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特許7430879アルブミン結合性を有するＮＯラジカル放出型抗がん剤としてのニトロ化フェニルカルボン酸誘導体
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-02-05
(45)【発行日】2024-02-14
(54)【発明の名称】アルブミン結合性を有するＮＯラジカル放出型抗がん剤としてのニトロ化フェニルカルボン酸誘導体
(51)【国際特許分類】
C07C 229/42 20060101AFI20240206BHJP
A61K 31/196 20060101ALI20240206BHJP
A61K 47/64 20170101ALI20240206BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240206BHJP
A61P 11/00 20060101ALI20240206BHJP
A61P 1/18 20060101ALI20240206BHJP
A61P 1/04 20060101ALI20240206BHJP
C07K 14/76 20060101ALN20240206BHJP
【ＦＩ】
C07C229/42 CSP
A61K31/196
A61K47/64
A61P35/00
A61P11/00
A61P1/18
A61P1/04
C07K14/76
【請求項の数】
7
(21)【出願番号】P 2020010513
(22)【出願日】2020-01-27
(65)【公開番号】P2021116259
(43)【公開日】2021-08-10
【審査請求日】2023-01-25
(73)【特許権者】
【識別番号】594158150
【氏名又は名称】学校法人君が淵学園
(74)【代理人】
【識別番号】100174791
【弁理士】
【氏名又は名称】川口 敬義
(72)【発明者】
【氏名】西 弘二
(72)【発明者】
【氏名】山崎 啓之
(72)【発明者】
【氏名】小田切 優樹
(72)【発明者】
【氏名】井本 修平
(72)【発明者】
【氏名】別府 拓豪
【審査官】高橋 直子
(56)【参考文献】
【文献】特表２００９－５１６７１９（ＪＰ，Ａ）
【文献】Medicinal Chemistry，2013年，Vol.9, No.6，875-880
【文献】Drug Delivery System，2018年，33(2)，130-138
【文献】Journal of Parmaceutical Sciences ，2016年，105，1987-1994
【文献】J. Chem. Soc., Perkin Trans 2，1999年，10，2183-2187
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｃ ２２９／４２
Ａ６１Ｋ ３１／１９６
Ａ６１Ｋ ４７／６４
Ａ６１Ｐ ３５／００
Ａ６１Ｐ １１／００
Ａ６１Ｐ １／１８
Ａ６１Ｐ １／０４
Ｃ０７Ｋ １４／７６
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
下記化１で表されることを特徴とする化合物。（式中，m，nはそれぞれ1から７，oは１から５の整数で表される）
【化1】
【請求項2】
下記化２で表される化合物。（式中，m，nは，それぞれ1から7の整数で表される）
【化2】
【請求項3】
ｍ，ｎが1から3の整数で表される請求項１または２に記載の化合物。【請求項4】
ｍ，ｎがいずれも2で表される請求項１または２に記載の化合物。【請求項5】
請求項１から４のいずれかに記載される化合物を有効成分とするがん治療薬。【請求項6】
請求項１から請求項4のいずれかの化合物とアルブミンを結合させた複合体を有効成分とするがん治療薬。【請求項7】
前記がんが，すい臓がん，肺がん，大腸がんのいずれかから選択される請求項５又は６に記載のがん治療薬。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は，ニトロ化フェニルカルボン酸誘導体，ならびにこれを有効成分とする抗がん剤に関する。
【背景技術】
【0002】
がんは，医療が発達した現代においても，治療が困難な疾患の一つであり，さらなる治療方法の開発が望まれている。
その中で，ニトロ化合物によるラジカル放出をメカニズムとしてがん細胞を死滅させ治療効果を発揮する化合物が報告されている（非特許文献１から３）。
しかるに，報告されているニトロ化合物は，短い血中半減期や化合物の不安定性などが原因で，医薬品としての十分な抗がん効果の発揮には至らず，臨床応用されているものはないのが現状である。
その中で，ニトロ化合物によるラジカル放出をメカニズムとしてがん細胞を死滅させ治療効果を発揮する化合物が報告されている（非特許文献１から３）。
しかるに，報告されているニトロ化合物は，短い血中半減期や化合物の不安定性などが原因で，医薬品としての十分な抗がん効果の発揮には至らず，臨床応用されているものはないのが現状である。
【0003】
一方，発明者らは，4-フェニル酪酸ナトリウム（Phenylbutyrate; PB）に関する報告を行っている（非特許文献４）。
すなわち，4-フェニル酪酸ナトリウムは，尿素サイクル異常症の治療薬として臨床使用されている薬剤である。尿素サイクル異常症患者では残余窒素の尿素としての排泄が不十分となることにより高アンモニア血症を呈する。これに対しフェニル酪酸ナトリウムは，ヒト生体内でβ酸化により速やかにフェニル酢酸に代謝されてグルタミンと結合し，フェニルアセチルグルタミンとして尿中に排泄される。この際，αケトグルタル酸からグルタミン酸を経てグルタミンが生合成される過程で，アンモニア2 分子が取り込まれるため，フェニル酪酸ナトリウム1 分子により窒素2 原子が排泄されることとなり，高アンモニア血症を防ぐことをメカニズムとする。
このように，4-フェニル酪酸ナトリウムの薬効薬理は十分に明らかとなっているものの，体内動態の詳細については十分に解明されていなかった。発明者らは，4-フェニル酪酸が，ヒト血清中のアルブミンに対し高い結合性を有することを明らかとしたものである。
すなわち，4-フェニル酪酸ナトリウムは，尿素サイクル異常症の治療薬として臨床使用されている薬剤である。尿素サイクル異常症患者では残余窒素の尿素としての排泄が不十分となることにより高アンモニア血症を呈する。これに対しフェニル酪酸ナトリウムは，ヒト生体内でβ酸化により速やかにフェニル酢酸に代謝されてグルタミンと結合し，フェニルアセチルグルタミンとして尿中に排泄される。この際，αケトグルタル酸からグルタミン酸を経てグルタミンが生合成される過程で，アンモニア2 分子が取り込まれるため，フェニル酪酸ナトリウム1 分子により窒素2 原子が排泄されることとなり，高アンモニア血症を防ぐことをメカニズムとする。
このように，4-フェニル酪酸ナトリウムの薬効薬理は十分に明らかとなっているものの，体内動態の詳細については十分に解明されていなかった。発明者らは，4-フェニル酪酸が，ヒト血清中のアルブミンに対し高い結合性を有することを明らかとしたものである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0004】
【文献】Kashfi et al., J Pharmacol Exp Ther. 2002
【文献】Hungenin et al., Mol. Cnacer Ther. 2004
【文献】Rcciotti et al., J Immunol. 2010
【文献】Enokida T, Yamasaki K, Okamoto Y, Taguchi K, Ishiguro T, Maruyama T, Seo H, Otagiri M. Tyrosine411 and Arginine410 of Human Serum Albumin Play an Important Role in the Binding of Sodium 4-Phenylbutyrate to Site II. J Pharm Sci. 105:1987-1994 (2016).
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
発明者らは，ニトロ化合物の短い血中半減期や不安定性について，4-フェニル酪酸が有するアルブミン結合能をもって解決できるのではないかと考え，研究に着手したものである。
上記事情を背景として，本発明では，4-フェニル酪酸を基本化合物としたニトロ化合物誘導体の開発を課題とする。
上記事情を背景として，本発明では，4-フェニル酪酸を基本化合物としたニトロ化合物誘導体の開発を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0006】
発明者らは，鋭意研究の結果，4-フェニル酪酸を基本構造として有するニトロ化フェニル酪酸誘導体の合成に成功し，ニトロ化フェニルカルボン酸誘導体の発明を完成させた。
さらに，発明者らは，ニトロ化フェニルカルボン酸誘導体が，がん細胞のアポトーシスを誘導することを確認し，ニトロ化フェニル酪酸誘導体を有効成分とするがん治療薬に関する発明を完成させた。
さらに，発明者らは，ニトロ化フェニルカルボン酸誘導体が，がん細胞のアポトーシスを誘導することを確認し，ニトロ化フェニル酪酸誘導体を有効成分とするがん治療薬に関する発明を完成させた。
【0007】
本発明は，以下の構成からなる。
【0008】
［１］下記化１で表されることを特徴とする化合物。
（式中，m，nはそれぞれ1から７，oは１から５の整数で表される）
［２］下記化２で表される化合物。
（式中，m，nはそれぞれ1から７の整数で表される）
（式中，m，nはそれぞれ1から７，oは１から５の整数で表される）
【化1】
（式中，m，nはそれぞれ1から７の整数で表される）
【化2】
【0009】
［３］ｍ，ｎが1から３の整数で表される［１］または［２］に記載の化合物。
［４］ｍ，ｎがいずれも２で表される［１］または［２］に記載の化合物。
［４］ｍ，ｎがいずれも２で表される［１］または［２］に記載の化合物。
【0010】
［５］［１］から［４］のいずれかに記載される化合物を有効成分とするがん治療薬。
［６］［１］から［４］のいずれかの化合物とアルブミンを結合させた複合体を有効成分とするがん治療薬。
［７］前記がんが，すい臓がんである［５］又は［６］に記載のがん治療薬。
［６］［１］から［４］のいずれかの化合物とアルブミンを結合させた複合体を有効成分とするがん治療薬。
［７］前記がんが，すい臓がんである［５］又は［６］に記載のがん治療薬。
【発明の効果】
【0011】
本発明により，4-フェニル酪酸を基本化合物としたニトロ化フェニルカルボン酸誘導体の提供が可能となった。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1】本発明のニトロ化フェニルカルボン酸誘導体のがん治療のメカニズムを例示した図。
【図2】本発明のニトロ化フェニル酪酸（NO2-PB）の合成スキームを示した図。
【図3】本発明のニトロ化フェニル酪酸の1H-NMRを，クロラムブシルと比較して示した図。
【図4】ヒト膵臓がん細胞株を用いて，ニトロ化フェニル酪酸のアポトーシス誘導能を，濃度依存的に評価した結果を示した図。
【図5】ヒト膵臓がん細胞株を用いて，ニトロ化フェニル酪酸のアポトーシス誘導能を，時間依存的に評価した結果を示した図。
【図6】ヒト膵臓がん細胞株を用いて，ニトロ基を有しない化合物とニトロ化フェニル酪酸のアポトーシス誘導能を比較して評価した結果を示した図。
【発明を実施するための形態】
【0013】
本発明について，説明を行う。
【0014】
本発明の化合物は，一つの態様として，下記化１で表されることを特徴とする。
（式中，m，nはそれぞれ1から７，oは１から５の整数で表される）
（式中，m，nはそれぞれ1から７，oは１から５の整数で表される）
【化1】
【0015】
また，本発明の化合物は，より好ましい態様として，下記化２で表される。
（式中，m，nはそれぞれ1から７の整数で表される）
（式中，m，nはそれぞれ1から７の整数で表される）
【化2】
【0016】
前記化１ないし化２の化合物は，フェニル酪酸を基本構造として誘導体化されたものであり，フェニル酪酸が有するアルブミン結合能と，ニトロ基が有するラジカル発生能を備えるものである。
すなわち，下記のメカニズムに基づき，がん治療効果を発揮するものである（図１）。
(1) 本発明の化合物が，血中において，アルブミンに非共有的な結合力により結合し，複合体を形成することで高い血中滞留性を有する。
(2) 複合体が腫瘍組織ないしこれの周辺に集積する。
(3) 腫瘍環境（低酸素，低pH）により，化合物中のニトロ基が，NO2 -からNOラジカルに変換される。
(4) NOラジカルが，腫瘍細胞および周辺の繊維組織に作用し，アポトーシスを誘導する。
すなわち，下記のメカニズムに基づき，がん治療効果を発揮するものである（図１）。
(1) 本発明の化合物が，血中において，アルブミンに非共有的な結合力により結合し，複合体を形成することで高い血中滞留性を有する。
(2) 複合体が腫瘍組織ないしこれの周辺に集積する。
(3) 腫瘍環境（低酸素，低pH）により，化合物中のニトロ基が，NO2 -からNOラジカルに変換される。
(4) NOラジカルが，腫瘍細胞および周辺の繊維組織に作用し，アポトーシスを誘導する。
【0017】
式中m，nは，本発明の化合物の第二級アミノ基において設定が必要となる整数である。本発明の化合物における第二級アミノ基は，アルブミンとは結合せず，フリーな側鎖として機能するものである。これより，式中m，nは，ニトロ化カルボン酸誘導体としての安定性と適度な水溶性を有する限り特に限定する必要はなく，適宜，設定することができる。
このようなm，nとして，通常1から7の整数を選択すればよく，より好ましくは1から5の整数，特に好ましくは1から3の整数，最も好ましくはm，nいずれも2とすることができる。
このようなm，nとして，通常1から7の整数を選択すればよく，より好ましくは1から5の整数，特に好ましくは1から3の整数，最も好ましくはm，nいずれも2とすることができる。
【0018】
式中oは，本発明の化合物の直鎖アルキルカルボキシル基において設定が必要となる整数である。本発明の化合物における直鎖アルキルカルボキシル基は，アルブミンと非共有的な結合力により結合し，血中滞留性と安定性を保持するために機能するものである。そのため，式中oは，ニトロ化カルボン酸誘導体として，アルブミン結合能を損なわない限り特に限定する必要はなく，化合物としての安定性とコンパクト性を備える整数として選択することができる。
このようなoとして，通常1から5の整数を選択すればよく，より好ましくは1から4の整数，特に好ましくは1から3の整数，最も好ましくは3とすることができる。
このようなoとして，通常1から5の整数を選択すればよく，より好ましくは1から4の整数，特に好ましくは1から3の整数，最も好ましくは3とすることができる。
【0019】
本発明の化合物は，がんを治療するための有効成分として用いることができる。すなわち，本発明の化合物を有効成分として，抗がん剤として構成することができる。また，本発明の化合物とアルブミンを非共有的に結合させた複合体を有効成分として構成することもできる。
これらがん治療薬としての使用については，がんである限り特に限定する必要はないが，好ましくは，低血流および低酸素状態を惹起する固形がんに用いることができる。このようながんとして，例えば，すい臓がん，肺がん，大腸がんなどが挙げられる。
これらがん治療薬としての使用については，がんである限り特に限定する必要はないが，好ましくは，低血流および低酸素状態を惹起する固形がんに用いることができる。このようながんとして，例えば，すい臓がん，肺がん，大腸がんなどが挙げられる。
【0020】
また，本発明の化合物を有効成分として用いる際は，そのままの化学形で用いてもよいし，塩として用いてもよい。塩として用いる場合，好ましくはカチオン塩とすることができ，例えば，ナトリウム塩，カリウム塩，アンモニウム塩などが挙げられ，最も好ましくはナトリウム塩とすることができる。
さらに，本発明の化合物を有効成分として用いる際は，種々の添加物を含む組成物とすることができる。このような添加物として，例えば，例えば，賦形剤，安定化剤，酸化防止剤，pH調整剤などが挙げられる。
さらに，本発明の化合物を有効成分として用いる際は，種々の添加物を含む組成物とすることができる。このような添加物として，例えば，例えば，賦形剤，安定化剤，酸化防止剤，pH調整剤などが挙げられる。
【実施例】
【0021】
本発明のニトロ化フェニル酪酸誘導体について，詳述する。
【0022】
＜＜実験例１，ニトロ化フェニル酪酸誘導体の合成＞＞
１．クロラムブシル，硝酸銀のアセトニトリル溶液を70℃に加熱して，一昼夜，攪拌を行なった（図２）。
２．反応液を室温まで冷却し，ろ過を行ってから減圧蒸留により反応液の濃縮を行った。得られた残渣についてシリカゲルクロマトグラフィーにて精製を行い，目的物を良好な収率で得た。
３．目的物について，1H-NMR（図３），13C-NMR，MS各種スペクトル測定を行い，NO2-PBであることを確認した。
１．クロラムブシル，硝酸銀のアセトニトリル溶液を70℃に加熱して，一昼夜，攪拌を行なった（図２）。
２．反応液を室温まで冷却し，ろ過を行ってから減圧蒸留により反応液の濃縮を行った。得られた残渣についてシリカゲルクロマトグラフィーにて精製を行い，目的物を良好な収率で得た。
３．目的物について，1H-NMR（図３），13C-NMR，MS各種スペクトル測定を行い，NO2-PBであることを確認した。
【0023】
＜＜実験例２，膵がん細胞に対する細胞死誘導効果の検討＞＞
１．ヒト膵臓がん細胞株として，AsPC1細胞，BxPC3細胞を用いて，NO2-PBの細胞死誘導効果ついて評価を行った。すなわち，各細胞を，NO2-PBを所定の条件で含む培地で培養を行い，培養終了後の総細胞数に対するアネキシン陽性細胞（アポトーシス細胞）数の比率を求めることにより，評価を行った。
１．ヒト膵臓がん細胞株として，AsPC1細胞，BxPC3細胞を用いて，NO2-PBの細胞死誘導効果ついて評価を行った。すなわち，各細胞を，NO2-PBを所定の条件で含む培地で培養を行い，培養終了後の総細胞数に対するアネキシン陽性細胞（アポトーシス細胞）数の比率を求めることにより，評価を行った。
【0024】
２．濃度依存性を調べた結果を図４に示す。図４は，NO2-PBを各濃度で48時間培養を行った後のアネキシン陽性細胞率を示した結果である。
(1) AsPC1細胞において，NO2-PBを含まない培地と比較して，いずれの濃度においてもアネキシン陽性細胞率は高かった。また，アネキシン陽性細胞率は，濃度依存的に増加する傾向であった。
(2) BxPC3細胞において，NO2-PBを含まない培地と比較して，いずれの濃度においてもアネキシン陽性細胞率は高かった。また，アネキシン陽性細胞率は，濃度依存的に増加する傾向であった。
(1) AsPC1細胞において，NO2-PBを含まない培地と比較して，いずれの濃度においてもアネキシン陽性細胞率は高かった。また，アネキシン陽性細胞率は，濃度依存的に増加する傾向であった。
(2) BxPC3細胞において，NO2-PBを含まない培地と比較して，いずれの濃度においてもアネキシン陽性細胞率は高かった。また，アネキシン陽性細胞率は，濃度依存的に増加する傾向であった。
【0025】
３．時間依存性を調べた結果を図５に示す。図５は，NO2-PBを500μMの濃度で，各時間培養を行った後のアネキシン陽性細胞率を示した結果である。
(1) AsPC1細胞において，陰性対象（NO2-PB無し）では24時間，48時間，いずれにおいてもアネキシン陽性細胞率は，20%弱と，ほとんど変わらなかった。一方，実施例（NO2-PB，500μM）では，24時間で26%，48時間で50%強と，いずれも陰性対象より高く，時間依存的に，アネキシン陽性細胞率が高くなっていった。
(2) BxPC3細胞において，陰性対象（NO2-PB無し）では，アネキシン陽性細胞率が，24時間で35%，48時間で43%とわずかながらではあるが上昇していた。これに対し，実施例（NO2-PB，500μM）では，24時間で53%，48時間で68%と，いずれも陰性対象より高く，時間依存的に，アネキシン陽性細胞率が高くなっていった。
(1) AsPC1細胞において，陰性対象（NO2-PB無し）では24時間，48時間，いずれにおいてもアネキシン陽性細胞率は，20%弱と，ほとんど変わらなかった。一方，実施例（NO2-PB，500μM）では，24時間で26%，48時間で50%強と，いずれも陰性対象より高く，時間依存的に，アネキシン陽性細胞率が高くなっていった。
(2) BxPC3細胞において，陰性対象（NO2-PB無し）では，アネキシン陽性細胞率が，24時間で35%，48時間で43%とわずかながらではあるが上昇していた。これに対し，実施例（NO2-PB，500μM）では，24時間で53%，48時間で68%と，いずれも陰性対象より高く，時間依存的に，アネキシン陽性細胞率が高くなっていった。
【0026】
４．これらの結果から，NO2-PBは，膵がん細胞において，濃度依存的，時間依存的に，アポトーシス誘導効果を有することが分かった。
【0027】
＜＜実験例３，ヒト膵がん細胞のアポトーシス誘導効果におけるNO2依存性の検討＞＞
１．実験例２で示されたNO2-PBのアポトーシス誘導効果が，ニトロ基に由来するかを調べることを目的に検討を行った。すなわち，NO2-PBと化学構造が類似するニトロ基を有しない化合物（PB，OH-PB）について，実験例２と同じ方法で検討を行い，アポトーシス誘導効果の比較を行った。
１．実験例２で示されたNO2-PBのアポトーシス誘導効果が，ニトロ基に由来するかを調べることを目的に検討を行った。すなわち，NO2-PBと化学構造が類似するニトロ基を有しない化合物（PB，OH-PB）について，実験例２と同じ方法で検討を行い，アポトーシス誘導効果の比較を行った。
【0028】
２．結果を図６に示す。図６は，各化合物を含んで48時間培養を行った場合のAsPC1細胞におけるアネキシン陽性細胞率を，何も含まない培地を用いて行った場合を1として，相対値で表した結果である。
(1) NO2-PBの相対値が3.1であった。
(2) 一方，ニトロ基を有しない化合物（PB，OH-PB）について，PBが1.2，OH-PBが1.1であり，なにも含まない場合とほとんど変わらない値であり，NO2-PBと比較してもおよそ3分の1にとどまった。
(1) NO2-PBの相対値が3.1であった。
(2) 一方，ニトロ基を有しない化合物（PB，OH-PB）について，PBが1.2，OH-PBが1.1であり，なにも含まない場合とほとんど変わらない値であり，NO2-PBと比較してもおよそ3分の1にとどまった。
【0029】
３．これらの結果から，NO2-PBにおけるアポトーシス誘導効果は，ニトロ基に由来するものであることが示された。
【0030】
＜＜まとめ＞＞
NO2-PBは，緩やかに細胞死を誘導したことから，NOラジカルの放出が緩やかであることが示唆された。このことは，NO2-PBの構造がこれまでのニトロ化化合物より安定であることを示している。このようにNO2-PBは，がん細胞に対して有意な効果を示すだけでなくて，アルブミン結合性を有することで，血中滞留性（作用持続性）および腫瘍集積性も併せ持つ新しいNOラジカル放出型抗がん剤として臨床応用が期待される。
NO2-PBは，緩やかに細胞死を誘導したことから，NOラジカルの放出が緩やかであることが示唆された。このことは，NO2-PBの構造がこれまでのニトロ化化合物より安定であることを示している。このようにNO2-PBは，がん細胞に対して有意な効果を示すだけでなくて，アルブミン結合性を有することで，血中滞留性（作用持続性）および腫瘍集積性も併せ持つ新しいNOラジカル放出型抗がん剤として臨床応用が期待される。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
