特許 7430865 微生物植病原体の増殖を抑制する光線力学的方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-02-05

(45)【発行日】2024-02-14

(54)【発明の名称】微生物植病原体の増殖を抑制する光線力学的方法

(51)【国際特許分類】

   A01N 43/90 20060101AFI20240206BHJP

   A01P 3/00 20060101ALI20240206BHJP

   A01N 35/02 20060101ALI20240206BHJP

   A01N 43/72 20060101ALI20240206BHJP

   A01N 25/00 20060101ALI20240206BHJP

   A01N 59/20 20060101ALI20240206BHJP

【ＦＩ】

A01N43/90 105

A01P3/00

A01N35/02

A01N43/90 101

A01N43/72

A01N25/00 102

A01N59/20 Z

【請求項の数】 37

(21)【出願番号】P 2022518778

(86)(22)【出願日】2019-09-24

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-12-26

(86)【国際出願番号】 US2019052796

(87)【国際公開番号】W WO2021061109

(87)【国際公開日】2021-04-01

【審査請求日】2022-09-02

(73)【特許権者】

【識別番号】522113981

【氏名又は名称】ティーディーエー リサーチ インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】ＴＤＡ ＲＥＳＥＡＲＣＨ， ＩＮＣ．

【住所又は居所原語表記】１２３４５ Ｗｅｓｔ ５２ｎｄ Ａｖｅｎｕｅ， Ｗｈｅａｔ Ｒｉｄｇｅ， ＣＯ ８００３３ （ＵＳ）

(74)【代理人】

【識別番号】100180781

【弁理士】

【氏名又は名称】安達 友和

(74)【代理人】

【識別番号】100182903

【弁理士】

【氏名又は名称】福田 武慶

(72)【発明者】

【氏名】フランス，クリストファー，ブリアン

(72)【発明者】

【氏名】ウィリアム，ベル

【審査官】澤田 浩平

(56)【参考文献】

【文献】米国特許出願公開第２０１７／００６４９６４（ＵＳ，Ａ１）

【文献】特公昭４８－００３８３８（ＪＰ，Ｂ１）

【文献】国際公開第０３／０７５６６４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】Journal of the American Society for Horticultural Science，123(6)，pp.987-991

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ０１Ｎ，Ａ０１Ｐ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

植物の微生物病原体の増殖を抑制する方法であって、
前記植物に以下を含む組み合わせを適用することと：
活性酸素種光増感剤である色素含有化合物；および
前記微生物病原体に対する前記色素含有化合物の微生物致死率を高めるための銅化合物；
前記植物に光を暴露して、前記色素含有化合物と前記銅化合物の前記組み合わせを活性化させ、植物の微生物病原体の増殖を抑制することと、を含み、
前記微生物病原体に対する前記組み合わせの前記微生物致死率を高めるために、前記植物にアスコルビン酸塩を適用することをさらに含む、方法。

【請求項2】

前記銅化合物が銅塩であることにより、前記微生物病原体に対する前記色素含有化合物の前記微生物致死率を高める、植物の微生物病原体の増殖を抑制するための請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記銅塩は、前記活性酸素種光増感剤単独の微生物病原体増殖抑制と比較して前記微生物病原体増殖抑制を増加させるのに十分な量で提供される、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記銅塩および前記色素含有化合物は、前記微生物病原体の増殖を抑制するために相乗的に有効な量で提供される、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

前記銅塩および前記色素含有化合物は、前記微生物病原体の増殖を抑制するために相乗的に有効な量で提供され、前記組み合わせは、相加的な効果モデルに基づいて期待されるｌｏｇキル（ｌｏｇ ｋｉｌｌ）と比較して、少なくとも１桁の大きさで微生物病原体のｌｏｇキルを増加させ、前記相加的な効果モデルは、式、Ｐ＝Ｘ＋Ｙ（１００－１）／１００によって計算されるように、期待殺傷率を決定し、式中、Ｐは前記活性酸素種光増感剤および前記銅塩の前記組み合わせを用いた病原体の期待殺傷率であり、Ｘは前記活性酸素種光増感剤を単独で使用した場合の前記病原体の殺傷率、Ｙは前記銅塩を単独で使用した場合の前記病原体の殺傷率である、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

前記色素含有化合物は、リボフラビン、誘導体化リボフラビン、ルミクローム、誘導体化ルミクローム、クルクミン、フルオレセイン、エオシンＹ、エリスロシン、フラビン含有化合物およびローズベンガルＢからなる群から選択される、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記色素含有化合物は、リボフラビンである、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

銅塩は、硫酸銅（ＩＩ）、硝酸銅（ＩＩ）、水酸化銅、炭酸銅、塩化銅、酸化銅、および臭化銅からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。

【請求項9】

前記色素含有化合物は、質量基準で約１～１００ｐｐｍの濃度で提供され、銅塩は、質量基準で約０．１～１００ｐｐｍの銅の濃度で提供される、請求項１に記載の方法。

【請求項10】

前記色素含有化合物は、質量基準で約５～５０ｐｐｍの濃度で提供され、前記銅塩は、銅の質量基準で約２～１０ｐｐｍの濃度で提供される、請求項８に記載の方法。

【請求項11】

前記植物を光に暴露することは、前記植物を自然光に暴露することを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項12】

前記植物を光に暴露することは、前記植物を人工光に暴露することを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項13】

前記組み合わせは、土壌浸漬、ピペッティング（ｐｉｐｅｔｔｉｎｇ）、灌漑、噴霧、リスティング（ｌｉｓｔｉｎｇ）、散水、注ぎ込みの少なくとも１つによって前記植物に適用される、請求項１に記載の方法。

【請求項14】

前記微生物病原体は、細菌性病原体、シアノバクテリア、藻類、真菌性病原体、またはウイルス病原体のいずれかを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項15】

前記植物は、非木質作物植物、木質植物、芝草、果実のなる木、木の実のなる木、または観賞用植物である、請求項１に記載の方法。

【請求項16】

前記組み合わせは、少なくとも１つの農業上許容されるアジュバントをさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項17】

前記農業上許容されるアジュバントは、界面活性剤、浸透剤、湿潤剤、展着剤、保湿剤および乳化剤からなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

前記色素含有化合物および銅塩は、前記植物に同時に適用される、請求項１に記載の方法。

【請求項19】

前記色素含有化合物および銅塩は、前記植物に順に適用される、請求項１に記載の方法。

【請求項20】

前記植物に前記組み合わせを適用することは、前記組み合わせの成分を含む組成物を前記植物に適用することを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項21】

銅塩は、前記植物または環境に対する不要な損傷を避けるために、質量基準で１００ｐｐｍ未満の濃度で使用される、請求項１に記載の方法。

【請求項22】

前記色素含有化合物および銅塩は、有機農法に適している、請求項１に記載の方法。

【請求項23】

前記銅塩と反応して活性酸素種を生成するために、アスコルビン酸および炭酸水素ナトリウムを前記植物に適用することをさらに含む、請求項４に記載の方法。

【請求項24】

活性酸素種光増感剤である前記色素含有化合物は、リボフラビン、誘導体化リボフラビン、ルミクローム、誘導体化ルミクローム、クルクミン、フルオレセイン、エオシンＹ、エリスロシン、およびローズベンガルＢからなる群から選択され；前記銅化合物が銅イオン含有有機錯体であり、前記微生物病原体に対する前記色素含有化合物の前記微生物致死率を増大させる、請求項１に記載の方法。

【請求項25】

前記銅イオン含有有機錯体は、前記活性酸素種光増感剤単独の微生物病原体増殖抑制と比較して前記微生物病原体増殖抑制を増加させるのに十分な量で提供される、請求項２４に記載の方法。

【請求項26】

前記銅イオン含有有機錯体および前記色素含有化合物は、前記微生物病原体の増殖を抑制するために相乗的に有効な量で提供され、前記組み合わせは、前記活性酸素種光増感剤と前記銅イオン含有有機錯体をそれぞれ単独で使用した場合の前記微生物病原体増殖抑制の和よりも大きい程度に微生物病原体増殖抑制を高める、請求項２５に記載の方法。

【請求項27】

前記銅イオン含有有機錯体は、前記微生物病原体の増殖を抑制するために相乗的に有効な量で提供され、前記組み合わせは、相加的な効果モデルに基づいて期待されるｌｏｇキルと比較して、少なくとも１ｌｏｇまたは少なくとも１桁の大きさで微生物病原体のｌｏｇキルを増加させ、前記相加的な効果モデルは、式、Ｐ＝Ｘ＋Ｙ（１００－１）／１００によって計算されるように、期待殺傷率を決定し、式中、Ｐは前記活性酸素種光増感剤および前記銅イオン含有有機錯体の前記組み合わせを用いた病原体の期待殺傷率であり、Ｘは前記活性酸素種光増感剤を単独で使用した場合の前記病原体の殺傷率、Ｙは前記銅イオン含有有機錯体を単独で使用した場合の前記病原体の殺傷率である、請求項２５に記載の方法。

【請求項28】

前記色素含有化合物は、リボフラビンである、請求項２４に記載の方法。

【請求項29】

前記銅イオン含有有機錯体は、銅エタノールアミン、銅ＥＤＴＡ、クラウンエーテルに錯化された銅イオン、およびポリエチレングリコールに錯化された銅イオンからなる群から選択される、請求項２４に記載の方法。

【請求項30】

前記組み合わせは、少なくとも１つの農業上許容されるアジュバントをさらに含む、請求項２４に記載の方法。

【請求項31】

前記農業上許容されるアジュバントは、界面活性剤、浸透剤、湿潤剤、展着剤、保湿剤および乳化剤からなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。

【請求項32】

前記色素含有化合物および前記銅イオン含有有機錯体は、前記植物に同時に適用される、請求項２４に記載の方法。

【請求項33】

前記色素含有化合物および前記銅イオン含有有機錯体は、前記植物に順に適用される、請求項２４に記載の方法。

【請求項34】

前記植物に前記組み合わせを適用することは、前記組み合わせの成分を含む組成物を前記植物に適用することを含む、請求項２４に記載の方法。

【請求項35】

前記銅イオン含有有機錯体は、前記植物または環境に対する不要な損傷を避けるために、質量基準で１００ｐｐｍ未満の濃度で使用される、請求項２４に記載の方法。

【請求項36】

前記色素含有化合物および前記銅イオン含有有機錯体は、有機農法に適している、請求項２４に記載の方法。

【請求項37】

銅塩と反応して活性酸素種を生成するために、アスコルビン酸および炭酸水素ナトリウムを前記植物に適用することをさらに含む、請求項２７に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

（連邦政府出資の研究または開発に関する記述）
本発明は、米国農務省契約番号２０１７－３３６１０－２７３０３による米国政府の資金を利用して行われたものである。政府は、この発明について一定の権利を有する。

【0002】

（発明の分野）
技術分野は概して、光増感剤化合物と少量であるが相乗的に有効な量の銅化合物の両方を含む化合物および組成物を使用する、植物における微生物病原体の光線力学的抑制に関する。より具体的には、技術分野は、少量の銅化合物によって抑制が劇的に増加する植物における微生物病原体の光線力学的抑制に関する。この分野はさらに、有機農業的方法と一致して使用され得、特定の環境規制から免除されるような低濃度の銅化合物を使用する方法に関する。

【背景技術】

【0003】

活性酸化種による植物病原体の抑制は、作用機序のために標的生物において耐性が発達するのが遅いという利点を有する。第２の利点は、酸化種は一般的な材料との反応によって分解する傾向があり、したがって環境に残留しないため、一般に他の抗菌剤よりも環境への危険性が少ないことである。抗菌剤として酸化剤を使用することの不利な点は、それらの反応性に関連する：酸化剤は迅速に反応するため、その効果は持続しない。これはそれらの有効性を制限し得、頻繁な再適用が必要になり得る。例として、過酸化水素は効果的な抗菌剤および農薬であるが、水と酸素への分解を触媒するなど、一般的な材料が過酸化水素と反応し得るため、有用性は限られる。

【0004】

酸化性抗菌種はまた、それらが光エネルギーによって駆動される反応によって必要とされる場所で生成され得る。このプロセスは、光線力学的療法または光線力学的抑制と呼ばれる。微生物病原体の光線力学的抑制は、微生物病原体に有害な影響を与え得る一重項酸素などの活性酸素種（ＲＯＳ）を生成するために、感光剤を光に暴露することを含む。この光線力学療法（ＰＤＴ）は、酸素を消費し、過酸化物、スーパーオキシドアニオン（Ｏ_２ ^－１）、ヒドロキシルラジカル（・ＯＨ）、ヒドロペルオキシルラジカル（・ＯＯＨ）、および一重項酸素（^１Ｏ_２）を含むいくつかの活性酸素種（ＲＯＳ）の少なくとも１つを生成する。ＰＤＴには、光エネルギーを活性酸素種に変換する効率を高める光活性化剤または光触媒が必要である。このプロセスは、抗菌光線力学療法（ａＰＤＴ）とも呼ばれる。既存の光線力学的抑制技術および用途には、さまざまな欠点がある。例えば、感光剤は、単独で使用した場合の効果が低いか、有機農業の慣行と一致しない物質から作られているか、またはその両方である。

【0005】

別のクラスの抗菌材料は、銅化合物（例えば、硫酸銅（ＣｕＳＯ４）および水酸化銅（Ｃｕ（ＯＨ）２））からなる。銅化合物は農薬として使用される；ただし、農薬として銅化合物を使用することにはいくつかの欠点がある。第一に、銅塩は農薬として広く使用されているため、一部の害虫は耐性を発達させている。第二に、銅は環境への危険性もあり、地表水への銅の排出は制限され得る。最後に、農薬として使用される銅塩は、水溶液中において高濃度で作物に適用され（例えば、水中で１％の硫酸銅）、蒸発によって作物に析出物が残り得る。これらの析出物は望ましくなく、作物の価値を低下させる。環境中の高レベルの銅の広い散布は、農業における高濃度の銅系抗菌剤の継続的な使用に対する厳しい制限である。

【0006】

（本発明の簡単な説明）
本発明は先行技術の制限を解決し、植物の微生物病原体の増殖を抑制する方法を提供し、該方法は、活性酸素種光増感剤である色素含有化合物；および微生物病原体に対する色素含有化合物の微生物致死率を高めるための銅化合物を含む組み合わせを植物に適用することと、植物に光を暴露して、色素含有化合物と銅化合物の組み合わせを活性化させ、植物の微生物病原体の増殖を抑制することと、を含む。特定の実施形態では、銅化合物は、微生物病原体に対する色素含有化合物の微生物致死率を高める銅塩である。銅塩は、活性酸素種光増感剤単独の微生物病原体増殖抑制と比較して微生物病原体増殖抑制を増加させるのに十分な量で提供され得る。

【0007】

本発明の特に有益な実施形態では、銅塩および色素含有化合物は、微生物病原体の増殖を抑制するために相乗的に有効な量で提供される。微生物病原体の増殖の相乗的に有効な抑制が定義され得、組み合わせは、相加的な効果モデルに基づいて期待されるキル（ｋｉｌｌ）と比較して、微生物病原体のキルを少なくとも１桁増加させる。微生物病原体のキルがｌｏｇキル（ｌｏｇ ｋｉｌｌ）単位で測定される場合、相乗的に有効なキルは、キルが１ｌｏｇ単位で増加することである。この相加的な効果モデルは、式、Ｐ＝Ｘ＋Ｙ（１００－１）／１００によって計算されるように、期待殺傷率を決定し、式中、Ｐは活性酸素種光増感剤および銅塩の組み合わせを用いた病原体の期待殺傷率であり、Ｘは活性酸素種光増感剤を単独で使用した場合の病原体の殺傷率、Ｙは銅塩を単独で使用した場合の病原体の殺傷率である。

【0008】

好ましい実施形態では、色素含有化合物は、リボフラビン、誘導体化リボフラビン、ルミクローム、誘導体化ルミクローム、クルクミン、フルオレセイン、エオシンＹ、エリスロシン、フラビン含有化合物およびローズベンガルＢからなる群から選択される。最も好ましくは、色素含有化合物は、リボフラビンである。

【0009】

好ましい実施形態では、銅塩は、硫酸銅（ＩＩ）、硝酸銅（ＩＩ）、水酸化銅、炭酸銅、塩化銅、酸化銅、および臭化銅からなる群から選択される。

【0010】

任意の実施形態では、方法は、微生物病原体に対する前記組み合わせの微生物致死率を高めるために、植物にアスコルビン酸塩を適用するステップをさらに含む。

【0011】

実施形態では、色素含有化合物は、質量基準で約１～１００ｐｐｍの濃度で提供され得、銅塩は、質量基準で約０．１～１００ｐｐｍの銅の濃度である。より好ましくは、色素含有化合物は、質量基準で約５～５０ｐｐｍの濃度で提供され、銅塩は、銅の質量基準で約２～１０ｐｐｍの濃度で提供される。

【0012】

実施形態では、植物を光に暴露することは、植物を自然光に暴露することを含む、またはその代わりに、植物を光に暴露することは、植物を人工光に暴露することを含む。

【0013】

組み合わせは、土壌浸漬、ピペッティング（ｐｉｐｅｔｔｉｎｇ）、灌漑、噴霧、リスティング（ｌｉｓｔｉｎｇ）、散水、注ぎ込みの少なくとも１つによって植物に適用され得る。

【0014】

微生物病原体は、細菌性病原体、シアノバクテリア、藻類、真菌性病原体、またはウイルス病原体のいずれかを含み得る。植物は、非木質作物植物、木質植物、芝草、果実のなる木、木の実のなる木、または観賞用植物であり得る。組み合わせは、少なくとも１つの農業上許容されるアジュバントをさらに含み得、農業上許容されるアジュバントは、界面活性剤、浸透剤、湿潤剤、展着剤、保湿剤および乳化剤からなる群から選択され得る。

【0015】

色素含有化合物および銅塩は、同時に植物に適用され得る、または順に植物に適用され得る。組み合わせは、組み合わせの成分を含む組成物を植物に適用することによって植物に適用され得る。

【0016】

好ましい実施形態では、銅塩は、植物または環境に対する不要な損傷を避けるために、質量基準で１００ｐｐｍ未満の濃度で使用される。別の実施形態では、色素含有化合物および銅塩は、有機農法に適している。

【0017】

任意の実施形態では、方法は、銅塩と反応して活性酸素種を生成するためのアスコルビン酸および炭酸水素ナトリウム、またはその代わりに銅塩と反応して活性酸素種を生成するためのアスコルビン酸塩を植物に適用するステップをさらに含む。方法のアスコルビン酸塩は、農業上許容される塩であり得る。

【0018】

好ましい実施形態では、活性酸素種光増感剤である色素含有化合物は、リボフラビン、誘導体化リボフラビン、ルミクローム、誘導体化ルミクローム、クルクミン、フルオレセイン、エオシンＹ、エリスロシン、およびローズベンガルＢからなる群から選択され；銅化合物が銅イオン含有有機錯体であり、微生物病原体に対する色素含有化合物の微生物致死率を増大させる。

【0019】

任意の実施形態では、銅イオン含有有機錯体は、活性酸素種光増感剤単独の微生物病原体増殖抑制と比較して微生物病原体増殖抑制を増加させるのに十分な量で提供される。

【0020】

好ましい実施形態では、銅イオン含有有機錯体および色素含有化合物は、微生物病原体の増殖を抑制するために相乗的に有効な量で提供され、前記組み合わせは、活性酸素種光増感剤と銅イオン含有有機錯体をそれぞれ単独で使用した場合の微生物病原体増殖抑制の和よりも大きい程度に微生物病原体増殖抑制を高める。別の実施形態では、銅イオン含有有機錯体および色素含有化合物は、微生物病原体の増殖を抑制するために相乗的に有効な量で提供され、組み合わせは、相加的な効果モデルに基づいて期待されるｌｏｇキルと比較して、少なくとも１ｌｏｇ、または１桁の大きさで微生物病原体のｌｏｇキルを増加させ、相加的な効果モデルは、式、Ｐ＝Ｘ＋Ｙ（１００－１）／１００によって計算されるように、期待殺傷率を決定し、式中、Ｐは活性酸素種光増感剤および銅イオン含有有機錯体の組み合せを用いた病原体の期待殺傷率であり、Ｘは活性酸素種光増感剤を単独で使用した場合の病原体の殺傷率であり、Ｙは銅イオン含有有機錯体を単独で使用した場合の病原体の殺傷率である。好ましい実施形態では、色素含有化合物はリボフラビンである。他の好ましい実施形態では、銅イオン含有有機錯体は、銅エタノールアミン、銅ＥＤＴＡ、クラウンエーテルに錯化された銅イオン、およびポリエチレングリコールに錯化された銅イオンからなる群から選択される。方法は、少なくとも１つの農業上許容されるアジュバントをさらに含み得、任意で農業上許容されるアジュバントは、界面活性剤、浸透剤、湿潤剤、展着剤、保湿剤および乳化剤からなる群から選択され得る。

【0021】

任意の実施形態では、色素含有化合物および銅イオン含有有機錯体は、同時に植物に適用され得る、または任意で順に植物に適用され得る。方法は、組み合わせを組み合わせの成分を含む組成物を植物に適用することによって植物に適用することを含む。

【0022】

好ましくは、銅イオン含有有機錯体は、植物または環境に対する不要な損傷を避けるために、質量基準で１００ｐｐｍ未満の濃度で使用される。好ましくは、色素含有化合物および銅イオン含有有機錯体は、有機農法に適している。

【0023】

任意の実施形態では、方法は、銅塩と反応して活性酸素種を生成するためのアスコルビン酸および炭酸水素ナトリウムを植物に適用するステップ、または銅塩と反応して活性酸素種を生成するためのアスコルビン酸塩を植物に適用するステップを含み得る。アスコルビン酸塩は、農業上許容される塩であり得る。

【図面の簡単な説明】

【0024】

【図1】リボフラビンの構造。

【0025】

【図2】ルミクロームの構造。

【0026】

【図3】フラビン含有化合物、フラビンモノヌクレオチドの例。

【0027】

【図4】修飾フラビン、ＦＬＡＳＨ－０１ａの構造。

【0028】

【図5】修飾フラビン、ＦＬＡＳＨ－０７ａの構造。

【0029】

【図6】クルクミン、エノール、およびケトの形態の構造。

【0030】

【図7】ハロゲン化キサンテンローズベンガルの構造。

【0031】

【図8】フェノチアジニウムメチレンブルーの構造。

【0032】

【図9】トリスカチオン性フラーレンＢＢ６の代表的な構造。

【0033】

【図10】フルオレセインの構造。

【0034】

【図11】ＨＩＧＲＯＷ ＨＧ－ＧＬ３６Ｂ出力光６スペクトル

【0035】

【図12】実施例１の結果。

【0036】

【図13】実施例１のデータ。

【0037】

【図14】１５分間の暴露後の大腸菌の低減

【0038】

【図15】実施例２の結果。

【0039】

【図16】Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｈｏｒｔｏｒｕｍ ｐｖ．の結果。ゼラニウムのＰｅｌａｒｇｏｎｉｉ （実施例５を参照）。

【発明を実施するための形態】

【0040】

（発明の詳細な説明）
植物上の微生物病原体の光線力学的抑制のための様々な組成物および方法が本明細書に記載される。細菌性、真菌性、ウイルス性、または微生物病原体の光線力学的抑制は、光増感剤化合物および銅化合物（任意で銅塩または銅イオン含有有機錯体であり得る）を植物に適用し、植物を光に暴露することによって実施され得る。光増感剤化合物は、リボフラビン、誘導体化リボフラビン、ルミクローム、誘導体化ルミクローム、クルクミン、フルオレセイン、エオシンＹ、エリスロシン、フラビン含有化合物およびローズベンガルＢからなる群から任意で選択され得る。

【0041】

驚くべきことに、光駆動による活性酸素種（ＲＯＳ）の生成による抗菌効果は、銅塩などの低レベルの銅化合物の存在によって劇的に強化されることがわかった。例えば、光増感剤と銅塩の組み合わせは、光駆動抗菌プロセスまたは銅塩のいずれかを個別に生成するよりもはるかに大きな抗菌効果を生成し、それぞれの相加的な効果を超える。一例は、光活性化剤がリボフラビンであり、硫酸銅が添加される光駆動プロセスの組み合わせである（以下の実施例１を参照）。リボフラビン（ビタミンＢ２）は、人間の消費と環境に安全な天然素材である。ビタミンとして、それは人間の必須栄養素である。リボフラビンおよび銅塩はどちらも、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）の一般に安全と認められている（ＧＲＡＳ）リストにある。リボフラビンおよび銅を含む抗菌または殺虫製剤は、有機農薬として適格であり、有機農産物の栽培に使用され得る。

【0042】

本発明の特定の実施形態は、光活性化剤および銅塩との組み合わせを使用する。これらの２つの成分は、溶媒中の混合物として組み合わされ得る。例えば、光活性化剤および銅塩の両方は水に溶解され得る。混合物は完全に均質である必要はない。銅を使用する場合、銅塩はＣｕ^＋１またはＣｕ^＋２であり得る。

【0043】

光増感剤
光増感剤は、光（ＵＶおよび／または可視光）を吸収し、その光を、銅と相互作用して相乗効果を生み出し得るエネルギーのある中間体に効率的に変換する任意の材料であり得る。実施例２に示すように、我々は、リボフラビン、エリスロシン、ローズベンガル、およびエオシンＹを試験した；これらはすべて効果的であり、リボフラビンが試験条件下で最も効果的であった。リボフラビンの光分解によって生成されるルミクローム、およびリボフラビンテトラアセテート（２’，３’，４’，５’－テトラアセチルリボフラビン）は、光増感反応に効果的である。帯電した、例えば正に帯電した官能基をフラビン誘導体に添加して、これらの分子を細菌の負に帯電した表面に付着させたり、または水への溶解度を高めたりし得る（図２）。光増感剤の部分分解生成物を含む、一連の追加官能基を含む適切な発色団を含む化合物は、本発明で使用するのに適した光増感剤であり得る。

【0044】

上記のように、光増感剤化合物を使用して、植物に存在する微生物病原体の光線力学的抑制を可能にし得る。光増感剤化合物は、活性酸素種（ＲＯＳ）を生成することによって光に反応する。生成されるＲＯＳのタイプに応じて、光増感剤は２つのクラス、すなわちタイプＩ光増感剤とタイプＩＩ光増感剤に分類され得る。一方では、タイプＩ光増感剤は、酸素の存在下で適切な波長で励起されると、電子の引き抜きまたは基質からの移動によって短命のフリーラジカルを形成する。一方、タイプＩＩ光増感剤は、「一重項酸素」として知られる高反応性酸素状態を形成し、これは、本明細書では「活性一重項酸素種」とも呼ばれる。一重項酸素は概して比較的長寿命であり、作用半径が大きくなり得る。

【0045】

光増感剤化合物は、一般に、金属化または非金属化され得ることを理解されたい。本発明の好ましい実施形態は、非金属化される。特定の金属化光増感剤は、それらが金属化状態にあると効果が低下することが知られている。例えば、クロリン光増感剤化合物が銅で金属化されている場合、生成されるＲＯＳ（タイプＩ）は、例えば半減期が非常に短いため、微生物抑制の利用可能性が低くなる傾向がある。対照的に、同じ光増感剤化合物がマグネシウムなどの他の金属で金属化されている場合、生成されるＲＯＳは微生物抑制の利用可能性がより高くなる。したがって、（光増感剤を金属化するために）光増感剤と共に化学量論に近い量で使用される銅は有利ではない。銅は、少なくとも高濃度では、タイプＩＩ光増感剤に悪影響を与えることが知られていることが理解されるべきである。タイプＩＩ光増感剤の形成を可能にしない金属を選択すると、少なくとも反応性の一重項酸素種が生成されないか、または生成が少ないため、通常、微生物病原体の増殖の抑制がはるかに低くなることが理解されるべきである。クロリンと錯体を形成したときにタイプＩＩ光増感剤を形成しないことが知られている金属の非限定的な例は、Ｃｕ、Ｃｏ、Ｆｅ、Ｎｉ、およびＭｎである。したがって、光増感剤と少量の銅含有化合物との組み合わせの相乗効果、特に本発明の好ましい実施形態は、驚くべきことであり、銅が光増感剤を使用した植物病原体の抑制にどのように悪影響を与え得るかについての既存の理解に反する。

【0046】

金属化状態は、別個の非金属化光増感剤と金属塩または他の金属含有化合物との混合物と混同されるべきではない。本発明の好ましい光増感剤は、光増感剤化合物自体が金属イオンに結合するか、または化学的に錯化する形態では使用されない。

【0047】

本明細書で使用される「一重項酸素光増感剤」という用語は、光によって励起されたときに反応性一重項酸素種を生成する化合物を指すことを理解されたい。言い換えれば、この用語は、上記で定義されたタイプＩＩプロセスがタイプＩプロセスと比較して支配的である光増感剤を指す。

【0048】

また、本発明の潜在的な光増感剤の選択に関連するのは、例えば、以下の米国特許出願：ＵＳ２０１５／０２０８８９６、ＵＳ２０１５／０２０８８９８、ＵＳ２０１５／０２０９８０８、ＵＳ２０１５／０２１０９６０、ＵＳ２０１５／０２１０９６３、ＵＳ２０１５／０２１０９６４、ＵＳ２０１５／０２１１１６５、およびＵＳ２０１５／０２１１１７０に記載されるＰｒｏｃｔｅｒ ＆ Ｇａｍｂｌｅ Ｃｏｍｐａｎｙにおける研究者による研究であり、これらの文献は本明細書に参照をもって組み込まれる。

【0049】

光増感剤は、任意に、１，１’－ビフェニル－４，４’－ジアミン、１，１’－ビフェニル－４－アミン、ベンゾフェノン、１，１’－ビフェニル－４，４’－ジオール、１，１’－ビフェニル－４－アミン、１，１’－ビフェニル－４－オール、１，１’：２’，１’’－テルフェニル、１，１’：３’，１’’－テルフェニル、１，１’：４’，１’’：４’’，１’’’－クアテルフェニル、１，１’：４’，１’’－テルフェニル、１，１０－フェナントロリン、１，１’－ビフェニル、１，２，３，４－ジベンズアントラセン、１，２－ベンゼンジカルボニトリル、１，３－イソベンゾフランジオン、１，４－ナフトキノン、１，５－ナフタレンジオール、１０Ｈ－フェノチアジン、１０Ｈ－フェノキサジン、１０－メチルアクリドン、１－アセトナフトン、１－クロロアントラキノン、１－ヒドロキシアントラキノン、１－ナフタレンカルボニトリル、１－ナフタレンカルボキシアルデヒド、１－ナフタレンスルホン酸、１－ナフタレノール、２（１Ｈ）－キノリノン、２，２’－ビキノリン、２，３－ナフタレンジオール、２，６－ジクロロベンズアルデヒド、２１Ｈ，２３Ｈ－ポルフィン、２－アミノアントラキノン、２－ベンゾイルチオフェン、２－クロロベンズアルデヒド、２－クロロチオキサントン、２－エチルアントラキノン、２Ｈ－１－ベンゾピラン－２－オン、２－メトキシチオキサントン、２－メチル－１，４－ナフトキノン、２－メチル－９（１０－メチル）－アクリジノン、２－メチルアントラキノン、２－メチルベンゾフェノン、２－ナフタレンアミン、２－ナフタレンカルボン酸、２－ナフタレノール、２－ニトロ－９（１０－メチル）－アクリジノン、９（１０－エチル）－アクリジノン、３，６－アクリジンジアミン（ｑｃｒｉｄｉｎｅｄｉａｍｉｎｅ）、３，９－ジブロモペリレン、３，９－ジシアノフェナントレン、３－ベンゾイルクマリン、３－メトキシ－９－シアノフェナントレン、３－メトキシチオキサントン、３’－メチルアセトフェノン、４，４’－ジクロロベンゾフェノン、４，４’－ジメトキシベンゾフェノン、４－ブロモベンゾフェノン、４－クロロベンゾフェノン、４’－フルオロアセトフェノン、４－メトキシベンゾフェノン、４’－メチルアセトフェノン、４－メチルベンズアルデヒド、４－メチルベンゾフェノン、４－フェニルベンゾフェノン、６－メチルクロマノン、７－（ジエチルアミノ）クマリン、７Ｈ－ベンズ［ｄｅ］アントラセン－７－オン、７Ｈ－ベンゾ［ｃ］キサンテン－７－オン、７Ｈ－フロ［３，２－ｇ］［１］ベンゾピラン－７－オン、９（１０Ｈ）－アクリジノン、９（１０Ｈ）－アントラセノン、９（１０－メチル）－アクリジノン、９（１０－フェニル）－アクリジノン、９，１０－アントラセンジオン、９－アクリジンアミン、９－シアノフェナントレン、９－フルオレノン、９Ｈ－カルバゾール、９Ｈ－フルオレン－２－アミン、９Ｈ－フルオレン、９Ｈ－チオキサンテン－９－オール、９Ｈ－チオキサンテン－９－オン、９Ｈ－チオキサンテン－２，９－ジオール、９Ｈ－キサンテン－９－オン、アセトフェノン、アクリデン、アクリジン、アクリドン、アントラセン、アントラキノン、アントロン、α－テトラロン、ベンズ［ａ］アントラセン、ベンズアルデヒド、ベンズアミド、ベンゾ［ａ］コロネン、ベンゾ［ａ］ピレン、ベンゾ［ｆ］キノリン、ベンゾ［ｇｈｉ］ペリレン、ベンゾ［ｒｓｔ］ペンタフェン、ベンゾフェノン、ベンゾキノン、２，３，５，６－テトラメチル、クリセン、コロネン、ジベンズ［ａ，ｈ］アントラセン、ジベンゾ［ｂ，ｄｅｆ］クリセン、ジベンゾ［ｃ，ｇ］フェナントレン、ジベンゾ［ｄｅｆ，ｍｎｏ］クリセン、ジベンゾ［ｄｅｆ，ｐ］クリセン、ＤＬ－トリプトファン、フルオランテン、フルオレン－９－オン、フルオレノン、イソキノリン、メトキシクマリン、メチルアクリドン、ミヒラーケトン、ナフタセン、ナフト［１，２－ｇ］クリセン、Ｎ－メチルアクリドン、ｐ－ベンゾキノン、ｐ－ベンゾキノン、２，３，５，６－テトラクロロ、ペンタセン、ペリレンキノノイド顔料、フェナントレン、フェナントレンキノン、フェナントリジン、フェナントロ［３，４－ｃ］フェナントレン、フェナジン、フェノチアジン、ｐ－メトキシアセトフェノン、ピラントレン、ピレン、キノリン、キノキサリン、リボフラビン５’－（二水素ホスフェート）、チオキサントン、チミジン、キサンテン－９－オン、キサントン、およびそれらの混合物からなる群から選択される光活性部位を含み得る。他の適切な水溶性光活性化剤は、フルオレセインおよびその誘導体；好ましくは、ハロゲン置換フルオレセイン；より好ましくは、ブロモフルオレセインおよびヨードフルオレセイン、例えばジブロモフルオレセイン、ジヨードフルオレセイン、ローズベンガル、エリスロシン、エオシン（例えば、エオシンＹ）、クルクミン、プロトポルフィリンＩＸ、レサズリン、ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート、ジヒドロローダミン１２３および関連するクロモフォア、メチレンブルー、およびローズベンガルを含む。

【0050】

銅含有化合物
本発明の銅化合物は、銅塩（好ましくはＣｕ^＋２、および任意でＣｕ^＋１）、および銅エタノールアミン錯体などの銅－有機錯体化合物を含み得る。非限定的な例は、硫酸銅（ＩＩ）、硝酸銅（ＩＩ）、水酸化銅、炭酸銅、塩化銅、酸化銅、オクタン酸銅、臭化銅（またはそれらの銅＋１状態のこれらの塩の還元生成物）ならびに、銅エタノールアミン錯体、グルコン酸銅、オルトリン酸銅、ピロリン酸銅、またはそれらの農業的に許容される塩およびそれらの水和物形態を含む。

【0051】

活性酸素種（ＲＯＳ）を生成する光活性化剤と銅の間の相乗効果を使用して植物保護製品を定義する際には、我々はどの銅化合物が許容されるかを考慮する必要がある。元素銅を使用した大腸菌での実験は有意な性能を示さなかったが、成功した試験は必ずしも可溶性塩または可溶性化合物のみに基づく必要はなかった。さらに、かろうじて溶解する塩も有効であるため、本発明の実施は、溶解度の高い銅水溶性塩を用いた製剤のみに限定されるべきでない。他の形態の浮遊された銅が効果的であり得る。

【0052】

Ｃｕ^＋２塩の水への溶解度は、ｐＨの関数であり、炭酸塩と重炭酸塩の存在によっても影響を受ける。銅塩は一般にｐＨ５．５の蒸留水に溶ける。より高いｐＨ値では、可溶性銅の量はｐＨと総銅濃度の両方の関数であり、ｐＨ６．５で最大４ｍｇ／ｌの可溶性銅、ｐＨ７．４で最大１．３ｍｇ／ｌの可溶性銅である。本発明は、低レベルの銅化合物が、植物病原体の増殖を減少させることに対する光増感剤との相乗効果に及ぼす重要な貢献を教示する。好ましい実施形態では、１０ｍｇ／ｌの硫酸銅、または４ｍｇ／ｌの銅のみが使用される。制御放出用に設計された製剤を含め、水への溶解度が制限された銅化合物を使用する場合でも、本発明が操作可能であることは明らかであるはずである。

【0053】

光増感剤と銅含有化合物の組み合わせ
光増感剤と銅含有化合物の組み合わせは、別々に使用された場合のいずれかの成分の個々の貢献よりもはるかに大きい植物病原体の増殖の低減につながる。この方法で増殖を遅らせ得る植物病原体には、グラム陰性菌、グラム陽性菌、シアノバクテリア、藻類、真菌、およびウイルスが含まれる。

【0054】

光増感剤化合物、銅含有化合物および他の任意の添加剤またはアジュバントの組み合わせが本明細書および請求項にわたって記載されている場合、組み合わせの成分の各１つの農業的に有効な量は、宿主植物に対して最小限のまたは非植物毒性でありながら抗菌活性を提供するように使用され得ることを理解されたい。

【0055】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法および組成物は、１以上の農業的に適切なアジュバントを含む。いくつかの実施形態において、１以上の農業的に適切なアジュバントのそれぞれは、１以上のアクチベーターアジュバント（例えば、１以上の界面活性剤；１以上の油性アジュバント、例えば、１以上の浸透剤）１以上の湿潤剤または展着剤；１以上の保湿剤；１以上の乳化剤；１以上のドリフト制御剤；１以上の増粘剤；１以上の沈着剤；１以上の水質調節剤；１以上の緩衝剤；１以上の消泡剤；１以上のＵＶ遮断薬；１以上の抗酸化剤；１以上の肥料、栄養素、および／もしくは微量栄養素；ならびに／または１以上の除草剤からなる群から独立して選択される。例示的なアジュバントは、参照によりその全体が組み込まれる、Ｈａｚｅｎ， Ｊ．Ｌ． Ｗｅｅｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４： ７７３－７８４ （２０００）に提供される。

【0056】

光増感剤化合物および銅含有化合物は、抗菌組成物の一部として提供され得る。また、抗菌組成物は、水などの送達流体を含み得る。抗菌組成物は、成分の特定の濃度および相対比率を有するように提供され得る。例えば、抗菌組成物は、約１００ｎＭと約５０ｍＭの間、１マイクロモルと約１０００マイクロモルの間、５マイクロモルと約２００マイクロモルの間の光増感剤化合物、約１０マイクロモルと約１５０マイクロモルの間、約２０マイクロモルと約１００マイクロモルの間の光増感剤化合物、または約２５マイクロモルと約７５マイクロモルの間の光増感剤化合物、を有し得る。

【0057】

抗菌組成物はまた、例えば、約２マイクロモルと約１０，０００マイクロモルの間の銅含有化合物、約５マイクロモルと約５，０００マイクロモルの間の銅含有化合物、約１０マイクロモルと約１，０００マイクロモルの間の銅含有化合物、約２５マイクロモルと約５００マイクロモルの間の銅含有化合物、約５０マイクロモルと約１００マイクロモルの間の銅含有化合物、を有し得る。１マイクロモル／Ｌの銅は０．０６３５ｍｇ／Ｌであることに留意されたい。また、１０ｐｐｍのＣｕＳＯ４は４ｐｐｍの銅に相当し、これは６２．７マイクロモルである。

【0058】

抗菌組成物中の光増感剤化合物と銅含有化合物の重量による相対割合は、例えば、約１０００：１と約１：１０００との間、約５００：１と約１：５００との間、約１００：１と約１：１００との間、または約１０：１と約１：１０との間とし得る。

【0059】

銅と光増感剤の相対モル比は、１：１程度であることが最も好ましい。

【0060】

抗菌組成物中に存在し得る他の添加剤に関して、界面活性剤は、植物の葉の被覆を補助するためのアジュバントとして存在し得る。界面活性剤は、許容されるポリソルベート型界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ（登録商標） ８０）、非イオン性界面活性剤ブレンド（例えば、Ａｌｔｏｘ（商標） ３２７３）、または他の適切な界面活性剤とし得る。

【0061】

光増感剤と銅含有化合物の適用
本発明の光増感剤化合物およびエンハンサー化合物は、微生物病原体の光線力学的抑制のために植物に適用し得る。光増感剤化合物およびエンハンサー化合物は、植物に同時に適用し得る。例えば、光増感剤化合物およびエンハンサー化合物ならびに送達液を含むように、抗菌組成物が調製され得る。抗菌組成物は、噴霧、霧吹き、散水、注ぎ込み、または他の任意の適切な方法によって植物に適用され得る。抗菌組成物は、植物の葉、根および／または茎に適用され得る。他の添加剤も抗菌組成物に含められ得、他の適用方法も実施され得る。

【0062】

抗菌組成物が適用される植物は、それらが自然光に暴露される屋外または屋内（例えば、温室）であり得、それらが人工光に暴露される屋内であり得る。入射光への暴露は、光増感剤化合物が、順に微生物の増殖の崩壊を促進するＲＯＳを生成し得るように提供される。

【0063】

操作としては、光増感剤化合物とエンハンサー化合物を植物に感染した微生物病原体に接触させる。光増感剤とエンハンサー化合物の両方は、病原微生物の細胞壁および細胞間物質と接触するようになる。

【0064】

アスコルビン酸またはアスコルビン酸塩添加剤
アスコルビン酸（別称：ビタミンＣ）は、本発明の抗菌組成物の致死率をさらに高め得る任意添加剤である。アスコルビン酸は固体であり、ｐＫａが４．１７である。本発明の植物保護製剤は、溶液のｐＨが７になるように緩衝化されているので、それは主にアスコルビン酸塩の形態で存在する。少量の銅はアスコルビン酸塩の酸化を触媒し、過酸化水素を含むＲＯＳを生成することが示されている（Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ， ＲＳＣ Ａｄｖ．， ２０１６， ６， ３８５４１）。これらは、暗室（夜間など）でも植物病原体の防除に有用である。

【0065】

病圧が高いとき、または光強度が少ないと期待されるとき（例えば、どんより曇った日、夕方または夜間の適用）には、アスコルビン酸を添加して光増感抗菌性能を補い得る。銅の存在下でのアスコルビン酸塩の酸化の効果は、添加するアスコルビン酸塩の濃度を制御することで制御され得る。高濃度であれば効果が長く、一方で低濃度であれば効果が短くなるだろう。植物保護用途では、中性のｐＨを維持し、アスコルビン酸をアスコルビン酸塩に変換するために含まれなければならない得られる溶液のイオン強度が過度に高く、したがって塩辛いため、高濃度のアスコルビン酸を含めることは問題となり得る。

【0066】

本発明に記載されているような植物保護用途の光線力学的療法では、製剤へのアスコルビン酸の配合は、１０と０．０００１％の間、５と０．００５％の間、１と０．０１％の間の重量％レベルで有益であることが判明した。

【0067】

微生物病原体および植物
抗菌組成物が適用可能な微生物病原体は、真菌性病原体および細菌性病原体を含む。抗菌組成物が適用され得る真菌性病原体は、トマトおよびジャガイモなどの植物に感染し得るＡｌｔｅｒｎａｒｉａ ｓｏｌａｎｉ；ブドウの他、軟果および球根作物に感染し得るＢｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ；または芝草に一般的に感染し得るＳｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｈｏｍｏｅｏｃａｒｐａを含む。Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ、Ｂｏｔｒｙｔｉｓ、またはＳｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ属の他の真菌性病原体も、抗菌組成物の適用を受け得る。抗菌組成物は、例えば、Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｐｕｃｃｉｎｉａ、Ｅｒｙｓｉｐｈａｃｅａｅ、Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ、Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ、Ｂｉｐｏｌａｒｉｓ、Ｍｉｃｒｏｄｏｃｈｉｕｍ、Ｖｅｎｔｕｒｉａ ｉｎａｅｑｕａｌｉｓ、Ｍｏｎｉｌｉｎｉａ ｆｒｕｃｔｉｃｏｌａ、Ｇｙｍｎｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｊｕｎｉｐｅｒｉ－ｖｉｒｇｉｎｉａｎａｅ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｏｐｈｏｒａ ｂｒａｓｓｉｃａｅ、Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｚｅａｅ、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ、Ｐｙｔｈｉｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｉｎｆｅｓｔａｎｓ、Ｔａｐｈｒｉｎａ ｄｅｆｏｒｍａｎｓ、Ｐｏｗｄｅｒｙ Ｍｉｌｄｅｗ、Ｐｈｒａｇｍｉｄｉｕｍ ｓｐｐ．、その他の真菌性病原体のような様々な植物病を引き起こす病原体に罹患しているかまたは感受性がある植物に適用され得る。

【0068】

抗菌組成物が適用可能な細菌性病原体は、Ｅｒｗｉｎｉａ ａｍｙｌｏｖａｒａなどのグラム陰性菌、または木本植物に感染し得るＥｒｗｉｎｉａ属の他の細菌性病原体を含む。Ｅ． ａｍｙｌｏｖａｒａは、ナシ、リンゴ、および他のバラ科作物を含む様々な植物に火傷病を引き起こす。抗菌組成物は、種々の植物病を引き起こす病原体、例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｕｒｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、大腸菌、（オリーブ急速衰弱症候群（ＯＱＤＳ）病を引き起こす）Ｘｙｌｅｌｌａ ｆａｓｔｉｄｉｏｓａ、またはその他の細菌性病原体に罹患または感受性を有する植物に適用され得る。

【0069】

抗菌組成物は、微生物病原体の影響を受ける様々な種類の植物に使用され得る。作物植物、芝生植物、樹木、および微生物病原体に感染した他の植物が処理され得る。また、本明細書に記載の抗菌組成物は、植物および病原体の種類、ならびに微生物感染の状態に応じて、微生物病原体に対して様々な抑制効果を有し得ることに留意されたい。本明細書では、抗菌組成物が植物上の微生物病原体の増殖を抑制することができると記載されているが、かかる表現は限定されるべきものではなく、微生物病原体の抑制、微生物病原体に対する予防、微生物病原体の破壊または微生物病原体に対する毒性の増大を一般的に含むものと理解されるべきである。

【0070】

植物の種類
化合物または組成物は、微生物病原体の影響を受け得る様々な種類の植物に使用され得る。植物は、非木質作物植物、木質植物、または芝草であり得る。植物は、食用作物植物、非食用作物植物、果実植物、野菜植物、マメ科植物、穀物植物、飼料植物、油糧種子植物、畑作物、庭作物、温室植物、ハウス植物、花卉、芝草、果樹などの樹木、および微生物病原体の影響を受け得る他の植物からなる群から選択され得る。

【0071】

いくつかの実施態様では、植物は芝草である。本明細書で使用される場合、「芝草」という用語は、グランドカバーを提供する栽培された草、例えば、一定の高さを維持するために定期的に切断または刈り取られるターフまたは芝生を指す。草はイネ科に属し、６つの亜科に細分され、そのうち３つは一般的な芝草を含む：涼しい季節の芝草のＦｅｓｔｕｃｏｉｄｅａｅ亜科；暖かい季節の芝草のキビ亜科およびＥｒａｇｒｏｓｔｏｉｄｅａｅ亜科。限られた数の種が芝草として広く使用されており、一般に均一な土壌被覆を形成し、草刈りおよび交通に耐えるという基準を満たす。一般的に、芝草は、成長点を切断することなく草刈りを容易にする圧縮されたクラウンを備える。本文脈では、「芝草」という用語は、１種類以上の草を栽培し、比較的均一な土壌を形成している領域を含み、同種の異なる品種を組み合わせたブレンド、または異なる種および／もしくは品種を組み合わせた混合を含む。

【0072】

いくつかのシナリオでは、組み合わせは、植物における微生物病原体の増殖を抑制するための相乗的な反応を示し得る。本明細書で使用される「相乗」または「相乗的な」という用語は、それらの組み合わせ効果がそれらの個々の効果の合計よりも大きくなるように、組み合わせ（または組成物）の２つ以上の成分の相互作用を指すことを理解されたい。これは、本明細書の文脈において、２つ以上の光増感剤、銅含有化合物の作用を含み得る。

【0073】

いくつかのシナリオでは、Ｓ． Ｒ． Ｃｏｌｂｙ， “Ｃａｌｃｕｌａｔｉｎｇ ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ ａｎｄ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｏｆ ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ”， Ｗｅｅｄｓ １５， ２０－２２ （１９６７）に示されるアプローチが使用されて、相乗効果を評価し得る。期待される効果、Ｅは、次のように表される：Ｅ＝Ｘ＋Ｙ－［（Ｘ＊Ｙ／１００］、式中、Ｘは、組み合わせの第１成分の、未処理対照の％で表される効果であり、Ｙは組み合わせの第２成分の未処理対照の％で表される効果である。観察された効果が期待される効果よりも高いとき、２つの成分は相乗的に有効な量で存在すると言われる。より好ましくは、本発明において、２つの成分は、観察された効果が期待される効果よりも少なくとも１桁高いとき、より好ましくは観察された効果が期待される効能よりも少なくとも２桁高いとき、最も好ましくは観察された効果が期待される効果よりも３桁以上高いとき、相乗的に有効な量で存在すると言われる。

【0074】

本発明の製剤の適用は、植物が植物病原体に感染する前または後のいずれかで植物に行い得る。従って、本方法は、予防法として、または感染した植物の処理として使用され得る。

【0075】

実施例及び実験
実施例１：ＬＥＤ青色光源を用いた１０ｐｐｍのＣｕＳＯ４と１８ｐｐｍのリボフラビンを用いた大腸菌の光線力学的処理。

【0076】

大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細菌（ＡＴＣＣ ２５９２２）を用いて、生物を様々な試験条件に暴露する試験を実施した。光活性化のための光源は、青色ＬＥＤライト（ＨＩＧＲＯＷ ２０１９）で、大腸菌を入れた容器から７ｃｍの距離に置いた。光活性化剤はリボフラビン（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｒ７６４９、ロットＷＸＢＢ４０４８Ｖ、純度９８．６％）を１８ｐｐｍの濃度で使用した。硫酸銅は１０ｐｐｍの濃度（水溶液）で使用した。試験は、湿潤剤Ｓｉｌｗｅｔ（登録商標）Ｌ－７７を０．０１２５％の濃度で含んだ。Ｓｉｌｗｅｔ（登録商標）Ｌ－７７ はＣｏｌｌｉｅｒｖｉｌｌｅ， ＴＮの Ｈｅｌｅｎａ Ａｇｒｉ－Ｅｎｔｅｒｐｒｉｓｅｓ， ＬＬＣ の製品であり、水性スプレーで使用すると濡れ拡がり特性が向上する非イオン性有機シリコーン界面活性剤コポリマーである。Ｓｉｌｗｅｔ（登録商標）Ｌ－７７は、２７３０６－７８－１のＣＡＳ登録番号を有する。各試験は、５分から３０分の間で変化する、規定された時間の間で行われた。暴露時間終了後、細菌を希釈してプレーティングし、コロニーを計数し、未処理の対照との比較により、対応する低減が決定された。

【0077】

その結果を図１２に示し、以下に要約する。暗室において１８ｐｐｍのリボフラビンは、測定可能なキルを生じなかった。暗室で１０ｐｐｍの硫酸銅は３０分で０．２２６－ｌｏｇキルを与えただけであった。青色光のみ（銅も光増感剤もなし）では、３０分後に０．２７７５－ｌｏｇキルを生じた。１８ｐｐｍのリボフラビン単独で青色光を照射すると、３０分後に０．８３－ｌｏｇキルを示し、わずかながらキルさせることができた。１０ｐｐｍの硫酸銅単独で青色光を照射すると、３０分後に０．９５４－ｌｏｇキルを示し、わずかながらキルさせることができた。驚いたことに、１０ｐｐｍの硫酸銅と１８ｐｐｍのリボフラビンを青色光で照射すると、５分で３．６７－ｌｏｇキル、１５分で６．８９－ｌｏｇキル、３０分で完全キル（７．７３－ｌｏｇキル）が得られた。

【0078】

１０ｐｐｍの硫酸銅単独と１８ｐｐｍのリボフラビン単独に基づく期待される効果Ｅは、次のように計算され得る：Ｅ＝Ｘ＋Ｙ（１００－Ｘ）／１００、式中、Ｘは、組み合わせの第１成分の、未処理対照の％で表される効果であり、Ｙは組み合わせの第２成分の未処理対照の％で表される効果である。まず、上記のｌｏｇキルデータを（対照の接種と比較して）大腸菌の存在率に変換する必要がある。Ｌｏｇ低減率を低減率に変換する式は、％低減＝（１－１０^－Ｌ）Ｘ１００であり、ＬはＬｏｇ低減率である。したがって、１８ｐｐｍのリボフラビン単独で青色光を照射した場合、３０分後に０．８３－ｌｏｇキルをもたらし、これは８５．２０８％の低減である。１０ｐｐｍの硫酸銅単独で青色光を照射した場合、３０分後に０．９５４－ｌｏｇキルをもたらし、これは８８．８８％の低減である。したがって、期待される効果は、８５．２０８＋８８．８８－（８５．２０８＊８８．８８）／１００＝９８．３５５と予測されよう。９８．３５５％の低減は１．７８５－ｌｏｇキルに過ぎない。実際の効果は７．７３－ｌｏｇキルであり、これは古典的な抗菌剤の相加理論で予測されるよりも５．９４５－ｌｏｇ大きい。相乗効果は、６桁近く多くの細菌を死滅させる原因となる。

【0079】

１８ｐｐｍのリボフラビンと１０ｐｐｍの硫酸銅の組み合わせは、病原体の低減の劇的な相乗効果を有する。それは、相加効果より１００万倍も優れている。これは明らかに予測されない。抗菌剤と抗生物質のさらなる組み合わせは、相加的、相乗的、または場合によっては拮抗的な相互作用につながり得る（Ｏｃａｍｐｏ ２０１４， Ｂｏｌｌｅｎｂａｃｈ ２０１５）。したがって、光処理抗菌システムでリボフラビンに銅を添加すると、１００万倍超優れた結果は言うまでもなく、大幅に改善された結果が得られることは明らかではない。生データは、図１３に見られる表に記載される。

【0080】

また、我々は光強度の影響を評価するための試験も行った。これらの試験は、１０ｐｐｍの硫酸銅と１８ｐｐｍのリボフラビン（水溶液）を使用して青色光の下で１５分間暴露し、減光フィルターを使用して光強度を下げた。４５０ｎｍから４６０ｎｍの範囲における全光強度は３５３Ｗ／ｍ^２であった。結果を表１４に示す。我々は、１６Ｗ／ｍ^２（全光強度の４．５％）で０．７１ｌｏｇキルを観察し、我々は、５６Ｗ／ｍ^２（全光強度の１５．９％）で１．８ｌｏｇキルを観察し、我々は、１９５Ｗ／ｍ^２（全光強度の５５％）で３．１２ｌｏｇキルを観察し、全強度（３５３Ｗ／ｍ^２、１００％）は６．９ｌｏｇキルを生じた。これらの結果は、光強度の増加により所望の効果が増加するため、これが光活性化プロセスであることを確認するものである。

【0081】

実施例１で使用した硫酸銅の濃度と、先行技術で汎用農薬に使用されている濃度との違いを認識することが重要である。ボルドー混合物（ＣｕＳＯ４とＣａ（ＯＨ）２）およびブルゴーニュ混合物（ＣｕＳＯ４とＮａ２ＣＯ３）では硫酸銅を１％以上（ブルゴーニュ混合物は２０％まで）使用する。好ましい実施形態では、本発明は、硫酸銅を１０ｐｐｍの濃度で使用することを教示し、これは１，０００分の１の低濃度である。広く使用されている銅系農薬ＣｕＰＲＯ（登録商標） ５０００（ＣｕＰＲＯ（登録商標）２０１９）は、水酸化銅を含む。ラベルの説明書によると、銅の濃度が最も低い場合の推奨混合率は、水１００ガロン（８３４ｌｂｓ）あたり４ｌｂｓのＣｕＰＲＯ（登録商標）（２．４５ｌｂｓの水酸化銅）であり、これは０．０３０Ｍまたは０．２９４．％の銅濃度に相当する。その濃度は、本発明の好ましい製剤で使用される１０ｐｐｍの値よりも２９４倍高い。したがって、本発明で使用される銅のレベルだけを、広く使用されている製品が推奨する最低濃度と比較すると、我々はほぼ３００倍も低い濃度を使用することになる。本明細書で引用した複数の試験は、１０ｐｐｍの硫酸銅を使用する；より高い濃度（例えば１００ｐｐｍ）では、銅自体の抗菌特性により、リボフラビンの非存在下でいくつかの抗菌活性を生じ得る。

【0082】

実施例２：銅塩を用いた光増感剤と広域スペクトル光源を用いた相乗的な大腸菌の殺傷。

【0083】

この実施例では、我々は、異なる光増感剤（水中５０μＭ）を硫酸銅と組み合わせた場合と組み合わせない場合を比較する。農業用アジュバントであるスティッカースプレッダー、Ｓｉｌｗｅｔ（登録商標） Ｌ－７７も０．０１２５％の濃度で含まれた。実験条件は、実施例１と同じにした。大腸菌を試験菌とし、硫酸銅を１０ｐｐｍとし、光暴露時間を３０分とした。ただし、この試験シリーズでは、我々は、ＵＶを含む太陽光のスペクトルを再現した光源を使用した。それは、爬虫類を飼育するテラリウムに使用され、その中にはそれらの光にＵＶ成分を必要とするものがある。本明細書では、それは、「爬虫類ライト」（Ｚｏｏ Ｍｅｄ ２０１９）と呼ばれる。我々は、リボフラビン（Ｒ）、エリスロシン（ＥＲ）、ローズベンガル（ＲＢ）、エオシンＹ（Ｙ）、およびリボフラビン一リン酸（ＲＭＰ）；銅ありおよびなし、を試験した。結果（３試験平均）を図１５に示す。すべての色素が相乗的な殺傷効果を示し、銅と組み合わせたリボフラビンが期待外の最大の相乗的なｌｏｇキルを生じた。

【0084】

各試験の中央値を使用すると（図１５を参照）、光増感剤と銅の組み合わせが相乗効果をもたらすことは明らかである。まず、爬虫類ランプの下で１０ｐｐｍの硫酸銅を３０分間照射しても０．１３１－Ｌｏｇキル（２６．０４％キル）にしかならず、単独で使用した光増感剤もあまり効果がないＥＲは０．１３－Ｌｏｇキル（２５．８８％キル）を有し；ＲＢは０．１６－Ｌｏｇキル（３０．８１％キル）を有し；Ｒは０．１１５－Ｌｏｇキル（２３．２６％キル）を有し；ＥＹは平均０．８７－Ｌｏｇキル（６．４６％キル）を有し；そしてＲＭＰは平均０．０４２－Ｌｏｇキル（３．１７％キル）を有する。

【0085】

古典的な相加理論を用いると、１８ｐｐｍのＥＲと１０ｐｐｍの硫酸銅の組み合わせで期待されるキルは４５．１８％（０．２６１－Ｌｏｇキル）である。実際の中央値は１．２２－Ｌｏｇキルであり、期待より０．９５９－Ｌｏｇ高いので、これは相乗効果であると言える。

【0086】

古典的な相加理論を用いると、１８ｐｐｍのＥＹと１０ｐｐｍの硫酸銅の組み合わせで期待されるキルは３０．８２％（０．１６０－Ｌｏｇキル）である。実際の中央値は１．８６－Ｌｏｇキルであり、期待より１．７０－Ｌｏｇ高いので、これは相乗効果であると言える。

【0087】

古典的な相加理論を用いると、１８ｐｐｍのＲと１０ｐｐｍの硫酸銅の組み合わせで期待されるキルは４３．２４％（０．２４６－Ｌｏｇキル）である。実際の中央値は３．４７３－Ｌｏｇキルであり、期待より３．２３－Ｌｏｇ高いので、これは相乗効果であると言える。また、これは相加理論から期待されるよりも平均して１，０００倍超の効果がある。

【0088】

古典的な相加理論を用いると、１８ｐｐｍのＲＢと１０ｐｐｍの硫酸銅の組み合わせで期待されるキルは４８．８２％（０．１５９－Ｌｏｇキル）である。実際の中央値は１．３８－Ｌｏｇキルであり、期待より１．２２－Ｌｏｇ高いので、これは相乗効果であると言える。

【0089】

古典的な相加理論を用いると、１８ｐｐｍのＲＭＰと１０ｐｐｍの硫酸銅の組み合わせで期待されるキルは２８．３８％（０．１４４－Ｌｏｇキル）である。実際の中央値は４．１３－Ｌｏｇキルであり、期待より３．９８－Ｌｏｇ高いので、これは相乗効果であると言える。これは期待よりのほぼ１万倍の効果である。

【0090】

実施例３：より高い光増感剤濃度での追加試験。

【0091】

この実施では、我々は爬虫類ライトも使用した。この試験では、光強度は８，５２０Ｌｕｘ、または２６Ｗ／ｍ^２であった（比較のため、これは曇りの日の完全な昼光、または温室内の一般的な光レベルであり得る）。我々は、以下のような結果を観察した。３０分間のリボフラビン（１０ｐｐｍ）＋Ｓｉｌｗｅｔ（０．０１２５％）は、０．１５のｌｏｇ低減を示した。１時間、５０ｐｐｍのリボフラビンは、１．６のｌｏｇ低減を示した。Ｓｉｌｗｅｔ（Ｈｅｌｅｎａ ２０１９参照）は、農薬とともに一般的に使用される農業用非イオン性有機ケイ素界面活性剤の湿潤アジュバントおよび展着剤であり、一般にスティッカースプレッダーとしても知られる）。Ｓｉｌｗｅｔ（登録商標）Ｌ－７７抗菌活性がほとんどない。

【0092】

３０分間の硫酸銅（１０ｐｐｍ）＋Ｓｉｌｗｅｔ（０．０１２５％）は、０．１３のｌｏｇ低減を示した。３０分間、４０ｐｐｍの硫酸銅も０．１３のｌｏｇ低減を示した。３０分間のリボフラビン（１８ｐｐｍ）＋硫酸銅（１０ｐｐｍ）＋Ｓｉｌｗｅｔ（０．０１２５％）は、３．８のｌｏｇ低減を示した。再び、我々は、光活性化剤と銅の組み合わせで、１，０００倍超の結果向上を見る。この実施例は、光活性化剤と銅塩の組み合わせが、最も関連性の高い条件：すなわち一般的な光レベルで、光活性化剤と銅の両方の有効濃度が最も低い状態で高い効果を発揮することを示し、これは経済的な理由からも望ましい。この実施例では、光源はＵＶ光を含む。しかし、青色ＬＥＤを用いた実施例で示したように、ＵＶは必要ない。

【0093】

実施例４：銅化合物としての銅エタノールアミン

【0094】

この実施例では、我々は、銅エタノールアミン（製品ラベルより：銅エタノールアミン錯体、混合（Ｍｏｎｏ ＣＡＳ＃１４２１５－５２－２およびＴｒｉ ＣＡＳ＃８２０２７－５９－６）２７．９％；その他の成分７２．１％ 合計１００．０％ 金属銅換算、９％；ガロンあたりの０．９０９ｌｂｓの量の元素銅を含む）（ＥＰＡ登録番号８９５９－１０）を含む、市販の殺藻剤製品、Ｃｕｔｒｉｎｅ（登録商標）を試験した。銅エタノールアミンは、銅塩を中性ｐＨの溶液に保つのに有効である。試験は上記のように、爬虫類ライトの下で３０分間行われた。これまでの試験データから、これらの条件下ではリボフラビン単独では１－ｌｏｇキルを大きく下回ることが得られている。

【0095】

ＣｕＳＯ４を１０ｐｐｍで用いた上記試験は、銅３．９８ｐｐｍに相当する。我々は、当初、低濃度と高濃度でのＣｕｔｒｉｎｅ（登録商標）を試験したが、ここでは、低濃度は以前通りの約３．９８ｐｐｍの銅に調整され、高濃度は３９．８ｐｐｍの銅（１００ｐｐｍのＣｕＳＯ４と同じ銅濃度）に調整される。我々は、それらを１８ｐｐｍのリボフラビンの有り無しで試験した。また、試験は３重で行われた。また、１８ｐｐｍかつ爬虫類ランプの下で３０分のリボフラビン単独は、０．１１５－Ｌｏｇキル（大腸菌）を有する。３．９８ｐｐｍの銅のＣｕｔｒｉｎｅ（登録商標）は０．３０－Ｌｏｇキルを有し、３９．８ｐｐｍのＣｕｔｒｉｎｅ（登録商標）は３．１－Ｌｏｇキルを有する。

【0096】

３．９８ｐｐｍの銅のＣｕｔｒｉｎｅ（登録商標）と１８ｐｐｍのリボフラビンの組み合わせで、２．５－Ｌｏｇキルが観察された。相加理論に基づいて期待されるキルは、わずか０．３１４－Ｌｏｇキルである。従って、実際のキルは期待されるものより２．１８－Ｌｏｇ高く、これは相乗効果である。

【0097】

３９．８ｐｐｍの銅のＣｕｔｒｉｎｅ（登録商標）と１８ｐｐｍのリボフラビンの組み合わせで、７．４－Ｌｏｇキルが観察された（実質的に完全に殺傷）。相加理論に基づいて期待されるキルは、わずか３．１１－Ｌｏｇキルである。従って、実際のキルは期待されるものより４．２９－Ｌｏｇ高く、これは明らかに相乗効果である。

【0098】

実施例５：ゼラニウムの植物におけるＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｈｏｒｔｏｒｕｍ ｐｖ． Ｐｅｌａｒｇｏｎｉｉの低減。

【0099】

これらの試験において、ゼラニウムの挿し木「アメリカンブライトレッド（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｒｉｇｈｔ Ｒｅｄ）」がＳｙｎｇｅｎｔａ Ｆｌｏｗｅｒｓ（Ｇｉｌｒｏｙ， ＣＡ）から入手された。挿し木は発根させ、Ｊｏｌｙ Ｒａｎｃｈ Ｐｏｔｔｉｎｇ Ｍｉｘ ＃２を入れた３．５インチポットに植え付けた。植物は最初に１．５ｇ／ポット（Ｏｓｍｏｃｏｔｅ Ｐｌｕｓ、微量栄養素を含む１５－９－１２）で施肥され、週に３回手で水が与えられた。植物を樹立させ、高さ約１５ｃｍまで成長させた。実験は、温度が６５～９０°Ｆに維持され、光のレベルが１０００～２０００フートキャンドルの温室ハウスで行われた。実験は、処理ごとに３ブロック（処理ごとに１０植物、総数６０）のランダム化ブロック設計で設定された。単一製品の適用は、０２／２７／１９に行われた。殺菌剤ＣｕＰｒｏＴ／Ｎ／Ｏ ２００５（水酸化銅、３５％の金属銅当量を含む）は２ｌｂｓ／１００ガロン（１００ガロンあたり０．７ｌｂｓの金属銅当量）で使用され、同じ日に標準対照として適用された。すべての製品は、ハンドスプレーを使用して流出するまで植物の表面に噴霧された。

【0100】

細菌接種物の生産のために、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｈｏｒｔｏｒｕｍ ｐｖ． ｐｅｌａｒｇｏｎｉｉ（旧Ｘ． ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ． Ｐｅｌａｒｇｏｎｉ、Ｘ５７５）の培養物を、５％ショ糖で補正したＤｉｆｃｏ Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ａｇａｒ（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ）上で２８±１℃で４８時間増殖させた。細菌をＮＡプレートから採取し、生理食塩水（ＮａＣｌ、８．５ｇ／ｌ）に懸濁し、分光光度法でＡ６００から１Ｘ１０５コロニー形成単位／ｍｌで調整した。葉および茎に細菌懸濁液が流出するまで噴霧し、それらは透明なポリエチレン袋に２４時間封入された。処理物は、殺菌剤を適用した（０２／２８／１９）２４時間後に接種された。処理１では、非接種植物（生理食塩水を噴霧）が対照として用いられた。接種後２週間目に各植物の葉の斑点数が数えられた。各処理はＡＮＯＶＡとＬＳＤを用いて比較した。また、植物毒性の任意の兆候があるかどうかを判断するために、視覚的な比較も行われた。

【0101】

このデータは、リボフラビンだけを２０ｐｐｍにした処理Ｅは、部分的な効果しかないことを示す。しかし、リボフラビンを２０ｐｐｍ、硫酸銅を１０ｐｐｍとした処理Ｃは有効である。リボフラビンと硫酸銅にアスコルビン酸ナトリウムを加えた処理Ｄは、市販品のＣｕＰＲＯと同程度の効果がある。必要な銅の量を大幅に減らすことができるのは、本発明の利点である。１００ガロンあたり０．７ｌｂｓの金属銅換算値、またはＬあたり０．８３９ｇの銅を含む市販のＣｕＰＲＯ製品の処理Ｆと、１０ｐｐｍの硫酸銅、またはＬあたり０．００３９８ｇの銅を含む処理Ｄを比較すると、本発明の解決策は、銅の濃度を２００倍超低下させながら、同等の結果を提供することが分かる。（図１６を参照）。

【0102】

本発明は、その特定の好ましいバージョンを参照してかなり詳細に説明されてきたが、他のバージョンが可能である。したがって、添付の請求項の精神および範囲は、法律で義務付けられている場合を除き、本明細書に含まれる好ましいバージョンの説明に限定されるべきではない。

【0103】

読者の注意は、本明細書と同時に提出され、参照により本明細書に組み込まれるすべての参考文献に向けられる。

【0104】

本明細書の特徴はすべて（添付の特許請求の範囲、要約書および図面を含む）、特に明記されない限り、同じ、同等または同類の目的を果たす別の特徴に取って代わってよい。したがって、特に明記しない限り、開示された各特徴は、同等の類似の特徴を有する一連の一般的な例としてのみ記載される。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】