知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
▶ バイオアプリケーションズ インコーポレイテッドの特許一覧
特許7430011動物の中性化用組換えタンパク質およびこれを含むワクチン組成物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-02-01
(45)【発行日】2024-02-09
(54)【発明の名称】動物の中性化用組換えタンパク質およびこれを含むワクチン組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 39/00 20060101AFI20240202BHJP
A61K 39/39 20060101ALI20240202BHJP
A61K 47/64 20170101ALI20240202BHJP
A61P 15/16 20060101ALI20240202BHJP
A61P 15/18 20060101ALI20240202BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20240202BHJP
C07K 14/59 20060101ALI20240202BHJP
C07K 14/575 20060101ALI20240202BHJP
C12N 15/16 20060101ALI20240202BHJP
C12N 15/31 20060101ALI20240202BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20240202BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20240202BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20240202BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240202BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20240202BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20240202BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240202BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240202BHJP
C07K 16/00 20060101ALI20240202BHJP
C07K 14/47 20060101ALI20240202BHJP
C07K 5/117 20060101ALI20240202BHJP
C07K 14/28 20060101ALI20240202BHJP
C12P 21/02 20060101ALN20240202BHJP
【ＦＩ】
A61K39/00 H ZNA
A61K39/39
A61K47/64
A61P15/16 171
A61P15/18 171
C07K19/00
C07K14/59
C07K14/575
C12N15/16
C12N15/31
C12N15/13
C12N15/12
C12N15/62 Z
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C07K16/00
C07K14/47
C07K5/117
C07K14/28
C12P21/02 C
【請求項の数】
17
(21)【出願番号】P 2022545872
(86)(22)【出願日】2021-03-12
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2023-03-17
(86)【国際出願番号】 KR2021003097
(87)【国際公開番号】W WO2021194142
(87)【国際公開日】2021-09-30
【審査請求日】2022-07-27
(31)【優先権主張番号】10-2020-0035898
(32)【優先日】2020-03-24
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(73)【特許権者】
【識別番号】519142114
【氏名又は名称】バイオアプリケーションズ インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】ＢＩＯＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ ＩＮＣ．
(74)【代理人】
【識別番号】110000729
【氏名又は名称】弁理士法人ユニアス国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ソン、ウン－ジュ
(72)【発明者】
【氏名】イ、ヨン ジク
【審査官】伊藤 良子
(56)【参考文献】
【文献】特表２００２－５１３７７０（ＪＰ，Ａ）
【文献】韓国登録特許第１０－２０５３００９（ＫＲ，Ｂ１）
【文献】米国特許出願公開第２０２０／００８５９２６（ＵＳ，Ａ１）
【文献】特許第７２３３１１６（ＪＰ，Ｂ２）
【文献】Vaccine，1994年，12(8)，pp.741-746
【文献】Mol Biotechnol.，2011年，48，pp.201-209
【文献】BioMed Research International，2014年，Volume 2014，Article ID 421486, pp.1-11
【文献】Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC)，2019年，138，pp.213-223
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ
Ａ６１Ｐ
Ｃ０７Ｋ
Ｃ１２Ｎ
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＣＴＢ（Ｃｈｏｌｅｒａ ｔｏｘｉｎ Ｂ ｓｕｂｕｎｉｔ）、ｎ個のＧｎＲＨ（Ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ－ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ）および豚のＦｃ断片（ｐｏｒｃｉｎｅ Ｆｃ ｆｒａｇｍｅｎｔ；ｐＦｃ２）が融合した組み換えタンパク質を有効成分として含み、前記ＣＴＢは、ＧｎＲＨのＮ末端方向に融合し、ｐＦｃ２は、ＧｎＲＨのＣ末端方向に融合し、及び、
前記ｎは、１～２０の整数である、動物の中性化ワクチン組成物。
【請求項2】
前記ＧｎＲＨは、配列番号１のアミノ酸配列からなることを特徴とする、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項3】
前記ＣＴＢは、配列番号４のアミノ酸配列からなることを特徴とする、請求項１又は２に記載のワクチン組成物。
【請求項4】
前記ｎは、６であることを特徴とする、請求項１～３のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
【請求項5】
前記ＧｎＲＨは、配列番号２のアミノ酸配列からなることを特徴とする、請求項４に記載のワクチン組成物。
【請求項6】
前記ＧｎＲＨは、ｎが２以上であるとき、それぞれ、アラニン－グリシン－アラニン（ａｌａｎｉｎｅ－ｇｌｙｃｉｎｅ－ａｌａｎｉｎｅ）リンカーで連結されたことを特徴とする、請求項１～５のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
【請求項7】
前記組み換えタンパク質において、シャペロン結合タンパク質（ｃｈａｐｅｒｏｎｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ；ＢｉＰ）、及び／又はＨＤＥＬ（Ｈｉｓ－Ａｓｐ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ）がさらに融合し、および、ＢｉＰ、ＣＴＢ、ＧｎＲＨ、ｐＦｃ２、およびＨＤＥＬが順次融合されることを特徴とする、請求項１～６のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
【請求項8】
前記ＢｉＰは、配列番号８のアミノ酸配列からなり、及び／又は前記ＨＤＥＬは、配列番号１１の塩基配列によってコードされることを特徴とする、請求項７に記載のワクチン組成物。
【請求項9】
前記ｐＦｃ２は、配列番号６のアミノ酸配列からなる、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項10】
前記組み換えタンパク質は、配列番号１２のアミノ酸配列からなることを特徴とする、請求項１～９のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
【請求項11】
前記ワクチン組成物は、アジュバント（ａｄｊｕｖａｎｔ）をさらに含むことを特徴とする、請求項１～９のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
【請求項12】
前記アジュバントは、エマルシゲン（Ｅｍｕｌｓｉｇｅｎ）系であることを特徴とする、請求項１１に記載のワクチン組成物。
【請求項13】
請求項１～１２のいずれか一項に記載のワクチン組成物をヒトを除いた動物に投与する段階を含む、動物の中性化方法。
【請求項14】
配列番号５のアミノ酸配列からなるＣＴＢ遺伝子、
配列番号３の塩基配列からなるＧｎＲＨ遺伝子、及び、
配列番号６のアミノ酸配列からなる豚のＦｃ断片（ｐｏｒｃｉｎｅ Ｆｃ ｆｒａｇｍｅｎｔ；ｐＦｃ２）をコードするポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、動物の中性化用組み換えベクター。
【請求項15】
ＣＴＢ（Ｃｈｏｌｅｒａ ｔｏｘｉｎ Ｂ ｓｕｂｕｎｉｔ）、ｎ個のＧｎＲＨ（Ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ－ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ）およびブタＦｃフラグメント（ｐＦｃ２）が融合した、動物の中性化用組み換えタンパク質であって、
前記ＣＴＢは、ＧｎＲＨのＮ末端方向に融合し、ｐＦｃ２は、ＧｎＲＨのＣ末端方向に融合し、及び、
前記ｎは、１～２０の整数である組換えタンパク質。
【請求項16】
請求項１４に記載の組み換えベクターで形質転換された、形質転換体。
【請求項17】
ＣＴＢ（Ｃｈｏｌｅｒａ ｔｏｘｉｎ Ｂ ｓｕｂｕｎｉｔ）、ｎ個のＧｎＲＨ（Ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ－ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ）および豚のＦｃ断片（ｐｏｒｃｉｎｅ Ｆｃ ｆｒａｇｍｅｎｔ；ｐＦｃ２）が融合し、前記ＣＴＢは、ＧｎＲＨのＮ末端方向に融合し、ｐＦｃ２は、ＧｎＲＨのＣ末端方向に融合し、及び、
前記ｎは、１～２０の整数である組換えタンパク質の、動物中性化に用いられるワクチンを製造するための使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、動物の中性化ワクチン組成物に関し、より具体的に、性腺刺激ホルモン放出ホルモン（Ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ－ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ；ＧｎＲＨ）に対する抗体を誘導するための動物の中性化用組換えタンパク質、これを生産するための組換えベクター、前記組換えタンパク質を有効成分として含む動物の中性化ワクチン組成物およびこれを用いた中性化方法などに関する。
【0002】
本出願は、２０２０年３月２４日に出願された韓国特許出願第１０－２０２０－００３５８９８号に基づく優先権を主張し、当該出願の明細書および図面に開示されたすべての内容は、本出願に援用される。
【背景技術】
【0003】
中性化とは、動物の生殖腺を除去して生殖機能をなくすことであり、雄性の場合、睾丸を、雌性の場合、卵巣を除去することによって、性腺ホルモンの分泌が断絶されて生殖不能となり、第二次性徴が出現しなかったり退化する現象が起こる。中性化は、医学、生物学、畜産学などにおいて研究および利用価値の増大を目的で行われている。特に、畜産業において中性化は、動物の病気治療だけでなく、その利用価値を高めるために実行され、主に雄性にのみ行われるが、これは、卵巣を除去する手術が極めて難しいだけでなく、その効果も少ないためである。中性化手術を受けた雄性動物の場合、性質が穏やかになって飼育が容易であり、交尾能力の喪失によって雌雄の混用飼育が可能であり、筋肉繊維が細くてやわらかくなって、雌性のように肉質が良くなり、骨が細くなって、肉のついている比率が高まる。また、雄臭の発生を減少させて雄の臭いを低減する。
【0004】
中性化方法としては、外科的な手術として挫切式、精系結糸式、捻転式、被睾結糸式、牽断式、部分去勢、無血去勢式などがあり、その他、生殖腺に敏感な放射線を一定量以上照射してその能力を喪失させる方法もある。しかし、物理的中性化は、動物に非常に深刻な苦痛およびストレスを発生させるので、動物福祉次元で問題となっており、スイス、ノルウェー、ベルギー、オランダなどのヨーロッパ国家の場合、約２００９年頃に動物の物理的中性化を禁止することに決定し、韓国でもこれと類似した措置を検討している。
【0005】
したがって、最近では、中性化手術の問題点を解決するための方法として、ワクチンを用いた中性化方法が活発に研究されている。ワクチンを用いた中性化方法は、ほとんどＧｎＲＨ（ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ－ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ）に対する免疫反応を誘導できるタンパク質を用いて実施するが、その理由は、視床下部で分泌されるＧｎＲＨが脳下垂体の濾胞刺激ホルモン放出ホルモン（ＦＳＨ）と黄体形成ホルモン（ＬＨ）の分泌を刺激するためである。ＦＳＨは、濾胞の成熟、エストロゲンの分泌および精子形成を促進させ、ＬＨは、生殖器官の発達、テストステロンの分泌および排卵を促進させる。また、ＬＨとＦＳＨは、雄性動物の精巣でアンドロステノン（Ａｎｄｒｏｓｔｅｎｏｎｅ）の分泌を促進させ、アンドロステノンが脂肪組織に蓄積されて雄臭を発生させる。
【0006】
現在まで開発された中性化ワクチンとしては、ファイザー社のインプロバック（Ｉｍｐｒｏｖａｃ）があるが、強力な免疫反応を誘導しない短所を持っている。これによって、本発明者らは、既存の中性化ワクチンより強力な免疫反応を誘導するワクチンを開発しようと研究しているところ、本発明のＣＴＢ－ＧｎＲＨ組換えタンパク質が従前に知られた中性化ワクチンより優れた抗原性を持っていて、ＧｎＲＨに対する卓越した抗体形成効果およびこれによる強力な動物の性成熟抑制効果を示すことを確認することによって、本発明を完成するに至った。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明は、上述したような従来技術上の問題点を解決するためになされたものであって、人為的に性腺刺激ホルモン放出ホルモン（Ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ－ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ；ＧｎＲＨ）の抗原性を向上させるために、キャリア（ｃａｒｒｉｅｒ）タンパク質と融合した動物の中性化用組換えタンパク質を含むワクチンを開発して、本発明を完成した。
【0008】
これより、本発明の目的は、ＣＴＢ（Ｃｈｏｌｅｒａ ｔｏｘｉｎ Ｂ ｓｕｂｕｎｉｔ）およびｎ個のＧｎＲＨ（Ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ－ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ）が融合した組換えタンパク質を有効成分として含み、前記ｎは、１～２０の整数である、動物の中性化ワクチン組成物を提供することにある。
【0009】
本発明の他の目的は、本発明によるワクチン組成物をヒトを除いた動物に投与する段階を含む、動物の中性化方法を提供することにある。
【0010】
本発明のさらに他の目的は、配列番号３の塩基配列からなるＧｎＲＨ遺伝子および配列番号５の塩基配列からなるＣＴＢ遺伝子を含む、動物の中性化用組換えベクターを提供することにある。
【0011】
本発明のさらに他の目的は、本発明による組換えベクターを用いて製造した動物の中性化用組換えタンパク質を提供することにある。
【0012】
本発明のさらに他の目的は、本発明による組換えベクターで形質転換された、形質転換体を提供することにある。
【0013】
しかしながら、本発明が解決しようとする技術的課題は、以上で言及した課題に制限されず、言及されていない他の課題は、下記の記載から本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者に明確に理解され得る。
【課題を解決するための手段】
【0014】
上記のような本発明の目的を達成するために、ＣＴＢ（Ｃｈｏｌｅｒａ ｔｏｘｉｎ Ｂ ｓｕｂｕｎｉｔ）およびｎ個のＧｎＲＨ（Ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ－ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ）が融合した組換えタンパク質を有効成分として含み、前記ｎは、１～２０の整数である、動物の中性化ワクチン組成物を提供する。
【0015】
また、本発明は、ＣＴＢおよびｎ個のＧｎＲＨが融合した組換えタンパク質を有効成分として含み、前記ｎは、１～２０の整数であるワクチン組成物をヒトを除いた個体に投与して中性化する方法を提供する。
【0016】
また、本発明は、ＣＴＢおよびｎ個のＧｎＲＨが融合し、前記ｎは、１～２０の整数である組換えタンパク質の中性化用途を提供する。
【0017】
さらに、本発明は、ＣＴＢおよびｎ個のＧｎＲＨが融合し、前記ｎは、１～２０の整数である組換えタンパク質の中性化に用いられるワクチンを生産するための用途を提供する。
【0018】
本発明の一具現例において、前記ＧｎＲＨは、配列番号１のアミノ酸配列からなってもよいが、これに制限されるものではない。
【0019】
本発明の他の具現例において、前記ＣＴＢは、配列番号４のアミノ酸配列からなってもよいが、これに制限されるものではない。
【0020】
本発明のさらに他の具現例において、前記ｎは、６であってもよいが、これに制限されるものではない。
【0021】
本発明のさらに他の具現例において、前記ｎが６である場合、ＧｎＲＨは、配列番号２のアミノ酸配列からなってもよいが、これに制限されるものではない。
【0022】
本発明のさらに他の具現例において、前記ＧｎＲＨは、ｎが２以上であるとき、それぞれアラニン－グリシン－アラニンリンカー（ａｌａｎｉｎｅ－ｇｌｙｃｉｎｅ－ａｌａｎｉｎｅ ｌｉｎｋｅｒ）で連結されてもよいが、これに制限されるものではない。
【0023】
本発明の一具現例において、前記組換えタンパク質は、豚の免疫グロブリンＦｃ断片（ｐｏｒｃｉｎｅ Ｆｃ ｆｒａｇｍｅｎｔ；ｐＦｃ２）がさらに融合してもよい。
【0024】
本発明の他の具現例において、前記ｐＦｃ２は、配列番号６のアミノ酸配列からなってもよいが、これに制限されるものではない。
【0025】
本発明のさらに他の具現例において、前記ＣＴＢは、ＧｎＲＨのＮ末端方向に融合し、前記ｐＦｃ２は、ＧｎＲＨのＣ末端方向に融合してもよいが、これに制限されるものではない。
【0026】
本発明の一具現例において、前記組換えタンパク質は、ＢｉＰ（ｃｈａｐｅｒｏｎｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）がさらに融合してもよい。
【0027】
本発明の他の具現例において、前記ＢｉＰは、配列番号８のアミノ酸配列からなってもよいが、これに制限されるものではない。
【0028】
本発明のさらに他の具現例において、前記ＣＴＢは、ＧｎＲＨのＮ末端方向に融合し、前記ＢｉＰは、ＣＴＢのＮ末端方向に融合してもよいが、これに制限されるものではない。
【0029】
本発明の一具現例において、前記組換えタンパク質は、ＨＤＥＬ（Ｈｉｓ－Ａｓｐ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ）がさらに融合してもよい。
【0030】
本発明の他の具現例において、前記ＨＤＥＬは、配列番号１１の塩基配列によってコードされるものであってもよいが、これに制限されるものではない。
【0031】
本発明のさらに他の具現例において、前記ＣＴＢは、ＧｎＲＨのＮ末端方向に融合し、前記ＨＤＥＬは、ＧｎＲＨのＣ末端方向に融合してもよいが、これに制限されるものではない。
【0032】
また、本発明の一具現例において、前記組換えタンパク質は、ＢｉＰ、ＣＴＢ、ＧｎＲＨ、ｐＦｃ２およびＨＤＥＬが順次に融合したものであってもよいが、これに制限されるものではない。
【0033】
本発明の他の具現例において、前記組換えタンパク質は、配列番号１２のアミノ酸配列からなってもよいが、これに制限されるものではない。
【0034】
本発明の一実施例において、前記ワクチン組成物は、アジュバント（ａｄｊｕｖａｎｔ）をさらに含んでもよい。
【0035】
本発明の他の具現例において、前記アジュバントは、エマルシゲン（Ｅｍｕｌｓｉｇｅｎ）系であってもよいが、これに制限されるものではない。
【0036】
また、本発明は、本発明によるワクチン組成物をヒトを除いた動物に投与する段階を含む、動物の中性化方法を提供する。
【0037】
本発明の一具現例において、前記動物は、犬、鯨、猫、ゴリラ、ガチョウ、ギニアピッグ、キジ、ラクダ、ノロ、ラバ、鶏、ロバ、イルカ、豚、ラマ、馬、水牛、鹿、牛、トナカイ、アルパカ、ヤク、羊、ヤギ、オランウータン、鴨、猿、フェレット、マウス、七面鳥、ダチョウまたはウサギであってもよいが、これに制限されるものではない。
【0038】
また、本発明は、配列番号３の塩基配列からなるＧｎＲＨ遺伝子および配列番号５の塩基配列からなるＣＴＢ遺伝子を含む、動物の中性化用組換えベクターを提供する。
【0039】
本発明の一具現例において、前記組換えベクターは、配列番号６のアミノ酸配列からなるｐＦｃ２をコードするポリヌクレオチドをさらに含んでもよいが、これに制限されるものではない。
【0040】
本発明の他の具現例において、前記組換えベクターは、配列番号８のアミノ酸配列からなるＢｉＰをコードするポリヌクレオチドをさらに含んでもよいが、これに制限されるものではない。
【0041】
本発明のさらに他の具現例において、前記組換えベクターは、配列番号１１の塩基配列からなるＨＤＥＬ遺伝子をさらに含んでもよいが、これに制限されるものではない。
【0042】
本発明のさらに他の具現例において、前記組換えベクターは、配列番号１２のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドまたは配列番号１３の塩基配列を含んでもよいが、これに制限されるものではない。
【0043】
また、本発明は、本発明による組換えベクターを用いて製造した動物の中性化用組換えタンパク質を提供する。
【0044】
また、本発明は、本発明による組換えベクターで形質転換された、形質転換体を提供する。
【発明の効果】
【0045】
本発明は、ＣＴＢ（Ｃｈｏｌｅｒａ ｔｏｘｉｎ Ｂ ｓｕｂｕｎｉｔ）およびＧｎＲＨ（Ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ－ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ）が融合した組換えタンパク質を含む、動物の中性化ワクチン組成物などに関し、ＧｎＲＨのポリペプチド配列を含む組換えタンパク質を用いてこれを投与した個体にＧｎＲＨに対する抗体を誘導し、これを通じて卵巣および睾丸の萎縮効果を確認した。したがって、本発明は、低い費用、高い安全性および最小限の副作用で動物を中性化するのに有用に用いられる。
【図面の簡単な説明】
【0046】
【図1】図１は、本発明の一実施例による組換えＧｎＲＨタンパク質の製造のための発現カセット（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃａｓｓｅｔｔｅ）を示す図である（ＢｉＰ，ｃｈａｐｅｒｏｎｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ；ＣＴＢ，Ｃｈｏｌｅｒａ ｔｏｘｉｎ Ｂ ｓｕｂｕｎｉｔ；ｐＦｃ２，ｐｏｒｃｉｎｅ Ｆｃ ｆｒａｇｍｅｎｔ；ＨＤＥＬ，Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ－Ａｓｐａｒｔｉｃ ａｃｉｄ－Ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ－Ｌｅｕｃｉｎｅ）。
【図5】図５は、本発明の一実施例による組換えＧｎＲＨタンパク質が含まれたワクチン組成物を雄性ラットに３回投与した後、血中テストステロンの濃度を測定した結果を示す図であり、上段および中断の図は、スタンダードを、下段の図は、各グループの測定結果を示す図である。
【図7】図７および図８は、本発明の一実施例による中性化ワクチンによってＧｎＲＨに対する抗体が生成されたか否かを確認するために実施した血清の抗原－抗体反応結果を示す図であり、図７は、ＣＴＢ－ＧｎＲＨを含むワクチン組成物を、図８は、Ｆｅ－ＧｎＲＨを含むワクチン組成物を投与した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0047】
本発明者らは、組換え性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）タンパク質を４週齢の雄性および雌性ラットに接種した後、それによる睾丸または卵巣のサイズおよび重量の変化、血中性ホルモン濃度の変化を分析した。その結果、本発明の組換えＧｎＲＨタンパク質でワクチン化された群が、対照群と比較して睾丸または卵巣のサイズおよび重量が減少し、血中性ホルモンの濃度が減少したことを確認することによって、本発明による組換えＧｎＲＨタンパク質を含むワクチン組成物が中性化効果を有することを確認して、本発明を完成した。
【0048】
これより、本発明は、ＣＴＢ（Ｃｈｏｌｅｒａ ｔｏｘｉｎ Ｂ ｓｕｂｕｎｉｔ）およびｎ個のＧｎＲＨ（Ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ－ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ）が融合した組換えタンパク質を有効成分として含み、前記ｎは、１～２０の整数である、動物の中性化ワクチン組成物を提供することができる。
【0049】
本明細書において使用された用語「ＣＴＢ（Ｃｈｏｌｅｒａ ｔｏｘｉｎ Ｂ ｓｕｂｕｎｉｔ）」または「コレラ毒素Ｂサブユニット」は、宿主細胞に対する結合活性を有するポリペプチドを称するものであって、好ましくは配列番号５の塩基配列を含むポリヌクレオチドによりコードされ、最も好ましくは配列番号５で表されるポリヌクレオチドによりコードされるが、配列番号５の塩基配列と８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の配列相同性を有する塩基配列によりコードされ得る。例えば、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％の配列相同性を有するポリヌクレオチドを含む。ポリヌクレオチドに対する「配列相同性の％」は、二つの最適に配列された配列と比較領域を比較することによって確認され、比較領域におけるポリヌクレオチド配列の一部は、二つの配列の最適配列に対する参考配列（追加または削除を含まない）に比べて追加または削除（すなわちギャップ）を含んでもよい。コレラ毒素は、Ａ１およびＡ２サブユニットと５個のＢサブユニットが結合した形態の複合体であり、コレラ毒素の内在化および活性化のためにＣＴＢが粘膜免疫系（ｍｕｃｏｓａｌ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ）のＭ細胞（ｍｉｃｒｏｆｏｌｄ ｃｅｌｌ）に結合する。この際、ＣＴＢは、細胞膜二重層のＧＭ１－ガングリオシド（ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ）と特異的に反応して結合した後に、ＣＴＢに結合されているＡサブユニットまたは抗原タンパク質が細胞膜を通過するようにする。ＣＴＢは、粘膜障壁を通過する結合抗原の吸収増加および結合抗原の効率的な提示を通じて抗原の免疫原性を改善して、粘膜免疫強化のための強力な粘膜アジュバント（ａｄｊｕｖａｎｔ）および輸送体（ｃａｒｒｉｅｒ）分子として用いられる。
【0050】
本明細書において使用された用語「ポリヌクレオチド」は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）を含む、一般的にリン酸ジエステル結合により互いに結合した２以上の連結されたヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体を含むオリゴマーまたはポリマーを示す。ポリヌクレオチドは、また、例えばヌクレオチド類似体、またはリン酸ジエステル結合以外の「骨格」結合、例えばリン酸トリエステル結合、ホスホルアミダート結合、ホスホロチオエート結合、チオエステル結合またはペプチド結合（ペプチド核酸）を含むＤＮＡおよびＲＮＡ誘導体を含む。ポリヌクレオチドは、一本鎖および／または二本鎖ポリヌクレオチド、例えばデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）だけでなく、ＲＮＡまたはＤＮＡのうちいずれか一つの類似体を含む。
【0051】
本明細書において使用された用語「ＧｎＲＨ（ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ－ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ）」は、性腺刺激ホルモン放出ホルモンを意味するものであって、好ましくは配列番号１のアミノ酸配列からなるＧｎＲＨや、ＧｎＲＨに対する免疫反応を誘導できるものであれば、これに制限されない。また、本発明のＧｎＲＨは、配列番号１の変異体が本発明の範囲に含まれる。具体的に、前記ペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列と８０％以上、より好ましくは９０％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。ＧｎＲＨは、１０個のアミノ酸から構成され、すべての動物においてほぼ同じアミノ酸から構成されているものと知られている。ＧｎＲＨは、視床下部で生成されて脳下垂体に作用することによって、性ホルモンであるＦＳＨおよびＬＨの生成を促進させるが、ＧｎＲＨを抗原として用いて動物に接種する場合、ＧｎＲＨを認識する抗体が形成され、前記抗体が体内で存在するＧｎＲＨを除去することによって、雄性および雌性動物の性成熟が遮断されて中性化効果が発生することになる。
【0052】
本明細書において使用された用語「組み換えタンパク質」または「融合した組み換えタンパク質」は、２種以上のタンパク質が人為的に連結された形態のタンパク質を意味し、本発明では、ＣＴＢとＧｎＲＨが連結された形態のタンパク質を意味する。上記のように融合した組み換えタンパク質は、それぞれのパートナーが決定された後、化学的に合成したりまたは遺伝子組換え方法で発現および精製して収得することができる。好ましくは、ＣＴＢをコードするポリヌクレオチドとＧｎＲＨをコードするポリヌクレオチドを連結した融合遺伝子を細胞発現システムで発現させて収得することができる。
【0053】
本発明の組み換えタンパク質に使用されるＧｎＲＨは、ＧｎＲＨアミノ酸配列の１コピー（ｏｎｅ ｃｏｐｙ）よりは、２またはそれ以上のコピー（ｔｗｏ ｏｒ ｍｏｒｅ ｃｏｐｉｅｓ）を有することが好ましい。このような多重コピー（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｏｐｙ）を有する場合、ＧｎＲＨに対する免疫原性をさらに増強させることができるので、ＧｎＲＨのアミノ酸配列、好ましくは配列番号１のアミノ酸配列が２個以上の多量体を取ることができる。ＧｎＲＨの個数は、発現ベクター内で受け入れ可能であれば、特別な制限はないが、好ましくは２個～２０個、より好ましくは２個～１０個が連結された多量体の形態を取ることができ、さらに好ましくは６個が連結された六量体を使用することができる。本発明の具体的な実施例では、ＧｎＲＨタンパク質が連続的に６回繰り返されるように製作した。前記６個のＧｎＲＨが連結されたポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列からなり得るが、これに制限されるものではない。
【0054】
また、このような融合組み換えタンパク質は、ＣＴＢとＧｎＲＨが直接連結されたり、リンカーのようなアミノ酸連結子を介して連結され得る。また、ＧｎＲＨが複数コピー含まれる場合にも、各ＧｎＲＨは、直接連結されたり、リンカーのような連結子を介して連結され得る。リンカーを介して連結される場合、これによる全体免疫原性（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）を減少させないことが好ましい。
【0055】
本明細書において使用された用語「リンカー」とは、ＣＴＢとＧｎＲＨを連結して組み換えタンパク質を作る場合または数個のＧｎＲＨを連結させる場合、これらタンパク質の構造的柔軟性を増加させて結合させた各タンパク質の活性が増進され得るようにタンパク質とタンパク質の間に挿入するペプチドを意味する。リンカーは、免疫反応を最小化できるものであれば、その種類やアミノ酸の個数は制限がないが、好ましくはアミノ酸１個～２０個、より好ましくはアミノ酸１個～５個が好ましい。本発明の具体的な実施例では、各タンパク質を連結させるために、ベクターのマルチクローニングサイトにある制限酵素部位の配列を使用したり、アラニン－グリシン－アラニン（ＡＧＡ）リンカーを使用した。
【0056】
本明細書において使用された用語「ワクチン（ｖａｃｃｉｎｅ）」は、生体に免疫反応を起こす抗原を含有する生物学的な製剤であって、感染症の予防または特定抗原に対する抗体を誘導するために、動物に注射したり経口投与することによって、生体に免疫が生じるようにする免疫原をいう。前記動物は、非ヒト動物であって、その例は、後述する。
【0057】
本発明の「ワクチン組成物」は、それぞれ、通常の方法によって散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エアロゾルなどの経口型剤形および滅菌注射溶液の形態に剤形化して使用できる。製剤化する場合には、通常使用される充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を使用して調製することができる。経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、このような固形製剤は、前記レシチン類似乳化剤に少なくとも一つ以上の賦形剤、例えば、デンプン、カルシウムカーボネート（ｃａｌｃｉｕｍ ｃａｒｂｏｎａｔｅ）、スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）またはラクトース（ｌａｃｔｏｓｅ）、ゼラチンなどを混ぜて調製することができる。また、単純な賦形剤以外にマグネシウムステアレート、タルクのような潤滑剤をも使用することができる。経口投与のための液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などを使用することができ、頻繁に使用される単純希釈剤である水、リキッドパラフィン以外に様々な賦形剤、例えば湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれ得る。非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水溶性製剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤が含まれる。非水溶性製剤、懸濁剤としては、プロピレングリコール（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性オイル、エチルオレートのような注射可能なエステルなどが使用できる。
【0058】
本発明によるワクチン組成物の投与経路は、これらに限定されるものではないが、口腔、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、硬膜内、心臓内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸管、局所、舌下または直腸が含まれる。経口または非経口投与が好ましい。本願に使用された用語「非経口」は、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、滑液嚢内、胸骨内、硬膜内、病巣内および頭蓋骨内注射または注入技術を含む。本発明のワクチン組成物は、また、直腸投与のための坐剤の形態で投与されることもできるが、前記列挙した投与方法に限定されず、活性物質が標的細胞に移動できる任意の装置により投与され得る。本発明によるワクチン組成物は、体液性または選択的に細胞－媒介性免疫反応および／または前記二つの免疫反応の組合せを誘導することができる。
【0059】
本発明によるワクチン組成物の投与量は、個体の年齢、体重、性別、身体状態などを考慮して選択される。特別な副作用なしに個体に免疫反応を誘導するのに必要な量は、免疫原として使用された組み換えタンパク質および賦形剤の任意存在によって多様になり得る。
【0060】
一方、本発明による動物の中性化ワクチン組成物は、抗原、薬剤学的許容可能な担体、適切な補助剤、その他通常の物質から構成され得、免疫学的効果量で投与する。本明細書において使用された用語「免疫学的効果量」とは、動物で中性化効果を示すことができるほどの十分な量と副作用や深刻なまたは過度な免疫反応を起こさないほどの量を意味し、正確な投与濃度は、投与される特定の免疫原によって変わり、免疫反応の発生を検査するために当業者が公知の方法を用いてこれを決定することができる。また、投与形態および経路、受容者の年齢、健康および体重、症状の特性および程度、現在の治療法の種類、および治療回数によって変化することができる。
【0061】
また、本発明による組み換えタンパク質は、豚の免疫グロブリンＦｃ断片（ｐｏｒｃｉｎｅ Ｆｃ ｆｒａｇｍｅｎｔ；ｐＦｃ２）がさらに融合したものでありうる。前記ｐＦｃ２は、ＧｎＲＨのＣ末端方向に融合することができるが、これに制限されるものではない。
【0062】
本明細書において使用された用語「Ｆｃ断片（Ｆｃ ｆｒａｇｍｅｎｔ）」とは、免疫グロブリンがパパイン（ｐａｐａｉｎ）により消化されたとき、重鎖（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ；Ｈ ｃｈａｉｎ）部分のみがＳ－Ｓ結合で連結され、抗原結合部位を有しない部分をＦｃ断片と言い、本発明のＦｃ断片は、好ましくは豚のＦｃ断片であり、より好ましくは配列番号６のアミノ酸配列からなる豚のＦｃ断片や、組み換えタンパク質と融合したとき、組み換えタンパク質の発現量および溶解性を増加させるＦｃ断片であれば、これに制限されない。また、本発明のＦｃ断片は、配列番号６の変異体が本発明の範囲に含まれる。具体的に、前記ペプチドは、配列番号６のアミノ酸配列と９０％以上、より好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。
【0063】
また、本発明による組み換えタンパク質は、ＢｉＰ（ｃｈａｐｅｒｏｎｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）がさらに融合したものでありうる。前記ＢｉＰは、ＧｎＲＨまたはＣＴＢのＮ末端方向に融合することができるが、これに制限されるものではない。
【0064】
本明細書において使用された用語「ＢｉＰ（ｃｈａｐｅｒｏｎｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）」は、発現した組み換えタンパク質を小胞体に移動させるために使用されたものであって、好ましくは配列番号８のアミノ酸配列からなるＢｉＰや、組み換えタンパク質と融合したとき、組み換えタンパク質を小胞体に移動させるＢｉＰであれば、これに制限されない。また、本発明のＢｉＰは、配列番号８の変異体が本発明の範囲に含まれる。具体的に、前記ペプチドは、配列番号８のアミノ酸配列と９０％以上、より好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。前記ＢｉＰは、発現するときまたは発現した後、ペプチドの一部が切られて、一部のペプチドのみが残ることがある。
【0065】
また、本発明による組み換えタンパク質は、ＨＤＥＬ（Ｈｉｓ－Ａｓｐ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ）がさらに融合したものでありうる。前記ＨＤＥＬは、ＧｎＲＨまたはｐＦｃ２のＣ末端方向に融合することができるが、これに制限されるものではない。
【0066】
本明細書において使用された用語「ＨＤＥＬ」は、ヒスチジン－アスパラギン酸－グルタミン酸－ロイシンよりなる標的ペプチド配列を意味するものであって、前記ＨＤＥＬは、組み換えタンパク質が小胞体（ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ）から分泌されるのを防止したり、小胞体内で安定的に維持され得るようにする。前記ＨＤＥＬは、配列番号１１の塩基配列によりコードされるものでありうるが、これに制限されるものではない。
【0067】
また、本発明による組み換えタンパク質は、ＢｉＰ、ＣＴＢ、ＧｎＲＨ、ｐＦｃ２およびＨＤＥＬが順次に融合したものであり得、これによる前記組み換えタンパク質は、配列番号１２のアミノ酸配列からなるものでありうるが、前記融合順序またはアミノ酸配列により本発明が制限されるものではない。
【0068】
また、本発明によるワクチン組成物は、犬または猫の中性化に卓越した効果がある。
【0069】
また、本発明によるワクチン組成物には、免疫反応を改善または強化させるために、一つ以上のアジュバント（ａｄｊｕｖａｎｔ）を含んでもよい。
【0070】
本明細書において使用された用語「アジュバント（Ａｄｊｕｖａｎｔ）」とは、ワクチンまたは薬学的に活性がある成分に添加されて、免疫反応を増加させたり影響を与える物質または組成物をいう。代表的に、免疫原（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ）用キャリアまたは補助物質および／または他の薬学的に活性がある物質または組成物を通常的に意味する。典型的に、用語「アジュバント」は、広い概念で解されるべきであり、前記アジュバントに統合されたり前記アジュバントとともに投与された抗原の免疫原性（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）を増進させることができる広い範囲の物質または策略（ｓｔｒａｔａｇｅｒｍ）を意味する。また、アジュバントは、これに制限されず、免疫強化剤（ｉｍｍｕｎｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｔｏｒ）、抗原伝達系またはこれらの組合せに分けられる。適切なアジュバントの例として、アルミニウムヒドロキシド、フロイド完全または不完全アジュバント、ＤＥＡＥデキストラン、レバミゾール、ＰＣＧおよびｐｏｌｙ Ｉ：Ｃまたはｐｏｌｙ Ａ：Ｕを含んでもよい。本発明の一実施例では、エマルシゲン（Ｅｍｕｌｓｉｇｅｎ）系アジュバントとしてＤＤＡ（ｄｉｍｅｔｈｙｌｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）を含むエマルシゲン－Ｄアジュバントを使用した。
【0071】
本発明による組み換えタンパク質は、野生型（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）のアミノ酸配列を有するタンパク質だけでなく、融合した組み換えタンパク質の変異体を含む。組み換えタンパク質の変異体とは、正常アミノ酸配列と一つ以上のアミノ酸残基が欠失、挿入、非保全的または保全的置換またはこれらの組合せによって異なる配列を有するタンパク質を意味する。分子の活性を全体的に変更させないタンパク質およびペプチドレベルでのアミノ酸交換は、当該分野に公知となっている（Ｈ．Ｎｅｕｒａｔｈ ｅｔ ａｌ．，１９７９）。また、前記組み換えタンパク質は、リン酸化（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）、メチル化（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）、硫化（ｓｕｌｆａｔｉｏｎ）、アクリル化（ａｃｒｙｌａｔｉｏｎ）、糖化（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）、ファルネシル化（ｆａｒｎｅｓｙｌａｔｉｏｎ）などで修飾（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）されることもできる。前記変異体または修飾体は、天然タンパク質と同じ生物学的活性を示す機能的等価物であるが、必要によっては、そのタンパク質の特性を変形させた変異体または修飾体でありうる。好ましくは、アミノ酸配列上の変異と修飾によってタンパク質の熱、ｐＨなどに対する構造的安定性が増加したり、タンパク質活性が増加したものである。
【0072】
本発明による組み換えＧｎＲＨタンパク質は、化学的に合成したり、遺伝子組換え方法を通じて生産することができ、好ましくは組み換えベクターを用いてこれを宿主細胞に形質転換させて、これから発現したタンパク質を分離、精製して生産することができる。
【0073】
したがって、本発明の他の様態として、本発明は、配列番号３の塩基配列からなるＧｎＲＨ遺伝子および配列番号５の塩基配列からなるＣＴＢ遺伝子を含む、動物の中性化用組み換えベクターを提供することができる。
【0074】
組み換えベクターは、通常、外来ＤＮＡの断片が挿入されたキャリアであって、一般的に二本鎖のＤＮＡの断片を意味する。本明細書において「外来ＤＮＡ」とは、外来種から起源するＤＮＡを意味したり、同じ種から起源する場合には、本来の形態から実質的に変形された形態を意味し、外来遺伝子は、転写される特定の目的核酸でポリペプチドをコードする。組み換えベクターは、宿主細胞で形質転換された遺伝子の発現レベルを高めるためには、当該遺伝子が選択された発現宿主内で機能を発揮する転写および翻訳発現調節配列に作動可能に連結されなければならない。前記組み換えベクターは、個体の細胞内で遺伝子挿入物が発現するように作動可能に連結された必須の調節要素を含む遺伝子構築物であって、このような遺伝子構築物を製造するために、標準組み換えＤＮＡ技術を用いることができる。組み換えベクターの種類は、原核細胞および真核細胞の各種宿主細胞で目的する遺伝子を発現し、目的とするタンパク質を生産する機能をすれば、特に限定されないが、強力な活性を示すプロモーターと強い発現力を保有しつつ、自然状態と類似した形態の外来タンパク質を大量で生産できるベクターが好ましい。組み換えベクターは、少なくとも、プロモーター、開始コドン、目的とするタンパク質を暗号化する遺伝子、終止コドンおよびターミネーターを含んでいることが好ましい。その他に、シグナルペプチドをコードするＤＮＡ、エンハンサー配列、目的とする遺伝子の５’末端および３’末端の非翻訳領域（ＵＴＲ）、選別マーカー領域、または複製可能単位などを適切に含むこともできる。
【0075】
本発明の具体的な実施例では、６コピーのＧｎＲＨ遺伝子断片が含まれたｐＣＡＭＢＩＡ１３０００ベクターにＣＴＢ遺伝子断片を挿入して製造した組み換えベクターをタバコ植物（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）に形質転換した。前記ベクターは、３５ＳプロモーターとＨＳＰ（ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ）ターミネーターシステムを有しており、タバコ植物でタンパク質を大量生産するのに有用なベクターである。
【0076】
本明細書において使用された用語「ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）」とは、適合した宿主内でＤＮＡを発現させることができる適合した調節配列に作動可能に連結されたＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ製造物を意味する。ベクターは、プラスミド、ファージ粒子、または簡単に潜在的遺伝体（ｇｅｎｏｍｅ）挿入物でありうる。適当な宿主に形質転換されれば、ベクターは、宿主のゲノムと関係なく複製し機能することができるか、または場合によっては、ゲノムそれ自体に統合され得る。プラスミドが現在ベクターの最も通常的に使用される形態であるから、用語「プラスミド（ｐｌａｓｍｉｄ）」および「ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）」は、時には相互交換的に使用できる。しかしながら、本発明は、当業界に知られたまたは知られることになるものと同等な機能を有するベクターの他の形態を含む。
【0077】
また、本発明において前記組み換えベクターは、配列番号６のアミノ酸配列からなるｐＦｃ２をコードするポリヌクレオチド、配列番号８のアミノ酸配列からなるＢｉＰをコードするポリヌクレオチドおよび配列番号１１の塩基配列からなるＨＤＥＬ遺伝子よりなる群から選択される１種以上の配列がさらに含まれ得る。
【0078】
本発明のさらに他の様態として、本発明は、本発明による組み換えベクターを用いて製造した動物の中性化用組み換えタンパク質を提供することができる。
【0079】
また、本発明の他の様態として、本発明は、本発明による組み換えベクターで形質転換された、形質転換体を提供することができる。
【0080】
本明細書において使用された用語「形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）」とは、注入されたＤＮＡにより生物の遺伝的な性質が変わることを総称し、「形質転換体（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｏｒｇａｎｉｓｍまたはｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔ）」とは、分子遺伝学的方法で外部の遺伝子を注入して製造された有機体であって、好ましくは本発明の組み換えベクターにより形質転換された有機体であり、前記有機体は、本発明の目的を達成するためのものであれば、制限がない。
【0081】
本発明のさらに他の様態として、本発明は、本発明によるワクチン組成物をヒトを除いた動物に投与する段階を含む、動物の中性化方法を提供することができる。
【0082】
本発明のワクチン組成物を用いた中性化方法は、動物種に関係なく、ヒトを除いたすべての動物に適用可能である。前記動物は、哺乳動物が好ましく、例えば犬、鯨、猫、ゴリラ、ガチョウ、ギニアピッグ、キジ、ラクダ、ノロ、ラバ、鶏、ロバ、イルカ、豚、ラマ、馬、スイギュウ、鹿、牛、トナカイ、アルパカ、ヤク、羊、ヤギ、オランウータン、鴨、猿、フェレット、マウス、七面鳥、ダチョウまたはウサギを例示することができるが、これに制限されるものではない。
【0083】
本発明の方法において、投与は、２回以上実施することが好ましい。例えば、１次接種（ｉｎｉｔｉａｌ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ）後にブースター接種（ｂｏｏｓｔｅｒ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎｓ）を１週～１０週間隔で１回～４回程度実施することができるが、これは、当該動物の種類によって当業者が適切に変形して実施することができる。
【0084】
本明細書および請求範囲に使用された用語や単語は、通常的または事前的な意味に限定して解されるべきものではなく、発明者は、自分の発明を最も最善の方法で説明するために用語の概念を適切に定義することができるという原則に基づいて本発明の技術的思想に符合する意味と概念として解されなければならない。
【0085】
以下、本発明の理解を助けるための好ましい実施例を提示する。しかしながら、下記の実施例は本発明をより容易に理解するために提供されるものに過ぎず、下記の実施例により本発明の内容が限定されるものではない。
【実施例】
【0086】
［実施例］
実施例１：ＢｉＰ－ＣＴＢ－ＧｎＲＨ－ｐＦｃ２－ＨＤＥＬ融合タンパク質の発現および精製
ＧｎＲＨに対する免疫原性を誘導するために、図１に示されたように、ＧｎＲＨにＣＴＢ、ｐＦｃ２、ＢｉＰおよびＨＤＥＬを融合した組み換えＧｎＲＨを発現させるためのベクターを製作した。１０個のアミノ酸から構成されたＧｎＲＨは、６個が連続するようにしてアラニン－グリシン－アラニン（ＡＧＡ）リンカーで連結した。６個が連結されたＧｎＲＨのアミノ酸配列および塩基配列は、それぞれ、配列番号２および配列番号３に示した。また、ＣＴＢに対するアミノ酸配列および塩基配列は、それぞれ、配列番号４および配列番号５に、ｐＦｃ２に対するアミノ酸配列および塩基配列は、それぞれ、配列番号６および配列番号７に、ＢｉＰに対するアミノ酸配列および塩基配列は、それぞれ、配列番号８および配列番号９に、ＨＤＥＬに対するアミノ酸配列および塩基配列は、それぞれ、配列番号１０および配列番号１１に示し、発現カセット（ｃａｓｓｅｔｔｅ）の全体アミノ酸配列および塩基配列は、それぞれ、配列番号１２および配列番号１３に示した。
実施例１：ＢｉＰ－ＣＴＢ－ＧｎＲＨ－ｐＦｃ２－ＨＤＥＬ融合タンパク質の発現および精製
ＧｎＲＨに対する免疫原性を誘導するために、図１に示されたように、ＧｎＲＨにＣＴＢ、ｐＦｃ２、ＢｉＰおよびＨＤＥＬを融合した組み換えＧｎＲＨを発現させるためのベクターを製作した。１０個のアミノ酸から構成されたＧｎＲＨは、６個が連続するようにしてアラニン－グリシン－アラニン（ＡＧＡ）リンカーで連結した。６個が連結されたＧｎＲＨのアミノ酸配列および塩基配列は、それぞれ、配列番号２および配列番号３に示した。また、ＣＴＢに対するアミノ酸配列および塩基配列は、それぞれ、配列番号４および配列番号５に、ｐＦｃ２に対するアミノ酸配列および塩基配列は、それぞれ、配列番号６および配列番号７に、ＢｉＰに対するアミノ酸配列および塩基配列は、それぞれ、配列番号８および配列番号９に、ＨＤＥＬに対するアミノ酸配列および塩基配列は、それぞれ、配列番号１０および配列番号１１に示し、発現カセット（ｃａｓｓｅｔｔｅ）の全体アミノ酸配列および塩基配列は、それぞれ、配列番号１２および配列番号１３に示した。
【0087】
前記ベクターで形質転換されたアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）をタバコ植物の葉に接種し、一過性発現（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）をした。植物の葉から総タンパク質（Ｔｏｔａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ）を抽出して遠心分離した後、溶液に含まれている水溶性（ｓｏｌｕｂｌｅ）形態のタンパク質をｐｒｏｔｅｉｎ Ａ－ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｃｏｌｕｍｎを装着したＡＫＴＡ ｐｒｉｍｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、米国）を用いてｐＦｃ２融合ＧｎＲＨタンパク質を分離した。
【0088】
実施例２：組み換えＧｎＲＨタンパク質の濃度の確認
前記実施例１で分離・精製した組み換えＧｎＲＨタンパク質の濃度を確認および測定するために、濃度を知っているＢＳＡ（ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）をスタンダード（ｓｔａｎｄａｒｄ）としてＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った。分離精製した組み換えＧｎＲＨタンパク質を１、２μｌローディングし、定量のために０．５、１、２μｇのＢＳＡを含ませた。Ｇｅｌは、クマシーブルー染色（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ ｂｌｕｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ）を通じてバンドを最終的に確認した。
前記実施例１で分離・精製した組み換えＧｎＲＨタンパク質の濃度を確認および測定するために、濃度を知っているＢＳＡ（ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）をスタンダード（ｓｔａｎｄａｒｄ）としてＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った。分離精製した組み換えＧｎＲＨタンパク質を１、２μｌローディングし、定量のために０．５、１、２μｇのＢＳＡを含ませた。Ｇｅｌは、クマシーブルー染色（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ ｂｌｕｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ）を通じてバンドを最終的に確認した。
【0089】
その結果、図２に示されたように、組み換えＧｎＲＨタンパク質がよく発現して分離・精製されたことを確認し、ＧｎＲＨ組み換えタンパク質の濃度が約２μｇ／μｌであることを確認した。上記のように確認された組み換えＧｎＲＨタンパク質を下記実施例３および４の動物実験に使用した。
【0090】
実施例３：組み換えＧｎＲＨタンパク質の投与効果の確認－雄性
３．１．実験動物、投与条件および日程
組み換えＧｎＲＨタンパク質の中性化効果を確認するために、４週齢の雄性ＳＤ（Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ）ラットに下記表１に記載された投与条件で、図３に示された日程によって本発明による組み換えＧｎＲＨタンパク質が含まれたワクチン組成物を投与した。対照群は、同量のＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）を投与し、実験群は、前記ワクチン組成物１００μｇ／１８０μｌおよびＥｍｕｌｓｉｇｅｎ（登録商標）－Ｄアジュバント２０μｌを投与した（下記表１参照）。入舎した４週齢のラットを約４日間安定化させた後、１４日～１５日の投与間隔で総３回投与した。採血は、それぞれ、投与前および実験終了時に実施し、３次投与後４週が経過した時点で睾丸を摘出して、重量およびサイズを測定し、血中テストステロン（ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ）の濃度を測定した。
３．１．実験動物、投与条件および日程
組み換えＧｎＲＨタンパク質の中性化効果を確認するために、４週齢の雄性ＳＤ（Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ）ラットに下記表１に記載された投与条件で、図３に示された日程によって本発明による組み換えＧｎＲＨタンパク質が含まれたワクチン組成物を投与した。対照群は、同量のＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）を投与し、実験群は、前記ワクチン組成物１００μｇ／１８０μｌおよびＥｍｕｌｓｉｇｅｎ（登録商標）－Ｄアジュバント２０μｌを投与した（下記表１参照）。入舎した４週齢のラットを約４日間安定化させた後、１４日～１５日の投与間隔で総３回投与した。採血は、それぞれ、投与前および実験終了時に実施し、３次投与後４週が経過した時点で睾丸を摘出して、重量およびサイズを測定し、血中テストステロン（ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ）の濃度を測定した。
【0091】
【表1】
【0092】
３．２．睾丸の目視評価
本発明によるワクチン組成物の３次投与後に４週が経過した時点で睾丸を摘出して、目視評価を実施した。結果は、下記表２および図４に示した。
本発明によるワクチン組成物の３次投与後に４週が経過した時点で睾丸を摘出して、目視評価を実施した。結果は、下記表２および図４に示した。
【0093】
【表2】
【0094】
前記表２および図４に示されたように、非接種対照群と比較して組み換えＧｎＲＨタンパク質を含むワクチン接種群は、睾丸の重量および長さが有意に減少したことを確認した。また、重量比から確認できるように、個体の総体重対比睾丸の重量が占める比率は、ワクチン接種群が顕著に低いことが示され、ワクチン接種群の睾丸の平均長さも、非接種群対比６４％～８６％レベルに示された。
【0095】
上記のような結果は、本発明による組み換えＧｎＲＨタンパク質を含むワクチン組成物の投与によって成功裏に中性化になったことを確認したものである。
【0096】
３．３．テストステロン（ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ）のＥＬＩＳＡ結果
本発明によるワクチン組成物の３次投与後に４週が経過した時点で採血して、血中テストステロンの濃度を測定した。測定は、Ｅｌａｂｓｃｉｅｎｃｅ（登録商標）のＥＬＩＳＡキットを用いて製造社の指針によって行った。具体的に、テストステロンがコートされているプレートに５０μＬの血清を入れ、すぐに同量のｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ抗体を入れた。３７℃で４５分間反応させた後、３５０μＬの洗浄バッファーを用いて３回洗浄した。次に、１００μＬのＨＲＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ溶液を入れ、３７℃で３０分間培養した。上述した過程と同一に洗浄を５回進めた後、９０μＬの基質液を添加した後、３７℃で１５分間培養した。その後、５０μＬの反応停止液を入れ、ＥＬＩＳＡ機械を通じて４５０ｎｍの波長でＯＤ値を測定した。血中テストステロンの実際量を定量するために、テストステロンスタンダードタンパク質を０．１、０．４、１．６、５、２０ｎｇ／ｍｌで含んで反応を進めた。これを通じて得られたＯＤ値でスタンダードグラフを作成し、これに上記で得られたサンプルのＯＤ値を代入してテストステロンを定量した。その結果は、下記表３および図５に示した。
本発明によるワクチン組成物の３次投与後に４週が経過した時点で採血して、血中テストステロンの濃度を測定した。測定は、Ｅｌａｂｓｃｉｅｎｃｅ（登録商標）のＥＬＩＳＡキットを用いて製造社の指針によって行った。具体的に、テストステロンがコートされているプレートに５０μＬの血清を入れ、すぐに同量のｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ抗体を入れた。３７℃で４５分間反応させた後、３５０μＬの洗浄バッファーを用いて３回洗浄した。次に、１００μＬのＨＲＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ溶液を入れ、３７℃で３０分間培養した。上述した過程と同一に洗浄を５回進めた後、９０μＬの基質液を添加した後、３７℃で１５分間培養した。その後、５０μＬの反応停止液を入れ、ＥＬＩＳＡ機械を通じて４５０ｎｍの波長でＯＤ値を測定した。血中テストステロンの実際量を定量するために、テストステロンスタンダードタンパク質を０．１、０．４、１．６、５、２０ｎｇ／ｍｌで含んで反応を進めた。これを通じて得られたＯＤ値でスタンダードグラフを作成し、これに上記で得られたサンプルのＯＤ値を代入してテストステロンを定量した。その結果は、下記表３および図５に示した。
【0097】
【表3】
【0098】
その結果、前記表３および図５に示されたように、非接種対照群と比較して組み換えＧｎＲＨタンパク質を含むワクチン接種群は、血中テストステロンの濃度が顕著に減少したことが示された。
【0099】
上記のような結果、前記実施例３．２．結果と一致するものであって、本発明による組み換えＧｎＲＨタンパク質を含むワクチン組成物の投与によって成功裏に中性化になったことを確認したものである。
【0100】
実施例４：組換えＧｎＲＨタンパク質の投与効果の確認－雌性
４．１．実験動物、投与条件および日程
組換えＧｎＲＨタンパク質の中性化効果を確認するために、４週齢の雌性ＳＤ（Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ）ラットに下記表５に記載された投与条件で、図７に示した日程によって本発明による組換えＧｎＲＨタンパク質が含まれたワクチン組成物を投与した。対照群は、同量のＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）を投与し、比較群としてＣＴＢの代わりにＦｅが融合したＧｎＲＨタンパク質が含まれたワクチン組成物１００μｇ／１８０μｌおよびＥｍｕｌｓｉｇｅｎ（登録商標）－Ｄアジュバント２０μｌを投与した。実験群は、本発明によるワクチン組成物１００μｇ／１８０μｌおよびＥｍｕｌｓｉｇｅｎ（登録商標）－Ｄアジュバント２０μｌを投与した（下記表５参照）。ワクチンは、４週齢のラットにそれぞれ１４日および７日の投与間隔で総３回投与した。採血は、それぞれの投与前および実験終了時に施行し、３次投与後３週が経過した時点で卵巣を摘出して重量およびサイズを測定し、血中プロゲストロン（ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ）およびエストラジオール（ｅｓｔｒａｄｉｏｌ）の濃度を測定した。
４．１．実験動物、投与条件および日程
組換えＧｎＲＨタンパク質の中性化効果を確認するために、４週齢の雌性ＳＤ（Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ）ラットに下記表５に記載された投与条件で、図７に示した日程によって本発明による組換えＧｎＲＨタンパク質が含まれたワクチン組成物を投与した。対照群は、同量のＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）を投与し、比較群としてＣＴＢの代わりにＦｅが融合したＧｎＲＨタンパク質が含まれたワクチン組成物１００μｇ／１８０μｌおよびＥｍｕｌｓｉｇｅｎ（登録商標）－Ｄアジュバント２０μｌを投与した。実験群は、本発明によるワクチン組成物１００μｇ／１８０μｌおよびＥｍｕｌｓｉｇｅｎ（登録商標）－Ｄアジュバント２０μｌを投与した（下記表５参照）。ワクチンは、４週齢のラットにそれぞれ１４日および７日の投与間隔で総３回投与した。採血は、それぞれの投与前および実験終了時に施行し、３次投与後３週が経過した時点で卵巣を摘出して重量およびサイズを測定し、血中プロゲストロン（ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ）およびエストラジオール（ｅｓｔｒａｄｉｏｌ）の濃度を測定した。
【0101】
【表4】
【0102】
４．２．ＧｎＲＨに対する抗体形成の確認
本発明による中性化ワクチンによりＧｎＲＨに対する抗体が生成されたか否かを確認するために、９６－ｗｅｌｌプレートにＧｎＲＨ抗原をそれぞれ５０および２５ｎｇ／ｗｅｌｌでコートした。対照群としては、同量のＰＢＳを注入したマウスから得られた血清を使用した。
本発明による中性化ワクチンによりＧｎＲＨに対する抗体が生成されたか否かを確認するために、９６－ｗｅｌｌプレートにＧｎＲＨ抗原をそれぞれ５０および２５ｎｇ／ｗｅｌｌでコートした。対照群としては、同量のＰＢＳを注入したマウスから得られた血清を使用した。
【0103】
１次抗体としてＣＴＢ－ＧｎＲＨまたはＦｅ－ＧｎＲＨを投与したラットの血清（ｓｅｒｕｍ）を１：１００の割合で希釈して３７℃で２時間の間反応させた。その後、抗ラット２次抗体（１：５０００）を処理し、発色基質ＴＭＢ（３，３’，５，５’－Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）を処理した。
【0104】
【0105】
【表5】
【0106】
【表6】
【0107】
４．３．卵巣の目視評価
本発明によるワクチン組成物の３次投与後、３週が経過した時点で卵巣を摘出して、目視評価を実施した。結果は、下記表７および図９に示した。
本発明によるワクチン組成物の３次投与後、３週が経過した時点で卵巣を摘出して、目視評価を実施した。結果は、下記表７および図９に示した。
【0108】
【表7】
【0109】
前記表７および図９に示されたように、非接種対照群と比較して組換えＧｎＲＨタンパク質を含むワクチン接種群は、卵巣の重量および長さが有意に減少したことを確認した。すなわち、重量比から確認できるように、個体の総体重に対して卵巣の重量が占める比率は、２つのワクチン接種群の両方で顕著に低いことが示され、卵巣の長さ比も、非接種群と比べて６７％～８９％レベルであることが示された。
【0110】
特に、ＣＴＢ－ＧｎＲＨは、Ｆｅ－ＧｎＲＨと比較してさらに優れた卵巣萎縮効果を示したが、ワクチン接種群における長さ比は、Ｆｅ－ＧｎＲＨを投与した場合、平均８３％であることと比較して、ＣＴＢ－ＧｎＲＨを投与した場合には、平均７４．６％であることが示され、重量比も、Ｆｅ－ＧｎＲＨを投与した場合、平均０．０１９％であることが示されたのに対し、ＣＴＢ－ＧｎＲＨを投与した場合には、平均０．０１３％であることが示された。
【0111】
上記のような結果は、本発明による組換えＣＴＢ－ＧｎＲＨタンパク質を含むワクチン組成物の投与によって成功裏に中性化が行われ、ＦｅよりＣＴＢを融合した場合、さらに効果に優れていることを確認したものである。
【0112】
上述した本発明の説明は例示のためのもので、本発明が属する技術分野において通常の知識を有した者は、本発明の技術的思想や必須的な特徴を変更しなくても他の具体的な形態に容易に変形が可能であることが理解できる。したがって、以上で記述した実施例は、全ての面で例示的なものであり、限定的ではないものと理解すべきである。
【産業上の利用可能性】
【0113】
本発明は、ＣＴＢ（Ｃｈｏｌｅｒａ ｔｏｘｉｎ Ｂ ｓｕｂｕｎｉｔ）およびＧｎＲＨ（Ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ－ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ）が融合した組換えタンパク質を含む、動物の中性化ワクチン組成物などに関し、ＧｎＲＨのポリペプチド配列を含む組換えタンパク質を用いてこれを投与した個体にＧｎＲＨに対する抗体を誘導し、これを通じて卵巣および睾丸が萎縮することを確認した。したがって、本発明は、低い費用、高い安全性および最小限の副作用で動物を中性化するのに有用に用いられるので、産業上の利用価値が大きいものと予想される。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【配列表】