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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-02-05
(45)【発行日】2024-02-14
(54)【発明の名称】抗体修飾キメラ抗原受容体修飾Ｔ細胞及びその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 5/10 20060101AFI20240206BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20240206BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20240206BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20240206BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20240206BHJP
C07K 14/725 20060101ALI20240206BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20240206BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240206BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240206BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20240206BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240206BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20240206BHJP
A61K 47/68 20170101ALN20240206BHJP
【ＦＩ】
C12N5/10 ZNA
C12N15/13
C12N15/12
C12N15/62 Z
C07K16/28
C07K14/725
C07K19/00
C12N15/63 Z
A61P35/00
A61P35/02
A61K39/395 T
A61K48/00
A61K47/68
【請求項の数】
18
(21)【出願番号】P 2020555283
(86)(22)【出願日】2018-12-28
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2021-04-15
(86)【国際出願番号】 CN2018124692
(87)【国際公開番号】W WO2019129177
(87)【国際公開日】2019-07-04
【審査請求日】2021-12-16
(31)【優先権主張番号】201711462801.X
(32)【優先日】2017-12-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
【前置審査】
(73)【特許権者】
【識別番号】520233869
【氏名又は名称】上海細胞治療集団有限公司
【氏名又は名称原語表記】ＳＨＡＮＧＨＡＩ ＣＥＬＬ ＴＨＥＲＡＰＹ ＧＲＯＵＰ ＣＯ．， ＬＴＤ．
(74)【代理人】
【識別番号】110001999
【氏名又は名称】弁理士法人はなぶさ特許商標事務所
(72)【発明者】
【氏名】銭 其軍
(72)【発明者】
【氏名】金 華君
(72)【発明者】
【氏名】江 ▲ヅ▼青
(72)【発明者】
【氏名】何 周
(72)【発明者】
【氏名】游 術梅
(72)【発明者】
【氏名】唐 熙
(72)【発明者】
【氏名】李 林芳
(72)【発明者】
【氏名】王 超
(72)【発明者】
【氏名】崔 連振
【審査官】田ノ上 拓自
(56)【参考文献】
【文献】中国特許出願公開第１０７０３４２３５（ＣＮ，Ａ）
【文献】特表２０１６－５０８７２８（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１５／００１０８５（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１７／１３６８２９（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１７／１６５６８３（ＷＯ，Ａ１）
【文献】IgG Fc engineering to modulate antibody effector functions，Protein Cell, 2017年10月6日，(p.1-11)，DOI 10.1007/s13238-017-0473-8
【文献】Molecular Therapy, 2015年，Vol.23, No.4，p.757-768，doi:10.1038/mt.2014.208
【文献】Clin. Cancer Res., 2017年11月15日，Vol.23, No.22，p.6982-6992，doi: 10.1158/1078-0432.CCR-17-0867
【文献】Molecular Therapy, 2015年，Vol.23, No.4，p.769-778，doi:10.1038/mt.2015.4
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ ５／１０
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００
Ａ６１Ｐ ３５／００
Ａ６１Ｐ ３５／０２
Ａ６１Ｋ ３５／１７
Ａ６１Ｋ ３９／３９５
Ａ６１Ｋ ４８／００
Ａ６１Ｋ ４７／６８
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
任意に含まれてもよいシグナルペプチドと、抗原結合配列と、突然変異型Ｆｃフラグメントとを含む抗体を発現する、或いは前記抗体のコード配列またはその発現ベクターを含有するＴ細胞であって、前記突然変異型Ｆｃフラグメントはそのアミノ酸配列が配列番号１の２６９～４９７位のアミノ酸残基に示されるもの、又はそのコード配列が配列番号２の８０５～１４９１位の塩基配列に示されるものであって；前記Ｔ細胞はキメラ抗原受容体を発現するＣＡＲ－Ｔ細胞であって、
前記抗原結合配列は、抗原と特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片から由来するものであり、或いは腫瘍微小環境で機能するタンパク質のリガンドまたは該タンパク質に結合するその断片から由来するものであり、前記抗原と特異的に結合する抗体はＣＤ４０一本鎖抗体またはＰＤ－１一本鎖抗体であり、前記リガンドはＣＤ４７のリガンドであり、前記ＣＤ４７リガンドのアミノ酸配列は配列番号５の２１～１３８位のアミノ酸残基に示されるものであり、又は前記ＣＤ４７リガンドのコード配列は配列番号６の６０～４１４位の塩基配列に示されるものであることを特徴とする、Ｔ細胞。
【請求項2】
前記Ｔ細胞のゲノムには、前記抗体の発現フレームが組み込まれることを特徴とする、請求項１に記載のＴ細胞。
【請求項3】
前記シグナルペプチドは軽鎖シグナルペプチドであることを特徴とする、請求項１に記載のＴ細胞。
【請求項4】
前記軽鎖シグナルペプチドのアミノ酸配列は配列番号１の１～２０位のアミノ酸配列に示されるもの、又は前記軽鎖シグナルペプチドのコード配列は配列番号２の１～６０位の塩基配列に示されるものであることを特徴とする、請求項３に記載のＴ細胞。
【請求項5】
前記ＣＤ４０一本鎖抗体の軽鎖可変領域アミノ酸配列は配列番号１の２１～１４６位のアミノ酸残基に示されるものであり、及び／又は前記ＣＤ４０一本鎖抗体の重鎖可変領域アミノ酸配列は配列番号１の１６１～２６８位のアミノ酸残基に示されるものである；前記ＣＤ４０一本鎖抗体の軽鎖可変領域のコード配列は配列番号２の６０～４３８位の塩基配列に示されるものであり、及び／或その重鎖可変領域のコード配列は配列番号２の４８１～８０４位の塩基配列に示されるものである；
前記ＰＤ－１一本鎖抗体の軽鎖可変領域アミノ酸配列は配列番号３の２１～１３１位のアミノ酸残基に示されるものであり、及び／又は前記ＰＤ－１一本鎖抗体の重鎖可変領域アミノ酸配列は配列番号３の１４７～２６６位のアミノ酸残基に示されるものである；前記ＰＤ－１一本鎖抗体の軽鎖可変領域のコード配列は配列番号４の６０～３９３位の塩基配列に示されるものであり、及び／或その重鎖可変領域のコード配列は配列番号４の４３９～７９８位の塩基配列に示されるものである；
ことを特徴とする、請求項１に記載のＴ細胞。
【請求項6】
前記任意に含まれてもよいシグナルペプチドと、抗原結合配列と、突然変異型Ｆｃフラグメントとを含む抗体はＣＤ４０抗体、ＰＤ－１抗体またはＣＤ４７抗体である；ただし、前記ＣＤ４０抗体のアミノ酸配列は配列番号１の２１～４９７位に示されるもの、または配列番号１に示されるものであり、前記ＰＤ－１抗体のアミノ酸配列は配列番号３の２１～４９５位に示されるもの、または配列番号３に示されるものであり、前記ＣＤ４７抗体のアミノ酸配列は配列番号５の２１～３６７位に示されるもの、または配列番号５に示されるものである；或いは
ただし、前記ＣＤ４０抗体のコード配列は配列番号２の６０～１４９１位の塩基配列に示されるもの、または配列番号２に示されるものであり；或いは、前記ＰＤ－１抗体のコード配列は配列番号４の６０～１４８５位の塩基配列に示されるもの、または配列番号４に示されるものであり；或いは、前記ＣＤ４７抗体のコード配列は配列番号６の６０～１１０４位の塩基配列に示されるもの、または配列番号６に示されるものである；
ことを特徴とする、請求項１に記載のＴ細胞。
【請求項7】
前記Ｔ細胞のゲノムには、前記抗体の発現フレームおよび前記キメラ抗原受容体の発現フレームが組み込まれたことを特徴とする、請求項１～６のいずれか一項に記載のＴ細胞。
【請求項8】
前記キメラ抗原受容体は下記抗原の１種または多種を認識する、標的とする、または特異的に結合するものである：ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＥＡ、ＧＤ２、ＦＲ、ＰＳＭＡ、ＰＭＥＬ、ＣＡ９、ＣＤ１７１／Ｌ１－ＣＡＭ、ＩＬ－１３Ｒα２、ＭＡＲＴ－１、ＥＲＢＢ２、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＭＡＧＥファミリータンパク質、ＢＡＧＥファミリータンパク質、ＧＡＧＥファミリータンパク質、ＡＦＰ、ＭＵＣ１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＩＬ－１１Ｒα、ＥＧＰ－２、ＥＧＰ－４０、ＦＢＰ、ＧＤ３、ＰＳＣＡ、ＦＳＡ、ＰＳＡ、ＨＭＧＡ２、胎児型アセチルコリン受容体、ＬｅＹ、ＥｐＣＡＭ、ＭＳＬＮ、ＩＧＦＲ１、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＲＢＢ３、ＥＲＢＢ４、ＣＡ１２５、ＣＡ１５－３、ＣＡ１９－９、ＣＡ７２－４、ＣＡ２４２、ＣＡ５０、ＣＹＦＲＡ２１－１、ＳＣＣ、ＡＦＵ、ＥＢＶ－ＶＣＡ、ＰＯＡ、β２－ＭＧおよびＰＲＯＧＲＰ；ことを特徴とする、請求項１に記載のＴ細胞。
【請求項9】
前記キメラ抗原受容体は、任意に含まれてもよいシグナルペプチド配列と、抗原認識領域と、ヒンジ領域と、膜貫通領域と、細胞内共刺激シグナル領域と、細胞内シグナル領域とを含む；ただし、前記シグナルペプチドは、ＣＤ８シグナルペプチド、ＣＤ２８シグナルペプチド、ＣＤ４シグナルペプチドおよび軽鎖シグナルペプチドから選ばれるものである；
前記抗原認識領域は、標的抗原を認識する、標的とする、または特異的に結合するアミノ酸配列である；
前記ヒンジ領域は、ＣＤ８の細胞外ヒンジ領域、ＩｇＧ１ Ｆｃ ＣＨ２ＣＨ３ヒンジ
領域、ＩｇＤヒンジ領域、ＣＤ２８の細胞外ヒンジ領域、ＩｇＧ４ Ｆｃ ＣＨ２ＣＨ３ヒンジ領域およびＣＤ４の細胞外ヒンジ領域から選ばれるものである；
前記膜貫通領域は、ＣＤ２８膜貫通領域、ＣＤ８膜貫通領域、ＣＤ３ζ膜貫通領域、ＣＤ１３４膜貫通領域、ＣＤ１３７膜貫通領域、ＩＣＯＳ膜貫通領域およびＤＡＰ１０膜貫通領域である；
前記細胞内共刺激シグナル領域は、共刺激シグナル分子の細胞内ドメインであり、ＣＤ２８、ＣＤ１３４／ＯＸ４０、ＣＤ１３７／４－１ＢＢ、リンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ、誘導性Ｔ細胞共刺激因子およびＤＮＡＸ活性化タンパク質１０の細胞内ドメインから選ばれるものである；及び／又は
前記細胞内シグナル領域は、ＣＤ３ζ細胞内シグナル領域またはＦｃεＲＩγ細胞内シグナル領域である；
ことを特徴とする、請求項８に記載のＴ細胞。
【請求項10】
前記シグナルペプチドのアミノ酸配列は、配列番号７の１～２１位のアミノ酸残基に示されるもの、または配列番号９の１～２２位のアミノ酸残基に示されるもの、または配列番号１１の１～２０位のアミノ酸残基に示されるものである；または前記シグナルペプチドのコード配列は、配列番号８の１～６３位の塩基配列に示されるもの、または配列番号１０の１～６６位の塩基配列に示されるもの、または配列番号１２の１～６０位の塩基配列に示されるものである；前記抗原認識領域は、ＣＤ１９、メソテリン、ＥＧＦＲまたはムチンを認識する、標的とする、または特異的に結合する一本鎖抗体であり、或いはＥｒｂＢ受容体ファミリーを認識する、標的とする、または特異的に結合するアミノ酸配列からなるものである；
前記ヒンジ領域のアミノ酸配列は、配列番号７の２６４～３０８位のアミノ酸残基に示されるもの、または配列番号９の２７３～５００位のアミノ酸残基に示されるもの、または配列番号１７の２６４～３１８位のアミノ酸残基に示されるものである；または前記ヒンジ領域のコード配列は、配列番号８の７９０～９２４位の塩基配列に示されるもの、または配列番号１０の８１７～１５００位の塩基配列に示されるもの、または配列番号１８の７９０～９５４位の塩基配列に示されるものである；
前記膜貫通領域のアミノ酸配列は、配列番号７の３０９～３３２位のアミノ酸残基に示されるもの、または配列番号９の５０１～５２８位のアミノ酸残基に示されるもの、または配列番号１７の３１９～３４４位のアミノ酸残基に示されるものである；または前記膜貫通領域のコード配列は、配列番号８の９２５～９９６位の塩基配列に示されるもの、または配列番号１０の１５０１～１５８４位の塩基配列に示されるもの、または配列番号１８の９５５～１０３２位の塩基配列に示されるものである；
前記細胞内共刺激シグナル領域のアミノ酸配列は、配列番号７の３３３～３７４位のアミノ酸残基に示されるもの、または配列番号９の５２９～５６９位のアミノ酸残基に示されるものである；または前記細胞内共刺激シグナル領域のコード配列は、配列番号８の９９７～１１２２位の塩基配列に示されるもの、または配列番号１０の１５８５～１７０７位の塩基配列に示されるものである；
及び／又は
前記細胞内シグナル領域のアミノ酸配列は、配列番号７の３７５～４８６位のアミノ酸残基に示されるものである；または前記細胞内シグナル領域のコード配列は、配列番号８の１１２３～１４５８位の塩基配列に示されるものである；
ことを特徴とする、請求項９に記載のＴ細胞。
【請求項11】
前記ＣＤ１９を認識する、標的とする、または特異的に結合する一本鎖抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号７の２２～１２８位のアミノ酸残基に示されるものであってもよく、及び／又はその重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号７の１４４～２６３位のアミノ酸残基に示されるものであってもよい；前記メソテリン抗原を認識する、標的とする、または特異的に結合する一本鎖抗体は、
メソテリンの領域ＩまたはＩＩＩに対する一本鎖抗体である；
前記ＥｒｂＢ受容体ファミリーを認識する、標的とする、または特異的に結合する抗原認識領域は、天然のＴ１Ｅとヘリン（Ｈｅｒｉｎ）の融合タンパク質を含む；ただし、Ｔ１Ｅはヒトトランスフォーミング成長因子αＮ末端の７個のアミノ酸と、上皮成長因子（ＥＧＦ）Ｃ末端の４８個のアミノ酸からなるものである；
前記ムチン抗原を認識する、標的とする、または特異的に結合する一本鎖抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列と重鎖可変領域のアミノ酸配列は、Ｍｕｃ１の膜近傍末端のアミノ酸配列に対する抗体から由来するものである；
前記ＥＧＦＲを認識する、標的とする、または特異的に結合する抗原認識領域は、ＥＧＦＲ特異的抗体の軽鎖可変領域と重鎖可変領域からなる一本鎖抗体である；
ことを特徴とする、請求項１０に記載のＴ細胞。
【請求項12】
前記メソテリン領域ＩＩＩに対する一本鎖抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号９の２３～１４６位のアミノ酸残基に示されるものであり、及び／又は重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号９の１６２～２７２位のアミノ酸残基に示されるものである；前記Ｔ１Ｅのアミノ酸配列は配列番号１３の２３～７７位のアミノ酸残基に示されるものである；前記ヘリンのアミノ酸配列は配列番号１３の９３～１７１位のアミノ酸残基に示されるものである；
前記Ｍｕｃ１の膜近傍末端のアミノ酸配列は配列番号２４に示されるものである；
前記ＥＧＦＲ特異的抗体の軽鎖可変領域と重鎖可変領域からなる一本鎖抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１７の２３～１２９位のアミノ酸残基に示されるものであり、及び／又は重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１７の１４５～２６３位のアミノ酸残基に示されるものである；
前記ＥｒｂＢ受容体ファミリーを認識する、標的とする、または特異的に結合する抗原認識領域は配列番号１３の２３～１７１位のアミノ酸残基に示されるものである；
前記前記ムチン抗原を認識する、標的とする、または特異的に結合する一本鎖抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１５の２３～１３３位のアミノ酸残基に示されるものであり、及び／又は重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１５の１４９～２６９位のアミノ酸残基に示されるものである；
ことを特徴とする、請求項１１のいずれか一項に記載のＴ細胞。
【請求項13】
前記キメラ抗原受容体は下記のものから選ばれるものである、ことを特徴とする、請求項１１に記載のＴ細胞。（１）そのアミノ酸配列は配列番号７の２２～４８６位のアミノ酸残基に示されるもの、または配列番号７に示されるものである；またはそのコード配列は、配列番号８の６４～１４５８位の塩基配列に示されるもの、または配列番号８に示されるものである、ＣＤ１９を標的とするキメラ抗原受容体；
（２）そのアミノ酸配列は配列番号９の２３～６８１位のアミノ酸残基に示されるもの、または配列番号９に示されるものである；またはそのコード配列は、配列番号１０の６７～２０４３位の塩基配列に示されるものである；または配列番号１０に示されるものである；或いは、そのアミノ酸配列は配列番号１１の２１～６７９位のアミノ酸残基に示されるもの、または配列番号１１に示されるものである；またはそのコード配列は、配列番号１２の６１～２０３７位の塩基配列に示されるもの、または配列番号１２に示されるものである、メソテリンを標的とするキメラ抗原受容体；
（３）そのアミノ酸配列は配列番号１３の２３～５８０位のアミノ酸残基に示されるもの、または配列番号１３に示されるものである；またはそのコード配列は、配列番号１４の６７～１７４０位の塩基配列に示されるもの、または配列番号１４に示されるものである、ＥｒｂＢファミリーを標的とする抗原認識領域；
（４）そのアミノ酸配列は配列番号１５の２３～６７８位のアミノ酸残基に示されるもの、または配列番号１５に示されるものである；またはそのコード配列は、好ましくは配
列番号１６の６７～２０３４位の塩基配列に示されるもの、または配列番号１６に示されるものである、ムチンを標的とするキメラ抗原受容体；
（５）そのアミノ酸配列は配列番号１７の２３～４９７位のアミノ酸残基に示されるもの、または配列番号１７に示されるものである；またはそのコード配列は、好ましくは配列番号１８の６７～１４９１位の塩基配列に示されるもの、または配列番号１８に示されるものである、ＥＧＦＲを標的とするキメラ抗原受容体
【請求項14】
請求項１～１３のいずれか一項に記載のＴ細胞或いは前記Ｔ細胞およびそれが発現する抗体を含む医薬組成物。
【請求項15】
請求項１～１３のいずれか一項に記載のＴ細胞の、悪性腫瘍を治療または予防するための薬物の製造における使用。
【請求項16】
前記悪性腫瘍は、急性Ｂリンパ球性白血病、慢性Ｂリンパ球性白血病、マントル細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫および多発性骨髄腫から選ばれるものであり；或いはメソセリン、少なくとも１つのＥＧＦＲファミリーメンバータンパク質、Ｍｕｃ１抗原、ＥＧＦＲ及び／又はＣＤ４７を癌細胞表面で異常発現する悪性腫瘍であり；或いはＣＤ４０またはＰＤ１によって仲介される悪性腫瘍であることを特徴とする、請求項１５に記載の使用。
【請求項17】
下記のベクターで請求項１～１３のいずれか一項に記載のＴ細胞をトランスフェクトする工程を含むことを特徴とする、Ｔ細胞の製造方法。（１）前記キメラ抗原受容体の発現フレームを前記Ｔ細胞のゲノムに導入させるための、トランスポザーゼコード配列を含むベクター、および
（２）前記抗体の発現フレームを前記Ｔ細胞のゲノムに組み込むための、トランスポザーゼコード配列を含まないベクター
【請求項18】
質量で、（１）と（２）に記載のベクターの比率は１～７：１～７であることを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、抗体修飾キメラ抗原受容体修飾Ｔ細胞及びその使用に関する。
【背景技術】
【0002】
キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔ
ｃｅｌｌ、ＣＡＲ－Ｔ）治療技術は、間違いなく腫瘍免疫細胞療法の分野での希望の星である。ＣＡＲ－Ｔ技術は、ある抗原分子を認識する抗体可変領域の遺伝子配列と、Ｔリンパ球免疫受容体の細胞内領域配列とを遺伝子工学技術でスプライスした後、レトロウイルスやレンチウイルスベクター、トランスポゾンやトランスポザーゼシステムを介して、或いは直接にｍＲＮＡとしてリンパ球へ形質導入し、且つ融合タンパク質を細胞表面に発現させることにより、Ｔリンパ球が非ＭＨＣ制限様式で特定の抗原を認識できるようにし、その腫瘍認識・殺傷能を高めるものである。
ｃｅｌｌ、ＣＡＲ－Ｔ）治療技術は、間違いなく腫瘍免疫細胞療法の分野での希望の星である。ＣＡＲ－Ｔ技術は、ある抗原分子を認識する抗体可変領域の遺伝子配列と、Ｔリンパ球免疫受容体の細胞内領域配列とを遺伝子工学技術でスプライスした後、レトロウイルスやレンチウイルスベクター、トランスポゾンやトランスポザーゼシステムを介して、或いは直接にｍＲＮＡとしてリンパ球へ形質導入し、且つ融合タンパク質を細胞表面に発現させることにより、Ｔリンパ球が非ＭＨＣ制限様式で特定の抗原を認識できるようにし、その腫瘍認識・殺傷能を高めるものである。
【0003】
ＣＡＲの構造は、１９８９年にイスラエルのＥｓｈｈａｒ研究チームによって初めて提案されてから、約３０年の開発を経って、ＣＡＲ構造によって修飾されたＴ細胞が腫瘍免疫療法に優れた治療効果を持つことは証明されていた。１世代目のＣＡＲ受容体には、細胞外の腫瘍抗原を特異的に認識する断片（一本鎖可変フラグメント、ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ、ｓｃＦｖ）が含まれており、細胞内活性化シグナルはＣＤ３ζシグナルチェーンによって伝達される。しかしながら、１世代目のＣＡＲ受容体には、Ｔ細胞の共刺激シグナルが欠けているため、Ｔ細胞は瞬時的な効果しか発揮できず、生体内で短時間しか存在できず、サイトカインを少量しか分泌しない。２世代目のＣＡＲ受容体には、例えばＣＤ２８、ＣＤ１３４／ＯＸ４０、ＣＤ１３７／４－１ＢＢ、リンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ、ＬＣＫ）、誘導性Ｔ細胞共刺激因子（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｔ－ｃｅｌｌ ｃｏ－ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ、ＩＣＯＳ）及びＤＮＡＸ活性化タンパク質１０（ＤＮＡＸ－ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ １０、ＤＡＰ１０）等のドメインのような共刺激シグナル分子の細胞内ドメインが追加され、Ｔ細胞の増殖能及びサイトカイン分泌能が高められ、ＩＬ－２、ＩＦＮ－γ及びＧＭ－ＣＳＦが増加したことにより、腫瘍微小環境の免疫抑制は打ち破られ、ＡＩＣＤ（活性化誘導細胞死、ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ、ＡＩＣＤ）は延長される。３世代目のＣＡＲ受容体には、共刺激構造のＣＤ２８とＩＴＡＭシグナルチェーンの間に４－１ＢＢのような二次共刺激分子がさらに融合されたため、トリプルシグナルＣＡＲ受容体が生み出され、３世代目のＣＡＲ受容体によって改造されたＴ細胞は、より優れたエフェクター機能と生体内生存時間を持っている。一般的に使用される典型的なＣＡＲ－Ｔ構造は、２世代目のＣＡＲ受容体であり、その構造は具体的に、腫瘍抗原を認識する抗体一本鎖可変領域（ｓｃＦｖ）、ヒンジ領域、膜貫通領域、および細胞内刺激シグナルドメインの４つの部分に分けられる。ＣＡＲ構造のヒンジ領域は、正確な立体配座を形成し、二量体を形成する役割を担う。ヒンジ領域の長さとアミノ酸配列特徴は、ＣＡＲの立体配座を決定すると共に、その腫瘍細胞表面抗原結合能も決定する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
現在、ＧＤ２、ＦＲ－α、Ｌ１－ＣＡＭ、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＶＥＧＦＲ－２、ＩＬ－１３Ｒα２、ＦＡＰ、メソテリン、ｃ－ＭＥＴ、ＰＳＭＡ、ＣＥＡ、ＧＰＣ３、ＥｐｈＡ２、ＭＵＣ１、ＣＡＩＸ（炭酸脱水酵素ＩＸ）等を含む複数の標的に対するＣＡＲ－Ｔ細胞は、固形腫瘍治療のための臨床試験が行われている。そのうち、
一部の臨床試験は比較的に良好な結果が得られた；例えば、ＧＤ２に対するＣＡＲ－Ｔ細胞で高リスク神経芽細胞腫を治療する臨床試験（１９例患者）において、８例の患者では、ＣＡＲ－Ｔ細胞を戻した後に腫瘍が完全に退縮し、３例の未退縮患者では、ＣＡＲ－Ｔ細胞を戻した６週間後の観察時点で完全な応答を示し、１名の完全応答患者では、１９２週目にもＣＡＲ－Ｔ細胞が検出できた；ＨＥＲ２に対するＣＡＲ－Ｔ細胞でＨＥＲ２陽性固形腫瘍を治療する臨床試験（合計で１９例、そのうちの骨肉腫が１６例）において、４例では無増悪生存状態を１２週間～１４ヶ月維持し、そのうちの３例では腫瘍が退縮し、１例では９０％以上退縮した。しかしながら、一般的に言えば、固形腫瘍のＣＡＲ－Ｔ療法は、血液腫瘍に比べて治療効果に大きな差があり、その原因は主に、下記のものを含む：
１、免疫を抑制する微小環境
固形腫瘍組織には、Ｔｒｅｇ細胞、腫瘍関連線維芽細胞、骨髄由来未熟ＤＣ細胞、Ｍ２型マクロファージ等、並びにそれらで分泌されるＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＤＯ、ＶＥＧＦ、ＴＧＦβ等のサイトカインを含む免疫抑制の微小環境が存在し、これらの細胞及びそれらで分泌されるサイトカインは、直接的な又は間接的な方式でＴ細胞の機能を抑制できる。放射線療法や化学療法による腫瘍微小環境の破壊、免疫チェックポイント抗体（例えばＰＤ１／ＰＤＬ１）又は負の免疫調節因子（例えばＩＤＯ小分子阻害剤）による関連のシグナル伝達経路の特異的な遮断、関連酵素の阻害剤のエピジェネティックな修飾による免疫微小環境の全体的な調整、正の免疫調節因子（例えばＩＬ－１２）の過剰発現、（例えばＦＡＰ陽性腫瘍関連線維芽細胞をターゲトとするＣＡＲ－Ｔによる）腫瘍間質細胞の直接標的除去等の策は全て、固形腫瘍の免疫抑制の微小環境に作用し、浸潤したＣＡＲ－Ｔ細胞の生存能と殺傷効果を高めることができる。
２、適切なＣＡＲ－Ｔ治療標的の欠乏
固形腫瘍は高度に不均一であり、異なる患者、同じ患者の異なる病巣、および同じ病巣の異なる腫瘍細胞の間ではいずれも高度に相違している。このような高度な不均一性により、標的腫瘍治療は、汎用的で広域的な望ましい標的の欠乏という不利な境地に陥り、固形腫瘍の治療におけるＣＡＲ－Ｔ細胞の治療効果は制限されてしまう。そこで、ＣＡＲ－Ｔ細胞の殺傷範囲を拡大させるために、ある学者は、異なる腫瘍関連抗原に結合する２種類のｓｃＦｖを直列に接続し、２つの標的を同時に認識して結合できる新しいＣＡＲを構築し、ＣＡＲ－Ｔ細胞の治療効果を効果的に向上させるＴａｎＣＡＲの設計概念を提案した。
３、生体内で有効量に到達することの困難さ
Ｔ細胞で腫瘍細胞を殺傷するには、クラスター化の必要があり、１つの腫瘍細胞を殺傷するには、いくつかのＴ細胞の協力が必要であるため、エフェクター細胞が特定の数に到達しなければ、腫瘍細胞を効果的に殺傷することができない。したがって、Ｔ細胞は特定の標的の腫瘍細胞に接触すると、急速に増殖し、直接接触と傍分泌経路を介して殺傷機能を増幅することができる。ＣＡＲ－Ｔ細胞は静脈内で投与され、血液腫瘍の場合には、腫瘍細胞と非常に簡単に接触でき、ＣＡＲ－Ｔ細胞の数は急速に増幅し、ひいては過剰に増幅してサイトカインストームを形成するため、治療効果は比較的に良好であるが、固形腫瘍の場合には、血液循環中の腫瘍細胞の数は限られており、ＣＡＲ－Ｔ細胞は刺激を受けるために腫瘍部位に到達する必要があり、有効量に到達することは困難である。
一部の臨床試験は比較的に良好な結果が得られた；例えば、ＧＤ２に対するＣＡＲ－Ｔ細胞で高リスク神経芽細胞腫を治療する臨床試験（１９例患者）において、８例の患者では、ＣＡＲ－Ｔ細胞を戻した後に腫瘍が完全に退縮し、３例の未退縮患者では、ＣＡＲ－Ｔ細胞を戻した６週間後の観察時点で完全な応答を示し、１名の完全応答患者では、１９２週目にもＣＡＲ－Ｔ細胞が検出できた；ＨＥＲ２に対するＣＡＲ－Ｔ細胞でＨＥＲ２陽性固形腫瘍を治療する臨床試験（合計で１９例、そのうちの骨肉腫が１６例）において、４例では無増悪生存状態を１２週間～１４ヶ月維持し、そのうちの３例では腫瘍が退縮し、１例では９０％以上退縮した。しかしながら、一般的に言えば、固形腫瘍のＣＡＲ－Ｔ療法は、血液腫瘍に比べて治療効果に大きな差があり、その原因は主に、下記のものを含む：
１、免疫を抑制する微小環境
固形腫瘍組織には、Ｔｒｅｇ細胞、腫瘍関連線維芽細胞、骨髄由来未熟ＤＣ細胞、Ｍ２型マクロファージ等、並びにそれらで分泌されるＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＤＯ、ＶＥＧＦ、ＴＧＦβ等のサイトカインを含む免疫抑制の微小環境が存在し、これらの細胞及びそれらで分泌されるサイトカインは、直接的な又は間接的な方式でＴ細胞の機能を抑制できる。放射線療法や化学療法による腫瘍微小環境の破壊、免疫チェックポイント抗体（例えばＰＤ１／ＰＤＬ１）又は負の免疫調節因子（例えばＩＤＯ小分子阻害剤）による関連のシグナル伝達経路の特異的な遮断、関連酵素の阻害剤のエピジェネティックな修飾による免疫微小環境の全体的な調整、正の免疫調節因子（例えばＩＬ－１２）の過剰発現、（例えばＦＡＰ陽性腫瘍関連線維芽細胞をターゲトとするＣＡＲ－Ｔによる）腫瘍間質細胞の直接標的除去等の策は全て、固形腫瘍の免疫抑制の微小環境に作用し、浸潤したＣＡＲ－Ｔ細胞の生存能と殺傷効果を高めることができる。
２、適切なＣＡＲ－Ｔ治療標的の欠乏
固形腫瘍は高度に不均一であり、異なる患者、同じ患者の異なる病巣、および同じ病巣の異なる腫瘍細胞の間ではいずれも高度に相違している。このような高度な不均一性により、標的腫瘍治療は、汎用的で広域的な望ましい標的の欠乏という不利な境地に陥り、固形腫瘍の治療におけるＣＡＲ－Ｔ細胞の治療効果は制限されてしまう。そこで、ＣＡＲ－Ｔ細胞の殺傷範囲を拡大させるために、ある学者は、異なる腫瘍関連抗原に結合する２種類のｓｃＦｖを直列に接続し、２つの標的を同時に認識して結合できる新しいＣＡＲを構築し、ＣＡＲ－Ｔ細胞の治療効果を効果的に向上させるＴａｎＣＡＲの設計概念を提案した。
３、生体内で有効量に到達することの困難さ
Ｔ細胞で腫瘍細胞を殺傷するには、クラスター化の必要があり、１つの腫瘍細胞を殺傷するには、いくつかのＴ細胞の協力が必要であるため、エフェクター細胞が特定の数に到達しなければ、腫瘍細胞を効果的に殺傷することができない。したがって、Ｔ細胞は特定の標的の腫瘍細胞に接触すると、急速に増殖し、直接接触と傍分泌経路を介して殺傷機能を増幅することができる。ＣＡＲ－Ｔ細胞は静脈内で投与され、血液腫瘍の場合には、腫瘍細胞と非常に簡単に接触でき、ＣＡＲ－Ｔ細胞の数は急速に増幅し、ひいては過剰に増幅してサイトカインストームを形成するため、治療効果は比較的に良好であるが、固形腫瘍の場合には、血液循環中の腫瘍細胞の数は限られており、ＣＡＲ－Ｔ細胞は刺激を受けるために腫瘍部位に到達する必要があり、有効量に到達することは困難である。
【0005】
したがって、ＣＡＲ－Ｔ、特に腫瘍膜抗原を広域的に認識できるＣＡＲ－Ｔ細胞に、Ｔ細胞の増殖や生存などの機能を直接的または間接的に刺激する抗体を発現させることができれば、固形腫瘍ＣＡＲ－Ｔ治療の難題を効果的に乗り越え、治療効果を大幅に向上させることができる。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明は、任意に含まれてもよいシグナルペプチドと、抗原結合配列と、突然変異型Ｆｃフラグメントとを含む抗体を発現する、或いは前記抗体のコード配列またはその発現ベ
クターを含有するＴ細胞であって、前記突然変異型Ｆｃフラグメントは、配列番号２５に示されるＩｇＧ４ Ｆｃフラグメントの１７位および７９位に相応する位置でのアミノ酸残基がそれぞれＥおよびＱに突然変異された突然変異型Ｆｃフラグメントであることを特徴とするＴ細胞を提供する。
クターを含有するＴ細胞であって、前記突然変異型Ｆｃフラグメントは、配列番号２５に示されるＩｇＧ４ Ｆｃフラグメントの１７位および７９位に相応する位置でのアミノ酸残基がそれぞれＥおよびＱに突然変異された突然変異型Ｆｃフラグメントであることを特徴とするＴ細胞を提供する。
【0007】
一つ又は複数の実施形態において、前記突然変異型Ｆｃフラグメントは突然変異型ＩｇＧ４ Ｆｃフラグメントであり、そのアミノ酸配列は配列番号１の２６９～４９７位のアミノ酸残基に示されるものが好ましく、そのコード配列は配列番号２の８０５～１４９１位の塩基配列に示されるものが好ましい。
【0008】
一つ又は複数の実施形態において、前記Ｔ細胞のゲノムには、前記抗体の発現フレームが組み込まれた。
【0009】
一つ又は複数の実施形態において、前記シグナルペプチドは軽鎖シグナルペプチドであり、そのアミノ酸配列は配列番号１の１～２０位のアミノ酸配列に示されるものが好ましく、そのコード配列は配列番号２の１～６０位の塩基配列に示されるものが好ましい。
【0010】
一つ又は複数の実施形態において、前記抗原結合配列は、抗原と特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片（例えば一本鎖抗体）から由来するものであり、或いは腫瘍微小環境で機能するタンパク質のリガンドまたは該タンパク質に結合するその断片から由来するものである；好ましくは、前記抗体はアゴニスト抗体またはアンタゴニスト抗体である。
【0011】
一つ又は複数の実施形態において、前記アゴニスト抗体は、下記抗原に対する抗体から選ばれるものである：ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ１３４、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＩＣＯＳ、ＨＶＥＭ、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＧＩＴＲ、ＬＩＧＨＴ、ＤＲ３、ＳＬＡＭ、ＣＤ２２６、ＣＤ８０およびＣＤ８６。
【0012】
一つ又は複数の実施形態において、前記アンタゴニスト抗体は、下記抗原に対する抗体から選ばれるものである：ＰＤ－１、ＣＴＬＡ４、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＰＤＬ３、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＣＤ４７、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１６０、ＬＡＩＲ１、Ｂ７－Ｈ１、Ｂ７－１、ＶＳＩＲおよびＣＤ２４４；好ましくは、前記リガンドはＣＤ４７のリガンドである。
【0013】
一つ又は複数の実施形態において、前記アゴニスト抗体はＣＤ４０一本鎖抗体である；好ましくは、前記ＣＤ４０一本鎖抗体の軽鎖可変領域アミノ酸配列は配列番号１の２１～１４６位のアミノ酸残基に示されるものであり、及び／又は前記ＣＤ４０一本鎖抗体の重鎖可変領域アミノ酸配列は配列番号１の１６１～２６８位のアミノ酸残基に示されるものである；好ましくは、前記ＣＤ４０一本鎖抗体のアミノ酸配列は配列番号１の２１～２６８位のアミノ酸残基に示されるものである。
【0014】
一つ又は複数の実施形態において、前記アンタゴニスト抗体はＰＤ－１一本鎖抗体である；好ましくは、前記ＰＤ－１一本鎖抗体の軽鎖可変領域アミノ酸配列は配列番号３の２１～１３１位のアミノ酸残基に示されるものであり、及び／又は前記ＰＤ－１一本鎖抗体の重鎖可変領域アミノ酸配列は配列番号３の１４７～２６６位のアミノ酸残基に示されるものである；好ましくは、前記ＰＤ－１一本鎖抗体のアミノ酸配列は配列番号３の２１～２６６位のアミノ酸残基に示されるものである。
【0015】
一つ又は複数の実施形態において、前記ＣＤ４７リガンドのアミノ酸配列は配列番号５の２１～１３８位のアミノ酸残基に示されるものである。
【0016】
一つ又は複数の実施形態において、前記ＣＤ４０一本鎖抗体の軽鎖可変領域のコード配列は配列番号２の６０～４３８位の塩基配列に示されるものであり、及び／或その重鎖可変領域のコード配列は配列番号２の４８１～８０４位の塩基配列に示されるものである；好ましくは、前記ＣＤ４０一本鎖抗体のコード配列は配列番号２の６０～８０４位のアミノ酸残基に示されるものである。
【0017】
一つ又は複数の実施形態において、前記ＰＤ－１一本鎖抗体の軽鎖可変領域のコード配列は配列番号４の６０～３９３位の塩基配列に示されるものであり、及び／或その重鎖可変領域のコード配列は配列番号４の４３９～７９８位の塩基配列に示されるものである；好ましくは、前記ＰＤ－１一本鎖抗体のコード配列は配列番号２の６０～７９８位のアミノ酸残基に示されるものである。
【0018】
一つ又は複数の実施形態において、前記ＣＤ４７リガンドのコード配列は配列番号６の６０～４１４位の塩基配列に示されるものであってもよい。
【0019】
一つ又は複数の実施形態において、前記抗体はＣＤ４０抗体、ＰＤ－１抗体またはＣＤ４７抗体である。
【0020】
一つ又は複数の実施形態において、前記ＣＤ４０抗体のアミノ酸配列は配列番号１の２１～４９７位に示されるもの、または配列番号１に示されるものであり、前記ＰＤ－１抗体のアミノ酸配列は配列番号３の２１～４９５位に示されるもの、または配列番号３に示されるものであり、前記ＣＤ４７抗体のアミノ酸配列は配列番号５の２１～３６７位に示されるもの、または配列番号５に示されるものである。
【0021】
一つ又は複数の実施形態において、前記抗体のコード配列は配列番号２の６０～１４９１位の塩基配列に示されるもの、または配列番号２に示されるものであり；或いは、配列番号４の６０～１４８５位の塩基配列に示されるもの、または配列番号４に示されるものであり；或いは、配列番号６の６０～１１０４位の塩基配列に示されるもの、または配列番号６に示されるものである。
一つ又は複数の実施形態において、前記Ｔ細胞はキメラ抗原受容体を発現するＣＡＲ－Ｔ細胞であり、ただし、前記Ｔ細胞のゲノムには、前記抗体の発現フレームおよび前記キメラ抗原受容体の発現フレームが組み込まれた。
一つ又は複数の実施形態において、前記キメラ抗原受容体は下記抗原の１種または多種を認識する、標的とする、または特異的に結合するものである：ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＥＡ、ＧＤ２、ＦＲ、ＰＳＭＡ、ＰＭＥＬ、ＣＡ９、ＣＤ１７１／Ｌ１－ＣＡＭ、ＩＬ－１３Ｒα２、ＭＡＲＴ－１、ＥＲＢＢ２、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＭＡＧＥファミリータンパク質、ＢＡＧＥファミリータンパク質、ＧＡＧＥファミリータンパク質、ＡＦＰ、ＭＵＣ１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＩＬ－１１Ｒα、ＥＧＰ－２、ＥＧＰ－４０、ＦＢＰ、ＧＤ３、ＰＳＣＡ、ＦＳＡ、ＰＳＡ、ＨＭＧＡ２、胎児型アセチルコリン受容体、ＬｅＹ、ＥｐＣＡＭ、ＭＳＬＮ、ＩＧＦＲ１、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＲＢＢ３、ＥＲＢＢ４、ＣＡ１２５、ＣＡ１５－３、ＣＡ１９－９、ＣＡ７２－４、ＣＡ２４２、ＣＡ５０、ＣＹＦＲＡ２１－１、ＳＣＣ、ＡＦＵ、ＥＢＶ－ＶＣＡ、ＰＯＡ、β２－ＭＧおよびＰＲＯＧＲＰ；好ましくは、ＣＤ１９、メソテリン、ＥＧＦＲ、ムチンまたはＥｒｂＢ受容体ファミリーを認識する、標的とする、または特異的に結合するキメラ抗原受容体である。
一つ又は複数の実施形態において、前記Ｔ細胞はキメラ抗原受容体を発現するＣＡＲ－Ｔ細胞であり、ただし、前記Ｔ細胞のゲノムには、前記抗体の発現フレームおよび前記キメラ抗原受容体の発現フレームが組み込まれた。
一つ又は複数の実施形態において、前記キメラ抗原受容体は下記抗原の１種または多種を認識する、標的とする、または特異的に結合するものである：ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＥＡ、ＧＤ２、ＦＲ、ＰＳＭＡ、ＰＭＥＬ、ＣＡ９、ＣＤ１７１／Ｌ１－ＣＡＭ、ＩＬ－１３Ｒα２、ＭＡＲＴ－１、ＥＲＢＢ２、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＭＡＧＥファミリータンパク質、ＢＡＧＥファミリータンパク質、ＧＡＧＥファミリータンパク質、ＡＦＰ、ＭＵＣ１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＩＬ－１１Ｒα、ＥＧＰ－２、ＥＧＰ－４０、ＦＢＰ、ＧＤ３、ＰＳＣＡ、ＦＳＡ、ＰＳＡ、ＨＭＧＡ２、胎児型アセチルコリン受容体、ＬｅＹ、ＥｐＣＡＭ、ＭＳＬＮ、ＩＧＦＲ１、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＲＢＢ３、ＥＲＢＢ４、ＣＡ１２５、ＣＡ１５－３、ＣＡ１９－９、ＣＡ７２－４、ＣＡ２４２、ＣＡ５０、ＣＹＦＲＡ２１－１、ＳＣＣ、ＡＦＵ、ＥＢＶ－ＶＣＡ、ＰＯＡ、β２－ＭＧおよびＰＲＯＧＲＰ；好ましくは、ＣＤ１９、メソテリン、ＥＧＦＲ、ムチンまたはＥｒｂＢ受容体ファミリーを認識する、標的とする、または特異的に結合するキメラ抗原受容体である。
【0022】
一つ又は複数の実施形態において、前記キメラ抗原受容体は、任意に含まれてもよいシグナルペプチド配列と、抗原認識領域と、ヒンジ領域と、膜貫通領域と、細胞内共刺激シグナル領域と、細胞内シグナル領域とを含む；ただし、前記シグナルペプチドは、ＣＤ８
シグナルペプチド、ＣＤ２８シグナルペプチド、ＣＤ４シグナルペプチドおよび軽鎖シグナルペプチドから選ばれるものである；前記抗原認識領域は、標的抗原を認識する、標的とする、または特異的に結合するアミノ酸配列である；前記ヒンジ領域は、ＣＤ８の細胞外ヒンジ領域、ＩｇＧ１ Ｆｃ ＣＨ２ＣＨ３ヒンジ領域、ＩｇＤヒンジ領域、ＣＤ２８の細胞外ヒンジ領域、ＩｇＧ４ Ｆｃ ＣＨ２ＣＨ３ヒンジ領域およびＣＤ４の細胞外ヒンジ領域から選ばれるもので、好ましくは長さが５０個のアミノ酸残基以上、より好ましくは長さが８０個のアミノ酸以上のヒンジ領域である；好ましくは、前記ヒンジ領域はＣＤ８αヒンジ領域またはＩｇＧ４ Ｆｃ ＣＨ２ＣＨ３ヒンジ領域である；前記膜貫通領域は、ＣＤ２８膜貫通領域、ＣＤ８膜貫通領域、ＣＤ３ζ膜貫通領域、ＣＤ１３４膜貫通領域、ＣＤ１３７膜貫通領域、ＩＣＯＳ膜貫通領域およびＤＡＰ１０膜貫通領域である；好ましくはＣＤ８膜貫通領域またはＣＤ２８膜貫通領域である；前記細胞内共刺激シグナル領域は、共刺激シグナル分子の細胞内ドメインであり、ＣＤ２８、ＣＤ１３４／ＯＸ４０、ＣＤ１３７／４－１ＢＢ、リンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ、誘導性Ｔ細胞共刺激因子およびＤＮＡＸ活性化タンパク質１０の細胞内ドメインから選ばれるもので、好ましくはＣＤ１３７／４－１ＢＢの細胞内ドメインまたはＣＤ２８の細胞内ドメインである；及び／又は前記細胞内シグナル領域は、ＣＤ３ζ細胞内シグナル領域またはＦｃεＲＩγ細胞内シグナル領域である；好ましくはＣＤ３ζ細胞内シグナル領域である。
シグナルペプチド、ＣＤ２８シグナルペプチド、ＣＤ４シグナルペプチドおよび軽鎖シグナルペプチドから選ばれるものである；前記抗原認識領域は、標的抗原を認識する、標的とする、または特異的に結合するアミノ酸配列である；前記ヒンジ領域は、ＣＤ８の細胞外ヒンジ領域、ＩｇＧ１ Ｆｃ ＣＨ２ＣＨ３ヒンジ領域、ＩｇＤヒンジ領域、ＣＤ２８の細胞外ヒンジ領域、ＩｇＧ４ Ｆｃ ＣＨ２ＣＨ３ヒンジ領域およびＣＤ４の細胞外ヒンジ領域から選ばれるもので、好ましくは長さが５０個のアミノ酸残基以上、より好ましくは長さが８０個のアミノ酸以上のヒンジ領域である；好ましくは、前記ヒンジ領域はＣＤ８αヒンジ領域またはＩｇＧ４ Ｆｃ ＣＨ２ＣＨ３ヒンジ領域である；前記膜貫通領域は、ＣＤ２８膜貫通領域、ＣＤ８膜貫通領域、ＣＤ３ζ膜貫通領域、ＣＤ１３４膜貫通領域、ＣＤ１３７膜貫通領域、ＩＣＯＳ膜貫通領域およびＤＡＰ１０膜貫通領域である；好ましくはＣＤ８膜貫通領域またはＣＤ２８膜貫通領域である；前記細胞内共刺激シグナル領域は、共刺激シグナル分子の細胞内ドメインであり、ＣＤ２８、ＣＤ１３４／ＯＸ４０、ＣＤ１３７／４－１ＢＢ、リンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ、誘導性Ｔ細胞共刺激因子およびＤＮＡＸ活性化タンパク質１０の細胞内ドメインから選ばれるもので、好ましくはＣＤ１３７／４－１ＢＢの細胞内ドメインまたはＣＤ２８の細胞内ドメインである；及び／又は前記細胞内シグナル領域は、ＣＤ３ζ細胞内シグナル領域またはＦｃεＲＩγ細胞内シグナル領域である；好ましくはＣＤ３ζ細胞内シグナル領域である。
【0023】
一つ又は複数の実施形態において、前記シグナルペプチドのアミノ酸配列は、配列番号７の１～２１位のアミノ酸残基に示されるもの、または配列番号９の１～２２位のアミノ酸残基に示されるもの、または配列番号１１の１～２０位のアミノ酸残基に示されるものである；前記抗原認識領域は、ＣＤ１９、メソテリン、ＥＧＦＲまたはムチンを認識する、標的とする、または特異的に結合する一本鎖抗体であり、或いはＥｒｂＢ受容体ファミリーを認識する、標的とする、または特異的に結合するアミノ酸配列からなるものである；前記ヒンジ領域のアミノ酸配列は、配列番号７の２６４～３０８位のアミノ酸残基に示されるもの、または配列番号９の２７３～５００位のアミノ酸残基に示されるもの、または配列番号１７の２６４～３１８位のアミノ酸残基に示されるものである；前記膜貫通領域のアミノ酸配列は、配列番号７の３０９～３３２位のアミノ酸残基に示されるもの、または配列番号９の５０１～５２８位のアミノ酸残基に示されるもの、または配列番号１７の３１９～３４４位のアミノ酸残基に示されるものである；前記細胞内共刺激シグナル領域のアミノ酸配列は、配列番号７の３３３～３７４位のアミノ酸残基に示されるもの、または配列番号９の５２９～５６９位のアミノ酸残基に示されるものである；及び／又は前記細胞内シグナル領域のアミノ酸配列は、配列番号７の３７５～４８６位のアミノ酸残基に示されるものである。
【0024】
一つ又は複数の実施形態において、前記シグナルペプチドのコード配列は、配列番号８の１～６３位の塩基配列に示されるもの、または配列番号１０の１～６６位の塩基配列に示されるもの、または配列番号１２の１～６０位の塩基配列に示されるものである；前記ヒンジ領域のコード配列は、配列番号８の７９０～９２４位の塩基配列に示されるもの、または配列番号１０の８１７～１５００位の塩基配列に示されるもの、または配列番号１８の７９０～９５４位の塩基配列に示されるものである；前記膜貫通領域のコード配列は、配列番号８の９２５～９９６位の塩基配列に示されるもの、または配列番号１０の１５０１～１５８４位の塩基配列に示されるもの、または配列番号１８の９５５～１０３２位の塩基配列に示されるものである；前記細胞内共刺激シグナル領域のコード配列は、配列番号８の９９７～１１２２位の塩基配列に示されるもの、または配列番号１０の１５８５～１７０７位の塩基配列に示されるものである；及び／又は前記細胞内シグナル領域のコード配列は、配列番号８の１１２３～１４５８位の塩基配列に示されるものである。
【0025】
一つ又は複数の実施形態において、前記ＣＤ１９を認識する、標的とする、または特異的に結合する一本鎖抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号７の２２～１２８位
のアミノ酸残基に示されるものであってもよく、及び／又はその重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号７の１４４～２６３位のアミノ酸残基に示されるものであってもよい；好ましくは、前記一本鎖抗体のアミノ酸配列は、配列番号７の２２～２６３位のアミノ酸残基に示されるものである。
のアミノ酸残基に示されるものであってもよく、及び／又はその重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号７の１４４～２６３位のアミノ酸残基に示されるものであってもよい；好ましくは、前記一本鎖抗体のアミノ酸配列は、配列番号７の２２～２６３位のアミノ酸残基に示されるものである。
【0026】
一つ又は複数の実施形態において、前記メソテリン抗原を認識する、標的とする、または特異的に結合する一本鎖抗体は、メソテリンの領域ＩまたはＩＩＩに対する一本鎖抗体であり、好ましくはメソテリン領域ＩＩＩに対する一本鎖抗体である；好ましくは、メソテリン領域ＩＩＩに対する一本鎖抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号９の２３～１４６位のアミノ酸残基に示されるものであり、及び／又はメソテリン領域ＩＩＩに対する一本鎖抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号９の１６２～２７２位のアミノ酸残基に示されるものである；好ましくは、前記メソテリン抗原を認識する、標的とする、または特異的に結合する一本鎖抗体のアミノ酸配列は配列番号９の２３～２７２位のアミノ酸残基に示されるものである。
【0027】
一つ又は複数の実施形態において、前記ＥｒｂＢ受容体ファミリーを認識する、標的とする、または特異的に結合する抗原認識領域は、天然のＴ１Ｅとヘリン（Ｈｅｒｉｎ）の融合タンパク質を含む；ただし、Ｔ１Ｅはヒトトランスフォーミング成長因子α（ＴＧＦα）Ｎ末端の７個のアミノ酸と、上皮成長因子（ＥＧＦ）Ｃ末端の４８個のアミノ酸からなるものであり、好ましくは、Ｔ１Ｅのアミノ酸配列は配列番号１３の２３～７７位のアミノ酸残基に示されるものである；前記ヘリンは、ハースタチン（Ｈｅｒｓｔａｔｉｎ）の８番目のイントロンによってコードされる７９個のアミノ酸であり、好ましくは、前記ヘリンのアミノ酸配列は配列番号１３の９３～１７１位のアミノ酸残基に示されるものである；好ましくは、前記抗原認識領域は配列番号１３の２３～１７１位のアミノ酸残基に示されるものである。
【0028】
一つ又は複数の実施形態において、前記ムチン抗原を認識する、標的とする、または特異的に結合する一本鎖抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列と重鎖可変領域のアミノ酸配列は、Ｍｕｃ１の膜近傍末端のアミノ酸配列に対する抗体から由来するものであり、好ましくは、該Ｍｕｃ１の膜近傍末端のアミノ酸配列は配列番号２４に示されるものである；好ましくは、前記一本鎖抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１５の２３～１３３位のアミノ酸残基に示されるものであり、及び／又は重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１５の１４９～２６９位のアミノ酸残基に示されるものである；好ましくは、前記一本鎖抗体のアミノ酸配列は配列番号１５の２３～２６９位のアミノ酸残基に示されるものである。
【0029】
一つ又は複数の実施形態において、前記ＥＧＦＲを認識する、標的とする、または特異的に結合する抗原認識領域は、ＥＧＦＲ特異的抗体の軽鎖可変領域と重鎖可変領域からなる一本鎖抗体である；好ましくは、前記一本鎖抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１７の２３～１２９位のアミノ酸残基に示されるものであり、及び／又は重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１７の１４５～２６３位のアミノ酸残基に示されるものである；好ましくは、前記一本鎖抗体のアミノ酸配列は配列番号１７の２３～２６３位のアミノ酸残基に示されるものである。
【0030】
一つ又は複数の実施形態において、前記キメラ抗原受容体はＮ末端からＣ末端まで、任意に含まれてもよいシグナルペプチド配列と、抗原認識領域と、ＣＤ８αヒンジ領域若しくはＩｇＧ４ ＣＨ２ＣＨ３ヒンジ領域と、ＣＤ８膜貫通領域若しくはＣＤ２８膜貫通領域と、４－１ＢＢ若しくはＣＤ２８の細胞内ドメインと、およびＣＤ３ζ細胞内シグナル領域と、を順次に含む。
【0031】
一つ又は複数の実施形態において、前記キメラ抗原受容体は下記のものから選ばれるものである：
（１）そのアミノ酸配列は配列番号７の２２～４８６位のアミノ酸残基に示されるもの、または配列番号７に示されるものであり、そのコード配列は、好ましくは配列番号８の６４～１４５８位の塩基配列に示されるもの、または配列番号８に示されるものである、ＣＤ１９を標的とするキメラ抗原受容体；
（２）そのアミノ酸配列は配列番号９の２３～６８１位のアミノ酸残基に示されるもの、または配列番号９に示されるものであり、そのコード配列は、好ましくは配列番号１０の６７～２０４３位の塩基配列に示されるもの、または配列番号１０に示されるものであり、或いは、そのアミノ酸配列は配列番号１１の２１～６７９位のアミノ酸残基に示されるもの、または配列番号１１に示されるものであり、そのコード配列は、好ましくは配列番号１２の６１～２０３７位の塩基配列に示されるもの、または配列番号１２に示されるものである、メソテリンを標的とするキメラ抗原受容体；
（３）そのアミノ酸配列は配列番号１３の２３～５８０位のアミノ酸残基に示されるもの、または配列番号１３に示されるものであり、そのコード配列は、好ましくは配列番号１４の６７～１７４０位の塩基配列に示されるもの、または配列番号１４に示されるものである、ＥｒｂＢファミリーを標的とする抗原認識領域；
（４）そのアミノ酸配列は配列番号１５の２３～６７８位のアミノ酸残基に示されるもの、または配列番号１５に示されるものであり、そのコード配列は、好ましくは配列番号１６の６７～２０３４位の塩基配列に示されるもの、または配列番号１６に示されるものである、ムチンを標的とするキメラ抗原受容体；
（５）そのアミノ酸配列は配列番号１７の２３～４９７位のアミノ酸残基に示されるもの、または配列番号１７に示されるものであり、そのコード配列は、好ましくは配列番号１８の６７～１４９１位の塩基配列に示されるもの、または配列番号１８に示されるものである、ＥＧＦＲを標的とするキメラ抗原受容体。
（１）そのアミノ酸配列は配列番号７の２２～４８６位のアミノ酸残基に示されるもの、または配列番号７に示されるものであり、そのコード配列は、好ましくは配列番号８の６４～１４５８位の塩基配列に示されるもの、または配列番号８に示されるものである、ＣＤ１９を標的とするキメラ抗原受容体；
（２）そのアミノ酸配列は配列番号９の２３～６８１位のアミノ酸残基に示されるもの、または配列番号９に示されるものであり、そのコード配列は、好ましくは配列番号１０の６７～２０４３位の塩基配列に示されるもの、または配列番号１０に示されるものであり、或いは、そのアミノ酸配列は配列番号１１の２１～６７９位のアミノ酸残基に示されるもの、または配列番号１１に示されるものであり、そのコード配列は、好ましくは配列番号１２の６１～２０３７位の塩基配列に示されるもの、または配列番号１２に示されるものである、メソテリンを標的とするキメラ抗原受容体；
（３）そのアミノ酸配列は配列番号１３の２３～５８０位のアミノ酸残基に示されるもの、または配列番号１３に示されるものであり、そのコード配列は、好ましくは配列番号１４の６７～１７４０位の塩基配列に示されるもの、または配列番号１４に示されるものである、ＥｒｂＢファミリーを標的とする抗原認識領域；
（４）そのアミノ酸配列は配列番号１５の２３～６７８位のアミノ酸残基に示されるもの、または配列番号１５に示されるものであり、そのコード配列は、好ましくは配列番号１６の６７～２０３４位の塩基配列に示されるもの、または配列番号１６に示されるものである、ムチンを標的とするキメラ抗原受容体；
（５）そのアミノ酸配列は配列番号１７の２３～４９７位のアミノ酸残基に示されるもの、または配列番号１７に示されるものであり、そのコード配列は、好ましくは配列番号１８の６７～１４９１位の塩基配列に示されるもの、または配列番号１８に示されるものである、ＥＧＦＲを標的とするキメラ抗原受容体。
【0032】
本発明はさらに、任意に含まれてもよいシグナルペプチドと、抗原結合配列と、突然変異型Ｆｃフラグメントとを含む抗体であって、前記突然変異型Ｆｃフラグメントは、配列番号２５に示されるＩｇＧ４ Ｆｃフラグメントの１７位および７９位に相応する位置でのアミノ酸残基がそれぞれＥおよびＱに突然変異された突然変異型Ｆｃフラグメントであることを特徴とする抗体を提供する。
【0033】
一つ又は複数の実施形態において、前記突然変異型Ｆｃフラグメントは突然変異型ＩｇＧ４ Ｆｃフラグメントであり、そのアミノ酸配列は配列番号１の２６９～４９７位のアミノ酸残基に示されるものが好ましく、そのコード配列は配列番号２の８０５～１４９１位の塩基配列に示されるものが好ましい。
【0034】
一つ又は複数の実施形態において、前記シグナルペプチドは軽鎖シグナルペプチドであり、そのアミノ酸配列は配列番号１の１～２０位のアミノ酸配列に示されるものが好ましく、そのコード配列は配列番号２の１～６０位の塩基配列に示されるものが好ましい。
【0035】
一つ又は複数の実施形態において、前記抗原結合配列は、抗原と特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片（例えば一本鎖抗体）から由来するものであり、或いは腫瘍微小環境で機能するタンパク質のリガンドまたは該タンパク質に結合するその断片から由来するものである；好ましくは、前記抗体はアゴニスト抗体またはアンタゴニスト抗体である；好ましくは、前記アゴニスト抗体は、下記抗原に対する抗体から選ばれるものである：ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ１３４、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＩＣＯＳ、ＨＶＥＭ、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＧＩＴＲ、ＬＩＧＨＴ、ＤＲ３、ＳＬＡＭ、ＣＤ２２６、ＣＤ８０およびＣＤ８６；好ましくは、前記アンタゴニスト抗体は、下記抗原に対する抗体から選ばれるものである：ＰＤ－１、ＣＴＬＡ４、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＰＤＬ３、ＴＩＭ
３、ＬＡＧ３、ＣＤ４７、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１６０、ＬＡＩＲ１、Ｂ７－Ｈ１、Ｂ７－１、ＶＳＩＲおよびＣＤ２４４；好ましくは、前記リガンドはＣＤ４７のリガンドである。
３、ＬＡＧ３、ＣＤ４７、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１６０、ＬＡＩＲ１、Ｂ７－Ｈ１、Ｂ７－１、ＶＳＩＲおよびＣＤ２４４；好ましくは、前記リガンドはＣＤ４７のリガンドである。
【0036】
一つ又は複数の実施形態において、前記アゴニスト抗体はＣＤ４０一本鎖抗体である；好ましくは、前記ＣＤ４０一本鎖抗体の軽鎖可変領域アミノ酸配列は配列番号１の２１～１４６位のアミノ酸残基に示されるものであり、及び／又は前記ＣＤ４０一本鎖抗体の重鎖可変領域アミノ酸配列は配列番号１の１６１～２６８位のアミノ酸残基に示されるものである；好ましくは、前記ＣＤ４０一本鎖抗体のアミノ酸配列は配列番号１の２１～２６８位のアミノ酸残基に示されるものである。
【0037】
一つ又は複数の実施形態において、前記アンタゴニスト抗体はＰＤ－１一本鎖抗体である；好ましくは、前記ＰＤ－１一本鎖抗体の軽鎖可変領域アミノ酸配列は配列番号３の２１～１３１位のアミノ酸残基に示されるものであり、及び／又は前記ＰＤ－１一本鎖抗体の重鎖可変領域アミノ酸配列は配列番号３の１４７～２６６位のアミノ酸残基に示されるものである；好ましくは、前記ＰＤ－１一本鎖抗体のアミノ酸配列は配列番号３の２１～２６６位のアミノ酸残基に示されるものである。
【0038】
一つ又は複数の実施形態において、前記ＣＤ４７リガンドのアミノ酸配列は配列番号５の２１～１３８位のアミノ酸残基に示されるものである。
【0039】
一つ又は複数の実施形態において、前記ＣＤ４０一本鎖抗体の軽鎖可変領域のコード配列は配列番号２の６０～４３８位の塩基配列に示されるものであり、及び／或その重鎖可変領域のコード配列は配列番号２の４８１～８０４位の塩基配列に示されるものである；好ましくは、前記ＣＤ４０一本鎖抗体のコード配列は配列番号２の６０～８０４位のアミノ酸残基に示されるものである。
【0040】
一つ又は複数の実施形態において、前記ＰＤ－１一本鎖抗体の軽鎖可変領域のコード配列は配列番号４の６０～３９３位の塩基配列に示されるものであり、及び／或その重鎖可変領域のコード配列は配列番号４の４３９～７９８位の塩基配列に示されるものである；好ましくは、前記ＰＤ－１一本鎖抗体のコード配列は配列番号２の６０～７９８位のアミノ酸残基に示されるものである。
【0041】
一つ又は複数の実施形態において、前記ＣＤ４７リガンドのコード配列は配列番号６の６０～４１４位の塩基配列に示されるものであってもよい。
【0042】
一つ又は複数の実施形態において、前記抗体はＣＤ４０抗体、ＰＤ－１抗体またはＣＤ４７抗体である。
【0043】
一つ又は複数の実施形態において、前記ＣＤ４０抗体のアミノ酸配列は配列番号１の２１～４９７位に示されるもの、または配列番号１に示されるものであり、前記ＰＤ－１抗体のアミノ酸配列は配列番号３の２１～４９５位に示されるもの、または配列番号３に示されるものであり、前記ＣＤ４７抗体のアミノ酸配列は配列番号５の２１～３６７位に示されるもの、または配列番号５に示されるものである。
【0044】
一つ又は複数の実施形態において、前記抗体のコード配列は配列番号２の６０～１４９１位の塩基配列に示されるもの、または配列番号２に示されるものであり；或いは、配列番号４の６０～１４８５位の塩基配列に示されるもの、または配列番号４に示されるものであり；或いは、配列番号６の６０～１１０４位の塩基配列に示されるもの、または配列番号６に示されるものである。
【0045】
本発明はさらに、本文に記載の抗体のコード配列またはその相補的配列から選ばれる核酸配列を提供する。
【0046】
本発明はさらに、本文に記載の核酸配列を含む核酸構築物を提供する；好ましくは、前記核酸構築物は発現フレームまたはベクターである。
【0047】
一つ又は複数の実施形態において、前記核酸構築物は、発現ベクター、または前記発現フレームを宿主細胞ゲノムに挿入させるための組み込みベクターである。
【0048】
一つ又は複数の実施形態において、前記組み込みベクターは、５’ＬＴＲと３’ＬＴＲの間に、作動可能に連結されるプロモーターと、本文に記載の抗体のコード配列と、ポリアデニル化シグナル配列とを含み、且つトランスポザーゼコード配列を含まない組み込みベクターである。
【0049】
本発明はさらに、本文に記載のベクターと、任意のトランスフェクション試薬とを含む組成物を提供する；好ましくは、前記組成物は、本文に記載の組み込みベクターと、キメラ抗原受容体の発現フレームを宿主細胞ゲノムに挿入させるための組み込みベクターとを含む；好ましくは、前記キメラ抗原受容体は本文のいずれかの実施形態に限定されるものである。
【0050】
一つ又は複数の実施形態において、組成物におけるキメラ抗原受容体の発現フレームを宿主細胞ゲノムに挿入させるための前記組み込みベクターと、本文に記載の抗体の発現フレームを宿主細胞ゲノムに挿入させるための組み込みベクターの質量比は１～７：１～７、例えば１～５：１～５、好ましくは１～３：１～３、より好ましくは１～２：１～２、さらに好ましくは１～２：１である。
【0051】
本発明はさらに、本文に記載のベクターと、任意のトランスフェクション試薬とを含むキットを提供する；好ましくは、前記キットは、本文に記載の抗体の発現フレームを宿主細胞ゲノムに挿入させるための組み込みベクターと、キメラ抗原受容体の発現フレームを宿主細胞ゲノムに挿入させるための組み込みベクターとを含む；好ましくは、前記キメラ抗原受容体は本文のいずれかの実施形態に限定されるものである；
【0052】
一つ又は複数の実施形態において、前記キットは本文に記載の組成物を含む。
【0053】
本発明はさらに、本文に記載のＴ細胞或いは前記Ｔ細胞およびそれが発現する本文に記載の抗体を含む医薬組成物を提供する。
【0054】
本発明はさらに、本文に記載の核酸配列または核酸構築物を含む宿主細胞を提供する。
【0055】
本発明はさらに、本文に記載のＴ細胞、抗体、核酸配列、核酸構築物および宿主細胞の、悪性腫瘍を治療または予防するための薬物の製造における使用を提供する。
【0056】
一つ又は複数の実施形態において、前記悪性腫瘍は、急性Ｂリンパ球性白血病、慢性Ｂリンパ球性白血病、マントル細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫および多発性骨髄腫から選ばれるものであり；或いはメソセリン、少なくとも１つのＥＧＦＲファミリーメンバータンパク質、Ｍｕｃ１抗原、ＥＧＦＲ及び／又はＣＤ４７を癌細胞表面で異常発現する悪性腫瘍であり；或いはＣＤ４０またはＰＤ１によって仲介される悪性腫瘍である。
【0057】
本発明はさらに、下記のベクターで前記Ｔ細胞をトランスフェクトする工程を含むＴ細
胞の製造方法を提供する：
（１）前記キメラ抗原受容体の発現フレームを前記Ｔ細胞のゲノムに導入させるための、トランスポザーゼコード配列を含むベクター、および
（２）前記抗体の発現フレームを前記Ｔ細胞のゲノムに組み込むための、トランスポザーゼコード配列を含まないベクター；
好ましくは、質量で、（１）と（２）に記載のベクターの比率は１～７：１～７、例えば１～５：１～５、好ましくは１～３：１～３、より好ましくは１～２：１～２、さらに好ましくは１～２：１である。
胞の製造方法を提供する：
（１）前記キメラ抗原受容体の発現フレームを前記Ｔ細胞のゲノムに導入させるための、トランスポザーゼコード配列を含むベクター、および
（２）前記抗体の発現フレームを前記Ｔ細胞のゲノムに組み込むための、トランスポザーゼコード配列を含まないベクター；
好ましくは、質量で、（１）と（２）に記載のベクターの比率は１～７：１～７、例えば１～５：１～５、好ましくは１～３：１～３、より好ましくは１～２：１～２、さらに好ましくは１～２：１である。
【図面の簡単な説明】
【0058】
【図1】ＣＤ１９ＣＡＲ－分泌量比較：ＣＤ１９抗原による刺激下で、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＴＮＦ－αおよびＩＦＮ－γサイトカイン分泌の変化。
【図2】ＣＤ１９ＣＡＲ Ｔ細胞およびＣＤ１９ＣＡＲ－αＣＤ４０ Ｔ細胞の増殖アッセイ。
【図3】マウスＲａｊｉ－ｌｕｃ異種移植片モデルに対するＣＤ１９ＣＡＲ Ｔ細胞、ＣＤ１９ＣＡＲ－αＣＤ４０－ｗｔ Ｔ、ＣＤ１９ＣＡＲ－αＣＤ４０ Ｔ細胞の治療効果。
【図4】子宮頸癌細胞Ｈｅｌａ、卵巣癌細胞ＳＫ－ＯＶ－３および胃癌細胞ＨＧＣ－２７に対するｍｅｓｏＣＡＲ－αＣＤ４０ Ｔ細胞の殺傷。
【図5】メソテリン抗原による刺激下で、ｍｅｓｏＣＡＲ－αＣＤ４０のＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＴＮＦ－αおよびＩＦＮ－γサイトカイン分泌の変化。
【図6】ｍｅｓｏＣＡＲ Ｔ細胞およびｍｅｓｏＣＡＲ－αＣＤ４０ Ｔ細胞の増殖アッセイ。
【図7】ＳＫ－ＯＶ－３卵巣癌マウス異種移植片モデルに対するｍｅｓｏＣＡＲ Ｔ細胞およびｍｅｓｏＣＡＲ－αＣＤ４０ Ｔ細胞の治療効果。
【図8】ＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺとＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ－αＣＤ４０ Ｔ細胞の増殖速度の対比。
【図9A】ＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺおよびＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ－αＣＤ４０ Ｔ細胞のＴ細胞の細胞表現型測定・解析；９Ａは老化表現型ＣＤ４０を表し、９Ｂと９Ｃはそれぞれ活性化表現型ＣＤ６９とＣＤ１０７αを表す。
【図9B】ＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺおよびＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ－αＣＤ４０ Ｔ細胞のＴ細胞の細胞表現型測定・解析；９Ｂと９Ｃはそれぞれ活性化表現型ＣＤ１０７αを表す。
【図9C】ＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺおよびＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ－αＣＤ４０ Ｔ細胞のＴ細胞の細胞表現型測定・解析；９Ｂと９Ｃはそれぞれ活性化表現型ＣＤ１０７αを表す。
【図9D】ＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺおよびＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ－αＣＤ４０ Ｔ細胞のＴ細胞の細胞表現型測定・解析；９Ｄはメモリー表現型を表す。
【図10】ヒト肝癌細胞ＨＣＣＬＭ３、ヒト肺変性癌細胞Ｃａｌｕ－６およびヒト非小細胞肺癌Ｈ２３を含むものに対するＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺとＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ－αＣＤ４０ Ｔ細胞の殺傷の対比。
【図11】ＥＧＦＲ抗原による刺激下で、ＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺおよびＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ－αＣＤ４０ Ｔ細胞のＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＴＮＦ－αおよびＩＦＮ－γサイトカイン分泌の変化。
【図12】ＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ Ｔ細胞、ＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ－αＣＤ４０－ｗｔ Ｔ細胞、ＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ－αＣＤ４０ Ｔ細胞、Ｍｏｃｋ－Ｔ細胞およびＰＢＳ空白対照でそれぞれマウスを治療した後の異なる日の腫瘍細胞蛍光値の変化。
【図13】Ｍｕｃ１ＣＡＲ Ｔ細胞とＭｕｃ１ＣＡＲ－αＣＤ４０ Ｔ細胞の増殖速度の対比。
【図14B】Ｍｕｃ１ＣＡＲ Ｔ細胞およびＭｕｃ１ＣＡＲ－αＣＤ４０ Ｔ細胞の細胞表現型測定・解析；１４Ｂはメモリー表現型を表す。
【図15】ヒト肝癌細胞ＨＣＣＬＭ３及びヒト非小細胞肺癌Ｈ２３を含むものに対するＭｕｃ１ＣＡＲ Ｔ細胞とＭｕｃ１ＣＡＲ－αＣＤ４０ Ｔ細胞の殺傷の対比。
【図16】Ｍｕｃ１抗原による刺激下で、Ｍｕｃ１ＣＡＲ Ｔ細胞およびＭｕｃ１ＣＡＲ－αＣＤ４０ Ｔ細胞のＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＴＮＦ－αおよびＩＦＮ－γサイトカイン分泌の変化。
【図17】Ｍｕｃ１ＣＡＲ Ｔ細胞、Ｍｕｃ１ＣＡＲ－αＣＤ４０－ｗｔ Ｔ細胞、Ｍｕｃ１ＣＡＲ－αＣＤ４０ Ｔ細胞、Ｍｏｃｋ－Ｔ細胞およびＰＢＳ空白対照でそれぞれマウスを治療した後の異なる日の腫瘍細胞蛍光値の変化。
【図18】ＣＤ１９ＣＡＲ－ａｎｔｉ ＰＤ１多能性Ｔ細胞の殺傷効果アッセイ。
【図19】ＣＤ１９ＣＡＲ－ａｎｔｉ ＰＤ１多能性Ｔ細胞はインビトロでＴ細胞の殺傷活性を増強できる。
【図20】ＣＤ１９ＣＡＲ－ａｎｔｉ ＰＤ１ Ｔ細胞のインビボ殺傷機能アッセイ。
【図21】子宮頸癌細胞Ｈｅｌａ、卵巣癌細胞ＳＫ－ＯＶ－３および胃癌細胞ＨＧＣ－２７に対するｍｅｓｏＣＡＲ－ａｎｔｉＰＤ１ Ｔ細胞の殺傷。
【図22】メソテリン抗原による刺激下で、ｍｅｓｏＣＡＲ－ａｎｔｉＰＤ１のＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＴＮＦ－αおよびＩＦＮ－γサイトカイン分泌の変化。
【図23】ＳＫ－ＯＶ－３卵巣癌マウス異種移植片モデルに対するｍｅｓｏ３ＣＡＲ Ｔ細胞およびｍｅｓｏＣＡＲ－ａｎｔｉＰＤ１ Ｔ細胞の治療効果。
【図24】ＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺとＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ－ａｎｔｉＰＤ１ Ｔ細胞の増殖速度の対比。
【図25A】ＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺおよびＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ－ａｎｔｉＰＤ１ Ｔ細胞のＴ細胞の細胞表現型測定・解析；２５Ａは老化表現型ＰＤ１を表す。
【図25B】ＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺおよびＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ－ａｎｔｉＰＤ１ Ｔ細胞のＴ細胞の細胞表現型測定・解析；２５Ｂと２５Ｃはそれぞれ活性化表現型ＣＤ６９とＣＤ１０７αを表す。
【図25C】ＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺおよびＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ－ａｎｔｉＰＤ１ Ｔ細胞のＴ細胞の細胞表現型測定・解析；２５Ｂと２５Ｃはそれぞれ活性化表現型ＣＤ６９とＣＤ１０７αを表す。
【図25D】ＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺおよびＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ－ａｎｔｉＰＤ１ Ｔ細胞のＴ細胞の細胞表現型測定・解析；２５Ｄはメモリー表現型を表す。
【図26】ヒト肝癌細胞ＨＣＣＬＭ３、ヒト肝癌細胞Ｈｅｐ３Ｂおよびヒト非小細胞肺癌Ｈ２３を含むものに対するＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺとＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ－ａｎｔｉＰＤ１ Ｔ細胞の殺傷の対比。
【図27】ＥＧＦＲ抗原による刺激下で、ＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺおよびＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ－ａｎｔｉＰＤ１ Ｔ細胞のＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＴＮＦ－αおよびＩＦＮ－γサイトカイン分泌の変化。
【図28】ＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ Ｔ細胞、ＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ－ａｎｔｉＰＤ１－ｗｔ Ｔ細胞、ＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ－ａｎｔｉＰＤ１ Ｔ細胞、Ｍｏｃｋ－Ｔ細胞およびＰＢＳ空白対照でそれぞれマウスを治療した後の異なる日の腫瘍細胞蛍光値の変化。
【図29A】Ｍｕｃ１ＣＡＲ－ａｎｔｉ ＰＤ１多能性Ｔ細胞はインビトロでＴ細胞の殺傷活性を増強できる。２９Ａ：Ｔ細胞の殺傷活性を間接的に反映する標識ＣＤ１０７α、活性化標識ＣＤ２５および除去標識ＬＡＧ３のフローサイトメトリーによる検出；
【図29B】２９Ｂ：Ｔ細胞のメモリー表現型を反映する標識タンパク質ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２ＬおよびＣＣＲ７のフローサイトメトリーによる検出。
【図29C】２９Ｃ：Ｔ細胞ＣＤ３／ＣＤ４／ＣＤ８の比率のフローサイトメトリーによる検出。
【図29D】２９Ｄ：Ｍｕｃ１ＣＡＲ－ａｎｔｉ ＰＤ１多能性Ｔ細胞、Ｍｕｃ１ＣＡＲ－Ｔ細胞およびＭｏｃｋ Ｔ細胞がＭｕｃ１抗原によって刺激された後のＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＴＮＦ－αおよびＩＦＮ－γサイトカインの変化の、複数因子検出キットによる検出。
【図30】Ｍｕｃ１ＣＡＲ－ａｎｔｉ ＰＤ１多能性Ｔ細胞の殺傷効果アッセイ。
【図31】ＰＤ－１抗体を発現するＭｕｃ１ＣＡＲ Ｔ細胞のインビボ機能研究。
【図32】Ｍｏｃｋ Ｔ細胞、ＥＧＦＲ－ＣＡＲ Ｔ細胞およびαＣＤ４７－ＥＧＦＲ－ＣＡＲ Ｔ細胞のＣＤ４７発現のフローサイトメトリーによる検出。
【図33】異なる腫瘍細胞に対するαＣＤ４７－ＥＧＦＲ－ＣＡＲ Ｔ細胞の殺傷。
【図34】αＣＤ４７－ＥＧＦＲ－ＣＡＲ Ｔ細胞上澄を異なる腫瘍細胞と共培養した後、腫瘍細胞表面のＣＤ４７はブロックされる。
【図35】腫瘍細胞表面のＣＤ４７のブロッキングは、それに対するマクロファージの貪食作用を向上させることができる。
【図36】αＣＤ４７－ＥＧＦＲ－ＣＡＲ Ｔ細胞のマウス生体内の抗腫瘍効果。
【図37】Ｍｏｃｋ、Ｍｅｓｏ３ＣＡＲおよびαＣＤ４７－Ｍｅｓｏ３ＣＡＲ Ｔ細胞のＣＤ４７発現のフローサイトメトリーによる検出。
【図38】αＣＤ４７－Ｍｅｓｏ３ＣＡＲ Ｔ細胞の腫瘍細胞株に対する殺傷。
【図39】αＣＤ４７－Ｍｅｓｏ３ＣＡＲ Ｔ細胞上澄を異なる腫瘍細胞と共培養した後、腫瘍細胞表面のＣＤ４７はブロックされる。
【図40】腫瘍細胞表面のＣＤ４７のブロッキングは、それに対するマクロファージの貪食作用を向上させることができる。
【図41】αＣＤ４７－Ｍｅｓｏ３ＣＡＲ Ｔ細胞のインビボでの抗腫瘍効果。
【0059】
なお、図中の縦座標の「カウント（Ｃｏｕｎｔ）」は「細胞数」である。
【発明を実施するための形態】
【0060】
本発明の範囲内であれば、本発明の上記各技術的特徴および以下（例えば実施例）で具体的に開示される各技術的特徴は、互いに組み合わせて、好ましい技術方案を構成してもよいことは理解されるべきである。
【0061】
以下、本発明が関わる一部の用語について解釈する。
【0062】
本発明において、用語の「発現フレーム」とは、一つの遺伝子の発現に必要な全要素を意味し、作動可能に連結されるプロモーターと、遺伝子コード配列とを含む。
用語の「コード配列」は本文において、核酸配列中の、そのタンパク質産物（例えばＣＡＲ、一本鎖抗体、ヒンジ領域および膜貫通領域）を直接に決定するアミノ酸配列の部分と定義される。コード配列の境界は通常、ｍＲＮＡ ５’末端のオープンリーディングフレームの上流に近接するリボソーム結合部位（原核細胞の場合）と、ｍＲＮＡ ３’末端のオープンリーディングフレームの下流に近接する転写ターミネーター配列とで決定される。コード配列は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡおよび組換え核酸配列を含んでもよいが、それらに限定されない。
用語の「Ｆｃ」、即ち抗体の結晶化可能フラグメント（ｆｒａｇｍｅｎｔ ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｂｌｅ、Ｆｃ）とは、、抗体分子「Ｙ」構造の幹部分末端に位置し、抗体重
鎖定常領域ＣＨ２とＣＨ３ドメインのペプチドフラグメントを含み、抗体がエフェクター分子または細胞と相互作用する部位を指す。
用語の「共刺激分子」とは、抗原提示細胞表面に存在し、Ｔｈ細胞における共刺激分子受容体に結合し、共刺激シグナルを産生する分子を指す。リンパ球の増殖には、抗原の結合だけでなく、共刺激分子のシグナルを受信することも必要とされる。共刺激シグナルのＴ細胞への伝達は主に、抗原提示細胞表面に発現される共刺激分子ＣＤ８０、ＣＤ８６と、Ｔ細胞表面のＣＤ２８分子の結合によるものである。Ｂ細胞の共刺激シグナルの受信は、一般的な病原体成分（例えばＬＰＳ）、または補体成分、または活性化された抗原特異的Ｔｈ細胞表面のＣＤ４０Ｌによるものであってもよい。
用語の「リンカー」またはヒンジとは、異なるタンパク質やポリペプチド同士を連結するポリペプチド断片であり、連結されるタンパク質やポリペプチドにそれぞれの立体配座を保持させ、タンパク質やポリペプチドの機能または活性を維持することを目的とする。例示的なリンカーは、Ｇ及び／又はＳを含有するリンカー、及び例えばフーリン２Ａペプチドを含む。
用語の「特異的結合」とは、抗体または抗原結合断片と、対する抗原との間の反応を指す。ある実施形態において、ある抗原と特異的に結合する抗体（またはある抗原に対して特異性を有する抗体）とは、抗体が約１０－５Ｍ未満、例えば約１０－６Ｍ、１０－７Ｍ、１０－８Ｍ、１０－９Ｍまたは１０－１０Ｍ未満、或いはそれ以下の親和力（ＫＤ）で該抗原と結合する。「特異的に認識する」または「を標的とする」とは、類似の意味を有する。
用語の「薬学的に許容される補助剤」とは、薬理学的に及び／又は生理学的に被験者及び活性成分に適合するビヒクル及び／又は賦形剤を指し、それらは本分野で公知されるもので（例えばレミントン薬科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｇｅｎｎ
ａｒｏ ＡＲ編集、第１９版、ペンシルベニア州マック出版社（Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ： Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ）、１９９５を参照）、且つｐＨ調節剤、界面活性剤、アジュバント、イオン強度増強剤を含むが、それらに限定される。例えば、ｐＨ調節剤は、リン酸塩緩衝液を含むが、それらに限定されない；界面活性剤は、陽イオン、陰イオンまたは非イオン系界面活性剤、例えばＴｗｅｅｎ－８０を含むが、それらに限定されない；イオン強度増強剤は、塩化ナトリウムを含むが、それらに限定されない。
用語の「有効量」とは、被験者において本発明に記載の疾患または病症を治療、予防、軽減及び／又は緩和できる投与量を指す。
用語の「疾患及び／又は病症」とは、本発明に記載の疾患及び／又は病症に関わる前記被験者の身体状態を指す。
用語の「被験者」または「患者」とは、患者、或いは本発明に記載の疾患または病症を治療、予防、軽減及び／又は緩和するために本発明にかかる医薬組成物を受ける他の動物、特に例えばヒト、イヌ、サル、ウシ、ウマのような哺乳動物を指してもよい。
用語の「キメラ抗原受容体」（ＣＡＲ）とは、腫瘍細胞表面抗原を認識する特異的な分子（例えば抗体）を免疫細胞（例えばＴ細胞）にアンカーし、免疫細胞が腫瘍抗原またはウイルス抗原を認識して腫瘍細胞またはウイルスに感染された細胞を殺傷できるようにする人工的に改変された受容体である。ＣＡＲは通常、任意に含まれてもよいシグナルペプチドと、腫瘍細胞膜抗原に結合する一本鎖抗体のようなポリペプチドと、ヒンジ領域と、膜貫通領域と、細胞内シグナル領域と、を順次に含む。通常、腫瘍細胞膜抗原に結合するポリペプチドは、中等の親和力で腫瘍細胞に広範に発現される膜抗原に結合できる。腫瘍細胞膜抗原に結合するポリペプチドは、天然ポリペプチドであっても、人工的に合成されるポリペプチドであってもよい；好ましくは、人工的に合成されるポリペプチドは一本鎖抗体またはＦａｂ断片である。
用語の「一本鎖抗体」（ｓｃＦｖ）とは、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ領域）アミノ酸配列と重鎖可変領域（ＶＨ領域）アミノ酸配列とがヒンジを介して連結されてなるもので、抗
原結合能を有する抗体断片を指す。ある実施形態において、目的の一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）は目的の抗体から由来するものである。目的の抗体は、ヒト・マウスキメラ抗体とヒト化抗体を含むヒト抗体であってもよい。抗体は分泌型であっても、膜結合型であってもよい；膜結合型が好ましい。
用語の「作動可能に連結される」または「作動可能に連結する」とは、ＤＮＡ調節配列（例えばエンハンサー、プロモーター等）が、目的のタンパク質のコード配列の発現を可能にするように該コード配列と連結することを指す。
用語の「コード配列」は本文において、核酸配列中の、そのタンパク質産物（例えばＣＡＲ、一本鎖抗体、ヒンジ領域および膜貫通領域）を直接に決定するアミノ酸配列の部分と定義される。コード配列の境界は通常、ｍＲＮＡ ５’末端のオープンリーディングフレームの上流に近接するリボソーム結合部位（原核細胞の場合）と、ｍＲＮＡ ３’末端のオープンリーディングフレームの下流に近接する転写ターミネーター配列とで決定される。コード配列は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡおよび組換え核酸配列を含んでもよいが、それらに限定されない。
用語の「Ｆｃ」、即ち抗体の結晶化可能フラグメント（ｆｒａｇｍｅｎｔ ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｂｌｅ、Ｆｃ）とは、、抗体分子「Ｙ」構造の幹部分末端に位置し、抗体重
鎖定常領域ＣＨ２とＣＨ３ドメインのペプチドフラグメントを含み、抗体がエフェクター分子または細胞と相互作用する部位を指す。
用語の「共刺激分子」とは、抗原提示細胞表面に存在し、Ｔｈ細胞における共刺激分子受容体に結合し、共刺激シグナルを産生する分子を指す。リンパ球の増殖には、抗原の結合だけでなく、共刺激分子のシグナルを受信することも必要とされる。共刺激シグナルのＴ細胞への伝達は主に、抗原提示細胞表面に発現される共刺激分子ＣＤ８０、ＣＤ８６と、Ｔ細胞表面のＣＤ２８分子の結合によるものである。Ｂ細胞の共刺激シグナルの受信は、一般的な病原体成分（例えばＬＰＳ）、または補体成分、または活性化された抗原特異的Ｔｈ細胞表面のＣＤ４０Ｌによるものであってもよい。
用語の「リンカー」またはヒンジとは、異なるタンパク質やポリペプチド同士を連結するポリペプチド断片であり、連結されるタンパク質やポリペプチドにそれぞれの立体配座を保持させ、タンパク質やポリペプチドの機能または活性を維持することを目的とする。例示的なリンカーは、Ｇ及び／又はＳを含有するリンカー、及び例えばフーリン２Ａペプチドを含む。
用語の「特異的結合」とは、抗体または抗原結合断片と、対する抗原との間の反応を指す。ある実施形態において、ある抗原と特異的に結合する抗体（またはある抗原に対して特異性を有する抗体）とは、抗体が約１０－５Ｍ未満、例えば約１０－６Ｍ、１０－７Ｍ、１０－８Ｍ、１０－９Ｍまたは１０－１０Ｍ未満、或いはそれ以下の親和力（ＫＤ）で該抗原と結合する。「特異的に認識する」または「を標的とする」とは、類似の意味を有する。
用語の「薬学的に許容される補助剤」とは、薬理学的に及び／又は生理学的に被験者及び活性成分に適合するビヒクル及び／又は賦形剤を指し、それらは本分野で公知されるもので（例えばレミントン薬科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｇｅｎｎ
ａｒｏ ＡＲ編集、第１９版、ペンシルベニア州マック出版社（Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ： Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ）、１９９５を参照）、且つｐＨ調節剤、界面活性剤、アジュバント、イオン強度増強剤を含むが、それらに限定される。例えば、ｐＨ調節剤は、リン酸塩緩衝液を含むが、それらに限定されない；界面活性剤は、陽イオン、陰イオンまたは非イオン系界面活性剤、例えばＴｗｅｅｎ－８０を含むが、それらに限定されない；イオン強度増強剤は、塩化ナトリウムを含むが、それらに限定されない。
用語の「有効量」とは、被験者において本発明に記載の疾患または病症を治療、予防、軽減及び／又は緩和できる投与量を指す。
用語の「疾患及び／又は病症」とは、本発明に記載の疾患及び／又は病症に関わる前記被験者の身体状態を指す。
用語の「被験者」または「患者」とは、患者、或いは本発明に記載の疾患または病症を治療、予防、軽減及び／又は緩和するために本発明にかかる医薬組成物を受ける他の動物、特に例えばヒト、イヌ、サル、ウシ、ウマのような哺乳動物を指してもよい。
用語の「キメラ抗原受容体」（ＣＡＲ）とは、腫瘍細胞表面抗原を認識する特異的な分子（例えば抗体）を免疫細胞（例えばＴ細胞）にアンカーし、免疫細胞が腫瘍抗原またはウイルス抗原を認識して腫瘍細胞またはウイルスに感染された細胞を殺傷できるようにする人工的に改変された受容体である。ＣＡＲは通常、任意に含まれてもよいシグナルペプチドと、腫瘍細胞膜抗原に結合する一本鎖抗体のようなポリペプチドと、ヒンジ領域と、膜貫通領域と、細胞内シグナル領域と、を順次に含む。通常、腫瘍細胞膜抗原に結合するポリペプチドは、中等の親和力で腫瘍細胞に広範に発現される膜抗原に結合できる。腫瘍細胞膜抗原に結合するポリペプチドは、天然ポリペプチドであっても、人工的に合成されるポリペプチドであってもよい；好ましくは、人工的に合成されるポリペプチドは一本鎖抗体またはＦａｂ断片である。
用語の「一本鎖抗体」（ｓｃＦｖ）とは、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ領域）アミノ酸配列と重鎖可変領域（ＶＨ領域）アミノ酸配列とがヒンジを介して連結されてなるもので、抗
原結合能を有する抗体断片を指す。ある実施形態において、目的の一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）は目的の抗体から由来するものである。目的の抗体は、ヒト・マウスキメラ抗体とヒト化抗体を含むヒト抗体であってもよい。抗体は分泌型であっても、膜結合型であってもよい；膜結合型が好ましい。
用語の「作動可能に連結される」または「作動可能に連結する」とは、ＤＮＡ調節配列（例えばエンハンサー、プロモーター等）が、目的のタンパク質のコード配列の発現を可能にするように該コード配列と連結することを指す。
【0063】
１、突然変異型Ｆｃフラグメント
研究によって示されたように、ＰＤ－１アンタゴニスト抗体やＣＤ４０アゴニスト抗体などのＩｇＧ４ Ｆｃフラグメントは、単球／マクロファージによって容易に認識され貪食されるが、本発明は、該ＩｇＧ４ Ｆｃフラグメントについて塩基突然変異改変を行うことで、Ｔ細胞自身で発現する抗体はＡＤＣＣ応答を引き起こすことなく良好に機能できるようになる。
具体的には、本発明の例示的なＩｇＧ４ Ｆｃフラグメントは、配列番号１の２６９～４９７位のアミノ酸残基に示される配列を有するもので、ただし、野生型のＩｇＧ４ Ｆｃフラグメント（配列番号２５）に比べて、本発明のＩｇＧ４ Ｆｃフラグメントは１７位でＬからＥへの突然変異が生じ、７９位でＮからＱへの突然変異が生じた。
研究によって示されたように、ＰＤ－１アンタゴニスト抗体やＣＤ４０アゴニスト抗体などのＩｇＧ４ Ｆｃフラグメントは、単球／マクロファージによって容易に認識され貪食されるが、本発明は、該ＩｇＧ４ Ｆｃフラグメントについて塩基突然変異改変を行うことで、Ｔ細胞自身で発現する抗体はＡＤＣＣ応答を引き起こすことなく良好に機能できるようになる。
具体的には、本発明の例示的なＩｇＧ４ Ｆｃフラグメントは、配列番号１の２６９～４９７位のアミノ酸残基に示される配列を有するもので、ただし、野生型のＩｇＧ４ Ｆｃフラグメント（配列番号２５）に比べて、本発明のＩｇＧ４ Ｆｃフラグメントは１７位でＬからＥへの突然変異が生じ、７９位でＮからＱへの突然変異が生じた。
【0064】
本発明は、他の抗体または免疫グロブリン種類から由来し、ＩｇＧ４ Ｆｃ（配列番号２５）の１７位に相応する位置でのアミノ酸残基がＥへ突然変異し、且つ７９位に相応する位置でのアミノ酸残基がＱへ突然変異したＦｃフラグメントも含む。前記抗体または免疫グロブリン（Ｉｇ）種類は、本分野で周知されるＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥを含むが、それらに限定されず、ただし、前記ＩｇＧはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含み；ＩｇＡはＩｇＡ１およびｌｇＡ２を含む。よって、ある実施形態において、本発明は、配列番号２５に示されるＩｇＧ４ Ｆｃフラグメントの１７位に相応する位置でのアミノ酸残基がＥであり、７９位に相応する位置でのアミノ酸残基がＱである突然変異型抗体Ｆｃフラグメントを適用する。ある実施形態において、本発明は膜結合型Ｉｇの突然変異Ｆｃフラグメントを適用する。
【0065】
ある実施形態において、本発明は配列番号１の２６９～４９７位のアミノ酸残基に示されるＦｃフラグメントを適用し、その例示的なコード配列は配列番号２の８０５～１４９１位の塩基配列に示される。
【0066】
２、抗原結合配列
本文において、用語の「抗原結合配列」は、抗原と特異的に結合できる抗体またはその抗原結合断片、例えば一本鎖抗体も含むが、腫瘍微小環境で機能するタンパク質のリガンドまたは該タンパク質に結合するその断片も含む。
本文において、用語の「抗原結合配列」は、抗原と特異的に結合できる抗体またはその抗原結合断片、例えば一本鎖抗体も含むが、腫瘍微小環境で機能するタンパク質のリガンドまたは該タンパク質に結合するその断片も含む。
【0067】
本発明に適用されるＣＡＲ－Ｔ細胞が発現する抗体は、腫瘍治療に用いられる各種の抗体であってもよく、アゴニスト抗体とアンタゴニスト抗体を含む。
【0068】
本発明に適用されるアゴニスト抗体は、本分野で周知される各種のアゴニスト抗体であってもよく、下記抗原に対する抗体を含むが、それらに限定されない：ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ１３４、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＩＣＯＳ、ＨＶＥＭ、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＧＩＴＲ、ＬＩＧＨＴ、ＤＲ３、ＳＬＡＭ、ＣＤ２２６、ＣＤ８０およびＣＤ８６。ある実施形態において、本発明に適用されるアゴニスト抗体はＣＤ４０の抗体である。好ましくは、前記ＣＤ４０抗体は一本鎖抗体である。例示的なＣＤ４０一本鎖抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ領域）アミノ酸配列は配列番号１の２１～１４６位のアミノ酸残基に示されるものであり、その例示的なコード配列は配列番号２の６０～４３８位の塩基配列に
示されるものである；例示的なＣＤ４０一本鎖抗体の重鎖可変領域（ＶＨ領域）アミノ酸配列は配列番号１の１６１～２６８位のアミノ酸残基に示されるものであり、その例示的なコード配列は配列番号２の４８１～８０４位の塩基配列に示されるものである。前記軽鎖可変領域と重鎖可変領域はＧＳを含有するヒンジ領域によって連結されてもよく、例示的なヒンジ領域の配列は、配列番号１の１４７～１６０位のアミノ酸残基に示されるものである。ある実施形態において、本発明に適用されるＣＤ４０一本鎖抗体のアミノ酸配列は配列番号１の２１～２６８位のアミノ酸残基に示されるものであり、その例示的なコード配列は配列番号２の６０～８０４位のアミノ酸残基に示されるものである。
示されるものである；例示的なＣＤ４０一本鎖抗体の重鎖可変領域（ＶＨ領域）アミノ酸配列は配列番号１の１６１～２６８位のアミノ酸残基に示されるものであり、その例示的なコード配列は配列番号２の４８１～８０４位の塩基配列に示されるものである。前記軽鎖可変領域と重鎖可変領域はＧＳを含有するヒンジ領域によって連結されてもよく、例示的なヒンジ領域の配列は、配列番号１の１４７～１６０位のアミノ酸残基に示されるものである。ある実施形態において、本発明に適用されるＣＤ４０一本鎖抗体のアミノ酸配列は配列番号１の２１～２６８位のアミノ酸残基に示されるものであり、その例示的なコード配列は配列番号２の６０～８０４位のアミノ酸残基に示されるものである。
【0069】
本発明に適用されるアンタゴニスト抗体は、本分野で周知される各種の免疫チェックポイントアンタゴニスト抗体、例えば下記抗原に対する抗体を含むが、それらに限定されない：ＰＤ－１、ＣＴＬＡ４、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＰＤＬ３、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＣＤ４７、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１６０、ＬＡＩＲ１、Ｂ７－Ｈ１、Ｂ７－１、ＶＳＩＲおよびＣＤ２４４。ある実施形態において、本発明に適用されるアンタゴニスト抗体はＰＤ－１またはＣＤ４７の抗体である。ある実施形態において、前記ＰＤ－１抗体は一本鎖抗体である。例示的なＰＤ－１一本鎖抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ領域）アミノ酸配列は配列番号３の２１～１３１位のアミノ酸残基に示されるものであり、その例示的なコード配列は配列番号４の６０～３９３位の塩基配列に示されるものである；例示的なＰＤ－１一本鎖抗体の重鎖可変領域（ＶＨ領域）アミノ酸配列は配列番号３の１４７～２６６位のアミノ酸残基に示されるものであり、その例示的なコード配列は配列番号４の４３９～７９８位の塩基配列に示されるものである。前記軽鎖可変領域と重鎖可変領域はＧＳを含有するヒンジ領域によって連結されてもよく、例示的なヒンジ領域の配列は、配列番号３の１３２～１４６位のアミノ酸残基に示されるものである。ある実施形態において、本発明に適用されるＰＤ－１一本鎖抗体のアミノ酸配列は配列番号３の２１～２６６位のアミノ酸残基に示されるものであり、その例示的なコード配列は配列番号４の６０～７９８位のアミノ酸残基に示されるものである。
【0070】
ある実施形態において、本文に適用される抗原結合配列は、腫瘍微小環境で機能する（例えば腫瘍細胞の成長と移動、貪食逃避等に関連する）タンパク質のリガンド、特に癌細胞表面に発現されるＣＤ４７のようなタンパク質のリガンドである。ある実施形態において、本発明に適用されるＣＤ４７リガンドのアミノ酸配列は配列番号５の２１～１３８位のアミノ酸残基に示されるものであり、その例示的なコード配列は配列番号６の６０～４１４位の塩基配列に示されるものである。
【0071】
３、ＣＡＲ－Ｔ細胞が発現する抗体
本発明において、ＣＡＲ－Ｔ細胞によって発現される抗体は通常、本文に記載の抗原結合配列および前記突然変異型Ｆｃフラグメントを含む。両者は直接に連結してもよく、或いは適切なリンカーを介して互いに結合しても良い。
本発明において、ＣＡＲ－Ｔ細胞によって発現される抗体は通常、本文に記載の抗原結合配列および前記突然変異型Ｆｃフラグメントを含む。両者は直接に連結してもよく、或いは適切なリンカーを介して互いに結合しても良い。
【0072】
ある実施形態において、本発明の抗体は、任意に含まれてもよいシグナルペプチドと、アゴニスト抗体またはアンタゴニスト抗体と、および本文に記載の突然変異型Ｆｃフラグメントとを含む。例えば、本発明の抗体は、任意に含まれてもよいシグナルペプチドと、下記抗原に対する抗体から選ばれるものと、および本文に記載の突然変異型Ｆｃフラグメントとを含む：ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ１３４、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＩＣＯＳ、ＨＶＥＭ、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＧＩＴＲ、ＬＩＧＨＴ、ＤＲ３、ＳＬＡＭ、ＣＤ２２６、ＣＤ８０およびＣＤ８６。或いは、本発明の抗体は、任意に含まれてもよいシグナルペプチドと、下記抗原に対する抗体から選ばれるものと、および本文に記載の突然変異型Ｆｃフラグメントとを含む：ＰＤ－１、ＣＴＬＡ４、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＰＤＬ３、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＣＤ４７、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１６０、ＬＡＩＲ１、Ｂ７－Ｈ１、Ｂ７－１、ＶＳＩＲおよびＣＤ２４４。好ましくは、前記抗原結合配列は、
前記抗原に対する抗体の軽鎖可変領域と重鎖可変領域からなる一本鎖抗体であり、または癌細胞表面に発現されるタンパク質のリガンドである。
前記抗原に対する抗体の軽鎖可変領域と重鎖可変領域からなる一本鎖抗体であり、または癌細胞表面に発現されるタンパク質のリガンドである。
【0073】
ある実施形態において、前記抗体はさらにシグナルペプチド配列を含む。シグナルペプチドは、新たに合成されたタンパク質の分泌経路への輸送を誘導する短いペプチド鎖（長さが５～３０個のアミノ酸）であり、一般的には、新たに合成されたポリペプチド鎖においてタンパク質の膜貫通輸送（位置決め）を指導するためのＮ－末端のアミノ酸配列（Ｎ末端に存在しない場合もある）を指し、タンパク質を細胞における異なる膜構造を含有する細胞内小器官内へ誘導する役割を担う。シグナルペプチドは、分泌型シグナルペプチドであっても、膜結合型シグナルペプチドであってもよい。
【0074】
適切なシグナルペプチドは何でも本発明に適用できる。ある実施形態において、シグナルペプチドはＣＤ８シグナルペプチド、ＣＤ２８シグナルペプチド、ＣＤ４シグナルペプチドまたは軽鎖シグナルペプチドであってもよい。ある実施形態において、本発明の抗体におけるシグナルペプチドは軽鎖シグナルペプチドであり、その例示的なアミノ酸配列は配列番号１の１～２０位のアミノ酸残基に示されるものであり、例示的なコード配列は配列番号２の１～６０位の塩基配列に示されるものである。ある実施形態において、本発明の抗体におけるシグナルペプチドはＣＤ８シグナルペプチドであり、その例示的なアミノ酸配列は配列番号７の１～２１位のアミノ酸残基に示されるものであり、その例示的なコード配列は配列番号８の１～６３位の塩基配列に示されるものである；或いは、配列番号９の１～２２位のアミノ酸残基に示されるものであり、その例示的なコード配列は配列番号１０の１～６６位の塩基配列に示されるものである。
【0075】
ある実施形態において、本発明の抗体は、任意に含まれてもよいシグナルペプチドと、ＣＤ４０一本鎖抗体と、本文に記載の突然変異型Ｆｃフラグメントとを含むＣＤ４０抗体である；好ましくは、前記シグナルペプチドは軽鎖シグナルペプチドである；好ましくは、前記ＣＤ４０一本鎖抗体のアミノ酸配列は配列番号１の２１～１４６位のアミノ酸残基に示されるものであり、その例示的なコード配列は配列番号２の６０～４３８位の塩基配列に示されるものである；好ましくは、前記ＣＤ４０一本鎖抗体の重鎖可変領域（ＶＨ領域）アミノ酸配列は配列番号１の１６１～２６８位のアミノ酸残基に示されるものであり、その例示的なコード配列は配列番号２の４８１～８０４位の塩基配列に示されるものである。ある実施形態において、前記ＣＤ４０一本鎖抗体のアミノ酸配列は配列番号１の２１～２６８位のアミノ酸残基に示されるものであり、その例示的なコード配列は配列番号２の６０～８０４位のアミノ酸残基に示されるものである。ある実施形態において、前記突然変異型Ｆｃフラグメントのアミノ酸配列は配列番号１の２６９～４９７位のアミノ酸残基に示されるものであり、その例示的なコード配列は配列番号２の８０５～１４９１位の塩基配列に示されるものである。ある実施形態において、本発明のＣＤ４０抗体のアミノ酸配列は、配列番号１の２１～４９７位に示されるもの、または配列番号１に示されるものであり、その例示的なコード配列は、配列番号２の６０～１４９１位の塩基配列に示されるもの、または配列番号２に示されるものである。
【0076】
ある実施形態において、本発明の抗体は、任意に含まれてもよいシグナルペプチドと、ＰＤ－１一本鎖抗体と、本文に記載の突然変異型Ｆｃフラグメントとを含むＰＤ－１抗体である；好ましくは、前記シグナルペプチドは軽鎖シグナルペプチドである；好ましくは、前記ＰＤ－１一本鎖抗体のアミノ酸配列は配列番号３の２１～１３１位のアミノ酸残基に示されるものであり、その例示的なコード配列は配列番号４の６０～３９３位の塩基配列に示されるものである；好ましくは、前記ＰＤ－１一本鎖抗体の重鎖可変領域（ＶＨ領域）アミノ酸配列は配列番号３の１４７～２６６位のアミノ酸残基に示されるものであり、その例示的なコード配列は配列番号４の４３９～７９８位の塩基配列に示されるものである。ある実施形態において、前記ＰＤ－１一本鎖抗体のアミノ酸配列は配列番号３の２
１～２６６位のアミノ酸残基に示されるものであり、その例示的なコード配列は配列番号４の６０～７９８位のアミノ酸残基に示されるものである。ある実施形態において、前記突然変異型Ｆｃフラグメントのアミノ酸配列は配列番号３の２６７～４９５位のアミノ酸残基に示されるものであり、その例示的なコード配列は配列番号２の７９９～１４８５位の塩基配列に示されるものである。ある実施形態において、本発明のＰＤ－１抗体のアミノ酸配列は、配列番号３の２１～４９５位に示されるもの、または配列番号３に示されるものであり、その例示的なコード配列は、配列番号４の６０～１４８５位の塩基配列に示されるもの、または配列番号４に示されるものである。
１～２６６位のアミノ酸残基に示されるものであり、その例示的なコード配列は配列番号４の６０～７９８位のアミノ酸残基に示されるものである。ある実施形態において、前記突然変異型Ｆｃフラグメントのアミノ酸配列は配列番号３の２６７～４９５位のアミノ酸残基に示されるものであり、その例示的なコード配列は配列番号２の７９９～１４８５位の塩基配列に示されるものである。ある実施形態において、本発明のＰＤ－１抗体のアミノ酸配列は、配列番号３の２１～４９５位に示されるもの、または配列番号３に示されるものであり、その例示的なコード配列は、配列番号４の６０～１４８５位の塩基配列に示されるもの、または配列番号４に示されるものである。
【0077】
ある実施形態において、本発明の抗体は、任意に含まれてもよいシグナルペプチドと、ＣＤ４７のリガンド配列と、本文に記載の突然変異型Ｆｃフラグメントとを含むＣＤ４７抗体である；好ましくは、シグナルペプチドは軽鎖シグナルペプチドである；好ましくは、前記リガンドのアミノ酸配列はアミノ酸配列の配列番号５の２１～１３８位のアミノ酸残基に示されるものであり、その例示的なコード配列は配列番号６の６０～４１４位の塩基配列に示されるものである。ある実施形態において、前記突然変異型Ｆｃフラグメントのアミノ酸配列は配列番号５の１３９～３６７位のアミノ酸残基に示されるものであり、その例示的なコード配列は配列番号６の４１５～１１０１位の塩基配列に示されるものである。ある実施形態において、本発明のＣＤ４７抗体のアミノ酸配列は、配列番号５の２１～３６７位に示されるもの、または配列番号５に示されるものであり、その例示的なコード配列は、配列番号６の６０～１１０４位の塩基配列に示されるもの、または配列番号６に示されるものである。
【0078】
４、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
本発明は、Ｔ細胞で発現できる任意のキメラ抗原受容体に関し、下記抗原の１種または多種に対する、標的とする、または特異的に結合するキメラ抗原受容体を含むが、それらに限定されない：ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＥＡ、ＧＤ２（Ｂ４ＧＡＬＮＴ１、β１，４－アセチル－アミノガラクトシルトランスフェラーゼ１とも呼ばれる）、ＦＲ（フラビンレダクターゼ）、ＰＳＭＡ（前立腺特異的膜抗原）、ＰＭＥＬ（プレメラノソームタンパク質）、ＣＡ９（炭酸脱水酵素ＩＸ）、ＣＤ１７１／Ｌ１－ＣＡＭ、ＩＬ－１３Ｒα２、ＭＡＲＴ－１（ムチン－Ａとも呼ばれる）、ＥＲＢＢ２、ＮＹ－ＥＳＯ－１（ＣＴＡＧ１Ｂ、癌／精巣抗原１Ｂとも呼ばれる）、ＭＡＧＥ（黒色腫関連抗原Ｅ１）ファミリータンパク質、ＢＡＧＥ（Ｂ黒色腫抗原ファミリー）ファミリータンパク質、ＧＡＧＥ（成長ホルモン放出因子）ファミリータンパク質、ＡＦＰ（α－フェトプロテイン）、ＭＵＣ１（ムチン１、細胞表面関連）、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＩＬ－１１Ｒα、ＥＧＰ－２、ＥＧＰ－４０、ＦＢＰ、ＧＤ３（ＳＴ８ＳＩＡ１、ＳＴ８α－Ｎ－アセチル－セラミドα－２、８－シアル酸転移酵素１とも呼ばれる）、ＰＳＣＡ（前立腺幹細胞抗原）、ＦＳＡ（ＫＩＡＡ１１０９とも呼ばれる）、ＰＳＡ（ＫＬＫ３、カリクレイン関連ペプチダーゼ３とも呼ばれる）、ＨＭＧＡ２、胎児型アセチルコリン受容体、ＬｅＹ（ＦＵＴ３とも呼ばれる）、ＥｐＣＡＭ、ＭＳＬＮ（メソセリン）、ＩＧＦＲ１、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＲＢＢ３、ＥＲＢＢ４、ＣＡ１２５（ＭＵＣ１６、ムチン１６とも呼ばれる、細胞表面関連）、ＣＡ１５－３、ＣＡ１９－９、ＣＡ７２－４、ＣＡ２４２、ＣＡ５０、ＣＹＦＲＡ２１－１、ＳＣＣ（ＳＥＲＰＩＮＢ３とも呼ばれる）、ＡＦＵ（ＦＵＣＡ１とも呼ばれる）、ＥＢＶ－ＶＣＡ、ＰＯＡ（ＶＤＲ、ビタミンＤ（１，２５－ジヒドロビタミンＤ３）受容体とも呼ばれる）、β２－ＭＧ（β－２－ミクログロブリン）およびＰＲＯＧＲＰ（ＧＲＰガストリン放出ペプチド）。
本発明は、Ｔ細胞で発現できる任意のキメラ抗原受容体に関し、下記抗原の１種または多種に対する、標的とする、または特異的に結合するキメラ抗原受容体を含むが、それらに限定されない：ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＥＡ、ＧＤ２（Ｂ４ＧＡＬＮＴ１、β１，４－アセチル－アミノガラクトシルトランスフェラーゼ１とも呼ばれる）、ＦＲ（フラビンレダクターゼ）、ＰＳＭＡ（前立腺特異的膜抗原）、ＰＭＥＬ（プレメラノソームタンパク質）、ＣＡ９（炭酸脱水酵素ＩＸ）、ＣＤ１７１／Ｌ１－ＣＡＭ、ＩＬ－１３Ｒα２、ＭＡＲＴ－１（ムチン－Ａとも呼ばれる）、ＥＲＢＢ２、ＮＹ－ＥＳＯ－１（ＣＴＡＧ１Ｂ、癌／精巣抗原１Ｂとも呼ばれる）、ＭＡＧＥ（黒色腫関連抗原Ｅ１）ファミリータンパク質、ＢＡＧＥ（Ｂ黒色腫抗原ファミリー）ファミリータンパク質、ＧＡＧＥ（成長ホルモン放出因子）ファミリータンパク質、ＡＦＰ（α－フェトプロテイン）、ＭＵＣ１（ムチン１、細胞表面関連）、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＩＬ－１１Ｒα、ＥＧＰ－２、ＥＧＰ－４０、ＦＢＰ、ＧＤ３（ＳＴ８ＳＩＡ１、ＳＴ８α－Ｎ－アセチル－セラミドα－２、８－シアル酸転移酵素１とも呼ばれる）、ＰＳＣＡ（前立腺幹細胞抗原）、ＦＳＡ（ＫＩＡＡ１１０９とも呼ばれる）、ＰＳＡ（ＫＬＫ３、カリクレイン関連ペプチダーゼ３とも呼ばれる）、ＨＭＧＡ２、胎児型アセチルコリン受容体、ＬｅＹ（ＦＵＴ３とも呼ばれる）、ＥｐＣＡＭ、ＭＳＬＮ（メソセリン）、ＩＧＦＲ１、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＲＢＢ３、ＥＲＢＢ４、ＣＡ１２５（ＭＵＣ１６、ムチン１６とも呼ばれる、細胞表面関連）、ＣＡ１５－３、ＣＡ１９－９、ＣＡ７２－４、ＣＡ２４２、ＣＡ５０、ＣＹＦＲＡ２１－１、ＳＣＣ（ＳＥＲＰＩＮＢ３とも呼ばれる）、ＡＦＵ（ＦＵＣＡ１とも呼ばれる）、ＥＢＶ－ＶＣＡ、ＰＯＡ（ＶＤＲ、ビタミンＤ（１，２５－ジヒドロビタミンＤ３）受容体とも呼ばれる）、β２－ＭＧ（β－２－ミクログロブリン）およびＰＲＯＧＲＰ（ＧＲＰガストリン放出ペプチド）。
【0079】
本発明のキメラ抗原受容体は通常、任意に含まれてもよいシグナルペプチド配列と、抗原認識領域と、ヒンジ領域と、膜貫通領域と、細胞内共刺激シグナル領域と、細胞内シグナル領域とを含む。
【0080】
本発明に適用されるキメラ抗原受容体におけるシグナルペプチドは、以上に説明されたように、分泌型シグナルペプチドであっても、膜結合型シグナルペプチドであってもよく、ＣＤ８シグナルペプチド、ＣＤ２８シグナルペプチド、ＣＤ４シグナルペプチドおよび軽鎖シグナルペプチドを含むが、それらに限定されない。ある実施形態において、本発明のキメラ抗原受容体におけるシグナルペプチドは軽鎖シグナルペプチドであり、その例示的なアミノ酸配列は配列番号１１の１～２０位のアミノ酸残基に示されるものであり、例示的なコード配列は配列番号１２の１～６０位の塩基配列に示されるものである。ある実施形態において、本発明の抗体におけるシグナルペプチドはＣＤ８シグナルペプチドであり、その例示的なアミノ酸配列は配列番号７の１～２１位のアミノ酸残基に示されるものであり、その例示的なコード配列は配列番号８の１～６３位の塩基配列に示されるものである；或いは、配列番号９の１～２２位のアミノ酸残基に示されるものであり、その例示的なコード配列は配列番号１０の１～６６位の塩基配列に示されるものである。
【0081】
抗原認識領域は一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）であってもよい。一本鎖抗体は、本分野で常用の標的抗原を認識するｓｃＦｖであってもよく、以上に記載の抗原の１種または多種を認識する、標的とする、または特異的に結合する抗体の軽鎖可変領域と重鎖可変領域からなるｓｃＦｖを含むが、それらに限定されない。ある実施形態において、本発明の標的抗原を認識するアミノ酸配列は、ＣＤ１９、メソテリン、ＥＧＦＲまたはムチンを認識する、標的とする、または特異的に結合する一本鎖抗体である。ある実施形態において、本発明の抗原認識領域は、ＥｒｂＢ受容体ファミリーを標的とするアミノ酸配列からなるものである。
【0082】
例えば、ＣＤ１９を認識する一本鎖抗体の軽鎖可変領域の例示的なアミノ酸配列は配列番号７の２２～１２８位のアミノ酸残基に示されるものであり、その例示的なコード配列は配列番号８の６４～３８４位の塩基配列に示されるものである。ＣＤ１９を認識する一本鎖抗体の重鎖可変領域の例示的なアミノ酸配列は配列番号７の１４４～２６３位のアミノ酸残基に示されるものであり、その例示的なコード配列は配列番号８の４３０～７８９位の塩基配列に示されるものである。ある実施形態において、ＣＤ１９を認識する一本鎖抗体の例示的なアミノ酸配列は配列番号７の２２～２６３位のアミノ酸残基に示されるものであり、その例示的なコード配列は配列番号８の６４～７８９位の塩基配列に示されるものである。
【0083】
メソテリン抗原を認識する例示的なｓｃＦｖは、本分野で周知されるメソテリン抗原に対する一本鎖抗体であってもよい。好ましくは、該一本鎖抗体の軽鎖可変領域アミノ酸配列と重鎖可変領域アミノ酸配列は、メソテリンの膜近傍末端のアミノ酸配列に対する抗体から由来するものである。好ましくは、本文に記載の抗メソテリン一本鎖抗体は、メソテリンの領域ＩまたはＩＩＩに対する一本鎖抗体である。好ましくは、該一本鎖抗体の軽鎖可変領域アミノ酸配列と重鎖可変領域アミノ酸配列は、メソテリンの領域ＩまたはＩＩＩのアミノ酸配列に対する抗体から由来するものである。ある実施形態において、メソテリン領域Ｉのアミノ酸配列は配列番号２１に示されるものであり；メソテリン領域ＩＩＩのアミノ酸配列は配列番号２２に示されるものである。抗メソテリン領域Ｉ一本鎖抗体の例示的なアミノ酸配列は配列番号２３に示されるものである。抗メソテリン領域ＩＩＩ一本鎖抗体の軽鎖可変領域の例示的なアミノ酸配列は配列番号９の２３～１４６位のアミノ酸残基に示されるものであり、その例示的なコード配列は配列番号１０の６７～４３８位のヌクレオチド配列に示されるものである；抗メソテリン領域ＩＩＩ一本鎖抗体の重鎖可変領域の例示的なアミノ酸配列は配列番号９の１６２～２７２位のアミノ酸残基に示されるものであり、その例示的なコード配列は配列番号１０の４８４～８１６位のヌクレオチド配列に示されるものである。ある実施形態において、本発明に記載のメソテリン抗原を認識するｓｃＦｖのアミノ酸配列は配列番号９の２３～２７２位のアミノ酸残基に示される
ものであり、その例示的なコード配列は配列番号１０の６７～８１６位の塩基配列に示されるものである。本文において、特に断らない限り、メソテリンとは、膜にアンカーしているメソテリン断片を指す。
ものであり、その例示的なコード配列は配列番号１０の６７～８１６位の塩基配列に示されるものである。本文において、特に断らない限り、メソテリンとは、膜にアンカーしているメソテリン断片を指す。
【0084】
本発明において、例示的なＥｒｂＢ受容体ファミリーを標的とする抗原認識領域は、天然のＴ１Ｅとヘリンの融合タンパク質を含む。本文において、Ｔ１Ｅは、ヒトトランスフォーミング成長因子α（ＴＧＦα）Ｎ末端の７個のアミノ酸と、上皮成長因子（ＥＧＦ）Ｃ末端の４８個のアミノ酸からなるキメラポリペプチドである。好ましくは、Ｔ１Ｅのアミノ酸配列は配列番号１３の２３～７７位のアミノ酸残基に示されるものであり、その例示的なコード配列は配列番号１４の６７～２３１位の塩基配列に示されるものである。本文において、ヘリンとは、ハースタチンの８番目のイントロンによってコードされる７９個のアミノ酸を指す。好ましくは、そのアミノ酸配列は配列番号１３の９３～１７１位のアミノ酸残基に示されるものである。本発明は、ヘリンアミノ酸をコードするコドンを最適化する。よって、本発明にとって好ましいヘリンのヌクレオチド配列は、配列番号１４の２７７～５１３位の塩基配列に示されるものである。通常、Ｔ１Ｅとヘリンは剛直リンカー配列を介して連結できる。剛直リンカー配列の例示的な一例は、ＥＡＡＡＫを単位とする２つまたは複数の反復配列であり、本文ではＥＡＡＡＫリンカーとも呼ばれる。例示的な剛直リンカー配列は配列番号１３の７８～９２位のアミノ酸残基に示されるものであり、その例示的なコード配列は配列番号１４の２３２～２７６位の塩基配列に示されるものである。ある実施形態において、本文に記載の抗原認識領域は配列番号１３の２３～１７１位のアミノ酸残基に示されるものであり、その例示的なコード配列は配列番号１４の６７～５１３位の塩基配列に示されるものである。
【0085】
本発明において、ムチン（Ｍｕｃ１）抗原を認識する例示的な抗原認識領域は、ムチンのｓｃＦｖであってもよく、該一本鎖抗体は、本分野で周知されるＭｕｃ１抗原に対する一本鎖抗体であってもよい。ある実施形態において、該一本鎖抗体の軽鎖可変領域アミノ酸配列と重鎖可変領域アミノ酸配列は、Ｍｕｃ１の膜近傍末端のアミノ酸配列に対する抗体から由来するものである。ある実施形態において、該Ｍｕｃ１の膜近傍末端のアミノ酸配列は配列番号２４に示されるものである。抗Ｍｕｃ１一本鎖抗体の軽鎖可変領域の例示的なアミノ酸配列は配列番号１５の２３～１３３位のアミノ酸残基に示されるものであり、その例示的なコード配列は配列番号１６の６７～３９９位の塩基配列に示されるものである。抗Ｍｕｃ１一本鎖抗体の重鎖可変領域の例示的なアミノ酸配列は配列番号１５の１４９～２６９位のアミノ酸残基に示されるものであり、その例示的なコード配列は配列番号１６の４４５～８０９位の塩基配列に示されるものである。ある実施形態において、ムチン抗原を認識する一本鎖抗体の例示的なアミノ酸配列は配列番号１５の２３～２６９位のアミノ酸残基に示されるものであり、その例示的なコード配列は配列番号１６の６７～８０７位の塩基配列に示されるものである。
【0086】
本発明において、ＥＧＦＲを認識する例示的な抗原認識領域は、ＥＧＦＲ特異的抗体の軽鎖可変領域と重鎖可変領域からなる一本鎖抗体であってもよく、該一本鎖抗体は、本分野で周知されるＥＧＦＲに対する一本鎖抗体であってもよい。ＥＧＦＲを認識する一本鎖抗体の軽鎖可変領域の例示的なアミノ酸配列は配列番号１７の２３～１２９位のアミノ酸残基に示されるものであり、その例示的なコード配列は配列番号１８の６７～３８７位の塩基配列に示されるものである。ＥＧＦＲを認識する一本鎖抗体の重鎖可変領域の例示的なアミノ酸配列は配列番号１７の１４５～２６３位のアミノ酸残基に示されるものであり、その例示的なコード配列は配列番号１８の４３３～７８９位の塩基配列に示されるものである。ある実施形態において、ＥＧＦＲを認識する一本鎖抗体の例示的なアミノ酸配列は配列番号１７の２３～２６３位のアミノ酸残基に示されるものであり、その例示的なコード配列は配列番号１８の６７～７８９位のヌクレオチド配列に示されるものである。
【0087】
本文において、ヒンジ領域とは、免疫グロブリン重鎖ＣＨ１とＣＨ２機能領域の間の領域を指し、該領域は豊富なプロリンを含有し、αヘリックスを形成せず、伸長やある程度の歪みを起こしやすく、抗体の抗原結合部位と抗原エピトープとの間の相補的結合に有利である。本文に適用されるヒンジ領域は、ＣＤ８の細胞外ヒンジ領域、ＩｇＧ１ Ｆｃ ＣＨ２ＣＨ３ヒンジ領域、ＩｇＤヒンジ領域、ＣＤ２８の細胞外ヒンジ領域、ＩｇＧ４ Ｆｃ ＣＨ２ＣＨ３ヒンジ領域およびＣＤ４の細胞外ヒンジ領域から選ばれる任意の１種または多種であってもよい。ヒンジ領域は、長さが５０個のアミノ酸残基以上のヒンジ領域が好ましく、長さが８０個のアミノ酸残基以上のヒンジ領域がより好ましい。ある実施形態において、本文はＣＤ８αヒンジ領域またはＩｇＧ４ Ｆｃ ＣＨ２ＣＨ３ヒンジ領域を適用する。ある実施形態において、ＣＤ８αヒンジ領域のアミノ酸配列は配列番号７の２６４～３０８位のアミノ酸残基に示されるものであり、その例示的なコード配列は配列番号８の７９０～９２４位の塩基配列に示されるものである；他の実施形態において、ＣＤ８αヒンジ領域のアミノ酸配列は配列番号１７の２６４～３１８位のアミノ酸残基に示されるものであり、その例示的なコード配列は配列番号１８の７９０～９５４位の塩基配列に示されるものである。ＩｇＧ４ ＣＨ２ＣＨ３ヒンジ領域の例示的なアミノ酸配列は配列番号９の２７３～５００位のアミノ酸残基に示されるものであり、その例示的なコード配列は配列番号１０の８１７～１５００位の塩基配列に示されるものである。
【0088】
膜貫通領域は、ＣＤ２８膜貫通領域、ＣＤ８膜貫通領域、ＣＤ３ζ膜貫通領域、ＣＤ１３４膜貫通領域、ＣＤ１３７膜貫通領域、ＩＣＯＳ膜貫通領域およびＤＡＰ１０膜貫通領域の中の１種であってもよい。ある実施形態において、膜貫通領域はＣＤ８膜貫通領域であり、その例示的なアミノ酸配列は配列番号７の３０９～３３２位のアミノ酸残基に示されるものであり、その例示的なコード配列配列番号８の９２５～９９６位の塩基配列に示されるものである。ある実施形態において、ＣＤ８膜貫通領域のアミノ酸配列は配列番号１７の３１９～３４４位のアミノ酸残基に示されるものであり、その例示的なコード配列は配列番号１８の９５５～１０３２位の塩基配列に示されるものである。ある実施形態において、膜貫通領域はＣＤ２８膜貫通領域であり、そのアミノ酸配列は配列番号９の５０１～５２８位のアミノ酸残基に示されるものであり、その例示的なコード配列配列番号８の１５０１～１５８４位の塩基配列に示されるものである。
【0089】
細胞内共刺激シグナル領域は、ＣＤ２８、ＣＤ１３４／ＯＸ４０、ＣＤ１３７／４－１ＢＢ、リンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ（ＬＣＫ）、誘導性Ｔ細胞共刺激因子（ＩＣＯＳ）およびＤＮＡＸ活性化タンパク質１０（ＤＡＰ１０）の細胞内ドメインから選ばれる共刺激シグナル分子の細胞内ドメインを含む。ある実施形態において、共刺激シグナル分子の細胞内ドメインはＣＤ１３７／４－１ＢＢの細胞内ドメインである；好ましくは、前記ＣＤ１３７／４－１ＢＢのアミノ酸配列は配列番号７の３３３～３７４位のアミノ酸残基に示されるものであり、その例示的なコード配列は配列番号８の９９７～１１２２位の塩基配列に示されるものである。ある実施形態において、細胞内共刺激シグナル領域はＣＤ２８細胞内ドメインであり、その例示的なアミノ酸配列は配列番号９の５２９～５６９位のアミノ酸残基に示されるものであり、その例示的なコード配列配列番号１０の１５８５～１７０７位の塩基配列に示されるものである。
【0090】
細胞内シグナル領域は、免疫受容体チロシン活性化モチーフが好ましく、ＣＤ３ζ細胞内シグナル領域またはＦｃεＲＩγ細胞内シグナル領域であってもよく、ＣＤ３ζ細胞内シグナル領域が好ましい；好ましくは、前記ＣＤ３ζ細胞内シグナル領域のアミノ酸配列は配列番号７の３７５～４８６位のアミノ酸残基に示されるものであり、その例示的なコード配列は配列番号８の１１２３～１４５８位の塩基配列に示されるものである。
【0091】
ある実施形態において、本発明のキメラ抗原受容体はＮ末端からＣ末端まで、任意に含まれてもよいシグナルペプチド配列と、抗原認識領域と、ＣＤ８αヒンジ領域若しくはＩ
ｇＧ４ ＣＨ２ＣＨ３ヒンジ領域と、ＣＤ８膜貫通領域若しくはＣＤ２８膜貫通領域と、４－１ＢＢ若しくはＣＤ２８の細胞内ドメインと、およびＣＤ３ζ細胞内シグナル領域と、を順次に含む。好ましくは、本発明のキメラ抗原受容体は：そのアミノ酸配列は配列番号７の２２～４８６位のアミノ酸残基に示されるもの、または配列番号７に示されるものであり、その例示的なコード配列は配列番号８の６４～１４５８位の塩基配列に示されるもの、または配列番号８に示されるものである、ＣＤ１９を標的とするキメラ抗原受容体；そのアミノ酸配列は配列番号９の２３～６８１位のアミノ酸残基に示されるもの、または配列番号９に示されるものであり、その例示的なコード配列は配列番号１０の６７～２０４３位の塩基配列に示されるもの、または配列番号１０に示されるものであり、或いは、そのアミノ酸配列は配列番号１１の２１～６７９位のアミノ酸残基に示されるもの、または配列番号１１に示されるものであり、その例示的なコード配列は配列番号１２の６１～２０３７位の塩基配列に示されるもの、または配列番号１２に示されるものである、メソテリンを標的とするキメラ抗原受容体；そのアミノ酸配列は配列番号１３の２３～５８０位のアミノ酸残基に示されるもの、または配列番号１３に示されるものであり、その例示的なコード配列は配列番号１４の６７～１７４０位の塩基配列に示されるもの、または配列番号１４に示されるものである、ＥｒｂＢファミリーを標的とする抗原認識領域；そのアミノ酸配列は配列番号１５の２３～６７８位のアミノ酸残基に示されるもの、または配列番号１５に示されるものであり、その例示的なコード配列は配列番号１６の６７～２０３４位の塩基配列に示されるもの、または配列番号１６に示されるものである、ムチンを標的とするキメラ抗原受容体；或いは、そのアミノ酸配列は配列番号１７の２３～４９７位のアミノ酸残基に示されるもの、または配列番号１７に示されるものであり、その例示的なコード配列は配列番号１８の６７～１４９１位の塩基配列に示されるもの、または配列番号１８に示されるものである、ＥＧＦＲを標的とするキメラ抗原受容体。
ｇＧ４ ＣＨ２ＣＨ３ヒンジ領域と、ＣＤ８膜貫通領域若しくはＣＤ２８膜貫通領域と、４－１ＢＢ若しくはＣＤ２８の細胞内ドメインと、およびＣＤ３ζ細胞内シグナル領域と、を順次に含む。好ましくは、本発明のキメラ抗原受容体は：そのアミノ酸配列は配列番号７の２２～４８６位のアミノ酸残基に示されるもの、または配列番号７に示されるものであり、その例示的なコード配列は配列番号８の６４～１４５８位の塩基配列に示されるもの、または配列番号８に示されるものである、ＣＤ１９を標的とするキメラ抗原受容体；そのアミノ酸配列は配列番号９の２３～６８１位のアミノ酸残基に示されるもの、または配列番号９に示されるものであり、その例示的なコード配列は配列番号１０の６７～２０４３位の塩基配列に示されるもの、または配列番号１０に示されるものであり、或いは、そのアミノ酸配列は配列番号１１の２１～６７９位のアミノ酸残基に示されるもの、または配列番号１１に示されるものであり、その例示的なコード配列は配列番号１２の６１～２０３７位の塩基配列に示されるもの、または配列番号１２に示されるものである、メソテリンを標的とするキメラ抗原受容体；そのアミノ酸配列は配列番号１３の２３～５８０位のアミノ酸残基に示されるもの、または配列番号１３に示されるものであり、その例示的なコード配列は配列番号１４の６７～１７４０位の塩基配列に示されるもの、または配列番号１４に示されるものである、ＥｒｂＢファミリーを標的とする抗原認識領域；そのアミノ酸配列は配列番号１５の２３～６７８位のアミノ酸残基に示されるもの、または配列番号１５に示されるものであり、その例示的なコード配列は配列番号１６の６７～２０３４位の塩基配列に示されるもの、または配列番号１６に示されるものである、ムチンを標的とするキメラ抗原受容体；或いは、そのアミノ酸配列は配列番号１７の２３～４９７位のアミノ酸残基に示されるもの、または配列番号１７に示されるものであり、その例示的なコード配列は配列番号１８の６７～１４９１位の塩基配列に示されるもの、または配列番号１８に示されるものである、ＥＧＦＲを標的とするキメラ抗原受容体。
【0092】
本文のキメラ抗原受容体を形成するシグナルペプチド、抗Ｍｕｃ１一本鎖抗体の軽鎖可変領域と重鎖可変領域、ヒンジ領域、膜貫通領域、細胞内共刺激シグナル領域および細胞内シグナル領域等の上記各部分は、互いに直接に連結してもよいが、リンカー配列を介して連結してもよい。リンカー配列は、抗体に適切に用いられる本分野で周知されるリンカー配列、例えばＧおよびＳを含有するリンカー配列であってもよい。リンカーの長さは３～２５個のアミノ酸残基、例えば３～１５、５～１５、１０～２０個のアミノ酸残基であってもよい。ある実施形態において、リンカー配列はポリグリシンリンカー配列である。リンカー配列におけるグリシンの数は特に制限されないが、通常は２～２０個、例えば２～１５、２～１０、２～８個である。グリシンとセリンの他に、リンカーはさらに他の既知のアミノ酸残基、例えばアラニン（Ａ）、ロイシン（Ｌ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）、フェニルアラニン（Ｆ）、アルギニン（Ｒ）、グルタミン（Ｑ）等を含んでも良い。
【0093】
５、核酸配列、核酸構築物およびベクター並びにそれらの製造方法
本発明は、本文に記載の抗体のコード配列またはその相補的配列である核酸配列も含む。核酸配列は、ＤＮＡ形態またはＲＮＡ形態であってもよい。ＤＮＡは一本鎖または二本鎖であってもよい。
本発明は、本文に記載の抗体のコード配列またはその相補的配列である核酸配列も含む。核酸配列は、ＤＮＡ形態またはＲＮＡ形態であってもよい。ＤＮＡは一本鎖または二本鎖であってもよい。
【0094】
より具体的には、本発明は、任意に含まれてもよいシグナルペプチドと、本文に記載の抗原結合配列と、前記突然変異型Ｆｃフラグメントを含む抗体のコード配列またはその相補的配列を含む。例示的なコード配列は、配列番号２またはその６０～１４９１位の塩基配列に示されるコード配列；配列番号４またはその６０～１４８５位の塩基配列に示されるコード配列；及び配列番号６またはその６０～１１０４位の塩基配列に示されるコード配列を含むが、それらに限定されない。
【0095】
本発明は、本文に記載のキメラ抗原受容体のコード配列またはその相補的配列も含む。
例示的なキメラ抗原受容体のコード配列は、Ｎ末端からＣ末端まで、任意に含まれてもよいシグナルペプチド配列と、抗原認識領域と、ＣＤ８αヒンジ領域若しくはＩｇＧ４ ＣＨ２ＣＨ３ヒンジ領域と、ＣＤ８膜貫通領域若しくはＣＤ２８膜貫通領域と、４－１ＢＢ若しくはＣＤ２８の細胞内ドメインと、およびＣＤ３ζ細胞内シグナル領域と、を順次に含むキメラ抗原受容体をコードするコード配列。例示的なコード配列は、配列番号８またはその６４～１４５８位の塩基配列に示されるコード配列、配列番号１０またはその６７～２０４３位の塩基配列に示されるコード配列、配列番号１２またはその６１～２０３７位の塩基配列に示されるコード配列、配列番号１４またはその６７～１７４０位の塩基配列に示されるコード配列、配列番号１６またはその６７～２０３４位の塩基配列に示されるコード配列、および配列番号１８またはその６７～１４９１位の塩基配列に示されるコード配列を含む。
例示的なキメラ抗原受容体のコード配列は、Ｎ末端からＣ末端まで、任意に含まれてもよいシグナルペプチド配列と、抗原認識領域と、ＣＤ８αヒンジ領域若しくはＩｇＧ４ ＣＨ２ＣＨ３ヒンジ領域と、ＣＤ８膜貫通領域若しくはＣＤ２８膜貫通領域と、４－１ＢＢ若しくはＣＤ２８の細胞内ドメインと、およびＣＤ３ζ細胞内シグナル領域と、を順次に含むキメラ抗原受容体をコードするコード配列。例示的なコード配列は、配列番号８またはその６４～１４５８位の塩基配列に示されるコード配列、配列番号１０またはその６７～２０４３位の塩基配列に示されるコード配列、配列番号１２またはその６１～２０３７位の塩基配列に示されるコード配列、配列番号１４またはその６７～１７４０位の塩基配列に示されるコード配列、配列番号１６またはその６７～２０３４位の塩基配列に示されるコード配列、および配列番号１８またはその６７～１４９１位の塩基配列に示されるコード配列を含む。
【0096】
本発明は、本発明に記載の抗体またはキメラ抗原受容体のコード配列またはその相補的配列を含む核酸構築物も含む。
【0097】
ある実施形態において、前記核酸構築物は、作動可能に連結されるプロモーター配列と、抗体またはキメラ抗原受容体のコード配列またはその相補的配列と、任意に含まれてもよいポリアデニル化シグナル配列とを含む発現フレームである。プロモーター配列は通常、本文に記載のコード配列と作動可能に連結される。プロモーターは、選択される宿主細胞中で転写活性を示す任意のヌクレオチド配列であってもよく、突然変異プロモーター、短く切断されたプロモーターおよびヘテロプロモーターを含み、且つ該宿主細胞と同種または異種の細胞外または細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から獲得できる。発現フレームは通常、宿主細胞によって認識されて転写を終結させる配列である転写ターミネーター配列を含む。ターミネーター配列は、本文に記載のコード配列の３’末端と作動可能に連結される。選択される宿主細胞中で機能するターミネーターは何でも本発明に適用できる。
【0098】
ある実施形態において、前記核酸構築物はベクターである。ベクターの種類は、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウイルスおよびコスミドを含むが、それらに限定されない。ベクターは発現ベクターであってもよいが、真核発現ベクターが好ましい。発現ベクターはウイルスベクターとして細胞に提供することができる。ベクターに用いられるウイルスは、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルスおよびレンチウイルスを含むが、それらに限定されない。ベクターは前記コード配列またはその相補的配列を宿主細胞へ組み込むための組み込みベクターであってもよい。
【0099】
適切なベクターは通常、少なくとも１種の有機体中で機能する複製起点と、プロモーター配列と、便利な制限酵素部位、および１つまたは複数の選択的なマーカーと、を含む。例えば、ある実施形態において、本発明は、複製開始部位と、３’ＬＴＲと、５’ＬＴＲと、本文に記載の抗体またはキメラ抗原受容体のコード配列と、および任意の選択的なマーカーとを含むレトロウイルスベクターを適用する。
【0100】
本文において、適切なプロモーターは、前初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター配列を含むが、それに限定されない。該プロモーター配列は、それと作動可能に連結される任意のポリヌクレオチド配列の高レベルの発現を駆動できる強力な構成的プロモーター配列である。適切なプロモーターのもう一つの例は伸長因子－１α（ＥＦ－１α）である。しかしながら、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）長い末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、ＥＢウイルス前初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、およびヒト遺伝子プロモーター、例えばアクチニンプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘムプロモーターとクレアチ
ンキナーゼプロモーターを含む他の構成的プロモーター配列も適用できるが、それらに限定されない。さらに、誘導型プロモーターの適用も考えられる。誘導型プロモーターの適用は、発現が望ましい場合に誘導型プロモーターと作動可能に連結されるポリヌクレオチド配列の発現をオンにし、発現が望ましくない場合に発現をオフにすることのできる分子スイッチを提供する。誘導型プロモーターの例は、メタロチオネインプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーターおよびテトラサイクリンプロモーターを含むが、それらに限定されない。
ンキナーゼプロモーターを含む他の構成的プロモーター配列も適用できるが、それらに限定されない。さらに、誘導型プロモーターの適用も考えられる。誘導型プロモーターの適用は、発現が望ましい場合に誘導型プロモーターと作動可能に連結されるポリヌクレオチド配列の発現をオンにし、発現が望ましくない場合に発現をオフにすることのできる分子スイッチを提供する。誘導型プロモーターの例は、メタロチオネインプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーターおよびテトラサイクリンプロモーターを含むが、それらに限定されない。
【0101】
ある実施形態において、ＣＮ２０１５１００２１４０８．１に開示された各種のプロモーター配列を適用でき、該出願の配列番号５に示されるｍＣＭＶエンハンサー、ｈＣＭＶエンハンサーとＥＦ１αプロモーターを含むＣＣＥＦプロモーター；配列番号７に示されるＣＤ３ｅエンハンサー、ｍＣＭＶエンハンサー、ｈＣＭＶエンハンサーとＥＦ１αプロモーターを含むＴＣＥＦプロモーター；配列番号８に示されるｍＣＭＶエンハンサー、ｈＣＭＶエンハンサーとイントロン含有ＥＦ１αプロモーターを含むＣＣＥＦＩプロモーター；配列番号３に示される含ＣＤ３ｅエンハンサーとイントロン含有ＥＦ１αプロモーターを含むＴＥＦＩプロモーター；並びに配列番号３に示される含ＣＤ３ｅエンハンサー、ｍＣＭＶエンハンサー、ｈＣＭＶエンハンサーとイントロン含有ＥＦ１αプロモーターを含むＴＣＥＦＩプロモーターを含むが、それらに限定されない。該出願の全内容は、参照により本文に組み込まれる。
【0102】
選択的なマーカーは、ウイルスベクターに感染された細胞群から発現細胞を容易に同定・選択できるように、選択的なマーカー遺伝子またはレポーター遺伝子のいずれか一方または両方を含む。有用な選択的なマーカー遺伝子は、例えばｎｅｏ等のような抗生物質耐性遺伝子を含む。適切なレポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ、β－ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌型アルカリホスファターゼまたは緑色蛍光タンパク質遺伝子をコードする遺伝子を含む。
【0103】
ある実施形態において、本文に記載のキメラ抗原受容体のコード配列と前記抗体のコード配列をそれぞれ、標的核酸配列を宿主細胞のゲノムに組み込むためのベクター（組み込みベクターとも呼ばれる）、特にトランスポゾンベクターにクローンしてもよい。ある実施形態において、該トランスポゾンベクターは、ｐｉｇｇｙｂａｃ、ｓｌｅｅｐｉｎｇ ｂｅａｕｔｙ、ｆｒｏｇ ｐｒｉｎｃｅ、Ｔｎ５またはＴｙから選ばれる転置因子を含む真核発現ベクターである。このようなトランスポゾンベクターは、相応のトランスポゾンの５’逆位末端反復配列（５’ＬＴＲ）と、相応のトランスポゾンの３’逆位末端反復配列（３’ＬＴＲ）とを含む。トランスポザーゼは、ｐｉｇｇｙｂａｃ、ｓｌｅｅｐｉｎｇ
ｂｅａｕｔｙ、ｆｒｏｇ ｐｒｉｎｃｅ、Ｔｎ５またはＴｙトランスポゾンシステムから由来するトランスポザーゼであってもよい。異なるトランスポゾンシステムから由来するトランスポザーゼを適用する場合、前記ベクターにおける５’ＬＴＲと３’ＬＴＲの配列も相応に該トランスポゾンシステムに適合な配列に変更され、これは当業者によって容易に決定できる。ある実施形態において、５’ＬＴＲｔ３’ＬＴＲの間には、相応のプロモーター配列と、ＣＡＲまたは抗体のコード配列と、ポリアデニル化シグナル配列とを含む本発明のＣＡＲまたは抗体の発現フレームがある。
ｂｅａｕｔｙ、ｆｒｏｇ ｐｒｉｎｃｅ、Ｔｎ５またはＴｙトランスポゾンシステムから由来するトランスポザーゼであってもよい。異なるトランスポゾンシステムから由来するトランスポザーゼを適用する場合、前記ベクターにおける５’ＬＴＲと３’ＬＴＲの配列も相応に該トランスポゾンシステムに適合な配列に変更され、これは当業者によって容易に決定できる。ある実施形態において、５’ＬＴＲｔ３’ＬＴＲの間には、相応のプロモーター配列と、ＣＡＲまたは抗体のコード配列と、ポリアデニル化シグナル配列とを含む本発明のＣＡＲまたは抗体の発現フレームがある。
【0104】
ある実施形態において、トランスポザーゼはｐｉｇｇｙｂａｃトランスポゾンシステムから由来するトランスポザーゼである。よって、これらの実施形態において、トランスポゾンの５’逆位末端反復配列と３’逆位末端反復配列はそれぞれ、ｐｉｇｇｙｂａｃトランスポゾンの５’逆位末端反復配列と３’逆位末端反復配列である。ある実施形態において、トランスポゾンの５’逆位末端反復配列はＣＮ ２０１５１０６３８９７４．７（その内容は参照により本文に組み込まれる）の配列番号１に示されるものである。ある実施形態において、トランスポゾンの３’逆位末端反復配列はＣＮ ２０１５１０６３８９７
４．７の配列番号４に示されるものである。ある実施形態において、ｐｉｇｇｙｂａｃトランスポザーゼはｃ－ｍｙｃ核局在化シグナルコード配列を含むトランスポザーゼである。ある実施形態において、ｐｉｇｇｙｂａｃトランスポザーゼのコード配列はＣＮ ２０１５１０６３８９７４．７の配列番号５に示されるものである。
４．７の配列番号４に示されるものである。ある実施形態において、ｐｉｇｇｙｂａｃトランスポザーゼはｃ－ｍｙｃ核局在化シグナルコード配列を含むトランスポザーゼである。ある実施形態において、ｐｉｇｇｙｂａｃトランスポザーゼのコード配列はＣＮ ２０１５１０６３８９７４．７の配列番号５に示されるものである。
【0105】
トランスポザーゼコード配列のプロモーターは、本分野で公知のトランスポザーゼコード配列の発現制御用の各種のプロモーターであってもよい。ある実施形態において、ＣＭＶプロモーターでトランスポザーゼコード配列の発現を制御する。ＣＭＶプロモーターの配列はＣＮ ２０１５１０６３８９７４．７の配列番号６に示されるものである。
【0106】
ある実施形態において、本発明のキメラ抗原受容体のコード配列を含むベクターは、ＣＮ ２０１５１０６３８９７４．７に開示されたｐＮＢ３２８ベクターである。本分野の常法を用いて、本発明のキメラ抗原受容体のコード配列を製造し、且つそれを適切なベクターにクローンすることができる。
【0107】
ある実施形態において、標的遺伝子を宿主細胞のゲノムに組み込むための前記ベクターはトランスポザーゼコード配列を含まない。例えば、ｐＮＢ３２８ベクターを元に、トランスポザーゼコード配列を除去すると、このようなベクターを獲得できる。通常、このようなベクターを用いて本発明に記載の抗体の発現フレームを宿主細胞のゲノムに組み込むことができる。
【0108】
本分野で周知される方法、例えばＰＣＲ増幅法を用いて、本文に記載の核酸配列を獲得できる。例えば、本文に開示されたヌクレオチド配列を根拠としてプライマーを設計し、且つ市販のｃＤＮＡライブラリーまたは当業者にとって既知の常法によって作製されるｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、関連配列を増幅して獲得できる。配列が長い場合、２回又は複数回のＰＣＲ増幅を行い、その後に各回で増幅された断片を正確な順序でライゲートすることが多い。
【0109】
遺伝子クローニング操作では、適切な制限部位を設計することがしばしば必要であり、発現されるアミノ酸配列の末端に１つまたは複数の無関係な残基を必然的に導入するが、これは標的配列の活性に影響しないことは理解すべきである。融合タンパク質の構築、組換えタンパク質の発現の促進、宿主細胞外へ自動的に分泌される組換えタンパク質の取得、または組換えタンパク質の精製の便利化を目的として、組換えタンパク質のＮ－末端、Ｃ－末端、または該タンパク質における他の適切な領域内には、いくつかのアミノ酸を追加する必要がしばしばあり、例えば、適切なリンカーペプチド、シグナルペプチド、リーダーペプチド、末端伸長などが含まれるが、それらに限定されない。よって、本文のＣＡＲのアミノ末端またはカルボキシル末端はさらに、タンパク質タグとして、１つまたは複数のポリペプチド断片を含んでもよい。適切なタグは何でも本文に適用できる。例えば、前記タグはＦＬＡＧ、ＨＡ、ＨＡ１、ｃ－Ｍｙｃ、Ｐｏｌｙ－Ｈｉｓ、Ｐｏｌｙ－Ａｒｇ、Ｓｔｒｅｐ－ＴａｇＩＩ、ＡＵ１、ＥＥ、Ｔ７、４Ａ６、ε、Ｂ、ｇＥおよびＴｙ１であってもよい。これらのタグはタンパク質に対する精製に適用できる。
【0110】
６、宿主細胞およびその製造
本発明はさらに、本文に記載の核酸構築物を含む、または本文に記載の抗体及び／又はキメラ抗原受容体を発現する宿主細胞を提供する。
本発明はさらに、本文に記載の核酸構築物を含む、または本文に記載の抗体及び／又はキメラ抗原受容体を発現する宿主細胞を提供する。
【0111】
本発明の宿主細胞は、本分野で周知される抗体の発現に適切な各種の細胞、例えば２９３またはＣＨＯ細胞であってもよい。このような宿主細胞は本文に記載の抗体の発現ベクターを含んでもよい。
【0112】
ある実施形態において、本発明の宿主細胞は、本文に記載の抗体とキメラ抗原受容体を同時に発現するための細胞であり、本文に記載の抗体とキメラ抗原受容体のコード配列または発現フレームを含み、好ましくは、そのゲノムには、２つの発現フレーム、即ち本文に記載の抗体の発現フレームとキメラ抗原受容体の発現フレームが組み込まれる。好ましくは、このような細胞はＴ細胞である。目的のＴ細胞は、末梢血Ｔリンパ球、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）、ヘルパーＴ細胞、サプレッサー／制御性Ｔ細胞、γδＴ細胞、およびサイトカイン誘導性キラー細胞（ＣＩＫ）、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）等の混合細胞集団のＴ細胞を含むが、それらに限定されない。
【0113】
好ましくは、前記Ｔ細胞には、そのゲノムにキメラ抗原受容体の発現フレームを組み込むための、トランスポザーゼコード配列を含むベクターと、そのゲノムに本文に記載の抗体の発現フレームを組み込むための、トランスポザーゼコード配列を含まないベクターと、が導入された。より好ましくは、前記Ｔ細胞には、ｐＮＢ３２８ベクターを骨格ベクターとして構築される、キメラ抗原受容体の発現フレームを含むベクターと、ｐＳ３２８ベクター（ｐＮＢ３２８に比べてトランスポザーゼコード配列を含まないもの）を骨格ベクターとして構築される、本文に記載の抗体の発現フレームを含むベクターと、が導入された。ある実施形態において、Ｔ細胞のゲノムにキメラ抗原受容体の発現フレームを組み込むための、トランスポザーゼコード配列を含む前記ベクターは、５’ＬＴＲと、プロモーターと、ＣＤ８シグナルペプチドまたは軽鎖シグナルペプチドのコード配列と、抗原認識領域のコード配列と、ＣＤ８αヒンジ領域またはＩｇＧ４ ＣＨ２ＣＨ３ヒンジ領域のコード配列と、ＣＤ８またはＣＤ２８膜貫通領域のコード配列と、４－１ＢＢまたはＣＤ２８細胞内ドメインのコード配列と、ＣＤ３ζ細胞内シグナル領域のコード配列と、ポリアデニル化シグナル配列と、３’ＬＴＲと、トランスポザーゼのコード配列およびそのプロモーターと、を順次に含む；Ｔ細胞のゲノムに本文に記載の抗体のコード配列を組み込むための、トランスポザーゼコード配列を含まない前記ベクターは、５’ＬＴＲと３’ＬＴＲの間に、プロモーターと、軽鎖シグナルペプチドまたはＣＤ８シグナルペプチドのコード配列と、抗体のコード配列と、ポリアデニル化シグナル配列と、を順次に含む。好ましくは、前記抗原認識領域は、ＣＤ１９、メソテリン、ムチン、ＥＧＦＲまたはＥｒｂＢファミリーを標的とする抗原認識領域であり、好ましくは、そのアミノ酸とコード配列は上記のようである。好ましくは、前記抗体は抗ＰＤ－１抗体、抗ＣＤ４７抗体または抗ＣＤ４０抗体であり、好ましくは、そのアミノ酸配列とコード配列は上記のようである。
【0114】
通常のトランスフェクション方法を用いて本発明のベクターを目的の細胞に導入することができ、これらの導入方法は、ウイルス形質導入、マイクロインジェクション、パーティクルボンバードメント、遺伝子銃形質転換およびエレクトロポレーションを含むが、それらに限定されない。ある実施形態において、エレクトロポレーションによって本文に記載のベクターを目的の細胞にトランスフェクトする。好ましくは、トランスフェクションの時、キメラ抗原受容体のコード配列を含むベクターと抗体のコード配列を含むベクターの質量比は１～７：１～７、例えば１～５：１～５、好ましくは１～３：１～３、より好ましくは１～２：１～２、さらに好ましくは１～２：１である。
【0115】
７、組成物とキット
本発明はさらに、本文に記載のベクターを含む、好ましくは本文に記載のキメラ抗原受容体を発現するベクターと本文に記載の抗体を発現するベクターを含む組成物を提供する。該組成物は、少なくともトランスフェクション用のベクターの提供のために用いられる。
本発明はさらに、本文に記載のベクターを含む、好ましくは本文に記載のキメラ抗原受容体を発現するベクターと本文に記載の抗体を発現するベクターを含む組成物を提供する。該組成物は、少なくともトランスフェクション用のベクターの提供のために用いられる。
【0116】
本発明の組成物において、本文に記載のキメラ抗原受容体を発現するベクターと本文に記載の抗体を発現するベクターの質量比は１～７：１～７、例えば１～５：１～５、好ましくは１～３：１～３、より好ましくは１～２：１～２、さらに好ましくは１～２：１で
ある。該組成物はさらに適切な試薬を含んでもよく、トランスフェクション用の試薬を含むが、それらに限定されない。
ある。該組成物はさらに適切な試薬を含んでもよく、トランスフェクション用の試薬を含むが、それらに限定されない。
【0117】
本発明はさらに、本文に記載のキメラ抗原受容体を発現するベクターと本文に記載の抗体を発現するベクターを含むキット、或いは本文に記載の組成物を含むキットを提供する。キットにはさらに、前記ベクターを細胞に導入するための試薬及び／又は機器が配置されてもよい。
【0118】
本発明の組成物はさらに、本文に記載のＴ細胞或いは前記Ｔ細胞およびそれが発現する本文に記載の抗体を含む医薬組成物であってもよい。医薬組成物は、適切な薬学的に許容されるビヒクルや補助剤を含んでもよい。適切なビヒクルや補助剤は、緩衝液や浸透圧調節剤等を含むが、それらに限定されない。医薬組成物は治療または予防有効量のＴ細胞を含む。患者の病状等の要素に応じてＴ細胞の治療または予防有効量を決定できる。
【0119】
８、方法と使用
本発明はさらに、本文に記載の抗体、そのコード配列または相補的配列、核酸構築物および宿主細胞の、悪性腫瘍を治療または予防するための薬物の製造における使用を提供する。前記腫瘍は、前記抗体と特異的に結合する抗原に関連する腫瘍を含むが、それらに限定されない。本発明はさらに、悪性腫瘍を治療または予防するための、本文に記載の抗体、そのコード配列または相補的配列、核酸構築物および宿主細胞を含む。
本発明はさらに、本文に記載の抗体、そのコード配列または相補的配列、核酸構築物および宿主細胞の、悪性腫瘍を治療または予防するための薬物の製造における使用を提供する。前記腫瘍は、前記抗体と特異的に結合する抗原に関連する腫瘍を含むが、それらに限定されない。本発明はさらに、悪性腫瘍を治療または予防するための、本文に記載の抗体、そのコード配列または相補的配列、核酸構築物および宿主細胞を含む。
【0120】
本発明はさらに、本文に記載のＴ細胞、または前記Ｔ細胞およびそれが発現する抗体、またはその医薬組成物の、悪性腫瘍を治療または予防するための薬物の製造における使用を提供する。本発明はさらに、悪性腫瘍を治療または予防するための、本文に記載のＴ細胞、または前記Ｔ細胞およびそれが発現する抗体、またはその医薬組成物を含む。
【0121】
本発明はさらに、その必要のある対象に治療または予防有効量の本発明に記載のＴ細胞またはその医薬組成物を投与することを含む、悪性腫瘍を治療または予防する方法を提供する。
【0122】
本発明のＴ細胞、または前記Ｔ細胞およびそれが発現する抗体、またはその医薬組成物、または本発明に記載の方法によって治療または予防できる悪性腫瘍（癌）とは、前記Ｔ細胞が発現する抗体及び／又はキメラ抗原受容体により治療または予防できる悪性腫瘍であってもよい。例えば、キメラ抗原受容体はＣＤ１９を標的とするキメラ抗原受容体である場合、悪性腫瘍は悪性Ｂ細胞リンパ腫であってもよいが、急性Ｂリンパ性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）、慢性Ｂリンパ性白血病（Ｂ－ＣＬＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）および多発性骨髄腫（ＭＭ）を含む。前記キメラ抗原受容体はメソテリンを標的とする場合、悪性腫瘍は、その癌細胞の表面でメソテリンが異常に発現されている癌であってもよいが、好ましくは腺癌、中皮腫、肺癌、結腸癌、結腸直腸癌、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、胃癌、胆管癌、胆嚢癌、食道癌、黒色腫、非小細胞肺癌、腎細胞癌、頭頸部扁平上皮癌、直腸癌、ホジキンリンパ腫、膵臓癌または前立腺癌であってもよい；より好ましくは、前記癌はメソテリンおよびＣＡ１２５／ＭＵＣ１６が共に高発現される癌である。前記キメラ抗原受容体はＥｒｂＢファミリーを標的する時、前記悪性腫瘍は、癌細胞の表面で少なくとも１つのＥＧＦＲファミリーメンバータンパク質が異常に発現される癌、例えば肝癌、腺癌、肺癌、結腸癌、結腸直腸癌、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、胃癌、胆管癌、非小細胞癌、胆嚢癌、食道癌、黒色腫、膵臓癌、尿路上皮癌、頭頸部癌または前立腺癌であってもよい。前記キメラ抗原受容体はムチンを標的する時、前記悪性腫瘍は、癌細胞の表面でＭｕｃ１抗原が異常に発現される癌、例えば肝癌、腺癌、肺癌、結腸癌、結腸直腸癌、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、胃癌、胆管癌、非小細胞癌、胆嚢癌、食道癌、黒色腫、膵臓癌、尿路上皮癌、頭頸部癌または前立腺癌であってもよい。前記キ
メラ抗原受容体はＥＧＦＲを標的する時、前記悪性腫瘍は、癌細胞の表面でＥＧＦＲが異常に発現される癌、例えばグリア細胞癌、腎臓癌、腺癌、肺癌、結腸癌、結腸直腸癌、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、胃癌、胆管癌、胆嚢癌、食道癌、膵臓癌または前立腺癌であってもよい。抗体がＣＤ４０抗体である場合、適切な悪性腫瘍は、ＣＤ４０によって仲介される悪性腫瘍であり、非小細胞癌、黒色腫、尿路上皮癌、高頻度マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ－およびＨ）および頭頸部癌などを含むが、それらに限定されない；抗体がＰＤ－１抗体である場合、適切な悪性腫瘍は、ＰＤ－１によって仲介される悪性腫瘍であり、黒色腫、結腸癌、前立腺癌、非小細胞肺癌および腎臓細胞癌などの固形腫瘍を含むが、それらに限定されない。抗体がＣＤ４７抗体である場合、適切な悪性腫瘍は、癌細胞表面にＣＤ４７が発現される任意の腫瘍を含む。
メラ抗原受容体はＥＧＦＲを標的する時、前記悪性腫瘍は、癌細胞の表面でＥＧＦＲが異常に発現される癌、例えばグリア細胞癌、腎臓癌、腺癌、肺癌、結腸癌、結腸直腸癌、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、胃癌、胆管癌、胆嚢癌、食道癌、膵臓癌または前立腺癌であってもよい。抗体がＣＤ４０抗体である場合、適切な悪性腫瘍は、ＣＤ４０によって仲介される悪性腫瘍であり、非小細胞癌、黒色腫、尿路上皮癌、高頻度マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ－およびＨ）および頭頸部癌などを含むが、それらに限定されない；抗体がＰＤ－１抗体である場合、適切な悪性腫瘍は、ＰＤ－１によって仲介される悪性腫瘍であり、黒色腫、結腸癌、前立腺癌、非小細胞肺癌および腎臓細胞癌などの固形腫瘍を含むが、それらに限定されない。抗体がＣＤ４７抗体である場合、適切な悪性腫瘍は、癌細胞表面にＣＤ４７が発現される任意の腫瘍を含む。
【0123】
以下、実施例を参照して、本発明にかかる実施形態について詳細に説明する。当業者に理解されるように、以下の実施例は本発明を説明するためにのみ使用され、本発明の範囲を限定するものと見なされるべきではない。実施例で技術や条件が具体的に示されていない場合、本分野の文献に記載の技術や条件（例えばＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋらが編集し、Ｈｕａｎｇ Ｐｅｉｔａｎｇらが翻訳した「分子クローニング：実験マニュアル」、第３版、科学出版社を参照）、または製品の取扱説明書に従う。
【0124】
使用される試薬や機器は、メーカーが明記されない場合、いずれも市販されている普通の製品である。
【0125】
実施例１：組換えプラスミドの構築
上海Ｇｅｎｅｒａｙ Ｂｉｏｔｅｃｈ社に下表１に示される各外因性遺伝子（抗体またはＣＡＲ）の合成を依頼し、且つそれらの上流にマルチクローニング部位（ＢｇｌＩＩ－ＸｂａＩ－ＥｃｏＲＩ－ＢａｍＨＩ）を導入し、それらの下流に制限酵素切断部位（ＳａｌＩ－ＮｈｅＩ－ＨｉｎｄＩＩＩ－ＳｐｅＩ）を導入し、それらをＥｃｏＲ１＋ＳａｌＩで二重酵素切断されたｐＮＢ３２８ベクターまたはｐＳ３２８ベクターに挿入し（ｐＮＢ３２８の構造および配列はＣＮ ２０１５１０６３８９７４．７を参照し、その全内容は参照により本文に組み込まれる；ｐＮＢ３２８に比べて、ｐＳ３２８はトランスポザーゼコード配列が欠けている；キメラ抗原受容体の遺伝子はｐＮＢ３２８ベクターに挿入され、抗体の配列はｐＳ３２８ベクターに挿入された）、組換えプラスミドを構築した。
上海Ｇｅｎｅｒａｙ Ｂｉｏｔｅｃｈ社に下表１に示される各外因性遺伝子（抗体またはＣＡＲ）の合成を依頼し、且つそれらの上流にマルチクローニング部位（ＢｇｌＩＩ－ＸｂａＩ－ＥｃｏＲＩ－ＢａｍＨＩ）を導入し、それらの下流に制限酵素切断部位（ＳａｌＩ－ＮｈｅＩ－ＨｉｎｄＩＩＩ－ＳｐｅＩ）を導入し、それらをＥｃｏＲ１＋ＳａｌＩで二重酵素切断されたｐＮＢ３２８ベクターまたはｐＳ３２８ベクターに挿入し（ｐＮＢ３２８の構造および配列はＣＮ ２０１５１０６３８９７４．７を参照し、その全内容は参照により本文に組み込まれる；ｐＮＢ３２８に比べて、ｐＳ３２８はトランスポザーゼコード配列が欠けている；キメラ抗原受容体の遺伝子はｐＮＢ３２８ベクターに挿入され、抗体の配列はｐＳ３２８ベクターに挿入された）、組換えプラスミドを構築した。
【0126】
【表1】
＊：配列番号１９は２Ａのヌクレオチド配列を示し、配列番号２０はＩＲＥＳのヌクレオチド配列を示す；前記外因性遺伝子配列のその他の部分の配列は表中の同じ名の外因性遺伝子の配列と同一である；
＊＊：野生型ＩｇＧ４Ｆｃ配列は配列番号２５に示され、突然変異型ＩｇＧ４Ｆｃに比べて、Ｌ１７Ｅ（ＣＴＧからＧＡＧへの突然変異）、Ｎ７９Ｑ（ＡＡＣからＣＡＧへの突然変異）の突然変異が存在するが、その他の配列は同一である。
【0127】
実施例２：ＣＡＲ－Ｔ細胞の構築
フィコール分離法を利用して、患者の血液から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を分離して獲得した。ＰＢＭＣを２～４時間付着培養したが、付着しなかった浮遊細胞はナイーブＴ細胞であり、浮遊細胞を１５ｍｌ遠心チューブに収集し、１２００ｒｐｍで３分間遠心し、上澄を捨て、生理食塩水を加え、１２００ｒｐｍで３分間遠心し、生理食塩水を捨て、そしてこのステップを繰り返した。
１．５ｍｌ遠心チューブを取り、５×１０６個の細胞を入れ、１２００ｒｐｍで３分間遠心し、上澄を捨て、エレクトロポレーションキット（Ｌｏｎｚａ社より）を取り、エレ
クトロポレーション試薬を１００ｕｌ加え、下表２に示すように異なる組換えプラスミドを加えた。細胞をそれぞれ再懸濁して均一に混合した；混合液をエレクトロポレーションカップに移し、エレクトロポレーターに入れ、所要なプログラムを選択し、電気ショックを与えた；キットのマイクロピペットを用いて、エレクトロポレーションされた細胞懸濁液を培地（２％ＦＢＳを含むＡＩＭ－Ｖ培養液）の入れた６ウェルプレ
ートに移し、均一に混合し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターに入れて培養し、６時間後に刺激因子ＩＬ－２、抗ＣＤ２８抗体および相応の抗原（ＣＤ１９、メソテリン、ＥＧＦＲまたはムチン）または抗ＣＤ３抗体を加え、３７℃、５％ＣＯ２で３～４日間培養し、相応のＴ細胞を獲得した。
２種類の組換えプラスミドを導入した場合、各種の組換えプラスミドの使用量を４ｕｇとした；１種の組換えプラスミドのみを導入した場合，その使用量を６ｕｇとした。
フィコール分離法を利用して、患者の血液から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を分離して獲得した。ＰＢＭＣを２～４時間付着培養したが、付着しなかった浮遊細胞はナイーブＴ細胞であり、浮遊細胞を１５ｍｌ遠心チューブに収集し、１２００ｒｐｍで３分間遠心し、上澄を捨て、生理食塩水を加え、１２００ｒｐｍで３分間遠心し、生理食塩水を捨て、そしてこのステップを繰り返した。
１．５ｍｌ遠心チューブを取り、５×１０６個の細胞を入れ、１２００ｒｐｍで３分間遠心し、上澄を捨て、エレクトロポレーションキット（Ｌｏｎｚａ社より）を取り、エレ
クトロポレーション試薬を１００ｕｌ加え、下表２に示すように異なる組換えプラスミドを加えた。細胞をそれぞれ再懸濁して均一に混合した；混合液をエレクトロポレーションカップに移し、エレクトロポレーターに入れ、所要なプログラムを選択し、電気ショックを与えた；キットのマイクロピペットを用いて、エレクトロポレーションされた細胞懸濁液を培地（２％ＦＢＳを含むＡＩＭ－Ｖ培養液）の入れた６ウェルプレ
ートに移し、均一に混合し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターに入れて培養し、６時間後に刺激因子ＩＬ－２、抗ＣＤ２８抗体および相応の抗原（ＣＤ１９、メソテリン、ＥＧＦＲまたはムチン）または抗ＣＤ３抗体を加え、３７℃、５％ＣＯ２で３～４日間培養し、相応のＴ細胞を獲得した。
２種類の組換えプラスミドを導入した場合、各種の組換えプラスミドの使用量を４ｕｇとした；１種の組換えプラスミドのみを導入した場合，その使用量を６ｕｇとした。
【0128】
【表2】
【0129】
実施例３：ＣＡＲ－Ｔ細胞の陽性率および抗体分泌
１、ＣＡＲ－Ｔ細胞陽性率のフローサイトメトリーによる検出
実施例２で得られたＣＡＲ－Ｔ細胞を収集し、それぞれを一部分に１×１０６個の細胞の量で２つの部分に分け、生理食塩水で２回洗浄し、細胞を１００ｕｌの生理食塩水で再懸濁し、１つの部分には１ｕｇのビオチン結合抗原（ＣＤ１９、メソセリン、ＥＧＦＲまたはムチン）を加え、もう１つの部分には加えず、４℃で３０分間インキュベートした。生理食塩水で２回洗浄し、細胞をもう一回１００ｕｌの生理食塩水で再懸濁し、１ｕｌのストレプトマイシン－ＰＥ抗体を加え、４℃で３０分間インキュベートした。生理食塩水で２回洗浄し、第二抗体のみを加えたものを対照として機器で検出し、結果は下表３に示す。
１、ＣＡＲ－Ｔ細胞陽性率のフローサイトメトリーによる検出
実施例２で得られたＣＡＲ－Ｔ細胞を収集し、それぞれを一部分に１×１０６個の細胞の量で２つの部分に分け、生理食塩水で２回洗浄し、細胞を１００ｕｌの生理食塩水で再懸濁し、１つの部分には１ｕｇのビオチン結合抗原（ＣＤ１９、メソセリン、ＥＧＦＲまたはムチン）を加え、もう１つの部分には加えず、４℃で３０分間インキュベートした。生理食塩水で２回洗浄し、細胞をもう一回１００ｕｌの生理食塩水で再懸濁し、１ｕｌのストレプトマイシン－ＰＥ抗体を加え、４℃で３０分間インキュベートした。生理食塩水で２回洗浄し、第二抗体のみを加えたものを対照として機器で検出し、結果は下表３に示す。
【0130】
【表3】
【0131】
２、実施例２で得られたＣＡＲ－Ｔ細胞の抗体発現量のＥＬＩＳＡによる検出
［１］ コーティング液で相応の抗原（ＣＤ４０、ＰＤ１またはＣＤ４７）を０．５ｕｇ
／ｍｌ（５ｕｌ＋１ｍｌコーティング液）に希釈し、マイクロプレートを１００ｕｌ／ウェルで４℃で一晩コーティングした。
［２］ ＰＢＳＴで５回、毎回３分間洗浄し、２００ｕｌ／ウェルで吸水紙で叩いて乾燥させた。
［３］各ウェルにブロッキング液を１００ｕｌ加え、３７℃で１時間インキュベートした。
［４］ ＰＢＳＴで５回、毎回３分間洗浄し、２００ｕｌ／ウェルで吸水紙で叩いて乾燥させた。
［５］サンプルと標準サンプルを１００ｕｌ／ウェル加え、重複ウェルと対照ウェルを設け、３７℃で１時間インキュベートした。
［６］ＰＢＳＴで５回、毎回３分間洗浄し、２００ｕｌ／ウェルで吸水紙で叩いて乾燥させた。
［７］ブロッキング液でＩｇＧ Ｆ４ ＨＲＰを１００ｕｌ／ウェルで１：３００００希釈し、３７℃で４５分間インキュベートした。
［８］ＰＢＳＴで５回、毎回３分間洗浄し、２００ｕｌ／ウェルで吸水紙で叩いて乾燥させた。
［９］発色液ＴＭＢを１００ｕｌ／ウェル加え、３７℃で遮光で１０～１５分間発色した。
［１０］ 停止液を５０ｕｌ／ウェル加えて反応を停止した。
［１］ コーティング液で相応の抗原（ＣＤ４０、ＰＤ１またはＣＤ４７）を０．５ｕｇ
／ｍｌ（５ｕｌ＋１ｍｌコーティング液）に希釈し、マイクロプレートを１００ｕｌ／ウェルで４℃で一晩コーティングした。
［２］ ＰＢＳＴで５回、毎回３分間洗浄し、２００ｕｌ／ウェルで吸水紙で叩いて乾燥させた。
［３］各ウェルにブロッキング液を１００ｕｌ加え、３７℃で１時間インキュベートした。
［４］ ＰＢＳＴで５回、毎回３分間洗浄し、２００ｕｌ／ウェルで吸水紙で叩いて乾燥させた。
［５］サンプルと標準サンプルを１００ｕｌ／ウェル加え、重複ウェルと対照ウェルを設け、３７℃で１時間インキュベートした。
［６］ＰＢＳＴで５回、毎回３分間洗浄し、２００ｕｌ／ウェルで吸水紙で叩いて乾燥させた。
［７］ブロッキング液でＩｇＧ Ｆ４ ＨＲＰを１００ｕｌ／ウェルで１：３００００希釈し、３７℃で４５分間インキュベートした。
［８］ＰＢＳＴで５回、毎回３分間洗浄し、２００ｕｌ／ウェルで吸水紙で叩いて乾燥させた。
［９］発色液ＴＭＢを１００ｕｌ／ウェル加え、３７℃で遮光で１０～１５分間発色した。
［１０］ 停止液を５０ｕｌ／ウェル加えて反応を停止した。
【0132】
マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍにおけるＯＤ値を計測し、標準曲線をプロットし、ＣＤ４０抗体濃度を算出した。結果は下表４に示す。
【0133】
【表4】
【0134】
実施例４：異なるプラスミド配合でのテスト
実施例２の方法を採用して、実施例１で構築したプラスミドの組み合わせで、下表５に示される使用量配合（１ｕｇ＋７ｕｇ、２ｕｇ＋６ｕｇ、３ｕｇ＋５ｕｇ、４ｕｇ＋４ｕｇ、５ｕｇ＋３ｕｇ、６ｕｇ＋２ｕｇ、７ｕｇ＋１ｕｇ）に従ってＣＡＲ－Ｔ細胞を構築した。実施例３に記載の方法を採用して、異なる使用量配合で構築したＣＡＲ Ｔ細胞の陽性率および抗体分泌量を計測した（方法は実施例３と同じであった）。
実施例２の方法を採用して、実施例１で構築したプラスミドの組み合わせで、下表５に示される使用量配合（１ｕｇ＋７ｕｇ、２ｕｇ＋６ｕｇ、３ｕｇ＋５ｕｇ、４ｕｇ＋４ｕｇ、５ｕｇ＋３ｕｇ、６ｕｇ＋２ｕｇ、７ｕｇ＋１ｕｇ）に従ってＣＡＲ－Ｔ細胞を構築した。実施例３に記載の方法を採用して、異なる使用量配合で構築したＣＡＲ Ｔ細胞の陽性率および抗体分泌量を計測した（方法は実施例３と同じであった）。
【0135】
【表5】
【0136】
例示的な結果は下表６と７に示す。
【0137】
【表6】
【0138】
【表7】
【0139】
結果から分かるように、陽性率と抗体分泌量の結果を併せてみれば、５ｕｇのｐＮＢ３２８－ＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺと３ｕｇのｐＳ３２８－αＣＤ４０を用いて構築したＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ－αＣＤ４０ Ｔ細胞は、効果が最高であった（陽性率は６０％を超え、抗体分泌量は２３０ｎｇ／ｍｌを超えた）；他のプラスミドの組み合わせの中で、４ｕｇ＋４ｕｇを用いた効果は良好であった。
【0140】
実施例５：ＣＤ１９抗原による特異的刺激下でのＣＤ１９ＣＡＲとＣＤ１９ＣＡＲ－αＣＤ４０ Ｔ細胞のサイトカイン放出の対比
９６ウェルプレートを２ｕｇ／ｍｌのＣＤ１９抗原で４℃で一晩コーティングし、ＰＢ
Ｓで３回洗浄し、実施例２で構築したＣＤ１９ＣＡＲとＣＤ１９ＣＡＲ－αＣＤ４０ Ｔ細胞および対照としてのＭｏｃｋ Ｔ細胞を１×１０５個加え、２４時間培養した後、細胞上澄を収集した。ＢＤ社のＣＢＡ Ｈｕｍａｎ Ｔｈ１／Ｔｈ２サイトカインキットＩＩにより、これらの３種類のＴ細胞がＣＤ１９抗原による刺激を受けた後のサイトカインの分泌状況を検出し、具体的な手順は以下のようであった：
（１）ヒトＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ捕捉磁気ビーズを混合し、渦励振盪で捕捉磁気ビーズを均一に混合し、チューブ毎に均一に混合された磁気ビーズを５０ｕｌ入れた；
（２）５０ｕｌのヒトＴｈ１／Ｔｈ２サイトカイン標準サンプル（倍加希釈５０００ｐｇ／ｍｌ、２５００ｐｇ／ｍｌ、１２５０ｐｇ／ｍｌ、６２５ｐｇ／ｍｌ、３１２．５ｐｇ／ｍｌ、１５６ｐｇ／ｍｌ、８０ｐｇ／ｍｌ、４０ｐｇ／ｍｌ、２０ｐｇ／ｍｌ、０ｐｇ／ｍｌ）および５０ｕｌの被験サンプル（希釈剤で２倍に希釈されたもの）を加えた；
（３）チューブ毎にヒトＴｈ１／Ｔｈ２－ＩＩ－ＰＥ検出抗体を５０ｕｌ加えた；
（４）室温で遮光で３時間インキュベートした；
（５）チューブ毎に洗浄緩衝液を１ｍｌ加え、２００で５分間遠心し、上澄を捨てた；
（６）チューブ毎に洗浄緩衝液を３００ｕｌ加えて細胞を再懸濁し、フローサイトメトリー用チューブに移し、フローサイトメーターで蛍光値を検出した。
結果は図１に示す。
９６ウェルプレートを２ｕｇ／ｍｌのＣＤ１９抗原で４℃で一晩コーティングし、ＰＢ
Ｓで３回洗浄し、実施例２で構築したＣＤ１９ＣＡＲとＣＤ１９ＣＡＲ－αＣＤ４０ Ｔ細胞および対照としてのＭｏｃｋ Ｔ細胞を１×１０５個加え、２４時間培養した後、細胞上澄を収集した。ＢＤ社のＣＢＡ Ｈｕｍａｎ Ｔｈ１／Ｔｈ２サイトカインキットＩＩにより、これらの３種類のＴ細胞がＣＤ１９抗原による刺激を受けた後のサイトカインの分泌状況を検出し、具体的な手順は以下のようであった：
（１）ヒトＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ捕捉磁気ビーズを混合し、渦励振盪で捕捉磁気ビーズを均一に混合し、チューブ毎に均一に混合された磁気ビーズを５０ｕｌ入れた；
（２）５０ｕｌのヒトＴｈ１／Ｔｈ２サイトカイン標準サンプル（倍加希釈５０００ｐｇ／ｍｌ、２５００ｐｇ／ｍｌ、１２５０ｐｇ／ｍｌ、６２５ｐｇ／ｍｌ、３１２．５ｐｇ／ｍｌ、１５６ｐｇ／ｍｌ、８０ｐｇ／ｍｌ、４０ｐｇ／ｍｌ、２０ｐｇ／ｍｌ、０ｐｇ／ｍｌ）および５０ｕｌの被験サンプル（希釈剤で２倍に希釈されたもの）を加えた；
（３）チューブ毎にヒトＴｈ１／Ｔｈ２－ＩＩ－ＰＥ検出抗体を５０ｕｌ加えた；
（４）室温で遮光で３時間インキュベートした；
（５）チューブ毎に洗浄緩衝液を１ｍｌ加え、２００で５分間遠心し、上澄を捨てた；
（６）チューブ毎に洗浄緩衝液を３００ｕｌ加えて細胞を再懸濁し、フローサイトメトリー用チューブに移し、フローサイトメーターで蛍光値を検出した。
結果は図１に示す。
【0141】
実施例６：ＣＤ１９ＣＡＲおよびＣＤ１９ＣＡＲ－αＣＤ４０ Ｔ細胞増殖アッセイ
実施例２で構築して８日目に培養したＣＤ１９ＣＡＲ Ｔ細胞、ＣＤ１９ＣＡＲ －αＣＤ４０ Ｔ細胞およびＭｏｃｋ Ｔ細胞をそれぞれ３×１０５個の細胞を取り、１２ウェルプレートに置いて、いずれも１ｍｌの培養体積で培養した。
２． 白色で非透光性の９６ウェルプレートを用意し、３群の細胞からそれぞれ細胞含有培養液を１００μＬ取って、異なるウェルに加えたと共に、細胞非含有培養液を取って、空白対照とした。次に、各ウェルに１００μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ試薬を加え、シェーカーで２分間均一に混合し、室温で１０分間インキュベートし、マイクロプレートリーダーでＬｕｃ蛍光値を読み取った。使用されたＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ発光細胞生存試験（Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ）キットはＰｒｏｍｅｇａ社から購入した。
３． 培養の９、１０、１１、１２、１３日目に、毎日１２ウェルプレートで培養された細胞からサンプリングし、上記の手順で検出し、蛍光値に基づいて細胞増殖曲線をプロットした。
結果から分かるように、ＣＤ１９ＣＡＲ－αＣＤ４０ Ｔ細胞はＣＤ１９ＣＡＲ Ｔ細胞よりも良好な増殖効果を有し、具体的な結果は図２に示す。
実施例２で構築して８日目に培養したＣＤ１９ＣＡＲ Ｔ細胞、ＣＤ１９ＣＡＲ －αＣＤ４０ Ｔ細胞およびＭｏｃｋ Ｔ細胞をそれぞれ３×１０５個の細胞を取り、１２ウェルプレートに置いて、いずれも１ｍｌの培養体積で培養した。
２． 白色で非透光性の９６ウェルプレートを用意し、３群の細胞からそれぞれ細胞含有培養液を１００μＬ取って、異なるウェルに加えたと共に、細胞非含有培養液を取って、空白対照とした。次に、各ウェルに１００μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ試薬を加え、シェーカーで２分間均一に混合し、室温で１０分間インキュベートし、マイクロプレートリーダーでＬｕｃ蛍光値を読み取った。使用されたＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ発光細胞生存試験（Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ）キットはＰｒｏｍｅｇａ社から購入した。
３． 培養の９、１０、１１、１２、１３日目に、毎日１２ウェルプレートで培養された細胞からサンプリングし、上記の手順で検出し、蛍光値に基づいて細胞増殖曲線をプロットした。
結果から分かるように、ＣＤ１９ＣＡＲ－αＣＤ４０ Ｔ細胞はＣＤ１９ＣＡＲ Ｔ細胞よりも良好な増殖効果を有し、具体的な結果は図２に示す。
【0142】
実施例７：ＣＤ１９ＣＡＲ Ｔ細胞およびＣＤ１９ＣＡＲ－αＣＤ４０ Ｔ細胞のインビボ機能実験
実験では、北京Ｂｉｏｓａｆｅｔｙ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社より提供され、ＳＰＦレベルの動物実験室で飼育された４～６週齢の平均体重２２～２７ｇの１２匹のＮＳＧ完全免疫不全マウスが使用された。
ヒトＢ細胞リンパ腫Ｒａｊｉ－ｌｕｃ細胞をインビトロで培養し、対数増殖期にある増殖細胞を取り、遠心して細胞を収集した後、ＰＢＳ液で再懸濁し、３０００ｇで室温で２分間遠心し、上澄を捨て、もう一回ＰＢＳ液で再懸濁した後、遠心で細胞を収集し、細胞懸濁液の濃度を５×１０７個／ｍｌに調整した。前記Ｒａｊｉ－ｌｕｃ細胞をマウスの右側のリブ裏側に０．１ｍｌ／匹で皮下接種した。接種後約１０日で、腫瘍のサイズをインビボイメージャーで観察することにより、ＮＳＧ免疫不全マウスを無作為に５つの群に分けることができた。それぞれＰＢＳ群、Ｍｏｃｋ Ｔ群、ＣＤ１９ＣＡＲ Ｔ群、ＣＤ１９ＣＡＲ－αＣＤ４０－ｗｔ Ｔ群、ＣＤ１９ＣＡＲ－αＣＤ４０ Ｔ群とし、各群に相応の（実施例２からの）Ｔ細胞を１×１０７個／１００ｕｌで注射し、ＰＢＳ群に１００
ｕｌのＰＢＳを投与し、投与経路は尾静脈注射であった。毎日マウスの生存状態を観察し、且つ７～８日おきにインビボイメージャーでマウス腫瘍の変化を観察した。
結果は図３に示す。
実験では、北京Ｂｉｏｓａｆｅｔｙ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社より提供され、ＳＰＦレベルの動物実験室で飼育された４～６週齢の平均体重２２～２７ｇの１２匹のＮＳＧ完全免疫不全マウスが使用された。
ヒトＢ細胞リンパ腫Ｒａｊｉ－ｌｕｃ細胞をインビトロで培養し、対数増殖期にある増殖細胞を取り、遠心して細胞を収集した後、ＰＢＳ液で再懸濁し、３０００ｇで室温で２分間遠心し、上澄を捨て、もう一回ＰＢＳ液で再懸濁した後、遠心で細胞を収集し、細胞懸濁液の濃度を５×１０７個／ｍｌに調整した。前記Ｒａｊｉ－ｌｕｃ細胞をマウスの右側のリブ裏側に０．１ｍｌ／匹で皮下接種した。接種後約１０日で、腫瘍のサイズをインビボイメージャーで観察することにより、ＮＳＧ免疫不全マウスを無作為に５つの群に分けることができた。それぞれＰＢＳ群、Ｍｏｃｋ Ｔ群、ＣＤ１９ＣＡＲ Ｔ群、ＣＤ１９ＣＡＲ－αＣＤ４０－ｗｔ Ｔ群、ＣＤ１９ＣＡＲ－αＣＤ４０ Ｔ群とし、各群に相応の（実施例２からの）Ｔ細胞を１×１０７個／１００ｕｌで注射し、ＰＢＳ群に１００
ｕｌのＰＢＳを投与し、投与経路は尾静脈注射であった。毎日マウスの生存状態を観察し、且つ７～８日おきにインビボイメージャーでマウス腫瘍の変化を観察した。
結果は図３に示す。
【0143】
実施例８：ｍｅｓｏＣＡＲ ＴとｍｅｓｏＣＡＲ－αＣＤ４０ Ｔ細胞の殺傷機能の対比
リアルタイムラベルフリー細胞機能アナライザーにより、実施例２で構築したｍｅｓｏＣＡＲ Ｔ細胞およびｍｅｓｏＣＡＲ－αＣＤ４０ Ｔ細胞のインビトロで腫瘍細胞に対する殺傷効果を検出した。 具体的には、ＭＨＣクラスＩタイピングが一致するエフェクター細胞とターゲット細胞を選択し、ＡＣＥＡ社のリアルタイムラベルフリー細胞機能アナライザー（ＲＴＣＡ）を用いて、上記の２種類のＣＡＲ－Ｔ細胞のインビトロ殺傷活性を検出し、具体的な手順は以下のようであった：
（１）ゼロ調整：各ウェルに５０μｌのＤＭＥＭまたは１６４０培地を加え、機器に入れ、ステップ１を選択し、ゼロを調整した；
（２）標的細胞プレーティング：子宮頸癌細胞Ｈｅｌａ、卵巣癌細胞ＳＫ－ＯＶ－３、胃癌ＨＧＣ－２７（アメリカ菌株保存機関ＡＴＣＣから購入）を、検出電極を備えたプレートに１ウェルあたり１０４個の細胞／５０μｌでプレーティングし、数分間放置し、細胞が安定になったら機器に入れ、ステップ２を開始し、細胞を培養した；
（３）エフェクター細胞の添加：ターゲット細胞を２４時間培養した後、ステップ２を一時停止し、エフェクター細胞を５０μｌ／ウェル加え、エフェクター／ターゲット比を４：１に設定し、Ｍｏｃｋ Ｔ細胞を対照として、ステップ３を開始し、共培養を２４時間継続した後、細胞増殖曲線を観察した；
結果は図４に示すように、ＣＤ４０抗体を自己発現するｍｅｓｏＣＡＲ－αＣＤ４０ Ｔ細胞の細胞殺傷機能は、ｍｅｓｏＣＡＲ Ｔ細胞単独での細胞殺傷機能と実質的に同じであり、抗体の発現はＣＡＲ－Ｔ機能に影響を与えなかった。
リアルタイムラベルフリー細胞機能アナライザーにより、実施例２で構築したｍｅｓｏＣＡＲ Ｔ細胞およびｍｅｓｏＣＡＲ－αＣＤ４０ Ｔ細胞のインビトロで腫瘍細胞に対する殺傷効果を検出した。 具体的には、ＭＨＣクラスＩタイピングが一致するエフェクター細胞とターゲット細胞を選択し、ＡＣＥＡ社のリアルタイムラベルフリー細胞機能アナライザー（ＲＴＣＡ）を用いて、上記の２種類のＣＡＲ－Ｔ細胞のインビトロ殺傷活性を検出し、具体的な手順は以下のようであった：
（１）ゼロ調整：各ウェルに５０μｌのＤＭＥＭまたは１６４０培地を加え、機器に入れ、ステップ１を選択し、ゼロを調整した；
（２）標的細胞プレーティング：子宮頸癌細胞Ｈｅｌａ、卵巣癌細胞ＳＫ－ＯＶ－３、胃癌ＨＧＣ－２７（アメリカ菌株保存機関ＡＴＣＣから購入）を、検出電極を備えたプレートに１ウェルあたり１０４個の細胞／５０μｌでプレーティングし、数分間放置し、細胞が安定になったら機器に入れ、ステップ２を開始し、細胞を培養した；
（３）エフェクター細胞の添加：ターゲット細胞を２４時間培養した後、ステップ２を一時停止し、エフェクター細胞を５０μｌ／ウェル加え、エフェクター／ターゲット比を４：１に設定し、Ｍｏｃｋ Ｔ細胞を対照として、ステップ３を開始し、共培養を２４時間継続した後、細胞増殖曲線を観察した；
結果は図４に示すように、ＣＤ４０抗体を自己発現するｍｅｓｏＣＡＲ－αＣＤ４０ Ｔ細胞の細胞殺傷機能は、ｍｅｓｏＣＡＲ Ｔ細胞単独での細胞殺傷機能と実質的に同じであり、抗体の発現はＣＡＲ－Ｔ機能に影響を与えなかった。
【0144】
実施例９：メソテリン抗原による特異的刺激下でのｍｅｓｏＣＡＲとｍｅｓｏＣＡＲ－αＣＤ４０ Ｔ細胞のサイトカイン放出の対比
９６ウェルプレートを２ｕｇ／ｍｌのメソテリン抗原で４℃で一晩コーティングし、ＰＢＳで３回洗浄し、実施例２で構築したｍｅｓｏ３ＣＡＲ Ｔ細胞とｍｅｓｏＣＡＲ－αＣＤ４０ Ｔ細胞および対照としてのＭｏｃｋ Ｔ細胞を１×１０５個加え、２４時間培養した後、細胞上澄を収集した。ＢＤ社のＣＢＡ Ｈｕｍａｎ Ｔｈ１／Ｔｈ２サイトカインキットＩＩにより、これらの３種類のＴ細胞がメソテリン抗原による刺激を受けた後のサイトカインの分泌状況を検出し、具体的な手順は以下のようであった：
（１）ヒトＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＴＮＦ、ＩＦＮ－γ捕捉磁気ビーズを混合し、渦励振盪で捕捉磁気ビーズを均一に混合し、チューブ毎に均一に混合された磁気ビーズを５０ｕｌ入れた；
（２）５０ｕｌのヒトＴｈ１／Ｔｈ２サイトカイン標準サンプル（倍加希釈５０００ｐｇ／ｍｌ、２５００ｐｇ／ｍｌ、１２５０ｐｇ／ｍｌ、６２５ｐｇ／ｍｌ、３１２．５ｐｇ／ｍｌ、１５６ｐｇ／ｍｌ、８０ｐｇ／ｍｌ、４０ｐｇ／ｍｌ、２０ｐｇ／ｍｌ、０ｐｇ／ｍｌ）および５０ｕｌの被験サンプル（希釈剤で２倍に希釈されたもの）を加えた。
（３）チューブ毎にヒトＴｈ１／Ｔｈ２－ＩＩ－ＰＥ検出抗体を５０ｕｌ加えた；
（４）室温で遮光で３時間インキュベートした；
（５）チューブ毎に洗浄緩衝液を１ｍｌ加え、２００で５分間遠心し、上澄を捨てた；
（６）チューブ毎に洗浄緩衝液を３００ｕｌ加えて細胞を再懸濁し、フローサイトメトリー用チューブに移し、フローサイトメーターで蛍光値を検出した；
結果は図５に示すように、ＣＤ４０抗体を自己発現するｍｅｓｏＣＡＲ－αＣＤ４０ Ｔ細胞のサイトカイン分泌量は、ｍｅｓｏＣＡＲ Ｔ細胞単独でのサイトカイン分泌量と有意差がなかった。
９６ウェルプレートを２ｕｇ／ｍｌのメソテリン抗原で４℃で一晩コーティングし、ＰＢＳで３回洗浄し、実施例２で構築したｍｅｓｏ３ＣＡＲ Ｔ細胞とｍｅｓｏＣＡＲ－αＣＤ４０ Ｔ細胞および対照としてのＭｏｃｋ Ｔ細胞を１×１０５個加え、２４時間培養した後、細胞上澄を収集した。ＢＤ社のＣＢＡ Ｈｕｍａｎ Ｔｈ１／Ｔｈ２サイトカインキットＩＩにより、これらの３種類のＴ細胞がメソテリン抗原による刺激を受けた後のサイトカインの分泌状況を検出し、具体的な手順は以下のようであった：
（１）ヒトＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＴＮＦ、ＩＦＮ－γ捕捉磁気ビーズを混合し、渦励振盪で捕捉磁気ビーズを均一に混合し、チューブ毎に均一に混合された磁気ビーズを５０ｕｌ入れた；
（２）５０ｕｌのヒトＴｈ１／Ｔｈ２サイトカイン標準サンプル（倍加希釈５０００ｐｇ／ｍｌ、２５００ｐｇ／ｍｌ、１２５０ｐｇ／ｍｌ、６２５ｐｇ／ｍｌ、３１２．５ｐｇ／ｍｌ、１５６ｐｇ／ｍｌ、８０ｐｇ／ｍｌ、４０ｐｇ／ｍｌ、２０ｐｇ／ｍｌ、０ｐｇ／ｍｌ）および５０ｕｌの被験サンプル（希釈剤で２倍に希釈されたもの）を加えた。
（３）チューブ毎にヒトＴｈ１／Ｔｈ２－ＩＩ－ＰＥ検出抗体を５０ｕｌ加えた；
（４）室温で遮光で３時間インキュベートした；
（５）チューブ毎に洗浄緩衝液を１ｍｌ加え、２００で５分間遠心し、上澄を捨てた；
（６）チューブ毎に洗浄緩衝液を３００ｕｌ加えて細胞を再懸濁し、フローサイトメトリー用チューブに移し、フローサイトメーターで蛍光値を検出した；
結果は図５に示すように、ＣＤ４０抗体を自己発現するｍｅｓｏＣＡＲ－αＣＤ４０ Ｔ細胞のサイトカイン分泌量は、ｍｅｓｏＣＡＲ Ｔ細胞単独でのサイトカイン分泌量と有意差がなかった。
【0145】
実施例１０：ｍｅｓｏＣＡＲおよびｍｅｓｏＣＡＲ－αＣＤ４０ Ｔ細胞増殖アッセイ
実施例２で８日目に培養したｍｅｓｏＣＡＲ、ｍｅｓｏＣＡＲ－αＣＤ４０ Ｔ細胞およびＭｏｃｋ Ｔ細胞をそれぞれ３×１０５個取り、１２ウェルプレートに置いて、いずれも１ｍｌの培養体積で培養した。
２． 白色で非透光性の９６ウェルプレートを用意し、３群の細胞からそれぞれ細胞含有培養液を１００μＬ取って、異なるウェルに加えたと共に、細胞非含有培養液を取って、空白対照とした。次に、各ウェルに１００μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ試薬を加え、シェーカーで２分間均一に混合し、室温で１０分間インキュベートし、マイクロプレートリーダーでＬｕｃ蛍光値を読み取った。使用されたＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ発光細胞生存試験（Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ）キットはＰｒｏｍｅｇａ社から購入した。
３． 培養の９、１０、１１、１２、１３日目に、毎日１２ウェルプレートで培養された細胞からサンプリングし、上記の手順で検出し、蛍光値に基づいて細胞増殖曲線をプロットした。
結果は図６に示すように、ｍｅｓｏＣＡＲ－αＣＤ４０ Ｔ細胞はｍｅｓｏＣＡＲ Ｔ細胞よりも良好な増殖効果を有した。
実施例２で８日目に培養したｍｅｓｏＣＡＲ、ｍｅｓｏＣＡＲ－αＣＤ４０ Ｔ細胞およびＭｏｃｋ Ｔ細胞をそれぞれ３×１０５個取り、１２ウェルプレートに置いて、いずれも１ｍｌの培養体積で培養した。
２． 白色で非透光性の９６ウェルプレートを用意し、３群の細胞からそれぞれ細胞含有培養液を１００μＬ取って、異なるウェルに加えたと共に、細胞非含有培養液を取って、空白対照とした。次に、各ウェルに１００μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ試薬を加え、シェーカーで２分間均一に混合し、室温で１０分間インキュベートし、マイクロプレートリーダーでＬｕｃ蛍光値を読み取った。使用されたＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ発光細胞生存試験（Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ）キットはＰｒｏｍｅｇａ社から購入した。
３． 培養の９、１０、１１、１２、１３日目に、毎日１２ウェルプレートで培養された細胞からサンプリングし、上記の手順で検出し、蛍光値に基づいて細胞増殖曲線をプロットした。
結果は図６に示すように、ｍｅｓｏＣＡＲ－αＣＤ４０ Ｔ細胞はｍｅｓｏＣＡＲ Ｔ細胞よりも良好な増殖効果を有した。
【0146】
実施例１１：卵巣癌マウス異種移植片モデルに対するｍｅｓｏＣＡＲおよびｍｅｓｏＣＡＲ－αＣＤ４０ Ｔ細胞の治療効果
１：Ｂｉｏｓａｆｅｔｙ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社より提供され、ＳＰＦレベルの動物実験室で飼育された４～６週齢の平均体重２２～２７ｇの２０匹のＮＳＧ完全免疫不全マウスが使用された。
２：ヒト卵巣癌細胞ＳＫ－ＯＶ－３－ｌｕｃをインビトロで培養し、対数増殖期にある付着増殖細胞を取り、０．２５％トリプシンで消化し、遠心して細胞を収集した後、ＰＢＳで再懸濁し、１０００ｒｍｐで室温で２分間遠心し、上澄を捨て、もう一回ＰＢＳ液で再懸濁した後、遠心で細胞を収集し、細胞懸濁液の濃度を５×１０７個／ｍｌに調整した。
３：ＯＶＣＡＲ－３－ｌｕｃ細胞をマウスの右側のリブ裏側に０．１ｍｌ／匹で皮下接種した。接種後７日で、蛍光強度をインビボイメージャーで観察し、且つ腫瘍のサイズをノギスで計測することにより、ＮＳＧ免疫不全マウスを無作為に、それぞれＰＢＳ群および実施例２で得られたＭｏｃｋ Ｔ群、ｍｅｓｏＣＡＲ Ｔ群、ｍｅｓｏＣＡＲ－αＣＤ４０－ｗｔ Ｔ群、ｍｅｓｏＣＡＲ－αＣＤ４０ Ｔ群という５つの群に分けることができた。各群に相応のＴ細胞を１×１０７個／１００ｕｌで注射し、ＰＢＳ群に１００ｕｌのＰＢＳを投与し、投与経路は尾静脈注射であった。
４：毎日マウスの生存状態を観察し、且つ４日おきにインビボイメージャーでマウス腫瘍の変化を観察した。
結果は図７に示す。
１：Ｂｉｏｓａｆｅｔｙ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社より提供され、ＳＰＦレベルの動物実験室で飼育された４～６週齢の平均体重２２～２７ｇの２０匹のＮＳＧ完全免疫不全マウスが使用された。
２：ヒト卵巣癌細胞ＳＫ－ＯＶ－３－ｌｕｃをインビトロで培養し、対数増殖期にある付着増殖細胞を取り、０．２５％トリプシンで消化し、遠心して細胞を収集した後、ＰＢＳで再懸濁し、１０００ｒｍｐで室温で２分間遠心し、上澄を捨て、もう一回ＰＢＳ液で再懸濁した後、遠心で細胞を収集し、細胞懸濁液の濃度を５×１０７個／ｍｌに調整した。
３：ＯＶＣＡＲ－３－ｌｕｃ細胞をマウスの右側のリブ裏側に０．１ｍｌ／匹で皮下接種した。接種後７日で、蛍光強度をインビボイメージャーで観察し、且つ腫瘍のサイズをノギスで計測することにより、ＮＳＧ免疫不全マウスを無作為に、それぞれＰＢＳ群および実施例２で得られたＭｏｃｋ Ｔ群、ｍｅｓｏＣＡＲ Ｔ群、ｍｅｓｏＣＡＲ－αＣＤ４０－ｗｔ Ｔ群、ｍｅｓｏＣＡＲ－αＣＤ４０ Ｔ群という５つの群に分けることができた。各群に相応のＴ細胞を１×１０７個／１００ｕｌで注射し、ＰＢＳ群に１００ｕｌのＰＢＳを投与し、投与経路は尾静脈注射であった。
４：毎日マウスの生存状態を観察し、且つ４日おきにインビボイメージャーでマウス腫瘍の変化を観察した。
結果は図７に示す。
【0147】
実施例１２：ＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺとＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ－αＣＤ４０ Ｔ細胞の増殖速度の対比
実施例２で８日目に培養したＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ Ｔ細胞、ＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ－αＣＤ４０ Ｔ細胞およびＭｏｃｋ Ｔ細胞をそれぞれ３×１０５個取り、１２ウェルプレートに置いて、いずれも１ｍｌの培養体積で培養した。白色で非透光性の９６ウェルプレートを用意し、３群の細胞からそれぞれ細胞含有培養液を８０μＬ取って、異なるウェルに加えたと共に、８０μＬの栄養液を元の１２ウェルプレートに追加した。次に、９６ウェルプレートに８０μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ試薬を加え、シェーカーで２分間均一に混合し、室温で１０分間インキュベートし、マイクロプレートリーダーでＬｕｃ蛍光値を読み取った。使用されたＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ発光細胞生存試験（Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ）キットはＰｒｏｍｅｇａ社から購入した。培養の９、１０、１１、１２、１３日目に、毎日１
２ウェルプレートで培養された細胞からサンプリングし、上記の手順で検出し、蛍光値に基づいて細胞増殖曲線をプロットした。
結果は図８に示すように、ＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ－αＣＤ４０ Ｔ細胞の増殖速度はＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ Ｔ細胞よりも有意に早いことから、ＣＤ４０抗体の発現はＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖を促進できることが分かった。
実施例２で８日目に培養したＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ Ｔ細胞、ＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ－αＣＤ４０ Ｔ細胞およびＭｏｃｋ Ｔ細胞をそれぞれ３×１０５個取り、１２ウェルプレートに置いて、いずれも１ｍｌの培養体積で培養した。白色で非透光性の９６ウェルプレートを用意し、３群の細胞からそれぞれ細胞含有培養液を８０μＬ取って、異なるウェルに加えたと共に、８０μＬの栄養液を元の１２ウェルプレートに追加した。次に、９６ウェルプレートに８０μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ試薬を加え、シェーカーで２分間均一に混合し、室温で１０分間インキュベートし、マイクロプレートリーダーでＬｕｃ蛍光値を読み取った。使用されたＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ発光細胞生存試験（Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ）キットはＰｒｏｍｅｇａ社から購入した。培養の９、１０、１１、１２、１３日目に、毎日１
２ウェルプレートで培養された細胞からサンプリングし、上記の手順で検出し、蛍光値に基づいて細胞増殖曲線をプロットした。
結果は図８に示すように、ＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ－αＣＤ４０ Ｔ細胞の増殖速度はＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ Ｔ細胞よりも有意に早いことから、ＣＤ４０抗体の発現はＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖を促進できることが分かった。
【0148】
実施例１３：ＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺとＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ－αＣＤ４０ Ｔ細胞の細胞表現型測定・解析
実施例２で得られた２種類のＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺおよびＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ－αＣＤ４０ Ｔ細胞を収集し、数をカウントした後、それぞれ１×１０６個の細胞／チューブで６本の１．５ｍｌ ＥＰチューブに入れ、ＰＢＳで２回洗浄し、１２００ｒｐｍで５分間遠心し、上澄を捨てた；そのうち、２本のチューブにはそれぞれ、活性化Ｔ細胞の表現型を検出するためのフローサイトメトリー用抗体である抗ＣＤ１０７α－ＰＥおよび抗ＣＤ６９－ＰＥが添加され、１本のチューブには、メモリーＴ細胞の表現型を検出するためのフローサイトメトリー用抗体である抗ＣＤ４５ＲＯ－ＰＥＣｙ５＋抗ＣＤ１９７－ＦＩＴＣ＋抗ＣＤ６２Ｌ－ＰＥが添加され、１本のチューブには、サプレッサーＴ細胞の表現型を検出するためのフローサイトメトリー用抗体である抗ＰＤ１－ＰＥが添加され、残りの２本のチューブにはそれぞれ、アイソタイプコントロールフローサイトメトリー用抗体であるＩｇＧ１－ＰＥおよびＩｇＧ１－ＰＥ＋ＩｇＧ２ａ－ＰＥＣｙ５＋ＩｇＧ２ａ－ＰＥが添加され、各抗体（いずれもＪａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈから購入）は２μｌ添加された；沈殿物を軽くフリックして均一に混合させた；室温で遮光で３０分間インキュベートした後、ＰＢＳで１回洗浄し、１２００ｒｐｍで５分間遠心し、上澄を捨て、４００μｌの生理食塩水を加え、細胞をフローサイトメトリー用チューブに移し、機器で検出した。
実験結果からみれば、フローサイトメトリー検出により、ＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺおよびＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ－αＣＤ４０ Ｔ細胞の老化表現型ＰＤ１の発現量は殆ど同様である（図９Ａ）；ＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ－αＣＤ４０ Ｔ細胞の活性化表現型ＣＤ６９とＣＤ１０７αの発現量は、ＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ細胞よりも高い（図９Ｂおよび９Ｃ）；同時に、ＣＤ６２Ｌ（Ｌ－セレクチン）はセントラルメモリーＴ細胞のマーカーであり、ＣＤ１９７はエフェクターメモリーＴ細胞のマーカーであり、ＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ－αＣＤ４０ Ｔ細胞におけるエフェクターＴ細胞の割合は、ＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ細胞およびＭｏｃｋ－Ｔ細胞よりも有意に高かった（図９Ｄ）。これらの結果から、ＣＤ４０抗体の発現はＣＡＲ－Ｔ細胞の活性化を促進し、その免疫殺傷機能を増強できることが分かった。
実施例２で得られた２種類のＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺおよびＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ－αＣＤ４０ Ｔ細胞を収集し、数をカウントした後、それぞれ１×１０６個の細胞／チューブで６本の１．５ｍｌ ＥＰチューブに入れ、ＰＢＳで２回洗浄し、１２００ｒｐｍで５分間遠心し、上澄を捨てた；そのうち、２本のチューブにはそれぞれ、活性化Ｔ細胞の表現型を検出するためのフローサイトメトリー用抗体である抗ＣＤ１０７α－ＰＥおよび抗ＣＤ６９－ＰＥが添加され、１本のチューブには、メモリーＴ細胞の表現型を検出するためのフローサイトメトリー用抗体である抗ＣＤ４５ＲＯ－ＰＥＣｙ５＋抗ＣＤ１９７－ＦＩＴＣ＋抗ＣＤ６２Ｌ－ＰＥが添加され、１本のチューブには、サプレッサーＴ細胞の表現型を検出するためのフローサイトメトリー用抗体である抗ＰＤ１－ＰＥが添加され、残りの２本のチューブにはそれぞれ、アイソタイプコントロールフローサイトメトリー用抗体であるＩｇＧ１－ＰＥおよびＩｇＧ１－ＰＥ＋ＩｇＧ２ａ－ＰＥＣｙ５＋ＩｇＧ２ａ－ＰＥが添加され、各抗体（いずれもＪａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈから購入）は２μｌ添加された；沈殿物を軽くフリックして均一に混合させた；室温で遮光で３０分間インキュベートした後、ＰＢＳで１回洗浄し、１２００ｒｐｍで５分間遠心し、上澄を捨て、４００μｌの生理食塩水を加え、細胞をフローサイトメトリー用チューブに移し、機器で検出した。
実験結果からみれば、フローサイトメトリー検出により、ＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺおよびＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ－αＣＤ４０ Ｔ細胞の老化表現型ＰＤ１の発現量は殆ど同様である（図９Ａ）；ＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ－αＣＤ４０ Ｔ細胞の活性化表現型ＣＤ６９とＣＤ１０７αの発現量は、ＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ細胞よりも高い（図９Ｂおよび９Ｃ）；同時に、ＣＤ６２Ｌ（Ｌ－セレクチン）はセントラルメモリーＴ細胞のマーカーであり、ＣＤ１９７はエフェクターメモリーＴ細胞のマーカーであり、ＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ－αＣＤ４０ Ｔ細胞におけるエフェクターＴ細胞の割合は、ＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ細胞およびＭｏｃｋ－Ｔ細胞よりも有意に高かった（図９Ｄ）。これらの結果から、ＣＤ４０抗体の発現はＣＡＲ－Ｔ細胞の活性化を促進し、その免疫殺傷機能を増強できることが分かった。
【0149】
実施例１４：ＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺとＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ－αＣＤ４０ Ｔ細胞の殺傷機能の対比
ＭＨＣクラスＩタイピングが一致するエフェクター細胞とターゲット細胞を選択し、ＡＣＥＡ社のリアルタイムラベルフリー細胞機能アナライザー（ＲＴＣＡ）を用いて、実施例２得られた２種類のＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ Ｔ細胞とＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ－αＣＤ４０ Ｔ細胞のインビトロ殺傷活性を検出し、具体的な手順は以下のようであった：
（１）ゼロ調整：各ウェルに５０μｌのＤＭＥＭまたは１６４０培地を加え、機器に入れ、ステップ１を選択し、ゼロを調整した；
（２）標的細胞プレーティング：ヒト肝癌細胞ＨＣＣＬＭ３、ヒト肺変性癌細胞Ｃａｌｕ－６およびヒト非小細胞肺癌Ｈ２３（アメリカ菌株保存機関ＡＴＣＣから購入）を、検出電極を備えたプレートに１ウェルあたり１０４個の細胞／５０μｌでプレーティングし、数分間放置し、細胞が安定になったら機器に入れ、ステップ２を開始し、細胞を培養した；
（３）エフェクター細胞の添加：ターゲット細胞を２４時間培養した後、ステップ２を
一時停止し、エフェクター細胞を５０μｌ／ウェル加え、エフェクター／ターゲット比を４：１に設定し、ｐＮＢ３２８空ベクターが導入されたＭｏｃｋ Ｔ細胞を対照として、ステップ３を開始し、共培養を２４時間継続した後、細胞増殖曲線を観察した；
結果は図１０に示す。ＣＤ４０抗体を自己発現するＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ－αＣＤ４０ Ｔ細胞の多種の腫瘍細胞に対する殺傷効果は、ＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ
Ｔ細胞および対照Ｔ細胞よりも有意に高かった。
ＭＨＣクラスＩタイピングが一致するエフェクター細胞とターゲット細胞を選択し、ＡＣＥＡ社のリアルタイムラベルフリー細胞機能アナライザー（ＲＴＣＡ）を用いて、実施例２得られた２種類のＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ Ｔ細胞とＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ－αＣＤ４０ Ｔ細胞のインビトロ殺傷活性を検出し、具体的な手順は以下のようであった：
（１）ゼロ調整：各ウェルに５０μｌのＤＭＥＭまたは１６４０培地を加え、機器に入れ、ステップ１を選択し、ゼロを調整した；
（２）標的細胞プレーティング：ヒト肝癌細胞ＨＣＣＬＭ３、ヒト肺変性癌細胞Ｃａｌｕ－６およびヒト非小細胞肺癌Ｈ２３（アメリカ菌株保存機関ＡＴＣＣから購入）を、検出電極を備えたプレートに１ウェルあたり１０４個の細胞／５０μｌでプレーティングし、数分間放置し、細胞が安定になったら機器に入れ、ステップ２を開始し、細胞を培養した；
（３）エフェクター細胞の添加：ターゲット細胞を２４時間培養した後、ステップ２を
一時停止し、エフェクター細胞を５０μｌ／ウェル加え、エフェクター／ターゲット比を４：１に設定し、ｐＮＢ３２８空ベクターが導入されたＭｏｃｋ Ｔ細胞を対照として、ステップ３を開始し、共培養を２４時間継続した後、細胞増殖曲線を観察した；
結果は図１０に示す。ＣＤ４０抗体を自己発現するＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ－αＣＤ４０ Ｔ細胞の多種の腫瘍細胞に対する殺傷効果は、ＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ
Ｔ細胞および対照Ｔ細胞よりも有意に高かった。
【0150】
実施例１５：ＥＧＦＲ抗原による特異的刺激下でのＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ Ｔ細胞とＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ－αＣＤ４０ Ｔ細胞のサイトカイン放出の対比
９６ウェルプレートを５ｕｇ／ｍｌのＥＧＦＲ抗原で４℃で一晩コーティングし、ＰＢＳで３回洗浄し、実施例２で得られたＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺとＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ－αＣＤ４０ Ｔ細胞および対照としての（ｐＮＢ３２８空ベクターが導入された）Ｍｏｃｋ Ｔ細胞を１×１０５個（１００ｕｌ体積）加え、２４時間培養した後、細胞上澄を収集した。これらの３種類のＴ細胞がＥＧＦＲ抗原による刺激を受けた後のサイトカインの分泌状況を検出した。
結果は図１１に示すように、ＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ－αＣＤ４０のＩＬ－２およびＩＦＮ－γ分泌量はＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ Ｔ細胞およびＭｏｃｋ－Ｔよりも有意に高いことから、ＣＤ４０アゴニスト抗体の自己発現はＣＡＲ－Ｔ細胞からのサイトカインの分泌を促進できることが分かった。
９６ウェルプレートを５ｕｇ／ｍｌのＥＧＦＲ抗原で４℃で一晩コーティングし、ＰＢＳで３回洗浄し、実施例２で得られたＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺとＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ－αＣＤ４０ Ｔ細胞および対照としての（ｐＮＢ３２８空ベクターが導入された）Ｍｏｃｋ Ｔ細胞を１×１０５個（１００ｕｌ体積）加え、２４時間培養した後、細胞上澄を収集した。これらの３種類のＴ細胞がＥＧＦＲ抗原による刺激を受けた後のサイトカインの分泌状況を検出した。
結果は図１１に示すように、ＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ－αＣＤ４０のＩＬ－２およびＩＦＮ－γ分泌量はＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ Ｔ細胞およびＭｏｃｋ－Ｔよりも有意に高いことから、ＣＤ４０アゴニスト抗体の自己発現はＣＡＲ－Ｔ細胞からのサイトカインの分泌を促進できることが分かった。
【0151】
実施例１６：ＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ Ｔ細胞、ＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ－αＣＤ４０－ｗｔ Ｔ細胞およびＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ－αＣＤ４０ Ｔ細胞のインビボ抗腫瘍効果
４～６週齢のＮＳＧマウスを２０匹購入し、１群につき４匹で、５つの群に平均に分け、肝癌細胞株ＨＣＣＬＭ３－ＬＵＣを１×１０７個／匹で接種し、腫瘍形成後１０日で、それぞれＰＢＳ、実施例２で得られたＭｏｃｋ－Ｔ、ＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ Ｔ細胞、ＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ－αＣＤ４０ Ｔ細胞、およびＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ－αＣＤ４０－ｗｔ Ｔ細胞を尾静脈注射し、各群に相応のＴ細胞を１×１０７個／１００ｕｌで注射し、ＰＢＳ群に１００ｕｌのＰＢＳを投与した。マウス生体内の腫瘍蛍光の変化を観察して記録した。
結果から分かるように、ＰＢＳ、Ｍｏｃｋ－Ｔ、ＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ－αＣＤ４０－ｗｔ Ｔ細胞は腫瘍モデルに治療効果を有しないが、ＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ Ｔ細胞、ＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ－αＣＤ４０ Ｔ細胞は抗腫瘍効果を有し、ＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ－αＣＤ４０ Ｔ細胞の効果は有意に高かった。具体的には図１２に示す。
４～６週齢のＮＳＧマウスを２０匹購入し、１群につき４匹で、５つの群に平均に分け、肝癌細胞株ＨＣＣＬＭ３－ＬＵＣを１×１０７個／匹で接種し、腫瘍形成後１０日で、それぞれＰＢＳ、実施例２で得られたＭｏｃｋ－Ｔ、ＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ Ｔ細胞、ＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ－αＣＤ４０ Ｔ細胞、およびＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ－αＣＤ４０－ｗｔ Ｔ細胞を尾静脈注射し、各群に相応のＴ細胞を１×１０７個／１００ｕｌで注射し、ＰＢＳ群に１００ｕｌのＰＢＳを投与した。マウス生体内の腫瘍蛍光の変化を観察して記録した。
結果から分かるように、ＰＢＳ、Ｍｏｃｋ－Ｔ、ＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ－αＣＤ４０－ｗｔ Ｔ細胞は腫瘍モデルに治療効果を有しないが、ＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ Ｔ細胞、ＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ－αＣＤ４０ Ｔ細胞は抗腫瘍効果を有し、ＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ－αＣＤ４０ Ｔ細胞の効果は有意に高かった。具体的には図１２に示す。
【0152】
実施例１７：Ｍｕｃ１ＣＡＲ ＴとＭｕｃ１ＣＡＲ－αＣＤ４０ Ｔ細胞の増殖速度の対比
実施例２で８日目に培養したＭｕｃ１ＣＡＲ Ｔ細胞、Ｍｕｃ１ＣＡＲ－αＣＤ４０ Ｔ細胞およびＭｏｃｋ Ｔ細胞の数をカウントし、それぞれ３×１０５個の細胞を取り、１２ウェルプレートに置いて、いずれも１ｍｌの培養体積で培養した。白色で非透光性の９６ウェルプレートを用意し、３群の細胞からそれぞれ細胞含有培養液を８０μＬ取って、異なるウェルに加えたと共に、８０μＬの栄養液を元の１２ウェルプレートに追加した。次に、９６ウェルプレートに８０μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ試薬を加え、シェーカーで２分間均一に混合し、室温で１０分間インキュベートし、マイクロプレートリーダーでＬｕｃ蛍光値を読み取った。使用されたＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ発光細胞生存試験（Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ）キットはＰｒｏｍｅｇａ社から購入した。培養の９、１０、１１、１２、１３日目に、毎日１２ウェルプレートで培養された細胞からサンプリングし、上記の手順で検出し、蛍光値に基づいて細胞増殖曲線をプロットした。
結果は図１３に示すように、Ｍｕｃ１ＣＡＲ－αＣＤ４０ Ｔ細胞の増殖速度はＭｕｃ１ＣＡＲ Ｔ細胞よりも有意に早いことから、ＣＤ４０抗体の発現はＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖を促進できることが分かった。
実施例２で８日目に培養したＭｕｃ１ＣＡＲ Ｔ細胞、Ｍｕｃ１ＣＡＲ－αＣＤ４０ Ｔ細胞およびＭｏｃｋ Ｔ細胞の数をカウントし、それぞれ３×１０５個の細胞を取り、１２ウェルプレートに置いて、いずれも１ｍｌの培養体積で培養した。白色で非透光性の９６ウェルプレートを用意し、３群の細胞からそれぞれ細胞含有培養液を８０μＬ取って、異なるウェルに加えたと共に、８０μＬの栄養液を元の１２ウェルプレートに追加した。次に、９６ウェルプレートに８０μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ試薬を加え、シェーカーで２分間均一に混合し、室温で１０分間インキュベートし、マイクロプレートリーダーでＬｕｃ蛍光値を読み取った。使用されたＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ発光細胞生存試験（Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ）キットはＰｒｏｍｅｇａ社から購入した。培養の９、１０、１１、１２、１３日目に、毎日１２ウェルプレートで培養された細胞からサンプリングし、上記の手順で検出し、蛍光値に基づいて細胞増殖曲線をプロットした。
結果は図１３に示すように、Ｍｕｃ１ＣＡＲ－αＣＤ４０ Ｔ細胞の増殖速度はＭｕｃ１ＣＡＲ Ｔ細胞よりも有意に早いことから、ＣＤ４０抗体の発現はＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖を促進できることが分かった。
【0153】
実施例１８：Ｍｕｃ１ＣＡＲ ＴとＭｕｃ１ＣＡＲ－αＣＤ４０ Ｔ細胞の細胞表現型測定・解析
実施例２で得られた２種類のＭｕｃ１ＣＡＲ Ｔ細胞およびＭｕｃ１ＣＡＲ－αＣＤ４０ Ｔ細胞を収集し、数をカウントした後、それぞれ１×１０６個の細胞／チューブで７本の１．５ｍｌ ＥＰチューブに入れ、ＰＢＳで２回洗浄し、１２００ｒｐｍで５分間遠心し、上澄を捨てた；そのうち、１本のチューブには、活性化Ｔ細胞の表現型を検出するためのフローサイトメトリー用抗体である抗ＣＤ２５－ＰＥが添加され、１本のチューブには、メモリーＴ細胞の表現型を検出するためのフローサイトメトリー用抗体である抗ＣＤ４５ＲＯ－ＰＥＣｙ５＋抗ＣＤ１９７－ＦＩＴＣ＋抗ＣＤ６２Ｌ－ＰＥが添加され、２本のチューブにはそれぞれ、サプレッサーＴ細胞の表現型を検出するためのフローサイトメトリー用抗体である抗ＰＤ１－ＰＥおよび抗ＬＡＧ３－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７が添加され、残りの３本のチューブにはそれぞれ、アイソタイプコントロールフローサイトメトリー用抗体であるＩｇＧ１－ＰＥ、ＩｇＧ１－ＰＥ＋ＩｇＧ２ａ－ＰＥＣｙ５＋ＩｇＧ２ａ－ＰＥおよびＩｇＧ１ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７が添加され、各抗体（いずれもＪａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈから購入）は２μｌ添加された；沈殿物を軽くフリックして均一に混合させた；室温で遮光で３０分間インキュベートした後、ＰＢＳで１回洗浄し、１２００ｒｐｍで５分間遠心し、上澄を捨て、４００μｌの生理食塩水を加え、細胞をフローサイトメトリー用チューブに移し、機器で検出した。
実験結果からみれば、フローサイトメトリー検出により、Ｍｕｃ１ＣＡＲ－αＣＤ４０
Ｔ細胞の老化表現型ＰＤ１およびＬＡＧ３の発現量はいずれもＭｕｃ１ＣＡＲ Ｔ細胞よりも低く、活性化表現型ＣＤ２５の発現量はＭｕｃ１ＣＡＲ Ｔ細胞よりも高い（図１４Ａ）；同時に、ＣＤ６２Ｌ（Ｌ－セレクチン）はセントラルメモリーＴ細胞のマーカーであり、ＣＤ１９７はエフェクターメモリーＴ細胞のマーカーであり、Ｍｕｃ１ＣＡＲ－αＣＤ４０ Ｔ細胞におけるエフェクターＴ細胞の割合は、Ｍｕｃ１ＣＡＲ Ｔ細胞およびＭｏｃｋ－Ｔ細胞よりも有意に高かった（図１４Ｂ）。これらの結果から、ＣＤ４０抗体の発現はＣＡＲ－Ｔ細胞の活性化を促進し、その免疫殺傷機能を増強できることが分かった。
実施例２で得られた２種類のＭｕｃ１ＣＡＲ Ｔ細胞およびＭｕｃ１ＣＡＲ－αＣＤ４０ Ｔ細胞を収集し、数をカウントした後、それぞれ１×１０６個の細胞／チューブで７本の１．５ｍｌ ＥＰチューブに入れ、ＰＢＳで２回洗浄し、１２００ｒｐｍで５分間遠心し、上澄を捨てた；そのうち、１本のチューブには、活性化Ｔ細胞の表現型を検出するためのフローサイトメトリー用抗体である抗ＣＤ２５－ＰＥが添加され、１本のチューブには、メモリーＴ細胞の表現型を検出するためのフローサイトメトリー用抗体である抗ＣＤ４５ＲＯ－ＰＥＣｙ５＋抗ＣＤ１９７－ＦＩＴＣ＋抗ＣＤ６２Ｌ－ＰＥが添加され、２本のチューブにはそれぞれ、サプレッサーＴ細胞の表現型を検出するためのフローサイトメトリー用抗体である抗ＰＤ１－ＰＥおよび抗ＬＡＧ３－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７が添加され、残りの３本のチューブにはそれぞれ、アイソタイプコントロールフローサイトメトリー用抗体であるＩｇＧ１－ＰＥ、ＩｇＧ１－ＰＥ＋ＩｇＧ２ａ－ＰＥＣｙ５＋ＩｇＧ２ａ－ＰＥおよびＩｇＧ１ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７が添加され、各抗体（いずれもＪａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈから購入）は２μｌ添加された；沈殿物を軽くフリックして均一に混合させた；室温で遮光で３０分間インキュベートした後、ＰＢＳで１回洗浄し、１２００ｒｐｍで５分間遠心し、上澄を捨て、４００μｌの生理食塩水を加え、細胞をフローサイトメトリー用チューブに移し、機器で検出した。
実験結果からみれば、フローサイトメトリー検出により、Ｍｕｃ１ＣＡＲ－αＣＤ４０
Ｔ細胞の老化表現型ＰＤ１およびＬＡＧ３の発現量はいずれもＭｕｃ１ＣＡＲ Ｔ細胞よりも低く、活性化表現型ＣＤ２５の発現量はＭｕｃ１ＣＡＲ Ｔ細胞よりも高い（図１４Ａ）；同時に、ＣＤ６２Ｌ（Ｌ－セレクチン）はセントラルメモリーＴ細胞のマーカーであり、ＣＤ１９７はエフェクターメモリーＴ細胞のマーカーであり、Ｍｕｃ１ＣＡＲ－αＣＤ４０ Ｔ細胞におけるエフェクターＴ細胞の割合は、Ｍｕｃ１ＣＡＲ Ｔ細胞およびＭｏｃｋ－Ｔ細胞よりも有意に高かった（図１４Ｂ）。これらの結果から、ＣＤ４０抗体の発現はＣＡＲ－Ｔ細胞の活性化を促進し、その免疫殺傷機能を増強できることが分かった。
【0154】
実施例１９：Ｍｕｃ１ＣＡＲ ＴとＭｕｃ１ＣＡＲ－αＣＤ４０ Ｔ細胞の殺傷機能の対比
ＭＨＣクラスＩタイピングが一致するエフェクター細胞とターゲット細胞を選択し、ＡＣＥＡ社のリアルタイムラベルフリー細胞機能アナライザー（ＲＴＣＡ）を用いて、実施例２得られた２種類のＭｕｃ１ＣＡＲ Ｔ細胞とＭｕｃ１ＣＡＲ－αＣＤ４０ Ｔ細胞のインビトロ殺傷活性を検出し、具体的な手順は以下のようであった：
（１）ゼロ調整：各ウェルに５０μｌのＤＭＥＭまたは１６４０培地を加え、機器に入れ、ステップ１を選択し、ゼロを調整した；
（２）標的細胞プレーティング：ヒト肝癌細胞ＨＣＣＬＭ３およびヒト非小細胞肺癌Ｈ２３（アメリカ菌株保存機関ＡＴＣＣから購入）を、検出電極を備えたプレートに１ウェルあたり１０４個の細胞／５０μｌでプレーティングし、数分間放置し、細胞が安定になったら機器に入れ、ステップ２を開始し、細胞を培養した；
（３）エフェクター細胞の添加：ターゲット細胞を２４時間培養した後、ステップ２を一時停止し、エフェクター細胞を５０μｌ／ウェル加え、エフェクター／ターゲット比を４：１に設定し、ｐＮＢ３２８空ベクターが導入されたＭｏｃｋ Ｔ細胞を対照として、ステップ３を開始し、共培養を２４時間継続した後、細胞増殖曲線を観察した。
結果は図１５に示す。ＣＤ４０抗体を自己発現するＭｕｃ１ＣＡＲ－αＣＤ４０
Ｔ細胞の多種の腫瘍細胞に対する殺傷効果は、Ｍｕｃ１ＣＡＲ Ｔ細胞および対照Ｔ細
胞よりも有意に高かった。
ＭＨＣクラスＩタイピングが一致するエフェクター細胞とターゲット細胞を選択し、ＡＣＥＡ社のリアルタイムラベルフリー細胞機能アナライザー（ＲＴＣＡ）を用いて、実施例２得られた２種類のＭｕｃ１ＣＡＲ Ｔ細胞とＭｕｃ１ＣＡＲ－αＣＤ４０ Ｔ細胞のインビトロ殺傷活性を検出し、具体的な手順は以下のようであった：
（１）ゼロ調整：各ウェルに５０μｌのＤＭＥＭまたは１６４０培地を加え、機器に入れ、ステップ１を選択し、ゼロを調整した；
（２）標的細胞プレーティング：ヒト肝癌細胞ＨＣＣＬＭ３およびヒト非小細胞肺癌Ｈ２３（アメリカ菌株保存機関ＡＴＣＣから購入）を、検出電極を備えたプレートに１ウェルあたり１０４個の細胞／５０μｌでプレーティングし、数分間放置し、細胞が安定になったら機器に入れ、ステップ２を開始し、細胞を培養した；
（３）エフェクター細胞の添加：ターゲット細胞を２４時間培養した後、ステップ２を一時停止し、エフェクター細胞を５０μｌ／ウェル加え、エフェクター／ターゲット比を４：１に設定し、ｐＮＢ３２８空ベクターが導入されたＭｏｃｋ Ｔ細胞を対照として、ステップ３を開始し、共培養を２４時間継続した後、細胞増殖曲線を観察した。
結果は図１５に示す。ＣＤ４０抗体を自己発現するＭｕｃ１ＣＡＲ－αＣＤ４０
Ｔ細胞の多種の腫瘍細胞に対する殺傷効果は、Ｍｕｃ１ＣＡＲ Ｔ細胞および対照Ｔ細
胞よりも有意に高かった。
【0155】
実施例２０：Ｍｕｃ１抗原による特異的刺激下でのＭｕｃ１ＣＡＲ ＴとＭｕｃ１ＣＡＲ－αＣＤ４０ Ｔ細胞のサイトカイン放出の対比
９６ウェルプレートを５ｕｇ／ｍｌのＭｕｃ１抗原で４℃で一晩コーティングし、ＰＢＳで３回洗浄し、実施例２で得られたＭｕｃ１ＣＡＲ Ｔ細胞とＭｕｃ１ＣＡＲ－αＣＤ４０ Ｔ細胞および対照としての（ｐＮＢ３２８空ベクターが導入された）Ｍｏｃｋ Ｔ細胞を１×１０５個（１００ｕｌ体積）加え、２４時間培養した後、細胞上澄を収集した。これらの３種類のＴ細胞がＭｕｃ１抗原による刺激を受けた後のサイトカインの分泌状況を検出した。
結果は図１６に示すように、Ｍｕｃ１ＣＡＲ－αＣＤ４０ Ｔ細胞のＩＬ－２、ＴＮＦαおよびＩＦＮ－γ分泌量はＭｕｃ１ＣＡＲ Ｔ細胞およびＭｏｃｋ－Ｔよりも有意に高いことから、ＣＤ４０アゴニスト抗体の自己発現はＣＡＲ－Ｔ細胞からのサイトカインの分泌を促進できることが分かった。
９６ウェルプレートを５ｕｇ／ｍｌのＭｕｃ１抗原で４℃で一晩コーティングし、ＰＢＳで３回洗浄し、実施例２で得られたＭｕｃ１ＣＡＲ Ｔ細胞とＭｕｃ１ＣＡＲ－αＣＤ４０ Ｔ細胞および対照としての（ｐＮＢ３２８空ベクターが導入された）Ｍｏｃｋ Ｔ細胞を１×１０５個（１００ｕｌ体積）加え、２４時間培養した後、細胞上澄を収集した。これらの３種類のＴ細胞がＭｕｃ１抗原による刺激を受けた後のサイトカインの分泌状況を検出した。
結果は図１６に示すように、Ｍｕｃ１ＣＡＲ－αＣＤ４０ Ｔ細胞のＩＬ－２、ＴＮＦαおよびＩＦＮ－γ分泌量はＭｕｃ１ＣＡＲ Ｔ細胞およびＭｏｃｋ－Ｔよりも有意に高いことから、ＣＤ４０アゴニスト抗体の自己発現はＣＡＲ－Ｔ細胞からのサイトカインの分泌を促進できることが分かった。
【0156】
実施例２１：Ｍｕｃ１ＣＡＲ－Ｔ、Ｍｕｃ１ＣＡＲ－αＣＤ４０－ｗｔ Ｔ細胞およびＭｕｃ１ＣＡＲ－αＣＤ４０ Ｔ細胞のインビボ抗腫瘍効果
４～６週齢のＮＳＧマウスを２０匹購入し、１群につき４匹で、５つの群に平均に分け、肝癌細胞株ＨＣＣＬＭ３－ＬＵＣを１×１０７個／匹で接種し、腫瘍形成後１０日で、それぞれＰＢＳ、実施例２で構築したＭｏｃｋ－Ｔ、Ｍｕｃ１ＣＡＲ－Ｔ、Ｍｕｃ１ＣＡＲ－αＣＤ４０ Ｔ細胞、およびＭｕｃ１ＣＡＲ－αＣＤ４０－ｗｔ Ｔ細胞を尾静脈注射し、各群に相応のＴ細胞を１×１０７個／１００ｕｌで注射し、ＰＢＳ群に１００ｕｌのＰＢＳを投与し、マウス生体内の腫瘍蛍光の変化を観察して記録した。
結果から分かるように、ＰＢＳ、Ｍｏｃｋ－Ｔ、Ｍｕｃ１ＣＡＲ－αＣＤ４０－ｗｔ Ｔ細胞は腫瘍モデルに治療効果を有しないが、Ｍｕｃ１ＣＡＲ－ＴおよびＭｕｃ１ＣＡＲ－αＣＤ４０ Ｔ細胞は抗腫瘍効果を有し、Ｍｕｃ１ＣＡＲ－αＣＤ４０ Ｔ細胞の効果は有意に高かった。具体的には図１７に示す。
４～６週齢のＮＳＧマウスを２０匹購入し、１群につき４匹で、５つの群に平均に分け、肝癌細胞株ＨＣＣＬＭ３－ＬＵＣを１×１０７個／匹で接種し、腫瘍形成後１０日で、それぞれＰＢＳ、実施例２で構築したＭｏｃｋ－Ｔ、Ｍｕｃ１ＣＡＲ－Ｔ、Ｍｕｃ１ＣＡＲ－αＣＤ４０ Ｔ細胞、およびＭｕｃ１ＣＡＲ－αＣＤ４０－ｗｔ Ｔ細胞を尾静脈注射し、各群に相応のＴ細胞を１×１０７個／１００ｕｌで注射し、ＰＢＳ群に１００ｕｌのＰＢＳを投与し、マウス生体内の腫瘍蛍光の変化を観察して記録した。
結果から分かるように、ＰＢＳ、Ｍｏｃｋ－Ｔ、Ｍｕｃ１ＣＡＲ－αＣＤ４０－ｗｔ Ｔ細胞は腫瘍モデルに治療効果を有しないが、Ｍｕｃ１ＣＡＲ－ＴおよびＭｕｃ１ＣＡＲ－αＣＤ４０ Ｔ細胞は抗腫瘍効果を有し、Ｍｕｃ１ＣＡＲ－αＣＤ４０ Ｔ細胞の効果は有意に高かった。具体的には図１７に示す。
【0157】
実施例２２：Ｍｏｃｋ Ｔ細胞、ＣＤ１９ＣＡＲ Ｔ細胞およびＣＤ１９ＣＡＲ－ａｎｔｉＰＤ１ Ｔ細胞のインビトロで培養腫瘍細胞に対する殺傷実験
ＭＨＣクラスＩタイピングが一致するエフェクター細胞とターゲット細胞を選択し、ＤＥＬＦＩＡ ＥｕＴＤＡ細胞傷害性試験によってＣＡＲ－Ｔ細胞のインビトロ殺傷活性を検出し、具体的な手順は以下のようであった：
（１）Ｒａｊｉ細胞を遠心で収集し、ＰＢＳで１回洗浄した；
（２）遠心で細胞沈殿物を収集し、１６４０培地で細胞を再懸濁し、数をカウントし、細胞密度を１×１０６／ｍｌに調整した；
（３）上記の細胞を２～４ｍｌ取り、５ｕｌの蛍光強化リガンドを加え、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターに２０分間置いた；
（４）ＰＢＳで細胞を３～５回洗浄した；
（５）遠心で細胞沈殿物を収集し、１６４０培地で細胞を再懸濁し、数をカウントし、細胞密度を５×１０４／ｍｌに調整し、細胞懸濁液を１００ｕｌ取って９６ウェルプレートに加えた；
（６）実施例２で構築したＭｏｃｋ Ｔ細胞、ＣＤ１９ＣＡＲ Ｔ細胞およびＣＤ１９ＣＡＲ－ａｎｔｉＰＤ１ Ｔ細胞をカウントし、異なるエフェクター／ターゲット比４：１で、細胞懸濁液を１００ｕｌ取って相応に上記Ｒａｊｉ細胞に加え、且つ高対照群（腫瘍細胞＋リシスバッファーによる溶解）、低対照群（腫瘍細胞のみを含む）、空白対照群（培地のみを含む）を設置した；
（７）３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターに２０分間置いて、３時間共培養した；
（８）２０ｕｌの培養上澄を９６ウェル空白プレートに移した；
（９）ユーロピウム溶液を２００ｕｌ加えた；
（１０）室温で振とうで１５分間均一に混合した；
（１１）マイクロプレートリーダーで時間分解蛍光検出により数値を読み取った；
結果は図１８に示すように、ＣＤ１９ＣＡＲ Ｔ細胞およびＣＤ１９ＣＡＲ－ａｎｔｉＰＤ１ Ｔ細胞は、腫瘍細胞に対して強い殺傷効果を有し、且つ殺傷効果は同等であった。
ＭＨＣクラスＩタイピングが一致するエフェクター細胞とターゲット細胞を選択し、ＤＥＬＦＩＡ ＥｕＴＤＡ細胞傷害性試験によってＣＡＲ－Ｔ細胞のインビトロ殺傷活性を検出し、具体的な手順は以下のようであった：
（１）Ｒａｊｉ細胞を遠心で収集し、ＰＢＳで１回洗浄した；
（２）遠心で細胞沈殿物を収集し、１６４０培地で細胞を再懸濁し、数をカウントし、細胞密度を１×１０６／ｍｌに調整した；
（３）上記の細胞を２～４ｍｌ取り、５ｕｌの蛍光強化リガンドを加え、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターに２０分間置いた；
（４）ＰＢＳで細胞を３～５回洗浄した；
（５）遠心で細胞沈殿物を収集し、１６４０培地で細胞を再懸濁し、数をカウントし、細胞密度を５×１０４／ｍｌに調整し、細胞懸濁液を１００ｕｌ取って９６ウェルプレートに加えた；
（６）実施例２で構築したＭｏｃｋ Ｔ細胞、ＣＤ１９ＣＡＲ Ｔ細胞およびＣＤ１９ＣＡＲ－ａｎｔｉＰＤ１ Ｔ細胞をカウントし、異なるエフェクター／ターゲット比４：１で、細胞懸濁液を１００ｕｌ取って相応に上記Ｒａｊｉ細胞に加え、且つ高対照群（腫瘍細胞＋リシスバッファーによる溶解）、低対照群（腫瘍細胞のみを含む）、空白対照群（培地のみを含む）を設置した；
（７）３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターに２０分間置いて、３時間共培養した；
（８）２０ｕｌの培養上澄を９６ウェル空白プレートに移した；
（９）ユーロピウム溶液を２００ｕｌ加えた；
（１０）室温で振とうで１５分間均一に混合した；
（１１）マイクロプレートリーダーで時間分解蛍光検出により数値を読み取った；
結果は図１８に示すように、ＣＤ１９ＣＡＲ Ｔ細胞およびＣＤ１９ＣＡＲ－ａｎｔｉＰＤ１ Ｔ細胞は、腫瘍細胞に対して強い殺傷効果を有し、且つ殺傷効果は同等であった。
【0158】
実施例２３：フローサイトメトリー検出によるＭｏｃｋ Ｔ細胞、ＣＤ１９ＣＡＲ Ｔ細胞およびＣＤ１９ＣＡＲ－ａｎｔｉＰＤ１ Ｔ細胞活性化表現型およびサイトカイン分泌の分別
１、実施例２で構築した懸濁のＭｏｃｋ Ｔ細胞、ＣＤ１９ＣＡＲ Ｔ細胞およびＣＤ１９ＣＡＲ－ａｎｔｉＰＤ１ Ｔ細胞を収集し、ＰＢＳで２回洗浄し、１２００ｒｐｍで５分間遠心し、アイソタイプコントロール抗体ＩｇＧ１－ＰＥ、蛍光フローサイトメトリー用抗体である抗ＣＤ６９－ＰＥ、抗ＫＬＲＧ１－ＰＥ、抗ＰＤ１－ＰＥ；アイソタイプコントロール抗体ＩｇＧ１－ＰＣ５、蛍光フローサイトメトリー用抗体である抗ＣＤ１０７－ＰＣ５；アイソタイプコントロール抗体ＩｇＧ１ ＦＩＴＣ、蛍光フローサイトメトリー用抗体である抗ＣＤ６２Ｌ－ＦＩＴＣ；アイソタイプコントロール抗体ＩｇＧ１－ＰＣ５、蛍光フローサイトメトリー用抗体である抗ＣＤ４５ＲＯ－ＰＣ５；アイソタイプコントロール抗体ＩｇＧ１－ＰＥ、蛍光フローサイトメトリー用抗体である抗ＣＣＲ７－ＰＥをそれぞれ２ｕｌ加えた。沈殿物を軽くフリックして均一に混合させ、室温で遮光で３０分間インキュベートした後、ＰＢＳで１回洗浄し、４００μｌのＰＢＳを加え、細胞をフローサイトメトリー用チューブに移し、機器で検出した。
結果は図１９（１枚目と２枚目の図）に示すように、ＣＤ１９ＣＡＲ－ａｎｔｉＰＤ１
Ｔ細胞が分泌するＰＤ－１一本鎖抗体は、Ｔ細胞表面のＰＤ－１タンパク質を良好にブロックことができ、且つＣＤ１９ＣＡＲ Ｔ細胞およびＣＤ１９ＣＡＲ－ａｎｔｉＰＤ１
Ｔ細胞はいずれも、インビトロで顕著な殺傷活性を有すると共に、メモリーＴの形成も促進でき、活性化標識ＣＤ６９はＭｏｃｋ Ｔ細胞よりも有意に高かったが、除去標識ＬＡＧ３はＭｏｃｋ Ｔ細胞よりも有意に低かった。
２、２４ウェルプレートを５ｕｇ／ｍｌのＣＤ１９抗原で４℃で一晩コーティングし、ＰＢＳで３回洗浄し、Ｍｏｃｋ Ｔ細胞、ＣＤ１９ＣＡＲ Ｔ細胞またはＣＤ１９ＣＡＲ－ａｎｔｉＰＤ１ Ｔ細胞を３×１０５個加え、２４時間培養した後、細胞上澄を収集した。ＢＤＴＭＣＢＡ Ｈｕｍａｎ Ｔｈ１／Ｔｈ２サイトカインキットＩＩにより、ＣＤ１９ＣＡＲ Ｔ細胞およびＣＤ１９ＣＡＲ－ａｎｔｉＰＤ１ Ｔ細胞がＣＤ１９抗原による刺激を受けた後のサイトカインの分泌状況を検出した：
（１）ヒトＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ捕捉磁気ビーズを混合し、渦励振盪で捕捉磁気ビーズを均一に混合し、チューブ毎に５０ｕｌの混合磁気ビーズを入れた；
（２）５０ｕｌのヒトＴｈ１／Ｔｈ２サイトカイン標準サンプル（倍加希釈５０００ｐｇ／ｍｌ、２５００ｐｇ／ｍｌ、１２５０ｐｇ／ｍｌ、６２５ｐｇ／ｍｌ、３１２．５ｐｇ／ｍｌ、１５６ｐｇ／ｍｌ、８０ｐｇ／ｍｌ、４０ｐｇ／ｍｌ、２０ｐｇ／ｍｌ、０ｐｇ／ｍｌ）および５０ｕｌの被験サンプル（希釈剤で２倍に希釈されたもの）を加えた；
（３）チューブ毎にヒトＴｈ１／Ｔｈ２－ＩＩ－ＰＥ検出抗体を５０ｕｌ加えた；
（４）室温で遮光で３時間インキュベートした；
（５）チューブ毎に洗浄緩衝液を１ｍｌ加え、２００で５分間遠心し、上澄を捨てた；
（６）チューブ毎に洗浄緩衝液を３００ｕｌ加えて細胞を再懸濁し、フローサイトメトリー用チューブに移し、フローサイトメーターで蛍光値を検出した；
結果は図１９（３枚目の図）に示すように、ＣＤ１９ＣＡＲ Ｔ細胞およびＣＤ１９ＣＡＲ－ａｎｔｉＰＤ１ Ｔ細胞が分泌したＩＬ－２、ＴＮＦ－αおよびＩＦＮ－γはＭｏｃｋ Ｔ細胞に比べて大幅に向上したが、３種類の細胞が分泌したＩＬ－４、ＩＬ－６およびＩＬ－１０は有意差がなかった。
３、ＣＤ１９ＣＡＲ Ｔ細胞およびＣＤ１９ＣＡＲ－ａｎｔｉＰＤ１ Ｔ細胞を１×１
０６個収集し、それぞれ１．５ｍｌ ＥＰチューブに入れ、ＰＢＳで２回洗浄し、１２００ｒｐｍで５分間遠心し、α－ＣＤ３ＣＤ４ＣＤ８抗体を２ｕｌ加え、室温で遮光で３０分間インキュベートし、ＰＢＳで１回洗浄し、４００ｕｌのＰＢＳを加え、細胞をフローサイトメトリー用チューブに移し、機器で検出した。
結果は図１９（４枚目の図）に示すように、ＣＤ１９ＣＡＲ Ｔ細胞、ＣＤ１９ＣＡＲ－ａｎｔｉＰＤ１ Ｔ細胞およびＭｏｃｋ ＴにおけるＣＤ３＋ＣＤ４＋、ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞が占める百分率は有意差がなかった。
１、実施例２で構築した懸濁のＭｏｃｋ Ｔ細胞、ＣＤ１９ＣＡＲ Ｔ細胞およびＣＤ１９ＣＡＲ－ａｎｔｉＰＤ１ Ｔ細胞を収集し、ＰＢＳで２回洗浄し、１２００ｒｐｍで５分間遠心し、アイソタイプコントロール抗体ＩｇＧ１－ＰＥ、蛍光フローサイトメトリー用抗体である抗ＣＤ６９－ＰＥ、抗ＫＬＲＧ１－ＰＥ、抗ＰＤ１－ＰＥ；アイソタイプコントロール抗体ＩｇＧ１－ＰＣ５、蛍光フローサイトメトリー用抗体である抗ＣＤ１０７－ＰＣ５；アイソタイプコントロール抗体ＩｇＧ１ ＦＩＴＣ、蛍光フローサイトメトリー用抗体である抗ＣＤ６２Ｌ－ＦＩＴＣ；アイソタイプコントロール抗体ＩｇＧ１－ＰＣ５、蛍光フローサイトメトリー用抗体である抗ＣＤ４５ＲＯ－ＰＣ５；アイソタイプコントロール抗体ＩｇＧ１－ＰＥ、蛍光フローサイトメトリー用抗体である抗ＣＣＲ７－ＰＥをそれぞれ２ｕｌ加えた。沈殿物を軽くフリックして均一に混合させ、室温で遮光で３０分間インキュベートした後、ＰＢＳで１回洗浄し、４００μｌのＰＢＳを加え、細胞をフローサイトメトリー用チューブに移し、機器で検出した。
結果は図１９（１枚目と２枚目の図）に示すように、ＣＤ１９ＣＡＲ－ａｎｔｉＰＤ１
Ｔ細胞が分泌するＰＤ－１一本鎖抗体は、Ｔ細胞表面のＰＤ－１タンパク質を良好にブロックことができ、且つＣＤ１９ＣＡＲ Ｔ細胞およびＣＤ１９ＣＡＲ－ａｎｔｉＰＤ１
Ｔ細胞はいずれも、インビトロで顕著な殺傷活性を有すると共に、メモリーＴの形成も促進でき、活性化標識ＣＤ６９はＭｏｃｋ Ｔ細胞よりも有意に高かったが、除去標識ＬＡＧ３はＭｏｃｋ Ｔ細胞よりも有意に低かった。
２、２４ウェルプレートを５ｕｇ／ｍｌのＣＤ１９抗原で４℃で一晩コーティングし、ＰＢＳで３回洗浄し、Ｍｏｃｋ Ｔ細胞、ＣＤ１９ＣＡＲ Ｔ細胞またはＣＤ１９ＣＡＲ－ａｎｔｉＰＤ１ Ｔ細胞を３×１０５個加え、２４時間培養した後、細胞上澄を収集した。ＢＤＴＭＣＢＡ Ｈｕｍａｎ Ｔｈ１／Ｔｈ２サイトカインキットＩＩにより、ＣＤ１９ＣＡＲ Ｔ細胞およびＣＤ１９ＣＡＲ－ａｎｔｉＰＤ１ Ｔ細胞がＣＤ１９抗原による刺激を受けた後のサイトカインの分泌状況を検出した：
（１）ヒトＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ捕捉磁気ビーズを混合し、渦励振盪で捕捉磁気ビーズを均一に混合し、チューブ毎に５０ｕｌの混合磁気ビーズを入れた；
（２）５０ｕｌのヒトＴｈ１／Ｔｈ２サイトカイン標準サンプル（倍加希釈５０００ｐｇ／ｍｌ、２５００ｐｇ／ｍｌ、１２５０ｐｇ／ｍｌ、６２５ｐｇ／ｍｌ、３１２．５ｐｇ／ｍｌ、１５６ｐｇ／ｍｌ、８０ｐｇ／ｍｌ、４０ｐｇ／ｍｌ、２０ｐｇ／ｍｌ、０ｐｇ／ｍｌ）および５０ｕｌの被験サンプル（希釈剤で２倍に希釈されたもの）を加えた；
（３）チューブ毎にヒトＴｈ１／Ｔｈ２－ＩＩ－ＰＥ検出抗体を５０ｕｌ加えた；
（４）室温で遮光で３時間インキュベートした；
（５）チューブ毎に洗浄緩衝液を１ｍｌ加え、２００で５分間遠心し、上澄を捨てた；
（６）チューブ毎に洗浄緩衝液を３００ｕｌ加えて細胞を再懸濁し、フローサイトメトリー用チューブに移し、フローサイトメーターで蛍光値を検出した；
結果は図１９（３枚目の図）に示すように、ＣＤ１９ＣＡＲ Ｔ細胞およびＣＤ１９ＣＡＲ－ａｎｔｉＰＤ１ Ｔ細胞が分泌したＩＬ－２、ＴＮＦ－αおよびＩＦＮ－γはＭｏｃｋ Ｔ細胞に比べて大幅に向上したが、３種類の細胞が分泌したＩＬ－４、ＩＬ－６およびＩＬ－１０は有意差がなかった。
３、ＣＤ１９ＣＡＲ Ｔ細胞およびＣＤ１９ＣＡＲ－ａｎｔｉＰＤ１ Ｔ細胞を１×１
０６個収集し、それぞれ１．５ｍｌ ＥＰチューブに入れ、ＰＢＳで２回洗浄し、１２００ｒｐｍで５分間遠心し、α－ＣＤ３ＣＤ４ＣＤ８抗体を２ｕｌ加え、室温で遮光で３０分間インキュベートし、ＰＢＳで１回洗浄し、４００ｕｌのＰＢＳを加え、細胞をフローサイトメトリー用チューブに移し、機器で検出した。
結果は図１９（４枚目の図）に示すように、ＣＤ１９ＣＡＲ Ｔ細胞、ＣＤ１９ＣＡＲ－ａｎｔｉＰＤ１ Ｔ細胞およびＭｏｃｋ ＴにおけるＣＤ３＋ＣＤ４＋、ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞が占める百分率は有意差がなかった。
【0159】
実施例２４：ＣＤ１９ＣＡＲ Ｔ細胞、ＣＤ１９ＣＡＲ－ａｎｔｉＰＤ１ Ｔ細胞およびＣＤ１９ＣＡＲ－ａｎｔｉＰＤ１－ｗｔ Ｔ細胞のインビボ機能実験
実験では、北京Ｂｉｏｓａｆｅｔｙ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社より提供され、ＳＰＦレベルの動物実験室で飼育された４～６週齢の平均体重２２～２７ｇの１２匹のＮＳＧ完全免疫不全マウスが使用された。
実験では、北京Ｂｉｏｓａｆｅｔｙ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社より提供され、ＳＰＦレベルの動物実験室で飼育された４～６週齢の平均体重２２～２７ｇの１２匹のＮＳＧ完全免疫不全マウスが使用された。
【0160】
ヒトＢ細胞リンパ腫Ｒａｊｉ－ｌｕｃ細胞をインビトロで培養し、対数増殖期にある増殖細胞を取り、遠心して細胞を収集した後、ＰＢＳ液で再懸濁し、３０００ｇで室温で２分間遠心し、上澄を捨て、もう一回ＰＢＳ液で再懸濁した後、遠心で細胞を収集し、細胞懸濁液の濃度を５×１０７個／ｍｌに調整した。前記Ｒａｊｉ－ｌｕｃ細胞をマウスの右側のリブ裏側に０．１ｍｌ／匹で皮下接種した。接種後約１０日で、腫瘍のサイズをインビボイメージャーで観察することにより、ＮＳＧ免疫不全マウスを無作為に５つの群に分けることができた。それぞれＰＢＳ群、Ｍｏｃｋ Ｔ群、ＣＤ１９ＣＡＲ Ｔ群、ＣＤ１９ＣＡＲ－ａｎｔｉＰＤ１ Ｔ群およびＣＤ１９ＣＡＲ－ａｎｔｉＰＤ１－ｗｔ Ｔ群（実施例２で構築したＴ細胞）とし、各群に相応のＴ細胞を１×１０７個／１００ｕｌで注射し、ＰＢＳ群に１００ｕｌのＰＢＳを投与し、投与経路は尾静脈注射であった。毎日マウスの生存状態を観察し、且つ７～８日おきにインビボイメージャーでマウス腫瘍の変化を観察した。
結果は図２０に示す。
結果は図２０に示す。
【0161】
実施例２５：ｍｅｓｏ３ＣＡＲ ＴとｍｅｓｏＣＡＲ－ａｎｔｉＰＤ１ Ｔ細胞の殺傷機能の対比
リアルタイムラベルフリー細胞機能アナライザーにより、実施例２で構築したｍｅｓｏ３ＣＡＲ Ｔ細胞およびｍｅｓｏＣＡＲ－ａｎｔｉＰＤ１ Ｔ細胞のインビトロで腫瘍細胞に対する殺傷効果を検出した。
具体的には、ＭＨＣクラスＩタイピングが一致するエフェクター細胞とターゲット細胞を選択し、ＡＣＥＡ社のリアルタイムラベルフリー細胞機能アナライザー（ＲＴＣＡ）を用いて、上記の２種類のＣＡＲ－Ｔ細胞のインビトロ殺傷活性を検出し、具体的な手順は以下のようであった：
（１）ゼロ調整：各ウェルに５０μｌのＤＭＥＭまたは１６４０培地を加え、機器に入れ、ステップ１を選択し、ゼロを調整した；
（２）標的細胞プレーティング：子宮頸癌細胞Ｈｅｌａ、卵巣癌細胞ＳＫ－ＯＶ－３、胃癌ＨＧＣ－２７（いずれもアメリカ菌株保存機関ＡＴＣＣから購入）を、検出電極を備えたプレートに１ウェルあたり１０４個の細胞／５０μｌでプレーティングし、数分間放置し、細胞が安定になったら機器に入れ、ステップ２を開始し、細胞を培養した；
（３）エフェクター細胞の添加：ターゲット細胞を２４時間培養した後、ステップ２を一時停止し、エフェクター細胞を５０μｌ／ウェル加え、エフェクター／ターゲット比を４：１に設定し、プラスミドが導入されないＭｏｃｋ Ｔ細胞を対照として、ステップ３を開始し、共培養を２４時間継続した後、細胞増殖曲線を観察した。
結果は図２１に示すように、ＰＤ１抗体を自己発現するｍｅｓｏＣＡＲ－ａｎｔｉＰＤ１ Ｔ細胞の細胞殺傷機能は、ｍｅｓｏ３ＣＡＲ Ｔ細胞単独での細胞殺傷機能と実質的に同じであり、抗体の発現はＣＡＲ－Ｔ機能に影響を与えなかった。
リアルタイムラベルフリー細胞機能アナライザーにより、実施例２で構築したｍｅｓｏ３ＣＡＲ Ｔ細胞およびｍｅｓｏＣＡＲ－ａｎｔｉＰＤ１ Ｔ細胞のインビトロで腫瘍細胞に対する殺傷効果を検出した。
具体的には、ＭＨＣクラスＩタイピングが一致するエフェクター細胞とターゲット細胞を選択し、ＡＣＥＡ社のリアルタイムラベルフリー細胞機能アナライザー（ＲＴＣＡ）を用いて、上記の２種類のＣＡＲ－Ｔ細胞のインビトロ殺傷活性を検出し、具体的な手順は以下のようであった：
（１）ゼロ調整：各ウェルに５０μｌのＤＭＥＭまたは１６４０培地を加え、機器に入れ、ステップ１を選択し、ゼロを調整した；
（２）標的細胞プレーティング：子宮頸癌細胞Ｈｅｌａ、卵巣癌細胞ＳＫ－ＯＶ－３、胃癌ＨＧＣ－２７（いずれもアメリカ菌株保存機関ＡＴＣＣから購入）を、検出電極を備えたプレートに１ウェルあたり１０４個の細胞／５０μｌでプレーティングし、数分間放置し、細胞が安定になったら機器に入れ、ステップ２を開始し、細胞を培養した；
（３）エフェクター細胞の添加：ターゲット細胞を２４時間培養した後、ステップ２を一時停止し、エフェクター細胞を５０μｌ／ウェル加え、エフェクター／ターゲット比を４：１に設定し、プラスミドが導入されないＭｏｃｋ Ｔ細胞を対照として、ステップ３を開始し、共培養を２４時間継続した後、細胞増殖曲線を観察した。
結果は図２１に示すように、ＰＤ１抗体を自己発現するｍｅｓｏＣＡＲ－ａｎｔｉＰＤ１ Ｔ細胞の細胞殺傷機能は、ｍｅｓｏ３ＣＡＲ Ｔ細胞単独での細胞殺傷機能と実質的に同じであり、抗体の発現はＣＡＲ－Ｔ機能に影響を与えなかった。
【0162】
実施例２６：メソテリン抗原による特異的刺激下でのｍｅｓｏ３ＣＡＲとｍｅｓｏＣＡＲ－ａｎｔｉＰＤ１ Ｔ細胞のサイトカイン放出の対比
９６ウェルプレートを２ｕｇ／ｍｌのメソテリン抗原で４℃で一晩コーティングし、ＰＢＳで３回洗浄し、実施例２で構築したｍｅｓｏ３ＣＡＲとｍｅｓｏＣＡＲ－ａｎｔｉＰＤ１ Ｔ細胞および対照としてのＭｏｃｋ Ｔ細胞をそれぞれ１×１０５個加え、２４時間培養した後、細胞上澄を収集した。ＢＤＴＭＣＢＡ Ｈｕｍａｎ Ｔｈ１／Ｔｈ２サイトカインキットＩＩにより、これらの３種類のＴ細胞がメソテリン抗原による刺激を受けた後のサイトカインの分泌状況を検出し、具体的な手順は以下のようであった：
（１）ヒトＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ捕捉磁気ビーズを混合し、渦励振盪で捕捉磁気ビーズを均一に混合し、チューブ毎に均一に混合された磁気ビーズを５０ｕｌ入れた；
（２）５０ｕｌのヒトＴｈ１／Ｔｈ２サイトカイン標準サンプル（倍加希釈５０００ｐｇ／ｍｌ、２５００ｐｇ／ｍｌ、１２５０ｐｇ／ｍｌ、６２５ｐｇ／ｍｌ、３１２．５ｐｇ／ｍｌ、１５６ｐｇ／ｍｌ、８０ｐｇ／ｍｌ、４０ｐｇ／ｍｌ、２０ｐｇ／ｍｌ、０ｐｇ／ｍｌ）および５０ｕｌの被験サンプル（希釈剤で２倍に希釈されたもの）を加えた；
（３）チューブ毎にヒトＴｈ１／Ｔｈ２－ＩＩ－ＰＥ検出抗体を５０ｕｌ加えた；
（４）室温で遮光で３時間インキュベートした；
（５）チューブ毎に洗浄緩衝液を１ｍｌ加え、２００で５分間遠心し、上澄を捨てた；
（６）チューブ毎に洗浄緩衝液を３００ｕｌ加えて細胞を再懸濁し、フローサイトメトリー用チューブに移し、フローサイトメーターで蛍光値を検出した。
結果は図２２に示すように、ＰＤ１抗体を自己発現するｍｅｓｏＣＡＲ－ａｎｔｉＰＤ１ Ｔ細胞のサイトカイン分泌量は、ｍｅｓｏ３ＣＡＲ Ｔ細胞単独でのサイトカイン分泌量と有意差がなかった。
９６ウェルプレートを２ｕｇ／ｍｌのメソテリン抗原で４℃で一晩コーティングし、ＰＢＳで３回洗浄し、実施例２で構築したｍｅｓｏ３ＣＡＲとｍｅｓｏＣＡＲ－ａｎｔｉＰＤ１ Ｔ細胞および対照としてのＭｏｃｋ Ｔ細胞をそれぞれ１×１０５個加え、２４時間培養した後、細胞上澄を収集した。ＢＤＴＭＣＢＡ Ｈｕｍａｎ Ｔｈ１／Ｔｈ２サイトカインキットＩＩにより、これらの３種類のＴ細胞がメソテリン抗原による刺激を受けた後のサイトカインの分泌状況を検出し、具体的な手順は以下のようであった：
（１）ヒトＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ捕捉磁気ビーズを混合し、渦励振盪で捕捉磁気ビーズを均一に混合し、チューブ毎に均一に混合された磁気ビーズを５０ｕｌ入れた；
（２）５０ｕｌのヒトＴｈ１／Ｔｈ２サイトカイン標準サンプル（倍加希釈５０００ｐｇ／ｍｌ、２５００ｐｇ／ｍｌ、１２５０ｐｇ／ｍｌ、６２５ｐｇ／ｍｌ、３１２．５ｐｇ／ｍｌ、１５６ｐｇ／ｍｌ、８０ｐｇ／ｍｌ、４０ｐｇ／ｍｌ、２０ｐｇ／ｍｌ、０ｐｇ／ｍｌ）および５０ｕｌの被験サンプル（希釈剤で２倍に希釈されたもの）を加えた；
（３）チューブ毎にヒトＴｈ１／Ｔｈ２－ＩＩ－ＰＥ検出抗体を５０ｕｌ加えた；
（４）室温で遮光で３時間インキュベートした；
（５）チューブ毎に洗浄緩衝液を１ｍｌ加え、２００で５分間遠心し、上澄を捨てた；
（６）チューブ毎に洗浄緩衝液を３００ｕｌ加えて細胞を再懸濁し、フローサイトメトリー用チューブに移し、フローサイトメーターで蛍光値を検出した。
結果は図２２に示すように、ＰＤ１抗体を自己発現するｍｅｓｏＣＡＲ－ａｎｔｉＰＤ１ Ｔ細胞のサイトカイン分泌量は、ｍｅｓｏ３ＣＡＲ Ｔ細胞単独でのサイトカイン分泌量と有意差がなかった。
【0163】
実施例２７：卵巣癌マウス異種移植片モデルに対するｍｅｓｏ３ＣＡＲおよびｍｅｓｏＣＡＲ－ａｎｔｉＰＤ１ Ｔ細胞の治療効果
１、Ｂｉｏｓａｆｅｔｙ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社より提供され、ＳＰＦレベルの動物実験室で飼育された４～６週齢の平均体重２２～２７ｇの２５匹のＮＳＧ完全免疫不全マウスが使用された。
２、ヒト卵巣癌細胞ＳＫ－ＯＶ－３－ｌｕｃをインビトロで培養し、対数増殖期にある付着増殖細胞を取り、０．２５％トリプシンで消化し、遠心して細胞を収集した後、ＰＢＳで再懸濁し、１０００ｒｍｐで室温で２分間遠心し、上澄を捨て、もう一回ＰＢＳ液で再懸濁した後、遠心で細胞を収集し、細胞懸濁液の濃度を５×１０７個／ｍｌに調整した。
３、ＳＫ－ＯＶ－３－ｌｕｃ細胞をマウスの右側のリブ裏側に０．１ｍｌ／匹で皮下接種した。接種後７日で、蛍光強度をインビボイメージャーで観察することにより、ＮＳＧ免疫不全マウスを無作為に５つの群に分けることができた。各群に相応のＴ細胞を１×１０７個／１００ｕｌで注射し、ＰＢＳ群に１００ｕｌのＰＢＳを投与し、投与経路は尾静脈注射であった。
４、毎日マウスの生存状態を観察し、且つ４日おきにインビボイメージャーでマウス腫瘍の変化を観察した。
結果は図２３に示すように、ＳＫ－ＯＶ－３卵巣癌マウス異種移植片モデルにおいて、ＭｅｓｏＣＡＲ－ａｎｔｉＰＤ１ Ｔ細胞はＭｅｓｏ３ＣＡＲ Ｔ細胞よりも有意に良好な治療効果を有したが、Ｍｅｓｏ３ＣＡＲ－ｗｔ－ａｎｔｉＰＤ１ Ｔ細胞は効果をあまり有しなかった。
１、Ｂｉｏｓａｆｅｔｙ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社より提供され、ＳＰＦレベルの動物実験室で飼育された４～６週齢の平均体重２２～２７ｇの２５匹のＮＳＧ完全免疫不全マウスが使用された。
２、ヒト卵巣癌細胞ＳＫ－ＯＶ－３－ｌｕｃをインビトロで培養し、対数増殖期にある付着増殖細胞を取り、０．２５％トリプシンで消化し、遠心して細胞を収集した後、ＰＢＳで再懸濁し、１０００ｒｍｐで室温で２分間遠心し、上澄を捨て、もう一回ＰＢＳ液で再懸濁した後、遠心で細胞を収集し、細胞懸濁液の濃度を５×１０７個／ｍｌに調整した。
３、ＳＫ－ＯＶ－３－ｌｕｃ細胞をマウスの右側のリブ裏側に０．１ｍｌ／匹で皮下接種した。接種後７日で、蛍光強度をインビボイメージャーで観察することにより、ＮＳＧ免疫不全マウスを無作為に５つの群に分けることができた。各群に相応のＴ細胞を１×１０７個／１００ｕｌで注射し、ＰＢＳ群に１００ｕｌのＰＢＳを投与し、投与経路は尾静脈注射であった。
４、毎日マウスの生存状態を観察し、且つ４日おきにインビボイメージャーでマウス腫瘍の変化を観察した。
結果は図２３に示すように、ＳＫ－ＯＶ－３卵巣癌マウス異種移植片モデルにおいて、ＭｅｓｏＣＡＲ－ａｎｔｉＰＤ１ Ｔ細胞はＭｅｓｏ３ＣＡＲ Ｔ細胞よりも有意に良好な治療効果を有したが、Ｍｅｓｏ３ＣＡＲ－ｗｔ－ａｎｔｉＰＤ１ Ｔ細胞は効果をあまり有しなかった。
【0164】
実施例２８：ＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺとＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ－ａｎｔｉＰＤ１ Ｔ細胞の増殖速度の対比
実施例２で８日目に培養したＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ Ｔ細胞、ＥＨＣＡＲ－Ｅ
Ｋ－２８ＴＩＺ－ａｎｔｉＰＤ１ Ｔ細胞およびＭｏｃｋ Ｔ細胞をそれぞれ３×１０５個取り、１２ウェルプレートに置いて、いずれも１ｍｌの培養体積で培養した。白色で非透光性の９６ウェルプレートを用意し、３群の細胞からそれぞれ細胞含有培養液を８０μＬ取って、異なるウェルに加えたと共に、８０μＬの栄養液を元の１２ウェルプレートに追加した。次に、９６ウェルプレートに８０μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ試薬を加え、シェーカーで２分間均一に混合し、室温で１０分間インキュベートし、マイクロプレートリーダーでＬｕｃ蛍光値を読み取った。使用されたＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ発光細胞生存試験（Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ）キットはＰｒｏｍｅｇａ社から購入した。培養の９、１０、１１、１２、１３日目に、毎日１２ウェルプレートで培養された細胞からサンプリングし、上記の手順で検出し、蛍光値に基づいて細胞増殖曲線をプロットした。
結果は図２４に示すように、ＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ－ａｎｔｉＰＤ１ Ｔ細胞の増殖速度はＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ Ｔ細胞よりも有意に早いことから、ＰＤ１抗体の発現はＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖を促進できることが分かった。
実施例２で８日目に培養したＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ Ｔ細胞、ＥＨＣＡＲ－Ｅ
Ｋ－２８ＴＩＺ－ａｎｔｉＰＤ１ Ｔ細胞およびＭｏｃｋ Ｔ細胞をそれぞれ３×１０５個取り、１２ウェルプレートに置いて、いずれも１ｍｌの培養体積で培養した。白色で非透光性の９６ウェルプレートを用意し、３群の細胞からそれぞれ細胞含有培養液を８０μＬ取って、異なるウェルに加えたと共に、８０μＬの栄養液を元の１２ウェルプレートに追加した。次に、９６ウェルプレートに８０μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ試薬を加え、シェーカーで２分間均一に混合し、室温で１０分間インキュベートし、マイクロプレートリーダーでＬｕｃ蛍光値を読み取った。使用されたＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ発光細胞生存試験（Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ）キットはＰｒｏｍｅｇａ社から購入した。培養の９、１０、１１、１２、１３日目に、毎日１２ウェルプレートで培養された細胞からサンプリングし、上記の手順で検出し、蛍光値に基づいて細胞増殖曲線をプロットした。
結果は図２４に示すように、ＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ－ａｎｔｉＰＤ１ Ｔ細胞の増殖速度はＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ Ｔ細胞よりも有意に早いことから、ＰＤ１抗体の発現はＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖を促進できることが分かった。
【0165】
実施例２９：ＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺとＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ－ａｎｔｉＰＤ１ Ｔ細胞の細胞表現型測定・解析
実施例２で得られた２種類のＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ Ｔ細胞およびＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ－ａｎｔｉＰＤ１ Ｔ細胞を収集し、数をカウントした後、それぞれ１×１０６個の細胞／チューブで６本の１．５ｍｌ ＥＰチューブに入れ、ＰＢＳで２回洗浄し、１２００ｒｐｍで５分間遠心し、上澄を捨てた；そのうち、２本のチューブにはそれぞれ、活性化Ｔ細胞の表現型を検出するためのフローサイトメトリー用抗体である抗ＣＤ１０７α－ＰＥおよび抗ＣＤ６９－ＰＥが添加され、１本のチューブには、メモリーＴ細胞の表現型を検出するためのフローサイトメトリー用抗体である抗ＣＤ４５ＲＯ－ＰＥＣｙ５＋抗ＣＤ１９７－ＦＩＴＣ＋抗ＣＤ６２Ｌ－ＰＥが添加され、１本のチューブには、サプレッサーＴ細胞の表現型を検出するためのフローサイトメトリー用抗体である抗ＰＤ１－ＰＥが添加され、残りの２本のチューブにはそれぞれ、アイソタイプコントロールフローサイトメトリー用抗体であるＩｇＧ１－ＰＥおよびＩｇＧ１－ＰＥ＋ＩｇＧ２ａ－ＰＥＣｙ５＋ＩｇＧ２ａ－ＰＥが添加され、各抗体（いずれもＪａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈから購入）は２μｌ添加された；沈殿物を軽くフリックして均一に混合させた；室温で遮光で３０分間インキュベートした後、ＰＢＳで一回洗浄し、１２００ｒｐｍで５分間遠心し、上澄を捨て、４００μｌの生理食塩水を加え、細胞をフローサイトメトリー用チューブに移し、機器で検出した。
実験結果からみれば、フローサイトメトリー検出により、ＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ－ａｎｔｉＰＤ１ Ｔ細胞の老化表現型ＰＤ１の発現量は、ＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺよりも有意に低い（図２５Ａ）；ＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ－ａｎｔｉＰＤ１ Ｔ細胞の活性化表現型ＣＤ６９とＣＤ１０７αの発現量は、ＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ細胞よりも高い（図２５Ｂおよび２５Ｃ）；同時に、ＣＤ６２Ｌ（Ｌ－セレクチン）はセントラルメモリーＴ細胞のマーカーであり、ＣＤ１９７はエフェクターメモリーＴ細胞のマーカーであり、ＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ－ａｎｔｉＰＤ１ Ｔ細胞におけるエフェクターＴ細胞の割合は、ＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ細胞およびＭｏｃｋ－Ｔ細胞よりも有意に高かった（図２５Ｄ）。これらの結果から、ＰＤ１抗体の発現はＣＡＲ－Ｔ細胞の除去を阻害し、ＣＡＲ－Ｔ細胞の活性化を促進し、その免疫殺傷機能を増強できることが分かった。
実施例２で得られた２種類のＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ Ｔ細胞およびＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ－ａｎｔｉＰＤ１ Ｔ細胞を収集し、数をカウントした後、それぞれ１×１０６個の細胞／チューブで６本の１．５ｍｌ ＥＰチューブに入れ、ＰＢＳで２回洗浄し、１２００ｒｐｍで５分間遠心し、上澄を捨てた；そのうち、２本のチューブにはそれぞれ、活性化Ｔ細胞の表現型を検出するためのフローサイトメトリー用抗体である抗ＣＤ１０７α－ＰＥおよび抗ＣＤ６９－ＰＥが添加され、１本のチューブには、メモリーＴ細胞の表現型を検出するためのフローサイトメトリー用抗体である抗ＣＤ４５ＲＯ－ＰＥＣｙ５＋抗ＣＤ１９７－ＦＩＴＣ＋抗ＣＤ６２Ｌ－ＰＥが添加され、１本のチューブには、サプレッサーＴ細胞の表現型を検出するためのフローサイトメトリー用抗体である抗ＰＤ１－ＰＥが添加され、残りの２本のチューブにはそれぞれ、アイソタイプコントロールフローサイトメトリー用抗体であるＩｇＧ１－ＰＥおよびＩｇＧ１－ＰＥ＋ＩｇＧ２ａ－ＰＥＣｙ５＋ＩｇＧ２ａ－ＰＥが添加され、各抗体（いずれもＪａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈから購入）は２μｌ添加された；沈殿物を軽くフリックして均一に混合させた；室温で遮光で３０分間インキュベートした後、ＰＢＳで一回洗浄し、１２００ｒｐｍで５分間遠心し、上澄を捨て、４００μｌの生理食塩水を加え、細胞をフローサイトメトリー用チューブに移し、機器で検出した。
実験結果からみれば、フローサイトメトリー検出により、ＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ－ａｎｔｉＰＤ１ Ｔ細胞の老化表現型ＰＤ１の発現量は、ＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺよりも有意に低い（図２５Ａ）；ＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ－ａｎｔｉＰＤ１ Ｔ細胞の活性化表現型ＣＤ６９とＣＤ１０７αの発現量は、ＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ細胞よりも高い（図２５Ｂおよび２５Ｃ）；同時に、ＣＤ６２Ｌ（Ｌ－セレクチン）はセントラルメモリーＴ細胞のマーカーであり、ＣＤ１９７はエフェクターメモリーＴ細胞のマーカーであり、ＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ－ａｎｔｉＰＤ１ Ｔ細胞におけるエフェクターＴ細胞の割合は、ＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ細胞およびＭｏｃｋ－Ｔ細胞よりも有意に高かった（図２５Ｄ）。これらの結果から、ＰＤ１抗体の発現はＣＡＲ－Ｔ細胞の除去を阻害し、ＣＡＲ－Ｔ細胞の活性化を促進し、その免疫殺傷機能を増強できることが分かった。
【0166】
実施例３０：ＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺとＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ－ａｎｔｉＰＤ１ Ｔ細胞の殺傷機能の対比
ＭＨＣクラスＩタイピングが一致するエフェクター細胞とターゲット細胞を選択し、ＡＣＥＡ社のリアルタイムラベルフリー細胞機能アナライザー（ＲＴＣＡ）を用いて、実施例２得られた２種類のＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ Ｔ細胞とＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８
ＴＩＺ－ａｎｔｉＰＤ１ Ｔ細胞のインビトロ殺傷活性を検出し、具体的な手順は以下のようであった：
（１）ゼロ調整：各ウェルに５０μｌのＤＭＥＭまたは１６４０培地を加え、機器に入れ、ステップ１を選択し、ゼロを調整した；
（２）標的細胞プレーティング：ヒト肝癌細胞ＨＣＣＬＭ３、ヒト肝癌細胞Ｈｅｐ３Ｂおよびヒト非小細胞肺癌Ｈ２３（アメリカ菌株保存機関ＡＴＣＣから購入）を、検出電極を備えたプレートに１ウェルあたり１０４個の細胞／５０μｌでプレーティングし、数分間放置し、細胞が安定になったら機器に入れ、ステップ２を開始し、細胞を培養した；
（３）エフェクター細胞の添加：ターゲット細胞を２４時間培養した後、ステップ２を一時停止し、エフェクター細胞を５０μｌ／ウェル加え、エフェクター／ターゲット比を４：１に設定し、ｐＮＢ３２８空ベクターが導入されたＭｏｃｋ Ｔ細胞を対照として、ステップ３を開始し、共培養を２４時間継続した後、細胞増殖曲線を観察した；
結果は図２６に示す。ＰＤ１抗体を自己発現するＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ－ａｎｔｉＰＤ１ Ｔ細胞の多種の腫瘍細胞に対する殺傷効果は、ＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ Ｔ細胞および対照Ｔ細胞よりも有意に高かった。
ＭＨＣクラスＩタイピングが一致するエフェクター細胞とターゲット細胞を選択し、ＡＣＥＡ社のリアルタイムラベルフリー細胞機能アナライザー（ＲＴＣＡ）を用いて、実施例２得られた２種類のＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ Ｔ細胞とＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８
ＴＩＺ－ａｎｔｉＰＤ１ Ｔ細胞のインビトロ殺傷活性を検出し、具体的な手順は以下のようであった：
（１）ゼロ調整：各ウェルに５０μｌのＤＭＥＭまたは１６４０培地を加え、機器に入れ、ステップ１を選択し、ゼロを調整した；
（２）標的細胞プレーティング：ヒト肝癌細胞ＨＣＣＬＭ３、ヒト肝癌細胞Ｈｅｐ３Ｂおよびヒト非小細胞肺癌Ｈ２３（アメリカ菌株保存機関ＡＴＣＣから購入）を、検出電極を備えたプレートに１ウェルあたり１０４個の細胞／５０μｌでプレーティングし、数分間放置し、細胞が安定になったら機器に入れ、ステップ２を開始し、細胞を培養した；
（３）エフェクター細胞の添加：ターゲット細胞を２４時間培養した後、ステップ２を一時停止し、エフェクター細胞を５０μｌ／ウェル加え、エフェクター／ターゲット比を４：１に設定し、ｐＮＢ３２８空ベクターが導入されたＭｏｃｋ Ｔ細胞を対照として、ステップ３を開始し、共培養を２４時間継続した後、細胞増殖曲線を観察した；
結果は図２６に示す。ＰＤ１抗体を自己発現するＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ－ａｎｔｉＰＤ１ Ｔ細胞の多種の腫瘍細胞に対する殺傷効果は、ＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ Ｔ細胞および対照Ｔ細胞よりも有意に高かった。
【0167】
実施例３１：ＥＧＦＲ抗原による特異的刺激下でのＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ Ｔ細胞とＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ－ａｎｔｉＰＤ１ Ｔ細胞のサイトカイン放出の対比
９６ウェルプレートを５ｕｇ／ｍｌのＥＧＦＲ抗原で４℃で一晩コーティングし、ＰＢＳで３回洗浄し、実施例２で得られたＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ Ｔ細胞とＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ－ａｎｔｉＰＤ１ Ｔ細胞および対照としての（ｐＮＢ３２８空ベクターが導入された）Ｍｏｃｋ Ｔ細胞を１×１０５個（１００ｕｌ体積）加え、２４時間培養した後、細胞上澄を収集した。これらの３種類のＴ細胞がＥＧＦＲ抗原による刺激を受けた後のサイトカインの分泌状況を検出した、
結果は図２７に示すように、ＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ－ａｎｔｉＰＤ１ Ｔ細胞のＩＬ－２およびＩＦＮ－γ分泌量はＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ Ｔ細胞およびＭｏｃｋ－Ｔよりも有意に高いことから、ＰＤ１抗体の自己発現はＣＡＲ－Ｔ細胞からのサイトカインの分泌を促進できることが分かった。
９６ウェルプレートを５ｕｇ／ｍｌのＥＧＦＲ抗原で４℃で一晩コーティングし、ＰＢＳで３回洗浄し、実施例２で得られたＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ Ｔ細胞とＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ－ａｎｔｉＰＤ１ Ｔ細胞および対照としての（ｐＮＢ３２８空ベクターが導入された）Ｍｏｃｋ Ｔ細胞を１×１０５個（１００ｕｌ体積）加え、２４時間培養した後、細胞上澄を収集した。これらの３種類のＴ細胞がＥＧＦＲ抗原による刺激を受けた後のサイトカインの分泌状況を検出した、
結果は図２７に示すように、ＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ－ａｎｔｉＰＤ１ Ｔ細胞のＩＬ－２およびＩＦＮ－γ分泌量はＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ Ｔ細胞およびＭｏｃｋ－Ｔよりも有意に高いことから、ＰＤ１抗体の自己発現はＣＡＲ－Ｔ細胞からのサイトカインの分泌を促進できることが分かった。
【0168】
実施例３２：ＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ Ｔ細胞、ＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ－ａｎｔｉＰＤ１－ｗｔ Ｔ細胞およびＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ－ａｎｔｉＰＤ１
Ｔ細胞のインビボ抗腫瘍効果
４～６週齢のＮＳＧマウスを２０匹購入し、１群につき４匹で、５つの群に平均に分け、肝癌細胞株ＨＣＣＬＭ３－ＬＵＣを１×１０７個／匹で接種し、腫瘍形成後１０日で、ＰＢＳ、Ｍｏｃｋ－Ｔ、ＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ Ｔ細胞、ＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ－ａｎｔｉＰＤ１－ｗｔ Ｔ細胞、およびＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ－ａｎｔｉＰＤ１ Ｔ細胞を尾静脈注射し、各群に相応のＴ細胞を１×１０７個／１００ｕｌで注射し、ＰＢＳ群に１００ｕｌのＰＢＳを投与し、マウス生体内の腫瘍蛍光の変化を観察して記録した。
Ｔ細胞のインビボ抗腫瘍効果
４～６週齢のＮＳＧマウスを２０匹購入し、１群につき４匹で、５つの群に平均に分け、肝癌細胞株ＨＣＣＬＭ３－ＬＵＣを１×１０７個／匹で接種し、腫瘍形成後１０日で、ＰＢＳ、Ｍｏｃｋ－Ｔ、ＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ Ｔ細胞、ＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ－ａｎｔｉＰＤ１－ｗｔ Ｔ細胞、およびＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ－ａｎｔｉＰＤ１ Ｔ細胞を尾静脈注射し、各群に相応のＴ細胞を１×１０７個／１００ｕｌで注射し、ＰＢＳ群に１００ｕｌのＰＢＳを投与し、マウス生体内の腫瘍蛍光の変化を観察して記録した。
【0169】
結果から分かるように、ＰＢＳ、Ｍｏｃｋ－Ｔ、ＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ－ａｎｔｉＰＤ１－ｗｔ Ｔ細胞は腫瘍モデルに治療効果を有しないが、ＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ Ｔ細胞、ＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ－ａｎｔｉＰＤ１ Ｔ細胞は良好な抗腫瘍効果を有し、ＥＨＣＡＲ－ＥＫ－２８ＴＩＺ－ａｎｔｉＰＤ１ Ｔ細胞の効果は有意に高かった。具体的には図２８に示す。
【0170】
実施例３３：異なる患者から由来のＰＢＭＣ細胞がＭｕｃ１ＣＡＲ遺伝子およびＰＤ－１抗体遺伝子で修飾された後、Ｔ細胞ゲノムにおけるＭｕｃ１ＣＡＲのゲノム発現レベルの検出
実施例２で得られたＭｏｃｋ Ｔ細胞、Ｍｕｃ１ＣＡＲ Ｔ細胞およびＭｕｃ１ＣＡＲ－ａｎｔｉＰＤ１ Ｔ細胞のゲノムＤＮＡを（キット法で）抽出し、実験手順については、キットに添付されている取扱説明書を参照し、Ｍｏｃｋ Ｔ細胞、Ｍｕｃ１ＣＡＲ Ｔ細胞およびＭｕｃ１ＣＡＲ－ａｎｔｉＰＤ１ Ｔ細胞のＤＮＡ濃度を測定し、リアルタイム蛍光定量ＰＣＲでＭｕｃ１ＣＡＲゲノムの発現レベルを検出し、反応プログラムは、５０℃、２ｍｉｎ→９５℃、１０ｍｉｎ→９５℃、１５ｓ→６０℃、１ｍｉｎ、４０サイクルであった。得られたＭｕｃ１ＣＡＲゲノムのＣＴ値およびアクチンのＣＴ値から、相応の計算式により、絶対コピー数含有量を算出した。
結果からみれば、ＰＢトランスポザーゼシステムを介して、Ｍｕｃ１ＣＡＲゲノムはＴ細胞のゲノムに組み込まれており、具体的には下表８に示す：
実施例２で得られたＭｏｃｋ Ｔ細胞、Ｍｕｃ１ＣＡＲ Ｔ細胞およびＭｕｃ１ＣＡＲ－ａｎｔｉＰＤ１ Ｔ細胞のゲノムＤＮＡを（キット法で）抽出し、実験手順については、キットに添付されている取扱説明書を参照し、Ｍｏｃｋ Ｔ細胞、Ｍｕｃ１ＣＡＲ Ｔ細胞およびＭｕｃ１ＣＡＲ－ａｎｔｉＰＤ１ Ｔ細胞のＤＮＡ濃度を測定し、リアルタイム蛍光定量ＰＣＲでＭｕｃ１ＣＡＲゲノムの発現レベルを検出し、反応プログラムは、５０℃、２ｍｉｎ→９５℃、１０ｍｉｎ→９５℃、１５ｓ→６０℃、１ｍｉｎ、４０サイクルであった。得られたＭｕｃ１ＣＡＲゲノムのＣＴ値およびアクチンのＣＴ値から、相応の計算式により、絶対コピー数含有量を算出した。
結果からみれば、ＰＢトランスポザーゼシステムを介して、Ｍｕｃ１ＣＡＲゲノムはＴ細胞のゲノムに組み込まれており、具体的には下表８に示す：
【0171】
【表8】
【0172】
実施例３４：フローサイトメトリー検出によるＭｏｃｋ Ｔ細胞、Ｍｕｃ１ＣＡＲ Ｔ細胞およびＭｕｃ１ＣＡＲ－ａｎｔｉＰＤ１ Ｔ細胞活性化表現型およびサイトカイン分泌の分別。
１、実施例２で得られた懸濁のＭｏｃｋ Ｔ細胞、Ｍｕｃ１ＣＡＲ Ｔ細胞、およびｐＮＢ３２８－Ｍｕｃ１ＣＡＲとｐＳ３２８－ｍ２７９Ｖプラスミドが導入されたＭｕｃ１ＣＡＲ－ａｎｔｉＰＤ１ Ｔ細胞を収集し、ＰＢＳで２回洗浄し、１２００ｒｐｍで５分間遠心し、アイソタイプコントロール抗体ＩｇＧ１－ＰＥ、蛍光フローサイトメトリー用抗体である抗ＣＤ２５－ＰＥ、抗ＬＡＧ３－ＰＥ、抗ＰＤ１－ＰＥ；アイソタイプコントロール抗体ＩｇＧ１－ＰＣ５、蛍光フローサイトメトリー用抗体である抗ＣＤ１０７－ＰＣ５；アイソタイプコントロール抗体ＩｇＧ１ ＦＩＴＣ、蛍光フローサイトメトリー用抗体である抗ＣＤ６２Ｌ－ＦＩＴＣ；アイソタイプコントロール抗体ＩｇＧ１－ＰＣ５、蛍光フローサイトメトリー用抗体である抗ＣＤ４５ＲＯ－ＰＣ５；アイソタイプコントロール抗体ＩｇＧ１－ＰＥ、蛍光フローサイトメトリー用抗体である抗ＣＣＲ７－ＰＥをそれぞれ２ｕｌ加え、沈殿物を軽くフリックして均一に混合させ、室温で遮光で３０分間インキュベートした後、ＰＢＳで１回洗浄し、４００μｌのＰＢＳを加え、細胞をフローサイトメトリー用チューブに移し、機器で検出した。
結果からみれば、Ｍｕｃ１ＣＡＲ－ａｎｔｉＰＤ１ Ｔ細胞が分泌するＰＤ－１一本鎖抗体は、Ｔ細胞表面のＰＤ－１タンパク質を良好にブロックことができ、且つＭｕｃ１ＣＡＲ Ｔ細胞およびＭｕｃ１ＣＡＲ－ａｎｔｉＰＤ１ Ｔ細胞はいずれも、インビトロで顕著な殺傷活性を有すると共に、メモリーＴの形成も促進でき、活性化標識ＣＤ２５はＭｏｃｋ Ｔ細胞よりも有意に高かったが、Ｍｕｃ１ＣＡＲ－ａｎｔｉＰＤ１ Ｔ細胞の除去標識ＬＡＧ３はＭｏｃｋ Ｔ細胞およびＭｕｃ１ＣＡＲ Ｔ細胞よりも有意に低く、具体的には図２９Ａ、２９Ｂに示す。
２、実施例２で得られたＭｕｃ１ＣＡＲ Ｔ細胞、およびｐＮＢ３２８－Ｍｕｃ１ＣＡ
ＲとｐＳ３２８－ｍ２７９Ｖプラスミドが導入されたＭｕｃ１ＣＡＲ－ａｎｔｉＰＤ１ Ｔ細胞を１×１０６個収集し、それぞれ１．５ｍｌ ＥＰチューブに入れ、ＰＢＳで２回洗浄し、１２００ｒｐｍで５分間遠心し、α－ＣＤ３ＣＤ４ＣＤ８抗体を２ｕｌ加え、室温で遮光で３０分間インキュベートし、ＰＢＳで１回洗浄し、４００ｕｌのＰＢＳを加え、細胞をフローサイトメトリー用チューブに移し、機器で検出した。
結果からみれば、Ｍｕｃ１ＣＡＲ Ｔ細胞、Ｍｕｃ１ＣＡＲ－ａｎｔｉＰＤ１ Ｔ細胞およびＭｏｃｋ ＴにおけるＣＤ３＋ＣＤ４＋、ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞が占める百分率は有意差がなく、具体的には図２９Ｃに示す。
３、２４ウェルプレートを５ｕｇ／ｍｌのＭｕｃ１抗原で４℃で一晩コーティングし、ＰＢＳで３回洗浄し、実施例２で得られたＭｏｃｋ Ｔ細胞、Ｍｕｃ１ＣＡＲ Ｔ細胞、およびｐＮＢ３２８－Ｍｕｃ１ＣＡＲとｐＳ３２８－ｍ２７９Ｖプラスミドが導入されたＭｕｃ１ＣＡＲ－ａｎｔｉＰＤ１ Ｔ細胞を３×１０５個加え、２４時間培養した後、細胞上澄を収集した。ＢＤＴＭＣＢＡ Ｈｕｍａｎ Ｔｈ１／Ｔｈ２サイトカインキットＩＩにより、Ｍｕｃ１ＣＡＲ Ｔ細胞およびＭｕｃ１ＣＡＲ－ａｎｔｉＰＤ１ Ｔ細胞がＭｕｃ１抗原による刺激を受けた後のサイトカインの分泌状況を検出した：
（１）ヒトＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ捕捉磁気ビーズを混合し、渦励振盪で捕捉磁気ビーズを均一に混合し、チューブ毎に均一に混合された磁気ビーズを５０ｕｌ入れた；
（２）５０ｕｌのヒトＴｈ１／Ｔｈ２サイトカイン標準サンプル（倍加希釈５０００ｐｇ／ｍｌ、２５００ｐｇ／ｍｌ、１２５０ｐｇ／ｍｌ、６２５ｐｇ／ｍｌ、３１２．５ｐｇ／ｍｌ、１５６ｐｇ／ｍｌ、８０ｐｇ／ｍｌ、４０ｐｇ／ｍｌ、２０ｐｇ／ｍｌ、０ｐｇ／ｍｌ）および５０ｕｌの被験サンプル（希釈剤で２倍に希釈されたもの）を加えた；
（３）チューブ毎にヒトＴｈ１／Ｔｈ２－ＩＩ－ＰＥ検出抗体を５０ｕｌ加えた；
（４）室温で遮光で３時間インキュベートした；
（５）チューブ毎に洗浄緩衝液を１ｍｌ加え、２００ｇで５分間遠心し、上澄を捨てた；
（６）チューブ毎に洗浄緩衝液を３００ｕｌ加えて細胞を再懸濁し、フローサイトメトリー用チューブに移し、フローサイトメーターで蛍光値を検出した。
結果からみれば、Ｍｕｃ１ＣＡＲ Ｔ細胞およびＭｕｃ１ＣＡＲ－ａｎｔｉＰＤ１ Ｔ細胞が分泌したＩＬ－２、ＴＮＦ－αおよびＩＦＮ－γはＭｏｃｋ Ｔ細胞に比べて大幅に向上したが、３種類の細胞が分泌したＩＬ－４、ＩＬ－６およびＩＬ－１０は有意差がなく、具体的には図２９Ｄに示す。
１、実施例２で得られた懸濁のＭｏｃｋ Ｔ細胞、Ｍｕｃ１ＣＡＲ Ｔ細胞、およびｐＮＢ３２８－Ｍｕｃ１ＣＡＲとｐＳ３２８－ｍ２７９Ｖプラスミドが導入されたＭｕｃ１ＣＡＲ－ａｎｔｉＰＤ１ Ｔ細胞を収集し、ＰＢＳで２回洗浄し、１２００ｒｐｍで５分間遠心し、アイソタイプコントロール抗体ＩｇＧ１－ＰＥ、蛍光フローサイトメトリー用抗体である抗ＣＤ２５－ＰＥ、抗ＬＡＧ３－ＰＥ、抗ＰＤ１－ＰＥ；アイソタイプコントロール抗体ＩｇＧ１－ＰＣ５、蛍光フローサイトメトリー用抗体である抗ＣＤ１０７－ＰＣ５；アイソタイプコントロール抗体ＩｇＧ１ ＦＩＴＣ、蛍光フローサイトメトリー用抗体である抗ＣＤ６２Ｌ－ＦＩＴＣ；アイソタイプコントロール抗体ＩｇＧ１－ＰＣ５、蛍光フローサイトメトリー用抗体である抗ＣＤ４５ＲＯ－ＰＣ５；アイソタイプコントロール抗体ＩｇＧ１－ＰＥ、蛍光フローサイトメトリー用抗体である抗ＣＣＲ７－ＰＥをそれぞれ２ｕｌ加え、沈殿物を軽くフリックして均一に混合させ、室温で遮光で３０分間インキュベートした後、ＰＢＳで１回洗浄し、４００μｌのＰＢＳを加え、細胞をフローサイトメトリー用チューブに移し、機器で検出した。
結果からみれば、Ｍｕｃ１ＣＡＲ－ａｎｔｉＰＤ１ Ｔ細胞が分泌するＰＤ－１一本鎖抗体は、Ｔ細胞表面のＰＤ－１タンパク質を良好にブロックことができ、且つＭｕｃ１ＣＡＲ Ｔ細胞およびＭｕｃ１ＣＡＲ－ａｎｔｉＰＤ１ Ｔ細胞はいずれも、インビトロで顕著な殺傷活性を有すると共に、メモリーＴの形成も促進でき、活性化標識ＣＤ２５はＭｏｃｋ Ｔ細胞よりも有意に高かったが、Ｍｕｃ１ＣＡＲ－ａｎｔｉＰＤ１ Ｔ細胞の除去標識ＬＡＧ３はＭｏｃｋ Ｔ細胞およびＭｕｃ１ＣＡＲ Ｔ細胞よりも有意に低く、具体的には図２９Ａ、２９Ｂに示す。
２、実施例２で得られたＭｕｃ１ＣＡＲ Ｔ細胞、およびｐＮＢ３２８－Ｍｕｃ１ＣＡ
ＲとｐＳ３２８－ｍ２７９Ｖプラスミドが導入されたＭｕｃ１ＣＡＲ－ａｎｔｉＰＤ１ Ｔ細胞を１×１０６個収集し、それぞれ１．５ｍｌ ＥＰチューブに入れ、ＰＢＳで２回洗浄し、１２００ｒｐｍで５分間遠心し、α－ＣＤ３ＣＤ４ＣＤ８抗体を２ｕｌ加え、室温で遮光で３０分間インキュベートし、ＰＢＳで１回洗浄し、４００ｕｌのＰＢＳを加え、細胞をフローサイトメトリー用チューブに移し、機器で検出した。
結果からみれば、Ｍｕｃ１ＣＡＲ Ｔ細胞、Ｍｕｃ１ＣＡＲ－ａｎｔｉＰＤ１ Ｔ細胞およびＭｏｃｋ ＴにおけるＣＤ３＋ＣＤ４＋、ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞が占める百分率は有意差がなく、具体的には図２９Ｃに示す。
３、２４ウェルプレートを５ｕｇ／ｍｌのＭｕｃ１抗原で４℃で一晩コーティングし、ＰＢＳで３回洗浄し、実施例２で得られたＭｏｃｋ Ｔ細胞、Ｍｕｃ１ＣＡＲ Ｔ細胞、およびｐＮＢ３２８－Ｍｕｃ１ＣＡＲとｐＳ３２８－ｍ２７９Ｖプラスミドが導入されたＭｕｃ１ＣＡＲ－ａｎｔｉＰＤ１ Ｔ細胞を３×１０５個加え、２４時間培養した後、細胞上澄を収集した。ＢＤＴＭＣＢＡ Ｈｕｍａｎ Ｔｈ１／Ｔｈ２サイトカインキットＩＩにより、Ｍｕｃ１ＣＡＲ Ｔ細胞およびＭｕｃ１ＣＡＲ－ａｎｔｉＰＤ１ Ｔ細胞がＭｕｃ１抗原による刺激を受けた後のサイトカインの分泌状況を検出した：
（１）ヒトＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ捕捉磁気ビーズを混合し、渦励振盪で捕捉磁気ビーズを均一に混合し、チューブ毎に均一に混合された磁気ビーズを５０ｕｌ入れた；
（２）５０ｕｌのヒトＴｈ１／Ｔｈ２サイトカイン標準サンプル（倍加希釈５０００ｐｇ／ｍｌ、２５００ｐｇ／ｍｌ、１２５０ｐｇ／ｍｌ、６２５ｐｇ／ｍｌ、３１２．５ｐｇ／ｍｌ、１５６ｐｇ／ｍｌ、８０ｐｇ／ｍｌ、４０ｐｇ／ｍｌ、２０ｐｇ／ｍｌ、０ｐｇ／ｍｌ）および５０ｕｌの被験サンプル（希釈剤で２倍に希釈されたもの）を加えた；
（３）チューブ毎にヒトＴｈ１／Ｔｈ２－ＩＩ－ＰＥ検出抗体を５０ｕｌ加えた；
（４）室温で遮光で３時間インキュベートした；
（５）チューブ毎に洗浄緩衝液を１ｍｌ加え、２００ｇで５分間遠心し、上澄を捨てた；
（６）チューブ毎に洗浄緩衝液を３００ｕｌ加えて細胞を再懸濁し、フローサイトメトリー用チューブに移し、フローサイトメーターで蛍光値を検出した。
結果からみれば、Ｍｕｃ１ＣＡＲ Ｔ細胞およびＭｕｃ１ＣＡＲ－ａｎｔｉＰＤ１ Ｔ細胞が分泌したＩＬ－２、ＴＮＦ－αおよびＩＦＮ－γはＭｏｃｋ Ｔ細胞に比べて大幅に向上したが、３種類の細胞が分泌したＩＬ－４、ＩＬ－６およびＩＬ－１０は有意差がなく、具体的には図２９Ｄに示す。
【0173】
実施例３５：Ｍｏｃｋ Ｔ細胞、Ｍｕｃ１ＣＡＲ Ｔ細胞およびＭｕｃ１ＣＡＲ－ａｎｔｉＰＤ１ Ｔ細胞のインビトロで培養腫瘍細胞に対する殺傷実験
ＭＨＣクラスＩタイピングが一致するエフェクター細胞とターゲット細胞を選択し、リアルタイムラベルフリー細胞機能アナライザー（ＲＴＣＡ）を用いて、細胞のインビトロ殺傷活性を検出し、具体的な手順は以下のようであった：
（１）ゼロ調整：各ウェルに５０μｌのＤＭＥＭまたは１６４０培地を加え、機器に入れ、ステップ１を選択し、ゼロを調整した；
（２）標的細胞プレーティング：子宮頸癌細胞Ｈｅｌａ、肝癌細胞ＨＣＣ－ＬＭ３、肺癌細胞Ａ５４９（アメリカ菌株保存機関ＡＴＣＣから購入）を、検出電極を備えたプレートに１ウェルあたり１０４個の細胞／５０μｌでプレーティングし、数分間放置し、細胞が安定になったら機器に入れ、ステップ２を開始し、細胞を培養した；
（３）エフェクター細胞の添加：ターゲット細胞を２４時間培養した後、ステップ２を一時停止し、エフェクター細胞（実施例２で得られたＭｏｃｋ Ｔ細胞、Ｍｕｃ１ＣＡＲ
Ｔ細胞、およびｐＮＢ３２８－Ｍｕｃ１ＣＡＲとｐＳ３２８－ｍ２７９Ｖプラスミドが導入されたＭｕｃ１ＣＡＲ－ａｎｔｉＰＤ１ Ｔ細胞）を５０μｌ／ウェル加え、エフェクター／ターゲット比を４：１に設定し、プラスミドが導入されないＭｏｃｋ Ｔ細胞を対照として、ステップ３を開始し、共培養を２４時間継続した後、細胞増殖曲線を観察し
た。
結果から分かるように、ＰＤ－１抗体を発現するＭｕｃ１ＣＡＲ Ｔ細胞は３種類の腫瘍細胞に対する殺傷はいずれも、Ｍｕｃ１ＣＡＲ Ｔ細胞よりも優れた。具体的には図３０に示す。
ＭＨＣクラスＩタイピングが一致するエフェクター細胞とターゲット細胞を選択し、リアルタイムラベルフリー細胞機能アナライザー（ＲＴＣＡ）を用いて、細胞のインビトロ殺傷活性を検出し、具体的な手順は以下のようであった：
（１）ゼロ調整：各ウェルに５０μｌのＤＭＥＭまたは１６４０培地を加え、機器に入れ、ステップ１を選択し、ゼロを調整した；
（２）標的細胞プレーティング：子宮頸癌細胞Ｈｅｌａ、肝癌細胞ＨＣＣ－ＬＭ３、肺癌細胞Ａ５４９（アメリカ菌株保存機関ＡＴＣＣから購入）を、検出電極を備えたプレートに１ウェルあたり１０４個の細胞／５０μｌでプレーティングし、数分間放置し、細胞が安定になったら機器に入れ、ステップ２を開始し、細胞を培養した；
（３）エフェクター細胞の添加：ターゲット細胞を２４時間培養した後、ステップ２を一時停止し、エフェクター細胞（実施例２で得られたＭｏｃｋ Ｔ細胞、Ｍｕｃ１ＣＡＲ
Ｔ細胞、およびｐＮＢ３２８－Ｍｕｃ１ＣＡＲとｐＳ３２８－ｍ２７９Ｖプラスミドが導入されたＭｕｃ１ＣＡＲ－ａｎｔｉＰＤ１ Ｔ細胞）を５０μｌ／ウェル加え、エフェクター／ターゲット比を４：１に設定し、プラスミドが導入されないＭｏｃｋ Ｔ細胞を対照として、ステップ３を開始し、共培養を２４時間継続した後、細胞増殖曲線を観察し
た。
結果から分かるように、ＰＤ－１抗体を発現するＭｕｃ１ＣＡＲ Ｔ細胞は３種類の腫瘍細胞に対する殺傷はいずれも、Ｍｕｃ１ＣＡＲ Ｔ細胞よりも優れた。具体的には図３０に示す。
【0174】
実施例３６：ＰＤ－１抗体を発現するＭｕｃ１ＣＡＲ Ｔ細胞のインビボ機能研究
ステップ１：北京Ｖｉｔａｌｓｔａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社より提供され、ＳＰＦレベルの動物実験室で飼育された４～６週齢の平均体重２２～２７ｇの１５匹のＮＳＧ完全免疫不全マウスが使用された。
ステップ２：ヒト子宮頸癌細胞Ｈｅｌａをインビトロで培養し、対数増殖期にある付着増殖細胞を取り、０．２５％トリプシンで消化し、遠心して細胞を収集した後、ＰＢＳで再懸濁し、３０００ｇで室温で２分間遠心し、上澄を捨て、もう一回ＰＢＳ液で再懸濁した後、遠心で細胞を収集し、細胞懸濁液の濃度を５×１０７個／ｍｌに調整した。
ステップ３：Ｈｅｌａ－ｌｕｃ細胞をマウスの右側のリブ裏側に０．１ｍｌ／匹で皮下接種した。接種後約１０日で、腫瘍のサイズをインビボイメージャーで観察することにより、ＮＳＧ免疫不全マウスを、１群につき５匹で、、無作為に４つの群に分け、それぞれＰＢＳおよび実施例２で得られたＭｏｃｋ Ｔ細胞、Ｍｕｃ１ＣＡＲ Ｔ細胞、ｐＮＢ３２８－Ｍｕｃ１ＣＡＲとｐＳ３２８－ｍ２７９Ｖ－ｗｔが導入されたＭｕｃ１ＣＡＲ－ａｎｔｉＰＤ１－ｗｔ Ｔ細胞、およびｐＮＢ３２８－Ｍｕｃ１ＣＡＲとｐＳ３２８－ｍ２７９Ｖプラスミドが導入されたＭｕｃ１ＣＡＲ－ａｎｔｉＰＤ１ Ｔ細胞（１×１０７個／匹）、ＰＢＳ群に１００ｕｌのＰＢＳを投与した。投与経路は尾静脈注射であった。
ステップ４：毎日マウスの生存状態を観察し、且つ１０日おきにインビボイメージャーでマウス腫瘍の変化を観察した。
結果は図３１に示す。
ステップ１：北京Ｖｉｔａｌｓｔａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社より提供され、ＳＰＦレベルの動物実験室で飼育された４～６週齢の平均体重２２～２７ｇの１５匹のＮＳＧ完全免疫不全マウスが使用された。
ステップ２：ヒト子宮頸癌細胞Ｈｅｌａをインビトロで培養し、対数増殖期にある付着増殖細胞を取り、０．２５％トリプシンで消化し、遠心して細胞を収集した後、ＰＢＳで再懸濁し、３０００ｇで室温で２分間遠心し、上澄を捨て、もう一回ＰＢＳ液で再懸濁した後、遠心で細胞を収集し、細胞懸濁液の濃度を５×１０７個／ｍｌに調整した。
ステップ３：Ｈｅｌａ－ｌｕｃ細胞をマウスの右側のリブ裏側に０．１ｍｌ／匹で皮下接種した。接種後約１０日で、腫瘍のサイズをインビボイメージャーで観察することにより、ＮＳＧ免疫不全マウスを、１群につき５匹で、、無作為に４つの群に分け、それぞれＰＢＳおよび実施例２で得られたＭｏｃｋ Ｔ細胞、Ｍｕｃ１ＣＡＲ Ｔ細胞、ｐＮＢ３２８－Ｍｕｃ１ＣＡＲとｐＳ３２８－ｍ２７９Ｖ－ｗｔが導入されたＭｕｃ１ＣＡＲ－ａｎｔｉＰＤ１－ｗｔ Ｔ細胞、およびｐＮＢ３２８－Ｍｕｃ１ＣＡＲとｐＳ３２８－ｍ２７９Ｖプラスミドが導入されたＭｕｃ１ＣＡＲ－ａｎｔｉＰＤ１ Ｔ細胞（１×１０７個／匹）、ＰＢＳ群に１００ｕｌのＰＢＳを投与した。投与経路は尾静脈注射であった。
ステップ４：毎日マウスの生存状態を観察し、且つ１０日おきにインビボイメージャーでマウス腫瘍の変化を観察した。
結果は図３１に示す。
【0175】
実施例３７：Ｍｏｃｋ Ｔ細胞、ＥＧＦＲ－ＣＡＲ Ｔ細胞およびαＣＤ４７－ＥＧＦＲ－ＣＡＲ Ｔ細胞のＣＤ４７発現の検出
実施例２で構築したＭｏｃｋ Ｔ細胞、ＥＧＦＲ－ＣＡＲ Ｔ細胞およびαＣＤ４７－ＥＧＦＲ－ＣＡＲ Ｔ細胞を収集し、ＢＤ社のフローサイトメトリー用抗体であるマウス抗ヒトＣＤ４７－ＦＩＴＣでＣＤ４７の発現を検出し、フローサイトメトリー方法は実施例３と同様であった。
結果は図３２に示すように、αＣＤ４７－ＥＧＦＲ－ＣＡＲ Ｔが分泌したＣＤ４７抗体は細胞自体のＣＤ４７発現をブロックできた。
実施例２で構築したＭｏｃｋ Ｔ細胞、ＥＧＦＲ－ＣＡＲ Ｔ細胞およびαＣＤ４７－ＥＧＦＲ－ＣＡＲ Ｔ細胞を収集し、ＢＤ社のフローサイトメトリー用抗体であるマウス抗ヒトＣＤ４７－ＦＩＴＣでＣＤ４７の発現を検出し、フローサイトメトリー方法は実施例３と同様であった。
結果は図３２に示すように、αＣＤ４７－ＥＧＦＲ－ＣＡＲ Ｔが分泌したＣＤ４７抗体は細胞自体のＣＤ４７発現をブロックできた。
【0176】
実施例３８：Ｍｏｃｋ Ｔ細胞、ＥＧＦＲ－ＣＡＲ Ｔ細胞およびαＣＤ４７－ＥＧＦＲ－ＣＡＲ Ｔ細胞の腫瘍細胞に対する殺傷効果
肺癌細胞株Ｈ２３、卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ３、膵癌細胞株ＡＳＰＣ－１という３種類のＥＧＦＲ陽性細胞をターゲット細胞として選択し、ＡＣＥＡ社のリアルタイムラベルフリー細胞機能アナライザー（ＲＴＣＡ）を用いて、実施例２で得られたＭｏｃｋ Ｔ細胞、ＥＧＦＲ－ＣＡＲ Ｔ細胞およびαＣＤ４７－ＥＧＦＲ－ＣＡＲ Ｔ細胞のインビトロ殺傷活性を検出し、具体的な手順は以下のようであった：
（１）ゼロ調整：各ウェルに５０μｌのＤＭＥＭまたは１６４０培地を加え、機器に入れ、ステップ１を選択し、ゼロを調整した；
（２）標的細胞プレーティング：肺癌細胞株Ｈ２３、卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ３、膵癌細胞株ＡＳＰＣ－１（アメリカ菌株保存機関ＡＴＣＣから購入）を、検出電極を備えたプレートに１ウェルあたり１０４個の細胞／５０μｌでプレーティングし、数分間放置し、細胞が安定になったら機器に入れ、ステップ２を開始し、細胞を培養した；
（３）エフェクター細胞の添加：ターゲット細胞を２４時間培養した後、ステップ２を一時停止し、エフェクター細胞を５０μｌ／ウェル加え、エフェクター／ターゲット比を４：１に設定し、ｐＮＢ３２８空ベクターが導入されたＭｏｃｋ Ｔ細胞を対照として、
ステップ３を開始し、共培養を２４時間継続した後、細胞増殖曲線を観察した。
結果は図３３に示す。ＥＧＦＲ－ＣＡＲ Ｔ細胞およびαＣＤ４７－ＥＧＦＲ－ＣＡＲ
Ｔ細胞のインビトロ殺傷活性はＭｏｃｋ Ｔ細胞よりも有意に高く、且つＣＤ４７抗体の自己発現はＣＡＲ－Ｔ細胞の殺傷機能に影響を与えなかった。
肺癌細胞株Ｈ２３、卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ３、膵癌細胞株ＡＳＰＣ－１という３種類のＥＧＦＲ陽性細胞をターゲット細胞として選択し、ＡＣＥＡ社のリアルタイムラベルフリー細胞機能アナライザー（ＲＴＣＡ）を用いて、実施例２で得られたＭｏｃｋ Ｔ細胞、ＥＧＦＲ－ＣＡＲ Ｔ細胞およびαＣＤ４７－ＥＧＦＲ－ＣＡＲ Ｔ細胞のインビトロ殺傷活性を検出し、具体的な手順は以下のようであった：
（１）ゼロ調整：各ウェルに５０μｌのＤＭＥＭまたは１６４０培地を加え、機器に入れ、ステップ１を選択し、ゼロを調整した；
（２）標的細胞プレーティング：肺癌細胞株Ｈ２３、卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ３、膵癌細胞株ＡＳＰＣ－１（アメリカ菌株保存機関ＡＴＣＣから購入）を、検出電極を備えたプレートに１ウェルあたり１０４個の細胞／５０μｌでプレーティングし、数分間放置し、細胞が安定になったら機器に入れ、ステップ２を開始し、細胞を培養した；
（３）エフェクター細胞の添加：ターゲット細胞を２４時間培養した後、ステップ２を一時停止し、エフェクター細胞を５０μｌ／ウェル加え、エフェクター／ターゲット比を４：１に設定し、ｐＮＢ３２８空ベクターが導入されたＭｏｃｋ Ｔ細胞を対照として、
ステップ３を開始し、共培養を２４時間継続した後、細胞増殖曲線を観察した。
結果は図３３に示す。ＥＧＦＲ－ＣＡＲ Ｔ細胞およびαＣＤ４７－ＥＧＦＲ－ＣＡＲ
Ｔ細胞のインビトロ殺傷活性はＭｏｃｋ Ｔ細胞よりも有意に高く、且つＣＤ４７抗体の自己発現はＣＡＲ－Ｔ細胞の殺傷機能に影響を与えなかった。
【0177】
実施例３９：αＣＤ４７－ＥＧＦＲ－ＣＡＲ Ｔ細胞培養上澄は腫瘍細胞表面のＣＤ４７をブロックできる
実施例２で得られたαＣＤ４７－ＥＧＦＲ－ＣＡＲ Ｔ細胞の培養上澄を、肺癌細胞株Ｈ２３、卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ３、膵癌細胞株ＡＳＰＣ－１のそれぞれと共培養し、２４時間後に腫瘍細胞を収集し、αＣＤ４７－ＥＧＦＲ－ＣＡＲ Ｔ細胞上澄と共培養されないものを対照として、ＣＤ４７の発現を検出した。フローサイトメトリー検出方法は実施例３と同様であった。
結果は図３４に示すように、αＣＤ４７－ＥＧＦＲ－ＣＡＲ Ｔ細胞上澄におけるＣＤ４７抗体は腫瘍細胞表面のＣＤ４７をブロックできた。
実施例２で得られたαＣＤ４７－ＥＧＦＲ－ＣＡＲ Ｔ細胞の培養上澄を、肺癌細胞株Ｈ２３、卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ３、膵癌細胞株ＡＳＰＣ－１のそれぞれと共培養し、２４時間後に腫瘍細胞を収集し、αＣＤ４７－ＥＧＦＲ－ＣＡＲ Ｔ細胞上澄と共培養されないものを対照として、ＣＤ４７の発現を検出した。フローサイトメトリー検出方法は実施例３と同様であった。
結果は図３４に示すように、αＣＤ４７－ＥＧＦＲ－ＣＡＲ Ｔ細胞上澄におけるＣＤ４７抗体は腫瘍細胞表面のＣＤ４７をブロックできた。
【0178】
実施例４０：腫瘍細胞表面のＣＤ４７のブロッキングは、それに対するマクロファージの貪食作用を向上させることができる
１． マクロファージの分離と培養：フィコール密度勾配遠心分離法で末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を分離し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで４時間付着培養し、付着しなかった細胞を予熱した培地で洗い流し、ＡＩＭ－Ｖ培地およびｒｈＧＭ－ＣＳＦ（最終濃度１０００Ｕ／ｍｌ）を添加した。２日間おきに半分の量で液体を取替え、７日間培養し、付着細胞としてマクロファージを得た。
２． 腫瘍細胞に対するマクロファージの貪食作用：腫瘍細胞をＨｏｅｃｈｓｔ染料で青色に染色し、マクロファージをＣＭ－Ｄｉｌで赤色に染色し、具体的な染色方法は染料の取扱説明書を参照した。染色された２種類の細胞を混合し、２つの部分に分け、１つの部分には実施例２で構築したＥＧＦＲ－ＣＡＲ Ｔ細胞の培養上澄を対照として加え、もう１つの部分には実施例２で構築したαＣＤ４７－ＥＧＦＲ－ＣＡＲ Ｔ細胞の培養上澄を加え、共焦点顕微鏡で貪食作用を観察し、且つカウントで貪食効率を統計した。
結果は図３５に示すように、αＣＤ４７－ＥＧＦＲ－ＣＡＲ Ｔ細胞の培養上澄が加えられた群では、そのマクロファージの貪食作用が対照群よりも有意に高かった。
１． マクロファージの分離と培養：フィコール密度勾配遠心分離法で末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を分離し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで４時間付着培養し、付着しなかった細胞を予熱した培地で洗い流し、ＡＩＭ－Ｖ培地およびｒｈＧＭ－ＣＳＦ（最終濃度１０００Ｕ／ｍｌ）を添加した。２日間おきに半分の量で液体を取替え、７日間培養し、付着細胞としてマクロファージを得た。
２． 腫瘍細胞に対するマクロファージの貪食作用：腫瘍細胞をＨｏｅｃｈｓｔ染料で青色に染色し、マクロファージをＣＭ－Ｄｉｌで赤色に染色し、具体的な染色方法は染料の取扱説明書を参照した。染色された２種類の細胞を混合し、２つの部分に分け、１つの部分には実施例２で構築したＥＧＦＲ－ＣＡＲ Ｔ細胞の培養上澄を対照として加え、もう１つの部分には実施例２で構築したαＣＤ４７－ＥＧＦＲ－ＣＡＲ Ｔ細胞の培養上澄を加え、共焦点顕微鏡で貪食作用を観察し、且つカウントで貪食効率を統計した。
結果は図３５に示すように、αＣＤ４７－ＥＧＦＲ－ＣＡＲ Ｔ細胞の培養上澄が加えられた群では、そのマクロファージの貪食作用が対照群よりも有意に高かった。
【0179】
実施例４１：αＣＤ４７－ＥＧＦＲ－ＣＡＲ Ｔ細胞のインビボ抗腫瘍効果
４～６週齢のＮＳＧマウスを２０匹購入し、１群につき４匹で、５つの群に平均に分け、肺癌細胞株Ｈ２３を１×１０７個の細胞／匹で接種し、腫瘍形成後１０日で、それぞれＰＢＳおよび実施例２で得られたＭｏｃｋ－Ｔ細胞、ＥＧＦＲ－ＣＡＲ Ｔ細胞、ｗｔ－αＣＤ４７－ＥＧＦＲ－ＣＡＲ Ｔ細胞、およびαＣＤ４７－ＥＧＦＲ－ＣＡＲ Ｔ細胞を尾静脈注射し、各群に相応のＴ細胞を１×１０７個／１００ｕｌで注射し、ＰＢＳ群に１００ｕｌのＰＢＳを投与し、腫瘍サイズを観察して記録した。結果から分かるように、ＰＢＳ、Ｍｏｃｋ Ｔ細胞、ｗｔ－αＣＤ４７－ＥＧＦＲ－ＣＡＲ Ｔ細胞は腫瘍モデルに治療効果を有しないが、ＥＧＦＲ－ＣＡＲ Ｔ細胞およびαＣＤ４７－ＥＧＦＲ－ＣＡＲ Ｔ細胞はいずれも良好な抗腫瘍効果を有し、且つαＣＤ４７－ＥＧＦＲ－ＣＡＲ Ｔ細胞の効果がより優れた。具体的には図３６に示す。
４～６週齢のＮＳＧマウスを２０匹購入し、１群につき４匹で、５つの群に平均に分け、肺癌細胞株Ｈ２３を１×１０７個の細胞／匹で接種し、腫瘍形成後１０日で、それぞれＰＢＳおよび実施例２で得られたＭｏｃｋ－Ｔ細胞、ＥＧＦＲ－ＣＡＲ Ｔ細胞、ｗｔ－αＣＤ４７－ＥＧＦＲ－ＣＡＲ Ｔ細胞、およびαＣＤ４７－ＥＧＦＲ－ＣＡＲ Ｔ細胞を尾静脈注射し、各群に相応のＴ細胞を１×１０７個／１００ｕｌで注射し、ＰＢＳ群に１００ｕｌのＰＢＳを投与し、腫瘍サイズを観察して記録した。結果から分かるように、ＰＢＳ、Ｍｏｃｋ Ｔ細胞、ｗｔ－αＣＤ４７－ＥＧＦＲ－ＣＡＲ Ｔ細胞は腫瘍モデルに治療効果を有しないが、ＥＧＦＲ－ＣＡＲ Ｔ細胞およびαＣＤ４７－ＥＧＦＲ－ＣＡＲ Ｔ細胞はいずれも良好な抗腫瘍効果を有し、且つαＣＤ４７－ＥＧＦＲ－ＣＡＲ Ｔ細胞の効果がより優れた。具体的には図３６に示す。
【0180】
実施例４２：Ｍｏｃｋ、Ｍｅｓｏ３ＣＡＲおよびαＣＤ４７－Ｍｅｓｏ３ＣＡＲ Ｔ細胞のＣＤ４７発現の検出
実施例２で構築したＭｏｃｋ Ｔ細胞、Ｍｅｓｏ３ＣＡＲ Ｔ細胞およびαＣＤ４７－Ｍｅｓｏ３ＣＡＲ Ｔ細胞を収集し、ＢＤ社のフローサイトメトリー用抗体であるＦＩＴＣ－マウス抗ヒトＣＤ４７でＰＤ１の発現を検出し、フローサイトメトリー方法は実施例３と同様であった。
結果は図３７に示すように、αＣＤ４７－Ｍｅｓｏ３ＣＡＲ Ｔが分泌したＣＤ４７抗
体は細胞表面のＣＤ４７発現をブロックできた。
実施例２で構築したＭｏｃｋ Ｔ細胞、Ｍｅｓｏ３ＣＡＲ Ｔ細胞およびαＣＤ４７－Ｍｅｓｏ３ＣＡＲ Ｔ細胞を収集し、ＢＤ社のフローサイトメトリー用抗体であるＦＩＴＣ－マウス抗ヒトＣＤ４７でＰＤ１の発現を検出し、フローサイトメトリー方法は実施例３と同様であった。
結果は図３７に示すように、αＣＤ４７－Ｍｅｓｏ３ＣＡＲ Ｔが分泌したＣＤ４７抗
体は細胞表面のＣＤ４７発現をブロックできた。
【0181】
実施例４３：Ｍｏｃｋ、Ｍｅｓｏ３ＣＡＲおよびαＣＤ４７－Ｍｅｓｏ３ＣＡＲ Ｔ細胞の腫瘍細胞に対する殺傷効果
胃癌細胞株Ｈｇｃ２７、卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ３、膵癌細胞株ＡＳＰＣ－１という３種類のＥＧＦＲ陽性細胞をターゲット細胞として選択し、ＡＣＥＡ社のリアルタイムラベルフリー細胞機能アナライザー（ＲＴＣＡ）を用いて、実施例２で得られたＭｏｃｋ、Ｍｅｓｏ３ＣＡＲおよびαＣＤ４７－Ｍｅｓｏ３ＣＡＲ Ｔ細胞のインビトロ殺傷活性を検出し、具体的な手順は以下のようであった：
（１）ゼロ調整：各ウェルに５０μｌのＤＭＥＭまたは１６４０培地を加え、機器に入れ、ステップ１を選択し、ゼロを調整した；
（２）標的細胞プレーティング：胃癌細胞株Ｈｇｃ２７、卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ３、膵癌細胞株ＡＳＰＣ－１（アメリカ菌株保存機関ＡＴＣＣから購入）を、検出電極を備えたプレートに１ウェルあたり１０４個の細胞／５０μｌでプレーティングし、数分間放置し、細胞が安定になったら機器に入れ、ステップ２を開始し、細胞を培養した；
（３）エフェクター細胞の添加：ターゲット細胞を２４時間培養した後、ステップ２を一時停止し、エフェクター細胞を５０μｌ／ウェル加え、エフェクター／ターゲット比を４：１に設定し、ｐＮＢ３２８空ベクターが導入されたＭｏｃｋ Ｔ細胞を対照として、ステップ３を開始し、共培養を２４時間継続した後、細胞増殖曲線を観察した。
結果は図３８に示す。Ｍｅｓｏ３ＣＡＲおよびαＣＤ４７－Ｍｅｓｏ３ＣＡＲ Ｔ細胞のインビトロ殺傷活性はＭｏｃｋ Ｔ細胞よりも有意に高く、且つＣＤ４７抗体の発現はＣＡＲ－Ｔ細胞の殺傷機能に影響を与えなかった。
胃癌細胞株Ｈｇｃ２７、卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ３、膵癌細胞株ＡＳＰＣ－１という３種類のＥＧＦＲ陽性細胞をターゲット細胞として選択し、ＡＣＥＡ社のリアルタイムラベルフリー細胞機能アナライザー（ＲＴＣＡ）を用いて、実施例２で得られたＭｏｃｋ、Ｍｅｓｏ３ＣＡＲおよびαＣＤ４７－Ｍｅｓｏ３ＣＡＲ Ｔ細胞のインビトロ殺傷活性を検出し、具体的な手順は以下のようであった：
（１）ゼロ調整：各ウェルに５０μｌのＤＭＥＭまたは１６４０培地を加え、機器に入れ、ステップ１を選択し、ゼロを調整した；
（２）標的細胞プレーティング：胃癌細胞株Ｈｇｃ２７、卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ３、膵癌細胞株ＡＳＰＣ－１（アメリカ菌株保存機関ＡＴＣＣから購入）を、検出電極を備えたプレートに１ウェルあたり１０４個の細胞／５０μｌでプレーティングし、数分間放置し、細胞が安定になったら機器に入れ、ステップ２を開始し、細胞を培養した；
（３）エフェクター細胞の添加：ターゲット細胞を２４時間培養した後、ステップ２を一時停止し、エフェクター細胞を５０μｌ／ウェル加え、エフェクター／ターゲット比を４：１に設定し、ｐＮＢ３２８空ベクターが導入されたＭｏｃｋ Ｔ細胞を対照として、ステップ３を開始し、共培養を２４時間継続した後、細胞増殖曲線を観察した。
結果は図３８に示す。Ｍｅｓｏ３ＣＡＲおよびαＣＤ４７－Ｍｅｓｏ３ＣＡＲ Ｔ細胞のインビトロ殺傷活性はＭｏｃｋ Ｔ細胞よりも有意に高く、且つＣＤ４７抗体の発現はＣＡＲ－Ｔ細胞の殺傷機能に影響を与えなかった。
【0182】
実施例４４：αＣＤ４７－Ｍｅｓｏ３ＣＡＲ Ｔ細胞培養上澄は腫瘍細胞表面のＣＤ４７をブロックできる
実施例２で得られたαＣＤ４７－Ｍｅｓｏ３ＣＡＲ Ｔ細胞の培養上澄を、胃癌細胞株Ｈｇｃ２７、卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ３、膵癌細胞株ＡＳＰＣ－１のそれぞれと共培養し、２４時間後に腫瘍細胞を収集し、αＣＤ４７－Ｍｅｓｏ３ＣＡＲ Ｔ細胞上澄と共培養されないものを対照として、ＣＤ４７の発現を検出した。フローサイトメトリー検出方法は上記と同様であった。
結果は図３９に示すように、αＣＤ４７－Ｍｅｓｏ３ＣＡＲ Ｔ細胞上澄におけるＣＤ４７抗体は腫瘍細胞表面のＣＤ４７をブロックできた。
実施例２で得られたαＣＤ４７－Ｍｅｓｏ３ＣＡＲ Ｔ細胞の培養上澄を、胃癌細胞株Ｈｇｃ２７、卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ３、膵癌細胞株ＡＳＰＣ－１のそれぞれと共培養し、２４時間後に腫瘍細胞を収集し、αＣＤ４７－Ｍｅｓｏ３ＣＡＲ Ｔ細胞上澄と共培養されないものを対照として、ＣＤ４７の発現を検出した。フローサイトメトリー検出方法は上記と同様であった。
結果は図３９に示すように、αＣＤ４７－Ｍｅｓｏ３ＣＡＲ Ｔ細胞上澄におけるＣＤ４７抗体は腫瘍細胞表面のＣＤ４７をブロックできた。
【0183】
実施例４５：腫瘍細胞表面のＣＤ４７のブロッキングは、それに対するマクロファージの貪食作用を向上させることができる
１、マクロファージの分離と培養：フィコール密度勾配遠心分離法で末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を分離し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで４時間付着培養し、付着しなかった細胞を予熱した培地で洗い流し、ＡＩＭ－Ｖ培地およびｒｈＧＭ－ＣＳＦ（最終濃度１０００Ｕ／ｍｌ）を添加した。２日間おきに半分の量で液体を取替え、７日間培養し、付着細胞としてマクロファージを得た。
２、腫瘍細胞に対するマクロファージの貪食作用：腫瘍細胞をＨｏｅｃｈｓｔ染料で青色に染色し、マクロファージをＣＭ－Ｄｉｌで赤色に染色し、具体的な染色方法は染料の取扱説明書を参照した。染色された２種類の細胞を混合し、２つの部分に分け、１つの部分には実施例２で構築したＭｅｓｏ３ＣＡＲ Ｔ細胞の培養上澄を対照として加え、もう１つの部分には実施例２で構築したαＣＤ４７－Ｍｅｓｏ３ＣＡＲ Ｔ細胞の培養上澄を加え、共焦点顕微鏡で貪食作用を観察し、且つカウントで貪食効率を統計した。
結果からみれば、αＣＤ４７－Ｍｅｓｏ３ＣＡＲ Ｔ細胞の培養上澄が加えられた群では、そのマクロファージの貪食作用が対照群よりも有意に高かった。統計結果は図４０に示す。
１、マクロファージの分離と培養：フィコール密度勾配遠心分離法で末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を分離し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで４時間付着培養し、付着しなかった細胞を予熱した培地で洗い流し、ＡＩＭ－Ｖ培地およびｒｈＧＭ－ＣＳＦ（最終濃度１０００Ｕ／ｍｌ）を添加した。２日間おきに半分の量で液体を取替え、７日間培養し、付着細胞としてマクロファージを得た。
２、腫瘍細胞に対するマクロファージの貪食作用：腫瘍細胞をＨｏｅｃｈｓｔ染料で青色に染色し、マクロファージをＣＭ－Ｄｉｌで赤色に染色し、具体的な染色方法は染料の取扱説明書を参照した。染色された２種類の細胞を混合し、２つの部分に分け、１つの部分には実施例２で構築したＭｅｓｏ３ＣＡＲ Ｔ細胞の培養上澄を対照として加え、もう１つの部分には実施例２で構築したαＣＤ４７－Ｍｅｓｏ３ＣＡＲ Ｔ細胞の培養上澄を加え、共焦点顕微鏡で貪食作用を観察し、且つカウントで貪食効率を統計した。
結果からみれば、αＣＤ４７－Ｍｅｓｏ３ＣＡＲ Ｔ細胞の培養上澄が加えられた群では、そのマクロファージの貪食作用が対照群よりも有意に高かった。統計結果は図４０に示す。
【0184】
実施例４６：αＣＤ４７－Ｍｅｓｏ３ＣＡＲ Ｔ細胞のインビボ抗腫瘍効果
４～６週齢のＮＳＧマウスを２０匹購入し、１群につき４匹で、５つの群に平均に分け、肺癌細胞株Ｈ２３を１×１０７個／匹で接種し、腫瘍形成後１０日で、それぞれＰＢＳおよび実施例２で得られたＭｏｃｋ、Ｍｅｓｏ３ＣＡＲ、ｗｔ－αＣＤ４７－Ｍｅｓｏ３ＣＡＲ、αＣＤ４７－Ｍｅｓｏ３ＣＡＲ Ｔ細胞を（１×１０７個／匹で）尾静脈注射し、ＰＢＳ群に１００ｕｌのＰＢＳを投与し、腫瘍サイズを観察して記録した。
結果から分かるように、ＰＢＳ、Ｍｏｃｋ、ｗｔ－αＣＤ４７－Ｍｅｓｏ３ＣＡＲ Ｔ細胞は腫瘍モデルに治療効果を有しないが、αＣＤ４７－Ｍｅｓｏ３ＣＡＲ Ｔ細胞は良好な抗腫瘍効果を有した。
具体的には図４１に示す。
４～６週齢のＮＳＧマウスを２０匹購入し、１群につき４匹で、５つの群に平均に分け、肺癌細胞株Ｈ２３を１×１０７個／匹で接種し、腫瘍形成後１０日で、それぞれＰＢＳおよび実施例２で得られたＭｏｃｋ、Ｍｅｓｏ３ＣＡＲ、ｗｔ－αＣＤ４７－Ｍｅｓｏ３ＣＡＲ、αＣＤ４７－Ｍｅｓｏ３ＣＡＲ Ｔ細胞を（１×１０７個／匹で）尾静脈注射し、ＰＢＳ群に１００ｕｌのＰＢＳを投与し、腫瘍サイズを観察して記録した。
結果から分かるように、ＰＢＳ、Ｍｏｃｋ、ｗｔ－αＣＤ４７－Ｍｅｓｏ３ＣＡＲ Ｔ細胞は腫瘍モデルに治療効果を有しないが、αＣＤ４７－Ｍｅｓｏ３ＣＡＲ Ｔ細胞は良好な抗腫瘍効果を有した。
具体的には図４１に示す。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【図9D】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14A】
【図14B】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図19-1】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25A】
【図25B】
【図25C】
【図25D】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29A】
【図29B】
【図29C】
【図29D】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33】
【図34】
【図35】
【図36】
【図37】
【図38】
【図39】
【図40】
【図41】
