特許 7430223 多重特異性単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及びＴ細胞アダプター、核酸、その発現細胞、その用途及び癌治療用の医薬組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-02-01

(45)【発行日】2024-02-09

(54)【発明の名称】多重特異性単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及びＴ細胞アダプター、核酸、その発現細胞、その用途及び癌治療用の医薬組成物

(51)【国際特許分類】

   C07K 19/00 20060101AFI20240202BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20240202BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240202BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20240202BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240202BHJP

   C07K 16/28 20060101ALN20240202BHJP

   C12N 15/13 20060101ALN20240202BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20240202BHJP

   C12N 5/0783 20100101ALN20240202BHJP

【ＦＩ】

C07K19/00

C12N15/62 Z ZNA

C12N5/10

A61K35/17

A61P35/00

C07K16/28

C12N15/13

C12N15/12

C12N5/0783

【請求項の数】 15

(21)【出願番号】P 2022116679

(22)【出願日】2022-07-21

(65)【公開番号】P2023016779

(43)【公開日】2023-02-02

【審査請求日】2022-07-21

(31)【優先権主張番号】63/223,985

(32)【優先日】2021-07-21

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】522292688

【氏名又は名称】エバー シュプリーム バイオ テクノロジー カンパニー リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110001519

【氏名又は名称】弁理士法人太陽国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】周徳陽

(72)【発明者】

【氏名】邱紹智

(72)【発明者】

【氏名】黄士維

(72)【発明者】

【氏名】潘志明

(72)【発明者】

【氏名】セン佳穎

(72)【発明者】

【氏名】陳美智

(72)【発明者】

【氏名】林育全

(72)【発明者】

【氏名】呉仲峻

【審査官】小田 浩代

(56)【参考文献】

【文献】特開２０２１－０６５２１９（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０２０／０４３８９９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特表２０２０－５１６２７６（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ１５／００－１５／９０

Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＨＬＡ－Ｇ単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体と、
前記ＨＬＡ－Ｇ単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体のＣ端に接続される二重特異性Ｔ細胞アダプターと、
をＮ端からＣ端まで順に備え、
前記ＨＬＡ－Ｇ単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体は、ヒト白血球抗原Ｇ（ｈｕｍａｎ
ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ Ｇ；ＨＬＡ－Ｇ）と特異的結合され、アミノ酸配列が配列番号：１及び／又は配列番号：２に示す少なくとも１つのＨＬＡ－Ｇ単一ドメイン抗体を含むＨＬＡ－Ｇ単一ドメイン抗体ユニットと、アミノ酸配列が配列番号：２９に示す膜貫通ドメインと、アミノ酸配列が配列番号：２５に示すＣＤ３ｚシグナル伝達ドメインと、を含有し、
前記二重特異性Ｔ細胞アダプターは、プログラム細胞死リガンド１（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｄｅａｔｈ－ｌｉｇａｎｄ １；ＰＤ－Ｌ１）と特異的結合され、アミノ酸配列が配列番号：５及び／又は配列番号：６に示す少なくとも１つのＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体を含むＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体ユニットと、ＣＤ３ｅ分子と特異的結合され、アミノ酸配列が配列番号：９に示すＣＤ３ｅ単一ドメイン抗体と、を含有する多重特異性単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及びＴ細胞アダプター。

【請求項2】

前記ＨＬＡ－Ｇ単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体のＮ端に接続され、且つアミノ酸配列が配列番号：１１に示す第１のシグナルペプチドを更に含む請求項１に記載の多重特異性単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及びＴ細胞アダプター。

【請求項3】

前記ＨＬＡ－Ｇ単一ドメイン抗体ユニット及び前記膜貫通ドメインをタンデムで接続するＣＤ８ヒンジ領域を更に含む請求項１に記載の多重特異性単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及びＴ細胞アダプター。

【請求項4】

前記ＨＬＡ－Ｇ単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及び前記二重特異性Ｔ細胞アダプターをタンデムで接続するＰ２Ａペプチドを更に含む請求項１に記載の多重特異性単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及びＴ細胞アダプター。

【請求項5】

前記二重特異性Ｔ細胞アダプターのＮ端に接続され、且つアミノ酸配列が配列番号：１５に示す第２のシグナルペプチドを更に含む請求項１に記載の多重特異性単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及びＴ細胞アダプター。

【請求項6】

前記ＨＬＡ－Ｇ単一ドメイン抗体ユニットは、ＨＬＡ－ＧとＨＬＡ－Ｇ受容体との相互作用及び／又は結合をブロックする請求項１に記載の多重特異性単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及びＴ細胞アダプター。

【請求項7】

前記ＨＬＡ－Ｇ受容体は、ＫＩＲ２ＤＬ４及び／又はＬＩＬＲＢ１である請求項６に記載の多重特異性単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及びＴ細胞アダプター。

【請求項8】

前記ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体ユニットは、ＰＤ－Ｌ１とＰＤ－Ｌ１受容体の相互作用及び／又は結合をブロックする請求項１に記載の多重特異性単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及びＴ細胞アダプター。

【請求項9】

前記ＰＤ－Ｌ１受容体は、プログラム細胞死タンパク質－１（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｐｒｏｔｅｉｎ－１；ＰＤ－１）である請求項８に記載の多重特異性単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及びＴ細胞アダプター。

【請求項10】

前記ＣＤ３ｅ単一ドメイン抗体は、Ｔ細胞を活性化させ、及び／又は動員する請求項１に記載の多重特異性単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及びＴ細胞アダプター。

【請求項11】

請求項１に記載の多重特異性単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及びＴ細胞アダプターをコードする核酸であって、
ＨＬＡ－Ｇ単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体をコードする断片と、
前記ＨＬＡ－Ｇ単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体をコードする断片の３’端に接続される二重特異性Ｔ細胞アダプターをコードする断片と、
を５’端から３’端まで順に備え、
前記ＨＬＡ－Ｇ単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体をコードする断片は、
ヌクレオチド配列が配列番号：３及び／又は配列番号：４に示す少なくとも１つのＨＬＡ－Ｇ単一ドメイン抗体をコードする断片を含むＨＬＡ－Ｇ単一ドメイン抗体ユニットをコードする断片と、ヌクレオチド配列が配列番号：３０に示す膜貫通ドメインをコードする断片と、ヌクレオチド配列が配列番号：２６に示すＣＤ３ｚシグナル伝達ドメインをコードする断片と、を含有し、
前記二重特異性Ｔ細胞アダプターをコードする断片は、
ヌクレオチド配列が配列番号：７及び／又は配列番号：８に示す少なくとも１つのＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体をコードする断片を含むＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体ユニットをコードする断片と、ヌクレオチド配列が配列番号：１０に示すＣＤ３ｅ単一ドメイン抗体をコードする断片と、を含有する核酸。

【請求項12】

免疫細胞と、
請求項１１に記載の核酸と、
を備える多重特異性単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及びＴ細胞アダプターの発現細胞であって、
前記多重特異性単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及びＴ細胞アダプターの発現細胞は、前記核酸を前記免疫細胞へトランスフェクトして得られるものである多重特異性単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及びＴ細胞アダプターの発現細胞。

【請求項13】

前記免疫細胞は、ナチュラルキラー細胞又はγδＴ細胞である請求項１２に記載の多重特異性単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及びＴ細胞アダプターの発現細胞。

【請求項14】

請求項１２に記載の多重特異性単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及びＴ細胞アダプターの発現細胞と、
医薬的に許容される担体と、
を含む癌治療用の医薬組成物。

【請求項15】

哺乳動物の腫瘍細胞死を誘発する薬物の調製における請求項１２に記載の多重特異性単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及びＴ細胞アダプターの発現細胞の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、抗原又は抗体を含む医薬製品に関し、特に、多重特異性単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及びＴ細胞アダプター、核酸、その発現細胞、癌治療用の医薬組成物及び多重特異性単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及びＴ細胞アダプターの発現細胞の用途に関する。

【背景技術】

【0002】

通常の腫瘍治療法としては、手術療法、放射線療法、化学療法、及び標的療法を含む。腫瘍免疫療法は、上記の治療法とは別の腫瘍治療法であり、患者自体の免疫系を活性化させ、腫瘍細胞又は腫瘍抗原物質によって人体の特異な細胞性免疫及び体液性免疫応答を誘導し、人体の抗癌能力を高め、腫瘍の成長、拡大、再発を阻止することで、腫瘍を除去又は制御する。

【0003】

近年、免疫系の癌治療での役割がますます注目されており、現在、主な腫瘍免疫療法には、免疫チェックポイントの活性化をブロックすることで腫瘍細胞に対する自己Ｔ細胞の攻撃力を回復する免疫チェックポイント阻害療法と、Ｔ細胞に対する遺伝子組み換えによって腫瘍細胞に対する抗原認識及び殺傷能力を高めるキメラ抗原受容体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＣＡＲ）という２つのタイプが含まれる。また、二重特異性Ｔ細胞アダプター（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ ｃｅｌｌ ｅｎｇａｇｅｒ；ＢｉＴＥ）という別の新規な免疫療法も注目され、ＢｉＴＥは、２種類のモノクローナル抗体の単鎖可変領域断片（ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｖａｒｉａｂｌｅｓ；ｓｃＦｖｓ）からなる抗体分子であり、標的細胞の表面の抗原及びＴ細胞の表面のＣＤ３分子をそれぞれ特異的に認識できる２つの分子フックを有するため、Ｔ細胞を活性化させると同時に癌細胞を認識することができる。

【0004】

腫瘍は、その存在形態によって、固形腫瘍及び非固形腫瘍に分けられる。固形腫瘍は、常に臨床的に明確な固まりを有し、主に手術を主とする複合療法が適用される。非固形腫瘍は、殆ど血液悪性腫瘍であり、一般的に明確な固まりが発現されず、化学療法を主要とする。現在、臨床的に適用されるＣＡＲ免疫細胞及びＢｉＴＥ腫瘍免疫療法は、血液悪性腫瘍の治療において効果的であるが、固形腫瘍への作用が限られており、腫瘍関連の標的タンパク質の選択が治療効果にとって非常に肝心であるので、ＣＡＲ免疫細胞又はＢｉＴＥの固形腫瘍での治療効果を如何に高めるかは、研究する価値のある課題となる。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

本発明の目的は、多重特異性単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及びＴ細胞アダプター、核酸、多重特異性単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及びＴ細胞アダプターの発現細胞、その用途及び癌治療用の医薬組成物を提供することにある。前記多重特異性単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及びＴ細胞アダプターは、腫瘍細胞への優れた特異的結合能力を持つＨＬＡ－Ｇ単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体と、Ｔ細胞表面のＣＤ３分子及び腫瘍細胞表面のＰＤ－Ｌ１を特異的に認識できる二重特異性Ｔ細胞アダプターと、を含む。前記核酸は、前記多重特異性単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及びＴ細胞アダプターをコードする。前記多重特異性単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及びＴ細胞アダプターの発現細胞は、前記核酸を含み、前記多重特異性単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及びＴ細胞アダプターを発現し、腫瘍細胞を特異的に標的とすることができ、オフターゲット効果を回避し、同時にＴ細胞を活性化させ、免疫チェックポイントの活性化をブロックすることができ、更に効果的に腫瘍細胞を殺して、哺乳動物の腫瘍細胞死を誘発する薬物の調製に用いられる。前記癌治療用の医薬組成物は、前記多重特異性単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及びＴ細胞アダプターの発現細胞を含み、効果的に腫瘍細胞を殺して癌を治療することができる。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明の一態様の一実施形態は、ＨＬＡ－Ｇ単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体と、ＨＬＡ－Ｇ単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体のＣ端に接続される二重特異性Ｔ細胞アダプターと、をＮ端からＣ端まで順に備え、ＨＬＡ－Ｇ単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体は、ヒト白血球抗原Ｇ（ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ Ｇ；ＨＬＡ－Ｇ）と特異的結合され、アミノ酸配列が配列番号：１及び／又は配列番号：２に示す少なくとも１つのＨＬＡ－Ｇ単一ドメイン抗体を含むＨＬＡ－Ｇ単一ドメイン抗体ユニットと、アミノ酸配列が配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３又は配列番号：２９に示す膜貫通ドメインと、アミノ酸配列が配列番号：２５に示すＣＤ３ｚシグナル伝達ドメインと、を含有し、二重特異性Ｔ細胞アダプターは、プログラム細胞死リガンド１（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｄｅａｔｈ－ｌｉｇａｎｄ １；ＰＤ－Ｌ１）と特異的結合され、アミノ酸配列が配列番号：５及び／又は配列番号：６に示す少なくとも１つのＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体を含むＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体ユニットと、ＣＤ３ｅ分子と特異的結合され、アミノ酸配列が配列番号：９に示すＣＤ３ｅ単一ドメイン抗体と、を含有する多重特異性単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及びＴ細胞アダプターを提供する。

【0007】

前記多重特異性単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及びＴ細胞アダプターによれば、ＨＬＡ－Ｇ単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体のＮ端に接続され、且つアミノ酸配列が配列番号：１１に示す第１のシグナルペプチドを更に含んでよい。

【0008】

前記多重特異性単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及びＴ細胞アダプターによれば、ＨＬＡ－Ｇ単一ドメイン抗体ユニット及び膜貫通ドメインをタンデムで接続するＣＤ８ヒンジ領域を更に含んでよい。

【0009】

前記多重特異性単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及びＴ細胞アダプターによれば、ＨＬＡ－Ｇ単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及び二重特異性Ｔ細胞アダプターをタンデムで接続するＰ２Ａペプチドを更に含んでよい。

【0010】

前記多重特異性単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及びＴ細胞アダプターによれば、二重特異性Ｔ細胞アダプターのＮ端に接続され、且つアミノ酸配列が配列番号：１５に示す第２のシグナルペプチドを更に含んでよい。

【0011】

前記多重特異性単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及びＴ細胞アダプターによれば、ＨＬＡ－Ｇ単一ドメイン抗体ユニットは、ＨＬＡ－ＧとＨＬＡ－Ｇ受容体との相互作用及び／又は結合をブロックすることができる。

【0012】

前記多重特異性単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及びＴ細胞アダプターによれば、ＨＬＡ－Ｇ受容体は、ＫＩＲ２ＤＬ４及び／又はＬＩＬＲＢ１であってよい。

【0013】

前記多重特異性単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及びＴ細胞アダプターによれば、ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体ユニットは、ＰＤ－Ｌ１とＰＤ－Ｌ１受容体の相互作用及び／又は結合をブロックすることができる。

【0014】

前記多重特異性単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及びＴ細胞アダプターによれば、ＰＤ－Ｌ１受容体は、プログラム細胞死タンパク質－１（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｐｒｏｔｅｉｎ－１；ＰＤ－１）であってよい。

【0015】

前記多重特異性単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及びＴ細胞アダプターによれば、ＣＤ３ｅ単一ドメイン抗体は、Ｔ細胞を活性化させ、及び／又は動員することができる。

【0016】

本発明の一態様の別の実施形態は、前文に記載の多重特異性単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及びＴ細胞アダプターをコードする核酸であって、ＨＬＡ－Ｇ単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体をコードする断片と、ＨＬＡ－Ｇ単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体をコードする断片の３’端に接続される二重特異性Ｔ細胞アダプターをコードする断片と、を５’端から３’端まで順に備え、ＨＬＡ－Ｇ単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体をコードする断片は、ヌクレオチド配列が配列番号：３及び／又は配列番号：４に示す少なくとも１つのＨＬＡ－Ｇ単一ドメイン抗体をコードする断片を含むＨＬＡ－Ｇ単一ドメイン抗体ユニットをコードする断片と、ヌクレオチド配列が配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２４又は配列番号：３０に示す膜貫通ドメインをコードする断片と、ヌクレオチド配列が配列番号：２６に示すＣＤ３ｚシグナル伝達ドメインをコードする断片と、を含有し、二重特異性Ｔ細胞アダプターをコードする断片は、ヌクレオチド配列が配列番号：７及び／又は配列番号：８に示す少なくとも１つのＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体をコードする断片を含むＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体ユニットをコードする断片と、ヌクレオチド配列が配列番号：１０に示すＣＤ３ｅ単一ドメイン抗体をコードする断片と、を含有する核酸を提供する。

【0017】

本発明の一態様のまた他の実施形態は、免疫細胞と、前文に記載の核酸と、を備える多重特異性単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及びＴ細胞アダプターの発現細胞であって、多重特異性単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及びＴ細胞アダプターの発現細胞は、前記核酸を前記免疫細胞へトランスフェクトして得られるものである多重特異性単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及びＴ細胞アダプターの発現細胞を提供する。

【0018】

前記多重特異性単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及びＴ細胞アダプターの発現細胞によれば、免疫細胞は、ナチュラルキラー細胞又はγδＴ細胞であってよい。

【0019】

本発明の一態様のまた他の実施形態は、前文に記載の多重特異性単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及びＴ細胞アダプターの発現細胞と、医薬的に許容される担体と、を含む癌治療用の医薬組成物を提供する。

【0020】

本発明の別の態様の一実施形態は、哺乳動物の腫瘍細胞死を誘発する薬物の調製に用いられる前文に記載の多重特異性単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及びＴ細胞アダプターの発現細胞の用途を提供する。

【0021】

上記の発明の内容は、読者に本開示内容を基本的に理解させるように、本開示内容の簡略化された概要を提供する。この発明の内容は、本開示内容の完全な概説ではなく、また本発明実施例の重要な／肝心な素子を指摘し、又は本発明の範囲を限定するものではない。

【0022】

本発明の上記及び他の目的、特徴、メリット及び実施例をより分かりやすくするために、添付図面の説明は以下の通りである。

【図面の簡単な説明】

【0023】

【図1】本発明の多重特異性単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及びＴ細胞アダプターの構造及び作用機序を示す模式図である。

【図2A】本発明の核酸の構築を示す模式図である。

【図2B】本発明の核酸の構築を示す模式図である。

【図3A】本発明のＨＬＡ－Ｇ単一ドメイン抗体の結合親和性を示す分析結果図である。

【図3B】本発明のＨＬＡ－Ｇ単一ドメイン抗体の結合親和性を示す分析結果図である。

【図4】本発明のＨＬＡ－Ｇ単一ドメイン抗体のＬＩＬＲＢ１ブロック活性を示す分析結果図である。

【図5】本発明のＨＬＡ－Ｇ単一ドメイン抗体のＫＩＲ２ＤＬ４ブロック活性を示す分析結果図である。

【図6A】本発明のＨＬＡ－Ｇ単一ドメイン抗体によるナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が媒介する細胞毒性の増強がＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞に及ぼす影響を示す分析結果図である。

【図6B】本発明のＨＬＡ－Ｇ単一ドメイン抗体によるナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が媒介する細胞毒性の増強がＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞に及ぼす影響を示す分析結果図である。

【図7】本発明のＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体のＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１バイオブロッキング活性を示す分析結果図である。

【図8A】本発明のＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体の結合親和性を示す分析結果図である。

【図8B】本発明のＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体の結合親和性を示す分析結果図である。

【図9】本発明のＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体によるγδＴ細胞が媒介する細胞毒性の増強がＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞に及ぼす影響を示す分析結果図である。

【図10】本発明のＣＤ３ｅ単一ドメイン抗体による末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びγδＴ細胞におけるＣＤ３^＋Ｔ細胞増殖への影響を示す分析結果図である。

【図11】本発明の核酸及び比較例の核酸の構築を示す模式図である。

【図12A】本発明の多重特異性単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及びＴ細胞アダプターの発現細胞がＨＬＡ－Ｇ単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体を発現する分析結果図である。

【図12B】本発明の多重特異性単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及びＴ細胞アダプターの発現細胞がＨＬＡ－Ｇ単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体を発現する分析結果図である。

【図13A】本発明の実施例４の多重特異性単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及びＴ細胞アダプターの発現細胞による腫瘍細胞の特異的溶解を示す分析結果図である。

【図13B】本発明の実施例４の多重特異性単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及びＴ細胞アダプターの発現細胞による腫瘍細胞の特異的溶解を示す分析結果図である。

【図14A】本発明の実施例４の多重特異性単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及びＴ細胞アダプターの発現細胞による腫瘍細胞の特異的溶解を示す分析結果図である。

【図14B】本発明の実施例４の多重特異性単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及びＴ細胞アダプターの発現細胞による腫瘍細胞の特異的溶解を示す分析結果図である。

【図15A】本発明の実施例４の多重特異性単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及びＴ細胞アダプターの発現細胞による腫瘍細胞の特異的溶解を示す分析結果図である。

【図15B】本発明の実施例４の多重特異性単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及びＴ細胞アダプターの発現細胞による腫瘍細胞の特異的溶解を示す分析結果図である。

【図16A】本発明の実施例４の多重特異性単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及びＴ細胞アダプターの発現細胞による腫瘍細胞の特異的溶解を示す分析結果図である。

【図16B】本発明の実施例４の多重特異性単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及びＴ細胞アダプターの発現細胞による腫瘍細胞の特異的溶解を示す分析結果図である。

【図17】本発明の実施例４の多重特異性単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及びＴ細胞アダプターの発現細胞による腫瘍細胞の特異的溶解を示す分析結果図である。

【図18】本発明の多重特異性単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及びＴ細胞アダプターの発現細胞が多重特異性単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及びＴ細胞アダプターを分泌する作用機序を示す模式図である。

【図19】本発明の多重特異性単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及びＴ細胞アダプターの発現細胞が二重特異性Ｔ細胞アダプターを分泌する分析結果図である。

【図20A】本発明の多重特異性単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及びＴ細胞アダプターの発現細胞の条件培地でのＰＢＭＣによって誘発される細胞毒性に対する増強による多形神経膠芽腫細胞への影響を示す分析結果図である。

【図20B】本発明の多重特異性単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及びＴ細胞アダプターの発現細胞の条件培地でのＰＢＭＣによって誘発される細胞毒性に対する増強による多形神経膠芽腫細胞への影響を示す分析結果図である。

【図20C】本発明の多重特異性単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及びＴ細胞アダプターの発現細胞の条件培地でのＰＢＭＣによって誘発される細胞毒性に対する増強による多形神経膠芽腫細胞への影響を示す分析結果図である。

【図21A】本発明の多重特異性単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及びＴ細胞アダプターの発現細胞による動物介在療法の試験策略を示す模式図である。

【図21B】本発明の多重特異性単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及びＴ細胞アダプターの発現細胞による腫瘍マウスの腫瘍成長阻害への影響を示す分析結果図である。

【図21C】本発明の多重特異性単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及びＴ細胞アダプターの発現細胞による腫瘍マウスの腫瘍成長阻害への影響を示す分析結果図である。

【図21D】本発明の多重特異性単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及びＴ細胞アダプターの発現細胞による腫瘍マウスの腫瘍成長阻害への影響を示す分析結果図である。

【発明を実施するための形態】

【0024】

本明細書の開示内容は、多重特異性単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及びＴ細胞アダプター、前記多重特異性単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及びＴ細胞アダプターをコードする核酸、前記核酸を含む多重特異性単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及びＴ細胞アダプターの発現細胞、その用途及び多重特異性単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及びＴ細胞アダプターの発現細胞をを含む癌治療用の医薬組成物を提出する。明細書は、腫瘍細胞の細胞試験により、本発明の多重特異性単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及びＴ細胞アダプターが腫瘍細胞に対する免疫細胞の細胞毒性を増強できるため、本発明の多重特異性単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及びＴ細胞アダプターを発現する多重特異性単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及びＴ細胞アダプターの発現細胞に、腫瘍細胞に対する優れた特異的溶解能力を持たせることができることが証明された。明細書において動物試験により、本発明の多重特異性単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及びＴ細胞アダプターの発現細胞が優れた腫瘍成長阻害効果を持ち、哺乳動物の腫瘍細胞死を誘発する薬物の調製に用いられることが証明された。前記本発明の癌治療用の医薬組成物は、本発明の多重特異性単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及びＴ細胞アダプターの発現細胞を含み、効果的に腫瘍細胞を殺して癌を治療することができる。

【0025】

本明細書に記載の「単一ドメイン抗体（ｓｉｎｇｌｅ ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ；ｓｄＡｂ）」とは、抗体の軽鎖が欠失し、重鎖の可変領域のみが存在する抗体の一種を指す。インタクトな抗体には２つの免疫グロブリン軽鎖と２つの重鎖が含まれているため、インタクトな抗体の分子量は約１５０－１６０ｋＤａである。対照的に、単一ドメイン抗体の分子量が約１２－１５ｋＤａだけであり、単一ドメイン抗体の分子量が小さいため、ナノボディ抗体（ｎａｎｏｂｏｄｙ）とも呼ばれる。単一ドメイン抗体は、構造が簡単であるが、依然としてインタクトな抗体と同じひいてはインタクトな抗体よりも高い特異的抗原結合親和性を実現することができる。

【0026】

本明細書に記載の「ヒト白血球抗原Ｇ（ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ Ｇ；ＨＬＡ－Ｇ）」は、ＨＬＡ－Ｇ遺伝子によってコードされ、非典型的な第１類の主要組織適合遺伝子複合体（ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ；ＭＨＣ）であり、重鎖が約４５ｋＤａである。ＨＬＡ－Ｇは、胎児由来の胎盤細胞に発現し、免疫応答の負の調節に非常に積極的であり、その主な役割は細胞毒性免疫細胞の機能を阻害することである。

【0027】

本明細書に記載の「プログラム細胞死リガンド１（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｄｅａｔｈ－ｌｉｇａｎｄ １；ＰＤ－Ｌ１）」は、サイズが４０ｋＤａの第１型の膜貫通タンパク質であり、ＣＤ２７４遺伝子によってコードされ、その受容体－プログラム細胞死タンパク質－１（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｐｒｏｔｅｉｎ－１；ＰＤ－１）と結合できる。現在、研究からわかるように、腫瘍細胞表面のＰＤ－Ｌ１の発現の増加は、免疫細胞のＰＤ－１と結合して、宿主免疫細胞を抑制して機能を喪失させ、アポトーシスを招くことで、腫瘍細胞が免疫監視から逃れるようにすることができる。

【0028】

本明細書に記載の「ＣＤ３ｅ分子（ＣＤ３Ｅとも呼ばれる）」は、Ｔ細胞表面の第１型の膜貫通タンパク質であり、ＣＤ３Ｅ遺伝子によってコードされ、Ｔ細胞発育において重要な役割を果たす。ＣＤ３ｅ分子はＣＤ３γ、ＣＤ３δ及びＣＤ３ζ並びにＴ細胞受容体α／β及びγ／δヘテロ二量体と共にＴ細胞受容体－ＣＤ３複合物を形成する。ＣＤ３複合物は、抗原認識をいくつかの細胞内シグナル伝達経路に結合する上で重要な役割を果たす。

【0029】

以下の具体的な試験例によって、更に本発明を説明し、当業者のために寄与し、過度の解釈なしに本発明を十分に利用及び実施することができ、これらの試験例を、本発明の範囲を限定することを意図していると見なされるべきではなく、本発明の材料及び方法がどのように実施するかを説明することを意図している。

【0030】

一、本発明の多重特異性単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及びＴ細胞アダプター並びに核酸
１．１．多重特異性単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及びＴ細胞アダプター
図１を参照されたく、本発明の多重特異性単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及びＴ細胞アダプターの構造及び作用機序を示す模式図である。本発明の多重特異性単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及びＴ細胞アダプターは、ＨＬＡ－Ｇ単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及び二重特異性Ｔ細胞アダプターをＮ端からＣ端まで順に含む。

【0031】

ＨＬＡ－Ｇ単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体は、ＨＬＡ－Ｇ単一ドメイン抗体ユニット、膜貫通ドメイン及びＣＤ３ｚシグナル伝達ドメインを含む。ＨＬＡ－Ｇ単一ドメイン抗体ユニットは、ＨＬＡ－Ｇと特異的結合され、少なくとも１つのＨＬＡ－Ｇ単一ドメイン抗体を含み、且つ少なくとも１つのＨＬＡ－Ｇ単一ドメイン抗体のアミノ酸配列が配列番号：１及び／又は配列番号：２に示された。膜貫通ドメインのアミノ酸配列が配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３又は配列番号：２９に示され、ＣＤ３ｚシグナル伝達ドメインのアミノ酸配列が配列番号：２５に示された。ＨＬＡ－Ｇ単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体から構成できる腫瘍標的受容体複合物により、本発明の多重特異性単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及びＴ細胞アダプターと腫瘍細胞表面で特異的に認識するヒト白血球抗原Ｇとを結合してからシグナル伝達をトリガーして、シグナルカスケードを生成して本発明の多重特異性単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及びＴ細胞アダプターの発現細胞の活性化及び成長をもたらして、更に溶解顆粒のエキソサイトーシスを誘発し、標的腫瘍細胞を殺した。

【0032】

ＨＬＡ－Ｇ単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体のＮ端は、第１のシグナルペプチドを更に含んでよく、そのアミノ酸配列が配列番号：１１に示された。ＨＬＡ－Ｇ単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体は、ＨＬＡ－Ｇ単一ドメイン抗体ユニット及び膜貫通ドメインをタンデムで接続するＣＤ８ヒンジ領域を更に含んでよく、ＣＤ８ヒンジ領域のアミノ酸配列が配列番号：１７に示された。

【0033】

二重特異性Ｔ細胞アダプターは、ＨＬＡ－Ｇ単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体のＣ端に接続され、且つＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体ユニット及びＣＤ３ｅ単一ドメイン抗体を含む。ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体ユニットは、ＰＤ－Ｌ１と特異的結合され、少なくとも１つのＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体を含み、且つ少なくとも１つのＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体のアミノ酸配列が配列番号：５及び／又は配列番号：６に示された。ＣＤ３ｅ単一ドメイン抗体は、ＣＤ３ｅ分子と特異的結合され、且つＣＤ３ｅ単一ドメイン抗体のアミノ酸配列が配列番号：９に示された。

【0034】

二重特異性Ｔ細胞アダプターのＮ端は、第２のシグナルペプチドを更に含んでよく、そのアミノ酸配列が配列番号：１５に示された。また、本発明の多重特異性単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及びＴ細胞アダプターは、ＨＬＡ－Ｇ単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及び二重特異性Ｔ細胞アダプターをタンデムで接続するＰ２Ａペプチドを更に含んでよく、Ｐ２Ａペプチドのアミノ酸配列が配列番号：２７に示された。Ｐ２Ａペプチドは、発現された多重特異性単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及びＴ細胞アダプターを、ＨＬＡ－Ｇ単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及び二重特異性Ｔ細胞アダプターで自己切断し、更に二重特異性Ｔ細胞アダプターを切断して細胞外に分泌した。

【0035】

１．２．核酸
本発明の核酸は、前文に記載の多重特異性単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及びＴ細胞アダプターをコードするものであり、ＨＬＡ－Ｇ単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体をコードする断片及び二重特異性Ｔ細胞アダプターをコードする断片を５’端から３’端まで順に含む。

【0036】

ＨＬＡ－Ｇ単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体をコードする断片は、ＨＬＡ－Ｇ単一ドメイン抗体ユニットをコードする断片、膜貫通ドメインをコードする断片及びＣＤ３ｚシグナル伝達ドメインをコードする断片を含む。ＨＬＡ－Ｇ単一ドメイン抗体ユニットをコードする断片は、少なくとも１つのＨＬＡ－Ｇ単一ドメイン抗体をコードする断片を含み、且つ少なくとも１つのＨＬＡ－Ｇ単一ドメイン抗体をコードする断片のヌクレオチド配列が配列番号：３及び／又は配列番号：４に示された。膜貫通ドメインをコードする断片のヌクレオチド配列が配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２４又は配列番号：３０に示され、ＣＤ３ｚシグナル伝達ドメインをコードする断片のヌクレオチド配列が配列番号：２６に示された。

【0037】

ＨＬＡ－Ｇ単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体をコードする断片の５’端は、第１のシグナルペプチドをコードする断片を更に含んでよく、そのヌクレオチド配列が配列番号：１２に示された。ＨＬＡ－Ｇ単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体をコードする断片は、ＨＬＡ－Ｇ単一ドメイン抗体ユニットをコードする断片及び膜貫通ドメインをコードする断片をタンデムで接続するＣＤ８ヒンジ領域をコードする断片を更に含んでよく、ＣＤ８ヒンジ領域をコードする断片のヌクレオチド配列が配列番号：１８に示された。

【0038】

二重特異性Ｔ細胞アダプターをコードする断片は、ＨＬＡ－Ｇ単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体をコードする断片の３’端に接続され、且つＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体ユニットをコードする断片及びＣＤ３ｅ単一ドメイン抗体をコードする断片を含む。ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体ユニットをコードする断片は、少なくとも１つのＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体をコードする断片を含み、且つ少なくとも１つのＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体をコードする断片のヌクレオチド配列が配列番号：７及び／又は配列番号：８に示された。ＣＤ３ｅ単一ドメイン抗体をコードする断片のヌクレオチド配列が配列番号：１０に示された。

【0039】

二重特異性Ｔ細胞アダプターをコードする断片の５’端は、第２のシグナルペプチドをコードする断片を更に含んでよく、そのヌクレオチド配列が配列番号：１６に示された。本発明の核酸は、ＨＬＡ－Ｇ単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体をコードする断片及び二重特異性Ｔ細胞アダプターをコードする断片をタンデムで接続するＰ２Ａペプチドをコードする断片を更に含んでよく、Ｐ２Ａペプチドをコードする断片のヌクレオチド配列が配列番号：２８に示された。

【0040】

図２Ａ及び図２Ｂを参照されたく、図２Ａは、本発明の実施例１の核酸の構築を示す模式図であり、それは、インビトロ転写（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ；ＩＶＴ）ｍＲＮＡ技術により構築され、図２Ｂは、本発明の実施例２の核酸の構築を示す模式図であり、それは、レンチウイルスベクターによって構築された。図２Ａ及び図２Ｂにおけるラベルは、そのコードされたタンパク質である。

【0041】

実施例１の核酸及び実施例２の核酸は、第１のシグナルペプチドをコードする断片のヌクレオチド配列が配列番号：１２に示され、ＨＬＡ－Ｇ単一ドメイン抗体ユニットをコードする断片が２つのＨＬＡ－Ｇ単一ドメイン抗体をコードする断片を含み、そのヌクレオチド配列がそれぞれ配列番号：３（ＨＬＡ－Ｇ Ｎｂ ＃１）及び配列番号：４（ＨＬＡ－Ｇ Ｎｂ ＃１０９）に示され、膜貫通ドメインをコードする断片が配列番号：３０に示す４－１ＢＢ／ＴＹＫをコードする断片であり、ＣＤ３ｚシグナル伝達ドメインをコードする断片のヌクレオチド配列が配列番号：２６に示された。第２のシグナルペプチドをコードする断片のヌクレオチド配列が配列番号：１６に示され、ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体ユニットをコードする断片が２つのＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体をコードする断片を含み、そのヌクレオチド配列がそれぞれ配列番号：８（ＰＤ－Ｌ１ Ｎｂ ＃１５）及び配列番号：７（ＰＤ－Ｌ１ Ｎｂ ＃３）に示され、ＣＤ３ｅ単一ドメイン抗体をコードする断片のヌクレオチド配列が配列番号：１０に示された。実施例１及び実施例２におけるＧ－Ｓリンカー分子のヌクレオチド配列が配列番号：１４に示された。また、本発明の核酸は、構築されたシステムに応じて５’端のプロモーターを選択することができる。実施例１の核酸は、そのプロモーターがＴ７プロモーターであってよく、実施例２の核酸は、そのプロモーターがＥＦ－１ａプロモーターであってよい。

【0042】

１．３．ＨＬＡ－Ｇ単一ドメイン抗体
試験において、まずＨＬＡ－Ｇ単一ドメイン抗体を調製して、また表面プラズモン共鳴（ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ；ＳＰＲ）分析により速度論的分析及びＨＬＡ－Ｇ組換えタンパク質（Ｏｒｉｇｅｎｅ；ＣＡＴ＃：ＴＰ３０５２１６）との結合親和性分析を行った。本試験例において調製されたＨＬＡ－Ｇ単一ドメイン抗体は、配列番号：１（ＨＬＡ－Ｇ Ｎｂ ＃１）及び配列番号：２（ＨＬＡ－Ｇ Ｎｂ ＃１０９）に示すＨＬＡ－Ｇ単一ドメイン抗体を含む。

【0043】

図３Ａ、図３Ｂ及び以下の表１を参照されたく、図３Ａは、ＨＬＡ－Ｇ Ｎｂ ＃１の結合親和性を示す分析結果図であり、図３Ｂは、ＨＬＡ－Ｇ Ｎｂ ＃１０９の結合親和性を示す分析結果図であり、表１は、ＨＬＡ－Ｇ Ｎｂ ＃１（表において＃１と略す）及びＨＬＡ－Ｇ Ｎｂ ＃１０９（表において＃１０９と略す）の速度論的分析結果である。

【0044】

【表1】

【0045】

図３Ａ、図３Ｂ及び表１の結果からわかるように、本発明のＨＬＡ－Ｇ単一ドメイン抗体とＨＬＡ－Ｇは、優れた結合親和性を持ち、ＨＬＡ－Ｇ Ｎｂ ＃１のＫ_Ｄが０．１１ｎＭに、ＨＬＡ－Ｇ Ｎｂ ＃１０９のＫ_Ｄが２．６ｎＭに達することができる。

【0046】

試験において、更に本発明のＨＬＡ－Ｇ単一ドメイン抗体がＨＬＡ－ＧとＨＬＡ－Ｇ受容体との相互作用及び／又は結合をブロックできるかをテストし、試験においてテストするＨＬＡ－Ｇ受容体がＫＩＲ２ＤＬ４及びＬＩＬＲＢ１であり、使用されるＨＬＡ－Ｇ単一ドメイン抗体がＨＬＡ－Ｇ Ｎｂ ＃１であり、競合性ＥＬＩＳＡによりＨＬＡ－Ｇ Ｎｂ ＃１がビオチン化のＫＩＲ２ＤＬ４（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ；ＣＡＴ＃：１３０５２－Ｈ０２Ｓ）及びビオチン化のＬＩＬＲＢ１（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ；ＣＡＴ＃：１６０１４－Ｈ０８Ｈ）とＨＬＡ－Ｇ組換えタンパク質（Ｏｒｉｇｅｎｅ；ＣＡＴ＃：ＴＰ３０５２１６）との相互作用及び／又は結合をブロックできるかをテストした。試験は、対照群として市販のＨＬＡ－Ｇモノクローナル抗体（８７Ｇ；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を別に含む。

【0047】

図４及び図５を参照されたく、図４は、本発明のＨＬＡ－Ｇ単一ドメイン抗体のＬＩＬＲＢ１ブロック活性を示す分析結果図であり、図５は、本発明のＨＬＡ－Ｇ単一ドメイン抗体のＫＩＲ２ＤＬ４ブロック活性の分析結果図である。図４の結果からわかるように、８７ＧのＬＩＬＲＢ１に対するブロック活性のＩＣ_５０は１μＭを超え、ＨＬＡ－Ｇ Ｎｂ ＃１のＬＩＬＲＢ１に対するブロック活性のＩＣ_５０は約７０ｎＭである。図５の結果からわかるように、８７ＧのＫＩＲ２ＤＬ４に対するブロック活性のＩＣ_５０は約１０４ｎＭであり、ＨＬＡ－Ｇ Ｎｂ ＃１のＫＩＲ２ＤＬ４に対するブロック活性のＩＣ_５０は約２２ｎＭである。上記の結果からわかるように、本発明のＨＬＡ－Ｇ単一ドメイン抗体は、優れたＨＬＡ－ＧとＬＩＬＲＢ１／ＫＩＲ２ＤＬ４との相互作用及び結合をブロックする能力を持つ。

【0048】

試験において、本発明のＨＬＡ－Ｇ単一ドメイン抗体によるナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が媒介する細胞毒性の増強が腫瘍細胞に及ぼす影響を別にテストした。本試験においてテストする腫瘍細胞がＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞であり、テストするＨＬＡ－Ｇ単一ドメイン抗体がＨＬＡ－Ｇ Ｎｂ ＃１及びＨＬＡ－Ｇ Ｎｂ ＃１０９である。試験において、細胞密度が１×１０^５個／ウェルのＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を１２ウェルプレートに接種し、一晩培養した後、３×１０^５個／ウェル又は５×１０^５個／ウェルの初代ＮＫ細胞をＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を含むウェルに加えて、また１ｍｇ／ｍｌのＨＬＡ－Ｇ Ｎｂ ＃１及び／又はＨＬＡ－Ｇ Ｎｂ ＃１０９、或いは１０ｍｇ／ｍｌの８７Ｇをそれぞれ加えてから４８時間後、フローサイトメトリーによりＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ細胞が媒介する細胞毒性の測定を行って、初代ＮＫ細胞によるＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の特異的溶解を確認した。

【0049】

図６Ａ及び図６Ｂを参照されたく、本発明のＨＬＡ－Ｇ単一ドメイン抗体によるナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が媒介する細胞毒性の増強がＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞に及ぼす影響を示す分析結果図である。図６Ｂにおいて、＊はｐ＜０．０５を示し、＊＊はｐ＜０．０１を示した。図６Ａの結果からわかるように、ＨＬＡ－Ｇ Ｎｂ ＃１又はＨＬＡ－Ｇ Ｎｂ ＃１０９単独で処理した群別は、未処理の群別と比べると、本発明のＨＬＡ－Ｇ単一ドメイン抗体は何れも初代ＮＫ細胞によるＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の特異的溶解を増強できるが、同時にＨＬＡ－Ｇ Ｎｂ ＃１及びＨＬＡ－Ｇ Ｎｂ ＃１０９で処理した群別は、初代ＮＫ細胞によるＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の特異的溶解を更に増強できる。図６Ｂの結果からわかるように、ＨＬＡ－Ｇ Ｎｂ ＃１又はＨＬＡ－Ｇ Ｎｂ ＃１０９で処理した群別は、未処理の群別と比べると、本発明のＨＬＡ－Ｇ単一ドメイン抗体が初代ＮＫ細胞によるＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の特異的溶解を増強することは統計的に有意な差（ｐ＜０．０１）があり、ＨＬＡ－Ｇモノクローナル抗体－８７Ｇと比べると、同じ抗体濃度に変換する場合、本発明のＨＬＡ－Ｇ単一ドメイン抗体は初代ＮＫ細胞によるＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の特異的溶解を更に増強できる。

【0050】

１．４．ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体
試験において、まずＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体を調製して、また本発明のＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体がＰＤ－Ｌ１とＰＤ－Ｌ１受容体の相互作用及び／又は結合をブロックできるかをテストした。本試験例において調製されたＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体は、配列番号：５（ＰＤ－Ｌ１ Ｎｂ ＃３）及び配列番号：６（ＰＤ－Ｌ１ Ｎｂ ＃１５）に示すＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体を含む。

【0051】

ブロッキングテストは、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１ Ｂｌｏｃｋａｄｅ Ｂｉｏａｓｓａｙキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）によりテストを行い、使用されるＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体がＰＤ－Ｌ１ Ｎｂ ＃３及びＰＤ－Ｌ１ Ｎｂ ＃１５であり、テストするＰＤ－Ｌ１受容体がＰＤ－１である。試験において、細胞密度が１×１０^４個／ウェルのＰＤ－Ｌ１ ａＡＰＣ／ＣＨＯ－Ｋ１細胞を９６ウェルプレートに接種し、一晩培養した後、１×１０^４個／ウェルのＰＤ－１エフェクター細胞をＰＤ－Ｌ１ ａＡＰＣ／ＣＨＯ－Ｋ１細胞を含むウェルに加えて、また異なる濃度のＰＤ－Ｌ１ Ｎｂ ＃３、ＰＤ－Ｌ１ Ｎｂ ＃１５又はアテゾリズマブ（ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ）をそれぞれ加えてから６時間後、Ｂｉｏ－Ｇｌｏ（商標）試薬を加えＧｌｏＭａｘ（登録商標） Ｄｉｓｃｏｖｅｒシステムにより発光を測定した。Ｓｉｇｍａｐｌｏｔソフトウェアによりデータに対して４ＰＬ曲線を描いた。アテゾリズマブは、市販のＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体であり、対照群として用いられた。

【0052】

図７を参照されたく、本発明のＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体のＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１バイオブロッキング活性の分析結果図である。結果からわかるように、アテゾリズマブのＰＤ－１に対するブロック活性のＩＣ_５０は約４１ｎＭであり、ＰＤ－Ｌ１ Ｎｂ ＃１５のＰＤ－１に対するブロック活性ＩＣ_５０は約０．４８ｎＭであり、ＰＤ－Ｌ１ Ｎｂ ＃３のＰＤ－１に対するブロック活性のＩＣ_５０は約３７．７ｎＭである。本発明のＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体は優れたＰＤ－Ｌ１とＰＤ－１との相互作用及び結合をブロックする能力を持つことが示された。

【0053】

試験において、またＳＰＲ分析により本発明のＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体の速度論的分析及びＰＤ－Ｌ１組換えタンパク質（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ；ＣＡＴ＃：１００８４－Ｈ０５Ｈ）との結合親和性分析を行った。図８Ａ、図８Ｂ及び以下の表２を参照されたく、本発明のＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体の結合親和性の分析結果図である。図８ＡはＰＤ－Ｌ１ Ｎｂ ＃１５の結合親和性を示す分析結果図である。図８ＢはＰＤ－Ｌ１ Ｎｂ ＃３の結合親和性を示す分析結果図である。表２はＰＤ－Ｌ１ Ｎｂ ＃１５（表において＃１５と略す）及びＰＤ－Ｌ１ Ｎｂ ＃３（表において＃３と略す）の速度論的分析結果である。

【0054】

【表2】

【0055】

図８Ａ、図８Ｂ及び表２の結果からわかるように、本発明のＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体とＰＤ－Ｌ１は、優れた結合親和性を持ち、ＰＤ－Ｌ１ Ｎｂ ＃１５のＫ_Ｄが０．９１ｎＭに、ＰＤ－Ｌ１ Ｎｂ ＃３のＫ_Ｄが０．８６ｎＭに達することができる。

【0056】

試験において、本発明のＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体によるγδＴ細胞が媒介する細胞毒性の増強が腫瘍細胞に及ぼす影響を別にテストした。本試験においてテストする腫瘍細胞はＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞であり、テストするＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体はＰＤ－Ｌ１ Ｎｂ ＃１５及びＰＤ－Ｌ１ Ｎｂ ＃３である。試験において、細胞密度が１×１０^５個／ウェルのＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を１２ウェルプレートに接種し、一晩培養した後、３×１０^５個／ウェルの初代γδＴ細胞をＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を含むウェルに加えて、また１ｍｇ／ｍｌのＰＤ－Ｌ１ Ｎｂ ＃１５又はＰＤ－Ｌ１ Ｎｂ ＃３、或いは１０ｍｇ／ｍｌのアテゾリズマブをそれぞれ加えてから４８時間後、フローサイトメトリーによりＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ細胞が媒介する細胞毒性の測定を行って、初代γδＴ細胞によるＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の特異的溶解を決定した。

【0057】

図９を参照されたく、本発明のＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体によるγδＴ細胞が媒介する細胞毒性の増強がＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞に及ぼす影響を示す分析結果図である。＊はｐ＜０．０５を示した。結果からわかるように、ＰＤ－Ｌ１ Ｎｂ ＃１５又はＰＤ－Ｌ１ Ｎｂ ＃３で処理した群別は、未処理の群別と比べると、本発明のＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体が初代γδＴ細胞によるＭＡ－ＭＢ－２３１細胞の特異的溶解を増強することは統計的に有意な差（ｐ＜０．０５）があり、アテゾリズマブと比べると、同じ抗体濃度に変換する場合、本発明のＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体は初代γδＴ細胞によるＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の特異的溶解を更に増強できる。

【0058】

１．５．ＣＤ３ｅ単一ドメイン抗体
試験において、まずＣＤ３ｅ単一ドメイン抗体を調製して、また本発明のＣＤ３ｅ単一ドメイン抗体による末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びγδＴ細胞におけるＣＤ３^＋Ｔ細胞増殖への影響をテストし、本試験例において調製されたＣＤ３ｅ単一ドメイン抗体のアミノ酸配列が配列番号：９（ＣＤ３ｅ Ｎｂ）に示された。試験において、１ｍｇ／ｍｌのＣＤ３ｅ Ｎｂ、１０ｍｇ／ｍｌのＯＫＴ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；ＣＡＴ＃：ＭＡ１－１０１７５）が塗り付けられた、又は未処理の１２ウェルプレートを予備し、ＯＫＴ３が市販のＣＤ３モノクローナル抗体である。また１×１０^６個／ウェルのＰＢＭＣ又はγδＴ細胞をそれぞれ前記１２ウェルプレートに接種してから、またウェル毎に５０ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２（Ｇｉｂｃｏ；ＣＡＴ＃：ＰＨＣ００２１）及び２ｍｇ／ｍｌのＩＬ－１５（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ；ＣＡＴ＃：１０３６０－Ｈ０７Ｅ）を加えてから、７日後に総細胞数を記録して、ＦＩＴＣに結合したＯＫＴ３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ；ＣＡＴ＃：１１－００３７－４２）により染色し、フローサイトメトリーにより分析し、顕微鏡で４０×で写真を撮りＣＤ３陽性Ｔ細胞（ＣＤ３^＋Ｔ細胞）の数を計算し、その計算方法がＣＤ３^＋Ｔ細胞の百分率×総細胞数である。

【0059】

図１０を参照されたく、本発明のＣＤ３ｅ単一ドメイン抗体によるＰＢＭＣ及びγδＴ細胞におけるＣＤ３^＋Ｔ細胞増殖への影響を示す分析結果図である。＊はｐ＜０．０５を示し、＊＊はｐ＜０．０１を示し、＊＊＊はｐ＜０．００１を示した。結果からわかるように、ＰＢＭＣの部分において、本発明のＣＤ３ｅ単一ドメイン抗体及びＯＫＴ３での処理は何れもＰＢＭＣにおけるＣＤ３^＋Ｔ細胞の増殖を増強できるが、本発明のＣＤ３ｅ単一ドメイン抗体は未処理の群別又はＯＫＴ３で処理した群別の何れかと比べると、そのＰＢＭＣにおけるＣＤ３^＋Ｔ細胞増殖を増強する効果の何れも統計的差異がある（それぞれはｐ＜０．００１及びｐ＜０．０５）。γδＴ細胞の部分で、本発明のＣＤ３ｅ単一ドメイン抗体及びＯＫＴ３での処理は何れもγδＴ細胞におけるＣＤ３^＋Ｔ細胞の増殖を増強でき且つ差は統計学的に有意であり（それぞれはｐ＜０．００１及びｐ＜０．０１）、且つ本発明のＣＤ３ｅ単一ドメイン抗体はＯＫＴ３で処理した群別と比べると、その増強効果がより著しくなった。要するに、本発明のＣＤ３ｅ単一ドメイン抗体は、ＰＢＭＣ及びγδＴ細胞におけるＣＤ３^＋Ｔ細胞増殖を増強する優れた能力がある。

【0060】

二、本発明の多重特異性単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及びＴ細胞アダプターの発現細胞、その用途及び癌治療用の医薬組成物
図１１を参照されたく、本発明の実施例の核酸及び比較例の核酸の構築を示す模式図であり、ラベルがそのコードされたタンパク質である。実施例１の核酸（以下実施例１と略す）はＩＶＴ ｍＲＮＡ技術により構築され、実施例２の核酸（以下実施例２と略す）はレンチウイルスベクターにより構築され、構築の細部は前記の通りであり、ここに繰り返して説明しない。比較例１の核酸は、ＩＶＴ ｍＲＮＡ技術により構築されるＨＬＡ－Ｇ単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体であり、ＰＤ－Ｌ１及びＣＤ３ｅを標的とする二重特異性Ｔ細胞アダプターを含まない。比較例１の核酸において第１のシグナルペプチドをコードする断片は配列番号：１２に示すＣＤ８ａシグナルペプチドをコードする断片であり、ＨＬＡ－Ｇ単一ドメイン抗体ユニットをコードする断片は２個のＨＬＡ－Ｇ単一ドメイン抗体をコードする断片を含み、そのヌクレオチド配列がそれぞれ配列番号：３（ＨＬＡ－Ｇ Ｎｂ ＃１）及び配列番号：４（ＨＬＡ－Ｇ Ｎｂ ＃１０９）に示され、膜貫通ドメインをコードする断片は配列番号：３０に示す４－１ＢＢ／ＴＹＫをコードする断片であり、ＣＤ３ｚシグナル伝達ドメインをコードする断片のヌクレオチド配列が配列番号：２６に示された。

【0061】

試験において、２μｇの実施例１の核酸又は比較例１の核酸をそれぞれ１×１０^６個のγδＴ細胞にエレクトロポレーションして、実施例３の多重特異性単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及びＴ細胞アダプターの発現細胞（以下実施例３と略す）並びに比較例２のＨＬＡ－Ｇ単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体発現細胞（以下比較例２と略す）が得られた。また、レンチウイルスにより実施例２の核酸をγδＴ細胞に形質導入して、実施例４の多重特異性単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及びＴ細胞アダプターの発現細胞（以下実施例４と略す）が得られた。また１×１０^６個の比較例２、実施例３、実施例４及び親γδＴ細胞（以下親細胞と略す）をｉＦｌｕｏｒ ６４７に結合した抗ＶＨＨ抗体（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）により染色を行った。また１％ ＢＳＡを含むＰＢＳにより２回洗浄した後、フローサイトメトリーにより親細胞をバックグラウンドコントロールとして使用して、比較例２、実施例３及び実施例４が第１日～第７日の毎日のＨＬＡ－Ｇ単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体の発現状況を測定して、実施例１及び実施例２のγδＴ細胞における形質導入率を確認した。

【0062】

本発明の癌治療用の医薬組成物は、本発明の多重特異性単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及びＴ細胞アダプターの発現細胞を含む。前記癌治療用の医薬組成物は、例えば化学療法薬、標的療法薬、抗体薬、免疫調節剤又はそれらの組み合わせのような、別の癌治療の薬剤を更に含んでよいことが好ましい。

【0063】

図１２Ａ及び図１２Ｂを参照されたく、比較例２、実施例３及び実施例４のＨＬＡ－Ｇ単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体を発現する分析結果図である。図１２Ａは、第１日～第４日の分析結果図である。図１２Ｂは、第５日～第７日間の分析結果図である。図１２Ａ及び図１２Ｂの結果からわかるように、比較例２は第１日のＨＬＡ－Ｇ単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体の発現量が一番高く、５９．８％に達するが、発現量が日々に低減し、第７日の発現量が１３．５％だけである。実施例３のＨＬＡ－Ｇ単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体の発現量も第１日に一番高く、５６．１％に達し、発現量も日々に低減するが、第７日の発現量が依然として２６．１％である。実施例４は第１日のＨＬＡ－Ｇ単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体が１０．３％だけであるが、日々に増加して第６日の発現量が一番高く、７４％に達し、第７日になって５４．８％の発現量に低減した。上記の結果から示されるように、本発明の多重特異性単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及びＴ細胞アダプターの発現細胞は、その中に形質導入されたＨＬＡ－Ｇ単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体を安定的に発現することができる。

【0064】

試験において、更に本発明の多重特異性単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及びＴ細胞アダプターの発現細胞が腫瘍細胞に及ぼす細胞毒性をテストした。この試験において使用される多重特異性単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及びＴ細胞アダプターの発現細胞は実施例４であり、テストされる細胞はトリプルネガティブ乳癌（Ｔｒｉｐｌｅ－ｎｅｇａｔｉｖｅ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ；ＴＮＢＣ）細胞、多形神経膠芽腫細胞、肺癌細胞、卵巣癌細胞及び膵臓癌細胞を含み、ＴＮＢＣ細胞はＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞及びＭＤＡ－ＭＢ－２３１ ＨＬＡ－Ｇｏｖ細胞を含み、多形神経膠芽腫細胞はＧＢＭ－８９０１細胞及びＤＢＴＲＧ－０５ＭＧ細胞を含み、肺癌細胞はＡ５４９細胞及びＨ１９７５細胞を含み、卵巣癌細胞はＳＫＯＶ３細胞及びＳＫＯＶ３ ＨＬＡ－Ｇｏｖ細胞を含み、膵臓癌細胞はＡｓＰＣ１細胞である。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１ ＨＬＡ－Ｇｏｖ細胞は安定的にＨＬＡ－Ｇを過剰発現するＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞株であり、ＳＫＯＶ３ ＨＬＡ－Ｇｏｖ細胞は安定的にＨＬＡ－Ｇを過剰発現するＳＫＯＶ３細胞株であり、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によりそれぞれＨＬＡ－ＧをコードできるｐＣＭＶ１色素体をＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞株及びＳＫＯＶ３細胞株にトランスフェクトして得られた細胞株である。

【0065】

試験において、実施例４又は親細胞をエフェクター細胞として、３７℃でエフェクター細胞／腫瘍細胞（Ｅ：Ｔ）の割合が１：１、２：１、３：１、６：１及び１０：１である条件で、エフェクター細胞及び腫瘍細胞を共培養した。全ての腫瘍細胞が共培養前に、緑色蛍光を発するカルセイン－ＡＭで染色され、共培養の４８時間後に赤色蛍光を発するヨウ化プロピジウムで染色され、フローサイトメトリーによりＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ細胞が媒介する細胞毒性の測定を行って、実施例４による腫瘍細胞の特異的溶解を確認した。

【0066】

図１３Ａ～図１７を参照されたく、本発明の実施例４による腫瘍細胞の特異的溶解を示す分析結果図である。図１３Ａ及び図１３Ｂで分析された腫瘍細胞はＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞及びＭＤＡ－ＭＢ－２３１ ＨＬＡ－Ｇｏｖ細胞であり、図１４Ａ及び図１４Ｂで分析された腫瘍細胞はＧＢＭ－８９０１細胞及びＤＢＴＲＧ－０５ＭＧ細胞であり、図１５Ａ及び図１５Ｂで分析された腫瘍細胞はＡ５４９細胞及びＨ１９７５細胞であり、図１６Ａ及び図１６Ｂで分析された腫瘍細胞はＳＫＯＶ３細胞及びＳＫＯＶ３ ＨＬＡ－Ｇｏｖ細胞であり、図１７で分析された腫瘍細胞はＡｓＰＣ１細胞である。図１３Ａ～図１７において、＊はｐ＜０．０５を示し、＊＊はｐ＜０．０１を示し、＊＊＊はｐ＜０．００１を示した。

【0067】

図１３Ａ及び図１３Ｂの結果からわかるように、親細胞と比べると、実施例４はＥ：Ｔの割合が１：１、２：１、３：１、６：１及び１０：１である条件で何れもそのＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞及びＭＤＡ－ＭＢ－２３１ ＨＬＡ－Ｇｏｖ細胞に対する特異的溶解を増強でき、且つ差は統計学的に有意である。図１４Ａ及び図１４Ｂの結果からわかるように、親細胞と比べると、実施例４はＥ：Ｔの割合が１：１、２：１、３：１、６：１及び１０：１の条件で何れもそのＧＢＭ－８９０１細胞及びＤＢＴＲＧ－０５ＭＧ細胞に対する特異的溶解を増強でき、且つ差は統計学的に有意である。図１５Ａ及び図１５Ｂの結果からわかるように、親細胞と比べると、実施例４はＥ：Ｔの割合が１：１、２：１、３：１、６：１及び１０：１の条件で何れもそのＡ５４９細胞及びＨ１９７５細胞に対する特異的溶解を増強でき、且つ差は統計学的に有意である。図１６Ａ及び図１６Ｂの結果からわかるように、親細胞と比べると、実施例４はＥ：Ｔの割合が１：１、２：１、３：１、６：１及び１０：１の条件で何れもそのＳＫＯＶ３細胞及びＳＫＯＶ３ ＨＬＡ－Ｇｏｖ細胞に対する特異的溶解を増強でき、且つ差は統計学的に有意である。図１７の結果からわかるように、親細胞と比べると、実施例４はＥ：Ｔの割合が１：１、２：１、３：１、６：１及び１０：１の条件で何れもそのＡｓＰＣ１細胞に対する特異的溶解を増強でき、且つ差は統計学的に有意である。上記の結果からわかるように、本発明の多重特異性単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及びＴ細胞アダプターの発現細胞は、ＴＮＢＣ細胞、多形神経膠芽腫細胞、肺癌細胞、卵巣癌細胞又は膵臓癌細胞の何れもに対して優れた細胞毒性を有した。

【0068】

図１８及び図１を参照されたく、図１８は、本発明の多重特異性単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及びＴ細胞アダプターの発現細胞が多重特異性単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及びＴ細胞アダプターを分泌する作用機序を示す模式図である。本発明の多重特異性単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及びＴ細胞アダプターはＨＬＡ－Ｇ単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体と二重特異性Ｔ細胞アダプターとの間に自己切断ができるＰ２Ａペプチドがあるため、多重特異性単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及びＴ細胞アダプターの発現細胞が多重特異性単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及びＴ細胞アダプターを発現した後、二重特異性Ｔ細胞アダプターを切断でき、それを細胞外へ分泌した。

【0069】

本発明の多重特異性単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及びＴ細胞アダプターの発現細胞における二重特異性Ｔ細胞アダプターの分泌状況をテストするために、試験において、親細胞、実施例３又は実施例４とＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を３：１のＥ：Ｔの割合でＰＤ－Ｌ１が塗り付けられた１２ウェルプレートに接種し、共培養の４８時間後、抗ＣＤ３の抗体で二重特異性Ｔ細胞アダプターの分泌量を検出した。

【0070】

図１９を参照されたく、本発明の多重特異性単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及びＴ細胞アダプターの発現細胞が二重特異性Ｔ細胞アダプターを分泌する分析結果図である。結果からわかるように、共培養前のデータと比べると、実施例３又は実施例４に関わらず、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞と共培養した後、何れも二重特異性Ｔ細胞アダプターの分泌量を増加させることができ、これは本発明の多重特異性単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及びＴ細胞アダプターの発現細胞が分泌される二重特異性Ｔ細胞アダプターが検出可能なものであると示された。

【0071】

本試験において、更に細胞侵入不可能なｔｒａｎｓｗｅｌｌ膜（孔径が０．４μｍ）により本発明の多重特異性単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及びＴ細胞アダプターの発現細胞から放出された多重特異性単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及びＴ細胞アダプターの腫瘍細胞に対する細胞毒性を評価することができる。試験において、エフェクター細胞（ＰＢＭＣ）及び／又は腫瘍細胞（ＧＢＭ－８９０１細胞又はＤＢＴＲＧ－０５ＭＧ）を５：１のＥ：Ｔの割合で１２ウェルプレートの底部に接種してから、細胞侵入不可能なｔｒａｎｓｗｅｌｌ膜を含む又は含まない上部空間に５×１０^５の実施例３、親細胞又は比較例２を加えた。指定の時点で、底部細胞に対してＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ細胞が媒介する細胞毒性の測定を行って、フローサイトメトリーにより分析した。

【0072】

図２０Ａ、図２０Ｂ及び図２０Ｃを参照されたく、実施例３、親細胞又は比較例２の条件培地でのＰＢＭＣによって誘発される細胞毒性に対する増強による多形神経膠芽腫細胞への影響を示す分析結果図である。図２０Ａは顕微鏡写真図であり、図２０Ｂ及び図２０Ｃは図２０Ａの統計結果図であり、且つ＊はｐ＜０．０５を示し、＊＊はｐ＜０．０１を示し、＊＊＊はｐ＜０．００１を示した。図２０Ａ及び図２０Ｂの結果からわかるように、未処理のブランク対照群と比べると、親細胞、比較例２及び実施例３の条件培地は何れもＰＢＭＣによって誘発される細胞毒性を増強でき、更にＧＢＭ－８９０１細胞に対する特異的溶解を引き起こすが、実施例３の条件培地で増強されたＰＢＭＣによって誘発される細胞毒性は著しく他の群別よりも好ましく、親細胞又は比較例２と比べると、差の何れも統計的に有意である（それぞれはｐ＜０．００１及びｐ＜０．０５）。図２０Ａ及び図２０Ｃの結果からわかるように、未処理のブランク対照群と比べると、親細胞、比較例２及び実施例３の条件培地の何れもＰＢＭＣによって誘発される細胞毒性を増強でき、更にＤＢＴＲＧ－０５ＭＧ細胞に対する特異的溶解を引き起こすが、実施例３の条件培地でＰＢＭＣによって誘発される細胞毒性は著しく他の群別よりも好ましく、親細胞又は比較例２と比べると、差の何れも統計的に有意である（それぞれはｐ＜０．０５及びｐ＜０．０５）。上記の結果からわかるように、本発明の多重特異性単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及びＴ細胞アダプターの発現細胞は、確実に二重特異性Ｔ細胞アダプターを細胞培地に分泌でき、更にエフェクター細胞の腫瘍細胞に対する細胞毒性を増強して特異的溶解を引き起こした。

【0073】

更に、本発明の多重特異性単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及びＴ細胞アダプターの発現細胞が癌治療の有効性があるかをテストするために、図２１Ａを参照されたく、本発明の多重特異性単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及びＴ細胞アダプターの発現細胞による動物介在療法の試験策略を示す模式図である。試験の１０日前（第－１０日）に、まず同所性異種移植乳房腫瘍ＰＢＭＣ－ｈｕＮＧＳマウスモデルを作り、雌のＮＧＳマウスの左側第４乳腺に１×１０^６個のＭＤＡ－ＭＢ－２３１－ｌｕｃ細胞を皮下注射し、移植の７日後（第－３日）、尾静脈注射で５×１０^６個のｈｕＰＢＭＣ細胞をＮＧＳマウスに注射して、同所性異種移植乳房腫瘍ＰＢＭＣ－ｈｕＮＧＳマウスモデル（以下腫瘍マウスと略す）を作った。また３日後（第０日）から治療を行い、治療形態は尾静脈注射で１×１０^７個の親細胞又は実施例４を腫瘍マウスに注射し、追加して週に１回１×１０^７個の親細胞又は実施例４を腫瘍マウスに注射し、追加回数が３回（第７日、第１４日及び第２１日）である。腫瘍マウスに対して、治療中に、週にインビボイメージングシステム（ＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ；ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）により監視腫瘍の成長状況を監視し、監視時点が第０日、第７日、第１４日、第２１日、第２８日、第３５日、第４２日、第４９日、第５６日、第６３日、第７０日、第７７日及び第８４日である。また、腫瘍マウスの生存率はＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ生存曲線によって分析された。

【0074】

図２１Ｂ、図２１Ｃ及び図２１Ｄを参照されたく、本発明の多重特異性単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及びＴ細胞アダプターの発現細胞による腫瘍マウスの腫瘍成長阻害への影響の分析結果図である。図２１ＢはＩＶＩＳの画像図であり、写真の下の番号は腫瘍マウスの試験群別における番号である。図２１Ｃは各組の腫瘍マウスの各監視時点での生物発光量であり、生物発光量が腫瘍のサイズに比例した。図２１Ｄは各群の腫瘍マウスのＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ生存曲線図である。

【0075】

結果からわかるように、治療されていない腫瘍マウス（以下担体群と略す）の腫瘍が第０日から徐々に成長しはじめ、第６３日になってもう全ての担体群の腫瘍マウス（ｎ＝６）も死亡した。親細胞で治療された腫瘍マウス（以下親細胞群と略す）は担体群と比べると、その腫瘍の成長速度が遅いが、第０日から腫瘍のサイズも時間の経つにつれて増加し、第８１日になってもう全ての親細胞群の腫瘍マウス（ｎ＝６）も死亡した。実施例４で治療された腫瘍マウス（以下実施例４群と略す）はその腫瘍サイズが制御され、ひいては６匹の実施例４群における２匹の腫瘍マウスは第８４日に腫瘍残存のシグナルが検出されなく、１匹の生存日間数が第１２８日に伸ばすことができる。上記の結果からわかるように、本発明の多重特異性単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及びＴ細胞アダプターの発現細胞は、腫瘍阻害の有効性を増強し、効果的に同所性異種移植乳房腫瘍ＰＢＭＣ－ｈｕＮＧＳマウスの生存時間を延長することができる。

【0076】

要するに、本発明の多重特異性単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及びＴ細胞アダプターは、特に腫瘍細胞の細胞膜で発現するＨＬＡ－Ｇと特異的結合されるため、本発明の多重特異性単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及びＴ細胞アダプターを発現する発現細胞を特異的に腫瘍細胞を標的とし、オフターゲット効果を回避することができる。また、本発明の多重特異性単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及びＴ細胞アダプターは、Ｔ細胞表面のＣＤ３分子及び腫瘍細胞表面のＰＤ－Ｌ１の二重特異性Ｔ細胞アダプターを特異的に認識でき、同時にＴ細胞を活性化させ、免疫チェックポイントの活性化をブロックすることができ、更に効果的に腫瘍細胞を殺して、哺乳動物の腫瘍細胞死を誘発する薬物の調製に用いられることができる。本発明の癌治療用の医薬組成物は、本発明の多重特異性単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及びＴ細胞アダプターの発現細胞を含み、効果的に腫瘍細胞を殺して癌を治療することができる。実験データによって確認されるように、本発明の多重特異性単一ドメイン抗体キメラ抗原受容体及びＴ細胞アダプターの発現細胞は、動物モデルにおいて腫瘍の進行を阻害する優れた効果をもち、生物医学ヘルスケア市場に適用される可能性がある。

【0077】

本発明は実施形態によって前上記の通りに開示されたが、本発明を限定するためのものではなく、当業者であれば、本発明の精神と範囲から逸脱しない限り、多様の変更や修飾を加えることができる。従って、本発明の保護範囲は、下記特許請求の範囲で指定した内容を基準とする。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図3A】

【図3B】

【図4】

【図5】

【図6A】

【図6B】

【図7】

【図8A】

【図8B】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12A】

【図12B】

【図13A】

【図13B】

【図14A】

【図14B】

【図15A】

【図15B】

【図16A】

【図16B】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20A】

【図20B】

【図20C】

【図21A】

【図21B】

【図21C】

【図21D】

【配列表】

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