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特許7432244アルツハイマー病の病原性因子としてのグラニンの同定、およびグラニン凝集を阻害し、アルツハイマー病を治療するための組成物及び方法

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-02-07

(45)【発行日】2024-02-16

(54)【発明の名称】アルツハイマー病の病原性因子としてのグラニンの同定、およびグラニン凝集を阻害し、アルツハイマー病を治療するための組成物及び方法

(51)【国際特許分類】

A61K 31/05 20060101AFI20240208BHJP

A61K 31/353 20060101ALI20240208BHJP

A61K 31/517 20060101ALI20240208BHJP

A61K 31/7076 20060101ALI20240208BHJP

A61P 25/28 20060101ALI20240208BHJP

【ＦＩ】

A61K31/05

A61K31/353

A61K31/517

A61K31/7076

A61P25/28

【請求項の数】 9

(21)【出願番号】P 2020555225

(86)(22)【出願日】2019-04-12

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2021-08-26

(86)【国際出願番号】 KR2019004409

(87)【国際公開番号】W WO2019199099

(87)【国際公開日】2019-10-17

【審査請求日】2020-12-08

【審判番号】

【審判請求日】2022-08-15

(31)【優先権主張番号】62/657,601

(32)【優先日】2018-04-13

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】520488481

【氏名又は名称】ユ、スンヒョン

(74)【代理人】

【識別番号】100130111

【弁理士】

【氏名又は名称】新保斉

(72)【発明者】

【氏名】ユ、スンヒョン

【合議体】

【審判長】前田佳与子

【審判官】吉田佳代子

【審判官】磯部洋一郎

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１７／０３１３００（ＷＯ，Ａ１）

【文献】米国特許出願公開第２００８／００２６０８６（ＵＳ，Ａ１）

【文献】米国特許出願公開第２００９／０１６３５８０（ＵＳ，Ａ１）

【文献】特表２００３－５３２６３４（ＪＰ，Ａ）

【文献】米国特許出願公開第２０１１／０１１１０１４（ＵＳ，Ａ１）

【文献】韓国公開特許第１０－２０１５－００４０６１８（ＫＲ，Ａ）

【文献】ＣＮＡ＆ＮｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌＤｉｓｏｒｄｅｒｓ：ＤｒｕｇＴａｒｇｅｔｓ、２０１７年、Ｖｏｌ．１６、Ｎｏ．４、ｐ．３８７－３９７

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

低分子量形態から高分子量凝集形態へのグラニンの凝集を阻害するための組成物であって、
ｉ）スクテラレイン、ルテオリン、バイカレイン、ケンフェロール、ケルセチン、アピゲニン、タンゲレチン、ミリセチン、フィセチンおよびモリンから選択されるアントキサンチン；ii）レスベラトロール；iii）エピガロカテキン３－ガレート（ＥＧＣＧ）；およびiv）コルジセピン、５，７－ジメトキシフラボン、およびチルホスチンＡＧ１４７８；の４つの各グループ（i～iv）からそれぞれ少なくとも１つ選択された4つ以上の化合物を含む
ことを特徴とする組成物。

【請求項2】

スクテラレイン、ルテオリン、バイカレイン、ケンフェロール、ケルセチン、アピゲニン、タンゲレチン、ミリセチン、フィセチン、モリン、レスベラトロール、エピガロカテキン３－ガレート（ＥＧＣＧ）、コルジセピン、５，７－ジメトキシフラボン、およびチルホスチンＡＧ１４７８のうちの少なくとも４つを含む
請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

動物の神経系において金属イオンＺｎ^２＋、Ｃｕ^２＋、Ｆｅ^２＋およびＣａ^２＋の１つ以上を低減、阻害、抑制または隔離する１つ以上の薬剤（ａｇｅｎｔ）をさらに含み、前記薬剤は、金属タンパク質、カゼイン、アルブミン、セルロプラスミン、カルモジュリン、トロポニン、フェリチン、トランスフェリン、ラクトフェリン、およびアントシアニンから選択される
請求項１に記載の組成物。

【請求項4】

グラニンと金属イオンとの相互作用を阻害するための組成物であって、
ｉ）スクテラレイン、ルテオリン、バイカレイン、ケンフェロール、ケルセチン、アピゲニン、タンゲレチン、ミリセチン、フィセチンおよびモリンから選択されるアントキサンチン；ii）レスベラトロール；iii）エピガロカテキン３－ガレート（ＥＧＣＧ）；およびiv）コルジセピン、５，７－ジメトキシフラボン、およびチルホスチンＡＧ１４７８；の４つの各グループ（i～iv）からそれぞれ少なくとも１つ選択された4つ以上の化合物を含む
ことを特徴とする組成物。

【請求項5】

スクテラレイン、ルテオリン、バイカレイン、ケンフェロール、ケルセチン、アピゲニン、タンゲレチン、ミリセチン、フィセチン、モリン、レスベラトロール、エピガロカテキン３－ガレート、コルジセピン、５，７－ジメトキシフラボンおよびチルホスチンＡＧ１４７８のうちの少なくとも４つを含む
請求項４に記載の組成物。

【請求項6】

動物の神経系において、Ｚｎ^２＋、Ｃｕ^２＋、Ｆｅ^２＋およびＣａ^２＋から選択される金属イオンを低減、阻害、抑制または隔離する１つ以上の薬剤をさらに含み、
前記薬剤は、金属タンパク質、カゼイン、アルブミン、セルロプラスミン、カルモジュリン、トロポニン、フェリチン、トランスフェリン、ラクトフェリン、およびアントシアニンから選択される
請求項４に記載の組成物。

【請求項7】

認知症またはアルツハイマー病の治療または予防のための薬学的組成物であって、
ｉ）スクテラレイン、ルテオリン、バイカレイン、ケンフェロール、ケルセチン、アピゲニン、タンゲレチン、ミリセチン、フィセチンおよびモリンから選択されるアントキサンチン；ii）レスベラトロール；iii）エピガロカテキン３－ガレート（ＥＧＣＧ）；およびiv）コルジセピン、５，７－ジメトキシフラボン、およびチルホスチンＡＧ１４７８；の４つの各グループ（i～iv）からそれぞれ少なくとも１つ選択された4つ以上の化合物を含む
ことを特徴とする組成物。

【請求項8】

スクテラレイン、ルテオリン、バイカレイン、ケンフェロール、ケルセチン、アピゲニン、タンゲレチン、ミリセチン、フィセチン、モリン、レスベラトロール、エピガロカテキン３－ガレート、コルジセピン、５，７－ジメトキシフラボン、モリンおよびチルホスチンＡＧ１４７８のうちの少なくとも４つを含む
請求項７に記載の組成物。

【請求項9】

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

以下の説明は、本発明を理解するのに有用であり得る情報を含む。これは、ここに提供された情報のいずれかが、現在記述されているかもしくは請求項に記載されている発明の先行技術であるかまたは関連するものであること、または、具体的にもしくは暗黙的に参照されている出版物あるいは文書が先行技術であることを認めるものではない。

【背景技術】

【0002】

アルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓＤｉｓｅａｓｅ；ＡＤ）患者の脳は、老人斑（ｓｅｎｉｌｅｐｌａｑｕｅ）と呼ばれるタンパク質凝集体を持っていることが知られており、アルツハイマー病患者の臨床的重症度は、これらの老人斑に直接関連されている（非特許文献１－２）。したがって、アルツハイマー病の治療法を見つけるための過去の取り組みは、主に、これらの老人斑の研究に焦点を当ててきた。老人斑の成分を見つけ、老人斑の形成の阻害、または老人斑のタンパク質成分の凝集を妨害することにより、既に形成された老人斑の破壊および／または減少のいずれかの方法を考案しようと取り組んだ（非特許文献２－３）。同定された老人斑の主要成分は、β－アミロイド（ｂｅｔａ－ａｍｙｌｏｉｄ；Ａβ）とグラニン（クロモグラニン（ｃｈｒｏｍｏｇｒａｎｉｎｓ）とセクレトグラニン（ｓｅｃｒｅｔｏｇｒａｉｎｉｎｓ））である（非特許文献２－５）。老人斑に見られるβ－アミロイドは～４２個のアミノ酸からなり、グラニンタンパク質は主に～４３０－７００個のアミノ酸からなる（非特許文献６－８）。

【0003】

伝統的に、アルツハイマー病の治療法を見つけるためのほとんどすべての努力は、β－アミロイド（Ａβ）に集中しており、成功していない（非特許文献１－３、９－１０）。その結果、人間は治療法なしにこの致命的な病気に無力にさらされており、アルツハイマー病の治療に関連する世界の年間支出は約１兆ドルに達する。地球規模の悲惨な状況にもかかわらず、世界規模で約３０年以上にわたる広範な努力の後でさえ、パイプラインでこの病気と戦う有望な薬物は現在ない（非特許文献９－１０）。この行き止まりは、主に標的タンパク質として老人斑のマイナーなコンポーネントであるβ－アミロイドに主に焦点を当てた、アルツハイマー病の治療法を見つけるための世界的な取り組みにおける狭いアプローチによって引き起こされたようである。

【0004】

実際、アルツハイマー病（ＡＤ）の特徴は、脳間質（ｂｒａｉｎｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉｕｍ）における老人斑として知られる脳タンパク質の細胞外凝集体の存在である（非特許文献１－３）。老人斑は、脳タンパク質の凝集体、すなわちグラニンとβ－アミロイドの凝集体で構成されている（非特許文献９－１０）。これらのうち、グラニンはβ－アミロイドよりも著しく大きく、脳内ではβ－アミロイドよりはるかに豊富である（非特許文献６－８）。本出願では、凝集されたグラニンがアルツハイマー病の病原因子であり、金属イオンがアルツハイマー病の補因子（ｃｏ－ｆａｃｔｏｒ）であることを確認するだけでなく、金属によって引き起こされるグラニンの凝集を阻害すると、アルツハイマー病を予防し、少なくとも部分的な治癒につながる可能性があることを指摘している。したがって、グラニン凝集および凝集されたグラニンの毒性を阻害するための組成物および方法に一般的に関連する実験的発見および発明を報告する。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0005】

【文献】Ｇｌａｓｓｅｔａｌ．，２０１０

【文献】Ｈｅｎｅｋａｅｔａｌ．，２０１０

【文献】Ｈｅｎｅｋａｅｔａｌ．，２０１５

【文献】Ｗｉｌｌｉｓｅｔａｌ．，２００８

【文献】Ｗｉｌｌｉｓｅｔａｌ．，２０１１

【文献】Ｂａｒｔｏｌｏｍｕｃｃｉｅｔａｌ．，２０１１

【文献】Ｈｅｌｌｅ，２０００

【文献】Ｔａｕｐｅｎｏｔｅｔａｌ．，２００３

【文献】Ｄｏｏｄｙｅｔａｌ．，２０１４

【文献】Ｓａｌｌｏｗａｙｅｔａｌ．，２０１４

【文献】Ｂｒｉｎｋｍａｌｍｅｔａｌ．，２０１８

【文献】Ｄｕｉｔｓｅｔａｌ．，２０１８

【文献】Ｍａｔｔｓｓｏｎｅｔａｌ．，２０１３

【文献】Ｓｈａｗｅｔａｌ．，２００９

【文献】Ｗｉｌｄｓｍｉｔｈｅｔａｌ．，２０１４

【文献】Ｔｗｉｇｅｔａｌ．，２００５

【文献】Ｗｕｅｔａｌ．，２０１３

【文献】Ｆａｌｌｅｒｅｔａｌ、２０１４

【文献】ＷａｎｇａｎｄＸｕ、２０１１

【文献】Ｗａｒｄｅｔａｌ．，２０１４

【文献】Ｙａｔｅｓｅｔａｌ．，１９９０

【文献】Ｚａｔｔａｅｔａｌ．，２００９

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

本明細書で説明および特許請求される発明は、本概要で記載または説明または参照されるものを含むが、これらに限定されない多くの属性および実施形態を有する。本明細書で説明および特許請求される発明は、本概要で識別される特徴または実施形態に限定されるものではなく、説明のためにのみ含まれ、制限のためのものではない。

【0007】

本願では、老人斑の形成における老人斑の主成分タンパク質であるグラニンの寄与、および脳細胞の病原性発達におけるグラニンの潜在的な役割を研究した。この研究は、無毒性の低分子量形態から毒性の高分子量凝集形態へのグラニンの凝集を阻害する、および／または高分子量凝集形態を低分子量形態に解離するための組成物の開発につながった。このような組成物は、典型的には、本明細書で分解化合物（ｄｉｓａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎｃｏｍｐｏｕｎｄ）と呼ばれる１つ以上の活性化合物（ａｃｔｉｖｅｃｏｍｐｏｕｎｄ）または薬剤（ａｇｅｎｔ）を含む。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本明細書に記載される１つの態様は、グラニンの低分子量形態から高分子量凝集形態への凝集を調節、阻害または抑制すること、および／または高分子量凝集形態を低分子量形態に解離することである。

【0009】

より詳細には、低分子量形態から高分子量凝集形態へのグラニンの凝集を阻害する、および／または高分子量凝集形態を低分子量形態に解離するための組成物が提供される。このような組成物は、典型的には、グラニンの低分子量形態から高分子量凝集形態への凝集を阻害、防止または調節する、および／または高分子量凝集形態を低分子量形態に解離する１つ以上の分解化合物を含む。

【0010】

本明細書に記載されている特定のアントキサンチン（ａｎｔｈｏｘａｎｔｈｉｎ）化合物は、好ましい分解化合物である。したがって、本明細書で提供される特定の実施形態は、グラニンと金属イオンとの相互作用および／またはグラニンの金属誘導凝集を阻害するための組成物を使用する方法に関するものであり、この組成物は、少なくとも１つの分解化合物として１つ以上のアントキサンチンを含む。

【0011】

本明細書で提供される別の態様は、アルツハイマー病および他の神経変性疾患を引き起こす脳細胞の病因（ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ）を低減、阻害または抑制するために、動物の脳におけるグラニンの凝集を調節、阻害または抑制することである。

【0012】

また別の態様では、グラニンと金属イオンとの相互作用を調節、阻害または防止する方法が提供される。この態様による実施形態では、グラニンと、Ｚｎ^２＋、Ｃｕ^２＋、Ｆｅ^２＋およびＣａ^２＋から選択される金属イオンまたは補因子との相互作用または結合を阻害、防止または調節する分解化合物が提供される。

【0013】

また別の態様では、本明細書で提供される分解化合物は、動物の神経系におけるグラニンと金属イオンとの相互作用または結合を阻害、防止または調節するために、Ｚｎ^２＋、Ｃｕ^２＋、Ｆｅ^２＋およびＣａ^２＋から選択される金属イオンを低減、阻害、抑制または隔離することにより、低分子量形態から高分子量凝集形態へのグラニンの凝集を調節、阻害または防止する、および／または高分子量凝集形態を低分子量形態に解離する機能を有する。

【0014】

また別の態様では、グラニンの低分子量形態から高分子量凝集形態への凝集を調節、阻害または防止する方法、および／または高分子量凝集形態を低分子量形態に解離する方法が提供される。

【0015】

また別の態様では、細胞毒性を低減または阻害する方法が提供される。特定の実施形態では、この方法は、低分子量形態から高分子量凝集形態へのグラニンの凝集を阻害するための組成物を投与すること、および／または高分子量凝集形態を低分子量形態に解離することを含む。

【0016】

また別の態様では、認知症またはアルツハイマー病の治療または予防のための方法が提供される。特定の実施形態では、これらの方法は、低分子量形態から高分子量凝集形態へのグラニンの凝集を阻害するための組成物を使用する。

【0017】

本発明の態様の他の特徴および利点は、例として本発明の態様の原理を示す添付の図面と併せて、以下のより詳細な説明から明らかになるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0018】

添付の図面は、本発明の態様を示す。

【図1】アルツハイマー病患者の脳海馬におけるクロモグラニンＡ（ａ、ｄ）、セクレトグラニンII（ｂ、ｅ）、クロモグラニンＢ（ｃ、ｆ）の免疫染色（写真では黒く表示）を示す。バー（ｂａｒ）＝１００μｍ（ａ）、２００μｍ（ｂ、ｃ）、４０μｍ（ｄ）、８０μｍ（ｅ、ｆ）。

【図2】アルツハイマー病（ＡＤ）患者の脳海馬におけるクロモグラニンＢ（Ａ、Ｃ）およびβ－アミロイド（Ｂ、Ｄ）の存在を示す。

【図3】クロモグラニンＡ（ＣＧＡ）－（パネルＡ）およびβ－アミロイド（Ａβ）－（パネルＢ）による、脳免疫細胞ミクログリア（ｂｒａｉｎｉｍｍｕｎｅｃｅｌｌｍｉｃｒｏｇｌｉａ）からの一酸化窒素（ＮＯ）および腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦα）の誘導放出の用量反応効果を示す。

【図4】精製された天然のクロモグラニンＢ（ｃ）、セクレトグラニンII（ｄ）、およびクロモグラニンＡ（ｂ）を示す。

【図5】増加するＦｅ^２＋濃度の関数としてのクロモグラニンＡの凝集を示す。

【図6】増加するＦｅ^２＋濃度の関数としてのクロモグラニンＢの凝集を示す。

【図7】増加するＦｅ^２＋濃度の関数としてのセクレトグラニンIIの凝集を示す。

【図8】増加するＺｎ^２＋濃度の関数としてのクロモグラニンＢの凝集を示す。

【図9】増加するＺｎ^２＋濃度の関数としてのセクレトグラニンIIの凝集を示す。

【図10】増加するＣｕ^２＋濃度の関数としてのセクレトグラニンIIの凝集を示す。

【図11】スクテラレイン（ｓｃｕｔｅｌｌａｒｅｉｎ）による、Ｃｕ^２＋誘導クロモグラニンＡ凝集の抑制を示す。Ｃｕ^２＋誘導クロモグラニンＡ凝集（０．００５ｍｇ／ｍｌ）（０．１μＭ）は、ｐＨ７．４で１μＭスクテラレインによってほとんど抑制された。Ｃｕ^２＋の濃度の増加によるクロモグラニンＡの凝集は黒い線（黒丸）で表され、スクテラレインの存在下では灰色の線（白丸）で表される。

【図12】スクテラレインによる、Ｃｕ^２＋誘導セクレトグラニンII凝集の抑制を示す。Ｃｕ^２＋誘導セクレトグラニンII凝集（０．００５ｍｇ／ｍｌ）（０．０７μＭ）は、ｐＨ７．４で１μＭスクテラレインによってほとんど阻害された。Ｃｕ^２＋の濃度の増加によるセクレトグラニンIIの凝集は黒い線（黒丸）で表され、スクテラレインの存在下では灰色の線（白丸）で表される。

【図13】ルテオリン（ｌｕｔｅｏｌｉｎ）による、Ｆｅ^２＋誘導クロモグラニンＢ凝集の抑制を示す。Ｆｅ^２＋誘導クロモグラニンＢ凝集（０．００５ｍｇ／ｍｌ）（０．０６μＭ）は、ｐＨ７．４で１μＭルテオリンによってほとんど阻害された。Ｆｅ^２＋の濃度の増加によるクロモグラニンＢの凝集は黒い線（黒丸）で表され、ルテオリンの存在下では灰色の線（白丸）で表される。

【図14】ルテオリンによる、Ｆｅ^２＋誘導セクレトグラニンII凝集の抑制を示す。Ｆｅ^２＋誘導セクレトグラニンII凝集（０．００５ｍｇ／ｍｌ）（０．０７μＭ）は、ｐＨ７．４で１μＭルテオリンによってほとんど阻害された。Ｆｅ^２＋の濃度の増加によるセクレトグラニンIIの凝集は黒い線（黒丸）で表され、ルテオリンの存在下では灰色の線（白丸）で表される。

【図15】バイカレイン（ｂａｉｃａｌｅｉｎ）による、Ｃｕ^２＋誘導クロモグラニンＢ凝集の抑制を示す。Ｃｕ^２＋誘導クロモグラニンＢ凝集（０．００５ｍｇ／ｍｌ）（０．０６μＭ）は、ｐＨ７．４で１μＭバイカレインによってほとんど抑制された。Ｃｕ^２＋の濃度の増加によるクロモグラニンＢの凝集は黒い線（黒丸）で表され、バイカレインの存在下では灰色の線（白丸）で表される。

【図16】バイカレインによる、Ｆｅ^２＋誘導セクレトグラニンII凝集の抑制を示す。Ｆｅ^２＋誘導セクレトグラニンII凝集（０．０１ｍｇ／ｍｌ）（０．１４μＭ）は、ｐＨ７．４で１μＭバイカレインによって完全に抑制された。Ｆｅ^２＋の濃度の増加によるセクレトグラニンIIの凝集は黒い線（黒丸）で表され、バイカレインの存在下では灰色の線（白丸）で表される。

【図17】ケンフェロール（ｋａｅｍｐｆｅｒｏｌ）による、Ｃｕ^２＋誘導セクレトグラニンII凝集の抑制を示す。Ｃｕ^２＋誘導セクレトグラニンII凝集（０．００５ｍｇ／ｍｌ）（０．０７μＭ）は、ｐＨ７．４で１μＭケンフェロールによってほとんど抑制された。Ｃｕ^２＋の濃度の増加によるセクレトグラニンIIの凝集は黒い線（黒丸）で表され、バイカレインの存在下では灰色の線（白丸）で表される。

【図18】ケンフェロールによる、Ｆｅ^２＋誘導クロモグラニンＡ凝集の抑制を示す。Ｆｅ^２＋誘導クロモグラニンＡ凝集（０．００５ｍｇ／ｍｌ）（０．１μＭ）は、ｐＨ７．４で１μＭケンフェロールによって完全に抑制された。Ｆｅ^２＋の濃度の増加によるクロモグラニンＡの凝集は黒い線（黒丸）で表され、バイカレインの存在下では灰色の線（白丸）で表される。

【図19】レスベラトロール（ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ）による、Ｆｅ^２＋誘導クロモグラニンＢ凝集の抑制を示す。Ｆｅ^２＋誘導クロモグラニンＢ凝集（０．００５ｍｇ／ｍｌ）（０．０６μＭ）は、ｐＨ７．４で１μＭレスベラトロールによってほとんど抑制された。Ｆｅ^２＋の濃度の増加によるクロモグラニンＢの凝集は黒い線（黒丸）で表され、レスベラトロールの存在下では灰色の線（白丸）で表される。

【図20】レスベラトロールによる、Ｚｎ^２＋誘導セクレトグラニンII凝集の抑制を示す。Ｚｎ^２＋誘導セクレトグラニンII凝集（０．００５ｍｇ／ｍｌ）（０．０７μＭ）は、ｐＨ７．４で１μＭレスベラトロールによって有意に抑制された。Ｚｎ^２＋の濃度の増加によるセクレトグラニンIIの凝集は黒い線（黒丸）で表され、レスベラトロールの存在下では灰色の線（白丸）で表される。

【図21】エピガロカテキン３－ガレート（ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ３－ｇａｌｌａｔｅ；ＥＧＣＧ）による、Ｃｕ^２＋誘導セクレトグラニンII凝集の抑制を示す。Ｃｕ^２＋誘導セクレトグラニンII凝集（０．００５ｍｇ／ｍｌ）（０．０７μＭ）は、ｐＨ７．４で１μＭＥＧＣＧによってほとんど抑制された。Ｃｕ^２＋の濃度の増加によるセクレトグラニンIIの凝集は黒い線（黒丸）で表され、ＥＧＣＧの存在下では灰色の線（白丸）で表される。

【図22】エピガロカテキン３－ガレート（ＥＧＣＧ）による、Ｆｅ^２＋誘導セクレトグラニンII凝集の抑制を示す。Ｆｅ^２＋誘導セクレトグラニンII凝集（０．００５ｍｇ／ｍｌ）（０．０７μＭ）は、ｐＨ７．４で１μＭＥＧＣＧによって完全に抑制された。Ｆｅ^２＋の濃度の増加によるセクレトグラニンIIの凝集は黒い線（黒丸）で表され、ＥＧＣＧの存在下では灰色の線（白丸）で表される。

【図23】コルジセピン（ｃｏｒｄｙｃｅｐｉｎ）による、Ｃｕ^２＋誘導クロモグラニンＡ凝集の抑制を示す。Ｃｕ^２＋誘導クロモグラニンＡ凝集（０．００５ｍｇ／ｍｌ）（０．１μＭ）は、ｐＨ７．４で１μＭコルジセピンによってほとんど抑制された。Ｃｕ^２＋の濃度の増加によるクロモグラニンＡの凝集は黒い線（黒丸）で表され、コルジセピンの存在下では灰色の線（白丸）で表される。Ｃｕ^２＋によるクロモグラニンＡの凝集は、コルジセピンによって実質的に阻害された。

【図24】コルジセピンによる、Ｆｅ^２＋誘導セクレトグラニンII凝集の抑制を示す。Ｆｅ^２＋誘導セクレトグラニンII凝集（０．００５ｍｇ／ｍｌ）（０．０７μＭ）は、ｐＨ７．４で１μＭコルジセピンによって有意に抑制された。Ｆｅ^２＋の濃度の増加によるセクレトグラニンIIの凝集は黒い線（黒丸）で表され、コルジセピンの存在下では灰色の線（白丸）で表される。Ｆｅ^２＋によるセクレトグラニンII凝集は、コルジセピンによって完全に阻害された。

【図25】チルホスチン（ｔｙｒｐｈｏｓｔｉｎ）ＡＧ１４７８による、Ｆｅ^２＋誘導クロモグラニンＡ凝集の抑制を示す。Ｆｅ^２＋誘導クロモグラニンＡ凝集（０．００５ｍｇ／ｍｌ）（０．１μＭ）は、ｐＨ７．４で１μＭチルホスチンＡＧ１４７８によって有意に抑制された。Ｆｅ^２＋の濃度の増加によるクロモグラニンＡの凝集は黒い線（黒丸）で表され、チルホスチンＡＧ１４７８の存在下では灰色の線（白丸）で表される。Ｆｅ^２＋によるクロモグラニンＡ凝集は、チルホスチンＡＧ１４７８によって完全に阻害された。

【図26】チルホスチンＡＧ１４７８による、Ｆｅ^２＋誘導セクレトグラニンII凝集の抑制を示す。Ｆｅ^２＋誘導セクレトグラニンII凝集（０．００５ｍｇ／ｍｌ）（０．０７μＭ）は、ｐＨ７．４で１μＭチルホスチンＡＧ１４７８によって有意に抑制された。Ｆｅ^２＋の濃度の増加によるセクレトグラニンIIの凝集は黒い線（黒丸）で表され、チルホスチンＡの存在下では灰色の線（白丸）で表される。Ｆｅ^２＋によるセクレトグラニンII凝集は、チルホスチンＡＧ１４７８によって完全に阻害された。

【図27】０．２ｍＭＦｅ^２＋の存在下でのクロモグラニンＢの流体力学的状態の分布プロファイルを示す。金属誘導グラニン凝集の流体力学的状態の分布プロファイルは、ｐＨ７．４で動的光散乱法を使用して、０．２ｍＭＦｅ^２＋の存在下でクロモグラニンＢ（０．５ｍｇ／ｍｌ）で測定された。

【図28】フラボノイド（ｆｌａｖｏｎｏｉｄ）の１つであるバイカレインとＦｅ^２＋の存在下でのクロモグラニンＢの流体力学的状態の分布プロファイルを示す。金属誘導グラニン凝集の流体力学的状態の分布プロファイルは、ｐＨ７．４で動的光散乱法を使用して、０．２ｍＭバイカレインおよび０．２ｍＭＦｅ^２＋の存在下でクロモグラニンＢ（０．５ｍｇ／ｍｌ）（６μＭ）で測定された。

【図29】注入カニューレ（ｉｎｊｅｃｔｉｏｎｃａｎｎｕｌａ）が頭部に取り付けられたラットと、注入が行われた箇所を示すラットの前頭部（ｆｒｏｎｔａｌｓｅｃｔｉｏｎ）の図を示している。（右）ラットの脳室内（ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｏｒｖｅｎｔｒｉｃｌｅ）は灰色で示され、注入カニューレの位置は右脳室内の灰色で示されている。４種類の分子が次のように脳室内注入法により適用された（左から右に表示）：グループ１（コントロール）；１μｌの緩衝液（２ｍＭＭＯＰＳ、ｐＨ７．４）をラット脳（７匹のラット）の脳室内に注入した。グループ２（グラニン）；それぞれ０．１μＭのクロモグラニンＡ（ＣＧＡ）、クロモグラニンＢ（ＣＧＢ）およびセクレトグラニンII（ＳｇII）が含まれたグラニン溶液を１μｌの緩衝液（２ｍＭＭＯＰＳ、ｐＨ７．４）に入れて、これをラット脳（９匹のラット）の脳室内に注入した。グループ３（グラニン＋金属イオン）；それぞれ０．１μＭのＣＧＡ、ＣＧＢおよびＳｇIIが含まれたグラニン溶液に０．８ｍＭＣｕ^２＋、２５０μＭＦｅ^２＋および２ｍＭＺｎ^２＋を加えたものを、１μｌの緩衝液（２ｍＭＭＯＰＳ、ｐＨ７．４）に入れて、これをラット脳（９匹のラット）の脳室内に注入した。グループ４（グラニン＋金属イオン＋４種類のフラボノイドとスチルベノイド）；それぞれ０．１μＭのＣＧＡ、ＣＧＢおよびＳｇIIと、０．８ｍＭのＣｕ^２＋、２５０μＭのＦｅ^２＋および２ｍＭのＺｎ^２＋とを含む溶液に、４種類のフラボノイド、スチルベノイドおよびその他の分子をそれぞれ１μＭずつ添加したものを、１μｌの緩衝液（２ｍＭＭＯＰＳ、ｐＨ７）に入れて、これをラット脳（８匹のラット）の脳室内に注入した。

【図30】試験分子の脳室内注入後１．５ヶ月が経過した後、モリス水迷路試験（Ｍｏｒｒｉｓｗａｔｅｒｍａｚｅｔｅｓｔ）で各グループのラットが費やした探索時間（ｓｅａｒｃｈｔｉｍｅ）を示す。各グループのラットがモリス水迷路試験で逃避台（ｐｌａｔｆｏｒｍ：プラットフォーム）に脱出するのに費やした平均時間（秒単位）は、標準誤差（ｎは各グループのラットの数）で表された。

【図31】各グループのラットの代表的な水泳軌跡（ｓｗｉｍｍｉｎｇｔｒａｃｋｓ）を示す。

【図32】再配置された逃避台を見つけるために費やされた時間を示す。数字はグループ番号を示し、探索の平均時間（秒）は標準誤差バーで表される。

【図33】各グループのラットの代表的な水泳軌跡を示す。左上の数字はグループ番号を示し、トレース（ｔｒａｃｅ）は各グループのラットの水泳軌跡を示す。右上の象限にある小さな円は、左下の象限にある大きな円で示された逃避台を見つけるためにラットが泳ぎ始めた場所を示す。

【図34】グラニンを注入した一部のラットの異常な姿勢を示す。グループ３の一部のラットは、グラニンと金属イオン（Ｃｕ^２＋、Ｚｎ^２＋およびＦｅ^２＋）を注入してから２週間後に首のゆがみ（ｓｋｅｗｅｄｎｅｃｋ）を示したが、グループ２の一部のラットは、グラニンを注入してから４～５週間後に首のゆがみを示し始めた。グループ１及びグループ４のラットは、１匹も注入してから３５週間（約８ヶ月）後でも異常な姿勢を見せていない。

【図35】グループ２（グラニン注入）における首がゆがんだラットの収縮した海馬（右半分）を示す。首がゆがんだグループ２（グラニン注入）のラットを、グラニンを注入してから１０週間後（首のゆがみが現れてから６週間後、生後６ヶ月後）に犠牲にし、脳組織を調べた。

【図36】アピゲニン（Ａｐｉｇｅｎｉｎ）による、Ｚｎ^２＋誘導クロモグラニンＢ凝集の抑制を示す。

【図37】アピゲニンによる、Ｃｕ^２＋誘導クロモグラニンＡ凝集の抑制を示す。

【図38】タンゲレチン（Ｔａｎｇｅｒｅｔｉｎ）による、Ｆｅ^２＋誘導クロモグラニンＢ凝集の抑制を示す。

【図39】タンゲレチンによる、Ｃｕ^２＋誘導クロモグラニンＡ凝集の抑制を示す。

【図40】ケルセチン（Ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ）による、Ｃｕ^２＋誘導クロモグラニンＢ凝集の抑制を示す。

【図41】ケルセチンによる、Ｆｅ^２＋誘導セクレトグラニンII凝集の抑制を示す。

【図42】フィセチン（Ｆｉｓｅｔｉｎ）による、Ｆｅ^２＋誘導クロモグラニンＡ凝集の抑制を示す。

【図43】フィセチンによる、Ｆｅ^２＋誘導セクレトグラニンII凝集の抑制を示す。

【図44】ミリセチン（Ｍｙｒｉｃｅｔｉｎ）による、Ｆｅ^２＋誘導クロモグラニンＡ凝集の抑制を示す。

【図45】ミリセチンによる、Ｆｅ^２＋誘導クロモグラニンＢ凝集の抑制を示す。

【図46】モリン（Ｍｏｒｉｎ）による、Ｆｅ^２＋誘導クロモグラニンＡ凝集の抑制を示す。

【図47】モリンによる、Ｚｎ^２＋誘導クロモグラニンＡ凝集の抑制を示す。

【図48】５，７－ジメトキシフラボン（５，７－ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｆｌａｖｏｎｅ）による、Ｚｎ^２＋誘導クロモグラニンＡ凝集の抑制を示す。

【図49】５，７－ジメトキシフラボンによる、Ｆｅ^２＋誘導クロモグラニンＡ凝集の抑制を示す。

【図50】２０μＭのＣｕ^２＋および１μＭの毒性阻害剤ルテオリンの存在下での各グラニンの細胞毒性を示す。２０μＭのＣｕ^２＋の存在下および１μＭルテオリン（金属誘導グラニン毒性阻害剤の一つ、上記の図１３及び図１４参照）の追加存在下での、各グラニン（０．１μＭクロモグラニンＡ、０．０６μＭクロモグラニンＢ、および０．０７μＭセクレトグラニンII）の細胞毒性を、ＰＣ１２細胞及びＭＴＴアッセイを用いて測定した（Ｃｈｅｒｕｖａｒａｅｔａｌ．，２０１５；Ｓｈｅａｒｍａｎｅｔａｌ．，１９９４）。金属誘導グラニン凝集の阻害剤の１つであるルテオリン（上記の図１３及び図１４参照）は、実質的にグラニン誘導毒性を停止させた。

【図51】試験分子の脳室内注入後２．５ヶ月が経過した後、モリス水迷路試験において各グループのラットが費やした探索時間（逃避台を見つけるのにかかった時間）を示す。

【図52】図５１の各グループのラットの代表的な水泳軌跡を示す。

【図53】１０．５ヶ月齢（グラニン注入後７．５ヶ月）のラットの脳海馬部位（ｂｒａｉｎｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓｓｅｃｔｉｏｎ）をヘマトキシリン（ｈａｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ）で染色したことを示す。

【図54】図５３の海馬のほぼ同じ領域の高倍率ビューを示す。

【図55】アルツハイマー病（ＡＤ）のような症状がある場合とない場合の１０．５ヶ月齢のラットの脳皮質の前部（ｆｒｏｎｔａｌｓｅｃｔｉｏｎ）を示す。

【図56】アルツハイマー病のような症状がある場合とない場合の１０．５ヶ月齢のラットの脳組織密度の比較を示す。

【図57】クロモグラニンＡ特異的抗体により、１０．５ヶ月齢のラットの海馬の免疫染色を示す。

【図58】クロモグラニンＢ特異的抗体により、１０．５ヶ月齢のラットの海馬の免疫染色を示す。

【図59】セクレトグラニンII特異的抗体により、１０．５ヶ月齢のラットの海馬の免疫染色を示す。

【図60】アルツハイマー病のような症状がある場合とない場合の１１．５ヶ月齢のラットの活動性（ｍｏｂｉｌｅａｃｔｉｖｉｔｙ）の比較を示す。

【0019】

上述の図面は、例示的な実施形態の少なくとも１つにおける本発明の態様を示しており、これらの態様は、以下の説明においてさらに詳細に定義されている。異なる図において同じ番号で参照される本発明の特徴、要素および態様は、１つ以上の実施形態による、同じ、同等または類似の特徴、要素または態様を表す。

【発明を実施するための形態】

【0020】

アルツハイマー病（ＡＤ）患者の脳は、老人斑と呼ばれるタンパク質凝集体を持っていることが知られており、アルツハイマー病患者の臨床的重症度はこれらの老人斑に直接関連している（非特許文献１－３）。このため、アルツハイマー病の治療法を見つけるためのこれまでの取り組みは、主にこれらの老人斑の研究に焦点を当ててきた。老人斑の成分を見つけ、老人斑の形成の阻害、または斑のタンパク質成分の凝集を妨害することにより、すでに形成された老人斑の破壊および／または減少のいずれかの方法を考案しようとした（非特許文献１－３）。同定された老人斑の主な成分は、β－アミロイド（Ａβ）とグラニン（クロモグラニン及びセクレトグラニン）である（非特許文献２－５）。老人斑に見られるβ－アミロイドは～４２個のアミノ酸からなり、グラニンタンパク質はほとんど～４３０－７００個のアミノ酸からなる（非特許文献６－８）。

【0021】

グラニンは、脳の３つの主要な分泌細胞、すなわち星状細胞（ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ）、ニューロン（ｎｅｕｒｏｎｓ）及びおそらくミクログリア（ｍｉｃｒｏｇｌｉａ）からも分泌され、脳細胞の約８０％を構成し、脳にはるかに豊富であり、β－アミロイド（Ａβ）よりも桁違いに高い凝集特性を持っており（非特許文献１１－１７）、β－アミロイドよりもモルベースで少なくとも～５，４００倍、重量ベースで～５００倍毒性が高い（非特許文献１６－１７）。

【0022】

本発明者は、老人斑の形成における老人斑の主成分タンパク質であるグラニンの寄与、および脳細胞の病原性発達におけるグラニンの潜在的な役割を研究した。この研究によれば、そのプロセスにおいて、Ｃａ^２＋、Ｃｕ^２＋、Ｆｅ^２＋およびＺｎ^２＋などの金属イオンの存在および酸性ｐＨ、このようなアルツハイマー病患者の脳に明らかな２つの特徴下で、グラニンが容易に凝集すること（非特許文献１８－２２）、また、凝集されたグラニンは老人斑の形成に積極的に関与していることが示されている。グラニンの凝集傾向は、β－アミロイドの凝集傾向よりも桁違いに高い。さらに、グラニンタンパク質は脳細胞に対して非常に有毒であることが示され、毒性はβ-アミロイドの毒性よりもモルベースで少なくとも～５，４００倍、重量ベースで～５００倍高いことが示された（非特許文献１６－１７）。

【0023】

本発明の一態様は、グラニンの低分子量形態から高分子量凝集形態への凝集を調節、阻害または抑制する方法、および／または高分子量凝集形態を低分子量形態に解離する方法を研究および提供することである。特定の態様は、アルツハイマー病および他の神経変性疾患につながる脳細胞の病因を調節、阻害または抑制するために、動物の脳におけるグラニンの凝集を調節、阻害または抑制する方法を提供することである。グラニンは通常、以下のクロモグラニンＡ（ＣＧＡ）、クロモグラニンＢ（ＣＧＢ）、セクレトグラニンII（ＳｇII）およびセクレトグラニンIII（ＳｇIII）のうちの１つ以上を含む。

【0024】

したがって、本発明の実施形態は、低分子量形態から高分子量凝集形態へのグラニンの凝集を阻害するための組成物を開示する。このような組成物は、典型的には、本明細書では分解化合物と呼ばれることもある１つ以上の活性化合物（ａｃｔｉｖｅｃｏｍｐｏｕｎｄ）または薬剤（ａｇｅｎｔ）を含む。本明細書で使用される活性化合物または化合物（本明細書では互換的に使用される）は、通常、十分な量が動物または患者の血流に吸収されたときに生物学的効果を引き起こす薬剤（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌａｇｅｎｔ）を指す。実施形態は、低分子量形態から高分子量凝集形態へのグラニンの凝集を阻害するため、および／または高分子量凝集形態を低分子量形態に解離するための１つ以上の分解化合物を含有してもよい。

【0025】

様々な実施形態では、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または少なくとも１０つの分解化合物が使用される。しかしながら、代替の実施形態では、１０つを超える分解化合物を使用できる。一態様では、本明細書で提供される分解化合物は、低分子量形態から高分子量凝集形態へのグラニンの凝集を阻害し、および／または高分子量凝集形態を低分子量形態に解離する。別の態様では、本明細書で提供される分解化合物は、グラニンと、例えば、Ｚｎ^２＋、Ｃｕ^２＋、Ｆｅ^２＋、およびＣａ^２＋を含む金属イオンまたは補因子との相互作用または結合を阻害、防止または調節する。特定の実施形態では、動物の神経系において、グラニンと金属イオンとの相互作用または結合を阻害、防止または調節するために、Ｚｎ^２＋、Ｃｕ^２＋、Ｆｅ^２＋およびＣａ^２＋から選択される金属イオンを低減、阻害、抑制または隔離する１つ以上の分解化合物を提供することにより、動物において、低分子量形態から高分子量凝集形態へのグラニンの凝集を阻害する、および／または高分子量凝集形態を低分子量形態に解離する。

【0026】

適切な分解化合物は、制限なく、以下のものを含む：アントキサンチン、アントシアニン、アントシアニジン、フラバン、フラバノン、フラボノール、スチルベノイド、金属タンパク質、Ｚｎ^２＋結合および隔離分子、カゼイン、アルブミン、亜鉛フィンガー転写因子、金属イオンキレーター（ｍｅｔａｌｉｏｎｃｈｅｌａｔｏｒ）、Ｃｕ^２＋結合および隔離分子、セルロプラスミン、Ｆｅ^２＋結合および隔離分子、カルモジュリン、トロポニン、フェリチン、トランスフェリン、ラクトフェリン、コルジセピン、５，７－ジメトキシフラボン、およびチルホスチンＡＧ１４７８。

【0027】

適切なアントキサンチンみは、制限なく、以下のものを含む：スクテラレイン、ルテオリン、バイカレイン、ケンフェロール、ケルセチン、アピゲニン、タンゲレチン、ミリセチン、フィセチン、モリン、ガランギン、イソラムネチン、パキポドール、ラムナジン、ピラノフラボノール、およびフラノフラボノール。

【0028】

適切なスチルベノイドは、制限なく、以下のものを含む：レスベラトロール、ピセアタンノリン（ｐｉｃｅａｔａｎｎｏｌｉｎ）、ピノシルビン、プテロスチルベン、アストリンギン、およびピセイド。ここで好ましいスチルベノイドはレスベラトロールである。

【0029】

適切なフラバンは、制限なく、以下のものを含む：エピガロカテキン３－ガレート（ＥＧＣＧ）、カテキン、ガロカテキン、カテキン３－ガレート、ガロカテキン３－ガレート、エピカテキン、エピガロカテキン、エピカテキン３－ガレート、テアフラビン－３－ガレート、テアフラビン－３’－ガレート、テアフラビン－３，３’－ガレート、テアルビジン、およびプロアントシアニジン。ここで好ましいフラバンは、エピガロカテキン３－ガレート（ＥＧＣＧ）である。

【0030】

方法
また別の態様では、ｉ）グラニンと金属イオンとの相互作用を調節、阻害または防止する方法；ii）グラニンの凝集を調節、阻害、防止するか、または高分子量凝集形態を低分子量形態に解離する方法；iii）細胞毒性を低減または阻害する方法；およびiv）認知症またはアルツハイマー病を治療または予防する方法を提供する。

【0031】

一態様では、これらの方法は、通常、１つ以上の分解化合物を使用する。好ましい分解化合物は、アントキサンチンを含む。したがって、本明細書で提供される特定の実施形態は、グラニンと金属イオンとの相互作用を阻害するための組成物を使用する方法に関するものであり、ここで、組成物は１つ以上のアントキサンチンを含む。

【0032】

非限定的な例として、本明細書で提供される特定の一実施形態は、グラニンと金属イオンとの相互作用を阻害するための組成物を使用する方法に関するものであり、その組成物は、以下のうちの少なくとも２つを含む：スクテラレイン、ルテオリン、バイカレイン、ケンフェロール、ケルセチン、アピゲニン、タンゲレチン、ミリセチン、フィセチン、モリン、レスベラトロール、エピガロカテキン３－ガレート、コルジセピン、５，７－ジメトキシフラボン、およびチルホスチンＡＧ１４７８。他の実施形態は、以下のうちの少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、またはすべてを含む、グラニンと金属イオンとの相互作用を阻害するための組成物を使用する：スクテラレイン、ルテオリン、バイカレイン、ケンフェロール、ケルセチン、アピゲニン、タンゲレチン、ミリセチン、フィセチン、モリン、レスベラトロール、エピガロカテキン３－ガレート、コルジセピン、５，７－ジメトキシフラボン、およびチルホスチンＡＧ１４７８。一実施形態は、以下のものを含む：スクテラレイン、ルテオリン、バイカレイン、ケンフェロール、アピゲニン、タンゲレチン、ミリセチン、フィセチン、モリン、レスベラトロール、およびＥＧＣＧ。別の実施形態は、以下のものを含む：スクテラレイン、ルテオリン、バイカレイン、ケンフェロール、ケルセチン、レスベラトロール、エピガロカテキン３－ガレート、コルジセピン、５，７－ジメトキシフラボン、およびチルホスチンＡＧ１４７８。

【0033】

本明細書で提供される特定の実施形態は、グラニンと金属イオンとの相互作用を阻害するための組成物および方法に関するものであり、この組成物は、ｉ）アントキサンチン；ii）スチルベノイド、およびiii）アントキサンチンまたはスチルベノイド以外の分解化合物を含む。特定のさらなる実施形態において、アントキサンチンは、以下のスクテラレイン、ルテオリン、バイカレイン、ケンフェロール、ケルセチン、アピゲニン、タンゲレチン、ミリセチンおよびフィセチンのうちの１つ以上である。特定のさらなる実施形態において、スチルベノイドは、レスベラトロールまたはその誘導体、塩またはエステルである。特定のさらなる実施形態では、アントキサンチンまたはスチルベノイド以外の分解化合物は、エピガロカテキン３－ガレート、コルジセピン、５，７－ジメトキシフラボン、およびチルホスチンＡＧ１４７８から選択される。

【0034】

別の態様では、グラニンの低分子量形態から高分子量凝集形態への凝集を調節、阻害または防止する方法、または高分子量凝集形態を低分子量形態に解離する方法が提供される。したがって、特定の実施形態では、グラニンの低分子量形態から高分子量凝集形態への凝集を調節、阻害または防止するための薬学的組成物が開示および提供される。特定の実施形態において、これらの方法は、低分子量形態から高分子量凝集形態へのグラニンの凝集を阻害するための組成物を使用する。提供される低分子量形態から高分子量凝集形態へのグラニンの凝集を調節、阻害または防止する方法のための薬学的組成物の1つの特定の実施形態は、以下のうちの少なくとも２つを含む：スクテラレイン、ルテオリン、バイカレイン、ケンフェロール、ケルセチン、アピゲニン、タンゲレチン、ミリセチン、フィセチン、レスベラトロール、エピガロカテキン３－ガレート、コルジセピン、およびチルホスチンＡＧ１４７８。代替の実施形態は、薬学的組成物または製剤中に少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または少なくとも１０つの分解化合物を含む。

【0035】

また別の態様では、認知症またはアルツハイマー病の治療または予防のための方法が提供される。したがって、特定の実施形態では、認知症またはアルツハイマー病の治療または予防の方法のための薬学的組成物が開示されて提供される。特定の実施形態において、これらの方法は、低分子量形態から高分子量凝集形態へのグラニンの凝集を阻害するため、および／または高分子量凝集形態を低分子量形態に解離するための組成物を使用する。提供される、認知症またはアルツハイマー病の治療または予防のための薬学的組成物の１つの特定の実施形態は、以下のうちの少なくとも２つを含む：スクテラレイン、ルテオリン、バイカレイン、ケンフェロール、ケルセチン、アピゲニン、タンゲレチン、ミリセチン、フィセチン、レスベラトロール、エピガロカテキン３－ガレート、コルジセピン、およびチルホスチンＡＧ１４７８。代替の実施形態は、薬学的組成物または製剤中に少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または少なくとも１０つの分解化合物を含む。

【0036】

また別の態様では、細胞毒性を低減または阻害する方法が提供される。好ましい実施形態において、方法は、低分子量形態から高分子量凝集形態へのグラニンの凝集を阻害するための組成物を投与すること、および／または本明細書で提供される高分子量凝集形態を低分子量形態に解離することを含む。

【0037】

また別の態様では、認知症またはアルツハイマー病の治療または予防のための方法が提供される。特定の実施形態において、その方法は、低分子量形態から高分子量凝集形態へのグラニンの凝集を阻害するために、および／または高分子量凝集形態を低分子量形態に解離するために、有効量の薬学的組成物を動物（例えば、患者）に投与することを含む。特定の一実施形態において、組成物は、スクテラレイン、ルテオリン、バイカレイン、ケンフェロール、ケルセチン、アピゲニン、タンゲレチン、ミリセチン、フィセチン、レスベラトロール、エピガロカテキン３－ガレート、コルジセピン、およびチルホスチンＡＧ１４７８のうちの少なくとも２つを含む。好ましい実施形態において、その方法は、動物においてグラニンの低分子量形態から高分子量凝集形態への凝集を阻害する、および／または高分子量凝集形態を低分子量形態に解離するのに有効である。

【0038】

組成物および製剤
活性化合物の１日投与量は、例えば、少なくとも１０ｍｇ、少なくとも１５ｍｇ、少なくとも２０ｍｇ、少なくとも２５ｍｇ、少なくとも３０ｍｇ、少なくとも３５ｍｇ、少なくとも４０ｍｇ、少なくとも４５ｍｇ、少なくとも５０ｍｇ、少なくとも５５ｍｇ、少なくとも６０ｍｇ、少なくとも６５ｍｇ、少なくとも７０ｍｇ、少なくとも７５ｍｇ、少なくとも８０ｍｇ、少なくとも８５ｍｇ、少なくとも９０ｍｇ、少なくとも９５ｍｇ、少なくとも１００ｍｇ、少なくとも１５０ｍｇ、少なくとも２００ｍｇ、少なくとも２５０ｍｇ、少なくとも３００ｍｇ、少なくとも３５０ｍｇ、少なくとも４００ｍｇ、少なくとも４５０ｍｇ、少なくとも５００ｍｇ、少なくとも５５０ｍｇ、少なくとも６００ｍｇ、少なくとも６５０ｍｇ、少なくとも７００ｍｇ、少なくとも７５０ｍｇ、少なくとも８００ｍｇ、少なくとも８５０ｍｇ、少なくとも９００ｍｇ、少なくとも９５０ｍｇ、少なくとも１０００ｍｇ、少なくとも１０５０ｍｇ、少なくとも１１００ｍｇ、少なくとも１１５０ｍｇ、少なくとも１２００ｍｇ、少なくとも１２５０ｍｇ、少なくとも１３００ｍｇ、少なくとも１３５０ｍｇ、少なくとも１４００ｍｇ、少なくとも１４５０ｍｇ、少なくとも１５００ｍｇ、少なくとも２０００ｍｇ、少なくとも３０００ｍｇ、少なくとも５０００ｍｇ、またはその以上であってもよい。

【0039】

本明細書の態様は、障害を治療するための治療用化合物の用量が、少なくとも０．１ｍｇ／ｋｇ／日、少なくとも１．０ｍｇ／ｋｇ／日、少なくとも５．０ｍｇ／ｋｇ／日、少なくとも１０ｍｇ／ｋｇ／日、少なくとも１５ｍｇ／ｋｇ／日、少なくとも２０ｍｇ／ｋｇ／日、少なくとも２５ｍｇ／ｋｇ／日、少なくとも３０ｍｇ／ｋｇ／日、少なくとも３５ｍｇ／ｋｇ／日、少なくとも４０ｍｇ／ｋｇ／日、少なくとも４５ｍｇ／ｋｇ／日または少なくとも５０ｍｇ／ｋｇ／日であるか、または約０．００１ｍｇ／ｋｇ／日～約１００ｍｇ／ｋｇ／日、約０．００１ｍｇ／ｋｇ／日～約１０ｍｇ／ｋｇ／日、約０．００１ｍｇ／ｋｇ／日～約１５ｍｇ／ｋｇ／日、約０．００１ｍｇ／ｋｇ／日～約２０ｍｇ／ｋｇ／日、約０．００１ｍｇ／ｋｇ／日～約２５ｍｇ／ｋｇ／日、約０．００１ｍｇ／ｋｇ／日～約３０ｍｇ／ｋｇ／日、約０．００１ｍｇ／ｋｇ／日～約３５ｍｇ／ｋｇ／日、約０．００１ｍｇ／ｋｇ／日～約４０ｍｇ／ｋｇ／日、約０．００１ｍｇ／ｋｇ／日～約４５ｍｇ／ｋｇ／日、約０。００１ｍｇ／ｋｇ／日～約５０ｍｇ／ｋｇ／日、約０．００１ｍｇ／ｋｇ／日～約７５ｍｇ／ｋｇ／日、または約０．００１ｍｇ／ｋｇ／日～約１００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲であることを開示する。

【0040】

また別の態様において、グラニンの低分子量形態から高分子量凝集形態への凝集を阻害するための、および／または高分子量凝集形態を低分子量形態に解離するための組成物における１つ以上の分解化合物と別の分解化合物との比は、異なる実施形態では異なり得る。この態様では、１つの分解化合物の総量と別の分解化合物の総量との比は、例えば、約１：１００、１：９５、１：９０、１：８５、１：８０、１：７５、１：７０、１：６５、１：６０、１：５５、１：５０、１：４５、１：４０、１：３５、１：３０、１：２５、１：２０、１：１５、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、または１：１ｗ／ｗから、約１００：１、９５：１、９０：１、８５：１、８０：１、７５：１、７０：１、６５：１、６０：１、５５：１、５０：１、４５：１、４０：１、３５：１、３０：１、２５：１、２０：１、１５：１、１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２．５：１、２：１、１．９：１、１．８：１、１．７：１、１．６：１、１：５：１、１．４：１、１．３：１、１．２：１、１．１：１、および１：１ｗ／ｗの範囲であってもよい。

【0041】

本明細書の態様は、グラニン凝集の減少または低減が、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％で行われ、アルツハイマー病の症状（ＡＤ）に関連する重症度が、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％で低減することを開示する。

【0042】

この実施形態の別の態様において、本明細書に開示される本発明の治療用化合物の投与は、グラニン凝集に関連する疾患に関連する症状の重症度を、例えば、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％低減する。

【0043】

本明細書の態様は、グラニン凝集の減少または低減に関連する症状が、約１０％～約１００％、約２０％～約１００％、約３０％～約１００％、約４０％～約１００％、約５０％～約１００％、約６０％～約１００％、約７０％～約１００％、約８０％～約１００％、約１０％～約９０％、約２０％～約９０％、約３０％～約９０％、約４０％～約９０％、約５０％～約９０％、約６０％～約９０％、約７０％～約９０％、約１０％～約８０％、約２０％～約８０％、約３０％～約８０％、約４０％～約８０％、約５０％～約８０％、約６０％～約８０％、約１０％～約７０％、約２０％～約７０％、約３０％～約７０％、約４０％～約７０％、または約５０％～約７０％低減することを開示する。好ましい実施形態において、グラニン凝集の減少または低減に関連する上記の症状は、ｉ）グラニンと金属イオンとの相互作用を調節、阻害または防止する方法；ii）グラニンの凝集を調節、阻害または防止するか、または高分子量凝集形態を低分子量形態に解離する方法；iii）細胞毒性を低減または阻害する方法；およびiv）本明細書に記載の認知症またはアルツハイマー病を治療または予防する方法にさらに適用される。

【0044】

投薬は、単回投薬または累積的（連続投薬）であり得、そして当業者により容易に決定され得る。本発明の治療用化合物は、被験体に対して、１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回、１２回、１３回、１４回、１５回、１６回、１７回、１８回、１９回、２０回、またはそれ以上投与されてもよい。例えば、アルツハイマー病の治療は、本明細書に開示されているような治療用化合物（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｃｏｍｐｏｕｎｄ）の有効量の１回の投与を含み得る。あるいは、アルツハイマー病の治療は、例えば、１日１回、１日２回、１日３回、数日おきに１回、または週１回など、一定期間にわたって実施される治療用化合物の有効用量の複数回投与を含み得る。投与のタイミングは個人の症状の重症度などの要因によって個人ごとに異なり得る。例えば、本明細書に開示される治療用化合物の有効容量は、無期限に１日１回、または個人がもはや治療を必要としないまで、個人に投与することができる。当業者は、個体の状態を治療の過程を通して監視でき、本明細書に開示される薬学的組成物の投与有効量をそれに応じて調整できることを認識するであろう。一実施形態において、本明細書に開示される治療用化合物は、アルツハイマー病に罹患している個体を含む、疾患の症状を解決するためにかかる時間を、同じ治療を受けていない患者と比較して、例えば、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％短縮することができる。

【0045】

一実施形態において、治療用化合物の投与期間は、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日。１３日、１４日、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１２ヶ月、またはそれ以上である。さらなる実施形態において、投与が停止される期間は、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１２ヶ月、またはそれ以上である。

【0046】

本明細書に開示される治療用化合物は、個体に投与される。個体は、通常人間であるが、家畜であるかどうかにかかわらず、犬、猫、鳥、牛、馬、羊、山羊、爬虫類、およびその他の動物を含むがこれらに限定されない動物であり得る。

【0047】

また別の態様では、使用説明書とともに、本発明の少なくとも１つの組み合わせ組成物を制限なく含むキットまたはパッケージが提供される。一実施形態では、各治療用化合物自体が、制限なく、個別または別個の剤形（投与形態）（例えば、カプセル、錠剤または液体）として投与される場合、キットは、制限なしに、使用説明書とともに、発明の組成物を構成する各治療用化合物を含む。さらなる実施形態において、治療用化合物は、パッケージングが、投与の指示と共に考慮されるとき、制限なしに、各治療用化合物が投与される方法を明確に示す限り、制限なく、投与に適した任意の方法でパッケージされてもよい。またさらなる実施形態において、各治療用化合物または治療用化合物の組み合わせは、制限なく、皮下投与される液体または他の液体製剤を含む液体などの単一の投与可能な剤形に組み合わせられてもよい。治療用化合物は、パッケージで個体に提供され得る。前記パッケージは、例えば、制限なく、ボトル、キャニスター、チューブまたは他の密閉容器であるコンテナであり得る。

【0048】

一実施形態では、それぞれの薬物自体が、制限なく、個別または別個の剤形（投与形態）（例えば、カプセルまたは錠剤）として投与される場合、キットは、制限なしに、使用説明書とともに、発明の組成物を構成する各薬物を含む。さらなる実施形態において、薬物成分は、パッケージングが、投与の指示と共に考慮されるとき、制限なしに、各薬物成分が投与される方法を明確に示す限り、制限なく、投与に適した任意の方法でパッケージされてもよい。またさらなる実施形態では、組み合わせの薬物成分のそれぞれは、制限なく、カプセルなどの単一の投与可能な剤形に組み合わせられてもよい。

【0049】

発明の形態
実施例
以下の非限定的な例は、現在検討されている代表的な実施形態のより完全な理解を容易にするために、例示の目的でのみ提供されている。したがって、これらの実施例は、単なる例示であることを意図しており、本発明の範囲を限定することを意図していない。

【0050】

したがって、これらの例は、本明細書に記載されている実施形態のいずれかを限定するものと解釈されるべきではない。

【0051】

実施例１
金属イオン結合時のグラニンの凝集
グラニンの凝集に対する金属、特にＣｕ^２＋、Ｚｎ^２＋およびＦｅ^２＋の影響をテストする実験が行われた。

【0052】

材料および方法
材料：主要なグラニンタンパク質であるクロモグラニンＡ（ＣＧＡ）、クロモグラニンＢ（ＣＧＢ）およびセクレトグラニンII（ＳｇII）は、ウシ副腎髄質の分泌顆粒から精製された（Ｐａｒｋｅｔａｌ．，２００２；Ｙｏｏ，１９９５；Ｙｏｏａｎｄアルバネシ、１９９０年）。Ｃｈｅｌｅｘ１００はＢｉｏ－Ｒａｄ（米国）製であり、他の化学物質は市販されている最高純度のものであった。精製された天然クロモグラニンＢ（ｃ）、セクレトグラニンII（ｄ）およびクロモグラニンＡ（ｂ）を図４に示す。本実験で使用されたフラボノイド、スチルベノイドおよびその他の試験化合物は、ＭｅｄＣｈｅｍＥｘｐｒｅｓｓ（米国）、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（米国）およびＳａｎｔａ－ＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈ（米国）から入手したものであり、全試験化合物の純度は９８％以上であった。

【0053】

凝集実験：凝集試験に先たち、グラニン凝集体を解離させるために、Ｃｈｅｌｅｘ１００（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、米国）などのキレート剤を用いた広範囲な処理により、グラニンから、精製過程でグラニンと相互作用した金属イオンを除去する必要がある。金属誘導凝集試験では、２ｍＭＭＯＰＳ（ｐＨ７．４）でＣｈｅｌｅｘ１００処理ＣＧＡ、ＣＧＢまたはＳｇIIを、ＣｕＣｌ_２、ＦｅＣｌ_２およびＺｎＣｌ_２などの濃縮金属イオンで滴定した。凝集は、ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）ＤＵ６４０ｕｖ／ｖｉｓ分光光度計を使用して濁度の変化を測定することにより観察された。すべての測定は２４^ｏＣで行われた。

【0054】

図５から図１０は、特定のグラニンの凝集特性に対する特定の金属の影響を示している。図５は、増加するＦｅ^２＋濃度の関数としてのクロモグラニンＡの凝集を示す。０．００５ｍｇ／ｍｌクロモグラニンＡ（０．１μＭ）を、ｐＨ７．４でＦｅ^２＋濃度の関数として使用した。図５から、Ｆｅ^２＋濃度が高くなるほど、Ｆｅ^２＋誘導クロモグラニンＡ凝集の大きさが大きくなることが明らかである。図６は．増加するＦｅ^２＋濃度の関数としてのクロモグラニンＢの凝集を示す。０．００５ｍｇ／ｍｌクロモグラニンＢ（０．０６μＭ）を、ｐＨ７．４でのＦｅ^２＋濃度の関数として使用した。図６から、Ｆｅ^２＋濃度が高くなるほど、Ｆｅ^２＋誘導クロモグラニンＢ凝集の大きさが大きくなることが明らかである。図７は、増加するＦｅ^２＋濃度の関数としてのセクレトグラニンIIの凝集を示す。０．００５ｍｇ／ｍｌセクレトグラニンII（０．０７μＭ）の量を、ｐＨ７．４でのＦｅ^２＋濃度の関数として使用した。図７から、Ｆｅ^２＋濃度が高くなるほど、Ｆｅ^２＋誘導セクレトグラニンII凝集の大きさが大きくなることが明らかである。図８は、増加するＺｎ^２＋濃度の関数としてのクロモグラニンＢの凝集を示す。０．００５ｍｇ／ｍｌクロモグラニンＢ（０．０６μＭ）を、生理的ｐＨ７．４でのＺｎ^２＋濃度の関数として使用した。図８から、Ｚｎ^２＋濃度が高くなるほど、Ｚｎ^２＋誘導クロモグラニンＢ凝集の大きさが大きくなることが明らかである。図９は、増加するＺｎ^２＋濃度の関数としてのセクレトグラニンIIの凝集を示す。増加するセクレトグラニンII濃度を、生理的ｐＨ７．４でのＺｎ^２＋濃度の関数として使用した。図９から、Ｚｎ^２＋濃度が高くなるほど、Ｚｎ^２＋誘導セクレトグラニンII凝集の大きさが大きくなることが明らかである。図１０は、増加するＣｕ^２＋濃度の関数としてのセクレトグラニンIIの凝集を示す。０．００５ｍｇ／ｍｌセクレトグラニンII（０．０７μＭ）の量を、ｐＨ７．４でのＣｕ^２＋濃度の関数として使用した。図１０から、Ｃｕ^２＋濃度が高くなるほど、Ｃｕ^２＋誘導セクレトグラニンII凝集の大きさが大きくなることが明らかである。図１１は、スクテラレインによる、Ｃｕ^２＋誘導クロモグラニンＡ凝集の抑制を示す。Ｃｕ^２＋誘導クロモグラニンＡ凝集（０．００５ｍｇ／ｍｌ）（０．１μＭ）は、ｐＨ７．４で１μＭスクテラレインによってほとんど抑制された。Ｃｕ^２＋の濃度の増加によるクロモグラニンＡの凝集は黒い線（黒丸）で表され、スクテラレインの存在下では灰色の線（白丸）で表される。図１１から、スクテラレインがＣｕ^２＋誘導クロモグラニンＡ凝集をほとんど阻害したことが明らかである。図１２は、スクテラレインによる、Ｃｕ^２＋誘導セクレトグラニンII凝集の抑制を示す。Ｃｕ^２＋誘導セクレトグラニンII凝集（０．００５ｍｇ／ｍｌ）（０．０７μＭ）は、ｐＨ７．４で１μＭスクテラレインによってほとんど阻害された。Ｃｕ^２＋の濃度の増加によるセクレトグラニンIIの凝集は黒い線（黒丸）で表され、スクテラレインの存在下では灰色の線（白丸）で表される。図１２から、スクテラレインがＣｕ^２＋誘導セクレトグラニンIIの凝集をほとんど阻害したことが明らかである。図１３は、ルテオリンによる、Ｆｅ^２＋誘導クロモグラニンＢ凝集の抑制を示す。Ｆｅ^２＋誘導クロモグラニンＢ凝集（０．００５ｍｇ／ｍｌ）（０．０６μＭ）は、ｐＨ７．４で１μＭルテオリンによってほとんど阻害された。Ｆｅ^２＋の濃度の増加によるクロモグラニンＢの凝集は黒い線（黒丸）で表され、ルテオリンの存在では灰色の線（白丸）で表される。図１３から、ルテオリンがＦｅ^２＋誘導クロモグラニンＢ凝集をほとんど阻害したことが明らかである。

【0055】

図１４は、ルテオリンによる、Ｆｅ^２＋誘導セクレトグラニンII凝集の抑制を示す。Ｆｅ^２＋誘導セクレトグラニンII凝集（０．００５ｍｇ／ｍｌ）（０．０７μＭ）は、ｐＨ７．４で１μＭルテオリンによってほとんど阻害された。Ｆｅ^２＋の濃度の増加によるセクレトグラニンIIの凝集は黒い線（黒丸）で表され、ルテオリンの存在下では灰色の線（白丸）で表される。図１４から、ルテオリンがＦｅ^２＋誘導セクレトグラニンII凝集をほとんど阻害したことが明らかである。図１５は、バイカレインによる、Ｃｕ^２＋誘導クロモグラニンＢ凝集の抑制を示す。Ｃｕ^２＋誘導クロモグラニンＢ凝集（０．００５ｍｇ／ｍｌ）（０．０６μＭ）は、ｐＨ７．４で１μＭバイカレインによってほとんど抑制された。Ｃｕ^２＋の濃度の増加によるクロモグラニンＢの凝集は黒い線（黒丸）で表され、バイカレインの存在下では灰色の線（白丸）で表される。図１５から、バイカレインがＣｕ^２＋誘導クロモグラニンＢ凝集をほとんど阻害したことが明らかである。図１６は、バイカレインによる、Ｆｅ^２＋誘導セクレトグラニンII凝集の抑制を示す。Ｆｅ^２＋誘導セクレトグラニンII凝集（０．０１ｍｇ／ｍｌ）（０．１４μＭ）は、ｐＨ７．４で１μＭバイカレインによって完全に抑制された。Ｆｅ^２＋の濃度の増加によるセクレトグラニンIIの凝集は黒い線（黒丸）で表され、バイカレインの存在下では灰色の線（白丸）で表される。図１６から、バイカレインがＦｅ^２＋誘導セクレトグラニンII凝集を完全に阻害したことが明らかである。図１７は、ケンフェロールによる、Ｃｕ^２＋誘導セクレトグラニンII凝集の抑制を示す。Ｃｕ^２＋誘導セクレトグラニンII凝集（０．００５ｍｇ／ｍｌ）（０．０７μＭ）は、ｐＨ７．４で１μＭケンフェロールによってほとんど抑制された。Ｃｕ^２＋の濃度の増加によるセクレトグラニンIIの凝集は黒い線（黒丸）で表され、バイカレインの存在下では灰色の線（白丸）で表される。図１７から、ケンフェロールがＣｕ^２＋誘導セクレトグラニンII凝集をほとんど阻害したことが明らかである。図１８は、ケンフェロールによる、Ｆｅ^２＋誘導クロモグラニンＡ凝集の抑制を示す。Ｆｅ^２＋誘導クロモグラニンＡ凝集（０．００５ｍｇ／ｍｌ）（０．１μＭ）は、ｐＨ７．４で１μＭケンフェロールによって完全に抑制された。Ｆｅ^２＋の濃度の増加によるクロモグラニンＡの凝集は黒い線（黒丸）で表され、バイカレインの存在下では灰色の線（白丸）で表される。図１８から、ケンフェロールがＦｅ^２＋誘導クロモグラニンＡ凝集を完全に阻害したことが明らかである。

【0056】

図１９は、レスベラトロールによる、Ｆｅ^２＋誘導クロモグラニンＢ凝集の抑制を示す。Ｆｅ^２＋誘導クロモグラニンＢ凝集（０．００５ｍｇ／ｍｌ）（０．０６μＭ）は、ｐＨ７．４で１μＭレスベラトロールによってほとんど抑制された。Ｆｅ^２＋の濃度の増加によるクロモグラニンＢの凝集は黒い線（黒丸）で表され、レスベラトロールの存在下では灰色の線（白丸）で表される。図１９から、レスベラトロールがＦｅ^２＋誘導クロモグラニンＡ凝集をほとんど阻害したことが明らかである。図２０は、レスベラトロールによる、Ｚｎ^２＋誘導セクレトグラニンII凝集の抑制を示す。Ｚｎ^２＋誘導セクレトグラニンII凝集（０．００５ｍｇ／ｍｌ）（０．０７μＭ）は、ｐＨ７．４で１μＭレスベラトロールによって有意に抑制された。Ｚｎ^２＋の濃度の増加によるセクレトグラニンIIの凝集は黒い線（黒丸）で表され、レスベラトロールの存在下では灰色の線（白丸）で表される。図２１は、エピガロカテキン３－ガレート（ＥＧＣＧ）による、Ｃｕ^２＋誘導セクレトグラニンII凝集の抑制を示す。Ｃｕ^２＋誘導セクレトグラニンII凝集（０．００５ｍｇ／ｍｌ）（０．０７μＭ）は、ｐＨ７．４で１μＭＥＧＣＧによってほとんど抑制された。Ｃｕ^２＋の濃度の増加によるセクレトグラニンIIの凝集は黒い線（黒丸）で表され、ＥＧＣＧの存在下では灰色の線（白丸）で表される。図２１から、ＥＧＣＧがＣｕ^２＋誘導セクレトグラニンII凝集をほとんど阻害したことが明らかである。図２２は、ＥＧＣＧによる、Ｆｅ^２＋誘導セクレトグラニンII凝集の抑制を示す。Ｆｅ^２＋誘導セクレトグラニンII凝集（０．００５ｍｇ／ｍｌ）（０．０７μＭ）は、ｐＨ７．４で１μＭＥＧＣＧによって完全に抑制された。Ｆｅ^２＋の濃度の増加によるセクレトグラニンIIの凝集は黒い線（黒丸）で表され、ＥＧＣＧの存在下では灰色の線（白丸）で表される。ＥＧＣＧがＦｅ^２＋誘導セクレトグラニンII凝集を完全に抑制したことが明らかである。図２３は、コルジセピンによる、Ｃｕ^２＋誘導クロモグラニンＡ凝集の抑制を示す。Ｃｕ^２＋誘導クロモグラニンＡ凝集（０．００５ｍｇ／ｍｌ）（０．１μＭ）は、ｐＨ７．４で１μＭコルジセピンによってほとんど抑制された。Ｃｕ^２＋の濃度の増加によるクロモグラニンＡの凝集は黒い線（黒丸）で表され、コルジセピンの存在下では灰色の線（白丸）で表される。Ｃｕ^２＋によるクロモグラニンＡの凝集は、コルジセピンによって実質的に阻害された。図２４は、コルジセピンによる、Ｆｅ^２＋誘導セクレトグラニンII凝集の抑制を示す。Ｆｅ^２＋誘導セクレトグラニンII凝集（０．００５ｍｇ／ｍｌ）（０．０７μＭ）は、ｐＨ７．４で１μＭコルジセピンによって有意に抑制された。Ｆｅ^２＋の濃度の増加によるセクレトグラニンIIの凝集は黒い線（黒丸）で表され、コルジセピンの存在下では灰色の線（白丸）で表される。Ｆｅ^２＋によるセクレトグラニンII凝集は、コルジセピンによって完全に阻害された。図２５は、チルホスチンＡＧ１４７８による、Ｆｅ^２＋誘導クロモグラニンＡ凝集の抑制を示す。Ｆｅ^２＋誘導クロモグラニンＡ凝集（０．００５ｍｇ／ｍｌ）（０．１μＭ）は、ｐＨ７．４で１μＭチルホスチンＡＧ１４７８によって有意に抑制された。Ｆｅ^２＋の濃度の増加によるクロモグラニンＡの凝集は黒い線（黒丸）で表され、チルホスチンＡＧ１４７８の存在下では灰色の線（白丸）で表される。Ｆｅ^２＋によるクロモグラニンＡ凝集は、チルホスチンＡＧ１４７８によって完全に阻害された。図２６は、チルホスチンＡＧ１４７８による、Ｆｅ^２＋誘導セクレトグラニンII凝集の抑制を示す。Ｆｅ^２＋誘導セクレトグラニンII凝集（０．００５ｍｇ／ｍｌ）（０．０７μＭ）は、ｐＨ７．４で１μＭチルホスチンＡＧ１４７８によって有意に抑制された。Ｆｅ^２＋の濃度の増加によるセクレトグラニンIIの凝集は黒い線（黒丸）で表され、チルホスチンＡの存在下では灰色の線（白丸）で表される。Ｆｅ^２＋によるセクレトグラニンII凝集は、チルホスチンＡＧ１４７８によって完全に阻害された。図２７は、０．２ｍＭＦｅ^２＋の存在下でのクロモグラニンＢの流体力学的状態の分布プロファイルを示す。金属誘導グラニン凝集の流体力学的状態の分布プロファイルは、ｐＨ７．４で動的光散乱法を使用して、０．２ｍＭＦｅ^２＋の存在下でクロモグラニンＢ（０．５ｍｇ／ｍｌ）で測定された。この溶液条件下では、クロモグラニンＢの大部分（７２．３％）は大きな凝集状態のままであり、２７．７％は低分子量のオリゴマー状態のままであった。金属イオンの存在下で他のグラニンでも同様の結果が得られた。この結果は、上記の結果（図５から図１０）と一致し、金属によって誘導されるグラニンの凝集が確認された。

【0057】

図１１から図２６および図３６から図４９で説明されているように、金属誘導グラニン凝集の阻害でテストされた他のフラボノイド、スチルベノイドおよび分子は、同一の細胞アッセイ（図示せず）において同様の毒性阻害結果を示し、アルツハイマー病のための強力な治療薬候補（ｄｒｕｇｃａｎｄｉｄａｔｅ）としてのこれらの阻害剤分子の有効性を示す。

【0058】

実施例２
グラニンの流体力学的特性実験
分子動的光散乱：異なる溶液条件でグラニンがモノマー－オリゴマー（ｍｏｎｏｍｅｒ－ｔｏ－ｏｌｉｇｏｍｅｒ）状態であるか高分子量凝集状態であるかを判断するために、ワイアットテクノロジー（ＷｙａｔｔＴｅｃｈｏｌｏｇｙ：サンタバーバラ，ＣＡ、米国）社のダイナプロナノスター（ＤｙｎａＰｒｏＮａｎｏＳｔａｒ）を用いて２４℃でグラニンの動的光散乱実験を行い、その結果を、会社が提供するプログラム（Ｄｙｎａｍｉｃｓ７．５．０）により分析した。

【0059】

図２８は、フラボノイドの１つであるバイカレインとＦｅ^２＋の存在下でのクロモグラニンＢの流体力学的状態の分布プロファイルを示す。金属誘導グラニン凝集の流体力学的状態の分布プロファイルは、ｐＨ７．４で動的光散乱法を使用して、０．２ｍＭバイカレインおよび０．２ｍＭＦｅ^２＋の存在下でクロモグラニンＢ（０．５ｍｇ／ｍｌ）（６μＭ）で測定された。かなり驚くべきことに、０．２ｍＭＦｅ^２＋の存在にもかかわらず、クロモグラニンＢの大部分（９４．７％）は低分子量のオリゴマー状態に留まり、ごく一部（５．３％）だけが大きな凝集体状態に留まっており、これは、バイカレインが、クロモグラニンＢ同士が互いに相互作用して大きな凝集体を形成するのを防ぎ、および／または、図２７に示されたクロモグラニンＢの大きな凝集体状態を低分子量オリゴマー状態に解離したことを示す。他のグラニンでも同様の結果が得られた。この結果は、上記の結果（図１１から図２６および図３６から図４９）と一致し、フラボノイド、スチルベノイド、および一部の特定の分子が、金属によって誘導されるグラニンの凝集を阻害する理由を説明する。

【0060】

実施例３
細胞毒性実験
これらの実験では、グラニン誘導アルツハイマー病（ＡＤ）の病因における治療剤（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓａｇｅｎｔｓ）としてのこれらの分子の有効性をテストするために、選択された化合物および薬剤をラットに適用した。テストされた化合物には、フラボノイド、スチルベノイド及びその他のものが含まれている。

【0061】

ＭＴＴ細胞毒性アッセイ：細胞毒性アッセイは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（米国）製のＭＴＴ細胞増殖アッセイキットと５０，０００ＰＣ１２細胞／ウェルを使用して行われた（Ｃｈｅｒｕｖａｒａｅｔａｌ．，２０１５；Ｓｈｅａｒｍａｎｅｔａｌ．，１９９４）。このアッセイは、細胞によるＭＴＴ色素減少（ＭＴＴｄｙｅｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）のレベルを検出するように設計されており、５７０ｎｍにおける色の変化は、細胞生存率（健康状態）の指標として使用される。細胞が健康であればあるほど、色の変化が大きくなる。

【0062】

図５０は、２０μＭのＣｕ^２＋および１μＭの毒性阻害剤ルテオリンの存在下での各グラニンの細胞毒性を示す。２０μＭのＣｕ^２＋の存在下および１μＭルテオリン（金属誘導グラニン毒性阻害剤の一つ、上記の図１３及び図１４参照）の追加存在下での各グラニン（０．１μＭクロモグラニンＡ、０．０６μＭクロモグラニンＢ、および０．０７μＭセクレトグラニンII）の細胞毒性を、ＰＣ１２細胞及びＭＴＴアッセイを用いて測定した（Ｃｈｅｒｕｖａｒａｅｔａｌ．，２０１５；Ｓｈｅａｒｍａｎｅｔａｌ．，１９９４）。金属誘導グラニン凝集の阻害剤の１つであるルテオリン（上記の図１３及び図１４参照）は、実質的にグラニン誘導毒性を停止させた。

【0063】

グラニン誘導アルツハイマー病（ＡＤ）の病因における治療剤としてのこれらの分子の有効性をテストするために、４種類の分子を同時にラットに適用した。Ｗｉｓｔａｒラットの４つのグループ（各グループで７～９匹のラット）を動物実験で使用して、アルツハイマー病の病因におけるグラニンの効果、および脳室内注入法によるアルツハイマー病治療薬候補の効果を、次のようにテストした：グループ１（コントロール）；１μｌの緩衝液（２ｍＭＭＯＰＳ、ｐＨ７．４）をラット脳（７匹のラット）の脳室内に注入した。グループ２（グラニン）；それぞれ０．１μＭのクロモグラニンＡ（ＣＧＡ）、クロモグラニンＢ（ＣＧＢ）およびセクレトグラニンII（ＳｇII）が含まれたグラニン溶液を１μｌの緩衝液（２ｍＭＭＯＰＳ、ｐＨ７．４）に入れて、これをラット脳（９匹のラット）の脳室内に注入した。グループ３（グラニン＋金属イオン）；それぞれ０．１μＭのＣＧＡ、ＣＧＢおよびＳｇIIが含まれたグラニン溶液に０．８ｍＭＣｕ^２＋、２５０μＭＦｅ^２＋および２ｍＭＺｎ^２＋を加えたものを、１μｌの緩衝液（２ｍＭＭＯＰＳ、ｐＨ７．４）に入れて、これをラット脳（９匹のラット）の脳室内に注入した。グループ４（グラニン＋金属イオン＋４種類のフラボノイドとスチルベノイド）；それぞれ０．１μＭのＣＧＡ、ＣＧＢおよびＳｇIIと、０．８ｍＭのＣｕ^２＋、２５０μＭのＦｅ^２＋および２ｍＭのＺｎ^２＋とを含む溶液に、４種類のフラボノイド、スチルベノイドおよびその他の分子をそれぞれ１μＭずつ添加したものを、１μｌの緩衝液（２ｍＭＭＯＰＳ、ｐＨ７）に入れて、これをラット脳（８匹のラット）の脳室内に注入した。

【0064】

ここに提示された結果は、グラニン凝集を予防または抑制する、金属キレート剤および／または任意の薬剤が、図５から図１０に示される金属誘導凝集を阻害または予防することにより、アルツハイマー病の治療剤として役立つ可能性があることを示す。実際、フラボノイド、スチルベノイド、およびいくつかの特定の分子は、金属誘導グラニン凝集を阻害および／または抑制し（図１１から図２６、図３６から図４９）、細胞内（図５０）およびラットの脳内（図３０から図３５、図５１から図６０）におけるグラニンの毒性効果を予防するのに非常に効果的であることが証明された。さらに、動的光散乱実験において、金属イオンが、グラニンのモノマー－オリゴマー状態を大きな凝集体（図２７）に、すなわち、非毒性から毒性状態に変換することが確認され、また、フラボノイド及び他の分子の役割が、グラニンのモノマー－オリゴマー状態の大きな凝集体への変換を防止し、および／または高分子量凝集体を低分子量モノマー－オリゴマー状態（図２８）に解離することであると確認された。

【0065】

実施例４
動物実験
以下に記載する実験は、低分子量形態から高分子量凝集形態へのグラニンの凝集を阻害するために本明細書で提供される化合物および組成物が、アルツハイマー病（ＡＤ）および関連する神経変性疾患の治療剤として役立つ可能性があることをさらに示す。

【0066】

材料および方法
動物実験：動物実験では、体重が約２８０ｇから３００ｇの８週齢のＷｉｓｔａｒラットを地元のブリーダーから購入し、特定病原体フリー（ｓｐｅｃｉｆｉｃｐａｔｈｏｇｅｎｆｒｅｅ：ＳＰＦ）動物施設に収容し、アメリカ国立衛生研究所（ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈ、ＮＩＨ）の規則と規定に厳密に準拠して使用した。

【0067】

ラット脳への定位脳室内（ＳｔｅｒｅｏｔａｘｉｃＩｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ）注入：本実験では、Ｉｎｖｉｖｏ１（ＶＡ、米国）から購入したガイドカニューレ（ｇｕｉｄｅｃａｎｎｕｌａ）を、脳の中心線（吻端から尾部まで）から右側に２ｍｍ、ブレグマ線（脳の中心線に垂直なブレグマ上に描かれる線）から尾部側に０．８ｍｍの特定の箇所で、ラットの脳に脳組織の２．９ｍｍの深さで挿入した。注入カニューレ（Ｉｎｖｉｖｏ１、ＶＡ）は、ガイドカニューレの端から側脳室内にさらに０．５ｍｍ突き出ていた。１μｌの２ｍＭＭＯＰＳ、ｐＨ７．４でのグラニンおよび／またはテスト分子の最初の注入は、ラットが３歳のときに前述の脳の右心室に行われ、２回目の注入はその１週間後に行われた。対照群ラットには、実験群と同時に１μｌの２ｍＭＭＯＰＳ、ｐＨ７．４を注入した。

【0068】

学習能力と記憶力のテスト：注入されたグラニンがラットに及ぼす影響を確認するために、各ラットの学習能力と記憶力をテストする目的で、モリス水迷路実験を行った。水タンクの直径は１３５ｃｍ、水深は２３ｃｍで、ラットが１つの象限において境界壁から１５ｃｍ離れて脱出できる逃避台（直径１２ｃｍ）が配置される。ラットが１９～２０週齢（４．５ヶ月）のときに、各ラットの学習能力をテストした。このため、正常に見えた各グループ（上記のグループ１～４参照）の７匹のラットは、生後１８週～１９週の間に７～８日間（１トレーニング／１日または２日間）にわたって総５回泳いで逃避台を見つける訓練を行った。訓練後には、逃避台を１．５ｃｍの乳白色の水（合計深度２４．５ｃｍ）の下で見えなくなるようにし、ラットが泳いで逃避台に到達できるようにして、各ラットが逃避台に到達するまでに必要な時間を測定した。各ラットが逃避台に到着するのに必要な時間は、各ラットの学習能力を反映するように解釈される。記憶力テストでは、ラットをして３日間でさらに３回（１日１回）逃避台の位置を学習せしめるようにし、その後、タンク全体を１８０回転させることにより、隠された逃避台を訓練時の環境に対して反対の位置に再配置した。ラットが、逃避台が配置されていた場所から出発して泳ぎ、再配置された逃避台を見つけるとき、逃避台の元の場所をより明確に記憶していたラットは、新しく移転した逃避台を見つける前に、元の場所で長時間逃避台を探索し続けた。ここでは、ラットが新しく配置された、水タンク内の逃避台を見つけるために費やした時間を、各ラットの記憶の尺度として使用した。

【0069】

図２９は．注入カニューレが頭に取り付けられたラットと、注入が行われた箇所を示すラットの前頭部の図を示されている。（右）ラットの脳室内は青色で示され、注入カニューレの位置は右脳室内の灰色で示されている。図３０は、モリス水迷路試験で各グループのラットが費やした探索時間を示す。各グループのラットがモリス水迷路試験で逃避台に脱出するのに費やした平均時間（秒単位）は、標準誤差（ｎは各グループのラットの数）で表された。グループ４のラットには治療薬候補と一緒にグラニンと金属イオンを同時に注入したにもかかわらず、グループ１および４のラットは逃避台の位置を確認するのに７～８秒を費やし、グループ２のラットは２７秒を費やし、グループ３のラットは３７秒を費やしたことに注意を要する。これらの結果は、フラボノイドとスチルベノイドのメンバーが、グラニンがラットに有害な影響を及ぼすことを完全に防止したことを示し、すなわち、アルツハイマー病の特徴的な症状である、学習能力と記憶を損なうことを完全に防止したことを示す。

【0070】

図３１は、各グループのラットの代表的な水泳軌跡を示す。左上の数字はグループ番号を示し、トレース（ｔｒａｃｅ）は各グループのラットの水泳軌跡を示す。左下の象限にある小さな円は、右上の象限にある大きな円で示された逃避台を見つけるためにラットが泳ぎ始めた場所を示す。

【0071】

図３２は、再配置された逃避台を見つけるために費やされた時間を示す。モリス水迷路試験における逃避台の位置についてラットをして十分習熟せしめた後、水タンクを１８０°回して水タンク内の逃避台を反対側の象限に再配置し、ラットが再配置された逃避台を見つけるのに必要な時間を、各試行の間に１日のギャップを置いて３つの異なる試行で測定した。数字はグループ番号を示し、探索の平均時間（秒）は標準誤差バーで表される。グループ１とグループ４のラットは、最初の試行で逃避台を元の場所で見つけようと長い時間（＞４０秒）費やしたが、逃避台が新しい場所に移動されたことに気づいた後には、探索時間が大幅に短縮され、３回目の試行では６～８秒で逃避台を見つけることができたことに注意を要する。しかし、グループ２とグループ３のラットは、最初の試行で２１～３２秒、３回目の試行で１６～２５秒を費やしており、これは、明確な記憶力の欠如を示している。

【0072】

図３３は、各グループのラットの代表的な水泳軌跡を示す。左上の数字はグループ番号を示し、ピンク色は各グループのラットの水泳軌跡を示す。右上の象限にある小さな円は、左下の象限にある大きな緑色の円で示された逃避台を見つけるためにラットが泳ぎ始めた場所を示す。この結果は、グループ１および４のラットがグループ２および３のラットよりも著しく優れた記憶力を持っていることを明らかに示し、注入したグラニンの有害な（神経変性）効果だけでなく、グラニン誘導神経変性の阻害剤（治療薬候補）として共に注入したフラボノイドとスチルベノイドの顕著な効果も明らかに示している。

【0073】

図３４は、グラニンを注入した一部のラットの異常な姿勢を示す。グループ３の一部のラットは、グラニンと金属イオン（Ｃｕ^２＋、Ｚｎ^２＋およびＦｅ^２＋）を注入してから２週間後に首のゆがみ（ｓｋｅｗｅｄｎｅｃｋ）を示したが、グループ２の一部のラットは、グラニンを注入してから４～５週間後に首のゆがみを示し始めた。グループ１及びグループ４のラットは、１匹も異常な姿勢を見せず、年齢が上がるまで（約１８ヶ月のときに犠牲にされるまで）、正常で健康そうに見えた。

【0074】

図３５は、グループ２（グラニン注入）における首がゆがんだラットの収縮した海馬（右半分）を示す。首がゆがんだグループ２（グラニン注入）のラットを、グラニンを注入してから１０週間後（首のゆがみが現れてから６週間後、生後６ヶ月後）に犠牲にし、脳組織を調べた。驚くべきことに、学習と記憶に関与する海馬の右半分は、左半分と比較してかなり収縮していることが示された。右側は、これらのラットの右脳室内にグラニンが注入された場所である（図２９参照）。収縮した脳（海馬を含む）がアルツハイマー病患者の特徴であることを考えると、グラニンがこれほど短時間（グラニンの注入後１０週間）で若いラット（６ヶ月齢）の脳を収縮できることは驚くべきことである。

【0075】

上記の実験とデータから、１）アルツハイマー病の病原体（ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃａｇｅｎｔｓ）として機能するグラニン；２）脳内でグラニンの凝集を誘導することにより、アルツハイマー病の病因における補因子（ｃｏｆａｃｔｏｒ）として機能するＣｕ^２＋、Ｚｎ^２＋およびＦｅ^２＋などの金属イオン；３）グラニン凝集を阻害および／または抑制する、または高分子量凝集形態を低分子量形態に解離する能力を介してアルツハイマー病の治療薬候補（ｄｒｕｇｃａｎｄｉｄａｔｅ）として機能するフラボノイド分子、スチルベノイド分子、およびその誘導体のメンバー、ならびに他の幾つかの分子；が確認され、また、４）ラットにおけるアルツハイマー病のような症状を阻害する因子（ａｇｅｎｔｓ）として機能するフラボノイド分子とスチルベノイド分子のメンバーがさらに確認される。

【0076】

上記の実験とデータから、以下の因子（ａｇｅｎｔ）が、アルツハイマー病および関連する神経変性疾患の治療剤として役立つ可能性があることを提案する：１）脳内でＺｎ^２＋、Ｃｕ^２＋、Ｆｅ^２＋およびＣａ^２＋などの金属イオンの増加を阻害または抑制する任意の分子または因子、２）グラニンと相互作用してグラニンの凝集を防止または抑制する任意の分子（天然物、タンパク質、核酸など）、および３）グラニンから金属イオンを除去できる金属イオンのキレーター（ｃｈｅｌａｔｏｒ）および任意の因子（ａｇｅｎｔ）。

【0077】

実施例５
ＩｎＶｉｔｒｏおよびＩｎＶｉｖｏ実験
材料および方法
材料：主要なグラニンタンパク質であるクロモグラニンＡ（ＣＧＡ）、クロモグラニンＢ（ＣＧＢ）およびセクレトグラニンII（ＳｇII）は、ウシ副腎髄質の分泌顆粒から精製された（Ｐａｒｋｅｔａｌ．，２００２；Ｙｏｏ，１９９５；Ｙｏｏａｎｄアルバネシ、１９９０年）。Ｃｈｅｌｅｘ１００はＢｉｏ－Ｒａｄ（米国）製であり、他の化学物質は市販されている最高純度のものであった。

【0078】

凝集実験：凝集試験に先たち、グラニン凝集体を解離させるために、Ｃｈｅｌｅｘ１００（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、米国）などのキレート剤を用いた広範囲な処理により、グラニンから、精製過程でグラニンと相互作用した金属イオンを除去する必要がある。金属誘導凝集試験では、２ｍＭＭＯＰＳ（ｐＨ７．４）でＣｈｅｌｅｘ１００処理ＣＧＡ、ＣＧＢまたはＳｇIIを、ＣｕＣｌ_２、ＦｅＣｌ_２およびＺｎＣｌ_２などの濃縮金属イオンで滴定した。凝集は、ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）分光光度計を使用して濁度の変化を測定することにより観察された。すべての測定は２４^ｏＣで行われた。

【0079】

分子動的光散乱：異なる溶液条件でグラニンがモノマー－オリゴマー（ｍｏｎｏｍｅｒ－ｔｏ－ｏｌｉｇｏｍｅｒ）状態であるか高分子量凝集状態であるかを判断するために、ワイアットテクノロジー（ＷｙａｔｔＴｅｃｈｏｌｏｇｙ：サンタバーバラ，ＣＡ、米国）社のダイナプロナノスター（ＤｙｎａＰｒｏＮａｎｏＳｔａｒ）を用いて２４℃でグラニンの動的光散乱実験を行い、その結果を、会社が提供するプログラム（Ｄｙｎａｍｉｃｓ７．５．０）により分析した。

【0080】

動物実験：動物実験では、体重が約２８０ｇから３００ｇの８週齢のＷｉｓｔａｒラットを地元のブリーダーから購入し、特定病原体フリー（ｓｐｅｃｉｆｉｃｐａｔｈｏｇｅｎｆｒｅｅ：ＳＰＦ）動物施設に収容し、アメリカ国立衛生研究所（ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈ、ＮＩＨ）の規則と規定に厳密に準拠して使用した。

【0081】

【0082】

【0083】

脳の組織化学的実験：グラニンを注入したラットの脳がグラニンの影響を受けるかどうかを調べるために、ラットの脳を摘出して薄切片に切り、染色して調べた。

【0084】

結果
アピゲニンによる、Ｚｎ^２＋誘導クロモグラニンＢ凝集の防止。図３６に示す実験結果では、Ｚｎ^２＋誘導クロモグラニンＢ凝集（０．００５ｍｇ／ｍｌ）は、ｐＨ７．４で１μＭアピゲニンによってほとんど抑制された。Ｚｎ^２＋の濃度の増加によるクロモグラニンＢの凝集は黒い線（黒丸）で表され、アピゲニンの存在下では灰色の線（白丸）で表される。この実験に基づくと、アピゲニンは、Ｚｎ^２＋誘導クロモグラニンＢ凝集をほとんど阻害した。

【0085】

アピゲニンによる、Ｃｕ^２＋誘導クロモグラニンＡ凝集の防止。図３７に示す実験結果では、Ｃｕ^２＋誘導クロモグラニンＡ凝集（０．００５ｍｇ／ｍｌ）（０．１μＭ）は、ｐＨ７．４で１μＭアピゲニンによって完全に抑制された。Ｃｕ^２＋の濃度の増加によるクロモグラニンＡの凝集は黒い線（黒丸）で表され、アピゲニンの存在下では灰色の線（白丸）で表される。この実験に基づくと、アピゲニンは、Ｃｕ^２＋誘導クロモグラニンＡ凝集を完全に阻害した。

【0086】

タンゲレチンによる、Ｆｅ^２＋誘導クロモグラニンＢ凝集の防止。図３８に示す実験結果では、Ｆｅ^２＋誘導クロモグラニンＢ凝集（０．００５ｍｇ／ｍｌ）（０．０６μＭ）は、ｐＨ７．４で１μＭのタンゲレチンによって完全に抑制された。Ｆｅ^２＋の濃度の増加によるクロモグラニンＢの凝集は黒い線（黒丸）で表され、タンゲレチンの存在下では灰色の線（白丸）で表される。この実験に基づくと、タンゲレチンは、Ｆｅ^２＋誘導クロモグラニンＢ凝集を完全に阻害した。

【0087】

タンゲレチンによる、Ｃｕ^２＋誘導クロモグラニンＡ凝集の防止。図３９に示す実験結果では、Ｃｕ^２＋誘導クロモグラニンＡ凝集（０．００５ｍｇ／ｍｌ）（０．１μＭ）は、ｐＨ７．４で１μＭタンゲレチンによってほとんど抑制された。Ｃｕ^２＋の濃度の増加によるクロモグラニンＡの凝集は黒い線（黒丸）で表され、タンゲレチンの存在下では灰色の線（白丸）で表される。この実験に基づくと、タンゲレチンは、Ｃｕ^２＋誘導クロモグラニンＡ凝集をほとんど阻害した。

【0088】

ケルセチンによる、Ｃｕ^２＋誘導クロモグラニンＢ凝集の防止。図４０に示す実験結果では、Ｃｕ^２＋誘導クロモグラニンＢ凝集（０．００５ｍｇ／ｍｌ）（０．０６μＭ）は、ｐＨ７．４で１μＭケルセチンによって完全に抑制された。Ｃｕ^２＋濃度の増加によるクロモグラニンＢの凝集は黒い線（黒丸）で表され、ケルセチンの存在下では灰色の線（白丸）で表される。この実験に基づくと、ケルセチンは、Ｃｕ^２＋誘導クロモグラニンＢ凝集を完全に阻害した。

【0089】

Ｆｅ^２＋によってセクレトグラニンIIが凝集されていることをケルセチンが遮断した。図４１は、Ｆｅ^２＋によってセクレトグラニンII（０．００５ｍｇ／ｍｌ）を（０．０７μＭ）が凝集されていることを１μＭケルセチンが完全に抑制する（ｐＨ７．４）を示す。Ｆｅ^２＋濃度の増加に伴うセクレトグラニンIIの凝集は、黒丸でケルセチン存在下で行われたウォンで示した。
ケルセチンによる、Ｆｅ^２＋誘導セクレトグラニンII凝集の防止。図４１に示す実験結果では、Ｆｅ^２＋誘導セクレトグラニンIIの凝集（０．００５ｍｇ／ｍｌ）（０．０７μＭ）は、ｐＨ７．４で１μＭケルセチンによって完全に抑制された。Ｆｅ^２＋の濃度の増加によるセクレトグラニンIIの凝集は黒い線（黒丸）で表され、ケルセチンの存在下では灰色の線（白丸）で表される。この実験に基づくと、ケルセチンは、Ｆｅ^２＋誘導セクレトグラニンII凝集を完全に阻害した。

【0090】

フィセチンによる、Ｆｅ^２＋誘導クロモグラニンＡ凝集の防止。図４２に示す実験結果では、Ｆｅ^２＋誘導クロモグラニンＡ凝集（０．００５ｍｇ／ｍｌ）（０．１μＭ）は、ｐＨ７．４で１μＭのフィセチンによって完全に抑制された。Ｆｅ^２＋の濃度の増加によるクロモグラニンＡ凝集は黒い線（黒丸）で表され、フィセチンの存在下では灰色の線（白丸）で表される。この実験に基づくと、フィセチンは、Ｆｅ^２＋誘導クロモグラニンＡ凝集をほとんど阻害した。

【0091】

フィセチンによる、Ｆｅ^２＋誘導セクレトグラニンII凝集の防止。図４３に示す実験結果では、Ｆｅ^２＋誘導セクレトグラニンII凝集（０．００５ｍｇ／ｍｌ）は、ｐＨ７．４で１μＭフィセチンによって完全に抑制された。Ｆｅ^２＋の濃度の増加によるセクレトグラニンIIの凝集は黒い線（黒丸）で表され、フィセチンの存在下では灰色の線（白丸）で表される。この実験に基づくと、フィセチンは、Ｆｅ^２＋誘導セクレトグラニンII凝集を完全に阻害した。

【0092】

ミリセチンによる、Ｆｅ^２＋誘導クロモグラニンＡ凝集の防止。図４４に示す実験結果では、Ｆｅ^２＋誘導クロモグラニンＡ凝集（０．００５ｍｇ／ｍｌ）（０．１μＭ）は、ｐＨ７．４で１μＭミリセチンによって完全に抑制された。Ｆｅ^２＋の濃度の増加によるクロモグラニンＡの凝集は黒い線（黒丸）で表され、ミリセチンの存在下では灰色の線（白丸）で表される。この実験に基づくと、ミリセチンは、Ｆｅ^２＋誘導クロモグラニンＡ凝集を完全に阻害した。

【0093】

ミリセチンによる、Ｆｅ^２＋誘導クロモグラニンＢ凝集の防止。図４５に示す実験結果では、Ｆｅ^２＋誘導クロモグラニンＢ凝集（０．００５ｍｇ／ｍｌ）は、ｐＨ７．４で１μＭミリセチンによって完全に抑制された。Ｆｅ^２＋の濃度の増加によるクロモグラニンＢの凝集は黒い線（黒丸）で表され、ミリセチンの存在下では灰色の線（白丸）で表される。この実験に基づくと、ミリセチンは、Ｆｅ^２＋誘導クロモグラニンＢ凝集を完全に阻害した。

【0094】

モリンによる、Ｆｅ^２＋誘導クロモグラニンＡ凝集の防止。図４６に示す実験結果では、Ｆｅ^２＋誘導クロモグラニンＡ凝集（０．００５ｍｇ／ｍｌ）は、ｐＨ７．４で１μＭモリンによって完全に抑制された。Ｆｅ^２＋の濃度の増加によるクロモグラニンＡの凝集は黒い線（黒丸）で表されるが、モリンの存在下では灰色の線（白丸）で表される。この実験に基づくと、モリンは、Ｆｅ^２＋誘導クロマグラニンＡ凝集を完全に阻害した。

【0095】

モリンによる、Ｚｎ^２＋誘導クロモグラニンＡ凝集の防止。図４７に示す実験結果では、Ｚｎ^２＋誘導クロモグラニンＡ凝集（０．００５ｍｇ／ｍｌ）は、ｐＨ７．４で１μＭモリンによってほとんど抑制された。Ｚｎ^２＋の濃度の増加によるクロモグラニンＡの凝集は黒い線（黒丸）で表され、モリンの存在下では灰色の線（白丸）で表される。この実験に基づくと、モリンは、Ｚｎ^２＋誘導クロモグラニンＡ凝集をほとんど阻害した。

【0096】

５，７－ジメトキシフラボンによる、Ｚｎ^２＋誘導クロモグラニンＡ凝集の防止。図４８に示す実験結果では、Ｚｎ^２＋誘導クロモグラニンＡ凝集（０．００５ｍｇ／ｍｌ）は、ｐＨ７．４で１μＭの５，７－ジメトキシフラボンによってほとんど抑制された。Ｚｎ^２＋の濃度の増加によるクロモグラニンＡの凝集は黒い線（黒丸）で表され、５，７－ジメトキシフラボンの存在下では灰色の線（白丸）で表される。この実験に基づくと、５，７－ジメトキシフラボンは、Ｚｎ^２＋誘導クロモグラニンＡ凝集をほとんど阻害した。

【0097】

５，７－ジメトキシフラボンによる、Ｆｅ^２＋誘導クロモグラニンＡ凝集の防止。図４９に示す実験結果では、Ｆｅ^２＋誘導クロモグラニンＡ凝集（０．００５ｍｇ／ｍｌ）は、ｐＨ７．４で１μＭ５，７－ジメトキシフラボンによって完全に抑制された。Ｆｅ^２＋の濃度の増加によるクロモグラニンＡの凝集は黒い線（黒丸）で表され、５，７－ジメトキシフラボンの存在下では灰色の線（白丸）で表される。この実験に基づくと、５，７－ジメトキシフラボンは、Ｆｅ^２＋誘導クロモグラニンＡ凝集を完全に阻害した。

【0098】

図５０は、２０μＭのＣｕ^２＋および１μＭの毒性阻害剤ルテオリンの存在下での各グラニンの細胞毒性を示す。２０μＭのＣｕ^２＋の存在下および１μＭルテオリン（金属誘導グラニン毒性阻害剤の一つ）の追加存在下での、各グラニン（０．１μＭクロモグラニンＡ、０．０６μＭクロモグラニンＢ、および０．０７μＭセクレトグラニンII）の細胞毒性を、ＰＣ１２細胞及びＭＴＴアッセイを用いて測定した。金属誘導グラニン凝集の阻害剤の１つであるルテオリンは、実質的にグラニン誘導毒性を停止させた。図１１から図２６および図３６から図４９に示すように、金属誘導グラニン凝集の阻害についてテストされた他のフラボノイド、スチルベノイドおよび他の分子も、他の実験で見られるように、同一の細胞アッセイ（図示せず）で同様の毒性阻害結果を示し、これらの阻害剤分子の有効性をアルツハイマー病の強力な治療薬候補として予測した。

【0099】

図５１は、脳室内注入後２．５ヶ月が経過した後、モリス水迷路試験において各グループのラットが費やした探索時間を示す。各グループのラットが逃避台に脱出するまでに費やした平均時間（秒単位）は、標準誤差（ｎは各グループのラットの数）で表された。グループ１および４のラットは逃避台の位置を確認するのに６．０～６．５秒を費やしたのに対し、グループ２のラットは１６．８秒を費やし、グループ３のラットは１３．３秒を費やした。これは、グループ３のラットがグループ２のラットよりも少し早くグランン誘導毒性から回復したことを意味する。これらの実験に基づくと、フラボノイドとスチルベノイドのメンバーは、グラニン注射後２．５ヶ月経過した時点でも、アルツハイマー病の特徴的な症状である学習能力や記憶力の低下など、グラニンがラットに及ぼす有害な影響を完全に防止した。

【0100】

図５２は、図５１の各グループのラットの代表的な水泳軌跡が示す。左上の数字はグループ番号を示し、トレースは各グループのラットの水泳軌跡を示す。左下の象限にある小さな円は、右上の象限にある大きな円で示された逃避台を見つけるためにラットが泳ぎ始めた場所を示す。

【0101】

図５３及び図５４は、アルツハイマー病のような症状がある場合とない場合の１０．５ヶ月齢のラットの海馬の前部（ｆｒｏｎｔａｌｓｅｃｔｉｏｎ）を示す。図５３は、１０．５ヶ月齢（グラニン注入後７．５ヶ月）のラットの脳部位（ｂｒａｉｎｓｅｃｔｉｏｎ）をヘマトキシリンで染色し、コントロール群（グループ１）、グラニン注入群（グループ２）、グラニン及び金属イオン注入群（グループ３）、および、グラニン、金属イオン及び分解化合物注入群（グループ４）のラットの海馬を比較したものである。グループ２のラットの海馬は、死細胞の徴候である多数の大きな空洞（ｈｏｌｌｏｗｓｐａｃｅ）を示し、グループ３のラットの海馬にも同様に観察される。コントロール群（グループ１）のラットの海馬における死細胞の徴候は、グループ２および３のラットに比べて有意に少なかった。さらに、グループ４のラットの海馬には、空洞がほとんどなく、コントロール群のラットのそれよりもはるかに少なかったが、これは、グループ４のラットの海馬の完全性が十分に保存されていることを示す。図５４は、図５３からの海馬のほぼ同じ領域の高倍率ビューを示す（バー＝１００μｍ）。

【0102】

図５５は、アルツハイマー病のような症状がある場合とない場合の１０．５ヶ月齢のラットの脳皮質の前部を示す。１０．５ヶ月齢のラットの脳部位をヘマトキシリンで染色し、コントロール群（グループ１）、グラニン注入群（グループ２）、グラニン及び金属イオン注入群（グループ３）、および、グラニン、金属イオン及び分解化合物注入群（グループ４）のラットの脳皮質を比較した。グループ２のラットの脳皮質は、死細胞の徴候である多数の大きな空洞を示し、グループ３のラットの脳皮質にも同様に観察された。海馬の場合と同様に、コントロール群（グループ１）のラットの脳皮質における死細胞の徴候は、グループ２および３のラットに比べて有意に少なかった。しかし、グループ４のラットの脳皮質には、空洞がほとんどなく、コントロール群のラットのそれよりもはるかに少なかった。グループ４のラットには、脳皮質の完全性が十分に保存されていた（バー＝１００μｍ）。

【0103】

図５６は、アルツハイマー病のような症状がある場合とない場合の１０．５ヶ月齢のラットの脳組織密度の比較を示す。アルツハイマー病のような症状のラットとそうではないラットでは、脳組織密度に大きな違いがあった。アルツハイマー病のような症状を発現するラット（グループ２および３）の脳組織密度は、コントロール群のラットに比べて有意に減少して約１０～２５％減少した。グループ４のラットの脳組織密度は約３～４％上昇し、グラニンと金属イオンと共に注入された分解化合物が脳細胞の完全性を保護したことを示した。データは、脳皮質と海馬の異なる領域の４つの測定値の平均であり、コントロールに対して平均±ｓｅで表された。

【0104】

図５７は、クロモグラニンＡ特異的抗体により、１０．５ヶ月齢のラットの海馬の免疫染色を示す。１０．５ヶ月齢のラットの脳部位をクロモグラニンＡ特異抗体で免疫染色し、４つのグループのラットの海馬を比較した。海馬および脳皮質には多数のクロモグラニンＡ含有老人斑（ｐｌａｑｕｅｓ）があった（図示せず）。しかし、グループ１および２のラットでは、グループ３および４のラットよりもクロモグラニンＡ含有老人斑がはるかに多かったが、グループ１のラットの老人斑は有意に小さかった。また、クロモグラニンＡ含有老人斑と死細胞の徴候である脳組織の穴は、グループ２および３の方がグループ１および４よりも大きかった。グループ３の脳のグラニン含有老人斑は特に最も大きく、多くの場合、空洞に絶縁されているように見えた。グループ４のラットにおけるクロモグラニンＡ含有老人斑はまれであり、脳組織はコントルール群の脳組織よりも穴が少なく、十分に保存されているように見えた（バー＝５０μｍ）。

【0105】

図５８は、クロモグラニンＢ特異的抗体により、１０．５ヶ月齢のラットの海馬の免疫染色を示す。１０．５ヶ月齢のラットの脳部位をクロモグラニンＢ特異抗体で免疫染色し、４つのグループのラットの海馬を比較した。海馬および脳皮質には多数のクロモグラニンＢ含有老人斑があった（図示せず）。グループ１および２のラットでは、グループ３および４のラットよりもクロモグラニンＢ含有老人斑がはるかに多かったが、グループ１のラットの老人斑は有意に小さかった。クロモグラニンＢ含有老人斑と脳組織の穴は、グループ２および３の方がグループ１および４よりも大きかった。グループ３の脳のグラニン含有老人斑は最も大きく、多くの場合、空洞に絶縁されているように見えた。クロモグラニンＡと同様に、グループ４のラットにおけるクロモグラニンＢ含有老人斑はまれであり、脳組織はコントロール群の脳組織よりも穴が少なく、十分に保存されているように見えた（バー＝５０μｍ）。

【0106】

図５９は、セクレトグラニンII特異的抗体により、１０．５ヶ月齢のラットの海馬の免疫染色を示す。１０．５ヶ月齢のラットの脳部位をセクレトグラニンII特異抗体で免疫染色し、４つのグループのラットの海馬を比較した。海馬および脳皮質には多数のセクレトグラニンII含有老人斑があった（図示せず）。グループ１および２のラットでは、グループ３および４のラットよりもセクレトグラニンII含有老人斑がはるかに多かったが、グループ１のラットの老人斑は有意に小さかった。セクレトグラニンII含有老人斑と脳組織の穴は、グループ２および３の方がグループ１および４よりも大きかった。前述したように、グループ３の脳のグラニン含有老人斑は大きく、コンパクトであり、多くの場合、空洞に絶縁されているように見えた。他のグラニンと同様に、グループ４のラットにおけるセクレトグラニンII含有老人斑はまれであり、脳組織はコントロール群の脳組織よりも穴が少なく、十分に保存されているように見えた（バー＝５０μｍ）。

【0107】

図６０は、アルツハイマー病のような症状がある場合とない場合の１１．５ヶ月齢のラットの活動性の比較を示す。ラットの活動性は、スピニングホイールを使用して測定され、各ラットの活動時間は、各ラットがホイールを回転させている時間であった。さらに、各ラットが９０^ｏ前後に動いたときにホイールにしがみつくことができる時間の長さも活動として見なされた。コントロール群ラット（グループ１）は、２分間のうち１７．５秒間活動した。アルツハイマー病のような症状があるラット（グループ２および３）は、それぞれ１１．２秒間および１４．２秒間活動した。分解化合物を注入したグループ４のラットは、２３．５秒間活動し、コントロール群のラットの活動よりも大幅に長くなった。各グループに４匹のラットがおり、測定は４回行われ、データは平均±ｓｅとして表される。

【0108】

この結果は、グラニンがアルツハイマー病のような症状を引き起こす可能性があることを示し、以下のアルツハイマー病の特徴を含む：１）学習能力の低下、２）記憶力の低下、３）脳細胞の喪失の加速、４）脳内のグラニン含有老人斑の発達の加速、および５）活動性の低減。この結果は、フラボノイドおよびスチルベノイドの４分子を同時に投与することにより、ラットにおけるグラニン誘導アルツハイマー病のような症状を抑制することを示す。

【0109】

低分子量形態から高分子量凝集形態へのグラニンの凝集を阻害するための組成物であって、スクテラレイン、ルテオリン、バイカレイン、ケンフェロール、ケルセチン、アピゲニン、タンゲレチン、ミリセチン、フィセチン、モリン、レスベラトロール、エピガロカテキン３－ガレート（ＥＧＣＧ）、コルジセピン、５，７－ジメトキシフラボン、およびチルホスチンＡＧ１４７８のうちの少なくとも２つを含む、組成物。

【0110】

スクテラレイン、ルテオリン、バイカレイン、ケンフェロール、ケルセチン、レスベラトロール、エピガロカテキン３－ガレート、コルジセピン、およびチルホスチンＡＧ１４７８のうちの少なくとも４つを含む、請求項１に記載の組成物。

【0111】

スクテラレイン、ルテオリン、バイカレイン、ケンフェロール、レスベラトロール、およびエピガロカテキン３－ガレートを含む、請求項１に記載の組成物。

【0112】

スクテラレイン、ルテオリン、バイカレイン、ケンフェロール、ケルセチン、レスベラトロール、エピガロカテキン３－ガレート、およびチルホスチンＡＧ１４７８を含む、請求項１に記載の組成物。

【0113】

前記グラニンが、クロモグラニンＡ（ＣＧＡ）、クロモグラニンＢ（ＣＧＢ）、セクレトグラニンII（ＳｇII）およびセクレトグラニンIII（ＳｇIII）のうちの１つ以上を含む、請求項１に記載の組成物。

【0114】

動物の神経系において金属イオンＺｎ^２＋、Ｃｕ^２＋、Ｆｅ^２＋およびＣａ^２＋の１つ以上を低減、阻害、抑制または隔離する１つ以上の薬剤（ａｇｅｎｔ）をさらに含み、前記薬剤は、金属タンパク質、Ｚｎ^２＋結合および隔離分子、カゼイン、アルブミン、ジンクフィンガー転写因子、Ｃｕ^２＋結合および隔離分子、セルロプラスミン、カゼイン、アルブミン、Ｆｅ^２＋結合および隔離分子、カルモジュリン、トロポニン、フェリチン、トランスフェリン、ラクトフェリン、およびアントシアニンから選択される、請求項１に記載の組成物。

【0115】

Ｚｎ^２＋、Ｃｕ^２＋またはＦｅ^２＋から選択される金属イオンのキレーター（ｍｅｔａｌｉｏｎｃｈｅｌａｔｏｒ）をさらに含む、請求項１に記載の組成物。

【0116】

前記組成物が、動物において、低分子量形態から高分子量凝集形態へのグラニンの凝集を阻害する、および／または高分子量凝集形態を低分子量形態に解離するのに有効である、請求項１に記載の組成物。

【0117】

低分子量形態から高分子量凝集形態へのグラニンの凝集を阻害する、および／または高分子量凝集形態を低分子量形態に解離するための組成物であって、ｉ）スクテラレイン、ルテオリン、バイカレイン、ケンフェロール、ケルセチン、アピゲニン、タンゲレチン、ミリセチン、およびフィセチンから選択されるアントキサンチン；ii）レスベラトロール、ピセアタンノリン、ピノシルビン、プテロスチルベン、アストリンギン、およびピセイドから選択されるスチルベノイド；iii）エピガロカテキン３－ガレート（ＥＧＣＧ）、カテキン、ガロカテキン、カテキン３－ガレート、ガロカテキン３－ガレート、エピカテキン、エピガロカテキン、エピカテキン３－ガレート、テアフラビン－３－ガレート、テアフラビン－３’－ガレート、テアフラビン－３，３’－ガレート、テアルビジン、およびプロアントシアニジンから選択されるフラバン；およびiv）コルジセピン、５，７－ジメトキシフラボン、およびチルホスチンＡＧ１４７８から選択される化合物；を含む、組成物。

【0118】

グラニンと金属イオンとの相互作用を阻害するための組成物であって、スクテラレイン、ルテオリン、バイカレイン、ケンフェロール、ケルセチン、レスベラトロール、エピガロカテキン３－ガレート、コルジセピン、およびチルホスチンＡＧ１４７８のうちの少なくとも２つを含む、組成物。

【0119】

スクテラレイン、ルテオリン、バイカレイン、ケンフェロール、レスベラトロール、およびエピガロカテキン３－ガレートを含む、請求項１０に記載の組成物。

【0120】

スクテラレイン、ルテオリン、バイカレイン、ケンフェロール、ケルセチン、レスベラトロール、エピガロカテキン３－ガレート、コルジセピン、およびチルホスチンＡＧ１４７８を含む、請求項１０に記載の組成物。

【0121】

前記グラニンが、クロモグラニンＡ（ＣＧＡ）、クロモグラニンＢ（ＣＧＢ）、セクレトグラニンII（ＳｇII）およびセクレトグラニンIII（ＳｇIII）のうちの１つ以上を含む、請求項１０に記載の組成物。

【0122】

動物の神経系において、Ｚｎ^２＋、Ｃｕ^２＋、Ｆｅ^２＋およびＣａ^２＋から選択される金属イオンを低減、阻害、抑制または隔離する１つ以上の薬剤をさらに含む、請求項１０に記載の組成物。

【0123】

Ｚｎ^２＋、Ｃｕ^２＋またはＦｅ^２＋から選択される金属イオンのキレーターをさらに含む、請求項１０に記載の組成物。

【0124】

前記組成物が、動物において、低分子量形態から高分子量凝集形態へのグラニンの凝集を阻害する、および／または高分子量凝集形態を低分子量形態に解離するのに有効である、請求項１０に記載の組成物。

【0125】

グラニンと金属イオンとの相互作用を阻害するための組成物であって、ｉ）スクテラレイン、ルテオリン、バイカレイン、ケンフェロール、ケルセチン、アピゲニン、タンゲレチン、ミリセチン、フィセチン、およびモリンから選択されるアントキサンチン；ii）レスベラトロール、ピセアタンノリン、ピノシルビン、プテロスチルベン、アストリンギン、およびピセイドから選択されるスチルベノイド；iii）エピガロカテキン３－ガレート（ＥＧＣＧ）、カテキン、ガロカテキン、カテキン３－ガレート、ガロカテキン３－ガレート、エピカテキン、エピガロカテキン、エピカテキン３－ガレート、テアフラビン－３－ガレート、テアフラビン－３’－ガレート、テアフラビン－３，３’－ガレート、テアルビジン、およびプロアントシアニジンから選択されるフラバン；およびiv）コルジセピン、５，７－ジメトキシフラボン、およびチルホスチンＡＧ１４７８から選択される化合物；を含む、組成物。

【0126】

低分子量形態から高分子量凝集形態へのグラニンの凝集を阻害するための組成物を含む、認知症またはアルツハイマー病の治療または予防のための薬学的組成物。

【0127】

認知症またはアルツハイマー病の治療または予防のための薬学的組成物であって、スクテラレイン、ルテオリン、バイカレイン、ケンフェロール、ケルセチン、アピゲニン、タンゲレチン、ミリセチン、フィセチン、レスベラトロール、エピガロカテキン３－ガレート、コルジセピン、およびチルホスチンＡＧ１４７８のうちの少なくとも２つを含む、組成物。

【0128】

スクテラレイン、ルテオリン、バイカレイン、ケンフェロール、ケルセチン、アピゲニン、タンゲレチン、ミリセチン、フィセチン、モリン、レスベラトロール、エピガロカテキン３－ガレート、コルジセピン、５，７－ジメトキシフラボン、およびチルホスチンＡＧ１４７８のうちの少なくとも４つを含む、請求項１９に記載の薬学的組成物。

【0129】

スクテラレイン、ルテオリン、バイカレイン、ケンフェロール、アピゲニン、タンゲレチン、ミリセチン、フィセチン、モリン、レスベラトロール、およびエピガロカテキン３－ガレートを含む、請求項１９に記載の薬学的組成物。

【0130】

スクテラレイン、ルテオリン、バイカレイン、ケンフェロール、ケルセチン、アピゲニン、タンゲレチン、ミリセチン、フィセチン、モリン、レスベラトロール、エピガロカテキン３－ガレート、コルジセピン、５，７－ジメトキシフラボン、およびチルホスチンＡＧ１４７８を含む、請求項１９に記載の薬学的組成物。

【0131】

前記グラニンが、クロモグラニンＡ（ＣＧＡ）、クロモグラニンＢ（ＣＧＢ）、セクレトグラニンII（ＳｇII）およびセクレトグラニンIII（ＳｇIII）のうちの１つ以上を含む、請求項１９に記載の薬学的組成物。

【0132】

動物の神経系において、Ｚｎ^２＋、Ｃｕ^２＋、Ｆｅ^２＋およびＣａ^２＋から選択される金属イオンを低減、阻害、抑制または隔離する１つ以上の薬剤をさらに含む、請求項１９に記載の薬学的組成物。

【0133】

Ｚｎ^２＋、Ｃｕ^２＋またはＦｅ^２＋から選択される金属イオンのキレーターをさらに含む、請求項１９に記載の薬学的組成物。

【0134】

前記組成物が、動物において、低分子量形態から高分子量凝集形態へのグラニンの凝集を阻害するのに有効である、請求項１９に記載の薬学的組成物。

【0135】

認知症またはアルツハイマー病の治療または予防のための薬学的組成物であって、ｉ）スクテラレイン、ルテオリン、バイカレイン、ケンフェロール、ケルセチン、アピゲニン、タンゲレチン、ミリセチン、フィセチン、およびモリンから選択されるアントキサンチン；ii）レスベラトロール、ピセアタンノリン、ピノシルビン、プテロスチルベン、アストリンギン、およびピセイドから選択されるスチルベノイド；iii）エピガロカテキン３－ガレート（ＥＧＣＧ）、カテキン、ガロカテキン、カテキン３－ガレート、ガロカテキン３－ガレート、エピカテキン、エピガロカテキン、エピカテキン３－ガレート、テアフラビン－３－ガレート、テアフラビン－３’－ガレート、テアフラビン－３，３’－ガレート、テアルビギン、およびプロアントシアニジンから選択されるフラバン；およびiv）コルジセピン、５，７－ジメトキシフラボン、およびチルホスチンＡＧ１４７８から選択される化合物；を含む、組成物。

【0136】

細胞毒性を低減または阻害する方法であって、低分子量形態から高分子量凝集形態へのグラニンの凝集を阻害するための組成物を投与するステップを含む、方法。

【0137】

細胞毒性を低減または阻害する方法であって、低分子量形態から高分子量凝集形態へのグラニンの凝集を阻害するための組成物を投与するステップを含み、前記組成物が、スクテラレイン、ルテオリン、バイカレイン、ケンフェロール、レスベラトロール、およびエピガロカテキン３－ガレートのうちの少なくとも４つを含む、方法。

【0138】

認知症またはアルツハイマー病の治療または予防のための方法であって、低分子量形態から高分子量凝集形態へのグラニンの凝集を阻害するための有効量の薬学的組成物を投与するステップを含み、前記組成物が、少なくとも次の２つ：スクテラレイン、ルテオリン、バイカレイン、ケンフェロール、ケルセチン、レスベラトロール、エピガロカテキン３－ガレート、コルジセピン、５，７－ジメトキシフラボン、およびチルホスチンＡＧ１４７８のうちの少なくとも２つを含む、方法。

【0139】

前記薬学的組成物が、スクテラレイン、ルテオリン、バイカレイン、ケンフェロール、ケルセチン、レスベラトロール、エピガロカテキン３－ガレート、コルジセピン、およびチルホスチンＡＧ１４７８の少なくとも４つを含む、請求項３０に記載の方法。

【0140】

前記薬学的組成物が、スクテラレイン、ルテオリン、バイカレイン、ケンフェロール、レスベラトロール、およびエピガロカテキン３－ガレートを含む、請求項３０に記載の方法。

【0141】

前記薬学的組成物が、スクテラレイン、ルテオリン、バイカレイン、ケンフェロール、ケルセチン、レスベラトロール、エピガロカテキン３－ガレート、コルジセピン、５，７－ジメトキシフラボン、およびチルホスチンＡＧ１４７８を含む、請求項３０に記載の方法。

【0142】

前記薬学的組成物が、クロモグラニンＡ（ＣＧＡ）、クロモグラニンＢ（ＣＧＢ）、セクレトグラニンII（ＳｇII）およびセクレトグラニンIII（ＳｇIII）のうちの１つ以上のグラニンを含む、請求項３０に記載の方法。

【0143】

前記薬学的組成物が、動物の神経系において、Ｚｎ^２＋、Ｃｕ^２＋、Ｆｅ^２＋およびＣａ^２＋から選択される金属イオンを低減、阻害、抑制または隔離する１つ以上の薬剤をさらに含む、請求項３０に記載の方法。

【0144】

前記薬学的組成物が、Ｚｎ^２＋、Ｃｕ^２＋またはＦｅ^２＋から選択される金属イオンのキレーターをさらに含む、請求項３０に記載の方法。

【0145】

前記方法が、動物において、低分子量形態から高分子量凝集形態へのグラニンの凝集を阻害する、および／または高分子量凝集形態を低分子量形態に解離するのに有効である、請求項３０に記載の方法。

【0146】

認知症またはアルツハイマー病の治療または予防のための方法であって、ｉ）スクテラレイン、ルテオリン、バイカレイン、ケンフェロール、ケルセチン、アピゲニン、タンゲレチン、ミリセチン、フィセチン、およびモリンから選択されるアントキサンチン；ii）レスベラトロール、ピセアタンノリン、ピノシルビン、プテロスチルベン、アストリンギン、およびピセイドから選択されるスチルベノイド；iii）エピガロカテキン３－ガレート（ＥＧＣＧ）、カテキン、ガロカテキン、カテキン３－ガレート、ガロカテキン３－ガレート、エピカテキン、エピガロカテキン、エピカテキン３－ガレート、テアフラビン－３－ガレート、テアフラビン－３’－ガレート、テアフラビン－３，３’－ガレート、テアルビジン、およびプロアントシアニジンから選択されるフラバン；およびiv）コルジセピン、５，７－ジメトキシフラボン、およびチルホスチンＡＧ１４７８から選択される化合物；を含む薬学的組成物の有効量を投与するステップを含む、方法。

【0147】

前記薬学的組成物が、スクテラレイン、ルテオリン、バイカレイン、ケンフェロール、ケルセチン、アピゲニン、タンゲレチン、ミリセチン、フィセチン、モリン、レスベラトロール、エピガロカテキン３－ガレート、コルジセピン、５，７－ジメトキシフラボン、およびチルホスチンＡＧ１４７８のうちの少なくとも４つを含む、請求項３８に記載の方法。

【0148】

前記薬学的組成物が、スクテラレイン、ルテオリン、バイカレイン、ケンフェロール、アピゲニン、タンゲレチン、ミリセチン、フィセチン、モリン、レスベラトロール、およびエピガロカテキン３－ガレートを含む、請求項３８記載の方法。

【0149】

前記薬学的組成物が、スクテラレイン、ルテオリン、バイカレイン、ケンフェロール、ケルセチン、アピゲニン、タンゲレチン、ミリセチン、フィセチン、モリン、レスベラトロール、エピガロカテキン３－ガレート、コルジセピン、５，７－ジメトキシフラボン、およびチルホスチンＡＧ１４７８を含む、請求項３８に記載の方法。

【0150】

前記薬学的組成物が、クロモグラニンＡ（ＣＧＡ）、クロモグラニンＢ（ＣＧＢ）、セクレトグラニンII（ＳｇII）およびセクレトグラニンIII（ＳｇIII）のうちの１つ以上のグラニンを含む、請求項３８に記載の方法。

【0151】

前記薬学的組成物が、動物の神経系において、Ｚｎ^２＋、Ｃｕ^２＋、Ｆｅ^２＋およびＣａ^２＋から選択される金属イオンを低減、阻害、抑制または隔離する１つ以上の薬剤をさらに含む、請求項３８に記載の方法。

【0152】

前記薬学的組成物が、Ｚｎ^２＋、Ｃｕ^２＋またはＦｅ^２＋から選択される金属イオンのキレーターをさらに含む、請求項３８に記載の方法。

【0153】

前記方法が、動物において、低分子量形態から高分子量凝集形態へのグラニンの凝集を阻害するのに有効である、請求項３８に記載の方法。

【0154】

被験体における認知症またはアルツハイマー病の治療または予防のための方法であって、被験体の神経系において、Ｚｎ^２＋、Ｃｕ^２＋、Ｆｅ^２＋およびＣａ^２＋から選択される金属イオンを低減、阻害、抑制または隔離する１つ以上の薬剤を含む薬学的組成物の有効量を投与するステップを含む、方法。

【0155】

【0156】

前記薬学的組成物が、スクテラレイン、ルテオリン、バイカレイン、ケンフェロール、レスベラトロール、およびエピガロカテキン３－ガレートを含む、請求項４６に記載の方法。

【0157】

前記薬学的組成物が、スクテラレイン、ルテオリン、バイカレイン、ケンフェロール、ケルセチン、レスベラトロール、エピガロカテキン３－ガレート、コルジセピン、５，７－ジメトキシフラボン、およびチルホスチンＡＧ１４７８を含む、請求項４６に記載の方法。

【0158】

前記薬学的組成物が、クロモグラニンＡ（ＣＧＡ）、クロモグラニンＢ（ＣＧＢ）、セクレトグラニンII（ＳｇII）およびセクレトグラニンIII（ＳｇIII）のうちの１つ以上のグラニンを含む、請求項４６に記載の方法。

【0159】

前記薬学的組成物が、動物の神経系において、Ｚｎ^２＋、Ｃｕ^２＋、Ｆｅ^２＋およびＣａ^２＋から選択される金属イオンを低減、阻害、抑制または隔離する１つ以上の薬剤をさらに含む、請求項４６に記載の方法。

【0160】

前記薬学的組成物が、Ｚｎ^２＋、Ｃｕ^２＋またはＦｅ^２＋から選択される金属イオンのキレーターをさらに含む、請求項４６に記載の方法。

【0161】

前記方法が、動物において、低分子量形態から高分子量凝集形態へのグラニンの凝集を阻害するのに有効である、請求項４６に記載の方法。

【0162】

アルツハイマー病の治療薬候補をスクリーニングする方法であって、Ｚｎ^２＋、Ｃｕ^２＋、Ｆｅ^２＋およびＣａ^２＋から選択される金属イオンによって誘導される１つ以上のグラニンの凝集を阻害および／または抑制するか、または凝集されたグラニンを解離する能力に基づいて、治療薬候補を選択するステップを含む、方法。

【0163】

本明細書では、本発明を実施するために発明者に知られている最良の形態を含む、本発明の特定の実施形態について説明する。もちろん、これらの説明された実施形態の変形は、前述の記載を読むことで当業者には明らかになるであろう。本発明者は、当業者がそのような変形を適切に使用することを予測しており、本発明者は、本明細書に具体的に記載された以外の方法で本発明を実施することを意図する。したがって、本発明は、適用可能な法律により許可された、本明細書に添付の特許請求の範囲に列挙された主題の全ての修正および等価物を含む。その上、可能なすべての変形における上記の実施形態の任意の組み合わせは、本明細書中で特に指摘したり、明らかに文脈と矛盾したりしない限り、本発明に含まれる。

【0164】

本発明の代替の実施形態、要素、またはステップのグループ化は、制限として解釈されるべきではない。各グループのメンバーは、個別に、または本明細書に開示される他のグループのメンバーとの任意の組み合わせで参照および主張され得る。グループの１つ以上のメンバーは、利便性および／または特許性の理由から、グループに含まれるか、グループから削除されることが予想される。そのような包含または削除が発生すると、本明細書は、変更されたグループを含むと見なされ、したがって、添付の請求項で使用されるすべてのマーカッシュグループの記述を満たすものとみなされる。

【0165】

特に明記しない限り、本明細書および特許請求の範囲で使用される特性、品目、数量、パラメータ、特性、用語などを表すすべての数字は、すべての場合に「約」という用語によって変更されるものとして理解されるべきである。本明細書で使用される場合、「約」という用語は、そのように修飾された特性、アイテム、数量、パラメータ、プロパティ、または用語が、記載された特性、アイテム、数量、パラメータ、プロパティ、または用語の値の上下１０パーセントの範囲を包含することを意味する。したがって、別段の記載がない限り、本明細書および添付の特許請求の範囲に示される数値パラメータは、変動し得る近似値である。少なくとも、そして均等論の適用をクレームの範囲に限定する試みとしてではなく、各数値表示は、少なくとも、報告された有効数字の数を考慮して、かつ、通常の丸め手法を適用することによって解釈されるべきである。本発明の広い範囲を示す数値範囲および数値は近似値であるにもかかわらず、特定の実施例に示される数値範囲および数値は、可能な限り正確に報告されている。ただし、数値の範囲または値には、それぞれのテスト測定で見られる標準偏差から必然的に生じる特定のエラーが本質的に含まれている。本明細書における数値範囲の列挙は、その範囲内に含まれるそれぞれの別個の数値を個々に参照する簡略法として役立つことを単に意図している。本明細書で別段の指示がない限り、数値範囲の各個々の値は、本明細書で個別に列挙されているかのように本明細書に組み込まれる。

【0166】

本発明の説明に関連して（特に以下の請求項に関連して）用いられる名詞および同様な指示語の使用は、本明細書中で特に指摘したり、明らかに文脈と矛盾したりしない限り、単数および複数の両方に及ぶものと解釈される。本明細書に記載されているすべての方法は、本明細書中で特に指摘したり、明らかに文脈と矛盾したりしない限り、任意の適切な順序で実行できる。本明細書中で使用するあらゆる例または例示的な言い回し（例えば、「など」）の使用は、単に本発明をよりよく明らかにすることを意図しており、他に請求される本発明の範囲を限定するものではない。明細書中のいかなる言い回しも、本発明の実施に不可欠である、請求項に記載されていない要素を示すものとは解釈されないものとする。

【0167】

本明細書に開示される特定の実施形態は、言語からなるか、または本質的に言語からなることを使用する特許請求の範囲においてさらに限定され得る。特許請求の範囲において使用される場合、出願時または補正で加えられたかにかかわらず、「からなる」という移行用語は、特許請求の範囲に記載されていない要素、ステップまたは成分を排除する。「から本質的になる」という移行用語は、特定の材料またはステップ、および基本的かつ新規の特性に実質的に影響を及ぼさず、特許請求の範囲を限定する。そのように請求された本発明の実施形態は、本明細書において本質的または明示的に説明され、有効にされる。

【0168】

本明細書において参照および識別されるすべての特許、特許公報および他の刊行物は、例えば、本発明に関連して使用され得る刊行物に記載された組成物および方法論を、説明および開示する目的で、その全体が参照により、別個におよび明示的に本明細書に組み込まれる。これらの刊行物は、単に本出願の出願日前の開示のためにのみ供される。この点に関して、発明者が先行発明に起因して、または他の何らかの理由によって、当該開示よりも先行する権利がないことを認めるものとして解釈されるべきではない。これらの文書の内容に関する日付または表現に関するすべての記述は、出願人が利用可能な情報に基づいており、これらの文書の日付または内容の正確性についての承認を構成するものではない。

【図1】