主の筋線維と融合が認められ、ジストロフィン陽性筋線維数は同程度であった（図５）。
【0150】
また、移植部位の組織切片に対するＨＥ染色においてＣＤ８２陽性ＣＤ５７陰性細胞を移植した組織では間質が拡大し筋線維の配列が乱れていたのに対し、ＭＣＡＭ陽性ＣＤ５７陰性細胞を移植した組織では正常な筋線維の組織像であった（図６）。
【0151】
さらに、移植部位の組織切片に対するＳｉｒｉｕｓ Ｒｅｄ染色においてＣＤ８２陽性ＣＤ５７陰性細胞を移植した組織では拡大した間質で繊維化が亢進しているのに対し、ＭＣＡＭ陽性ＣＤ５７陰性細胞を移植した組織では異常な繊維化は認められなかった（図７）。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4a】
【図4b】
【図5】
【図6】
【図7a】
【図7b】
【配列表】