特許 7431359 眼咽頭型筋ジストロフィー（ＯＰＭＤ）を治療するための試薬及びその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-02-05

(45)【発行日】2024-02-14

(54)【発明の名称】眼咽頭型筋ジストロフィー（ＯＰＭＤ）を治療するための試薬及びその使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/113 20100101AFI20240206BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240206BHJP

   C12N 15/864 20060101ALI20240206BHJP

   C12N 15/867 20060101ALI20240206BHJP

   C12N 15/861 20060101ALI20240206BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20240206BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20240206BHJP

   A61K 31/7105 20060101ALI20240206BHJP

   A61K 31/711 20060101ALI20240206BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20240206BHJP

   A61K 35/761 20150101ALI20240206BHJP

   A61P 11/04 20060101ALI20240206BHJP

   A61P 27/02 20060101ALI20240206BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240206BHJP

   A61P 21/04 20060101ALI20240206BHJP

【ＦＩ】

C12N15/113 Z ZNA

C12N15/63 Z

C12N15/864 100Z

C12N15/867 Z

C12N15/861 Z

A61K31/7088

A61K48/00

A61K31/7105

A61K31/711

A61K35/76

A61K35/761

A61P11/04

A61P27/02

A61P43/00 105

A61P21/04

【請求項の数】 24

(21)【出願番号】P 2023023159

(22)【出願日】2023-02-17

(62)【分割の表示】P 2019532105の分割

【原出願日】2017-12-14

(65)【公開番号】P2023062092

(43)【公開日】2023-05-02

【審査請求日】2023-03-01

(31)【優先権主張番号】62/434,312

(32)【優先日】2016-12-14

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】521375829

【氏名又は名称】ベニテック アイピー ホールディングス インコーポレーテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110002572

【氏名又は名称】弁理士法人平木国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ストリングス－ウフォムバー，ヴァネッサ

(72)【発明者】

【氏名】スーイ，デイヴィッド

【審査官】上條 のぶよ

(56)【参考文献】

【文献】AGING，2013年，Vol.5, No.6，p.412-426

【文献】Human molecular genetics，2010年，19(6)，1058-1065

【文献】Journal of Neuromuscular diseases，2014年，Vol.1，p.S222, PS2-220/#515

【文献】Molecular Therapy，2016年03月，Vol.24, Supplement 1，p.S199, 501

【文献】French P.，BENITEC FEATURED AT CHI’S “DISCOVERY ON TARGET” CONFERENCE，BENITEC BIOPHARMA ASX ANNOUNCEMENT，2015年09月23日，https://blt.live.irmau.com/irm/PDF/1609_0

【文献】Cold Spring Harb Perspect Biol，2010年，Vol.2，a003640

【文献】Cell Reports，2013年，Vol.5，p.1704-1713

【文献】Advanced Drug Delivery Reviews，2009年，Vol.61，p.650-664

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ

Ａ６１Ｋ

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

PABPN1の転写物を標的とする低分子ヘアピンマイクロRNA(shmiR)をコードするDNA配列を含む核酸を含むDNA特異的RNA干渉(ddRNAi)構築物であって、前記shmiRが、
少なくとも17ヌクレオチド長のエフェクター配列と、
エフェクター相補配列と、
ステムループ配列と、
プライマリーマイクロRNA(pri-miRNA)骨格と、
を含み、
前記エフェクター配列が、配列番号９に記載のRNA転写物内における対応する長さの領域に対して相補的である、
前記ddRNAi構築物。

【請求項2】

前記shmiRが、配列番号３１に記載のエフェクター配列及び配列番号３０に記載のエフェクター相補配列を含む、請求項１記載のddRNAi構築物。

【請求項3】

(a) 前記shmiRが、5'→3'方向に、
(i) 前記pri-miRNA骨格の5'隣接配列、
前記エフェクター相補配列、
前記ステムループ配列、
前記エフェクター配列、及び
前記pri-miRNA骨格の3'隣接配列；又は、
(ii) 前記pri-miRNA骨格の5'隣接配列、
前記エフェクター配列、
前記ステムループ配列、
前記エフェクター相補配列、及び
前記pri-miRNA骨格の3'隣接配列
を含み、
(b) 前記ステムループ配列が、配列番号４０に記載の配列であり、
(c) 前記pri-miRNA骨格が、pri-miR-30a骨格であり、且つ/又は、
(d) 前記pri-miRNA骨格が、配列番号４１に記載の5'隣接配列及び配列番号４２に記載の3'隣接配列を含む、
請求項１記載のddRNAi構築物。

【請求項4】

前記shmiRが、配列番号５１に記載の配列を含み、且つ/又は、
前記shmiRをコードする前記DNA配列が、配列番号６４に記載されるものである、
請求項３記載のddRNAi構築物。

【請求項5】

PABPN1の転写物を標的とする更なるshmiRをコードするDNA配列を含む少なくとも1種の更なる核酸を含み、
前記更なるshmiRが、
少なくとも17ヌクレオチド長のエフェクター配列と、
エフェクター相補配列と、
ステムループ配列と、
pri-miRNA骨格と、
を含み、
前記エフェクター配列が、配列番号１～８又は１０～１３のいずれか1つに記載のRNA転写物内における対応する長さの領域に対して相補的である、
請求項１記載のddRNAi構築物。

【請求項6】

(a) 前記ddRNAi構築物内の前記更なる核酸が、配列番号１、２、４、７、１０及び１３のうちの1つに記載のRNA転写物内における対応する長さの領域に対して相補的である、エフェクター配列を含むshmiRをコードし、
(b) 前記ddRNAi構築物が、
(i) 配列番号３１に記載のエフェクター配列及び配列番号３０に記載のエフェクター相補配列を含むshmiR(shmiR13)をコードするDNA配列を含むか又はそれから成る核酸と、
(ii) 配列番号１５に記載のエフェクター配列及び配列番号１４に記載のエフェクター相補配列を含むshmiR(shmiR2)をコードするDNA配列を含むか又はそれから成る核酸、
配列番号１７に記載のエフェクター配列及び配列番号１６に記載のエフェクター相補配列を含むshmiR(shmiR3)をコードするDNA配列を含むか又はそれから成る核酸、
配列番号２１に記載のエフェクター配列及び配列番号２０に記載のエフェクター相補配列を含むshmiR(shmiR5)をコードするDNA配列を含むか又はそれから成る核酸、
配列番号２７に記載のエフェクター配列及び配列番号２６に記載のエフェクター相補配列を含むshmiR(shmiR9)をコードするDNA配列を含むか又はそれから成る核酸、
配列番号３３に記載のエフェクター配列及び配列番号３２に記載のエフェクター相補配列を含むshmiR(shmiR14)をコードするDNA配列を含むか又はそれから成る核酸、及び
配列番号３９に記載のエフェクター配列及び配列番号３８に記載のエフェクター相補配列を含むshmiR(shmiR17)をコードするDNA配列を含むか又はそれから成る核酸
から成る群より選択される更なる核酸と、
を含み、
且つ/又は、
(c) 前記ddRNAi構築物が、
(i) 配列番号６４(shmiR13)に記載のDNA配列を含むか又はそれから成る核酸と、
(ii) 配列番号５６(shmiR2)に記載のDNA配列を含むか又はそれから成る核酸、
配列番号５７(shmiR3)に記載のDNA配列を含むか又はそれから成る核酸、
配列番号５９(shmiR5)に記載のDNA配列を含むか又はそれから成る核酸、
配列番号６２(shmiR9)に記載のDNA配列を含むか又はそれから成る核酸、
配列番号６５(shmiR14)に記載のDNA配列を含むか又はそれから成る核酸、及び
配列番号６８(shmiR17)に記載のDNA配列を含むか又はそれから成る核酸、
から成る群より選択される更なる核酸と、
を含む、
請求項５記載のddRNAi構築物。

【請求項7】

(a) 前記ddRNAi構築物内の前記更なる核酸が、配列番号２、１０及び１３のうちの1つに記載のRNA転写物内における対応する長さの領域に対して相補的である、エフェクター配列を含むshmiRをコードし、
(b) 前記ddRNAi構築物が、
(i) 配列番号３１に記載のエフェクター配列及び配列番号３０に記載のエフェクター相補配列を含むshmiR(shmiR13)をコードするDNA配列を含むか又はそれから成る核酸と、
(ii) 配列番号１７に記載のエフェクター配列及び配列番号１６に記載のエフェクター相補配列を含むshmiR(shmiR3)をコードするDNA配列を含むか又はそれから成る核酸、
配列番号３３に記載のエフェクター配列及び配列番号３２に記載のエフェクター相補配列を含むshmiR(shmiR14)をコードするDNA配列を含むか又はそれから成る核酸、及び
配列番号３９に記載のエフェクター配列及び配列番号３８に記載のエフェクター相補配列を含むshmiR(shmiR17)をコードするDNA配列を含むか又はそれから成る核酸、
から成る群より選択される更なる核酸と、
を含み、
且つ/又は
(c) 前記ddRNAi構築物が、
(i) 配列番号６４(shmiR13)に記載のDNA配列を含むか又はそれから成る核酸と、
(ii) 配列番号５７(shmiR3)に記載のDNA配列を含むか又はそれから成る核酸、
配列番号６５(shmiR14)に記載のDNA配列を含むか又はそれから成る核酸、及び
配列番号６８(shmiR17)に記載のDNA配列を含むか又はそれから成る核酸、
から成る群より選択される更なる核酸と、
を含む、
請求項６記載のddRNAi構築物。

【請求項8】

前記ddRNAi構築物が、
(a)配列番号３１に記載のエフェクター配列及び配列番号３０に記載のエフェクター相補配列を含むshmiR(shmiR13)をコードするDNA配列を含むか又はそれから成る核酸と、
(b)配列番号３９に記載のエフェクター配列及び配列番号３８に記載のエフェクター相補配列を含むshmiR(shmiR17)をコードするDNA配列を含むか又はそれから成る核酸と、
を含む、請求項６記載のddRNAi構築物。

【請求項9】

前記ddRNAi構築物が、
(a)配列番号６４(shmiR13)に記載の前記DNA配列を含むか又はそれから成る核酸と、
(b)配列番号６８(shmiR17)に記載の前記DNA配列を含むか又はそれから成る核酸と、
を含む、請求項８記載のddRNAi構築物。

【請求項10】

shmiRをコードする前記DNA配列が、プロモーターに機能的に連結される、請求項１記載のddRNAi構築物。

【請求項11】

前記プロモーターが、筋特異的プロモーターである、請求項１０記載のddRNAi構築物。

【請求項12】

(a) 請求項１～１１のいずれか１項記載のddRNAi構築物と、
(b) 前記ddRNAi構築物によりコードされる前記shmiRによって標的とされないmRNA転写物を有する機能性PABPN1タンパク質をコードするDNA配列を含むPABPN1構築物であって、前記機能性PABPN1タンパク質をコードする前記DNA配列が、コドン最適化されたものである、前記PABPN1構築物と、
を含む、組成物。

【請求項13】

前記機能性PABPN1タンパク質が、配列番号７４に記載されるものであり、
前記機能性PABPN1タンパク質をコードする前記DNA配列が、配列番号７３に記載されるものであり、且つ/又は
前記機能性PABPN1タンパク質をコードする前記DNA配列が、前記PABPN1構築物内に含まれ、且つ前記機能性PABPN1タンパク質をコードする前記DNA配列の上流に位置するプロモーターに機能的に連結される、
請求項１２記載の組成物。

【請求項14】

(a) 前記プロモーターが、筋特異的プロモーターであり、且つ/又は
(b) 前記shmiRをコードする前記DNA配列及び前記機能性PABPN1タンパク質をコードする前記DNA配列が、同一のプロモーターに機能的に連結される、
請求項１３記載の組成物。

【請求項15】

前記ddRNAi構築物と前記PABPN1構築物とが、単一のDNA構築物で含まれる、請求項１２記載の組成物。

【請求項16】

前記DNA構築物が、5'→3'方向に、前記ddRNAi構築物と前記PABPN1構築物とを含むか、又は
前記DNA構築物が、5'→3'方向に、前記PABPN1構築物と前記ddRNAi構築物とを含む、
請求項１５記載の組成物。

【請求項17】

前記DNA構築物が、発現ベクター内に含まれる、請求項１５記載の組成物。

【請求項18】

前記発現ベクターが、プラスミド又はミニサークルであるか、又は
前記発現ベクターが、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルス(AdV)ベクター及びレンチウイルス(LV)ベクターから成る群より選択されるウイルスベクターである、
請求項１７記載の組成物。

【請求項19】

(a) 前記ddRNAi構築物を含む第１の発現ベクターと、
(b) 前記PABPN1構築物を含む第２の発現ベクターと、
を含む、請求項１２記載の組成物。

【請求項20】

前記発現ベクターが、プラスミド又はミニサークルであるか、又は、
前記発現ベクターが、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルス(AdV)ベクター及びレンチウイルス(LV)ベクターから成る群より選択されるウイルスベクターである、
請求項１９記載の組成物。

【請求項21】

1種又は複数種の薬学的に許容される担体を含む、請求項１２記載の組成物。

【請求項22】

対象において眼咽頭型筋ジストロフィー(OPMD)の原因となるPABPN1タンパク質の発現を阻害するための、請求項１２記載の組成物。

【請求項23】

眼咽頭型筋ジストロフィー(OPMD)を患うか、又はOPMDに罹患しやすい対象においてOPMDを治療又は予防するための、請求項１２記載の組成物。

【請求項24】

対象において眼咽頭型筋ジストロフィー(OPMD)を治療又は予防するための医薬の調製における、請求項１２記載の組成物の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年１２月１４日出願の米国仮番号６２／４３４，３１２に対する優先権を主張するものであり、その完全な内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

本開示は、眼咽頭型筋ジストロフィー（ＯＰＭＤ）を治療するためのＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）試薬、そのＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）試薬を含む組成物、及び、ＯＰＭＤを患うまたはＯＰＭＤに罹患しやすい個体を治療するためのその使用に関する。

【背景技術】

【0003】

ＯＰＭＤは、常染色体優性遺伝、緩徐進行性、遅発性の筋変性疾患である。この疾患は主として、進行性の眼瞼下垂（ｅｙｅｌｉｄ ｄｒｏｏｐｉｎｇ）（眼瞼下垂（ｐｔｏｓｉｓ））及び嚥下困難（ｓｗａｌｌｏｗｉｎｇ ｄｉｆｆｉｃｕｌｔｉｅｓ）（嚥下困難（ｄｙｓｐｈａｇｉａ））を特徴とする。咽頭筋及び輪状咽頭筋はＯＰＭＤに特異的な標的である。疾患進行の後期に四肢近位の筋力低下が引き続いて起こる傾向がある。この疾患の原因となる変異は、ポリ（Ａ）結合タンパク質核１（ＰＡＢＰＮ１）遺伝子のコード領域内における（ＧＣＮ）ｎトリヌクレオチド反復の異常伸長である。この伸長によりＰＡＢＰＮ１タンパク質のＮ末端に伸長ポリアラニントラクトがもたらされるが、正常なタンパク質には１０個のアラニンが存在し、変異形態（ｅｘｐＰＡＢＰＮ１）では１１～１８個のアラニンに増加する。この疾患の主たる病理学的特徴はｅｘｐＰＡＢＰＮ１の核凝集である。伸長ＰＡＢＰＮ１のミスフォールディングにより、罹患細胞の細胞核内における不溶性ポリマー状線維凝集体の蓄積がもたらされる。ＰＡＢＰＮ１は凝集しやすいタンパク質であり、ＯＰＭＤにおける変異アラニン伸長ＰＡＢＰＮ１の凝集率は、野生型正常タンパク質の凝集率よりも高い。しかしながら、ＯＰＭＤにおける核凝集が病理学的作用、または細胞防御機構の結果としての保護的役割を有するかどうかについては、依然としてはっきりとしていない。

【0004】

ＯＰＭＤに対する治療薬、薬理学または別のものは現時点において提供されていない。重度罹患者に対して対症性の外科的処置を行うことにより部分的に、眼瞼下垂を矯正して嚥下をまずまずに改善することは可能である。例えば、輪状咽頭筋切開術は、現時点においてこれらの患者の嚥下改善に利用できる唯一実行可能な処置である。しかしながら、この手術は、咽頭筋組織の進行性の悪化を矯正するものではなく、多くの場合、嚥下困難及び窒息の後、死に至る。

【0005】

それゆえ、ＯＰＭＤを患う及び／またはＯＰＭＤに罹患しやすい患者におけるＯＰＭＤを治療するための治療薬に対する要望は依然として存在している。

【0006】

本明細書に含まれる文献、行為、物質、デバイス、論文などに関するいずれの記載も、これら事項のいずれかまたはその全てが先行技術基準の一部を形成すること、または、本開示に関連する分野における共通一般知識が添付の特許請求の範囲のそれぞれの優先日以前に既に存在していたことを認めるものとして解釈されるべきではない。

【発明の概要】

【0007】

本開示は部分的に、ＯＰＭＤを治療するための治療薬が現時点において存在していないという本発明者らの認識に基づいている。それゆえ、本開示は、ＯＰＭＤの原因となるＰＡＢＰＮ１ ｍＲＮＡ転写物の領域を標的とするＲＮＡｉ試薬を提供する。本発明者らは、ＯＰＭＤの原因となる変異ＰＡＢＰＮ１タンパク質（すなわち、伸長ポリアラニントラクトを含むようなＰＡＢＰＮ１タンパク質）へとさもなければ翻訳され得る転写変異体を含むＰＡＢＰＮ１ ｍＲＮＡ転写物の転写後抑制にこれらのＲＮＡｉ試薬が有効であることを示している。例えば、本開示の例示的なＲＮＡｉ試薬がＰＡＢＰＮ１タンパク質のインビトロ発現を阻害または抑制することが示されている。更に、本開示は、本開示のＲＮＡｉ試薬が標的としないｍＲＮＡ転写物を有する野生型ヒトＰＡＢＰＮ１タンパク質を発現させるための試薬（以下「ＰＡＢＰＮ１置換試薬」）を提供する。本発明者らは、本開示のＲＮＡｉ試薬と共に発現させる場合、ＰＡＢＰＮ１置換試薬が、ＲＮＡｉ試薬に対する耐性を有し機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質へと翻訳されることが可能なＰＡＢＰＮ１転写物を生成可能であることを示している。本発明者らによるこれらの知見は、ＯＰＭＤの治療に治療適用を有し得る試薬を提供する。

【0008】

それゆえ、本開示は、低分子ヘアピンマイクロＲＮＡ（ｓｈｍｉＲ）をコードするＤＮＡ配列を含む核酸を提供し、上記ｓｈｍｉＲは、
少なくとも１７ヌクレオチド長のエフェクター配列、
エフェクター相補配列、
ステムループ配列、及び、
プライマリーマイクロＲＮＡ（ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ）骨格、
を含み、
エフェクター配列は、配列番号：１～１３のいずれか１つに記載のＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的である。エフェクター配列は３０ヌクレオチド長未満であることが好ましい。例えば、好適なエフェクター配列は１７～２９ヌクレオチド長の範囲であってもよい。エフェクター配列は２０ヌクレオチド長であることが好ましい。エフェクター配列が２１ヌクレオチド長であり、エフェクター相補配列が２０ヌクレオチド長であることがより好ましい。

【0009】

エフェクター配列は、エフェクター配列が実質的に相補的である配列番号：１～１３のいずれか１つに記載のＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して４塩基対のミスマッチを含んでいてもよい。別の例では、エフェクター配列は、エフェクター配列が実質的に相補的である配列番号：１～１３のいずれか１つに記載のＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して３塩基対のミスマッチを含む。別の例では、エフェクター配列は、エフェクター配列が実質的に相補的である配列番号：１～１３のいずれか１つに記載のＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して２塩基対のミスマッチを含む。別の例では、エフェクター配列は、エフェクター配列が実質的に相補的である配列番号：１～１３のいずれか１つに記載のＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して１塩基対のミスマッチを含む。更に別の例では、エフェクター配列は、配列番号：１～１３のいずれか１つに記載のＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して１００％相補的である。ミスマッチが存在する場合、それらミスマッチが、ｓｈｍｉＲのシード領域、すなわち、エフェクター配列のヌクレオチド２～８に相当する領域内に位置していないことが好ましい。

【0010】

配列番号：１に記載のＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的なエフェクター配列を含む例示的なｓｈｍｉＲについて本明細書に記載する（以下「ｓｈｍｉＲ２」と呼ぶ）。

【0011】

配列番号：２に記載のＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的なエフェクター配列を含む例示的なｓｈｍｉＲについて本明細書に記載する（以下「ｓｈｍｉＲ３」と呼ぶ）。

【0012】

配列番号：３に記載のＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的なエフェクター配列を含む例示的なｓｈｍｉＲについて本明細書に記載する（以下「ｓｈｍｉＲ４」と呼ぶ）。

【0013】

配列番号：４に記載のＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的なエフェクター配列を含む例示的なｓｈｍｉＲについて本明細書に記載する（以下「ｓｈｍｉＲ５」と呼ぶ）。

【0014】

配列番号：５に記載のＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的なエフェクター配列を含む例示的なｓｈｍｉＲについて本明細書に記載する（以下「ｓｈｍｉＲ６」と呼ぶ）。

【0015】

配列番号：６に記載のＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的なエフェクター配列を含む例示的なｓｈｍｉＲについて本明細書に記載する（以下「ｓｈｍｉＲ７」と呼ぶ）。

【0016】

配列番号：７に記載のＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的なエフェクター配列を含む例示的なｓｈｍｉＲについて本明細書に記載する（以下「ｓｈｍｉＲ９」と呼ぶ）。

【0017】

配列番号：８に記載のＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的なエフェクター配列を含む例示的なｓｈｍｉＲについて本明細書に記載する（以下「ｓｈｍｉＲ１１」と呼ぶ）。

【0018】

配列番号：９に記載のＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的なエフェクター配列を含む例示的なｓｈｍｉＲについて本明細書に記載する（以下「ｓｈｍｉＲ１３」と呼ぶ）。

【0019】

配列番号：１０に記載のＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的なエフェクター配列を含む例示的なｓｈｍｉＲについて本明細書に記載する（以下「ｓｈｍｉＲ１４」と呼ぶ）。

【0020】

配列番号：１１に記載のＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的なエフェクター配列を含む例示的なｓｈｍｉＲについて本明細書に記載する（以下「ｓｈｍｉＲ１５」と呼ぶ）。

【0021】

配列番号：１２に記載のＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的なエフェクター配列を含む例示的なｓｈｍｉＲについて本明細書に記載する（以下「ｓｈｍｉＲ１６」と呼ぶ）。

【0022】

配列番号：１３に記載のＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的なエフェクター配列を含む例示的なｓｈｍｉＲについて本明細書に記載する（以下「ｓｈｍｉＲ１７」と呼ぶ）。

【0023】

１つの例では、本明細書に記載の核酸は、
（ｉ）エフェクター配列が配列番号：１４に記載の配列と二本鎖を形成可能である場合、１、２、３または４塩基のミスマッチを有すること以外は配列番号：１４に記載の配列に対して実質的に相補的なエフェクター配列、及び、（ｉｉ）エフェクター配列に対して実質的に相補的な配列を含むエフェクター相補配列、を含むｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ２）、
（ｉ）エフェクター配列が配列番号：１６に記載の配列と二本鎖を形成可能である場合、１、２、３または４塩基のミスマッチを有すること以外は配列番号：１６に記載の配列に対して実質的に相補的なエフェクター配列、及び、（ｉｉ）エフェクター配列に対して実質的に相補的な配列を含むエフェクター相補配列、を含むｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ３）、
（ｉ）エフェクター配列が配列番号：１８に記載の配列と二本鎖を形成可能である場合、１、２、３または４塩基のミスマッチを有すること以外は配列番号：１８に記載の配列に対して実質的に相補的なエフェクター配列、及び、（ｉｉ）エフェクター配列に対して実質的に相補的な配列を含むエフェクター相補配列、を含むｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ４）、
（ｉ）エフェクター配列が配列番号：２０に記載の配列と二本鎖を形成可能である場合、１、２、３または４塩基のミスマッチを有すること以外は配列番号：２０に記載の配列に対して実質的に相補的なエフェクター配列、及び、（ｉｉ）エフェクター配列に対して実質的に相補的な配列を含むエフェクター相補配列、を含むｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ５）、
（ｉ）エフェクター配列が配列番号：２２に記載の配列と二本鎖を形成可能である場合、１、２、３または４塩基のミスマッチを有すること以外は配列番号：２２に記載の配列に対して実質的に相補的なエフェクター配列、及び、（ｉｉ）エフェクター配列に対して実質的に相補的な配列を含むエフェクター相補配列、を含むｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ６）、
（ｉ）エフェクター配列が配列番号：２４に記載の配列と二本鎖を形成可能である場合、１、２、３または４塩基のミスマッチを有すること以外は配列番号：２４に記載の配列に対して実質的に相補的なエフェクター配列、及び、（ｉｉ）エフェクター配列に対して実質的に相補的な配列を含むエフェクター相補配列、を含むｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ７）、
（ｉ）エフェクター配列が配列番号：２６に記載の配列と二本鎖を形成可能である場合、１、２、３または４塩基のミスマッチを有すること以外は配列番号：２６に記載の配列に対して実質的に相補的なエフェクター配列、及び、（ｉｉ）エフェクター配列に対して実質的に相補的な配列を含むエフェクター相補配列、を含むｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ９）、
（ｉ）エフェクター配列が配列番号：２８に記載の配列と二本鎖を形成可能である場合、１、２、３または４塩基のミスマッチを有すること以外は配列番号：２８に記載の配列に対して実質的に相補的なエフェクター配列、及び、（ｉｉ）エフェクター配列に対して実質的に相補的な配列を含むエフェクター相補配列、を含むｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ１１）、
（ｉ）エフェクター配列が配列番号：３０に記載の配列と二本鎖を形成可能である場合、１、２、３または４塩基のミスマッチを有すること以外は配列番号：３０に記載の配列に対して実質的に相補的なエフェクター配列、及び、（ｉｉ）エフェクター配列に対して実質的に相補的な配列を含むエフェクター相補配列、を含むｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ１３）、
（ｉ）エフェクター配列が配列番号：３２に記載の配列と二本鎖を形成可能である場合、１、２、３または４塩基のミスマッチを有すること以外は配列番号：３２に記載の配列に対して実質的に相補的なエフェクター配列、及び、（ｉｉ）エフェクター配列に対して実質的に相補的な配列を含むエフェクター相補配列、を含むｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ１４）、
（ｉ）エフェクター配列が配列番号：３４に記載の配列と二本鎖を形成可能である場合、１、２、３または４塩基のミスマッチを有すること以外は配列番号：３４に記載の配列に対して実質的に相補的なエフェクター配列、及び、（ｉｉ）エフェクター配列に対して実質的に相補的な配列を含むエフェクター相補配列、を含むｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ１５）、
（ｉ）エフェクター配列が配列番号：３６に記載の配列と二本鎖を形成可能である場合、１、２、３または４塩基のミスマッチを有すること以外は配列番号：３６に記載の配列に対して実質的に相補的なエフェクター配列、及び、（ｉｉ）エフェクター配列に対して実質的に相補的な配列を含むエフェクター相補配列、を含むｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ１６）、及び、
（ｉ）エフェクター配列が配列番号：３８に記載の配列と二本鎖を形成可能である場合、１、２、３または４塩基のミスマッチを有すること以外は配列番号：３８に記載の配列に対して実質的に相補的なエフェクター配列、及び、（ｉｉ）エフェクター配列に対して実質的に相補的な配列を含むエフェクター相補配列、を含むｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ１７）、
からなる群から選択されるｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列を含んでいてもよい。

【0024】

別の例では、本明細書に記載の核酸は、
配列番号：１５に記載のエフェクター配列、及び、配列番号：１５に記載の配列に対して実質的に相補的でありその配列と二本鎖を形成可能なエフェクター相補配列、を含むｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ２）、
配列番号：１７に記載のエフェクター配列、及び、配列番号：１７に記載の配列に対して実質的に相補的でありその配列と二本鎖を形成可能なエフェクター相補配列、を含むｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ３）、
配列番号：１９に記載のエフェクター配列、及び、配列番号：１９に記載の配列に対して実質的に相補的でありその配列と二本鎖を形成可能なエフェクター相補配列、を含むｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ４）、
配列番号：２１に記載のエフェクター配列、及び、配列番号：２１に記載の配列に対して実質的に相補的でありその配列と二本鎖を形成可能なエフェクター相補配列、を含むｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ５）、
配列番号：２３に記載のエフェクター配列、及び、配列番号：２３に記載の配列に対して実質的に相補的でありその配列と二本鎖を形成可能なエフェクター相補配列、を含むｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ６）、
配列番号：２５に記載のエフェクター配列、及び、配列番号：２５に記載の配列に対して実質的に相補的でありその配列と二本鎖を形成可能なエフェクター相補配列、を含むｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ７）、
配列番号：２７に記載のエフェクター配列、及び、配列番号：２７に記載の配列に対して実質的に相補的でありその配列と二本鎖を形成可能なエフェクター相補配列、を含むｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ９）、
配列番号：２９に記載のエフェクター配列、及び、配列番号：２９に記載の配列に対して実質的に相補的でありその配列と二本鎖を形成可能なエフェクター相補配列、を含むｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ１１）、
配列番号：３１に記載のエフェクター配列、及び、配列番号：３１に記載の配列に対して実質的に相補的でありその配列と二本鎖を形成可能なエフェクター相補配列、を含むｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ１３）、
配列番号：３３に記載のエフェクター配列、及び、配列番号：３３に記載の配列に対して実質的に相補的でありその配列と二本鎖を形成可能なエフェクター相補配列、を含むｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ１４）、
配列番号：３５に記載のエフェクター配列、及び、配列番号：３５に記載の配列に対して実質的に相補的でありその配列と二本鎖を形成可能なエフェクター相補配列、を含むｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ１５）、
配列番号：３７に記載のエフェクター配列、及び、配列番号：３７に記載の配列に対して実質的に相補的でありその配列と二本鎖を形成可能なエフェクター相補配列、を含むｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ１６）、及び、
配列番号：３９に記載のエフェクター配列、及び、配列番号：３９に記載の配列に対して実質的に相補的でありその配列と二本鎖を形成可能なエフェクター相補配列、を含むｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ１７）、
からなる群から選択されるｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列を含んでいてもよい。

【0025】

例えば、本明細書に記載の核酸がコードするｓｈｍｉＲは、同種のエフェクター配列とエフェクター相補配列が二本鎖領域を形成可能である場合、対応するエフェクター配列に対して１、２、３または４つのミスマッチを含むエフェクター相補配列を含んでいてもよい。

【0026】

別の例では、本明細書に記載の核酸は、
配列番号：１５に記載のエフェクター配列及び配列番号：１４に記載のエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ２）、
配列番号：１７に記載のエフェクター配列及び配列番号：１６に記載のエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ３）、
配列番号：１９に記載のエフェクター配列及び配列番号：１８に記載のエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ４）、
配列番号：２１に記載のエフェクター配列及び配列番号：２０に記載のエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ５）、
配列番号：２３に記載のエフェクター配列及び配列番号：２２に記載のエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ６）、
配列番号：２５に記載のエフェクター配列及び配列番号：２４に記載のエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ７）、
配列番号：２７に記載のエフェクター配列及び配列番号：２６に記載のエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ９）、
配列番号：２９に記載のエフェクター配列及び配列番号：２８に記載のエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ１１）、
配列番号：３１に記載のエフェクター配列及び配列番号：３０に記載のエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ１３）、
配列番号：３３に記載のエフェクター配列及び配列番号：３２に記載のエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ１４）、
配列番号：３５に記載のエフェクター配列及び配列番号：３４に記載のエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ１５）、
配列番号：３７に記載のエフェクター配列及び配列番号：３６に記載のエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ１６）、及び、
配列番号：３９に記載のエフェクター配列及び配列番号：３８に記載のエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ１７）、
からなる群から選択されるｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列を含んでいてもよい。

【0027】

本開示の核酸がコードするｓｈｍｉＲは、５´→３´方向に、
ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ骨格の５´隣接配列、
エフェクター相補配列、
ステムループ配列、
エフェクター配列、及び、
ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ骨格の３´隣接配列、
を含んでいてもよい。

【0028】

本開示の核酸がコードするｓｈｍｉＲは、５´→３´方向に、
ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ骨格の５´隣接配列、
エフェクター配列、
ステムループ配列、
エフェクター相補配列、及び、
ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ骨格の３´隣接配列、
を含んでいてもよい。

【0029】

好適なループ配列を当該技術分野において周知のループ配列から選択してもよい。しかしながら、例示的なステムループ配列については配列番号：４０に記載している。

【0030】

本開示の核酸に用いる好適なプライマリーマイクロＲＮＡ（ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡまたはｐｒｉ－Ｒ）骨格を当該技術分野において周知のプライマリーマイクロＲＮＡ骨格から選択してもよい。例えば、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ骨格を、ｐｒｉ－ｍｉＲ－３０ａ骨格、ｐｒｉ－ｍｉＲ－１５５骨格、ｐｒｉ－ｍｉＲ－２１骨格及びｐｒｉ－ｍｉＲ－１３６骨格から選択してもよい。しかしながら、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ骨格はｐｒｉ－ｍｉＲ－３０ａ骨格であることが好ましい。ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ骨格がｐｒｉ－ｍｉＲ－３０ａ骨格である例によれば、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ骨格の５´隣接配列は配列番号：４１に記載されており、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ骨格の３´隣接配列は配列番号：４２に記載されている。

【0031】

１つの例では、本明細書に記載の核酸は、配列番号：５６～６８のいずれか１つに記載の配列から選択されるＤＮＡ配列を含む。この例によれば、本開示の核酸がコードするｓｈｍｉＲは、配列番号：４３～５５のいずれか１つに記載の配列を含んでいてもよい。

【0032】

本開示による核酸を、ＯＰＭＤを治療するためのその他の治療薬、例えば、ＯＰＭＤの原因となるＰＡＢＰＮ１タンパク質に対応するＲＮＡ転写物を標的とするその他のＲＮＡｉ薬剤などと組み合わせてもよい、またはそれらと共に使用してもよいということを当業者は理解する。それゆえ、本開示は、ＯＰＭＤを治療するための１種または複数種のその他のＲＮＡｉ薬剤と組み合わせて、本明細書に記載のｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列を含む核酸を提供する。１つの例では、複数種の核酸は、
（ａ）本明細書に記載の少なくとも１種の核酸、及び、
（ｂ）
（ｉ）本明細書に記載の核酸による核酸、または、
（ｉｉ）少なくとも１７ヌクレオチド長のエフェクター配列及びエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲまたは低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をコードするＤＮＡ配列を含む核酸（エフェクター配列は、眼咽頭型筋ジストロフィー（ＯＰＭＤ）の原因となるＰＡＢＰＮ１タンパク質に対応するＲＮＡ転写物に対して実質的に相補的である）、
から選択される少なくとも１種の更なる核酸、
を含み、
（ａ）の核酸がコードするｓｈｍｉＲと（ｂ）の核酸がコードするｓｈｍｉＲまたはｓｈＲＮＡは、異なるエフェクター配列を含む、
ように提供される。

【0033】

１つの例では、（ｂ）（ｉｉ）のｓｈｍｉＲまたはｓｈＲＮＡのエフェクター配列は、配列番号：１～１３のいずれか１つに記載のＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的である。配列番号：１～１３のいずれか１つに記載のＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的な（ｂ）（ｉｉ）のｓｈｍｉＲまたはｓｈＲＮＡのエフェクター配列は、３０ヌクレオチド長未満であることが好ましい。例えば、ｓｈｍｉＲまたはｓｈＲＮＡの好適なエフェクター配列は１７～２９ヌクレオチド長の範囲であってもよい。

【0034】

１つの例では、複数種の核酸のうちの少なくとも１種は、本明細書に記載のｓｈｍｉＲ２をコードするＤＮＡ配列を含む。

【0035】

１つの例では、複数種の核酸のうちの少なくとも１種は、本明細書に記載のｓｈｍｉＲ３をコードするＤＮＡ配列を含む。

【0036】

１つの例では、複数種の核酸のうちの少なくとも１種は、本明細書に記載のｓｈｍｉＲ４をコードするＤＮＡ配列を含む。

【0037】

１つの例では、複数種の核酸のうちの少なくとも１種は、本明細書に記載のｓｈｍｉＲ５をコードするＤＮＡ配列を含む。

【0038】

１つの例では、複数種の核酸のうちの少なくとも１種は、本明細書に記載のｓｈｍｉＲ６をコードするＤＮＡ配列を含む。

【0039】

１つの例では、複数種の核酸のうちの少なくとも１種は、本明細書に記載のｓｈｍｉＲ７をコードするＤＮＡ配列を含む。

【0040】

１つの例では、複数種の核酸のうちの少なくとも１種は、本明細書に記載のｓｈｍｉＲ９をコードするＤＮＡ配列を含む。

【0041】

１つの例では、複数種の核酸のうちの少なくとも１種は、本明細書に記載のｓｈｍｉＲ１１をコードするＤＮＡ配列を含む。

【0042】

１つの例では、複数種の核酸のうちの少なくとも１種は、本明細書に記載のｓｈｍｉＲ１３をコードするＤＮＡ配列を含む。

【0043】

１つの例では、複数種の核酸のうちの少なくとも１種は、本明細書に記載のｓｈｍｉＲ１４をコードするＤＮＡ配列を含む。

【0044】

１つの例では、複数種の核酸のうちの少なくとも１種は、本明細書に記載のｓｈｍｉＲ１５をコードするＤＮＡ配列を含む。

【0045】

１つの例では、複数種の核酸のうちの少なくとも１種は、本明細書に記載のｓｈｍｉＲ１６をコードするＤＮＡ配列を含む。

【0046】

１つの例では、複数種の核酸のうちの少なくとも１種は、本明細書に記載のｓｈｍｉＲ１７をコードするＤＮＡ配列を含む。

【0047】

本開示による複数種の核酸は、それぞれが本明細書に記載のｓｈｍｉＲ、すなわち、ｓｈｍｉＲ２～７、ｓｈｍｉＲ９、ｓｈｍｉＲ１１、及びｓｈｍｉＲ１３～１７をコードする最大１０種の核酸、例えば、２種の核酸、３種の核酸、４種の核酸、５種の核酸、６種の核酸、７種の核酸、８種の核酸、９種の核酸または１０種の核酸を含んでいてもよい。１つの例では、複数種の核酸は、それぞれが本明細書に記載のｓｈｍｉＲをコードする本開示の２種の核酸を含む。別の例では、複数種の核酸は、それぞれが本明細書に記載のｓｈｍｉＲをコードする本開示の３種の核酸を含む。１つの例では、複数種の核酸は、それぞれが本明細書に記載のｓｈｍｉＲをコードする本開示の４種の核酸を含む。１つの例では、複数種の核酸は、それぞれが本明細書に記載のｓｈｍｉＲをコードする本開示の５種の核酸を含む。１つの例では、複数種の核酸は、それぞれが本明細書に記載のｓｈｍｉＲをコードする本開示の６種の核酸を含む。１つの例では、複数種の核酸は、それぞれが本明細書に記載のｓｈｍｉＲをコードする本開示の７種の核酸を含む。１つの例では、複数種の核酸は、それぞれが本明細書に記載のｓｈｍｉＲをコードする本開示の８種の核酸を含む。１つの例では、複数種の核酸は、それぞれが本明細書に記載のｓｈｍｉＲをコードする本開示の９種の核酸を含む。１つの例では、複数種のＲＮＡは、それぞれが本明細書に記載のｓｈｍｉＲをコードする本開示の１０種の核酸を含む。本明細書に記載する例のいずれかによれば、複数種のうちの１種または複数種の核酸は、本明細書に記載のｓｈＲＮＡをコードしてもよい。

【0048】

１つの例では、本開示の複数種の核酸は、本明細書に記載のｓｈｍｉＲ２、ｓｈｍｉＲ３、ｓｈｍｉＲ５、ｓｈｍｉＲ９、ｓｈｍｉＲ１３、ｓｈｍｉＲ１４及びｓｈｍｉＲ１７からなる群から選択されるｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列をそれぞれが含む少なくとも２種の核酸を含む。

【0049】

１つの例示的な本開示の複数種の核酸は、本明細書に記載のｓｈｍｉＲ１３をコードするＤＮＡ配列を含む１種の核酸及び本明細書に記載のｓｈｍｉＲ１７をコードするＤＮＡ配列を含む別の核酸を含む。

【0050】

別の例示的な本開示の複数種の核酸は、本明細書に記載のｓｈｍｉＲ３をコードするＤＮＡ配列を含む１種の核酸及び本明細書に記載のｓｈｍｉＲ１４をコードするＤＮＡ配列を含む別の核酸を含む。

【0051】

複数種の核酸を提供する例によれば、核酸のうちの２種以上は同一ポリヌクレオチドの別々の部位を形成してもよい。別の例では、複数種の核酸のうちの２種以上はそれぞれ、異なるポリヌクレオチドの部位を形成する。

【0052】

本開示による核酸またはそれぞれの核酸は、１つまたは複数の転写ターミネーター配列を含むかまたはそれらと機能的に連結してもよい。例えば、核酸またはそれぞれの核酸は、ｓｈｍｉＲをコードする配列の３´末端に転写ターミネーター配列を含んでいてもよい。このような配列はプロモーターの選択に依存するが、当業者に周知である。しかしながら、本開示の核酸または複数種の核酸に使用するプロモーター及び転写ターミネーター配列の好適な選択肢について本明細書に記載する。

【0053】

代替的にまたは加えて、本開示による核酸またはそれぞれの核酸は、転写イニシエーター配列を含むかまたはそれらと機能的に連結してもよい。例えば、核酸またはそれぞれの核酸は、ｓｈｍｉＲをコードする配列の５´末端に転写イニシエーター配列を含んでいてもよい。このような配列は当業者に周知である。

【0054】

代替的にまたは加えて、本開示による核酸またはそれぞれの核酸は、例えば、クローニングベクターまたは発現ベクター内への核酸（複数可）のクローニングを促進するための１つまたは複数の制限部位を含んでいてもよい。例えば、本明細書に記載の核酸は、本開示のｓｈｍｉＲをコードする配列の上流及び／または下流に制限部位を含んでいてもよい。好適な制限酵素認識配列は当業者に周知である。

【0055】

本開示による核酸または本明細書に記載の複数種の核酸はまた、本開示の核酸（複数可）がコードする１種または複数種のｓｈｍｉＲを発現可能なＤＮＡ特異的ＲＮＡ干渉（ｄｄＲＮＡｉ）構築物の形態で提供され得るかまたはその構築物内に含まれ得る。

【0056】

１つの例では、ｄｄＲＮＡｉ構築物は、ＯＰＭＤの原因となるＰＡＢＰＮ１タンパク質に対応するＲＮＡ転写物を標的とする少なくとも２種のｓｈｍｉＲ（そのそれぞれは互いに異なる）をｄｄＲＮＡｉ構築物がコードするように、本開示の少なくとも２種の核酸を含む。

【0057】

１つの例では、ｄｄＲＮＡｉ構築物内における少なくとも２種の核酸のそれぞれは、配列番号：１、２、４、７、９、１０及び１３のうちの１つに記載のＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的なエフェクター配列を含むｓｈｍｉＲをコードする。それゆえ、この例によるｄｄＲＮＡｉ構築物は、本明細書に記載のｓｈｍｉＲ２、ｓｈｍｉＲ３、ｓｈｍｉＲ５、ｓｈｍｉＲ９、ｓｈｍｉＲ１３、ｓｈｍｉＲ１４及びｓｈｍｉＲ１７から選択される２種のｓｈｍｉＲをコードする。

【0058】

本開示のｄｄＲＮＡｉ構築物の１つの例は、
配列番号：１５に記載のエフェクター配列、及び、配列番号：１５に対して実質的に相補的でありその配列と二本鎖を形成可能なエフェクター相補配列、例えば、配列番号：１４に記載のエフェクター相補配列、を含むｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ２）をコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、
配列番号：１７に記載のエフェクター配列、及び、配列番号：１７に対して実質的に相補的でありその配列と二本鎖を形成可能なエフェクター相補配列、例えば、配列番号：１６に記載のエフェクター相補配列、を含むｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ３）をコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、
配列番号：２１に記載のエフェクター配列、及び、配列番号：２１に対して実質的に相補的でありその配列と二本鎖を形成可能なエフェクター相補配列、例えば、配列番号：２０に記載のエフェクター相補配列、を含むｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ５）をコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、
配列番号：２７に記載のエフェクター配列、及び、配列番号：２７に対して実質的に相補的でありその配列と二本鎖を形成可能なエフェクター相補配列、例えば、配列番号：２６に記載のエフェクター相補配列、を含むｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ９）をコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、
配列番号：３１に記載のエフェクター配列、及び、配列番号：３１に対して実質的に相補的でありその配列と二本鎖を形成可能なエフェクター相補配列、例えば、配列番号：３０に記載のエフェクター相補配列、を含むｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ１３）をコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、
配列番号：３３に記載のエフェクター配列、及び、配列番号：３３に対して実質的に相補的でありその配列と二本鎖を形成可能なエフェクター相補配列、例えば、配列番号：３２に記載のエフェクター相補配列、を含むｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ１４）をコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、及び、
配列番号：３９に記載のエフェクター配列、及び、配列番号：３９に対して実質的に相補的でありその配列と二本鎖を形成可能なエフェクター相補配列、例えば、配列番号：３８に記載のエフェクター相補配列、を含むｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ１７）をコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、
からなる群から選択される少なくとも２種の核酸を含む。

【0059】

１つの例では、ｄｄＲＮＡｉ構築物は、
配列番号：５６（ｓｈｍｉＲ２）に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、
配列番号：５７（ｓｈｍｉＲ３）に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、
配列番号：５９（ｓｈｍｉＲ５）に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、
配列番号：６２（ｓｈｍｉＲ９）に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、
配列番号：６４（ｓｈｍｉＲ１３）に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、
配列番号：６５（ｓｈｍｉＲ１４）に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、及び、
配列番号：６８（ｓｈｍｉＲ１７）に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、
からなる群から選択される少なくとも２種の核酸を含む。

【0060】

１つの例では、ｄｄＲＮＡｉ構築物内における少なくとも２種の核酸のそれぞれは、配列番号：２、９、１０及び１３のうちの１つに記載のＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的なエフェクター配列を含むｓｈｍｉＲをコードする。それゆえ、この例によるｄｄＲＮＡｉ構築物は、本明細書に記載のｓｈｍｉＲ３、ｓｈｍｉＲ１３、ｓｈｍｉＲ１４及びｓｈｍｉＲ１７から選択される２種のｓｈｍｉＲをコードする。

【0061】

本開示のｄｄＲＮＡｉ構築物の１つの例は、
配列番号：１７に記載のエフェクター配列、及び、配列番号：１７に対して実質的に相補的でありその配列と二本鎖を形成可能なエフェクター相補配列、例えば、配列番号：１６に記載のエフェクター相補配列、を含むｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ３）をコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、
配列番号：３１に記載のエフェクター配列、及び、配列番号：３１に対して実質的に相補的でありその配列と二本鎖を形成可能なエフェクター相補配列、例えば、配列番号：３０に記載のエフェクター相補配列、を含むｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ１３）をコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、
配列番号：３３に記載のエフェクター配列、及び、配列番号：３３に対して実質的に相補的でありその配列と二本鎖を形成可能なエフェクター相補配列、例えば、配列番号：３２に記載のエフェクター相補配列、を含むｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ１４）をコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、及び、
配列番号：３９に記載のエフェクター配列、及び、配列番号：３９に対して実質的に相補的でありその配列と二本鎖を形成可能なエフェクター相補配列、例えば、配列番号：３８に記載のエフェクター相補配列、を含むｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ１７）をコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、
からなる群から選択される少なくとも２種の核酸を含む。

【0062】

１つの例では、ｄｄＲＮＡｉ構築物は、
配列番号：５７（ｓｈｍｉＲ３）に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、
配列番号：６４（ｓｈｍｉＲ１３）に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、
配列番号：６５（ｓｈｍｉＲ１４）に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、及び、
配列番号：６８（ｓｈｍｉＲ１７）に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、
からなる群から選択される少なくとも２種の核酸を含む。

【0063】

本開示の１つの例示的なｄｄＲＮＡｉ構築物は、
（ａ）配列番号：３１に記載のエフェクター配列及び配列番号：３０に記載のエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ１３）をコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、及び、
（ｂ）配列番号：３９に記載のエフェクター配列及び配列番号：３８に記載のエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ１７）をコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、
を含む。

【0064】

この例によるｄｄＲＮＡｉ構築物は、
（ａ）配列番号：６４（ｓｈｍｉＲ１３）に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、及び、
（ｂ）配列番号：６８（ｓｈｍｉＲ１７）に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、
を含んでいてもよい。

【0065】

本開示の別の例示的なｄｄＲＮＡｉ構築物は、
（ａ）配列番号：１７に記載のエフェクター配列及び配列番号：１６に記載のエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ３）をコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、及び、
（ｂ）配列番号：３３に記載のエフェクター配列及び配列番号：３２に記載のエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ１４）をコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、
を含む。

【0066】

この例によるｄｄＲＮＡｉ構築物は、
（ａ）配列番号：５７（ｓｈｍｉＲ３）に記載の配列を含むかまたはそれからなる核酸、及び、
（ｂ）配列番号：６５（ｓｈｍｉＲ１４）に記載の配列を含むかまたはそれからなる核酸、
を含んでいてもよい。

【0067】

１つの例では、本明細書に記載のｄｄＲＮＡｉ構築物は、本開示のｓｈｍｉＲをコードする核酸またはそれぞれの核酸に機能的に連結する単一のプロモーターを含む。別の例では、本開示のｓｈｍｉＲをコードするそれぞれの核酸は別々のプロモーターに機能的に連結する。例えば、プロモーター（複数可）は、ｓｈｍｉＲ（複数可）をコードする対応する核酸（複数可）の上流に配置される。

【0068】

ｄｄＲＮＡｉ構築物が複数のプロモーターを含む例によれば、それらプロモーターは同一であるかまたは異なっていてもよい。採用され得る例示的なプロモーターは、例えば、Ｓｐｃ５１２及びＣＫ８などの筋特異的プロモーターである。採用され得るその他のプロモーターは、例えば、Ｕ６プロモーター及びＨ１プロモーターなどのＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターである。例示的なＵ６プロモーターは、Ｕ６－１プロモーター、Ｕ６－８プロモーター及びＵ６－９プロモーターである。

【0069】

本明細書に記載の複数種の核酸はまた、本開示の核酸（複数可）がコードする１種または複数種のｓｈｍｉＲをそれぞれが発現可能な複数種のｄｄＲＮＡｉ構築物の形態で提供され得るかまたはその構築物内に含まれ得る。例えば、複数種の核酸のそれぞれの核酸は、別々のｄｄＲＮＡｉ構築物の形態で提供され得るかまたはその構築物内に含まれ得る。

【0070】

１つの例では、複数種のｄｄＲＮＡｉ構築物は、ＯＰＭＤの原因となるＰＡＢＰＮ１タンパク質に対応するＲＮＡ転写物を標的とする少なくとも２種のｓｈｍｉＲ（そのそれぞれは互いに異なる）をｄｄＲＮＡｉ構築物が集合的にコードするように、本明細書に記載の複数種の核酸のうちの核酸をそれぞれが含む少なくとも２種のｄｄＲＮＡｉ構築物を含む。

【0071】

１つの例では、少なくとも２種のｄｄＲＮＡｉ構築物のそれぞれは、配列番号：１、２、４、７、９、１０及び１３のうちの１つに記載のＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的なエフェクター配列を含むｓｈｍｉＲをコードする。それゆえ、この例による複数種のｄｄＲＮＡｉ構築物は集合的に、本明細書に記載のｓｈｍｉＲ２、ｓｈｍｉＲ３、ｓｈｍｉＲ５、ｓｈｍｉＲ９、ｓｈｍｉＲ１３、ｓｈｍｉＲ１４及びｓｈｍｉＲ１７から選択される２種のｓｈｍｉＲをコードする。

【0072】

本開示の複数種のｄｄＲＮＡｉ構築物の１つの例は、
配列番号：１５に記載のエフェクター配列、及び、配列番号：１５に対して実質的に相補的でありその配列と二本鎖を形成可能なエフェクター相補配列、例えば、配列番号：１４に記載のエフェクター相補配列、を含むｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ２）をコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、を含むｄｄＲＮＡｉ構築物、
配列番号：１７に記載のエフェクター配列、及び、配列番号：１７に対して実質的に相補的でありその配列と二本鎖を形成可能なエフェクター相補配列、例えば、配列番号：１６に記載のエフェクター相補配列、を含むｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ３）をコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、を含むｄｄＲＮＡｉ構築物、
配列番号：２１に記載のエフェクター配列、及び、配列番号：２１に対して実質的に相補的でありその配列と二本鎖を形成可能なエフェクター相補配列、例えば、配列番号：２０に記載のエフェクター相補配列、を含むｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ５）をコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、を含むｄｄＲＮＡｉ構築物、
配列番号：２７に記載のエフェクター配列、及び、配列番号：２７に対して実質的に相補的でありその配列と二本鎖を形成可能なエフェクター相補配列、例えば、配列番号：２６に記載のエフェクター相補配列、を含むｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ９）をコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、を含むｄｄＲＮＡｉ構築物、
配列番号：３１に記載のエフェクター配列、及び、配列番号：３１に対して実質的に相補的でありその配列と二本鎖を形成可能なエフェクター相補配列、例えば、配列番号：３０に記載のエフェクター相補配列、を含むｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ１３）をコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、を含むｄｄＲＮＡｉ構築物、
配列番号：３３に記載のエフェクター配列、及び、配列番号：３３に対して実質的に相補的でありその配列と二本鎖を形成可能なエフェクター相補配列、例えば、配列番号：３２に記載のエフェクター相補配列、を含むｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ１４）をコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、を含むｄｄＲＮＡｉ構築物、及び、
配列番号：３９に記載のエフェクター配列、及び、配列番号：３９に対して実質的に相補的でありその配列と二本鎖を形成可能なエフェクター相補配列、例えば、配列番号：３８に記載のエフェクター相補配列、を含むｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ１７）をコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、を含むｄｄＲＮＡｉ構築物、
からなる群から選択される少なくとも２種のｄｄＲＮＡｉ構築物を含む。

【0073】

１つの例では、複数種のｄｄＲＮＡｉ構築物は、
配列番号：５６（ｓｈｍｉＲ２）に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、を含むｄｄＲＮＡｉ構築物、
配列番号：５７（ｓｈｍｉＲ３）に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、を含むｄｄＲＮＡｉ構築物、
配列番号：５９（ｓｈｍｉＲ５）に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、を含むｄｄＲＮＡｉ構築物、
配列番号：６２（ｓｈｍｉＲ９）に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、を含むｄｄＲＮＡｉ構築物、
配列番号：６４（ｓｈｍｉＲ１３）に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、を含むｄｄＲＮＡｉ構築物、
配列番号：６５（ｓｈｍｉＲ１４）に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、を含むｄｄＲＮＡｉ構築物、及び、
配列番号：６８（ｓｈｍｉＲ１７）に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、を含むｄｄＲＮＡｉ構築物、
からなる群から選択される少なくともｄｄＲＮＡｉ構築物を含む。

【0074】

１つの例では、少なくとも２種のｄｄＲＮＡｉ構築物のそれぞれは、配列番号：２、９、１０及び１３のうちの１つに記載のＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的なエフェクター配列を含むｓｈｍｉＲをコードする。それゆえ、この例による複数種のｄｄＲＮＡｉ構築物は集合的に、本明細書に記載のｓｈｍｉＲ３、ｓｈｍｉＲ１３、ｓｈｍｉＲ１４及びｓｈｍｉＲ１７から選択される２種のｓｈｍｉＲをコードする。

【0075】

本開示の複数種のｄｄＲＮＡｉ構築物の１つの例は、
配列番号：１７に記載のエフェクター配列、及び、配列番号：１７に対して実質的に相補的でありその配列と二本鎖を形成可能なエフェクター相補配列、例えば、配列番号：１６に記載のエフェクター相補配列、を含むｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ３）をコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、を含むｄｄＲＮＡｉ構築物、
配列番号：３１に記載のエフェクター配列、及び、配列番号：３１に対して実質的に相補的でありその配列と二本鎖を形成可能なエフェクター相補配列、例えば、配列番号：３０に記載のエフェクター相補配列、を含むｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ１３）をコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、を含むｄｄＲＮＡｉ構築物、
配列番号：３３に記載のエフェクター配列、及び、配列番号：３３に対して実質的に相補的でありその配列と二本鎖を形成可能なエフェクター相補配列、例えば、配列番号：３２に記載のエフェクター相補配列、を含むｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ１４）をコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、を含むｄｄＲＮＡｉ構築物、及び、
配列番号：３９に記載のエフェクター配列、及び、配列番号：３９に対して実質的に相補的でありその配列と二本鎖を形成可能なエフェクター相補配列、例えば、配列番号：３８に記載のエフェクター相補配列、を含むｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ１７）をコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、を含むｄｄＲＮＡｉ構築物、
からなる群から選択される少なくとも２種のｄｄＲＮＡｉ構築物を含む。

【0076】

１つの例では、少なくとも２種のｄｄＲＮＡｉ構築物は、
配列番号：５７（ｓｈｍｉＲ３）に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、を含むｄｄＲＮＡｉ構築物、
配列番号：６４（ｓｈｍｉＲ１３）に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、を含むｄｄＲＮＡｉ構築物、
配列番号：６５（ｓｈｍｉＲ１４）に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、を含むｄｄＲＮＡｉ構築物、及び、
配列番号：６８（ｓｈｍｉＲ１７）に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、を含むｄｄＲＮＡｉ構築物、
からなる群から選択される。

【0077】

１つの例示的な本開示の複数種のｄｄＲＮＡｉ構築物は、
（ａ）配列番号：３１に記載のエフェクター配列及び配列番号：３０に記載のエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ１３）をコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、を含むｄｄＲＮＡｉ構築物、及び、
（ｂ）配列番号：３９に記載のエフェクター配列及び配列番号：３８に記載のエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ１７）をコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、を含むｄｄＲＮＡｉ構築物、
を含む。

【0078】

この例による複数種のｄｄＲＮＡｉ構築物は、
（ａ）配列番号：６４（ｓｈｍｉＲ１３）に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、を含むｄｄＲＮＡｉ構築物、及び、
（ｂ）配列番号：６８（ｓｈｍｉＲ１７）に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、を含むｄｄＲＮＡｉ構築物、
を含んでいてもよい。

【0079】

別の例示的な本開示の複数種のｄｄＲＮＡｉ構築物は、
（ａ）配列番号：１７に記載のエフェクター配列及び配列番号：１６に記載のエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ３）をコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、を含むｄｄＲＮＡｉ構築物、及び、
（ｂ）配列番号：３３に記載のエフェクター配列及び配列番号：３２に記載のエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ１４）をコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、を含むｄｄＲＮＡｉ構築物、
を含む。

【0080】

この例による複数種のｄｄＲＮＡｉ構築物は、
（ａ）配列番号：５７（ｓｈｍｉＲ３）に記載の配列を含むかまたはそれからなる核酸、を含むｄｄＲＮＡｉ構築物、及び、
（ｂ）配列番号：６５（ｓｈｍｉＲ１４）に記載の配列を含むかまたはそれからなる核酸、を含むｄｄＲＮＡｉ構築物、
を含んでいてもよい。

【0081】

本明細書に記載の複数種のｄｄＲＮＡｉ構築物のそれぞれのｄｄＲＮＡｉ構築物は、ｄｄＲＮＡｉ構築物内に含まれる、ｓｈｍｉＲをコードする核酸またはそれぞれの核酸に機能的に連結する単一のプロモーターを含む。複数種のｄｄＲＮＡｉ構築物のｄｄＲＮＡｉ構築物がｓｈｍｉＲをコードする２種以上の核酸を含む場合、それぞれの核酸は、同一のプロモーターに機能的に連結するかまたは別々のプロモーターに機能的に連結してもよい。複数種のｄｄＲＮＡｉ構築物について説明した上の例のそれぞれでは、プロモーター（複数可）は、ｓｈｍｉＲ（複数可）をコードする対応する核酸（複数可）の上流に配置される。

【0082】

採用され得る例示的なプロモーターは、例えば、Ｓｐｃ５１２及びＣＫ８などの筋特異的プロモーターである。採用され得るその他のプロモーターは、例えば、Ｕ６プロモーター及びＨ１プロモーターなどのＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターである。例示的なＵ６プロモーターは、Ｕ６－１プロモーター、Ｕ６－８プロモーター及びＵ６－９プロモーターである。複数種のｄｄＲＮＡｉ構築物の対応するｄｄＲＮＡｉ構築物内に含まれるプロモーターは同一であるかまたは異なっていてもよい。

【0083】

本開示はまた、
（ａ）本明細書に記載のｄｄＲＮＡｉ構築物、及び、
（ｂ）ｄｄＲＮＡｉ構築物がコードするｓｈｍｉＲ（複数可）が標的としないｍＲＮＡ転写物を有する機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含むＰＡＢＰＮ１構築物、
を含むＤＮＡ構築物を提供する。機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードするＤＮＡ配列は、そのｍＲＮＡ転写物がｄｄＲＮＡｉ構築物のｓｈｍｉＲによって標的とされないようにコドン最適化されることが好ましい。１つの例では、機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質は、例えば、配列番号：７４に記載の配列を有する野生型ヒトＰＡＢＰＮ１タンパク質である。１つの例では、機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードするコドン最適化ＤＮＡ配列は配列番号：７３に記載されている。

【0084】

ＤＮＡ構築物は１つまたは複数のプロモーターを含んでいてもよい。本開示のＤＮＡ構築物に使用する例示的なプロモーターは、例えば、Ｓｐｃ５１２及びＣＫ８などの筋特異的プロモーターである。

【0085】

１つの例によれば、ＤＮＡ構築物はＰＡＢＰＮ１構築物とｄｄＲＮＡｉ構築物に機能的に連結するプロモーターを含み、そのプロモーターはＰＡＢＰＮ１構築物とｄｄＲＮＡｉ構築物の上流に配置される。

【0086】

１つの例では、ＤＮＡ構築物は、５´→３´方向に、
（ａ）筋特異的プロモーター、例えば、Ｓｐｃ５１２、
（ｂ）ｄｄＲＮＡｉ構築物がコードするｓｈｍｉＲが標的としないｍＲＮＡ転写物を有する機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む本明細書に記載のＰＡＢＰＮ１構築物、及び、
（ｃ）本明細書に記載のｓｈｍｉＲ１３をコードするＤＮＡ配列を含む核酸及び本明細書に記載のｓｈｍｉＲ１７をコードするＤＮＡ配列を含む核酸を含む本開示のｄｄＲＮＡｉ構築物、
を含む。

【0087】

別の例では、ＤＮＡ構築物は、
（ａ）筋特異的プロモーター、例えば、Ｓｐｃ５１２、
（ｂ）ｄｄＲＮＡｉ構築物がコードするｓｈｍｉＲが標的としないｍＲＮＡ転写物を有する機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む本明細書に記載のＰＡＢＰＮ１構築物、及び、
（ｃ）本明細書に記載のｓｈｍｉＲ３をコードするＤＮＡ配列を含む核酸及び本明細書に記載のｓｈｍｉＲ１４をコードするＤＮＡ配列を含む核酸を含む本開示のｄｄＲＮＡｉ構築物、
を含む。

【0088】

別の例では、ＰＡＢＰＮ１構築物とｄｄＲＮＡｉ構築物はそれぞれ、ＤＮＡ構築物内における別々のプロモーターに機能的に連結する。例えば、ＰＡＢＰＮ１構築物と機能的に連結するプロモーターは、ＰＡＢＰＮ１構築物内に含まれる、機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードするＤＮＡ配列に機能的に連結する。ｄｄＲＮＡｉ構築物と機能的に連結するプロモーターまたはそれぞれのプロモーターは、ｄｄＲＮＡｉ構築物内に含まれる、本開示のｓｈｍｉＲをコードする１種または複数種の核酸と機能的に連結する。本開示のＤＮＡ構築物に使用する例示的なプロモーターは、例えば、Ｓｐｃ５１２及びＣＫ８などの筋特異的プロモーターである。

【0089】

この例による１種のＤＮＡ構築物は、５´→３´方向に、
（ａ）筋特異的プロモーター、例えば、本明細書に記載のｓｈｍｉＲ１３をコードするＤＮＡ配列を含む核酸及び本明細書に記載のｓｈｍｉＲ１７をコードするＤＮＡ配列を含む核酸を含む本開示のｄｄＲＮＡｉ構築物の上流に配置されるＣＫ８プロモーター、及び、
（ｂ）筋特異的プロモーター、例えば、ｄｄＲＮＡｉ構築物がコードするｓｈｍｉＲが標的としないｍＲＮＡ転写物を有する機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む本明細書に記載のＰＡＢＰＮ１構築物の上流に配置されるＳｐｃ５１２プロモーター、
を含む。

【0090】

この例による別のＤＮＡ構築物は、５´→３´方向に、
（ａ）筋特異的プロモーター、例えば、本明細書に記載のｓｈｍｉＲ３をコードするＤＮＡ配列を含む核酸及び本明細書に記載のｓｈｍｉＲ１４をコードするＤＮＡ配列を含む核酸を含む本開示のｄｄＲＮＡｉ構築物の上流に配置されるＣＫ８プロモーター、及び、 （ｂ）筋特異的プロモーター、例えば、ｄｄＲＮＡｉ構築物がコードするｓｈｍｉＲが標的としないｍＲＮＡ転写物を有する機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む本明細書に記載のＰＡＢＰＮ１構築物の上流に配置されるＳｐｃ５１２プロモーター、
を含む。

【0091】

本開示のＤＮＡ構築物内に含まれる、ｓｈｍｉＲ１３とｓｈｍｉＲ１７をコードする例示的なｄｄＲＮＡｉ構築物は、配列番号：３１に記載のエフェクター配列及び配列番号：３１に記載の配列に対して実質的に相補的なエフェクター相補配列、例えば、配列番号：３０に記載のエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ１３）をコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、及び、配列番号：３９に記載のエフェクター配列及び配列番号：３９に記載の配列に対して実質的に相補的なエフェクター相補配列、例えば、配列番号：３８に記載のエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ１７）をコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸を含んでいてもよい。例えば、ＤＮＡ構築物のこの例によるｄｄＲＮＡｉ構築物は、配列番号：６４に記載のＤＮＡ配列（ｓｈｍｉＲ１３）を含むかまたはそれからなる核酸、及び、配列番号：６８に記載のＤＮＡ配列（ｓｈｍｉＲ１７）を含むかまたはそれからなる核酸、を含んでいてもよい。

【0092】

本開示のＤＮＡ構築物内に含まれる、ｓｈｍｉＲ３とｓｈｍｉＲ１４をコードする例示的なｄｄＲＮＡｉ構築物は、配列番号：１７に記載のエフェクター配列及び配列番号：１７に記載の配列に対して実質的に相補的なエフェクター相補配列、例えば、配列番号：１６に記載のエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ３）をコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、及び、配列番号：３３に記載のエフェクター配列及び配列番号：３３に記載の配列に対して実質的に相補的なエフェクター相補配列、例えば、配列番号：３４に記載のエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ１４）をコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸を含んでいてもよい。例えば、ＤＮＡ構築物のこの例によるｄｄＲＮＡｉ構築物は、配列番号：５７に記載のＤＮＡ配列（ｓｈｍｉＲ３）を含むかまたはそれからなる核酸、及び、配列番号：６５に記載のＤＮＡ配列（ｓｈｍｉＲ１４）を含むかまたはそれからなる核酸、を含んでいてもよい。

【0093】

本開示はまた、本開示のｄｄＲＮＡｉ構築物もしくは本開示の複数種のｄｄＲＮＡｉ構築物または本開示のＤＮＡ構築物を含む発現ベクターを提供する。

【0094】

本開示はまた、そのそれぞれが本開示のｄｄＲＮＡｉ構築物を含む複数種の発現ベクターを提供する。例えば、複数種の発現ベクターのうちの１種または複数種は、本明細書で開示する複数種のｄｄＲＮＡｉ構築物を含む。別の例では、複数種の発現ベクターのそれぞれの発現ベクターは、本明細書で開示する複数種のｄｄＲＮＡｉ構築物を含む。更なる例では、複数種の発現ベクターのそれぞれの発現ベクターは、本明細書に記載の単一のｄｄＲＮＡｉ構築物を含む。本パラグラフ中における上記様式のいずれかでは、複数種の発現ベクターは、本開示による複数種のｓｈｍｉＲを集合的に発現し得る。

【0095】

本開示はまた、
（ａ）本開示の１種または複数種のｄｄＲＮＡｉ構築物を含む発現ベクター、及び、
（ｂ）ｄｄＲＮＡｉ構築物がコードするｓｈｍｉＲ（複数可）が標的としないｍＲＮＡ転写物を有する機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含むＰＡＢＰＮ１構築物を含む発現ベクター、
を含む複数種の発現ベクターを提供する。

【0096】

機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードするＤＮＡ配列は、そのｍＲＮＡ転写物がｄｄＲＮＡｉ構築物のｓｈｍｉＲによって標的とされないようにコドン最適化されることが好ましい。１つの例では、機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質は、例えば、配列番号：７４に記載の配列を有する野生型ヒトＰＡＢＰＮ１タンパク質である。１つの例では、機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードするコドン最適化ＤＮＡ配列は配列番号：７３に記載されている。

【0097】

１つの例では、機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードするＤＮＡ配列は、ＰＡＢＰＮ１構築物内に含まれ機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードするＤＮＡ配列の上流に配置されるプロモーターに機能的に連結してもよい。別の例では、ＰＡＢＰＮ１構築物を含む発現ベクターは、ＰＡＢＰＮ１構築物の上流にあり機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードするＤＮＡ配列と機能的に連結するプロモーターを含む。本開示の発現ベクター（複数可）に使用する例示的なプロモーターは、例えば、Ｓｐｃ５１２及びＣＫ８などの筋特異的プロモーターである。

【0098】

１つの例では、発現ベクターまたはそれぞれの発現ベクターはプラスミドまたはミニサークルである。

【0099】

１つの例では、プラスミド、ミニサークル、発現ベクターまたはｄｄＲＮＡｉ構築物は、カチオン性ＤＮＡ結合ポリマー、例えば、ポリエチレンイミンと複合体を形成する。

【0100】

別の例では、発現ベクターまたはそれぞれの発現ベクターはウイルスベクターである。例えば、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター（ＡｄＶ）及びレンチウイルス（ＬＶ）ベクターからなる群から選択される。

【0101】

本開示はまた、本明細書に記載のｄｄＲＮＡｉ構築物及び／または複数種のｄｄＲＮＡｉ構築物及び／または発現ベクター及び／または複数種の発現ベクターを含む組成物を提供する。１つの例では、組成物はまた、１種または複数種の薬学的に許容される担体及び／または希釈剤を含んでいてもよい。

【0102】

本開示はまた、ＯＰＭＤの原因となるＰＡＢＰＮ１タンパク質の対象における発現を阻害するための方法を提供し、上記方法は、本明細書に記載の核酸、複数種の核酸、ｄｄＲＮＡｉ構築物、複数種のｄｄＲＮＡｉ構築物、ＤＮＡ構築物、発現ベクター、複数種の発現ベクター、または組成物を対象に投与することを含む。

【0103】

本開示はまた、ＯＰＭＤを患う対象においてそれを治療するための方法を提供し、その方法は、本明細書に記載の核酸、複数種の核酸、ｄｄＲＮＡｉ構築物、複数種のｄｄＲＮＡｉ構築物、ＤＮＡ構築物、発現ベクター、複数種の発現ベクター、または組成物を対象に投与することを含む。本方法は、複数種の発現ベクターを共に、同時にまたは連続で対象に投与することを含んでいてもよい。

【0104】

本開示はまた、
（ａ）ＯＰＭＤの原因となるＰＡＢＰＮ１タンパク質の発現を阻害するための１種または複数種の薬剤（上記薬剤（複数可）は、本明細書に記載の核酸、複数種の核酸、ｄｄＲＮＡｉ構築物、複数種のｄｄＲＮＡｉ構築物、ＤＮＡ構築物、発現ベクター、複数種の発現ベクター、または組成物から選択される）、及び、
（ｂ）（ａ）の薬剤により発現されるｓｈｍｉＲが標的としないｍＲＮＡ転写物を有する機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクター、
を含むキットを提供する。

【0105】

機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードするＤＮＡ配列は、そのｍＲＮＡ転写物が、（ａ）の薬剤がコードするｓｈｍｉＲによって標的とされないように、コドン最適化されることが好ましい。１つの例では、機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質は、例えば、配列番号：７４に記載の配列を有する野生型ヒトＰＡＢＰＮ１タンパク質である。１つの例では、機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードするコドン最適化ＤＮＡ配列は配列番号：７３に記載されている。

【0106】

機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードするＤＮＡ配列は、（ｂ）の発現ベクター内に含まれ機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードするＤＮＡ配列の上流に配置されるプロモーターに機能的に連結してもよい。（ｂ）の発現ベクターに使用する例示的なプロモーターは、例えば、Ｓｐｃ５１２プロモーターまたはＣＫ８プロモーターなどの筋特異的プロモーターである。

【0107】

本開示はまた、別々の構成成分としてパッケージ化された本明細書に記載の複数種の発現ベクターを含むキットを提供する。

【0108】

本開示はまた、本開示の方法に使用するための取扱説明書と共にパッケージ化された、本明細書に記載の核酸、複数種の核酸、ｄｄＲＮＡｉ構築物、複数種のｄｄＲＮＡｉ構築物、ＤＮＡ構築物、発現ベクター、複数種の発現ベクター、または組成物を含むキットを提供する。

【0109】

１つの例では、本明細書に記載のキットは、本明細書に記載の方法に従ってＯＰＭＤを治療するのに使用される。

【0110】

本開示はまた、例えば、対象におけるＯＰＭＤを治療するための薬剤の調製における、及び／または、本明細書で開示する方法における、本明細書に記載の核酸、複数種の核酸、ｄｄＲＮＡｉ構築物、複数種のｄｄＲＮＡｉ構築物、ＤＮＡ構築物、発現ベクター、複数種の発現ベクター及び／または組成物の使用を提供する。

【0111】

本開示はまた、治療に使用するための、本明細書に記載の核酸、複数種の核酸、ｄｄＲＮＡｉ構築物、複数種のｄｄＲＮＡｉ構築物、ＤＮＡ構築物、発現ベクター、複数種の発現ベクター及び／または組成物を提供する。例えば、核酸、複数種の核酸、ｄｄＲＮＡｉ構築物、複数種のｄｄＲＮＡｉ構築物、ＤＮＡ構築物、発現ベクター、複数種の発現ベクター及び／または組成物は、ＯＰＭＤを患うまたはＯＰＭＤに罹患しやすい対象におけるＯＰＭＤの治療に使用するもの、及び／または、本明細書で開示する方法に使用するものであってもよい。

【図面の簡単な説明】

【0112】

【図1】５´隣接領域、ｓｉＲＮＡセンス鎖、ステム／ループ接合部配列、ｓｉＲＮＡアンチセンス鎖及び３´隣接領域を含む代表的なｓｈｍｉＲ構築物の予測二次構造を示す図である。

【図2】ｓｈｍｉＲ２～１７と呼ばれるｓｈｍｉＲのアンチセンス配列及びセンス配列を有するｓｈｍｉＲのＨＥＫ２９３細胞におけるｗｔＰＡＢＰＮ１阻害活性をｐｓｉｌｅｎｃｅｒ対照と比較して示す図である。このグラフは、ｓｈｍｉＲ１１を除く全てのｓｈｍｉＲがｗｔＰＡＢＰＮ１ルシフェラーゼレポーター由来のルシフェラーゼ発現のレベルを下方制御したことを示している。

【図3】ｓｈｍｉＲ２～１７と呼ばれるｓｈｍｉＲのアンチセンス配列及びセンス配列を有するｓｈｍｉＲのＨＥＫ２９３細胞におけるｏｐｔＰＡＢＰＮ１阻害活性をｐｓｉｌｅｎｃｅｒ対照と比較して示す図である。このグラフは、ｏｐｔＰＡＢＰＮ１ルシフェラーゼレポーター由来の発現の下方制御がなかったことを示している。

【図4】図４（Ａ）は、ｓｈｍｉＲ２、ｓｈｍｉＲ３、ｓｈｍｉＲ５、ｓｈｍｉＲ９、ｓｈｍｉＲ１３、ｓｈｍｉＲ１４、ｓｈｍｉＲ１６またはｓｈｍｉＲ１７をコードするプラスミドをトランスフェクションしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞で発現したＦＬＡＧタグ付きｗｔＰＡＢＰＮ１タンパク質のレベルをＨｓｐ９０タンパク質と比較して示すウェスタンブロットである。これは、選択したｓｈｍｉＲの全てがｗｔＰＡＢＰＮ１の発現をノックダウンしたことを示している。図４（Ｂ）は、ＨＥＫ２９３細胞におけるＦＬＡＧタグ付きｗｔＰＡＢＰＮ１タンパク質の阻害率をｐｓｉｌｅｎｃｅｒ対照と比較して示す図である。このグラフは、選択したｓｈｍｉＲの全てがｗｔＰＡＢＰＮ１の発現を阻害率＞９０％（図４（Ａ）のウェスタンブロットの濃度測定解析により確認した）でノックダウンしたことを示している。

【図5】図５（Ａ）は、ｓｈｍｉＲ２、ｓｈｍｉＲ３、ｓｈｍｉＲ５、ｓｈｍｉＲ９、ｓｈｍｉＲ１３、ｓｈｍｉＲ１４、ｓｈｍｉＲ１６またはｓｈｍｉＲ１７をコードするｓｈｍｉＲプラスミドをトランスフェクションしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞で発現したＦＬＡＧタグ付きコドン最適化ＰＡＢＰＮ１タンパク質のレベルをＨｓｐ９０タンパク質と比較して示すウェスタンブロットである。これは、どのｓｈｍｉＲもコドン最適化ＰＡＢＰＮ１構築物の発現産物の阻害をもたらさなかったことを示している。図５（Ｂ）は、ＨＥＫ２９３細胞におけるＦＬＡＧタグ付きコドン最適化ＰＡＢＰＮ１タンパク質の阻害率をｐｓｉｌｅｎｃｅｒ対照と比較して示す図である。このグラフは、どのｓｈｍｉＲもコドン最適化ＰＡＢＰＮ１構築物の発現産物の阻害をもたらさなかった（図５（Ａ）のウェスタンブロットの濃度測定解析により確認した）ことを示している。

【図6】ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における、ｓｈｍｉＲ２、ｓｈｍｉＲ３、ｓｈｍｉＲ５、ｓｈｍｉＲ９、ｓｈｍｉＲ１３、ｓｈｍｉＲ１４、ｓｈｍｉＲ１６またはｓｈｍｉＲ１７による内在性ｗｔＰＡＢＰＮ１発現の阻害率（ｑＰＣＲ解析により確認した）を示す図である。このグラフは、ｓｈｍｉＲがｗｔＰＡＢＰＮ１の発現を１６．４％～４９．１％の範囲の阻害率（平均３５．５％）で下方制御したことを示している。

【図7】ｓｈｍｉＲ２、ｓｈｍｉＲ３、ｓｈｍｉＲ５、ｓｈｍｉＲ９、ｓｈｍｉＲ１３、ｓｈｍｉＲ１４、ｓｈｍｉＲ１６またはｓｈｍｉＲ１７による阻害に応じた、Ｃ２Ｃ１２細胞における内在性ＰＡＢＰＮ１発現の阻害率（ｑＰＣＲ解析により確認した）を示す図である。このグラフは、ｓｈｍｉＲ１６（約４３％の阻害率）を除く個々のｓｈｍｉＲの全てが、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ対照と比較して、Ｃ２Ｃ１２細胞におけるＰＡＢＰＮ１の発現を約８０％の平均阻害率で下方制御したことを示している。

【図8】Ｃ２Ｃ１２細胞における、個々のｓｈｍｉＲ１３、ｓｈｍｉＲ１７、ｓｈｍｉＲ３及びｓｈｍｉＲ１４、ならびに、ｓｈｍｉＲ１３とｓｈｍｉＲ１７の組み合わせ（ｓｈｍｉＲ１３／１７）及びｓｈｍｉＲ３とｓｈｍｉＲ１４の組み合わせ（ｓｈｍｉＲ３／１４）のｓｈｍｉＲによるＰＡＢＰＮ１発現の阻害率（ｑＰＣＲ解析により確認した）を示す図である。このグラフは、ｓｈｍｉＲ１３／１７共トランスフェクションが、それぞれ個々のｓｈｍｉＲ１３とｓｈｍｉＲ１７における９２．５％と７６．７％と比較して８４．４％のＰＡＢＰＮ１発現の阻害率をもたらし、ｓｈｍｉＲ３／１４共トランスフェクションが、それぞれ個々のｓｈｍｉＲ３とｓｈｍｉＲ１４における７６．２％と８０．４％と比較して７９．０％の阻害率をもたらしたことを示している。

【図9】ＡＲＰＥ－１９細胞における、個々のｓｈｍｉＲ１３、ｓｈｍｉＲ１７、ｓｈｍｉＲ３及びｓｈｍｉＲ１４、ならびに、ｓｈｍｉＲ１３とｓｈｍｉＲ１７の組み合わせ（ｓｈｍｉＲ１３／１７）及びｓｈｍｉＲ３とｓｈｍｉＲ１４の組み合わせ（ｓｈｍｉＲ３／１４）によるＰＡＢＰＮ１発現の阻害率（ｑＰＣＲ解析により確認した）を示す図である。このグラフは、ＡＲＰＥ－１９細胞におけるＰＡＢＰＮ１発現の阻害率が４８時間と７２時間の間で１．１４倍上昇したことを示している。

【図10】図１０（Ａ）は、ｓｈｍｉＲ１３、ｓｈｍｉＲ１４及びｓｈｍｉＲ１７をトランスフェクションしたＣ２Ｃ１２細胞内で発現したｓｈｍｉＲの総数を測定するｑＰＣＲにより得られた標準曲線を示す図である。図１０（Ｂ）は、ｓｈｍｉＲ３をトランスフェクションしたＣ２Ｃ１２細胞内で発現したｓｈｍｉＲの総数を測定するｑＰＣＲにより得られた非線形標準曲線を示す図である。

【図11】ｓｈｍｉＲ３、ｓｈｍｉＲ１３、ｓｈｍｉＲ１４及びｓｈｍｉＲ１７を発現するｓｈｍｉＲベクターを形質導入したＣ２Ｃ１２細胞における上記ｓｈｍｉＲの発現のレベルを示す図である。

【図12】図１２（Ａ）は、内在性ＰＡＢＰＮ１の遺伝子サイレンシングと、ｗｔＰＡＢＰＮ１を標的とする２種のｓｈｍｉＲをｐＡＡＶ２ベクター骨格におけるコドン最適化ＰＡＢＰＮ１転写物の３´非翻訳領域にサブクローニングすることにより作製したコドン最適化ＰＡＢＰＮ１への置換を同時に行うための構築物を示す概略図である。図１２（Ｂ）は、内在性ＰＡＢＰＮ１の遺伝子サイレンシングと、ｗｔＰＡＢＰＮ１を標的とする２種のｓｈｍｉＲをｏｐｔＰＡＢＰＮ１の上流にある配列にサブクローニングすることにより作製したコドン最適化ＰＡＢＰＮ１への置換を同時に行うための構築物を示す概略図である。

【図13】ＡＡＶ９－ｅＧＦＰ注射後のマウス四肢におけるインビボ蛍光を示す図である。

【図14】内在性ＰＡＢＰＮ１の遺伝子サイレンシングと、ｗｔＰＡＢＰＮ１を標的とする２種のｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ１７及びｓｈｍｉＲ１３）をｐＡＡＶ２ベクター骨格におけるコドン最適化ＰＡＢＰＮ１転写物の３´非翻訳領域にサブクローニングすることにより作製したコドン最適化ＰＡＢＰＮ１への置換を同時に行うために設計されたＳＲ－構築物を示す概略図である。

【図15】サイレンシング置換構築物（以下「ＳＲ－構築物」）で治療したＡ１７マウスにおけるＰＡＢＰＮ１の阻害率を示し、高用量と低用量の両方においてＰＡＢＰＮ１の強力な阻害が達成されていることを示す図である。

【図16】高用量及び低用量のＳＲ－構築物で治療したＡ１７マウスにおけるコドン最適化ＰＡＢＰＮ１の発現のレベルを野生型ＰＡＢＰＮ１（変異形態を含む）と比較して示す図である。

【図17】（ｉ）生理食塩水で治療したＡ１７マウス、（ｉｉ）生理食塩水で治療したＦｖＢマウス、（ｉｉｉ）高用量及び低用量のＳＲ－構築物で治療したＡ１７マウス由来の前脛骨筋（ＴＡ）の切片内における、ＰＡＢＰＮ１とラミニンを検出するための免疫蛍光組織化学を示す図である。ＰＡＢＰＮ１陽性核内封入体（ＩＮＩ）の数は、ＳＲ－構築物（高用量と低用量の両方）で治療したマウス由来の筋肉において有意に減少している。

【図18】（ｉ）生理食塩水で治療したＡ１７マウス、（ｉｉ）生理食塩水で治療したＦｖＢマウス、（ｉｉｉ）高用量及び低用量のＳＲ－構築物で治療したＡ１７マウス由来の前脛骨筋（ＴＡ）の切片内における、ＩＮＩを含有する核のレベル（パーセンテージで表す）を示す図である。このグラフは、ＳＲ－構築物（高用量と低用量の両方）による治療が、生理食塩水を注射したＡ１７の筋肉と比較してＩＮＩの量を約１０％に低下させることを示している。

【図19】（ｉ）生理食塩水で治療したＡ１７マウス、（ｉｉ）生理食塩水で治療したＦｖＢマウス、（ｉｉｉ）高用量及び低用量のＳＲ－構築物で治療したＡ１７マウスから切除した前脛骨筋（ＴＡ）の重量を示す図である。このグラフは、ＳＲ－構築物（高用量と低用量の両方）による治療が、筋肉量をＦｖＢ動物の野生型レベル付近に回復させることを示している。全ての筋肉測定は１４週目または２０週目の屠殺日に実施した。

【図20】（ｉ）生理食塩水で治療したＡ１７マウス、（ｉｉ）生理食塩水で治療したＦｖＢマウス、（ｉｉｉ）高用量及び低用量のＳＲ－構築物で治療したＡ１７マウスから切除した前脛骨筋（ＴＡ）の最大等尺力を示す図である。このグラフは、ＳＲ－構築物（高用量と低用量の両方）を用いた治療により、ＦｖＢ野生型動物と比較した際にＡ１７マウスに認められたおおよそ６６％の筋力低下の差が回復したことを示している。全ての筋肉測定は１４週目または２０週目の屠殺日に実施した。統計値は、Ａ１７生理食塩水マウスと比較した対応のないｔ検定で示している。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１。

【0113】

主な配列表
配列番号：１： ＰＡＢＰＮ１ ｍＲＮＡ領域２と呼ばれる、ＰＡＢＰＮ１タンパク質に対応するｍＲＮＡ転写物内の領域のＲＮＡ配列。
配列番号：２： ＰＡＢＰＮ１ ｍＲＮＡ領域３と呼ばれる、ＰＡＢＰＮ１タンパク質に対応するｍＲＮＡ転写物内の領域のＲＮＡ配列。
配列番号：３： ＰＡＢＰＮ１ ｍＲＮＡ領域４と呼ばれる、ＰＡＢＰＮ１タンパク質に対応するｍＲＮＡ転写物内の領域のＲＮＡ配列。
配列番号：４： ＰＡＢＰＮ１ ｍＲＮＡ領域５と呼ばれる、ＰＡＢＰＮ１タンパク質に対応するｍＲＮＡ転写物内の領域のＲＮＡ配列。
配列番号：５： ＰＡＢＰＮ１ ｍＲＮＡ領域６と呼ばれる、ＰＡＢＰＮ１タンパク質に対応するｍＲＮＡ転写物内の領域のＲＮＡ配列。
配列番号：６： ＰＡＢＰＮ１ ｍＲＮＡ領域７と呼ばれる、ＰＡＢＰＮ１タンパク質に対応するｍＲＮＡ転写物内の領域のＲＮＡ配列。
配列番号：７： ＰＡＢＰＮ１ ｍＲＮＡ領域９と呼ばれる、ＰＡＢＰＮ１タンパク質に対応するｍＲＮＡ転写物内の領域のＲＮＡ配列。
配列番号：８： ＰＡＢＰＮ１ ｍＲＮＡ領域１１と呼ばれる、ＰＡＢＰＮ１タンパク質に対応するｍＲＮＡ転写物内の領域のＲＮＡ配列。
配列番号：９： ＰＡＢＰＮ１ ｍＲＮＡ領域１３と呼ばれる、ＰＡＢＰＮ１タンパク質に対応するｍＲＮＡ転写物内の領域のＲＮＡ配列。
配列番号：１０： ＰＡＢＰＮ１ ｍＲＮＡ領域１４と呼ばれる、ＰＡＢＰＮ１タンパク質に対応するｍＲＮＡ転写物内の領域のＲＮＡ配列。
配列番号：１１： ＰＡＢＰＮ１ ｍＲＮＡ領域１５と呼ばれる、ＰＡＢＰＮ１タンパク質に対応するｍＲＮＡ転写物内の領域のＲＮＡ配列。
配列番号：１２： ＰＡＢＰＮ１ ｍＲＮＡ領域１６と呼ばれる、ＰＡＢＰＮ１タンパク質に対応するｍＲＮＡ転写物内の領域のＲＮＡ配列。
配列番号：１３： ＰＡＢＰＮ１ ｍＲＮＡ領域１７と呼ばれる、ＰＡＢＰＮ１タンパク質に対応するｍＲＮＡ転写物内の領域のＲＮＡ配列。
配列番号：１４： ｓｈｍｉＲ２と呼ばれるｓｈｍｉＲのＲＮＡエフェクター相補配列。配列番号：１５： ｓｈｍｉＲ２と呼ばれるｓｈｍｉＲのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号：１６： ｓｈｍｉＲ３と呼ばれるｓｈｍｉＲのＲＮＡエフェクター相補配列。配列番号：１７： ｓｈｍｉＲ３と呼ばれるｓｈｍｉＲのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号：１８： ｓｈｍｉＲ４と呼ばれるｓｈｍｉＲのＲＮＡエフェクター相補配列。配列番号：１９： ｓｈｍｉＲ４と呼ばれるｓｈｍｉＲのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号：２０： ｓｈｍｉＲ５と呼ばれるｓｈｍｉＲのＲＮＡエフェクター相補配列。配列番号：２１： ｓｈｍｉＲ５と呼ばれるｓｈｍｉＲのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号：２２： ｓｈｍｉＲ６と呼ばれるｓｈｍｉＲのＲＮＡエフェクター相補配列。配列番号：２３： ｓｈｍｉＲ６と呼ばれるｓｈｍｉＲのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号：２４： ｓｈｍｉＲ７と呼ばれるｓｈｍｉＲのＲＮＡエフェクター相補配列。配列番号：２５： ｓｈｍｉＲ７と呼ばれるｓｈｍｉＲのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号：２６： ｓｈｍｉＲ９と呼ばれるｓｈｍｉＲのＲＮＡエフェクター相補配列。配列番号：２７： ｓｈｍｉＲ９と呼ばれるｓｈｍｉＲのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号：２８： ｓｈｍｉＲ１１と呼ばれるｓｈｍｉＲのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号：２９： ｓｈｍｉＲ１１と呼ばれるｓｈｍｉＲのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号：３０： ｓｈｍｉＲ１３と呼ばれるｓｈｍｉＲのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号：３１： ｓｈｍｉＲ１３と呼ばれるｓｈｍｉＲのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号：３２： ｓｈｍｉＲ１４と呼ばれるｓｈｍｉＲのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号：３３： ｓｈｍｉＲ１４と呼ばれるｓｈｍｉＲのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号：３４： ｓｈｍｉＲ１５と呼ばれるｓｈｍｉＲのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号：３５： ｓｈｍｉＲ１５と呼ばれるｓｈｍｉＲのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号：３６： ｓｈｍｉＲ１６と呼ばれるｓｈｍｉＲのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号：３７： ｓｈｍｉＲ１６と呼ばれるｓｈｍｉＲのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号：３８： ｓｈｍｉＲ１７と呼ばれるｓｈｍｉＲのＲＮＡエフェクター相補配列。
配列番号：３９： ｓｈｍｉＲ１７と呼ばれるｓｈｍｉＲのＲＮＡエフェクター配列。
配列番号：４０： ｓｈｍｉＲのＲＮＡステムループ配列
配列番号：４１： ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ骨格の５´隣接配列。
配列番号：４２： ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ骨格の３´隣接配列。
配列番号：４３： ｓｈｍｉＲ２と呼ばれるｓｈｍｉＲのＲＮＡ配列。
配列番号：４４： ｓｈｍｉＲ３と呼ばれるｓｈｍｉＲのＲＮＡ配列。
配列番号：４５： ｓｈｍｉＲ４と呼ばれるｓｈｍｉＲのＲＮＡ配列。
配列番号：４６： ｓｈｍｉＲ５と呼ばれるｓｈｍｉＲのＲＮＡ配列。
配列番号：４７： ｓｈｍｉＲ６と呼ばれるｓｈｍｉＲのＲＮＡ配列。
配列番号：４８： ｓｈｍｉＲ７と呼ばれるｓｈｍｉＲのＲＮＡ配列。
配列番号：４９： ｓｈｍｉＲ９と呼ばれるｓｈｍｉＲのＲＮＡ配列。
配列番号：５０： ｓｈｍｉＲ１１と呼ばれるｓｈｍｉＲのＲＮＡ配列。
配列番号：５１： ｓｈｍｉＲ１３と呼ばれるｓｈｍｉＲのＲＮＡ配列。
配列番号：５２： ｓｈｍｉＲ１４と呼ばれるｓｈｍｉＲのＲＮＡ配列。
配列番号：５３： ｓｈｍｉＲ１５と呼ばれるｓｈｍｉＲのＲＮＡ配列。
配列番号：５４： ｓｈｍｉＲ１６と呼ばれるｓｈｍｉＲのＲＮＡ配列。
配列番号：５５： ｓｈｍｉＲ１７と呼ばれるｓｈｍｉＲのＲＮＡ配列。
配列番号：５６： ｓｈｍｉＲ２と呼ばれるｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列。
配列番号：５７： ｓｈｍｉＲ３と呼ばれるｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列。
配列番号：５８： ｓｈｍｉＲ４と呼ばれるｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列。
配列番号：５９： ｓｈｍｉＲ５と呼ばれるｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列。
配列番号：６０： ｓｈｍｉＲ６と呼ばれるｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列。
配列番号：６１： ｓｈｍｉＲ７と呼ばれるｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列。
配列番号：６２： ｓｈｍｉＲ９と呼ばれるｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列。
配列番号：６３： ｓｈｍｉＲ１１と呼ばれるｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列。
配列番号：６４： ｓｈｍｉＲ１３と呼ばれるｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列。
配列番号：６５： ｓｈｍｉＲ１４と呼ばれるｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列。
配列番号：６６： ｓｈｍｉＲ１５と呼ばれるｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列。
配列番号：６７： ｓｈｍｉＲ１６と呼ばれるｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列。
配列番号：６８： ｓｈｍｉＲ１７と呼ばれるｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列。
配列番号：６９： 筋特異的ＣＫ８プロモーターの制御下でｓｈｍｉＲ３及びｓｈｍｉＲ１４を、Ｓｐｃ５１２の制御下でコドン最適化ＰＡＢＰＮ１をコードする二重構築物１型のＤＮＡ配列
配列番号：７０： 筋特異的ＣＫ８プロモーターの制御下でｓｈｍｉＲ１７及びｓｈｍｉＲ１３を、Ｓｐｃ５１２の制御下でコドン最適化ＰＡＢＰＮ１をコードする二重構築物１型のＤＮＡ配列
配列番号：７１： Ｓｐｃ５１２の制御下でｃｏＰＡＢＰＮ１ならびにｓｈｍｉＲ３及びｓｈｍｉＲ１４と呼ばれるｓｈｍｉＲをコードする二重構築物２型のＤＮＡ配列。
配列番号：７２： Ｓｐｃ５１２の制御下でｃｏＰＡＢＰＮ１ならびにｓｈｍｉＲ１７及びｓｈｍｉＲ１３と呼ばれるｓｈｍｉＲをコードする二重構築物２型のＤＮＡ配列。
配列番号：７３ ヒトコドン最適化ＰＡＢＰＮ１ ｃＤＮＡ配列のＤＮＡ配列。
配列番号：７４ コドン最適化ヒトＰＡＢＰＮ１タンパク質のアミノ酸配列。
配列番号：７５ ＦＬＡＧタグを有する野生型ヒトＰＡＢＰＮ１タンパク質のアミノ酸配列。
配列番号：７６ ＦＬＡＧタグを有するコドン最適化ヒトＰＡＢＰＮ１タンパク質のアミノ酸配列。
配列番号：７７ ｗｔＰＡＢＰＮ１－Ｆｗｄと呼ばれるプライマーのＤＮＡ配列。
配列番号：７８ ｗｔＰＡＢＰＮ１－Ｒｅｖと呼ばれるプライマーのＤＮＡ配列
配列番号：７９ ｗｔＰＡＢＰＮ１－Ｐｒｏｂｅと呼ばれるプローブのＤＮＡ配列
配列番号：８０ ｏｐｔＰＡＢＰＮ１－Ｆｗｄと呼ばれるプライマーのＤＮＡ配列
配列番号：８１ ｏｐｔＰＡＢＰＮ１－Ｒｅｖと呼ばれるプライマーのＤＮＡ配列
配列番号：８２ ｏｐｔＰＡＢＰＮ１－Ｐｒｏｂｅと呼ばれるプローブのＤＮＡ配列
配列番号：８３ ｓｈｍｉＲ３－ＦＷＤと呼ばれるプライマーのＤＮＡ配列
配列番号：８４ ｓｈｍｉＲ１３－ＦＷＤと呼ばれるプライマーのＤＮＡ配列
配列番号：８５ ｓｈｍｉＲ１４－ＦＷＤと呼ばれるプライマーのＤＮＡ配列
配列番号：８６ ｓｈｍｉＲ１７－ＦＷＤと呼ばれるプライマーのＤＮＡ配列

【発明を実施するための形態】

【0114】

一般
本明細書の全体にわたり、特に明記しない限り、または、文脈上特に必要としない限り、単一の工程、物質の特性、組成物、工程の群、または、物質の特性もしくは組成物の群への言及は、これら工程、物質の特性、組成物、工程の群、または、物質の特性もしくは組成物の群のうちの１つ及び複数（すなわち、１つまたは複数）を包含すると解釈されるべきである。

【0115】

本開示において具体的に記載されている変形形態及び変更以外の変形形態及び変更を本開示が実施可能であることを当業者は理解する。本開示が全てのこのような変形形態及び変更を含むことを理解すべきである。本開示はまた、本明細書において個別にまたは集合的に言及または示す全ての工程、特性、組成物及び化合物、ならびに、上記工程または特性の全ての組み合わせまたは任意の２つ以上を含む。

【0116】

本開示は本明細書に記載の特定の例の範囲内に限定されず、それらは例示目的に過ぎないことを意味する。機能的に同等な生成物、組成物及び方法が本開示の範囲内であることは明らかである。

【0117】

本明細書における本開示のいずれの例も、特に明記しない限り、本開示の任意のその他の例に準用されると解釈されるべきである。

【0118】

特に定義しない限り、本明細書で使用する全ての技術用語及び科学用語は、当業者（例えば、細胞培養、分子遺伝学、免疫学、免疫組織化学、タンパク質化学及び生化学の）に一般に理解される意味と同一の意味を有すると解釈されるべきである。

【0119】

特に明記しない限り、本開示に利用する組換えＤＮＡ技術、組換えタンパク質技術、細胞培養技術及び免疫学的技術は、当業者に周知の標準的な方法である。このような技術については、Ｊ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９８４），Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９），Ｔ．Ａ．Ｂｒｏｗｎ（ｅｄｉｔｏｒ），Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ １ ａｎｄ ２，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９１），Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ ａｎｄ Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ（ｅｄｉｔｏｒｓ），ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ １－４，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９５ ａｎｄ １９９６），ａｎｄ Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｉｔｏｒｓ），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８，現在までの全ての改定版を含む），Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ（ｅｄｉｔｏｒｓ）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（１９８８）、及びＪ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｉｔｏｒｓ）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（現在までの全ての改定版を含む）などの出典における文献全体にわたり記載及び説明されている。

【0120】

本明細書の全体にわたり、文脈上特に必要としない限り、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、または、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形形態は、明示した工程、要素もしくは整数、または、工程、要素もしくは整数の群を包含するが、任意のその他の工程、要素もしくは整数、または、要素もしくは整数の群を除外しないことを意味するものと理解されるべきである。

【0121】

用語「及び／または」、例えば、「Ｘ及び／またはＹ」は、「Ｘ及びＹ」または「ＸまたはＹ」のいずれかのことを意味するものと理解されるべきであり、両方の意味またはいずれかの意味の明瞭な裏付けを提供するものと解釈されるべきである。

【0122】

選択した定義
「ＲＮＡ」とは、少なくとも１つのリボヌクレオチド残基を含む分子のことを意味する。「リボヌクレオチド」とは、β－Ｄ－リボフラノース部分の２´位にヒドロキシル基を有するヌクレオチドのことを意味する。この用語は、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、単離されたＲＮＡ、例えば、部分的に精製されたＲＮＡ、実質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、組換え生成されたＲＮＡなどに加えて、天然ＲＮＡとは１つまたは複数のヌクレオチドの付加、欠失、置換及び／または変異が異なる変異ＲＮＡを含む。このような変異としては、ｓｉＲＮＡの末端（複数可）または内部、例えば、ＲＮＡの１つまたは複数のヌクレオチドなどへの非ヌクレオチド物質の付加を挙げることができる。本開示のＲＮＡ分子内のヌクレオチドはまた、非標準的なヌクレオチド、例えば、非天然ヌクレオチド、化学合成ヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドなどを含んでいてもよい。これらの変異ＲＮＡをアナログまたは天然ＲＮＡのアナログと呼ぶ場合もある。

【0123】

用語「ＲＮＡ干渉」すなわち「ＲＮＡｉ」とは一般的に、細胞の細胞質内における二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子により開始される、遺伝子発現のＲＮＡ依存性サイレンシングのことを意味する。ｄｓＲＮＡ分子は、標的核酸配列の転写産物を抑制または阻害することにより、遺伝子をサイレンシングするかまたはその遺伝子の発現を抑制する。

【0124】

本明細書で使用する場合、用語「二本鎖ＲＮＡ」すなわち「ｄｓＲＮＡ」とは、二本鎖構造を有し、互いに長さが類似したエフェクター配列とエフェクター相補配列を含むＲＮＡ分子のことを意味する。エフェクター配列とエフェクター相補配列は、単一のＲＮＡ鎖内にあるかまたは別々のＲＮＡ鎖内にあってもよい。「エフェクター配列」（「ガイド鎖」と呼ぶ場合が多い）は標的配列に対して実質的に相補的であり、本明細書のケースにおいては、ＰＡＢＰＮ１ ｍＲＮＡ転写物の領域である。「エフェクター配列」はまた、「アンチセンス配列」と呼ばれることもある。「エフェクター相補配列」は、エフェクター配列にアニールして二本鎖を形成可能なように、エフェクター配列に対して十分に相補的である。これに関連すると、エフェクター相補配列は標的配列の領域に対して実質的に相同である。当業者には明らかであるが、用語「エフェクター相補配列」はまた、「エフェクター配列の相補体」またはセンス配列と呼ばれることもある。

【0125】

本明細書で使用する場合、用語「二本鎖」とは、ワトソンクリック型塩基対またはヌクレオチド配列間の相補的または実質的に相補的な安定二本鎖を可能とする任意のその他の様式のいずれかで互いに塩基対を形成する、２本の相補的もしくは実質的に相補的な核酸（例えば、ＲＮＡ）内の領域、または、一本鎖核酸（例えば、ＲＮＡ）の２つの相補的もしくは実質的に相補的な領域のことを意味する。二本鎖領域内において１００％の相補性は必要とされず、実質的な相補性が許容されるということを当業者は理解する。実質的な相補性としては７９％以上の相補性を挙げてもよい。例えば、１９塩基対からなる二本鎖領域内における単一のミスマッチ（すなわち、１８塩基対及び１つのミスマッチ）は９４．７％の相補性となり、その二本鎖領域を実質的に相補的とする。別の例では、１９塩基対からなる二本鎖領域内における２つのミスマッチ（すなわち、１７塩基対及び２つのミスマッチ）は８９．５％の相補性となり、その二本鎖領域を実質的に相補的とする。更に別の例では、１９塩基対からなる二本鎖領域内における３つのミスマッチ（すなわち、１６塩基対及び３つのミスマッチ）は８４．２％の相補性となり、その二本鎖領域を実質的に相補的とする、などである。

【0126】

ステムループと呼ばれる少なくとも２ヌクレオチド配列で連結したエフェクター配列とエフェクター相補配列からなる二本鎖領域を有するようなヘアピン構造またはステムループ構造としてｄｓＲＮＡを提供してもよい。ヘアピン構造またはステムループ構造としてｄｓＲＮＡを提供する場合、そのｄｓＲＮＡを「ヘアピンＲＮＡ」、「低分子ヘアピンＲＮＡｉ薬剤」または「ｓｈＲＮＡ」と呼ぶ場合もある。ヘアピン構造またはステムループ構造で提供されるまたはそれらの構造を生じるその他のｄｓＲＮＡ分子としては、プライマリーｍｉＲＮＡ転写物（ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ）及びマイクロＲＮＡ前駆体（ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ）が挙げられる。ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ ｓｈＲＮＡは、ステムループ構造を形成するプライマリーｍｉＲＮＡ転写物の領域を認識して切断する酵素ＤｒｏｓｈａとＰａｓｈａの作用により、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡから自然に生成され得る。代替的に、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ転写物を遺伝子操作して天然ステムループ構造を人工／組換えステムループ構造に置換することができる。つまり、天然ステムループ構造を欠くｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ骨格配列に人工／組換えステムループ構造を挿入またはクローニングすることができる。ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡの一部として発現するように遺伝子操作されたステムループ配列の場合、Ｄｒｏｓｈａ及びＰａｓｈａは人工ｓｈＲＮＡを認識して切断する。この手法を用いて生成されたｄｓＲＮＡ分子は、「ｓｈｍｉＲＮＡ」、「ｓｈｍｉＲ」または「マイクロＲＮＡフレームワークｓｈＲＮＡ」として周知である。

【0127】

本明細書で使用する場合、配列に関する用語「相補的」とは、ワトソンクリック型塩基対による配列の相補性のことを意味し、それにより、グアニン（Ｇ）はシトシン（Ｃ）と対をなし、アデニン（Ａ）はウラシル（Ｕ）またはチミン（Ｔ）の一方と対をなす。ある配列が別の配列の全長に対して相補的であってもよく、または、別の配列の特定の部分または長さに対して相補的であってもよい。ＵがＲＮＡ内に存在していてもよくＴがＤＮＡ内に存在していてもよいということを当業者は理解する。それゆえ、ＲＮＡ配列またはＤＮＡ配列のいずれか内のＡは、ＲＮＡ配列内のＵまたはＤＮＡ配列内のＴと対をなすことができる。

【0128】

本明細書で使用する場合、用語「実質的に相補的」は、核酸配列間、例えば、エフェクター配列とエフェクター相補配列の間またはエフェクター配列と標的配列の間に安定かつ特異的な結合が生じるような、十分な程度の相補性または正確なペアリングがあることを示すために使用される。核酸の配列がその標的または相補体に対して１００％相補的である必要がないということを理解されたい。この用語は、オーバーハングを除く別の配列に対して相補的な配列を包含する。一部の例では、配列は、１～２つのミスマッチを除きその他の配列に対して相補的である。一部の例では、配列は、１つのミスマッチを除き相補的である。一部の例では、配列は、２つのミスマッチを除き相補的である。その他の例では、配列は、３つのミスマッチを除き相補的である。更にその他の例では、配列は、４つのミスマッチを除き相補的である。

【0129】

本開示のｓｈＲＮＡまたはｓｈｍｉＲの文脈で使用される用語「コードされる」は、ＤＮＡテンプレートから転写可能なｓｈＲＮＡまたはｓｈｍｉＲのことを意味するものと理解すべきである。それゆえ、本開示のｓｈＲＮＡまたはｓｈｍｉＲをコード（ｅｎｃｏｄｅｓ または ｃｏｄｅｓ ｆｏｒ）する核酸は、対応するｓｈＲＮＡまたはｓｈｍｉＲを転写するためのテンプレートとして機能するＤＮＡ配列を含む。

【0130】

用語「ＤＮＡ特異的ＲＮＡｉ構築物」すなわち「ｄｄＲＮＡｉ構築物」とは、ＲＮＡｉを誘導するｓｈＲＮＡ分子またはｓｈｍｉＲ分子（ｓｈｍｉＲが好ましい）を転写時に生成する、ＤＮＡ配列を含む核酸のことを意味する。ｄｄＲＮＡｉ構築物は、少なくとも２ヌクレオチドのステムループで連結した二本鎖領域を有するヘアピン構造、すなわち、ｓｈＲＮＡまたはｓｈｍｉＲへと自己アニール可能な単一のＲＮＡとして、複数のｓｈＲＮＡまたはｓｈｍｉＲを有する単一のＲＮＡとして、または、それぞれが単一のｓｈＲＮＡまたはｓｈｍｉＲのそれぞれにフォールディング可能な複数のＲＮＡ転写物として、転写される核酸を含んでいてもよい。１種または複数種の別のＤＮＡ配列を含むより大きな「ＤＮＡ構築物」内におけるｄｄＲＮＡｉ構築物を提供してもよい。例えば、ＤＮＡ配列のｍＲＮＡ転写物がｄｄＲＮＡｉ構築物のｓｈｍｉＲによって標的とされないようにコドン最適化された、機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードする更なるＤＮＡ配列、を含むＤＮＡ構築物内におけるｄｄＲＮＡｉ構築物を提供してもよい。ｄｄＲＮＡｉ構築物、及び／または、そのｄｄＲＮＡｉ構築物を含むＤＮＡ構築物は、発現ベクター内にあってもよく、例えば、プロモーターに機能的に連結する。

【0131】

本明細書で使用する場合、用語「機能的に連結する」または「機能的な連結」（またはその類似用語）とは、コード核酸配列が、調節配列、例えば、プロモーターにコード配列の発現を促進するような様式で連結するまたはと共同することを意味する。調節配列としては、技術分野において認知されているプロモーター、エンハンサー及びその他の発現制御エレメントが挙げられ、コード配列の発現を誘導するために選択される。

【0132】

「ベクター」は、核酸を細胞内に導入するための媒介物を意味するものと理解される。ベクターとしては、プラスミド、ファージミド、ウイルス、細菌、及び、ウイルス源または細菌源に由来する媒介物が挙げられるがこれらに限定されない。「プラスミド」は環状の二本鎖ＤＮＡ分子である。本開示に使用するための有用なタイプのベクターはウイルスベクターであり、修飾を行い１つまたは複数のウイルス遺伝子またはその一部を欠損可能なウイルスゲノム内に非相同ＤＮＡ配列が挿入されている。特定のベクター（例えば、宿主細胞内において機能する複製起点を有するベクター）は宿主細胞内において自律複製可能である。その他のベクターを宿主細胞のゲノム内に安定的に組み込むことにより、宿主ゲノムと共に複製することができる。本明細書で使用する場合、用語「発現ベクター」は、本開示のＲＮＡ分子を発現可能なベクターを意味するものと理解される。

【0133】

「機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質」は、野生型ＰＡＢＰＮ１タンパク質の機能特性、例えば、哺乳動物細胞内におけるｍＲＮＡポリアデニル化及び／またはイントロンスプライシングの部位を制御する機能を有するＰＡＢＰＮ１タンパク質を意味するものと理解すべきである。それゆえ、「機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質」は、対象内で発現するまたは存在する場合にＯＰＭＤの原因とはならないＰＡＢＰＮ１タンパク質であると理解される。１つの例では、本明細書における「機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質」への言及は、ヒト野生型ＰＡＢＰＮ１タンパク質への言及である。ヒト野生型ＰＡＢＰＮ１タンパク質の配列はＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿００４６３４に記載されている。それゆえ、機能性ヒトＰＡＢＰＮ１タンパク質は、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿００４６３４に記載のヒトＰＡＢＰＮ１タンパク質のインビボ機能特性を有し得る。

【0134】

本明細書で使用する場合、用語「治療すること」、「治療する」または「治療」及びその変形形態とは、治療する個体または細胞の自然経過を臨床病理学の経過中に変化させることを目的とした臨床介入のことを意味する。治療の望ましい効果としては、疾患進行の速度を低下させること、病態を緩和または軽減すること、及び、寛解または優れた予後が挙げられる。当然ながら、ＯＰＭＤの治療は、ＯＰＭＤの原因となるＰＡＢＰＮ１タンパク質の対象内における発現を抑制または阻害すること、及び／または、正常な長さのポリアラニン残基を有するＰＡＢＰＮ１タンパク質を対象内において発現させることを含む。ＯＰＭＤの治療は、ＯＰＭＤの原因となるＰＡＢＰＮ１タンパク質の対象内における発現を抑制または阻害すること、及び、正常な長さのポリアラニン残基を有するＰＡＢＰＮ１タンパク質を対象内において発現させることを含むことが好ましい。例えば、上記治療結果のうちの１つまたは複数が達成される場合、個体は成功裏に「治療される」。

【0135】

「治療有効量」は、ＯＰＭＤ症状における測定可能な改善、例えば、対象における眼瞼下垂、嚥下困難及び筋力低下が挙げられるがこれらに限定されないＯＰＭＤの１種または複数種の症状における測定可能な改善などを達成するのに必要な少なくとも最低限の濃度または量のことである。本明細書における治療有効量は、患者の病態、年齢、性別及び体重、ならびに、個体における所望の反応を誘導するｓｈｍｉＲ、そのｓｈｍｉＲをコードする核酸、ｄｄＲＮＡｉ構築物、ＤＮＡ構築物、発現ベクター、またはその発現ベクターを含む組成物の機能、及び／または、対象において機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質を発現する発現ベクターの機能などの因子に応じて様々であり得る。治療有効量はまた、単独でまたは機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質の対象における発現の治療上の有益な作用と組み合わせて検討する場合、ｓｈｍｉＲ、そのｓｈｍｉＲをコードする核酸、ｄｄＲＮＡｉ構築物、ＤＮＡ構築物、発現ベクター、またはその発現ベクターを含む組成物の任意の毒性または有害作用よりも、ＯＰＭＤの原因となるＰＡＢＰＮ１タンパク質の発現を阻害、抑制または低下させるためのｓｈｍｉＲ、そのｓｈｍｉＲをコードする核酸、ｄｄＲＮＡｉ構築物、ＤＮＡ構築物、発現ベクター、またはその発現ベクターを含む組成物の治療上の有益な作用がまさる治療有効量のことである。

【0136】

本明細書で使用する場合、「対象」または「患者」は、ＯＰＭＤを患うまたは遺伝的にＯＰＭＤに罹患しやすい、すなわち、ＯＰＭＤの原因となるＰＡＢＰＮ１遺伝子変異を有する、ヒトまたは非ヒト動物であり得る。「非ヒト動物」は、霊長類、家畜（例えば、ヒツジ、ウマ、ウシ、ブタ、ロバ）、伴侶動物（例えば、イヌ及びネコなどのペット）、臨床試験用動物（例えば、マウス、ウサギ、ラット、モルモット、ショウジョウバエ、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ、ゼブラフィッシュ）、パフォーマンス動物（例えば、競走馬、ラクダ、グレーハウンド）、または、捕獲野生動物であってもよい。１つの例では、対象または患者は哺乳動物である。１つの例では、対象または患者はヒトである。

【0137】

用語「発現抑制」、「発現の抑制」またはその類似用語とは、標的遺伝子、例えば、ＰＡＢＰＮ１遺伝子由来のタンパク質及び／またはｍＲＮＡ産物のレベルにおける欠如または観察可能な低下のことを意味する。低下は完全である必要はないが、本開示のｓｈｍｉＲ、そのｓｈｍｉＲをコードする核酸、ｄｄＲＮＡｉ構築物、ＤＮＡ構築物、発現ベクター、またはその発現ベクターを含む組成物によってＲＮＡｉが影響を受けた結果として、検出可能または観察可能な変化をもたらすのに十分な部分的な低下であり得る。ｓｈｍｉＲ、そのｓｈｍｉＲをコードする核酸、ｄｄＲＮＡｉ構築物、ＤＮＡ構築物、発現ベクター、またはその発現ベクターを含む組成物を欠く細胞を基準として、標的核酸由来のｍＲＮＡ及び／またはタンパク質産物のレベルにおける低下を測定することにより、低下を測定することができ、その低下は、わずか１％、５％または１０％ほどの阻害であってもよく、または、完全、すなわち、１００％の阻害であってもよい。細胞または生体における外部の特性、すなわち、定量的及び／または定性的な表現型を検査することによって低下の効果を測定してもよく、本開示のｓｈｍｉＲ、そのｓｈｍｉＲをコードする核酸、ｄｄＲＮＡｉ構築物、ＤＮＡ構築物、発現ベクター、またはその発現ベクターを含む組成物を投与した後の細胞または生体内における、ｅｘｐＰＡＢＰＮ１の核凝集の量の存在または変化を検出することも含んでいてもよい。

【0138】

ＲＮＡｉ用試薬
１つの例では、本開示は、低分子ヘアピンマイクロＲＮＡ（ｓｈｍｉＲ）をコードするＤＮＡ配列を含む核酸を提供し、上記ｓｈｍｉＲは、
少なくとも１７ヌクレオチド長のエフェクター配列、
エフェクター相補配列、
ステムループ配列、及び、
プライマリーマイクロＲＮＡ（ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ）骨格、
を含み、
エフェクター配列は、配列番号：１～１３のいずれか１つに記載のＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的である。エフェクター配列は３０ヌクレオチド長未満であることが好ましい。例えば、好適なエフェクター配列は１７～２９ヌクレオチド長の範囲であってもよい。特に好ましい例では、エフェクター配列は２１ヌクレオチド長である。エフェクター配列が２１ヌクレオチド長であり、エフェクター相補配列が２０ヌクレオチド長であることがより好ましい。

【0139】

１つの例では、ｓｈｍｉＲは、配列番号：１に記載の配列を含むかまたはそれからなるＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的なエフェクター配列を含む。例えば、エフェクター配列は、配列番号：１に記載の配列を含むかまたはそれからなりそれと比較して４つのミスマッチ塩基を含有するＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的であってもよい。例えば、エフェクター配列は、配列番号：１に記載の配列を含むかまたはそれからなりそれと比較して３つのミスマッチ塩基を含有するＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的であってもよい。例えば、エフェクター配列は、配列番号：１に記載の配列を含むかまたはそれからなりそれと比較して２つのミスマッチ塩基を含有するＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的であってもよい。例えば、エフェクター配列は、配列番号：１に記載の配列を含むかまたはそれからなりそれと比較して１つのミスマッチ塩基を含有するＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的であってもよい。例えば、エフェクター配列は、配列番号：１に記載の配列を含むかまたはそれからなるＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して１００％相補的であってもよい。

【0140】

１つの例では、ｓｈｍｉＲは、配列番号：２に記載の配列を含むかまたはそれからなるＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的なエフェクター配列を含む。例えば、エフェクター配列は、配列番号：２に記載の配列を含むかまたはそれからなりそれと比較して４つのミスマッチ塩基を含有するＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的であってもよい。例えば、エフェクター配列は、配列番号：２に記載の配列を含むかまたはそれからなりそれと比較して３つのミスマッチ塩基を含有するＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的であってもよい。例えば、エフェクター配列は、配列番号：２に記載の配列を含むかまたはそれからなりそれと比較して２つのミスマッチ塩基を含有するＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的であってもよい。例えば、エフェクター配列は、配列番号：２に記載の配列を含むかまたはそれからなりそれと比較して１つのミスマッチ塩基を含有するＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的であってもよい。例えば、エフェクター配列は、配列番号：２に記載の配列を含むかまたはそれからなるＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して１００％相補的であってもよい。

【0141】

１つの例では、ｓｈｍｉＲは、配列番号：３に記載の配列を含むかまたはそれからなるＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的なエフェクター配列を含む。例えば、エフェクター配列は、配列番号：３に記載の配列を含むかまたはそれからなりそれと比較して４つのミスマッチ塩基を含有するＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的であってもよい。例えば、エフェクター配列は、配列番号：３に記載の配列を含むかまたはそれからなりそれと比較して３つのミスマッチ塩基を含有するＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的であってもよい。例えば、エフェクター配列は、配列番号：３に記載の配列を含むかまたはそれからなりそれと比較して２つのミスマッチ塩基を含有するＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的であってもよい。例えば、エフェクター配列は、配列番号：３に記載の配列を含むかまたはそれからなりそれと比較して１つのミスマッチ塩基を含有するＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的であってもよい。例えば、エフェクター配列は、配列番号：３に記載の配列を含むかまたはそれからなるＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して１００％相補的であってもよい。

【0142】

１つの例では、ｓｈｍｉＲは、配列番号：４に記載の配列を含むかまたはそれからなるＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的なエフェクター配列を含む。例えば、エフェクター配列は、配列番号：４に記載の配列を含むかまたはそれからなりそれと比較して４つのミスマッチ塩基を含有するＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的であってもよい。例えば、エフェクター配列は、配列番号：４に記載の配列を含むかまたはそれからなりそれと比較して３つのミスマッチ塩基を含有するＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的であってもよい。例えば、エフェクター配列は、配列番号：４に記載の配列を含むかまたはそれからなりそれと比較して２つのミスマッチ塩基を含有するＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的であってもよい。例えば、エフェクター配列は、配列番号：４に記載の配列を含むかまたはそれからなりそれと比較して１つのミスマッチ塩基を含有するＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的であってもよい。例えば、エフェクター配列は、配列番号：４に記載の配列を含むかまたはそれからなるＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して１００％相補的であってもよい。

【0143】

１つの例では、ｓｈｍｉＲは、配列番号：５に記載の配列を含むかまたはそれからなるＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的なエフェクター配列を含む。例えば、エフェクター配列は、配列番号：５に記載の配列を含むかまたはそれからなりそれと比較して４つのミスマッチ塩基を含有するＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的であってもよい。例えば、エフェクター配列は、配列番号：５に記載の配列を含むかまたはそれからなりそれと比較して３つのミスマッチ塩基を含有するＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的であってもよい。例えば、エフェクター配列は、配列番号：５に記載の配列を含むかまたはそれからなりそれと比較して２つのミスマッチ塩基を含有するＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的であってもよい。例えば、エフェクター配列は、配列番号：５に記載の配列を含むかまたはそれからなりそれと比較して１つのミスマッチ塩基を含有するＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的であってもよい。例えば、エフェクター配列は、配列番号：５に記載の配列を含むかまたはそれからなるＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して１００％相補的であってもよい。

【0144】

１つの例では、ｓｈｍｉＲは、配列番号：６に記載の配列を含むかまたはそれからなるＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的なエフェクター配列を含む。例えば、エフェクター配列は、配列番号：６に記載の配列を含むかまたはそれからなりそれと比較して４つのミスマッチ塩基を含有するＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的であってもよい。例えば、エフェクター配列は、配列番号：６に記載の配列を含むかまたはそれからなりそれと比較して３つのミスマッチ塩基を含有するＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的であってもよい。例えば、エフェクター配列は、配列番号：６に記載の配列を含むかまたはそれからなりそれと比較して２つのミスマッチ塩基を含有するＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的であってもよい。例えば、エフェクター配列は、配列番号：６に記載の配列を含むかまたはそれからなりそれと比較して１つのミスマッチ塩基を含有するＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的であってもよい。例えば、エフェクター配列は、配列番号：６に記載の配列を含むかまたはそれからなるＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して１００％相補的であってもよい。

【0145】

１つの例では、ｓｈｍｉＲは、配列番号：７に記載の配列を含むかまたはそれからなるＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的なエフェクター配列を含む。例えば、エフェクター配列は、配列番号：７に記載の配列を含むかまたはそれからなりそれと比較して４つのミスマッチ塩基を含有するＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的であってもよい。例えば、エフェクター配列は、配列番号：７に記載の配列を含むかまたはそれからなりそれと比較して３つのミスマッチ塩基を含有するＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的であってもよい。例えば、エフェクター配列は、配列番号：７に記載の配列を含むかまたはそれからなりそれと比較して２つのミスマッチ塩基を含有するＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的であってもよい。例えば、エフェクター配列は、配列番号：７に記載の配列を含むかまたはそれからなりそれと比較して１つのミスマッチ塩基を含有するＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的であってもよい。例えば、エフェクター配列は、配列番号：７に記載の配列を含むかまたはそれからなるＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して１００％相補的であってもよい。

【0146】

１つの例では、ｓｈｍｉＲは、配列番号：８に記載の配列を含むかまたはそれからなるＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的なエフェクター配列を含む。例えば、エフェクター配列は、配列番号：８に記載の配列を含むかまたはそれからなりそれと比較して４つのミスマッチ塩基を含有するＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的であってもよい。例えば、エフェクター配列は、配列番号：８に記載の配列を含むかまたはそれからなりそれと比較して３つのミスマッチ塩基を含有するＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的であってもよい。例えば、エフェクター配列は、配列番号：８に記載の配列を含むかまたはそれからなりそれと比較して２つのミスマッチ塩基を含有するＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的であってもよい。例えば、エフェクター配列は、配列番号：８に記載の配列を含むかまたはそれからなりそれと比較して１つのミスマッチ塩基を含有するＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的であってもよい。例えば、エフェクター配列は、配列番号：８に記載の配列を含むかまたはそれからなるＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して１００％相補的であってもよい。

【0147】

１つの例では、ｓｈｍｉＲは、配列番号：９に記載の配列を含むかまたはそれからなるＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的なエフェクター配列を含む。例えば、エフェクター配列は、配列番号：９に記載の配列を含むかまたはそれからなりそれと比較して４つのミスマッチ塩基を含有するＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的であってもよい。例えば、エフェクター配列は、配列番号：９に記載の配列を含むかまたはそれからなりそれと比較して３つのミスマッチ塩基を含有するＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的であってもよい。例えば、エフェクター配列は、配列番号：９に記載の配列を含むかまたはそれからなりそれと比較して２つのミスマッチ塩基を含有するＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的であってもよい。例えば、エフェクター配列は、配列番号：９に記載の配列を含むかまたはそれからなりそれと比較して１つのミスマッチ塩基を含有するＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的であってもよい。例えば、エフェクター配列は、配列番号：９に記載の配列を含むかまたはそれからなるＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して１００％相補的であってもよい。

【0148】

１つの例では、ｓｈｍｉＲは、配列番号：１０に記載の配列を含むかまたはそれからなるＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的なエフェクター配列を含む。例えば、エフェクター配列は、配列番号：１０に記載の配列を含むかまたはそれからなりそれと比較して４つのミスマッチ塩基を含有するＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的であってもよい。例えば、エフェクター配列は、配列番号：１０に記載の配列を含むかまたはそれからなりそれと比較して３つのミスマッチ塩基を含有するＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的であってもよい。例えば、エフェクター配列は、配列番号：１０に記載の配列を含むかまたはそれからなりそれと比較して２つのミスマッチ塩基を含有するＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的であってもよい。例えば、エフェクター配列は、配列番号：１０に記載の配列を含むかまたはそれからなりそれと比較して１つのミスマッチ塩基を含有するＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的であってもよい。例えば、エフェクター配列は、配列番号：１０に記載の配列を含むかまたはそれからなるＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して１００％相補的であってもよい。

【0149】

１つの例では、ｓｈｍｉＲは、配列番号：１１に記載の配列を含むかまたはそれからなるＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的なエフェクター配列を含む。例えば、エフェクター配列は、配列番号：１１に記載の配列を含むかまたはそれからなりそれと比較して４つのミスマッチ塩基を含有するＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的であってもよい。例えば、エフェクター配列は、配列番号：１１に記載の配列を含むかまたはそれからなりそれと比較して３つのミスマッチ塩基を含有するＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的であってもよい。例えば、エフェクター配列は、配列番号：１１に記載の配列を含むかまたはそれからなりそれと比較して２つのミスマッチ塩基を含有するＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的であってもよい。例えば、エフェクター配列は、配列番号：１１に記載の配列を含むかまたはそれからなりそれと比較して１つのミスマッチ塩基を含有するＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的であってもよい。例えば、エフェクター配列は、配列番号：１１に記載の配列を含むかまたはそれからなるＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して１００％相補的であってもよい。

【0150】

１つの例では、ｓｈｍｉＲは、配列番号：１２に記載の配列を含むかまたはそれからなるＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的なエフェクター配列を含む。例えば、エフェクター配列は、配列番号：１２に記載の配列を含むかまたはそれからなりそれと比較して４つのミスマッチ塩基を含有するＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的であってもよい。例えば、エフェクター配列は、配列番号：１２に記載の配列を含むかまたはそれからなりそれと比較して３つのミスマッチ塩基を含有するＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的であってもよい。例えば、エフェクター配列は、配列番号：１２に記載の配列を含むかまたはそれからなりそれと比較して２つのミスマッチ塩基を含有するＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的であってもよい。例えば、エフェクター配列は、配列番号：１２に記載の配列を含むかまたはそれからなりそれと比較して１つのミスマッチ塩基を含有するＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的であってもよい。例えば、エフェクター配列は、配列番号：１２に記載の配列を含むかまたはそれからなるＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して１００％相補的であってもよい。

【0151】

１つの例では、ｓｈｍｉＲは、配列番号：１３に記載の配列を含むかまたはそれからなるＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的なエフェクター配列を含む。例えば、エフェクター配列は、配列番号：１３に記載の配列を含むかまたはそれからなりそれと比較して４つのミスマッチ塩基を含有するＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的であってもよい。例えば、エフェクター配列は、配列番号：１３に記載の配列を含むかまたはそれからなりそれと比較して３つのミスマッチ塩基を含有するＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的であってもよい。例えば、エフェクター配列は、配列番号：１３に記載の配列を含むかまたはそれからなりそれと比較して２つのミスマッチ塩基を含有するＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的であってもよい。例えば、エフェクター配列は、配列番号：１３に記載の配列を含むかまたはそれからなりそれと比較して１つのミスマッチ塩基を含有するＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的であってもよい。例えば、エフェクター配列は、配列番号：１３に記載の配列を含むかまたはそれからなるＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して１００％相補的であってもよい。

【0152】

本開示のｓｈｍｉＲのエフェクター配列が本明細書に記載のＰＡＢＰＮ１ ｍｉＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的であり、そのＰＡＢＰＮ１ ｍｉＲＮＡ転写物と比較して１、２、３または４つのミスマッチ塩基（複数可）を含有する例によれば、それらミスマッチ（複数可）が、ｓｈｍｉＲのシード領域、すなわち、エフェクター配列のヌクレオチド２～８に相当する領域内に位置していないことが好ましい。

【0153】

１つの例では、本明細書に記載の核酸は、（ｉ）エフェクター配列が配列番号：１４に記載の配列と二本鎖を形成可能である場合、１、２、３または４塩基のミスマッチを有すること以外は配列番号：１４に記載の配列に対して実質的に相補的なエフェクター配列、及び、（ｉｉ）エフェクター配列に対して実質的に相補的な配列を含むエフェクター相補配列、を含むｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列を含んでいてもよい。例えば、核酸がコードするｓｈｍｉＲは、配列番号：１５に記載のエフェクター配列、及び、配列番号：１５に記載の配列に対して実質的に相補的でありその配列と二本鎖を形成可能なエフェクター相補配列を含んでいてもよい。配列番号：１５に記載の配列に対して実質的に相補的なエフェクター相補配列は、配列番号：１４に記載の配列であってもよい。この例によるｓｈｍｉＲを以下「ｓｈｍｉＲ２」と呼ぶ。

【0154】

１つの例では、本明細書に記載の核酸は、（ｉ）エフェクター配列が配列番号：１６に記載の配列と二本鎖を形成可能である場合、１、２、３または４塩基のミスマッチを有すること以外は配列番号：１６に記載の配列に対して実質的に相補的なエフェクター配列、及び、（ｉｉ）エフェクター配列に対して実質的に相補的な配列を含むエフェクター相補配列、を含むｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列を含んでいてもよい。例えば、核酸がコードするｓｈｍｉＲは、配列番号：１７に記載のエフェクター配列、及び、配列番号：１７に記載の配列に対して実質的に相補的でありその配列と二本鎖を形成可能なエフェクター相補配列を含んでいてもよい。配列番号：１７に記載の配列に対して実質的に相補的なエフェクター相補配列は、配列番号：１６に記載の配列であってもよい。この例によるｓｈｍｉＲを以下「ｓｈｍｉＲ３」と呼ぶ。

【0155】

１つの例では、本明細書に記載の核酸は、（ｉ）エフェクター配列が配列番号：１８に記載の配列と二本鎖を形成可能である場合、１、２、３または４塩基のミスマッチを有すること以外は配列番号：１８に記載の配列に対して実質的に相補的なエフェクター配列、及び、（ｉｉ）エフェクター配列に対して実質的に相補的な配列を含むエフェクター相補配列、を含むｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列を含んでいてもよい。例えば、核酸がコードするｓｈｍｉＲは、配列番号：１９に記載のエフェクター配列、及び、配列番号：１９に記載の配列に対して実質的に相補的でありその配列と二本鎖を形成可能なエフェクター相補配列を含んでいてもよい。配列番号：１９に記載の配列に対して実質的に相補的なエフェクター相補配列は、配列番号：１８に記載の配列であってもよい。この例によるｓｈｍｉＲを以下「ｓｈｍｉＲ４」と呼ぶ。

【0156】

１つの例では、本明細書に記載の核酸は、（ｉ）エフェクター配列が配列番号：２０に記載の配列と二本鎖を形成可能である場合、１、２、３または４塩基のミスマッチを有すること以外は配列番号：２０に記載の配列に対して実質的に相補的なエフェクター配列、及び、（ｉｉ）エフェクター配列に対して実質的に相補的な配列を含むエフェクター相補配列、を含むｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列を含んでいてもよい。例えば、核酸がコードするｓｈｍｉＲは、配列番号：２１に記載のエフェクター配列、及び、配列番号：２１に記載の配列に対して実質的に相補的でありその配列と二本鎖を形成可能なエフェクター相補配列を含んでいてもよい。配列番号：２１に記載の配列に対して実質的に相補的なエフェクター相補配列は、配列番号：２０に記載の配列であってもよい。この例によるｓｈｍｉＲを以下「ｓｈｍｉＲ５」と呼ぶ。

【0157】

１つの例では、本明細書に記載の核酸は、（ｉ）エフェクター配列が配列番号：２２に記載の配列と二本鎖を形成可能である場合、１、２、３または４塩基のミスマッチを有すること以外は配列番号：２２に記載の配列に対して実質的に相補的なエフェクター配列、及び、（ｉｉ）エフェクター配列に対して実質的に相補的な配列を含むエフェクター相補配列、を含むｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列を含んでいてもよい。例えば、核酸がコードするｓｈｍｉＲは、配列番号：２３に記載のエフェクター配列、及び、配列番号：２３に記載の配列に対して実質的に相補的でありその配列と二本鎖を形成可能なエフェクター相補配列を含んでいてもよい。配列番号：２３に記載の配列に対して実質的に相補的なエフェクター相補配列は、配列番号：２２に記載の配列であってもよい。この例によるｓｈｍｉＲを以下「ｓｈｍｉＲ６」と呼ぶ。

【0158】

１つの例では、本明細書に記載の核酸は、（ｉ）エフェクター配列が配列番号：２４に記載の配列と二本鎖を形成可能である場合、１、２、３または４塩基のミスマッチを有すること以外は配列番号：２４に記載の配列に対して実質的に相補的なエフェクター配列、及び、（ｉｉ）エフェクター配列に対して実質的に相補的な配列を含むエフェクター相補配列、を含むｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列を含んでいてもよい。例えば、核酸がコードするｓｈｍｉＲは、配列番号：２５に記載のエフェクター配列、及び、配列番号：２５に記載の配列に対して実質的に相補的でありその配列と二本鎖を形成可能なエフェクター相補配列を含んでいてもよい。配列番号：２５に記載の配列に対して実質的に相補的なエフェクター相補配列は、配列番号：２４に記載の配列であってもよい。この例によるｓｈｍｉＲを以下「ｓｈｍｉＲ７」と呼ぶ。

【0159】

１つの例では、本明細書に記載の核酸は、（ｉ）エフェクター配列が配列番号：２６に記載の配列と二本鎖を形成可能である場合、１、２、３または４塩基のミスマッチを有すること以外は配列番号：２６に記載の配列に対して実質的に相補的なエフェクター配列、及び、（ｉｉ）エフェクター配列に対して実質的に相補的な配列を含むエフェクター相補配列、を含むｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列を含んでいてもよい。例えば、核酸がコードするｓｈｍｉＲは、配列番号：２７に記載のエフェクター配列、及び、配列番号：２７に記載の配列に対して実質的に相補的でありその配列と二本鎖を形成可能なエフェクター相補配列を含んでいてもよい。配列番号：２７に記載の配列に対して実質的に相補的なエフェクター相補配列は、配列番号：２６に記載の配列であってもよい。この例によるｓｈｍｉＲを以下「ｓｈｍｉＲ９」と呼ぶ。

【0160】

１つの例では、本明細書に記載の核酸は、（ｉ）エフェクター配列が配列番号：２８に記載の配列と二本鎖を形成可能である場合、１、２、３または４塩基のミスマッチを有すること以外は配列番号：２８に記載の配列に対して実質的に相補的なエフェクター配列、及び、（ｉｉ）エフェクター配列に対して実質的に相補的な配列を含むエフェクター相補配列、を含むｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列を含んでいてもよい。例えば、核酸がコードするｓｈｍｉＲは、配列番号：２９に記載のエフェクター配列、及び、配列番号：２９に記載の配列に対して実質的に相補的でありその配列と二本鎖を形成可能なエフェクター相補配列を含んでいてもよい。配列番号：２９に記載の配列に対して実質的に相補的なエフェクター相補配列は、配列番号：２８に記載の配列であってもよい。この例によるｓｈｍｉＲを以下「ｓｈｍｉＲ１１」と呼ぶ。

【0161】

１つの例では、本明細書に記載の核酸は、（ｉ）エフェクター配列が配列番号：３０に記載の配列と二本鎖を形成可能である場合、１、２、３または４塩基のミスマッチを有すること以外は配列番号：３０に記載の配列に対して実質的に相補的なエフェクター配列、及び、（ｉｉ）エフェクター配列に対して実質的に相補的な配列を含むエフェクター相補配列、を含むｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列を含んでいてもよい。例えば、核酸がコードするｓｈｍｉＲは、配列番号：３１に記載のエフェクター配列、及び、配列番号：３１に記載の配列に対して実質的に相補的でありその配列と二本鎖を形成可能なエフェクター相補配列を含んでいてもよい。配列番号：３１に記載の配列に対して実質的に相補的なエフェクター相補配列は、配列番号：３０に記載の配列であってもよい。この例によるｓｈｍｉＲを以下「ｓｈｍｉＲ１３」と呼ぶ。

【0162】

１つの例では、本明細書に記載の核酸は、（ｉ）エフェクター配列が配列番号：３２に記載の配列と二本鎖を形成可能である場合、１、２、３または４塩基のミスマッチを有すること以外は配列番号：３２に記載の配列に対して実質的に相補的なエフェクター配列、及び、（ｉｉ）エフェクター配列に対して実質的に相補的な配列を含むエフェクター相補配列、を含むｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列を含んでいてもよい。例えば、核酸がコードするｓｈｍｉＲは、配列番号：３３に記載のエフェクター配列、及び、配列番号：３３に記載の配列に対して実質的に相補的でありその配列と二本鎖を形成可能なエフェクター相補配列を含んでいてもよい。配列番号：３３に記載の配列に対して実質的に相補的なエフェクター相補配列は、配列番号：３２に記載の配列であってもよい。この例によるｓｈｍｉＲを以下「ｓｈｍｉＲ１４」と呼ぶ。

【0163】

１つの例では、本明細書に記載の核酸は、（ｉ）エフェクター配列が配列番号：３４に記載の配列と二本鎖を形成可能である場合、１、２、３または４塩基のミスマッチを有すること以外は配列番号：３４に記載の配列に対して実質的に相補的なエフェクター配列、及び、（ｉｉ）エフェクター配列に対して実質的に相補的な配列を含むエフェクター相補配列、を含むｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列を含んでいてもよい。例えば、核酸がコードするｓｈｍｉＲは、配列番号：３５に記載のエフェクター配列、及び、配列番号：３５に記載の配列に対して実質的に相補的でありその配列と二本鎖を形成可能なエフェクター相補配列を含んでいてもよい。配列番号：３５に記載の配列に対して実質的に相補的なエフェクター相補配列は、配列番号：３４に記載の配列であってもよい。この例によるｓｈｍｉＲを以下「ｓｈｍｉＲ１５」と呼ぶ。

【0164】

１つの例では、本明細書に記載の核酸は、（ｉ）エフェクター配列が配列番号：３６に記載の配列と二本鎖を形成可能である場合、１、２、３または４塩基のミスマッチを有すること以外は配列番号：３６に記載の配列に対して実質的に相補的なエフェクター配列、及び、（ｉｉ）エフェクター配列に対して実質的に相補的な配列を含むエフェクター相補配列、を含むｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列を含んでいてもよい。例えば、核酸がコードするｓｈｍｉＲは、配列番号：３７に記載のエフェクター配列、及び、配列番号：３７に記載の配列に対して実質的に相補的でありその配列と二本鎖を形成可能なエフェクター相補配列を含んでいてもよい。配列番号：３７に記載の配列に対して実質的に相補的なエフェクター相補配列は、配列番号：３６に記載の配列であってもよい。この例によるｓｈｍｉＲを以下「ｓｈｍｉＲ１６」と呼ぶ。

【0165】

１つの例では、本明細書に記載の核酸は、（ｉ）エフェクター配列が配列番号：３８に記載の配列と二本鎖を形成可能である場合、１、２、３または４塩基のミスマッチを有すること以外は配列番号：３８に記載の配列に対して実質的に相補的なエフェクター配列、及び、（ｉｉ）エフェクター配列に対して実質的に相補的な配列を含むエフェクター相補配列、を含むｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列を含んでいてもよい。例えば、核酸がコードするｓｈｍｉＲは、配列番号：３９に記載のエフェクター配列、及び、配列番号：３９に記載の配列に対して実質的に相補的でありその配列と二本鎖を形成可能なエフェクター相補配列を含んでいてもよい。配列番号：３９に記載の配列に対して実質的に相補的なエフェクター相補配列は、配列番号：３８に記載の配列であってもよい。この例によるｓｈｍｉＲを以下「ｓｈｍｉＲ１７」と呼ぶ。

【0166】

本明細書に記載の例のいずれかでは、本開示の核酸がコードするｓｈｍｉＲは、５´→３´方向に、
ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ骨格の５´隣接配列、
エフェクター相補配列、
ステムループ配列、
エフェクター配列、及び、
ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ骨格の３´隣接配列、
を含んでいてもよい。

【0167】

本明細書に記載の例のいずれかでは、本開示の核酸がコードするｓｈｍｉＲは、５´→３´方向に、
ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ骨格の５´隣接配列、
エフェクター配列、
ステムループ配列、
エフェクター相補配列、及び、
ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ骨格の３´隣接配列、
を含んでいてもよい。

【0168】

好適なループ配列を当該技術分野において周知のループ配列から選択してもよい。しかしながら、例示的なステムループ配列については配列番号：４０に記載している。

【0169】

本開示の核酸に用いる好適なプライマリーマイクロＲＮＡ（ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡまたはｐｒｉ－Ｒ）骨格を当該技術分野において周知のプライマリーマイクロＲＮＡ骨格から選択してもよい。例えば、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ骨格を、ｐｒｉ－ｍｉＲ－３０ａ骨格、ｐｒｉ－ｍｉＲ－１５５骨格、ｐｒｉ－ｍｉＲ－２１骨格及びｐｒｉ－ｍｉＲ－１３６骨格から選択してもよい。しかしながら、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ骨格はｐｒｉ－ｍｉＲ－３０ａ骨格であることが好ましい。ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ骨格がｐｒｉ－ｍｉＲ－３０ａ骨格である例によれば、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ骨格の５´隣接配列は配列番号：４１に記載されており、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ骨格の３´隣接配列は配列番号：４２に記載されている。それゆえ、本開示のｓｈｍｉＲ（例えば、本明細書に記載のｓｈｍｉＲ－１～ｓｈｍｉＲ－１６）をコードする核酸は、配列番号：４１に記載の配列をコードするＤＮＡ配列及び配列番号：４２に記載の配列をコードするＤＮＡ配列を含んでいてもよい。

【0170】

１つの例では、本明細書に記載の核酸は、配列番号：５６～６８のいずれか１つに記載の配列から選択されるＤＮＡ配列を含んでいてもよい。

【0171】

１つの例では、本明細書に記載の核酸は、配列番号：５６に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなり、配列番号：４３に記載の配列を含むかまたはそれからなるｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ２）をコードする。

【0172】

１つの例では、本明細書に記載の核酸は、配列番号：５７に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなり、配列番号：４４に記載の配列を含むかまたはそれからなるｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ３）をコードする。

【0173】

１つの例では、本明細書に記載の核酸は、配列番号：５８に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなり、配列番号：４５に記載の配列を含むかまたはそれからなるｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ４）をコードする。

【0174】

１つの例では、本明細書に記載の核酸は、配列番号：５９に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなり、配列番号：４６に記載の配列を含むかまたはそれからなるｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ５）をコードする。

【0175】

１つの例では、本明細書に記載の核酸は、配列番号：６０に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなり、配列番号：４７に記載の配列を含むかまたはそれからなるｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ６）をコードする。

【0176】

１つの例では、本明細書に記載の核酸は、配列番号：６１に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなり、配列番号：４８に記載の配列を含むかまたはそれからなるｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ７）をコードする。

【0177】

１つの例では、本明細書に記載の核酸は、配列番号：６２に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなり、配列番号：４９に記載の配列を含むかまたはそれからなるｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ９）をコードする。

【0178】

１つの例では、本明細書に記載の核酸は、配列番号：６３に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなり、配列番号：５０に記載の配列を含むかまたはそれからなるｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ１１）をコードする。

【0179】

１つの例では、本明細書に記載の核酸は、配列番号：６４に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなり、配列番号：５１に記載の配列を含むかまたはそれからなるｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ１３）をコードする。

【0180】

１つの例では、本明細書に記載の核酸は、配列番号：６５に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなり、配列番号：５２に記載の配列を含むかまたはそれからなるｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ１４）をコードする。

【0181】

１つの例では、本明細書に記載の核酸は、配列番号：６６に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなり、配列番号：５３に記載の配列を含むかまたはそれからなるｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ１５）をコードする。

【0182】

１つの例では、本明細書に記載の核酸は、配列番号：６７に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなり、配列番号：５４に記載の配列を含むかまたはそれからなるｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ１６）をコードする。

【0183】

１つの例では、本明細書に記載の核酸は、配列番号：６８に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなり、配列番号：５５に記載の配列を含むかまたはそれからなるｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ１７）をコードする。

【0184】

本開示の例示的な核酸は、本明細書に記載のｓｈｍｉＲ２、ｓｈｍｉＲ３、ｓｈｍｉＲ５、ｓｈｍｉＲ９、ｓｈｍｉＲ１３、ｓｈｍｉＲ１４及びｓｈｍｉＲ１７から選択されるｓｈｍｉＲをコードする。本明細書に記載のｓｈｍｉＲ３、ｓｈｍｉＲ１３、ｓｈｍｉＲ１４及びｓｈｍｉＲ１７から選択されるｓｈｍｉＲをコードする本開示の核酸が特に好ましい。

【0185】

本開示による核酸を、ＯＰＭＤの原因となるＰＡＢＰＮ１タンパク質に対応するＲＮＡ転写物の領域に対して実質的に相補的な少なくとも１７連続ヌクレオチドのエフェクター配列を含むｓｈＲＮＡまたはｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列を含む１種または複数種のその他の核酸と組み合わせてもよい、またはそれらと共に使用してもよいということを当業者は理解する。１つの例では、複数種の核酸は、
（ａ）本明細書に記載の少なくとも１種の核酸、及び、
（ｂ）
（ｉ）本明細書に記載のｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列を含む核酸、または、
（ｉｉ）本明細書に記載のｓｈｍｉＲの同種のエフェクター配列とエフェクター相補配列を含む低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をコードするＤＮＡ配列を含む核酸、
から選択される少なくとも１種の更なる核酸、
を含み、
（ａ）の核酸がコードするｓｈｍｉＲと（ｂ）の核酸がコードするｓｈｍｉＲまたはｓｈＲＮＡは、異なるエフェクター配列を含む、
ように提供される。

【0186】

それゆえ、１つの例では、本開示の複数種の核酸は、本明細書に記載のｓｈｍｉＲをコードする２種またはそれ以上の核酸、例えば、本明細書に記載のｓｈｍｉＲをコードする２、３、４、５、６、７、８、９または１０種の核酸などを含んでいてもよい。

【0187】

別の例では、本開示の複数種の核酸は、本明細書に記載のｓｈｍｉＲをコードする少なくとも１種の核酸、及び、本明細書に記載のｓｈｍｉＲの同種のエフェクター配列とエフェクター相補配列を含むｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含む少なくとも１種の核酸を含む。例えば、ｓｈｍｉＲ２のエフェクター配列とエフェクター相補配列を含むｓｈＲＮＡを以下「ｓｈＲＮＡ２」と呼ぶ。例えば、ｓｈｍｉＲ３のエフェクター配列とエフェクター相補配列を含むｓｈＲＮＡを以下「ｓｈＲＮＡ３」と呼ぶ。例えば、ｓｈｍｉＲ４のエフェクター配列とエフェクター相補配列を含むｓｈＲＮＡを以下「ｓｈＲＮＡ４」と呼ぶ。例えば、ｓｈｍｉＲ５のエフェクター配列とエフェクター相補配列を含むｓｈＲＮＡを以下「ｓｈＲＮＡ５」と呼ぶ。例えば、ｓｈｍｉＲ６のエフェクター配列とエフェクター相補配列を含むｓｈＲＮＡを以下「ｓｈＲＮＡ６」と呼ぶ。例えば、ｓｈｍｉＲ７のエフェクター配列とエフェクター相補配列を含むｓｈＲＮＡを以下「ｓｈＲＮＡ７」と呼ぶ。例えば、ｓｈｍｉＲ９のエフェクター配列とエフェクター相補配列を含むｓｈＲＮＡを以下「ｓｈＲＮＡ９」と呼ぶ。例えば、ｓｈｍｉＲ１１のエフェクター配列とエフェクター相補配列を含むｓｈＲＮＡを以下「ｓｈＲＮＡ１１」と呼ぶ。例えば、ｓｈｍｉＲ１３のエフェクター配列とエフェクター相補配列を含むｓｈＲＮＡを以下「ｓｈＲＮＡ１３」と呼ぶ。例えば、ｓｈｍｉＲ１４のエフェクター配列とエフェクター相補配列を含むｓｈＲＮＡを以下「ｓｈＲＮＡ１４」と呼ぶ。例えば、ｓｈｍｉＲ１５のエフェクター配列とエフェクター相補配列を含むｓｈＲＮＡを以下「ｓｈＲＮＡ１５」と呼ぶ。例えば、ｓｈｍｉＲ１６のエフェクター配列とエフェクター相補配列を含むｓｈＲＮＡを以下「ｓｈＲＮＡ１６」と呼ぶ。例えば、ｓｈｍｉＲ１７のエフェクター配列とエフェクター相補配列を含むｓｈＲＮＡを以下「ｓｈＲＮＡ１７」と呼ぶ。

【0188】

本明細書に記載の複数種の核酸における１種または複数種の核酸がｓｈＲＮＡをコードするいずれかの例によれば、ｓｈＲＮＡは、同種のエフェクター配列とエフェクター相補配列の間に位置するループ配列またはステムループ配列を含んでいてもよい。好適なループ配列を当該技術分野において周知のループ配列から選択してもよい。代替的に、好適なステムループを新規に開発してもよい。１つの例では、ｓｈＲＮＡをコードする本明細書に記載の複数種の核酸は、エフェクター配列とエフェクター相補配列をそれぞれコードするＤＮＡ配列間に位置するステムループをコードするＤＮＡ配列を含んでいてもよい。

【0189】

１つの例では、本明細書に記載の複数種の核酸は、ｓｈｍｉＲ２をコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、及び、ＰＡＢＰＮ１ ｍＲＮＡ転写物の領域を標的とするｓｈｍｉＲまたはｓｈＲＮＡをコードする本開示の少なくとも１種のその他の核酸を含む。ｓｈｍｉＲ２をコードする例示的な核酸は本明細書に記載されており、本開示のこの例に準用されると解釈されるべきである。１つの例では、本明細書に記載の複数種の核酸は、配列番号：５６に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなり、配列番号：４３に記載の配列を含むかまたはそれからなるｓｈｍｉＲをコードする核酸、及び、ＰＡＢＰＮ１ ｍＲＮＡ転写物の領域を標的とするｓｈｍｉＲまたはｓｈＲＮＡをコードする本開示の少なくとも１種のその他の核酸を含む。例えば、本明細書に記載の複数種の核酸は、（ｉ）配列番号：５６（ｓｈｍｉＲ２）に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、及び、（ｉｉ）ｓｈｍｉＲ３～ｓｈｍｉＲ７、ｓｈｍｉＲ９、ｓｈｍｉＲ１１、もしくは、ｓｈｍｉＲ１３～ｓｈｍｉＲ１７、または、これらいずれかの対応するｓｈＲＮＡのうちの１つをコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸を含んでいてもよい。

【0190】

１つの例では、本明細書に記載の複数種の核酸は、ｓｈｍｉＲ３をコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、及び、ＰＡＢＰＮ１ ｍＲＮＡ転写物の領域を標的とするｓｈｍｉＲまたはｓｈＲＮＡをコードする本開示の少なくとも１種のその他の核酸を含む。ｓｈｍｉＲ３をコードする例示的な核酸は本明細書に記載されており、本開示のこの例に準用されると解釈されるべきである。１つの例では、本明細書に記載の複数種の核酸は、配列番号：５７に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなり、配列番号：４４に記載の配列を含むかまたはそれからなるｓｈｍｉＲをコードする核酸、及び、ＰＡＢＰＮ１ ｍＲＮＡ転写物の領域を標的とするｓｈｍｉＲまたはｓｈＲＮＡをコードする本開示の少なくとも１種のその他の核酸を含む。例えば、本明細書に記載の複数種の核酸は、（ｉ）配列番号：５７（ｓｈｍｉＲ３）に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、及び、（ｉｉ）ｓｈｍｉＲ２、ｓｈｍｉＲ４～ｓｈｍｉＲ７、ｓｈｍｉＲ９、ｓｈｍｉＲ１１、もしくは、ｓｈｍｉＲ１３～ｓｈｍｉＲ１７、または、これらいずれかの対応するｓｈＲＮＡのうちの１つをコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸を含んでいてもよい。

【0191】

１つの例では、本明細書に記載の複数種の核酸は、ｓｈｍｉＲ４をコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、及び、ＰＡＢＰＮ１ ｍＲＮＡ転写物の領域を標的とするｓｈｍｉＲまたはｓｈＲＮＡをコードする本開示の少なくとも１種のその他の核酸を含む。ｓｈｍｉＲ４をコードする例示的な核酸は本明細書に記載されており、本開示のこの例に準用されると解釈されるべきである。１つの例では、本明細書に記載の複数種の核酸は、配列番号：５８に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなり、配列番号：４５に記載の配列を含むかまたはそれからなるｓｈｍｉＲをコードする核酸、及び、ＰＡＢＰＮ１ ｍＲＮＡ転写物の領域を標的とするｓｈｍｉＲまたはｓｈＲＮＡをコードする本開示の少なくとも１種のその他の核酸を含む。例えば、本明細書に記載の複数種の核酸は、（ｉ）配列番号：５８（ｓｈｍｉＲ４）に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、及び、（ｉｉ）ｓｈｍｉＲ２、ｓｈｍｉＲ３、ｓｈｍｉＲ５～ｓｈｍｉＲ７、ｓｈｍｉＲ９、ｓｈｍｉＲ１１、もしくは、ｓｈｍｉＲ１３～ｓｈｍｉＲ１７、または、これらいずれかの対応するｓｈＲＮＡのうちの１つをコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸を含んでいてもよい。

【0192】

１つの例では、本明細書に記載の複数種の核酸は、ｓｈｍｉＲ５をコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、及び、ＰＡＢＰＮ１ ｍＲＮＡ転写物の領域を標的とするｓｈｍｉＲまたはｓｈＲＮＡをコードする本開示の少なくとも１種のその他の核酸を含む。ｓｈｍｉＲ５をコードする例示的な核酸は本明細書に記載されており、本開示のこの例に準用されると解釈されるべきである。１つの例では、本明細書に記載の複数種の核酸は、配列番号：５９に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなり、配列番号：４６に記載の配列を含むかまたはそれからなるｓｈｍｉＲをコードする核酸、及び、ＰＡＢＰＮ１ ｍＲＮＡ転写物の領域を標的とするｓｈｍｉＲまたはｓｈＲＮＡをコードする本開示の少なくとも１種のその他の核酸を含む。例えば、本明細書に記載の複数種の核酸は、（ｉ）配列番号：５９（ｓｈｍｉＲ５）に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、及び、（ｉｉ）ｓｈｍｉＲ２～ｓｈｍｉＲ４、ｓｈｍｉＲ６～ｓｈｍｉＲ７、ｓｈｍｉＲ９、ｓｈｍｉＲ１１、もしくは、ｓｈｍｉＲ１３～ｓｈｍｉＲ１７、または、これらいずれかの対応するｓｈＲＮＡのうちの１つをコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸を含んでいてもよい。

【0193】

１つの例では、本明細書に記載の複数種の核酸は、ｓｈｍｉＲ６をコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、及び、ＰＡＢＰＮ１ ｍＲＮＡ転写物の領域を標的とするｓｈｍｉＲまたはｓｈＲＮＡをコードする本開示の少なくとも１種のその他の核酸を含む。ｓｈｍｉＲ６をコードする例示的な核酸は本明細書に記載されており、本開示のこの例に準用されると解釈されるべきである。１つの例では、本明細書に記載の複数種の核酸は、配列番号：６０に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなり、配列番号：４７に記載の配列を含むかまたはそれからなるｓｈｍｉＲをコードする核酸、及び、ＰＡＢＰＮ１ ｍＲＮＡ転写物の領域を標的とするｓｈｍｉＲまたはｓｈＲＮＡをコードする本開示の少なくとも１種のその他の核酸を含む。例えば、本明細書に記載の複数種の核酸は、（ｉ）配列番号：６０（ｓｈｍｉＲ６）に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、及び、（ｉｉ）ｓｈｍｉＲ２～ｓｈｍｉＲ５、ｓｈｍｉＲ７、ｓｈｍｉＲ９、ｓｈｍｉＲ１１、もしくは、ｓｈｍｉＲ１３～ｓｈｍｉＲ１７、または、これらいずれかの対応するｓｈＲＮＡのうちの１つをコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸を含んでいてもよい。

【0194】

１つの例では、本明細書に記載の複数種の核酸は、ｓｈｍｉＲ７をコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、及び、ＰＡＢＰＮ１ ｍＲＮＡ転写物の領域を標的とするｓｈｍｉＲまたはｓｈＲＮＡをコードする本開示の少なくとも１種のその他の核酸を含む。ｓｈｍｉＲ７をコードする例示的な核酸は本明細書に記載されており、本開示のこの例に準用されると解釈されるべきである。１つの例では、本明細書に記載の複数種の核酸は、配列番号：６１に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなり、配列番号：４８に記載の配列を含むかまたはそれからなるｓｈｍｉＲをコードする核酸、及び、ＰＡＢＰＮ１ ｍＲＮＡ転写物の領域を標的とするｓｈｍｉＲまたはｓｈＲＮＡをコードする本開示の少なくとも１種のその他の核酸を含む。例えば、本明細書に記載の複数種の核酸は、（ｉ）配列番号：６１（ｓｈｍｉＲ７）に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、及び、（ｉｉ）ｓｈｍｉＲ２～ｓｈｍｉＲ６、ｓｈｍｉＲ９、ｓｈｍｉＲ１１、もしくは、ｓｈｍｉＲ１３～ｓｈｍｉＲ１７、または、これらいずれかの対応するｓｈＲＮＡのうちの１つをコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸を含んでいてもよい。

【0195】

１つの例では、本明細書に記載の複数種の核酸は、ｓｈｍｉＲ９をコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、及び、ＰＡＢＰＮ１ ｍＲＮＡ転写物の領域を標的とするｓｈｍｉＲまたはｓｈＲＮＡをコードする本開示の少なくとも１種のその他の核酸を含む。ｓｈｍｉＲ９をコードする例示的な核酸は本明細書に記載されており、本開示のこの例に準用されると解釈されるべきである。１つの例では、本明細書に記載の複数種の核酸は、配列番号：６２に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなり、配列番号：４９に記載の配列を含むかまたはそれからなるｓｈｍｉＲをコードする核酸、及び、ＰＡＢＰＮ１ ｍＲＮＡ転写物の領域を標的とするｓｈｍｉＲまたはｓｈＲＮＡをコードする本開示の少なくとも１種のその他の核酸を含む。例えば、本明細書に記載の複数種の核酸は、（ｉ）配列番号：６２（ｓｈｍｉＲ９）に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、及び、（ｉｉ）ｓｈｍｉＲ２～ｓｈｍｉＲ７、ｓｈｍｉＲ１１、もしくは、ｓｈｍｉＲ１３～ｓｈｍｉＲ１７、または、これらいずれかの対応するｓｈＲＮＡのうちの１つをコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸を含んでいてもよい。

【0196】

１つの例では、本明細書に記載の複数種の核酸は、ｓｈｍｉＲ１１をコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、及び、ＰＡＢＰＮ１ ｍＲＮＡ転写物の領域を標的とするｓｈｍｉＲまたはｓｈＲＮＡをコードする本開示の少なくとも１種のその他の核酸を含む。ｓｈｍｉＲ１１をコードする例示的な核酸は本明細書に記載されており、本開示のこの例に準用されると解釈されるべきである。１つの例では、本明細書に記載の複数種の核酸は、配列番号：６３に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなり、配列番号：５０に記載の配列を含むかまたはそれからなるｓｈｍｉＲをコードする核酸、及び、ＰＡＢＰＮ１ ｍＲＮＡ転写物の領域を標的とするｓｈｍｉＲまたはｓｈＲＮＡをコードする本開示の少なくとも１種のその他の核酸を含む。例えば、本明細書に記載の複数種の核酸は、（ｉ）配列番号：６３（ｓｈｍｉＲ１１）に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、及び、（ｉｉ）ｓｈｍｉＲ２～ｓｈｍｉＲ７、ｓｈｍｉＲ９、もしくは、ｓｈｍｉＲ１３～ｓｈｍｉＲ１７、または、これらいずれかの対応するｓｈＲＮＡのうちの１つをコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸を含んでいてもよい。

【0197】

１つの例では、本明細書に記載の複数種の核酸は、ｓｈｍｉＲ１３をコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、及び、ＰＡＢＰＮ１ ｍＲＮＡ転写物の領域を標的とするｓｈｍｉＲまたはｓｈＲＮＡをコードする本開示の少なくとも１種のその他の核酸を含む。ｓｈｍｉＲ１３をコードする例示的な核酸は本明細書に記載されており、本開示のこの例に準用されると解釈されるべきである。１つの例では、本明細書に記載の複数種の核酸は、配列番号：６４に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなり、配列番号：５１に記載の配列を含むかまたはそれからなるｓｈｍｉＲをコードする核酸、及び、ＰＡＢＰＮ１ ｍＲＮＡ転写物の領域を標的とするｓｈｍｉＲまたはｓｈＲＮＡをコードする本開示の少なくとも１種のその他の核酸を含む。例えば、本明細書に記載の複数種の核酸は、（ｉ）配列番号：６４（ｓｈｍｉＲ１３）に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、及び、（ｉｉ）ｓｈｍｉＲ２～ｓｈｍｉＲ７、ｓｈｍｉＲ９、ｓｈｍｉＲ１１、もしくは、ｓｈｍｉＲ１４～ｓｈｍｉＲ１７、または、これらいずれかの対応するｓｈＲＮＡのうちの１つをコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸を含んでいてもよい。

【0198】

１つの例では、本明細書に記載の複数種の核酸は、ｓｈｍｉＲ１４をコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、及び、ＰＡＢＰＮ１ ｍＲＮＡ転写物の領域を標的とするｓｈｍｉＲまたはｓｈＲＮＡをコードする本開示の少なくとも１種のその他の核酸を含む。ｓｈｍｉＲ１４をコードする例示的な核酸は本明細書に記載されており、本開示のこの例に準用されると解釈されるべきである。１つの例では、本明細書に記載の複数種の核酸は、配列番号：６５に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなり、配列番号：５２に記載の配列を含むかまたはそれからなるｓｈｍｉＲをコードする核酸、及び、ＰＡＢＰＮ１ ｍＲＮＡ転写物の領域を標的とするｓｈｍｉＲまたはｓｈＲＮＡをコードする本開示の少なくとも１種のその他の核酸を含む。例えば、本明細書に記載の複数種の核酸は、（ｉ）配列番号：６５（ｓｈｍｉＲ１４）に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、及び、（ｉｉ）ｓｈｍｉＲ２～ｓｈｍｉＲ７、ｓｈｍｉＲ９、ｓｈｍｉＲ１１、ｓｈｍｉＲ１３、もしくは、ｓｈｍｉＲ１５～ｓｈｍｉＲ１７、または、これらいずれかの対応するｓｈＲＮＡのうちの１つをコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸を含んでいてもよい。

【0199】

１つの例では、本明細書に記載の複数種の核酸は、ｓｈｍｉＲ１５をコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、及び、ＰＡＢＰＮ１ ｍＲＮＡ転写物の領域を標的とするｓｈｍｉＲまたはｓｈＲＮＡをコードする本開示の少なくとも１種のその他の核酸を含む。ｓｈｍｉＲ１５をコードする例示的な核酸は本明細書に記載されており、本開示のこの例に準用されると解釈されるべきである。１つの例では、本明細書に記載の複数種の核酸は、配列番号：６６に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなり、配列番号：５３に記載の配列を含むかまたはそれからなるｓｈｍｉＲをコードする核酸、及び、ＰＡＢＰＮ１ ｍＲＮＡ転写物の領域を標的とするｓｈｍｉＲまたはｓｈＲＮＡをコードする本開示の少なくとも１種のその他の核酸を含む。例えば、本明細書に記載の複数種の核酸は、（ｉ）配列番号：６６（ｓｈｍｉＲ１５）に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、及び、（ｉｉ）ｓｈｍｉＲ２～ｓｈｍｉＲ７、ｓｈｍｉＲ９、ｓｈｍｉＲ１１、ｓｈｍｉＲ１３～ｓｈｍｉＲ１４、もしくは、ｓｈｍｉＲ１６～ｓｈｍｉＲ１７、または、これらいずれかの対応するｓｈＲＮＡのうちの１つをコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸を含んでいてもよい。

【0200】

１つの例では、本明細書に記載の複数種の核酸は、ｓｈｍｉＲ１６をコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、及び、ＰＡＢＰＮ１ ｍＲＮＡ転写物の領域を標的とするｓｈｍｉＲまたはｓｈＲＮＡをコードする本開示の少なくとも１種のその他の核酸を含む。ｓｈｍｉＲ１６をコードする例示的な核酸は本明細書に記載されており、本開示のこの例に準用されると解釈されるべきである。１つの例では、本明細書に記載の複数種の核酸は、配列番号：６７に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなり、配列番号：５４に記載の配列を含むかまたはそれからなるｓｈｍｉＲをコードする核酸、及び、ＰＡＢＰＮ１ ｍＲＮＡ転写物の領域を標的とするｓｈｍｉＲまたはｓｈＲＮＡをコードする本開示の少なくとも１種のその他の核酸を含む。例えば、本明細書に記載の複数種の核酸は、（ｉ）配列番号：６７（ｓｈｍｉＲ１６）に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、及び、（ｉｉ）ｓｈｍｉＲ２～ｓｈｍｉＲ７、ｓｈｍｉＲ９、ｓｈｍｉＲ１１、ｓｈｍｉＲ１３～ｓｈｍｉＲ１５、もしくは、ｓｈｍｉＲ１７、または、これらいずれかの対応するｓｈＲＮＡのうちの１つをコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸を含んでいてもよい。

【0201】

１つの例では、本明細書に記載の複数種の核酸は、ｓｈｍｉＲ１７をコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、及び、ＰＡＢＰＮ１ ｍＲＮＡ転写物の領域を標的とするｓｈｍｉＲまたはｓｈＲＮＡをコードする本開示の少なくとも１種のその他の核酸を含む。ｓｈｍｉＲ１７をコードする例示的な核酸は本明細書に記載されており、本開示のこの例に準用されると解釈されるべきである。１つの例では、本明細書に記載の複数種の核酸は、配列番号：６８に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなり、配列番号：５５に記載の配列を含むかまたはそれからなるｓｈｍｉＲをコードする核酸、及び、ＰＡＢＰＮ１ ｍＲＮＡ転写物の領域を標的とするｓｈｍｉＲまたはｓｈＲＮＡをコードする本開示の少なくとも１種のその他の核酸を含む。例えば、本明細書に記載の複数種の核酸は、（ｉ）配列番号：６８（ｓｈｍｉＲ１７）に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、及び、（ｉｉ）ｓｈｍｉＲ２～ｓｈｍｉＲ７、ｓｈｍｉＲ９、ｓｈｍｉＲ１１、もしくは、ｓｈｍｉＲ１３～ｓｈｍｉＲ１６、または、これらいずれかの対応するｓｈＲＮＡのうちの１つをコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸を含んでいてもよい。

【0202】

本明細書に記載の複数種の核酸のいずれかの例によれば、複数種の核酸は、核酸のうちの少なくとも１種が本開示のｓｈｍｉＲをコードする場合、本明細書に記載のｓｈｍｉＲまたはｓｈＲＮＡをコードする２種またはそれ以上の核酸、例えば、本明細書に記載のｓｈｍｉＲをコードする２、３、４、５、６、７、８、９または１０種の核酸などを含んでいてもよい。

【0203】

１つの例では、複数種の核酸は、その核酸のうちの少なくとも１種が本明細書に記載のｓｈｍｉＲをコードするという条件において、本明細書に記載のｓｈｍｉＲまたはｓｈＲＮＡをコードする２種の核酸を含む。１つの例では、複数種の核酸は、その核酸のうちの少なくとも１種が本明細書に記載のｓｈｍｉＲをコードするという条件において、本明細書に記載のｓｈｍｉＲまたはｓｈＲＮＡをコードする３種の核酸を含む。１つの例では、複数種の核酸は、その核酸のうちの少なくとも１種が本明細書に記載のｓｈｍｉＲをコードするという条件において、本明細書に記載のｓｈｍｉＲまたはｓｈＲＮＡをコードする４種の核酸を含む。１つの例では、複数種の核酸は、その核酸のうちの少なくとも１種が本明細書に記載のｓｈｍｉＲをコードするという条件において、本明細書に記載のｓｈｍｉＲまたはｓｈＲＮＡをコードする５種の核酸を含む。１つの例では、複数種の核酸は、その核酸のうちの少なくとも１種が本明細書に記載のｓｈｍｉＲをコードするという条件において、本明細書に記載のｓｈｍｉＲまたはｓｈＲＮＡをコードする６種の核酸を含む。１つの例では、複数種の核酸は、その核酸のうちの少なくとも１種が本明細書に記載のｓｈｍｉＲをコードするという条件において、本明細書に記載のｓｈｍｉＲまたはｓｈＲＮＡをコードする７種の核酸を含む。１つの例では、複数種の核酸は、その核酸のうちの少なくとも１種が本明細書に記載のｓｈｍｉＲをコードするという条件において、本明細書に記載のｓｈｍｉＲまたはｓｈＲＮＡをコードする８種の核酸を含む。１つの例では、複数種の核酸は、その核酸のうちの少なくとも１種が本明細書に記載のｓｈｍｉＲをコードするという条件において、本明細書に記載のｓｈｍｉＲまたはｓｈＲＮＡをコードする９種の核酸を含む。１つの例では、複数種の核酸は、その核酸のうちの少なくとも１種が本明細書に記載のｓｈｍｉＲをコードするという条件において、本明細書に記載のｓｈｍｉＲまたはｓｈＲＮＡをコードする１０種の核酸を含む。

【0204】

本明細書に記載の複数種の核酸の１つの例では、核酸のうちの１種は、配列番号：１に記載の配列を含むかまたはそれからなるＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的なエフェクター配列を有するｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列を含む。配列番号：１に記載の配列を含むかまたはそれからなるＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的なエフェクター配列を有するｓｈｍｉＲをコードする好適な核酸、例えば、ｓｈｍｉＲ２について本明細書に記載する。

【0205】

本明細書に記載の複数種の核酸の１つの例では、核酸のうちの１種は、配列番号：２に記載の配列を含むかまたはそれからなるＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的なエフェクター配列を有するｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列を含む。配列番号：２に記載の配列を含むかまたはそれからなるＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的なエフェクター配列を有するｓｈｍｉＲをコードする好適な核酸、例えば、ｓｈｍｉＲ３について本明細書に記載する。

【0206】

本明細書に記載の複数種の核酸の１つの例では、核酸のうちの１種は、配列番号：４に記載の配列を含むかまたはそれからなるＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的なエフェクター配列を有するｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列を含む。配列番号：４に記載の配列を含むかまたはそれからなるＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的なエフェクター配列を有するｓｈｍｉＲをコードする好適な核酸、例えば、ｓｈｍｉＲ５について本明細書に記載する。

【0207】

本明細書に記載の複数種の核酸の１つの例では、核酸のうちの１種は、配列番号：７に記載の配列を含むかまたはそれからなるＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的なエフェクター配列を有するｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列を含む。配列番号：７に記載の配列を含むかまたはそれからなるＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的なエフェクター配列を有するｓｈｍｉＲをコードする好適な核酸、例えば、ｓｈｍｉＲ９について本明細書に記載する。

【0208】

本明細書に記載の複数種の核酸の１つの例では、核酸のうちの１種は、配列番号：９に記載の配列を含むかまたはそれからなるＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的なエフェクター配列を有するｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列を含む。配列番号：９に記載の配列を含むかまたはそれからなるＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的なエフェクター配列を有するｓｈｍｉＲをコードする好適な核酸、例えば、ｓｈｍｉＲ１３について本明細書に記載する。

【0209】

本明細書に記載の複数種の核酸の１つの例では、核酸のうちの１種は、配列番号：１０に記載の配列を含むかまたはそれからなるＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的なエフェクター配列を有するｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列を含む。配列番号：１０に記載の配列を含むかまたはそれからなるＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的なエフェクター配列を有するｓｈｍｉＲをコードする好適な核酸、例えば、ｓｈｍｉＲ１４について本明細書に記載する。

【0210】

本明細書に記載の複数種の核酸の１つの例では、核酸のうちの１種は、配列番号：１３に記載の配列を含むかまたはそれからなるＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的なエフェクター配列を有するｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列を含む。配列番号：１３に記載の配列を含むかまたはそれからなるＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的なエフェクター配列を有するｓｈｍｉＲをコードする好適な核酸、例えば、ｓｈｍｉＲ１７について本明細書に記載する。

【0211】

例示的な本開示の複数種の核酸は、本開示のｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列をそれぞれが含む少なくとも２種の核酸を含み、それぞれのｓｈｍｉＲは異なるエフェクター配列を含む。

【0212】

１つの例では、少なくとも２種の核酸のそれぞれは、配列番号：１、２、４、７、９、１０及び１３のうちの１つに記載のＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的なエフェクター配列を含むｓｈｍｉＲをコードする。配列番号：１、２、４、７、９、１０及び１３に記載のＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的なエフェクター配列を含むｓｈｍｉＲをコードする例示的な本開示の核酸は本明細書に記載されており、本開示のこの例に準用されると解釈されるべきである。

【0213】

１つの例では、少なくとも２種の核酸は、
配列番号：１５に記載のエフェクター配列及び配列番号：１４に記載のエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、例えば、配列番号：５６（ｓｈｍｉＲ２）に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、
配列番号：１７に記載のエフェクター配列及び配列番号：１６に記載のエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、例えば、配列番号：５７（ｓｈｍｉＲ３）に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、
配列番号：２１に記載のエフェクター配列及び配列番号：２０に記載のエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、例えば、配列番号：５９（ｓｈｍｉＲ５）に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、
配列番号：２７に記載のエフェクター配列及び配列番号：２６に記載のエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、例えば、配列番号：６２（ｓｈｍｉＲ９）に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、
配列番号：３１に記載のエフェクター配列及び配列番号：３０に記載のエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、例えば、配列番号：６４（ｓｈｍｉＲ１３）に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、
配列番号：３３に記載のエフェクター配列及び配列番号：３２に記載のエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、例えば、配列番号：６５（ｓｈｍｉＲ１４）に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、及び、
配列番号：３９に記載のエフェクター配列及び配列番号：３８に記載のエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、例えば、配列番号：６８（ｓｈｍｉＲ１７）に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、
からなる群から選択される。

【0214】

１つの例では、少なくとも２種の核酸のそれぞれは、配列番号：２、９、１０及び１３のうちの１つに記載のＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的なエフェクター配列を含むｓｈｍｉＲをコードする。配列番号：２、９、１０及び１３に記載のＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的なエフェクター配列を含むｓｈｍｉＲをコードする例示的な本開示の核酸は本明細書に記載されており、本開示のこの例に準用されると解釈されるべきである。

【0215】

１つの例では、少なくとも２種の核酸は、
配列番号：１７に記載のエフェクター配列及び配列番号：１６に記載のエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、例えば、配列番号：５７（ｓｈｍｉＲ３）に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、
配列番号：３１に記載のエフェクター配列及び配列番号：３０に記載のエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、例えば、配列番号：６４（ｓｈｍｉＲ１３）に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、
配列番号：３３に記載のエフェクター配列及び配列番号：３２に記載のエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、例えば、配列番号：６５（ｓｈｍｉＲ１４）に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、及び、
配列番号：３９に記載のエフェクター配列及び配列番号：３８に記載のエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、例えば、配列番号：６８（ｓｈｍｉＲ１７）に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、
からなる群から選択される。

【0216】

１つの例では、複数種の核酸は、配列番号：１０に記載のＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的なエフェクター配列を含むｓｈｍｉＲをコードする核酸、及び、配列番号：１３に記載のＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的なエフェクター配列を含むｓｈｍｉＲをコードする核酸を含む。例えば、複数種の核酸は、
（ａ）配列番号：３１に記載のエフェクター配列及び配列番号：３０に記載のエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、例えば、配列番号：６４（ｓｈｍｉＲ１３）に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、及び、
（ｂ）配列番号：３９に記載のエフェクター配列及び配列番号：３８に記載のエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、例えば、配列番号：６８（ｓｈｍｉＲ１７）に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、
を含んでいてもよい。

【0217】

例示的な本開示の複数種の核酸は、配列番号：６４（ｓｈｍｉＲ１３）に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、及び、配列番号：６８（ｓｈｍｉＲ１７）に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸を含む。

【0218】

１つの例では、複数種の核酸は、配列番号：２に記載のＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的なエフェクター配列を含むｓｈｍｉＲをコードする核酸、及び、配列番号：９に記載のＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的なエフェクター配列を含むｓｈｍｉＲをコードする核酸を含む。例えば、複数種の核酸は、
（ａ）配列番号：１７に記載のエフェクター配列及び配列番号：１６に記載のエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、例えば、配列番号：５７（ｓｈｍｉＲ３）に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、及び、
（ｂ）配列番号：３３に記載のエフェクター配列及び配列番号：３２に記載のエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、例えば、配列番号：６５（ｓｈｍｉＲ１４）に記載の配列を含むかまたはそれからなる核酸、
を含んでいてもよい。

【0219】

例示的な本開示の複数種の核酸は、配列番号：６４（ｓｈｍｉＲ１３）に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、及び、配列番号：６８（ｓｈｍｉＲ１７）に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸を含む。

【0220】

複数種の核酸を提供する例によれば、核酸のうちの２種以上は同一ポリヌクレオチドの別々の部位を形成してもよい。別の例では、複数種の核酸のうちの２種以上はそれぞれ、異なるポリヌクレオチドの部位を形成する。別の例では、本明細書に記載の複数種の核酸は、複数の構成成分、例えば、複数の組成物として提供される。例えば、複数種の核酸のそれぞれは、別々に提供されてもよい。代替的に、本開示の３種またはそれ以上の核酸を提供する１つの例では、核酸のうちの少なくとも１種は別々に提供され、複数種のうちの２種またはそれ以上は共に提供されてもよい。

【0221】

一部の例では、本開示による核酸またはそれぞれの核酸は、例えば、ｓｈｍｉＲまたはｓｈＲＮＡの転写を促進するための別のエレメントを含むかまたはそれらと機能的に連結してもよい。例えば、核酸またはそれぞれの核酸は、本明細書に記載のｓｈｍｉＲまたはｓｈＲＮＡをコードする配列に機能的に連結するプロモーターを含んでいてもよい。その他のエレメント、例えば、転写ターミネーター及び転写イニシエーターは、当該技術分野において周知及び／または本明細書に記載されている。

【0222】

代替的にまたは加えて、本開示による核酸またはそれぞれの核酸は、例えば、クローニングベクターまたは発現ベクター内への核酸（複数可）のクローニングを促進するための１つまたは複数の制限部位を含んでいてもよい。例えば、本明細書に記載の核酸は、本開示のｓｈｍｉＲまたはｓｈＲＮＡをコードする配列の上流及び／または下流に制限部位を含んでいてもよい。好適な制限酵素認識配列は当業者に周知である。しかしながら、１つの例では、本開示の核酸（複数可）は、５´末端、すなわち、ｓｈｍｉＲまたはｓｈＲＮＡをコードする配列の上流にＢａｍＨ１制限部位（ＧＧＡＴＣＣ）を、３´末端、すなわち、ｓｈｍｉＲまたはｓｈＲＮＡをコードする配列の下流にＥｃｏＲ１制限部位（ＧＡＡＴＴＣ）を含んでいてもよい。

【0223】

ｄｄＲＮＡｉ構築物
１つの例では、本開示の核酸またはそれぞれの核酸は、ＤＮＡ特異的ＲＮＡｉ（ｄｄＲＮＡｉ）構築物の形態で提供されるかまたはその構築物内に含まれる。それゆえ、１つの例では、本開示は、本明細書に記載の核酸を含むｄｄＲＮＡｉ構築物を提供する。別の例では、本開示は、本明細書に記載の複数種の核酸を含むｄｄＲＮＡｉ構築物を提供する。更に別の例では、本開示は、本明細書に記載の複数種の核酸のうちの核酸をそれぞれが含む複数種のｄｄＲＮＡｉ構築物（すなわち、複数種のうちの核酸の全てが複数種のｄｄＲＮＡｉ構築物内において示されるように）を提供する。ＯＰＭＤの原因となるＰＡＢＰＮ１のｍＲＮＡ転写物を標的とするエフェクター配列を含むｓｈｍｉＲまたはｓｈＲＮＡをコードする例示的な核酸は本明細書に記載されており、本開示のこの例に準用されると解釈されるべきである。

【0224】

１つの例では、ｄｄＲＮＡｉ構築物は、プロモーターに機能的に連結する本開示の核酸を含む。

【0225】

ｄｄＲＮＡｉ構築物が本明細書に記載の複数種の核酸を含む例によれば、核酸のうちのそれぞれはプロモーターに機能的に連結してもよい。１つの例では、ｄｄＲＮＡｉ構築物内における核酸は同一のプロモーターに機能的に連結してもよい。１つの例では、ｄｄＲＮＡｉ構築物内における核酸は異なるプロモーターに機能的に連結してもよい。

【0226】

１つの例では、本開示のｄｄＲＮＡｉ構築物は、ｓｈｍｉＲ２をコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸を含む。例えば、ｄｄＲＮＡｉ構築物は、配列番号：１に記載の配列を含むかまたはそれからなるＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的なエフェクター配列を有するｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸を含んでいてもよい。ｓｈｍｉＲ２をコードする例示的な核酸は本明細書に記載されており、本開示のこの例に準用されると解釈されるべきである。１つの例では、ｄｄＲＮＡｉ構築物は、配列番号：５６に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなり配列番号：４３に記載の配列を含むかまたはそれからなるｓｈｍｉＲをコードする核酸を含む。ｄｄＲＮＡｉ構築物は、ＰＡＢＰＮ１ ｍＲＮＡ転写物の領域を標的とするｓｈｍｉＲまたはｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含む本開示の１種または複数種の更なる核酸、例えば、本明細書に記載のｓｈｍｉＲ３～ｓｈｍｉＲ７、ｓｈｍｉＲ９、ｓｈｍｉＲ１１、もしくは、ｓｈｍｉＲ１３～ｓｈｍｉＲ１７、または、これらいずれかの対応するｓｈＲＮＡのうちの１つをコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸などを含んでいてもよい。例えば、本明細書に記載のｄｄＲＮＡｉ構築物は、（ｉ）配列番号：５６（ｓｈｍｉＲ２）に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、及び、（ｉｉ）ｓｈｍｉＲ３～ｓｈｍｉＲ７、ｓｈｍｉＲ９、ｓｈｍｉＲ１１、もしくは、ｓｈｍｉＲ１３～ｓｈｍｉＲ１７、または、これらいずれかの対応するｓｈＲＮＡのうちの１つをコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸を含んでいてもよい。ｓｈｍｉＲ３～ｓｈｍｉＲ７、ｓｈｍｉＲ９、ｓｈｍｉＲ１１、及び、ｓｈｍｉＲ１３～ｓｈｍｉＲ１７と呼ばれるｓｈｍｉＲをコードする例示的な核酸は本明細書に記載されており、本開示のこの例に準用されると解釈されるべきである。

【0227】

１つの例では、本開示のｄｄＲＮＡｉ構築物は、ｓｈｍｉＲ３をコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸を含む。例えば、ｄｄＲＮＡｉ構築物は、配列番号：２に記載の配列を含むかまたはそれからなるＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的なエフェクター配列を有するｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸を含んでいてもよい。ｓｈｍｉＲ３をコードする例示的な核酸は本明細書に記載されており、本開示のこの例に準用されると解釈されるべきである。１つの例では、ｄｄＲＮＡｉ構築物は、配列番号：５７に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなり配列番号：４４に記載の配列を含むかまたはそれからなるｓｈｍｉＲをコードする核酸を含む。ｄｄＲＮＡｉ構築物は、ＰＡＢＰＮ１ ｍＲＮＡ転写物の領域を標的とするｓｈｍｉＲまたはｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含む本開示の１種または複数種の更なる核酸、例えば、本明細書に記載のｓｈｍｉＲ２、ｓｈｍｉＲ４～ｓｈｍｉＲ７、ｓｈｍｉＲ９、ｓｈｍｉＲ１１、もしくは、ｓｈｍｉＲ１３～ｓｈｍｉＲ１７、または、これらいずれかの対応するｓｈＲＮＡのうちの１つをコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸などを含んでいてもよい。例えば、本明細書に記載のｄｄＲＮＡｉ構築物は、（ｉ）配列番号：５７（ｓｈｍｉＲ３）に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、及び、（ｉｉ）ｓｈｍｉＲ２、ｓｈｍｉＲ４～ｓｈｍｉＲ７、ｓｈｍｉＲ９、ｓｈｍｉＲ１１、もしくは、ｓｈｍｉＲ１３～ｓｈｍｉＲ１７、または、これらいずれかの対応するｓｈＲＮＡのうちの１つをコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸を含んでいてもよい。ｓｈｍｉＲ２、ｓｈｍｉＲ４～ｓｈｍｉＲ７、ｓｈｍｉＲ９、ｓｈｍｉＲ１１、または、ｓｈｍｉＲ１３～ｓｈｍｉＲ１７と呼ばれるｓｈｍｉＲをコードする例示的な核酸は本明細書に記載されており、本開示のこの例に準用されると解釈されるべきである。

【0228】

１つの例では、本開示のｄｄＲＮＡｉ構築物は、ｓｈｍｉＲ４をコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸を含む。例えば、ｄｄＲＮＡｉ構築物は、配列番号：３に記載の配列を含むかまたはそれからなるＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的なエフェクター配列を有するｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸を含んでいてもよい。ｓｈｍｉＲ４をコードする例示的な核酸は本明細書に記載されており、本開示のこの例に準用されると解釈されるべきである。１つの例では、ｄｄＲＮＡｉ構築物は、配列番号：５８に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなり配列番号：４５に記載の配列を含むかまたはそれからなるｓｈｍｉＲをコードする核酸を含む。ｄｄＲＮＡｉ構築物は、ＰＡＢＰＮ１ ｍＲＮＡ転写物の領域を標的とするｓｈｍｉＲまたはｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含む本開示の１種または複数種の更なる核酸、例えば、本明細書に記載のｓｈｍｉＲ２、ｓｈｍｉＲ３、ｓｈｍｉＲ５～ｓｈｍｉＲ７、ｓｈｍｉＲ９、ｓｈｍｉＲ１１、もしくは、ｓｈｍｉＲ１３～ｓｈｍｉＲ１７、または、これらいずれかの対応するｓｈＲＮＡのうちの１つをコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸などを含んでいてもよい。例えば、本明細書に記載のｄｄＲＮＡｉ構築物は、（ｉ）配列番号：５８（ｓｈｍｉＲ４）に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、及び、（ｉｉ）ｓｈｍｉＲ２、ｓｈｍｉＲ３、ｓｈｍｉＲ５～ｓｈｍｉＲ７、ｓｈｍｉＲ９、ｓｈｍｉＲ１１、もしくは、ｓｈｍｉＲ１３～ｓｈｍｉＲ１７、または、これらいずれかの対応するｓｈＲＮＡのうちの１つをコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸を含んでいてもよい。ｓｈｍｉＲ２、ｓｈｍｉＲ３、ｓｈｍｉＲ５～ｓｈｍｉＲ７、ｓｈｍｉＲ９、ｓｈｍｉＲ１１、または、ｓｈｍｉＲ１３～ｓｈｍｉＲ１７と呼ばれるｓｈｍｉＲをコードする例示的な核酸は本明細書に記載されており、本開示のこの例に準用されると解釈されるべきである。

【0229】

１つの例では、本開示のｄｄＲＮＡｉ構築物は、ｓｈｍｉＲ５をコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸を含む。例えば、ｄｄＲＮＡｉ構築物は、配列番号：４に記載の配列を含むかまたはそれからなるＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的なエフェクター配列を有するｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸を含んでいてもよい。ｓｈｍｉＲ５をコードする例示的な核酸は本明細書に記載されており、本開示のこの例に準用されると解釈されるべきである。１つの例では、ｄｄＲＮＡｉ構築物は、配列番号：５９に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなり配列番号：４６に記載の配列を含むかまたはそれからなるｓｈｍｉＲをコードする核酸を含む。ｄｄＲＮＡｉ構築物は、ＰＡＢＰＮ１ ｍＲＮＡ転写物の領域を標的とするｓｈｍｉＲまたはｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含む本開示の１種または複数種の更なる核酸、例えば、本明細書に記載のｓｈｍｉＲ２～ｓｈｍｉＲ４、ｓｈｍｉＲ６～ｓｈｍｉＲ７、ｓｈｍｉＲ９、ｓｈｍｉＲ１１、もしくは、ｓｈｍｉＲ１３～ｓｈｍｉＲ１７、または、これらいずれかの対応するｓｈＲＮＡのうちの１つをコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸などを含んでいてもよい。例えば、本明細書に記載のｄｄＲＮＡｉ構築物は、（ｉ）配列番号：５９（ｓｈｍｉＲ５）に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、及び、（ｉｉ）ｓｈｍｉＲ２～ｓｈｍｉＲ４、ｓｈｍｉＲ６～ｓｈｍｉＲ７、ｓｈｍｉＲ９、ｓｈｍｉＲ１１、もしくは、ｓｈｍｉＲ１３～ｓｈｍｉＲ１７、または、これらいずれかの対応するｓｈＲＮＡのうちの１つをコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸を含んでいてもよい。ｓｈｍｉＲ２～ｓｈｍｉＲ４、ｓｈｍｉＲ６～ｓｈｍｉＲ７、ｓｈｍｉＲ９、ｓｈｍｉＲ１１、または、ｓｈｍｉＲ１３～ｓｈｍｉＲ１７と呼ばれるｓｈｍｉＲをコードする例示的な核酸は本明細書に記載されており、本開示のこの例に準用されると解釈されるべきである。

【0230】

１つの例では、本開示のｄｄＲＮＡｉ構築物は、ｓｈｍｉＲ６をコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸を含む。例えば、ｄｄＲＮＡｉ構築物は、配列番号：５に記載の配列を含むかまたはそれからなるＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的なエフェクター配列を有するｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸を含んでいてもよい。ｓｈｍｉＲ６をコードする例示的な核酸は本明細書に記載されており、本開示のこの例に準用されると解釈されるべきである。１つの例では、ｄｄＲＮＡｉ構築物は、配列番号：６０に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなり配列番号：４７に記載の配列を含むかまたはそれからなるｓｈｍｉＲをコードする核酸を含む。ｄｄＲＮＡｉ構築物は、ＰＡＢＰＮ１ ｍＲＮＡ転写物の領域を標的とするｓｈｍｉＲまたはｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含む本開示の１種または複数種の更なる核酸、例えば、本明細書に記載のｓｈｍｉＲ２～ｓｈｍｉＲ５、ｓｈｍｉＲ７、ｓｈｍｉＲ９、ｓｈｍｉＲ１１、もしくは、ｓｈｍｉＲ１３～ｓｈｍｉＲ１７、または、これらいずれかの対応するｓｈＲＮＡのうちの１つをコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸などを含んでいてもよい。例えば、本明細書に記載のｄｄＲＮＡｉ構築物は、（ｉ）配列番号：６０（ｓｈｍｉＲ６）に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、及び、（ｉｉ）ｓｈｍｉＲ２～ｓｈｍｉＲ５、ｓｈｍｉＲ７、ｓｈｍｉＲ９、ｓｈｍｉＲ１１、もしくは、ｓｈｍｉＲ１３～ｓｈｍｉＲ１７、または、これらいずれかの対応するｓｈＲＮＡのうちの１つをコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸を含んでいてもよい。ｓｈｍｉＲ２～ｓｈｍｉＲ５、ｓｈｍｉＲ７、ｓｈｍｉＲ９、ｓｈｍｉＲ１１、または、ｓｈｍｉＲ１３～ｓｈｍｉＲ１７と呼ばれるｓｈｍｉＲをコードする例示的な核酸は本明細書に記載されており、本開示のこの例に準用されると解釈されるべきである。

【0231】

１つの例では、本開示のｄｄＲＮＡｉ構築物は、ｓｈｍｉＲ７をコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸を含む。例えば、ｄｄＲＮＡｉ構築物は、配列番号：６に記載の配列を含むかまたはそれからなるＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的なエフェクター配列を有するｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸を含んでいてもよい。ｓｈｍｉＲ７をコードする例示的な核酸は本明細書に記載されており、本開示のこの例に準用されると解釈されるべきである。１つの例では、ｄｄＲＮＡｉ構築物は、配列番号：６１に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなり配列番号：４８に記載の配列を含むかまたはそれからなるｓｈｍｉＲをコードする核酸を含む。ｄｄＲＮＡｉ構築物は、ＰＡＢＰＮ１ ｍＲＮＡ転写物の領域を標的とするｓｈｍｉＲまたはｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含む本開示の１種または複数種の更なる核酸、例えば、本明細書に記載のｓｈｍｉＲ２～ｓｈｍｉＲ６、ｓｈｍｉＲ９、ｓｈｍｉＲ１１、もしくは、ｓｈｍｉＲ１３～ｓｈｍｉＲ１７、または、これらいずれかの対応するｓｈＲＮＡのうちの１つをコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸などを含んでいてもよい。例えば、本明細書に記載のｄｄＲＮＡｉ構築物は、（ｉ）配列番号：６１（ｓｈｍｉＲ７）に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、及び、（ｉｉ）ｓｈｍｉＲ２～ｓｈｍｉＲ６、ｓｈｍｉＲ９、ｓｈｍｉＲ１１、もしくは、ｓｈｍｉＲ１３～ｓｈｍｉＲ１７、または、これらいずれかの対応するｓｈＲＮＡのうちの１つをコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸を含んでいてもよい。ｓｈｍｉＲ２～ｓｈｍｉＲ６、ｓｈｍｉＲ９、ｓｈｍｉＲ１１、または、ｓｈｍｉＲ１３～ｓｈｍｉＲ１７と呼ばれるｓｈｍｉＲをコードする例示的な核酸は本明細書に記載されており、本開示のこの例に準用されると解釈されるべきである。

【0232】

１つの例では、本開示のｄｄＲＮＡｉ構築物は、ｓｈｍｉＲ９をコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸を含む。例えば、ｄｄＲＮＡｉ構築物は、配列番号：７に記載の配列を含むかまたはそれからなるＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的なエフェクター配列を有するｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸を含んでいてもよい。ｓｈｍｉＲ９をコードする例示的な核酸は本明細書に記載されており、本開示のこの例に準用されると解釈されるべきである。１つの例では、ｄｄＲＮＡｉ構築物は、配列番号：６２に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなり配列番号：４９に記載の配列を含むかまたはそれからなるｓｈｍｉＲをコードする核酸を含む。ｄｄＲＮＡｉ構築物は、ＰＡＢＰＮ１ ｍＲＮＡ転写物の領域を標的とするｓｈｍｉＲまたはｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含む本開示の１種または複数種の更なる核酸、例えば、本明細書に記載のｓｈｍｉＲ２～ｓｈｍｉＲ７、ｓｈｍｉＲ１１、もしくは、ｓｈｍｉＲ１３～ｓｈｍｉＲ１７、または、これらいずれかの対応するｓｈＲＮＡのうちの１つをコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸などを含んでいてもよい。例えば、本明細書に記載のｄｄＲＮＡｉ構築物は、（ｉ）配列番号：６２（ｓｈｍｉＲ９）に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、及び、（ｉｉ）ｓｈｍｉＲ２～ｓｈｍｉＲ７、ｓｈｍｉＲ１１、もしくは、ｓｈｍｉＲ１３～ｓｈｍｉＲ１７、または、これらいずれかの対応するｓｈＲＮＡのうちの１つをコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸を含んでいてもよい。ｓｈｍｉＲ２～ｓｈｍｉＲ７、ｓｈｍｉＲ１１、または、ｓｈｍｉＲ１３～ｓｈｍｉＲ１７と呼ばれるｓｈｍｉＲをコードする例示的な核酸は本明細書に記載されており、本開示のこの例に準用されると解釈されるべきである。

【0233】

１つの例では、本開示のｄｄＲＮＡｉ構築物は、ｓｈｍｉＲ１１をコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸を含む。例えば、ｄｄＲＮＡｉ構築物は、配列番号：８に記載の配列を含むかまたはそれからなるＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的なエフェクター配列を有するｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸を含んでいてもよい。ｓｈｍｉＲ１１をコードする例示的な核酸は本明細書に記載されており、本開示のこの例に準用されると解釈されるべきである。１つの例では、ｄｄＲＮＡｉ構築物は、配列番号：６３に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなり配列番号：５０に記載の配列を含むかまたはそれからなるｓｈｍｉＲをコードする核酸を含む。ｄｄＲＮＡｉ構築物は、ＰＡＢＰＮ１ ｍＲＮＡ転写物の領域を標的とするｓｈｍｉＲまたはｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含む本開示の１種または複数種の更なる核酸、例えば、本明細書に記載のｓｈｍｉＲ２～ｓｈｍｉＲ７、ｓｈｍｉＲ９、もしくは、ｓｈｍｉＲ１３～ｓｈｍｉＲ１７、または、これらいずれかの対応するｓｈＲＮＡのうちの１つをコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸などを含んでいてもよい。例えば、本明細書に記載のｄｄＲＮＡｉ構築物は、（ｉ）配列番号：６３（ｓｈｍｉＲ１１）に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、及び、（ｉｉ）ｓｈｍｉＲ２～ｓｈｍｉＲ７、ｓｈｍｉＲ９、もしくは、ｓｈｍｉＲ１３～ｓｈｍｉＲ１７、または、これらいずれかの対応するｓｈＲＮＡのうちの１つをコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸を含んでいてもよい。ｓｈｍｉＲ２～ｓｈｍｉＲ７、ｓｈｍｉＲ９、または、ｓｈｍｉＲ１３～ｓｈｍｉＲ１７と呼ばれるｓｈｍｉＲをコードする例示的な核酸は本明細書に記載されており、本開示のこの例に準用されると解釈されるべきである。

【0234】

１つの例では、本開示のｄｄＲＮＡｉ構築物は、ｓｈｍｉＲ１３をコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸を含む。例えば、ｄｄＲＮＡｉ構築物は、配列番号：９に記載の配列を含むかまたはそれからなるＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的なエフェクター配列を有するｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸を含んでいてもよい。ｓｈｍｉＲ１３をコードする例示的な核酸は本明細書に記載されており、本開示のこの例に準用されると解釈されるべきである。１つの例では、ｄｄＲＮＡｉ構築物は、配列番号：６４に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなり配列番号：５１に記載の配列を含むかまたはそれからなるｓｈｍｉＲをコードする核酸を含む。ｄｄＲＮＡｉ構築物は、ＰＡＢＰＮ１ ｍＲＮＡ転写物の領域を標的とするｓｈｍｉＲまたはｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含む本開示の１種または複数種の更なる核酸、例えば、本明細書に記載のｓｈｍｉＲ２～ｓｈｍｉＲ７、ｓｈｍｉＲ９、ｓｈｍｉＲ１１、もしくは、ｓｈｍｉＲ１４～ｓｈｍｉＲ１７、または、これらいずれかの対応するｓｈＲＮＡのうちの１つをコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸などを含んでいてもよい。例えば、本明細書に記載のｄｄＲＮＡｉ構築物は、（ｉ）配列番号：６４（ｓｈｍｉＲ１３）に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、及び、（ｉｉ）ｓｈｍｉＲ２～ｓｈｍｉＲ７、ｓｈｍｉＲ９、ｓｈｍｉＲ１１、もしくは、ｓｈｍｉＲ１４～ｓｈｍｉＲ１７、または、これらいずれかの対応するｓｈＲＮＡのうちの１つをコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸を含んでいてもよい。ｓｈｍｉＲ２～ｓｈｍｉＲ７、ｓｈｍｉＲ９、ｓｈｍｉＲ１１、または、ｓｈｍｉＲ１４～ｓｈｍｉＲ１７と呼ばれるｓｈｍｉＲをコードする例示的な核酸は本明細書に記載されており、本開示のこの例に準用されると解釈されるべきである。

【0235】

１つの例では、本開示のｄｄＲＮＡｉ構築物は、ｓｈｍｉＲ１４をコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸を含む。例えば、ｄｄＲＮＡｉ構築物は、配列番号：１０に記載の配列を含むかまたはそれからなるＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的なエフェクター配列を有するｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸を含んでいてもよい。ｓｈｍｉＲ１４をコードする例示的な核酸は本明細書に記載されており、本開示のこの例に準用されると解釈されるべきである。１つの例では、ｄｄＲＮＡｉ構築物は、配列番号：６５に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなり配列番号：５２に記載の配列を含むかまたはそれからなるｓｈｍｉＲをコードする核酸を含む。ｄｄＲＮＡｉ構築物は、ＰＡＢＰＮ１ ｍＲＮＡ転写物の領域を標的とするｓｈｍｉＲまたはｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含む本開示の１種または複数種の更なる核酸、例えば、本明細書に記載のｓｈｍｉＲ２～ｓｈｍｉＲ７、ｓｈｍｉＲ９、ｓｈｍｉＲ１１、ｓｈｍｉＲ１３、もしくは、ｓｈｍｉＲ１５～ｓｈｍｉＲ１７、または、これらいずれかの対応するｓｈＲＮＡのうちの１つをコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸などを含んでいてもよい。例えば、本明細書に記載のｄｄＲＮＡｉ構築物は、（ｉ）配列番号：６５（ｓｈｍｉＲ１４）に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、及び、（ｉｉ）ｓｈｍｉＲ２～ｓｈｍｉＲ７、ｓｈｍｉＲ９、ｓｈｍｉＲ１１、ｓｈｍｉＲ１３、もしくは、ｓｈｍｉＲ１５～ｓｈｍｉＲ１７、または、これらいずれかの対応するｓｈＲＮＡのうちの１つをコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸を含んでいてもよい。ｓｈｍｉＲ２～ｓｈｍｉＲ７、ｓｈｍｉＲ９、ｓｈｍｉＲ１１、ｓｈｍｉＲ１３、または、ｓｈｍｉＲ１５～ｓｈｍｉＲ１７と呼ばれるｓｈｍｉＲをコードする例示的な核酸は本明細書に記載されており、本開示のこの例に準用されると解釈されるべきである。

【0236】

１つの例では、本開示のｄｄＲＮＡｉ構築物は、ｓｈｍｉＲ１５をコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸を含む。例えば、ｄｄＲＮＡｉ構築物は、配列番号：１１に記載の配列を含むかまたはそれからなるＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的なエフェクター配列を有するｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸を含んでいてもよい。ｓｈｍｉＲ１５をコードする例示的な核酸は本明細書に記載されており、本開示のこの例に準用されると解釈されるべきである。１つの例では、ｄｄＲＮＡｉ構築物は、配列番号：６６に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなり配列番号：５３に記載の配列を含むかまたはそれからなるｓｈｍｉＲをコードする核酸を含む。ｄｄＲＮＡｉ構築物は、ＰＡＢＰＮ１ ｍＲＮＡ転写物の領域を標的とするｓｈｍｉＲまたはｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含む本開示の１種または複数種の更なる核酸、例えば、本明細書に記載のｓｈｍｉＲ２～ｓｈｍｉＲ７、ｓｈｍｉＲ９、ｓｈｍｉＲ１１、ｓｈｍｉＲ１３～ｓｈｍｉＲ１４、もしくは、ｓｈｍｉＲ１６～ｓｈｍｉＲ１７、または、これらいずれかの対応するｓｈＲＮＡのうちの１つをコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸などを含んでいてもよい。例えば、本明細書に記載のｄｄＲＮＡｉ構築物は、（ｉ）配列番号：６６（ｓｈｍｉＲ１５）に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、及び、（ｉｉ）ｓｈｍｉＲ２～ｓｈｍｉＲ７、ｓｈｍｉＲ９、ｓｈｍｉＲ１１、ｓｈｍｉＲ１３～ｓｈｍｉＲ１４、もしくは、ｓｈｍｉＲ１６～ｓｈｍｉＲ１７、または、これらいずれかの対応するｓｈＲＮＡのうちの１つをコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸を含んでいてもよい。ｓｈｍｉＲ２～ｓｈｍｉＲ７、ｓｈｍｉＲ９、ｓｈｍｉＲ１１、ｓｈｍｉＲ１３～ｓｈｍｉＲ１４、または、ｓｈｍｉＲ１６～ｓｈｍｉＲ１７と呼ばれるｓｈｍｉＲをコードする例示的な核酸は本明細書に記載されており、本開示のこの例に準用されると解釈されるべきである。

【0237】

１つの例では、本開示のｄｄＲＮＡｉ構築物は、ｓｈｍｉＲ１６をコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸を含む。例えば、ｄｄＲＮＡｉ構築物は、配列番号：１２に記載の配列を含むかまたはそれからなるＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的なエフェクター配列を有するｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸を含んでいてもよい。ｓｈｍｉＲ１６をコードする例示的な核酸は本明細書に記載されており、本開示のこの例に準用されると解釈されるべきである。１つの例では、ｄｄＲＮＡｉ構築物は、配列番号：６７に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなり配列番号：５４に記載の配列を含むかまたはそれからなるｓｈｍｉＲをコードする核酸を含む。ｄｄＲＮＡｉ構築物は、ＰＡＢＰＮ１ ｍＲＮＡ転写物の領域を標的とするｓｈｍｉＲまたはｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含む本開示の１種または複数種の更なる核酸、例えば、本明細書に記載のｓｈｍｉＲ２～ｓｈｍｉＲ７、ｓｈｍｉＲ９、ｓｈｍｉＲ１１、ｓｈｍｉＲ１３～ｓｈｍｉＲ１５、もしくは、ｓｈｍｉＲ１７、または、これらいずれかの対応するｓｈＲＮＡのうちの１つをコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸などを含んでいてもよい。例えば、本明細書に記載のｄｄＲＮＡｉ構築物は、（ｉ）配列番号：６７（ｓｈｍｉＲ１６）に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、及び、（ｉｉ）ｓｈｍｉＲ２～ｓｈｍｉＲ７、ｓｈｍｉＲ９、ｓｈｍｉＲ１１、ｓｈｍｉＲ１３～ｓｈｍｉＲ１５、もしくは、ｓｈｍｉＲ１７、または、これらいずれかの対応するｓｈＲＮＡのうちの１つをコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸を含んでいてもよい。ｓｈｍｉＲ２～ｓｈｍｉＲ７、ｓｈｍｉＲ９、ｓｈｍｉＲ１１、ｓｈｍｉＲ１３～ｓｈｍｉＲ１５、または、ｓｈｍｉＲ１７と呼ばれるｓｈｍｉＲをコードする例示的な核酸は本明細書に記載されており、本開示のこの例に準用されると解釈されるべきである。

【0238】

１つの例では、本開示のｄｄＲＮＡｉ構築物は、ｓｈｍｉＲ１７をコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸を含む。例えば、ｄｄＲＮＡｉ構築物は、配列番号：１３に記載の配列を含むかまたはそれからなるＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的なエフェクター配列を有するｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸を含んでいてもよい。ｓｈｍｉＲ１７をコードする例示的な核酸は本明細書に記載されており、本開示のこの例に準用されると解釈されるべきである。１つの例では、ｄｄＲＮＡｉ構築物は、配列番号：６８に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなり配列番号：５５に記載の配列を含むかまたはそれからなるｓｈｍｉＲをコードする核酸を含む。ｄｄＲＮＡｉ構築物は、ＰＡＢＰＮ１ ｍＲＮＡ転写物の領域を標的とするｓｈｍｉＲまたはｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含む本開示の１種または複数種の更なる核酸、例えば、本明細書に記載のｓｈｍｉＲ２～ｓｈｍｉＲ７、ｓｈｍｉＲ９、ｓｈｍｉＲ１１、もしくは、ｓｈｍｉＲ１３～ｓｈｍｉＲ１６、または、これらいずれかの対応するｓｈＲＮＡのうちの１つをコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸などを含んでいてもよい。例えば、本明細書に記載のｄｄＲＮＡｉ構築物は、（ｉ）配列番号：６８（ｓｈｍｉＲ１７）に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、及び、（ｉｉ）ｓｈｍｉＲ２～ｓｈｍｉＲ７、ｓｈｍｉＲ９、ｓｈｍｉＲ１１、もしくは、ｓｈｍｉＲ１３～ｓｈｍｉＲ１６、または、これらいずれかの対応するｓｈＲＮＡのうちの１つをコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸を含んでいてもよい。ｓｈｍｉＲ２～ｓｈｍｉＲ７、ｓｈｍｉＲ９、ｓｈｍｉＲ１１、または、ｓｈｍｉＲ１３～ｓｈｍｉＲ１６と呼ばれるｓｈｍｉＲをコードする例示的な核酸は本明細書に記載されており、本開示のこの例に準用されると解釈されるべきである。

【0239】

本明細書に記載の複数種の核酸を含むｄｄＲＮＡｉ構築物のいずれかの例によれば、ｄｄＲＮＡｉ構築物は、核酸のうちの少なくとも１種が本明細書に記載のｓｈｍｉＲをコードする場合、本明細書に記載のｓｈｍｉＲまたはｓｈＲＮＡをコードする２種またはそれ以上の核酸、例えば、本明細書に記載のｓｈｍｉＲまたはｓｈＲＮＡをコードする２、３、４、５、６、７、８、９または１０種の核酸などを含んでいてもよい。

【0240】

１つの例では、ｄｄＲＮＡｉ構築物は、その核酸のうちの少なくとも１種が本明細書に記載のｓｈｍｉＲをコードするという条件において、本明細書に記載のｓｈｍｉＲまたはｓｈＲＮＡをコードする２種の核酸を含む。１つの例では、ｄｄＲＮＡｉ構築物は、その核酸のうちの少なくとも１種が本明細書に記載のｓｈｍｉＲをコードするという条件において、本明細書に記載のｓｈｍｉＲまたはｓｈＲＮＡをコードする３種の核酸を含む。１つの例では、ｄｄＲＮＡｉ構築物は、その核酸のうちの少なくとも１種が本明細書に記載のｓｈｍｉＲをコードするという条件において、本明細書に記載のｓｈｍｉＲまたはｓｈＲＮＡをコードする４種の核酸を含む。１つの例では、ｄｄＲＮＡｉ構築物は、その核酸のうちの少なくとも１種が本明細書に記載のｓｈｍｉＲをコードするという条件において、本明細書に記載のｓｈｍｉＲまたはｓｈＲＮＡをコードする５種の核酸を含む。１つの例では、ｄｄＲＮＡｉ構築物は、その核酸のうちの少なくとも１種が本明細書に記載のｓｈｍｉＲをコードするという条件において、本明細書に記載のｓｈｍｉＲまたはｓｈＲＮＡをコードする６種の核酸を含む。１つの例では、ｄｄＲＮＡｉ構築物は、その核酸のうちの少なくとも１種が本明細書に記載のｓｈｍｉＲをコードするという条件において、本明細書に記載のｓｈｍｉＲまたはｓｈＲＮＡをコードする７種の核酸を含む。１つの例では、ｄｄＲＮＡｉ構築物は、その核酸のうちの少なくとも１種が本明細書に記載のｓｈｍｉＲをコードするという条件において、本明細書に記載のｓｈｍｉＲまたはｓｈＲＮＡをコードする８種の核酸を含む。１つの例では、ｄｄＲＮＡｉ構築物は、その核酸のうちの少なくとも１種が本明細書に記載のｓｈｍｉＲをコードするという条件において、本明細書に記載のｓｈｍｉＲまたはｓｈＲＮＡをコードする９種の核酸を含む。１つの例では、ｄｄＲＮＡｉ構築物は、その核酸のうちの少なくとも１種が本明細書に記載のｓｈｍｉＲをコードするという条件において、本明細書に記載のｓｈｍｉＲまたはｓｈＲＮＡをコードする１０種の核酸を含む。

【0241】

例示的な本開示のｄｄＲＮＡｉ構築物は、本開示のｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列をそれぞれが含む少なくとも２種の核酸を含み、それぞれのｓｈｍｉＲは異なるエフェクター配列を含む。１つの例では、ｄｄＲＮＡｉ構築物内における少なくとも２種の核酸のそれぞれは、配列番号：１、２、４、７、９、１０及び１３のうちの１つに記載のＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的なエフェクター配列を含むｓｈｍｉＲをコードする。配列番号：１、２、４、７、９、１０及び１３に記載のＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的なエフェクター配列を含むｓｈｍｉＲをコードする例示的な本開示の核酸は本明細書に記載されており、ｄｄＲＮＡｉ構築物について記載する本開示のこの例に準用されると解釈されるべきである。

【0242】

１つの例では、ｄｄＲＮＡｉ構築物は、
配列番号：１５に記載のエフェクター配列及び配列番号：１４に記載のエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、例えば、配列番号：５６（ｓｈｍｉＲ２）に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、
配列番号：１７に記載のエフェクター配列及び配列番号：１６に記載のエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、例えば、配列番号：５７（ｓｈｍｉＲ３）に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、
配列番号：２１に記載のエフェクター配列及び配列番号：２０に記載のエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、例えば、配列番号：５９（ｓｈｍｉＲ５）に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、
配列番号：２７に記載のエフェクター配列及び配列番号：２６に記載のエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、例えば、配列番号：６２（ｓｈｍｉＲ９）に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、
配列番号：３１に記載のエフェクター配列及び配列番号：３０に記載のエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、例えば、配列番号：６４（ｓｈｍｉＲ１３）に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、
配列番号：３３に記載のエフェクター配列及び配列番号：３２に記載のエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、例えば、配列番号：６５（ｓｈｍｉＲ１４）に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、及び、
配列番号：３９に記載のエフェクター配列及び配列番号：３８に記載のエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、例えば、配列番号：６８（ｓｈｍｉＲ１７）に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、
からなる群から選択される少なくとも２種の核酸を含む。

【0243】

１つの例では、ｄｄＲＮＡｉ構築物内における少なくとも２種の核酸のそれぞれは、配列番号：２、９、１０及び１３のうちの１つに記載のＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的なエフェクター配列を含むｓｈｍｉＲをコードする。配列番号：２、９、１０及び１３に記載のＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的なエフェクター配列を含むｓｈｍｉＲをコードする例示的な本開示の核酸は本明細書に記載されており、ｄｄＲＮＡｉ構築物について記載する本開示のこの例に準用されると解釈されるべきである。

【0244】

１つの例では、ｄｄＲＮＡｉ構築物は、
配列番号：１７に記載のエフェクター配列及び配列番号：１６に記載のエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、例えば、配列番号：５７（ｓｈｍｉＲ３）に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、
配列番号：３１に記載のエフェクター配列及び配列番号：３０に記載のエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、例えば、配列番号：６４（ｓｈｍｉＲ１３）に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、
配列番号：３３に記載のエフェクター配列及び配列番号：３２に記載のエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、例えば、配列番号：６５（ｓｈｍｉＲ１４）に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、及び、
配列番号：３９に記載のエフェクター配列及び配列番号：３８に記載のエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、例えば、配列番号：６８（ｓｈｍｉＲ１７）に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、
からなる群から選択される少なくとも２種の核酸を含む。

【0245】

１つの例では、本開示のｄｄＲＮＡｉ構築物は、配列番号：１０に記載のＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的なエフェクター配列を含むｓｈｍｉＲをコードする核酸、及び、配列番号：１３に記載のＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的なエフェクター配列を含むｓｈｍｉＲをコードする核酸を含む。例えば、ｄｄＲＮＡｉ構築物は、
（ａ）配列番号：３１に記載のエフェクター配列及び配列番号：３０に記載のエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、例えば、配列番号：６４（ｓｈｍｉＲ１３）に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、及び、
（ｂ）配列番号：３９に記載のエフェクター配列及び配列番号：３８に記載のエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、例えば、配列番号：６８（ｓｈｍｉＲ１７）に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、
を含んでいてもよい。

【0246】

例示的な本開示のｄｄＲＮＡｉ構築物は、配列番号：６４（ｓｈｍｉＲ１３）に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、及び、配列番号：６８（ｓｈｍｉＲ１７）に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸を含む。

【0247】

１つの例では、ｄｄＲＮＡｉ構築物は、配列番号：２に記載のＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的なエフェクター配列を含むｓｈｍｉＲをコードする核酸、及び、配列番号：９に記載のＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的なエフェクター配列を含むｓｈｍｉＲをコードする核酸を含む。例えば、ｄｄＲＮＡｉ構築物は、
（ａ）配列番号：１７に記載のエフェクター配列及び配列番号：１６に記載のエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、例えば、配列番号：５７（ｓｈｍｉＲ３）に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、及び、
（ｂ）配列番号：３３に記載のエフェクター配列及び配列番号：３２に記載のエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、例えば、配列番号：６５（ｓｈｍｉＲ１４）に記載の配列を含むかまたはそれからなる核酸、
を含んでいてもよい。

【0248】

例示的な本開示のｄｄＲＮＡｉ構築物は、配列番号：６４（ｓｈｍｉＲ１３）に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、及び、配列番号：６８（ｓｈｍｉＲ１７）に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸を含む。

【0249】

本開示のｄｄＲＮＡｉ構築物について記載する上記の例のそれぞれでは、そのｄｄＲＮＡｉ構築物内に含まれる核酸またはそれぞれの核酸はプロモーターに機能的に連結してもよい。例えば、本明細書に記載のｄｄＲＮＡｉ構築物は、例えば、ｄｄＲＮＡｉ構築物由来の１種または複数種のｓｈｍｉＲ及び／またはｓｈＲＮＡの発現を駆動するための、ｄｄＲＮＡｉ構築物内に含まれる核酸またはそれぞれの核酸に機能的に連結する単一のプロモーターを含んでいてもよい。

【0250】

別の例では、ｄｄＲＮＡｉ構築物内に含まれる本開示のｓｈｍｉＲまたはｓｈＲＮＡをコードするそれぞれの核酸は、別々のプロモーターに機能的に連結する。

【0251】

複数のプロモーターが存在する例によれば、それらプロモーターは同一であるかまたは異なっていてもよい。例えば、構築物は、それぞれのコピーが本開示の異なる核酸に機能的に連結するように、同一プロモーターの複数のコピーを含んでいてもよい。別の例では、本開示の核酸に機能的に連結するそれぞれのプロモーターは異なる。例えば、２種のｓｈｍｉＲをコードするｄｄＲＮＡｉ構築物内において、それらｓｈｍｉＲをコードする２種の核酸はそれぞれ、異なるプロモーターに機能的に連結する。同様に、ｄｄＲＮＡｉ構築物が１種のｓｈｍｉＲ及び１種のｓｈＲＮＡをコードする例では、ｓｈｍｉＲ及びｓｈＲＮＡをコードする対応する核酸はそれぞれ、異なるプロモーターに機能的に連結する。

【0252】

１つの例では、プロモーターは構成的プロモーターである。プロモーターに言及する場合の用語「構成的」とは、特定の刺激（例えば、熱ショック、化学物質、光など）の不在下で、機能的に連結する核酸配列の転写をプロモーターが誘導可能であることを意味する。一般的に、構成的プロモーターは、実質的に全ての細胞及び全ての組織内において、コード配列の発現を誘導することができる。本開示の核酸（複数可）からｓｈｍｉＲまたはｓｈＲＮＡを転写するために使用するプロモーターとしては、ＲＮＡポリメラーゼＩＩが制御するユビキチン、ＣＭＶ、β－アクチン、ヒストン Ｈ４、ＥＦ－１αまたはｐｇｋ遺伝子用のプロモーター、または、ＲＮＡポリメラーゼＩが制御するプロモーターエレメントが挙げられる。

【0253】

１つの例では、Ｐｏｌ ＩＩプロモーター、例えば、ＣＭＶ、ＳＶ４０、Ｕ１、β－アクチンまたはハイブリッドＰｏｌ ＩＩプロモーターなどを使用する。その他の好適なＰｏｌ ＩＩプロモーターは当該技術分野において周知であり、本開示のこの例に従い使用してもよい。酵素Ｄｒｏｓｈａ及びＰａｓｈａの作用により１つまたは複数のｓｈｍｉＲへとプロセシングされるｐｒｉ－ｍｉＲＮＡを発現する本開示のｄｄＲＮＡｉ構築物には、例えば、Ｐｏｌ ＩＩプロモーターシステムが好ましい場合がある。単一のプロモーターの制御下で複数種のｓｈＲＮＡまたはｓｈｍｉＲをコードする配列を含む本開示のｄｄＲＮＡｉ構築物には、Ｐｏｌ ＩＩプロモーターシステムもまた好ましい場合がある。組織特異性が望まれる場合において、Ｐｏｌ ＩＩプロモーターシステムはまた好ましい場合がある。

【0254】

別の例では、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩが制御するプロモーターを使用するが、例えば、Ｕ６プロモーター（Ｕ６－１、Ｕ６－８、Ｕ６－９）、Ｈ１プロモーター、７ＳＬプロモーター、ヒトＹプロモーター（ｈＹ１、ｈＹ３、ｈＹ４（Ｍａｒａｉａ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２２（１５）：３０４５－５２（１９９４）を参照のこと）及びｈＹ５（Ｍａｒａｉａ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２４（１８）：３５５２－５９（１９９４）を参照のこと））、ヒトＭＲＰ－７－２プロモーター、アデノウイルスＶＡ１プロモーター、ヒトｔＲＮＡプロモーター、または、５ｓリボソームＲＮＡプロモーターなどである。

【0255】

本開示のｄｄＲＮＡｉ構築物に使用するための好適なプロモーターについては、米国特許番号８，００８，４６８及び米国特許番号８，１２９，５１０に記載されている。

【0256】

１つの例では、プロモーターはＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターである。例えば、プロモーターはＵ６プロモーター（例えば、Ｕ６－１プロモーター、Ｕ６－８プロモーターまたはＵ６－９プロモーター）である。別の例では、プロモーターはＨ１プロモーターである。

【0257】

本明細書に記載の複数種のｓｈｍｉＲをコードする、または、本明細書に記載の１種または複数種のｓｈｍｉＲ及びｓｈＲＮＡをコードする本開示のｄｄＲＮＡｉ構築物に関し、ｄｄＲＮＡｉ構築物内における核酸のそれぞれは、Ｕ６プロモーター、例えば、別々のＵ６プロモーターに機能的に連結する。

【0258】

１つの例では、構築物内におけるプロモーターはＵ６プロモーターである。例えば、プロモーターはＵ６－１プロモーターである。例えば、プロモーターはＵ６－８プロモーターである。例えば、プロモーターはＵ６－９プロモーターである。

【0259】

一部の例では、様々な強さのプロモーターを使用する。例えば、２種またはそれ以上の強力なプロモーター（Ｐｏｌ ＩＩＩタイプのプロモーターなど）を使用して、例えば、転写に必要な市販のヌクレオチドまたはその他の細胞成分のプールを減らすことにより、細胞に負荷をかけてもよい。加えてまたは代替的に、いくつかの強力なプロモーターを使用することにより、ＲＮＡｉ薬剤、例えば、ｓｈｍｉＲまたはｓｈＲＮＡの細胞内における有毒レベルの発現が生じる場合がある。それゆえ、一部の例では、複数種プロモーターｄｄＲＮＡｉ構築物内におけるプロモーターのうちの１種または複数種は構築物内におけるその他のプロモーターよりも弱く、または、構築物内における全てのプロモーターはｓｈｍｉＲまたはｓｈＲＮＡを最大比率未満で発現し得る。様々な分子技術を用いてプロモーターを修飾して、または別の方法、例えば、様々な調節エレメントを修飾することにより、より弱いレベルまたはより強いレベルの転写を達成してもよい。転写の低下を達成するための１つの方法は、プロモーター活性を制御することが知られているプロモーター内の配列エレメントを修飾することである。例えば、近位配列エレメント（ＰＳＥ）は、ヒトＵ６プロモーターの活性に影響を与えることが知られている（Ｄｏｍｉｔｒｏｖｉｃｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３１：２３４４－２３５２（２００３）を参照のこと）。ヒトＵ６－１プロモーター、ヒトＵ６－８プロモーターまたはヒトＵ６－９プロモーターなどの強力なプロモーター内に存在するＰＳＥエレメントを、ヒトＵ６－７プロモーターなどの弱いプロモーターに由来するエレメントに置換することにより、ハイブリッドＵ６－１プロモーター、ハイブリッドＵ６－８プロモーターまたはハイブリッドＵ６－９プロモーターの活性を低下させる。本出願に記載の例にこの手法を用いているが、この効果を達成するためのその他の手法は当該技術分野において周知である。

【0260】

本開示の一部の例において有用なプロモーターは組織特異的または細胞特異的であってもよい。プロモーターに適用する場合の用語「組織特異的」とは、目的の核酸の選択的転写を特定タイプの組織（例えば、眼または筋肉の組織）へと誘導することができるプロモーターのことを意味する（異なるタイプの組織（例えば、肝臓）における目的の同一ヌクレオチド配列の発現は相対的に欠如している）。プロモーターに適用する場合の用語「細胞特異的」とは、目的の核酸の選択的転写を特定タイプの細胞へと誘導することができるプロモーターのことを意味する（同一組織内の異なるタイプの細胞における目的の同一ヌクレオチド配列の発現は相対的に欠如している）。１つの例によれば、Ｓｐｃ５１２またはＣＫ８などの筋特異的プロモーターを使用する。しかしながら、その他の筋特異的プロモーターは当該技術分野において周知であり、本開示のｄｄＲＮＡｉ構築物に使用されると考えられる。

【0261】

１つの例では、本開示のｄｄＲＮＡｉ構築物は、本明細書に記載の核酸がコードするｓｈｍｉＲまたはｓｈＲＮＡの発現を増加させるための１種または複数種のエンハンサーを追加的に含んでいてもよい。本開示の例に使用するのに適切なエンハンサーとしては、Ａｐｏ Ｅ ＨＣＲエンハンサー、ＣＭＶエンハンサー（Ｘｉａ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３１－１７（２００３））、及び当業者に周知のその他のエンハンサーが挙げられる。本開示のｄｄＲＮＡｉ構築物に使用するための好適なエンハンサーについては、米国特許番号８，００８，４６８に記載されている。

【0262】

更なる例では、本開示のｄｄＲＮＡｉ構築物は、本開示のｓｈｍｉＲまたはｓｈＲＮＡをコードする核酸に連結する転写ターミネーターを含んでいてもよい。本明細書に記載の複数種の核酸を含む、すなわち、複数種のｓｈｍｉＲ及び／またはｓｈＲＮＡをコードするｄｄＲＮＡｉ構築物に関し、それぞれの核酸に連結するターミネーターは同一であるかまたは異なっていてもよい。例えば、ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターを使用する本開示のｄｄＲＮＡｉ構築物内において、ターミネーターは、４以上、５以上または６以上のＴ残基の連続ストレッチであってもよい。しかしながら、別々のプロモーターを使用する場合、ターミネーターは異なっていてもよく、そのターミネーターを誘導する遺伝子由来のプロモーターと対をなす。このようなターミネーターとしては、ＳＶ４０ポリＡ遺伝子、ＡｄＶ ＶＡ１遺伝子、５ＳリボソームＲＮＡ遺伝子、及び、ヒトｔ－ＲＮＡ用のターミネーターが挙げられるがこれらに限定されない。プロモーターとターミネーターのその他の組み合わせは当該技術分野において周知であり、本開示のｄｄＲＮＡｉ構築物に使用されると考えられる。

【0263】

加えて、ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩプロモーターとターミネーターにおいて一般に行うように、プロモーターとターミネーターを組み合わせて対にしてもよい。

【0264】

１つの例では、複数種の核酸を含むｄｄＲＮＡｉ構築物内におけるそれぞれの核酸用に用いるプロモーターとターミネーターの組み合わせは、構成要素間のＤＮＡ組換え事象の可能性を低下させるために異なっている。

【0265】

１つの例示的な本開示のｄｄＲＮＡｉ構築物は、プロモーターに機能的に連結する本明細書に記載のｓｈｍｉＲ１３をコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、及び、プロモーターに機能的に連結する本明細書に記載のｓｈｍｉＲ１７をコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸を含む。例えば、例示的な本開示のｄｄＲＮＡｉ構築物は、プロモーターに機能的に連結する配列番号：６４に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、及び、プロモーターに機能的に連結する配列番号：６８に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸を含む。１つの例では、ｓｈｍｉＲをコードするｄｄＲＮＡｉ構築物内におけるそれぞれの核酸は、別々のプロモーターに機能的に連結する。別の例では、ｓｈｍｉＲをコードするｄｄＲＮＡｉ構築物内におけるそれぞれの核酸は、同一のプロモーターに機能的に連結する。例えば、プロモーターまたはそれぞれのプロモーターはＵ６プロモーター、例えば、Ｕ６－１プロモーター、Ｕ６－８プロモーターまたはＵ６－９プロモーターであってもよい。例えば、プロモーターまたはそれぞれのプロモーターは筋特異的プロモーター、例えば、Ｓｐｃ５１２プロモーターまたはＣＫ８プロモーターであってもよい。

【0266】

ｓｈｍｉＲ１３及びｓｈｍｉＲ１７をコードするｄｄＲＮＡｉ構築物内における核酸が同一のＳｐｃ５１２プロモーターに機能的に連結する例によれば、そのｄｄＲＮＡｉ構築物は配列番号：７２に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる。ｓｈｍｉＲ１３及びｓｈｍｉＲ１７をコードするｄｄＲＮＡｉ構築物内における核酸が同一のＣＫ８プロモーターに機能的に連結する例によれば、そのｄｄＲＮＡｉ構築物は配列番号：７０に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる。

【0267】

別の例示的な本開示のｄｄＲＮＡｉ構築物は、プロモーターに機能的に連結する本明細書に記載のｓｈｍｉＲ３をコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、及び、プロモーターに機能的に連結する本明細書に記載のｓｈｍｉＲ１４をコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸を含む。例えば、例示的な本開示のｄｄＲＮＡｉ構築物は、プロモーターに機能的に連結する配列番号：５７に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、及び、プロモーターに機能的に連結する配列番号：６５に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸を含む。１つの例では、ｓｈｍｉＲをコードするｄｄＲＮＡｉ構築物内におけるそれぞれの核酸は、別々のプロモーターに機能的に連結する。別の例では、ｓｈｍｉＲをコードするｄｄＲＮＡｉ構築物内におけるそれぞれの核酸は、同一のプロモーターに機能的に連結する。例えば、プロモーターまたはそれぞれのプロモーターはＵ６プロモーター、例えば、Ｕ６－１プロモーター、Ｕ６－８プロモーターまたはＵ６－９プロモーターであってもよい。例えば、プロモーターまたはそれぞれのプロモーターは筋特異的プロモーター、例えば、Ｓｐｃ５１２プロモーターまたはＣＫ８プロモーターであってもよい。

【0268】

ｓｈｍｉＲ３及びｓｈｍｉＲ１４をコードするｄｄＲＮＡｉ構築物内における核酸が同一のＳｐｃ５１２プロモーターに機能的に連結する例によれば、そのｄｄＲＮＡｉ構築物は配列番号：７１に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる。ｓｈｍｉＲ３及びｓｈｍｉＲ１４をコードするｄｄＲＮＡｉ構築物内における核酸が同一のＣＫ８プロモーターに機能的に連結する例によれば、そのｄｄＲＮＡｉ構築物は配列番号：６９に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる。

【0269】

複数種のｄｄＲＮＡｉ構築物も提供する。例えば、複数種のｄｄＲＮＡｉ構築物内において、本明細書に記載のｓｈｍｉＲをコードする複数種の核酸を提供してもよく、それぞれのｄｄＲＮＡｉ構築物は、本明細書に記載の複数種の核酸のうちの１種または複数種を含む。ｓｈｍｉＲをコードする核酸の組み合わせについて説明してきたが、本開示のこの例に準用されると解釈されるべきである。１つの例では、本明細書に記載の複数種の核酸内におけるそれぞれの核酸は、その独自のｄｄＲＮＡｉ構築物内において提供される。

【0270】

複数種のｄｄＲＮＡｉ構築物を提供するいずれかの例によれば、それぞれのｄｄＲＮＡｉ構築物はまた、ｄｄＲＮＡｉ構築物内に含まれるｓｈｍｉＲ（複数可）をコードする核酸（複数可）に機能的に連結する１種または複数種のプロモーターを含んでいてもよい。１つの例では、それぞれのｄｄＲＮＡｉ構築物は、ｓｈｍｉＲをコードする単一の核酸、及び、その核酸に機能的に連結するプロモーターを含む。複数種のｄｄＲＮＡｉ構築物のうちの１種または複数種が、ｓｈｍｉＲをコードする２種またはそれ以上の核酸を含む例によれば、１種または複数種のｄｄＲＮＡｉ構築物内におけるそれぞれの核酸は別々のプロモーターに機能的に連結する。複数種のｄｄＲＮＡｉ構築物のうちの１種または複数種が、ｓｈｍｉＲをコードする２種またはそれ以上の核酸を含む別の例では、２種またはそれ以上の核酸はｄｄＲＮＡｉ構築物内における同一のプロモーターに機能的に連結する。

【0271】

１つの例示的な本開示の複数種のｄｄＲＮＡｉ構築物は、プロモーターに機能的に連結する本明細書に記載のｓｈｍｉＲ１３をコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸を含むｄｄＲＮＡｉ構築物、及び、プロモーターに機能的に連結する本明細書に記載のｓｈｍｉＲ１７をコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸を含むｄｄＲＮＡｉ構築物を含む。例えば、例示的な本開示の複数種のｄｄＲＮＡｉ構築物は、プロモーターに機能的に連結する配列番号：６４に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸を含むｄｄＲＮＡｉ構築物、及び、プロモーターに機能的に連結する配列番号：６８に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸を含むｄｄＲＮＡｉ構築物を含む。１つの例では、プロモーターはＵ６プロモーターであり、例えば、Ｕ６－１プロモーター、Ｕ６－８プロモーターまたはＵ６－９プロモーターから選択される。別の例では、プロモーターは筋特異的プロモーター、例えば、Ｓｐｃ５１２プロモーターまたはＣＫ８プロモーターである。

【0272】

別の例示的な本開示の複数種のｄｄＲＮＡｉ構築物は、プロモーターに機能的に連結する本明細書に記載のｓｈｍｉＲ３をコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸を含むｄｄＲＮＡｉ構築物、及び、プロモーターに機能的に連結する本明細書に記載のｓｈｍｉＲ１４をコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸を含むｄｄＲＮＡｉ構築物を含む。例えば、例示的な本開示の複数種のｄｄＲＮＡｉ構築物は、プロモーターに機能的に連結する配列番号：５７に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸を含むｄｄＲＮＡｉ構築物、及び、プロモーターに機能的に連結する配列番号：６５に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸を含むｄｄＲＮＡｉ構築物を含む。１つの例では、プロモーターはＵ６プロモーターであり、例えば、Ｕ６－１プロモーター、Ｕ６－８プロモーターまたはＵ６－９プロモーターから選択される。別の例では、プロモーターは筋特異的プロモーター、例えば、Ｓｐｃ５１２プロモーターまたはＣＫ８プロモーターである。

【0273】

加えて、ｄｄＲＮＡｉ構築物またはそれぞれのｄｄＲＮＡｉ構築物は、プロモーター、ｓｈｍｉＲまたはｓｈＲＮＡをコードする核酸、及び／または、その他の調節エレメントが容易に除去または置換されるように戦略的に配置された、１つまたは複数のマルチクローニング部位及び／または固有制限部位を含んでいてもよい。ｄｄＲＮＡｉ構築物またはそれぞれのｄｄＲＮＡｉ構築物は、戦略的に配置された制限部位及び／または相補的な付着末端を用いて、より小さなオリゴヌクレオチド成分から構築することができる。本開示による１つの手法に用いる基本ベクターは、全ての部位が固有である（このことは絶対条件ではないが）マルチリンカーを有するプラスミドを含む。結果として、それぞれのプロモーターがｄｄＲＮＡｉ構築物の指定の固有部位間に挿入されて、１つまたは複数のプロモーター（それらの全ては変更可能な配置を有し得る）を有する基本カセットがもたらされる。更に結果として、アニールされたプライマーペアが個々のプロモーターのそれぞれの下流の固有部位に挿入されて、単一、二重または多重発現カセット構築物がもたらされる。単一、二重または多重発現カセットインサートに隣接する２つの固有制限酵素部位（同一のまたは異なる部位）を使用して、例えば、ＡｄＶ骨格またはＡＡＶ骨格へとインサートを移動させてもよい。

【0274】

ｄｄＲＮＡｉ構築物またはそれぞれのｄｄＲＮＡｉ構築物の作製については、限定するわけではないが、ＰＣＲ、オリゴヌクレオチド合成、制限エンドヌクレアーゼ消化、ライゲーション、形質転換、プラスミド精製及びＤＮＡ塩基配列決定法の標準的な技術を含む当該技術分野において周知の任意の好適な遺伝子工学技術を使用して実施することができる。構築物またはそれぞれの構築物がウイルス性構築物である場合、その構築物は、例えば、ｄｄＲＮＡｉ構築物をウイルス粒子にパッケージングするのに必要な配列、及び／または、ｄｄＲＮＡｉ構築物を標的細胞ゲノム内に組み込むことを可能とする配列を含む。一部の例では、ウイルス性構築物またはそれぞれのウイルス性構築物は追加で、ウイルスの複製及び増殖を可能とする遺伝子を含有するが、このような遺伝子はトランスで供給される。加えて、ウイルス性構築物またはそれぞれのウイルス性構築物は、未変性形態で組み込まれたまたは修飾された、あらゆる周知の生物のゲノム由来の遺伝子または遺伝子配列を含有し得る。例えば、ウイルス性構築物は、細菌内における構築物の複製に有用な配列を含んでいてもよい。

【0275】

構築物またはそれぞれの構築物はまた、別の遺伝子エレメントを含有していてもよい。構築物内に含まれ得るエレメントのタイプはいかなる様式においても限定されず、当業者により選択可能である。例えば、別の遺伝子エレメントとしては、レポーター遺伝子、例えば、ＧＦＰまたはＲＦＰなどの蛍光マーカータンパク質用の１種または複数種の遺伝子など、容易にアッセイされる酵素、例えば、β－ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、β－グルクロニダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼまたは分泌型アルカリホスファターゼなど、または、イムノアッセイが容易に利用可能なタンパク質、例えば、ホルモンまたはサイトカインなどを挙げてもよい。

【0276】

本開示の実施形態に有用となり得るその他の遺伝子エレメントとしては、アデノシンデアミナーゼ、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、ジヒドロ葉酸還元酵素、ヒグロマイシン－Ｂ－ホスホトランスフェラーゼ、薬剤抵抗性などの選択的増殖の利点を細胞に付与するタンパク質をコードする遺伝子エレメント、または、栄養要求株には存在が確認できない生合成能をもたらすタンパク質をコードする遺伝子エレメントの遺伝子が挙げられる。レポーター遺伝子が構築物またはそれぞれの構築物内に含まれる場合、内部リボソーム導入部位（ＩＲＥＳ）配列が含まれ得る。１つの例では、別の遺伝子エレメントは独立したプロモーター／エンハンサーと機能的に連結し、それらに制御される。加えて、細菌内における構築物増殖のための好適な複製起点を使用してもよい。複製起点の配列は通常、ｄｄＲＮＡｉ構築物及びその他の遺伝子配列から分離されている。このような複製起点は当該技術分野において周知であり、ｐＵＣ、ＣｏｌＥ１、２－ｍｉｃｒｏｎまたはＳＶ４０複製起点が挙げられる。

【0277】

発現ベクター
１つの例では、本開示のｄｄＲＮＡｉ構築物は発現ベクター内に含まれる。

【0278】

１つの例では、発現ベクターはプラスミド、例えば、当該技術分野において周知のプラスミドである。１つの例では、好適なプラスミド発現ベクターはｐＡＡＶベクター、例えば、自己相補的なｐＡＡＶ（ｐｓｃＡＡＶ）プラスミドベクターまたは一本鎖ｐＡＡＶ（ｐｓｓＡＡＶ）プラスミドベクターである。本明細書に記載するとおり、プラスミドは、本開示の１種または複数種のｓｈｍｉＲの発現を駆動するための１種または複数種のプロモーター（その好適な例については記載している）を含んでいてもよい。

【0279】

１つの例では、発現ベクターはミニサークルＤＮＡである。ミニサークルＤＮＡについては米国特許公開番号２００４／０２１４３２９に記載されている。ミニサークルＤＮＡは、持続的に高レベルの核酸転写に有用である。環状ベクターは発現サイレンシング細菌配列を欠くことを特徴としている。例えば、ミニサークルベクターは、それらが複製起点を欠き、細菌プラスミド内に通常は存在する薬剤選択マーカー、例えば、β－ラクタマーゼ、ｔｅｔなどを欠くという点で細菌プラスミドベクターとは異なる。その結果、ミニサークルＤＮＡのサイズはより小さくなり、より効率的な導入が可能となる。

【0280】

１つの例では、発現ベクターはウイルスベクターである。

【0281】

任意の適切なウイルスをベースにしたウイルスベクターを使用して、本開示のｄｄＲＮＡｉを導入してもよい。加えて、ハイブリッドウイルスシステムを使用してもよい。ウイルス導入システムの選択は、様々なパラメータ、例えば、導入の標的となる組織、そのシステムの形質導入効率、病原性、免疫学的懸念及び毒性懸念などに依存する。

【0282】

遺伝子治療に用いる一般に使用される部類のウイルスシステムは、それらのゲノムが宿主細胞のクロマチンに組み込まれる（オンコレトロウイルス及びレンチウイルス）か、または、主に染色体外エピソームとして細胞核内に残存する（アデノ随伴ウイルス、アデノウイルス及びヘルペスウイルス）かに応じ、２つのグループに分類することができる。１つの例では、本開示のウイルスベクターは宿主細胞のクロマチンに組み込まれる。別の例では、本開示のウイルスベクターは染色体外エピソームとして宿主細胞の核内に残存する。

【0283】

１つの例では、ウイルスベクターはアデノウイルス（ＡｄＶ）ベクターである。アデノウイルスは、２６～４８Ｋｂｐの線状ゲノムを有する中型の二本鎖非エンベロープＤＮＡウイルスである。アデノウイルスは、非分裂細胞と分裂細胞の両方における受容体を介した結合、及び核を貫通する内部移行により標的細胞に侵入する。アデノウイルスは生存及び複製において宿主細胞に非常に依存しており、脊椎動物細胞の核内において宿主の複製機構を利用して自己複製することができる。

【0284】

１つの例では、ウイルスベクターはパルボウイルス科由来である。パルボウイルスは、約５０００ヌクレオチド長のゲノムを有する小型の一本鎖非エンベロープＤＮＡウイルスのファミリーである。ファミリーメンバー内に含まれるのはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である。１つの例では、本開示のウイルスベクターはＡＡＶである。ＡＡＶは、増殖性感染周期を開始及び維持するのに、通常は別のウイルス（一般的にはアデノウイルスまたはヘルペスウイルス）との重感染を必要とする依存性パルボウイルスである。このようなヘルパーウイルスの不在下においてもなお、ＡＡＶは、非分裂細胞と分裂細胞の両方における受容体を介した結合、及び核を貫通する内部移行により標的細胞に感染または形質導入する能力を有する。ヘルパーウイルス不在下におけるＡＡＶ感染では子孫ウイルスが産生されないため、形質導入の度合いはウイルスに感染した最初の細胞のみに限定される。ＡＡＶを本開示の望ましいベクターとするのはこの特徴である。更に、レトロウイルス、アデノウイルス及び単純ヘルペスウイルスとは異なり、ＡＡＶはヒトへの病原性及び毒性を欠いていると考えられる（Ｋａｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．４２４：２５１（２００３））。ゲノムは通常２種の遺伝子のみをコードしているため、導入媒介物としてのＡＡＶが４．５一本鎖キロベース（ｋｂ）のパッケージング容量に制限されるということは驚くべきことではない。しかしながら、このサイズ制限が遺伝子置換療法用に導入可能な遺伝子を限定し得るとはいえ、ｓｈｍｉＲ及びｓｈＲＮＡなどのより短い配列のパッケージング及び発現に悪影響を及ぼすことはない。

【0285】

本開示のｄｄＲＮＡｉ構築物に有用な別のウイルス導入システムは、レトロウイルス科のウイルスをベースにしたシステムである。レトロウイルスは、２つの固有の特性を特徴とする一本鎖ＲＮＡ動物ウイルスを含む。第一に、レトロウイルスのゲノムは二倍体であり、ＲＮＡの２つのコピーからなる。第二に、このＲＮＡは、ビリオン関連逆転写酵素によって二本鎖ＤＮＡに転写される。この二本鎖ＤＮＡすなわちプロウイルスは、その後、宿主ゲノム内に組み込まれ、宿主ゲノムの安定的に組み込まれた構成要素として親細胞から子孫細胞へと受け継がれ得る。

【0286】

一部の例では、ウイルスベクターはレンチウイルスである。レンチウイルスベクターは多くの場合、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ－Ｇ）で偽型化されており、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ｖｉｓａｎ－ｍａｅｄｉ（ヒツジにおいて脳炎（ビスナ）または肺炎を引き起こす）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）（ウマにおいて自己免疫性溶血性貧血及び脳症を引き起こす）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）（ネコにおいて免疫不全を引き起こす）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）（ウシにおいてリンパ節症及びリンパ球増加症を引き起こす）、及び、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）（非ヒト霊長類において免疫不全及び脳症を引き起こす）から誘導されている。ＨＩＶをベースにしたベクターは通常、親ゲノムの＜５％を保持し、ゲノムの＜２５％はパッケージング構築物内に組み込まれており、それにより、世代が複製能のあるＨＩＶに戻る可能性が最小限となる。下流の長末端反復配列における調節エレメントの欠失を含む自己不活性化ベクターの開発により、ベクターの動員に必要なパッケージングシグナルの転写が排除されることになり、バイオセーフティが更に増している。レンチウイルスベクターの使用における主な利点の１つは、導入細胞の細胞分裂後であったとしても、ほとんどの組織型または細胞型において遺伝子導入が持続的であるという点である。

【0287】

本開示の核酸及びｄｄＲＮＡｉ構築物由来のｓｈｍｉＲ及び／またはｓｈＲＮＡを発現させるために使用するレンチウイルスベース構築物は、レンチウイルスの５´及び３´長末端反復配列（ＬＴＲ）に由来する配列を含む。１つの例では、ウイルス性構築物はレンチウイルス由来の不活性化または自己不活性化３´ＬＴＲを含む。当該技術分野において周知の任意の方法を用い、自己不活性化により３´ＬＴＲを作製してもよい。例えば、３´ＬＴＲのＵ３エレメントは、そのエンハンサー配列、例えば、ＴＡＴＡボックス、Ｓｐ１部位及びＮＦ－κ Ｂ部位の欠失を含む。自己不活性化３´ＬＴＲの結果として、宿主ゲノムに組み込まれたプロウイルスは不活性化５´ＬＴＲを含む。ＬＴＲ配列は、あらゆる種に由来する任意のレンチウイルス由来のＬＴＲ配列であってもよい。レンチウイルスベース構築物はまた、ＭＭＬＶ遺伝子もしくはＭＳＣＶ遺伝子、ＲＳＶ遺伝子、または、哺乳動物遺伝子用の配列を組み込んでいてもよい。加えて、レンチウイルス５´ＬＴＲ由来のＵ３配列を、ウイルス性構築物内のプロモーター配列に置換してもよい。こうすることで、パッケージング細胞株から回収したウイルスの力価は上昇し得る。エンハンサー配列も含ませてもよい。

【0288】

当業者に周知のその他のウイルスシステムまたは非ウイルスシステムを使用して本発明のｄｄＲＮＡｉまたは核酸を目的の細胞に導入してもよく、それらシステムとしては、遺伝子欠失アデノウイルストランスポゾンベクター（Ｙａｎｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０：９９９－１００４（２００２）を参照のこと）、シンドビスウイルスまたはセムリキ森林ウイルスから誘導したシステム（Ｐｅｒｒｉ，ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４（２０）：９８０２－０７（２００２）を参照のこと）、ニューカッスル病ウイルスまたはセンダイウイルスから誘導したシステムが挙げられるがこれらに限定されない。

【0289】

本開示のｓｈｍｉＲ構築物またはｄｄＲＮＡｉ構築物の試験
細胞培養モデル
ＯＰＭＤの細胞培養モデルとして有用な細胞株の１つの例は、正常Ａｌａ１０－ヒトＰＡＢＰＮ１－ＦＬＡＧ（Ａｌａ１０）または変異Ａｌａ１７－ヒトＰＡＢＰＮ１－ＦＬＡＧ（Ａｌａ１７）（後者はＯＰＭＤの特徴）を発現するベクターをトランスフェクションしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞株（ＨＥＫ２９３Ｔ、ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＵＳＡ）である。

【0290】

ＯＰＭＤの細胞培養モデルとして有用な細胞株の更なる例は、例えば、実施例５に記載のＣ２Ｃ１２マウス筋細胞及びＡＲＰＥ－１９ヒト網膜細胞である。

【0291】

ＯＰＭＤの細胞培養モデルとして有用な細胞株の別の例は、正常Ａｌａ１０－ヒトＰＡＢＰＮ１－ＦＬＡＧ（Ａｌａ１０）または変異Ａｌａ１７－ヒトＰＡＢＰＮ１－ＦＬＡＧ（Ａｌａ１７）のいずれかを発現するように安定的にトランスフェクションされた初代マウス筋芽細胞（ＩＭ２）細胞株である。変異Ａｌａ１７－ヒトＰＡＢＰＮ１－ＦＬＡＧ（Ａｌａ１７）を安定的に発現する例示的なＩＭ２由来細胞株はＨ２ｋＢ－Ｄ７ｅ細胞株である。Ｈ２ｋＢ－Ｄ７ｅ細胞株についてはまた、Ｒａｚ ｅｔ ａｌ．，（２０１１）Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，１７９（４）：１９８８－２０００に記載されている。

【0292】

ＯＰＭＤの細胞培養モデルに好適なその他の細胞株は当該技術分野において周知であり、例えば、Ｆａｎ ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１０：２３４１－２３５１，Ｂａｏ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７７：１２２６３－１２２６９，及びＡｂｕ－Ｂａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１２：２６０９－２６２３に記載されている。

【0293】

本明細書において例示しているとおり、ｓｈｍｉＲをコードする核酸、または、その核酸を含むｄｄＲＮＡｉ構築物もしくは発現ベクターを細胞に投与してから、ＰＡＢＰＮ１遺伝子がコードするＲＮＡまたはタンパク質の発現のレベルを測定することにより、本開示のｓｈｍｉＲの活性を測定する。例えば、ＰＡＢＰＮ１に特異的な１種または複数種のプローブまたはプライマーを使用して、ストリンジェントな条件下、ＲＴ－ＰＣＲ、定量ＰＣＲ、半定量ＰＣＲまたはｉｎ－ｓｉｔｕハイブリダイゼーションのうちのいずれか１つまたは複数により、細胞内のＰＡＢＰＮ１遺伝子発現をアッセイすることができる。ＰＡＢＰＮ１に特異的な１種または複数種のプローブまたはプライマーを使用したＰＣＲ、または、ＰＡＢＰＮ１タンパク質の検出に使用可能なＥＬＩＳＡのいずれかにより、ＰＡＢＰＮ１ ｍＲＮＡまたはＤＮＡもアッセイすることができる。

【0294】

ＰＡＢＰＮ１発現を検出するためのＲＴ－ＰＣＲ、定量ＰＣＲまたは半定量ＰＣＲ技術に使用可能なポリヌクレオチドは周知であり、市販（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）されている。しかしながら、ＰＣＲベースの検出法に有用なポリヌクレオチドについては、当該技術分野において周知の方法及び／またはソフトウェアを使用しＰＡＢＰＮ１について入手可能な配列情報をベースにして設計することができる。１つの例では、当該技術分野において周知の標準的な方法を用いＲＴ－ＰＣＲを使用して、ＰＡＢＰＮ１ ｍＲＮＡの有無を検出してもよい。１つの例では、ウェスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ、もしくは、当該技術分野において利用可能なその他の標準的な定量もしくは半定量技術、または、このような技術の組み合わせのうちのいずれか１つまたは複数を使用して、ＰＡＢＰＮ１ポリペプチドまたはタンパク質の有無または相対量を検出してもよい。ＰＡＢＰＮ１の抗体認識に依存する技術が考えられ、本明細書、例えば、実施例４に記載されている。１つの例では、ＰＡＢＰＮ１ポリペプチドの抗体捕捉法と捕捉したＰＡＢＰＮ１ポリペプチドの電気泳動分離法の組み合わせを含む技術、例えば、Ｉｓｏｎｏｓｔｉｃ（商標）Ａｓｓａｙ（Ｔａｒｇｅｔ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ｉｎｃ．）を使用して、ＰＡＢＰＮ１ポリペプチドの有無または相対存在度を検出してもよい。ＰＡＢＰＮ１タンパク質用の抗体は市販されている。

【0295】

トランスフェクション効率または形質導入効率及び試料回収率における差異を正規化するための様々な方法は当該技術分野において周知である。

【0296】

本開示のＲＮＡの不在下でＰＡＢＰＮ１がコードするｍＲＮＡ発現またはタンパク質のレベル、または、ＰＡＢＰＮ１タンパク質の核凝集の量と比較して、ＰＡＢＰＮ１がコードするｍＲＮＡまたはタンパク質の発現を抑制する、または、ＰＡＢＰＮ１タンパク質の核凝集の存在を抑制する本開示の核酸、ｄｄＲＮＡｉ構築物または発現ベクターは、治療適用、例えば、内在性ＰＡＢＰＮ１の発現を抑制して、内在性ＰＡＢＰＮ１の一部または全てを本明細書に記載のＯＰＭＤの原因とはならないＰＡＢＰＮ１タンパク質に置換することによるＯＰＭＤの治療に有用であると考えられる。

【0297】

動物モデル
ＯＰＭＤの研究に利用可能な小型動物モデルにはいくつかあり、その例については、Ｕｙａｍａ ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ａｃｔａ Ｍｙｏｌｏｇｉｃａ，２４（２）：８４－８８及びＣｈａｒｔｉｅｒ ａｎｄ Ｓｉｍｏｎｅｌｉｇ（２０１３）Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ：ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，１０：ｅ１０３－１０７に記載されている。例示的な動物モデルは、Ｄａｖｉｅｓ ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１１：６７２－６７７及びＴｒｏｌｌｅｔ ｅｔ ａｌ．，（２０１０）Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９（１１）：２１９１－２２０７に以前記載されたＡ１７．１トランスジェニックマウスモデルである。

【0298】

上記動物モデルのいずれかを使用して、本開示のｓｈｍｉＲまたはｄｄＲＮＡｉ構築物が、ＰＡＢＰＮ１遺伝子によりコードされるＲＮＡまたはタンパク質の発現をノックダウン、抑制または阻害する効果を確認してもよい。

【0299】

細胞モデルに関しＰＡＢＰＮ１遺伝子発現をアッセイするための方法について本明細書で説明してきたが、本開示のこの例に準用されると解釈されるべきである。

【0300】

機能性ＰＡＢＰＮ１を補充するための薬剤
１つの例では、本開示は、機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質を、例えば、細胞または動物に補充するための薬剤を提供する。機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質はＯＰＭＤの原因とはならず、本開示のｓｈｍｉＲ（複数可）またはｓｈＲＮＡ（複数可）が標的とするｍＲＮＡ転写物によりコードされない。

【0301】

１つの例では、機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質を細胞または動物に補充するための薬剤は、機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードする核酸、例えば、ＤＮＡまたはｃＤＮＡなどである。例えば、機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードする核酸は、コドン最適化（例えば、野生型ＰＡＢＰＮ１核酸と比較して１つまたは複数の変性塩基またはゆらぎ塩基を含有するが同一アミノ酸をコードすることにより、機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードする対応するｍＲＮＡ配列が本開示のｓｈｍｉＲ（複数可）またはｓｈＲＮＡ（複数可）によって認識されないようになる）されてもよい。例えば、機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードするコドン最適化核酸は、野生型ＰＡＢＰＮ１核酸と比較して、本開示のｓｈｍｉＲ（複数可）またはｓｈＲＮＡ（複数可）が標的とする領域内に１つまたは複数の変性塩基またはゆらぎ塩基を含んでいてもよい。１つの例では、１つまたは複数の変性塩基またはゆらぎ塩基は、本開示のｓｈｍｉＲまたはｓｈＲＮＡのエフェクター配列のシード領域内に存在する。

【0302】

１つの例では、機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードする核酸は、その対応するｍＲＮＡ配列が本開示のｓｈｍｉＲ（複数可）またはｓｈＲＮＡ（複数可）によって認識されないようにコドン最適化される。コドン最適化核酸配列がコードする機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質は、配列番号：７４に記載のアミノ酸配列、すなわち、野生型ヒトＰＡＢＰＮ１タンパク質のアミノ酸配列を含むことが好ましい。機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードするのに使用可能な多数のヌクレオチド配列の組み合わせが存在しており、ヌクレオチド配列の選択は最終的に、ｓｈｍｉＲ（複数可）またはｓｈＲＮＡ（複数可）のエフェクター配列（すなわち、コドン最適化核酸がｓｈｍｉＲ（複数可）またはｓｈＲＮＡ（複数可）によって認識されないように）に依存することを当業者は理解する。１つの例では、機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質を補充するための薬剤は、配列番号：７３に記載の配列を含む核酸である。１つの例では、機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードする核酸はまたコザック配列を含んでいてもよい。

【0303】

１つの例では、機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードするコドン最適化核酸は、機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質の発現に好適なプロモーターに機能的に連結する。眼または筋肉の組織内における機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質の発現に好適なプロモーターが特に好適であり得る。機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードする核酸と共に使用するのに好適な１つの例示的なプロモーターはＳｐｃ５１２プロモーターである。機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードする核酸と共に使用するのに好適な別の例示的なプロモーターはＣＫ８プロモーターである。しかしながら、当該技術分野において周知の任意の好適なプロモーターを使用してもよい。例えば、機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードする核酸と共に使用するその他の好適なプロモーターについてはＵＳ２０１１０２１２５２９Ａ１に記載されている。

【0304】

本明細書に記載するとおり、本開示の一部の例において有用なプロモーターは組織特異的または細胞特異的であってもよい。

【0305】

１つの例では、本開示の機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードするコドン最適化核酸は、機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質及びその対応するｍＲＮＡ転写物の発現を増加させるための１種または複数種のエンハンサーを追加的に含んでいてもよい。本開示のこの例に使用するのに適切なエンハンサーは当業者に周知である。

【0306】

機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードする核酸は発現ベクター内に含まれていてもよい。例示的な発現ベクターについて本開示の核酸及びｄｄＲＮＡｉ構築物との関係から説明してきたが、この例に準用されると解釈されるべきである。

【0307】

それゆえ、１つの例では、機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質を細胞または動物に補充するための薬剤は、機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードするコドン最適化核酸を含む発現ベクターであってもよい。例えば、本開示の発現ベクターは、機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードするコドン最適化核酸及びその核酸を発現させるためのプロモーター、例えば、Ｓｐｃ５１２プロモーターまたはＣＫ８プロモーターを含んでいてもよい。１つの例では、機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードするコドン最適化核酸はまたコザック配列を含んでいてもよい。

【0308】

１つの例では、本明細書に記載の機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードする核酸はプラスミド発現ベクター内に含まれていてもよい。好適なプラスミド発現ベクターについては本明細書で説明しており、当該技術分野において周知である。１つの例では、好適なプラスミド発現ベクターはｐＡＡＶベクター、例えば、ｐｓｃＡＡＶプラスミドベクターまたはｐｓｓＡＡＶプラスミドベクターである。

【0309】

１つの例では、発現ベクターはミニサークルＤＮＡである。ミニサークルＤＮＡベクターについては本明細書で説明している。

【0310】

１つの例では、発現ベクターはウイルスベクターである。例えば、任意の適切なウイルスをベースにしたウイルスベクターを使用して、本開示の機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードするコドン最適化核酸を導入してもよい。加えて、ハイブリッドウイルスシステムを使用してもよい。ウイルス導入システムの選択は、様々なパラメータ、例えば、導入の標的となる組織、そのシステムの形質導入効率、病原性、免疫学的懸念及び毒性懸念などに依存する。

【0311】

遺伝物質を細胞または動物に導入するための例示的なウイルスシステムについて本開示のＲＮＡ及びｄｄＲＮＡｉ構築物との関係から説明してきたが、この例に準用されると解釈されるべきである。

【0312】

１つの例では、ウイルスベクターはＡＡＶである。

【0313】

１つの例では、ウイルスベクターはＡｄＶベクターである。

【0314】

１つの例では、ウイルスベクターはレンチウイルスである。

【0315】

当業者に周知のその他のウイルスシステムまたは非ウイルスシステムを使用して本開示の機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードするコドン最適化核酸を目的の細胞に導入してもよく、それらシステムとしては、遺伝子欠失アデノウイルストランスポゾンベクター（Ｙａｎｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０：９９９－１００４（２００２）を参照のこと）、シンドビスウイルスまたはセムリキ森林ウイルスから誘導したシステム（Ｐｅｒｒｉ，ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４（２０）：９８０２－０７（２００２）を参照のこと）、ニューカッスル病ウイルスまたはセンダイウイルスから誘導したシステムが挙げられるがこれらに限定されない。

【0316】

本明細書に記載の機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードするコドン最適化核酸を本開示の核酸、ｄｄＲＮＡｉ構築物または発現ベクターと共に提供する例によれば、機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードするコドン最適化核酸は、核酸またはｄｄＲＮＡｉ構築物と同一の発現ベクター内に含まれていてもよい。それゆえ、機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードするコドン最適化核酸及び本開示の核酸またはｄｄＲＮＡｉ構築物を、例えば、発現ベクター内の単一のＤＮＡ構築物として提供してもよい。

【0317】

本開示の機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードするコドン最適化核酸と本開示の核酸またはｄｄＲＮＡｉ構築物を共に提供する代替例では、機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードするコドン最適化核酸と核酸またはｄｄＲＮＡｉ構築物は、異なる発現ベクター内に含まれていてもよい。機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードするコドン最適化核酸と核酸またはｄｄＲＮＡｉ構築物が異なる発現ベクター内に含まれる場合、それぞれの発現ベクターは、同一タイプのベクターまたは異なるタイプのベクターであってもよい。

【0318】

機能性ＰＡＢＰＮ１用の試験
細胞培養モデル
ＯＰＭＤの例示的な細胞培養モデルについて、実施例、例えば、実施例４及び５を含む本明細書に記載している。内在性ＰＡＢＰＮ１を標的とする本開示のｓｈｍｉＲをコードする１種または複数種の核酸の存在下で、本開示の薬剤が機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質を補充する能力を評価するために、ＯＰＭＤのこのような細胞培養モデルを使用してもよい。

【0319】

ＰＡＢＰＮ１タンパク質の有無または相対量を検出するための例示的な方法についても説明してきたが、この例に準用される。例えば、ウェスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ、もしくは、当該技術分野において利用可能なその他の標準的な定量もしくは半定量技術、または、このような技術の組み合わせのうちのいずれか１つまたは複数を使用して、ＰＡＢＰＮ１タンパク質の有無または相対量を検出してもよい。ＰＡＢＰＮ１の抗体認識に依存する技術が考えられ、本明細書に記載されている。変異ＰＡＢＰＮ１タンパク質及び機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質を適切なタンパク質タグ、例えば、ｍｙｃタグまたはＦＬＡＧタグと共に発現させて、市販されている適切な抗体を使用した変異ＰＡＢＰＮ１タンパク質及び機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質の特異的な検出を容易にしてもよい。例えば、変異ヒトＰＡＢＰＮ１タンパク質をＦＬＡＧタグと共に発現させてもよい。この方法では、細胞内における変異ＰＡＢＰＮ１タンパク質と機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質の両方の有無または相対量を個別に検出してから、その細胞に、本開示の１種または複数種の核酸（複数可）、ｄｄＲＮＡｉ構築物（複数可）または発現ベクター（複数可）及び本開示の機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質を補充するための薬剤（本明細書に記載するとおり、別々にまたは共に提供され得る）をトランスフェクションまたは形質導入してもよい。

【0320】

１つの例では、ＰＡＢＰＮ１ポリペプチドの抗体捕捉法と捕捉したＰＡＢＰＮ１ポリペプチドの電気泳動分離法の組み合わせを含む技術、例えば、Ｉｓｏｎｏｓｔｉｃ（商標）Ａｓｓａｙ（Ｔａｒｇｅｔ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ｉｎｃ．）を使用して、ＰＡＢＰＮ１ポリペプチドの有無または相対存在度を検出してもよい。ＰＡＢＰＮ１タンパク質用の抗体は市販されている。

【0321】

本開示の核酸（複数可）、ｄｄＲＮＡｉ構築物（複数可）または発現ベクター（複数可）（本開示の１種または複数種のｓｈｍｉＲ（複数可）を発現する）の存在下で、ＯＰＭＤの原因とはならないＰＡＢＰＮ１タンパク質を細胞内で発現する本開示の薬剤は、ＯＰＭＤを治療するのに有用であると考えられる。

【0322】

動物モデル
ＯＰＭＤを研究するための例示的な動物モデルについて説明してきた。

【0323】

上記動物モデルのいずれかを使用して、本開示の薬剤が、本開示の１種または複数種の核酸（複数可）、ｄｄＲＮＡｉ構築物（複数可）または発現ベクター（複数可）（本開示の１種または複数種のｓｈｍｉＲ（複数可）を発現する）の存在下で、機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をインビボで補充する効果を確認してもよい。

【0324】

細胞モデルに関しＰＡＢＰＮ１発現をアッセイするための方法について説明してきたが、本開示のこの例に準用されると解釈されるべきである。

【0325】

１つの例では、組織学的解析及び形態学的解析を使用して、本開示の薬剤が、本開示の１種または複数種の核酸（複数可）、ｄｄＲＮＡｉ構築物（複数可）または発現ベクター（複数可）（本開示の１種または複数種のｓｈｍｉＲ（複数可）を発現する）の存在下で、機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をインビボで補充する効果を確認してもよい。本開示の薬剤が機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をインビボで補充する効果を確認するために使用され得る更なるアッセイについては、Ｔｒｏｌｌｅｔ ｅｔ ａｌ．，（２０１０）Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９（１１）：２１９１－２２０７に記載されている。

【0326】

ｄｄＲＮＡｉ用の単一のＤＮＡ構築物及び機能性ＰＡＢＰＮ１の補充
本開示はまた、本明細書に記載の機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードする核酸及び本開示の１種または複数種のｄｄＲＮＡｉ構築物（複数可）を含む単一のＤＮＡ構築物を提供する。機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードする核酸及び本開示のｄｄＲＮＡｉ構築物を含む例示的なＤＮＡ構築物については実施例７に記載されている。１つの例では、ＤＮＡ構築物は、機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードする核酸と組み合わせて、本明細書に記載の単一のｄｄＲＮＡｉ構築物を含んでいてもよい。別の例では、ＤＮＡ構築物は、機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードする核酸と組み合わせて、複数種のｄｄＲＮＡｉ構築物を含んでいてもよい。ＤＮＡ構築物のそれぞれの例では、機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードするＤＮＡ配列は、そのｍＲＮＡ転写物がｄｄＲＮＡｉ構築物（複数可）のｓｈｍｉＲ（複数可）によって標的とされないようにコドン最適化される。

【0327】

１つの例では、機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質は、例えば、配列番号：７４に記載の配列を有する野生型ヒトＰＡＢＰＮ１タンパク質である。機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードするコドン最適化ＤＮＡ配列はｄｄＲＮＡｉ構築物がコードするｓｈｍｉＲ（複数可）に応じて様々であり得るということを理解されたい。つまり、修飾されるＰＡＢＰＮ１ ｍＲＮＡ転写物内における特定のコドンはｄｄＲＮＡｉ構築物がコードするｓｈｍｉＲ（複数可）のエフェクター配列（複数可）に応じて様々であり得る。１つの例では、機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードするコドン最適化ＤＮＡ配列は配列番号：７３に記載されている。

【0328】

ＤＮＡ構築物はまた、例えば、ｄｄＲＮＡｉ構築物がコードする機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質及び／またはｓｈｍｉＲの発現を駆動するための１種または複数種のプロモーターを含んでいてもよい。本開示の一部の例において有用なプロモーターは組織特異的または細胞特異的であってもよい。本開示のＤＮＡ構築物に使用する例示的なプロモーターは、例えば、Ｓｐｃ５１２及びＣＫ８などの筋特異的プロモーターである。しかしながら、当該技術分野において周知の任意の好適なプロモーターは、本明細書に記載のＤＮＡ構築物（例えば、ＵＳ２０１１０２１２５２９Ａ１に記載されているようなもの）に使用されると考えられる。

【0329】

ＤＮＡ構築物は、発現ベクターの形態で提供されてもよく、または、発現ベクター内に含まれていてもよい。好適な発現ベクターについては本明細書で説明しており、当該技術分野において周知である。

【0330】

１つの例では、発現ベクターはウイルスベクターである。例えば、任意の適切なウイルスをベースにしたウイルスベクターを使用して、本開示の単一のＤＮＡ構築物を導入してもよい。加えて、ハイブリッドウイルスシステムを使用してもよい。ウイルス導入システムの選択は、様々なパラメータ、例えば、導入の標的となる組織、そのシステムの形質導入効率、病原性、免疫学的懸念及び毒性懸念などに依存する。

【0331】

別の例では、好適なプラスミド発現ベクターはｐＡＡＶベクター、例えば、ｐｓｃＡＡＶプラスミドベクターまたはｐｓｓＡＡＶプラスミドベクターである。遺伝物質を細胞または動物に導入するためのその他の例示的なウイルスシステムについて本開示のｄｄＲＮＡｉ構築物との関係から説明してきたが、この例に準用されると解釈されるべきである。

【0332】

１つの例では、５´→３´方向に、筋特異的プロモーター、例えば、Ｓｐｃ５１２プロモーター、本明細書に記載のｄｄＲＮＡｉ構築物及び本明細書に記載のＰＡＢＰＮ１構築物を含む、ｐＡＡＶ発現ベクターの形態のＤＮＡ構築物を提供し、例えば、ｄｄＲＮＡｉ構築物は、機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードする核酸の３´非翻訳領域（ＵＴＲ）に位置する。この例によるＤＮＡ構築物は図１２Ａに図示されている。

【0333】

この例による例示的なＤＮＡ構築物は、５´→３´方向に、
（ａ）筋特異的プロモーター、例えば、Ｓｐｃ５１２、
（ｂ）ｄｄＲＮＡｉ構築物がコードするｓｈｍｉＲが標的としないｍＲＮＡ転写物を有する機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む本明細書に記載のＰＡＢＰＮ１構築物、及び、
（ｃ）本明細書に記載のｓｈｍｉＲ１７をコードするＤＮＡ配列を含む核酸及び本明細書に記載のｓｈｍｉＲ１３をコードするＤＮＡ配列を含む核酸を含む本開示のｄｄＲＮＡｉ構築物、
を含むｐＡＡＶ発現ベクターである。

【0334】

この例によれば、ＤＮＡ構築物は、配列番号：７２に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなっていてもよい。

【0335】

この例による別の例示的なＤＮＡ構築物は、５´→３´方向に、
（ａ）筋特異的プロモーター、例えば、Ｓｐｃ５１２、
（ｂ）ｄｄＲＮＡｉ構築物がコードするｓｈｍｉＲが標的としないｍＲＮＡ転写物を有する機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む本明細書に記載のＰＡＢＰＮ１構築物、及び、
（ｃ）本明細書に記載のｓｈｍｉＲ３をコードするＤＮＡ配列を含む核酸及び本明細書に記載のｓｈｍｉＲ１４をコードするＤＮＡ配列を含む核酸を含む本開示のｄｄＲＮＡｉ構築物、
を含むｐＡＡＶ発現ベクターである。

【0336】

この例によれば、ＤＮＡ構築物は、配列番号：７１に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなっていてもよい。

【0337】

別の例では、５´→３´方向に、第１の筋特異的プロモーター、例えば、ＣＫ８プロモーター、本明細書に記載のＰＡＢＰＮ１構築物、第２の筋特異的プロモーター、例えば、Ｓｐｃ５１２プロモーター、及び本明細書に記載のｄｄＲＮＡｉ構築物を含む、ｐＡＡＶ発現ベクターの形態のＤＮＡ構築物を提供し、第１の筋特異的プロモーターと第２の筋特異的プロモーターはそれぞれ、ＰＡＢＰＮ１構築物とｄｄＲＮＡｉ構築物に機能的に連結する。この例によるＤＮＡ構築物は図１２Ｂに図示されている。例えば、ＰＡＢＰＮ１構築物と機能的に連結するプロモーターは、ＰＡＢＰＮ１構築物内に含まれる、機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードするＤＮＡ配列に機能的に連結し、ｄｄＲＮＡｉ構築物と機能的に連結するプロモーターは、本開示のｓｈｍｉＲをコードする１種または複数種の核酸と機能的に連結する。この例によるＤＮＡ構築物は図１２Ａに図示されている。

【0338】

この例による例示的なＤＮＡ構築物は、５´→３´方向に、
（ａ）筋特異的プロモーター、例えば、本明細書に記載のｓｈｍｉＲ１７をコードするＤＮＡ配列を含む核酸及び本明細書に記載のｓｈｍｉＲ１３をコードするＤＮＡ配列を含む核酸を含む本開示のｄｄＲＮＡｉ構築物の上流に配置されるＣＫ８プロモーター、及び、
（ｂ）筋特異的プロモーター、例えば、ｄｄＲＮＡｉ構築物がコードするｓｈｍｉＲが標的としないｍＲＮＡ転写物を有する機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む本明細書に記載のＰＡＢＰＮ１構築物の上流に配置されるＳｐｃ５１２プロモーター、
を含むｐＡＡＶ発現ベクターである。

【0339】

この例によれば、ＤＮＡ構築物は、配列番号：７０に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなっていてもよい。

【0340】

この例による別の例示的なＤＮＡ構築物は、５´→３´方向に、
（ａ）筋特異的プロモーター、例えば、本明細書に記載のｓｈｍｉＲ３をコードするＤＮＡ配列を含む核酸及び本明細書に記載のｓｈｍｉＲ１４をコードするＤＮＡ配列を含む核酸を含む本開示のｄｄＲＮＡｉ構築物の上流に配置されるＣＫ８プロモーター、及び、 （ｂ）筋特異的プロモーター、例えば、ｄｄＲＮＡｉ構築物がコードするｓｈｍｉＲが標的としないｍＲＮＡ転写物を有する機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む本明細書に記載のＰＡＢＰＮ１構築物の上流に配置されるＳｐｃ５１２プロモーター、
を含むｐＡＡＶ発現ベクターである。

【0341】

この例によれば、ＤＮＡ構築物は、配列番号：６９に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなっていてもよい。

【0342】

本開示のＤＮＡ構築物内に含まれる、ｓｈｍｉＲ１３とｓｈｍｉＲ１７をコードする例示的なｄｄＲＮＡｉ構築物は、配列番号：３１に記載のエフェクター配列及び配列番号：３１に記載の配列に対して実質的に相補的なエフェクター相補配列、例えば、配列番号：３０に記載のエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ１３）をコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、及び、配列番号：３９に記載のエフェクター配列及び配列番号：３９に記載の配列に対して実質的に相補的なエフェクター相補配列、例えば、配列番号：３８に記載のエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ１７）をコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸を含む。例えば、ＤＮＡ構築物のこの例によるｄｄＲＮＡｉ構築物は、配列番号：６４に記載のＤＮＡ配列（ｓｈｍｉＲ１３）を含むかまたはそれからなる核酸、及び、配列番号：６８に記載のＤＮＡ配列（ｓｈｍｉＲ１７）を含むかまたはそれからなる核酸、を含んでいてもよい。

【0343】

本開示のＤＮＡ構築物内に含まれる、ｓｈｍｉＲ３とｓｈｍｉＲ１４をコードする例示的なｄｄＲＮＡｉ構築物は、配列番号：１７に記載のエフェクター配列及び配列番号：１７に記載の配列に対して実質的に相補的なエフェクター相補配列、例えば、配列番号：１６に記載のエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ３）をコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、及び、配列番号：３３に記載のエフェクター配列及び配列番号：３３に記載の配列に対して実質的に相補的なエフェクター相補配列、例えば、配列番号：３４に記載のエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ１４）をコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸を含む。例えば、ＤＮＡ構築物のこの例によるｄｄＲＮＡｉ構築物は、配列番号：５７に記載のＤＮＡ配列（ｓｈｍｉＲ３）を含むかまたはそれからなる核酸、及び、配列番号：６５に記載のＤＮＡ配列（ｓｈｍｉＲ１４）を含むかまたはそれからなる核酸、を含んでいてもよい。

【0344】

特定の例について説明してきたが、本開示によるＤＮＡ構築物が、１種または複数種のｓｈｍｉＲをコードする本明細書に記載の任意のｄｄＲＮＡｉ構築物を含み得るということを理解されたい。例えば、実施例１～５に記載のｓｈｍｉＲをコードするｄｄＲＮＡｉ構築物は、本開示のＤＮＡ構築物内に含ませるのに特に好適であり得る。

【0345】

組成物及び担体
一部の例では、本開示の核酸（複数可）、ｄｄＲＮＡｉ構築物（複数可）または発現ベクター（複数可）を組成物内に提供する。一部の例では、本開示の機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードする核酸を組成物内に提供する。一部の例では、本開示の核酸（複数可）、ｄｄＲＮＡｉ構築物（複数可）または発現ベクター（複数可）を、本開示の機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードする核酸と共に組成物内に提供する。一部の例では、１種または複数種の核酸（複数可）またはｄｄＲＮＡｉ構築物（複数可）及び機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードする核酸を、組成物内における同一の発現ベクター内に提供する。

【0346】

本明細書に記載するとおり、発現ベクターは、本開示のｄｄＲＮＡｉ構築物を単独で、または、本開示の機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードするコドン最適化核酸と組み合わせて含んでいてもよい。本明細書において発現ベクター及び／またはその発現ベクターを含む組成物に言及する場合、それらは、（ｉ）本開示のｄｄＲＮＡｉ構築物を含む発現ベクターまたはその発現ベクターを含む組成物、（ｉｉ）本開示のｄｄＲＮＡｉ構築物と本開示の機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードするコドン最適化核酸の両方を含む発現ベクターまたはその発現ベクターを含む組成物、または、（ｉｉｉ）本開示の機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードするコドン最適化核酸を含む発現ベクターまたはその発現ベクターを含む組成物、を包含すると理解される。

【0347】

それゆえ、本開示の組成物は、（ｉ）本開示のｄｄＲＮＡｉ構築物を含む発現ベクター、及び、（ｉｉ）本開示の機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードするコドン最適化核酸を含む発現ベクター、を含んでいてもよい。代替的に、本開示の組成物は、本開示のｄｄＲＮＡｉ構築物を含む単一の発現ベクター、及び、本開示の機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードするコドン最適化核酸、を含んでいてもよい。

【0348】

更に別の例では、本開示のｄｄＲＮＡｉ構築物を含む発現ベクターは１種の組成物内に含まれていてもよく、本開示の機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードするコドン最適化核酸を含む発現ベクターは、例えば、共にパッケージ化される別の組成物内に提供されてもよい。

【0349】

本開示の組成物はまた、１種または複数種の薬学的に許容される担体または希釈剤を含んでいてもよい。例えば、組成物は、本開示の核酸（複数可）、ｄｄＲＮＡｉ構築物（複数可）または発現ベクター（複数可）を対象の筋肉に投与した後に対象の筋肉に導入するのに好適な担体を含んでいてもよい。

【0350】

一部の例では、担体は、脂質ベース担体、カチオン性脂質もしくはリポソーム核酸複合体、リポソーム、ミセル、ビロゾーム、脂質ナノ粒子、またはこれらの混合物である。

【0351】

一部の例では、担体は、カチオン性ポリマー－核酸複合体を形成するような生分解性ポリマーベースの担体である。例えば、担体は、本開示の１種または複数種の核酸（複数可）、ｄｄＲＮＡｉ構築物（複数可）または発現ベクター（複数可）を筋細胞または眼の組織に導入するのに好適なカチオン性ポリマー微粒子であってもよい。組成物を細胞に導入するためのカチオン性ポリマーの使用は当該技術分野において周知であり、例えば、Ｊｕｄｇｅ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ２５：４５７－４６２（２００５）に記載されている（その内容は参照により本明細書に組み込まれる）。例示的なカチオン性ポリマーベースの担体は、ポリエチレンイミンなどのカチオン性ＤＮＡ結合ポリマーである。本開示の核酸（複数可）、ｄｄＲＮＡｉ構築物（複数可）または発現ベクター（複数可）と複合体を形成するのに好適であり、それらを導入するのに好適なその他のカチオン性ポリマーとしては、ポリ（Ｌ－リジン）（ＰＬＬ）、キトサン、ＰＡＭＡＭデンドリマー、及び、ポリ（２－ジメチルアミノ）エチルメタクリレート（ｐＤＭＡＥＭＡ）が挙げられる。その他のポリマーとしてはポリβ－アミノエステルが挙げられる。これらは当該技術分野において周知のその他の好適なカチオン性ポリマーであり、Ｍａｓｔｒｏｂａｔｔｉｓｔａ ａｎｄ Ｈｅｎｎｉｎｋ，Ｎａｔｕｒｅ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，１１：１０－１２（２０１２），ＷＯ／２００３／０９７１０７及びＷＯ／２００６／０４１６１７に記載されている（それらの完全な内容は参照により本明細書に組み込まれる）。非経口の皮下注射、静脈注射及び吸入を含む様々な送達経路用に、このような担体製剤が開発されている。

【0352】

更なる例では、担体は、シクロデキストリンベースの担体、例えば、シクロデキストリンポリマー－核酸複合体などである。

【0353】

更なる例では、担体は、タンパク質ベースの担体、例えば、カチオン性ペプチド－核酸複合体などである。

【0354】

別の例では、担体は脂質ナノ粒子である。例示的なナノ粒子については、例えば、ＵＳ７５１４０９９に記載されている。

【0355】

一部の例では、本開示の核酸（複数可）、ｄｄＲＮＡｉ構築物（複数可）または発現ベクター（複数可）は、カチオン性脂質／コレステロール／ＰＥＧ－Ｃ－ＤＭＡ／ＤＳＰＣ（例えば、４０／４８／２／１０の比率）、カチオン性脂質／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ／ＤＳＰＣ（例えば、４０／４８／２／１０の比率）、または、カチオン性脂質／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ（例えば、６０／３８／２の比率）を含む脂質ナノ粒子組成物と配合される。一部の例では、カチオン性脂質は、ＤＭＡ中のＯｃｔｙｌ ＣＬ、ＤＭＡ中のＤＬ、Ｌ－２７８、ＤＬｉｎＫＣ２ＤＭＡまたはＭＣ３である。

【0356】

別の例では、本開示の核酸（複数可）、ｄｄＲＮＡｉ構築物（複数可）または発現ベクター（複数可）は、ＷＯ２０１０／０２１８６５、ＷＯ２０１０／０８０７２４、ＷＯ２０１０／０４２８７７、ＷＯ２０１０／１０５２０９またはＷＯ２０１１／０２２４６０に記載のカチオン性脂質製剤のうちのいずれかと配合される。

【0357】

別の例では、本開示の核酸（複数可）、ｄｄＲＮＡｉ構築物（複数可）または発現ベクター（複数可）は、例えば、核酸（複数可）、ｄｄＲＮＡｉ構築物（複数可）または発現ベクター（複数可）の導入を容易にするために、別の化合物にコンジュゲートされるかまたはその化合物と複合体を形成する。このようなコンジュゲートの非限定例（例えば、ＣＤＭ－ＬＢＡ、ＣＤＭ－Ｐｉｐ－ＬＢＡ、ＣＤＭ－ＰＥＧ、ＣＤＭ－ＮＡＧなど）については、ＵＳ２００８／０１５２６６１及びＵＳ２００４／０１６２２６０に記載されている。

【0358】

別の例では、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、本開示のＲＮＡもしくはｄｄＲＮＡｉまたは発現ベクターに共有結合する。結合したＰＥＧは、任意の分子量、例えば、約１００～約５０，０００ダルトン（Ｄａ）であってもよい。

【0359】

更にその他の例では、本開示の核酸（複数可）、ｄｄＲＮＡｉ構築物（複数可）または発現ベクター（複数可）は、例えば、ＷＯ９６／１０３９１、ＷＯ９６／１０３９０またはＷＯ９６／１０３９２に開示されている、ポリ（エチレングリコール）脂質（ＰＥＧ修飾リポソーム、すなわち、血中滞留性リポソームまたはステルスリポソーム）を含有する表面修飾リポソームを含む担体と配合される。

【0360】

一部の例では、本開示の核酸（複数可）、ｄｄＲＮＡｉ構築物（複数可）または発現ベクター（複数可）はまた、ポリエチレンイミンまたはその誘導体、例えば、ポリエチレンイミン－ポリエチレングリコール－Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＰＥＩ－ＰＥＧ－ＧＡＬ）誘導体またはポリエチレンイミン－ポリエチレングリコール－トリ－Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＰＥＩ－ＰＥＧ－トリＧＡＬ）誘導体などと配合するかまたはそれらと複合体を形成してもよい。

【0361】

その他の例では、本開示の核酸（複数可）、ｄｄＲＮＡｉ構築物（複数可）または発現ベクター（複数可）は、米国特許出願公開番号２００１／０００７６６６に記載されているような膜破壊剤と複合体を形成する。

【0362】

その他の担体としては、シクロデキストリン（例えば、Ｇｏｎｚａｌｅｚ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，１０，１０６８－１０７４；またはＷＯ０３／４６１８５を参照のこと）、ポリ（乳酸－グリコール酸共重合体）（ＰＬＧＡ）及びＰＬＣＡ微粒子（例えば、ＵＳ２００２１３０４３０を参照のこと）が挙げられる。

【0363】

本開示の核酸（複数可）、ｄｄＲＮＡｉ構築物（複数可）または発現ベクター（複数可）の生物学的安定性を高める物質、及び／または、組成物が選択的に筋細胞に局在する能力及び／または筋細胞を貫通する能力を高める物質を、組成物が含むことが望ましい。薬学的に許容される担体（例えば、生理食塩水）を用いて本開示の治療用組成物を投与してもよく、その担体は、投与方法及び投与経路ならびに標準的な薬学的手法に基づいて選択される。当業者は、本開示の１種または複数種の核酸（複数可）、ｄｄＲＮＡｉ構築物（複数可）または発現ベクター（複数可）を含む医薬組成物を容易に製剤化することができる。一部の例では、等張製剤を使用する。一般的に、等張性用の添加剤としては、塩化ナトリウム、ブドウ糖、マンニトール、ソルビトール及びラクトースを挙げることができる。一部の例では、リン酸緩衝食塩水などの等張液が好ましい。安定化剤としてはゼラチン及びアルブミンが挙げられる。一部の例では、血管収縮剤を製剤に加える。本開示による組成物は滅菌かつ発熱物質フリーで提供される。医薬品製剤に使用する好適な医薬品担体に加えて医薬必需品については、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（以前はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ），Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，（この分野における標準的な参考書）、及びＵＳＰ／ＮＦに記載されている。

【0364】

とりわけ、炎症反応などの毒性を最小化しつつ細胞導入を最大化するために、医薬組成物の容量、濃度及び配合に加えて投与レジメンを調節してもよい（例えば、比較的大きな容量（５、１０、２０、５０ｍｌまたはそれ以上）で相対的に低濃度の活性成分に加え、必要に応じ、コルチコステロイドなどの抗炎症化合物を含有させて利用してもよい）。

【0365】

任意の好適な経路による投与用に本開示の組成物を製剤化してもよい。例えば、投与経路としては、筋肉内、腹腔内、皮膚内、皮下、静脈内、動脈内、眼内及び経口に加え、経皮もしくは吸入、または座薬が挙げられるがこれらに限定されない。例示的な投与経路としては、静脈内（ＩＶ）、筋肉内（ＩＭ）、経口、腹腔内、皮膚内、動脈内及び皮下注射が挙げられる。１つの例では、本開示の組成物はＩＭ投与用に製剤化される。このような組成物は薬剤用途に有用であり、好適な滅菌非発熱性溶媒、例えば、緩衝生理食塩水中で、注射用に、非経口投与用、例えば、ＩＭ投与用、静脈内投与用（静脈内注射を含む）、ＳＣ投与用、及び腹腔内投与用に容易に製剤化できる。一部の投与経路、例えば、ＩＭ、ＩＶ注射または注入などにより、筋組織への送達、及び、本開示のＰＡＢＰＮ１をコードするｄｄＲＮＡｉ構築物及び／またはコドン最適化核酸のトランスフェクション、ならびに、そこにおけるＲＮＡ及び／またはコドン最適化核酸の発現、を効果的に達成することができる。

【0366】

治療方法
１つの例では、ＯＰＭＤの原因となるＰＡＢＰＮ１タンパク質を含む内在性ＰＡＢＰＮ１タンパク質の対象における発現を阻害するために、本明細書に記載の１種または複数種の核酸（複数可）、ｄｄＲＮＡｉ構築物（複数可）、発現ベクター（複数可）、またはそれらを含む組成物（複数可）を使用する。

【0367】

１つの例では、本明細書に記載の１種または複数種の核酸（複数可）、ｄｄＲＮＡｉ構築物（複数可）、発現ベクター（複数可）、またはそれらを含む組成物（複数可）を使用して、ＯＰＭＤを患う対象におけるＯＰＭＤを治療してもよい。同様に、本明細書に記載の１種または複数種の核酸（複数可）、ｄｄＲＮＡｉ構築物（複数可）、発現ベクター（複数可）、またはそれらを含む組成物（複数可）を使用して、ＯＰＭＤを患うまたはＯＰＭＤに罹患しやすい対象におけるＯＰＭＤの１種または複数種の症状の発現または進行を予防してもよい。

【0368】

上記の例のそれぞれにおいて、本開示の発現ベクター及び／または組成物は、本開示のｄｄＲＮＡｉ構築物と本開示の機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードするコドン最適化核酸の両方を含んでいてもよい。それゆえ、発現ベクターまたは組成物の投与は、（ｉ）ＯＰＭＤの原因となる伸長ポリアラニントラクトを含むＰＡＢＰＮ１タンパク質を含む内在性ＰＡＢＰＮ１の発現を阻害、抑制またはノックダウンすること、及び、（ｉｉ）内在性ＰＡＢＰＮ１の発現を阻害、抑制またはノックダウンするｓｈｍｉＲまたはｓｈＲＮＡが標的としない機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質の発現をもたらすこと、に有効となり得る。それゆえ、本開示の組成物は、それを投与した細胞または動物におけるＰＡＢＰＮ１タンパク質の機能、例えば、ＲＮＡの転写後プロセシングを回復させることができる。

【0369】

別の例では、ＯＰＭＤの治療は、（ｉ）ＯＰＭＤの原因となるＰＡＢＰＮ１タンパク質の発現を阻害するための１種または複数種の薬剤と、（ｉｉ）本開示の機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードするコドン最適化核酸を含む発現ベクター、またはその発現ベクターを含む組成物を別々に対象に投与することを含んでいてもよい。本明細書に記載するとおり、ＯＰＭＤの原因となるＰＡＢＰＮ１タンパク質の発現を阻害するための１種または複数種の薬剤は、本明細書に記載の核酸、ｄｄＲＮＡｉ構築物、発現ベクター、もしくはそれらを含む組成物、または、それらの任意の１種または複数種のうちの複数種であってもよい。構成成分（ｉ）と（ｉｉ）を共に、同時にまたは連続で対象に投与してもよい。

【0370】

例えば、ＯＰＭＤの治療は、本開示の機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードするコドン最適化核酸を対象に投与することを含んでいてもよく、その対象は以前に、ＯＰＭＤの原因となるがコドン最適化核酸の発現を阻害しないＰＡＢＰＮ１タンパク質の発現を阻害するための１種または複数種の薬剤を投与されている。例えば、対象は以前に、本明細書に記載の核酸、ｄｄＲＮＡｉ構築物、発現ベクター、もしくはそれらを含む組成物、または、それらの任意の１種または複数種のうちの複数種を投与されていてもよい。

【0371】

上述したとおり、投与経路としては、筋肉内、腹腔内、皮膚内、皮下、静脈内、動脈内、眼内及び経口に加え、経皮もしくは吸入、または座薬が挙げられるがこれらに限定されない。例示的な投与経路としては、静脈内（ＩＶ）、筋肉内（ＩＭ）、経口、腹腔内、皮膚内、動脈内及び皮下注射が挙げられる。一部の投与経路、例えば、ＩＭ、ＩＶ注射または注入などにより、筋組織への送達、及び、本開示のＰＡＢＰＮ１をコードするｄｄＲＮＡｉ構築物及び／またはコドン最適化核酸のトランスフェクション、ならびに、そこにおけるｓｈｍｉＲまたはｓｈＲＮＡ及び／またはコドン最適化核酸の発現、を効果的に達成することができる。

【0372】

当業者は、ＯＰＭＤを患う対象を治療するのに必要となり得る、有効で非毒性量の本明細書に記載の核酸、ｄｄＲＮＡｉ構築物、発現ベクター、もしくはそれらを含む組成物、または、それらの任意の１種または複数種のうちの複数種を通常の実験で決定することができ得る。任意の個々の患者における治療有効投与濃度は、使用する組成物、患者の年齢、体重、全身健康、性別及び栄養、投与期間、投与経路、本明細書に記載の核酸、ｄｄＲＮＡｉ構築物、発現ベクター、もしくはそれらを含む組成物、または、それらの任意の１種または複数種のうちの複数種の滞留率、治療期間に加え、内科医学において周知のその他の関連因子を含む様々な因子によって決まる。

【0373】

本開示の核酸、ｄｄＲＮＡｉ構築物、発現ベクター、またはそれらを含む組成物が、ＯＰＭＤの原因となるＰＡＢＰＮ１タンパク質の発現を抑制または阻害する効果、及び、ＰＡＢＰＮ１機能を回復させるのに十分な量でＯＰＭＤの原因とはならない機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質を発現する効果は、治療した対象における筋収縮特性及び／または嚥下困難を評価することにより確認することができる。嚥下能力及び筋収縮特性を試験するための方法は当技術分野において周知である。例えば、ビデオ透視検査、ＵＧＩ内視鏡検査または食道マノメトリー及びインピーダンス検査を使用して嚥下困難を評価してもよい。ＯＰＭＤの臨床像を評価するためのその他の方法については、Ｒｕｅｇｇ ｅｔ ａｌ，．（２００５）Ｓｗｉｓｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｗｅｅｋｌｙ，１３５：５７４－５８６に記載されている。

【0374】

キット
本開示はまた、本開示の１種または複数種の核酸（複数可）、ｄｄＲＮＡｉ構築物（複数可）、発現ベクター（複数可）、またはそれらを含む組成物をキットの形態で提供する。キットは容器を含んでいてもよい。キットは通常、本開示の１種または複数種の核酸（複数可）、ｄｄＲＮＡｉ構築物（複数可）、発現ベクター（複数可）、またはそれらを含む組成物を、それまたはそれらを投与するための取扱説明書と共に含有する。一部の例では、キットは、本開示の２種以上の核酸、ｄｄＲＮＡｉ構築物、発現ベクター、またはそれらを含む組成物を含有する。１つの例では、キットは、（ｉ）本開示の１種または複数種の核酸（複数可）、ｄｄＲＮＡｉ構築物（複数可）、発現ベクター（複数可）、またはそれらを含む組成物を含む、ＯＰＭＤの原因となるＰＡＢＰＮ１タンパク質の発現を抑制または阻害するための第１のキット構成成分、及び、（ｉｉ）第２のキット構成成分としての、本開示の機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードするコドン最適化核酸を含む発現ベクター、またはその発現ベクターを含む組成物、を含む。第１のキット構成成分と第２のキット構成成分はキット内に共にパッケージ化されてもよい。
表１－ＰＡＢＰＮ１内における標的領域

【実施例】

【0375】

実施例１－ＰＡＢＰＮ１を標的とするｓｈｍｉＲの設計
一般に利用可能なｓｉＲＮＡ設計アルゴリズム（Ａｍｂｉｏｎ、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｏｒｉｇｅｎｅ及びＭＷＧを含む）を使用して、ｓｉＲＮＡ構築物の設計に対する潜在的な標的を示す配列をＰＡＢＰＮ１ ｍＲＮＡ配列から同定したが、選択した配列は、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ及びマウス種に保存されていた。５´隣接領域（配列番号：４１）、ｓｉＲＮＡセンス鎖配列（エフェクター相補配列）、ステム／ループ接合部配列（配列番号：４０）、ｓｉＲＮＡアンチセンス鎖（エフェクター配列）及び３´隣接領域（配列番号：４２）を含む低分子ヘアピンマイクロＲＮＡ（ｓｈｍｉＲ）をコードする配列を作製するために、候補ｓｉＲＮＡをコードする配列をｐｒｅ－ｍｉＲ３０ａスキャフォールドに組み込んだ。代表的なｓｈｍｉＲの予測二次構造を図１に示す。設計したｓｈｍｉＲ用のＰＡＢＰＮ１ ｍＲＮＡ転写物の標的領域を表１に示し、対応するｓｈｍｉＲエフェクター配列（アンチセンス鎖）を表２に示す。

【0376】

実施例２－デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイにおけるｓｈｍｉＲの活性
本開示のｓｈｍｉＲがＰＡＢＰＮ１転写物の発現をノックダウンする効果を試験するために、ＨＥＫ２９３細胞を用いてデュアルルシフェラーゼレポーターアッセイを実施した。

【0377】

ｐＧＬ３ルシフェラーゼレポーターベクターを構築した。野生型ＰＡＢＰＮ１またはコドン最適化ＰＡＢＰＮ１（ｗｔＰＡＢＰＮ１またはｏｐｔＰＡＢＰＮ１）のいずれかの完全コード配列をｐＧＬ３コントロールベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）に挿入することによりルシフェラーゼレポーターを作製した。ＦｓｅＩ制限酵素部位及びＸｂａＩ制限酵素部位を使用して、インサートをルシフェラーゼレポーター遺伝子の３´ＵＴＲにサブクローニングした。Ｕ６ ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターが駆動するｓｈｍｉＲ配列（表３に列挙している）を標的とするＰＡＢＰＮ１を含有する構築物をＤＮＡ２．０（Ｎｅｗａｒｋ，ＣＡ）において合成し、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒプラスミド骨格にサブクローニングした。

【0378】

ＨＥＫ２９３細胞株をＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から購入した。１０％ウシ胎児血清、２ｍＭのグルタミン、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）及びストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）を含有するＤＭＥＭ培地を用いて、加湿インキュベーター内、５％ＣＯ２下３７℃でＨＥＫ２９３細胞を培養した。簡潔に説明すると、トランスフェクションの１日前に、ＨＥＫ２９３細胞をウェルあたり２×１０^４個の細胞の密度で９６ウェル培養プレートに播種した。

【0379】

製造業者の取扱説明書に従いＦｕｇｅｎｅ ６（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して、ＰＡＢＰＮ１ ｓｈｍｉＲ発現構築物と、それらの対応するアンチセンスまたはセンスルシフェラーゼレポーター構築物とＲｅｎｉｌｌａコントロールレポーター構築物をＨＥＫ２９３細胞に共トランスフェクションした。０．３ｕＬのＦｕｇｅｎｅ ６を使用して、トランスフェクションのそれぞれのウェルに、１００ｎｇのＰＡＢＰＮ１ ｓｈｍｉＲの１種と、１０ｎｇの対応するルシフェラーゼレポーター構築物と１ｎｇのＲｅｎｉｌｌａコントロールレポーター構築物（トランスフェクションコントロールとしての役割を果たす）を共トランスフェクションした。トランスフェクションの４８時間後、細胞溶解液を回収し、Ｄｕａｌ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して解析を行った。それぞれのウェルのｆｉｒｅｆｌｙ／Ｒｅｎｉｌｌａ活性比率を求め、非標的化ｓｉＲＮＡ、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ対照（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，ＵＳＡ）に正規化することによりｓｈｍｉＲの阻害効率を計算した。ｐｓｉｌｅｎｃｅｒ対照と比較した、ｓｈｍｉＲのそれぞれにおけるセンス鎖及びアンチセンス鎖のＨＥＫ２９３細胞におけるｗｔＰＡＢＰＮ１レポーター構築物またはｏｐｔＰＡＢＰＮ１レポーター構築物の阻害率を図２及び図３に示す。

【0380】

図２及び図３から明らかなように、表２に示す例示的なｓｈｍｉＲのうちの１種（ｓｈｍｉＲ１１）を除く全てがｗｔＰＡＢＰＮ１ルシフェラーゼレポーターベクターから発現されるルシフェラーゼのレベルを下方制御した（図２）が、ｃｏＰＡＢＰＮ１（図３）レポーター由来の発現を下方制御しなかった。特に、ｓｈｍｉＲ－３、ｓｈｍｉＲ－４、ｓｈｍｉＲ－１３、ｓｈｍｉＲ－１４、ｓｈｍｉＲ－１６及びｓｈｍｉＲ－１７が、ＰＡＢＰＮ１標的ｍＲＮＡ配列に対して強力な阻害活性（陰性対照として無関係なｓｈＲＮＡで処理した細胞と比較して、７０％超のルシフェラーゼ活性の阻害と定義）を有する一方で、パッセンジャー鎖が認識する標的配列を含有するそれらの同種レポーターに対して弱い活性（３５％未満の阻害）を有することが示された。

【0381】

実施例３－ＰＡＢＰＮ１タンパク質発現のインビトロ下方制御
上記のルシフェラーゼ活性アッセイを用いて測定したＰＡＢＰＮ１発現の下方制御に基づいて、更なる解析用に、ｓｈｍｉＲ２、３、５、９、１３、１４、１６及び１７を選択した。それらがインビトロでＰＡＢＰＮ１を下方制御する能力を検査するために、実施例２に記載のＵ６プロモーターが駆動するプラスミドを含有するｓｈｍｉＲを２種の別の発現プラスミドと共に使用した。一方はＦＬＡＧタグ付きヒトｗｔＰＡＢＰＮ１（ｗｔ－ＰＡＢＰＮ１－ＦＬＡＧ、配列番号：７５）をコードし、もう一方は、ＦＬＡＧタグと共にヒトＰＡＢＰＮ１をコードするコドン最適化配列（ｃｏ－ＰＡＢＰＮ１－ＦＬＡＧ、配列番号：７６）を含む。

【0382】

細胞
２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、２ｍＭのグルタミン、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１×Ｐｅｎｓｔｒｅｐを含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）内で、ヒト胎児腎臓細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ、ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＵＳＡ）を増殖させた。

【0383】

処理
簡潔に説明すると、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１×１０^６個の細胞／ウェルで播種し、翌日、野生型ヒトＰＡＢＰＮ１（ｗｔ－ＰＡＢＰＮ１－ＦＬＡＧ）（配列番号：７５）を発現するプラスミド（１００ｎｇ／ウェル）またはコドン最適化ＰＡＢＰＮ１（ｃｏ－ＰＡＢＰＮ１－ＦＬＡＧ）（配列番号：７６）を発現するプラスミド（１００ ｎｇ／ウェル）と共にまたはそれ無しで、上記ｓｈｍｉＲプラスミドのうちの１種（３００ｎｇ／ウェル）をトランスフェクションした。対照として、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に非標的化ｓｉＲＮＡ配列を発現するｐＳｉｌｅｎｃｅｒ対照プラスミド（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，ＵＳＡ）をトランスフェクションした。完全ＤＭＥＭ培地内でＨＥＫ２９３Ｔ細胞を３７℃で７２時間インキュベートし、その後、細胞を回収し、ウェスタンブロットで細胞溶解液を解析した。

【0384】

ウェスタンブロット解析
ＮａＣｌ ０．１５Ｍ、０．１％ＳＤＳ、５０ｍＭのトリス（ｐＨ８）、２ｍＭのＥＤＴＡ、及びプロテアーゼ阻害薬カクテル（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ，Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を含む１０％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ－１００を含有するＲＩＰＡ緩衝液中で細胞をインキュベートすることにより細胞溶解液を調製した。

【0385】

４～１２％Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ ｇｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上でタンパク質を分離し、ｉＢｌｏｔ ２ドライブロッティングシステム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してニトロセルロース膜に転写した。ｉＢｉｎｄ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用し、ブロットをブロッキングして一次抗体及び二次抗体をプローブした。一次抗体（抗ｆｌａｇ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）及び抗Ｈｓｐ９０（Ｓｉｇｍａ））を１：５００希釈で使用する一方で、二次ＡＰコンジュゲート抗体（抗マウス及び抗ウサギ、Ｓｉｇｍａ）を１：６０００希釈で使用した。ＤＤＡＯ色素を使用してバンドを検出し、ＦＬＡ－３０００スキャナー（Ｆｕｊｉ）を使用して画像化した。

【0386】

得られたブロット及びＩｍａｇｅＪを使用して得た対照と比較したＰＡＢＰＮ１発現阻害率の定量について図４及び図５に示す。図４から明らかなように、実施例３で選択したｓｈｍｉＲの全ては＞９０％の阻害率で野生型ＰＡＢＰＮ１の発現をノックダウンし、試験した８種のｓｈｍｉＲのうちの７種は野生型ＰＡＢＰＮ１タンパク質の発現を＞９５％のレベルで阻害した。それに対し、ｓｈｍｉＲはコドン最適化ＰＡＢＰＮ１構築物の発現を阻害しなかった（図５）。

【0387】

実施例４－ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＰＡＢＰＮ１のｓｈｍｉＲ標的化遺伝子サイレンシング
本実施例では、ＰＡＢＰＮ１ ｓｈｍｉＲプラスミドがＰＡＢＰＮ１の内在性発現をインビトロでノックダウンする能力を明らかにする。

【0388】

細胞
２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、２ｍＭのグルタミン、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１×Ｐｅｎｓｔｒｅｐを含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）内で、ヒト胎児腎臓細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ、ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＵＳＡ）を増殖させた。

【0389】

処理
簡潔に説明すると、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１×１０^６個の細胞／ウェルで播種し、翌日、実施例２に記載のｓｈｍｉＲプラスミドのうちの１種（３００ｎｇ／ウェル）をトランスフェクションした。対照として、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に非標的化ｓｉＲＮＡ配列を発現するｐｓｉｌｅｎｃｅｒプラスミド（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，ＵＳＡ）をトランスフェクションした。完全ＤＭＥＭ培地内でＨＥＫ２９３Ｔ細胞を３７℃で７２時間インキュベートし、その後、細胞を回収し、ＲＮＡを抽出、逆転写してから、ｑＰＣＲで解析した。

【0390】

ｑＰＣＲ解析
上記のｓｈｍｉＲによるｍＲＮＡレベルにおけるＰＡＢＰＮ１の阻害レベルを定量するために、抽出したＲＮＡ試料に対してｑＰＣＲ解析を実施した。

【0391】

コドン最適化ＰＡＢＰＮ１を野生型ＰＡＢＰＮ１と区別するために、ＴａｑＭａｎ Ｐｒｉｍｅｒｓ ａｎｄ Ｐｒｏｂｅｓを設計して野生型ＰＡＢＰＮ１またはコドン最適化ＰＡＢＰＮ１を特異的に増幅させた。ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ ＴａｑＭａｎプライマー設計ツール（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ．ｃｏｍ／ｓｓｌ－ｂｉｎ／ａｐｐ／ｐｒｉｍｅｒ）を使用してプライマーを設計した。

【0392】

定量ＲＴ－ＰＣＲに使用した得られたプライマーの配列を以下に示す。
ｗｔＰＡＢＰＮ１－Ｆｗｄ ５´－ＡＴＧＧＴＧＣＡＡＣＡＧＣＡＧＡＡＧＡＧ－３´（配列番号：７７）
ｗｔＰＡＢＰＮ１－Ｒｅｖ ５´－ＣＴＴＴＧＧＧＡＴＧＧＣＣＡＣＴＡＡＡＴ－３´（配列番号：７８）
ｗｔＰＡＢＰＮ１－Ｐｒｏｂｅ ５´－ＣＧＧＴＴＧＡＣＴＧＡＡＣＣＡＣＡＧＣＣＡＴＧ－３´（配列番号：７９）
ｏｐｔＰＡＢＰＮ１－Ｆｗｄ ５´－ＡＣＣＧＡＣＡＧＡＧＧＣＴＴＣＣＣＴＡ－３´（配列番号：８０）
ｏｐｔＰＡＢＰＮ１－Ｒｅｖ ５´－ＴＴＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＴＧＴＡＧＴＴＧＧ－３´（配列番号：８１）
ｏｐｔＰＡＢＰＮ１－Ｐｒｏｂｅ ５´－ＴＧＧＴＣＣＧＧＧＣＴＣＴＧＴＡＣＣＴＡＧＣＣ－３´（配列番号：８２）

【0393】

製造業者の取扱説明書に従いＴｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して細胞溶解液からトータルＲＮＡを抽出した。ＮＤ－１０００ ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してＲＮＡ試料を定量した。製造業者の取扱説明書に従いＭｕｌｔｉｓｃｒｉｂｅ逆転写酵素（ＡＢＩ）を使用してＲＮＡ（１００ｎｇ）を逆転写した。１０ｕｌの総反応容量のＴａｑｍａｎ ｑＰＣＲマスターミックスを用いた定量ＰＣＲ反応にｃＤＮＡを使用した。ＰＣＲ反応は以下：５０℃で２分間、９５℃で１０分間、続いて、９５℃で１５秒間、６０℃で１分間を４０サイクル、のとおりに実施した。

【0394】

それぞれのｍＲＮＡの発現レベルをＧＡＰＤＨに正規化した。標準曲線で測定した総コピーに従い発現レベルを計算し、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ対照と比較した阻害率に変換した。

【0395】

例示的なｓｈｍｉＲにより得られたＨＥＫ２９３細胞における野生型ＰＡＢＰＮ１発現の阻害率を図６に示す。図６に示すとおり、ｓｈｍｉＲは、ＰＡＢＰＮ１の発現を１６．４％～４９．１％の範囲（平均３５．５％）の阻害率で下方制御した。

【0396】

実施例５－Ｃ２Ｃ１２マウス筋細胞及びＡＲＰＥ－１９ヒト網膜細胞におけるＰＡＢＰＮ１のｓｈｍｉＲ標的化遺伝子サイレンシング
ｑＰＣＲで測定したＨＥＫ２９３細胞におけるＰＡＢＰＮ１発現に対する例示的なｓｈｍｉＲによる低阻害率がＰＡＢＰＮ１の遺伝子発現における細胞株の差異によるものかどうかを確認するために、ＯＰＭＤに関連する解析用の別の細胞株、すなわち、Ｃ２Ｃ１２マウス筋細胞及びＡＲＰＥ－１９ヒト網膜細胞を選択した。

【0397】

細胞
２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、２ｍＭのグルタミン、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１×Ｐｅｎｓｔｒｅｐを含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）内で、Ｃ２Ｃ１２マウス筋細胞を増殖させた。

【0398】

ダルベッコ改変イーグル培地／Ｈａｍ’ｓ Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｆ－１２（ＤＭＥＭ／Ｆ１２）、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１×Ｐｅｎｓｔｒｅｐ内で、ＡＲＰＥ－１９ヒト網膜細胞を増殖させた。

【0399】

処理
簡潔に説明すると、Ｎｅｏｎエレクトロポレーションシステム（パルス電圧：１６５０、パルス幅：１０、パルス数：３）を使用して２×１０^５個のＣ２Ｃ１２細胞にエレクトロポレーションした。上記の単一のｓｈｍｉＲと２種のｓｈｍｉＲの組み合わせの両方（２μｇ／ウェル）を解析した。対照として、Ｃ２Ｃ１２細胞に非標的化ｓｉＲＮＡ配列を発現するｐＳｉｌｅｎｃｅｒプラスミド（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，ＵＳＡ）をエレクトロポレーションした。完全ＤＭＥＭ培地内でＣ２Ｃ１２細胞を３７℃で２４時間インキュベートし、その後、非トランスフェクト細胞の増殖を遅らせるために５０ｕｇ／ｍＬのヒグロマイシンを加え、続いて、エレクトロポレーションの４８時間後に、更に１００ｕｇ／ｍＬを加えた。７２時間時点で細胞を回収し、ｑＰＣＲ用にトータルＲＮＡを抽出した。

【0400】

以下の条件：パルス電圧：１３５０、パルス幅：２０、パルス数：２、を用いて、Ｎｅｏｎエレクトロポレーションシステムにより５×１０^６個のＡＲＰＥ－１９細胞にエレクトロポレーションした。２４時間時点で５０ｕｇ／ｍＬのヒグロマイシンを加え更なる添加を行わないこと以外はＣ２Ｃ１２細胞について上に記載したように細胞を処理した。ＲＮＡ抽出及びｑＰＣＲ解析用に、４８時間と７２時間の両方の時点でＡＲＰＥ－１９細胞を回収した。

【0401】

ｑＰＣＲ解析
実施例３で選択したｓｈｍｉＲによる阻害に応じた内在性ＰＡＢＰＮ１の発現を測定するのに使用したｗｔＰＡＢＰＮ１プライマー及びプローブを用いて、実施例４のＨＥＫ２９３細胞用に記載したとおりに逆転写酵素ｑＰＣＲを実施した。Ｃ２Ｃ１２細胞におけるｓｈｍｉＲ３、１３、１４、１７について３連で、ｓｈｍｉＲ２、５、９、１６について２連で、ｑＰＣＲを実施した。ＡＲＰＥ－１９細胞の２つの時点（４８時間及び７２時間）における単一の測定値を使用した。

【0402】

図７に示すとおり、ｓｈｍｉＲ１６（約４３％の阻害率）を除く個々のｓｈｍｉＲの全てが、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ対照と比較して、Ｃ２Ｃ１２細胞におけるＰＡＢＰＮ１の発現を約８０％の平均阻害率で下方制御した。

【0403】

最も効果的なｓｈｍｉＲ（ＰＡＢＰＮ１の阻害率で評価した）を、それらｓｈｍｉＲが組み合わされてＰＡＢＰＮ１の発現を阻害する能力を解析するために選択した。ｓｈｍｉＲ１３／１７の組み合わせ及びｓｈｍｉＲ３／１４の組み合わせを細胞に共エレクトロポレーションし、個々のｓｈｍｉＲについて上記のとおりｑＰＣＲでＰＡＢＰＮ１の発現を測定した。

【0404】

図８は、これらの組み合わせのｓｈｍｉＲがＣ２Ｃ１２細胞におけるＰＡＢＰＮ１の発現に対する効果を示したことを示している。ｓｈｍｉＲ１３／１７の共トランスフェクションは、個々のｓｈｍｉＲ１３とｓｈｍｉＲ１７それぞれの９２．５％と７６．７％と比較して、８４．４％のＰＡＢＰＮ１発現の阻害率をもたらした。ｓｈｍｉＲ３／１４の共トランスフェクションは、個々のｓｈｍｉＲ３とｓｈｍｉＲ１４それぞれの７６．２％と８０．４％と比較して、７９．０％の阻害率をもたらした。

【0405】

上と同じｓｈｍｉＲの組み合わせについて、それらｓｈｍｉＲがヒト細胞株、すなわち、ＡＲＰＥ－１９細胞においてＰＡＢＰＮ１発現を阻害する能力を試験した。上記のとおりに細胞を処理したが、４８時間及び７２時間時点においてｑＰＣＲで測定した得られたＰＡＢＰＮ１発現の阻害について図９に示している。７２時間後、ｓｈｍｉＲ１３／１７の共トランスフェクションは、個々のｓｈｍｉＲ１３とｓｈｍｉＲ１７それぞれの８３．９％と８９．８％と比較して、８７．９％のＰＡＢＰＮ１発現の阻害率をもたらした。ｓｈｍｉＲ３／１４の共トランスフェクションは、個々のｓｈｍｉＲ３とｓｈｍｉＲ１４の８２．２％と８１．６％と比較して、８７．４％の阻害率をもたらした。平均して、ＡＲＰＥ－１９細胞におけるＰＡＢＰＮ１発現の阻害率が４８時間と７２時間の間で１．１４倍上昇した。

【0406】

実施例６－ｑＰＣＲによるｓｈｍｉＲ発現の測定
上記の最も効果的なｓｈｍｉＲをトランスフェクションしたＣ２Ｃ１２細胞において発現したｓｈｍｉＲの総数を測定するためにｍｉＳｃｒｉｐｔアッセイを開発した。

【0407】

Ｑｉａｇｅｎ’ｓ ｍｉＳｃｒｉｐｔ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用して、Ｕ６ ｓｈｍｉＲ発現構築物によるｓｈｍｉＲ３、１３、１４及び１７の産生を測定した。Ｑｉａｇｅｎ’ｓ ｍｉＳｃｒｉｐｔ ＩＩ ＲＴ ｋｉｔを使用して、それぞれのＲＴ－ｑＰＣＲ解析用に、５０ｎｇのトータルＲＮＡをｃＤＮＡに変換した。その後、以下に記載のカスタムフォワードプライマーを含むＱｉａｇｅｎ ｍｉＳｃｒｉｐｔ ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ ｋｉｔを使用して、ｓｈＲＮＡの定量ＰＣＲを実施した。
ｓｈｍｉＲ３－ＦＷＤ ５´－ＴＴＣＡＴＣＴＧＣＴＴＣＴＣＴＡＣＣＴＣＧ－３´（配列番号：８３）
ｓｈｍｉＲ１３－ＦＷＤ ５´－ＡＧＧＧＧＡＡＴＡＣＣＡＴＧＡＴＧＴＣＧＣ－３´（配列番号：８４）
ｓｈｍｉＲ１４－ＦＷＤ ５´－ＣＴＣＡＴＡＴＴＣＡＴＣＴＧＣＴＴＣＴＣＴ－３´（配列番号：８５）
ｓｈｍｉＲ１７－ＦＷＤ ５´－ＡＴＴＣＡＴＣＴＧＣＴＴＣＴＣＴＡＣＣＴＣ－３´（配列番号：８６）

【0408】

Ｑｉａｇｅｎ ｍｉＳｃｒｉｐｔ ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ ｋｉｔにはリバースプライマーが提供されていた。以下のリアルタイムＰＣＲ条件：初期変性９５℃で１５分間、続いて、９４℃で１５秒間、５５℃で３０秒間及び７０℃で３０秒間を４０サイクル、を使用した。

【0409】

既知量の選択ｓｈｍｉＲを増幅することによりこれらのアッセイの標準曲線を生成したが、図１０にそれらを示している。ｓｈｍｉＲ３（図１０Ｂ）は非線形標準曲線を生成したが、使用したｑＰＣＲ緩衝液によって異なった。

【0410】

３３３個のＣ２Ｃ１２細胞における１０ｎｇのトータルＲＮＡの推定量に基づいて細胞あたりのＲＮＡのコピー数を計算した。個々に発現する際の、ｓｈｍｉＲ３、ｓｈｍｉＲ１３、ｓｈｍｉＲ１４及びｓｈｍｉＲ１７のそれぞれにおける細胞あたりのｓｈｍｉＲのコピーを測定した。図１１に示すとおり、ｓｈｍｉＲベクターを形質導入したＣ２Ｃ１２細胞における個々のｓｈＲＮＡ発現レベルは、ｓｈｍｉＲ３、１３、１４及び１７それぞれにおいて細胞あたり５１，６６３、１３，８２６、１１，５７６、及び１４，７９１のコピーと推定された。

【0411】

実施例７－内在性ＰＡＢＰＮ１の遺伝子サイレンシングとコドン最適化ＰＡＢＰＮ１への置換を同時に行うためのベクターの作製
内在性野生型ＰＡＢＰＮ１（ｗｔＰＡＢＰＮ１）の遺伝子サイレンシングとコドン最適化ＰＡＢＰＮ１（ｃｏＰＡＢＰＮ１）への置換を同時に誘導するために、ｏｐｔＰＡＢＰＮ１配列と共に、選択したｓｈｍｉＲのうちの１種または複数種を発現する一本鎖アデノ随伴ウイルス２型（ｓｓＡＡＶ２）プラスミドを作製する。２種の代替構築物を図１２Ａ及び図１２Ｂに示す。

【0412】

ｗｔＰＡＢＰＮ１を標的とする２種のｓｈｍｉＲをｐＡＡＶ２ベクター骨格におけるｏｐｔＰＡＢＰＮ１転写物の３´非翻訳領域にサブクローニングすることにより、第１の構築物、２型（図１２Ａ）を作製した。単一の転写物におけるｏｐｔＰＡＢＰＮ１との２種のｓｈｍｉＲの両方の発現は、筋特異的プロモーターＳｐｃ５１２により駆動される。ｗｔＰＡＢＰＮ１を標的とする２種のｓｈｍｉＲをｏｐｔＰＡＢＰＮ１転写物の上流にある配列にサブクローニングすることにより、第２の構築物、１型（図１２Ｂ）を作製した。この構築物においては、２種の転写物が発現しており、第１の転写物がＣＫ８プロモーターの制御下で２種のｓｈｍｉＲをコードし、第２の転写物がＳｐｃ５１２プロモーター下でｏｐｔＰＡＢＰＮ１をコードしている。

【0413】

組換え偽型化ＡＡＶベクターストックを作製する。簡潔に説明すると、１０％ＦＢＳを補足したダルベッコ改変イーグル培地内の細胞工場でＨＥＫ２９３Ｔ細胞を培養し、５％ＣＯ_２下３７℃でインキュベートする。製造業者の取扱説明書に従い、本実施例に記載のｐＡＡＶ－ｓｈｍｉＲウイルスプラスミド、ならびに、ｐＡＡＶｈｅｌｐｅｒ及びｐＡＡＶｒｅｐｃａｐ８プラスミドまたはｐＡＡＶｈｅｌｐｅｒ及びｐＡＡＶｒｅｐｃａｐ９プラスミドを、リン酸カルシウムと複合体を形成させる。その後、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてｐＡＡＶｈｅｌｐｅｒ及びｐＡＡＶｒｅｐｃａｐ８またはｐＡＡＶｒｅｐｃａｐ９と組み合わせたｐＡＡＶ－ｓｈｍｉＲプラスミドのそれぞれに対して３連トランスフェクションを実施する。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を５％ＣＯ_２下３７℃で７２時間の間培養し、その後、細胞を溶解し、それぞれのウイルスプラスミド用のｓｓＡＡＶ ｓｈｍｉＲ発現粒子をイオジキサノール（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で精製し、密度勾配超遠心分離に続き塩化セシウム超遠心分離を行う。定量的ポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ－ＰＣＲ）によりベクターゲノムの数を定量した。

【0414】

実施例８－ＯＰＭＤのマウスモデルにおけるインビボ有効性試験
動物
ＯＰＭＤの最も一般的なマウスモデル、Ａ１７マウスモデルで前臨床有効性試験を実施した。ウシ伸長（１７アラニン残基）ＰＡＢＰＮ１を過剰発現させることにより、ＦｖＢバックグラウンドを用いてこのマウスモデルを作製した。骨格筋におけるこの変異ＰＡＢＰＮ１の発現をヒトαアクチン筋特異的プロモーター（ＨＳＡ１）の制御下に置いた。両方の内在性マウスＰＡＢＰＮ１対立遺伝子は機能的であり、正常なマウスＰＡＢＰＮ１を発現する。それゆえ、マウスの表現型は、正常タンパク質よりも変異ＰＡＢＰＮ１の過剰発現に起因していた。最も重要なことに、Ａ１７マウスは、核内封入体（ＩＮＩ）の存在、線維症及び筋力低下を含むＯＰＭＤの臨床的徴候の多くを示す。インビボマウス有効性試験では、容易に扱うことが可能及び／またはマウスから容易に切除可能な最も大きな筋肉の１つである前脛骨筋（ＴＡ）への投薬及び解析に焦点を合わせたため、表現型改善を観察することがより容易となった。

【0415】

治療
局所筋肉注射による組換え発現構築物の投与用に、アデノ随伴ウイルス血清型９（ＡＡＶ９）カプシドを選択した。ＡＡＶ９に加え、ＡＡＶ８、ＡＡＶＲｈ７４を含む多数の異なる血清型のＡＡＶカプシドを試験した。Ｓｐｃ５１２合成筋肉プロモーターの制御下で蛍光タンパク質ＧＦＰを発現した組換えＡＡＶ９構築物（ＡＡＶ９－ｅＧＦＰ）を使用して、筋肉の形質導入を評価した。両方の性別のマウスのそれぞれのＴＡ筋に５０μｌの一本鎖ベクターを２ｅ１１総ベクターゲノムの用量で注射した。２０日後、マウスを屠殺し、注射した四肢に対してインビボイメージングによる検査を行った。

【0416】

結果
図１３に示すとおり、ＴＡ筋にＡＡＶ９－ｅＧＦＰ構築物を直接注射することにより、相当量の局所蛍光が四肢に検出されることになり、両方のベクターが筋細胞への形質導入に有効であり直接注射後に導入遺伝子発現がもたらされることを示唆している。

【0417】

実施例９－内在性ＰＡＢＰＮ１の遺伝子サイレンシングとコドン最適化ＰＡＢＰＮ１への置換を同時に行うための単一の「サイレンシング置換構築物」の作製
ｏｐｔＰＡＢＰＮ１配列と共にｓｈｍｉＲ１７及びｓｈｍｉＲ１３（例えば、表３及び表４に記載されている）を発現する一本鎖アデノ随伴ウイルス２型（ｓｓＡＡＶ２）プラスミドを作製した。

【0418】

ｓｈｍｉＲ１７及びｓｈｍｉＲ１３（表４に記載されている）をコードするＤＮＡ配列をｐＡＡＶ２ベクター骨格におけるｏｐｔＰＡＢＰＮ１転写物の３´非翻訳領域にサブクローニングすることにより、サイレンシング置換構築物（以下「ＳＲ－構築物」）を作製した（ｐＡＡＶ－ｓｈｍｉＲウイルスプラスミド）。単一の転写物におけるｏｐｔＰＡＢＰＮ１と２種のｓｈｍｉＲの両方の発現は、筋特異的プロモーターＳｐｃ５１２により駆動される。ＳＲ－構築物の概略図を図１４に示す。

【0419】

その後、組換え偽型化ＡＡＶベクターストックを作製した。簡潔に説明すると、１０％ＦＢＳを補足したダルベッコ改変イーグル培地内の細胞工場でＨＥＫ２９３Ｔ細胞を培養し、５％ＣＯ_２下３７℃でインキュベートした。製造業者の取扱説明書に従い、ｐＡＡＶ－ｓｈｍｉＲウイルスプラスミド、ならびに、ｐＡＡＶｈｅｌｐｅｒ及びｐＡＡＶｒｅｐｃａｐ８プラスミドまたはｐＡＡＶｈｅｌｐｅｒ及びｐＡＡＶｒｅｐｃａｐ９またはｐＡＡＶｈｅｌｐｅｒ及びｐＡＡＶＲＨ７４プラスミドを、リン酸カルシウムと複合体を形成させた。その後、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてｐＡＡＶｈｅｌｐｅｒ及び以下のカプシド；ｐＡＡＶｒｅｐｃａｐ８、ｐＡＡＶｒｅｐｃａｐ９またはｐＡＡＶＲＨ７４のうちの１つと組み合わせたｐＡＡＶ－ｓｈｍｉＲプラスミドに対して３連トランスフェクションを実施した。それから、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を５％ＣＯ_２下３７℃で７２時間の間培養し、その後、細胞を溶解し、ｓｓＡＡＶ ｓｈｍｉＲ発現粒子をイオジキサノール（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で精製し、密度勾配超遠心分離に続き塩化セシウム超遠心分離を行った。定量的ポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ－ＰＣＲ）によりベクターゲノムの数を定量した。

【0420】

実施例１０－単一ベクターの「サイレンシング置換」手法を用いたインビボ有効性試験 治療
ＯＰＭＤの関連疾患モデルにおける実施例９に記載のＳＲ－構築物のインビボ有効性を試験するために、１０～１２週齢のＡ１７マウスのＴＡ筋にＳＲ－構築物を高用量及び低用量の筋肉注射で個別に投与した。低用量は筋肉あたり１×１０^１０個のベクターゲノムに設定した。高用量は筋肉あたり６×１０^１０個のベクターゲノムに設定した。ＦＶＢ野生型マウスも健康な比較群に含まれるが、生理食塩水を注射した週齢が同じＡ１７マウスを未治療群とした。ＳＲ－構築物の用量の違いが疾患に及ぼす影響を試験することに加え、治療後１４週または２０週のいずれかの時点で独立したコホートのマウスを屠殺し、異なる時点に関連する有効性を評価した。屠殺時にＴＡ筋を採取してＲＮＡ及びタンパク質を抽出した。

【0421】

ｑＰＣＲ解析
ＰＡＢＰＮ１レベルのノックダウンを確認するために、ＴＡ筋から単離したＲＮＡをＱＰＣＲ解析で評価した。使用したＱＰＣＲプライマーは野生型ＰＡＢＰＮ１転写物と変異ＰＡＢＰＮ１転写物を識別不能であったが、コドン最適化ＰＡＢＰＮ１種に対応する配列を認識または増幅しなかった。高用量と低用量の両方のＳＲ－構築物において強力なノックダウンが認められ、それぞれ８８．３％と６８．３％のＰＡＢＰＮ１転写物抑制がもたらされた（図１５）。これらの組織を用いた別の解析では、個別の投与ベクターレベルに一致した比率のｓｈｍｉＲ導入遺伝子の存在が示された。

【0422】

同様に、コドン最適化ＰＡＢＰＮ１配列を選択的に増幅して正常野生型ＰＡＢＰＮ１配列と変異ＰＡＢＰＮ１配列を識別することが可能な一対のプライマーを使用するＱＰＣＲ解析を用いて、コドン最適化ＰＡＢＰＮ１部分の発現を確認した。

【0423】

これらのＱＰＣＲ解析では、ＳＲ－構築物を投与された動物が、ＦｖＢマウスにおける正常ＰＡＢＰＮ１レベルの９０．９％と１３．７％（平均）のコドン最適化ＰＡＢＰＮ１レベルをそれぞれ高用量と低用量で発現したことが示された（図１６）。

【0424】

まとめると、Ａ１７マウスモデルにおいて単一の転写物が、ＰＡＢＰＮ１（変異形態を含む）のレベルをノックダウンする能力を有する機能性ｓｈｍｉＲを産生可能であることが解析により確認された。同様に、これらのベクターは、ＰＡＢＰＮ１機能を回復させるための置換により、適切なレベルのコドン最適化ＰＡＢＰＮ１を同時に産生する。

【0425】

核内封入体（ＩＮＩ）
核内封入体（ＩＮＩ）の残存に対する動物におけるＳＲ－構築物の影響について、１４週目に試験を行った。図１７から明らかなように、Ａ１７マウスにおける全ＴＡ筋細胞のほぼ３５％が、ＩＮＩを示す緑色の点状染色を示した。Ｒｅｄ Ｌａｍｉｎｉｎ（筋細胞の細胞外マトリックスにおいて豊富なタンパク質）とＢｌｕｅ ＤＡＰＩの対比染色剤を使用して、細胞形状と核をそれぞれはっきりとさせた（図１８）。高用量と低用量の両方のＳＲ－構築物で治療した一連の連続切片にわたり、ＩＮＩの有意な抑制が認められた。

【0426】

筋肉量
動物の筋肉量の回復に対するＳＲ－構築物の影響についても、２０週目に試験を行った。

【0427】

Ａ１７マウス由来のＴＡ筋細胞の重量は、それらマウスのＦｖＢ野生型同等種由来の同様の筋肉と比較しておおよそ２５％軽かった。試験した両方の用量において、ＳＲ－構築物は、ほぼＦｖＢ野生型動物レベルへの筋肉量の有意な回復を示した（図１９）。

【0428】

筋力
最後に、動物の筋力の回復に対するＳＲ－構築物の影響について、２０週目に最大力測定による評価を行った。

【0429】

１５０ｍＨｚの周波数を較正点として用いると、Ａ１７マウスの最大力は、それらマウスの野生型ＦｖＢ同等種と比較しておおよそ３０％低かった（それぞれ１０５０ｎｍ対１５００ｎｍ）。ＳＲ－構築物を用いた治療により、ＦＶＢ野生型動物と比較した際にＡ１７マウスに認められたおおよそ６６％の筋力低下の差が回復し、最大力に適度な増加がもたらされた（図２０）。図２０の統計値は、Ａ１７生理食塩水マウスと比較した対応のないｔ検定で示している（^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１）。

【0430】

まとめると、このインビボ試験により本明細書で提供するデータは、ＳＲ－構築物を用いた治療がＡ１７モデルシステムにおけるＯＰＭＤ疾患の生理学的特徴に対して影響を及ぼすことを示している。

【0431】

本開示の広範で一般的な範囲を逸脱することなく、上記の実施形態に対して多数の変形形態及び／または修正を行うことができるということを当業者は理解する。そのため、本実施形態は、あらゆる点において、限定するものではなく例示と捉えられるものである。
以下、本発明の実施形態を示す。
（１）低分子ヘアピンマイクロＲＮＡ（ｓｈｍｉＲ）をコードするＤＮＡ配列を含む核酸であって、前記ｓｈｍｉＲは、
少なくとも１７ヌクレオチド長のエフェクター配列と、
エフェクター相補配列と、
ステムループ配列と、
プライマリーマイクロＲＮＡ（ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ）骨格と、
を含み、
前記エフェクター配列は、配列番号：１～１３のいずれか１つに記載のＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的である、
前記核酸。
（２）前記ｓｈｍｉＲは、
配列番号：１５に記載のエフェクター配列及び配列番号：１４に記載のエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲ、
配列番号：１７に記載のエフェクター配列及び配列番号：１６に記載のエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲ、
配列番号：１９に記載のエフェクター配列及び配列番号：１８に記載のエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲ、
配列番号：２１に記載のエフェクター配列及び配列番号：２０に記載のエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲ、
配列番号：２３に記載のエフェクター配列及び配列番号：２２に記載のエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲ、
配列番号：２５に記載のエフェクター配列及び配列番号：２４に記載のエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲ、
配列番号：２７に記載のエフェクター配列及び配列番号：２６に記載のエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲ、
配列番号：２９に記載のエフェクター配列及び配列番号：２８に記載のエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲ、
配列番号：３１に記載のエフェクター配列及び配列番号：３０に記載のエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲ、
配列番号：３３に記載のエフェクター配列及び配列番号：３２に記載のエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲ、
配列番号：３５に記載のエフェクター配列及び配列番号：３４に記載のエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲ、
配列番号：３７に記載のエフェクター配列及び配列番号：３６に記載のエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲ、及び、
配列番号：３９に記載のエフェクター配列及び配列番号：３８に記載のエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲ、
からなる群から選択される、
（１）に記載の核酸。
（３）前記ｓｈｍｉＲは、５´→３´方向に、
前記ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ骨格の５´隣接配列と、
前記エフェクター相補配列と、
前記ステムループ配列と、
前記エフェクター配列と、
前記ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ骨格の３´隣接配列と、
を含む、
（１）または（２）に記載の核酸。
（４）前記ステムループ配列は配列番号：４０に記載の配列である、（１）から（３）のいずれか１に記載の核酸。
（５）前記ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ骨格はｐｒｉ－ｍｉＲ－３０ａ骨格である、（１）から（４）のいずれか１に記載の核酸。
（６）前記ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ骨格の前記５´隣接配列は配列番号：４１に記載されており、前記ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ骨格の前記３´隣接配列は配列番号：４２に記載されている、（３）から（５）のいずれか１に記載の核酸。
（７）前記ｓｈｍｉＲは、配列番号：４３～５５のいずれか１つに記載の配列を含む、（１）から（６）のいずれか１に記載の核酸。
（８）前記ｓｈｍｉＲをコードする前記ＤＮＡ配列は、配列番号：５６～６８のいずれか１つに記載されている、（１）から（７）のいずれか１に記載の核酸。
（９）（ａ）（１）から（８）のいずれか１に記載の少なくとも１種の核酸と、
（ｂ）
（ｉ）（１）から（８）のいずれか１に記載の核酸、または、
（ｉｉ）少なくとも１７ヌクレオチド長のエフェクター配列及びエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲまたは低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をコードするＤＮＡ配列を含む核酸であって、前記エフェクター配列は、眼咽頭型筋ジストロフィー（ＯＰＭＤ）の原因となるＰＡＢＰＮ１タンパク質に対応するＲＮＡ転写物に対して実質的に相補的である、前記核酸、
から選択される少なくとも１種の更なる核酸と、
を含み、
（ａ）の前記核酸がコードする前記ｓｈｍｉＲと（ｂ）の前記核酸がコードする前記ｓｈｍｉＲまたはｓｈＲＮＡは、異なるエフェクター配列を含む、
複数種の核酸。
（１０）（１）から（８）のいずれか１に記載の核酸または（９）に記載の複数種の核酸を含むＤＮＡ特異的ＲＮＡ干渉（ｄｄＲＮＡｉ）構築物。
（１１）（１）から（８）のいずれか１に記載の少なくとも２種の核酸を含む（１０）に記載のｄｄＲＮＡｉ構築物であって、前記核酸のそれぞれは異なるｓｈｍｉＲをコードする、前記ｄｄＲＮＡｉ構築物。
（１２）前記少なくとも２種の核酸のそれぞれは、配列番号：１、２、４、７、９、１０及び１３のうちの１つに記載のＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的なエフェクター配列を含むｓｈｍｉＲをコードする、（１１）に記載のｄｄＲＮＡｉ構築物。
（１３）前記少なくとも２種の核酸は、
配列番号：１５に記載のエフェクター配列及び配列番号：１４に記載のエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ２）をコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、
配列番号：１７に記載のエフェクター配列及び配列番号：１６に記載のエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ３）をコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、
配列番号：２１に記載のエフェクター配列及び配列番号：２０に記載のエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ５）をコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、
配列番号：２７に記載のエフェクター配列及び配列番号：２６に記載のエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ９）をコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、
配列番号：３１に記載のエフェクター配列及び配列番号：３０に記載のエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ１３）をコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、
配列番号：３３に記載のエフェクター配列及び配列番号：３２に記載のエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ１４）をコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、及び、
配列番号：３９に記載のエフェクター配列及び配列番号：３８に記載のエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ１７）をコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、
からなる群から選択される、
（１１）または（１２）に記載のｄｄＲＮＡｉ構築物。
（１４）前記少なくとも２種の核酸は、
配列番号：５６（ｓｈｍｉＲ２）に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、配列番号：５７（ｓｈｍｉＲ３）に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、配列番号：５９（ｓｈｍｉＲ５）に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、配列番号：６２（ｓｈｍｉＲ９）に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、配列番号：６４（ｓｈｍｉＲ１３）に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、
配列番号：６５（ｓｈｍｉＲ１４）に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、及び、
配列番号：６８（ｓｈｍｉＲ１７）に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、
からなる群から選択される、
（１３）に記載のｄｄＲＮＡｉ構築物。
（１５）前記少なくとも２種の核酸のそれぞれは、配列番号：２、９、１０及び１３のうちの１つに記載のＲＮＡ転写物内における対応する長さの領域に対して実質的に相補的なエフェクター配列を含むｓｈｍｉＲをコードする、（１１）から（１４）のいずれか１に記載のｄｄＲＮＡｉ構築物。
（１６）前記少なくとも２種の核酸は、
配列番号：１７に記載のエフェクター配列及び配列番号：１６に記載のエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ３）をコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、
配列番号：３１に記載のエフェクター配列及び配列番号：３０に記載のエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ１３）をコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、
配列番号：３３に記載のエフェクター配列及び配列番号：３２に記載のエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ１４）をコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、及び、
配列番号：３９に記載のエフェクター配列及び配列番号：３８に記載のエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ１７）をコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、
からなる群から選択される、
（１１）から（１５）のいずれか１に記載のｄｄＲＮＡｉ構築物。
（１７）前記少なくとも２種の核酸は、
配列番号：５７（ｓｈｍｉＲ３）に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、配列番号：６４（ｓｈｍｉＲ１３）に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、
配列番号：６５（ｓｈｍｉＲ１４）に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、及び、
配列番号：６８（ｓｈｍｉＲ１７）に記載のＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸、
からなる群から選択される、
（１６）に記載のｄｄＲＮＡｉ構築物。
（１８）前記ｄｄＲＮＡｉ構築物は、
（ａ）配列番号：３１に記載のエフェクター配列及び配列番号：３０に記載のエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ１３）をコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸と、
（ｂ）配列番号：３９に記載のエフェクター配列及び配列番号：３８に記載のエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ１７）をコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸と、
を含む、
（１１）から（１７）のいずれか１に記載のｄｄＲＮＡｉ構築物。
（１９）前記ｄｄＲＮＡｉ構築物は、
（ａ）配列番号：６４（ｓｈｍｉＲ１３）に記載の前記ＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸と、
（ｂ）配列番号：６８（ｓｈｍｉＲ１７）に記載の前記ＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸と、
を含む、
（１８）に記載のｄｄＲＮＡｉ構築物。
（２０）前記ｄｄＲＮＡｉ構築物は、
（ａ）配列番号：１７に記載のエフェクター配列及び配列番号：１６に記載のエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ３）をコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸と、
（ｂ）配列番号：３３に記載のエフェクター配列及び配列番号：３２に記載のエフェクター相補配列を含むｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ１４）をコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなる核酸と、
を含む、
（１１）から（１７）のいずれか１に記載のｄｄＲＮＡｉ構築物。
（２１）前記ｄｄＲＮＡｉ構築物は、
（ａ）配列番号：５７（ｓｈｍｉＲ３）に記載の配列を含むかまたはそれからなる核酸と、
（ｂ）配列番号：６５（ｓｈｍｉＲ１４）に記載の配列を含むかまたはそれからなる核酸と、
を含む、
（２０）に記載のｄｄＲＮＡｉ構築物。
（２２）ｓｈｍｉＲをコードする前記核酸またはそれぞれの核酸の上流にあるＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターを含む、（１０）から（２１）のいずれか１に記載のｄｄＲＮＡｉ構築物。
（２３）前記ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターまたはそれぞれのＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターは、Ｕ６プロモーター及びＨ１プロモーターから選択される、（２２）に記載のｄｄＲＮＡｉ構築物。
（２４）前記ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターまたはそれぞれのＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターは、Ｕ６－９プロモーター、Ｕ６－１プロモーター及びＵ６－８プロモーターから選択されるＵ６プロモーターである、（２２）または（２３）に記載のｄｄＲＮＡｉ構築物。
（２５）（ａ）（１０）から（２４）のいずれか１に記載のｄｄＲＮＡｉ構築物と、
（ｂ）前記ｄｄＲＮＡｉ構築物がコードする前記ｓｈｍｉＲ（複数可）が標的としないｍＲＮＡ転写物を有する機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含むＰＡＢＰＮ１構築物と、
を含む、
ＤＮＡ構築物。
（２６）前記機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードする前記ＤＮＡ配列は、そのｍＲＮＡ転写物が前記ｄｄＲＮＡｉ構築物の前記ｓｈｍｉＲによって標的とされないようにコドン最適化される、（２５）に記載のＤＮＡ構築物。
（２７）前記機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードする前記ＤＮＡ配列は配列番号：７３に記載されている、（２５）または（２６）に記載のＤＮＡ構築物。
（２８）前記機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードする前記ＤＮＡ配列は、前記ＰＡＢＰＮ１構築物内に含まれるプロモーターに機能的に連結し、前記機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードする前記ＤＮＡ配列の上流に配置される、（２５）から（２７）のいずれか１に記載のＤＮＡ構築物。
（２９）前記ＰＡＢＰＮ１構築物内に含まれる前記プロモーターは筋特異的プロモーターである、（２８）に記載のＤＮＡ構築物。
（３０）前記ＤＮＡ構築物は、５´→３´方向に、前記ｄｄＲＮＡｉ構築物と、前記ＰＡＢＰＮ１構築物と、を含む、（２５）から（２９）のいずれか１に記載のＤＮＡ構築物。（３１）前記ＤＮＡ構築物は、５´→３´方向に、前記ＰＡＢＰＮ１構築物と、前記ｄｄＲＮＡｉ構築物と、を含む、（２５）から（２９）のいずれか１に記載のＤＮＡ構築物。（３２）（１）から（９）のいずれか１に記載の核酸、（１０）から（２４）のいずれか１に記載のｄｄＲＮＡｉ構築物、または、（２５）から（３１）のいずれか１に記載のＤＮＡ構築物、を含む、発現ベクター。
（３３）（ａ）（１０）から（２４）のいずれか１に記載のｄｄＲＮＡｉ構築物を含む発現ベクターと、
（ｂ）前記ｄｄＲＮＡｉ構築物がコードする前記ｓｈｍｉＲ（複数可）が標的としないｍＲＮＡ転写物を有する機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含むＰＡＢＰＮ１構築物を含む発現ベクターと、
を含む、
複数種の発現ベクター。
（３４）前記機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードする前記ＤＮＡ配列は、そのｍＲＮＡ転写物が前記ｄｄＲＮＡｉ構築物の前記ｓｈｍｉＲによって標的とされないようにコドン最適化される、（３３）に記載の複数種の発現ベクター。
（３５）前記機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードする前記ＤＮＡ配列は配列番号：７３に記載されている、（３３）または（３４）に記載の複数種の発現ベクター。
（３６）前記機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードする前記ＤＮＡ配列は、前記ＰＡＢＰＮ１構築物内に含まれるプロモーターに機能的に連結し、前記機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードする前記ＤＮＡ配列の上流に配置される、（３３）から（３５）のいずれか１に記載の複数種の発現ベクター。
（３７）前記ＰＡＢＰＮ１構築物内に含まれる前記プロモーターは筋特異的プロモーターである、（３６）に記載の複数種の発現ベクター。
（３８）前記発現ベクターまたはそれぞれの発現ベクターは、プラスミドまたはミニサークルである、（３２）に記載の発現ベクターまたは（３３）から（３７）のいずれか１に記載の複数種の発現ベクター。
（３９）前記発現ベクターまたはそれぞれの発現ベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルス（ＡｄＶ）ベクター及びレンチウイルス（ＬＶ）ベクターからなる群から選択されるウイルスベクターである、（３２）に記載の発現ベクターまたは（３３）から（３７）のいずれか１に記載の複数種の発現ベクター。
（４０）（１）から（９）のいずれか１に記載の核酸、（１０）から（２４）のいずれか１に記載のｄｄＲＮＡｉ構築物、（２５）から（３１）のいずれか１に記載のＤＮＡ構築物、（３２）、（３８）または（３９）のいずれか１に記載の発現ベクター、または、（３３）から（３９）のいずれか１に記載の複数種の発現ベクター、を含む、組成物。
（４１）１種または複数種の薬学的に許容される担体を更に含む、（４０）に記載の組成物。
（４２）眼咽頭型筋ジストロフィー（ＯＰＭＤ）の原因となるＰＡＢＰＮ１タンパク質の対象における発現を阻害するための方法であって、前記方法は、（１）から（９）のいずれか１に記載の核酸、（１０）から（２４）のいずれか１に記載のｄｄＲＮＡｉ構築物、（２５）から（３１）のいずれか１に記載のＤＮＡ構築物、（３２）、（３８）または（３９）のいずれか１に記載の発現ベクター、（３３）から（３９）のいずれか１に記載の複数種の発現ベクター、または、（４０）または（４１）に記載の組成物を前記対象に投与すること、を含む、前記方法。
（４３）眼咽頭型筋ジストロフィー（ＯＰＭＤ）を患う対象においてそれを治療するための方法であって、前記方法は、（１）から（９）のいずれか１に記載の核酸、（１０）から（２４）のいずれか１に記載のｄｄＲＮＡｉ構築物、（２５）から（３１）のいずれか１に記載のＤＮＡ構築物、（３２）、（３８）または（３９）のいずれか１に記載の発現ベクター、（３３）から（３９）のいずれか１に記載の複数種の発現ベクター、または、（４０）または（４１）に記載の組成物を前記対象に投与すること、を含む、前記方法。（４４）前記方法は、（３３）から（３９）のいずれか１に記載の複数種の発現ベクターを共に、同時にまたは連続で前記対象に投与すること、を含む、（４２）または（４３）に記載の方法。
（４５）（ａ）ＯＰＭＤの原因となるＰＡＢＰＮ１タンパク質の発現を阻害するための１種または複数種の薬剤であって、前記薬剤（複数可）は、（ｉ）（１）から（９）のいずれか１に記載の核酸、（ｉｉ）（１０）から（２４）のいずれか１に記載のｄｄＲＮＡｉ構築物、（ｉｉｉ）（３２）、（３８）または（３９）のいずれか１に記載の発現ベクター、または、（ｉｖ）（４０）または（４１）に記載の組成物から選択される、前記薬剤と、
（ｂ）（ａ）の前記薬剤により発現されるｓｈｍｉＲが標的としないｍＲＮＡ転写物を有する機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターと、
を含む、
キット。
（４６）前記機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードする前記ＤＮＡ配列は、そのｍＲＮＡ転写物が、（ａ）の前記薬剤がコードする前記ｓｈｍｉＲによって標的とされないように、コドン最適化される、（４５）に記載のキット。
（４７）前記機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードする前記ＤＮＡ配列は配列番号：７３に記載されている、（４５）または（４６）に記載のキット。
（４８）前記機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードする前記ＤＮＡ配列は、前記発現ベクター内に含まれるプロモーターに機能的に連結し、前記機能性ＰＡＢＰＮ１タンパク質をコードする前記ＤＮＡ配列の上流に配置される、（４５）から（４７）のいずれか１に記載のキット。
（４９）（３３）から（３９）のいずれか１に記載の複数種の発現ベクターを含む（４５）から（４８）のいずれか１に記載のキットであって、前記複数種の発現ベクター内の（ａ）及び（ｂ）は、前記キットの構成成分（ａ）及び（ｂ）として提供される、前記キット。
（５０）（４２）から（４４）のいずれか１に記載の方法によりＯＰＭＤを治療するために使用する際の、（４５）から（４９）のいずれか１に記載のキット。

【0432】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【配列表】

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