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特許7432600効率的な広視野蛍光寿命顕微鏡法を可能にする電気光学イメージング
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-02-07
(45)【発行日】2024-02-16
(54)【発明の名称】効率的な広視野蛍光寿命顕微鏡法を可能にする電気光学イメージング
(51)【国際特許分類】
G01N 21/17 20060101AFI20240208BHJP
G01N 21/64 20060101ALI20240208BHJP
G01S 7/4863 20200101ALI20240208BHJP
G01S 17/894 20200101ALI20240208BHJP
G02B 21/36 20060101ALI20240208BHJP
G02F 1/03 20060101ALN20240208BHJP
【ＦＩ】
G01N21/17 A
G01N21/64 B
G01S7/4863
G01S17/894
G02B21/36
G02F1/03 505
【請求項の数】
13
(21)【出願番号】P 2021527850
(86)(22)【出願日】2019-11-21
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-02-07
(86)【国際出願番号】 US2019062640
(87)【国際公開番号】W WO2020106972
(87)【国際公開日】2020-05-28
【審査請求日】2022-07-28
(31)【優先権主張番号】62/770,533
(32)【優先日】2018-11-21
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】503115205
【氏名又は名称】ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー
(74)【代理人】
【識別番号】110001379
【氏名又は名称】弁理士法人大島特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ボウマン、アダム
(72)【発明者】
【氏名】カセヴィッチ、マーク・エー
(72)【発明者】
【氏名】クロッパー、ブラノン
【審査官】小野寺 麻美子
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１７－５２３４３８（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１３－５１８２８４（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１１／１３６３８２（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２０１７－５１７７４８（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｇ０１Ｎ ２１／００ － Ｇ０１Ｎ ２１／７４
Ｇ０１Ｓ ７／００ － Ｇ０１Ｓ １７／９５
Ｇ０２Ｂ １９／００ － Ｇ０２Ｂ ２１／３６
Ｇ０２Ｆ １／００ － Ｇ０２Ｆ ７／００
Ｇ０１Ｊ １／００ － Ｇ０１Ｊ １１／００
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
時間分解光学イメージングを提供する装置であって、広視野光強度変調器と、
１以上の２次元検出器アレイと、
前記広視野光強度変調器を介して前記１以上の２次元検出器アレイに入射する入射光を結像するように構成された撮像光学系であって、シーンを観測するように構成された、該撮像光学系と、
前記広視野光強度変調器に印加された入力変調に対する、前記１以上の２次元検出器アレイからの信号を解析することにより、前記入射光の１以上の波形形状パラメータを自動的に決定するように構成されたプロセッサと、を含み、
前記入射光が、観測される前記シーンに対して行われた励起に対する光学的応答を含み、
前記光学的応答は、蛍光応答を含み、
前記１以上の波形形状パラメータは、励起後の蛍光減衰の指数関数的減衰定数を含み、
前記広視野光強度変調器の時間的な帯域幅が、前記１以上の２次元検出器アレイの時間的なピクセル帯域幅よりも広く、前記入射光の前記１以上の波形形状パラメータが、前記１以上の２次元検出器アレイのピクセルごとに決定される装置。
【請求項2】
請求項１に記載の装置であって、前記広視野光強度変調器が、偏光変調を強度変調に変換するために、第１の偏光子と第２の偏光子との間に配置された広視野光偏光変調器を含む装置。
【請求項3】
請求項１に記載の装置であって、前記広視野光強度変調器が、入力偏光子と、広視野光偏光変調器と、偏光ビームスプリッタとを含み、
前記偏光ビームスプリッタが、前記２次元検出器アレイの第１の検出器に第１の出力を提供し、かつ前記２次元検出器アレイの第２の検出器に第２の出力を提供することにより、
偏光変調が、前記第１の出力及び前記第２の出力の強度変調に変換される装置。
【請求項4】
請求項３に記載の装置であって、前記入力変調が、ステップ関数であり、
前記指数関数的減衰定数が、前記２次元検出器アレイの前記第１の検出器及び第２の検出器の、それぞれ対応するピクセルからの単一フレーム信号を解析することにより決定される装置。
【請求項5】
時間分解光学イメージングを提供する装置であって、広視野光強度変調器と、
１以上の２次元検出器アレイと、
前記広視野光強度変調器を介して前記１以上の２次元検出器アレイに入射する入射光を結像するように構成された撮像光学系と、
前記広視野光強度変調器に印加された入力変調に対する、前記１以上の２次元検出器アレイからの信号を解析することにより、前記入射光の１以上の波形形状パラメータを自動的に決定するように構成されたプロセッサと、を含み、
前記広視野光強度変調器の時間的な帯域幅が、前記１以上の２次元検出器アレイの時間的なピクセル帯域幅よりも広く、前記入射光の前記１以上の波形形状パラメータが、前記１以上の２次元検出器アレイのピクセルごとに決定され、
前記広視野光強度変調器が、
第１の出力及び第２の出力を有する入力偏光ビームスプリッタと、
前記第１の出力及び前記第２の出力を並行して受信し、かつそれぞれに対応する第１のＰＭ出力及び第２のＰＭ出力を出力するように構成された広視野光偏光変調器（ＰＭ）と、
前記第１のＰＭ出力を受信し、かつ第３の出力及び第４の出力を出力するように構成された第１の出力偏光ビームスプリッタと、
前記第２のＰＭ出力を受信し、かつ第５の出力及び第６の出力を出力するように構成された第２の出力偏光ビームスプリッタと、を含み、
前記第３の出力は、前記２次元検出器アレイの第１の検出器に出力され、
前記第４の出力は、前記２次元検出器アレイの第２の検出器に出力され、
前記第５の出力は、前記２次元検出器アレイの第３の検出器に出力され、
前記第６の出力は、前記２次元検出器アレイの第４の検出器に出力される装置。
【請求項6】
請求項１に記載の装置であって、前記入力変調が、前記シーンに対して光励起が行われた後に自動的に調節可能な遅延時間ｔｄを有するパルスであり、
前記１以上の波形形状パラメータが、前記遅延時間に対する前記２次元検出器アレイの前記信号のデータポイントを含む装置。
【請求項7】
請求項１に記載の装置であって、前記入力変調が、ステップ関数、サンプリングパルス、及びロックイン検出のための周期的な変調からなる群から選択される装置。
【請求項8】
請求項１に記載の装置であって、前記広視野光強度変調器が、光の伝搬方向及び電界の印加方向が一致する縦型ポッケルスセルを含む装置。
【請求項9】
時間分解光学イメージングを提供する装置であって、広視野光強度変調器と、
１以上の２次元検出器アレイと、
前記広視野光強度変調器を介して前記１以上の２次元検出器アレイに入射する入射光を結像するように構成された撮像光学系と、
前記広視野光強度変調器に印加された入力変調に対する、前記１以上の２次元検出器アレイからの信号を解析することにより、前記入射光の１以上の波形形状パラメータを自動的に決定するように構成されたプロセッサと、を含み、
前記広視野光強度変調器の時間的な帯域幅が、前記１以上の２次元検出器アレイの時間的なピクセル帯域幅よりも広く、前記入射光の前記１以上の波形形状パラメータが、前記１以上の２次元検出器アレイのピクセルごとに決定され、
前記撮像光学系が、或る共振器往復時間を有するマルチパス光共振器を含み、
前記マルチパス光共振器が、前記共振器往復時間の倍数に対応した光学的時間分解能を提供するように構成された装置。
【請求項10】
請求項１に記載の装置であって、前記入射光が、前記シーンに対する周期的な励起に応答する周期的な信号であり、
前記広視野光強度変調器が、前記周期的な信号に対して同期的に共振駆動される装置。
【請求項11】
請求項１に記載の装置であって、前記広視野光強度変調器が、互いに同一または互いに異なる入力変調信号を有する２以上の光変調器を含む装置。
【請求項12】
請求項１に記載の装置であって、前記光学的応答が、非線形応答である装置。
【請求項13】
請求項１に記載の装置であって、前記広視野光強度変調器が、前記励起後に制御可能な遅延を有する変調信号で駆動される装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、光イメージングにおける時間分解能の向上に関する。
【背景技術】
【0002】
光イメージング測定において、時間分解能の向上がよく望まれている。例えば、蛍光分光法では、蛍光寿命から有用な情報が得られる。しかし、一般的な蛍光寿命はナノ秒のオーダーであり、これは、一般的なイメージング検出器アレイでは短すぎて検出することができない。この問題に対する従来のアプローチは、入射光の時間依存性を追うために、高速の単素子検出器を利用した、時間を要する走査手法が必要となる傾向にあった。このように、蛍光分光法は、入射光の時間依存性に関する情報が必要となるため、従来の撮像法のような、単にシーンに対して高速でシャッタを切るだけの技術とは一線を画している。したがって、光イメージング測定における時間分解能の向上を提供することは、当技術分野における前進となるであろう。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0003】
本願発明者らは、広視野光強度変調器（wide field optical intensity modulator）が一般的な光検出器アレイよりも広い帯域幅を有することが可能であり、これにより、広視野光強度変調器を光イメージングにおける時間分解能の向上に利用できることを発見した。好ましい実施形態では、変調器の構成は、高い光子収集効率を有し（損失が微小な寄生損失によるもののみであり）、かつ一般的な安価なカメラセンサに対して互換性を有する。変調器がこれらの長所を兼ね備えていることにより、該変調器は、特に、一般的に信号が弱く、かつ高い光子スループット（photon throughput）及び高速取得が望まれる蛍光寿命イメージング（ＦＬＩＭ）に対して好適である。しかし、以下に詳述するように、他の多くの用途に応用することもできる。
【図面の簡単な説明】
【0004】
【発明を実施するための形態】
【0005】
この詳細な説明のセクションＡでは、本発明の実施形態に関する一般原則を説明する。セクションＢでは、ポッケルスセル変調器を用いた蛍光寿命イメージング（ＦＬＩＭ）に関する詳細な例を説明する。セクションＣでは、いくつかの追加の変形例、実施形態、及び応用例について説明する。概して、本発明の実施形態は、セクションＢに例示されるＦＬＩＭへの応用に限定されるものではなく、またセクションＢに例示されるポッケルスセルの使用に限定されるものでもない。
【0006】
（Ａ）一般原則
【0007】
上述したように、本発明は、カメラよりも高速な広視野光変調器を用いることにより、時間変化型の波形パラメータの分解能をピクセル単位で向上させることを目的とする。
【0008】
より詳細には、本発明の一実施形態は、時間分解光学イメージングを提供するための装置に関する。この装置は、広視野光強度変調器（例えば、図１Ａの１０２、１０４、１０６、１０８の組み合わせ）と、１以上の２次元検出器アレイ（例えば、図１Ａの１４２、１４４、１４６、１４８）と、広視野光強度変調器を介して２次元検出器アレイに入射光を結像するように構成された撮像光学系（例えば、図１Ａの１１８、１２０）とを含む。広視野光強度変調器の時間的な帯域幅（temporal bandwidth）は、１以上の２次元検出器アレイの時間的なピクセル帯域幅（temporal pixel bandwidth）よりも広い。この装置は、広視野光強度変調器に印加された入力変調に対する、１以上の２次元検出器アレイからの信号を解析することにより、入射光の１以上の波形形状パラメータを自動的に決定するように構成されたプロセッサ（例えば図１Ａの１３０）をさらに含む。
【0009】
ここで、入射光の１以上の波形形状パラメータは、１以上の２次元検出器アレイのピクセルごとに決定される。この「波形形状パラメータ」は、（１）例えば、受信パルスの指数関数的減衰定数などのカーブフィッティングパラメータ、（２）受信パルスの波形形状の、離散的にサンプリングされた推定値を提供するデータポイント、及び、（３）例えば、結像されているシーンに対して行われる周期的な励起に関する位相シフト及び振幅変調などの、周期的な受信信号のパラメータ、の３つの可能性を含むものとして定義されている。遅延時間は波形形状を変化させるものではないため、波形形状パラメータには含まれない。これは、別の見方をすれば、（例えば、従来のＬＩＤＡＲ（ＬＩｇｈｔ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｒａｎｇｉｎｇ）で使用されるような）分離パルス波形が、定まった位相を有さないということである。
【0010】
検出器アレイとは、互いに隣接して配置された、光学検出素子の２次元のアレイを意味する。複数の検出器アレイを有する実施形態では、これらのアレイを同一基板上に配置してもよいし、または、それぞれを個別のデバイスとしてもよい。本明細書における「広視野」とは、２次元検出器アレイにマッチするのに十分な広さを有する開口を有する光変調器（光強度変調器または光偏光変調器）を意味する。換言すれば、検出器アレイの各ピクセルで受信される光は、すべて１つの広視野光変調器によって変調されている。
【0011】
好ましい実施形態では、光強度変調は、偏光光学系と組み合わせた偏光変調器により提供される。光強度変調は、様々な構成とすることができる。第１の変調器構成では、広視野光強度変調器が、偏光変調を強度変調に変換するために、第１の偏光子と第２の偏光子との間に配置された広視野光偏光変調器を含む（図８Ａの例）。
【0012】
第２の変調器構成では、広視野光強度変調器が、入力偏光子と、広視野光偏光変調器と、偏光ビームスプリッタとを含む。偏光ビームスプリッタは、２次元検出器アレイの第１の検出器に第１の出力を提供し、かつ２次元検出器アレイの第２の検出器に第２の出力を提供する。ここで、偏光変調はまた、第１の出力及び第２の出力の強度変調に変換される（図８Ｂの例）。
【0013】
第２の変調器構成の使用例としては、波形形状パラメータが指数関数的減衰時間を含み、かつ入力変調がステップ関数である場合が挙げられる。ここで、指数関数的減衰時間は、２次元検出器アレイの第１の検出器及び第２の検出器の、それぞれ対応するピクセルからの単一フレーム信号を解析することによって決定することができる。
【0014】
第３の変調器構成は図１Ａに示されており、セクションＢで詳細に説明する。ここでは、広視野光強度変調器は、
（ａ）第１の出力及び第２の出力を有する入力偏光ビームスプリッタ（例えば、図１Ａの１０２）と、
（ｂ）第１の出力及び第２の出力を並行して受信し、かつそれぞれに対応する第１のＰＭ出力及び第２のＰＭ出力を出力するように構成された広視野光偏光変調器（ＰＭ）（例えば、図１Ａの１０４）と、
（ｃ）第１のＰＭ出力を受信し、かつ第３の出力及び第４の出力（例えば、図１Ａの出力１、４）を出力するように構成された第１の出力偏光ビームスプリッタ（例えば、図１Ａの１０６）と、
（ｄ）第２のＰＭ出力を受信し、かつ第５の出力及び第６の出力（例えば、図１Ａの出力２、３）を出力するように構成された第２の出力偏光ビームスプリッタ（例えば、図１Ａの１０８）と、を含む。
（ａ）第１の出力及び第２の出力を有する入力偏光ビームスプリッタ（例えば、図１Ａの１０２）と、
（ｂ）第１の出力及び第２の出力を並行して受信し、かつそれぞれに対応する第１のＰＭ出力及び第２のＰＭ出力を出力するように構成された広視野光偏光変調器（ＰＭ）（例えば、図１Ａの１０４）と、
（ｃ）第１のＰＭ出力を受信し、かつ第３の出力及び第４の出力（例えば、図１Ａの出力１、４）を出力するように構成された第１の出力偏光ビームスプリッタ（例えば、図１Ａの１０６）と、
（ｄ）第２のＰＭ出力を受信し、かつ第５の出力及び第６の出力（例えば、図１Ａの出力２、３）を出力するように構成された第２の出力偏光ビームスプリッタ（例えば、図１Ａの１０８）と、を含む。
【0015】
ここで、第３の出力は２次元検出器アレイの第１の検出器（例えば、図１Ａの１４２）に出力され、第４の出力は２次元検出器アレイの第２の検出器（例えば、図１Ａの１４８）に出力され、第５の出力は２次元検出器アレイの第３の検出器（例えば、図１Ａの１４４）に出力され、第６の出力は２次元検出器アレイの第４の検出器（例えば、図１Ａの１４６）に出力される。
【0016】
上述した任意の変調器構成における偏光素子またはビームスプリッタは、様々な形態であってもよい。これには、偏光板、薄膜偏光子、グリッド偏光子、キューブ型ビームスプリッタ、及び偏光プリズムなどが含まれる。また、そのうちのいくつかは、複屈折ビームディスプレーサ、ロション偏光子、及びウォラストン偏光子などのインライン構成であってもよい。偏光変換系は、画像を維持しながら、一方で非偏光光を最小限の光学的損失で所定の偏光に変換するために使用される。このような偏光変換系は、特に、単一ビームのみが変調される場合における、光子効率を向上させるための第１の偏光子として適当であろう。最後の可能性として、各々がセンサの前に互いに異なる偏光子を有する検出器アレイに、空間的に互いに分離された領域が設けられてもよい。同様に、検出器アレイの各ピクセルが、それぞれ固有の偏光素子を有してもよい。偏光カメラセンサなどの一体化構成では、ビームスプリッタ出力の画像レジストレーションを行う必要はない。
【0017】
入力変調は、シーンに対して光が励起された後に自動的に調節可能な遅延時間ｔｄを有するパルスであってもよい。ここで、１以上の波形形状パラメータは、遅延時間に対する２次元検出器アレイの信号のデータポイントを含んでもよい。
【0018】
入力変調は、ステップ関数、サンプリングパルス、及びロックイン検出のための周期的な変調からなる群から選択されてもよい。
【0019】
広視野光強度変調器は、光の伝搬方向及び電界の印加方向が一致する縦型ポッケルスセルを含んでもよい。このような縦型変調器には、リン酸二重水素カリウム（ＫＤ２ＰＯ４またはＤＫＤＰ）またはリン酸二水素カリウム（ＫＤＰ）の結晶が用いられる。この縦型変調器構成は、横型ポッケルスセルを含む構成と比較して、より多くの用途に適する傾向がある。また、光強度変調器は、広い開口を有する標準的な横電界型ポッケルスセル構成を含んでもよい。これらの構成は、共振高電圧駆動を必要とする系、または、より大きい受光角が必要となる系にとっての理想的な構成となり得る。一般的な市販の横型変調器では、２つの結晶を、一方が他方に対して９０度をなすように回転させることにより、または、１／２波長板を用いて互いに分離することにより、軸外の複屈折効果を打ち消すようになされている。これにより、撮像性能が向上するばかりでなく、熱安定性も向上する。このような二結晶型変調器（dual modulator）としては、１０ｍｍ以上の開口を有する、例えばルビジウムチタニルリン酸塩（ＲｂＴｉＯＰＯ４）及びタンタル酸リチウム（ＬｉＴａＯ３）などの、標準的な材料を利用することができる。
【0020】
撮像光学系は、或る共振器往復時間を有するマルチパス光共振器を含んでもよい。マルチパス光共振器は、共振器往復時間の倍数に対応した光学的時間分解能を提供するように構成されている（図５Ａ～図５Ｄの例）。この場合、変調器は、マルチパス撮像系の内部にあってもよいし、外部にあってもよい。
【0021】
【0022】
ここで、変調器は、変調周波数が入射光の周波数と同じ（ホモダイン）である場合、入射光の周期信号に対して同期的に駆動される。ホモダインの場合、変調周波数は、入射光の周波数に対して位相同期される（さもなければ一定の位相関係に保たれる）。また、ヘテロダインの場合も本発明の関心の対象に含まれる。
【0023】
光強度変調器は、互いに同一または互いに異なる入力変調信号を有する２以上の光変調器を含んでもよい。
【0024】
光学撮像系は、典型的にはシーンを観測するように構成されている。ここで、観測される「シーン」とは、任意の種類の撮像光学系（例えば、顕微鏡、内視鏡、及び望遠鏡など）を介して観測される１以上の対象物の任意の組み合わせを意味する。このようなシーンの励起は、様々な励起方法（例えば、光学的方法、電気的方法、及び磁気的方法など）を用いて行うことができる。本明細書において関心の対象となる主な信号は、励起に応答してシーンから放出される光放射である。多くの場合、シーンから放出される光放射は、励起に対する該シーンの非線形応答である。より詳細には、このような非線形応答は、例えば光学的蛍光の場合のように、その応答内に、励起に含まれない周波数成分を含む。同様に、光励起の場合、このような非線形応答は、その応答内に、励起に含まれない波長成分を含む。
【0025】
入射光は、励起に対するシーンの光学応答により提供されてもよい。関心の対象となる多くの場合において、シーンの光学応答は非線形応答である。また、光学応答は、照明波形（illumination waveform）と比較して、入射光の波形形状に変化をもたらすこともある。広視野光強度変調器は、励起後に制御可能な遅延を有する変調信号で駆動されてもよい。
【0026】
出力偏光ビームスプリッタを使用する場合、その出力は相補的となる。例えば、一方の出力が印加変調信号Ｇ（ｔ）に応じて変調される場合、他方の出力は１－Ｇ（ｔ）に応じて変調される。
【0027】
（Ｂ）実験の説明
【0028】
（Ｂ１）導入
【0029】
広視野ナノ秒イメージング用の既存のセンサは、時間分解能を得るために性能を犠牲にしており、低信号用途において、科学用ＣＭＯＳセンサ及び電子増倍型ＣＣＤセンサに対して太刀打ちできない。現在、種々の検出器がナノ秒の領域に到達している。マイクロチャネルプレート（ＭＣＰ）を基にしたゲート光インテンシファイア（ＧＯＩ）は、単一の画像フレームにおけるサブナノ秒のゲーティング（gating）を可能にする。また、セグメント化されたＧＯＩは、画像分割と組み合わせることにより複数のフレームを取得できる。しかし、この方法を用いてｎ個のフレームをゲーティングすると、全体の収集効率が１／ｎ未満に制限されると共に、その性能は、光電陰極の量子効率、ＭＣＰのピクセル密度、過剰ノイズ、及び横方向の電子ドリフトにより一層制限される。ストリークカメラ技術による広視野イメージングも実証されているが、このストリークカメラ技術では、光電陰極を変換するステップ及び追加の高損失エンコーディングがさらに必要となる。単一光子アバランシェ検出器（ＳＰＡＤ）アレイは、新規のソリッドステート・アプローチであるが、現在のところ、充填率が低く、かつ暗電流が大きいという制限がある。
【0030】
今日のナノ秒イメージング技術の制限は、特に蛍光寿命イメージング顕微鏡法（ＦＬＩＭ）において顕著である。蛍光寿命は、蛍光体の局所環境の高感度なプローブであって、ｐＨ、極性、イオン濃度、フェルスター共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、及び粘性などのファクタをレポートするために使用できる。蛍光寿命イメージングは、励起強度ノイズ、標識密度、及びサンプルの光退色から影響を受けないため、多数の用途にとって魅力的な手法である。ＦＬＩＭには、通常、時間相関単一光子計数（ＴＣ－ＳＰＣ）検出器が組み合わされた共焦点走査が使用される。ＴＣ－ＳＰＣのスループットは、検出器の最大計数レート（通常１～１００ＭＨｚ）により制限されており、また、共焦点顕微鏡法には高い励起強度が必要となるため、生体サンプルに非線形的な光損傷を与えてしまう虞がある。周波数領域を利用した広視野法は有望な代替手段であるが、現在のところ、ＧＯＩまたは高ノイズで変調されたカメラチップを用いた復調が必要となる。既存の広視野法及びＴＣ－ＳＰＣ法における欠点を考慮すれば、ＦＬＩＭには、その実用性をバイオイメージングへと拡張するために、新規の効率的なイメージング手法の開発が一層求められている。
【0031】
ここで、標準的なカメラに対して互換性を有する超高速イメージング技術を説明する。この超高速イメージング技術は、固有の損失やデッドタイムがなく、これにより、サブフレームレートのサンプルダイナミクスに、ナノ秒の蛍光寿命と同程度の速さのタイムスケールでアクセスすることが可能となる。まず、偏光ビームスプリッタ（ＰＢＳ）及びポッケルスセル（ＰＣ）を基にした全光子広視野イメージング系を説明する。これは、２つの時間ビンを作成するために、または、ナノ秒からミリ秒までの任意のタイムスケールで像を変調するために使用される。これを用いて、多重標識サンプル（multi-labeled sample）、単一分子、及び生物学的ベンチマークにおける効率的な広視野ＦＬＩＭを説明する。次に、ポッケルスセル・ゲートと組み合わせた場合にｎ個のフレームの超高速イメージングを可能にする時空間変換器としての再結像光共振器の使用法について説明する。
【0032】
（Ｂ２）結果
【0033】
（Ｂ２ａ）２つの時間ビンを用いたゲーティング
【0034】
図１Ａ及び図１Ｂは、ポッケルスセルを有する効率的な超高速広視野イメージングを示す図である。図１Ａは、単一ピクセルの蛍光減衰用の、２つの時間ビンを有する広視野イメージングの模式図を示す図である。まず、ＰＢＳ１０２によって蛍光発光が偏光された後、ＰＣ１０４によって時間依存性リターダンス（図示のステップ関数）が適用され、さらにその後、ＰＢＳ１０６及びＰＢＳ１０８により、センサの前方で各偏光が再び分光される。２組の出力は、それぞれ、図示のステップ関数ゲートが適用される前の積分強度（出力１、３）及び適用された後の積分強度（出力２、４）に対応する。出力１、２、３、４は、それぞれ対応する検出器アレイ（またはカメラ）１４２、１４４、１４６、１４８によって受信される。ここで、挿入図１１０に、関連する、強度の時間依存性が示されている。この図において、１１２は励起であり、１１４は蛍光であり、１１６は変調器信号である。撮像光学系は、符号１１８、１２０で模式的に示されている。上述したプロセッサは、符号１３０で示されている。利便性の理由から、撮像光学系及びプロセッサは、概して存在はしているものの、以降の図では示されていない。また、この撮像光学系における他の部分とプロセッサ１３０との間の接続も示されていない。本発明の実施は、この撮像光学系に決定的に依存するものではなく、任意の既知の撮像構成（例えば、顕微鏡、望遠鏡、及び内視鏡など）が採用されてもよい。実際には、等しい光路長が使用され、また、これらの光路には、例えば、ビームエキスパンダ、ミラー、及びリレー光学系などの標準的な撮像光学系が組み込まれてもよい。図１Ｂは、３０ｍｍのＫＤ＊Ｐポッケルスセルのゲート効率（Ｉπ－Ｉ０）を、コノスコープ干渉パターンからの入射角の関数として算出したものを示す。これにより、広視野イメージングにおける高いゲート効率は、半受光角が６ｍｒａｄ以下の範囲で得られることが分かる。
【0035】
図１Ａに示すように、撮像系からの光はビームスプリッタにより偏光され、また各偏光に対応する像は、それぞれ、広開口ＰＣにおける互いに異なる位置を伝搬するように調整される。ＰＣは、入力光の偏光構成要素間に電界依存のリターダンスを与え、これにより、印加電界の時間的な特徴がイメージングビームの偏光状態にマッピングされる。ＰＣの後に配置された第２のＰＢＳは、分光されたイメージングビームを再び分光し、これにより、カメラに４つの画像フレームが与えられる。結果として得られる画像は、図１Ａに示すように時間的な情報を含むこととなる。この方法を説明するために、短い（～ｎｓ）励起パルスに対応する遅延時間ｔｄをもって印加される、ステップ関数型電圧パルスを考える。ｔｄをエッジとするステップ関数は、ｔｄ経過前及び経過後の積分信号にそれぞれ対応する一対の出力画像を与える。ゲート前及びゲート後のいずれにおいても、全光子は１回のカメラ露光で収集され得る。
【0036】
実際には、この構成は、後述の例に示すように、ｔｄのガウス型ゲーティングパルス、または、数ナノ秒の立ち上がり時間を有するステップゲートを用いて実現される。実際、特定の用途のために、ＰＣに任意のＶ（ｔ）が印加されてもよい（ディスカッションのセクションを参照）。ゲーティングパルスは、１ショット測定として適用されてもよいし、または、１つのカメラフレーム内に統合された繰り返しイベントにわたって適用されてもよいことに留意されたい。蛍光寿命は、蛍光減衰を直接測定するためのゲートの遅延時間ｔｄを変化させることによって（後述の多重標識ＦＬＩＭのセクションを参照）、または、単一フレームにおけるゲートチャネル強度と非ゲートチャネル強度との比を用いることによって（後述の単一分子ＦＬＩＭのセクションを参照）、回復させることができる。ＰＣの開口が制限されている場合には、１つのＰＣ結晶における互いに異なる領域を使用する代わりに、互いに異なる２つのＰＣ結晶を使用してもよい。例えば、図８Ｃに示すように、各ＰＣに別々のゲートを適用することにより、４個の時間ビンを作成できる。
【0037】
（Ｂ２ｂ）ポッケルスセルを介する結像
【0038】
この手法における重要な側面は、ポッケルスセルが広視野イメージングに理想的に適している可能性があることを認識したという点である。何十年もの間、ポッケルスセルは、パルスピッキング、Ｑスイッチ、及び位相変調等の用途において広く使用されてきた。しかし、現在使用されている最も一般的なポッケルスセルの構成は、広視野イメージングには適していない。具体的には、ポッケルスセルは、横型変調器の場合には開口が狭く、また縦型変調器の場合には数ｍｒａｄの狭い受光角を有するのが一般的である。これにより、イメージング用途において、視野または開口数が大きく制限されている。
【0039】
例えば、一般的なＰＣには、厚い（３０～５０ｍｍの）縦方向電界型リン酸二重水素カリウム（ＫＤ＊Ｐ）結晶が使用されることが多い。この結晶は高い消光比をもたらし、Ｑスイッチ及び位相変調の用途において広く使用されている。軸外光線（off-axis rays）は、軸上光線と異なる複屈折位相シフトを受け、これにより、広視野イメージング用結晶の開口数（ＮＡ）を制限している。像面では、ＰＣの半受光角αによって、低角度において集光光学系のＮＡがＭαに制限される。ここで、Ｍは倍率である。また、回折面（または無限補正空間）では、代わりに視野（ＦＯＶ）が２ｔａｎ（α）ｆｏｂｊに制限される。ここで、ｆｏｂｊはイメージング対物レンズの焦点距離である。例えば、１．４のＮＡを有する顕微鏡用対物レンズ（ｆｏｂｊ＝１．８ｍｍ）及び４０ｍｍの厚さを有するＫＤ＊Ｐ製縦型ＰＣ結晶を無限遠空間上（α～４ｍｒａｄ）に配置した場合、ＦＯＶは１０μｍとなる。ＰＣの開口が限界に達するまでビームを拡大することにより、ＦＯＶをさらに向上できる。従来のＫＤ＊Ｐ製ＰＣは、圧電共振によって長パルスの繰り返し率が数十ｋＨｚに制限されている。最終的な繰り返し率は、高電圧パルスの形状及び結晶の寸法に依存することに留意されたい。電気光学パルスピッカは、低ピエゾ材料を用いることにより、数百ｋＨｚのレートばかりか、数ＭＨｚのレートまで動作可能となる。さらに、周期的な駆動は、圧電共振の励起を回避し、かつ高励起速度で周波数領域ＦＬＩＭに対して互換性を有している。
【0040】
ゲート効率を評価するために、結晶の屈折率楕円体及びミューラー行列を用いて軸外複屈折の影響をシミュレートすることにより、交差偏光板を通して観測した場合のコノスコープ干渉パターン（アイソジャイヤ）を求めた。ゲート効率（Ｉπ－Ｉ０）は、半波電圧（Ｖπ）における送達強度パターンＩπから、ゼロ電圧（Ｖ０）における送達強度パターンＩ０を減ずることによって得られる。これによれば、ＰＣにおける有用なＮＡは、ゲート効率が高い低角度の領域で得られる（図１Ｂ）。ＰＣは、結晶軸の座標変換によって決定される軸外リターダンスを有する、線形均一リターダとして扱われる。この解析は、広視野イメージング用の標準的なポッケルスセルにおける理想的な構成を特定するために行った。縦型結晶では、結晶を薄くすることにより受光角を向上させることが可能であり、３ｍｍの厚さを有する結晶ではαが約２０ｍｒａｄに増加する。これにより、顕微鏡法におけるＮＡ及びＦＯＶの制限を効果的に取り除くことができる。本明細書には、４０ｍｍの厚さを有する市販のＰＣを使用した結果（図２Ａ～図２Ｃ及び図３Ａ～図３Ｃ）、及び、３ｍｍの厚さを有する自作のＫＤ＊Ｐ製ＰＣを使用した結果（図４Ａ～図４Ｃ）を示している。さらに、負の（ｎｅ＜ｎｏの）一軸性を有するＫＤ＊Ｐ結晶と、正の（ｎｅ＞ｎｏの）一軸性を有する静的補償結晶（static compensating crystal）（例えば、ＭｇＦ２またはＹＶＯ４）とを組み合わせることによって、軸外複屈折の完全なゼロフィールド・キャンセル（zero-field cancellation）を得ることができる。このような結晶は、Ｖ０での軸外光線を完全に補償し、ＶπでのＮＡを一層向上させる（ＫＤ＊Ｐは、印加電界により二軸になり、これにより、高電圧の完全な補償が妨げられる）。この方法は、結晶内の多数の経路においてＰＣが軸外に維持されるマルチパス光共振器内のゲートとして使用される薄型ＫＤ＊Ｐ結晶に対して特に有用である。本願発明者らは、業界標準の、二結晶補償型かつ横方向電界型の設計を用いることにより、ポッケルスセルの受光角をさらに拡大できる可能性があることを見出した。
【0041】
ここで、軸外複屈折及び熱的影響は、２つの横型電気光学変調器において、一方を他方に対して９０度回転して配置することにより、または、両変調器間に１／２波長板を配置することにより、取り除くことができる。この構成では、電界の印加方向を切り替えながら、その一方で常光線と異常光線とを効果的に交換しており、これにより軸外複屈折効果及び熱複屈折効果が打ち消されている。このような二結晶型変調器では、大きな受光角が得られることが知られている。実際、電気光学結晶の光学軸とその伝搬軸とが直交する変調器ユニットでは、撮像用途における理論的に完璧な軸外キャンセルが起こり得る。一般的な二結晶型変調器は開口が非常に小さいが、ルビジウムチタニルリン酸塩及びタンタル酸リチウム等の材料を使用した変調器では、１０ｍｍよりも大きな開口を有するものが市販されている。このような変調器では、それに比例して高いスイッチング電圧が必要である。
【0042】
薄型ＤＫＤＰ結晶変調器はあまり一般的ではないが、例えば、インジウムスズ酸化物または他の透明導電性コーティング剤でコーティングされたガラス、透明導電性薄膜、ワイヤメッシュ、または光学マイクロメッシュなどの、適切な導電性及び光透過性を有する電極を含む薄型結晶基板と組み合わせて構成されてもよい。
【0043】
ポッケルスセルを駆動する電子機器には、例えば、アバランシェ・トランジスタ、ＭＯＳＦＥＴ積重体、ハーフブリッジ構成またはフルブリッジ構成の高電圧ＭＯＳＦＥＴ、ドリフトステップ回復ダイオード、フライバック変圧器または共振変圧器、パルス形成ネットワーク、あるいは、非線形伝送線または可飽和伝送線（saturable transmission lines）等の、任意の高電圧波形生成器または増幅器が含まれる。共振構成の場合、ＲＦドライブは、ポッケルスセルを含む共振タンク回路に対して、電気素子としてインピーダンス整合されてもよい。このような回路には、例えば、標準的なＬＲＣ回路素子、インピーダンス整合ネットワーク、あるいは、共振伝送線または共振変圧器等が含まれる。冷却装置が、誘電加熱及び／または抵抗加熱を抑制するために設けられてもよい。誘電体液が、高電圧絶縁破壊を防止するために、屈折率を一致するために、または結晶を冷却するために使用されてもよい。
【0044】
（Ｂ２ｃ）多重標識ＦＬＩＭ
【0045】
図２Ａ～図２Ｃは、多重標識ＦＬＩＭに関する。図２Ａは、オレンジ（Ｏ、４．９ｎｓ）、赤（Ｒ、３．４ｎｓ）、ナイルレッド（ＮＲ、～３．１ｎｓ）、赤外（ＩＲ、２．３ｎｓ）、及びヨウ化プロピジウム（ＰＩ、１４ｎｓ）の各ビーズについて、ゲート遅延時間ｔｄを掃引することにより得られた蛍光減衰の直接測定結果を示している。減衰定数τは、フィッティングして示している。ガウス型の装置応答関数（ＩＲＦ）の測定値もまたプロットされている。図２Ｂは、オレンジビーズ、ナイルレッドビーズ、及び赤外ビーズで三重標識された広視野サンプルの強度を示す画像である（標識同士は空間的に強く重なり合っている）。図２Ｃは、各標識の空間分布を示す蛍光寿命画像である。蛍光寿命は、各ピクセルにおける減衰トレース（decay traces）をフィッティングすることにより測定されている（スケールバーは１０μｍ）。
【0046】
２つのビンを用いる方法は、固有のゲート損失を有さないことから、あらゆるセンサにおけるイメージングを可能にする。したがって、蛍光寿命イメージングは、蛍光励起後、遅延時間ｔｄが経過した後にＰＣゲーティングパルスが印加される本発明の技法において、理想的な実証法である。蛍光寿命は、その後、複数のフレームにわたって遅延時間ｔｄを変化させる方法（このセクションの方法）、または、単一フレームにおけるゲート強度（gated intensity）と非ゲート強度（ungated intensity）との比を測定する方法（次のセクションを参照）のうちのいずれかの方法を用いて測定される。図２Ａ～図２Ｃは、３．１ｎｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの２μｍナイルレッドビーズ）、４．９ｎｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの０．１μｍオレンジビーズ、背景）、及び２．３ｎｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの０．１μｍ赤外ビーズ（結晶を形成））と個別に測定された、互いに異なる蛍光寿命を有する３つの標識を合成した画像である。このデータでは、ＰＣを像面に配置することにより、０．１のＮＡ及び２０倍の倍率で、１００μｍのＦＯＶを有する明るいサンプルに対する広視野ＦＬＩＭが可能となった。サンプルは、５ｋＨｚの繰り返し率を有する５３２ｎｍのレーザパルスを用いて、１ｎｓの持続時間で励起した。蛍光信号は、減衰関数と、約２．４σｅのＦＷＨＭパルス幅を有する、該レーザのガウス型励起パルスとの畳み込みによって得られた。本実験では、図２Ａ～図２Ｃで使用した市販のＰＣを用いて、幅２．６ｎｓのガウス型ゲート関数ｇ（ｔ－ｔｄ）を適用した。遅延時間ｔｄを掃引することにより、蛍光とゲート関数との畳み込み、すなわちｆ（ｔ，τ，σｅ）×ｇ（ｔ－ｔｄ）を求めた。蛍光寿命などの時間的情報は、求めた畳み込みを直接フィッティングすることにより算出できる。この場合における励起とゲート関数との畳み込みは、図２Ａで直接測定された、ガウス型の機器応答関数（ＩＲＦ）（σＩＲＦ＝σｅ
２＋σｇ
２）を与えることに留意されたい。このフィッティング手法は、蛍光減衰をより多くのタイムポイントでサンプリングするため、２つのビンを用いた測定と比較して、明るい標識サンプルに対して有利になり得る。これは、例えば、多重指数関数的減衰をより効果的に測定するために使用できる。
【0047】
（Ｂ２ｄ）単一分子の広視野ＦＬＩＭ
【0048】
図３Ａ～図３Ｃは、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５３２分子の広視野ＦＬＩＭに関する図である。図３Ａは、ゲートチャネルの強度を示す。図３Ｂは、非ゲートチャネルの強度を示す（スケールバーは１μｍ）。図３Ｃは、番号付けされた各回折限界領域の全輝度に対して蛍光寿命の測定値をプロットし、ＳＥエラーバーと共に示した図である。これらのスポットのうちの大部分は、その光退色及びブリンキング挙動から単一分子のエミッタであることが分かる。
【0049】
効率的な光子収集に依存するか、または、高速な取得速度を必要とする、信号が制限された用途の場合、蛍光寿命は、単一フレームにおけるゲート強度と非ゲート強度との比によって、最も良く決定される。図３Ａ～図３Ｃは、ガラス上のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５３２分子の１０×１０μｍの領域に対して広視野蛍光寿命顕微鏡法を行ったものを示す図である。この蛍光寿命の測定値は、２．５ｎｓのアンサンブル寿命を有する点、及び、ガラス上で行われた同様の研究で観測された大きな分子変動（molecular variation）を有する点の両方について一致している。このＰＣは、同じガウス型ゲート関数をｔｄ＝１．６ｎｓにおいて１５ｋＨｚの繰り返し率で適用するために、顕微鏡対物レンズの無限遠空間で使用される。ゲート強度と非ゲート強度との比は、下記の数式１で与えられる。
【0050】
【数1】
【0051】
蛍光寿命を計算するために、この比は、各分子の周囲の関心領域の強度を合計することにより実験的に決定される。この方法によれば、回折限界分解能、及び１分子あたり～７×１０３（露光時間は１５ｓ）という効率的な光子収集を維持しながら単一分子寿命分光法を行うことができる。図３Ｃは、番号付けされた各回折限界エミッタの全輝度及び蛍光寿命の推定値を、蛍光寿命の推定値のエラーバーと共に示した図である。この推定は、蛍光のバックグラウンド及び暗電流により制限されている。検出器には、低価格の産業用ＣＭＯＳマシンビジョンカメラ（ＦＬＩＲ）を使用した。この場合、ＰＣの受光角によってＦＯＶが１０μｍに制限されるものの、１．４ＮＡでの光子収集は未だ可能である。広視野での単一分子寿命分光法は、共焦的アプローチでは依然困難なままであるが、ここではＰＣゲーティングと安価でノイズの多いカメラとを用いることにより、広視野での単一分子寿命分光法が容易に実現されている。
【0052】
（Ｂ２ｅ）薄型ＰＣを用いる高速ＦＬＩＭ
【0053】
図４Ａ～図４Ｃは、薄型ＰＣを用いる高速ＦＬＩＭに関する。図４Ａは、標準的なＦＬＩＭ用ベンチマークである、アクリジンオレンジで染色したＣｏｎｖａｌｌａｒｉａ ｍａｊａｌｉｓ ｒｈｉｚｏｍｅの強度を示す画像である（スケールバーは１００μｍ）。図４Ｂは、１００ｍｓの露光（５０μＷの励起）のタイミングトレースをフィッティングすることにより得られた蛍光寿命を示す画像である。図４Ｃは、１００ｍｓの単一フレームの取得から得られた蛍光寿命を示す画像である。挿入図（図４Ｃの右下）は、同じ単一フレームにおいて、高励起強度（３ｍＷ）で２ｍｓの露光を行った場合の画像である（光化学反応による影響であるのか、このサンプルでは、高励起強度で寿命が著しく減少した）。これらの蛍光寿命を示す画像は、サンプルの構造を示すために強度マスクを含む。
【0054】
これらの技術は、薄型ＰＣ結晶を使用することにより、超広視野へと拡張することができる。２０ｍｍの開口を有する３ｍｍ厚のＫＤ＊Ｐポッケルスセルは、０．８ＮＡの対物レンズを有する標準的な倒立顕微鏡における略全ての出力をゲートする。４．５ｎｓの立ち上がりエッジを有するパルスを、５ｋＨｚの繰り返し率で使用することにより、図４Ａ～図４Ｃに示す標準的なＦＬＩＭベンチマークを撮像した。単一フレーム及びトレースフィッティング解析により、３００μｍ２のＦＯＶにおいてメガピクセル単位のＦＬＩＭイメージを高速取得できることが示されている。単一フレームにおいて１００ｍｓの露光及び２ｍｓの露光を行ったが、後者は、カメラの最大フレームレートで撮像されてもよい。これらの取得は、広視野取得におけるスループットが飛躍的に向上していることを示している。図４Ｃに示す、１００ｍｓ露光のフレームは、１度の露光により検出された、０．８メガピクセル中の４．８×１０８個の光子により形成されている。図４Ｃの挿入図（右下）は、同様に、同フレームに対して、２ｍｓの露光をより高い励起強度で行った図であり、３．１×１０８個の光子が検出されている。検出された光子の数は、既知である該カメラの応答性から推定した。上述の取得では、ＴＣ－ＳＰＣの２ＭＨｚの光子計数レート（パイルアップによるエラーを避けるための標準）と比較して、光子スループットがそれぞれ２４００倍及び７８０００倍に向上している。この取得法は、このような高スループットを有し、かつ低露光時間の可能性をも有することから、将来的には動的なサンプルに対するＦＬＩＭ研究に使用できるであろう。単一フレーム取得法は、画像における（複数回の取得または走査等によって生じる）モーションアーチファクトを回避し、かつ、自己正規化を行うことにより、１度の露光中に強度ノイズを除去することができるため、非常に有効な方法である。定量的な寿命は、前のセクションで説明したように、校正前のＩＲＦを用いることにより簡単に計算できる。
【0055】
（Ｂ２ｆ）マルチフレームイメージング用のゲート型再結像共振器
【0056】
図５Ａ～図５Ｄは、時空間変換共振器を用いたマルチフレームナノ秒イメージングに関する。図５Ａは、外部ゲート式の傾斜ミラー型４ｆ再結像共振器を示す。像の入力は、像面（ｉ）の小型インカップリング（in-coupling）ミラーＭ１に対して行われる。ミラーＭ２は回折面（ｆ）で傾斜しており、これにより、Ｍ１面における像を光路ごとに空間的にオフセットする。像は、往復する度に、部分的に透過可能なミラーＭ２を介して受動的にアウトカップリングされる（out-coupled）。ここで、５０２及び５０４は４ｆ共振器用の再結像レンズであり、５０６はＰＣ出力ゲートである。図５Ｂは、共振器からの４つの出力像について正規化した画像強度を示す図であり、この画像強度は、往復遅延が４ｎｓであることを示している。図５Ｃの共振器出力オンカメラ（ＣＭＯＳカメラ）の画像は、１往復ごとに共振器から出力される、ＰＣアナライザから出力された４枚の画像を示す（図１Ａと同様に、各列に１～４の番号を付している）。図には、４回の往復（ｉ～ｉｖ行）が示されている（スケールバーは５０μｍ）。このサンプルは、２μｍのナイルレッドビーズ（～３．１ｎｓ）をドロップキャストしたものと、拡散フィラメントを形成する０．１μｍのオレンジビーズ（４．９ｎｓ）との混合物である。図５Ｄは、ｔｄ＝５ｎｓ（（ｂ）の赤線）のゲートチャネルにおける、ｉ行４列目の出力フレーム及びｉｉ行４列目の出力フレームの比を示す。この比は、後述する単一フレームＦＬＩＭに用いられる。これら２つの標識は互いに容易に区別される（スケールバーは１０μｍ）。
【0057】
ＰＣを用いたナノ秒イメージングは、ゲート型再結像光共振器を用いることにより、時間ビンの数を２個よりも増やすことができる。ビンの数を増やすことにより、多重指数関数的減衰の推定精度が高まり、かつ寿命のダイナミックレンジが向上するばかりでなく、効率的な１ショット超高速イメージングも可能となる。ここで、傾斜型共振器ミラーと組み合わせた再結像光共振器における光学的往復遅延を利用して、共振器往復を空間的に互いに分離することにより、ナノ秒の時間分解能が実現されている。ＧＯＩを用いたｎフレームのイメージングは、その収集効率が１／ｎ以下に制限されるものの、一方で、この再結像共振器技術は、高感度の低照度（low-light）用途または単一光子用途における効率的な光子収集を可能にする。関連する研究では、共振器は、単一チャネルの軌道角運動量及び波長を時間に変換するために使用される。整合型光共振器は、マルチパス顕微鏡法などの時間折り畳み型（time-folded）光学イメージングモダリティに使用されてきた。本明細書では、広視野イメージングにおける時間分解能を得るための手段として、代わりに再結像光共振器を採用している。
【0058】
図５Ａに示すように、画像は、小型ミラーＭ１により、中央焦点面で４ｆ共振器にインカップリングされる。この４ｆ構成では、１往復ごとにエンドミラー（回折面）が再結像される。一方のエンドミラーＭ２を角度θだけ傾けると、中央焦点面におけるｎ往復後の像位置ｙｉは、ｙｉ＝ｆｓｉｎ（２ｎθ）だけ変位する。ここで、ｆは４ｆ共振器の焦点距離である。この角度θは、結果として得られる像がインカップリングミラーによって遮られないように設定される。順次変位される各画像は、更なる往復によって順番に遅延されている。時間的な情報を得るためには、空間的に分離された像を外部からゲートするか、または、ＰＣを用いて、空間的に分離された像を共振器から同時にアウトカップリングする必要がある。外部ゲート方式（図５Ａに模式的に示す）では、光は、往復する度に、透過ミラーを介して受動的にアウトカップリングされる。空間的に変位された各像は、対応する往復回数ｎに基づく相対遅延時間Δｔ＝８ｆｎ／ｃを有する。また、外部ゲートは、時間的に別個なフレームを作成するために、全ての遅延画像に対して同時に適用される。ステップ関数ゲートＶ（ｔ）は、上述した２個のビンを有する場合と同様に、時間的に遅延したビンの比による蛍光寿命の測定を可能にする。この２ビンＰＣ方式を外部ゲートに用いた場合、各往復の出力から４つの画像フレームが得られる（図５Ｃ）。エンドミラーの反射率がｒである場合、光子効率、すなわち共振器に入力された光子数に対する検出光子数の比は、共振器内での損失を無視すれば、１－ｒｎで与えられる。この光子効率は、ｒを適切に選択することにより非常に高いものとすることができる。例えば、ｒ＝０．６かつｎ＝４の場合には、８７％の光子効率が得られる。なお、異なるフレーム間における強度変化は、ｎ往復後の部分透過により生じるものであることに留意されたい。
【0059】
図５Ｃ～図５Ｄは、傾斜ミラー型外部ゲート式共振器からの出力を示す図である。ここでは、往復時間よりも短い幅を有するガウス型ゲートパルスが使用される。図５Ｄに示す蛍光寿命は、４ｎｓの共振器往復時間ｔｒｔで１回遅延されたゲート後チャネルにおける２つのフレーム（図５Ｂの、ｉ行４列目の像及びｉｉ行４列目の像）の比Ｒを用いて、下記の数式２のように計算される。
【0060】
【数2】
【0061】
あるいは、上述した数式１のように全光子を利用するために、ゲート後フレーム及びゲート前フレームの両方を推定に含めてもよい。
【0062】
第２のゲート式共振器方式では、代わりに透過ミラーが含まれず、かつ、共振器中のポッケルスセル及び偏光ビームスプリッタによって、全入力光が同時に共振器からアウトカップリングされる。より具体的には、この構成では、ポッケルスセル５０６が、偏光子５０２と偏光子５０４との間の共振器中に配置されており、また、アウトカップリングのために、偏光ビームスプリッタ素子が、やはり偏光子５０２と偏光子５０４との間に配置されている。このような方式では、ｔｒｔ＝８ｆ／ｃの連続露光を用いてｎ個の画像が直接得られ、また共振器内には光が残らない。光は１往復ごとにＰＣを通過するため、共振器内ゲートには薄型結晶または補償ＰＣを用いるのが好適であろう。ｎ個のビンを用いた寿命測定法と２個のビンを用いた寿命測定法とを、理論的な推定精度の観点から比較することは興味深い（図６Ａ及び図６Ｂ参照）。単一指数関数的減衰の場合、全体的な推定精度が互いに略一致する一方で、ｎ個のビンを用いた方法が比較的広い時間的ダイナミックレンジを有するという利点がある。
【0063】
これらの共振器イメージング法は、フレーム間にデッドタイムが存在しないという利点があり、かつ共振器内損失以上に収集効率を制限する固有の損失を有さない。外部ゲート式共振器は、厚型ＰＣ結晶を用いて容易に実現できるものの、時間的ゲーティングが間接的になってしまう（indirect temporal gating）という欠点がある。代わりに、共振器内ゲーティングは、各往復が時間的に異なる１つの画像フレームにそれぞれ対応する、真のｎフレーム超高速イメージングを可能にする。１～１０ｎｓの往復時間は、標準的な光学系を用いて実現されてもよい。なお、ｎ個のビンを用いたイメージングにおける別のアプローチとして、同様に、複数のＰＣ及び検出器の構成（complexity）を加えた状態で、２ビンの複数のゲートを直列に（例えば図８Ｄのように）使用することもできる。
【0064】
（Ｂ２ｇ）理論上の推定精度
【0065】
図６Ａ及び図６Ｂは、寿命推定の誤差に関する図である。図６Ａは、異なる数のビンを用いた場合の、単一指数関数的蛍光減衰の寿命推定精度におけるクラメール・ラオの限界を示す。破線は、測定窓がｎ×４ｎｓである場合における、２～ｎ個のビンを用いた寿命測定を比較したものである。実線は、有限の測定窓（すなわち、理想的なステップ関数ゲート）を有さない場合における、ｔｄ＝４ｎｓで２個のビンを用いた寿命推定に対応している。なお、最大感度の範囲はｔｄに応じてシフトできることに留意されたい。水平方向に延びる一点鎖線は、下記の数式３で表されるショットノイズ限界στ／τを示す。
【0066】
【数3】
【0067】
図６Ｂは、図６Ａの実線におけるケースと同様に、１ｎｓのσｅ及び１ｎｓで１０～９０％のロジスティックな立ち上がり時間を有するＰＣゲートを含む、２個のビンを用いた現実的なＰＣ測定における寿命分解能をシミュレートしたものを示す図である。ショットノイズ限界に近い推定精度は、τがＰＣの立ち上がり時間よりも大きい場合に得ることができる。
【0068】
ｎ個のビンを用いたＴＣ－ＳＰＣにおけるクラメール・ラオの限界と比較すると、２個のビンを用いた寿命推定は驚くほど良い性能を発揮する。２個のビン及びｎ個のビンを用いた場合の推定精度は、いずれも光子計数のショットノイズに応じて変化する。図６Ａ及び図６Ｂは、ｎ個のビンを用いた測定の方が寿命感度のダイナミックレンジは広いものの、２個のビンを用いたＰＣゲートでは、ゲート遅延を適切な値に調節した場合に単一指数関数的減衰と略等しい推定精度を得ることができることを示している。ＴＣ－ＳＰＣは、ＡＤＣのビット深度から多数の時間ビンを得ることができ、これはダイナミックレンジに対して大きく影響を与える。理想的なＰＣゲーティングにより、１０年間の蛍光寿命にわたって、ＳＮＬの約１．３倍のピーク感度で、ショットノイズ限界（ＳＮＬ）の２倍以内の推定値を得ることができる。実際、１ｎｓのＰＣ立ち上がり時間を有するステップ関数ゲートでは、１～１０ｎｓの間で、ＳＮＬの２～３倍の範囲の推定値を得ることができる。
【0069】
（Ｂ２ｈ）ＰＣのゲート効率のスペクトル依存性
【0070】
図７Ａは、Ｖを５３２ｎｍに設定した場合における、ＰＣのゲート効率のスペクトル依存性を計算した結果を示す。高ゲート効率は、蛍光発光スペクトルに対して互換性を有する１００ｎｍの波長範囲で得られることが示されている。図７Ｂは、出力画像チャネルの強度をＰＣのリターダンスの関数として示した図である。図１Ａに示すケースでは、交差偏光板により、その強度がそれぞれ線７０２、７０４に従う一対の出力フレームが生じることとなる。第２のＰＢＳの前に配置されているＰＣの出力のうちの１つに１／４波長板（ＱＷＰ）が挿入されている場合、チャネルのうちの２つは、代わりに、それぞれ線７０６、７０８に従う。これは、正弦波変調を用いた場合、出力画像間に光学的な位相シフトを発生させる効果がある。また、光変調器より前、または、光変調器の直後に１／４波長板を追加した場合、フルスイッチングに必要な変調範囲をシフトさせる効果も得られ、これにより、共振正弦波駆動が０とπとの間の位相シフトを変調するために必要な振幅を半減できる。また、ＱＷＰ出力は、図７Ａに示すゲート効率が変動し難い５３２ｎｍ近傍において、高い分光感度を有することにも留意されたい。ＱＷＰ出力は、スペクトル及び寿命の多次元測定に利用できる可能性がある。
【0071】
（Ｂ３）ディスカッション
【0072】
２個のビンを用いた時間イメージング及びｎ個のビンを用いた時間イメージングを、ポッケルスセルを用いてナノ秒のタイムスケールで実施する方法について説明してきた。単一分子寿命分光法及び広視野ＦＬＩＭを用いた概念実証的実験は、該方法が、信号が制限されたアプリケーションに対してナノ秒の分解能をもたらす可能性があることが示している。本願発明者らのアプローチは、高光子効率を有し、かつ科学用カメラにおける画質及び感度を維持していることにより、広い互換性を有する上、安価に入手できる可能性もある。ゲート損失を有することなく単一フレームＦＬＩＭが可能であるという点は、他のアプローチで見られる、強度のアーチファクト及び動作の虞と、損失と、ノイズとを有さない動的ＦＬＩＭを可能にするため、特にユニークな利点である。点走査ＦＬＩＭを効率的な広視野取得法に置き換えることにより、寿命ＦＲＥＴ、単一分子顕微鏡法及び超解像顕微鏡法、マルチモーダルイメージング、及び臨床診断などの生体イメージング用途において特に有用になる可能性がある。さらに、超高速イメージング、時空間多重化（time-to-space multiplexing）、ロックインの検出、及び飛行時間法への応用も考えられる。
【0073】
ＦＬＩＭ用途では、ＰＣを用いたナノ秒イメージングにより、従来のＴＣ－ＳＰＣに対してスループットが大幅に向上している。ＰＣを用いたＦＬＩＭのスループットは、低い繰り返し率であってもＴＣ－ＳＰＣのスループットを容易に上回る。例えば、１５ｋＨｚで１光子／ピクセル／パルスという低い信号レベルでＰＣゲートされた１メガピクセルの画像を取得するには、１０％のカウントレート（パイルアップを避けるための標準）で動作する２０ＭＨｚの共焦的ＴＣ－ＳＰＣシステムの約７５００倍長い時間かかかる。このスループットの優位性は、信号及びピクセルの数に比例して大きくなる。なお、ＰＣは、ＧＯＩまたはＴＣ－ＳＰＣ検出器とは異なり、飽和することなく１光子／ピクセル／パルスをゲートできる。ＰＣを用いた高スループットの広視野寿命イメージングは、生物学的なダイナミクスを高いフレームレートでイメージングすることを可能にできる。関連する応用例としては、例えば、細胞内シグナル伝達、特にニューロンのリアルタイムイメージングなどが考えられる。ＦＬＩＭは、臨床診断またはｉｎ ｖｉｖｏ診断に対しても適用可能であり、広視野ゲーティングは内視鏡プローブにも容易に対応できる。
【0074】
ＰＣイメージングは、他の広視野技術における限界を解決する。特にゲート光インテンシファイアは、例えば、光電陰極の低量子効率、解像度の低下、相乗性雑音、及び飽和などの技術的な欠点に直面している。さらに、ゲートされていない光子（ｎ個の時間ビンでは１／ｎが収集される）の損失は、複数回の露光を用いたＦＬＩＭ取得が必要となる。近年、高いスループットを有するＦＬＩＭを実現するために周波数変調カメラが開発されたが、非常に高い暗電流及び読み取りノイズに悩まされている。ＰＣ変調は、ＭＨｚ代の励起速度を可能にする、周波数領域ＦＬＩＭの代替アプローチを提供する。
【0075】
ＰＣゲーティングは、さらに、ナノ秒の時間次元を利用することにより、新しい顕微鏡法技術をもたらす可能性がある。例えば、生物サンプルにおける多重標識を可能にするためにスペクトル情報が使用されており、これは、複雑な細胞内相互作用について理解する上で重要であることが証明されている。蛍光寿命も同様に、多重標識型信号をアンミックスするための魅力的な時間的アプローチを提供することができる。共焦点ＦＬＩＭは、既にこの問題に対して適用されている。単一分子の研究において、並列蛍光寿命測定（parallel lifetime measurements）と、空間的かつスペクトルなチャネルとを組み合わせることができれば、分子集団及び光物理学的状態を研究するための新しいタイプの高スループット分光実験が可能となる。また、寿命から得られる新たな情報は、超高解像顕微鏡法における空間的な局在性を高めるために利用することもできる。さらに、時間的ゲーティングは、短寿命で発生するバックグラウンドの自家蛍光を抑制するために利用されてもよい。
【0076】
主に蛍光顕微鏡法の用途に焦点を当ててきたが、ＰＣナノ秒イメージング技術は、高速ゲーティング、ロックイン検出、イベント選択、及びマルチパス顕微鏡などとして、量子光学分野においてさらに広く適用できることにも留意されたい。２個のビンを有するＰＣを用いた方式では、異なる変調Ｖ（ｔ）を適用することにより、他の有用な動作モードを実現することができる。プラズマ物理学、レーザ誘起破壊分光法、燃焼、飛行時間法、及び流体力学などの従来的な高速イメージング用途においても、高感度な１ショットイメージングから恩恵を受けることができる。ｎフレームの傾斜ミラー型再結像共振器は、内部のＰＣゲートを使用した場合に、フレーム間のデッドタイムなしに、弱い非反復性のイベントの超高速１ショットイメージングを行うことができる点で特にユニークである。また、この共振器は、広いダイナミックレンジを有する寿命イメージングに対しても有用である。
【0077】
以上を要約する。まず、広視野ＰＣ型ＦＬＩＭについて、単一フレームモダリティ及びタイムトレースモダリティで説明を行った。単一分子寿命分光法は、信号が制限された応用例に対して互換性を有することが示された。薄型ＰＣ結晶を使用することにより、本発明の技術が単一フレーム取得を有する超広視野ＦＬＩＭへと拡張された。ＦＬＩＭ画像は、標準的な生物学的ベンチマークを用いて取得した。このとき、露光時間は最小で２ｍｓであり、また取得速度を最小でカメラのフレームレートまで落として取得を行った。最後に、時空間多重化による超高速イメージングを可能にする、再結像共振器を用いた新規の方法を示した。これらの技術は、広視野蛍光顕微鏡法または単一分子蛍光顕微鏡法などの、信号が制限された適用分野におけるナノ秒領域への到達を担保する。さらに、これらの技術はあらゆる撮像系及びセンサに対して広く互換性を有するため、様々な分野への応用が期待できる。
【0078】
（Ｂ４）方法
【0079】
（Ｂ４ａ）実験準備
【0080】
図２Ａ～図２Ｃ、図３Ａ～図３Ｃ、及び図５Ａ～図５Ｄでは、自作の蛍光顕微鏡及び市販の厚型ＰＣ結晶を用いてＦＬＩＭを行った。単一分子顕微鏡法では、油浸対物レンズ（ニコン ＰｌａｎＡｐｏＶＣ １００ｘ １．４ＮＡ）を使用した。その他のデータはすべて、対物レンズ（Ｚｅｉｓｓ ＰｌａｎＡｐｏ ２０ｘ ０．８ＮＡ）を用いて測定した。５３２ｎｍの励起パルス（ＦＷＨＭは１ｎｓ）は、ＱスイッチングされたＮｄ：ＹＡＧを用いて５ｋＨｚ（単一分子のデータ測定時は１５ｋＨｚ）の繰り返し率により発生させた（Ｓｔａｎｄａ Ｑ１０－ＳＨ）。検出器には、マシンビジョンＣＭＯＳカメラ（ＦＬＩＲ ＢＦＳ－Ｕ３－３２Ｓ４Ｍ－Ｃ）を使用した。５０Ωの伝送線に組み込まれた、１０ｍｍの開口及び４０ｍｍの厚さを有する二結晶型の縦型ＫＤ＊Ｐ製ＰＣ（Ｌａｓｅｒｍｅｔｒｉｃｓ １０７２）を使用した。このＰＣには２つの結晶（一方が他方に対して９０度回転して配置され、かつ互いに逆の電界を有する）が使用されており、これにより、必要な半波電圧が半減されている。この設計により、同程度の厚さを有する単結晶ＰＣと同等の受光角（α～４ｍｒａｄ）が得られた。理論的には、結晶のマッチングが良ければ、この構成であっても、ある程度の軸外打消しを達成できることに留意されたい。高電圧ゲーティングパルスは、ＦＷＨＭが２．８ｎｓである１．３ｋＶの振幅（ＦＩＤ ＧｍｂＨ）を用いて５０Ωで発生され（ＦＩＤ ＧｍｂＨ）、Ｖπの８５％及び１．１ｎｓのσＩＲＦが達成された。レーザ及びＨＶパルサは、ＤＧ ５３５遅延発生器（Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｙｓｔｅｍｓ）と同期させた。タイミングジッタは、１００ｐｓ未満であった。また、蛍光減衰時におけるパルスのスプリアス反射（spurious pulse reflections）を防ぐために、長い伝送線を用いた。単一分子のデータには、ＰＣを介したＦＯＶを最大化するために、２つの出力フレーム（最初のＰＢＳからの１つの出力）のみを使用し、これにより光子効率が約５０％に制限された。これは、この技術における根本的な限界ではなく、ＰＣの開口を１つに制限することにより、実装を単純化するために行った。ＩＲＦは、すりガラスサンプルを用いて取得した。
【0081】
図４Ａ～図４Ｃに示す薄型ＰＣ結晶の説明は、倒立顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ）を用いて、対物レンズ（Ｚｅｉｓｓ ＰｌａｎＡｐｏ ２０ｘ ０．８ＮＡ）及びｓＣＭＯＳ（Ａｎｄｏｒ Ｎｅｏ５．５）を使用して行った。３ｍｍの厚さ及び２０ｍｍの開口を有する縦型ＫＤ＊Ｐ製ＰＣは、ナノ秒のスイッチングパルスを最大５ｋＶで供給できる高電圧ドライバと共に自作した。図４Ａ～図４Ｃのデータでは、０．８のゲート効率及び４．５ｎｓの立ち上がり時間を使用した。ここでは、片方の偏光チャネルのみが示されているが、第２のＰＣまたはウォラストン偏光子を追加することにより、両方のチャネルを組み込んでもよい。
【0082】
ｎ個のビンを用いた説明のために使用した４ｆ再結像共振器は、インカップリングに３ｍｍのプリズムミラー（Ｔｈｏｒｌａｂｓ ＭＲＡ０３－Ｇ０１）を使用し、このミラーのｆは１５０ｍｍ（ｔｒｔ＝８ｆ／ｃ＝４．０ｎｓ）であった。受動的なアウトカップリングは、光学濃度１（Ｒ＝０．４、Ｔ＝０．１）の中性濃度フィルターを介して行った。ＰＣ及びカメラ（ＣＭＯＳ）における像面の形成には、リレーレンズを使用した。ピックオフミラーは、互いに等しい経路長を有する２つのＰＢＳによって生成されたイメージングビームを組み合わせた。
【0083】
（Ｂ４ｂ）サンプルの準備
【0084】
Ａｌｅｘａ ５３２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）の単一分子サンプルは、疎水性基板上に希薄溶液をドロップキャストし、その後新品のカバースリップを配置及び除去することにより調製した。密なフィールド（dense field）は、単一の回折限界エミッタが観察されるポイントまで光退色された。ブリンキング現象（blink-on dynamics）と共に、階段状の光退色が観察された。回折限界のスポット内では複数分子の発光も確かに見られたものの、大部分のエミッタは単一分子であった。蛍光ビーズサンプルは、オレンジ（１００ｎｍ）、赤（１μｍ）、ナイルレッド（２μｍ）、赤外（１００ｎｍ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、及びヨウ化プロピジウム（１０μｍ）（Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ．Ｉｎｃ．）のビーズ溶液を、カバーグラスにドロップキャストすることにより作製された。赤外ビーズの溶液は、図２Ｂ及び図２Ｃに示されるように結晶を形成した。
【0085】
（Ｂ４ｃ）データ解析
【0086】
蛍光寿命は、画像強度からのレシオメトリック計算及びタイムトレースフィッティングの両方を用いて算出した。レシオメトリック計算では、数値的に生成されたルックアップテーブルを用いることにより、明細書中に示す数式及び事前に特性化されたＩＲＦに基づいて、測定値の比を蛍光寿命の推定値に変換する。図３Ａ～図３Ｃでは、特定のｔｄ及びガウス型ゲートパルスを使用しているため、１．１ｎｓ以下の蛍光寿命は、数値変換において１．１ｎｓ以上の蛍光寿命と重複している。ここでは、寿命の値が大きい方を報告する。タイミングトレースの計算では、最小二乗法によるフィッティングを用いて蛍光寿命の推定を行った。ＰＣは、直線偏光の入力に対して、下記の数式４で示される、時間的に変化するリターダンスを適用する。
【0087】
【数4】
【0088】
ここで、複屈折位相シフトδは、印加電圧Ｖ、常光線屈折率ｎｏ、及び縦電気光学係数ｒ６３により決定される。平行ビームスプリッタチャネル及び垂直ビームスプリッタチャネルでの伝送は、それぞれ、Ｔｓ＝ｓｉｎ２（δ／２）及びＴｐ＝ｃｏｓ２（δ／２）となる。蛍光寿命の計算では、ＩＲＦで観測されるポッケルスセルの不完全なゲート効率を考慮している。図２Ａ～図２Ｃ、図３Ａ～図３Ｃ、及び図５Ａ～図５Ｄでは、ＦＯＶが小さい領域全体でＩＲＦが一定であると仮定している。これにより、位置依存の蛍光寿命誤差が生じる虞がある。図４Ａ～図４Ｃでは、ＦＯＶが大きいことに起因して空間的な変化がより明らかとなっており、これは蛍光寿命の計算に含まれている。顕微鏡のフィルタースライダに配置されたビームスプリッタにより、蛍光とすりガラスによるＩＲＦ校正とを迅速に切り替えることができる。ＩＲＦ校正には、蛍光寿命が短い色素を使用してもよい。
【0089】
単一分子のゲート強度及び非ゲート強度は、バックグラウンドを減じた後、各分子の関心領域に対応するＮｐピクセルを合計することにより決定した。図３Ｃのエラーバーでは、下記の数式５に示すように、比の標準誤差σＲとして、ゲート後（Ｇ）及びゲート前（Ｕ）のフレームにおけるショットノイズ、並びに、バックグラウンド標準偏差σｇ及びσＵが考慮されている。
【0090】
【数5】
【0091】
ここで、バックグラウンドは、バックグラウンド信号及び高カメラ暗電流が組み合わされた主要な誤差項である。
【0092】
理想的な２ビンＰＣゲートにおける蛍光寿命の推定精度は、下記の数式６で表される。
【0093】
【数6】
【0094】
幅Ｔを有する固定時間窓におけるｎ個のビンを用いた寿命推定のクラメール・ラオの限界は、多項確率分布から直接計算することができる。図６Ａ及び図６Ｂの固定窓境界は、往復数をｎとしてＴ＝ｎ×ｔｒｔに設定することにより求めた。大きくｎが制限されている場合、これらの境界はＴＣ－ＳＰＣの性能を示す。光子が正規化された場合における、ｎ個のビンを用いた寿命推定のクラメール・ラオの限界は、下記の数式７で表される。
【0095】
【数7】
【0096】
（Ｃ）追加の変形例
【0097】
（Ｃ１）変調器構成
【0098】
上述したように、図１Ａに示す例だけでなく、様々な光変調器構成が可能である。図８Ａは、偏光板１２０と偏光板１２４との間に配置された偏光変調器１０４を示す図である。図８Ｂは、入力偏光板１２０と出力ＰＢＳ１０６との間に配置された偏光変調器１０４を示す図である。図８Ｃは、２つの偏光変調器１０４ａ、１０４ｂが採用されている点を除いて、図１Ａの例と同様である。このケースでは、２つの変調器１０４ａ、１０４ｂに印加される駆動信号は、互いに同一であってもよいし、互いに異なっていてもよい。
【0099】
これらの変調器構成には、偏光変調器の後（図８Ｃでは、例えば変調器１０４ａ及び／または変調器１０４ｂの後）に、光を反射して対応する変調器に戻すためのミラーが設けられた、二重経路の変形例も含まれる。その後、変調器１０２の前に設けられたビームスプリッタが反射された変調光を入射光から分光し、またそれを検出器アレイへ導いてもよい。これは、所定の変調器位相シフトに必要な電圧が半分になるという利点がある。欠点としては、二重経路では、両チャネルの同時出力が容易でないことが挙げられる。
【0100】
図８Ｄの例は、ｎ個のビンを用いたイメージングを提供するために使用される光変調器の直列配置を示す。ここで、変調器８０２、ＰＢＳ８０４、変調器８０６、ＰＢＳ８０８、変調器８１０、及びＰＢＳ８１２は、図のように直列に配置されている。変調器８０２、８０６、８１０へのゲーティング入力は、図示のように、それぞれＴ１、Ｔ２、Ｔ３におけるステップ関数である。その結果、カメラ８１４、８１６、８１８、８２０は、それぞれ対応する時間ビン８２２、８２４、８２６、８２８を取得することとなる。この例では４つの時間ビンが設けられているが、このような配置をもって任意の数の出力を設けることもできるし、また任意の変調波形が適用されてもよい。
【0101】
図８Ｅは、光変調器の直列配置の他の例を示す図である。ここで、第１のサブシステム８５０はＰＢＳ８５２及び変調器８５４を含み、第２のサブシステム８６０はＰＢＳ８６２及び変調器８６４を含む。このような直列配置における個々の変調器は、上述した任意の変調器構成を任意に組み合わせて使用してもよい。例えば、直列の各偏光変調器がＮ個の入力画像を受信して任意の変調を適用し、その後、ビームスプリッタを介して２Ｎ個の画像出力を生成してもよい。ある応用例は、一連の変調器に対して高速の変調波形及び低速の変調波形を適用することにより、系における時間的なダイナミックレンジを改善することができる。
【0102】
（Ｃ２）ハイパースペクトル構成
【0103】
図９Ａに示す例は、波長分離素子９０２、９０４（例えば、プリズムやグレーティングなど）が追加され、かつカメラ９０６、９０８が明示的に示されている点を除いて、図８Ｃに示す例と同様である。図９Ｂの例では、任意の数のカメラ９３２、９３４、９３６に対して光出力をカップリングする波長分離素子９２２、９２４、９２６（例えば、ダイクロイックミラー）が示されている。このような追加の分離素子は、変調器の一部の出力に設けられてもよいし、すべての出力に設けられてもよい。これにより、広視野画像における空間測定、ナノ秒時間測定、偏光測定、及び色測定を同時に行うことができる。このような時間分解ハイパースペクトルイメージングは、単一分子蛍光顕微鏡法において特に有用である。
【0104】
光変調器は、多次元または「ハイパースペクトル」モードの広視野イメージングを実現するために、波長分解素子と組み合わされてもよい（図９Ａ～図９Ｂ）。例えば、パルス励起を有する蛍光顕微鏡では、各放出光子が、それぞれ、放出時間、偏光、空間座標、及び波長という自由度を有する。偏光に基づく全光変調と波長選択光学系とを組み合わせることにより、これらのパラメータは、低速アレイ検出器ですべて同時に測定することができる。
【0105】
まばらなシングルポイントエミッタからシーンが構成されている局在顕微鏡法または単一分子分光法では、光変調器の出力経路に、プリズム、回折格子、または楔形フィルタースタックなどの分散素子を挿入してもよい。これにより、スペクトル情報を線形ストリークまたはエミッタ画像のアレイとしてエンコードすることができる。同様に、ダイクロイックミラーなどの波長分割素子を用いて、出力光を色チャネルのアレイに分割してもよい。この分割方法は広視野画像に対応しており、まばらなシーンに限定されるものではない。また、吸収性カラーフィルタ及びベイヤーフィルタなどのセンサアレイフィルタを採用してもよい。多次元技術では、波長チャネルと蛍光寿命チャネルとを組み合わせることにより、蛍光体間のフェルスター共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の測定精度を高めることができる。また、生体サンプル中の個々の蛍光標識をより多く識別できる、高次元のイメージングが可能となる。
【0106】
（Ｃ３）共振／ロックイン動作
【0107】
図１０Ａは、このアプローチによる共振／ロックイン信号処理の例示的な構成を示す図である。ここで、光学的構成は、図８Ｃと同様のものである。変調器１０４ａは、駆動電子機器１０１０により、第１の信号（φ１、ω１）で駆動される。変調器１０４ｂは、駆動電子機器１０２０により、第２の信号（φ２、ω２）で駆動される。カメラ１００２で得られることとなる画像は第１の信号であり、カメラ１００４における画像はカメラ１００２に対して位相がずれている。同様に、カメラ１００６で得られることとなる画像は第２の信号であり、カメラ１００８における画像はカメラ１００６に対して位相がずれている。図１０Ｂは、ロックイン信号処理の入射波形における２つの例である、蛍光減衰シーケンス１０２２及び正弦波１０２４を示す図である。周期的な入力波形の形状は、より一般的なものであってもよい。形状パラメータを推定するために、変調にＰＣを適用することにより、高速で変化する波形が低速検出器アレイに復調される。この構成は、２つの変調位相を使用することにより、低速帯域幅検出器における復調及び全ベクトル測定を可能にするロックインカメラと見做すことができる。
【0108】
正弦波変調により、周波数領域での波形形状パラメータの推定が可能となる。この技術は、標準的なカメラセンサの広視野画像にホモダイン検出またはヘテロダイン検出のいずれかを実装することができる。図１０Ａ及び図１０Ｂにその一例を示す。偏光変調器（例えば１０４ａ、１０４ｂ）の後ろにある偏光ビームスプリッタ（例えば１０６、１０８）は、２つの強度像を生成する。この強度像のうちの一方は、入射強度波形と変調との畳み込みに対応している。この強度像のうちの他方は、入射強度波形と変調の逆数との畳み込みに対応している。これは、正弦波変調の場合、２つの出力が互いに１８０度ずれた変調位相を有することを意味する。時間ゲート波形推定の場合と同様に、このアプローチにおける大きな利点は、ゲート画像及び非ゲート画像を同時に取得できる点である。ここでは、ゲート画像及び非ゲート画像は、それぞれ０度の位相を有する画像及び１８０度の位相を有する画像を意味する。これにより、入射光強度の正規化及び高速の単一フレーム取得が可能となる。
【0109】
ホモダインによる周波数領域の蛍光寿命推定は、よく知られている手法である。現在の広視野法では、ゲート光インテンシファイア、またはオンチップのマルチタップ変調カメラセンサのいずれかを使用することにより、周波数領域で撮像を行っている。この手法は、効率、コスト、及び速度の点で重大な欠点がある。代わりに、本願発明者らの方法は、蛍光寿命信号の全光復調を可能にする。
【0110】
蛍光シーンに周波数変調励起が適用される場合、蛍光応答は、変調深度及び励起光に対する位相シフトによって特徴付けることができる。これは、数学的には、通常、受信光強度の正弦フーリエ変換Ｇ（ω）及び余弦フーリエ変換Ｓ（ω）の観点から説明される。Ｇ及びＳは、下記の数式８及び数式９において、該応答の位相θ及び変調深度Ｍに関連している。これらは、蛍光減衰のフェーザ・プロット解析を可能にするために組み合わされることが多い。
【0111】
【数8】
【0112】
【数9】
【0113】
本願発明者らの技術は、所定の変調位相及び周波数を有する多数の強度出力を生成できる。図１０Ａは、４つの出力（カメラ１００２、１００４、１００６、１００８への出力）を示しており、各ＰＣ変調器の２つの出力は、一方が他方に対して１８０度シフトされている。単一指数関数的減衰を仮定し、かつ応答光の位相シフトが事前に較正されている場合、検出器に０度及び１８０度の２つの位相（Ｉ(０，ω１)及びＩ(１８０，ω１)）を有する１つの変調器による、１回の露光のみが必要となる。これにより、下記の数式１０によって、蛍光寿命の変調深度の推定値が求められる。
【0114】
【数10】
【0115】
応答の位相は、時間領域の遅延トレースと同様に、それぞれが互いに異なる変調器駆動位相を有する複数の個別のサンプルをフィッティングすることにより測定できる。互いに異なる駆動位相を有する複数の変調を使用することもできる。これにより、例えば、下記の数式１１に示すように、４つの強度出力から直接位相を推定することが可能となり、より一般的には、周期信号の全ベクトル測定が可能となる。
【0116】
【数11】
【0117】
位相及び変調深度から、下記の数式１２及び数式１３に示す２つの個別の寿命推定値が得られる。多重指数関数的寿命をより正確に推定するために、例えば位相プロット等でこれらを比較してもよい。周波数領域の推定は、時間領域の推定と同じ光子感度限界に近づく可能性がある。
【0118】
【数12】
【0119】
【数13】
【0120】
周波数領域の動作により、イメージングロックイン検出器であって、イメージング検出器アレイにおけるすべてのピクセルが、単一のロックインアンプに類似する個別のロックインまたは復調処理を行う、該イメージングロックイン検出器が実現されている。２つの位相シフトを互いに組み合わせることにより、同相成分及び直交成分の両方を取得する複素フェーザ（complex phasor）の全測定が実現されてもよい。これは、互いに異なる位相で駆動される２つの変調器を使用することにより、あるいはリターダまたは波長板を用いてイメージングビームの一部に位相シフトを光学的に導入することにより、容易に同時実現することができる。また、照明入力に対してわずかに異なる変調周波数を用いて、ヘテロダイン検出を行うことも考えられる。低速のビート周波数は、例えば、低速のカメラチップにより検出されてもよい。同様に、直列変調器は、異なる駆動周波数または不整合な位相で駆動されてもよい。ポッケルスセルが広視野イメージングに適しているという固有の前提条件に加え、高周波動作は独自の課題を有している。（１）結晶に対して高電圧の交流電圧の印加が必要となる場合がある。ＰＣを駆動させるための方法としては、ＬＣタンク回路などの共振電子回路にＰＣを組み込み、コンデンサとして機能させるのが理想的である。この回路は、実用的なドライブエレクトロニクスを実現するために、高いＱファクタを有する必要がある。（２）誘電損失に起因するポッケルスセル結晶の加熱により、または抵抗損失に起因するポッケルスセル電極の加熱により、アクティブ冷却の手段が必要となる場合がある。結晶は、冷却されたプレートに該結晶をマウントすることにより、あるいは、該結晶の金属電極を冷却することにより（例えば、横電界型変調器のジオメトリの場合）アクティブ冷却されてもよい。これらは、（流動または静的熱伝導を目的として）該結晶を誘電性冷却剤に浸すことにより、あるいは、縦型変調器を、熱伝導性を有しかつ光学的に透過的であるプレートで挟むことにより達成されてもよい。このようなプレートは、例えば、ガラス、透明セラミックス、またはサファイアなどから作成されてもよい。また、ヒートシンクまたは熱制御ユニットに接続されてもよい。
【0121】
（Ｃ４）荷電粒子の検出
【0122】
図１１Ａ～図１１Ｃは、本発明を荷電粒子検出器に応用したものを示す図である。これらの粒子検出器（例えば電子カメラ）は、リン光スクリーンまたはシンチレーション結晶を用いて、粒子束を高度な非線形光学応答に変換することが多い。結果として生じる「蛍光」の減衰波形形状は、既知の蛍光寿命をフィッティングして荷電粒子がいつ検出器に衝突したかという時間的情報を得るために、本明細書に記載の方法を用いて測定されてもよい。これにより、同時的に発生し、かつ空間的に互いに分離された数十から数千の衝突を含む広視野画像において、時間相関型荷電粒子計数が可能となる。この機能は、現在の検出器には備わっておらず、電子顕微鏡法における新しいタイプの測定を可能にするであろう。
【0123】
図１１Ａは、蛍光体またはシンチレータ１１０４に対して互いに異なる位置及び互いに異なる時間に衝突する３つの粒子（＃１、＃２、＃３）を模式的に示す図である。ここで、１１０２は任意選択で設けられる増倍器またはインテンシファイアであり、１１０６は上述して説明したような光変調器ユニットであり、１１０８はカメラである。時間の差異は、図１１Ｂに模式的に示されている。蛍光体／シンチレータ１１０４は、減衰が長く（Ｐ４７では８０ｎｓ）、かつ光子数が多い（マイクロチャネルプレート増倍器では１０６個）光のバーストを生成する。図１１Ｃのプロットでは、増倍器ステージのいくらかの電子走行時間広がり（ＴＴＳ）と、８０ナノ秒の減衰定数とを仮定し、理想的なステップゲートと、立ち上がり時間が長く、かつ９０％の効率を有するステップゲートとにおける時間推定精度をプロットしている。マイクロチャネルプレート及び蛍光体の光子数Ｎが大きい場合、これにより１００ピコ秒以下の時間分解能が得られる。
【0124】
時間相関型荷電粒子検出器は、時間相関型単一光子計数器と同様に制限されている。既存の技術では、マイクロチャネルプレートの電子増倍器を、交差配線（crossed-wire）のディレイラインからなる１以上のアノードに組み合わせている。粒子が衝突すると、マイクロチャネルプレートから電子のバーストが発生する。このバーストは、各線のパルス遅延時間に基づいて、交差配線アノードに空間的に局在する。この方法は複雑であって、同時に衝突する粒子数が数個に制限されており、かつカウントレートも数ＭＨｚに制限されている（低スループット）。本願発明者らの光学的手法は、シンチレータまたは燐光スクリーンを用いて各衝突から燐光または蛍光減衰波形を生成することにより、効率的な代替手段を提供する（図１１Ａ～図１１Ｃ）。この場合、減衰波形の蛍光寿命は既に知られており、燐光波形形状をフィッティングすることにより、粒子がスクリーンに衝突した時間を知ることができる。
【0125】
広視野の時間領域ＦＬＩＭの場合、理想的なゲートは、以下に示す数式１４により、ショットノイズ限界における精度を用いて蛍光寿命を推定できる。
【0126】
【数14】
【0127】
代わりに寿命が既知であれば、同様に、粒子の衝突時間は、ショットノイズ限界における感度を用いて、以下に示す数式１５のように推定できる。
【0128】
【数15】
【0129】
高ゲインのマイクロチャネルプレートは、１パルスあたり１０６個を超える光子を生成可能であり、これにより、非常に高い時間分解能での推定が可能となる。この時間分解能は、電子増倍器の数十ピコ秒のジッタに迫る程である。各粒子事象により変動するゲインを正規化するためには、ゲート画像と非ゲート画像の両方を得ることが重要である。ＭＣＰ検出器における通常の電子走行時間広がりは約３００ピコ秒であり、パルスのジッタは数十ピコ秒である。
【0130】
粒子用の時間相関型空間検出器は、各イメージング電子における高解像度の空間情報及び時間情報を記録するために、電子顕微鏡法に使用されてもよい。例えば、超高速透過電子顕微鏡（ＵＴＥＭＳ）、あるいは、パルスまたはレーザによって惹き起こされる発光源を有する他の電子顕微鏡及び超高速回折実験などに利用できる可能性がある。また、このような検出器は、サンプル内の非弾性散乱に起因するエネルギー損失が電子の速度及び到達時間に変化をもたらすこととなる電子エネルギー損失分光（ＥＥＬＳ）において、新規のイメージングモードを実現できる。同様に、低エネルギー電子撮像系（例えば、低エネルギー電子顕微鏡（ＬＥＥＭ）及び光電子顕微鏡（ＰＥＥＭ））において、光源エネルギーの変化に起因する色彩効果を除去することも可能である。このカメラは、さらに量子検出器としても機能するため、これにより、位置及び運動量の相関関係の測定、並びに、複数粒子の同時性（multi-particle coincidences）の検出が可能となる。
【0131】
本願発明者らの技術は１０個以上の同時衝突を測定できるという点で特徴的であり、さらに１００００個以上の同時衝突を測定できるように拡張することも可能である。その他の応用例としては、質量分析計のイオン飛行時間検出、イオン運動量分光実験（例えば、コールドターゲット反跳イオン運動量分光法：ＣＯＬＴＲＩＭＳ）、イメージインテンシファイア管を用いた単一光子の時間相関検出などが挙げられる。
【0132】
（Ｃ５）内視鏡への応用
【0133】
広視野光変調器は、臨床用蛍光寿命システムとして有望である。蛍光及び組織の自家蛍光をイメージングすることにより、様々な疾患及びバイオマーカーの指標を得ることができる。光変調器のフロントエンドとして、内視鏡、関節鏡、またはマクロ撮像系を臨床現場で使用することにより、病変組織及び切除縁の識別を向上できる。例えば、ＦＬＩＭでは、細胞内のＮＡＤＨ／ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを代謝のマーカーとして測定することができる。これにより、がん組織の光学的特徴を得ることができる。蛍光寿命と波長とを組み合わせたマルチスペクトルＦＬＩＭもまた、重要な診断ツールとなり得る。
【0134】
本願発明者らの単一フレーム法によって実現した高速撮影及び迅速な蛍光寿命計算は、医療行為中または手術中に蛍光寿命画像のリアルタイム表示及びビデオレート観察を可能にする点で特に有用である。
【0135】
内視鏡システムは、変調器ユニットに、柔軟な光ファイバ束、マルチモード光ファイバ、及び／またはＧＲＩＮ光学系をインターフェースしてもよい。また、リレーレンズ系は、例えば硬質な関節鏡等に使用されてもよい。
【図1A】
【図1B】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図6A】
【図6B】
【図7A】
【図7B】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図8D】
【図8E】
【図9A】
【図9B】
【図10A】
【図10B】
【図11A】
【図11B】
【図11C】