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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-01-31
(45)【発行日】2024-02-08
(54)【発明の名称】ＳＳＸ２抗原の短いペプチドを識別するＴ細胞受容体
(51)【国際特許分類】
C07K 14/725 20060101AFI20240201BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20240201BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20240201BHJP
C12N 15/867 20060101ALI20240201BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20240201BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20240201BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240201BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240201BHJP
C12N 5/0783 20100101ALI20240201BHJP
C12N 5/0789 20100101ALI20240201BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240201BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20240201BHJP
A61K 35/12 20150101ALI20240201BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20240201BHJP
A61K 38/17 20060101ALI20240201BHJP
【ＦＩ】
C07K14/725 ZNA
C12N15/12
C12N15/62 Z
C12N15/867 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12N5/0783
C12N5/0789
A61P35/00
A61P37/06
A61K35/12
A61K35/17
A61K38/17
【請求項の数】
34
(21)【出願番号】P 2022506517
(86)(22)【出願日】2019-07-30
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-11-30
(86)【国際出願番号】 CN2019098439
(87)【国際公開番号】W WO2021016887
(87)【国際公開日】2021-02-04
【審査請求日】2022-07-28
(73)【特許権者】
【識別番号】521121053
【氏名又は名称】エックスライフエスシー リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100102842
【弁理士】
【氏名又は名称】葛和 清司
(72)【発明者】
【氏名】リ，イ
(72)【発明者】
【氏名】フ，ジン
(72)【発明者】
【氏名】スン，ハンリ
【審査官】福間 信子
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１４－５００００２（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１６－５２５５３７（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１６－５２３２６８（ＪＰ，Ａ）
【文献】ABATA-DAGA D. et al.，Development of a T Cell Receptor Targeting an HLA-A*0201 Restricted Epitope from the Cancer-Testis Antigen SSX2 for Adoptive Immunotherapy of Cancer，PLOS ONE, 2014, vol. 9, no. 3, e93321
【文献】CHINNASAMY N. et al.，Development of a T Cell Receptor Targeting the HLA-A*0201 Restricted Epitope SSX2: 41-49 for Adoptive Immunotherapy of Cancer，Molecular Therapy, 2011, vol. 19, Suppl. 1, p. S89-S90
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）であって、前記ＴＣＲは、ＫＡＳＥＫＩＦＹＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）―ＨＬＡ Ａ０２０１複合体に結合することができ、前記ＴＣＲは、ＴＣＲα鎖可変ドメインおよびＴＣＲβ鎖可変ドメインを含み、
前記ＴＣＲα鎖可変ドメインの三つの相補性決定領域（ＣＤＲ）は、
α ＣＤＲ１―ＤＳＳＳＴＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）、
α ＣＤＲ２―ＩＦＳＮＭＤＭ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）、
α ＣＤＲ３―ＡＥＰＮＱＡＧＴＡＬＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）であり、および
前記ＴＣＲβ鎖可変ドメインの三つの相補性決定領域は、
β ＣＤＲ１―ＭＮＨＥＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）、
β ＣＤＲ２―ＳＶＧＥＧＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）、
β ＣＤＲ３―ＡＳＳＳＬＥＤＰＹＥＱＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）であることを特徴とする、前記ＴＣＲ。
【請求項2】
ＴＣＲα鎖可変ドメインおよびＴＣＲβ鎖可変ドメインを含み、前記ＴＣＲα鎖可変ドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列であり、および／または前記ＴＣＲβ鎖可変ドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列であることを特徴とする請求項１に記載のＴＣＲ。
【請求項3】
前記ＴＣＲは、α鎖可変ドメインのアミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１を含むことを特徴とする請求項１に記載のＴＣＲ。
【請求項4】
前記ＴＣＲは、β鎖可変ドメインのアミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５を含むことを特徴とする請求項１に記載のＴＣＲ。
【請求項5】
前記ＴＣＲは、ＴＣＲα鎖定常領域ＴＲＡＣ＊０１およびＴＣＲβ鎖定常領域ＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１を含む、αβヘテロダイマーであることを特徴とする請求項１に記載のＴＣＲ。
【請求項6】
前記ＴＣＲのα鎖アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３であり、および／または前記ＴＣＲのβ鎖アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７であることを特徴とする請求項５に記載のＴＣＲ。
【請求項7】
前記ＴＣＲは、可溶性であることを特徴とする請求項１～４のいずれか１項に記載のＴＣＲ。
【請求項8】
前記ＴＣＲは、一本鎖であることを特徴とする請求項７に記載のＴＣＲ。
【請求項9】
前記ＴＣＲは、ペプチドリンカー配列を介してα鎖可変ドメインとβ鎖可変ドメインとを結合することによって形成されることを特徴とする請求項８に記載のＴＣＲ。
【請求項10】
前記ＴＣＲは、α鎖可変領域の１１、１３、１９、２１、５３、７６、８９、９１、または９４番目のアミノ酸位置、および／またはα鎖Ｊ遺伝子の短いペプチドの最後から３番目、最後から５番目または最後から７番目のアミノ酸位置に一つまたは複数の突然変異を有し、および／または前記ＴＣＲは、β鎖可変領域の１１、１３、１９、２１、５３、７６、８９、９１、または９４番目のアミノ酸位置、および／またはβ鎖Ｊ遺伝子の短いペプチドの最後から２番目、最後から４番目または最後から６番目のアミノ酸位置に一つまたは複数の突然変異を有し、ここで、アミノ酸の位置番号は、ＩＭＧＴ（国際免疫遺伝学情報システム）に記載された位置番号によることを特徴とする請求項９に記載のＴＣＲ。
【請求項11】
前記ＴＣＲα鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２を含み、および／または前記ＴＣＲβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４を含むことを特徴とする請求項１０に記載のＴＣＲ。
【請求項12】
前記ＴＣＲのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０であることを特徴とする請求項１１に記載のＴＣＲ。
【請求項13】
システイン残基は、前記ＴＣＲのα鎖定常ドメインとβ鎖定常ドメインとの間に人工的なジスルフィド結合を形成し、且つ
前記ＴＣＲにおいて人工的なジスルフィド結合を形成するシステイン残基は、
ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＴｈｒ４８およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＳｅｒ５７、
ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＴｈｒ４５およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＳｅｒ７７、
ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＴｙｒ１０およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＳｅｒ１７、
ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＴｈｒ４５およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＡｓｐ５９、
ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＳｅｒ１５およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＧｌｕ１５、
ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＡｒｇ５３およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＳｅｒ５４、
ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＰｒｏ８９およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＡｌａ１９、および
ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＴｙｒ１０およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＧｌｕ２０から選択される一つまたは複数の部位を置換することを特徴とする
請求項７に記載のＴＣＲ。
【請求項14】
前記ＴＣＲα鎖アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６であり、および／または前記ＴＣＲβ鎖アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８であることを特徴とする請求項１３に記載のＴＣＲ。
【請求項15】
前記ＴＣＲのα鎖可変領域とβ鎖定常領域との間には、人工的な鎖間ジスルフィド結合が含まれることを特徴とする請求項７に記載のＴＣＲ。
【請求項16】
前記ＴＣＲにおいて人工的な鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基は、ＴＲＡＶの４６番目のアミノ酸およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１の６０番目のアミノ酸、
ＴＲＡＶの４７番目のアミノ酸およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１の６１番目のアミノ酸、
ＴＲＡＶの４６番目のアミノ酸およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１の６１番目のアミノ酸、または
ＴＲＡＶの４７番目のアミノ酸およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１の６０番目のアミノ酸から選択される１つの群または複数の群の部位を置換することを特徴とする
請求項１５に記載のＴＣＲ。
【請求項17】
前記ＴＣＲのα鎖および／またはβ鎖のＣ―末端またはＮ―末端にコンジュゲートが結合されることを特徴とする請求項１に記載のＴＣＲ。
【請求項18】
前記Ｔ細胞受容体に結合するコンジュゲートは、検出可能なマーカー、治療剤、ＰＫ修飾部分またはこれらの物質のいずれかの組み合わせであることを特徴とする請求項１７に記載のＴＣＲ。
【請求項19】
前記治療剤は、抗ＣＤ３抗体であることを特徴とする
請求項１８に記載のＴＣＲ。
【請求項20】
多価ＴＣＲ複合体であって、少なくとも二つのＴＣＲ分子を含み、またそのうちの少なくとも一つのＴＣＲ分子は、請求項１～１９のいずれか１項に記載のＴＣＲであることを特徴とする、前記多価ＴＣＲ複合体。
【請求項21】
核酸分子であって、前記核酸分子は、請求項１～１９のいずれか１項に記載のＴＣＲ分子をコードする核酸配列またはその相補的配列を含むことを特徴とする、前記核酸分子。
【請求項22】
ＴＣＲα鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３を含むことを特徴とする請求項２１に記載の核酸分子。
【請求項23】
ＴＣＲβ鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５を含むことを特徴とする請求項２１または２２に記載の核酸分子。
【請求項24】
ＴＣＲα鎖をコードするヌクレオチド配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４を含み、および／またはＴＣＲβ鎖をコードするヌクレオチド配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８を含むことを特徴とする請求項２１に記載の核酸分子。
【請求項25】
請求項２１～２４のいずれか１項に記載の核酸分子を含むことを特徴とする、ベクター。
【請求項26】
前記ベクターは、ウイルスベクターであることを特徴とする
請求項２５に記載のベクター。
【請求項27】
前記ベクターは、レンチウイルスベクターであることを特徴とする
請求項２６に記載のベクター。
【請求項28】
単離された宿主細胞であって、前記宿主細胞は、請求項２５～２７のいずれか１項に記載のベクターを含むか、または染色体には外因性の請求項２１～２４のいずれか１項に記載の核酸分子が組み込まれたことを特徴とする、前記単離された宿主細胞。
【請求項29】
細胞であって、前記細胞は、請求項２１～２４のいずれか１項に記載の核酸分子、または請求項２５～２７のいずれか１項に記載のベクターで形質導入されることを特徴とする、前記細胞。
【請求項30】
前記細胞は、Ｔ細胞または幹細胞であることを特徴とする
請求項２９に記載の細胞。
【請求項31】
医薬組成物であって、前記組成物は、薬学的に許容される担体および請求項１～１９のいずれか１項に記載のＴＣＲ、請求項２０に記載のＴＣＲ複合体、または請求項２９または３０に記載の細胞を含むことを特徴とする、前記医薬組成物。
【請求項32】
請求項１～１９のいずれか１項に記載のＴ細胞受容体、または請求項２０に記載のＴＣＲ複合体、または請求項２９または３０に記載の細胞を含む、腫瘍または自己免疫疾患を治療するための薬物。
【請求項33】
前記腫瘍は、ＳＳＸ２抗原陽性腫瘍であることを特徴とする
請求項３２に記載の薬物。
【請求項34】
前記腫瘍は、黒色腫、頭頸部がん、リンパ腫、様々な骨髄腫、膵臓がん、前立腺がん、肉腫、肝細胞がん、または結腸がんであることを特徴とする
請求項３２に記載の薬物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ＳＳＸ２抗原に由来する短いペプチドを識別することができるＴＣＲに関し、本発明は、上記ＴＣＲを形質導入することによって得られるＳＳＸ２特異的Ｔ細胞、ならびにＳＳＸ２関連疾患の予防および治療におけるそれらの用途にさらに関する。
【背景技術】
【0002】
ＳＳＸ２は、ＨＯＭ―ＭＥＬ―４０としても知られている、滑膜肉腫Ｘブレークポイントである。ＳＳＸ２は、ＳＳＸ２ファミリーの１０種の相同性の高い核酸タンパク質の一つである。ＳＳＸタンパク質は、腫瘍精巣抗原であり、腫瘍細胞およびＭＨＣ発現なしの精巣芽細胞でのみ発現される。ＳＳＸ２は、黒色腫、頭頸部がん、リンパ腫、様々な骨髄腫、膵臓がん、前立腺がん、肉腫、肝細胞がんおよび結腸がんを含むがこれらに限定されない、様々なヒト癌細胞で発現される。ＫＡＳＥＫＩＦＹＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）は、ＳＳＸ２抗原に由来する短いペプチドであり、ＳＳＸ２関連疾患の治療の標的である。上記疾患の治療には、化学療法および放射線療法等の方法を使用することができるが、自身の正常な細胞に損傷を与える。
【0003】
Ｔ細胞養子免疫療法は、標的細胞抗原に特異的な反応性Ｔ細胞を患者の体内に移して、標的細胞に対して役割を果たすことができるようにすることである。Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、Ｔ細胞表面の膜タンパク質であり、対応する標的細胞表面の抗原の短いペプチドを識別することができる。免疫系において、抗原の短いペプチド特異的ＴＣＲが短いペプチド―主要組織適合性複合体（ｐＭＨＣ複合体）に結合することによって、Ｔ細胞と抗原提示細胞（ＡＰＣ）との間の直接的な物理的接触を引き起こし、次に、Ｔ細胞およびＡＰＣの両者の他の細胞膜表面分子が相互作用して、一連の後続の細胞シグナル伝達および他の生理学的応答を引き起こすことにより、異なる抗原特異的Ｔ細胞がその標的細胞に免疫効果を発揮できるようにする。従って、当業者は、ＳＳＸ２抗原の短いペプチドに対して特異性を有するＴＣＲを単離し、および当該ＴＣＲをＴ細胞に形質導入することによって、ＳＳＸ２抗原の短いペプチドに対して特異性を有するＴ細胞を得ることにより、それらが細胞免疫治療で役割を発揮できるようにすることに専念している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
本発明の目的は、ＳＳＸ２抗原の短いペプチドを識別するＴ細胞受容体を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0005】
本発明の第１の態様は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を提供し、前記ＴＣＲは、ＫＡＳＥＫＩＦＹＶ―ＨＬＡ Ａ０２０１複合体に結合することができる。
別の好ましい例において、前記ＴＣＲは、ＴＣＲα鎖可変ドメインおよびＴＣＲβ鎖可変ドメインを含み、前記ＴＣＲα鎖可変ドメインのＣＤＲ３のアミノ酸配列は、ＡＥＰＮＱＡＧＴＡＬＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）であり、および／または前記ＴＣＲβ鎖可変ドメインのＣＤＲ３のアミノ酸配列は、ＡＳＳＳＬＥＤＰＹＥＱＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）である。
別の好ましい例において、前記ＴＣＲは、ＴＣＲα鎖可変ドメインおよびＴＣＲβ鎖可変ドメインを含み、前記ＴＣＲα鎖可変ドメインのＣＤＲ３のアミノ酸配列は、ＡＥＰＮＱＡＧＴＡＬＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）であり、および／または前記ＴＣＲβ鎖可変ドメインのＣＤＲ３のアミノ酸配列は、ＡＳＳＳＬＥＤＰＹＥＱＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）である。
【0006】
別の好ましい例において、前記ＴＣＲα鎖可変ドメインの三つの相補性決定領域（ＣＤＲ）は、
α ＣＤＲ１―ＤＳＳＳＴＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）、
α ＣＤＲ２―ＩＦＳＮＭＤＭ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）、
α ＣＤＲ３―ＡＥＰＮＱＡＧＴＡＬＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）であり、および／または
前記ＴＣＲβ鎖可変ドメインの三つの相補性決定領域は、
β ＣＤＲ１―ＭＮＨＥＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）、
β ＣＤＲ２―ＳＶＧＥＧＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）、
β ＣＤＲ３―ＡＳＳＳＬＥＤＰＹＥＱＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）である。
α ＣＤＲ１―ＤＳＳＳＴＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）、
α ＣＤＲ２―ＩＦＳＮＭＤＭ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）、
α ＣＤＲ３―ＡＥＰＮＱＡＧＴＡＬＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）であり、および／または
前記ＴＣＲβ鎖可変ドメインの三つの相補性決定領域は、
β ＣＤＲ１―ＭＮＨＥＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）、
β ＣＤＲ２―ＳＶＧＥＧＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）、
β ＣＤＲ３―ＡＳＳＳＬＥＤＰＹＥＱＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）である。
【0007】
別の好ましい例において、前記ＴＣＲは、ＴＣＲα鎖可変ドメインおよびＴＣＲβ鎖可変ドメインを含み、前記ＴＣＲα鎖可変ドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列であり、および／または前記ＴＣＲβ鎖可変ドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列である。
【0008】
別の好ましい例において、前記ＴＣＲは、α鎖可変ドメインのアミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１を含む。
別の好ましい例において、前記ＴＣＲは、β鎖可変ドメインのアミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５を含む。
別の好ましい例において、前記ＴＣＲは、ＴＣＲα鎖定常領域ＴＲＡＣ＊０１およびＴＣＲβ鎖定常領域ＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１を含む、αβヘテロダイマーである。
別の好ましい例において、前記ＴＣＲは、β鎖可変ドメインのアミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５を含む。
別の好ましい例において、前記ＴＣＲは、ＴＣＲα鎖定常領域ＴＲＡＣ＊０１およびＴＣＲβ鎖定常領域ＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１を含む、αβヘテロダイマーである。
【0009】
別の好ましい例において、前記ＴＣＲのα鎖アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３であり、および／または前記ＴＣＲのβ鎖アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７である。
別の好ましい例において、前記ＴＣＲは、可溶性である。
別の好ましい例において、前記ＴＣＲは、一本鎖である。
別の好ましい例において、前記ＴＣＲは、ペプチドリンカー配列を介してα鎖可変ドメインとβ鎖可変ドメインとを結合することによって形成される。
別の好ましい例において、前記ＴＣＲは、可溶性である。
別の好ましい例において、前記ＴＣＲは、一本鎖である。
別の好ましい例において、前記ＴＣＲは、ペプチドリンカー配列を介してα鎖可変ドメインとβ鎖可変ドメインとを結合することによって形成される。
【0010】
別の好ましい例において、前記ＴＣＲは、α鎖可変領域の１１、１３、１９、２１、５３、７６、８９、９１、または９４番目のアミノ酸位置、および／またはα鎖Ｊ遺伝子の短いペプチドの最後から３番目、最後から５番目または最後から７番目のアミノ酸位置に一つまたは複数の突然変異を有し、および／または前記ＴＣＲは、β鎖可変領域の１１、１３、１９、２１、５３、７６、８９、９１、または９４番目のアミノ酸位置、および／またはβ鎖Ｊ遺伝子の短いペプチドの最後から２番目、最後から４番目または最後から６番目のアミノ酸位置に一つまたは複数の突然変異を有し、ここで、アミノ酸の位置番号は、ＩＭＧＴ（国際免疫遺伝学情報システム）に記載された位置番号による。
【0011】
別の好ましい例において、前記ＴＣＲα鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２を含み、および／または前記ＴＣＲβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４を含む。
別の好ましい例において、前記ＴＣＲのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０である。
別の好ましい例において、前記ＴＣＲは、（ａ）膜貫通ドメインを除くＴＣＲα鎖の全部または一部、および（ｂ）膜貫通ドメインを除くＴＣＲβ鎖の全部または一部を含み、
別の好ましい例において、前記ＴＣＲのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０である。
別の好ましい例において、前記ＴＣＲは、（ａ）膜貫通ドメインを除くＴＣＲα鎖の全部または一部、および（ｂ）膜貫通ドメインを除くＴＣＲβ鎖の全部または一部を含み、
【0012】
また（ａ）および（ｂ）は、それぞれ機能的可変ドメインを含むか、または機能的可変ドメインおよび前記ＴＣＲ鎖定常ドメインの少なくとも一部を含む。
別の好ましい例において、システイン残基は、前記ＴＣＲのα鎖定常ドメインとβ鎖定常ドメインとの間に人工的なジスルフィド結合を形成する。
別の好ましい例において、前記ＴＣＲにおいて人工的なジスルフィド結合を形成するシステイン残基は、
別の好ましい例において、システイン残基は、前記ＴＣＲのα鎖定常ドメインとβ鎖定常ドメインとの間に人工的なジスルフィド結合を形成する。
別の好ましい例において、前記ＴＣＲにおいて人工的なジスルフィド結合を形成するシステイン残基は、
【0013】
ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＴｈｒ４８およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＳｅｒ５７、
ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＴｈｒ４５およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＳｅｒ７７、
ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＴｙｒ１０およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＳｅｒ１７、
ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＴｈｒ４５およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＡｓｐ５９、
ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＳｅｒ１５およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＧｌｕ１５、
ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＡｒｇ５３およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＳｅｒ５４、
ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＰｒｏ８９およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＡｌａ１９、および
ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＴｙｒ１０およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＧｌｕ２０から選択される１つの群または複数の群の部位を置換する。
ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＴｈｒ４５およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＳｅｒ７７、
ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＴｙｒ１０およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＳｅｒ１７、
ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＴｈｒ４５およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＡｓｐ５９、
ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＳｅｒ１５およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＧｌｕ１５、
ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＡｒｇ５３およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＳｅｒ５４、
ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＰｒｏ８９およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＡｌａ１９、および
ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＴｙｒ１０およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＧｌｕ２０から選択される１つの群または複数の群の部位を置換する。
【0014】
別の好ましい例において、前記ＴＣＲα鎖アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６であり、および／または前記ＴＣＲβ鎖アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８である。
別の好ましい例において、前記ＴＣＲのα鎖可変領域とβ鎖定常領域との間には、人工的な鎖間ジスルフィド結合が含まれる。
別の好ましい例において、前記ＴＣＲのα鎖可変領域とβ鎖定常領域との間には、人工的な鎖間ジスルフィド結合が含まれる。
【0015】
別の好ましい例において、前記ＴＣＲにおいて人工的な鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基は、
ＴＲＡＶの４６番目のアミノ酸およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１の６０番目のアミノ酸、
ＴＲＡＶの４７番目のアミノ酸およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１の６１番目のアミノ酸、
ＴＲＡＶの４６番目のアミノ酸およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１の６１番目のアミノ酸、または
ＴＲＡＶの４７番目のアミノ酸およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１の６０番目のアミノ酸から選択される１つの群または複数の群の部位を置換することを特徴とする。
ＴＲＡＶの４６番目のアミノ酸およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１の６０番目のアミノ酸、
ＴＲＡＶの４７番目のアミノ酸およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１の６１番目のアミノ酸、
ＴＲＡＶの４６番目のアミノ酸およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１の６１番目のアミノ酸、または
ＴＲＡＶの４７番目のアミノ酸およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１の６０番目のアミノ酸から選択される１つの群または複数の群の部位を置換することを特徴とする。
【0016】
別の好ましい例において、前記ＴＣＲは、α鎖可変ドメイン、β鎖可変ドメインおよび膜貫通ドメインを除くβ鎖定常ドメインの全部または一部を含むが、α鎖定常ドメインを含まず、前記ＴＣＲα鎖可変ドメインとβ鎖とは、ヘテロダイマーを形成する。
別の好ましい例において、前記ＴＣＲのα鎖および／またはβ鎖のＣ―末端またはＮ―末端にコンジュゲートが結合される。
別の好ましい例において、前記Ｔ細胞受容体に結合するコンジュゲートは、検出可能なマーカー、治療剤、ＰＫ修飾部分またはこれらの物質のいずれかの組み合わせであり、好ましくは、前記治療剤は、抗―ＣＤ３抗体である。
別の好ましい例において、前記ＴＣＲのα鎖および／またはβ鎖のＣ―末端またはＮ―末端にコンジュゲートが結合される。
別の好ましい例において、前記Ｔ細胞受容体に結合するコンジュゲートは、検出可能なマーカー、治療剤、ＰＫ修飾部分またはこれらの物質のいずれかの組み合わせであり、好ましくは、前記治療剤は、抗―ＣＤ３抗体である。
【0017】
本発明の第２の態様は、少なくとも二つのＴＣＲ分子を含み、またそのうちの少なくとも一つのＴＣＲ分子が本発明の第１の態様に記載のＴＣＲである、多価ＴＣＲ複合体を提供する。
【0018】
本発明の第３の態様は、核酸分子を提供し、前記核酸分子は、本発明の第１の態様に記載のＴＣＲ分子をコードする核酸配列またはその相補的配列を含む。
別の好ましい例において、前記核酸分子は、ＴＣＲα鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３を含む。
別の好ましい例において、前記核酸分子は、ＴＣＲα鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３を含む。
【0019】
別の好ましい例において、前記核酸分子は、ＴＣＲβ鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５を含む。
別の好ましい例において、前記核酸分子は、ＴＣＲα鎖をコードするヌクレオチド配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４を含み、および／またはＴＣＲβ鎖をコードするヌクレオチド配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８を含む。
別の好ましい例において、前記核酸分子は、ＴＣＲα鎖をコードするヌクレオチド配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４を含み、および／またはＴＣＲβ鎖をコードするヌクレオチド配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８を含む。
【0020】
本発明の第４の態様は、ベクターを提供し、前記ベクターは、本発明の第３の態様に記載の核酸分子を含み、好ましくは、前記ベクターは、ウイルスベクターであり、より好ましくは、前記ベクターは、レンチウイルスベクターである。
【0021】
本発明の第５の態様は、単離された宿主細胞を提供し、前記宿主細胞は、本発明の第４の態様に記載のベクターを含むか、またはゲノムには外因性の本発明の第３の態様に記載の核酸分子が組み込まれた。
【0022】
本発明の第６の態様は、細胞を提供し、前記細胞は、本発明の第３の態様に記載の核酸分子または本発明の第４の態様に記載のベクターで形質導入され、好ましくは、前記細胞は、Ｔ細胞または幹細胞である。
【0023】
本発明の第７の態様は、医薬組成物を提供し、前記組成物は、薬学的に許容される担体および本発明の第１の態様に記載のＴＣＲ、本発明の第２の態様に記載のＴＣＲ複合体、本発明の第３の態様に記載の核酸分子、本発明の第４の態様に記載のベクター、または本発明の第６の態様に記載の細胞を含む。
【0024】
本発明の第８の態様は、腫瘍または自己免疫疾患を治療する薬物の調製に使用される、本発明の第１の態様に記載のＴ細胞受容体、または本発明の第２の態様に記載のＴＣＲ複合体、本発明の第３の態様に記載の核酸分子、本発明の第４の態様に記載のベクター、または本発明の第６の態様に記載の細胞の用途を提供する。
【0025】
本発明の第９の態様は、治療を必要とする対象に適切な量の本発明の第１の態様に記載のＴ細胞受容体、または本発明の第２の態様に記載のＴＣＲ複合体、本発明の第３の態様に記載の核酸分子、本発明の第４の態様に記載のベクター、または本発明の第６の態様に記載の細胞、または本発明の第７の態様に記載の医薬組成物を投与する段階を含む、疾患を治療する方法を提供し、
好ましくは、前記疾患は、腫瘍であり、好ましくは、前記腫瘍は、肝細胞がんである。
好ましくは、前記疾患は、腫瘍であり、好ましくは、前記腫瘍は、肝細胞がんである。
【発明の効果】
【0026】
本発明の範囲内で、本発明の上記の各技術的特徴と以下（例えば、実施例）に具体的に説明される各技術的特徴との間を、互いに組み合わせることにより、新しいまたは好ましい技術的解決策を構成することができることに理解されたい。スペースに限りがあるため、ここでは繰り返さない。
【図面の簡単な説明】
【0027】
【図1a-1f】それぞれＴＣＲα鎖可変ドメインのアミノ酸配列、ＴＣＲα鎖可変ドメインヌクレオチド配列、ＴＣＲα鎖アミノ酸配列、ＴＣＲα鎖ヌクレオチド配列、リーダー配列を有するＴＣＲα鎖アミノ酸配列およびリーダー配列を有するＴＣＲα鎖ヌクレオチド配列を示す。
【0028】
【図2a-2f】それぞれＴＣＲβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列、ＴＣＲβ鎖可変ドメインヌクレオチド配列、ＴＣＲβ鎖アミノ酸配列、ＴＣＲβ鎖ヌクレオチド配列、リーダー配列を有するＴＣＲβ鎖アミノ酸配列およびリーダー配列を有するＴＣＲβ鎖ヌクレオチド配列を示す。
【0029】
【図3】モノクローナル細胞のＣＤ８＋およびテトラマー―ＰＥ二重陽性染色結果を示す。
【図4a-4b】それぞれ可溶性ＴＣＲα鎖のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を示す。
【図5a-5b】それぞれ可溶性ＴＣＲβ鎖のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を示す。
【0030】
【図6】精製後に得られた可溶性ＴＣＲのゲル図を示す。最左端のレーンは還元性接着剤であり、中央のレーンは、分子量マーカー（ｍａｒｋｅｒ）であり、最右端レーンは、非還元性接着剤である。
【図7a-7b】それぞれ一本鎖ＴＣＲのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を示す。
【0031】
【0032】
【図10a-10b】それぞれ一本鎖ＴＣＲリンカー配列（ｌｉｎｋｅｒ）のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を示す。
【図11】精製後に得られた可溶性一本鎖ＴＣＲのゲル図を示す。左側のレーンは、分子量マーカー（ｍａｒｋｅｒ）であり、右側のレーンは、非還元性接着剤である。
【0033】
【図12】本発明の可溶性ＴＣＲとＫＡＳＥＫＩＦＹＶ―ＨＬＡ Ａ０２０１複合体との結合のＢＩＡｃｏｒｅ動態学マップを示す。
【図13】本発明の可溶性一本鎖ＴＣＲとＫＡＳＥＫＩＦＹＶ―ＨＬＡ Ａ０２０１複合体との結合のＢＩＡｃｏｒｅ動態学マップを示す。
【0034】
【図14】得られたＴ細胞クローンのＥＬＩＳＰＯＴ活性化機能検証の結果を示す。
【図15】Ｔ２負荷標的細胞に対する本発明のＴＣＲで形質導入されたエフェクター細胞のＥＬＩＳＰＯＴ活性化機能検証の結果を示す。
【図16】腫瘍細胞株に対する本発明のＴＣＲで形質導入されたＴ細胞のＥｌｉｓｐｏｔ活性化実験の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【0035】
本発明者らは、広範囲にわたる詳細な研究の結果、ＳＳＸ２抗原の短いペプチドＫＡＳＥＫＩＦＹＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）に特異的に結合することができるＴＣＲを発見し、前記抗原の短いペプチドＫＡＳＥＫＩＦＹＶは、ＨＬＡ Ａ０２０１と複合体を形成し、かつ一緒に細胞表面に提示されることができる。本発明は、前記ＴＣＲをコードする核酸分子および前記核酸分子を含むベクターをさらに提供する。さらに、本発明は、本発明のＴＣＲで形質導入された細胞を提供する。
【0036】
用語
ＭＨＣ分子は、免疫グロブリンスーパーファミリーのタンパク質であり、クラスＩまたはクラスＩＩのＭＨＣ分子であり得る。従って、抗原の提示に対して特異性を有し、異なる個体は、異なるＭＨＣを有し、タンパク質抗原の異なる短いペプチドをそれぞれのＡＰＣ細胞表面に提示することができる。ヒトＭＨＣは、通常ＨＬＡ遺伝子またはＨＬＡ複合体と呼ばれる。
ＭＨＣ分子は、免疫グロブリンスーパーファミリーのタンパク質であり、クラスＩまたはクラスＩＩのＭＨＣ分子であり得る。従って、抗原の提示に対して特異性を有し、異なる個体は、異なるＭＨＣを有し、タンパク質抗原の異なる短いペプチドをそれぞれのＡＰＣ細胞表面に提示することができる。ヒトＭＨＣは、通常ＨＬＡ遺伝子またはＨＬＡ複合体と呼ばれる。
【0037】
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）に提示する特異性抗原ペプチドの唯一の受容体である。免疫システムにおいて、抗原の特異的ＴＣＲとｐＭＨＣ複合体との結合は、Ｔ細胞と抗原提示細胞（ＡＰＣ）との間の直接的な物理的接触を引き起こした後、Ｔ細胞とＡＰＣとの他の細胞膜表面分子が相互作用し、一連の後続の細胞信号伝達および他の生理学的反応を引き起こすことにより、異なる抗原特異的Ｔ細胞が標的細胞に対して免疫効果を発揮することができる。
【0038】
ＴＣＲは、α鎖／β鎖またはγ鎖／δ鎖がヘテロダイマーの形式で存在する細胞膜表面の糖タンパク質である。Ｔ細胞の９５％において、ＴＣＲヘテロダイマーは、α鎖とβとで構成され、Ｔ細胞の５％は、γ鎖とδ鎖とで構成されるＴＣＲを有する。天然のαβヘテロ二量体化ＴＣＲは、α鎖とβ鎖とを有し、α鎖とβ鎖とは、αβヘテロ二量体化ＴＣＲのサブユニットを構成する。大まかに言って、αとβとの各鎖は、可変領域、結合領域および定常領域を含み、β鎖は、通常可変領域と結合領域との間に短い多変領域をさらに含むが、当該多変領域は、通常結合領域の一部としてみなされる。各可変領域は、フレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎｓ）に埋め込まれた三つのＣＤＲ（相補性決定領域）であるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ＣＤＲ領域は、ＴＣＲとｐＭＨＣ複合体との結合を決定し、ここで、ＣＤＲ３は、超可変領域と呼ばれる可変領域と結合領域とから再結合される。ＴＣＲのα鎖とβ鎖とは、一般にそれぞれ二つの「ドメイン」、つまり可変ドメインと定常ドメインとを有すると見なされ、可変ドメインは、結合された可変領域と結合領域とで構成される。ＴＣＲの定常ドメインの配列は、国際免疫遺伝学情報システム（ＩＭＧＴ）の公開データベースで見つかることができ、例えば、ＴＣＲ分子のα鎖の定常ドメイン配列は、「ＴＲＡＣ＊０１」であり、ＴＣＲ分子のβ鎖の定常ドメイン配列は、「ＴＲＢＣ１＊０１」または「ＴＲＢＣ２＊０１」である。加えて、ＴＣＲのα鎖とβ鎖とは、膜貫通領域と細胞質領域とを含み、細胞質領域は、非常に短い。
【0039】
本発明において、「本発明のポリペプチド」、「本発明のＴＣＲ」、「本発明のＴ細胞受容体」という用語は、交換可能に使用される。
【0040】
天然の鎖間ジスルフィド結合および人工的な鎖間ジスルフィド結合
天然のＴＣＲの膜近位領域のＣα鎖とＣβ鎖との間には、一つのグループのジスルフィド結合が存在し、本発明では、「天然の鎖間ジスルフィド結合」と呼ばれる。本発明において、天然の鎖間ジスルフィド結合とは位置が異なる人工的に導入された鎖間共有ジスルフィド結合は、「人工鎖間ジスルフィド結合」と呼ばれる。
天然のＴＣＲの膜近位領域のＣα鎖とＣβ鎖との間には、一つのグループのジスルフィド結合が存在し、本発明では、「天然の鎖間ジスルフィド結合」と呼ばれる。本発明において、天然の鎖間ジスルフィド結合とは位置が異なる人工的に導入された鎖間共有ジスルフィド結合は、「人工鎖間ジスルフィド結合」と呼ばれる。
【0041】
ジスルフィド結合の位置を容易に説明するために、本発明におけるＴＲＡＣ＊０１およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１アミノ酸配列の位置番号は、Ｎ端からＣ末端まで順番に位置番号を付け、例えば、ＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１において、Ｎ端からＣ末端までの順番の順序の６０番目のアミノ酸は、Ｐ（プロリン）であると、本発明では、ＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＰｒｏ６０と表現することができ、ＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１の６０番目のアミノ酸と表現することもでき、例えば、ＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１において、Ｎ端からＣ末端までの順次的順序の６１番目のアミノ酸は、Ｑ（グルタミン）であると、本発明では、ＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＧｌｎ６１と表現することができ、ＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１の６１番目のアミノ酸と表現することもでき、他は、類推によって推測することができる。本発明において、可変領域のＴＲＡＶとＴＲＢＶとのアミノ酸配列の位置番号は、ＩＭＧＴに記載の位置番号に従って番号が付けられる。例えば、ＴＲＡＶの特定のアミノ酸について、ＩＭＧＴに記載された位置番号が４６であると、本発明においてＴＲＡＶの４６番目のアミノ酸と表現され、他は、類推によって推測することができる。本発明において、他のアミノ酸の配列位置番号について特別な指示がある場合、特別な指示に従う。
【0042】
発明の詳細な説明
ＴＣＲ分子
抗原プロセシングの過程において、抗原は、細胞内で分解され、次にＭＨＣ分子によって細胞表面に運ばれる。Ｔ細胞受容体は、抗原提示細胞表面のペプチド―ＭＨＣ複合体を識別することができる。従って、本発明の第１の態様は、ＫＡＳＥＫＩＦＹＶ―ＨＬＡ Ａ０２０１複合体に結合することができるＴＣＲ分子を提供する。好ましくは、前記ＴＣＲ分子は、単離または精製される。当該ＴＣＲのα鎖およびβ鎖は、それぞれ三つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する。
ＴＣＲ分子
抗原プロセシングの過程において、抗原は、細胞内で分解され、次にＭＨＣ分子によって細胞表面に運ばれる。Ｔ細胞受容体は、抗原提示細胞表面のペプチド―ＭＨＣ複合体を識別することができる。従って、本発明の第１の態様は、ＫＡＳＥＫＩＦＹＶ―ＨＬＡ Ａ０２０１複合体に結合することができるＴＣＲ分子を提供する。好ましくは、前記ＴＣＲ分子は、単離または精製される。当該ＴＣＲのα鎖およびβ鎖は、それぞれ三つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する。
【0043】
本発明の好ましい実施形態において、前記ＴＣＲのα鎖は、
α ＣＤＲ１―ＤＳＳＳＴＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）、
α ＣＤＲ２―ＩＦＳＮＭＤＭ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）、
α ＣＤＲ３―ＡＥＰＮＱＡＧＴＡＬＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含み、および／または
前記ＴＣＲβ鎖可変ドメインの三つの相補性決定領域は、
β ＣＤＲ１―ＭＮＨＥＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）、
β ＣＤＲ２―ＳＶＧＥＧＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）、
β ＣＤＲ３―ＡＳＳＳＬＥＤＰＹＥＱＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）である。
α ＣＤＲ１―ＤＳＳＳＴＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）、
α ＣＤＲ２―ＩＦＳＮＭＤＭ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）、
α ＣＤＲ３―ＡＥＰＮＱＡＧＴＡＬＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含み、および／または
前記ＴＣＲβ鎖可変ドメインの三つの相補性決定領域は、
β ＣＤＲ１―ＭＮＨＥＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）、
β ＣＤＲ２―ＳＶＧＥＧＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）、
β ＣＤＲ３―ＡＳＳＳＬＥＤＰＹＥＱＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）である。
【0044】
本発明のＣＤＲ領域の上記アミノ酸配列は、任意の適切なフレームワーク領域に札乳されて、キメラＴＣＲを調製することができる。フレームワーク領域が本発明のＴＣＲのＣＤＲ領域と交換性がある限り、当業者は、本発明に開示されたＣＤＲ領域に基づいて対応する機能を有するＴＣＲ分子を設計または合成することができる。従って、本発明のＴＣＲ分子は、上記α鎖および／またはβ鎖のＣＤＲ領域配列および任意の適切なフレームワーク領域を含むＴＣＲ分子を指す。本発明のＴＣＲα鎖可変ドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１と少なくとも９０％、好ましくは９５％、より好ましくは９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列であり、および／または本発明のＴＣＲβ鎖可変ドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５と少なくとも９０％、好ましくは９５％、より好ましくは９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列である。
【0045】
本発明の好ましい例において、本発明のＴＣＲ分子は、α鎖とβ鎖とから構成されるヘテロダイマーである。具体的には、一方で、前記ヘテロ二量体化ＴＣＲ分子のα鎖は、可変ドメインと定常ドメインとを含み、前記α鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、上記α鎖のＣＤＲ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）、ＣＤＲ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）およびＣＤＲ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）を含む。好ましくは、前記ＴＣＲ分子は、α鎖可変ドメインのアミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１を含む。より好ましくは、前記ＴＣＲ分子のα鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１である。一方で、前記ヘテロ二量体化ＴＣＲ分子のβ鎖は、可変ドメインと定常ドメインとを含み、前記β鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、上記β鎖のＣＤＲ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）、ＣＤＲ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）およびＣＤＲ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）を含む。好ましくは、前記ＴＣＲ分子は、β鎖可変ドメインのアミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５を含む。より好ましくは、前記ＴＣＲ分子のβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５である。
【0046】
本発明の好ましい例において、本発明のＴＣＲ分子は、α鎖の一部または全部および／またはβ鎖の一部または全部から構成される一本鎖ＴＣＲ分子である。一本鎖ＴＣＲ分子の説明しついては、Ｃｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ（１９９４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１，１２６５４－１２６５８を参照することができる。文献によると、当業者は、本発明のＣＤＲｓ領域を含む一本鎖ＴＣＲ分子を容易に構築することができる。具体的には、前記一本鎖ＴＣＲ分子は、Ｖα、ＶβおよびＣβを含み、好ましくは、Ｎ端からＣ末端までの順序に従って結合される。
【0047】
前記一本鎖ＴＣＲ分子のα鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、上記α鎖のＣＤＲ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）、ＣＤＲ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）およびＣＤＲ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ：１２）を含む。好ましくは、前記一本鎖ＴＣＲ分子は、α鎖可変ドメインのアミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１を含む。より好ましくは、前記一本鎖ＴＣＲ分子のα鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１である。前記一本鎖ＴＣＲ分子のβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、上記β鎖のＣＤＲ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）、ＣＤＲ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）およびＣＤＲ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）を含む。好ましくは、前記一本鎖ＴＣＲ分子は、β鎖可変ドメインのアミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５を含む。より好ましくは、前記一本鎖ＴＣＲ分子のβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５である。
【0048】
本発明の好ましい例において、本発明のＴＣＲ分子の定常ドメインは、ヒト定常ドメインである。当業者は、関連する本またはＩＭＧＴ（国際免疫遺伝学情報システム）の公開データベースを参照することにより、ヒト定常ドメインのアミノ酸配列を知るか、または得ることができる。例えば、本発明のＴＣＲ分子のα鎖の定常ドメイン配列は、「ＴＲＡＣ＊０１」であり得、ＴＣＲ分子のβ鎖の定常ドメイン配列は、「ＴＲＢＣ１＊０１」または「ＴＲＢＣ２＊０１」であり得る。ＩＭＧＴのＴＲＡＣ＊０１に記載されたアミノ酸配列の５３番目の位置は、Ａｒｇであり、ここでは、ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＡｒｇ５３を表示し、他は、類推によって推測することができる。好ましくは、本発明のＴＣＲ分子のα鎖のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３であり、および／またはβ鎖のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７である。
【0049】
天然に存在するＴＣＲは、膜貫通領域によって安定化された膜タンパク質である。抗原同定分子としての免疫グロブリン（抗体）と同様に、ＴＣＲも、診断や治療のために開発されることができ、この場合、可溶性ＴＣＲ分子を得る必要がある。可溶性ＴＣＲ分子は、膜貫通領域を含まない。可溶性ＴＣＲは、幅広い用途を有し、ＴＣＲとｐＭＨＣとの相互作用を研究するだけでなく、感染症を検出するための診断ツールや自身免疫疾患のマーカーとしても使用することができる。類似的に、可溶性ＴＣＲを使用して、特異的抗原を提示する細胞に治療薬（例えば、細胞毒素化合物または免疫刺激性化合物）を送達することができ、また、可溶性ＴＣＲを他の分子（例えば、抗－ＣＤ３－抗体）と結合して、Ｔ細胞を特定の抗原を提示する標的細胞にリダイレクトすることもできる。本発明は、ＳＳＸ２抗原の短いペプチドに対して特異性を有する可溶性ＴＣＲも得る。
【0050】
可溶性ＴＣＲを得るために、一方で、本発明のＴＣＲは、そのα鎖とβ鎖との定常ドメインの残基の間に人工的なジスルフィド結合を導入するＴＣＲであり得る。システイン残基は、前記ＴＣＲのα鎖とβ鎖との定常ドメインの間に人工的な鎖間ジスルフィド結合を形成する。システイン残基は、天然のＴＣＲの適切な部位の他のアミノ酸残基を置換して、人工的な鎖間ジスルフィド結合を形成することができる。例えば、ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＴｈｒ４８およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＳｅｒ５７のシステイン残基を置換してジスルフィド結合を形成する。システイン残基を導入してジスルフィド結合を形成する他の部位は、ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＴｈｒ４５およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＳｅｒ７７、ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＴｙｒ１０およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＳｅｒ１７、ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＴｈｒ４５およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＡｓｐ５９、ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＳｅｒ１５およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＧｌｕ１５、ＴＲＡＣ＊０１エクソン１の Ａｒｇ５３およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＳｅｒ５４、 ＴＲＡＣ＊０１エクソン１の Ｐｒｏ８９およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＡｌａ１９、またはＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＴｙｒ１０およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＧｌｕ２０であり得る。つまり、システイン残基は、上記α鎖とβ鎖との定常ドメインの任意の部位のグループを置換する。天然のジスルフィド結合を失う目的を達成するためのシステイン残基を含まないように、本発明のＴＣＲ定常ドメインの一つまたは複数のＣ末端で、最大５０個、または最大３０個、または最大１５個、または最大１０個、または最大８個またはもっと少ないアミノ酸を切り詰めることができ、天然のジスルフィド結合を形成するシステイン残基を別のアミノ酸へ突然変異させることによっても上記目的を達成することができる。
【0051】
上記のように、本発明のＴＣＲは、そのα鎖とβ鎖との定常ドメインの残基の間に導入された人工的なジスルフィド結合を含むことができる。定常ドメインの間に上記導入された人工的なジスルフィド結合を含むか、または含まないことにかかわらず、本発明のＴＣＲは、すべてＴＲＡＣ定常ドメイン配列およびＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２定常ドメイン配列を含むことができることに留意されたい。ＴＣＲのＴＲＡＣ定常ドメイン配列およびＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２定常ドメイン配列は、ＴＣＲに存在する天然のジスルフィド結合によって結合されることができる。
【0052】
可溶性ＴＣＲを得るために、一方で、本発明のＴＣＲは、その疎水性コア領域に突然変異が発生するＴＣＲを含み、これらの疎水性コア領域の突然変異は、好ましくは、例えば、公開番号ＷＯ２０１４／２０６３０４の特許文書に記載されたように、本発明の可溶性ＴＣＲの安定性を改善することができる突然変異である。このようなＴＣＲは、（α鎖および／またはβ鎖）可変領域アミノ酸の１１、１３、１９、２１、５３、７６、８９、９１、９４番目、および／またはα鎖Ｊ遺伝子（ＴＲＡＪ）の短いペプチドアミノ酸の最後から３番目、最後から５番目、最後から７番目、および／またはβ鎖Ｊ遺伝子（ＴＲＢＪ）の短いペプチドアミノ酸の最後から２番目、４番目、６番目の可変ドメイン疎水性コア位置で突然変異させることができ、ここで、アミノ酸配列の位置番号は、国際免疫遺伝学情報システム（ＩＭＧＴ）に記載された位置番号による。当業者は、上記国際免疫遺伝学情報システムを知り、当該データベースに従って、ＩＭＧＴにおける異なるＴＣＲのアミノ酸残基の位置番号を得ることができる。
【0053】
本発明において、疎水性コア領域で突然変異が発生するＴＣＲは、ＴＣＲのα鎖およびβ鎖の可変ドメインを結合する柔軟なペプチド鎖から構成される安定的な可溶性一本鎖ＴＣＲであり得る。本発明における柔軟なペプチド鎖は、ＴＣＲのα鎖およびβ鎖の可変ドメインを結合するのに適した任意のペプチド鎖であり得ることに留意されたい。本発明の実施例４で構築された一本鎖可溶性ＴＣＲの場合、そのα鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２であり、コードされたヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３であり、β鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４であり、コードされたヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５である。
【0054】
さらに、安定性の観点から、特許文書２０１５１０２６０３２２．４は、ＴＣＲのα鎖可変領域とβ鎖定常領域との間に人工的な鎖間ジスルフィド結合を導入することにより、ＴＣＲの安定性を顕著に向上させることができる。従って、本発明の高親和性ＴＣＲのα鎖可変領域とβ鎖定常領域との間に人工的な鎖間ジスルフィド結合を含むことができる。具体的に、前記ＴＣＲのα鎖可変領域とβ鎖定常領域との間に人工的な鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基は、ＴＲＡＶの４６番目のアミノ酸およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１の６０番目のアミノ酸、ＴＲＡＶの４７番目のアミノ酸およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１の６１番目のアミノ酸、ＴＲＡＶの４６番目のアミノ酸およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１の６１番目のアミノ酸、またはＴＲＡＶの４７番目のアミノ酸およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１の６０番目のアミノ酸を置換する。好ましくは、このようなＴＣＲは、（ｉ）膜貫通ドメインを除くＴＣＲα鎖の全部または一部、および（ii）膜貫通ドメインを除くＴＣＲβ鎖の全部または一部を含むことができ、ここで、（ｉ）および（ii）は、それぞれＴＣＲ鎖の可変ドメインおよび定常ドメインの少なくとも一部を含み、α鎖とβ鎖とは、ヘテロダイマーする。より好ましくは、このようなＴＣＲは、α鎖可変ドメインおよびβ鎖可変ドメインならびに膜貫通ドメインを除くβ鎖定常ドメインの全部または一部を含むが、α鎖定常ドメインを含まず、前記ＴＣＲα鎖可変ドメインとβ鎖とは、ヘテロダイマーを形成する。
【0055】
本発明のＴＣＲは、多価複合体の形態で提供されることもできる。本発明の多価ＴＣＲ複合体は、例えば、ｐ５３の四量体かドメインを使用してテトラマーを生成することができる、二つ、三つ、四つまたはそれ以上の本発明のＴＣＲを結合させることによって形成されるポリマーを含むか、または本発明の複数のＴＣＲを別の分子に結合させることによって形成される複合体を含むことができる。本発明のＴＣＲ複合体は、インビトロまたはインビボで特定の抗原を提示する細胞を追跡または標的化するために使用されることができ、そのような用途を有する他の多価ＴＣＲ複合体の中間体を形成するために使用されることもできる。
【0056】
本発明のＴＣＲは、単独で使用されることができ、共有結合または他の方法で、好ましくは、共有結合でコンジュゲートに結合させることができる。前記コンジュゲートは、検出可能なマーカー（診断の目的とし、ここで、前記ＴＣＲは、ＫＡＳＥＫＩＦＹＶ―ＨＬＡ Ａ０２０１複合体を提示する細胞の存在を検出するために使用される）、治療剤、ＰＫ（プロテインキナーゼ）修飾部分あるいはこれらの物質の任意の組み合わせの結合またはカップリングを含む。
【0057】
診断の目的で使用される検出可能なマーカーは、蛍光または発光マーカー、放射性マーカー、ＭＲＩ（磁気共鳴画像）またはＣＴ（電子コンピューターＸ線断層撮影技術）造影剤、または検出可能な生成物を生成することができる酵素を含むが、これらに限定されない。
【0058】
本発明のＴＣＲに結合またはカップリングされることができる治療剤は、（１）放射性核種（Ｋｏｐｐｅら、２００５、癌転移レビュー（Ｃａｎｃｅｒ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ｒｅｖｉｅｗｓ）２４、５３９）、（２）生物学的毒性（Ｃｈａｕｄｈａｒｙら、１９８９、自然（Ｎａｔｕｒｅ）３３９、３９４、Ｅｐｅｌら、２００２、癌免疫学および免疫治療（Ｃａｎｃｅｒ ＩｍＭｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ ＩｍＭｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ）５１、５６５）、（３）ＩＬ―２等のサイトカイン（Ｇｉｌｌｉｅｓら、１９９２、米国国立科学アカデミーの学術誌（ＰＮＡＳ）８９、１４２８、Ｃａｒｄら、２００４、癌免疫学および免疫治療（Ｃａｎｃｅｒ ＩｍＭｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ ＩｍＭｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ）５３、３４５、Ｈａｌｉｎら、２００３、癌研究（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）６３、３２０２）、（４）抗体Ｆｃフラグメント（Ｍｏｓｑｕｅｒａら、２００５、免疫学ジャーナル（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ Ｏｆ ＩｍＭｕｎｏｌｏｇｙ）１７４、４３８１）、（５）抗体ｓｃＦｖフラグメント（Ｚｈｕら、１９９５、癌国際ジャーナル（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ）６２、３１９）、（６）金ナノ粒子／ナノロッド（Ｌａｐｏｔｋｏら、２００５、癌コミュニケーション（ＣａｎｃｅｒＬｅｔｔｅｒｓ）２３９、３６、Ｈｕａｎｇら、２００６、米国化学会誌（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ）１２８、２１１５）、（７）ウイルス粒子（Ｐｅｎｇら、２００４、遺伝子治療（Ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ）１１、１２３４）、（８）リポソーム（Ｍａｍｏｔら、２００５、癌研究（Ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ）６５、１１６３１）、（９）ナノ磁性粒子、（１０）プロドラッグ活性化酵素（例えば、ＤＴ―ジアホラーゼ（ＤＴＤ）またはビフェニル加水分解酵素様タンパク質（ＢＰＨＬ））、（１１）化学療法剤（例えば、シスプラチン）または任意の形態のナノ粒子等を含むが、これらに限定されない。
【0059】
さらに、本発明のＴＣＲは、一つを超える種に由来する配列を含むハイブリッドＴＣＲであり得る。例えば、研究によると、マウスＴＣＲは、ヒトＴよりも細胞でより効果的に発現されることができることが示される。従って、本発明のＴＣＲは、ヒト可変ドメインおよびマウス定常ドメインを含むことができる。この方法の欠点は、免疫応答を引き起こす可能性があることである。従って、養子Ｔ細胞治療に使用される場合、マウスＴ細胞を発現する移植を可能にする免疫抑制の調節スキームが必要される。
【0060】
本明細書におけるアミノ酸の名称は、国際的に使用される単一の英字または三つの英字で表され、単一の英字および三つの英字のアミノ酸の名称の対応関係は、Ａｌａ（Ａ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ａｓｐ（Ｄ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｈｉｓ（Ｈ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｌｙｓ（Ｋ）、Ｍｅｔ（Ｍ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ｖａｌ（Ｖ）のとおりである。
【0061】
核酸分子
本発明の第２の態様は、本発明の第１の態様のＴＣＲ分子またはその一部コードする核酸分子を提供し、前記一部は、一つまたは複数のＣＤＲ、α鎖および／またはβ鎖の可変ドメイン、およびα鎖および／またはβ鎖であり得る。
本発明の第２の態様は、本発明の第１の態様のＴＣＲ分子またはその一部コードする核酸分子を提供し、前記一部は、一つまたは複数のＣＤＲ、α鎖および／またはβ鎖の可変ドメイン、およびα鎖および／またはβ鎖であり得る。
【0062】
本発明の第１の態様のＴＣＲ分子のα鎖ＣＤＲ領域をコードするヌクレオチド配列は、
α ＣＤＲ１―ｇａｃａｇｃｔｃｃｔｃｃａｃｃｔａｃ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）、
α ＣＤＲ２―ａｔｔｔｔｔｔｃａａａｔａｔｇｇａｃａｔｇ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）、
α ＣＤＲ３―ｇｃａｇａａｃｃｔａａｃｃａｇｇｃａｇｇａａｃｔｇｃｔｃｔｇａｔｃ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）であり、
本発明の第１の態様のＴＣＲ分子のβ鎖ＣＤＲ領域をコードするヌクレオチド配列は、
β ＣＤＲ１―ａｔｇａａｃｃａｔｇａａｔａｃ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）、
β ＣＤＲ２―ｔｃａｇｔｔｇｇｔｇａｇｇｇｔａｃａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）、
β ＣＤＲ３―ｇｃｃａｇｃａｇｔｔｃｃｃｔｇｇａｇｇａｃｃｃｃｔａｃｇａｇｃａｇｔａｃ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）である。
α ＣＤＲ１―ｇａｃａｇｃｔｃｃｔｃｃａｃｃｔａｃ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）、
α ＣＤＲ２―ａｔｔｔｔｔｔｃａａａｔａｔｇｇａｃａｔｇ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）、
α ＣＤＲ３―ｇｃａｇａａｃｃｔａａｃｃａｇｇｃａｇｇａａｃｔｇｃｔｃｔｇａｔｃ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）であり、
本発明の第１の態様のＴＣＲ分子のβ鎖ＣＤＲ領域をコードするヌクレオチド配列は、
β ＣＤＲ１―ａｔｇａａｃｃａｔｇａａｔａｃ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）、
β ＣＤＲ２―ｔｃａｇｔｔｇｇｔｇａｇｇｇｔａｃａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）、
β ＣＤＲ３―ｇｃｃａｇｃａｇｔｔｃｃｃｔｇｇａｇｇａｃｃｃｃｔａｃｇａｇｃａｇｔａｃ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）である。
【0063】
従って、本発明のＴＣＲα鎖をコードする本発明の核酸分子のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８を含み、および／または本発明のＴＣＲβ鎖をコードする本発明の核酸分子のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１を含む。
【0064】
本発明の核酸分子のヌクレオチド配列は、一本鎖または二本鎖であり得、当該核酸分子は、ＲＮＡ またはＤＮＡであり得、またイントロンを含むか、または含まないことができる。好ましくは、本発明の核酸分子のヌクレオチド配列は、イントロンを含まないが、本発明のポリペプチドをコードすることができ、例えば、本発明のＴＣＲα鎖可変ドメインをコードする本発明の核酸分子のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２を含み、および／または本発明のＴＣＲβ鎖可変ドメインをコードする本発明の核酸分子のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６を含む。または、本発明のＴＣＲα鎖可変ドメインをコードする本発明の核酸分子のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３を含み、および／または本発明のＴＣＲβ鎖可変ドメインをコードする本発明の核酸分子のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５を含む。より好ましくは、本発明の核酸分子のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４および／またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８を含む。または、本発明の核酸分子のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１である。
【0065】
遺伝暗号の縮重により、異なるヌクレオチド配列は、同じポリペプチドをコードすることができることを理解されたい。従って、本発明のＴＣＲをコードする核酸配列は、本発明の図面に示される核酸配列と同じであるか、または縮重された変異体であり得る。本発明の一つの例を説明すると、「縮重された変異体」とは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１を有するタンパク質配列をコードするが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の配列とは異なる核酸配列を指す。
【0066】
ヌクレオチド配列は、コドン最適化されることができる。異なる細胞によって具体的なコドンの使い方が異なり、細胞の種類に応じて、配列のコドンを変更して発現量を増やすことができる。哺乳動物の細胞および他の多くの生物のコドン選択リストは、当業者によく知られている。
【0067】
本発明の核酸分子の全長配列またはそのフラグメントは、通常、ＰＣＲ増幅法、組換え法または人工的合成法によって得られることができるが、これらに限定されない。現在、本発明のＴＣＲ（またはそのフラグメント、またはその誘導体）をコードするＤＮＡ配列は、化学合成によって完全に得られることができる。次に、当該ＤＮＡ配列は、当技術分野で知られている様々な既存のＤＮＡ分子（またはベクター）および細胞に導入されることができる。ＤＮＡは、コード鎖または非コード鎖であり得る。
【0068】
ベクター
本発明は、発現ベクター、即ち、インビボまたはインビトロで発現することができる構築物を含む、本発明の核酸分子を含むベクターに関する。一般に使用されるベクターは、細菌プラスミド、バクテリオファージおよび動植物ウイルスを含む。
本発明は、発現ベクター、即ち、インビボまたはインビトロで発現することができる構築物を含む、本発明の核酸分子を含むベクターに関する。一般に使用されるベクターは、細菌プラスミド、バクテリオファージおよび動植物ウイルスを含む。
【0069】
ウイルス送達システムは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、バキュロウイルスベクターを含むが、これらに限定されない。
好ましくは、ベクターは、本発明のヌクレオチドをＴ細胞等の細胞に移して、当該細胞がＳＳＸ２抗原に特異的なＴＣＲを発現させることができる。理想的には、当該ベクターは、Ｔ細胞で高レベルで持続的に発現されることができる。
好ましくは、ベクターは、本発明のヌクレオチドをＴ細胞等の細胞に移して、当該細胞がＳＳＸ２抗原に特異的なＴＣＲを発現させることができる。理想的には、当該ベクターは、Ｔ細胞で高レベルで持続的に発現されることができる。
【0070】
細胞
本発明は、本発明のベクターまたはコード配列を使用して遺伝子工学によって作成された宿主細胞に関する。前記宿主細胞は、本発明のベクターを含むか、または染色体には本発明の核酸分子が組み込まれた。宿主細胞は、大腸菌、酵母細胞、ＣＨＯ細胞等の原核細胞および真核細胞から選択される。
本発明は、本発明のベクターまたはコード配列を使用して遺伝子工学によって作成された宿主細胞に関する。前記宿主細胞は、本発明のベクターを含むか、または染色体には本発明の核酸分子が組み込まれた。宿主細胞は、大腸菌、酵母細胞、ＣＨＯ細胞等の原核細胞および真核細胞から選択される。
【0071】
さらに、本発明は、本発明のＴＣＲを発現する単離された細胞、特にＴ細胞をさらに含む。当該Ｔ細胞は、被験者から単離されたＴ細胞に由来することができるか、または末梢血リンパ球（ＰＢＬ）グループの一部等の被験者から単離された混合細胞グループであり得る。例えば、当該細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離されることができ、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞またはＣＤ８＋細胞毒性Ｔ細胞であり得る。当該細胞は、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞／ＣＤ８＋細胞毒性Ｔ細胞の混合グループに存在することができる。一般に、当該細胞は、抗体（例えば、抗―ＣＤ３または抗―ＣＤ２８の抗体）で活性化されて、トランスフェクションをより受け入れやすくすることができ、例えば、本発明のＴＣＲ分子をコードするヌクレオチド配列を含むベクターを用いてトランスフェクションを行う。
【0072】
選択的に、本発明の細胞は、幹細胞であるか、または造血幹細胞（ＨＳＣ）等の幹細胞に由来することができる。幹細胞の表面はＣＤ３分子を発現しないため、ＨＳＣへの遺伝子導入は、細胞表面でのＴＣＲの発現を引き起こさない。しかしながら、幹細胞が胸腺に移動するリンパ球前駆細胞（ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）に分化する場合、ＣＤ３分子の発現により、胸腺細胞表面に導入された当該ＴＣＲ分子の発現が開始される。
【0073】
本発明のＴＣＲをコードするＤＮＡまたはＲＮＡによるＴ細胞トランスフェクション（例えば、Ｒｏｂｂｉｎｓら、（２００８）Ｊ．ＩｍＭｕｎｏｌ．１８０：６１１６―６１３１）に適した多くの方法がある。本発明のＴＣＲを発現するＴ細胞は、養子免疫療法に使用されることができる。当業者は、養子治療に適した多くの方法を知ることができる（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、（２００８）Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ８（４）：２９９―３０８）。
【0074】
ＳＳＸ２抗原関連疾患
本発明は、ＳＳＸ２特異的Ｔ細胞を被験者に養子移入する段階を含む、被験者におけるＳＳＸ２関連疾患を治療および／または予防する方法に関する。当該ＳＳＸ２特異的Ｔ細胞は、ＫＡＳＥＫＩＦＹＶ―ＨＬＡ Ａ０２０１複合体を識別することができる。
本発明のＳＳＸ２特異的Ｔ細胞は、ＳＳＸ２抗原の短いペプチドＫＡＳＥＫＩＦＹＶ―ＨＬＡ Ａ０２０１複合体を提示する任意のＳＳＸ２関連疾患を治療するために使用されることができる。例えば、黒色腫、頭頸部がん、リンパ腫、様々な骨髄腫、膵臓がん、前立腺がん、肉腫、肝細胞がんおよび結腸がん等の腫瘍を含むが、これらに限定されない。
本発明は、ＳＳＸ２特異的Ｔ細胞を被験者に養子移入する段階を含む、被験者におけるＳＳＸ２関連疾患を治療および／または予防する方法に関する。当該ＳＳＸ２特異的Ｔ細胞は、ＫＡＳＥＫＩＦＹＶ―ＨＬＡ Ａ０２０１複合体を識別することができる。
本発明のＳＳＸ２特異的Ｔ細胞は、ＳＳＸ２抗原の短いペプチドＫＡＳＥＫＩＦＹＶ―ＨＬＡ Ａ０２０１複合体を提示する任意のＳＳＸ２関連疾患を治療するために使用されることができる。例えば、黒色腫、頭頸部がん、リンパ腫、様々な骨髄腫、膵臓がん、前立腺がん、肉腫、肝細胞がんおよび結腸がん等の腫瘍を含むが、これらに限定されない。
【0075】
治療方法
治療は、ＳＳＸ２抗原関連疾患に罹患している患者またはボランティアからＴ細胞を単離し、本発明のＴＣＲを上記Ｔ細胞に導入し、次にこれらの遺伝子操作された細胞を治療のために患者の体内に注入することによって実施されることができる。従って、本発明は、本発明のＴＣＲを発現する単離されたＴ細胞を含む、ＳＳＸ２関連疾患を治療する方法を提供し、好ましくは、当該Ｔ細胞は、患者自身に裕頼氏、患者の体内に移される。一般に、（１）患者のＴ細胞の単離、（２）本発明の核酸分子または本発明のＴＣＲ分子をコードすることができる核酸分子によるＴ細胞のインビトロ形質導入、（３）患者の体内に注入された遺伝子操作されたＴ細胞を含む。単離、トランスフェクションおよび再注入される細胞の数は、医師によって決定されることができる。
治療は、ＳＳＸ２抗原関連疾患に罹患している患者またはボランティアからＴ細胞を単離し、本発明のＴＣＲを上記Ｔ細胞に導入し、次にこれらの遺伝子操作された細胞を治療のために患者の体内に注入することによって実施されることができる。従って、本発明は、本発明のＴＣＲを発現する単離されたＴ細胞を含む、ＳＳＸ２関連疾患を治療する方法を提供し、好ましくは、当該Ｔ細胞は、患者自身に裕頼氏、患者の体内に移される。一般に、（１）患者のＴ細胞の単離、（２）本発明の核酸分子または本発明のＴＣＲ分子をコードすることができる核酸分子によるＴ細胞のインビトロ形質導入、（３）患者の体内に注入された遺伝子操作されたＴ細胞を含む。単離、トランスフェクションおよび再注入される細胞の数は、医師によって決定されることができる。
【0076】
本発明の主な利点は次のとおりである。
（１）本発明のＴＣＲは、ＳＳＸ２抗原の短いペプチド複合体ＫＡＳＥＫＩＦＹＶ―ＨＬＡ Ａ０２０１に結合することができ、同時に、本発明のＴＣＲで形質導入された細胞は、特異的に活性化され、かつ標的細胞に対して強い殺傷効果を有することができる。
（１）本発明のＴＣＲは、ＳＳＸ２抗原の短いペプチド複合体ＫＡＳＥＫＩＦＹＶ―ＨＬＡ Ａ０２０１に結合することができ、同時に、本発明のＴＣＲで形質導入された細胞は、特異的に活性化され、かつ標的細胞に対して強い殺傷効果を有することができる。
【0077】
以下、本発明は、具体的実施例と併せてさらに説明される。これらの実施例は、本発明を説明するためにのみ使用され、本発明の範囲を限定するものではないことを理解されたい。以下の実施例における具体的な条件を示さない実験方法は、通常、一般的な条件、例えば、（ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌら，分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ－Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）（第３版）（２００１）ＣＳＨＬ出版社）に記載の条件、メーカーよって提案された条件に従う。特に明記されない限り、パーセンテージと部数とは、重量で計算される。以下の実施例で使用される実験材料および試薬は、特に明記しない限り、商業チャネルから入手することができる。
【0078】
実施例１．ＳＳＸ２抗原の短いペプチド特異的Ｔ細胞のクローニング
合成短いペプチドＫＡＳＥＫＩＦＹＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：９、北京サイバーソン遺伝子技術株式会社）を使用して、遺伝子型がＨＬＡ―Ａ０２０１である健康なボランティアの末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を刺激する。ＫＡＳＥＫＩＦＹＶ短いペプチドを、ビオチンマーカーを有するＨＬＡ―Ａ０２０１で再生し、ｐＨＬＡ半数体を調製する。これらの半数体は、ＰＥマーカーのストレプトアビジン（ＢＤ会社）と組み合わせてＰＥマーカーのテトラマーを形成し、当該テトラマーおよび抗―ＣＤ８―ＡＰＣ二重陽性細胞が選択される。選択された細胞を増幅し、上記方法に従って二次選択を行い、次に限界希釈法を使用してものクローニングを行う。モノクローナル細胞は、テトラマーで染色され、スクリーニングされた二重陽性クローンは、図３に示されたとおりである。
合成短いペプチドＫＡＳＥＫＩＦＹＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：９、北京サイバーソン遺伝子技術株式会社）を使用して、遺伝子型がＨＬＡ―Ａ０２０１である健康なボランティアの末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を刺激する。ＫＡＳＥＫＩＦＹＶ短いペプチドを、ビオチンマーカーを有するＨＬＡ―Ａ０２０１で再生し、ｐＨＬＡ半数体を調製する。これらの半数体は、ＰＥマーカーのストレプトアビジン（ＢＤ会社）と組み合わせてＰＥマーカーのテトラマーを形成し、当該テトラマーおよび抗―ＣＤ８―ＡＰＣ二重陽性細胞が選択される。選択された細胞を増幅し、上記方法に従って二次選択を行い、次に限界希釈法を使用してものクローニングを行う。モノクローナル細胞は、テトラマーで染色され、スクリーニングされた二重陽性クローンは、図３に示されたとおりである。
【0079】
ＥＬＩＳＰＯＴ実験を通じて、当該Ｔ細胞クローンの機能および特異性をさらに検出する。当業者は、ＥＬＩＳＰＯＴ実験を使用して細胞機能を検出する方法をよく知っている。本実施例のＩＦＮ―γＥＬＩＳＰＯＴ実験で使用されるエフェクター細胞は、本発明で得られたＴ細胞クローンであり、標的細胞は、本発明の短いペプチドをロードしたＴ２細胞であり、対照グループは、他の短いペプチドをロードしたＴ２細胞および任意の短いペプチドをロードしないＴ２細胞である。
【0080】
まず、ＥＬＩＳＰＯＴプレートを準備し、ＥＬＩＳＰＯＴ実験の段階は次のとおりである。次の順序で、４０μｌのＴ２細胞５×１０５個の細胞／ｍＬ（即ち、２００００個のＴ２細胞／ウェル）、４０μｌのエフェクター細胞（２０００個のＴ細胞クローン／ウェル）等の試験の各成分をＥＬＩＳＰＯＴプレートに加え、２０μｌの特異的な短いペプチドを実験グループに加え、２０μｌの非特異的な短いペプチドを対照グループに加え、２０μｌの培地（試験培地）を空白グループに加え、二つのデュープリケートウェルを設置する。次に、一晩インキュベートする（３７℃、５％ＣＯ２）。その後、プレートを洗浄し、かつ二次検出および発色を行い、プレートを１時間乾燥させ、イムノスポットプレートリーダー（ＥＬＩＳＰＯＴ ＲＥＡＤＥＲ ｓｙｓｔｅｍ、ＡＩＤ会社）を使用して、メンブレンに形成されたスポットを数える。実験結果は、図１４に示されるように、得られた特定の抗原特異的Ｔ細胞クローンが、本発明の短いペプチドをロードしたＴ２細胞に対して特異的な反応を有し、他の無関係なペプチドおよび短いペプチドをロードしないＴ２細胞に対してほぼ反応がない。
【0081】
実施例２．ＳＳＸ２抗原の短いペプチド特異的Ｔ細胞クローンを得るためのＴＣＲ遺伝子およびベクターの構築
用Ｑｕｉｃｋ―ＲＮＡ（商標）ｍｉｎｉＰｒｅｐ（ＺＹＭＯ ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して、実施例１でスクリーニングされた抗原の短いペプチドＫＡＳＥＫＩＦＹＶ特異性、ＨＬＡ―Ａ０２０１限制性Ｔ細胞クローンのトータルＲＮＡを抽出する。ｃＤＮＡの合成は、ｃｌｏｎｔｅｃｈのＳＭＡＲＴ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ増幅キットを使用し、使用されるプライマーは、ヒトＴＣＲ遺伝子のＣ末端保存領域で設計される。配列をＴベクター（ＴＡＫＡＲＡ）にクローンしてシーケンシングする。当該配列は、イントロンを含まない相補的配列であることに注意されたい。シーケンシング後、当該二重陽性クローンによって発現されたＴＣＲのα鎖およびβ鎖の配列構造は、それぞれ図１および図２示されたとおりであり、図１ａ、図１ｂ、図１ｃ、図１ｄ、図１ｅおよび図１ｆは、それぞれＴＣＲα鎖可変ドメインのアミノ酸配列、ＴＣＲα鎖可変ドメインのヌクレオチド配列、ＴＣＲα鎖アミノ酸配列、ＴＣＲα鎖ヌクレオチド配列、リーダー配列を有するＴＣＲα鎖アミノ酸配列およびリーダー配列を有するＴＣＲα鎖ヌクレオチド配列であり、図２ａ、図２ｂ、図２ｃ、図２ｄ、図２ｅおよび図２ｆは、それぞれＴＣＲβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列、ＴＣＲβ鎖可変ドメインのヌクレオチド配列、ＴＣＲβ鎖アミノ酸配列、ＴＣＲβ鎖ヌクレオチド配列、リーダー配列を有するＴＣＲβ鎖アミノ酸配列およびリーダー配列を有するＴＣＲβ鎖ヌクレオチド配列である。
用Ｑｕｉｃｋ―ＲＮＡ（商標）ｍｉｎｉＰｒｅｐ（ＺＹＭＯ ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して、実施例１でスクリーニングされた抗原の短いペプチドＫＡＳＥＫＩＦＹＶ特異性、ＨＬＡ―Ａ０２０１限制性Ｔ細胞クローンのトータルＲＮＡを抽出する。ｃＤＮＡの合成は、ｃｌｏｎｔｅｃｈのＳＭＡＲＴ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ増幅キットを使用し、使用されるプライマーは、ヒトＴＣＲ遺伝子のＣ末端保存領域で設計される。配列をＴベクター（ＴＡＫＡＲＡ）にクローンしてシーケンシングする。当該配列は、イントロンを含まない相補的配列であることに注意されたい。シーケンシング後、当該二重陽性クローンによって発現されたＴＣＲのα鎖およびβ鎖の配列構造は、それぞれ図１および図２示されたとおりであり、図１ａ、図１ｂ、図１ｃ、図１ｄ、図１ｅおよび図１ｆは、それぞれＴＣＲα鎖可変ドメインのアミノ酸配列、ＴＣＲα鎖可変ドメインのヌクレオチド配列、ＴＣＲα鎖アミノ酸配列、ＴＣＲα鎖ヌクレオチド配列、リーダー配列を有するＴＣＲα鎖アミノ酸配列およびリーダー配列を有するＴＣＲα鎖ヌクレオチド配列であり、図２ａ、図２ｂ、図２ｃ、図２ｄ、図２ｅおよび図２ｆは、それぞれＴＣＲβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列、ＴＣＲβ鎖可変ドメインのヌクレオチド配列、ＴＣＲβ鎖アミノ酸配列、ＴＣＲβ鎖ヌクレオチド配列、リーダー配列を有するＴＣＲβ鎖アミノ酸配列およびリーダー配列を有するＴＣＲβ鎖ヌクレオチド配列である。
【0082】
同定によると、α鎖は、
α ＣＤＲ１―ＤＳＳＳＴＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）、
α ＣＤＲ２―ＩＦＳＮＭＤＭ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）、
α ＣＤＲ３―ＡＥＰＮＱＡＧＴＡＬＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含み、
β鎖は、
β ＣＤＲ１―ＭＮＨＥＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）、
β ＣＤＲ２―ＳＶＧＥＧＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）、
β ＣＤＲ３―ＡＳＳＳＬＥＤＰＹＥＱＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含む。
α ＣＤＲ１―ＤＳＳＳＴＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）、
α ＣＤＲ２―ＩＦＳＮＭＤＭ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）、
α ＣＤＲ３―ＡＥＰＮＱＡＧＴＡＬＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含み、
β鎖は、
β ＣＤＲ１―ＭＮＨＥＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）、
β ＣＤＲ２―ＳＶＧＥＧＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）、
β ＣＤＲ３―ＡＳＳＳＬＥＤＰＹＥＱＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含む。
【0083】
オーバーラップ（ｏｖｅｒｌａｐ）ＰＣＲによって、それぞれＴＣＲのα鎖およびβ鎖の全長遺伝子をレンチウイルス発現ベクターｐＬｅｎｔｉ（ａｄｄｇｅｎｅ）にクローンする。具体的には、オーバーラップＰＣＲを使用して、ＴＣＲのα鎖およびＴＣＲβ鎖の全長遺伝子を結合して、ＴＣＲα―２Ａ―ＴＣＲβフラグメントを得る。レンチウイルス発現ベクターおよびＴＣＲα―２Ａ―ＴＣＲβを消化し、結合して、ｐＬｅｎｔｉ―ＴＲＡ―２Ａ―ＴＲＢ―ＩＲＥＳ―ＮＧＦＲプラスミドを得る。対照として、同時にｅＧＦＰを発現するレンチウイルスベクターｐＬｅｎｔｉ―ｅＧＦＰも構築する。その後、２９３Ｔ／１７を使用して、偽ウイルスをパッケージ化する。
【0084】
実施例３．ＳＳＸ２抗原の短いペプチド特異的な可溶性ＴＣＲの発現、リフォールディングおよび精製
可溶性ＴＣＲ分子を得るために、本発明のＴＣＲ分子のα鎖およびβ鎖は、それぞれその可変ドメインおよび定常ドメインの一部のみを含むことができ、またα鎖およびβ鎖の定常ドメインにそれぞれ一つのシステイン残基を導入して、人工的な鎖間ジスルフィド結合を形成し、システイン残基を導入した位置は、それぞれＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＴｈｒ４８およびＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＳｅｒ５７であり、そのα鎖のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列は、それぞれ図４ａおよび図４ｂに示されたとおりであり、そのβ鎖のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列は、それぞれ図５ａおよび図５ｂに示されたとおりである。「分子クローニング：実験マニュアル」（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）（第３版、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ）に記載の標準的な方法を通じて、上記ＴＣＲのα鎖およびβ鎖の標的遺伝子配列を合成した後、それぞれ発現ベクターｐＥＴ２８ａ＋（Ｎｏｖａｇｅｎｅ）に插入し、上流と下流とのクローニング部位は、それぞれＮｃｏＩおよびＮｏｔＩである。插入されたフラグメントは、シーケンシングによって確認される。
可溶性ＴＣＲ分子を得るために、本発明のＴＣＲ分子のα鎖およびβ鎖は、それぞれその可変ドメインおよび定常ドメインの一部のみを含むことができ、またα鎖およびβ鎖の定常ドメインにそれぞれ一つのシステイン残基を導入して、人工的な鎖間ジスルフィド結合を形成し、システイン残基を導入した位置は、それぞれＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＴｈｒ４８およびＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＳｅｒ５７であり、そのα鎖のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列は、それぞれ図４ａおよび図４ｂに示されたとおりであり、そのβ鎖のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列は、それぞれ図５ａおよび図５ｂに示されたとおりである。「分子クローニング：実験マニュアル」（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）（第３版、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ）に記載の標準的な方法を通じて、上記ＴＣＲのα鎖およびβ鎖の標的遺伝子配列を合成した後、それぞれ発現ベクターｐＥＴ２８ａ＋（Ｎｏｖａｇｅｎｅ）に插入し、上流と下流とのクローニング部位は、それぞれＮｃｏＩおよびＮｏｔＩである。插入されたフラグメントは、シーケンシングによって確認される。
【0085】
ＴＣＲα鎖およびβ鎖の発現ベクターは、それぞれ化学形質転換法により発現細菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換され、細菌は、ＬＢ培養液で増殖し、ＯＤ６００＝０．６で最終濃度０．５ｍＭのＩＰＴＧで誘導され、ＴＣＲα鎖およびβ鎖の発現後に形成された封入体を、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｎｏｖａｇｅｎｅ）で抽出し、またＢｕｇＢｕｓｔｅｒ溶液で繰り返し洗浄し、最後に、封入体を６Ｍの塩酸グアニジン、１０ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）、１０ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、２０ｍＭのトリス（Ｔｒｉｓ）（ｐＨ８．１）に溶解する。
【0086】
溶解後のＴＣＲα鎖およびβ鎖は、５Ｍの尿素、０．４Ｍのアルギニン、２０ｍＭのトリス（ｐＨ８．１）、３．７ｍＭのシスタミン（ｃｙｓｔａｍｉｎｅ）、６．６ｍＭのβ―メルかポエチルアミン（β―ｍｅｒｃａｐｏｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）（４℃）に１：１の質量比ですばやく混合され、最終濃度は、６０ｍｇ／ｍＬである。混合後、溶液を１０倍量の脱イオン水に入れて透析し（４℃）、１２時間後、脱イオン水を緩衝液（２０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０）に変え、４℃で１２時間透析を続ける。透析完了後の溶液を０．４５μｍのフィルターメンプレンでろ過した後、陰イオン交換カラム（ＨｉＴｒａｐ Ｑ ＨＰ、５ｍｌ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製する。溶出されたピークに正常に再生されたαおよびβダイマーが含まれたＴＣＲは、ＳＤＳ―ＰＡＧＥゲルによって確認される。次に、ＴＣＲは、ゲルろ過クロマトグラフィー（ＨｉＰｒｅｐ １６／６０、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ―１００ ＨＲ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によってさらに精製される。精製後のＴＣＲの純度は、ＳＤＳ―ＰＡＧＥによって９０％を超えることが確認され、濃度は、ＢＣＡ法によって確認される。本発明によって得られた可溶性ＴＣＲのＳＤＳ―ＰＡＧＥゲル図は、図６に示されたとおりである。
【0087】
実施例４．ＳＳＸ２抗原の短いペプチド特異性的な可溶性一本鎖ＴＣＲの生成
特許文書ＷＯ２０１４／２０６３０４の記載によると、部位特異的突然変異の方法を使用して、実施例２のＴＣＲのα鎖およびβ鎖の可変ドメインを、一つの柔軟な短いペプチド（リンカー（ｌｉｎｋｅｒ））によって結合された安定的で可溶性の一本鎖ＴＣＲ分子に構築した。当該一本鎖ＴＣＲ分子のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列は、それぞれ図７ａおよび図７ｂに示されたとおりである。そのα鎖可変ドメインのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列は、それぞれ図８ａおよび図８ｂに示されたとおりであり、そのβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列は、それぞれ図９ａおよび図９ｂに示されたとおりであり、そのリンカー配列のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列は、それぞれ図１０ａおよび図１０ｂに示されたとおりである。
特許文書ＷＯ２０１４／２０６３０４の記載によると、部位特異的突然変異の方法を使用して、実施例２のＴＣＲのα鎖およびβ鎖の可変ドメインを、一つの柔軟な短いペプチド（リンカー（ｌｉｎｋｅｒ））によって結合された安定的で可溶性の一本鎖ＴＣＲ分子に構築した。当該一本鎖ＴＣＲ分子のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列は、それぞれ図７ａおよび図７ｂに示されたとおりである。そのα鎖可変ドメインのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列は、それぞれ図８ａおよび図８ｂに示されたとおりであり、そのβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列は、それぞれ図９ａおよび図９ｂに示されたとおりであり、そのリンカー配列のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列は、それぞれ図１０ａおよび図１０ｂに示されたとおりである。
【0088】
標的遺伝子をＮｃｏｉおよびＮｏｔｉで二重消化した後、ＮｃｏｉおよびＮｏｔｉで二重消化されたｐＥＴ２８ａベクターに結合する。結合生成物をＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αに形質転換し、カナマイシンを含むＬＢプレートにコーティングし、３７℃で一晩逆さにして培養し、ＰＣＲスクリーニング用の陽性クローンを選択し、陽性組換え単位に対してシーケンシングし、配列が正しいかどうかを確認した後、組換えプラスミドを抽出し、発現のためにＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換した。
【0089】
実施例５．ＳＳＸ２抗原の短いペプチド特異的な可溶性の一本鎖ＴＣＲの発現、再生および精製
実施例４で調製された組換えプラスミドｐＥＴ２８ａ―テンプレート鎖を含むすべてのＢＬ２１（ＤＥ ３）コロニーを、カナマイシンを含むＬＢ培地に接種し、３７℃でＯＤ６００が０．６～０．８になるまで培養し、最終濃度が０．５ｍＭになるようにＩＰＴＧを加え、３７℃で４時間インキュベートし続ける。５０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して細胞ペレットを溶解し、Ｂｕｇｂｕｓｔｅｒ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｍｅｒｃｋ）で細胞ペレットを溶解し、６０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して封入体を回収し、再びＢｕｇｂｕｓｔｅｒ（Ｍｅｒｃｋ）で洗浄して細胞破片および膜成分を除去し、６０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して、封入体を収集する。封入体を緩衝液（２０ｍＭのトリス―ＨＣｌ、ｐＨ８．０、８Ｍの尿素）に溶解し、高速で遠心分離して不溶性物質を除去し、上清液をＢＣＡ法で定量した後、分注して―８０℃で保存する。
実施例４で調製された組換えプラスミドｐＥＴ２８ａ―テンプレート鎖を含むすべてのＢＬ２１（ＤＥ ３）コロニーを、カナマイシンを含むＬＢ培地に接種し、３７℃でＯＤ６００が０．６～０．８になるまで培養し、最終濃度が０．５ｍＭになるようにＩＰＴＧを加え、３７℃で４時間インキュベートし続ける。５０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して細胞ペレットを溶解し、Ｂｕｇｂｕｓｔｅｒ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｍｅｒｃｋ）で細胞ペレットを溶解し、６０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して封入体を回収し、再びＢｕｇｂｕｓｔｅｒ（Ｍｅｒｃｋ）で洗浄して細胞破片および膜成分を除去し、６０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して、封入体を収集する。封入体を緩衝液（２０ｍＭのトリス―ＨＣｌ、ｐＨ８．０、８Ｍの尿素）に溶解し、高速で遠心分離して不溶性物質を除去し、上清液をＢＣＡ法で定量した後、分注して―８０℃で保存する。
【0090】
溶解した５ｍｇの一本鎖ＴＣＲ封入体タンパク質に、２．５ｍＬの緩衝液（６ＭＧｕａ―ＨＣｌ、５０ｍＭのトリス―ＨＣｌ、ｐＨ８．１、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡ）を加え、最終濃度が１０ｍＭになるまでＤＴＴを加え、３７℃で３０分間処理する。注射器を使用して、１２５ｍＬの再生緩衝液（１００ｍＭのトリス―ＨＣｌ、ｐＨ８．１、０．４ＭＬの―アルギニン、５Ｍの尿素、２ｍＭのＥＤＴＡ、６．５ｍＭのβ―メルカプトエチルアミン、１．８７ｍＭのシスタミン）に、上記処理後の一本鎖ＴＣＲを滴下し、４℃で１０分間撹拌し、次に再生溶液をカットオフが４ｋＤａであるセルロース膜透析バッグに入れ、透析バッグを１Ｌの予冷水に入れ、４℃で一晩ゆうっくりと攪拌する。１７時間後、透析溶液を１Ｌの予冷緩衝液（２０ｍＭのトリス―ＨＣｌ、ｐＨ８．０）に変更し、４℃で８時間透析を続け、次に透析溶液を同じ新鮮な緩衝液に変更して、一晩透析を続ける。１７時間後、サンプルを０．４５μｍのフィルターメンプレンでろ過し、真空脱気した後、陰イオン交換カラム（ＨｉＴｒａｐ Ｑ ＨＰ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に通過し、２０ｍＭのトリス―ＨＣｌ、ｐＨ８．０で調製した０―１ＭのＮａＣｌ線形勾配溶出液でタンパク質を精製し、収集された溶出成分をＳＤＳ―ＰＡＧＥで分析し、一本鎖ＴＣＲを含む成分を濃縮した後、ゲルろ過カラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ １０／３００、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって精製し、ターゲット成分もＳＤＳ―ＰＡＧＥで分析する。
【0091】
ＢＩＡｃｏｒｅ分析に使用される溶出成分は、ゲルろ過法によって純度がさらに試験される。条件は次のとおりである。クロマトグラフィーカラムＡｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏ ＳＥＣ―３（３００Ａ、φ７．８×３００ｍＭ）、移動相は、１５０ｍＭのリン酸塩緩衝液であり、流速は、０．５ｍＬ／ｍｉｎであり、カラム温度は、２５℃であり、ＵＶ検出波長は、２１４ｎｍである。
本発明で得られた可溶性一本鎖ＴＣＲのＳＤＳ―ＰＡＧＥゲル図は、図１１に示されたとおりである。
本発明で得られた可溶性一本鎖ＴＣＲのＳＤＳ―ＰＡＧＥゲル図は、図１１に示されたとおりである。
【0092】
実施例６．結合特性化
ＢＩＡｃｏｒｅ分析
本実施例は、本発明の可溶性ＴＣＲ分子がＫＡＳＥＫＩＦＹＶ―ＨＬＡ Ａ０２０１複合体に特異的に結合されることができることを証明する。
ＢＩＡｃｏｒｅ分析
本実施例は、本発明の可溶性ＴＣＲ分子がＫＡＳＥＫＩＦＹＶ―ＨＬＡ Ａ０２０１複合体に特異的に結合されることができることを証明する。
【0093】
ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ２００リアルタイム分析システムを使用して、実施例３および実施例５で得られたＴＣＲ分子とＫＡＳＥＫＩＦＹＶ―ＨＬＡ Ａ０２０１複合体との結合活性を検出する。抗ストレプトアビジン抗体（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）をカップリング緩衝液（１０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ４．７７）に加え、次に抗体を事前にＥＤＣとＮＨＳとで活性化したＣＭ５チップを流して、抗体をチップ表面に固定し、最後にエタノールアミン塩酸溶液で反応していない活性化表面を密閉して、カップリングプロセスを完了し、カップリングレベルは、約１５０００ＲＵである。
【0094】
抗体でコーティングされたチップの表面に低濃度のストレプトアビジンを流し、次にＫＡＳＥＫＩＦＹＶ―ＨＬＡ Ａ０２０１複合体を検出チャネルに流し、別のチャネルを参照チャネルとして流し、０．０５ｍＭのビオチンを１０μＬ／ｍｉｎの流速で２分間チップに流し、ストレプトアビジンの残りの結合部位を密閉する。
【0095】
上記ＫＡＳＥＫＩＦＹＶ―ＨＬＡ Ａ０２０１複合体の調製プロセスは、次のとおりである。
ａ．精製
重鎖または軽鎖の発現を誘導するＥ．ｃｏｌｉ菌溶液を１００ｍＬ収集し、４℃、８０００ｇで１０分間遠心分離した後、１０ｍＬのＰＢＳで細菌を１回洗浄し、その後５ｍＬのＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ｍｅｒｃｋ）で激しく振とうして細菌を再懸濁し、室温下で回転させながら２０分間インキュベートし、その後４℃、６０００ｇで１５分間遠心分離し、上清を捨て、封入体を収集する。
ａ．精製
重鎖または軽鎖の発現を誘導するＥ．ｃｏｌｉ菌溶液を１００ｍＬ収集し、４℃、８０００ｇで１０分間遠心分離した後、１０ｍＬのＰＢＳで細菌を１回洗浄し、その後５ｍＬのＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ｍｅｒｃｋ）で激しく振とうして細菌を再懸濁し、室温下で回転させながら２０分間インキュベートし、その後４℃、６０００ｇで１５分間遠心分離し、上清を捨て、封入体を収集する。
【0096】
上記封入体を５ｍＬのＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘに再懸濁し、室温下で回転させながら５分間インキュベートし、１０倍希釈した３０ｍＬのＢｕｇＢｕｓｔｅｒを加え、均等に混合し、４℃、６０００ｇで１５分間遠心分離し、上清を捨て、１０倍希釈した３０ｍＬのＢｕｇＢｕｓｔｅｒを加えて封入体を再懸濁し、均等に混合し、４℃、６０００ｇで１５分間遠心分離し、２回繰り返し、３０ｍＬの２０ｍＭトリス―ＨＣｌ、ｐＨ８．０を加えて封入体を再懸濁し、均等に混合し、４℃、６０００ｇで１５分間遠心分離し、最後に２０ｍＭトリス―ＨＣｌ、８Ｍ尿素で封入体を溶解し、ＳＤＳ―ＰＡＧＥで封入体の純度を検出し、ＢＣＡキットで濃度を測定する。
【0097】
ｂ．再生
合成された短いペプチドＫＡＳＥＫＩＦＹＶ（北京サイバーソン遺伝子技術株式会社）を２０ｍｇ／ｍｌの濃度になるまでＤＭＳＯに溶解する。軽鎖および重鎖の封入体を、８Ｍ尿素、２０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０、１０ｍＭＤＴＴで溶解し、再生前に、３Ｍ塩酸グアニジン、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、１０ｍＭＥＤＴＡを加えてさらに変性する。ＫＡＳＥＫＩＦＹＶペプチドを２５ｍｇ／Ｌ（最終濃度）で再生緩衝液（０．４ＭＬ―アルギニン、１００ｍＭトリス、ｐＨ８．３、２ｍＭＥＤＴＡ、０．５ｍＭ酸化型グルタチオンペプチド、５ｍＭ還元型グルタチオンペプチド、０．２ｍＭＰＭＳＦ、４℃に冷却する）に加え、次に順次に２０ｍｇ／Ｌの軽鎖および９０ｍｇ／Ｌの重鎖を加え（最終濃度、重鎖は、８時間／回で３回分けて加える）、再生は、４℃で少なくとも３日で完了し、ＳＤＳ―ＰＡＧＥで再生が成功したかどうかを検出する。
合成された短いペプチドＫＡＳＥＫＩＦＹＶ（北京サイバーソン遺伝子技術株式会社）を２０ｍｇ／ｍｌの濃度になるまでＤＭＳＯに溶解する。軽鎖および重鎖の封入体を、８Ｍ尿素、２０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０、１０ｍＭＤＴＴで溶解し、再生前に、３Ｍ塩酸グアニジン、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、１０ｍＭＥＤＴＡを加えてさらに変性する。ＫＡＳＥＫＩＦＹＶペプチドを２５ｍｇ／Ｌ（最終濃度）で再生緩衝液（０．４ＭＬ―アルギニン、１００ｍＭトリス、ｐＨ８．３、２ｍＭＥＤＴＡ、０．５ｍＭ酸化型グルタチオンペプチド、５ｍＭ還元型グルタチオンペプチド、０．２ｍＭＰＭＳＦ、４℃に冷却する）に加え、次に順次に２０ｍｇ／Ｌの軽鎖および９０ｍｇ／Ｌの重鎖を加え（最終濃度、重鎖は、８時間／回で３回分けて加える）、再生は、４℃で少なくとも３日で完了し、ＳＤＳ―ＰＡＧＥで再生が成功したかどうかを検出する。
【0098】
ｃ．再生後の精製
透析用として１０倍量の２０ｍＭトリス、ｐＨ８．０を使用して、再生緩衝液を交換し、緩衝液を少なくとも２回交換して、溶液のイオン強度を十分に低下させる。透析後、タンパク質溶液を０．４５μｍの酢酸セルロースフィルターメンプレンでろ過し、次にＨｉＴｒａｐ Ｑ ＨＰ（ＧＥゼネラルエレクトリックカンパニー（ＧＥ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｃｏｍｐａｎｙ））陰イオン交換カラム（５ｍＬのベッドボリューム）にロードする。Ａｋｔａ精製器（ＧＥゼネラルエレクトリックカンパニー）を使用して、２０ｍＭトリスｐＨ８．０で配制した０～４００ｍＭＮａＣｌ線形勾配溶液でタンパク質を溶出し、ｐＭＨＣは、約２５０ｍＭＮａＣｌで溶出され、各ピーク成分を収集し、ＳＤＳ―ＰＡＧＥで純度を検出する。
透析用として１０倍量の２０ｍＭトリス、ｐＨ８．０を使用して、再生緩衝液を交換し、緩衝液を少なくとも２回交換して、溶液のイオン強度を十分に低下させる。透析後、タンパク質溶液を０．４５μｍの酢酸セルロースフィルターメンプレンでろ過し、次にＨｉＴｒａｐ Ｑ ＨＰ（ＧＥゼネラルエレクトリックカンパニー（ＧＥ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｃｏｍｐａｎｙ））陰イオン交換カラム（５ｍＬのベッドボリューム）にロードする。Ａｋｔａ精製器（ＧＥゼネラルエレクトリックカンパニー）を使用して、２０ｍＭトリスｐＨ８．０で配制した０～４００ｍＭＮａＣｌ線形勾配溶液でタンパク質を溶出し、ｐＭＨＣは、約２５０ｍＭＮａＣｌで溶出され、各ピーク成分を収集し、ＳＤＳ―ＰＡＧＥで純度を検出する。
【0099】
ｄ．ビオチン化
精製したｐＭＨＣ分子をＭｉｌｌｉｐｏｒｅ限外ろ過チューブで濃縮し、同時に緩衝液を２０ｍＭトリスｐＨ８．０に変換し、次にビオチン化試薬０．０５ＭＢｉｃｉｎｅ、ｐＨ８．３、１０ｍＭＡＴＰ、１０ｍＭＭｇＯＡｃ、５０μｍのＤ―ビオチン、１００μｇ／ｍｌのＢｉｒＡ酵素（ＧＳＴ―ＢｉｒＡ）を加え、室温下で混合物を一晩インキュベートし、ＳＤＳ―ＰＡＧＥでビオチン化が完了したかどうかを検出する。
精製したｐＭＨＣ分子をＭｉｌｌｉｐｏｒｅ限外ろ過チューブで濃縮し、同時に緩衝液を２０ｍＭトリスｐＨ８．０に変換し、次にビオチン化試薬０．０５ＭＢｉｃｉｎｅ、ｐＨ８．３、１０ｍＭＡＴＰ、１０ｍＭＭｇＯＡｃ、５０μｍのＤ―ビオチン、１００μｇ／ｍｌのＢｉｒＡ酵素（ＧＳＴ―ＢｉｒＡ）を加え、室温下で混合物を一晩インキュベートし、ＳＤＳ―ＰＡＧＥでビオチン化が完了したかどうかを検出する。
【0100】
ｅ．ビオチン化後の複合体の精製
Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ限外ろ過チューブでマーカー後のビオチン化ｐＭＨＣ分子を１ｍＬに濃縮し、ゲルろ過クロマトグラフィーを使用してビオチン化ｐＭＨＣを精製し、Ａｋｔａ精製器（ＧＥゼネラルエレクトリックカンパニー）を使用して、ろ過したＰＢＳを使用して、ＨｉＰｒｅｐＴＭ １６／６０ Ｓ２００ ＨＲカラム（ＧＥゼネラルエレクトリックカンパニー）を事前に平衡化し、１ｍＬの濃縮後のビオチン化ｐＭＨＣ分子をロードし、次にＰＢＳで１ｍＬ／ｍｉｎの流速で溶出する。ビオチン化ｐＭＨＣ分子は、約５５ｍＬで単一のピークとして溶出される。タンパク質を含む成分を合併し、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ限外ろ過チューブで濃縮し、ＢＣＡ法（Ｔｈｅｒｍｏ）でタンパク質濃度を測定し、プロテアーゼ阻害剤ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｒｏｃｈｅ）を加えて、ビオチン化ｐＭＨＣ分子を分注して、―８０℃で保存する。
Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ限外ろ過チューブでマーカー後のビオチン化ｐＭＨＣ分子を１ｍＬに濃縮し、ゲルろ過クロマトグラフィーを使用してビオチン化ｐＭＨＣを精製し、Ａｋｔａ精製器（ＧＥゼネラルエレクトリックカンパニー）を使用して、ろ過したＰＢＳを使用して、ＨｉＰｒｅｐＴＭ １６／６０ Ｓ２００ ＨＲカラム（ＧＥゼネラルエレクトリックカンパニー）を事前に平衡化し、１ｍＬの濃縮後のビオチン化ｐＭＨＣ分子をロードし、次にＰＢＳで１ｍＬ／ｍｉｎの流速で溶出する。ビオチン化ｐＭＨＣ分子は、約５５ｍＬで単一のピークとして溶出される。タンパク質を含む成分を合併し、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ限外ろ過チューブで濃縮し、ＢＣＡ法（Ｔｈｅｒｍｏ）でタンパク質濃度を測定し、プロテアーゼ阻害剤ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｒｏｃｈｅ）を加えて、ビオチン化ｐＭＨＣ分子を分注して、―８０℃で保存する。
【0101】
ＢＩＡｃｏｒｅ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを使用して、ダイナミクスパラメーターを計算することにより、得られた本発明の可溶性ＴＣＲ分子および本発明で構築された可溶性一本鎖ＴＣＲ分子と、ＫＡＳＥＫＩＦＹＶ―ＨＬＡ Ａ０２０１複合体との結合の動態学マップは、それぞれ図１２および図１３に示されたとおりである。マップによると、本発明でえられた可溶性ＴＣＲ分子および可溶性一本鎖ＴＣＲ分子の両方は、ＫＡＳＥＫＩＦＹＶ―ＨＬＡ Ａ０２０１複合体に結合されることができることを示す。同時に、上記方法を使用して、本発明の可溶性ＴＣＲ分子および他のいくつかの無関係な抗原の短いペプチドおよびＨＬＡ複合体との結合活性を検出し、結果は、本発明のＴＣＲ分子が他の無関係な抗原に結合しなかったことを示す。
【0102】
実施例７．本発明のＴＣＲで形質導入されたＴ細胞の活性化実験（Ｔ２負荷）
本発明のＴＣＲ標的遺伝子を含むレンチウイルスベクターを構築し、Ｔ細胞を形質導入し、ＥＬＩＳＰＯＴ機能検証試験を実施する。
ＥＬＩＳＰＯＴスキーム
以下の試験を実施して、標的細胞特異性に対する本発明のＴＣＲで形質導入されたＴ細胞の活性化反応を証明する。ＥＬＩＳＰＯＴ試験で検出されたＩＦＮ―γ生成量をＴ細胞活性化の読み出し値として使用する。
本発明のＴＣＲ標的遺伝子を含むレンチウイルスベクターを構築し、Ｔ細胞を形質導入し、ＥＬＩＳＰＯＴ機能検証試験を実施する。
ＥＬＩＳＰＯＴスキーム
以下の試験を実施して、標的細胞特異性に対する本発明のＴＣＲで形質導入されたＴ細胞の活性化反応を証明する。ＥＬＩＳＰＯＴ試験で検出されたＩＦＮ―γ生成量をＴ細胞活性化の読み出し値として使用する。
【0103】
試薬
試験培地：１０％ＦＢＳ（ギブコ会社（Ｇｉｂｃｏ）、カタログ番号１６０００―０４４）、ＲＰＭＩ １６４０（ギブコ会社（Ｇｉｂｃｏ）、カタログ番号Ｃ１１８７５５００ｂｔ）
洗浄緩衝液（ＰＢＳＴ）：０．０１ＭＰＢＳ／０．０５％トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０
ＰＢＳ（ギブコ会社（Ｇｉｂｃｏ）、カタログ番号Ｃ１００１０５００ＢＴ）
ＰＶＤＦ ＥＬＩＳＰＯＴ ９６ウェルプレート（メルクミリポア（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、カタログ番号ＭＳＩＰＳ４５１０）
ヒトＩＦＮ―γ ＥＬＩＳＰＯＴ ＰＶＤＦ―酵素キット（ＢＤは、必要とする他のすべての試薬（捕捉および検出抗体、ストレプトアビジン―アルカリホスファターゼおよびＢＣＩＰ／ＮＢＴ溶液）を含む
試験培地：１０％ＦＢＳ（ギブコ会社（Ｇｉｂｃｏ）、カタログ番号１６０００―０４４）、ＲＰＭＩ １６４０（ギブコ会社（Ｇｉｂｃｏ）、カタログ番号Ｃ１１８７５５００ｂｔ）
洗浄緩衝液（ＰＢＳＴ）：０．０１ＭＰＢＳ／０．０５％トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０
ＰＢＳ（ギブコ会社（Ｇｉｂｃｏ）、カタログ番号Ｃ１００１０５００ＢＴ）
ＰＶＤＦ ＥＬＩＳＰＯＴ ９６ウェルプレート（メルクミリポア（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、カタログ番号ＭＳＩＰＳ４５１０）
ヒトＩＦＮ―γ ＥＬＩＳＰＯＴ ＰＶＤＦ―酵素キット（ＢＤは、必要とする他のすべての試薬（捕捉および検出抗体、ストレプトアビジン―アルカリホスファターゼおよびＢＣＩＰ／ＮＢＴ溶液）を含む
【0104】
方法
標的細胞の調製
本実験で使用される標的細胞は、特異的短いペプチドをロードするＴ２細胞である。実験培地で標的細胞を調製する。標的細胞の濃度を２．０×１０５細胞／ｍＬに調整し、ウェルあたり１００μＬを摂取することにより、２．０×１０４細胞／ウェルを得る。
標的細胞の調製
本実験で使用される標的細胞は、特異的短いペプチドをロードするＴ２細胞である。実験培地で標的細胞を調製する。標的細胞の濃度を２．０×１０５細胞／ｍＬに調整し、ウェルあたり１００μＬを摂取することにより、２．０×１０４細胞／ウェルを得る。
【0105】
エフェクター細胞の調製
本実験におけるエフェクター細胞（Ｔ細胞）は、本発明のＳＳＸ２抗原の短いペプチドの特異的なＴＣＲを発現するＣＤ８＋ Ｔ細胞であり、同じボランティアからの本発明のＴＣＲでトランスフェクトされたＣＤ８＋ Ｔ細胞を対照グループとして使用する。抗ＣＤ３／ＣＤ２８コーティングビーズ（Ｔ細胞増幅産物、ライフテクノロジー（ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））でＴ細胞を刺激し、ＳＳＸ２抗原の短いペプチド特異的なＴＣＲ遺伝子を保有するレンチウイルスで形質導入し、形質導入後９～１２日まで５０ＩＵ／ｍｌのＩＬ―２および１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ―７を含む１０％ＦＢＳを含む１６４０培地で増幅し、次にこれらの細胞を試験培地に入れ、室温下で３００ｇで１０分間遠心分離して洗浄する。次に細胞を、所望の最終濃度の２倍で試験培地に再懸濁する。陰性対照エフェクター細胞も同様に処理する。
本実験におけるエフェクター細胞（Ｔ細胞）は、本発明のＳＳＸ２抗原の短いペプチドの特異的なＴＣＲを発現するＣＤ８＋ Ｔ細胞であり、同じボランティアからの本発明のＴＣＲでトランスフェクトされたＣＤ８＋ Ｔ細胞を対照グループとして使用する。抗ＣＤ３／ＣＤ２８コーティングビーズ（Ｔ細胞増幅産物、ライフテクノロジー（ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））でＴ細胞を刺激し、ＳＳＸ２抗原の短いペプチド特異的なＴＣＲ遺伝子を保有するレンチウイルスで形質導入し、形質導入後９～１２日まで５０ＩＵ／ｍｌのＩＬ―２および１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ―７を含む１０％ＦＢＳを含む１６４０培地で増幅し、次にこれらの細胞を試験培地に入れ、室温下で３００ｇで１０分間遠心分離して洗浄する。次に細胞を、所望の最終濃度の２倍で試験培地に再懸濁する。陰性対照エフェクター細胞も同様に処理する。
【0106】
短いペプチド溶液の調製
ＥＬＩＳＰＯＴウェルプレートにおける短いペプチドの最終濃度が１μｇ／ｍｌにするために、対応する短いペプチドを対応する標的細胞（Ｔ２）実験グループに加える。
ＥＬＩＳＰＯＴウェルプレートにおける短いペプチドの最終濃度が１μｇ／ｍｌにするために、対応する短いペプチドを対応する標的細胞（Ｔ２）実験グループに加える。
【0107】
ＥＬＩＳＰＯＴ
製造業者の説明書に従って、ウェルプレートを次のように準備する。抗ヒトＩＦＮ―γ捕捉抗体をプレートあたり１０ｍＬの滅菌ＰＢＳで１：２００に希釈し、次に、１００μＬの希釈捕捉抗体を各ウェルに均等に加える。４℃下でウェルプレートを一晩インキュベートする。インキュベートした後、ウェルプレートを洗浄して、過剰な捕捉抗体を除去する。１０％ＦＢＳを含む１００μＬ／ウェルのＲＰＭＩ １６４０培地を加え、ウェルプレートを密閉するために、室温下でウェルプレートを２時間インキュベートする。次にウェルプレートから培地を洗い流し、ＥＬＩＳＰＯＴウェルプレートを紙上でフリックして軽くたたくことにより、残りの洗浄緩衝液をすべて除去する。
製造業者の説明書に従って、ウェルプレートを次のように準備する。抗ヒトＩＦＮ―γ捕捉抗体をプレートあたり１０ｍＬの滅菌ＰＢＳで１：２００に希釈し、次に、１００μＬの希釈捕捉抗体を各ウェルに均等に加える。４℃下でウェルプレートを一晩インキュベートする。インキュベートした後、ウェルプレートを洗浄して、過剰な捕捉抗体を除去する。１０％ＦＢＳを含む１００μＬ／ウェルのＲＰＭＩ １６４０培地を加え、ウェルプレートを密閉するために、室温下でウェルプレートを２時間インキュベートする。次にウェルプレートから培地を洗い流し、ＥＬＩＳＰＯＴウェルプレートを紙上でフリックして軽くたたくことにより、残りの洗浄緩衝液をすべて除去する。
【0108】
次に、次の順序で試験の各成分をＥＬＩＳＰＯＴウェルプレートに加える。
１００μＬの標的細胞２＊１０５細胞／ｍＬ（合計で約２＊１０４標的細胞／ウェルを得る）。
１００μＬのエフェクター細胞（１＊１０４対照エフェクター細胞／ウェルおよびＳＳＸ２ ＴＣＲ陽性Ｔ細胞／ウェル）。
すべてのウェルは、２回重複して調製され追加される。
１００μＬの標的細胞２＊１０５細胞／ｍＬ（合計で約２＊１０４標的細胞／ウェルを得る）。
１００μＬのエフェクター細胞（１＊１０４対照エフェクター細胞／ウェルおよびＳＳＸ２ ＴＣＲ陽性Ｔ細胞／ウェル）。
すべてのウェルは、２回重複して調製され追加される。
【0109】
次に、ウェルプレート一晩インキュベートし（３７℃／５％ ＣＯ２）、翌日、培地を捨て、再蒸留水でウェルプレートを２回洗浄し、洗浄緩衝液で３回洗浄し、ペーパータオルに置いて、軽くたたいて、残りの洗浄緩衝液を除去する。次に検出抗体を１０％ＦＢＳを含むＰＢＳで１：２００に希釈し、１００μＬ／ウェルで各ウェルに加える。室温下でウェルプレートを２時間インキュベートし、洗浄緩衝液で３回洗浄し、ウェルプレートをペーパータオルで軽くたたいて、過剰な洗浄緩衝液を除去する。
【0110】
ストレプトアビジン―アルカリホスファターゼを１０％ＦＢＳを含むＰＢＳで１：１００に希釈し、１００μＬの希釈したストレプトアビジン―アルカリホスファターゼを各ウェルに加え、かつ室温下でウェルプレートを１時間インキュベートする。次に洗浄緩衝液で４回洗浄し、ＰＢＳで２回洗浄し、ウェルプレートをペーパータオルで軽くたたいて過剰な洗浄緩衝液およびＰＢＳを除去する。洗浄完了後、キットによって提供されるＢＣＩＰ／ＮＢＴ溶液を１００μＬ／ウェルで加えて現像する。現像期間中に、光から保護するために錫箔でウェルプレートを覆い、５～１５分間静置する。この期間中に、反応が終了する最適な時間を確認するために、現像ウェルプレートのスポットを定期的に検出する。ＢＣＩＰ／ＮＢＴ溶液を除去し、かつウェルプレートを再蒸留水で洗い流して、現像反応を停止し、スピンドライし、次にウェルプレートの底部を除去し、各ウェルが完全に乾くまで室温下でウェルプレートを乾燥し、イムノスポットプレートリーダー（ＣＴＬ、細胞技術株式会社（Ｃｅｌｌｕｌａｒ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＬｉｍｉｔｅｄ））を使用して、ウェルプレートの底膜に形成されたスポット数える。
【0111】
結果
ＥＬＩＳＰＯＴ実験（上記のように）を使用して、ＳＳＸ２抗原の短いペプチドＫＡＳＥＫＩＦＹＶをロードする標的細胞に反応する、本発明のＴＣＲで形質導入されたＴ細胞のＩＦＮ―γ放出を試験する。ｇｒａｐｈｐａｄ ｐｒｉｓｍ６を使用して、各ウェルで観察されたＥＬＳＰＯＴスポットの数を製図する。
ＥＬＩＳＰＯＴ実験（上記のように）を使用して、ＳＳＸ２抗原の短いペプチドＫＡＳＥＫＩＦＹＶをロードする標的細胞に反応する、本発明のＴＣＲで形質導入されたＴ細胞のＩＦＮ―γ放出を試験する。ｇｒａｐｈｐａｄ ｐｒｉｓｍ６を使用して、各ウェルで観察されたＥＬＳＰＯＴスポットの数を製図する。
【0112】
実験結果は、図１５に示されたとおりであり、本発明のＴＣＲで形質導入されたＴ細胞は、その特異的な短いペプチドをロードする標的細胞に対して要綱な活性化反応を有するが、本発明のＴＣＲで形質導入されていないＴ細胞は、対応する標的細胞に対して活性化反応をほとんど有さない。
【0113】
実施例８．腫瘍細胞株に対する本発明のＴＣＲで形質導入されたＴ細胞のＥｌｉｓｐｏｔ活性化実験
本実施例は、本発明のＴＣＲでトランスフェクトされたエフェクター細胞が、標的細胞に対して良好な特異的活性化効果を有することを検証する。細胞における本発明のＴＣＲの機能および特異性をＥＬＩＳＰＯＴ実験によって検出される。
本実施例は、本発明のＴＣＲでトランスフェクトされたエフェクター細胞が、標的細胞に対して良好な特異的活性化効果を有することを検証する。細胞における本発明のＴＣＲの機能および特異性をＥＬＩＳＰＯＴ実験によって検出される。
【0114】
当業者は、ＥＬＩＳＰＯＴ実験を使用して細胞機能を検出するための方法に精通している。本発明のＴＣＲは、エフェクター細胞として健康なボランティアの血液から単離されたＣＤ３陽性Ｔ細胞をトランスフェクトする。対照グループは、他のＴＣＲでトランスフェクされた細胞である。本実施例で使用される腫瘍細胞株は、Ａ３７５、Ｋ５６２―Ａ２（ＨＬＡ Ａ０２０１過剰発現）、ＳＷ６２０―ＳＳＸ２（抗原ＳＳＸ２を過剰発現する）、ＮＣＩ―Ｈ１２９９―ＳＳＸ２、Ｋ５６２―Ａ１１、ＳＷ６２０である。ここで、Ａ３７５、Ｋ５６２―Ａ２およびＳＷ６２０―ＳＳＸ２は、陽性腫瘍細胞株であり、ＮＣＩ―Ｈ１２９９―ＳＳＸ２、Ｋ５６２―Ａ１１およびＳＷ６２０は、陰性腫瘍細胞株である。
【0115】
まず、ＥＬＩＳＰＯＴプレートを準備する。ＥＬＩＳＰＯＴプレートをエタノールで活性化およびコーティングし、４℃下で一晩置く。実験の初日に、コーティング溶液を除去し、洗浄して密閉し、室温下で２時間インキュベートし、密閉溶液を除去し、試験の各成分をＥＬＩＳＰＯＴプレートに加え、標的細胞は、２００００細胞／ウェルであり、エフェクター細胞は、１０００細胞／ウェルであり（トランスフェクションの陽性率に従って計算する）、二つのデュープリケートウェルを設置する。一晩インキュベートする（３７℃、５％ ＣＯ２）。実験の２日目に、プレートを洗浄し、かつ二次検出および発色を実施し、プレートを乾燥させ、イムノスポットプレートリーダー（ＥＬＩＳＰＯＴ ＲＥＡＤＥＲ ｓｙｓｔｅｍ、ＡＩＤ２０会社）を使用して、膜に形成されたスポットをカウントする。
【0116】
実験結果は、図１６に示されたとおりであり、本発明のＴＣＲでトランスフェクされたエフェクター細胞は、標的細胞に対して非常に良好な特異的活性化効果を有するが、他のＴＣＲでトランスフェクされた細胞は、陽性標的細胞に対してほとんど活性化効果を有さない。
【0117】
本発明で言及されたすべての文書は、あたかも各文書が個別に参照として引用されたかのように、本出願における参照として引用される。さらに、本発明の上記の教示内容を読んだ後、当業者は本発明に様々な変更または修正を加えることができ、これらの同等の形態も、本出願の添付の請求範囲によって定義される範囲に含まれる。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図1E】
【図1F】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図2E】
【図2F】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図5A】
【図5B】
【図6】
【図7A】
【図7B】
【図8A】
【図8B】
【図9A】
【図9B】
【図10A】
【図10B】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【配列表】