特許 7429907 セリアックスプルー病を治療するための組成物および方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-02-01

(45)【発行日】2024-02-09

(54)【発明の名称】セリアックスプルー病を治療するための組成物および方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 9/48 20060101AFI20240202BHJP

   C07K 14/00 20060101ALI20240202BHJP

   C12N 15/57 20060101ALI20240202BHJP

   A61P 37/08 20060101ALI20240202BHJP

   A61P 1/04 20060101ALI20240202BHJP

   A61K 38/48 20060101ALI20240202BHJP

   A61K 35/12 20150101ALI20240202BHJP

【ＦＩ】

C12N9/48 ZNA

C07K14/00

C12N15/57

A61P37/08

A61P1/04

A61K38/48

A61K35/12

【請求項の数】 11

(21)【出願番号】P 2021099361

(22)【出願日】2021-06-15

(62)【分割の表示】P 2017560984の分割

【原出願日】2016-06-08

(65)【公開番号】P2021151250

(43)【公開日】2021-09-30

【審査請求日】2021-07-14

(31)【優先権主張番号】62/172,557

(32)【優先日】2015-06-08

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】514104933

【氏名又は名称】ユニヴァーシティ オブ ワシントン

(73)【特許権者】

【識別番号】505434227

【氏名又は名称】ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア

(74)【代理人】

【識別番号】100114775

【弁理士】

【氏名又は名称】高岡 亮一

(74)【代理人】

【識別番号】100121511

【弁理士】

【氏名又は名称】小田 直

(74)【代理人】

【識別番号】100202751

【弁理士】

【氏名又は名称】岩堀 明代

(74)【代理人】

【識別番号】100191086

【弁理士】

【氏名又は名称】高橋 香元

(72)【発明者】

【氏名】プルツ，イングリッド，スワンソン

(72)【発明者】

【氏名】ウォルフ，クランシー

(72)【発明者】

【氏名】シーゲル，ジャスティン，ブルームフィールド

(72)【発明者】

【氏名】ティンバーグ，クリスティン，エレイン

(72)【発明者】

【氏名】スチュアート，ランス

(72)【発明者】

【氏名】ベイカー，デイヴィット

【審査官】中野 あい

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１４－５２９３９９（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１５／０２３７２８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】J Am Chem Soc. , 2012 Dec 19 (Epub 2012 Dec 5), vol. 134, no. 50, pp. 20513-20520

【文献】J Am Chem Soc. , 2015 Oct 14 (Epub 2015 Sep 29), vol. 137, no. 40, pp. 13106-13113，(supplementary information pp. S1-S9)

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １５／５７－１５／９０

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含み、
（ａ）残基４６７がＳｅｒであり、残基２６７がＧｌｕであり、かつ残基２７１がＡｓｐであり、かつ
（ｂ）配列番号１に対してＧ３５８Ｓ、Ｉ４６３Ｔ、Ｄ３９９Ｑ、Ａ４４９Ｑ、Ｋ２６２Ｅ、Ｅ２６９Ｔ、およびＳ３５４Ｑのアミノ酸変化を含む、それを必要とする対象においてセリアックスプルーまたは非セリアックグルテン過敏症（ＮＣＧＳ）を治療するためのポリペプチドであって、前記ポリペプチドはグリアジンエンドペプチダーゼ活性を有する、ポリペプチド。

【請求項2】

アミノ酸変化３２０Ｍをさらに含む、請求項１に記載のポリペプチド。

【請求項3】

アミノ酸変化Ｐ１７１ＲおよびＨ１７２Ｒをさらに含む、請求項１または２に記載のポリペプチド。

【請求項4】

配列番号７１のアミノ酸配列と少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を含み、
（ａ）残基２７８がＳｅｒであり、残基７８がＧｌｕであり、かつ残基８２がＡｓｐであり、かつ
（ｂ）配列番号７１に対してＧ１６９Ｓ、Ｉ２７４Ｔ、Ｄ２１０Ｑ、Ａ２６０Ｑ、Ｋ７３Ｅ、Ｅ８０Ｔ、およびＳ１６５Ｑのアミノ酸変化を含む、それを必要とする対象においてセリアックスプルーまたは非セリアックグルテン過敏症（ＮＣＧＳ）を治療するためのポリペプチドであって、前記ポリペプチドはグリアジンエンドペプチダーゼ活性を有する、ポリペプチド。

【請求項5】

アミノ酸変化１３１Ｍをさらに含む、請求項４に記載のポリペプチド。

【請求項6】

特に限定されないがアミノ酸配列ＧＳＴＥＮＬＹＦＱＳＧＡＬＥＨＨＨＨＨＨ（配列番号１３９）を含む、ヒスチジンタグをＣ末端にさらに含む、請求項１～５のいずれか１項に記載のポリペプチド。

【請求項7】

前記ヒスチジンタグが、特に限定されないがアミノ酸配列Ｘ_ＮＰＱ（Ｌ／Ｑ）ＰＸ_ＮＨＨＨＨＨＨ（配列番号１３１）を含む、切断可能なヒスチジンタグを含み、配列中Ｘ_Ｎが１～２５アミノ酸残基リンカーである、請求項６に記載のポリペプチド。

【請求項8】

前記切断可能なヒスチジンタグがアミノ酸配列ＧＳＳＧＳＳＧＳＱＰＱＬＰＹＧＳＳＧＳＳＧＳＨＨＨＨＨＨ（配列番号１３２）を含む、請求項７に記載のポリペプチド。

【請求項9】

配列番号５９のアミノ酸配列と少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み、
（ａ）残基４６７がＳｅｒであり、残基２６７がＧｌｕであり、かつ残基２７１がＡｓｐであり、かつ
（ｂ）配列番号１に対してＧ３５８Ｓ、Ｉ４６３Ｔ、Ｄ３９９Ｑ、Ａ４４９Ｑ、Ｋ２６２Ｅ、Ｅ２６９Ｔ、およびＳ３５４Ｑのアミノ酸変化を含む、それを必要とする対象においてセリアックスプルーまたは非セリアックグルテン過敏症（ＮＣＧＳ）を治療するためのポリペプチドであって、前記ポリペプチドはグリアジンエンドペプチダーゼ活性を有する、ポリペプチド。

【請求項10】

配列番号５９から少なくとも一つのアミノ酸欠失を含む、請求項９に記載のポリペプチド。

【請求項11】

配列番号１２９に記載のアミノ酸配列を含む、請求項９に記載のポリペプチド。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

（相互参照）
本願は、２０１５年６月８日に出願された米国仮特許出願第６２／１７２，５５７号の優先権を主張するものであり、上記出願の内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0002】

セリアックスプルーは有病率が極めて高い疾患の１つであり、コムギ、オオムギ、およびライムギの製品に含まれる「グルテン」として知られる食品タンパク質が、遺伝的素因のある人の小腸で免疫応答を引き起こすものである。生じた炎症によって小腸の絨毛が変性し、栄養吸収が阻害されることがある。幼少期または晩年を問わず症状が現れ、その重症度は下痢、疲労および体重減少から腹部膨満、貧血、および神経症状まで広範囲にわたる。この生涯にわたる疾患には現時点で、食事からグルテンを完全に排除すること以外に効果的な治療法はない。セリアックスプルーは依然として過小診断されることが多いものの、米国およびヨーロッパでのその有病率は人口の０．５～１．０％であると推定される。セリアックスプルーに加えて、非セリアックグルテン過敏症（ＮＣＧＳ）の病態に罹患している者も相当な割合にのぼると考えられており、この病態はグルテンの経口摂取に起因するがセリアック病とは機構的に異なっており、しかしながらその症状はセリアックスプルーのものと区別できないことが多い。ヒト消化管の厳しい強酸性条件下でグルテン由来ペプチドを特異的かつ効率的に分解するには厳しい物理的条件および化学的条件が必要とされるため、セリアック病およびＮＣＧＳの経口治療薬に適した天然の酵素を特定するのは困難である。グルテンペプチドは腸管内に侵入した直後に免疫応答を惹起することから、このような免疫原性グルテン領域を胃区画内で分解し、それによりこのグルテンペプチドが炎症による腸管損傷を引き起こさないようにするセリアック病の経口酵素治療薬が不可欠である。

【発明の概要】

【0003】

一態様では、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれを超えて同一であるアミノ酸配列を含み、
（ａ）残基４６７がＳｅｒであり、残基２６７がＧｌｕであり、残基２７１がＡｓｐであり；かつ
（ｂ）４６３、２２１、２６２Ｅ、２６８、２６９、２７０、３１９Ａ、３２０、３５４Ｅ／Ｑ／Ｒ／Ｙ、３５８Ｓ／Ｑ／Ｔ、３６８Ｆ／Ｑ、３９９、４０２、４０６、４２４、４４９、４６１、１０５、１７１、１７２、１７３、１７４、および４５６からなる群より選択される１つまたは複数の残基で配列番号１からのアミノ酸変化を含む、
ポリペプチドを提供する。

【0004】

一実施形態では、ポリペプチドは、４６３、２２１、２６２Ｅ、２６８、２６９、２７０、３１９Ａ、３２０、３５４Ｅ／Ｑ／Ｒ／Ｙ、３５８Ｓ／Ｑ／Ｔ、３６８Ｆ／Ｑ、３９９、４０２、４０６、４２４、４４９、および４６１からなる群より選択される１つまたは複数の残基で配列番号１からのアミノ酸変化を含む。別の実施形態では、ポリペプチドは、２２１Ｄ／Ｎ／Ｑ／Ｈ、２６２Ｅ、２６８Ｓ／Ｔ／Ａ、２６９Ｌ／Ｔ、２７０Ａ／Ｔ／Ｖ、３１９Ａ、３５４Ｅ／Ｑ／Ｒ／Ｙ、３５８Ｓ／Ｑ／Ｔ、３６８Ｆ／Ｑ、３９９Ｑ、４０２Ｓ／Ｑ、４０６Ｓ、４２４Ｋ、４４９Ｅ／Ｎ／Ｑ、４６１Ｒ、および４６３Ａ／Ｌ／Ｍ／Ｑ／Ｒ／Ｔ／Ｖからなる群より選択される１つまたは複数の残基で配列番号１からのアミノ酸変化を含む。さらなる実施形態では、ポリペプチドは、そのグループから選択される２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個またはそれより多い残基で配列番号１からのアミノ酸変化を含む。

【0005】

一実施形態では、ポリペプチドは、残基３９９および４４９で配列番号１からのアミノ酸変化、例えばアミノ酸変化３９９Ｑおよび４４９Ｑなどを含む。別の実施形態では、ポリペプチドは、アミノ酸変化３５８Ｓおよび４６３Ｔを含む。さらなる実施形態では、ポリペプチドは、アミノ酸変化２６２Ｅ、２６９Ｔ、３５４Ｑ、３５８Ｓ、３９９Ｑ、４４９Ｑ、および４６３Ｔを含む。別の実施形態では、ポリペプチドは、アミノ酸変化３１９Ａ、３６８Ｆ、３９９Ｑ、４４９Ｑ、および４６３Ｔを含む。さらなる実施形態では、ポリペプチドは、アミノ酸変化２６２Ｅ、２６９Ｔ、２７０Ｖ、３５４Ｑ、３５８Ｓ、３９９Ｑ、および４４９Ｑを含む。さらなる実施形態では、ポリペプチドは、アミノ酸変化２６２Ｅ、２６９Ｔ、３２０Ｍ、３５４Ｑ、３５８Ｓ、３９９Ｑ、４４９Ｑ、および４６３Ｔを含む。別の実施形態では、ポリペプチドは、アミノ酸変化３１９Ａ、３２０Ｍ、３６８Ｆ、３９９Ｑ、４４９Ｑ、および４６３Ｔを含む。一実施形態では、ポリペプチドは、１０５、１７１、１７２、１７３、１７４、および４５６からなる群より選択される１つまたは複数のアミノ酸位置に配列番号１からのアミノ酸変化、例えばアミノ酸変化１０５Ｈ；１７１Ｒ Ａ、もしくはＳ；１７２Ｒ、Ａ、もしくはＳ；１７３Ｒ、もしくはＳ、１７４Ｓおよび／または４５６Ｖなどを含む。

【0006】

別の態様では、本発明は、配列番号７１のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれを超えて同一であるアミノ酸配列を含み、
（ａ）残基２７８がＳｅｒであり、残基７８がＧｌｕであり、残基８２がＡｓｐであり；かつ
（ｂ）２７４、３２、７３Ｅ、７９、８０、８１、１３０Ａ、１６５Ｅ／Ｑ／Ｒ／Ｙ、１６９Ｓ／Ｑ／Ｔ、１７９Ｆ／Ｑ、２１０、２１３、２１７、２３５、２６０、２６７、および２７２からなる群より選択される１つまたは複数の残基で配列番号７１からのアミノ酸変化を含む、
ポリペプチドを提供する。

【0007】

一実施形態では、ポリペプチドは、２７４、３２、７３Ｅ、７９、８０、８１、１３０Ａ、１６５Ｅ／Ｑ／Ｒ／Ｙ、１６９Ｓ／Ｑ／Ｔ、１７９Ｆ／Ｑ、２１０、２１３、２１７、２３５、２６０、および２７２からなる群より選択される１つまたは複数の残基で配列番号７１からのアミノ酸変化を含む。

【0008】

一実施形態では、ポリペプチドは、３２Ｄ／Ｎ／Ｑ／Ｈ、７３Ｅ、７９Ｓ／Ｔ／Ａ、８０Ｌ／Ｔ、８１Ａ／Ｔ／Ｖ、１３０Ａ、１６５Ｅ／Ｑ／Ｒ／Ｙ、１６９Ｓ／Ｑ／Ｔ、１７９Ｆ／Ｑ、２１０Ｑ、２１３Ｓ／Ｑ、２１７Ｓ、２３５Ｋ、２６０Ｅ／Ｎ／Ｑ、２７２Ｒ、および２７４Ａ／Ｌ／Ｍ／Ｑ／Ｒ／Ｔ／Ｖからなる群より選択される１つまたは複数の残基で配列番号７１からのアミノ酸変化を含む。さらなる実施形態では、ポリペプチドは、そのグループから選択される２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、またはそれ以上の残基で配列番号７１からのアミノ酸変化を含む。一実施形態では、ポリペプチドは、残基２１０および２６０で、特に限定されないがアミノ酸変化２１０Ｑおよび２６０Ｑ含む配列番号７１からのアミノ酸変化を含む。別の実施形態では、ポリペプチドは、アミノ酸変化１６９Ｓおよび２７４Ｔを含む。さらなる実施形態では、ポリペプチドは、アミノ酸変化７３Ｅ、８０Ｔ、１６５Ｑ、１６９Ｓ、２１０Ｑ、２６０Ｑ、および２７４Ｔを含む。別の実施形態では、ポリペプチドは、アミノ酸変化１３０Ａ、１７９Ｆ、２１０Ｑ、２６０Ｑ、および２７４Ｔを含む。さらなる実施形態では、ポリペプチドは、アミノ酸変化７３Ｅ、８０Ｔ、８１Ｖ、１６５Ｑ、１６９Ｓ、２１０Ｑ、および２６０Ｑを含む。さらなる実施形態では、ポリペプチドは、アミノ酸変化７３Ｅ、８０Ｔ、３２０Ｍ、１６５Ｑ、１６９Ｓ、２１０Ｑ、２６０Ｑ、および２７４Ｔを含む。一実施形態では、ポリペプチドは、アミノ酸変化１３０Ａ、１３１Ｍ、１７９Ｆ、２１０Ｑ、２６０Ｑ、および２７４Ｔを含む。別の実施形態では、ポリペプチドは、アミノ酸位置２６７で、特に限定されないが２６７Ｖを含む配列番号７１からのアミノ酸変化を含む。

【0009】

別の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２～４２、配列番号４４～６０および７２～１１２、ならびに配列番号１１４～１３０および１５０～１５５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。さらなる実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２～４２、配列番号５５～６０および７２～１１２、ならびに配列番号１２５～１３０および１５０～１５５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。

【0010】

一実施形態では、本発明のポリペプチドは、ポリペプチドのＣ末端にヒスチジンタグをさらに含み得る。別の実施形態では、ヒスチジンタグは、切断可能なヒスチジンタグを含む。特定の実施形態では、切断可能なヒスチジンタグは、アミノ酸配列ＧＳＴＥＮＬＹＦＱＳＧＡＬＥＨＨＨＨＨＨ（配列番号１３９）を含むか、これよりなるものであり得る。別の実施形態では、切断可能なヒスチジンタグは、アミノ酸配列Ｘ_ＮＰＱ（Ｌ／Ｑ）ＰＸ_ＮＨＨＨＨＨＨ（配列番号１３１）を含んでよく、配列中、Ｘ_Ｎは１～２５アミノ酸残基のリンカーである。さらなる実施形態では、切断可能なヒスチジンタグは、アミノ酸配列ＧＳＳＧＳＳＧＳＱＰＱＬＰＹＧＳＳＧＳＳＧＳＨＨＨＨＨＨ（配列番号１３２）を含み得る。

【0011】

別の態様では、本発明は、本発明のいずれかの実施形態のポリペプチドをコードする核酸を提供する。本発明はさらに、本発明の核酸を含む核酸発現ベクターを提供する。本発明はさらに、本発明の核酸発現ベクターを含む組換え宿主細胞を提供する。本発明はまた、本発明のいずれかの実施形態のポリペプチド、核酸、核酸発現ベクター、および／または組換え宿主細胞と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物を提供する。

【0012】

別の態様では、本発明は、セリアックスプルーまたは非セリアックグルテン過敏症（ＮＣＧＳ）を治療するための方法であって、セリアックスプルーまたはＮＣＧＳを有する個体にセリアックスプルーまたはＮＣＧＳの治療に有効な量の本発明のいずれかの実施形態のポリペプチドまたは医薬組成物を投与することを含む、方法を提供する。一実施形態では、ポリペプチドまたは医薬組成物を経口投与する。

【図面の簡単な説明】

【0013】

【図1】Ｋｕｍａ０３０は胃内条件でグルテンの免疫原性領域を迅速かつ効率的に分解できる。（Ａ）示される濃度のＥＰＢ２およびＳＣＰＥＰ（比は１：１）、Ｋｕｍａ０１０、またはＫｕｍａ０３０のいずれかと胃内条件で６０分間インキュベートした後に、Ｇ１２抗体を用いるＥＬＩＳＡによる測定で検出されたグルテンの量。グルテンの開始濃度は１０ｍｇ／ｍＬ（１０，０００ｐｐｍ）であった。Ｙ軸が対数尺度でプロットされていることに留意されたい。（Ｂ）４００μｇ／ｍＬでのＥＰＢ２およびＳＣＰＥＰ、または１０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、もしくは４００μｇ／ｍＬでのＫｕｍａ０３０とのインキュベーションの５分後または３０分後に検出されたグルテンの量。グルテンの開始濃度は１０ｍｇ／ｍＬであった。ペプシン単独とインキュベートした後に測定したグルテンの量に対して試料を正規化した。ＥＳ：重量比１：１のＥＰＢ２およびＳＣＰＥＰ。アスタリスクは、グルテンの量が定量レベル（５ｐｐｍ）未満であったことを表す。（Ｃ）グリアジン（Ｗ０２－Ｅ０７、Ｗ０３－Ｅ０７、３３量体）、ホルデイン（Ｂ０８－Ｅ２Ｅ７）、またはセカリン（Ｒ１１－Ｅ４Ｅ７）由来の免疫優性ペプチドの全長ペプチド（灰色の点線）または分解産物（黒色の線）のＨＰＬＣトレース。図の下に、３３量体ペプチドのアミノ酸配列、既知の免疫原性エピトープの位置（水平の線）、ＬＣＭＳによって求めたＫｕｍａ０３０切断部位の位置（垂直の線）、および得られた分解産物の溶出ピーク（灰色の矢印）を示す。免疫優性ペプチドは以下の分解パターンを示した：Ｂ０８－Ｅ２Ｅ７：ＰＱＱＰＩＰＱ｜｜ＱＰＱＰＹＰＱ｜｜Ｑ（配列番号６１）；Ｒ１１－Ｅ４Ｅ５：ＱＰＦＰＱ｜｜ＱＰＥＱＩＩＰＱ｜｜ＱＰ（配列番号６２）；Ｗ０２－Ｅ７：ＬＱＰＦＰＱＰＱ｜｜ＬＰＹＰＱＰＱ（配列番号６３）；Ｗ０３－Ｅ７：ＱＰＦＰＱＰＱ｜｜ＱＰＦＰＷＱＰ（配列番号６４）。全ペプチドの質量および溶出時間をＬＣＭＳにより確認した。未消化のＷ０３－Ｅ０７ペプチドはＷ０３－Ｅ０７の分解フラグメントとほぼ同じ時間で溶出したが、ＬＣＭＳにより測定されるように、これらは別個のピークであることに留意されたい。ａＡＵは任意の吸光度単位である。

【図2】Ｋｕｍａ０３０で処理したグリアジンはその免疫刺激能を消失する。（Ａ～Ｅ）精製グリアジンを０．６ｍｇ／ｍＬのペプシンの存在下で、ｐＨ４．０にて、３７℃で６０分間、明記される濃度でＫｕｍａ０３０により処理した。胃相の後で、試料のｐＨを上昇させ、試料をキモトリプシンおよびＴＧ２で処理した。次いで、試料を照射自家Ｂ細胞系の存在下で、番号１（Ａ）、番号２（Ｂ）、番号３（Ｃ）、番号４（Ｄ）、または番号５（Ｅ）の患者に由来するＴ細胞系に曝露し、ＩＦＮ－γをＥＬＩＳＡにより測定した。フィトヘマグルテニン（ｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔｅｎｉｎ）（ＰＨＡ）およびグリアジンのペプシン－トリプシン消化物（ＰＴ－グリアジン）を陽性対照として含めた。抗原の不在下でのＴ細胞系と抗原提示細胞のインキュベーションを陰性対照とした。（Ｆ）このアッセイに使用したＴ細胞によって認識されるＴ細胞刺激性エピトープおよびこれらのエピトープ内の予測されるＫｕｍａ０３０切断部位。予測されるＫｕｍａ０３０切断部位は、垂直の線｜で示される。切断部位は、図１Ｆに示されるグリアジンペプチド（上から下に向かって、配列番号１４１、１４２、１４１、１４２、１４３、１４４、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４５、１４６、１４５）に対するＫｕｍａ０３０の活性に基づき予測される。

【図3】Ｋｕｍａ０３０はＴ細胞に対して毒性でない。酵素処理グリアジンの毒性作用の可能性を、マイトジェンフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）で刺激した健常ドナー由来のヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を用いて評価した。（ａ、ｂ）番号１の健常ドナー（Ａ）または番号２の健常ドナー（Ｂ）に由来するＴ細胞のＩＦＮ－ｇ産生。（Ｃ、Ｄ）番号１の健常ドナー（Ｃ）または番号２の健常ドナー（Ｄ）に由来するＴ細胞の増殖。番号２の健常ドナーの増殖（ＩＦＮ－ｇの産生ではない）を除き、ＩＦＮ－ｇ産生に対しても細胞増殖に対しても何ら作用は観察されなかった。ＰＨＡで刺激した細胞増殖の減少は酵素処理と関係なく同じであったため、本発明者らは、この作用は試料の毒性によるものではなかったと結論付ける。

【図4】Ｋｕｍａ０３０は複雑な食品基質中のグルテンを効率的に分解する。（Ａ）示される酵素濃度でＫｕｍａ０３０またはＥＰＢ２とＳＣＰＥＰの１：１の組合せと３０分間インキュベートした後に、全粒コムギパン中に残存するグルテンの量。グルテンの開始濃度は１０，０００ｐｐｍであった。両軸とも対数尺度でプロットされていることに留意されたい。（Ｂ）示される濃度のＥＰＢ２：ＳＣＰＥＰ（比は１：１）、またはＫｕｍａ０３０と３７℃または４℃で、５分、１５分、または６０分にてインキュベートした後にコムギビール中に残存するグルテンの量。グルテンはＧ１２ ＥＬＩＳＡ法を用いて検出した。

【図5】Ｋｕｍａ０１０、Ｋｕｍａ０２０、Ｋｕｍａ０３０、Ｋｕｍａ０４０、およびＫｕｍａ０５０の２６量体および３３量体を分解する能力の比較。酵素を２μｇ／ｍＬで１ｍｇ／ｍＬの３３量体ペプチド（ａ）または２６量体ペプチド（ｂ）と６０分間インキュベートした。試料を示される時点で採取し、ペプチド分解産物の濃度を測定した。分解産物は、３３量体ペプチド（配列番号６９）由来のＬＰＹＰＱＰＱＦ（配列番号１３７）、二十六量体ペプチド（配列番号７０）由来のＱＰＹＰＱ（配列番号１４７）であった。活性を内部標準のｍ／ｚシグナルに対するしかるべきｍ／ｚシグナルの比としてグラフで表す。

【図6】Ｇ３２０Ｍ変異は活性を２～４倍向上させる。免疫原性エピトープＤＱ２．５－グリア－α１ａ（ＰＱＬを含む）（左）、およびＤＱ２．５－グリア－ω１（ＰＱＱを含む）（右）の分解における活性が示される。試料を示される時点で採取し、ペプチド分解産物ＰＦＰＱＰＱ（配列番号１４８）の濃度を測定した。活性を内部標準のｍ／ｚシグナルに対するしかるべきｍ／ｚシグナルの比としてグラフで表す。

【図7】Ｐ１７１Ｒ変異およびＨ１７２Ｒ変異は活性に悪影響を及ぼさないと思われる。免疫原性グリアジンエピトープＤＱ２．５－グリア－α１ａに対する酵素バリアントＫｕｍａ０３０、Ｋｕｍａ０３１、Ｋｕｍａ０３２、Ｋｕｍａ０４０、Ｋｕｍａ０４１、およびＫｕｍａ０４２の酵素活性が示される。試料を示される時点で採取し、ペプチド分解産物ＰＦＰＱＰＱ（配列番号１４８）の濃度を測定した。活性を内部標準のｍ／ｚシグナルに対するしかるべきｍ／ｚシグナルの比としてグラフで表す。全ての酵素は陰イオン交換により精製した。

【図8】Ｋｕｍａ０６２はＫｕｍａ０３０またはＫｕｍａ０４０よりも高い酵素活性レベルを示す。免疫原性グリアジンエピトープＤＱ２．５－グリア－ω１に対する活性が示される。左：完全長ＤＱ２．５－グリア－ω１の検出；右：ＰＦＰＱＰＱ（配列番号１４８）分解産物の検出。試料を示される時点で採取し、全長ペプチド、または分解産物ＰＦＰＱＰＱ（配列番号１４８）の濃度を測定した。活性を内部標準のｍ／ｚシグナルに対するしかるべきｍ／ｚシグナルの比としてグラフで表す。

【発明を実施するための形態】

【0014】

（詳細な説明）
本明細書に引用される参考文献はいずれも、その全体が参照により組み込まれる。本願では、特に明記されない限り、用いる技術は、いくつかのよく知られた参考文献、例えば：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，第１８５巻，Ｄ．Ｇｏｅｄｄｅｌ編，１９９１．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ社、サンディエゴ、カリフォルニア州）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙの「Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ」（Ｍ．Ｐ．Ｄｅｕｔｓｈｃｅｒ編，（１９９０）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ社）；ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓら，１９９０．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ社、サンディエゴ、カリフォルニア州）、Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，第２版（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ．１９８７．Ｌｉｓｓ社、ニューヨーク、ニューヨーク州）、Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ｐｐ．１０９－１２８，Ｅ．Ｊ．Ｍｕｒｒａｙ編，Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ社、クリフトン、ニュージャージー州）、およびＡｍｂｉｏｎ １９９８ Ｃａｔａｌｏｇ（Ａｍｂｉｏｎ社、オースティン、テキサス州）などのいずれかにみられる。

【0015】

本明細書で使用される単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上明らかに別の意味を表す場合を除き複数形の指示対象を包含する。本明細書で使用される「および（ならびに）」は、別途明記されない限り、「または（あるいは、もしくは）」と互換的に使用される。

【0016】

本明細書で使用されるアミノ酸残基は、以下の通りに略記される：アラニン（Ａｌａ；Ａ）、アスパラギン（Ａｓｎ；Ｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ；Ｄ）、アルギニン（Ａｒｇ；Ｒ）、システイン（Ｃｙｓ；Ｃ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ；Ｅ）、グルタミン（Ｇｌｎ；Ｑ）、グリシン（Ｇｌｙ；Ｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ；Ｈ）、イソロイシン（Ｉｌｅ；Ｉ）、ロイシン（Ｌｅｕ；Ｌ）、リジン（Ｌｙｓ；Ｋ）、メチオニン（Ｍｅｔ；Ｍ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ；Ｆ）、プロリン（Ｐｒｏ；Ｐ）、セリン（Ｓｅｒ；Ｓ）、トレオニン（Ｔｈｒ；Ｔ）、トリプトファン（Ｔｒｐ；Ｗ）、チロシン（Ｔｙｒ；Ｙ）、およびバリン（Ｖａｌ；Ｖ）。

【0017】

本発明の任意の態様の実施形態はいずれも、文脈上明らかに別の意味を表す場合を除き、組み合わせて用いることができる。

【0018】

第一の態様では、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を含み、
（ａ）残基４６７がＳｅｒであり、残基２６７がＧｌｕであり、および残基２７１がＡｓｐであり；かつ
（ｂ）２６２Ｅ、２６８、２６９、２７０、３１９Ａ、３２０、３５４Ｅ／Ｑ／Ｒ／Ｙ、３５８Ｓ／Ｑ／Ｔ、３６８Ｆ／Ｑ、３９９、４０２、４０６、４２４、４４９、４６１、４６３、１０５、１７１、１７２、１７３、１７４、および４５６からなる群より選択される１つまたは複数の残基で配列番号１からのアミノ酸変化を含む、
ポリペプチドを提供する。一実施形態では、ポリペプチドは、２２１、２６２Ｅ、２６８、２６９、２７０、３１９Ａ、３２０、３５４Ｅ／Ｑ／Ｒ／Ｙ、３５８Ｓ／Ｑ／Ｔ、３６８Ｆ／Ｑ、３９９、４０２、４０６、４２４、４４９、４６１、および４６３からなる群より選択される１つまたは複数の残基で配列番号１からのアミノ酸変化を含む。

【0019】

配列番号１（Ｋｕｍａ０１１）
Ｋｕｍａ０１１
ＭＳＤＭＥＫＰＷＫＥ（１０）ＧＥＥＡＲＡＶＬＱＧ（２０）ＨＡＲＡＱＡＰＱＡＶ（３０）ＤＫＧＰＶＡＧＤＥＲ（４０）ＭＡＶＴＶＶＬＲＲＱ（５０）ＲＡＧＥＬＡＡＨＶＥ（６０）ＲＱＡＡＩＡＰＨＡＲ（７０）ＥＨＬＫＲＥＡＦＡＡ（８０）ＳＨＧＡＳＬＤＤＦＡ（９０）ＥＬＲＲＦＡＤＡＨＧ（１００）ＬＡＬＤＲＡＮＶＡＡ（１１０）ＧＴＡＶＬＳＧＰＤＤ（１２０）ＡＩＮＲＡＦＧＶＥＬ（１３０）ＲＨＦＤＨＰＤＧＳＹ（１４０）ＲＳＹＬＧＥＶＴＶＰ（１５０）ＡＳＩＡＰＭＩＥＡＶ（１６０）ＬＧＬＤＴＲＰＶＡＲ（１７０）ＰＨ（１７２）ＦＲＭＱＲＲＡＥ（１８０）ＧＧＦＥＡＲＳＱ（１８８）Ａ
Ａ（１９０）ＡＰＴＡＹＴＰＬＤＶ（２００）ＡＱＡＹＱＦＰＥＧＬ（２１０）ＤＧＱＧＱＣＩＡＩＩ（２２０）Ｅ（２２１／３２）ＬＧＧＧＹＤＥＡＳ（２３０／４１）ＬＡＱＹＦＡＳＬＧＶ（２４０／５１）ＰＡＰＱＶＶＳＶＳＶ（２５０／６１）ＤＧＡＳＮＱＰＴＧＤ（２６０／７１）ＰＫ（２６２／７３）ＧＰＤＧＥ（２６７／７８）Ｖ（２６８／７９）Ｅ（２６９／８０）Ｌ（２７０／８１）Ｄ（２７１／８２）ＩＥＶＡＧＡＬＡＰ（２８０／９１）ＧＡＫＦＡＶＹＦＡＰ（２９０／１０１）ＤＴＴＡＧＦＬＤＡＩ（３００／１１１）ＴＴＡＩＨＤＰＴＬＫ（３１０／１２１）ＰＳＶＶＳＩＳＷＳ（３１９／１３０）Ｇ（３２０／１３１）ＰＥＤＳＷＴＳＡＡＩ（３３０／１４１）ＡＡＭＮＲＡＦＬＤＡ（３４０／１５１）ＡＡＬＧＶＴＶＬＡＡ（３５０／１６１）ＡＧＤＳ（３５４／１６５）ＧＳＴＧ（３５８／１６９）ＧＥ（３６０／１７１）ＱＤＧＬＹＨＶＨ（３６８／１７９）ＦＰ（３７０／１８１）ＡＡＳＰＹＶＬＡＣＧ（３８０／１９１）ＧＴＲＬＶＡＳＧＧＲ（３９０／２０１）ＩＡＱＥＴＶＷＮＤ（３９９／２１０）Ｇ（４００／２１１）ＰＤ（４０２／２１３）ＧＧＡＴ（４０６／２１７）ＧＧＧＶ（４１０／２２１）ＳＲＩＦＰＬＰＡＷＱ（４２０／２３１）ＥＨＡＮ（４２４／２３５）ＶＰＰＳＡＮ（４３０／２４１）ＰＧＡＳＳＧＲＧＶＰ（４４０／２５１）ＤＬＡＧＮＡＤＰＡ（４４９／２６０）Ｔ（４５０／２６１）ＧＹＥＶＶＩＤＧＥＡ（４６０／２７１）Ｔ（４６１／２７２）ＶＩ（４６３／２７４）ＧＧＴＳ（４６７／２７８）ＡＶＡＰＬＦＡＡＬＶＡＲＩＮＱＫＬＧＫＡＶＧＹＬＮＰＴＬＹＱＬＰＡＤＶＦＨＤＩＴＥＧＮＮＤＩＡＮＲＡＱＩＹＱＡＧＰＧＷＤＰＣＴＧＬＧＳＰＩＧＶＲＬＬＱＡＬＬＰＳＡＳＱＰＱＰ（配列番号１）

【0020】

本明細書で参照されるＫｕｍａ０１０は、Ｋｕｍａ０１１と同一であるが、そのＣ末端にヒスチジンタグ配列ＧＳＴＥＮＬＹＦＱＳＧＡＬＥＨＨＨＨＨＨ（配列番号１３９）を含む。

【0021】

太字の残基は、非プロセスポリペプチド中に存在するＮ末端部分を表し；太字でないフォントは、プロセス型のポリペプチド中に存在する残基を表す。括弧内の数字は残基番号を表し；「／」で仕切られた２つの数字がある場合、左側の数字が非プロセス型の残基番号であり、右側の数字がプロセス型の残基番号である。配列番号１は非プロセス型のＫｕｍａ０１１であり；配列番号７１はプロセス型のＫｕｍａ０１１である。

【0022】

のちの実施例に開示するように、本発明のこの態様によるポリペプチドは、例えばセリアックスプルーの治療に使用するために改善されたポリペプチドである。ポリペプチドは、セリアックスプルーの治療のために有用であると開示（国際公開第２０１３／０２３１５１号）された、配列番号１（ＫＵＭＡＭＡＸ（商標）、以降Ｋｕｍａ０１０と称する）のプロセス型または前プロセス型のポリペプチドを改変したものである。セリアックスプルーを治療するためのポリペプチドは、「グリアジン」として知られほとんどのセリアックスプルー患者の免疫応答の大部分を担うと考えられている、グルテンのプロリン（Ｐ）とグルタミン（Ｑ）に富む構成成分を分解できる。本発明のポリペプチドは、ｐＨ４でＰＱＬＰ（配列番号６５）モチーフまたはＰＱＱＰ（配列番号６６）モチーフ（グリアジンを表す基質である、ＰＦＰＱＰＱＬＰＹ（配列番号６７）および／またはＰＦＰＱＰＱＱＰＦ（配列番号６８）など）を有するペプチドの分解において、Ｋｕｍａ０１１およびセリアックスプルーを治療するために有用であると開示される他のポリペプチド（国際公開第２０１５／０２３７２８号）と比較して優れた活性を示し、かつ／またはそれらのポリペプチドの産生を向上させることが示される。したがって、本発明のポリペプチドは、セリアックスプルーを治療するための大幅に改善された治療薬の構成要素となる。

【0023】

したがって、本発明のポリペプチドは、ｐＨ４でＰＦＰＱＰＱＬＰＹ（配列番号６７）ペプチドおよび／またはＰＦＰＱＰＱＱＰＦ（配列番号６８）ペプチド、ならびにＬＱＬＱＰＦＰＱＰＱＬＰＹＰＱＰＱＬＰＹＰＱＰＱＬＰＹＰＱＰＱＰＦ（配列番号６９）および／またはＦＬＱＰＱＱＰＦＰＱＱＰＱＱＰＹＰＱＱＰＱＱＰＦＰＱ（配列番号７０）を分解する。

【0024】

本発明の第一の態様のポリペプチドは、前プロセス型の本発明のポリペプチド酵素を含む。

【0025】

第二の態様では、配列番号７１のアミノ酸配列と少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を含み、
（ａ）残基２７８がＳｅｒであり、残基７８がＧｌｕであり、および残基８２がＡｓｐであり；かつ
（ｂ）３２、７３Ｅ、７９、８０、８１、１３０Ａ、１３１、１６５Ｅ／Ｑ／Ｒ／Ｙ、１６９Ｓ／Ｑ／Ｔ、１７９Ｆ／Ｑ、２１０、２１３、２１７、２３５、２６０、２６７、２７２、および２７４からなる群より選択される１つまたは複数の残基で配列番号７１からのアミノ酸変化を含む、
ポリペプチドを提供する。一実施形態では、ポリペプチドは、３２、７３Ｅ、７９、８０、８１、１３０Ａ、１３１、１６５Ｅ／Ｑ／Ｒ／Ｙ、１６９Ｓ／Ｑ／Ｔ、１７９Ｆ／Ｑ、２１０、２１３、２１７、２３５、２６０、２７２、および２７４からなる群より選択される１つまたは複数の残基で配列番号７１からのアミノ酸変化を含む。

【0026】

本発明の第一の態様のポリペプチドは、プロセス型の本発明のポリペプチド酵素を含み、またｐＨ４でＰＦＰＱＰＱＬＰＹ（配列番号６７）ペプチドおよび／またはＰＦＰＱＰＱＱＰＦ（配列番号６８）ペプチド、ならびにＬＱＬＱＰＦＰＱＰＱＬＰＹＰＱＰＱＬＰＹＰＱＰＱＬＰＹＰＱＰＱＰＦ（配列番号６９）および／またはＦＬＱＰＱＱＰＦＰＱＱＰＱＱＰＹＰＱＱＰＱＱＰＦＰＱ（配列番号７０）を分解する。

【0027】

本明細書で使用される「少なくとも７５％同一である」は、ポリペプチドがその完全長アミノ酸配列において、配列番号１または配列番号７１によって定められるポリペプチドと２５％以下異なっている（任意のアミノ酸の置換、欠失、付加または挿入を含む）ことを意味する。

【0028】

本発明のポリペプチドの任意の態様の種々の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１（前プロセス型）または配列番号７１（プロセス型）によるアミノ酸配列と少なくとも７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むか、これよりなる。

【0029】

本発明のポリペプチドの任意の態様のポリペプチドは、記載される残基の２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、または全２４個（実施形態による）の残基で配列番号１または配列番号７１からのアミノ酸変化を含み得る。

【0030】

本発明の第一の態様のポリペプチドの一実施形態では、ポリペプチドは、２２１Ｄ／Ｎ／Ｑ／Ｈ、２６２Ｅ、２６８Ｓ／Ｔ／Ａ、２６９Ｌ／Ｔ、２７０Ａ／Ｔ／Ｖ、３１９Ａ、３５４Ｅ／Ｑ／Ｒ／Ｙ、３５８Ｓ／Ｑ／Ｔ、３６８Ｆ／Ｑ、３９９Ｑ、４０２Ｓ／Ｑ、４０６Ｓ、４２４Ｋ、４４９Ｅ／Ｎ／Ｑ、４６１Ｒ、および４６３Ａ／Ｌ／Ｍ／Ｑ／Ｒ／Ｔ／Ｖからなる群より選択される１つまたは複数の残基で配列番号１からの１つまたは複数のアミノ酸変化を含む。全体を通じて使用される際、数字は、配列番号１または配列番号７１のポリペプチド配列中の残基番号を表し、数字の右側にある一文字のアミノ酸略記は、配列番号１または７１中のその位置に存在するアミノ酸残基と比較して可能なアミノ酸置換を表す。

【0031】

本発明の第一の態様のポリペプチドの別の実施形態では、ポリペプチドは、残基３９９および４４９で配列番号１からのアミノ酸変化を含む。一実施形態では、ポリペプチドはアミノ酸変化３９９Ｑおよび４４９Ｑを含む。

【0032】

本発明の第一の態様のポリペプチドのさらなる実施形態では、ポリペプチドは３５８Ｓおよび４６３Ｔを含む。これらのポリペプチドは、Ｋｕｍａ０２０と命名されるポリペプチドおよびそのバリアントによって例示されるように、のちの実施例で詳細に特徴が明らかにされる。

【0033】

本発明の第一の態様のポリペプチドの一実施形態では、ポリペプチドは、２６２Ｅ、２６９Ｔ、３５４Ｑ、３５８Ｓ、３９９Ｑ、４４９Ｑ、および４６３Ｔを含む。これらのポリペプチドは、Ｋｕｍａ０３０と命名されるポリペプチドおよびそのバリアントによって例示されるように、のちの実施例で詳細に特徴が明らかにされる。本発明の第一の態様のポリペプチドの別の実施形態では、ポリペプチドは、３１９Ａ、３６８Ｆ、３９９Ｑ、４４９Ｑ、およびＩ４６３Ｔを含む。これらのポリペプチドは、Ｋｕｍａ０４０と命名されるポリペプチドおよびそのバリアントによって例示されるように、のちの実施例で詳細に特徴が明らかにされる。本発明の第一の態様のポリペプチドのさらなる実施形態では、ポリペプチドは、２６２Ｅ、２６９Ｔ、２７０Ｖ、３５４Ｑ、３５８Ｓ、３９９Ｑ、およびＡ４４９Ｑを含む。これらのポリペプチドは、Ｋｕｍａ０５０と命名されるポリペプチドおよびそのバリアントによって例示されるように、のちの実施例で詳細に特徴が明らかにされる。本発明の第一の態様のポリペプチドの一実施形態では、ポリペプチドは、２６２Ｅ、２６９Ｔ、３２０Ｍ、３５４Ｑ、３５８Ｓ、３９９Ｑ、４４９Ｑ、および４６３Ｔを含む。これらのポリペプチドは、Ｋｕｍａ０６０と命名されるポリペプチドおよびそのバリアントによって例示されるように、のちの実施例で詳細に特徴が明らかにされる。本発明の第一の態様のポリペプチドのさらなる実施形態では、ポリペプチドは、３１９Ａ、３２０Ｍ、３６８Ｆ、３９９Ｑ、４４９Ｑ、および４６３Ｔを含む。これらのポリペプチドは、Ｋｕｍａ０７０と命名されるポリペプチドおよびそのバリアントによって例示されるように、のちの実施例で詳細に特徴が明らかにされる。

【0034】

本発明の第一の態様のポリペプチドの別の実施形態では、ポリペプチドは、１０５、１７１、１７２、１７３、１７４、および４５６１つまたは複数のアミノ酸位置で配列番号１からのアミノ酸変化を含む。一実施形態では、アミノ酸変化は、１０５Ｈ；１７１Ｒ Ａ、もしくはＳ；１７２Ｒ、Ａ、もしくはＳ；１７３ＲもしくはＳ、１７４Ｓ、および／または４５６Ｖである。別の実施形態では、アミノ酸変化は、１７１Ｒ、１７２Ｒ、および／または４５６Ｖである。

【0035】

本発明の第二の態様のポリペプチドの一実施形態では、ポリペプチドは、３２Ｄ／Ｎ／Ｑ／Ｈ、７３Ｅ、７９Ｓ／Ｔ／Ａ、８０Ｌ／Ｔ、８１Ａ／Ｔ／Ｖ、１３０Ａ、１６５Ｅ／Ｑ／Ｒ／Ｙ、１６９Ｓ／Ｑ／Ｔ、１７９Ｆ／Ｑ、２１０Ｑ、２１３Ｓ／Ｑ、２１７Ｓ、２３５Ｋ、２６０Ｅ／Ｎ／Ｑ、２７２Ｒ、および２７４Ａ／Ｌ／Ｍ／Ｑ／Ｒ／Ｔ／Ｖからなる群より選択される１つまたは複数の残基で配列番号７１からの１つまたは複数のアミノ酸変化を含む。本発明の第二の態様のポリペプチドの別の実施形態では、ポリペプチドは、残基２１０および２６０で配列番号７１からのアミノ酸変化を含む。本発明の第二の態様のポリペプチドのさらなる実施形態では、ポリペプチドはアミノ酸変化２１０Ｑおよび２６０Ｑを含む。本発明の第二の態様のポリペプチドの一実施形態では、ポリペプチドは１６９Ｓおよび２７４Ｔを含む。（Ｋｕｍａ２０属）本発明の第二の態様のポリペプチドの別の実施形態では、ポリペプチドは、７３Ｅ、８０Ｔ、１６５Ｑ、１６９Ｓ、２１０Ｑ、２６０Ｑ、および２７４Ｔを含む。（Ｋｕｍａ３０属）本発明の第二の態様のポリペプチドのさらなる実施形態では、ポリペプチドは、１３０Ａ、１７９Ｆ、２１０Ｑ、２６０Ｑ、および２７４Ｔを含む。（Ｋｕｍａ４０属）本発明の第二の態様のポリペプチドのさらなる実施形態では、ポリペプチドは、７３Ｅ、８０Ｔ、８１Ｖ、１６５Ｑ、１６９Ｓ、２１０Ｑ、および２６０Ｑを含む。（Ｋｕｍａ５０属）本発明の第二の態様のポリペプチドの一実施形態では、ポリペプチドは、７３Ｅ、８０Ｔ、３２０Ｍ、１６５Ｑ、１６９Ｓ、２１０Ｑ、２６０Ｑ、および２７４Ｔを含む。（Ｋｕｍａ６０属）本発明の第二の態様のポリペプチドの別の実施形態では、ポリペプチドは、１３０Ａ、１３１Ｍ、１７９Ｆ、２１０Ｑ、２６０Ｑ、および２７４Ｔを含む。（Ｋｕｍａ７０属）本発明の第二の態様のポリペプチドのさらなる実施形態では、ポリペプチドは、２６７からなる群より選択される１つまたは複数のアミノ酸位置で配列番号７１からのアミノ酸変化を含む。一実施形態では、アミノ酸変化は２６７Ｖである。

【0036】

本発明の任意の態様のポリペプチドのさらなる実施形態では、ポリペプチドは、ポリペプチドの単離を容易にするため、そのＣ末端にヒスチジンタグをさらに含む。任意の適切なヒスチジンタグを使用でき、一実施形態では、精製後にＴＥＶプロテアーゼによりタグを効率的に除去できるように、タグはＴＥＶプロテアーゼ切断部位（ＥＮＬＹＦＱＳ）（配列番号１４９）に連結されており、例えば、タグはアミノ酸配列ＧＳＴＥＮＬＹＦＱＳＧＡＬＥＨＨＨＨＨＨ（配列番号１３９）を含むか、これよりなり得る。別の実施形態では、ヒスチジンタグは、Ｈｉｓタグの除去を一層容易にする、切断可能なヒスチジンタグである。一実施形態では、切断可能なヒスチジンタグは、アミノ酸配列Ｘ_ＮＰＱ（Ｌ／Ｑ）ＰＸ_ＮＨＨＨＨＨＨ（配列番号１３１）を含み、配列中、Ｘ_Ｎは１～２５アミノ酸残基のリンカーである。１つの非限定的な例では、切断可能なヒスチジンタグは、アミノ酸配列ＧＳＳＧＳＳＧＳＱＰＱＬＰＹＧＳＳＧＳＳＧＳＨＨＨＨＨＨ（配列番号１３２）を含む。

【0037】

本発明のポリペプチドの任意の態様の一実施形態では、配列番号１または配列番号７１と比較したアミノ酸置換は、表１または２に記載される置換の１つまたは複数を含み得る。これらの位置での置換は、一般に十分に許容され（すなわち一般に、活性に対してわずかな影響を及ぼす～全く影響を及ぼさない）、かつ場合によっては本発明のポリペプチドの活性を最大２０％増大させることがわかっている。

【0038】

【表1】

【0039】

本発明のポリペプチドの任意の態様の別の実施形態では、配列番号１または配列番号７１と比較したアミノ酸置換は、表２に記載される置換の１つまたは複数を含み得る。

【0040】

【表2】

【0041】

本発明のポリペプチドの任意の態様の別の実施形態では、本発明のポリペプチドの各残基におけるアミノ酸は、表３に記載されるようなものであってよく、表３はコンピュータによる変異解析によって予測されるポリペプチド酵素中の各位置で可能な変異をすべて列挙する。のちの実施例に記載するように、縮重プライマーを用いて活性部位（残基２６１～２６４、２６６～２６７、２７０、３１７～３２０、３５０～３５４、３６８、３９７、４０３～４０４、４４６、４４８、４５６、および４６３～４６８）に存在する各位置での変異を試験して、種々のアミノ酸置換が活性に及ぼす影響を検討した。表３に示すように、活性に干渉しなかった変異を本発明のポリペプチドに組み込むことができる。

【0042】

【表3】

【0043】

さらなる実施形態では、本発明のポリペプチドは、下に示す配列番号２～４２、配列番号４４～６０および７２～１１２、ならびに配列番号１１４～１３０および１５０～１５５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むか、これよりなる。これらのポリペプチドは、のちの実施例に示すように、Ｋｕｍａ０１０と比較して活性が増大しているか、それらのポリペプチドの産生を向上させる。一実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２～４２、配列番号５５～６０および７２－１１２、ならびに配列番号１２５～１３０および１５０～１５５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むか、これよりなり、これらのポリペプチドは全て、Ｋｕｍａ０１０よりも向上した活性を示す。

【0044】

Ｎ末端ドメインを太字のフォントで表し、Ｋｕｍａ０１１に対する変化をポリペプチド名の隣に記載する。いずれの場合も、下に記載するポリペプチドは、Ｃ末端にヒスチジンタグをさらに含み得る。任意の適切なヒスチジンタグを使用でき、一実施形態では、精製後にＴＥＶプロテアーゼによりタグを効率的に除去できるように、タグはＴＥＶプロテアーゼ切断部位（ＥＮＬＹＦＱＳ）（配列番号１４９）に連結され、例えば、タグはアミノ酸配列ＧＳＴＥＮＬＹＦＱＳＧＡＬＥＨＨＨＨＨＨ（配列番号１３９）を含むか、これよりなり得る。別の実施形態では、アミノ酸配列Ｘ_ＮＰＱ（Ｌ／Ｑ）ＰＸ_ＮＨＨＨＨＨＨ（配列番号１３１）を含み、配列中、Ｘ_Ｎが１～２５アミノ酸残基のリンカーである、切断可能なヒスチジンタグをＣ末端に組み込み得る。１つの非限定的な例では、切断可能なヒスチジンタグは、アミノ酸配列ＧＳＳＧＳＳＧＳＱＰＱＬＰＹＧＳＳＧＳＳＧＳＨＨＨＨＨＨ（配列番号１３２）を含み得る。

【0045】

Ｋｕｍａ０１１－Ｋ２６２Ｅ
ＭＳＤＭＥＫＰＷＫＥＧＥＥＡＲＡＶＬＱＧＨＡＲＡＱＡＰＱＡＶＤＫＧＰＶＡＧＤＥＲＭＡＶＴＶＶＬＲＲＱＲＡＧＥＬＡＡＨＶＥＲＱＡＡＩＡＰＨＡＲＥＨＬＫＲＥＡＦＡＡＳＨＧＡＳＬＤＤＦＡＥＬＲＲＦＡＤＡＨＧＬＡＬＤＲＡＮＶＡＡＧＴＡＶＬＳＧＰＤＤＡＩＮＲＡＦＧＶＥＬＲＨＦＤＨＰＤＧＳＹＲＳＹＬＧＥＶＴＶＰＡＳＩＡＰＭＩＥＡＶＬＧＬＤＴＲＰＶＡＲＰＨＦＲＭＱＲＲＡＥＧＧＦＥＡＲＳＱＡ
ＡＡＰＴＡＹＴＰＬＤＶＡＱＡＹＱＦＰＥＧＬＤＧＱＧＱＣＩＡＩＩＥＬＧＧＧＹＤＥＡＳＬＡＱＹＦＡＳＬＧＶＰＡＰＱＶＶＳＶＳＶＤＧＡＳＮＱＰＴＧＤＰＥＧＰＤＧＥＶＥＬＤＩＥＶＡＧＡＬＡＰＧＡＫＦＡＶＹＦＡＰＤＴＴＡＧＦＬＤＡＩＴＴＡＩＨＤＰＴＬＫＰＳＶＶＳＩＳＷＳＧＰＥＤＳＷＴＳＡＡＩＡＡＭＮＲＡＦＬＤＡＡＡＬＧＶＴＶＬＡＡＡＧＤＳＧＳＴＧＧＥＱＤＧＬＹＨＶＨＦＰＡＡＳＰＹＶＬＡＣＧＧＴＲＬＶＡＳＧＧＲＩＡＱＥＴＶＷＮＤＧＰＤＧＧＡＴＧＧＧＶＳＲＩＦＰＬＰＡＷＱＥＨＡＮＶＰＰＳＡＮＰＧＡＳＳＧＲＧＶＰＤＬＡＧＮＡＤＰＡＴＧＹＥＶＶＩＤＧＥＡＴＶＩＧＧＴＳＡＶＡＰＬＦＡＡＬＶＡＲＩＮＱＫＬＧＫＡＶＧＹＬＮＰＴＬＹＱＬＰＡＤＶＦＨＤＩＴＥＧＮＮＤＩＡＮＲＡＱＩＹＱＡＧＰＧＷＤＰＣＴＧＬＧＳＰＩＧＶＲＬＬＱＡＬＬＰＳＡＳＱＰＱＰ（配列番号２（非プロセス型）、配列番号７２（プロセス型））

【0046】

Ｋｕｍａ０１１－Ｖ２６８Ａ
ＭＳＤＭＥＫＰＷＫＥＧＥＥＡＲＡＶＬＱＧＨＡＲＡＱＡＰＱＡＶＤＫＧＰＶＡＧＤＥＲＭＡＶＴＶＶＬＲＲＱＲＡＧＥＬＡＡＨＶＥＲＱＡＡＩＡＰＨＡＲＥＨＬＫＲＥＡＦＡＡＳＨＧＡＳＬＤＤＦＡＥＬＲＲＦＡＤＡＨＧＬＡＬＤＲＡＮＶＡＡＧＴＡＶＬＳＧＰＤＤＡＩＮＲＡＦＧＶＥＬＲＨＦＤＨＰＤＧＳＹＲＳＹＬＧＥＶＴＶＰＡＳＩＡＰＭＩＥＡＶＬＧＬＤＴＲＰＶＡＲＰＨＦＲＭＱＲＲＡＥＧＧＦＥＡＲＳＱＡ
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【0047】

Ｋｕｍａ０１１－Ｖ２６８Ｓ
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【0048】

Ｋｕｍａ０１１－Ｖ２６８Ｔ
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【0049】

Ｋｕｍａ０１１－Ｅ２６９Ｌ
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【0050】

Ｋｕｍａ０１１－Ｅ２６９Ｔ
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【0051】

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【0052】

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【0054】

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【0059】

Ｋｕｍａ０１１－Ｓ３５４Ｙ
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【0060】

Ｋｕｍａ０１１－Ｇ３５８Ｎ
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【0061】

Ｋｕｍａ０１１－Ｇ３５８Ｓ
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【0062】

Ｋｕｍａ０１１－Ｇ３５８Ｑ
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【0063】

Ｋｕｍａ０１１－Ｇ３５８Ｔ
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【0065】

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【0072】

Ｋｕｍａ０１１－Ａ４４９Ｑ
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【0073】

Ｋｕｍａ０１１－Ｉ４５６Ｖ
ＭＳＤＭＥＫＰＷＫＥＧＥＥＡＲＡＶＬＱＧＨＡＲＡＱＡＰＱＡＶＤＫＧＰＶＡＧＤＥＲＭＡＶＴＶＶＬＲＲＱＲＡＧＥＬＡＡＨＶＥＲＱＡＡＩＡＰＨＡＲＥＨＬＫＲＥＡＦＡＡＳＨＧＡＳＬＤＤＦＡＥＬＲＲＦＡＤＡＨＧＬＡＬＤＲＡＮＶＡＡＧＴＡＶＬＳＧＰＤＤＡＩＮＲＡＦＧＶＥＬＲＨＦＤＨＰＤＧＳＹＲＳＹＬＧＥＶＴＶＰＡＳＩＡＰＭＩＥＡＶＬＧＬＤＴＲＰＶＡＲＰＨＦＲＭＱＲＲＡＥＧＧＦＥＡＲＳＱＡ
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【0074】

Ｋｕｍａ０１１－Ｔ４６１Ｒ
ＭＳＤＭＥＫＰＷＫＥＧＥＥＡＲＡＶＬＱＧＨＡＲＡＱＡＰＱＡＶＤＫＧＰＶＡＧＤＥＲＭＡＶＴＶＶＬＲＲＱＲＡＧＥＬＡＡＨＶＥＲＱＡＡＩＡＰＨＡＲＥＨＬＫＲＥＡＦＡＡＳＨＧＡＳＬＤＤＦＡＥＬＲＲＦＡＤＡＨＧＬＡＬＤＲＡＮＶＡＡＧＴＡＶＬＳＧＰＤＤＡＩＮＲＡＦＧＶＥＬＲＨＦＤＨＰＤＧＳＹＲＳＹＬＧＥＶＴＶＰＡＳＩＡＰＭＩＥＡＶＬＧＬＤＴＲＰＶＡＲＰＨＦＲＭＱＲＲＡＥＧＧＦＥＡＲＳＱＡ
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【0075】

Ｋｕｍａ０１１－Ｉ４６３Ａ
ＭＳＤＭＥＫＰＷＫＥＧＥＥＡＲＡＶＬＱＧＨＡＲＡＱＡＰＱＡＶＤＫＧＰＶＡＧＤＥＲＭＡＶＴＶＶＬＲＲＱＲＡＧＥＬＡＡＨＶＥＲＱＡＡＩＡＰＨＡＲＥＨＬＫＲＥＡＦＡＡＳＨＧＡＳＬＤＤＦＡＥＬＲＲＦＡＤＡＨＧＬＡＬＤＲＡＮＶＡＡＧＴＡＶＬＳＧＰＤＤＡＩＮＲＡＦＧＶＥＬＲＨＦＤＨＰＤＧＳＹＲＳＹＬＧＥＶＴＶＰＡＳＩＡＰＭＩＥＡＶＬＧＬＤＴＲＰＶＡＲＰＨＦＲＭＱＲＲＡＥＧＧＦＥＡＲＳＱＡ
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【0076】

Ｋｕｍａ０１１－Ｉ４６３Ｌ
ＭＳＤＭＥＫＰＷＫＥＧＥＥＡＲＡＶＬＱＧＨＡＲＡＱＡＰＱＡＶＤＫＧＰＶＡＧＤＥＲＭＡＶＴＶＶＬＲＲＱＲＡＧＥＬＡＡＨＶＥＲＱＡＡＩＡＰＨＡＲＥＨＬＫＲＥＡＦＡＡＳＨＧＡＳＬＤＤＦＡＥＬＲＲＦＡＤＡＨＧＬＡＬＤＲＡＮＶＡＡＧＴＡＶＬＳＧＰＤＤＡＩＮＲＡＦＧＶＥＬＲＨＦＤＨＰＤＧＳＹＲＳＹＬＧＥＶＴＶＰＡＳＩＡＰＭＩＥＡＶＬＧＬＤＴＲＰＶＡＲＰＨＦＲＭＱＲＲＡＥＧＧＦＥＡＲＳＱＡ
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【0077】

Ｋｕｍａ０１１－Ｉ４６３Ｍ
ＭＳＤＭＥＫＰＷＫＥＧＥＥＡＲＡＶＬＱＧＨＡＲＡＱＡＰＱＡＶＤＫＧＰＶＡＧＤＥＲＭＡＶＴＶＶＬＲＲＱＲＡＧＥＬＡＡＨＶＥＲＱＡＡＩＡＰＨＡＲＥＨＬＫＲＥＡＦＡＡＳＨＧＡＳＬＤＤＦＡＥＬＲＲＦＡＤＡＨＧＬＡＬＤＲＡＮＶＡＡＧＴＡＶＬＳＧＰＤＤＡＩＮＲＡＦＧＶＥＬＲＨＦＤＨＰＤＧＳＹＲＳＹＬＧＥＶＴＶＰＡＳＩＡＰＭＩＥＡＶＬＧＬＤＴＲＰＶＡＲＰＨＦＲＭＱＲＲＡＥＧＧＦＥＡＲＳＱＡ
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【0078】

Ｋｕｍａ０１１－Ｉ４６３Ｑ
ＭＳＤＭＥＫＰＷＫＥＧＥＥＡＲＡＶＬＱＧＨＡＲＡＱＡＰＱＡＶＤＫＧＰＶＡＧＤＥＲＭＡＶＴＶＶＬＲＲＱＲＡＧＥＬＡＡＨＶＥＲＱＡＡＩＡＰＨＡＲＥＨＬＫＲＥＡＦＡＡＳＨＧＡＳＬＤＤＦＡＥＬＲＲＦＡＤＡＨＧＬＡＬＤＲＡＮＶＡＡＧＴＡＶＬＳＧＰＤＤＡＩＮＲＡＦＧＶＥＬＲＨＦＤＨＰＤＧＳＹＲＳＹＬＧＥＶＴＶＰＡＳＩＡＰＭＩＥＡＶＬＧＬＤＴＲＰＶＡＲＰＨＦＲＭＱＲＲＡＥＧＧＦＥＡＲＳＱＡ
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【0079】

Ｋｕｍａ０１１－Ｉ４６３Ｒ
ＭＳＤＭＥＫＰＷＫＥＧＥＥＡＲＡＶＬＱＧＨＡＲＡＱＡＰＱＡＶＤＫＧＰＶＡＧＤＥＲＭＡＶＴＶＶＬＲＲＱＲＡＧＥＬＡＡＨＶＥＲＱＡＡＩＡＰＨＡＲＥＨＬＫＲＥＡＦＡＡＳＨＧＡＳＬＤＤＦＡＥＬＲＲＦＡＤＡＨＧＬＡＬＤＲＡＮＶＡＡＧＴＡＶＬＳＧＰＤＤＡＩＮＲＡＦＧＶＥＬＲＨＦＤＨＰＤＧＳＹＲＳＹＬＧＥＶＴＶＰＡＳＩＡＰＭＩＥＡＶＬＧＬＤＴＲＰＶＡＲＰＨＦＲＭＱＲＲＡＥＧＧＦＥＡＲＳＱＡ
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【0080】

Ｋｕｍａ０１１－Ｉ４６３Ｔ
ＭＳＤＭＥＫＰＷＫＥＧＥＥＡＲＡＶＬＱＧＨＡＲＡＱＡＰＱＡＶＤＫＧＰＶＡＧＤＥＲＭＡＶＴＶＶＬＲＲＱＲＡＧＥＬＡＡＨＶＥＲＱＡＡＩＡＰＨＡＲＥＨＬＫＲＥＡＦＡＡＳＨＧＡＳＬＤＤＦＡＥＬＲＲＦＡＤＡＨＧＬＡＬＤＲＡＮＶＡＡＧＴＡＶＬＳＧＰＤＤＡＩＮＲＡＦＧＶＥＬＲＨＦＤＨＰＤＧＳＹＲＳＹＬＧＥＶＴＶＰＡＳＩＡＰＭＩＥＡＶＬＧＬＤＴＲＰＶＡＲＰＨＦＲＭＱＲＲＡＥＧＧＦＥＡＲＳＱＡ
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【0081】

Ｋｕｍａ０１１－Ｉ４６３Ｖ
ＭＳＤＭＥＫＰＷＫＥＧＥＥＡＲＡＶＬＱＧＨＡＲＡＱＡＰＱＡＶＤＫＧＰＶＡＧＤＥＲＭＡＶＴＶＶＬＲＲＱＲＡＧＥＬＡＡＨＶＥＲＱＡＡＩＡＰＨＡＲＥＨＬＫＲＥＡＦＡＡＳＨＧＡＳＬＤＤＦＡＥＬＲＲＦＡＤＡＨＧＬＡＬＤＲＡＮＶＡＡＧＴＡＶＬＳＧＰＤＤＡＩＮＲＡＦＧＶＥＬＲＨＦＤＨＰＤＧＳＹＲＳＹＬＧＥＶＴＶＰＡＳＩＡＰＭＩＥＡＶＬＧＬＤＴＲＰＶＡＲＰＨＦＲＭＱＲＲＡＥＧＧＦＥＡＲＳＱＡ
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【0082】

Ｋｕｍａ０２３：Ｇ３６８Ｓ；Ｉ４６３Ｔ
ＭＳＤＭＥＫＰＷＫＥＧＥＥＡＲＡＶＬＱＧＨＡＲＡＱＡＰＱＡＶＤＫＧＰＶＡＧＤＥＲＭＡＶＴＶＶＬＲＲＱＲＡＧＥＬＡＡＨＶＥＲＱＡＡＩＡＰＨＡＲＥＨＬＫＲＥＡＦＡＡＳＨＧＡＳＬＤＤＦＡＥＬＲＲＦＡＤＡＨＧＬＡＬＤＲＡＮＶＡＡＧＴＡＶＬＳＧＰＤＤＡＩＮＲＡＦＧＶＥＬＲＨＦＤＨＰＤＧＳＹＲＳＹＬＧＥＶＴＶＰＡＳＩＡＰＭＩＥＡＶＬＧＬＤＴＲＰＶＡＲＰＨＦＲＭＱＲＲＡＥＧＧＦＥＡＲＳＱＡ
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【0083】

実施例で参照されるＫｕｍａ０２０は、以下のＣ末端ヒスチジンタグ：ＧＳＴＥＮＬＹＦＱＳＧＡＬＥＨＨＨＨＨＨ（配列番号１３９）を含むＫｕｍａ０２３ポリペプチドである。

【0084】

Ｋｕｍａ０２１：Ｇ３６８Ｓ；Ｄ３９９Ｑ；Ａ４４９Ｑ；Ｉ４６３Ｔ
ＭＳＤＭＥＫＰＷＫＥＧＥＥＡＲＡＶＬＱＧＨＡＲＡＱＡＰＱＡＶＤＫＧＰＶＡＧＤＥＲＭＡＶＴＶＶＬＲＲＱＲＡＧＥＬＡＡＨＶＥＲＱＡＡＩＡＰＨＡＲＥＨＬＫＲＥＡＦＡＡＳＨＧＡＳＬＤＤＦＡＥＬＲＲＦＡＤＡＨＧＬＡＬＤＲＡＮＶＡＡＧＴＡＶＬＳＧＰＤＤＡＩＮＲＡＦＧＶＥＬＲＨＦＤＨＰＤＧＳＹＲＳＹＬＧＥＶＴＶＰＡＳＩＡＰＭＩＥＡＶＬＧＬＤＴＲＰＶＡＲＰＨＦＲＭＱＲＲＡＥＧＧＦＥＡＲＳＱＡ
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【0085】

Ｋｕｍａ０３１：Ｋ２６２Ｅ；Ｅ２６９Ｔ；Ｓ３５４Ｑ；Ｇ３５８Ｓ；Ｄ３９９Ｑ；Ａ４４９Ｑ；Ｉ４６３Ｔ
ＭＳＤＭＥＫＰＷＫＥＧＥＥＡＲＡＶＬＱＧＨＡＲＡＱＡＰＱＡＶＤＫＧＰＶＡＧＤＥＲＭＡＶＴＶＶＬＲＲＱＲＡＧＥＬＡＡＨＶＥＲＱＡＡＩＡＰＨＡＲＥＨＬＫＲＥＡＦＡＡＳＨＧＡＳＬＤＤＦＡＥＬＲＲＦＡＤＡＨＧＬＡＬＤＲＡＮＶＡＡＧＴＡＶＬＳＧＰＤＤＡＩＮＲＡＦＧＶＥＬＲＨＦＤＨＰＤＧＳＹＲＳＹＬＧＥＶＴＶＰＡＳＩＡＰＭＩＥＡＶＬＧＬＤＴＲＰＶＡＲＰＨＦＲＭＱＲＲＡＥＧＧＦＥＡＲＳＱＡ
ＡＡＰＴＡＹＴＰＬＤＶＡＱＡＹＱＦＰＥＧＬＤＧＱＧＱＣＩＡＩＩＥＬＧＧＧＹＤＥＡＳＬＡＱＹＦＡＳＬＧＶＰＡＰＱＶＶＳＶＳＶＤＧＡＳＮＱＰＴＧＤＰＥＧＰＤＧＥＶＴＬＤＩＥＶＡＧＡＬＡＰＧＡＫＦＡＶＹＦＡＰＤＴＴＡＧＦＬＤＡＩＴＴＡＩＨＤＰＴＬＫＰＳＶＶＳＩＳＷＳＧＰＥＤＳＷＴＳＡＡＩＡＡＭＮＲＡＦＬＤＡＡＡＬＧＶＴＶＬＡＡＡＧＤＱＧＳＴＳＧＥＱＤＧＬＹＨＶＨＦＰＡＡＳＰＹＶＬＡＣＧＧＴＲＬＶＡＳＧＧＲＩＡＱＥＴＶＷＮＱＧＰＤＧＧＡＴＧＧＧＶＳＲＩＦＰＬＰＡＷＱＥＨＡＮＶＰＰＳＡＮＰＧＡＳＳＧＲＧＶＰＤＬＡＧＮＡＤＰＱＴＧＹＥＶＶＩＤＧＥＡＴＶＴＧＧＴＳＡＶＡＰＬＦＡＡＬＶＡＲＩＮＱＫＬＧＫＡＶＧＹＬＮＰＴＬＹＱＬＰＡＤＶＦＨＤＩＴＥＧＮＮＤＩＡＮＲＡＱＩＹＱＡＧＰＧＷＤＰＣＴＧＬＧＳＰＩＧＶＲＬＬＱＡＬＬＰＳＡＳＱＰＱＰ（配列番号４０（非プロセス型）、配列番号１１０（プロセス型））

【0086】

実施例で参照されるＫｕｍａ０３０は、以下のＣ末端ヒスチジンタグ：ＧＳＴＥＮＬＹＦＱＳＧＡＬＥＨＨＨＨＨＨ（配列番号１３９）を含むＫｕｍａ０３１ポリペプチドである。

【0087】

Ｋｕｍａ０４１：Ｓ３１９Ａ；Ｈ３６８Ｆ；Ｄ３９９Ｑ；Ａ４４９Ｑ；Ｉ４６３Ｔ
ＭＳＤＭＥＫＰＷＫＥＧＥＥＡＲＡＶＬＱＧＨＡＲＡＱＡＰＱＡＶＤＫＧＰＶＡＧＤＥＲＭＡＶＴＶＶＬＲＲＱＲＡＧＥＬＡＡＨＶＥＲＱＡＡＩＡＰＨＡＲＥＨＬＫＲＥＡＦＡＡＳＨＧＡＳＬＤＤＦＡＥＬＲＲＦＡＤＡＨＧＬＡＬＤＲＡＮＶＡＡＧＴＡＶＬＳＧＰＤＤＡＩＮＲＡＦＧＶＥＬＲＨＦＤＨＰＤＧＳＹＲＳＹＬＧＥＶＴＶＰＡＳＩＡＰＭＩＥＡＶＬＧＬＤＴＲＰＶＡＲＰＨＦＲＭＱＲＲＡＥＧＧＦＥＡＲＳＱＡ
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【0088】

実施例で参照されるＫｕｍａ０４０は、以下のＣ末端ヒスチジンタグ：ＧＳＴＥＮＬＹＦＱＳＧＡＬＥＨＨＨＨＨＨ（配列番号１３９）を含むＫｕｍａ０４１ポリペプチドである。

【0089】

Ｋｕｍａ０５１：Ｋ２６２Ｅ；Ｅ２６９Ｔ；Ｌ２７０Ｖ；Ｓ３５４Ｑ；Ｇ３５８Ｓ；Ｄ３９９Ｑ；Ａ４４９Ｑ
ＭＳＤＭＥＫＰＷＫＥＧＥＥＡＲＡＶＬＱＧＨＡＲＡＱＡＰＱＡＶＤＫＧＰＶＡＧＤＥＲＭＡＶＴＶＶＬＲＲＱＲＡＧＥＬＡＡＨＶＥＲＱＡＡＩＡＰＨＡＲＥＨＬＫＲＥＡＦＡＡＳＨＧＡＳＬＤＤＦＡＥＬＲＲＦＡＤＡＨＧＬＡＬＤＲＡＮＶＡＡＧＴＡＶＬＳＧＰＤＤＡＩＮＲＡＦＧＶＥＬＲＨＦＤＨＰＤＧＳＹＲＳＹＬＧＥＶＴＶＰＡＳＩＡＰＭＩＥＡＶＬＧＬＤＴＲＰＶＡＲＰＨＦＲＭＱＲＲＡＥＧＧＦＥＡＲＳＱＡ
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【0090】

実施例で参照されるＫｕｍａ０５０は、以下のＣ末端ヒスチジンタグ：ＧＳＴＥＮＬＹＦＱＳＧＡＬＥＨＨＨＨＨＨ（配列番号１３９）を含むＫｕｍａ０５１ポリペプチドである。

【0091】

Ｋｕｍａ０２２：Ｐ１７１Ｒ；Ｈ１７２Ｒ；Ｇ３６８Ｓ；Ｉ４６３Ｔ
ＭＳＤＭＥＫＰＷＫＥＧＥＥＡＲＡＶＬＱＧＨＡＲＡＱＡＰＱＡＶＤＫＧＰＶＡＧＤＥＲＭＡＶＴＶＶＬＲＲＱＲＡＧＥＬＡＡＨＶＥＲＱＡＡＩＡＰＨＡＲＥＨＬＫＲＥＡＦＡＡＳＨＧＡＳＬＤＤＦＡＥＬＲＲＦＡＤＡＨＧＬＡＬＤＲＡＮＶＡＡＧＴＡＶＬＳＧＰＤＤＡＩＮＲＡＦＧＶＥＬＲＨＦＤＨＰＤＧＳＹＲＳＹＬＧＥＶＴＶＰＡＳＩＡＰＭＩＥＡＶＬＧＬＤＴＲＰＶＡＲＲＲＦＲＭＱＲＲＡＥＧＧＦＥＡＲＳＱＡ
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【0092】

Ｋｕｍａ０３２：Ｐ１７１Ｒ；Ｈ１７２Ｒ；Ｋ２６２Ｅ；Ｅ２６９Ｔ；Ｓ３５４Ｑ；Ｇ３５８Ｓ；Ｄ３９９Ｑ；Ａ４４９Ｑ；Ｉ４６３Ｔ
ＭＳＤＭＥＫＰＷＫＥＧＥＥＡＲＡＶＬＱＧＨＡＲＡＱＡＰＱＡＶＤＫＧＰＶＡＧＤＥＲＭＡＶＴＶＶＬＲＲＱＲＡＧＥＬＡＡＨＶＥＲＱＡＡＩＡＰＨＡＲＥＨＬＫＲＥＡＦＡＡＳＨＧＡＳＬＤＤＦＡＥＬＲＲＦＡＤＡＨＧＬＡＬＤＲＡＮＶＡＡＧＴＡＶＬＳＧＰＤＤＡＩＮＲＡＦＧＶＥＬＲＨＦＤＨＰＤＧＳＹＲＳＹＬＧＥＶＴＶＰＡＳＩＡＰＭＩＥＡＶＬＧＬＤＴＲＰＶＡＲＲＲＦＲＭＱＲＲＡＥＧＧＦＥＡＲＳＱＡ
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【0093】

Ｋｕｍａ０４２：Ｐ１７１Ｒ；Ｈ１７２Ｒ；Ｓ３１９Ａ；Ｈ３６８Ｆ；Ｄ３９９Ｑ；Ａ４４９Ｑ；Ｉ４６３Ｔ
ＭＳＤＭＥＫＰＷＫＥＧＥＥＡＲＡＶＬＱＧＨＡＲＡＱＡＰＱＡＶＤＫＧＰＶＡＧＤＥＲＭＡＶＴＶＶＬＲＲＱＲＡＧＥＬＡＡＨＶＥＲＱＡＡＩＡＰＨＡＲＥＨＬＫＲＥＡＦＡＡＳＨＧＡＳＬＤＤＦＡＥＬＲＲＦＡＤＡＨＧＬＡＬＤＲＡＮＶＡＡＧＴＡＶＬＳＧＰＤＤＡＩＮＲＡＦＧＶＥＬＲＨＦＤＨＰＤＧＳＹＲＳＹＬＧＥＶＴＶＰＡＳＩＡＰＭＩＥＡＶＬＧＬＤＴＲＰＶＡＲＲＲＦＲＭＱＲＲＡＥＧＧＦＥＡＲＳＱＡ
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【0094】

Ｋｕｍａ０５２：Ｐ１７１Ｒ；Ｈ１７２Ｒ；Ｋ２６２Ｅ；Ｅ２６９Ｔ；Ｌ２７０Ｖ；Ｓ３５４Ｑ；Ｇ３５８Ｓ；Ｄ３９９Ｑ；Ａ４４９Ｑ
ＭＳＤＭＥＫＰＷＫＥＧＥＥＡＲＡＶＬＱＧＨＡＲＡＱＡＰＱＡＶＤＫＧＰＶＡＧＤＥＲＭＡＶＴＶＶＬＲＲＱＲＡＧＥＬＡＡＨＶＥＲＱＡＡＩＡＰＨＡＲＥＨＬＫＲＥＡＦＡＡＳＨＧＡＳＬＤＤＦＡＥＬＲＲＦＡＤＡＨＧＬＡＬＤＲＡＮＶＡＡＧＴＡＶＬＳＧＰＤＤＡＩＮＲＡＦＧＶＥＬＲＨＦＤＨＰＤＧＳＹＲＳＹＬＧＥＶＴＶＰＡＳＩＡＰＭＩＥＡＶＬＧＬＤＴＲＰＶＡＲＲＲＦＲＭＱＲＲＡＥＧＧＦＥＡＲＳＱＡ
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【0095】

Ｋｕｍａ０６１：Ｋ２６２Ｅ；Ｅ２６９Ｔ；Ｓ３５４Ｑ；Ｇ３５８Ｓ；Ｄ３９９Ｑ；Ａ４４９Ｑ；Ｉ４６３Ｔ
ＭＳＤＭＥＫＰＷＫＥＧＥＥＡＲＡＶＬＱＧＨＡＲＡＱＡＰＱＡＶＤＫＧＰＶＡＧＤＥＲＭＡＶＴＶＶＬＲＲＱＲＡＧＥＬＡＡＨＶＥＲＱＡＡＩＡＰＨＡＲＥＨＬＫＲＥＡＦＡＡＳＨＧＡＳＬＤＤＦＡＥＬＲＲＦＡＤＡＨＧＬＡＬＤＲＡＮＶＡＡＧＴＡＶＬＳＧＰＤＤＡＩＮＲＡＦＧＶＥＬＲＨＦＤＨＰＤＧＳＹＲＳＹＬＧＥＶＴＶＰＡＳＩＡＰＭＩＥＡＶＬＧＬＤＴＲＰＶＡＲＰＨＦＲＭＱＲＲＡＥＧＧＦＥＡＲＳＱＡ
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【0096】

実施例で参照されるＫｕｍａ０６０は、以下のＣ末端ヒスチジンタグ：ＧＳＴＥＮＬＹＦＱＳＧＡＬＥＨＨＨＨＨＨ（配列番号１３９）を含むＫｕｍａ０６１ポリペプチドである。

【0097】

Ｋｕｍａ０６２：Ｐ１７１Ｒ；Ｈ１７２Ｒ；Ｋ２６２Ｅ；Ｅ２６９Ｔ；Ｓ３５４Ｑ；Ｇ３５８Ｓ；Ｄ３９９Ｑ；Ａ４４９Ｑ；Ｉ４６３Ｔ
ＭＳＤＭＥＫＰＷＫＥＧＥＥＡＲＡＶＬＱＧＨＡＲＡＱＡＰＱＡＶＤＫＧＰＶＡＧＤＥＲＭＡＶＴＶＶＬＲＲＱＲＡＧＥＬＡＡＨＶＥＲＱＡＡＩＡＰＨＡＲＥＨＬＫＲＥＡＦＡＡＳＨＧＡＳＬＤＤＦＡＥＬＲＲＦＡＤＡＨＧＬＡＬＤＲＡＮＶＡＡＧＴＡＶＬＳＧＰＤＤＡＩＮＲＡＦＧＶＥＬＲＨＦＤＨＰＤＧＳＹＲＳＹＬＧＥＶＴＶＰＡＳＩＡＰＭＩＥＡＶＬＧＬＤＴＲＰＶＡＲＲＲＦＲＭＱＲＲＡＥＧＧＦＥＡＲＳＱＡ
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【0098】

Ｋｕｍａ０７１：Ｓ３１９Ａ；Ｈ３６８Ｆ；Ｄ３９９Ｑ；Ａ４４９Ｑ；Ｉ４６３Ｔ
ＭＳＤＭＥＫＰＷＫＥＧＥＥＡＲＡＶＬＱＧＨＡＲＡＱＡＰＱＡＶＤＫＧＰＶＡＧＤＥＲＭＡＶＴＶＶＬＲＲＱＲＡＧＥＬＡＡＨＶＥＲＱＡＡＩＡＰＨＡＲＥＨＬＫＲＥＡＦＡＡＳＨＧＡＳＬＤＤＦＡＥＬＲＲＦＡＤＡＨＧＬＡＬＤＲＡＮＶＡＡＧＴＡＶＬＳＧＰＤＤＡＩＮＲＡＦＧＶＥＬＲＨＦＤＨＰＤＧＳＹＲＳＹＬＧＥＶＴＶＰＡＳＩＡＰＭＩＥＡＶＬＧＬＤＴＲＰＶＡＲＰＨＦＲＭＱＲＲＡＥＧＧＦＥＡＲＳＱＡ
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【0099】

実施例で参照されるＫｕｍａ０７０は、以下のＣ末端ヒスチジンタグ：ＧＳＴＥＮＬＹＦＱＳＧＡＬＥＨＨＨＨＨＨ（配列番号１３９）を含むＫｕｍａ０７１ポリペプチドである。

【0100】

Ｋｕｍａ０７２：Ｐ１７１Ｒ；Ｈ１７２Ｒ；Ｓ３１９Ａ；Ｈ３６８Ｆ；Ｄ３９９Ｑ；Ａ４４９Ｑ；Ｉ４６３Ｔ
ＭＳＤＭＥＫＰＷＫＥＧＥＥＡＲＡＶＬＱＧＨＡＲＡＱＡＰＱＡＶＤＫＧＰＶＡＧＤＥＲＭＡＶＴＶＶＬＲＲＱＲＡＧＥＬＡＡＨＶＥＲＱＡＡＩＡＰＨＡＲＥＨＬＫＲＥＡＦＡＡＳＨＧＡＳＬＤＤＦＡＥＬＲＲＦＡＤＡＨＧＬＡＬＤＲＡＮＶＡＡＧＴＡＶＬＳＧＰＤＤＡＩＮＲＡＦＧＶＥＬＲＨＦＤＨＰＤＧＳＹＲＳＹＬＧＥＶＴＶＰＡＳＩＡＰＭＩＥＡＶＬＧＬＤＴＲＰＶＡＲＲＲＦＲＭＱＲＲＡＥＧＧＦＥＡＲＳＱＡ
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【0101】

表４に記載されるように、Ｋｕｍａ０１０／０１１に施した変化は、設計タンパク質の触媒活性に大きな影響を及ぼす。表４に、種々のグリアジンペプチド配列の分解の触媒に及ぼす個々の変異の効果を列挙する。実施例では、特定の個々の変異体および変異体の組合せに関してさらなるデータを提供する。

【0102】

【表4】

【0103】

産生を向上させる変異
産生を向上させる変異によって、以下の３つのカテゴリーの１つが向上し得る：１．精製法を変える；２．収率が増大する；３．精製時に酵素的自己プロセシングが起こる確率を低下させ、それにより解析を簡略化する。本明細書に開示されるポリペプチドのタンパク質分解活性によって除去可能なＨｉｓタグの付加は、カテゴリー１に分類され；Ｒ１０５Ｈ変異体は収率を約２倍向上させると思われるため、カテゴリー２に分類され；位置１７１～１７４における変異について、それらの変異体はカテゴリー３に分類される。

【0104】

Ｋｕｍａ０１０－切断可能なＨｉｓタグを有するＫｕｍａ０１０
ＭＳＤＭＥＫＰＷＫＥＧＥＥＡＲＡＶＬＱＧＨＡＲＡＱＡＰＱＡＶＤＫＧＰＶＡＧＤＥＲＭＡＶＴＶＶＬＲＲＱＲＡＧＥＬＡＡＨＶＥＲＱＡＡＩＡＰＨＡＲＥＨＬＫＲＥＡＦＡＡＳＨＧＡＳＬＤＤＦＡＥＬＲＲＦＡＤＡＨＧＬＡＬＤＲＡＮＶＡＡＧＴＡＶＬＳＧＰＤＤＡＩＮＲＡＦＧＶＥＬＲＨＦＤＨＰＤＧＳＹＲＳＹＬＧＥＶＴＶＰＡＳＩＡＰＭＩＥＡＶＬＧＬＤＴＲＰＶＡＲＰＨＦＲＭＱＲＲＡＥＧＧＦＥＡＲＳＱＡ
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【0105】

Ｋｕｍａ０１１－Ｒ１０５Ｈ
ＭＳＤＭＥＫＰＷＫＥＧＥＥＡＲＡＶＬＱＧＨＡＲＡＱＡＰＱＡＶＤＫＧＰＶＡＧＤＥＲＭＡＶＴＶＶＬＲＲＱＲＡＧＥＬＡＡＨＶＥＲＱＡＡＩＡＰＨＡＲＥＨＬＫＲＥＡＦＡＡＳＨＧＡＳＬＤＤＦＡＥＬＲＲＦＡＤＡＨＧＬＡＬＤＲＡＮＶＡＡＧＴＡＶＬＳＧＰＤＤＡＩＮＲＡＦＧＶＥＬＲＨＦＤＨＰＤＧＳＹＲＳＹＬＧＥＶＴＶＰＡＳＩＡＰＭＩＥＡＶＬＧＬＤＴＲＰＶＡＲＰＨＦＲＭＱＲＲＡＥＧＧＦＥＡＲＳＱＡ
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【0106】

Ｋｕｍａ０１１－Ｐ１７１Ａ
ＭＳＤＭＥＫＰＷＫＥＧＥＥＡＲＡＶＬＱＧＨＡＲＡＱＡＰＱＡＶＤＫＧＰＶＡＧＤＥＲＭＡＶＴＶＶＬＲＲＱＲＡＧＥＬＡＡＨＶＥＲＱＡＡＩＡＰＨＡＲＥＨＬＫＲＥＡＦＡＡＳＨＧＡＳＬＤＤＦＡＥＬＲＲＦＡＤＡＨＧＬＡＬＤＲＡＮＶＡＡＧＴＡＶＬＳＧＰＤＤＡＩＮＲＡＦＧＶＥＬＲＨＦＤＨＰＤＧＳＹＲＳＹＬＧＥＶＴＶＰＡＳＩＡＰＭＩＥＡＶＬＧＬＤＴＲＰＶＡＲＡＨＦＲＭＱＲＲＡＥＧＧＦＥＡＲＳＱＡ
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【0107】

Ｋｕｍａ０１１－Ｐ１７１Ｒ
ＭＳＤＭＥＫＰＷＫＥＧＥＥＡＲＡＶＬＱＧＨＡＲＡＱＡＰＱＡＶＤＫＧＰＶＡＧＤＥＲＭＡＶＴＶＶＬＲＲＱＲＡＧＥＬＡＡＨＶＥＲＱＡＡＩＡＰＨＡＲＥＨＬＫＲＥＡＦＡＡＳＨＧＡＳＬＤＤＦＡＥＬＲＲＦＡＤＡＨＧＬＡＬＤＲＡＮＶＡＡＧＴＡＶＬＳＧＰＤＤＡＩＮＲＡＦＧＶＥＬＲＨＦＤＨＰＤＧＳＹＲＳＹＬＧＥＶＴＶＰＡＳＩＡＰＭＩＥＡＶＬＧＬＤＴＲＰＶＡＲＲＨＦＲＭＱＲＲＡＥＧＧＦＥＡＲＳＱＡ
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【0108】

Ｋｕｍａ０１１－Ｐ１７１Ｓ
ＭＳＤＭＥＫＰＷＫＥＧＥＥＡＲＡＶＬＱＧＨＡＲＡＱＡＰＱＡＶＤＫＧＰＶＡＧＤＥＲＭＡＶＴＶＶＬＲＲＱＲＡＧＥＬＡＡＨＶＥＲＱＡＡＩＡＰＨＡＲＥＨＬＫＲＥＡＦＡＡＳＨＧＡＳＬＤＤＦＡＥＬＲＲＦＡＤＡＨＧＬＡＬＤＲＡＮＶＡＡＧＴＡＶＬＳＧＰＤＤＡＩＮＲＡＦＧＶＥＬＲＨＦＤＨＰＤＧＳＹＲＳＹＬＧＥＶＴＶＰＡＳＩＡＰＭＩＥＡＶＬＧＬＤＴＲＰＶＡＲＳＨＦＲＭＱＲＲＡＥＧＧＦＥＡＲＳＱＡ
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【0109】

Ｋｕｍａ０１１－Ｈ１７２Ａ
ＭＳＤＭＥＫＰＷＫＥＧＥＥＡＲＡＶＬＱＧＨＡＲＡＱＡＰＱＡＶＤＫＧＰＶＡＧＤＥＲＭＡＶＴＶＶＬＲＲＱＲＡＧＥＬＡＡＨＶＥＲＱＡＡＩＡＰＨＡＲＥＨＬＫＲＥＡＦＡＡＳＨＧＡＳＬＤＤＦＡＥＬＲＲＦＡＤＡＨＧＬＡＬＤＲＡＮＶＡＡＧＴＡＶＬＳＧＰＤＤＡＩＮＲＡＦＧＶＥＬＲＨＦＤＨＰＤＧＳＹＲＳＹＬＧＥＶＴＶＰＡＳＩＡＰＭＩＥＡＶＬＧＬＤＴＲＰＶＡＲＰＡＦＲＭＱＲＲＡＥＧＧＦＥＡＲＳＱＡ
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【0110】

Ｋｕｍａ０１１－Ｈ１７２Ｒ
ＭＳＤＭＥＫＰＷＫＥＧＥＥＡＲＡＶＬＱＧＨＡＲＡＱＡＰＱＡＶＤＫＧＰＶＡＧＤＥＲＭＡＶＴＶＶＬＲＲＱＲＡＧＥＬＡＡＨＶＥＲＱＡＡＩＡＰＨＡＲＥＨＬＫＲＥＡＦＡＡＳＨＧＡＳＬＤＤＦＡＥＬＲＲＦＡＤＡＨＧＬＡＬＤＲＡＮＶＡＡＧＴＡＶＬＳＧＰＤＤＡＩＮＲＡＦＧＶＥＬＲＨＦＤＨＰＤＧＳＹＲＳＹＬＧＥＶＴＶＰＡＳＩＡＰＭＩＥＡＶＬＧＬＤＴＲＰＶＡＲＰＲＦＲＭＱＲＲＡＥＧＧＦＥＡＲＳＱＡ
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【0111】

Ｋｕｍａ０１１－Ｈ１７２Ｓ
ＭＳＤＭＥＫＰＷＫＥＧＥＥＡＲＡＶＬＱＧＨＡＲＡＱＡＰＱＡＶＤＫＧＰＶＡＧＤＥＲＭＡＶＴＶＶＬＲＲＱＲＡＧＥＬＡＡＨＶＥＲＱＡＡＩＡＰＨＡＲＥＨＬＫＲＥＡＦＡＡＳＨＧＡＳＬＤＤＦＡＥＬＲＲＦＡＤＡＨＧＬＡＬＤＲＡＮＶＡＡＧＴＡＶＬＳＧＰＤＤＡＩＮＲＡＦＧＶＥＬＲＨＦＤＨＰＤＧＳＹＲＳＹＬＧＥＶＴＶＰＡＳＩＡＰＭＩＥＡＶＬＧＬＤＴＲＰＶＡＲＰＳＦＲＭＱＲＲＡＥＧＧＦＥＡＲＳＱＡ
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【0112】

Ｋｕｍａ０１１－Ｆ１７３Ｒ
ＭＳＤＭＥＫＰＷＫＥＧＥＥＡＲＡＶＬＱＧＨＡＲＡＱＡＰＱＡＶＤＫＧＰＶＡＧＤＥＲＭＡＶＴＶＶＬＲＲＱＲＡＧＥＬＡＡＨＶＥＲＱＡＡＩＡＰＨＡＲＥＨＬＫＲＥＡＦＡＡＳＨＧＡＳＬＤＤＦＡＥＬＲＲＦＡＤＡＨＧＬＡＬＤＲＡＮＶＡＡＧＴＡＶＬＳＧＰＤＤＡＩＮＲＡＦＧＶＥＬＲＨＦＤＨＰＤＧＳＹＲＳＹＬＧＥＶＴＶＰＡＳＩＡＰＭＩＥＡＶＬＧＬＤＴＲＰＶＡＲＰＨＲＲＭＱＲＲＡＥＧＧＦＥＡＲＳＱＡ
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【0113】

Ｋｕｍａ０１１－Ｆ１７３Ｓ
ＭＳＤＭＥＫＰＷＫＥＧＥＥＡＲＡＶＬＱＧＨＡＲＡＱＡＰＱＡＶＤＫＧＰＶＡＧＤＥＲＭＡＶＴＶＶＬＲＲＱＲＡＧＥＬＡＡＨＶＥＲＱＡＡＩＡＰＨＡＲＥＨＬＫＲＥＡＦＡＡＳＨＧＡＳＬＤＤＦＡＥＬＲＲＦＡＤＡＨＧＬＡＬＤＲＡＮＶＡＡＧＴＡＶＬＳＧＰＤＤＡＩＮＲＡＦＧＶＥＬＲＨＦＤＨＰＤＧＳＹＲＳＹＬＧＥＶＴＶＰＡＳＩＡＰＭＩＥＡＶＬＧＬＤＴＲＰＶＡＲＰＨＳＲＭＱＲＲＡＥＧＧＦＥＡＲＳＱＡ
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【0114】

Ｋｕｍａ０１１－Ｒ１７４Ｓ
ＭＳＤＭＥＫＰＷＫＥＧＥＥＡＲＡＶＬＱＧＨＡＲＡＱＡＰＱＡＶＤＫＧＰＶＡＧＤＥＲＭＡＶＴＶＶＬＲＲＱＲＡＧＥＬＡＡＨＶＥＲＱＡＡＩＡＰＨＡＲＥＨＬＫＲＥＡＦＡＡＳＨＧＡＳＬＤＤＦＡＥＬＲＲＦＡＤＡＨＧＬＡＬＤＲＡＮＶＡＡＧＴＡＶＬＳＧＰＤＤＡＩＮＲＡＦＧＶＥＬＲＨＦＤＨＰＤＧＳＹＲＳＹＬＧＥＶＴＶＰＡＳＩＡＰＭＩＥＡＶＬＧＬＤＴＲＰＶＡＲＰＨＦＳＭＱＲＲＡＥＧＧＦＥＡＲＳＱＡ
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【0115】

Ｋｕｍａ０１２：Ｐ１７１Ｒ；Ｈ１７２Ｒ
ＭＳＤＭＥＫＰＷＫＥＧＥＥＡＲＡＶＬＱＧＨＡＲＡＱＡＰＱＡＶＤＫＧＰＶＡＧＤＥＲＭＡＶＴＶＶＬＲＲＱＲＡＧＥＬＡＡＨＶＥＲＱＡＡＩＡＰＨＡＲＥＨＬＫＲＥＡＦＡＡＳＨＧＡＳＬＤＤＦＡＥＬＲＲＦＡＤＡＨＧＬＡＬＤＲＡＮＶＡＡＧＴＡＶＬＳＧＰＤＤＡＩＮＲＡＦＧＶＥＬＲＨＦＤＨＰＤＧＳＹＲＳＹＬＧＥＶＴＶＰＡＳＩＡＰＭＩＥＡＶＬＧＬＤＴＲＰＶＡＲＲＲＦＲＭＱＲＲＡＥＧＧＦＥＡＲＳＱＡ
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【0116】

本願全体を通じて使用される「ポリペプチド」という用語は、天然に存在するか合成起源であるかを問わず、一続きのサブユニットアミノ酸を指す最も広い意味で使用される。本発明のポリペプチドは、Ｌ－アミノ酸、Ｄ－アミノ酸（ｉｎ ｖｉｖｏでＬ－アミノ酸特異的プロテアーゼに対する耐性を示す）、またはＤ－アミノ酸とＬ－アミノ酸の組合せを含み得る。本明細書に記載されるポリペプチドは、化学的に合成しても組換えにより発現させてもよい。ポリペプチドをＰＥＧ化、ＨＥＳ化、ＰＡＳ化、またはグリコシル化などによって他の化合物に連結して、ｉｎ ｖｉｖｏでの半減期の増大を促進してもよい。このような結合は、当業者によって理解されるように、共有結合であっても非共有結合であってもよい。ポリペプチドを、特に限定されないが精製または検出に使用できる任意のリンカー（ＦＬＡＧタグまたはＨｉｓタグなど）を含む、他の任意の適切なリンカーに連結してもよい。

【0117】

別の態様では、本発明は、本発明の任意の態様または実施形態のポリペプチドをコードする単離核酸を提供する。単離核酸配列はＲＮＡまたはＤＮＡを含み得る。本明細書で使用される「単離核酸」は、ゲノム中またはｃＤＮＡ配列中のその通常の周辺核酸配列から取り出されたものである。このような単離核酸配列は、コードされるタンパク質の発現および／または精製を促進するのに有用な追加の配列、特に限定されないが、ｐｏｌｙＡ配列、改変Ｋｏｚａｋ配列、ならびにエピトープタグ、排出シグナル、および分泌シグナル、核局在化シグナル、および細胞膜局在化シグナルをコードする配列を含む配列を含み得る。当業者には、本明細書の教示に基づき、いかなる核酸配列が本発明のポリペプチドをコードするのか明らかであろう。

【0118】

さらなる態様では、本発明は、適切な制御配列に作動可能に連結された本発明の任意の実施形態の単離核酸を含む、核酸発現ベクターを提供する。「組換え発現ベクター」は、遺伝子産物の発現を生じさせることができる任意の制御配列に核酸コード領域または遺伝子を作動可能に連結するベクターを含む。本発明の核酸配列に作動可能に連結される「制御配列」は、核酸分子の発現を生じさせることが可能な核酸配列である。制御配列は、核酸配列の発現を指令するよう機能する限り、その核酸配列と隣接している必要はない。したがって、例えば、翻訳はされないが転写される介在配列がプロモーター配列と核酸配列との間に存在してもよく、そのプロモーター配列は依然として、コード配列に「作動可能に連結される」と見なされ得る。他のこのような制御配列としては、特に限定されないが、ポリアデニル化シグナル、終止シグナル、およびリボソーム結合部位が挙げられる。このような発現ベクターは、特に限定されないが、プラスミド系およびウイルス系の発現ベクターを含む、当該技術分野で公知の任意の種類のものであり得る。哺乳動物系で本開示の核酸配列の発現を駆動するのに使用される制御配列は、構成的（特に限定されないが、ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＲＳＶ、アクチン、ＥＦを含む、様々なプロモーターによって駆動される）であっても誘導的（特に限定されないが、テトラサイクリン応答性、エクジソン応答性、ステロイド応答性のプロモーターを含む、多数の誘導プロモーターのいずれかによって駆動される）であってもよい。原核細胞の遺伝子導入に使用するための発現ベクターの構築も当該技術分野で周知であり、したがって、標準的技術によって実施できる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ，ｉｎ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ｐｐ．１０９－１２８，Ｅ．Ｊ．Ｍｕｒｒａｙ編（Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ社、クフィルトン、ニュージャージー州）およびＡｍｂｉｏｎ １９９８ Ｃａｔａｌｏｇ（Ａｍｂｉｏｎ社、オースティン、テキサス州）を参照されたい）。発現ベクターは、エピソームとしてまたは宿主染色体ＤＮＡ内への組込みによってのいずれかで、宿主生物中で複製可能でなければならない。好ましい実施形態では、発現ベクターはプラスミドを含む。ただし、本発明は、同等の機能を果たす他の発現ベクター、例えばウイルスベクターなどを含むと意図される。

【0119】

別の態様では、本発明は、本発明の核酸発現ベクターを含む組換え宿主細胞を提供する。宿主細胞は、原核細胞または真核細胞のいずれかであってよい。細胞は、一過的にまたは安定して遺伝子導入または形質導入され得る。原核細胞および真核細胞中への発現ベクターのこのような遺伝子導入および形質導入は、特に限定されないが、標準的な細菌の形質転換、リン酸カルシウム共沈殿法、電気穿孔法、またはリポソーム、ＤＥＡＥデキストラン、ポリカチオン、もしくはウイルスを介する遺伝子導入を含む、当該技術分野で公知の任意の技術によって実施できる（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，第２版（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ．１９８７．Ｌｉｓｓ社、ニューヨーク、ニューヨーク州を参照されたい）。本発明によるポリペプチドを作製する方法は、本発明の追加的な部分である。この方法は、（ａ）ポリペプチドの発現を促進する環境下で本発明のこの態様による宿主を培養する段階と、（ｂ）任意選択で、発現されたポリペプチドを回収する段階とを含む。発現されたポリペプチドは、無細胞抽出物、細胞ペレットから回収されるか、培地から回収される。組換えにより発現させたポリペプチドを精製する方法は、当業者に周知である。

【0120】

さらなる態様では、本発明は、本発明の任意の態様または実施形態のポリペプチド、核酸、核酸発現ベクター、および／または組換え宿主細胞と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、例えば、のちに記載する本発明の方法において使用できる。医薬組成物は、本発明のポリペプチド、核酸などに加えて、（ａ）リオプロテクタント；（ｂ）界面活性剤；（ｃ）増量剤；（ｄ）浸透圧調整剤；（ｅ）安定剤；（ｆ）保存剤および／または（ｇ）緩衝剤を含み得る。

【0121】

いくつかの実施形態では、医薬組成物中の緩衝剤は、トリス緩衝剤、ヒスチジン緩衝剤、リン酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤または酢酸緩衝剤である。医薬組成物はまた、リオプロテクタント、例えばスクロース、ソルビトールまたはトレハロースを含み得る。ある特定の実施形態では、医薬組成物は保存剤、例えば、塩化ベンザルコニウム、ベンゼトニウム、クロロヘキシジン、フェノール、ｍ－クレゾール、ベンジルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロロブタノール、ｏ－クレゾール、ｐ－クレゾール、クロロクレゾール、硝酸フェニル水銀、チメロサール、安息香酸、およびその様々な混合物を含む。他の実施形態では、医薬組成物はグリシンなどの増量剤を含む。また別の実施形態では、医薬組成物は界面活性剤、例えば、ポリソルベート－２０、ポリソルベート－４０、ポリソルベート－６０、ポリソルベート－６５、ポリソルベート－８０、ポリソルベート－８５、ポロキサマー－１８８、モノラウリン酸ソルビタン、モノパルミチン酸ソルビタン、モノステアリン酸ソルビタン、モノオレイン酸ソルビタン、トリラウリン酸ソルビタン、トリステアリン酸ソルビタン、ソルビタントリオレアステ（ｓｏｒｂｉｔａｎ ｔｒｉｏｌｅａｓｔｅ）、またはその組合せを含む。医薬組成物はまた、浸透圧調整剤、例えば、製剤をヒト血液と実質的に等張または等浸透圧にする化合物を含み得る。例示的な浸透圧調整剤としては、スクロース、ソルビトール、グリシン、メチオニン、マンニトール、デキストロース、イノシトール、塩化ナトリウム、アルギニン、およびアルギニン塩酸塩が挙げられる。他の実施形態では、医薬組成物は安定剤、例えば、目的タンパク質と組み合わせたときに凍結乾燥形態または液体形態の目的タンパク質の化学的および／または物理的不安定性を実質的に防止または軽減する分子をさらに含む。例示的な安定剤としては、スクロース、ソルビトール、グリシン、イノシトール、塩化ナトリウム、メチオニン、アルギニン、およびアルギニン塩酸塩が挙げられる。

【0122】

本発明のポリペプチド、核酸などは、医薬組成物中の唯一の活性薬剤であってよく、あるいは組成物は、意図する用途に適した１つまたは複数の他の活性薬剤をさらに含んでもよい。

【0123】

本明細書に記載される医薬組成物は一般に、本明細書に記載される化合物と、薬学的に許容される担体、希釈剤、または補形剤との組合せを含む。このような組成物は、薬学的に許容されない成分を実質的に含まない、すなわち、薬学的に許容されない成分の含有量が、本願出願時点で米国の規制要件により承認されている量よりも少ない。この態様のいくつかの実施形態では、化合物が水中に溶解または懸濁される場合、組成物は任意選択で、追加の薬学的に許容される担体、希釈剤、または補形剤をさらに含む。他の実施形態では、本明細書に記載される医薬組成物は固体医薬組成物（例えば、錠剤、カプセル剤など）である。

【0124】

本明細書に記載される組成物は、米国規制当局によって記載されるような栄養補助食品として提供することも可能である。

【0125】

上記の組成物は、製薬分野で周知の方法で調製でき、かつ任意の適切な経路によって投与できる。好ましい実施形態では、医薬組成物および製剤は経口投与用に設計される。従来の医薬担体、水性基剤、粉末基剤または油性基剤、増粘剤などが必要な場合や望ましい場合もある。

【0126】

医薬組成物は、特に限定されないが、錠剤、丸剤、散剤、トローチ剤、サシェ剤、カシェ剤、エリキシル剤、懸濁剤、乳剤、液剤、シロップ剤、エアゾール剤（固体としてまたは液体溶媒中の）、例えば最大１０重量％の活性化合物のを含有する軟膏剤、軟ゼラチンカプセル剤、硬ゼラチンカプセル剤、無菌注射用液剤、および無菌包装散剤を含む任意の適切な形態であり得る。

【0127】

別の態様では、本発明は、セリアックスプルーまたは非セリアックグルテン過敏症（ＮＣＧＳ）を治療するための方法であって、セリアックスプルーもしくはＮＣＧＳを有する個体にセリアックスプルーもしくはＮＣＧＳの治療に有効な量の本発明のポリペプチドからなる群より選択される１つもしくは複数のポリペプチドを投与すること、またはセリアックスプルーもしくはＮＣＧＳを有する個体が摂取する加工食品に上記のポリペプチドのうちの１つもしくは複数を使用することを含む、方法を提供する。

【0128】

本発明者らは、本発明のポリペプチドが、「グリアジン」として知られほとんどのセリアックスプルー患者の免疫応答の大部分を担うと考えられている、グルテンのプロリン（Ｐ）とグルタミン（Ｑ）に富む構成成分を分解できることを発見した。本発明のポリペプチドは、ｐＨ４でＰＱＬＰ（配列番号６５）モチーフまたはＰＱＱＰ（配列番号６６）モチーフ（グリアジンを表す基質である、ＰＦＰＱＰＱＬＰＹ（配列番号６７）および／またはＰＦＰＱＰＱＱＰＦ（配列番号６８）など）を有するペプチドの分解において、Ｋｕｍａ０１１およびセリアックスプルーを治療するために有用であると開示される他のポリペプチド（国際公開第２０１５／０２３７２８号）と比較して優れた活性を示す。したがって、本発明のポリペプチドは、セリアックスプルーおよびＮＣＧＳを治療するための大幅に改善された治療薬の構成要素となる。

【0129】

セリアックスプルー（セリアック病またはグルテン不耐症としても知られる）は有病率が極めて高い疾患のひとつであり、コムギ、オオムギ、およびライムギの製品に含まれる「グルテン」として知られる食品タンパク質が、遺伝的素因のある人の小腸で免疫応答を引き起こすものである。生じた炎症によって小腸の絨毛が変性し、栄養吸収が阻害されることがある。幼児期または晩年を問わず症状が現れ、その重症度は下痢から、疲労、体重減少、腹痛、鼓腸、ガス過剰、消化不良、便秘、腹部膨満、嘔気／嘔吐、貧血、易内出血、うつ、不安、小児の成長遅延、脱毛、皮膚炎、無月経、口腔内潰瘍、筋痙攣、関節痛、鼻出血、発作、手足の刺痛または痺れ、思春期遅延、歯のエナメル質異常、および運動失調または異常知覚などの神経症状まで広範囲にわたる。この生涯にわたる疾患には現時点で、食事からグルテンを完全に排除すること以外に効果的な治療法はない。セリアックスプルーは依然として過小診断されることが多いものの、米国およびヨーロッパでのその有病率は人口の０．５～１．０％であると推定される。セリアックスプルーに加えて、非セリアックグルテン過敏症（ＮＣＧＳ）の病態に罹患している者も相当な割合にのぼると考えられており、この病態はグルテンの経口摂取に起因するが、セリアック病とは機構的に異なっており、しかしながらその症状はセリアックスプルーのものと区別できないことが多い。

【0130】

本明細書で使用される「セリアックスプルーまたはＮＣＧＳの治療」は、（ａ）セリアックスプルーまたはＮＣＧＳの重症度を軽減すること；（ｂ）セリアックスプルーまたはＮＣＧＳに特徴的な症状の発現を抑制するまたは予防すること；（ｃ）セリアックスプルーまたはＮＣＧＳに特徴的な症状の悪化を抑制すること；（ｄ）以前にセリアックスプルーまたはＮＣＧＳに罹患したことのある患者において同障害の再発を抑制するまたは予防すること；（ｅ）以前にセリアックスプルーまたはＮＣＧＳの症状が認められた患者において症状の再発を抑制するまたは予防する；および（ｆ）セリアックスプルーまたはＮＣＧＳの発現リスクがあるか、未だセリアックスプルーまたはＮＣＧＳの臨床的影響がみられない対象においてセリアックスプルーまたはＮＣＧＳの発症を抑制する、のうちの１つまたは複数を達成することを意味する。

【0131】

本発明の方法により治療される個体は、ヒト対象を含む、セリアックスプルーまたはＮＣＧＳに罹患している任意の個体であり得る。個体は、既に症状が認められる個体であっても、無症状の個体であってもよい。

【0132】

本明細書で使用される「有効な量」は、セリアックスプルーを治療するために有効なポリペプチドの量を指す。ポリペプチドは通常、上に開示したような医薬組成物などの医薬組成物として製剤化され、かつ従来の薬学的に許容される担体、補助剤、および賦形剤を含有する投与単位製剤の形で、経口経路、非経口経路、吸入スプレーによる経路、または局所経路を含む任意の適切な経路で投与され得る。好ましい実施形態では、医薬組成物および製剤は錠剤、丸剤、トローチ剤、エリキシル剤、懸濁剤、乳剤、液剤、またはシロップ剤などにより、経口投与される。

【0133】

最適な所望の効果（例えば、治療効果または予防効果）が得られるよう投与レジメンを調整することができる。適切な用量範囲は、例えば０．１ｕｇ／ｋｇ体重～１００ｍｇ／ｋｇ体重であり得；あるいは、０．５ｕｇ／ｋｇ体重～５０ｍｇ／ｋｇ体重；１ｕｇ／ｋｇ体重～２５ｍｇ／ｋｇ体重、または５ｕｇ／ｋｇ体重～１０ｍｇ／ｋｇ体重であり得る。ポリペプチドを単回ボーラスの形で送達してもよく、あるいは主治医の判断により２回以上（例えば、２回、３回、４回、５回、またはそれ以上）投与してもよい。

【実施例】

【0134】

実施例１
グリアジンはプロリン（Ｐ）およびグルタミン（Ｑ）に極めて富み、そのためヒト消化酵素による分解に対して抵抗性を示す。グリアジンの部分的消化によって生じるＰＱリッチペプチドフラグメントは腸管腔内で脱アミド化され、それによりＨＬＡ－ＤＱ２またはＨＬＡ－ＤＱ８への結合が可能になり、ＣＤを有する者においてＴｈ１炎症性応答を刺激する^３。胃内条件で安定性および機能性を示す、グリアジンエンドペプチダーゼＫＵＭＡＭＡＸ（商標）（以降、Ｋｕｍａ０１１と称するか、Ｃ末端ヒスチジンタグを含むＫｕｍａ０１１：ＧＳＴＥＮＬＹＦＱＳＧＡＬＥＨＨＨＨＨＨ（配列番号１３９）に言及する場合はＫｕｍａ０１０と称する）がこれまでに操作されて、ＰＱジペプチドモチーフを含むペプチドに分解された^４。本発明者らは、Ｋｕｍａ０１０の結晶構造（ＰＤＢ ＩＤ ４ＮＥ７）に基づき、Ｋｕｍａ０１０の活性部位を再設計し、免疫原性グリアジンペプチドに対する活性を増大させる変異を選択した。次いで、設計した変異体を、免疫原性の高い３３量体（ＬＱＬＱＰＦＰＱＰＱＬＰＹＰＱＰＱＬＰＹＰＱＰＱＬＰＹＰＱＰＱＰＦ（配列番号６９））および２６量体（ＦＬＱＰＱＱＰＦＰＱＱＰＱＱＰＹＰＱＱＰＱＱＰＦＰＱ（配列番号７０））のグリアジンペプチドに対する活性の増大についてスクリーニングした^６，７。これらのペプチドは、大部分のセリアック患者に対して毒性であることが示された全てのグリアジンＴ細胞エピトープの代表である、ＰＱＬまたはＰＱＱトリペプチドモチーフのいずれかを有する^８。このようにして、バリアントＫｕｍａ０３０を作製した。Ｋｕｍａ０３０は、ＰＱＱを含むペプチドに対してＫｕｍａ０１０より４４倍高い活性、およびＰＱＬを含むペプチドに対してＫｕｍａ０１０より１１倍高い活性をもつ。

【0135】

分子モデリングに基づけば、Ｋｕｍａ０１０の推定Ｓ１’ペプチド結合面は全体的に疎水性残基で構成されており、したがって、Ｐ１’にはグルタミンなどの極性残基ではなくロイシンなどの疎水性残基が好ましいはずである。Ｋｕｍａ０３０のＳ１’結合ポケットにはイソロイシンからトレオニンへの変異（Ｉ４６３Ｔ）が導入されており、これがＰ１’グルタミンとの水素結合をもたらし、この酵素がＳ１’サブサイトにロイシンおよびグルタミンの両方を適合でき、それによりＰＱＬおよびＰＱＱトリペプチドの両方を標的とすることができるようにすると予測される。Ｋｕｍａ０３０はまた、２６量体ペプチドおよび３３量体ペプチドに対する触媒効率を増大させる６つの追加の変異（Ｋ２６２Ｅ、Ｅ２６９Ｔ、Ｓ３５４Ｑ、Ｇ３５８Ｓ、Ｄ３９９Ｑ、Ａ４４９Ｑ）を組み込んでいる。Ｇ３５８Ｓは、Ｐ１グルタミン残基と水素結合すると予測される、Ｋｕｍａ０１０に導入された設計ヒスチジンを含むループを安定化すると予測される。残りの変異は、モデル化されるようにタンパク質構造を安定化すると予測される。

【0136】

多数のＰＱリッチエピトープがＣＤと関係づけられているが、グリアジン（コムギ）、ホルデイン（オオムギ）、およびセカリン（ライムギ）に由来する数種類のペプチドはＣＤにおける免疫応答の大部分の原因であることが明らかにされており、このため免疫優性として分類されている^８。コムギでは、ペプチドＷ０２－Ｅ０７（ＬＱＰＦＰＱＰＱＬＰＹＰＱＰＱ（配列番号１３３））、Ｗ０３－Ｅ０７（ＱＰＦＰＱＰＱＱＰＦＰＷＱＰ（配列番号１３４））、およびＷ０２－Ｅ０７配列を含む３３量体ペプチドがこれらに含まれる^６，９。これらのペプチドは、免疫原性が高いことが明らかにされている数種類のエピトープを有する^９～１１。グルテン全体にわたってこれらのエピトープを破壊するＫｕｍａ０３０の能力を評価するため、精製した全グルテンを、胃内を模した条件（３７℃でｐＨ４．０、ペプシン０．６ｍｇ／ｍＬを含む）でＫｕｍａ０３０とインキュベートした^１２。分解後に残存するグルテンの画分を、上記のペプチド中の全ての免疫優性エピトープを包含するアミノ酸モチーフＱＱＰＦＰ（配列番号１３５）およびＱＰＱＬＰＹ（配列番号１３６）をそれぞれ認識するＲ５抗体またはＧ１２抗体のいずれかをベースとするＥＬＩＳＡアッセイを用いて、定量した^{１３，１４}。Ｋｕｍａ０３０の活性を公開されているグルテナーゼの活性と比較するため、ＣＤの組合せ酵素治療薬として１：１の比で現在開発中である、グルテナーゼＥＰＢ２およびＳＣＰＥＰも検討した^１５。この研究で作製された酵素ＥＰＢ２およびＳＣＰＥＰは、公開されている数値の活性と一致する活性があることが確認された^{１６，１７}。グルテンとのインキュベーションで、Ｋｕｍａ０３０、Ｋｕｍａ０１０、またはＥＰＢ２とＳＣＰＥＰの１：１の組合せのいずれかを用いてＱＱＰＦＰ（配列番号１３５）量またはＱＰＱＬＰＹ（配列番号１３６）量の用量依存的な減少が観察された（図１Ａ）。１：２５（ｗ：ｗ）比の酵素：グルテンで、ＥＰＢ２およびＳＣＰＥＰは、この酵素の組合せに関して既に公開されている報告と同じように、存在するグルテンの８４．８％を分解した^{１８，１９}。Ｋｕｍａ０３０は、グルテン全体の上記のペプチドエピトープを除去する効果が極めて高く、用いた２つの方法で定量したところ、１：４００（ｗ：ｗ）比の酵素：グルテンで存在するグルテンを６０分で９９．５％超減少させるのに十分であった（図１Ａ）。Ｋｕｍａ０３０依存的な免疫原性グルテン量の減少は急速であり、１：２５のｗ：ｗ比で５分までに９８％超の分解が達成された（図１Ｂ）。Ｋｕｍａ０３０切断産物の質量分光測定は、Ｋｕｍａ０３０がコムギ由来の免疫優性エピトープ（３３量体、Ｗ０２－Ｅ０７およびＷ０３－Ｅ０７）、ならびにまたオオムギ由来エピトープＢ０８－Ｅ２Ｅ７（ＰＱＱＰＩＰＱＱＰＱＰＹＰＱＱ（配列番号６１））およびライムギ由来エピトープＲ１１－Ｅ２Ｅ７（ＱＰＦＰＱＱＰＥＱＩＩＰＱＱＰ）^９（配列番号６２）中のＰＱジペプチドモチーフの後ろの各ペプチドを切断することを明らかにした（図１Ｃ）。これらのインタクトのペプチドは免疫刺激性が高いが、Ｋｕｍａ０３０の作用によって、免疫応答を誘発すると考えられる９量体コアエピトープが除去されることから、ペプチド分解産物が免疫系を刺激するとは予測されない^２０。ＰＱＬまたはＰＱＱのトリペプチドモチーフのいずれかを含む上記のペプチドを分解するＫｕｍａ０３０の能力、およびＧ１２抗体およびＲ５抗体の両方によって測定されるようなグリアジン量を減少させるＫｕｍａ０３０の能力は、Ｋｕｍａ０３０がＳ１’結合ポケットにロイシンまたはグルタミンのいずれかを有するペプチドを結合し分解できるという仮説と一致する。

【0137】

免疫原性グリアジンエピトープを効率的に分解するＫｕｍａ０３０の能力は、Ｋｕｍａ０３０とのグリアジンのインキュベーションが、Ｔ細胞性免疫応答を刺激するグリアジンの能力を低下させるかもしれないことを示唆する。セリアック患者の腸生検試料由来の細胞を用いるＴ細胞アッセイは、この評価の代表的な基準である。Ｋｕｍａ０３０とのインキュベーションがグリアジンの免疫刺激能を低下または消失させるという仮説を直接評価するため、Ｋｕｍａ０３０処理したグリアジンに細胞を曝露し生じたＴ細胞反応を評価する、Ｔ細胞アッセイを実施した。この試験で使用した高グリアジン反応性の腸ＣＤ４^＋Ｔ細胞系は、腸粘膜から以前に作製され、様々なグリアジンファミリーにわたり多様なエピトープに反応することが示されている^２１。Ｋｕｍａ０３０およびペプシンを、実験的に模した胃内条件で６０分間、精製コムギグリアジンとインキュベートした。腸区画内への移行を模倣するため、試料のｐＨレベルを次いで上昇させ、試料をキモトリプシンで処理し、ＴＧ２で脱アミド化して免疫原性エピトープを露出させた。得られたグリアジン試料をＴ細胞系に提示し、ＩＦＮ－γ産生（図２Ａ～２Ｅ）およびＴ細胞増殖（図３Ａ～３Ｄ）を測定することによって刺激を評価した。ペプシン処理したグリアジンにＴ細胞系を曝露するとＩＦＮ－γの産生が刺激され、グリアジンをペプシンとＫｕｍａ０３０で同時に処理するとこの応答は減少し、より高い濃度で消失した。ＩＦＮ－γ産生で観察された減少は、Ｋｕｍａ０３０の毒性に起因するものではなかった。重要なことに、Ｋｕｍａ０３０はＴ細胞のエピトープ特異性に関係なく試験したいずれのＴ細胞系においてもグリアジンに対するＴ細胞応答を消失させ、Ｋｕｍａ０３０がこのアッセイに使用されたＴ細胞系によって認識されるあらゆるエピトープに対して効果的であることを示唆する。これらのエピトープは３つの主要なグリアジンファミリー、すなわち、αグリアジン、ωグリアジン、およびγグリアジンにわたって存在するため、これはＫｕｍａ０３０がグリアジンの全ての関連領域内の免疫原性エピトープを分解できることを示唆する。

【0138】

上の実験は、精製された全グルテンまたはグリアジンにおいて免疫原性グリアジンエピトープを分解するＫｕｍａ０３０の能力を示す。しかし、実用性を評価するためには、生理学的に関連する食品および飲料の基質でのＫｕｍａ０３０の有効性を評価することが重要である。胃での消化の状況におけるＫｕｍａ０３０の活性を評価するため、酸性化したパンのスラリー中およびコムギビール中でグルテンを分解するＫｕｍａ０３０の能力を試験した。全粒コムギパンを人工唾液中ですりつぶして、パン１枚を摂取した後の胃中の典型的なパンの濃度で咀嚼を模倣した。次いで、ＨＣｌおよびペプシンの添加によって混合物を酸性化し、種々の濃度でグルテナーゼを加えた。次いで、グルテンの残存量を、幽門開口部を通って十二指腸内に摂取物を放出し始めるまでの胃中の食物の平均遅滞時間を表す、３０分間の消化の後で定量した^２２。試験した最も高濃度（１０００μｇ／ｍＬ）のグルテナーゼで、ＥＰＢ２およびＳＣＰＥＰでの処理によって８４．４％のグルテンが分解された（図４Ａ）。これは、ＥＰＢ２およびＳＣＰＥＰが３０分のインキュベーション時間後にヒト胃中で、１：１０の酵素：グルテンの比で被験食中のグルテンの７０～７９％を除去することを示す公開済みの第１相試験の結果と同等である^２３。濃度６２．５μｇ／ｍＬ（比１：１６０（ｗ：ｗ））で、Ｋｕｍａ０３０はパン中のグルテンレベルを２０ｐｐｍ（「無グルテン」表示に関するＦＤＡの閾値）未満に低下させた。最後に、コムギビールが比較的高いグルテンレベルを示すことから、Ｋｕｍａ０３０のグルテン分解能をコムギビール中で直接試験した^２４。ビールを、２種類の酵素濃度で３７℃または４℃にてＫｕｍａ０３０とインキュベートした。試料を種々の時点で採取し、残存グルテンの濃度を定量した。約７６４ｐｐｍのグルテン濃度を示すビールを、Ｋｕｍａ０３０とインキュベートしたところ、わずか５分までにグルテンレベルが２０ｐｐｍ未満に低下した（図４Ｂ）。液体が胃から出る時間は固体よりも相当早いため、このような即効性は特に重要である^２５。驚くべきことに、４℃でさえＫｕｍａ０３０はコムギビールのグルテン量を大幅に減少し、７００μｇ／ｍＬでのＫｕｍａ０３０とのインキュベーションは、グルテンレベルを５分までに２０ｐｐｍ未満に低下させた。

【0139】

現時点で、セリアック病の治療法は生涯にわたる厳格な無グルテン食のみである。免疫応答を刺激するＰＱリッチ免疫原性グリアジンエピトープが同定されて以来、経口酵素療法はＣＤ治療の魅力的な選択肢であると考えられてきた^３。グリアジンに対する炎症性免疫応答は腸内に入った直後に起こることから、ＣＤの経口酵素療法の有用な特徴は、胃内条件で免疫原性ペプチドを分解する能力である^２６。ＣＤ患者でのグルテン抗原刺激試験は、腸の損傷を予防するために摂取するグルテン量が１０ｍｇ以下に維持されなければならないことを示した^{２７，２８}。実際に、グルテンが２０ｐｐｍ未満であるという基準を厳格に順守することにより１日の摂取量が１０ｍｇ以下になると予測されることから、ＦＤＡは現時点で、「無グルテン」と表示される食品はグルテンが２０ｐｐｍ未満でなければならないことを義務付けている。したがって、偶然に摂取された１ｇのグルテン（クルトン１個中に存在するおよそのグルテン量）は、腸の損傷およびグルテン曝露により生じ得る症状を予防するために、胃区画内で９９％以上減らされなければならない。このため、胃内条件で免疫原性グリアジンエピトープを短時間で破壊できるグルテナーゼが必要とされていることは明白である。４ｇのグルテンを摂取を表すパンスラリーのモデルでは、Ｋｕｍａ０３０が１：１６０のｗ：ｗ比で９９．８％超のグリアジンを３０分で分解することがわかった。さらに、Ｋｕｍａ０３０は、グルテンの免疫原性領域全体にわたってよくみられるＰＱジペプチドモチーフを有するペプチドを特異的に破壊する。実際に、Ｋｕｍａ０３０は、試験した全ての免疫優性ペプチドを分解でき、Ｋｕｍａ０３０で処理したグリアジンは、試験した全てのＴ細胞系によるＩＦＮ－γ産生を刺激できず、このことは、ＣＤ患者は様々な免疫原性エピトープに対する無数の応答を示すため、重要である。

【0140】

実施例１の参考文献
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２．Ｃａｔａｓｓｉ，Ｃ．，Ｇａｔｔｉ，Ｓ．＆ Ｌｉｏｎｅｔｔｉ，Ｅ．Ｗｏｒｌｄ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ ａｎｄ ｃｅｌｉａｃ ｄｉｓｅａｓｅ ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ．Ｄｉｇ Ｄｉｓ ３３，１４１－１４６（２０１５）．
３．Ｓｏｌｌｉｄ，Ｌ．Ｍ．Ｃｏｅｌｉａｃ ｄｉｓｅａｓｅ：ｄｉｓｓｅｃｔｉｎｇ ａ ｃｏｍｐｌｅｘ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｄｉｓｏｒｄｅｒ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２，６４７－６５５（２００２）．
４．Ｇｏｒｄｏｎ，Ｓ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．ＣＯＭＰＵＴＡＴＩＯＮＡＬ ＤＥＳＩＧＮ ＯＦ ＡＮ ａｌｐｈａ－ＧＬＩＡＤＩＮ ＰＥＰＴＩＤＡＳＥ．Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ（２０１２）．
５．Ｒｉｃｈｔｅｒ，Ｆ．，Ｌｅａｖｅｒ－Ｆａｙ，Ａ．，Ｋｈａｒｅ，Ｓ．Ｄ．，Ｂｊｅｌｉｃ，Ｓ．＆ Ｂａｋｅｒ，Ｄ．Ｄｅ ｎｏｖｏ ｅｎｚｙｍｅ ｄｅｓｉｇｎ ｕｓｉｎｇ Ｒｏｓｅｔｔａ３．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ６，ｅ１９２３０（２０１１）．
６．Ｓｈａｎ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｇｌｕｔｅｎ ｉｎｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｉｎ ｃｅｌｉａｃ ｓｐｒｕｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９７，２２７５－２２７９（２００２）．
７．Ｓｈａｎ，Ｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃａｌｌｙ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｆｒｏｍ ｇｌｕｔｅｎ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｃｅｌｉａｃ ｓｐｒｕｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００５）．
８．Ｓｏｌｌｉｄ，Ｌ．Ｍ．，Ｑｉａｏ，Ｓ．Ｗ．，Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｒ．Ｐ．，Ｇｉａｎｆｒａｎｉ，Ｃ．＆ Ｋｏｎｉｎｇ，Ｆ．Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ ａｎｄ ｌｉｓｔｉｎｇ ｏｆ ｃｅｌｉａｃ ｄｉｓｅａｓｅ ｒｅｌｅｖａｎｔ ｇｌｕｔｅｎ Ｔ－ｃｅｌｌ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ ｂｙ ＨＬＡ－ＤＱ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ６４，４５５－４６０（２０１２）．
９．Ｔｙｅ－Ｄｉｎ，Ｊ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ，ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ Ｔ ｃｅｌｌ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｉｎ ｇｌｕｔｅｎ ｉｎ ｃｅｌｉａｃ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ２，４１ｒａ５１（２０１０）．
１０．Ａｒｅｎｔｚ－Ｈａｎｓｅｎ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ａｌｐｈａ－ｇｌｉａｄｉｎ ｉｎ ａｄｕｌｔ ｃｅｌｉａｃ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｓ ｆｏｃｕｓｅｄ ｏｎ ａ ｓｉｎｇｌｅ ｄｅａｍｉｄａｔｅｄ ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｂｙ ｔｉｓｓｕｅ ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９１，６０３－６１２（２０００）．
１１．Ａｒｅｎｔｚ－Ｈａｎｓｅｎ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｉａｃ ｌｅｓｉｏｎ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｔｈａｔ ｃｌｕｓｔｅｒ ｉｎ ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ ｇｌｉａｄｉｎｓ ｒｉｃｈ ｉｎ ｐｒｏｌｉｎｅ ｒｅｓｉｄｕｅｓ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １２３，８０３－８０９（２００２）．
１２．Ｃｈａｎｇ，Ｊ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．Ａ ｎｏｖｅｌ ｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｔｈｅ Ｂｒａｖｏ ｗｉｒｅｌｅｓｓ ｐＨ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｃａｐｓｕｌｅ ｆｏｒ ｍｅａｓｕｒｉｎｇ ｉｎｔｒａｇａｓｔｒｉｃ ｐＨ．Ｄｉｇ Ｄｉｓ Ｓｃｉ ５４，５７８－５８５（２００９）．
１３．Ｌｕｐｏ，Ａ．，Ｒｏｅｂｕｃｋ，Ｃ．，Ｗａｌｓｈ，Ａ．，Ｍｏｚｏｌａ，Ｍ．＆ Ａｂｏｕｚｉｅｄ，Ｍ．Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｖｅｒａｔｏｘ Ｒ５ ｒａｐｉｄ ＥＬＩＳＡ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｉａｄｉｎ．Ｊ ＡＯＡＣ Ｉｎｔ ９６，１２１－１３２（２０１３）．
１４．Ｍｏｒｏｎ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｒｅａｌ ｆｒａｃｔｉｏｎｓ ｔｈａｔ ａｒｅ ｔｏｘｉｃ ｔｏ ｃｅｌｉａｃ ｄｉｓｅａｓｅ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ ａ ｍａｉｎ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ ｗｈｅａｔ ｐｅｐｔｉｄｅ．Ａｍ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｎｕｔｒ ８７，４０５－４１４（２００８）．
１５．Ｌａｈｄｅａｈｏ，Ｍ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｇｌｕｔｅｎａｓｅ ＡＬＶ００３ Ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ Ｇｌｕｔｅｎ－Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｍｕｃｏｓａｌ Ｉｎｊｕｒｙ ｉｎ Ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｃｅｌｉａｃ Ｄｉｓｅａｓｅ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ（２０１４）．
１６．Ｂｅｔｈｕｎｅ，Ｍ．Ｔ．，Ｓｔｒｏｐ，Ｐ．，Ｔａｎｇ，Ｙ．，Ｓｏｌｌｉｄ，Ｌ．Ｍ．＆ Ｋｈｏｓｌａ，Ｃ．Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ，ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ－ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＥＰ－Ｂ２，ａ ｓｅｌｆ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｂａｒｌｅｙ ｃｙｓｔｅｉｎｅ ｅｎｄｏｐｒｏｔｅａｓｅ．Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ １３，６３７－６４７（２００６）．
１７．Ｅｈｒｅｎ，Ｊ．，Ｇｏｖｉｎｄａｒａｊａｎ，Ｓ．，Ｍｏｒｏｎ，Ｂ．，Ｍｉｎｓｈｕｌｌ，Ｊ．＆ Ｋｈｏｓｌａ，Ｃ．Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｐｒｏｌｙｌ ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅｓ ｆｏｒ ｃｅｌｉａｃ ｓｐｒｕｅ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ ２１，６９９－７０７（２００８）．
１８．Ｓｉｅｇｅｌ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．Ｒａｔｉｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｃｅｌｉａｃ ｓｐｒｕｅ．Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ １３，６４９－６５８（２００６）．
１９．Ｇａｓｓ，Ｊ．，Ｂｅｔｈｕｎｅ，Ｍ．Ｔ．，Ｓｉｅｇｅｌ，Ｍ．，Ｓｐｅｎｃｅｒ，Ａ．＆ Ｋｈｏｓｌａ，Ｃ．Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｇａｓｔｒｉｃ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｅｔａｒｙ ｇｌｕｔｅｎ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｃｅｌｉａｃ ｓｐｒｕｅ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １３３，４７２－４８０（２００７）．
２０．Ｐｅｔｅｒｓｅｎ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｔ－ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ＨＬＡ－ＤＱ２－ｇｌｉａｄｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｃｅｌｉａｃ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２１，４８０－４８８（２０１４）．
２１．Ｃａｍａｒｃａ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ｇｌｕｔｅｎ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｒｅ ｌａｒｇｅｌｙ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ａ ｐｅｐｔｉｄｅ－ｂａｓｅｄ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｃｅｌｉａｃ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １８２，４１５８－４１６６（２００９）．
２２．Ｐｅｒａ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｍａｓｔｉｃａｔｉｏｎ ｏｎ ｇａｓｔｒｉｃ ｅｍｐｔｙｉｎｇ．Ｊ Ｄｅｎｔ Ｒｅｓ ８１，１７９－１８１（２００２）．
２３．Ｓｉｅｇｅｌ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．Ｓａｆｅｔｙ，ｔｏｌｅｒａｂｉｌｉｔｙ，ａｎｄ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＡＬＶ００３：ｒｅｓｕｌｔｓ ｆｒｏｍ ｔｗｏ ｐｈａｓｅ １ ｓｉｎｇｌｅ，ｅｓｃａｌａｔｉｎｇ－ｄｏｓｅ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌｓ．Ｄｉｇ Ｄｉｓ Ｓｃｉ ５７，４４０－４５０（２０１２）．
２４．Ｐｉｃａｒｉｅｌｌｏ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｃｓ，ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ｗｈｅａｔ ｂｅｅｒ（ｗｅｉｓｓｂｉｅｒ）．Ｊ Ａｇｒｉｃ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ ６３，３５７９－３５８６（２０１５）．
２５．Ｈｏｕｇｈｔｏｎ，Ｌ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｔｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｔｒｕｍ，ｐｙｌｏｒｕｓ，ａｎｄ ｄｕｏｄｅｎｕｍ ｔｏ ｇａｓｔｒｉｃ ｅｍｐｔｙｉｎｇ ｏｆ ａ ｓｏｌｉｄ－ｌｉｑｕｉｄ ｍｉｘｅｄ ｍｅａｌ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ９４，１２８５－１２９１（１９８８）．
２６．Ｃａｓｔｉｌｌｏ，Ｎ．Ｅ．，Ｔｈｅｅｔｈｉｒａ，Ｔ．Ｇ．＆ Ｌｅｆｆｌｅｒ，Ｄ．Ａ．Ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｔ ａｎｄ ｔｈｅ ｆｕｔｕｒｅ ｉｎ ｔｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｃｅｌｉａｃ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｒｅｐ（Ｏｘｆ）３，３－１１（２０１５）．
２７．Ｃａｔａｓｓｉ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．Ａ ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ，ｄｏｕｂｌｅ－ｂｌｉｎｄ，ｐｌａｃｅｂｏ－ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｔｒｉａｌ ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ａ ｓａｆｅ ｇｌｕｔｅｎ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｆｏｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｃｅｌｉａｃ ｄｉｓｅａｓｅ．Ａｍ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｎｕｔｒ ８５，１６０－１６６（２００７）．
２８．Ａｋｏｂｅｎｇ，Ａ．Ｋ．＆ Ｔｈｏｍａｓ，Ａ．Ｇ．Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｒｅｖｉｅｗ：ｔｏｌｅｒａｂｌｅ ａｍｏｕｎｔ ｏｆ ｇｌｕｔｅｎ ｆｏｒ ｐｅｏｐｌｅ ｗｉｔｈ ｃｏｅｌｉａｃ ｄｉｓｅａｓｅ．Ａｌｉｍｅｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｈｅｒ ２７，１０４４－１０５２（２００８）．

【0141】

実施例２
次いで、コンピュータ設計による酵素を作製し、それらの免疫原性グリアジンペプチド分解能を試験した。次いで、関連ペプチドを標的とする酵素の能力を向上させることが示された変異を組み合わせ反復処理で試験して、活性をさらに高めた。ごく最近では、Ｌアミノ酸またはＱアミノ酸のいずれかを好むＳ１’結合ポケットへと設計が及んでいる。このような技術的作業により、実質的にあらゆる免疫原性グリアジンペプチドのコアエピトープ内に位置するＰＱＬまたはＰＱＱトリペプチドを含むペプチドに対する活性が大幅に増大した。

【0142】

複数のＫｕｍａ０１０バリアントを用いた。具体的な変異の差、および活性に対するそれらの相対的効果を下の表６に列挙する。

【0143】

【表5】

^ａ上記の変異を作製する際のバックグランドとしての役割を果たした特定のＫｕｍａ０１０バリアント。
^ｂ全長Ｋｕｍａ０１０酵素に対する変異位置を記載する。
^ｃ各バリアントの活性の向上は、そのバリアントの作製に使用した鋳型酵素である「バックグラウンド」酵素の活性に対する活性の増加倍数として算出した。活性は、以下の基質：蛍光標識ＰＱＰＱＬＰ（配列番号１５６）基質、３３量体５ペプチド（ＰＱＬを含む）もしくは２６量体ペプチド６（ＰＱＱを含む）、またはＤＱ２．５－グリア－α１ａ（ＰＱＬを含む）もしくはＤＱ２．５－グリア－ω１（ＰＱＱ）７の１つまたは複数に対し測定した。何百種類ものＫｕｍａ０１０バリアントが精巣であったため、各変異体の速度定数を求めるのは実行不可能であると考えられ、したがって、ここに示される向上倍数は確定された数値ではなく推定値であることに留意することが重要である。ここに示す向上倍数は、ＬＣ－ＭＳにより分解アッセイで検出されたペプチド分解産物の量から算出される。
^ｄＮＤ：求めなかった。Ｈｉｓタグ喪失時に酵素活性の低下が起こらないことを確認するため、個々のペプチド分解を評価する代わりに、リードＫｕｍａ０６０、Ｋｕｍａ０６１、およびＫｕｍａ０６２；ならびにＫｕｍａ０７０、Ｋｕｍａ０７１、およびＫｕｍａ０７２の活性を、パンまたは食事の分解アッセイで互いに直接比較した。のちに記載するように、ＰＱＬおよびＰＱＱ含有ペプチドを分解するＫｕｍａ０７０の能力をＫｕｍａ０４０と比較した。

【0144】

Ｋｕｍａ０２０、Ｋｕｍａ０２１、およびＫｕｍａ０３０
ＰＱＬまたはＰＱＱトリペプチドを含む基質に対する活性を向上させるべく、Ｋｕｍａ０１０の活性部位の設計作業をさらに進めた。技術的作業により、変異Ｇ３５８ＳおよびＩ４６３Ｔが活性増大に非常に寄与することがわかった。Ｇ３５８Ｓ変異は、Ｋｕｍａ０１０のこの部位で行ったこれまでの変異を改良したものであった。Ｉ４６３Ｔ変異は、ＰＱＬトリペプチドモチーフを標的とする場合にＰ１’結合ポケットに生じる立体障害を打ち消し、ＰＱＱが基質であった場合に新たな予測水素結合を導入した^４。これらの２つの変異を有するＫｕｍａ０１０バリアントは元のＫｕｍａ０１０に対し大幅な向上を示し、Ｋｕｍａ０２０と命名された。

【0145】

このＫｕｍａ０２０酵素に対してさらなる変異を行った。Ｄ３９９ＱおよびＡ４４９Ｑは、活性部位の外部に位置する変異であったため、基質への結合に影響を及ぼすとは予測されない。その代わりに、これらの２つの変異は、新たな予測分子内水素結合を生じ、したがって酵素を安定化すると予測された。得られたバリアントＫｕｍａ０２１は、活性のさらなる増大を示した。

【0146】

Ｋｕｍａ０２１からのＫｕｍａ０３０の作製には、３つの他の改良が寄与した。Ｋｕｍａ０３０は上で詳細に記載されている。

【0147】

Ｋｕｍａ０４０およびＫｕｍａ０５０
上記の変異に代えて、Ｋｕｍａ０１０バックグラウンドの異なるセットの変異であるＳ３１９ＡおよびＨ３６８Ｆは、Ｋｕｍａ０３０にみられるものとは異なる活性部位の構造をもたらした。これらの変異は、Ｄ３９９Ｑ、Ａ４４９Ｑ、およびＩ４６３Ｔ（これらの変異もＫｕｍａ０３０の活性を増大させた）とともにＫｕｍａ０４０バリアントを構成する。Ｋｕｍａ０４１、Ｋｕｍａ０４２、Ｋｕｍａ０７０、Ｋｕｍａ０７１、およびＫｕｍａ０７２はＫｕｍａ０４０に似た活性部位を有し、一方でＫｕｍａ０３１、Ｋｕｍａ０３２、Ｋｕｍａ０６０、Ｋｕｍａ０６１、およびＫｕｍａ０６２はＫｕｍａ０３０に似た活性部位を有する。

【0148】

Ｋｕｍａ０５０は、Ｋｕｍａ０２１バックグラウンドに構築されたＫｕｍａ０１０バリアントであり、Ｋｕｍａ０４０よりもＫｕｍａ０３０との共通点が多い活性部位構造を有する。しかし、Ｋｕｍａ０５０にはＩ４６３Ｔ変異がなく、代わりにＬ２７０Ｖ変異を有し、この変異はＰＱＬ含有ペプチドに対するＫｕｍａ０５０の活性を増大させると予測されるが、グルタミンのＰ１’結合ポケットへの接近を妨害することによりＰＱＱ含有基質に対する活性を低下させると予測される。したがって、Ｋｕｍａ０５０は、ＰＱＬ含有基質に対して高レベルの活性を特異的に示すが、ＰＱＱ含有基質に対してはそうではない。いくつかの研究が、ＰＱＬモチーフを複数含みＰＱＱモチーフを含まないαグリアジン由来の免疫優性３３量体ペプチドは一部の患者において疾患の大部分の原因となるペプチドであり得ることを示したことから、Ｋｕｍａ０５０の特異性プロファイルは望ましいものであった。

【0149】

それぞれＰＱＬおよびＰＱＱ含有ペプチドを代表する、高免疫原性のαグリアジンの３３量体ペプチド（ＬＱＬＱＰＦＰＱＰＱＬＰＹＰＱＰＱＬＰＹＰＱＰＱＬＰＹＰＱＰＱＰＦ（配列番号６９））およびγグリアジンの２６量体ペプチド（ＦＬＱＰＱＱＰＦＰＱＱＰＱＱＰＹＰＱＱＰＱＱＰＦＰＱ（配列番号７０））に対する、Ｋｕｍａ０１０、Ｋｕｍａ０２０、Ｋｕｍａ０３０、Ｋｕｍａ０４０、およびＫｕｍａ０５０の活性を下に示す。経時的な分解産物の出現（３３量体ペプチドについてはＬＰＹＰＱＰＱＰＦ（配列番号１３７）；２６量体ペプチドについてはＦＬＱＰＱ（配列番号１３８））を、図５Ａ～５Ｂに示す。

【0150】

いずれの場合も、Ｋｕｍａ０３０が有力な被験酵素であったが、Ｋｕｍａ０４０は、特に２６量体ペプチドに対してＫｕｍａ０３０とほぼ同じ強さの活性を示した。予想通り、Ｋｕｍａ０５０は３３量体ペプチドに対して優れた活性を示したが、２６量体ペプチドに対して極めて低い活性を示した。Ｋｕｍａ０３０およびＫｕｍａ０４０と比較して、Ｋｕｍａ０２０は両ペプチドに対し中程度の量の活性を示し、上記のようにそれが設計中間体であることと一致していた。全てのバリアントは、元のＫｕｍａ０１０酵素よりも著明な向上を示す。

【0151】

Ｋｕｍａ０６０およびＫｕｍａ０７０
追加の設計した変異は、変異Ｇ３２０Ｍであった。この変異は、活性を大幅に向上させると予測されなかったため、特に有望であるとは思われず、実際に、この残基は、活性部位中にあるものの、グリアジン基質と直接接触するようにはみえない。しかし、この位置での変異は、両基質に対する活性を２～４倍向上させた。これは、メチオニンの組込みによって起きたＫｕｍａ０１０主鎖でのわずかな変化によるものかもしれず、それが触媒作用に一層有利な確証になった可能性がある。Ｇ３２０Ｍ変異をＫｕｍａ０３０バックグラウンドおよびＫｕｍａ０４０バックグラウンドに組み込んで、それぞれ酵素Ｋｕｍａ０６０およびＫｕｍａ０７０を作製した。

【0152】

図６Ａ～６Ｂは、Ｋｕｍａ０４０バックグラウンドのＧ３２０Ｍ変異に起因する、免疫原性エピトープＤＱ２．５－グリア－α１ａ（ＰＱＬを含む）、およびＤＱ２．５－グリア－ω１（ＰＱＱを含む）の両方の分解における活性の向上を示す。

【0153】

ＫｕｍａＸＸ１シリーズおよびＫｕｍａＸＸ２シリーズ
Ｋｕｍａ０２１を除き、ＫｕｍａＸＸ１（例えば、Ｋｕｍａ０３１）と表示されるＫｕｍａ０１０バリアントは、Ｃ末端ＴＥＶプロテアーゼ切断部位および６×Ｈｉｓタグ（ＧＳＴＥＮＬＹＦＱＳＧＡＬＥＨＨＨＨＨＨ（配列番号１３９））を遺伝的に削除したＫｕｍａＸＸ０バリアント（例えば、Ｋｕｍａ０３０）に対応している。このタグは本来、Ｋｕｍａ０１０バリアントをハイスループットで容易に精製するためにクマモリシン－Ａｓ酵素に付加されたものであるが、６×Ｈｉｓタグが生物学的製剤に好ましいものではないため、特定のＫｕｍａ０１０リードバリアントでは除去された。全般的には、このタグの除去は酵素の活性に影響しなかったが、Ｈｉｓタグの除去は、全粒コムギパンの胃内消化でグリアジンを分解するＫｕｍａ０７０酵素（Ｋｕｍａ０６０酵素ではなく）の能力をわずかに低下させたように思われた。

【0154】

ＫｕｍａＸＸ２（例えば、Ｋｕｍａ０３２）と表示されるＫｕｍａ０１０バリアントもＨｉｓタグを欠き、追加の変異、すなわちＰ１７１ＲおよびＨ１７２Ｒを含む。これらの変異は酵素の活性に影響しないが、精製工程を簡略化するために組み込まれた。これらの変異をＫｕｍａ０１０のＮ末端領域のプロペプチドドメイン内に導入した。これらの変異はプロペプチドドメイン内に存在するため、成熟した活性酵素中には存在しない。これらの２つの変異は、低ｐＨに曝露されて切断されるまで、酵素の活性部位に存在するタンパク質のＮ末端領域内に収まっている。この領域は触媒残基に近接しているため、これが、標準的な精製工程中のＫｕｍａ０１０酵素の精製の際に最初の切断事象が起こる領域であると仮定される。部分的に切断された酵素のＮ末端は、酵素が酸に曝露されるまで成熟酵素と強く結合した状態を維持する。タンパク質精製中のこの最初の自己プロセシングは活性に悪影響を及ぼさないが、それは、Ｋｕｍａ０１０酵素に精通していない者によるＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析の解釈を複雑にする可能性がある。このため、精製酵素のＳＤＳ－ＰＡＧＥプロファイルを簡略化するために、Ｐ１７１Ｒ変異およびＨ１７２Ｒ変異を組み込んで、タンパク質精製工程中に起こる最初のＮ末端切断の量を低減した。

【0155】

ＫｕｍａＸＸ１バリアントおよびＫｕｍａＸＸ２バリアントはＨｉｓタグを欠くため、それらはＮｉアフィニティークロマトグラフィーにより精製されない。代わりに、これらを陰イオン交換クロマトグラフィーにより精製する。以下のグラフは、バリアントＫｕｍａ０３０、Ｋｕｍａ０３１、Ｋｕｍａ０３２、Ｋｕｍａ０４０、Ｋｕｍａ０４１、およびＫｕｍａ０４２の免疫原性グリアジンペプチドＤＱ２．５－グリア－α１ａに対する活性を示す。この場合、比較のため、全てのタンパク質を（インタクトの６×ヒスチジンタグを有するＫｕｍａ０３０およびＫｕｍａ０４０も）陰イオン交換クロマトグラフィーにより精製した。図７に示されるように、Ｋｕｍａ０３２およびＫｕｍａ０４２はＫｕｍａ０３０およびＫｕｍａ０４０と同程度の活性を示す（Ｋｕｍａ０４２はＫｕｍａ０４０と比較して、この基質に対する活性のわずかな増大さえ示す）ことから、Ｐ１７１Ｒ変異およびＨ１７２Ｒ変異は活性に悪影響を及ぼさないと思われる。

【0156】

Ｋｕｍａ０１０バリアントのＫｕｍａ０６２は、高い活性量を示しＨｉｓタグを欠く。Ｋｕｍａ０６２とＫｕｍａ０３０およびＫｕｍａ０４０との比較を、図８Ａ～８Ｂ（左、全長ＤＱ２．５－グリア－ω１の検出；右、分解産物の検出）に示す。

【0157】

酵素反応速度
Ｋｕｍａ０１０、Ｋｕｍａ０３０、Ｋｕｍａ０４０、およびＫｕｍａ０５０について生化学的パラメータを推定した。これらは免疫原性グリアジンエピトープＤＱ２．５－グリア－α１ａおよびＤＱ２．５－グリア－ω１を用いて推定した。１００ｍＭ ＮａＯＡｃ、ｐＨ４．０の緩衝液中で酵素１００ｎＭを用いて３７℃にて分解アッセイを実施した。基質濃度の関数として分解反応の初速度を下の表に示す。ミカエリス・メンテン式を用いてこれよりｋ_ｃａｔおよびＫ_Ｍを算出した。

【0158】

全被験酵素の生化学的パラメータを下の表７に示す。

【0159】

【表6】

【0160】

Ｋｕｍａ０３０およびＫｕｍａ０４０に行った変異は上記のペプチドに対する活性を大幅に増大し、このことは、セリアック病に関係するペプチドの解毒における上記の酵素の使用に有望である。予測された通り、Ｋｕｍａ０５０に行った変異はＤＱ２．５－グリア－α１ａペプチドに対する活性を増大したが、ＤＱ２．５－グリア－ω１ペプチドに対する活性を増大しなかった。

【0161】

実施例２の参考文献
（１）Ｇｏｒｄｏｎ，Ｓ．Ｒ．；Ｓｔａｎｌｅｙ，Ｅ．Ｊ．；Ｗｏｌｆ，Ｓ．；Ｔｏｌａｎｄ，Ａ．；Ｗｕ，Ｓ．Ｊ．；Ｈａｄｉｄｉ，Ｄ．；Ｍｉｌｌｓ，Ｊ．Ｈ．；Ｂａｋｅｒ，Ｄ．；Ｐｕｌｔｚ，Ｉ．Ｓ．；Ｓｉｅｇｅｌ，Ｊ．Ｂ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ２０１２．
（２）Ｗｌｏｄａｗｅｒ，Ａ．；Ｌｉ，Ｍ．；Ｇｕｓｔｃｈｉｎａ，Ａ．；Ｔｓｕｒｕｏｋａ，Ｎ．；Ａｓｈｉｄａ，Ｍ．；Ｍｉｎａｋａｔａ，Ｈ．；Ｏｙａｍａ，Ｈ．；Ｏｄａ，Ｋ．；Ｎｉｓｈｉｎｏ，Ｔ．；Ｎａｋａｙａｍａ，Ｔ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２００４，２７９，２１５００．
（３）Ｌｅａｖｅｒ－Ｆａｙ，Ａ．；Ｔｙｋａ，Ｍ．；Ｌｅｗｉｓ，Ｓ．Ｍ．；Ｌａｎｇｅ，Ｏ．Ｆ．；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．；Ｊａｃａｋ，Ｒ．；Ｋａｕｆｍａｎ，Ｋ．；Ｒｅｎｆｒｅｗ，Ｐ．Ｄ．；Ｓｍｉｔｈ，Ｃ．Ａ．；Ｓｈｅｆｆｌｅｒ，Ｗ．；Ｄａｖｉｓ，Ｉ．Ｗ．；Ｃｏｏｐｅｒ，Ｓ．；Ｔｒｅｕｉｌｌｅ，Ａ．；Ｍａｎｄｅｌｌ，Ｄ．Ｊ．；Ｒｉｃｈｔｅｒ，Ｆ．；Ｂａｎ，Ｙ．Ｅ．；Ｆｌｅｉｓｈｍａｎ，Ｓ．Ｊ．；Ｃｏｒｎ，Ｊ．Ｅ．；Ｋｉｍ，Ｄ．Ｅ．；Ｌｙｓｋｏｖ，Ｓ．；Ｂｅｒｒｏｎｄｏ，Ｍ．；Ｍｅｎｔｚｅｒ，Ｓ．；Ｐｏｐｏｖｉｃ，Ｚ．；Ｈａｖｒａｎｅｋ，Ｊ．Ｊ．；Ｋａｒａｎｉｃｏｌａｓ，Ｊ．；Ｄａｓ，Ｒ．；Ｍｅｉｌｅｒ，Ｊ．；Ｋｏｒｔｅｍｍｅ，Ｔ．；Ｇｒａｙ，Ｊ．Ｊ．；Ｋｕｈｌｍａｎ，Ｂ．；Ｂａｋｅｒ，Ｄ．；Ｂｒａｄｌｅｙ，Ｐ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ ２０１１，４８７，５４５．
（４）Ｗｏｌｆ，Ｃ．；Ｓｉｅｇｅｌ，Ｊ．Ｂ．；Ｔｉｎｂｅｒｇ，Ｃ．；Ｃａｍａｒｃａ，Ａ．；Ｇｉａｎｆｒａｎｉ，Ｃ．；Ｐａｓｋｉ，Ｓ．；Ｇｕａｎ，Ｒ．；Ｍｏｎｔｅｌｉｏｎｅ，Ｇ．；Ｂａｋｅｒ，Ｄ．；Ｐｕｌｔｚ，Ｉ．Ｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ２０１５，１３７，１３１０６．
（５）Ｓｈａｎ，Ｌ．；Ｍｏｌｂｅｒｇ，Ｏ．；Ｐａｒｒｏｔ，Ｉ．；Ｈａｕｓｃｈ，Ｆ．；Ｆｉｌｉｚ，Ｆ．；Ｇｒａｙ，Ｇ．Ｍ．；Ｓｏｌｌｉｄ，Ｌ．Ｍ．；Ｋｈｏｓｌａ，Ｃ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００２，２９７，２２７５．
（６）Ｓｈａｎ，Ｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００５．
（７）Ｓｏｌｌｉｄ，Ｌ．Ｍ．；Ｑｉａｏ，Ｓ．Ｗ．；Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｒ．Ｐ．；Ｇｉａｎｆｒａｎｉ，Ｃ．；Ｋｏｎｉｎｇ，Ｆ．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ２０１２，６４，４５５．
（８）Ａｒｅｎｔｚ－Ｈａｎｓｅｎ，Ｈ．；Ｋｏｒｎｅｒ，Ｒ．；Ｍｏｌｂｅｒｇ，Ｏ．；Ｑｕａｒｓｔｅｎ，Ｈ．；Ｖａｄｅｒ，Ｗ．；Ｋｏｏｙ，Ｙ．Ｍ．；Ｌｕｎｄｉｎ，Ｋ．Ｅ．；Ｋｏｎｉｎｇ，Ｆ．；Ｒｏｅｐｓｔｏｒｆｆ，Ｐ．；Ｓｏｌｌｉｄ，Ｌ．Ｍ．；ＭｃＡｄａｍ，Ｓ．Ｎ．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ ２０００，１９１，６０３．

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【配列表】

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