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特許7432237結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）のためのポリメラーゼ連鎖反応プライマーおよびプローブ
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-02-07
(45)【発行日】2024-02-16
(54)【発明の名称】結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）のためのポリメラーゼ連鎖反応プライマーおよびプローブ
(51)【国際特許分類】
C12N 15/11 20060101AFI20240208BHJP
C12Q 1/6816 20180101ALI20240208BHJP
C12Q 1/6869 20180101ALI20240208BHJP
C12Q 1/6883 20180101ALI20240208BHJP
C12Q 1/689 20180101ALI20240208BHJP
【ＦＩ】
C12N15/11 Z ZNA
C12Q1/6816 Z
C12Q1/6869 Z
C12Q1/6883 Z
C12Q1/689 Z
【請求項の数】
15
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2020100009
(22)【出願日】2020-06-09
(62)【分割の表示】P 2017518819の分割
【原出願日】2015-10-09
(65)【公開番号】P2020168007
(43)【公開日】2020-10-15
【審査請求日】2020-07-08
【審判番号】
【審判請求日】2022-06-29
(31)【優先権主張番号】62/062,351
(32)【優先日】2014-10-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】510144959
【氏名又は名称】ラトガース，ザ ステート ユニバーシティ オブ ニュー ジャージー
(74)【代理人】
【識別番号】110000671
【氏名又は名称】ＩＢＣ一番町弁理士法人
(72)【発明者】
【氏名】アランド，デイヴィッド
(72)【発明者】
【氏名】チャクラヴォーティ，サウミテシュ
【合議体】
【審判長】福井 悟
【審判官】飯室 里美
【審判官】松本 淳
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１３／１５５１８９（ＷＯ，Ａ１）
【文献】米国特許出願公開第２０１３／０２４４８８７（ＵＳ，Ａ１）
【文献】特表２００３－５０００３８（ＪＰ，Ａ）
【文献】Ｊ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ， ２０１３， Ｖｏｌ．６８， ｐ．１０９７－１１０３
【文献】Ｊ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ， ２０１１， Ｖｏｌ．６６， ｐ．１２４３－１２４６
【文献】Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ２０１４ Ａｐｒ， Ｖｏｌ．４８， ｐ．２１４－２２６
【文献】Ｄａｔａｂａｓｅ ＧｅｎＢａｎｋ ［ｏｎｌｉｎｅ］， １１－ＪＵＬ－２０１４， Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＣ＿０００９６２．３， ｆｒｏｍ ｂａｓｅ １４７１８４６ ｔｏ １４７３３８２
【文献】Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ２０１１， Ｖｏｌ．４９， ｐ．９３２－９４０
【文献】Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２００８年，Ｖｏｌ．１４５，ｐ．１０８－１１３
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
C12N
C12Q
ＢＩＯＳＩＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＣＡｐｌｕｓ／ＥＭＢＡＳＥ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
薬剤耐性の結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の存在を同定するためのオリゴヌクレオチドセットであって、
前記オリゴヌクレオチドセットは、ｒｒｓ遺伝子である結核菌領域の一部分を増幅するためのプライマーを含み、
前記領域の第１の部分に特異的な第１の対のフォワードプライマーおよびリバースプライマーを含み、各プライマーは、配列番号１５～１７、５１～５２からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列と少なくとも８５％同一である配列を有する、ならびに
配列番号５９の配列であるプローブ配列を含むスロッピー分子ビーコンプローブを含む、オリゴヌクレオチドセット。
【請求項2】
前記第１の対のプライマーが配列番号１５～１７、５１～５２からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列と同一である配列を有する、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドセット。
【請求項3】
前記スロッピー分子ビーコンプローブがラベル化されている、請求項１または２に記載のオリゴヌクレオチドセット。
【請求項4】
前記スロッピー分子ビーコンプローブが２つの末端それぞれでフルオロフォアおよびクエンチャーでラベル化されている、請求項３に記載のオリゴヌクレオチドセット。
【請求項5】
前記フルオロフォアがフルオレセイン、シアニン５、またはＴｅｘａｓＲｅｄ（登録商標）もしくはＴＡＭＲＡである、請求項４に記載のオリゴヌクレオチドセット。
【請求項6】
前記クエンチャーがＢＨＱ（登録商標）１、ＢＨＱ（登録商標）２またはＤＡＢＣＹＬである、請求項４に記載のオリゴヌクレオチドセット。
【請求項7】
請求項１～６のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドセットを含む、薬剤耐性の結核菌の存在を同定するためのキット。
【請求項8】
ＤＮＡポリメラーゼ、伸長ヌクレオチド、およびバッファーをさらに含む、請求項７に記載のキット。
【請求項9】
第１のプライマー対で第１の核酸ターゲット配列を増幅して、第１の単位複製配列を生成すること、および前記第１の単位複製配列における突然変異を検出することを含み、
前記第１のプライマー対がｒｒｓ遺伝子の第１の領域の一部分に特異的であり、各プライマーは、配列番号１５～１７、５１～５２からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列と少なくとも８５％同一である配列を有し、
前記突然変異の存在が薬剤耐性を示す、
結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）における薬剤耐性を検出する方法であって、
前記検出する工程を以下：
ハイブリダイゼーションを促す条件下で、前記第１の単位複製配列と前記突然変異に特異的な第１のスロッピー分子ビーコンプローブとを接触させて、プローブ－ターゲットハイブリットを形成すること；
融解温度（Ｔｍ）分析を行い、前記プローブ－ターゲットハイブリットのためのテストＴｍ値（ｔｅｓｔＴｍｖａｌｕｅ）を決定すること；および
前記テストＴｍ値と所定の基準Ｔｍ値とを比較すること、を含み、
前記テストＴｍ値は、前記所定の基準Ｔｍ値と異なる場合、突然変異の存在を示す、
のプロセスにより行うものであって、
前記第１のスロッピー分子ビーコンプローブが配列番号５９と同一である配列を含む、方法。
【請求項10】
前記検出する工程をシークエンシングにより行う、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
第２のプライマー対で第２の核酸ターゲット配列を増幅して、第２の単位複製配列を生成することをさらに含み、前記第２のプライマー対がｒｐｏＢ遺伝子、ｇｙｒＡ遺伝子、ｇｙｒＢ遺伝子、ｉｎｈＡプロモーター、ｒｒｓ遺伝子、ｅｉｓプロモーター、ｅｍｂＢ遺伝子、およびｋａｔＧ遺伝子からなる群から選択される第２の領域の一部分に特異的である、
請求項９または１０に記載の方法。
【請求項12】
前記第２の領域が前記ｅｉｓプロモーターである、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
前記突然変異が前記ｒｒｓ遺伝子におけるＡ１４０１ＧまたはＣ１４０２Ｔである、請求項９～１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項14】
前記耐性がイソニアジド、リファンピシン、フルオロキノロン類の薬剤、アミカシン、カナマイシン、カプレオマイシン、およびエタンブトールからなる群から選択される薬剤に対するものである、請求項９～１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項15】
前記第１のプライマー対が配列番号１５～１７、５１～５２からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列と同一である配列を有する、請求項９～１４のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年１０月１０日に出願された米国仮特許出願第６２／０６２，３５１号の優先権を主張し、その開示は、参照により本明細書中に援用される。
本出願は、２０１４年１０月１０日に出願された米国仮特許出願第６２／０６２，３５１号の優先権を主張し、その開示は、参照により本明細書中に援用される。
【0002】
連邦政府の利益
本明細書に開示される発明は、少なくとも一部が国立衛生研究所の認可番号Ｕ０１ＡＩ０８２１７４およびＲ０１ＡＩ０８０６５３に基づく政府の支援によりなされた。したがって、米国政府が、本発明について特定の権利を有しうる。
本明細書に開示される発明は、少なくとも一部が国立衛生研究所の認可番号Ｕ０１ＡＩ０８２１７４およびＲ０１ＡＩ０８０６５３に基づく政府の支援によりなされた。したがって、米国政府が、本発明について特定の権利を有しうる。
【0003】
発明の分野
本発明は、結核菌のＤＮＡの存在を同定するおよび抗結核薬への耐性を同定するために、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）における異なる遺伝子のセグメントを増幅および検出するための新規プライマーならびにスロッピー（ｓｌｏｐｐｙ）分子ビーコン（ＳＭＢ）および分子ビーコン（ＭＢ）プローブに関する。
本発明は、結核菌のＤＮＡの存在を同定するおよび抗結核薬への耐性を同定するために、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）における異なる遺伝子のセグメントを増幅および検出するための新規プライマーならびにスロッピー（ｓｌｏｐｐｙ）分子ビーコン（ＳＭＢ）および分子ビーコン（ＭＢ）プローブに関する。
【背景技術】
【0004】
結核（ＴＢ）は、およそ２０年前、世界規模の緊急事態と宣言された（ＷＨＯ Ｇｌｏｂａｌ Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｒｅｐｏｒｔ ２０１３）。ＴＢの新たな症例の割合は、世界的に減少しているが、２０１５年までに疾患の５０％削減というミレニアム開発目標の狙いを達成することは困難である（ＷＨＯ Ｇｌｏｂａｌ Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｒｅｐｏｒｔ ２０１３）。多剤耐性（ＭＤＲ）および広範な薬剤耐性（ＸＤＲ）であるＴＢの発生率の増加は、これらの減少目標に対する深刻な脅威である（ＷＨＯ Ｇｌｏｂａｌ Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｒｅｐｏｒｔ ２０１３）。ＭＤＲ ＴＢは、少なくともリファンピシンおよびイソニアジドによる治療に対するＴＢ耐性と定義され、ＸＤＲ ＴＢは、抗生物質のフルオロキノロン類ならびに注射剤のアミカシン、カナマイシンおよびカプレオマイシンによる治療に対してさらに耐性があるＭＤＲ ＴＢとして定義される。薬剤耐性ＴＢを患う患者は、適切な感染管理および治療を迅速に開始できるように、できるだけ迅速に同定されるのが最善である（Ｂｏｅｈｍｅ， Ｃ． Ｃ．， ｅｔ．ａｌ， ２０１１， Ｌａｎｃｅｔ ３７７：１４９５－１５０５）。
【0005】
従来の表現型の方法は、細菌の非常に遅い増殖のために、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）（Ｍｔｂ）の薬剤耐性パターンを完全に明らかにするために数週間から数ヶ月かかることがある（Ｈｅｉｆｅｔｓ， Ｌ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ３８：１２２７－１２３０； Ｋｉｍ， Ｓ． Ｊ．， ２００５， Ｅｕｒ Ｒｅｓｐｉｒ Ｊ ２５：５６４－５６９； ａｎｄ ＰＴ， Ｋ．， ａｎｄ Ｋ． ＧＰ．， １９８５， Ｐｕｂｌｉｃ ｈｅａｌｔｈ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ： Ａ ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｌｅｖｅｌ ＩＩＩ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ． Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ， Ｕ．Ｓ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ， Ａｔｌｔａｎｔａ， Ｇｅｏｒｇｉａ．）。分子検査は、より迅速な薬剤耐性の検出を約束する。Ｍｔｂは、薬剤耐性プラスミドを自然には含まない；したがって、分子検査は、染色体ＤＮＡに対して行われる。遺伝子型のアッセイは、Ｍｔｂゲノムがかなり高い配列保存を有するので、設計が比較的容易である。実質的には、すべての薬剤感受性の臨床Ｍｔｂ単離株は、いくつかの容易に同定される「自然多型（ｎａｔｕｒａｌ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ）」を除いて、薬剤耐性ターゲットにおいて同一のＤＮＡ配列を有する。薬剤耐性ターゲット遺伝子における野生型配列からのいかなる逸脱も、対応する薬剤に対する薬剤耐性の存在を示すことになる。遺伝子型のアッセイは、ＤＮＡターゲットがＰＣＲにより増幅されうるため、表現型のアッセイよりも迅速かつ敏感である。バイオハザードは、感染性の生物の早期死滅により最小限にすることができる。
【0006】
ＴＢにおける薬剤耐性のほとんどのケースの主要因である遺伝子のターゲットは、現在既知である。リアルタイムＰＣＲは、細菌の突然変異を検出する最も繊細、迅速および安定した方法である。実質的には、ＰＣＲ－ＭＳ、マイクロアレイ、ミニアレイおよび次世代シークエンシングを含む他のすべての突然変異検出方法は、検出プロセスの第１段階として核酸の増幅を必要とする。一方、リアルタイムＰＣＲでは、サンプル増幅、検出および分析をシングルウェルにおいて全て実施することができる。チューブを開く必要はなく、複雑な流体工学が不要である。しかし、参照試験所の外で実施するための十分に単純で安定である薬剤耐性検査の一般的な方法論を誰も開発できていない。したがって、Ｍ．ｔｂおよび最も一般的に使用される第一選択薬および第二選択薬に対するＭ．ｔｂ薬剤耐性を検出するための新規プライマーおよびプローブが必要である。
【発明の概要】
【0007】
本発明は、Ｍ．ｔｂおよびＭ．ｔｂ薬剤耐性におけるプライマー、プローブおよび関連する使用に関する。
【0008】
一態様において、本発明は、ｒｐｏＢ遺伝子、ｇｙｒＡ遺伝子、ｇｙｒＢ遺伝子、ｉｎｈＡプロモーター、ｒｒｓ遺伝子、ｅｉｓプロモーター、ｅｍｂＢ遺伝子、ｋａｔＧ遺伝子、ｄｏｓＲ遺伝子、ＩＳ６１１０遺伝子およびＩＳ１０８１遺伝子からなる群から選択される結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）領域の一部分を増幅するための単離されたオリゴヌクレオチドセットまたはプライマーセットを提供する。前記セットは、前記一部分に特異的な一対のフォワードプライマーおよびリバースプライマーを含み、各プライマーは、下記表１Ａおよび表１Ｂに記載のものから選択されるオリゴヌクレオチド配列と実質的に同一である配列を有する。したがって、各プライマーは、表に記載のものから選択されるオリゴヌクレオチド配列の相補体に実質的に相補的な配列を有する。いくつかの実施形態において、プライマーの配列は、表１Ａおよび表１Ｂに記載のものから選択されるオリゴヌクレオチド配列とオリゴヌクレオチド配列と同一である。
【0009】
第２の態様において、本発明は、表２に記載のものから選択される配列と実質的に同一である配列を有する単離された核酸を提供する。いくつかの実施形態において、前記核酸は、表２に記載のものから選択される一つの配列を含む。前記核酸は、例えば、２つの末端それぞれでフルオロフォアおよびクエンチャーで、またはプローブの内部ヌクレオチド（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）に結合したフルオロフォアでラベル化することができる。フルオロフォアの例は、フルオレセイン、シアニン５、またはＴｅｘａｓＲｅｄ（登録商標）およびＴＡＭＲＡを含む。クエンチャーの例は、ＢＨＱ１、ＢＨＱ２およびＤＡＢＣＹＬを含む
本発明は、１以上の上記オリゴヌクレオチドセットおよび核酸を含むキットを提供する。前記キットは、ＤＮＡポリメラーゼ、伸長ヌクレオチド、およびバッファーをさらに含むことができる。
本発明は、１以上の上記オリゴヌクレオチドセットおよび核酸を含むキットを提供する。前記キットは、ＤＮＡポリメラーゼ、伸長ヌクレオチド、およびバッファーをさらに含むことができる。
【0010】
第３の態様において、本発明は、結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）における薬剤耐性を検出する方法を特徴とする。前記方法は、第１のプライマー対で第１の核酸ターゲット配列を増幅して、第１の単位複製配列を生成する、この際（ｉ）前記第１のプライマー対がｒｐｏＢ遺伝子、ｇｙｒＡ遺伝子、ｇｙｒＢ遺伝子、ｉｎｈＡプロモーター、ｒｒｓ遺伝子、ｅｉｓプロモーター、ｅｍｂＢ遺伝子およびｋａｔＧ遺伝子からなる群から選択される領域の一部分に特異的であり、（ｉｉ）各プライマーは、表１Ａおよび表１Ｂに記載のものから選択されるオリゴヌクレオチド配列と実質的に同一である配列を有し、ならびに前記第１の単位複製配列における突然変異を検出する工程を含む。前記突然変異の存在は、薬剤耐性を示す。前記方法において、前記検出する工程は、例えば、シークエンシングに基づく技術および核酸またはペプチド核酸プローブハイブリダイゼーションに基づく技術を含む様々な公知の核酸検出技術により行うことができる。
【0011】
一実施形態において、前記検出工程は、（ｉ）ハイブリダイゼーションを促す条件下で、前記第１の単位複製配列と前記突然変異に特異的な第１のプローブとを接触させて、プローブ－ターゲットハイブリットを形成すること；（ｉｉ）融解温度（Ｔｍ）分析を行い、前記プローブ－ターゲットハイブリットのためのテストＴｍ値（ｔｅｓｔ Ｔｍ ｖａｌｕｅ）を決定すること；および（ｉｉｉ）前記テストＴｍ値と所定の基準Ｔｍ値とを比較することを含むプロセスにより行われる。前記テストＴｍ値は、前記所定の基準Ｔｍ値と異なる場合、突然変異の存在を示す。例えば、前記所定の基準Ｔｍ値から少なくとも３（例えば、３、４、または５）標準偏差である前記テストＴｍ値におけるシフトは、突然変異の存在を示す。逆に言うと、前記所定の基準Ｔｍ値から３未満の標準偏差である前記テストＴｍ値におけるシフトは、突然変異がないことを示す。本明細書において、所定の基準Ｔｍ値は、野生型Ｔｍ値の平均でありうる。一例において、所定の基準Ｔｍ値は、例えば少なくとも３標準偏差の差で所定の基準Ｔｍ値より低い場合、突然変異の存在を示す。そうでなければ、テストＴｍ値は、例えば３標準偏差の差で所定の基準Ｔｍ値以上である場合、突然変異がないことを示す。
【0012】
前記方法は、第２のプライマー対で第２の核酸ターゲット配列を増幅して、第２の単位複製配列を生成することをさらに含むことができ、前記第２のプライマー対は、ｒｐｏＢ遺伝子、ｇｙｒＡ遺伝子、ｇｙｒＢ遺伝子、ｉｎｈＡプロモーター、ｒｒｓ遺伝子、ｅｉｓプロモーター、ｅｍｂＢ遺伝子、およびｋａｔＧ遺伝子からなる群から選択される第２の領域の一部分に特異的である。いくつかの実施形態において、前記第１の領域は、ｒｓｓ遺伝子またはｅｉｓプロモーターである。例えば、第１の領域は、ｒｓｓ遺伝子であり得、第２の領域は、ｅｉｓプロモーターであり得る。２つの領域は、独立して増幅する、またはネステッドＰＣＲなどの技術を用いる同じ反応系において増幅することができる。その場合、前記突然変異は、ｒｒｓ遺伝子におけるＡ１４０１ＧまたはＣ１４０２Ｔであり得る。前記突然変異は、ｅｉｓプライマー配列によりクエリされるｅｉｓプロモーター領域内にあり得る。
【0013】
上記の方法は、イソニアジド、リファンピシン、アミカシン、カナマイシン、カプレオマイシン、エタンブトールおよびフルオロキノロン類の薬剤からなる群から選択される薬剤に対する耐性を検出することを可能にする。プライマー対は、表１Ａおよび表１Ｂに記載のものから選択された一つであり得る。プローブは、表２に記載のものから選択された一つと実質的に同一であるまたは完全に同一である配列を有することができる。
【0014】
第４の態様において、本発明は、例えば、被験体からのテストサンプルにおける結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の存在を検出する方法を提供する。前記方法は、増幅反応を促す条件下、テストサンプルと第１のプライマー対とを接触させて、第１の単位複製配列を得ること、および前記単位複製配列の存在を検出して、それによって前記テストサンプルにおける結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の存在を検出することを含む。前記第１のプライマー対は、ｇｙｒＢ遺伝子、ｉｎｈＡプロモーター、ｅｉｓプロモーター、ｅｍｂＢ遺伝子、ｋａｔＧ遺伝子、ｄｏｓＲ遺伝子、ＩＳ６１１０遺伝子、およびＩＳ１０８１遺伝子からなる群から選択される結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）領域の一部分を増幅するためのオリゴヌクレオチドセットであり得る。前記第１のプライマー対の各プライマーが表１Ｂに記載のものから選択されるオリゴヌクレオチド配列と実質的に同一であり得る配列を有する。前記方法は、増幅反応を促す条件下、前記テストサンプルまたは前記第１のプライマー対により生成された単位複製配列と第２のプライマー対とを接触させて、第２の単位複製配列を得ること、および前記第２の単位複製配列の存在を検出することをさらに含むことができる。その場合、第１の単位複製配列および第２の単位複製配列の両方の存在は、テストサンプルにおける結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の存在を示す。
【0015】
第５の態様において、本発明は、テストサンプルにおける結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の存在を検出するもう一つの方法を提供する。前記方法は、ハイブリッド形成反応を促す条件下、テストサンプルと第１の分子ビーコンプローブとを接触させて、プローブ－ターゲットハイブリッドを得ること、および前記プローブ－ターゲットハイブリッドの存在を検出して、それによってテストサンプルにおける結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の存在を検出することを含む。前記方法において、前記第１の分子ビーコンプローブは、表２に記載のものから選択される一つと実質的に同一である配列を含む。一例では、第１の分子指標プローブは、ＩＳ１０８１、ｄｏｓＲ２、およびＩＳ６１１０（配列番号６７～６９）からなる群から選択される。
【0016】
本発明の１以上の実施形態の詳細は、以下の明細書に記載されている。本発明のその他の特徴、目的および利点は、明細書および特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0017】
【図1】図１は、３点Ｔｍプロファイルを生成したＳＭＢプローブを用いた６０３の臨床ＤＮＡサンプルにおけるＡＭＫおよび／またはＫＡＮ耐性の検出を示す図である。３つのアッセイＳＭＢのそれぞれは、マルチプレックスＰＣＲ反応でのすべてのＭ．ｔｂ ＤＮＡサンプルに対して検査された。各サンプルの結果は、Ｘ軸での３点ＴＭプロットおよびＹ軸に示される各ＳＭＢのＴｍ値として示される。単離株は、表現型に感受性ありとして、次に耐性ありとして左から右へソートされる。３つのプローブの少なくとも１つからはっきりと異なるＴｍシフトは、各耐性単離株において見ることができる。
【発明を実施するための形態】
【0018】
本発明は、少なくとも一部では、Ｍ．ｔｂ ＤＮＡおよびイソニアジド、リファンピシン、アミカシン、カナマイシン、カプレオマイシン、エタンブトール、およびフルオロキノロン類の薬剤などの抗結核薬への耐性の存在を同定するためのＭ．ｔｂにおける１１の異なる遺伝子の断片増幅のための新規プライマー、ＳＭＢプローブ、およびＭＢプローブの予期せぬ発見に基づく。
【0019】
プライマーおよびプローブ
本明細書では、ｒｐｏＢ、ｇｙｒＡ、ｇｙｒＢ、ｉｎｈＡプロモーター領域、ｒｒｓ、ｅｉｓプロモーター領域、ｅｍｂＢおよびｋａｔＧ遺伝子を増幅することを特徴とするプライマーは、Ｍ．ｔｂにおける突然変異ホットスポットを誘発する薬剤耐性の感受性増幅を可能にする。対応するＳＭＢプローブは、最も一般的に使用される第一および第二選択薬への薬剤耐性をもたらすこれらの突然変異を標的および同定する。これらのプライマーは、対称および非対称の両方のＰＣＲアッセイにおいて非常に高い効率で使用することができる。本明細書に記載のプライマーおよびプローブ配列は、Ｍ．ｔｂに対する迅速で正確な分子薬剤感受性試験アッセイを開発するために本発明者らにより使用されている。Ｍ．ｔｂに対する分子診断アッセイにおける明らかな有用性とは別に、これらのプライマーはまた、ターゲット遺伝子をシークエンシングするために使用され、サーベイランスアッセイおよびその他のプローブに基づくアッセイにおける突然変異を誘発する耐性を同定し、Ｍ．ｔｂにおける突然変異を誘発する共通の薬剤耐性の特異的で高感度な同定を目的とする。ｄｏｓＲ、ＩＳ６１１０およびＩＳ１０８１遺伝子を増幅するプライマー配列は、Ｍ．ｔｂの非常に高感度で特異的な同定を可能にし、結核の非常に特異的で高感度な分子診断を目的とするいかなるＰＣＲアッセイフォーマットにおいても使用できる。下記表において記載されたものは、本発明の例示的なプライマーおよびプローブである。
本明細書では、ｒｐｏＢ、ｇｙｒＡ、ｇｙｒＢ、ｉｎｈＡプロモーター領域、ｒｒｓ、ｅｉｓプロモーター領域、ｅｍｂＢおよびｋａｔＧ遺伝子を増幅することを特徴とするプライマーは、Ｍ．ｔｂにおける突然変異ホットスポットを誘発する薬剤耐性の感受性増幅を可能にする。対応するＳＭＢプローブは、最も一般的に使用される第一および第二選択薬への薬剤耐性をもたらすこれらの突然変異を標的および同定する。これらのプライマーは、対称および非対称の両方のＰＣＲアッセイにおいて非常に高い効率で使用することができる。本明細書に記載のプライマーおよびプローブ配列は、Ｍ．ｔｂに対する迅速で正確な分子薬剤感受性試験アッセイを開発するために本発明者らにより使用されている。Ｍ．ｔｂに対する分子診断アッセイにおける明らかな有用性とは別に、これらのプライマーはまた、ターゲット遺伝子をシークエンシングするために使用され、サーベイランスアッセイおよびその他のプローブに基づくアッセイにおける突然変異を誘発する耐性を同定し、Ｍ．ｔｂにおける突然変異を誘発する共通の薬剤耐性の特異的で高感度な同定を目的とする。ｄｏｓＲ、ＩＳ６１１０およびＩＳ１０８１遺伝子を増幅するプライマー配列は、Ｍ．ｔｂの非常に高感度で特異的な同定を可能にし、結核の非常に特異的で高感度な分子診断を目的とするいかなるＰＣＲアッセイフォーマットにおいても使用できる。下記表において記載されたものは、本発明の例示的なプライマーおよびプローブである。
【0020】
【表1A】
【0021】
【表1B】
【0022】
【表2】
【0023】
表２において、１以上のプローブ配列は、ライナー（ｌｉｎｅｒ）プローブを含む二重ラベルプローブ、Ｔａｑｍａｎプローブ、分子ビーコンプローブ、およびスロッピー分子ビーコンプローブなど、様々な検出フォーマットで作製することができる。「スロッピー（ｓｌｏｐｐｙ）」プローブは、ミスマッチ耐性（ｍｉｓｍａｔｃｈ－ｔｏｌｅｒａｎｔ）があるプローブを意味する。ミスマッチ耐性プローブは、アッセイにおいて検出可能な温度で２つ以上のターゲット配列の検出可能なシグナルとハイブリダイズし、検出可能なシグナルを生成し、それにより形成された様々なハイブリッドは、異なる融点を有するであろう。ライナー、またはランダムコイルの、一本鎖プローブは、一般的にミスマッチ耐性である。かかるプローブの例は、１つまたは別のターゲット鎖へのハイブリダイゼーション時に蛍光のレベルが増加する内部蛍光部分を有するヘアピンまたはリニアプローブである。例えば、米国特許第７６６２５５０号明細書および第５９２５５１７号明細書、米国特許出願公開第２０１３００９５４７９号明細書参照。
【0024】
好ましくは、スロッピープローブは、米国特許第７６６２５５０号明細書および第５９２５５１７号明細書に記載の二重ラベルヘアピンプローブまたは分子ビーコンプローブである。これらのヘアピンプローブは、互いに補完する一対のアームによって挟まれているターゲット結合配列を含む。これらは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、もしくはＰＮＡ、または３つの核酸全ての組み合わせであり得る。さらに、これらは、修飾ヌクレオチドおよび修飾インターヌクレオチド結合を含んでもよい。これらは、第１のフルオロフォアを一方のアーム、第２のフルオロフォアをもう一方のアームに有し、第２のフルオロフォアの吸収スペクトルは、第１のフルオロフォアの発光スペクトルと実質的に重なる。最も好ましくは、かかるヘアピンプローブは、溶液中に遊離するとプローブがダークであるように、一方のアームにフルオロフォア、もう一方のアームにクエンチャーを有する「分子ビーコンプローブ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｅａｃｏｎ ｐｒｏｂｅｓ）」である。これらはまた、たとえば、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）によって相互作用する一方のアームの複数のフルオロフォアと、もう一方のアームのクエンチャーとを有する波長シフト分子ビーコンプローブであり得る。ターゲット結合配列は、例えば、長さ１２～５０、または２５～５０のヌクレオチドであり得、ハイブリダイズするアームは、長さ４～１０または４～６（例えば、５もしくは６）のヌクレオチドであり得る。分子ビーコンプローブは、米国特許第７６６２５５０号明細書および第５９２５５１７号明細書ならびに国際公開第０１／３１０６２号に記載のとおり、プライマーにつなぐことができる。
【0025】
したがって、スロッピー分子ビーコンプローブは、そのようなクラスの蛍光ラベルされたヘアピンオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブを意味する。かかるプローブは、ホモジニアスアッセイにおいて、検出可能なシグナルを生成する、すなわちターゲットにハイブリダイズしたプローブを結合していないプローブから分離する必要がない。所与のターゲット配列の２つ以上の変異に結合するそれらの能力のおかげで、プローブは、多くの可能な変異の中から関心のある核酸配列セグメントの１つの変異の存在を検出するために、または２つ以上の変異の存在を検出するためにアッセイにおいて使用することができる。したがって、プローブは、同じアッセイにおいて２以上の組み合わせで使用することができる。それらは、ターゲット結合配列が異なるので、異なる変異に対するそれらの相対的な親和性は、異なる。例えば、第１のプローブは、野生型配列に強く、第１の対立遺伝子にほどほどに、第２の対立遺伝子に弱く結合でき、第３の対立遺伝子には全く結合しない；一方、第２のプローブは、野生型配列および第１の変異に弱く、第２および第３の変異にほどほどに結合できる。さらなるスロッピープローブは、それらの異なるターゲット結合配列により、さらに異なる結合パターンを示すだろう。したがって、スロッピープローブの組み合わせからの蛍光発光スペクトルは、異なる微生物株または種、および遺伝子の対立遺伝子変異（ｖａｒｉａｎｔｓ）または突然変異（ｍｕｔａｔｉｏｎ）を明確にする。
【0026】
スロッピープローブは、異なるＤＮＡ配列に結合した後、様々な強度で再現性よく蛍光を発するので、例えば、単一の反応容器で複数の病原体または変異を同定する、単純、迅速および精度の高い核酸増幅反応アッセイ（例えば、ＰＣＲに基づくアッセイ）において、組み合わせを使用することができる。しかし、アッセイを直接検出可能な量の非増幅ターゲット核酸を含むと疑われるサンプルにおいても実施できることが理解されよう。この同定アッセイは、種特異的または変異特異的なＤＮＡ配列の「シグネチャスペクトル（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ｓｐｅｃｔｒａ）」を生成するのに最適な異なる波長の光を発するフルオロフォアでそれぞれ標識された、スロッピー分子ビーコンプローブなどの、一連の部分的にハイブリダイズするスロッピーシグナル伝達プローブのスペクトルを分析することに基づく。
【0027】
前記プローブを用いて、例えば、各ターゲットに対して異なる対立遺伝子識別（ａｌｌｅｌｅ－ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｎｇ）分子ビーコンプローブをデザインすることおよび各プローブを区別してラベル化することにより、多重化を達成できる。（例えば、米国特許第７６６２５５０号明細書および第５９２５５１７号明細書、国際公開第０１／３１０６２号、ならびにＴｙａｇｉ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １８：１１９１－１１９６参照）。対立遺伝子識別プローブの混合物は、それぞれが複数の色のありコートを含み、プローブシグネチャの数を拡張する。そのために、固有の融解温度を有する分子ビーコン－ターゲットハイブリッドのすべては、明らかな温度ならびにプローブおよび単位複製配列の濃度で、対応する固有のシグナル強度を有するであろう。したがって、リアルタイムＰＣＲ反応において多くの異なる可能性のあるターゲット配列を同定するために、限られた数のスロッピープローブをプローブとして使用することができる。前記プローブは、増幅前、増幅中、または増幅後に増幅反応混合物に加えることができる。米国特許第７６６２５５０号明細書参照。
【0028】
本発明はさらに、ＰＣＲおよび／またはプローブ－ターゲットハイブリダイゼーション反応を含む、上記方法を実施するための試薬を含むキットを提供する。そのために、本明細書に記載の方法のために、１以上の反応成分、例えば、ＰＣＲプライマー、ポリメラーゼ、およびプローブは、使用のためのキットの形態で提供することができる。かかるキットにおいて、適切な量の１以上の反応成分が１以上の容器で提供される、または基材上に保持される。
【0029】
前記キットはまた、上記方法を実施するための追加の材料を含む。いくつかの実施形態において、キットは、試薬、本発明に係るプライマーおよび／またはプローブを用いる方法を実施するための材料の一部またはすべてを含む。キットの成分の一部またはすべては、本発明のプライマーおよび／またはプローブを含む容器とは別の容器で提供することができる。キットの追加の成分の例は、特に制限されないが、１以上の異なるポリメラーゼ、１以上のコントロール試薬（例えば、プローブもしくはＰＣＲプライマーまたはコントロールテンプレート）、および反応のためのバッファー（１Ｘまたは濃縮形態）を含む。キットはまた、１以上の下記成分：支持体、終結、修飾または消化試薬、オスモライトおよび検出のための装置を含む。
【0030】
使用される反応成分は、様々な形態で提供され得る。例えば、前記成分（例えば、酵素、プローブおよび／またはプライマー）は、水溶液中に、または乾燥凍結もしくは凍結乾燥粉末、ペレット、もしくはビーズとして、懸濁することができる。後者の場合、成分は、再構成された場合、アッセイに使用する成分の完全な混合物を形成する。本発明のキットは、任意の適切な温度で提供することができる。例えば、液体にタンパク質成分（例えば、酵素）を含むキットの保管のために、それらを０℃以下、好ましくは－２０℃以下、またはその他の凍結状態で提供し、維持することが好ましい。
【0031】
この発明のキットまたはシステムは、少なくとも１つのアッセイに十分な量で、任意の組み合わせの本明細書に記載の成分を含んでもよい。いくつかの用途において、１以上の反応成分は、個々の、一般的には使い捨ての、チューブまたは同等の容器中のあらかじめ測定した１回使用量で提供されてもよい。このような準備で、ＰＣＲ反応は、ターゲット核酸または個々のチューブに対して直接ターゲット核酸を含むサンプル／細胞を加えることにより実施することができる。キットに含まれる成分の量は、任意の適切な量にすることができ、製品が対象にするターゲット市場に依存するであろう。成分が提供される容器は、提供形態を保持できる任意の一般的な容器、例えば、微量遠心管チューブ、アンプル、ボトル、または流体装置、カートリッジ、側方流動、もしくは他の同様な装置などの不可欠の試験装置であり得る。
【0032】
キットはまた、容器または容器の組み合わせを保持するための包装材料も含むことができる。かかるキットおよびシステムのための典型的な包装材料は、任意の様々な構成（例えば、バイアル、マイクロタイタープレートウェル、マイクロアレイなど）において反応成分または検出プローブを保持する固体マトリクス（例えば、ガラス、プラスチック、紙、箔、微小粒子など）を含む。キットは、成分の使用のための具体的な形態で記録された指示書をさらに含むことができる。
【0033】
定義
核酸は、ＤＮＡ分子（例えば、制限されないが、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えば、制限されないが、ｍＲＮＡ）、またはＤＮＡもしくはＲＮＡアナログを意味する。ＤＮＡまたはＲＮＡアナログは、ヌクレオチドアナログから合成することができる。核酸分子は、一本鎖または二本鎖であり得る。「単離された（ｉｓｏｌａｔｅｄ）」核酸は、その構造がいかなる天然起源の核酸構造、または天然起源のゲノム核酸のいかなる断片の構造とも同一ではない核酸である。したがって、この用語は、例えば、（ａ）天然起源のゲノムＤＮＡ分子の一部の配列を有するが、天然起源の生物のゲノムにおける分子のその部分に隣接するコード配列の両方に隣接していないＤＮＡ；（ｂ）結果として生じる分子がいかなる天然起源のベクターまたはゲノムＤＮＡと同一ではないように、ベクターまたは原核生物または真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれた核酸；（ｃ）ｃＤＮＡ、ゲノム断片、ＰＣＲにより生成された断片、または制限断片などの別の分子；ならびに（ｄ）ハイブリッド遺伝子、すなわち融合タンパク質をコードする遺伝子の一部である組み換え核酸配列をカバーする。
核酸は、ＤＮＡ分子（例えば、制限されないが、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えば、制限されないが、ｍＲＮＡ）、またはＤＮＡもしくはＲＮＡアナログを意味する。ＤＮＡまたはＲＮＡアナログは、ヌクレオチドアナログから合成することができる。核酸分子は、一本鎖または二本鎖であり得る。「単離された（ｉｓｏｌａｔｅｄ）」核酸は、その構造がいかなる天然起源の核酸構造、または天然起源のゲノム核酸のいかなる断片の構造とも同一ではない核酸である。したがって、この用語は、例えば、（ａ）天然起源のゲノムＤＮＡ分子の一部の配列を有するが、天然起源の生物のゲノムにおける分子のその部分に隣接するコード配列の両方に隣接していないＤＮＡ；（ｂ）結果として生じる分子がいかなる天然起源のベクターまたはゲノムＤＮＡと同一ではないように、ベクターまたは原核生物または真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれた核酸；（ｃ）ｃＤＮＡ、ゲノム断片、ＰＣＲにより生成された断片、または制限断片などの別の分子；ならびに（ｄ）ハイブリッド遺伝子、すなわち融合タンパク質をコードする遺伝子の一部である組み換え核酸配列をカバーする。
【0034】
本明細書において、用語「ターゲット核酸（ｔａｒｇｅｔ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）」または「ターゲット（ｔａｒｇｅｔ）」は、関心のあるターゲット核酸配列を含む核酸を意味する。ターゲット核酸は、一本鎖または二本鎖であり得、多くの場合、二本鎖ＤＮＡである。「ターゲット核酸配列（ｔａｒｇｅｔ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」、「ターゲット配列（ｔａｒｇｅｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」または「ターゲット領域（ｔａｒｇｅｔ ｒｅｇｉｏｎ）は、一本鎖核酸の配列の全てまたは一部を含む特定の配列を意味する。ターゲット配列は、核酸テンプレート内、または細胞のゲノム内にあってもよく、一本鎖または二本鎖核酸の任意の形態でもあり得る。テンプレートは、精製されたまたは単離された核酸でもよく、または精製されていないまたは単離されていないものでもよい。
【0035】
「相補的な（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）」配列は、本明細書において、ハイブリダイズするそれらの能力に関する上記要件が満たされる限り、ワトソン－クリック塩基対（例えば、Ａ－Ｔ／ＵおよびＣ－Ｇ）、非ワトソン－クリック塩基対および／または非天然および修飾ヌクレオチドからから形成される塩基対を含んでも、またはすべてがこれらから形成されてもよい。完全な相補体（ｆｕｌｌ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）または完全に相補的な（ｆｕｌｌｙ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）は、核酸分子のヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ間で１００％（完全に）相補的なまたは実質的に相補的な塩基対合を意味するであろう。
【0036】
「実質的に相補的な（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）」は、核酸またはオリゴヌクレオチドが例えばＰＣＲ反応のアニーリング条件またはプローブ－ターゲットハイブリダイゼーション条件下、ターゲット核酸配列にハイブリダイズまたはアニールできるように、核酸またはオリゴヌクレオチドがターゲット核酸配列の少なくとも１０の隣接する塩基に対して少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、および１００％）である少なくとも１０の隣接する塩基を含む配列を有することを意味する。配列間の相補性は、比較される少なくとも１０の隣接する塩基の各セットにおいて塩基ミスマッチの数を表すことができる。用語「実質的に同一（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ ｉｄｅｎｔｉｃａｌ）」は、第１の核酸がＰＣＲアニーリングまたはプローブ－ターゲットハイブリダイゼーション条件下、第２の核酸の相補体と実質的に相補的であるまたはハイブリダイズできるように、第１の核酸が第２の核酸に対して少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、および１００％）相補的であることを意味する。
【0037】
「ハイブリダイゼーション（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）」もしくは「ハイブリダイズすること（ｈｙｂｒｉｄｉｚｉｎｇ）」もしくは「ハイブリダイズする（ｈｙｂｒｉｄｉｚｅ）」または「アニールする（ａｎｎｅａｌ）は、２つの構成鎖が水素結合で結合されている安定な二本鎖構造または領域（時には、「ハイブリッド（ｈｙｂｒｉｄ）」または「二本鎖（ｄｕｐｌｅｘ）」または「ステム（ｓｔｅｍ）」と呼ばれる）を形成するために平行配向または好ましくは非平行配向で完全にまたは部分的に相補的な核酸鎖を特定のハイブリダイゼーション条件下で一つにする能力を意味する。水素結合は、典型的にはアデニンおよびチミンもしくはウラシル（ＡおよびＴもしくはＵ）またはシステインおよびグアニン（ＣおよびＤ）の間で形成されるが、他の塩基対が形成されてもよい（例えば、Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，１１ｔｈ ｅｄ．，１９９２）。
【0038】
「核酸二本鎖（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｄｕｐｌｅｘ）」、「二本鎖（ｄｕｐｌｅｘ）」、「ステム（ｓｔｅｍ）」、「核酸ハイブリッド（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｈｙｂｒｉｄ）」または「ハイブリッド（ｈｙｂｒｉｄ）」は、二本鎖、水素結合領域、例えばＲＮＡ：ＲＮＡ、ＲＮＡ：ＤＮＡおよびＤＮＡ：ＤＮＡ二本鎖分子およびそのアナログを含む安定した核酸構造を意味する。かかる構造は、例えば、ラベル化されたプローブ、その表面の質量の変化に敏感な光学活性プローブでコーティングされた基材（米国特許第６，０６０，２３７号明細書）、または結合剤（米国特許第５，９９４，０５６号明細書）を用いることで公知の手段により検出することができる。
【0039】
本明細書において、用語「増幅（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」およびそのバリアントは、ポリヌクレオチドの少なくともある部分の複数のコピーまたは相補体を生成するための任意のプロセスを含み、前記ポリヌクレオチドは、通常「テンプレート（ｔｅｍｐｌａｔｅ）」と呼ばれる。テンプレートポリヌクレオチドは、一本鎖でも二本鎖でもよい。テンプレートはまた、精製されたまたは単離された核酸でもよく、精製されていないまたは単離されていない核酸でもよい。所与のテンプレートの増幅は、ポリヌクレオチド増幅産物の集団の生成をもたらすことができ、集団で「単位複製配列（ａｍｐｌｉｃｏｎ）」と呼ばれる。単位複製配列のポリヌクレオチドは、一本鎖もしくは二本鎖または両方の混合物であり得る。通常、テンプレートは、ターゲット配列を含むであろうし、結果として生じる単位複製配列は、ターゲット配列と実質的に同一または実質的に相補的のいずれかである配列を有するポリヌクレオチドを含むであろう。いくつかの実施形態において、特定の単位複製配列のポリヌクレオチドは、互いに、実質的に同一であるか、実質的に相補的であり；または、いくつかの実施形態において、所与の単位複製配列内のポリヌクレオチドは、互いに異なるヌクレオチド配列を有することができる。増幅は、直線的にまたは指数関数的に進行することができ、２以上の増幅産物を形成するために所与のテンプレートの反復および連続した複製を含むことができる。いくつかの典型的な増幅反応は、テンプレートに基づく核酸合成の連続および反復サイクルを含み、テンプレートのクレオチド配列の少なくともある部分を含み、テンプレートと少なくともある程度の核酸配列同一性（または相補性）を共有する複数の娘ヌクレオチド（ｄａｕｇｈｔｅｒ ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）の形成をもたらす。いくつかの実施形態において、増幅の「サイクル（ｃｙｃｌｅ）」と呼ばれることがある、核酸合成の各過程は、遊離３’末端（例えば、ｄｓＤＮＡの一方の鎖を切断することによる）を生成し、それによりプライマーおよびプライマー伸長工程を生成することを含み；任意に、追加の変性工程を含むことも可能であり、この際テンプレートは、部分的または完全に変性される。いくつかの実施形態において、増幅の１ラウンドは、増幅のシングルサイクルの所与の数の反復を含む。例えば、増幅のラウンドは、特定サイクルの５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、またはそれ以上の反復を含むことができる。１つの例示的な実施形態において、増幅は、任意の反応を含み、この際特定のポリヌクレオチドテンプレートは、核酸合成の２つの連続するサイクルに供される。合成は、テンプレート依存性核酸合成を含むことができる。
【0040】
本発明の増幅はまた、等温増幅を含んでもよい。用語「等温（ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ）」は、実質的に一定の温度で、すなわち核酸重合反応が起こる反応温度を変化させることなく、反応を行うことを意味する。等温増幅反応の等温温度は、反応で使用される鎖置換核酸ポリメラーゼによる。一般的に、等温温度は、以下の一般的な反応産物の融解温度（Ｔｍ；混合物中の二本鎖の半分が一本鎖で、変性状態である可能性の温度）、すなわち一般的には、９０℃以下、通常約２０℃から７５℃の間、好ましくは３０℃から６０℃の間、またはより好ましくは約３７℃である。
【0041】
用語「プライマー（ｐｒｉｍｅｒ）」または「プライマーオリゴヌクレオチド（ｐｒｉｍｅｒ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」は、核酸合成用テンプレート核酸の組成物に従い、テンプレート核酸にハイブリダイズでき、伸長ヌクレオチドを組み込むための開始点の機能を果たすことができる核酸またはオリゴヌクレオチドの鎖を意味する。「伸長ヌクレオチド（Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」は、増幅の間の伸長産物、すなわちラベルを含んでもよい、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡもしくはＲＮＡの誘導体に組み込まれることができる任意のヌクレオチド（例えば、ｄＮＴＰ）およびそのアナログを意味する
本明細書において、用語「オリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」は、短いポリヌクレオチド、通常３００以下の長さ（例えば、５から１５０の範囲、好ましくは１０から１００の範囲、より好ましくは１５から５０の範囲の長さ）を意味する。しかし、本明細書において、この用語はまた、より長いまたはより短いポリヌクレオチド鎖を包含することも意味する。「オリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」は、他のポリヌクレオチドとハイブリダイズでき、よってポリヌクレオチド検出のためのプローブ、またはポリヌクレオチド鎖伸長のためのプライマーとしての機能を果たす。
本明細書において、用語「オリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」は、短いポリヌクレオチド、通常３００以下の長さ（例えば、５から１５０の範囲、好ましくは１０から１００の範囲、より好ましくは１５から５０の範囲の長さ）を意味する。しかし、本明細書において、この用語はまた、より長いまたはより短いポリヌクレオチド鎖を包含することも意味する。「オリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」は、他のポリヌクレオチドとハイブリダイズでき、よってポリヌクレオチド検出のためのプローブ、またはポリヌクレオチド鎖伸長のためのプライマーとしての機能を果たす。
【0042】
本明細書において、用語「プローブ（ｐｒｏｂｅ）」は、１以上のタイプの化学結合により、通常相補的な塩基対合により、通常水素結合形成により、相補的な配列のターゲット核酸に結合できるオリゴヌクレオチドを意味する。プローブは、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに依存して、完全な相補性を欠くターゲット配列とプローブ配列とを結合させることができる。ターゲット配列と本明細書に記載の一本鎖核酸とのハイブリダイゼーションを妨げるであろう任意の数の塩基対ミスマッチがあってもよい。しかし、突然変異の数が多すぎるため、最小のストリンジェントのハイブリダイゼーション条件下でさえ、ハイブリダイゼーションが起こらない場合、配列は、相補的なターゲット配列ではない。プローブは、一本鎖であってもよく、または部分的に一本鎖でありおよび部分的に二本鎖であってもよい。プローブの鎖は、構造、構成、およびターゲット配列の特性により決定される。プローブは、ストレプトアビジン複合体が後に結合するビオチンなどのラベルで直接ラベル化または間接的にラベル化されてもよい。
【0043】
用語「検出プローブ（ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｐｒｏｂｅ）」は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下、検出のために安定なプローブ：ターゲットハイブリットを形成するために、ターゲット配列と十分に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを意味する。プローブは通常、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下、ターゲット核酸とのハイブリダイゼーションを妨げないターゲットとされた領域の外側の配列に相補的な塩基を含んでもよい合成オリゴマーである。ターゲットに相補的ではない配列は、ホモポリマートラクト（例えば、ｐｏｌｙ－Ａまたはｐｏｌｙ－Ｔ）、プロモーター配列、制限エンドヌクレアーゼ認識配列、もしくは所望の二次または三次構造をもたらす配列（例えば、触媒サイトまたはヘアピン構造）、または検出および／または増幅を促進することができるタグ領域でもよい。「安定（ｓｔａｂｌｅ）」または「検出のために安定（ｓｔａｂｌｅ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）」は、反応混合物の温度が前記混合物に含まれる核酸二本鎖の融解温度（Ｔｍ）より少なくとも２℃低い、好ましくはＴｍより少なくとも５℃低い、よりさらに好ましくはＴｍより少なくとも１０℃低いことを意味する。
【0044】
「ラベル（ｌａｂｅｌ）」または「レポーター分子（ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」は、核酸（単一ヌクレオチドを含む）、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、またはタンパク質リガンド、例えばアミノ酸もしくは抗体をラベル化するために有用な化学的または生化学的部分である。例としては、蛍光剤、化学発光剤、消光剤、放射性ヌクレオチド、酵素、基質、補助因子、阻害剤、磁気粒子、および公知のその他の部分を含む。ラベルまたはレポーター分子は、測定可能なシグナルを生成することができ、オリゴヌクレオチドもしくはヌクレオチド（例えば、非天然ヌクレオチド）またはリガンドに共有結合または非共有結合することができる。
【0045】
本明細書において、用語「接触させる（ｃｏｎｔａｃｔｉｎｇ）」およびそのバリアントは、任意のセットの成分に関して使用される場合、任意のプロセスを含み、それにより接触される成分は、同じ混合物に混合され（例えば、同じ区画または溶液に添加される）、列挙した成分間の実際の物理的接触を必ずしも必要としない。列挙した成分は、任意の順番および任意の組み合わせ（またはサブコンビネーション）で接触することができ、１つまたはいくつかの列挙した成分がその後混合物から除かれる（その他の列挙した成分の添加より前でもよい）状況を含むことができる。例えば、「ＡとＢおよびＣとを接触させる（ｃｏｎｔａｃｔｉｎｇ Ａ ｗｉｔｈ Ｂ ａｎｄ Ｃ）」は、以下の状況のいずれかまたはすべてを含む：（ｉ）ＡがＣと混合され、その後Ｂが混合物に加えられる；（ｉｉ）ＡおよびＢが混合物中に混合する；Ｂを混合物から除き、その後Ｃを混合物に添加する；ならびに（ｉｉｉ）ＡをＢおよびＣの混合物に添加する。ターゲット核酸または細胞と１以上の反応成分、例えばポリメラーゼ、プライマーセットもしくはプローブとを「接触させる（ｃｏｎｔａｃｔｉｎｇ）」は、以下の状況のいずれかまたはすべてを含む：（ｉ）ターゲットまたは細胞を反応混合物の第１の成分と接触させて混合物を生成する；その後、反応混合物のその他の成分を任意の順番または組み合わせで混合物に加える；（ｉｉ）反応混合物をターゲットまたは細胞との混合より前に完全に形成する。
【0046】
本明細書において、用語「混合物（ｍｉｘｔｕｒｅ）」は、散在しており、特定の順序ではない、要素の組み合わせを意味する。混合物は、不均一であり、空間的のその異なる物質に分離できない。混合物の要素の例は、同じ水溶液中に溶解された多くの異なる要素、または異なる要素が空間的に区別されず、個体支持体にランダムにもしくは特定の順番ではなく付着した多くの異なる要素を含む。換言すると、混合物は、アドレス可能ではない。
【0047】
本明細書において、用語「被験体（ｓｕｂｊｅｃｔ）」は、ゲノムを有する任意の生命体、好ましくは生きている動物、例えば、哺乳類を意味し、診断、治療、観察または実験の対象である。被検体の例は、ヒト、家畜動物（肉牛および乳牛、ヒツジ、家禽、ブタなど）、またはコンパニオン動物（イヌ、ネコ、ウマなど）であり得る。
【0048】
本明細書において、「サンプル（ｓａｍｐｌｅ）」は、生命体（例えば、患者）から、または生命体の構成要素（例えば、血液）から得られた任意の生物学的液体または組織を意味する。サンプルは、任意の生物学的組織、細胞または液体であり得る。サンプルは、ヒト患者または獣医学的被検体などの被検体に由来するサンプルである「臨床サンプル（ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓａｍｐｌｅ）」であり得る。有用な生物学的サンプルは、制限されないが、全血、唾液、尿、滑液、骨髄、脳脊髄液、膣粘液、子宮頸管粘液、鼻分泌物、唾液、精液、羊水、気管支肺胞洗浄液、および患者または被験体からのその他の細胞滲出液を含む。かかるサンプルは、生理食塩水、バッファーまたは生理学的に許容される希釈剤でさらに希釈されてもよい。または、かかるサンプルは、従来の方法により濃縮される。生物学的サンプルはまた、組織学的目的のために採取された凍結切片などの組織の切片を含むことができる。生物学的サンプルはまた、「患者サンプル（ｐａｔｉｅｎｔ ｓａｍｐｌｅ）」と呼ぶこともできる。生物学的サンプルはまた、実質的に精製されたまたは単離されたタンパク質、膜調製物、または細胞培養物を含むことができる。
【0049】
用語「決定する（ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ）」、「測定する（ｍｅａｓｕｒｉｎｇ）」、「評価する（ａｓｓｅｓｓｉｎｇ）」および「アッセイする（ａｓｓａｙｉｎｇ）」は、交換可能に使用され、定量的および定性的測定の両方を含み、特性、形質、または特徴が存在するかどうかを決定することを含む。アッセイすることは、相対的または絶対的なものであり得る。ターゲットの存在を評価することは、存在するターゲットの量を決定すること、およびそれが存在するか否かを決定することを含む。
【0050】
本明細書において、用語「基準（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）」値は、アッセイ結果と比較した場合、統計的に特定のアウトカムと相関する値を意味する。好ましい実施形態において、基準値は、野生型値の平均を分析する統計的分析から決定することができる。基準値は、閾値スコア値またはカットオフスコア値であってもよい。一般的には、基準値は、１つのアウトカムがより可能性がある閾値を超える（またはそれより低い）もの、および代替のアウトカムがより可能性がある閾値より下のものでもよい。
【0051】
本明細書に開示されているように、値の差は、病原体（例えば、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ））または突然変異の有無を示す。レベルまたは値の「差（ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ）」というフレーズは、コントロールまたは基準レベルもしくは基準値と比較して、サンプルにおける検査対象（例えば、プローブ－ターゲットハイブリット）の変数（例えば、Ｔｍ）での差を意味する。一実施形態において、値またはレベルの差は、コントロールと比較して、サンプルにおける存在する検査対象の量の間の統計学的に有意な差であり得る。例えば、差は、分析対象の測定レベルが任意のコントロールまたは基準群の平均値の約１．０、２．０、３．０、４．０、または５．０標準偏差の範囲外である場合、統計学的に有意であり得る。
【0052】
本明細書に開示されているように、多くの範囲の値が提供される。その範囲の上限および下限の間に、明確に記載されない限り、下限の単位の１０分の１までの各介在値もまた、具体的に開示されることが理解される。言及した範囲におけるいかなる言及した値または介在値と、その言及した範囲におけるその他の言及または介在値との間の、より小さい範囲のそれぞれは、本発明に包含される。これらのより小さい範囲の上限および下限は、独立して、範囲に含まれても、含まれなくてもよく、いずれか一方、どちらでもない、または両方の限界値がより小さい範囲に含まれる範囲のそれぞれはまた、本発明に包含され、言及した範囲における任意の特定の除外された範囲に依存する。言及した範囲が一つまたは両方の限界値を含む場合、それらの含まれる限界値のいずれかまたは両方を除外する範囲もまた、本発明に含まれる。用語「約（ａｂｏｕｔ）」は、一般的に示された数値のプラスまたはマイナス１０％を意味する。例えば、「約１０％（ａｂｏｕｔ １０％）」は、９％～１１％範囲を示すであろうし、「約２０％（ａｂｏｕｔ ２０％）」は、１８～２２を意味するであろう。「約（ａｂｏｕｔ）」のその他の意味は、四捨五入などの文脈から明らかであり、よって、例えば「約１（ａｂｏｕｔ １）」はまた、０．５から１．４を意味するであろう。
【0053】
用途
リファンピンおよびフルオロキノロン（ＦＱ）耐性に大きく関与しているＭ．ｔｂ突然変異体を迅速かつ確実に同定する２つの別々なＳＭＢアッセイは、最近説明された（Ｃｈａｋｒａｖｏｒｔｙ，Ｓ．，Ｂ．ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ４９：９３２－９４０；Ｃｈａｋｒａｖｏｒｔｙ，Ｓ．，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ５０：２１９４－２２０２）。本明細書に開示されるアッセイは、リアルタイムＰＣＲフォーマットであるという利点を有するので、それらは使用が容易であり、単位複製配列二次汚染を受けない。また、突然変異の検出では、ハイスループット試験に対して頑強で適していることが示されている。以下の実施例は、ＳＭＢ ＴＢ薬剤耐性検出アッセイシステムを示し、ＡＭＫおよびＫＡＮに対する耐性の検出を可能にするアッセイを追加する。本明細書で開示されるアッセイと表現型感受性試験方法との間の不一致の原因もまた、調査された。結果は、最も一般的に使用される表現型方法のいくつかが、突然変異がＫＡＮへの最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を適度に増加させるだけの場合、耐性－付与突然変異を有するＭ．ｔｂ単離株を見逃し得ることを示す。低レベルＫＡＮ耐性に関連するｗｈｉＢ７での新規の突然変異もまた、発見された。
リファンピンおよびフルオロキノロン（ＦＱ）耐性に大きく関与しているＭ．ｔｂ突然変異体を迅速かつ確実に同定する２つの別々なＳＭＢアッセイは、最近説明された（Ｃｈａｋｒａｖｏｒｔｙ，Ｓ．，Ｂ．ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ４９：９３２－９４０；Ｃｈａｋｒａｖｏｒｔｙ，Ｓ．，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ５０：２１９４－２２０２）。本明細書に開示されるアッセイは、リアルタイムＰＣＲフォーマットであるという利点を有するので、それらは使用が容易であり、単位複製配列二次汚染を受けない。また、突然変異の検出では、ハイスループット試験に対して頑強で適していることが示されている。以下の実施例は、ＳＭＢ ＴＢ薬剤耐性検出アッセイシステムを示し、ＡＭＫおよびＫＡＮに対する耐性の検出を可能にするアッセイを追加する。本明細書で開示されるアッセイと表現型感受性試験方法との間の不一致の原因もまた、調査された。結果は、最も一般的に使用される表現型方法のいくつかが、突然変異がＫＡＮへの最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を適度に増加させるだけの場合、耐性－付与突然変異を有するＭ．ｔｂ単離株を見逃し得ることを示す。低レベルＫＡＮ耐性に関連するｗｈｉＢ７での新規の突然変異もまた、発見された。
【0054】
本明細書に開示されているように、多重化ＳＭＢ ＰＣＲおよび溶解アッセイ（ｍｅｌｔ ａｓｓａｙ）は、ＡＭＫおよび／またはＫＡＮに対する耐性に関連するｒｒｓ遺伝子およびｅｉｓプロモーターにおける突然変異を正確に同定した。アッセイは、ＮＴＭ、グラム陽性細菌、およびグラム陰性細菌に対して試験した場合、偽の耐性信号（ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｃａｌｌ）を生成しなかった。ヘテロ－抵抗性のほとんどのケースは、存在する場合、アッセイによっても検出された。ＭＴＢＤＲｓｌプラットフォームとは異なり、アッセイは、クローズドのリアルタイムＰＣＲシステムで実施することができ、全てのアッセイの工程が３８４ウェルプレートで行われるように、ハイスループット試験に容易に適合することができる。ＳＭＢアッセイはまた、突然変異の検出の代替方法に関連する潜在的な問題を回避する。高分解能融解曲線分析は、融解曲線の微妙な変化を検出する能力を必要とする（Ｙａｄａｖ，Ｒ．，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｊ Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １１３：８５６－８６２）。その他のポストＰＣＲ融解に基づく分子アッセイは、複雑な蛍光の輪郭を解読することにより突然変異を検出しなければならない（Ｒｉｃｅ，Ｊ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，２０１２．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４０：ｅ１６４．）。一方、ＳＭＢアッセイは、明確かつ容易に識別可能なＴｍピークおよび明確なＴｍシフトを生成し、関心ある突然変異を同定する。個々のＴｍ値はまた、同じ遺伝子型を有するサンプルをクラスター化するために使用することができる。
【0055】
本明細書に開示されているように、アッセイは、ＴＢの新たなケースと未解決の再処置のケースの両方を表す６０３の臨床サンプルのパネルで試行され、臨床単離株の感受性パターンを有するターゲットの突然変異の関係を評価した。ｒｒｓ Ａ１４０１Ｇ突然変異を有する単離株の１００％は、ＡＭＫおよびＫＡＮの両方に対する高いレベルの耐性と強い相関を有することが観察された。しかし、ｅｉｓプロモーター突然変異は、中（ｍｏｄｅｒａｔｅ）から低レベルＫＡＮ耐性およびＡＭＫに対する耐性がないことだけをもたらし、これは、以前の研究と一致している（Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｐ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ，２０１１，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ ５５：２０３２－２０４１；Ｚａｕｎｂｒｅｃｈｅｒ，Ｍ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０６：２０００４－２０００９）。本研究はまた、感受性試験のためのＬＪ絶対濃度法が中から低レベルのＫＡＮ耐性を適切に検出しないことを示した。実際には、ｅｉｓプロモーター変異を有するサンプルのほぼ３分の２は、ＬＪ培地におけるＫＡＮ感受性として検出された。しかし、ｅｉｓプロモーター変異を有する１つのサンプルを除くすべてがＭＧＩＴ法によりＫＡＮ耐性として検出された。２つのかかる単離株は、ｅｉｓ Ｃ（－１２）Ｔ突然変異を含んだ。これらの突然変異体はまた、ＭＹＣＯＴＢにより試験した場合、ＫＡＮにも耐性であり、５μｇ／ｍｌのＫＡＮ ＭＩＣを示した。これまでの研究は、Ｃ（－１２）Ｔ突然変異を有する臨床単離株がＫＡＮ耐性と相関がないこと（Ｚａｕｎｂｒｅｃｈｅｒ（２００９））または相関が低いこと（Ｃａｍｐｂｅｌｌ，２０１１；Ｈｏｓｈｉｄｅ，Ｍ．，Ｌ．ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ５２：１３２２－１３２９．）を示唆している。これらの研究はおそらく、表現型感受性を確立するために使用された試験方法によりこの突然変異と低レベルＫＡＮ耐性との関係を見落としていた。これらの結果は、ＭＧＩＴまたはＭＹＣＯＴＢ法がＫＡＮに対する表現型耐性を試験するのに好ましいはずであることを示唆している。それらはまた、本明細書に開示されるように、低レベル耐性を引きおこし、表現型試験単独では見落とされるであろう突然変異を検出するための遺伝子型耐性試験の力を強調している（Ｒｉｇｏｕｔｓ，Ｌ．，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ５１：２６４１－２６４５；Ｓｉｒｇｅｌ，Ｆ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｍｉｃｒｏｂ Ｄｒｕｇ Ｒｅｓｉｓｔ １８：１９３－１９７；およびＶａｎ Ｄｅｕｎ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ５１：２６３３－２６４０）。
【0056】
ここでの一揃いの研究は、ｒｒｓ野生型およびｒｒｓ Ｃ１４０２Ｔ突然変異体の混合物である１つのサンプルが含まれていた。このサンプルは、ＬＪ培地においてＡＭＫおよびＫＡＮの両方に対して感受性であった。Ｃ１４０２Ｔ突然変異を有する単離株は、ＡＭＫに対して感受性であるがＫＡＮに対して耐性であることが報告されている（Ｍａｕｓ，Ｃ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，２００５，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ ４９：３１９２－３１９７）。この特定のケースにおいて、ＬＪ培地を用いた度重なる感受性試験は、おそらくサンプルのヘテロ－耐性のために、ＫＡＮに対する感受性を示した。ここで、ＳＭＢアッセイが野生型および突然変異のＤＮＡ型の両方の存在を明確に検出したので、表現型アッセイよりも潜在的に生じる耐性のよりよい予測因子として役立った。
【0057】
ＡＭＫまたはＫＡＮ耐性を有する臨床株におけるｒｒｓ１４８４突然変異の発生率は、とても低いものであり（Ｇｅｏｒｇｈｉｏｕ，Ｓ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，２０１２，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ７：ｅ３３２７５）、その臨床的意義は議論の余地がある。ｒｒｓ１４８４コドンをターゲットにした別のバージョンのアッセイは、６０３の単離株のいずれにおいて、および３３のＡＭＫおよびＫＡＮ耐性単離株を含んでいた、ニュージャージー－ニューヨークエリアからの追加の２５９の単離株においていかなる突然変異を検出しなかった。この拡大された一揃いの研究において、いかなるｒｒｓ １４８４突然変異の欠如は、サンガーシークエンシングにより確認された（データ示さず）。ｒｒｓ １４８４突然変異の非常に低い罹患率に照らすと、このコドンは、アミノグリコシド耐性を予測する上で、大きな価値を提供するとは考えにくい。したがって、アミノグリコシド耐性の分子アッセイは、ｒｒｓ遺伝子の１４０１～１４０２コドンのみをターゲットにすることが推奨される。
【0058】
２２のＡＭＫまたはＫＡＮ耐性サンプルは、ｒｒｓ遺伝子およびｅｉｓプロモーター領域において野生型配列を有することが見出された。最近の研究は、説明できないＫＡＮ耐性を有する単一の臨床株での５’ＵＴＲ ｗｈｉＢ７突然変異を同定することにより、ｗｈｉＢ７突然変異の５’ＵＴＲでの突然変異とＫＡＮ耐性との間の関連の可能性を示している（Ｒｅｅｖｅｓ，Ａ．Ｚ．，ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ ５７：１８５７－１８６５）。ＫＡＮ耐性に関連すると思われる、いくつかの新規５’ＵＴＲ ｗｈｉＢ７突然変異、および欠失もまた示された。野生型ｒｒｓ、ｅｉｓプロモーター領域を有する臨床株の残り１５～２０％におけるＫＡＮおよびＡＭＫ耐性を説明できる、適切で普遍的なバイオマーカーは同定されていない。ＫＡＮまたはＡＭＫ耐性亜集団からの微量の変異体ターゲットと混合された野生型ｒｒｓ遺伝子およびｅｉｓプロモーター領域ＤＮＡを含むサンプルはまた、表現型耐性試験と本明細書に開示されるＳＭＢアッセイとの間の残りの不一致を説明できる。しかし、ヘテロ耐性の高額な調査は、この研究の範囲を超えている。いくつかの最近の研究は、臨床の場面において確認されることが残っているが、ＰＰＥ６０およびＲｖ３１６８遺伝子が説明できないＫＡＮ耐性に関連する可能性を示唆している（Ｆａｒｈａｔ，Ｍ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，２０１３．Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ４５：１１８３－１１８９；Ｚｈａｎｇ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ４５：１２５５－１２６０）。
【0059】
要約すると、高感度で特異的なアッセイは、Ｍ．ｔｂにおけるＡＭＫおよびＫＡＮ耐性の検出のために開発され、ＭＤＲおよびＸＤＲ ＴＢの罹患率が高い臨床単離株でそれを実証した。結果は、ｒｒｓ Ａ１４０１Ｇ突然変異がＡＭＫおよびＫＡＮの両方に対する高レベルの交差耐性をコードし、ｅｉｓプロモーター突然変異が以前の機能的ゲノム研究と一致する、中から低レベルのＫＡＮ耐性をコードすることを示す（Ｚａｕｎｂｒｅｃｈｅｒ ２００９）。本明細書に開示されたアッセイの性能と固体および液体培地における３つの異なる表現型感受性試験方法とを比較すると、ｅｉｓプロモーター突然変異により引き起こされる低から中レベルのＫＡＮ耐性がＬＪに基づく感受性試験により大きく見落とされていることが明らかになった。これらの結果は、アミノグリコシド耐性を検出するための遺伝子型試験の価値を強く示し、結果は、本明細書に開示されるＳＭＢに基づくアッセイの特異的有用性を明らかにする。
【実施例】
【0060】
実施例１
この実施例は、下記実施例２～７で使用した材料および方法を記載する。
この実施例は、下記実施例２～７で使用した材料および方法を記載する。
【0061】
ＤＮＡサンプル
Ｍ．ｔｂテストサンプルは、大韓民国カンウォンのナショナルマサン病院のＭＤＲ結核（ＮＣＴ００３４１６０１ ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ）の自然史研究に登録された５０３人の患者から培養された６０３の一連の単離株から単離されたＤＮＡから構成された。２つのコホートを試験した。コホートＡは、未治療の新たに疑われるＴＢのケース（１５８サンプル）から構成され、コホートＢは、再治療のＴＢケース（４４５サンプル）から構成された。新鮮な唾液サンプルを処置の開始時に各患者から採取し、Ｍ．ｔｂを培養した。患者のサブセットにおいて、反復して唾液サンプルを処置の１、４および６月目に採取し、まｔＭ．ｔｂのために培養された。非結核性抗酸菌（Ｎｏｎ－Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）（ＮＴＭ）ならびにグラム陽性およびグラム陰性菌テストサンプルを以前に記載のＮｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ（ＮＪＭＳ） ＤＮＡリポジトリから採取した（Ｃｈａｋｒａｖｏｒｔｙ，Ｓ．，２０１２．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ５０：２１９４－２２０２）。
Ｍ．ｔｂテストサンプルは、大韓民国カンウォンのナショナルマサン病院のＭＤＲ結核（ＮＣＴ００３４１６０１ ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ）の自然史研究に登録された５０３人の患者から培養された６０３の一連の単離株から単離されたＤＮＡから構成された。２つのコホートを試験した。コホートＡは、未治療の新たに疑われるＴＢのケース（１５８サンプル）から構成され、コホートＢは、再治療のＴＢケース（４４５サンプル）から構成された。新鮮な唾液サンプルを処置の開始時に各患者から採取し、Ｍ．ｔｂを培養した。患者のサブセットにおいて、反復して唾液サンプルを処置の１、４および６月目に採取し、まｔＭ．ｔｂのために培養された。非結核性抗酸菌（Ｎｏｎ－Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）（ＮＴＭ）ならびにグラム陽性およびグラム陰性菌テストサンプルを以前に記載のＮｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ（ＮＪＭＳ） ＤＮＡリポジトリから採取した（Ｃｈａｋｒａｖｏｒｔｙ，Ｓ．，２０１２．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ５０：２１９４－２２０２）。
【0062】
表現型薬剤感受性試験
表現型薬剤感受性試験（ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ｄｒｕｇ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｔｅｓｔｉｎｇ）は、韓国のＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ （ＩＴＲＣ）で、ＬＪ培地上で絶対濃度法により６０３の単離株の全てで行われ、両方の抗生物質（Ｊｎａｗａｌｉ，Ｈ．Ｎ．，２０１３，Ｄｉａｇｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ ７６：１８７－１９６）に対して４０μｇ／ｍｌの臨界濃度（２０１２年の間に、単離株を試験したときに使用した標準濃度）を用いてＡＭＫおよびＫＡＮに対する感受性を決定した。１７３／６０３サンプルのＡＭＫおよびＫＡＮに対するＭＩＣもまた、以前に記載されているように（Ｌｅｅ，Ｊ．，２０１４，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ ５８：１１－１８）、ＴＲＥＫ Ｓｅｎｓｉｔｉｔｒｅ（登録商標） ＭＹＣＯＴＢ ＭＩＣプレート（“ＭＹＣＯＴＢ”；ＴＲＥＫ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，Ｏｈｉｏ，ＵＳＡ）を用いて評価された。５６０／６０３サンプルについて、ＫＡＮに対する耐性はまた、２．５μｇ／ｍｌの臨界濃度でＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｉｎｄｉｃａｔｏｒ Ｔｕｂｅ （ＭＧＩＴ）システム（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ，ＵＳＡ）を用いて評価された。ターゲット遺伝子のサンガーシークエンシング結果と一致しなかった表現型感受性試験結果を有するサンプルについて、表現型感受性試験を繰り返して、初期の所見を確認した。ＭＧＩＴおよびＬＪ感受性試験結果が不一致を示した場合、両方のアッセイを繰り返して、初期の所見を確認または修正した。
表現型薬剤感受性試験（ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ｄｒｕｇ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｔｅｓｔｉｎｇ）は、韓国のＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ （ＩＴＲＣ）で、ＬＪ培地上で絶対濃度法により６０３の単離株の全てで行われ、両方の抗生物質（Ｊｎａｗａｌｉ，Ｈ．Ｎ．，２０１３，Ｄｉａｇｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ ７６：１８７－１９６）に対して４０μｇ／ｍｌの臨界濃度（２０１２年の間に、単離株を試験したときに使用した標準濃度）を用いてＡＭＫおよびＫＡＮに対する感受性を決定した。１７３／６０３サンプルのＡＭＫおよびＫＡＮに対するＭＩＣもまた、以前に記載されているように（Ｌｅｅ，Ｊ．，２０１４，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ ５８：１１－１８）、ＴＲＥＫ Ｓｅｎｓｉｔｉｔｒｅ（登録商標） ＭＹＣＯＴＢ ＭＩＣプレート（“ＭＹＣＯＴＢ”；ＴＲＥＫ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，Ｏｈｉｏ，ＵＳＡ）を用いて評価された。５６０／６０３サンプルについて、ＫＡＮに対する耐性はまた、２．５μｇ／ｍｌの臨界濃度でＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｉｎｄｉｃａｔｏｒ Ｔｕｂｅ （ＭＧＩＴ）システム（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ，ＵＳＡ）を用いて評価された。ターゲット遺伝子のサンガーシークエンシング結果と一致しなかった表現型感受性試験結果を有するサンプルについて、表現型感受性試験を繰り返して、初期の所見を確認した。ＭＧＩＴおよびＬＪ感受性試験結果が不一致を示した場合、両方のアッセイを繰り返して、初期の所見を確認または修正した。
【0063】
ＤＮＡ調製およびシークエンシング
ＳＭＢアッセイ試験およびサンガーシークエンシングのためのＤＮＡは、１０～１５分間、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００の存在下で２００μｌのＩｎｓｔａｇｅｎｅ Ｍａｔｒｉｘ樹脂（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）中の一白金耳量の培養物をボイルすることにより培養した単離株から調製された。上清を遠心分離後に回収し、Ｎａｎｏｄｒｏｐマイクロボリューム分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）を用いて定量した。サンガーシークエンシングのために、ｒｒｓ遺伝子の２つの異なる断片（ヌクレオチド４２０～９８０および１２９３～１５３７）ならびに上流のｅｉｓコード領域およびｅｉｓプロモーター全体を０．５μＭのフォワードおよびリバースプライマー１Ｘ ＰＣＲバッファー、２５０ｍＭ ｄＮＴＰｓ、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２および０．０３Ｕ／μｌのＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ ＤＮＡポリメラーゼ酵素 （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）を用いて、以下のパラメータに従って増幅した：最初の変性を９５℃で１０分間、続いて９５℃で１０秒、５８～６０℃で３０秒、および単位複製配列のサイズに依存して７０℃で１０～３０秒の４０サイクル。ｅｉｓプロモーター領域およびｒｒｓ遺伝子断片を以前に記載されているように（１０，３３）増幅した。サンプルのサブセットについて、４１２ｂｐの５’非翻訳領域およびＯＲＦからの１２６ｂｐを含むｗｈｉＢ７遺伝子からの５３８ｂｐの断片を増幅し、ｗｈｉＢ７Ｆ ５’ａａａｃｇｃｇｃａｇｇｔｃａｇａａａａｔ ３’およびｗｈｉＢ７Ｒ ５’ｃａｇｔｇｔｃｔｔｇｇｃｔａｃｃｔｃｇａ ３’（配列番号７０および７１）のプライマーを用いて配列決定した。さらに、ほぼ全体のｗｈｉＢ７ ＯＲＦを含む、ｗｈｉＢ７遺伝子からの２７５ｂｐの断片もまた、ｗｈｉＢ７－ｉｎｇｅｎｅ－Ｆ ５’ ＧＴＣＧＧＴＡＣＴＧＡＣＡＧＴＣＣＣＣ ３’およびｗｈｉＢ７－ｉｎｇｅｎｅ－Ｒ ５’ＡＴＧＣＡＡＣＡＧＣＡＴＣＣＴＴＧＣＧ ３’（配列番号７２および７３）のプライマーを用いて増幅した。ＰＣＲ産物は、製造業者の説明書に従い、ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ，ｖｅｒｓｉｏｎ ３．１，ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いる３１３０ＸＬ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏ－ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）で遺伝子特異的フォワードおよびリバースプライマーを用いて、双方向性のシークエンシングを受けた。
ＳＭＢアッセイ試験およびサンガーシークエンシングのためのＤＮＡは、１０～１５分間、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００の存在下で２００μｌのＩｎｓｔａｇｅｎｅ Ｍａｔｒｉｘ樹脂（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）中の一白金耳量の培養物をボイルすることにより培養した単離株から調製された。上清を遠心分離後に回収し、Ｎａｎｏｄｒｏｐマイクロボリューム分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）を用いて定量した。サンガーシークエンシングのために、ｒｒｓ遺伝子の２つの異なる断片（ヌクレオチド４２０～９８０および１２９３～１５３７）ならびに上流のｅｉｓコード領域およびｅｉｓプロモーター全体を０．５μＭのフォワードおよびリバースプライマー１Ｘ ＰＣＲバッファー、２５０ｍＭ ｄＮＴＰｓ、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２および０．０３Ｕ／μｌのＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ ＤＮＡポリメラーゼ酵素 （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）を用いて、以下のパラメータに従って増幅した：最初の変性を９５℃で１０分間、続いて９５℃で１０秒、５８～６０℃で３０秒、および単位複製配列のサイズに依存して７０℃で１０～３０秒の４０サイクル。ｅｉｓプロモーター領域およびｒｒｓ遺伝子断片を以前に記載されているように（１０，３３）増幅した。サンプルのサブセットについて、４１２ｂｐの５’非翻訳領域およびＯＲＦからの１２６ｂｐを含むｗｈｉＢ７遺伝子からの５３８ｂｐの断片を増幅し、ｗｈｉＢ７Ｆ ５’ａａａｃｇｃｇｃａｇｇｔｃａｇａａａａｔ ３’およびｗｈｉＢ７Ｒ ５’ｃａｇｔｇｔｃｔｔｇｇｃｔａｃｃｔｃｇａ ３’（配列番号７０および７１）のプライマーを用いて配列決定した。さらに、ほぼ全体のｗｈｉＢ７ ＯＲＦを含む、ｗｈｉＢ７遺伝子からの２７５ｂｐの断片もまた、ｗｈｉＢ７－ｉｎｇｅｎｅ－Ｆ ５’ ＧＴＣＧＧＴＡＣＴＧＡＣＡＧＴＣＣＣＣ ３’およびｗｈｉＢ７－ｉｎｇｅｎｅ－Ｒ ５’ＡＴＧＣＡＡＣＡＧＣＡＴＣＣＴＴＧＣＧ ３’（配列番号７２および７３）のプライマーを用いて増幅した。ＰＣＲ産物は、製造業者の説明書に従い、ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ，ｖｅｒｓｉｏｎ ３．１，ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いる３１３０ＸＬ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏ－ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）で遺伝子特異的フォワードおよびリバースプライマーを用いて、双方向性のシークエンシングを受けた。
【0064】
アッセイ分子ビーコンおよびプライマー
ＳＭＢアッセイは、ｒｒｓ遺伝子のコドン１４０１および１４０２のＭ．ｔｂ突然変異およびｅｉｓ遺伝子のプロモーター領域に沿った突然変異をターゲットにした。１１３ｂｐの断片（ヌクレオチド１３３５～１４５１）をＡＭＧ－Ｆ（５’－ＧＣＴＡＧＴＡＡＴＣＧＣＡＧＡＴＣＡＧＣＡＡＣＧＣＴＧＣ－３’，配列番号５１）およびＡＭＧ－Ｒ（５’－ＣＣＴＣＣＣＧＡＧＧＧＴＴＡＧＧＣＣＡＣＴ－３’，配列番号５２）のプライマーを用いてｒｒｓ遺伝子から増幅し、プロモーター領域およびｅｉｓ遺伝子の最初の５つのコドン（ヌクレオチド－８１から１７）を包含する９８ｂｐの断片をｅｉｓ－Ｆ（５’－ＣＡＣＡＧＧＧＴＣＡＣＡＧＴＣＡＣＡＧＡＡＴＣ－３’，配列番号１８）およびｅｉｓ－Ｒ（５’－ＧＣＡＴＣＧＣＧＴＧＡＴＣＣＴＴＴＧＣＣＡＧＡＣ－３’，配列番号５３）のプライマーを用いて増幅した。ｒｒｓプライマーは、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｅｎｕｓ）に特異的に設計され、ｅｉｓプライマーは、Ｍ．ｔｂ複合体に特異的に設計された。１つのＳＭＢプローブｒｒｓ－１４００（５’－６ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ－ｃａｃｇａｃｃｇｃｃｃｇｔｃａｃｇｔｃａｔｇａａａｇｔｃｇｇｔｃｇｔｇ－ＢＨＱ１－３’，配列番号５９）と２つのＳＭＢプローブｅｉｓ－１（５’－Ｃｙａｎｉｎｅ５－ｃａｇｇｃｇｇｔｃｇｔａａｔａｔｔｃａｃｇｔｇｃａｃｃｔｇｇｃｃｇｃｃｇｃｃｔｇ－ＢＨＱ２－３’，配列番号１６）およびｅｉｓ－２（５’－ＴｅｘａｓＲｅｄ－ｃｔｃｇｃｇｇｃａｔａｔｇｃｃａｃａｇｔｃｇｇａｔｔｃｔｃｔｇａｃｇｃｇａｇ－ＢＨＱ２－３’，配列番号６１）（配列がＳＭＢのステム部分を示すものおよびＢＨＱがブラックホールクエンチャーを示すものに下線を引いた）とは、それそれｒｒｓ遺伝子およびｅｉｓプロモーター領域に対するターゲットとされた。ｒｒｓプローブは、アンチセンス鎖に相補的であるように設計され、ｅｉｓプローブは、センス鎖に相補的であるように設計された。ＳＭＢは、ｈｔｔｐ：／／ｍｆｏｌｄ．ｒｎａ．ａｌｂａｎｙ．ｅｄｕ／？ｑ＿ｍｆｏｌｄ／ｄｎａ－ｆｏｌｄｉｎｇ－ｆｏｒｍのｉｎ ｓｉｌｉｃｏ ＤＮＡフォールディングプログラムを用いて設計され、ｈｔｔｐ：／／ｍｆｏｌｄ．ｒｎａ．ａｌｂａｎｙ．ｅｄｕ／？ｑ＿ＤＩＮＡＭｅｌｔ／Ｔｗｏ－ｓｔａｔｅ－ｍｅｌｔｉｎｇのプローブ－ターゲットハイブリッドフォールディングプログラムは、可能なプローブ－ターゲットハイブリッド構造および溶解温度（Ｔｍ）を予測するために使用された。プローブは、明確な突然変異の同定を可能にするために、それぞれの標的領域における野生型配列および突然変異体配列の間の最大のＴｍ差を生成するように設計された。プライマーは、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，ＵＳＡ）から、ＳＭＢプローブは、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｎｏｖａｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）から手に入れた。
ＳＭＢアッセイは、ｒｒｓ遺伝子のコドン１４０１および１４０２のＭ．ｔｂ突然変異およびｅｉｓ遺伝子のプロモーター領域に沿った突然変異をターゲットにした。１１３ｂｐの断片（ヌクレオチド１３３５～１４５１）をＡＭＧ－Ｆ（５’－ＧＣＴＡＧＴＡＡＴＣＧＣＡＧＡＴＣＡＧＣＡＡＣＧＣＴＧＣ－３’，配列番号５１）およびＡＭＧ－Ｒ（５’－ＣＣＴＣＣＣＧＡＧＧＧＴＴＡＧＧＣＣＡＣＴ－３’，配列番号５２）のプライマーを用いてｒｒｓ遺伝子から増幅し、プロモーター領域およびｅｉｓ遺伝子の最初の５つのコドン（ヌクレオチド－８１から１７）を包含する９８ｂｐの断片をｅｉｓ－Ｆ（５’－ＣＡＣＡＧＧＧＴＣＡＣＡＧＴＣＡＣＡＧＡＡＴＣ－３’，配列番号１８）およびｅｉｓ－Ｒ（５’－ＧＣＡＴＣＧＣＧＴＧＡＴＣＣＴＴＴＧＣＣＡＧＡＣ－３’，配列番号５３）のプライマーを用いて増幅した。ｒｒｓプライマーは、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｅｎｕｓ）に特異的に設計され、ｅｉｓプライマーは、Ｍ．ｔｂ複合体に特異的に設計された。１つのＳＭＢプローブｒｒｓ－１４００（５’－６ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ－ｃａｃｇａｃｃｇｃｃｃｇｔｃａｃｇｔｃａｔｇａａａｇｔｃｇｇｔｃｇｔｇ－ＢＨＱ１－３’，配列番号５９）と２つのＳＭＢプローブｅｉｓ－１（５’－Ｃｙａｎｉｎｅ５－ｃａｇｇｃｇｇｔｃｇｔａａｔａｔｔｃａｃｇｔｇｃａｃｃｔｇｇｃｃｇｃｃｇｃｃｔｇ－ＢＨＱ２－３’，配列番号１６）およびｅｉｓ－２（５’－ＴｅｘａｓＲｅｄ－ｃｔｃｇｃｇｇｃａｔａｔｇｃｃａｃａｇｔｃｇｇａｔｔｃｔｃｔｇａｃｇｃｇａｇ－ＢＨＱ２－３’，配列番号６１）（配列がＳＭＢのステム部分を示すものおよびＢＨＱがブラックホールクエンチャーを示すものに下線を引いた）とは、それそれｒｒｓ遺伝子およびｅｉｓプロモーター領域に対するターゲットとされた。ｒｒｓプローブは、アンチセンス鎖に相補的であるように設計され、ｅｉｓプローブは、センス鎖に相補的であるように設計された。ＳＭＢは、ｈｔｔｐ：／／ｍｆｏｌｄ．ｒｎａ．ａｌｂａｎｙ．ｅｄｕ／？ｑ＿ｍｆｏｌｄ／ｄｎａ－ｆｏｌｄｉｎｇ－ｆｏｒｍのｉｎ ｓｉｌｉｃｏ ＤＮＡフォールディングプログラムを用いて設計され、ｈｔｔｐ：／／ｍｆｏｌｄ．ｒｎａ．ａｌｂａｎｙ．ｅｄｕ／？ｑ＿ＤＩＮＡＭｅｌｔ／Ｔｗｏ－ｓｔａｔｅ－ｍｅｌｔｉｎｇのプローブ－ターゲットハイブリッドフォールディングプログラムは、可能なプローブ－ターゲットハイブリッド構造および溶解温度（Ｔｍ）を予測するために使用された。プローブは、明確な突然変異の同定を可能にするために、それぞれの標的領域における野生型配列および突然変異体配列の間の最大のＴｍ差を生成するように設計された。プライマーは、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，ＵＳＡ）から、ＳＭＢプローブは、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｎｏｖａｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）から手に入れた。
【0065】
アッセイ手順
全てのサンプルは、アッセイの検証が盲検法で行われることを確保するために、独立してコード化して、ランダムに分配された。アッセイは、韓国マサンのＩＴＲＣおよびニュージャージーメディカルスクール（ＮＪＭＳ），Ｒｕｔｇｅｒｓ，Ｎｅｗａｒｋ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙの両方で試験された。６０３サンプル全体の試験が完了すると、サンプルはデコードされ、ＰＣＲ結果は、対応するシークエンシング、および表現型薬剤感受性試験結果と比較された。各サイトで得られた結果も比較された。アッセイ結果は、治療する医師に報告されず、いかなる治療決定を導くために使用されなかった。ＰＣＲは、Ｒｏｃｈｅ Ｌｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ ４８０ ＩＩ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏ．Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄｉａｎａ，ＵＳＡ）を用いて３８４ウェルプレートで実施され、２０μｌの反応ボリュームは、ｒｒｓ遺伝子のための１００ｎＭのフォワードプライマーおよび１μＭのリバースプライマーならびにｅｉｓプロモーター領域のための１μＭフォワードプライマーおよび５０ｎＭリバースプライマー、１ｎｇ／μｌのｒｒｓ－１４００およびｅｉｓ－１プローブならびに０．８ｎｇ／μｌのｅｉｓ－２プローブ、４ｍＭ ＭｇＣｌ２、２５０ｍＭデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰｓ）、１Ｘ ＰＣＲバッファー、８％グリセロール、０．０６Ｕ／μｌのＰｌａｔｉｎｕｍ（登録商標） ＴｆｉＥｘｏ（－） ＤＮＡポリメラーゼ （Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ），ならびに２から５ｎｇのサンプルＤＮＡまたは等ボリュームの水を含む。ＰＣＲは、以下の工程で実施された：９５℃で２分間の酵素の活性化、続いて９５℃で１０秒間の変性および６７℃で３０秒間のアニーリングと伸長との組み合わせの５０サイクル。ＰＣＲサイクル後、１℃あたり１データの取得速度でプロセス中の蛍光の連続モニタリングと共に、９５℃で２分間の変性後、４５℃に冷却して、８５℃に徐々に加熱することにより、ポストＰＣＲ－Ｔｍ分析を行った。Ｔｍ値は、Ｔｍコーリングソフトウェア（Ｌｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ ４８０ ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて反応終了時に同定された。しかし、各Ｔｍはまた、Ｔｍ値の最終的な同定が行われる前に、訓練を受けた観察者により検証された。野生型および突然変異体のＴｍに対応する任意のプローブの明確なダブルピークを示すサンプルは、ヘテロ耐性を示すと考えられた。テンプレートとしてＤＮＡの代わりに滅菌水を用いたテンプレートなしのコントロールは、ＤＮＡ－ネガティブコントロールとして使用され、テンプレートとしてＭ．ｔｂ Ｈ３７Ｒｖからの１ｎｇのゲノムＤＮＡを用いたＤＮＡ－ポジティブコントロールはまた、各アッセイプレートに含まれた。
全てのサンプルは、アッセイの検証が盲検法で行われることを確保するために、独立してコード化して、ランダムに分配された。アッセイは、韓国マサンのＩＴＲＣおよびニュージャージーメディカルスクール（ＮＪＭＳ），Ｒｕｔｇｅｒｓ，Ｎｅｗａｒｋ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙの両方で試験された。６０３サンプル全体の試験が完了すると、サンプルはデコードされ、ＰＣＲ結果は、対応するシークエンシング、および表現型薬剤感受性試験結果と比較された。各サイトで得られた結果も比較された。アッセイ結果は、治療する医師に報告されず、いかなる治療決定を導くために使用されなかった。ＰＣＲは、Ｒｏｃｈｅ Ｌｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ ４８０ ＩＩ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏ．Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄｉａｎａ，ＵＳＡ）を用いて３８４ウェルプレートで実施され、２０μｌの反応ボリュームは、ｒｒｓ遺伝子のための１００ｎＭのフォワードプライマーおよび１μＭのリバースプライマーならびにｅｉｓプロモーター領域のための１μＭフォワードプライマーおよび５０ｎＭリバースプライマー、１ｎｇ／μｌのｒｒｓ－１４００およびｅｉｓ－１プローブならびに０．８ｎｇ／μｌのｅｉｓ－２プローブ、４ｍＭ ＭｇＣｌ２、２５０ｍＭデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰｓ）、１Ｘ ＰＣＲバッファー、８％グリセロール、０．０６Ｕ／μｌのＰｌａｔｉｎｕｍ（登録商標） ＴｆｉＥｘｏ（－） ＤＮＡポリメラーゼ （Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ），ならびに２から５ｎｇのサンプルＤＮＡまたは等ボリュームの水を含む。ＰＣＲは、以下の工程で実施された：９５℃で２分間の酵素の活性化、続いて９５℃で１０秒間の変性および６７℃で３０秒間のアニーリングと伸長との組み合わせの５０サイクル。ＰＣＲサイクル後、１℃あたり１データの取得速度でプロセス中の蛍光の連続モニタリングと共に、９５℃で２分間の変性後、４５℃に冷却して、８５℃に徐々に加熱することにより、ポストＰＣＲ－Ｔｍ分析を行った。Ｔｍ値は、Ｔｍコーリングソフトウェア（Ｌｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ ４８０ ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて反応終了時に同定された。しかし、各Ｔｍはまた、Ｔｍ値の最終的な同定が行われる前に、訓練を受けた観察者により検証された。野生型および突然変異体のＴｍに対応する任意のプローブの明確なダブルピークを示すサンプルは、ヘテロ耐性を示すと考えられた。テンプレートとしてＤＮＡの代わりに滅菌水を用いたテンプレートなしのコントロールは、ＤＮＡ－ネガティブコントロールとして使用され、テンプレートとしてＭ．ｔｂ Ｈ３７Ｒｖからの１ｎｇのゲノムＤＮＡを用いたＤＮＡ－ポジティブコントロールはまた、各アッセイプレートに含まれた。
【0066】
ヒト被検体の承認
この研究は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｍａｓａｎ Ｈｏｓｐｉｔａｌ、ＮＩＡＩＤおよびＲｕｔｇｅｒｓ（旧ＵＭＤＮＪ）ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ ｒｅｖｉｅｗ ｂｏａｒｄｓにより承認され、すべての被検体は、同意書を渡した（Ｒｕｔｇｅｒｓ ＩＲＢ ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｎｕｍｂｅｒ ０１２００９０１０４）。
この研究は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｍａｓａｎ Ｈｏｓｐｉｔａｌ、ＮＩＡＩＤおよびＲｕｔｇｅｒｓ（旧ＵＭＤＮＪ）ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ ｒｅｖｉｅｗ ｂｏａｒｄｓにより承認され、すべての被検体は、同意書を渡した（Ｒｕｔｇｅｒｓ ＩＲＢ ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｎｕｍｂｅｒ ０１２００９０１０４）。
【0067】
実施例２．野生型および突然変異体の配列に関連するＴｍ値の同定
本明細書に開示されるＳＭＢに基づくアッセイは、耐性との関連性が知られているＭ．ｔｂのｒｒｓ遺伝子およびｅｉｓプロモーターにおける突然変異を探すことによりＡＭＫおよびＫＡＮに対する耐性を検出した。本アッセイは、ｒｒｓおよびｅｉｓターゲット単位複製配列の一部分に相補的なＳＭＢプローブの存在下でのＴｍ分析に続くＰＣＲ工程からなる。本発明者らは、最初に、人工オリゴヌクレオチドでのターゲットの突然変異を同定するためにアッセイの能力を評価し、選択された野生型および突然変異体のＭ．ｔｂ株からのＤＮＡテンプレートを配列決定した（データ示さず）。野生型の配列は、野生型ターゲットの既知の平均値の１℃以内のＴｍ値の存在によって同定された。突然変異体の配列は、平均野生型Ｔｍ値から少なくとも５標準偏差のＴｍ値のシフトによって同定された。ＡＭＫおよびＫＡＮ耐性に関連する最も一般的な突然変異を検出する本アッセイの能力は、その後の臨床ＤＮＡサンプルで評価された。試験は、野生型配列を有する４８７のサンプルおよびアッセイターゲットに突然変異を有する１１６のサンプルからなる、６０３の臨床サンプルのパネルで行われた。これらのサンプルの５つは、野生型およびサンダーシークエンシングで検出された突然変異株のＤＮＡの混合物を有していた。ＳＭＢアッセイは、突然変異体または混合として１１５／１１６（９９％）の突然変異体または混合（突然変異体および野生型のＤＮＡの両方を含む不均一サンプル）サンプルおよび野生型として４８７／４８７（１００％）の純野生型サンプルを正確に同定した。ただ一つの混合サンプル（サンガーシークエンシングにより示される）は、本明細書で開示するアッセイにより野生型サンプルとして同定された。野生型および突然変異体のターゲットの設定において各ＳＭＢプローブにより生成されたＴｍ値は、高い再現性があった。野生型ターゲットについて、ｒｒｓ－１４００、ｅｉｓ－１およびｅｉｓ－２のプローブは、それぞれ７０．１℃±０．１５、６３．９℃±０．１９および６９℃±０．２３の平均Ｔｍ値を示した（表３）。Ａ１４０１ＧおよびＣ１４０２Ｔの突然変異体のＴｍターゲットについて、突然変異は、それぞれプローブｒｒｓ－１４００におけるＴｍ値の３．９℃（±０．１７）および５．６℃（±０．２１）の減少もたらした（表３）。同様に、ｅｉｓ－１およびｅｉｓ－２プローブは、期待された野生型Ｔｍ値と比較して、Ｔｍ値の４．３℃から６．５℃の減少を発生させることによって突然変異としてｅｉｓプロモーター領域における突然変異の範囲を確実に検出した（表３）。ＲｕｔｇｅｒｓおよびＩＴＲＣでの２つの異なる実験室で実施されたＰＣＲアッセイは、野生型および突然変異体ならびに混合物として検出されたすべてのサンプルについて完全に一致した。
本明細書に開示されるＳＭＢに基づくアッセイは、耐性との関連性が知られているＭ．ｔｂのｒｒｓ遺伝子およびｅｉｓプロモーターにおける突然変異を探すことによりＡＭＫおよびＫＡＮに対する耐性を検出した。本アッセイは、ｒｒｓおよびｅｉｓターゲット単位複製配列の一部分に相補的なＳＭＢプローブの存在下でのＴｍ分析に続くＰＣＲ工程からなる。本発明者らは、最初に、人工オリゴヌクレオチドでのターゲットの突然変異を同定するためにアッセイの能力を評価し、選択された野生型および突然変異体のＭ．ｔｂ株からのＤＮＡテンプレートを配列決定した（データ示さず）。野生型の配列は、野生型ターゲットの既知の平均値の１℃以内のＴｍ値の存在によって同定された。突然変異体の配列は、平均野生型Ｔｍ値から少なくとも５標準偏差のＴｍ値のシフトによって同定された。ＡＭＫおよびＫＡＮ耐性に関連する最も一般的な突然変異を検出する本アッセイの能力は、その後の臨床ＤＮＡサンプルで評価された。試験は、野生型配列を有する４８７のサンプルおよびアッセイターゲットに突然変異を有する１１６のサンプルからなる、６０３の臨床サンプルのパネルで行われた。これらのサンプルの５つは、野生型およびサンダーシークエンシングで検出された突然変異株のＤＮＡの混合物を有していた。ＳＭＢアッセイは、突然変異体または混合として１１５／１１６（９９％）の突然変異体または混合（突然変異体および野生型のＤＮＡの両方を含む不均一サンプル）サンプルおよび野生型として４８７／４８７（１００％）の純野生型サンプルを正確に同定した。ただ一つの混合サンプル（サンガーシークエンシングにより示される）は、本明細書で開示するアッセイにより野生型サンプルとして同定された。野生型および突然変異体のターゲットの設定において各ＳＭＢプローブにより生成されたＴｍ値は、高い再現性があった。野生型ターゲットについて、ｒｒｓ－１４００、ｅｉｓ－１およびｅｉｓ－２のプローブは、それぞれ７０．１℃±０．１５、６３．９℃±０．１９および６９℃±０．２３の平均Ｔｍ値を示した（表３）。Ａ１４０１ＧおよびＣ１４０２Ｔの突然変異体のＴｍターゲットについて、突然変異は、それぞれプローブｒｒｓ－１４００におけるＴｍ値の３．９℃（±０．１７）および５．６℃（±０．２１）の減少もたらした（表３）。同様に、ｅｉｓ－１およびｅｉｓ－２プローブは、期待された野生型Ｔｍ値と比較して、Ｔｍ値の４．３℃から６．５℃の減少を発生させることによって突然変異としてｅｉｓプロモーター領域における突然変異の範囲を確実に検出した（表３）。ＲｕｔｇｅｒｓおよびＩＴＲＣでの２つの異なる実験室で実施されたＰＣＲアッセイは、野生型および突然変異体ならびに混合物として検出されたすべてのサンプルについて完全に一致した。
【0068】
アッセイの結果は、我々が個々の３点Ｔｍパターンに基づき、６０３のサンプルを野生型および突然変異体のＴｍクラスター型に明確に分離することを可能にした（図１）。本アッセイは、Ａ１４０１Ｇ突然変異のみを含む７５サンプルの全てにおいて突然変異を正しく同定した（表３、図２パネルＡ）。Ａ１４０１Ｇおよび野生型配列の混合物を含む４つのサンプルのうち３つはまた、二重のＴｍピークの存在に基づき、混合野生型／突然変異体として検出された。Ｃ１４０２Ｔ突然変異および野生型ＤＮＡの混合物を含むただ一つのサンプルはまた、Ｃ１４０２Ｔ突然変異に特異的な突然変異体のＴｍを有するサンプルからの二重のＴｍピークの存在によって同定された（表３、図２パネルＡ）。ｅｉｓプロモーター領域の突然変異を有する３２のサンプルは、５つの異なる多型（－８、－１０、－１２、－１４および－３７の位置）を含んだ。これらの突然変異のすべては、ｅｉｓ ＳＭＢのいずれか一つによって成功裏に検出された（表３、図２パネルＢおよびＣ）。ｒｒｓ遺伝子およびｅｉｓプロモーター領域の両方に突然変異を有する４つのサンプルはまた、二重突然変異体として正しく検出された（表３）。ｒｒｓ遺伝子のシークエンシングは、その薬剤感受性パターンにもかかわらず、コドン１４８４突然変異を有するサンプルのいずれも同定しなかった。
【0069】
アミカシン耐性の同定
この実施例では、アッセイを行い、表現型薬剤感受性試験結果と比較して、分子アッセイの性能を評価した。遺伝型薬剤感受性試験の見かけの性能は、試験に含まれるために選択された突然変異およびゴールドスタンダードとして使用される表現型アッセイに依存して変化しうる（Ｋｉｍ，Ｓ．Ｊ．２００５ Ｅｕｒ Ｒｅｓｐｉｒ Ｊ ２５：５６４－５６９；Ｒｉｇｏｕｔｓ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ５１：２６４１－２６４５；およびＶａｎ Ｄｅｕｎ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ５１：２６３３－２６４０）。ＬＪに基づく薬剤感受性試験方法をゴールドスタンダードとして考慮すると（６０３の試験サンプルすべてに対して実施された）、Ａ１４０１Ｇ突然変異のｒｒｓ ＳＭＢ Ｔｍ特性は、ＡＭＫ耐性サンプルの８２／９０を耐性として分類した（９１．１％の感度；９５％ＣＩ、８２．８％から９６．８％）。野生型Ｔｍは、ＡＭＫ感受性サンプルの５１２／５１３を感受性として分類した。５１３のＡＭＫ感受性単離株中のただ一つの単離株は、野生型Ｔｍおよび特異的なＣ１４０２Ｔ突然変異体Ｔｍに対応する、ｒｒｓ ＳＭＢプローブによって生成された明らかな二重ピークの存在により、本明細書に開示されるＳＭＢアッセイによって野生型およびＣ１４０２Ｔ突然変異体のＤＮＡの混合物として同定された（図２パネルＡ）。これは、サンガーシークエンシングによっても確認された。これまでの研究では、Ｃ１４０２Ｔ突然変異がＡＭＫ耐性をコードしていないことが示されているため（２４）、Ｃ１４０２Ｔ突然変異に対応する特異的なＴｍは、ＡＭＫ感受性の指標として考えることができる。この考察は、１００％の特異性（９５％ＣＩ、９９から１００％）をもたらすすべての５１３／５１３ＡＭＫ感受性サンプルを正しく検出する本明細書に開示されるアッセイをもたらした。分析においてｅｉｓプロモーター領域での突然変異に特徴があるＴｍ値を含むことは、ＡＭＫ耐性を検出する感受性を増加させないが、特異性は１００％から９３．８％に減少した（９５％ＣＩ、９１．２から９５．６％）。これらの結果は、ｅｉｓプロモーター突然変異がＬＪ薬剤感受性試験によって明らかにされたようにＡＭＫ耐性に関連しないことを示唆する以前の報告と一致する（Ｃａｍｐｂｅｌｌ ２０１１およびＺａｕｎｂｒｅｃｈｅｒ ２００９）。
この実施例では、アッセイを行い、表現型薬剤感受性試験結果と比較して、分子アッセイの性能を評価した。遺伝型薬剤感受性試験の見かけの性能は、試験に含まれるために選択された突然変異およびゴールドスタンダードとして使用される表現型アッセイに依存して変化しうる（Ｋｉｍ，Ｓ．Ｊ．２００５ Ｅｕｒ Ｒｅｓｐｉｒ Ｊ ２５：５６４－５６９；Ｒｉｇｏｕｔｓ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ５１：２６４１－２６４５；およびＶａｎ Ｄｅｕｎ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ５１：２６３３－２６４０）。ＬＪに基づく薬剤感受性試験方法をゴールドスタンダードとして考慮すると（６０３の試験サンプルすべてに対して実施された）、Ａ１４０１Ｇ突然変異のｒｒｓ ＳＭＢ Ｔｍ特性は、ＡＭＫ耐性サンプルの８２／９０を耐性として分類した（９１．１％の感度；９５％ＣＩ、８２．８％から９６．８％）。野生型Ｔｍは、ＡＭＫ感受性サンプルの５１２／５１３を感受性として分類した。５１３のＡＭＫ感受性単離株中のただ一つの単離株は、野生型Ｔｍおよび特異的なＣ１４０２Ｔ突然変異体Ｔｍに対応する、ｒｒｓ ＳＭＢプローブによって生成された明らかな二重ピークの存在により、本明細書に開示されるＳＭＢアッセイによって野生型およびＣ１４０２Ｔ突然変異体のＤＮＡの混合物として同定された（図２パネルＡ）。これは、サンガーシークエンシングによっても確認された。これまでの研究では、Ｃ１４０２Ｔ突然変異がＡＭＫ耐性をコードしていないことが示されているため（２４）、Ｃ１４０２Ｔ突然変異に対応する特異的なＴｍは、ＡＭＫ感受性の指標として考えることができる。この考察は、１００％の特異性（９５％ＣＩ、９９から１００％）をもたらすすべての５１３／５１３ＡＭＫ感受性サンプルを正しく検出する本明細書に開示されるアッセイをもたらした。分析においてｅｉｓプロモーター領域での突然変異に特徴があるＴｍ値を含むことは、ＡＭＫ耐性を検出する感受性を増加させないが、特異性は１００％から９３．８％に減少した（９５％ＣＩ、９１．２から９５．６％）。これらの結果は、ｅｉｓプロモーター突然変異がＬＪ薬剤感受性試験によって明らかにされたようにＡＭＫ耐性に関連しないことを示唆する以前の報告と一致する（Ｃａｍｐｂｅｌｌ ２０１１およびＺａｕｎｂｒｅｃｈｅｒ ２００９）。
【0070】
実施例４．カナマイシン耐性の同定
ＫＡＮ耐性を検出するアッセイの性能はまた、６０３のサンプルのすべてについてゴールデンスタンダードとしてＬＪに基づく薬剤感受性試験を用いて評価された。耐性を明らかにするためにＡ１４０１ＧまたはＣ１４０２Ｔ突然変異のいずれかに典型的な本明細書に開示されたｒｒｓ ＳＭＢにより生成されたＴｍ値を用いて、本アッセイは、８２／１０６サンプルをＫＡＮ耐性として検出した（感受性７７．４％；９５％ＣＩ ６８．０から８４．７％）。逆に、感受性を明らかにするために野生型ターゲットに特徴的なｒｒｓ ＳＭＢ Ｔｍを用いると、４９６／４９７のＫＡＮ感受性サンプルが感受性として同定された（表４）（特異性９９．８％；９５％ＣＩ、９８．７から１００％）。ｅｉｓプロモーター領域において突然変異に特徴的な２つのｅｉｓＳＭＢのＴＭ値を耐性の定義に加えると、１１の追加のＫＡＮ耐性サンプルが耐性として分類されたので、ＫＡＮ耐性を検出する感受性が７７．４％から８７．７％（９５％ＣＩ、７９．５から９３％）に増加した。しかし、ｅｉｓプロモーター突然変異を有する２１のＫＡＮ感受性サンプルが現状ＫＡＮ耐性として「誤って（ｆａｌｓｅｌｙ）」検出されたので、特異性は、９９．８％から９５．６％（９５％ＣＩ、９３．３から９７．１％）に減少した（表４）。
ＫＡＮ耐性を検出するアッセイの性能はまた、６０３のサンプルのすべてについてゴールデンスタンダードとしてＬＪに基づく薬剤感受性試験を用いて評価された。耐性を明らかにするためにＡ１４０１ＧまたはＣ１４０２Ｔ突然変異のいずれかに典型的な本明細書に開示されたｒｒｓ ＳＭＢにより生成されたＴｍ値を用いて、本アッセイは、８２／１０６サンプルをＫＡＮ耐性として検出した（感受性７７．４％；９５％ＣＩ ６８．０から８４．７％）。逆に、感受性を明らかにするために野生型ターゲットに特徴的なｒｒｓ ＳＭＢ Ｔｍを用いると、４９６／４９７のＫＡＮ感受性サンプルが感受性として同定された（表４）（特異性９９．８％；９５％ＣＩ、９８．７から１００％）。ｅｉｓプロモーター領域において突然変異に特徴的な２つのｅｉｓＳＭＢのＴＭ値を耐性の定義に加えると、１１の追加のＫＡＮ耐性サンプルが耐性として分類されたので、ＫＡＮ耐性を検出する感受性が７７．４％から８７．７％（９５％ＣＩ、７９．５から９３％）に増加した。しかし、ｅｉｓプロモーター突然変異を有する２１のＫＡＮ感受性サンプルが現状ＫＡＮ耐性として「誤って（ｆａｌｓｅｌｙ）」検出されたので、特異性は、９９．８％から９５．６％（９５％ＣＩ、９３．３から９７．１％）に減少した（表４）。
【0071】
次に、ＭＧＩＴ結果が利用可能であった５０６のサンプルのゴールドスタンダードとして、ＭＧＩＴに基づく薬剤感受性試験結果を用いて同様の分析を行った。このサブセットは、ｅｉｓプロモーター突然変異のみを有する全てのサンプルを含んでいた。アッセイ結果とＭＧＩＴに基づくゴールドスタンダードとの比較は、ＬＪ培地における不一致なＫＡＮ耐性を有するｅｉｓ突然変異体を明らかにするのに役立った。ＫＡＮ耐性を明らかにするためにゴールドスタンダードとしてＭＧＩＴおよびＡ１４０１ＧまたはＣ１４０２Ｔ突然変異に特徴的なｒｒｓ ＳＭＢ Ｔｍ値のみを用いると、６３／１１３のＫＡＮ耐性サンプルだけがＳＭＢアッセイによって耐性のあるものとして同定された（感受性５５．８％；９５％ＣＩ、４６．１から６５％）。逆に、感受性を明らかにするために野生型ターゲットに特徴的なｒｒｓ ＳＭＢ Ｔｍを用いると、４４５／４４７サンプルをＫＡＮ感受性として同定した（感受性９９．８％；９５％ＣＩ、９＋８．５から１００％；表４）。ＬＪに基づく感受性試験の場合とは異なり、この場合におけるｅｉｓプロモーター突然変異に特徴的なＴｍ値を含むことで、９９．５％（９５％ＣＩ、９８．２から１００％）と非常に高いままであるＫＡＮ耐性のアッセイの特異性を用いて、耐性試験の感受性が５５．８％から８２．３％へと増加した。したがって、ＭＧＩＴに基づく感受性試験に基づいて、ｅｉｓアッセイは、特異性に影響を及ぼすことなく２９の追加のＫＡＮ耐性サンプルの検出を可能にした（表４）。
【0072】
実施例５．本アッセイおよびＭｉｃによって検出された突然変異間の関係
本明細書で開示されるアッセイにより明らかにされた耐性と本明細書で開示される２つの表現型感受性試験方法によって明らかにされた耐性との間の不一致は、主にｅｉｓプロモーター突然変異を有する単離株に関係していた。以前の研究は、ｅｉｓプロモーター突然変異が比較的低レベルのＫＡＮ耐性を引き起こし、一方ｒｓｓ遺伝子突然変異がＡＭＫ、ＫＡＮおよびＣＡＰに対する高レベルの耐性をもたらすことを示している（Ｃａｍｐｂｅｌｌ ２０１１；Ｄｕ，Ｑ．，ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｄｉａｇｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ ７７：１３８－１４２；Ｇｅｏｒｇｈｉｏｕ ２０１２；およびＺａｕｎｂｒｅｃｈｅｒ ２００９）。結果についてのさらなる知見は、ＬＪ対ＭＧＩＴに基づく感受性試験結果の間の不一致であった。ＭＩＣ試験は、ｒｒｓおよびｅｉｓプロモーター突然変異、ならびにＬＪおよびＭＧＩＴシステムにおけるそれらの感受性パターンの間の関係をより慎重に探索するために行われた。ＡＭＫおよびＫＡＮ（およびターゲット領域の両方で野生型）の両方に対して感受性であるもの、または２つのターゲット遺伝子（ｒｒｓ Ａ１４０１Ｇならびにｅｉｓ Ｇ（－１０）Ａ、Ｃ（－１４）ＴおよびＧ（－３７）Ｔ）における最も一般的な突然変異型を代表するように選択されるものいずれかであるサンプルは、ＭＹＣＯＴＢ法によって試験され、それらのＭＩＣを決定した。アッセイターゲットの両方における野生型として知られる追加の単離株もまた、コントロールとして試験された。ｅｉｓプロモーター突然変異のみ（ｒｒｓ突然変異なし）を有する単離株のＡＭＫ ＭＩＣは、０．５μｇ／ｍｌから１μｇ／ｍｌのＭＩＣを示すサンプルの大部分で、０．２５μｇ／ｍｌおよび２μｇ／ｍｌの間の範囲であることが観察された（図３）。一つのｅｉｓプロモーター突然変異体だけが４μｇ／ｍｌのＡＭＫ ＭＩＣを有した。ｅｉｓプロモーターまたはｒｒｓ突然変異を有さないコントロールの単離株は、０．２５μｇ／ｍｌおよび０．５μｇ／ｍｌの範囲の間にＭＩＣを有した。したがって、野生型または突然変異体のｅｉｓプロモーター配列のいずれかを有する単離株のＡＭＫ ＭＩＣは、実質的に重複していた。一方、同じｅｉｓプロモーター突然変異のほとんどのＫＡＮ ＭＩＣは、５μｇ／ｍｌから２０μｇ／ｍｌの範囲であり、一つの単離株が４０μｇ／ｍｌのＭＩＣを示した（図３）。２つのｅｉｓプロモーター突然変異体だけが２．５μｇ／ｍｌの低いＭＩＣを有した。野生型ｅｉｓプロモーター配列を有する単離株は、ｅｉｓプロモーター突然変異体の平均ＭＩＣの２から３０分の１である、０．６μｇ／ｍｌおよび２．５μｇ／ｍｌの間のＭＩＣを示した（図３）。したがって、ＡＭＫの状況とは対照的に、野生型単離体のＫＡＮ ＭＩＣは、ｅｉｓプロモーター突然変異体のＫＡＮ ＭＩＣとほとんど重複しなかった。これらの結果は、耐性がＬＪに基づくまたはＭＧＩＴに基づく感受性試験で検出されなくても、ｅｉｓプロモーター突然変異体が小から中レベルＫＡＮ耐性を有すると考えられるべきであることを強く示唆する。
本明細書で開示されるアッセイにより明らかにされた耐性と本明細書で開示される２つの表現型感受性試験方法によって明らかにされた耐性との間の不一致は、主にｅｉｓプロモーター突然変異を有する単離株に関係していた。以前の研究は、ｅｉｓプロモーター突然変異が比較的低レベルのＫＡＮ耐性を引き起こし、一方ｒｓｓ遺伝子突然変異がＡＭＫ、ＫＡＮおよびＣＡＰに対する高レベルの耐性をもたらすことを示している（Ｃａｍｐｂｅｌｌ ２０１１；Ｄｕ，Ｑ．，ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｄｉａｇｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ ７７：１３８－１４２；Ｇｅｏｒｇｈｉｏｕ ２０１２；およびＺａｕｎｂｒｅｃｈｅｒ ２００９）。結果についてのさらなる知見は、ＬＪ対ＭＧＩＴに基づく感受性試験結果の間の不一致であった。ＭＩＣ試験は、ｒｒｓおよびｅｉｓプロモーター突然変異、ならびにＬＪおよびＭＧＩＴシステムにおけるそれらの感受性パターンの間の関係をより慎重に探索するために行われた。ＡＭＫおよびＫＡＮ（およびターゲット領域の両方で野生型）の両方に対して感受性であるもの、または２つのターゲット遺伝子（ｒｒｓ Ａ１４０１Ｇならびにｅｉｓ Ｇ（－１０）Ａ、Ｃ（－１４）ＴおよびＧ（－３７）Ｔ）における最も一般的な突然変異型を代表するように選択されるものいずれかであるサンプルは、ＭＹＣＯＴＢ法によって試験され、それらのＭＩＣを決定した。アッセイターゲットの両方における野生型として知られる追加の単離株もまた、コントロールとして試験された。ｅｉｓプロモーター突然変異のみ（ｒｒｓ突然変異なし）を有する単離株のＡＭＫ ＭＩＣは、０．５μｇ／ｍｌから１μｇ／ｍｌのＭＩＣを示すサンプルの大部分で、０．２５μｇ／ｍｌおよび２μｇ／ｍｌの間の範囲であることが観察された（図３）。一つのｅｉｓプロモーター突然変異体だけが４μｇ／ｍｌのＡＭＫ ＭＩＣを有した。ｅｉｓプロモーターまたはｒｒｓ突然変異を有さないコントロールの単離株は、０．２５μｇ／ｍｌおよび０．５μｇ／ｍｌの範囲の間にＭＩＣを有した。したがって、野生型または突然変異体のｅｉｓプロモーター配列のいずれかを有する単離株のＡＭＫ ＭＩＣは、実質的に重複していた。一方、同じｅｉｓプロモーター突然変異のほとんどのＫＡＮ ＭＩＣは、５μｇ／ｍｌから２０μｇ／ｍｌの範囲であり、一つの単離株が４０μｇ／ｍｌのＭＩＣを示した（図３）。２つのｅｉｓプロモーター突然変異体だけが２．５μｇ／ｍｌの低いＭＩＣを有した。野生型ｅｉｓプロモーター配列を有する単離株は、ｅｉｓプロモーター突然変異体の平均ＭＩＣの２から３０分の１である、０．６μｇ／ｍｌおよび２．５μｇ／ｍｌの間のＭＩＣを示した（図３）。したがって、ＡＭＫの状況とは対照的に、野生型単離体のＫＡＮ ＭＩＣは、ｅｉｓプロモーター突然変異体のＫＡＮ ＭＩＣとほとんど重複しなかった。これらの結果は、耐性がＬＪに基づくまたはＭＧＩＴに基づく感受性試験で検出されなくても、ｅｉｓプロモーター突然変異体が小から中レベルＫＡＮ耐性を有すると考えられるべきであることを強く示唆する。
【0073】
実施例６．Ｍ．ｔｂ以外の菌に対するアッセイ特異性
本アッセイの分析特異性は、ＡＴＣＣリポジトリ（Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ、ＵＳＡ）から得られた非結核性マイコバクテリア（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）（ＮＴＭ）の１８種、２６種を代表する１２１の臨床ＮＴＭ株、ならびにグラム陽性およびグラム陰性菌の１８種のパネルに対して試験された。本アッセイでターゲットとするｒｒｓ領域は、異なるＮＴＭ種の間で高度に保存されている。したがって、ｒｒｓアッセイは、いかなるＴｍも生成しない、Ｍ・ゼノピ（Ｍ．ｘｅｎｏｐｉ）を除き、配列ホモロジーに基づいて予想されたとおり、試験したすべてのＮＴＭについて７０℃のＴｍを生成した（野生型Ｍ．ｔｂ ＤＮＡの存在下で生成されたＴｍと同一である）。アミノグリコシド感受性Ｍ．ｔｂと同一のＴｍ値を生成するＮＴＭ種は、偽の耐性試験結果の原因になるとは予想されない。ｒｒｓ突然変異体ＡＭＫおよびＫＡＮ耐性株からのＭ．ｔｂ ＤＮＡが１０から２０倍過剰なＮＴＭ ＤＮＡと混合された場合、明確な二重Ｔｍピークがアッセイによって生成され、Ｍ．ｔｂターゲットからの突然変異体Ｔｍ値およびＮＴＭ配列からの野生型Ｔｍ値（データ示さず）に相当することは、耐性－関連ｒｒｓ突然変異がＮＴＭ ＤＮＡの大きなバックグラウンドの存在下でさえ本アッセイによってＭ．ｔｂで検出され得ることを示している。１０７ゲノム当量のＤＮＡをＰＣＲアッセイに添加した場合でさえ、試験した任意のＮＴＭ種の存在下で、ｅｉｓプローブによって明らかな融解曲線は生成されなかった。グラム陽性またはグラム陰性菌のいずれも、ｒｒｓまたはｅｉｓ ＳＭＢのいずれにもＴｍ値を生成しなかった；したがって、それらは、アッセイによって生成されるべきいかなる偽の耐性コールを引き起こさなかった。
本アッセイの分析特異性は、ＡＴＣＣリポジトリ（Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ、ＵＳＡ）から得られた非結核性マイコバクテリア（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）（ＮＴＭ）の１８種、２６種を代表する１２１の臨床ＮＴＭ株、ならびにグラム陽性およびグラム陰性菌の１８種のパネルに対して試験された。本アッセイでターゲットとするｒｒｓ領域は、異なるＮＴＭ種の間で高度に保存されている。したがって、ｒｒｓアッセイは、いかなるＴｍも生成しない、Ｍ・ゼノピ（Ｍ．ｘｅｎｏｐｉ）を除き、配列ホモロジーに基づいて予想されたとおり、試験したすべてのＮＴＭについて７０℃のＴｍを生成した（野生型Ｍ．ｔｂ ＤＮＡの存在下で生成されたＴｍと同一である）。アミノグリコシド感受性Ｍ．ｔｂと同一のＴｍ値を生成するＮＴＭ種は、偽の耐性試験結果の原因になるとは予想されない。ｒｒｓ突然変異体ＡＭＫおよびＫＡＮ耐性株からのＭ．ｔｂ ＤＮＡが１０から２０倍過剰なＮＴＭ ＤＮＡと混合された場合、明確な二重Ｔｍピークがアッセイによって生成され、Ｍ．ｔｂターゲットからの突然変異体Ｔｍ値およびＮＴＭ配列からの野生型Ｔｍ値（データ示さず）に相当することは、耐性－関連ｒｒｓ突然変異がＮＴＭ ＤＮＡの大きなバックグラウンドの存在下でさえ本アッセイによってＭ．ｔｂで検出され得ることを示している。１０７ゲノム当量のＤＮＡをＰＣＲアッセイに添加した場合でさえ、試験した任意のＮＴＭ種の存在下で、ｅｉｓプローブによって明らかな融解曲線は生成されなかった。グラム陽性またはグラム陰性菌のいずれも、ｒｒｓまたはｅｉｓ ＳＭＢのいずれにもＴｍ値を生成しなかった；したがって、それらは、アッセイによって生成されるべきいかなる偽の耐性コールを引き起こさなかった。
【0074】
実施例７．ＡＭＫおよびＫＡＮ耐性のさらなる遺伝的原因
この実施例における研究は、ＡＭＫおよび／またはＫＡＮに対して耐性であるが、野生型ｒｒｓ遺伝子およびｅｉｓプロモーター配列を有する２２のサンプルを含んでいた。最近の研究により、ｗｈｉＢ７遺伝子の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）での突然変異がＭ．ｔｂにおけるアミノグリコシド耐性を引き起こすことが示唆されている。ｗｈｉＢ７突然変異が表現型の上では耐性であるがアッセイ－感受性である単離株のいくつかの原因でありうるかどうかを決定するために、２２サンプル全ては、ｗｈｉＢ７遺伝子開始部位の上流４１２ｂｐ領域、加えてｗｈｉＢ７オープンリーディングフレームの一部分において、配列決定された。コントロールセットとして、３０のランダムに選別された総感受性単離株もまた、配列決定された。２２の不一致な単離株のうち、３人の患者からの６の単離株がｗｈｉＢ７ ５’ＵＴＲ領域において突然変異を示した。転写開始部位を＋１と考えると、１つのサンプルは、５’ＵＴＲの＋１３８位にシトシン欠失を有し、一人の患者からの２つのサンプルは、＋２３７位にＡからＧの突然変異を含み、ただ一人の患者からの残りの３つのサンプルは、＋２３７位にＡからＧの突然変異を示した（表５）（Ｒｅｅｖｅｓ，Ａ．Ｚ．，２０１３，５７：１８５７－１８６５）。ただ一人の患者からの３つのサンプルは、機能するポジティブＰＣＲコントロールにもかかわらず、繰り返しＰＣＲを試した後、５’ＵＴＲからのいかなる増幅も生成しなかった。これは、２７５ｂｐの断片が３つのサンプル全てについてｗｈｉＢ７ ＯＲＦ内から容易に増幅されうるため、５’ＵＴＲ領域での大きな欠失の存在を示唆した。ｗｈｉＢ７突然変異を有するすべてのサンプルは、ｅｉｓ遺伝子の上方制御によって推定されるｗｈｉＢ７作用機序と一致するＫＡＮに対してのみ耐性であった（Ｒｅｅｖｅｓ ２０１３）。これらの単離株についてのＫＡＮ ＭＩＣはまた、５μｇ／ｍｌと低く、これはｅｉｓプロモーター突然変異株で観察されたものと同じであった。アミノグリコシドに感受性である３０のコントロールサンプルのいずれも、ｗｈｉＢ７遺伝子の５’ＵＴＲにいかなる突然変異も有していなかった。これらの突然変異とアミノグリコシド耐性を有するｗｈｉＢ７遺伝子の５’ＵＴＲにおける欠失との関係を確認するために、さらなる研究が必要である。しかし、感受性株にかかる突然変異が存在しないことは、それらがアミノグリコシド耐性において何らかの役割を有するであろうことを暗示し、さらなるアッセイが低レベルＫＡＮ耐性を検出するための感受性を改善するためにこれらの突然変異をターゲットにすることができる。
この実施例における研究は、ＡＭＫおよび／またはＫＡＮに対して耐性であるが、野生型ｒｒｓ遺伝子およびｅｉｓプロモーター配列を有する２２のサンプルを含んでいた。最近の研究により、ｗｈｉＢ７遺伝子の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）での突然変異がＭ．ｔｂにおけるアミノグリコシド耐性を引き起こすことが示唆されている。ｗｈｉＢ７突然変異が表現型の上では耐性であるがアッセイ－感受性である単離株のいくつかの原因でありうるかどうかを決定するために、２２サンプル全ては、ｗｈｉＢ７遺伝子開始部位の上流４１２ｂｐ領域、加えてｗｈｉＢ７オープンリーディングフレームの一部分において、配列決定された。コントロールセットとして、３０のランダムに選別された総感受性単離株もまた、配列決定された。２２の不一致な単離株のうち、３人の患者からの６の単離株がｗｈｉＢ７ ５’ＵＴＲ領域において突然変異を示した。転写開始部位を＋１と考えると、１つのサンプルは、５’ＵＴＲの＋１３８位にシトシン欠失を有し、一人の患者からの２つのサンプルは、＋２３７位にＡからＧの突然変異を含み、ただ一人の患者からの残りの３つのサンプルは、＋２３７位にＡからＧの突然変異を示した（表５）（Ｒｅｅｖｅｓ，Ａ．Ｚ．，２０１３，５７：１８５７－１８６５）。ただ一人の患者からの３つのサンプルは、機能するポジティブＰＣＲコントロールにもかかわらず、繰り返しＰＣＲを試した後、５’ＵＴＲからのいかなる増幅も生成しなかった。これは、２７５ｂｐの断片が３つのサンプル全てについてｗｈｉＢ７ ＯＲＦ内から容易に増幅されうるため、５’ＵＴＲ領域での大きな欠失の存在を示唆した。ｗｈｉＢ７突然変異を有するすべてのサンプルは、ｅｉｓ遺伝子の上方制御によって推定されるｗｈｉＢ７作用機序と一致するＫＡＮに対してのみ耐性であった（Ｒｅｅｖｅｓ ２０１３）。これらの単離株についてのＫＡＮ ＭＩＣはまた、５μｇ／ｍｌと低く、これはｅｉｓプロモーター突然変異株で観察されたものと同じであった。アミノグリコシドに感受性である３０のコントロールサンプルのいずれも、ｗｈｉＢ７遺伝子の５’ＵＴＲにいかなる突然変異も有していなかった。これらの突然変異とアミノグリコシド耐性を有するｗｈｉＢ７遺伝子の５’ＵＴＲにおける欠失との関係を確認するために、さらなる研究が必要である。しかし、感受性株にかかる突然変異が存在しないことは、それらがアミノグリコシド耐性において何らかの役割を有するであろうことを暗示し、さらなるアッセイが低レベルＫＡＮ耐性を検出するための感受性を改善するためにこれらの突然変異をターゲットにすることができる。
【0075】
【表3】
【0076】
ＳＤは、異なる臨床サンプルのプローブそれぞれのＴｍ値の＋／－標準偏差を表し、ｄＴｍは、各プローブの野生型配列と突然変異体配列とのＴｍ差を表す。
【0077】
ＳＤ；標準偏差、ｄＴｍ：デルタＴｍ
プローブ番号１、２および３は、それぞれｒｒｓ－１４００、ｅｉｓ－１およびｅｉｓ－２プローブに対応する。
プローブ番号１、２および３は、それぞれｒｒｓ－１４００、ｅｉｓ－１およびｅｉｓ－２プローブに対応する。
【0078】
【表4】
【0079】
ＬＪおよびＭＧＩＴは、それぞれＬＪ比率およびＭＧＩＴ法による感受性試験を意味する。
【0080】
【表5】
【0081】
ＬＪおよびＭＧＩＴは、それぞれＬＪ比率およびＭＧＩＴ法による感受性試験を意味する。
【0082】
ＮＤ：未決定、ＮＭ：変異なし、Ｒ：耐性、Ｓ：感受性。
【0083】
好ましい実施形態である前述の実施例は、特許請求の範囲により規定される本発明を限定するものではなく、例示とされるべきである。容易に理解されるように、上記特徴の多くの変形および組み合わせは、特許請求の範囲に記載された本発明から逸脱することなく利用することができる。かかる変形は、本発明の範囲からの逸脱とは見なされず、かかる変形のすべては、下記の特許請求の範囲内に含まれるものとする。本明細書に引用されるすべての参考文献は、その全体が参照により組み込まれる。
【図1】
【図2】
【図3】
【配列表】