(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-02-09
(45)【発行日】2024-02-20
(54)【発明の名称】遺伝子サンプルを識別且つ区別するためのシステムと方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6837 20180101AFI20240213BHJP
C12M 1/00 20060101ALI20240213BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20240213BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6837 Z
C12M1/00 A
C12N15/09 Z
【請求項の数】
15
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2021159641
(22)【出願日】2021-09-29
(62)【分割の表示】P 2018526506の分割
【原出願日】2016-11-15
(65)【公開番号】P2022023083
(43)【公開日】2022-02-07
【審査請求日】2021-10-26
(31)【優先権主張番号】62/306,597
(32)【優先日】2016-03-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/256,049
(32)【優先日】2015-11-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】518173090
【氏名又は名称】リヴィア バイオセンサーズ，エルエルシー
(74)【代理人】
【識別番号】110003797
【氏名又は名称】弁理士法人清原国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ケイン，ロバート，チャールズ
(72)【発明者】
【氏名】シェン，リチャード
【審査官】馬場 亮人
(56)【参考文献】
【文献】特表２００５－５０９１２７（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２００１－５１４９０６（ＪＰ，Ａ）
【文献】Anal Biochem. 2005, 342, pp.59-68
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｑ １／６８３７
Ｃ１２Ｍ １／００
Ｃ１２Ｎ １５／０９
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
（ａ）複数の異なる対象に由来する複数の核酸分子を含むサンプルを提供する工程と、（ｂ）前記複数の核酸分子を、複数の特徴を含むバイオチップに接触させる工程であって、前記複数の特徴のうちの第１の特徴は、第１の複数の同一のプローブを含み、前記第１の複数の同一のプローブは、前記複数の異なる対象のうちの第１の対象における第１の対象特異的属性を標的とし、前記複数の特徴のうちの第２の特徴は、第２の複数の同一のプローブを含み、前記第２の複数の同一のプローブは、前記第１の対象における第２の対象特異的属性を標的とし、前記第１の複数の同一のプローブと前記第２の複数の同一のプローブは、検出システムの有する光学的解像度未満またはそれに等しい領域に位置する、工程と、
（ｃ）前記核酸分子の少なくとも１つ以上の核酸分子の、前記複数の特徴の少なくとも１つ以上の前記プローブへの結合に関連する複数のシグナルを、前記検出システムを使用して検出する工程であって、それによって、（ｉ）前記第１の複数の同一のプローブに関連するシグナル、および（ｉｉ）前記第２の複数の同一のプローブに関連するシグナルが、単一の解像度要素に統合される、工程と、
（ｄ）前記結合に関連する前記複数のシグナルに基づいて、前記複数の異なる対象のうちの少なくとも前記第１の対象の同一性を決定する工程であって、前記同一性は、種または株の同一性を含む、工程と、
を含んでなる方法。
【請求項2】
前記シグナルが、少なくとも２つの異なる固有のプローブへの前記複数の核酸分子の核酸の結合に関連する、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記同一性が、前記複数の異なる対象のうちの少なくとも前記第１の対象の同一性を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記第１の複数の同一のプローブおよび前記第２の複数の同一のプローブが、前記複数の異なる対象のうちの少なくとも前記第１の対象の１つの病原性または毒性を示す核酸配列にハイブリダイズすることができる、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
前記第１の複数の同一のプローブおよび前記第２の複数の同一のプローブが、前記複数の異なる対象のうちの少なくとも前記第１の対象の抵抗を示す核酸配列にハイブリダイズすることができる、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
前記第１の対象特異的属性および前記第２の対象特異的属性が異なる遺伝的属性を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
前記第１の対象特異的属性および前記第２の対象特異的属性が、前記複数の異なる対象の前記第１の対象のゲノムの固有の領域を標的とする、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
前記第１の対象の前記ゲノムの前記固有の領域が、前記複数の異なる対象の第２の対象のゲノムに表されていない、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記複数の特徴が、アレイ上のスポットまたは領域を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項10】
前記複数の特徴がビーズを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項11】
前記工程（ｄ）の決定が、少なくとも５の対象の識別を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項12】
前記サンプルが環境サンプルを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項13】
前記複数の異なる対象が、異なる種のマイクロバイオームを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項14】
前記サンプルが液状の生体サンプルを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項15】
前記サンプルが固形の生体サンプルを含む、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
相互参照
本出願は、２０１５年１月１６日出願の米国仮特許出願第６１／２５６，０４９号、及び２０１６年３月１０日出願の米国仮特許出願第６２／３０６，５９７号の利益を請求するものであり、その各々は、全ての目的のために全体を参照することで本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１５年１月１６日出願の米国仮特許出願第６１／２５６，０４９号、及び２０１６年３月１０日出願の米国仮特許出願第６２／３０６，５９７号の利益を請求するものであり、その各々は、全ての目的のために全体を参照することで本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【0002】
ＤＮＡマイクロアレイ（又はバイオチップ）は、標的核酸の存在に対しサンプルをプローブで探すために頻繁に使用される。マイクロアレイは、固形支持体に固定されたプローブのアレイを含んでいる。プローブのアレイは、プローブのクラスターとして構築することができ、各々が個々に対処可能である。各クラスターは複数のプローブを含むことができ、各プローブは各クラスター中の他のプローブと同一であり、各々が同じ標的核酸配列に結合することができる。サンプルがマイクロアレイにハイブリダイズされた後、プローブに結合される標的核酸の存在が判定され得る。マイクロアレイには、コスト効率が良く、サンプル中の何千から何百万もの配列の存在を判定することができるという点で非常にスケーラブルであり、且つ他の同様に調整した（ｓｃａｌｅｄ）手法よりも早い時間での返答を提供するという利点を提供することができる。
【0003】
しかし、マイクロアレイは、ＤＮＡ配列決定などの他の技術と比較して低い感度及び特異性を示す場合がある。プローブは、対象の標的に対する特異性を確保するように注意深く設計されなければならない。このことは、環境サンプルなどの複合サンプル、即ち遺伝物質の１より多くのソースを含むものを調べる時に、問題となり得る。更に、高レベルの遺伝的類似性を共有する２以上の被験体を区別する能力は、マイクロアレイ技術を使用して区別することが困難となる場合がある。本明細書中の方法とシステムは、複合サンプルにおける被験体の識別と区別のための新たなマイクロアレイ又はバイオチップを記載する。
【発明の概要】
【0004】
幾つかの態様において、複数の被験体に特異的な特徴を含むバイオチップが開示され、ここで、被験体に特異的な特徴はそれぞれ複数の異なるプローブを含み、複数の異なるプローブは、サンプル中で複数の被験体から１つの被験体を区別することが可能な標的に結合することができる。幾つかの実施形態において、被験体は細胞型である。幾つかの実施形態において、サンプル中の被験体は異なる細胞型である。幾つかの実施形態において、被験体は有機体である。幾つかの実施形態において、サンプル中の被験体は異なる有機体である。幾つかの実施形態において、プローブは核酸である。幾つかの実施形態において、標的はゲノム領域である。
【0005】
幾つかの態様において、以下の工程を含む方法が開示される：（ａ）複数の被験体を含むサンプルを得る工程；（ｂ）サンプルから核酸を抽出して断片化する工程；（ｃ）抽出して断片化した核酸をバイオチップへとハイブリダイズする工程であって、バイオチップは、複数の固有のプローブを含む、被験体に特異的な特徴を含んでいる、工程；（ｄ）ハイブリダイズしたプローブを持つ被験体に特異的な特徴を識別するためにバイオチップを画像化する工程；及び（ｅ）バイオチップを使用して識別される複数の被験体から被験体を列挙するレポートを提供する工程。幾つかの実施形態において、核酸は増幅されない。幾つかの実施形態において、バイオチップには１００を超える被験体に特異的な特徴がある。幾つかの実施形態において、被験体は細胞型である。幾つかの実施形態において、被験体は有機体である。幾つかの実施形態において、被験体は細菌である。幾つかの実施形態において、被験体は遺伝子である。幾つかの実施形態において、被験体は保存領域である。幾つかの実施形態において、被験体は、病原性、ビルレンス、又は抗生物質耐性に関連した領域である。
【0006】
１つの態様において、１つ以上のセットのプローブを含むバイオチップが提供され、ここで、１つ以上のセットのプローブの各セットは複数のプローブを含み、複数のプローブの各々は１つ以上の被験体に特異的な特徴を含み、１つ以上のセットのプローブの各セットは、複数の異なる被験体の１人の異なる被験体からの標的核酸に結合する。場合によっては、１セットのプローブ内の複数のプローブの各々は同一である。場合によっては、１セットのプローブ内の複数のプローブの各々は異なっている。場合によっては、複数のプローブの各セットは複数の固有のプローブを含む。場合によっては、複数のプローブの各セットは、複数の固有のプローブの予め定めた平均表示を含む。場合によっては、複数の固有のプローブの平均表示は、プローブの１つ以上のセットの各セット内のプローブの総数を制限することにより、予め定めた比率で前記複数の固有のプローブを混合することにより、或いはその両方の組み合わせにより、制御される。場合によっては、前記１つ以上のセットのプローブの各々は、約２－１０００の固有のプローブを含む。場合によっては、平均表示は、前記プローブのセット内に前記複数の固有のプローブの各々の約２－１０００の表示を含む。場合によっては、プローブの各セット内の被験体に特異的な特徴は同一である。場合によっては、前記１つ以上のセットのプローブの各セットは、異なる被験体に特異的な特徴を含む。場合によっては、前記１つ以上のセットのプローブの各セットは、個々に対処可能である。場合によっては、１セットのプローブ内の前記複数のプローブの各々は、前記標的核酸上に存在する同一の核酸配列に相補的である。場合によっては、１セットのプローブ内の前記複数のプローブの各々は、前記標的核酸上に存在する異なる核酸配列に相補的である。場合によっては、前記１つ以上のセットのプローブの各セットは、被験体のゲノムの固有領域に相補的である。場合によっては、前記被験体のゲノムの固有領域は、異なる被験体のゲノムには表わされない。場合によっては、複数の異なる被験体は複数の異なる細胞型を含む。場合によっては、前記１つ以上のセットのプローブの各セットは、前記複数の異なる細胞型の１つの異なる細胞型からの標的核酸に結合する。場合によっては、複数の異なる被験体は複数の異なる有機体を含む。場合によっては、複数の異なる被験体は複数の異なる個体を含む。場合によっては、複数の異なる被験体は複数の異なる株を含む。場合によっては、複数の異なる被験体は複数の異なる遺伝子を含む。場合によっては、複数の異なる被験体は複数の異なるゲノム領域を含む。場合によっては、前記１つ以上のセットのプローブの各セットは、前記複数の異なる有機体の１つの異なる有機体からの標的核酸に結合する。場合によっては、複数のプローブは核酸分子を含む。場合によっては、複数のプローブは固形支持体に固定される。場合によっては、固形支持体はビーズである。場合によっては、被験体に特異的な特徴は１つ以上の遺伝子特徴を含む。場合によっては、１つ以上の遺伝子特徴は、以下から成る群から選択される：種を表わすゲノム、種の中の株を表わすゲノム、クロマチン、染色体、染色体遺伝子座、染色体物質、対立遺伝子、遺伝子、遺伝子クラスター、遺伝子座、遺伝的多型、遺伝子突然変異、ヌクレオチド、一塩基多型（ＳＮＰ）、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）、タンデム反復数（ｖａｒｉａｂｌｅ ｔａｎｄｅｍ ｒｅｐｅａｔ）（ＶＴＲ）、コピー数多型（ＣＮＶ）、マイクロサテライト配列、遺伝子マーカー、配列マーカー、配列でタグ付けした部位（ＳＴＳ）、プラスミド、転写ユニット、転写産物、遺伝子発現状態、保存領域、病原性アイランド、及びそれらの任意の組み合わせ。場合によっては、１つ以上のセットのプローブは、１００より多くのセットのプローブを含む。場合によっては、前記１つ以上のセットのプローブの各々は、約５０－１０００のプローブを含む。
【0007】
１つの態様において、以下を含む方法が提供される：ａ）複数の異なる被験体に由来する複数の核酸を含むサンプルを提供する工程であって、前記複数の核酸は、前記複数の異なる被験体の少なくとも２つからの少なくとも１つの標的核酸を含む、工程；ｂ）前記複数の核酸をバイオチップにハイブリダイズする工程であって、前記バイオチップは１つ以上のセットのプローブを含み、前記１つ以上のセットのプローブの各セットは複数のプローブを含み、前記複数のプローブの各々は１つ以上の被験体に特異的な特徴を含み、前記１つ以上のセットのプローブの各セットは、前記複数の異なる被験体のうち少なくとも２つからの前記少なくとも１つの標的核酸に結合する、工程；ｃ）前記複数のプローブの１つのプローブへの前記少なくとも１つの標的核酸の結合に関連したシグナルを検出する工程；及びｄ）前記サンプル中の前記少なくとも１つの標的核酸の存在に基づいて前記複数の異なる被験体を識別する工程。場合によっては、前記方法は、工程ａ）の前に、前記複数の異なる被験体から前記複数の核酸を抽出する工程を更に含む。場合によっては、前記方法は、工程ｂ）の前に、前記複数の核酸を断片化する工程を更に含む。場合によっては、前記方法は、工程ｂ）の前に、前記複数の核酸を増幅する工程を更に含む。場合によっては、複数の核酸は増幅されない。場合によっては、前記方法は、前記複数の異なる被験体を識別する１つ以上のレポートを提供する工程を更に含む。場合によっては、複数の異なる被験体は複数の異なる細胞型を含む。場合によっては、複数の異なる被験体は複数の異なる有機体を含む。場合によっては、１セットのプローブ内の前記複数のプローブの各々は同一である。場合によっては、１セットのプローブ内の前記複数のプローブの各々は異なっている。場合によっては、前記複数のプローブの各セットは複数の固有のプローブを含む。場合によっては、前記複数のプローブの各セットは、前記複数の固有のプローブの平均表示を含む。場合によっては、前記複数の固有のプローブの平均表示は、前記１つ以上のセットのプローブの各セット内のプローブの総数を制限することにより、予め定めた比率で前記複数の固有のプローブを混合することにより、或いはその両方の組み合わせにより、制御される。場合によっては、前記１つ以上のセットのプローブの各々は、約２－１０００の固有のプローブを含む。場合によっては、平均表示は、前記プローブのセット内に前記複数の固有のプローブの各々の約２－１０００の表示を含む。場合によっては、プローブの各セット内の被験体に特異的な特徴は同一である。場合によっては、前記１つ以上のセットのプローブの各セットは、異なる被験体に特異的な特徴を含む。場合によっては、前記１つ以上のセットのプローブの各セットは、個々に対処可能である。場合によっては、１セットのプローブ内の前記複数のプローブの各々は、前記標的核酸上に存在する同一の核酸配列に相補的である。場合によっては、１セットのプローブ内の前記複数のプローブの各々は、前記標的核酸上に存在する異なる核酸配列に相補的である。場合によっては、前記１つ以上のセットのプローブの各セットは、被験体のゲノムの固有領域に相補的である。場合によっては、被験体のゲノムの固有領域は、異なる被験体のゲノムには表わされない。場合によっては、複数のプローブは核酸分子を含む。場合によっては、複数のプローブは固形支持体に固定される。場合によっては、固形支持体はビーズである。場合によっては、１つ以上の被験体に特異的な特徴は１つ以上の遺伝子特徴を含む。場合によっては、１つ以上の遺伝子特徴は、以下から成る群から選択される：種のゲノム、株のゲノム、クロマチン、染色体、染色体遺伝子座、染色体物質、対立遺伝子、遺伝子、遺伝子クラスター、遺伝子座、遺伝的多型、遺伝子突然変異、ヌクレオチド、一塩基多型（ＳＮＰ）、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）、タンデム反復数（ＶＴＲ）、コピー数多型（ＣＮＶ）、マイクロサテライト配列、遺伝子マーカー、配列マーカー、配列でタグ付けした部位（ＳＴＳ）、プラスミド、転写ユニット、転写産物、遺伝子発現状態、保存領域、病原性アイランド、及びそれらの任意の組み合わせ。場合によっては、１つ以上のセットのプローブは、１００より多くのセットのプローブを含む。場合によっては、前記１つ以上のセットのプローブの各々は、約５０－１０００のプローブを含む。場合によっては、少なくとも１つの標的核酸は、検出可能な標識で標識される。場合によっては、検出可能な標識は蛍光染料を含む。場合によっては、前記複数のプローブの第１のプローブは第１の被験体に特異的な特徴を含み、前記複数のプローブの第２のプローブは第２の被験体に特異的な特徴を含み、前記第１のプローブと前記第２のプローブは、前記少なくとも１つの標的核酸にハイブリダイズする。
【0008】
別の態様において、標識された核酸断片を産生するための方法が提供され、該方法は、以下を含む：（ａ）二本鎖である標的核酸を提供する工程；（ｂ）前記標的核酸を、（ｉ）トランスポゾンと（ｉｉ）標識で標識されるオリゴヌクレオチドとを含むトランスポソームと接触させる工程；及び（ｃ）前記トランスポソームで、前記標的核酸から核酸断片を産生する工程であって、前記核酸断片は二本鎖であり、且つ（ｉ）前記標的核酸の一部と（ｉｉ）前記標識とを含む、工程。請求項６０に記載の方法は、標識された一本鎖断片をもたらすために前記核酸断片を変性させる工程を更に含む。場合によっては、前記方法は、前記標識された一本鎖断片をアレイにハイブリダイズする工程を更に含む。場合によっては、前記核酸断片は前記オリゴヌクレオチドの少なくとも一部を更に含む。場合によっては、前記標識は蛍光標識である。場合によっては、前記核酸断片は５’末端にて前記標識を含む。
【0009】
１つの態様において、第１の鎖と第２の鎖とを含む、標的核酸の二本鎖断片；前記第１の鎖に共有結合された第１のオリゴヌクレオチド；前記第１のオリゴヌクレオチドに結合される第１の標識；前記第２の鎖に共有結合された第２のオリゴヌクレオチド；及び前記第２のオリゴヌクレオチドに結合される第２の標識、を含む組成物が提供される。場合によっては、前記第１のオリゴヌクレオチドは、前記第１の鎖の５’末端にて前記第１の鎖に共有結合され、前記第２のオリゴヌクレオチドは、前記第２の鎖の５’末端にて前記第２の鎖に共有結合される。場合によっては、前記第１の標識と第２の標識は蛍光標識を含む。
【0010】
１つの態様において、光学的分解能を特徴とする光検出器；及び前記光検出器に光学的に接続されたバイオチップを含むバイオチップシステムが提供され、前記バイオチップは、（ｉ）第１の複数の同一のプローブを含む第１の特徴、及び（ｉｉ）第２の複数の同一のプローブを含む第２の特徴を含み、前記第１の複数の同一のプローブと前記第２の複数の同一のプローブは、互いに異なっており；ここで、前記第１の特徴と前記第２の特徴は、前記光学的分解能未満の領域或いはそれに略等しい領域に包含される。場合によっては、前記光学的分解能は、前記光検出器のピクセルサイズにより判定される。場合によっては、前記第１の複数の同一のプローブは被験体の第１の被験体に特異的な特徴を標的とし、前記第２の複数の同一のプローブは前記被験体の第２の被験体に特異的な特徴を標的とする。場合によっては、前記第１の被験体に特異的な特徴及び前記第２の被験体に特異的な特徴は、異なるものである。場合によっては、前記第１の被験体に特異的な特徴及び前記第２の被験体に特異的な特徴はそれぞれ、核酸配列を含む。場合によっては、前記第１の被験体に特異的な特徴又は前記第２の被験体に特異的な特徴は、細胞型を示す。場合によっては、前記第１の被験体に特異的な特徴又は前記第２の被験体に特異的な特徴は、有機体の型を示す。場合によっては、前記第１の被験体に特異的な特徴又は前記第２の被験体に特異的な特徴は、種を示す。場合によっては、前記第１の被験体に特異的な特徴又は前記第２の被験体に特異的な特徴は、種の個々のメンバーを示す。場合によっては、前記第１の被験体に特異的な特徴又は前記第２の被験体に特異的な特徴は、抵抗の形質（ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｒａｉｔ）を示す。場合によっては、前記第１の複数の同一のプローブ及び前記第２の複数の同一のプローブは、核酸である。
【0011】
１つの態様において、（ｉ）第１のプローブと第２のプローブとを含む第１の特徴、及び（ｉｉ）前記第１のプローブと前記第２のプローブとを含む第２の特徴を含むバイオチップ、を含むデバイスが提供され、前記第１のプローブは前記第２のプローブとは異なる。場合によっては、前記第１のプローブは被験体の第１の被験体に特異的な特徴を標的とし、前記第２のプローブは前記被験体の第２の被験体に特異的な特徴を標的とする。場合によっては、前記第１の被験体に特異的な特徴及び前記第２の被験体に特異的な特徴は、異なるものである。場合によっては、前記第１の被験体に特異的な特徴及び前記第２の被験体に特異的な特徴はそれぞれ、核酸配列を含む。場合によっては、前記第１の被験体に特異的な特徴又は前記第２の被験体に特異的な特徴は、細胞型を示す。場合によっては、前記第１の被験体に特異的な特徴又は前記第２の被験体に特異的な特徴は、有機体の型を示す。場合によっては、前記第１の被験体に特異的な特徴又は前記第２の被験体に特異的な特徴は、種を示す。場合によっては、前記第１の被験体に特異的な特徴又は前記第２の被験体に特異的な特徴は、種の個々のメンバーを示す。場合によっては、前記第１の被験体に特異的な特徴又は前記第２の被験体に特異的な特徴は、抵抗の形質を示す。場合によっては、前記第１の複数の同一のプローブ及び前記第２の複数の同一のプローブは、核酸である。場合によっては、前記第１の特徴から産生されたシグナルは、前記第１のプローブと前記第２のプローブの両方の標的の存在を示す。場合によっては、前記第１の特徴及び前記第２の特徴から産生されたシグナルは、信頼値における特異的な種、株、遺伝子、又はゲノム特徴の存在を示す。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1D】図１のＤは、１つの被験体に特異的な特徴に結合された４つの標的を示す。図１のＣを図１のＤと比較すると、複数の被験体標的に配向された複数の異なるプローブを使用した時に１つの特徴に生じ得るシグナル増幅が実証される。
【図2】１つの特徴ごとに結合するフルオロフォアの数の増大により得ることができる相対的なシグナルを示す。
【図3】本明細書に開示される方法を実行するのに適切な、典型的なコンピュータシステムを示す。
【図4】Ｍ１３ｍｐ１８ファージベクトル配列上で識別された２２の固有領域を示す。
【図5】本明細書に記載される方法を使用してＭ１３ｍｐ１８ファージベクトル配列に対して設計された固有のプローブの例を示す。
【図6】トランスポソーム複合体を使用した二本鎖ＤＮＡの一工程の（ｏｎｅ－ｓｔｅｐ）断片化及び標識化の典型的な図を示す。
【図7A】別個の捕捉配列及び検出配列でのハイブリダイゼーションを介した標的核酸のハイブリダイゼーション及び検出を示す。
【図7B】別個の捕捉配列及び検出配列でのハイブリダイゼーションを介した標的核酸のＦＲＥＴシグナル検出を示す。
【図7C】複数のハイブリダイゼーション配列を介した、アレイへの標的核酸のハイブリダイゼーションを表す。
【図8】フィルター基板上のオリゴヌクレオチドアレイに濃縮された核酸の典型的な概略図を示す。
【図9A】典型的なコンピュータシステムを表す。
【図9B】コンピュータシステムの典型的構成を表す。
【図9C】コンピュータシステムの典型的なネットワークを表す。
【図9D】典型的なマルチプロセッサコンピュータシステムを表す。
【図10】非ウイルスの結核に関するアッセイの結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【0013】
定義
以下の用語は、当業者によるこれらの用語の理解に加えて、本明細書において使用される用語の意味を例示するために説明される。本明細書および特許請求の範囲で使用されるように、「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、その内容が他に明確に示していない限り、複数の参照を含む。例えば、用語「細胞」は複数の細胞を含み、その混合物も含む。
以下の用語は、当業者によるこれらの用語の理解に加えて、本明細書において使用される用語の意味を例示するために説明される。本明細書および特許請求の範囲で使用されるように、「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、その内容が他に明確に示していない限り、複数の参照を含む。例えば、用語「細胞」は複数の細胞を含み、その混合物も含む。
【0014】
明細書において使用されるように、用語「エピゲノム」は、ＤＮＡメチル化および染色質再編成、あるいは再形成などの配列レベルに反映されない遺伝物質への変更、あるいは遺伝物質のタンパク質発現を指す。「トランスクリプトーム」は、特定の環境条件の下で、有機体によって合成された遺伝子転写産物（ｍＲＮＡ）の全体を指す。トランスクリプトームデータセットには、対象の遺伝子発現の活性化あるいは非活性化に関する質および量的情報が、制限なく含まれる。トランスクリプトームはさらに、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ｐｉｗｉＲＮＡ、構造ＲＮＡ、タンパク質と結合するＲＮＡ、テロメラーゼＲＮＡ、およびトランスポゾンＲＮＡを含む、タンパク質をコードしないＲＮＡ転写産物（非コードＲＮＡあるいはｎｃＲＮＡ）を含む。「エクソーム」は、エクソンによって形成されたゲノムの部分、すなわち転写された時に成熟ＲＮＡ内に残存する配列を指す。「マイクロバイオーム」は、通常は微生物を起原とするが、種に関わらず、生体サンプル内のゲノム全体を指す。
【0015】
明細書において使用されるように、用語「遺伝的特徴」は、任意のゲノム、遺伝子型、ハプロタイプ、染色質、染色体、染色体座、染色体物質、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、対立遺伝子、遺伝子、遺伝子集団、遺伝子座、遺伝的多形、遺伝子突然変異、遺伝子突然変異比率、ヌクレオチド、ヌクレオチド塩基対、一塩基多型（ＳＮＰ）、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）、タンデム反復数（ＶＴＲ）、コピー数多型（ＣＮＶ）、マイクロサテライト配列、遺伝子マーカー、配列マーカー、配列でタグ付けした部位（ＳＴＳ）、プラスミド、転写ユニット、転写産物、遺伝子発現レベル、遺伝子発現（例えば転写）状態、リボ核酸（ＲＮＡ）、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、保存領域、および病原性アイランドを指し、上記のいずれかに関連するヌクレオチド配列およびコードされたアミノ酸配列を含む。後成的な特徴は、体細胞分裂中に遺伝され得る、および時には生殖細胞系伝達において遺伝され得るように遺伝子発現に影響を与えるが、ＤＮＡ塩基配列へと突然変異せず、したがって基本的に可逆性であり、限定されないがＤＮＡヌクレオチドのメチル化およびクロマチン結合性ヒストンタンパク質のアセチル化を含む、遺伝物質、すなわちすべてのゲノム、媒介体、およびプラスミドＤＮＡと染色質等の任意の特徴である。したがって、明細書において使用されるように、遺伝子配列データは、ヌクレオチド配列、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）配列、およびリボ核酸（ＲＮＡ）配列を、制限なく含み得る。
【0016】
本明細書において使用される用語「被験体に特異的な特徴」は、ある被験体を他から区別することができる任意の特徴あるいは属性を指し得る。場合によっては、被験体に特異的な特徴は遺伝的特徴である。上記のように、遺伝的特徴は、被験体から単離した核酸上で存在することができる。場合によっては、被験体に特異的な特徴は、一連の機能を区別する１つ、あるいは複数の特徴に関連し得る。これは、例えば、単一の遺伝子、複数の遺伝子、既知のエピゲノムの機能を備えるプロモーター領域等のゲノム領域を標的にするために設計されたプローブによって達成され得る。被験体に特異的な特徴は、バイオチップ上のプローブとして表すことができる。被験体に特異的な特徴を表すプローブは、被験体から得られた１つ以上の標的核酸配列に結合することが可能でありうる。場合によっては、被験体に特異的な特徴は、各々が被験体を他から区別可能な、複数の非同一のプローブを含む。場合によっては、細菌株などの特定の被験体は、標的株に特有の、標的株を含む種に特有の、標的株に存在する保存領域に含まれる、あるいは標的株に含まれる病原性アイランドを認識する特徴を含む、バイオチップ上の１つまたは複数の特徴により区別可能である。場合によっては、単純に病原性アイランドを識別するために有益で有り得、なぜならこれは被験体がより多くの試験を必要とすることを示し得るからである。
【0017】
用語「アセンブリ」は、シーケンサーまたは質量分析計によって産生された配列の連続が、最初の配列の連続を再構成する目的で互いに融合され、全ての配列の連続一式が抽出される、任意の計算プロセスで有り得る。いくつかの例では、アセンブリは個々の有機体からである。いくつかの例では、多数の個体がアセンブリを作成するために使用され得る。いくつかの例では、アセンブリは、基準配列を使用することなく、新たに作成される。いくつかの例では、アセンブリは基準配列を用いて作成される。基準配列は同じ種からのゲノムで有り得る。基準ゲノムは、密接に関係した種からのゲノムで有り得る。
【0018】
本明細書で使用される用語「被験体」は、一般に遺伝物質の特定の供給源を指す。被験体は生物学的存在で有り得る。生物学的存在は、例えば、バクテリア、ウイルス、真菌類、および原生動物を含む、植物、動物、あるいは微生物であり得る。被験体は、器官、組織あるいは細胞で有り得る。被験体は、インビボで得られる、あるいはインビトロで培養され得る。被験体は細胞株で有り得る。被験体は培養で繁殖され得る。被験体は疾病細胞で有り得る。被験体は癌細胞で有り得る。被験体は哺乳動物で有り得る。哺乳動物はヒトで有り得る。被験体は、遺伝物質の特定の供給源の個別の代表を意味する場合がある（例えば、被験体は特定の個人あるいは特定の菌株で有り得る）。代替的に、被験体は、遺伝物質の特定の供給源の一種を一般的に代表するもので有りえ、例えば、被験体は単一の種の任意の、そして全ての構成員で有り得る。被験体はさらに、例えばサンプルが完全なゲノムを含んでいない場合、ゲノムの一部で有り得る。
【0019】
「サンプル」あるいは「核酸サンプル」は、核酸を含む、あるいは含んでいると推定される任意の物質を指し得る。サンプルは被験体から得られた生体サンプルで有り得る。核酸は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、例えばゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、合成ＤＮＡなどのＤＮＡ、あるいはＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡで有り得る。核酸サンプル中の核酸は、ハイブリダイズされたプライマーを拡張するためのテンプレートとなり得る。幾つかの場合には、生体サンプルは液状サンプルである。液状サンプルは、例えば全血、血漿、血清、腹水、精液、脳脊髄液、汗、尿、涙、唾液、頬側サンプル、窩洗浄水あるいは器官洗浄水で有り得る。液状サンプルは、本質的に無細胞の液状サンプル（例えば血漿、血清、汗、尿、涙等）で有り得る。その他の場合において、生体サンプルは、例えば糞便、毛、爪、例えば腫瘍生検などの組織生検によって得られた試料等の、固形の生体サンプルで有り得る。サンプルはさらにインビトロ細胞培養成分（限定されないが、細胞培養培地中の細胞の成長によってもたらされる調整培地、組み換え細胞、および細胞構成体を含む）を含み得る。サンプルは、癌細胞を含む、あるいは癌細胞由来で有り得る。サンプルはマイクロバイオームを含み得る。
【0020】
本明細書において使用される「複合サンプル」は、２つ以上の被験体を含む、あるいは２つ以上の被験体からの物質（例えば核酸）を含むサンプルを指す。複合サンプルは、２つ以上の被験体からの遺伝物質を含むことができる。複合サンプルは、２つ以上の被験体からの核酸分子を含むことができる。複合サンプルは、バクテリア、ウイルス、菌類などの２つ以上の株からの核酸を含むことができる。複合サンプルは２つ以上の分解可能な被験体（つまり互いに区別可能な２つ以上の被験体）を含むことができる。場合によっては、複合サンプルは環境から得ることができる。例えば、複合サンプルは、空気サンプル、土または泥のサンプル、あるいは水サンプル（例えば川、湖、海洋、廃水等）で有り得る。環境サンプルは、バクテリア、ウイルス、原生動物、ソウ類、菌類およびその他同種のものの１つ以上の種を含むことができる。
【0021】
「ヌクレオチド」は核酸を形成可能な生体分子で有り得る。ヌクレオチドは、既知のプリンおよびピリミジン塩基だけでなく、修飾された他の複素環式塩基も含む部分を有し得る。そのような修飾は、メチル化されたプリンまたはピリミジン、アシル化されたプリンまたはピリミジン、アルキル化されたリボース、あるいは他の複素環を含む。加えて、用語「ヌクレオチド」は、ハプテン、ビオチン、あるいは蛍光標識を含み、従来型のリボースおよびデオキシリボース糖だけでなく他の糖も同様に含み得る部分を含む。修飾されたヌクレオシドあるいはヌクレオチドは、さらに、糖部分の修飾を含み、例えばそこでは、ヒドロキシル基の１つ以上がハロゲン原子または脂肪族基で取り換えられているか、エーテル、アミン等として官能化される。
【0022】
「ヌクレオチド」はさらにロックド核酸（ＬＮＡ）あるいは架橋された核酸（ＢＮＡ）を含み得る。ＢＮＡとＬＮＡは、２’酸素および４’炭素を結合する架橋で、リボース部分が修飾された修飾リボヌクレオチドを一般的に指す。一般に架橋は、しばしばＡ型二本鎖に見られる３’－ｅｎｄｏ（Ｎｏｒｔｈ）立体構造中のリボースを「ロック」する。用語「ロックド核酸」（ＬＮＡ）は一般に、２’－Ｏ原子を４’－Ｃ原子に結合するメチレン架橋でリボース環が「ロックされる」ＢＮＡのクラスを指す。ＤＮＡとＲＮＡに現われる６つの共通の核酸塩基（Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ａ、ＵおよびｍＣ）を含むＬＮＡヌクレオシドは、標準的なワトソン－クリック型塩基対規則に従って、それらの相補的なヌクレオシドで塩基対を形成することができる。したがって、ＢＮＡおよびＬＮＡヌクレオチドは、望まれればいつでも、オリゴヌクレオチド中のＤＮＡまたはＲＮＡ塩基と混合可能である。ロックドリボース立体構造は塩基の積み重ねと脊椎の事前の組織化を増強する。塩基の積み重ねと脊椎の事前の組織化は、熱的安定性（例えば、増大したＴｍ）および二重螺旋の識別力の増加をもたらすことができる。ＬＮＡは、他の核酸では識別することができない状況下での、単一塩基のミスマッチを識別することができる。
【0023】
用語「ポリヌクレオチド」、「核酸」、「ヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、区別なく使用することができる。それらは、任意の長さのヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのいずれか、またはそのアナログの高分子成形体を指し得る。ポリヌクレオチドは任意の三次元構造を有し得、任意の未知または既知の機能を行い得る。下記はポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子または遺伝子断片のコードあるいは非コード領域、連鎖解析から限定された座（ｌｏｃｉ／ｌｏｃｕｓ）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組み換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の分離したＤＮＡ、任意の配列の分離したＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマー。ポリヌクレオチドは、メチル化されたヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログ等の修飾されたヌクレオチドを含み得る。ヌクレオチド構造に対する修飾が存在する場合、それはポリマーのアセンブリの前または後で与えられ得る。ヌクレオチドの配列は非ヌクレオチド成分によって妨げられ得る。ポリヌクレオチドは、標識要素との結合等によって、重合の後にさらに修飾され得る。
【0024】
「変異体」は、核酸配列（例えば遺伝子）の正常な配列の変質で有り得る。いくつかの例では、遺伝子型とそれに対応する表現型は変異体に関連する。他の例では、変異体の既知の作用はない。変異体はＳＮＰで有り得る。変異体はＳＮＶで有り得る。変異体は複数のヌクレオチドの挿入で有り得る。変異体は複数のヌクレオチドの欠失で有り得る。変異体は突然変異で有り得る。変異体はコピー数多型で有り得る。変異体は構造変異種で有り得る。変異体は、集団中の２つ以上の個体間の核酸偏差で有り得る。
【0025】
本明細書で使用される用語「標的ポリヌクレオチド」あるいは「標的核酸」は、一般に研究対象のポリヌクレオチドを指す。ある場合には、標的ポリヌクレオチドは、研究対象の１つ以上の配列を含む。標的ポリヌクレオチドは、例えばゲノム配列を含むことができる。標的ポリヌクレオチドはその存在、量、および／またはヌクレオチド配列、あるいはこれらにおける変化が判定されることが望まれる、標的配列を含むことができる。標的ポリヌクレオチドは、ゲノムの非コード領域を含むことができる。
【0026】
用語「ゲノム」は、生体の遺伝的相補体を指し得る。そして用語「ゲノムデータ」および「ゲノムデータセット」は、生体の染色体、遺伝子あるいはＤＮＡの配列情報を含む。
【0027】
本明細書において使用される用語「ゲノムデータ」は、以下の１つ以上で有り得るデータを指す：ミトコンドリア、細胞、卵子と精子を含み、組織、新生物、腫瘍、器官、有機体、微生物、ウイルス、個体、あるいは無細胞ＤＮＡの、１つ以上のゲノムまたはエクソーム配列、あるいは１つ以上の任意の組み合わせまたは混合、およびさらに限定されないが、核酸配列情報、遺伝子型情報、遺伝子発現情報、遺伝子データ、ＤＮＡメチル化、アセチル化、あるいは類似のＤＮＡ修飾データを含む後成的情報、ＲＮＡ転写、スプライシング、編集あるいは加工情報、あるいは医療、健康あるいは表現型のデータ、または栄養素、食事あるいは環境の状態、あるいは露出情報、あるいは任意の微生物、ウイルス、細胞、組織、新生物、腫瘍、器官、臓器系、無細胞サンプル（例えば血清または培地）についての他の属性データ、個別あるいはひとかたまりのサンプル、または個体を含む。したがって、本明細書において使用される用語「ゲノムの配列」は、ゲノムに発生する配列を指す。ＲＮＡがゲノムから転写されるため、この用語は、有機体の核ゲノムに存在する配列を含み、そのようなゲノムから転写されたＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）のｃＤＮＡコピーにある配列も同様に含む。「ゲノム配列」はさらに、細胞質上またはミトコンドリア中に発生する配列で有り得る。
【0028】
用語「判定すること（ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ）、「測定すること（ｍｅａｓｕｒｉｎｇ）、「評価すること（ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ）、「検出すること（ａｓｓｅｓｓｉｎｇ）」、「アッセイすること（ａｓｓａｙｉｎｇ）」、及び「分析すること（ａｎａｌｙｚｉｎｇ）」は、測定の任意の形態を指し、本明細書で互換的に使用され得る。およびある要素の存在の有無を判定することを含み得る。このような用語は、定量的及び／又は定質的両方の判定を含み得る。評価は相対的、又は絶対的な場合がある。「～の存在を検出すること」は、存在の有無を判定することと共に、存在するものの量を判定することを含み得る。
【0029】
用語「ゲノム断片」は、本明細書において使用されるように、例えば、ヒト、サル、ラット、魚あるいは昆虫や植物等の、動物または植物のゲノムの、ゲノム領域を指し得る。ゲノム断片はアダプターライゲートされることもあれば、されないこともある。ゲノム断片は、アダプターライゲートされ得る（その場合、少なくとも分子の５’末端に、断片の１つあるいは両方の末端にライゲートされたアダプターを有する）、あるいはアダプター以外でライゲートされることもある。
【0030】
本明細書において使用される用語「バーコード」は、一般的には、アッセイについての情報をコード可能なヌクレオチド配列を指す。幾つかの例では、バーコードは唯一無二である。バーコード配列は、調べられた対立遺伝子の正体、標的ポリヌクレオチドあるいはゲノム遺伝子座の正体、サンプルの正体、被験体、あるいはそれらの任意の組み合わせに関する情報をコードすることができる。バーコード配列は、プライマー、リポータープローブ、あるいはその両方の一部で有り得る。バーコード配列は、オリゴヌクレオチドの５’－末端または３’－末端ありえ、あるいはオリゴヌクレオチドの任意の領域に位置し得る。バーコード配列は、例えば研究下のサンプルに存在しない配列などの、非自然的に発生したもので有り得る。他の例では、自然発生する配列は、バーコードあるいはバーコード配列の一部として使用することができる。いくつかの例では、核酸が結合されている結合点は、バーコードとなり得る。いくつかの例では、配列決定アダプターは、バーコードあるいはバーコードの一部となり得る。いくつかの例では、バーコードは、標的分子、例えば対象のゲノム配列、を超過している。いくつかの例では、バーコードは、ランダムあるいは半ランダムに標的分子に関連付けられる。いくつかの例では、バーコードは、設計によって標的分子に関連付けられている。
【0031】
用語「突然変異」は、本明細書において使用されるように、一般にゲノムのヌクレオチド配列の変更を指す。突然変異は、ＤＮＡの大きな部位を含み得る（例えばコピー数多型）。突然変異は染色体全体を含み得る（例えば異数性）。突然変異は、ＤＮＡの小さな部位を含み得る。ＤＮＡの小さな部位を含む突然変異の例は、例えば、点変異あるいは一塩基多型、多数の一塩基多型、挿入（例えば、座における１つ以上のヌクレオチドの挿入）、多数のヌクレオチドの変更、欠失（例えば、座における１つ以上のヌクレオチドの欠失）、反転（例えば、１つ以上のヌクレオチド配列の反転）を含む。
【0032】
本明細書において使用される用語「遺伝子座」は、遺伝子、ヌクレオチド、あるいは染色体上の配列の位置を指し得る。本明細書において使用される遺伝子座の「対立遺伝子」は、遺伝子座におけるヌクレオチドあるいは配列の代替的な形態を指し得る。「野生型対立遺伝子」は一般的に、被験体集団において最も高い頻度を有する対立遺伝子を指す。「野生型」対立遺伝子は一般的に疾病に関係しない。「変異遺伝子」は一般的に、より低い頻度の「野生型対立遺伝子」を有する対立遺伝子を指し、および疾病に関連付けられ得る。「変異遺伝子」は疾病に関連付けられる必要のないこともある。用語「調べられた対立遺伝子」は、一般的に、アッセイで検知するように設計された対立遺伝子を指す。
【0033】
本明細書において使用される用語「一塩基多型」あるいは「ＳＮＰ」は、ある配列内での単一のヌクレオチドの置換によってもたらされる、一種のゲノム配列変種を一般的に指す。「ＳＮＰ対立遺伝子」あるいは「ＳＮＰの対立遺伝子」は、一般的に特定の座におけるＳＮＰの代替的な形態を指す。用語「調べられたＳＮＰ対立遺伝子」は、一般的に、アッセイで検知するように設計されたＳＮＰ対立遺伝子を指す。
【0034】
本明細書は、サンプル中の１つ以上の被験体を識別する、あるいは被験体についての重要な特徴、例えば、病原性、毒性、あるいは抗生物質耐性などを識別する能力を有する、新規性のあるバイオチップのための方法およびシステムを開示する。バイオチップは、被験体に特異的な１つ以上の特徴を含む複数のプローブを含むことができる。本明細書において使用される用語「被験体に特異的な特徴」は、ある被験体を他から区別および識別可能な複数のプローブを指す。本発明のいくつかの態様では、被験体に特異的な特徴は、複合サンプル中にある被験体を識別するために利用することができる。複合サンプルは、１つより多くの被験体（すなわち、２つ以上の被験体）からの物質を含む、生物学的あるいは他の任意のサンプルでありうる。場合によっては、被験体は、ウイルス、細菌、原生動物、真菌、およびその他同種のもの等の有機体である。その他の場合において、被験体はそれら由来の組織、器官あるいは細胞である。組織、器官あるいは細胞は、ヒトなどの動物に由来する場合がある。複合サンプルは複数の細胞型を含むことができる。場合によっては、複合サンプルは、腫瘍生検などの組織生検によって得られた試料を含むことができる。いくつかの例においては、複合サンプルは、微生物の２つ以上の株（例えば、バクテリア、ウイルス、真菌など）を含む。他の例においては、複合サンプルは、２つ以上の微生物の種を含む。場合によっては、複合サンプルは、２つ以上の被験体からの核酸などの物質を含む。被験体に特異的な特徴は、複合サンプル中にある１つ以上の被験体の正体を判定するために使用することができる。本明細書における方法とシステムは、任意の１つのタイプの複合サンプルに限定されない。重要な態様は、複合サンプルが少なくとも１つの区別可能な特徴をもつ複数の被験体を含むということである。
【0035】
複合サンプルは核酸の混合物を含み得る。核酸は１つを超える被験体に由来する場合がある。核酸のサンプルを生成するどんな方法も本開示によって許容可能である。場合によっては、生体細胞を含む複合サンプルが得られ、生体細胞をその後、溶解させて細胞から核酸を放出する。核酸を物理的な方法でも生体細胞から放出することができる。他の場合では、無細胞の核酸が得られる。無細胞の核酸は、ヒトまたは動物から、例えば、血液から得ることができる。無細胞の核酸は環境からも得ることができ、例えば、核酸は有機体から環境へと放出される。無細胞の核酸は、例えば、ウイルスのカプシド、あるいは胞子内に含まれる病原体に由来する場合がある。
【0036】
複合サンプル内の核酸は標的核酸配列を含むことができる。標的核酸配列は１つの被験体を別の被験体と区別する核酸配列であり得る。例えば、標的核酸配列は、被験体Ｂで見られない被験体Ａの複数のゲノムの配列であり得る。こうした標的核酸配列は、被験体Ａと被験体Ｂを含む複合サンプル中で被験体Ａの存在を特定するために利用できる。同様に、標的核酸配列は、被験体Ａで見られない被験体Ｂの複数のゲノムの配列であり得る。こうした標的核酸配列は、被験体Ａと被験体Ｂを含む複合サンプル中で被験体Ｂの存在を特定するために利用できる。場合によっては、バイオチップは、被験体Ａを被験体Ｂと識別することができる（つまり、単に被験体Ａを認識するプローブを有する）か、あるいは被験体Ｂを被験体Ａと識別することができる（つまり、単に被験体Ｂを認識するプローブを有する）か、あるいは被験体Ａと被験体Ｂの両方を識別することができる（つまり、被験体Ａを認識するプローブと被験体Ｂを認識するプローブを有する）。
【0037】
場合によっては、本明細書の方法とシステムは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１００００、あるいは１００００を超える被験体を区別することができる。場合によっては、バイオチップは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１００００、あるいは１００００を超える被験体に特異的な特徴を含む。場合によっては、本明細書の方法とシステムは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１００００、あるいは１００００を超える被験体を区別することができる。場合によっては、バイオチップは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１００００、あるいは１００００を超える被験体に特異的な特徴を含む。
【0038】
標的核酸配列は、複合サンプル内に含まれる核酸上に存在する１つ以上の核酸配列であり得る。標的配列は、サンプル内のその遺伝的補体に結合する（例えば、化学的に結合する）ように設計可能である。１つ以上の核酸配列は１つの他の核酸配列とは区別可能であり、それによって、サンプル内の核酸の起原を解決する能力を与える。例えば、複合サンプルは２つを超える被験体を含み得る。個々の被験体はそれぞれ核酸を含むことがあり、したがって、複合サンプルは個々の被験体からの核酸を含むことがある。場合によっては、本明細書の方法とシステムは、サンプル中に存在する個々の被験体を特定するために使用される。例えば、被験体Ａと被験体Ｂを含むサンプルを例に取る。サンプルは、被験体Ａと被験体Ｂの両方に由来する核酸を含み得る。核酸は、被験体Ａと被験体Ｂを、あるいはその逆を区別する少なくとも１つの標的核酸配列を含み得る。本明細書の方法とシステムは少なくとも１つの標的核酸配列を特定するために使用可能である。この情報は複合サンプルが被験体Ａと被験体Ｂの両方を含んでいたと断定するために使用可能である。
【0039】
標的核酸
標的核酸配列は、１つの被験体を別の被験体と識別するか、あるいは抗生物質耐性または病原性などの標的の属性を区別するあらゆる核酸配列であり得る。場合によっては、複合サンプル中に存在する１つを超える被験体は、実質的に同一であり、かつ標準的なマイクロアレイ技術を駆使しても解決するのが難しいこともあるゲノムを有する。場合によっては、１つを超える被験体は、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、９９．９９％、９９．９９９％同一であるゲノムを有する。場合によっては、１つを超える被験体は、微生物の１つ以上の異なる菌株、例えば、細菌、ウイルス、真菌などの１つ以上の菌株である。
標的核酸配列は、１つの被験体を別の被験体と識別するか、あるいは抗生物質耐性または病原性などの標的の属性を区別するあらゆる核酸配列であり得る。場合によっては、複合サンプル中に存在する１つを超える被験体は、実質的に同一であり、かつ標準的なマイクロアレイ技術を駆使しても解決するのが難しいこともあるゲノムを有する。場合によっては、１つを超える被験体は、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、９９．９９％、９９．９９９％同一であるゲノムを有する。場合によっては、１つを超える被験体は、微生物の１つ以上の異なる菌株、例えば、細菌、ウイルス、真菌などの１つ以上の菌株である。
【0040】
標的核酸配列は１つを超える遺伝的特徴を含み得る。１つを超える遺伝的特徴は、１つの被験体を別の被験体と区別することができる。遺伝的特徴は、ゲノム、遺伝子型、ハプロタイプ、染色質、染色体、染色体座、染色体材料、対立遺伝子、遺伝子、遺伝子群、遺伝子座、遺伝的多型、遺伝子突然変異、一塩基多型（ＳＮＰ）、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）、可変タンデムリピート（ＶＴＲ）、コピー数多型（ＣＮＶ）、マイクロサテライト配列、遺伝子マーカー、配列マーカー、配列でタグ付けされた部位（ＳＴＳ）、プラスミド、転写単位、転写生成物、遺伝子発現レベル、遺伝子発現状態を含み得る。標的核酸配列は任意の既知の遺伝的特徴も本質的に含むことができる。
【0041】
標的核酸はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）あるいはリボ核酸（ＲＮＡ）を含み得る。ＤＮＡはゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡであり得る。ｃＤＮＡは当該技術分野の当業者に知られているようなＲＮＡの逆転写によって生成可能である。標的核酸は一本鎖または二本鎖であり得る。場合によっては、標的核酸は修飾可能である。核酸修飾は当該技術分野で知られているものを含むことがあり、標的核酸は本質的にどんな修飾も含み得る。有用な修飾は、限定されないが、ビオチンまたはジゴキシゲニンのようなアンカーリガンドと同様に、放射標識と蛍光標識を含む。修飾は標的の内部に、あるいは５’または３’のいずれかの末端に置くことができる。標的修飾は、ライゲーションあるいはポリメラーゼによる伸長などの化学反応または酵素反応のいずれかによって、合成後に行うことができる。
【0042】
標的核酸の長さは変わることがある。標的核酸は、数十から数百、または数千もの塩基対、あるいは数万または数十万の塩基対のサイズで変動し得る。いくつかの例において、標的核酸は、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、８５００、９０００、９５００、あるいは１００００以上の塩基対の長さである。いくつかの例において、標的核酸は、少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、８５００、９０００、９５００、あるいは１００００以上の塩基対の長さである。いくつかの例において、標的核酸は、せいぜい約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、８５００ ９０００、９５００、あるいは１００００の塩基対長さである。
【0043】
バイオチップへの適用の前に、標的核酸は任意の数のサンプル調製工程を経験することがある。こうした工程は、当業者に知られている任意の数の断片化、増幅、修飾、あるいは調製の工程を含み得る。
【0044】
標的核酸は化学溶解、超音波処理、均質化などを含む任意の技術によって生体サンプルから放出可能である。標的核酸は、さらなる処理工程の前に、当該技術分野で知られている（例えば、細胞残屑、汚染物質、あるいは他の材料を除去するために）任意の数の精製工程を経験することがある。
【0045】
場合によっては、標的核酸は、バイオチップへの適用前に標識可能である。場合によっては、標的核酸はバイオチップへの適用後に標識可能である。標的核酸は多重標識で標識可能である。核酸ラベルは核酸の検出を可能にする任意のタグであり得る。放射標識、フルオロフォア、染料、ビオチン、酵素（例えば、ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリフォスファターゼ（ＡＰ）などを含む任意の数の標識を用いることができる。標的核酸は５’末端、３’末端、あるいはその両方で標識可能である。場合によっては、標的核酸に身体標識される。末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼなどの酵素的技術；あるいは、過ヨウ素酸酸化、５’リン酸塩の１－エチル－３－［３－ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）活性化、あるいは化学的な無作為標識（例えば、光反応性標識システム、Ｋｒｅａｔｅｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓから市販されているＵｎｉｖｅｒｓａｌ Ｌｉｎｋａｇｅ Ｓｙｓｔｅｍ）などの化学的技術を含む、核酸を標識する任意の方法が使用可能である。場合によっては、いかなる標識も必要とされず、標的の結合は、陽子の放出、表面上の化学組成の変化、光路の屈折率の変化、あるいは、ハイブリダイゼーション事象の直接的な電気的な検出を介して検知可能である。
【0046】
標的核酸は染料またはステインで標識可能である。核酸を標識するのに適切な染料は当該技術分野で知られているものを含み得る。染料は蛍光染料であり得る。場合によっては、緩衝液はＣｙ３である。場合によっては、緩衝液はＣｙ５である。
【0047】
標的核酸は５’末端、３’末端で標識可能であるか、あるいは身体標識可能である。どの方法を使用するべきかに関する決定は、必要とされる標識化の程度と、標識が立体障害を引き起こしてプローブとの相互作用を防ぐことがあり得るかに部分的に依存することがある。
【0048】
場合によっては、核酸標識は核酸分子の全体にわたって無作為に組込まれる（つまり、身体標識される）。様々な方法を用いて標的核酸に身体標識することができる。身体標識プロトコルは、標識されたヌクレオチドを標的核酸に組み込むための酵素の使用を含み得る。場合によっては、身体標識された核酸は標準的なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）方法で生成される。この方法は２つの目的に役立つことができる：１）成長している核酸鎖へ標識されたヌクレオチドを無作為に取り込むこと；２）鋳型核酸を増幅させること。この方法は、標的に特異的なプライマーまたは無作為のプライマーの使用を含み得る。場合によっては、標的核酸はバイオチップへの適用前にＰＣＲによって増幅される。
【0049】
場合によっては、標識されたヌクレオチドは無作為のプライマー伸長によって無作為に組み込まれる。この例において、複数の無作為のプライマー（例えば、ヘキサヌクレオチド）を用いて、一本鎖ＤＮＡ鋳型上で第１のＤＮＡ合成を無作為に刺激する。標識されたヌクレオチドのＤＮＡ合成と無作為な取り込みは、ＤＮＡポリメラーゼＩあるいはＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片の使用を含み得る。場合によっては、標識は、例えば、二本鎖ＤＮＡ標識プロトコルを使用することにより、標的核酸のプローブへのハイブリダイゼーションの後に生じることがある。
【0050】
他の場合では、標識されたヌクレオチドはローリングサークル増幅によって無作為に組み込まれる。この方法は、標的核酸分子が環状である（例えば、プラスミド、バクテリオファージの環状ゲノム、ウイロイドの環状ＲＮＡゲノムなど）ときに、とりわけ良く適していることがある。ローリングサークル増幅では、ニックは、不連続鎖と連続鎖を形成する環状の核酸分子の一本鎖で生成される。環状のベクターの連続的な鎖は等温の増幅反応を用いて増幅される。場合によっては、ローリングサークル増幅は、高い鎖置換活性を呈するΦ２９ＤＮＡポリメラーゼを使用する。
【0051】
場合によっては、標的核酸はバイオチップへのハイブリダイゼーション前には増幅されない。
【0052】
場合によっては、標的核酸はバイオチップへの適用前にせん断されるか、または断片化される。せん断方法は当該技術分野で知られており、超音波処理、針せん断、フレンチプレッシャーセル（Ｆｒｅｎｃｈ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｃｅｌｌ）の通過、ポイント－シンク（ｐｏｉｎｔ－ｓｉｎｋ）せん断、音響せん断、制限消化、断片化酵素、あるいはトランスポソーム媒介性の断片化を含み得る。場合によっては、標的核酸はせん断または断片化の前に標識される。この方法は、標識法が例えば、ローリングサークル増幅を含無場合、適切となることがある。他の場合では、標的核酸のせん断は標識の前に生じる。
【0053】
トランスポソームを媒介とする断片化を利用して、同時に、断片を生成し、かつ検出のためにその断片を標識することができる。トランスポサーゼ（Ｔｎ５など）は、合成ＤＮＡ配列を切断して、これを他のＤＮＡ分子の５’末端へ共有結合することができる。例えば、５’標識されたフルオロフォアを合成ＤＮＡに結合することにより、ＤＮＡを同時に断片化して標識することが可能である。変性後のこの断片化および標識された（例えば、蛍光標識された）ＤＮＡは、アレイへのハイブリダイゼーションの準備を整わせることができる。例えば、図６は、標識（６０３）（例えば、蛍光標識）を伴うオリゴヌクレオチドを含むトランスポソーム複合体（６０２）と相互作用する二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）（６０１）の典型的な概略図を示す。インキュベーション（６０４）の後、標識（６０５）を備えた断片化したｄｓＤＮＡは、トランスポソーム複合体によって生成される。その後、変性（６０６）を用いて、ハイブリダイゼーション用の標識された一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）（６０７）を生成することができる。トランスポソーム媒介性の断片化を利用して、標識とトランスポソームからの合成ＤＮＡの小片も含有する、二本鎖または一本鎖（例えば、変性後）の断片化したＤＮＡを生成することができる。こうした技術は、２工程プロセスの断片化と標識と比較して、収率と効率を増加させることができる。
【0054】
核酸などのサンプル材料は濃縮および／または精製可能である。このことはサンプル材料の解析を助けることがある。例えば、核酸を通過させないが、イオン、タンパク質、および他の細胞残屑を通過させる膜（例えば、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）セルロース紙などの分子量遮断膜（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｃｕｔｏｆｆ ｍｅｍｂｒａｎｅ））を用いて、核酸を濃縮することができる。この膜上でオリゴヌクレオチド捕捉アレイをスポットして固定することで、捕捉プローブの近くの標的の濃度を増加させて標的を捕捉プローブに持ち込み、アレイへのハイブリダイゼーションを加速させることができる。電場または流量の方向は一時的に反対にするか、あるいはパルス化することで、表面に平行な面の流れを助長して、ハイブリダイゼーション率を改善し、ハイブリダイゼーション時間を短くすることができる。例えば、図８は、フィルター基質（８０１）上のオリゴヌクレオチドアレイに近づけたサンプルＤＮＡ（８００）の例を示す。電場が適用されるとき（負（８０２）正（８０３））、サンプルＤＮＡは電気泳動にさらされ、アレイに集まる。代替的に、電流を（例えば、単純な分子量遮断フィルター膜を用いて）簡単に逆にすると、核酸を膜から溶液へ移動させることができ、これを用いて、例えば、シリカ、プラスチック、ガラス、あるいは別の基質上に固定されたアレイにハイブリダイズすることができる。電気泳動運動の代わりに、あるいは電気泳動運動に加えて、膜に対して核酸を移動させるために流量を適用することにより濃縮を行うこともできる。
【0055】
酸化的損傷の遊離ラジカルあるいは他の供給源の核酸への濃縮が減少するように、電極（例えば、図８の（８０２）と（８０３））を互いに一定の間隔で配置することができる。この種の設計は、核酸が、例えば濃縮工程の間に経験する酸化的損傷の量を減らすことができる。
【0056】
拡散に加えて様々な手段によって、核酸をバイオチップあるいは他のアレイ表面に近接させることができる。上に議論されるように、電気泳動および／または流量を用いて、アレイ表面あるいはアレイ表面の近くに核酸を濃縮することができる。他の手法も使用できる。例えば、アレイ表面は、その表面の全体または一部にわたって（例えばプローブ特徴における）疎水性の界面化学を備えることができ、標的核酸は疎水性の部分でタグ付けされ、核酸は表面の疎水性領域をエネルギー的に優先するようになる。別の例において、標的核酸は磁粉でタグ付け可能であり、磁場を用いてアレイ表面へ標的核酸を近づけることができる。
【0057】
体積排除（Ｖｏｌｕｍｅ－ｅｘｃｌｕｄｉｎｇ）化合物を用いても、サンプルＤＮＡなどのサンプル材料を有効に濃縮することができる。体積排除剤（ｖｏｌｕｍｅ ｅｘｃｌｕｄｅｒ）は、占有された液体体積からサンプル材料を除外するために使用可能であり、それによって、残りの液体体積にサンプル材料を濃縮することができる。このメカニズムは、基質に対するサンプル核酸のハイブリダイゼーションなどのサンプル材料の捕捉あるいは結合を加速するのを助けることがきる。例えば、体積排除剤はハイブリダイゼーション動力学を改善するためにハイブリダイゼーション緩衝剤に含めることができる。体積排除剤は、限定されないが、デキストラン硫酸塩、フィコール、およびポリエチレングリコールを含む、例えば、ビーズまたはポリマーであり得る。体積排除剤は高分子量ポリマーであり得る。体積排除剤は、例えば、核酸の体積排除剤への結合を減らすために負に帯電させることができる。
【0058】
プローブ
本明細書で開示されたバイオチップは、表面に分布する複数のプローブを有する。場合によっては、複数のプローブはバイオチップの表面に固定される。場合によっては、表面は固形物である。他の場合では、表面は半固形物である。場合によっては、表面はガラスまたはシリコンである。複数のプローブは界面化学を用いて表面へ固定可能である。
本明細書で開示されたバイオチップは、表面に分布する複数のプローブを有する。場合によっては、複数のプローブはバイオチップの表面に固定される。場合によっては、表面は固形物である。他の場合では、表面は半固形物である。場合によっては、表面はガラスまたはシリコンである。複数のプローブは界面化学を用いて表面へ固定可能である。
【0059】
１つの非限定的な例において、複数のプローブは、１－エチル－３－［３－ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）化学を用いて、バイオチップの表面へ固定される。この方法では、バイオチップ上のカルボキシル基はＥＤＣで活性化される。活性化されたカルボキシル基は第一級アミン基と反応して、安定したアミド結合を形成することができる。この例において、バイオチップはビーズ、場合によっては、シリカあるいはガラスビーズであり得る。複数のプローブは、５’あるいは３’の末端でアミノ修飾される。アミノ修飾の非限定的な例としては、５’－アミノアリル－ｄＵＴＰ、５－プロパルギルアミノ－ｄＣＴＰ、Ｎ６－６－アミノヘキシル－ｄＡＴＰ、および７－Ｄｅａｚａ－７－プロパルギルアミノ－ｄＡＴＰを含む１つ以上のアミノ修飾されたヌクレオチドが挙げられる。プローブは、この方法を使用して、５’または３’末端のいずれかでバイオチップに固定可能である。場合によっては、２工程方法が利用される：１）ＥＤＣによる活性化と、その後の、２）効率を改善するか、あるいは乾燥して安定している（アミン反応性）中間体を作製するための、Ｎ－ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）による処置。いくつかの例では、２工程のＥＤＣ処置は固定効率を改善するために使用される。この例において、ＥＤＣの第１の濃度をバイオチップに適用可能であり、その後に、ＥＤＣの後の第２の濃度を適用可能である。場合によっては、ＥＤＣの第１の濃度はＥＤＣの第２の濃度よりも低い。場合によっては、この２工程のＥＤＣ処置はプローブ固定の効率を改善する。
【0060】
バイオチップは複数のプローブを含みうる。複数のプローブは、バイオチップの表面上に分布されうる。バイオチップは、単一の固体として物理的に結合される必要のない複数の表面を含みうる。プローブを含む表面は例えばビーズまたは一連のビーズでありうる。ビーズは同一でありうる。ビーズはマイクロビーズでありうる。ビーズは個別に溶解可能でありうる。ビーズはビーズに特異的なバーコードを含みうる。ビーズはビーズに特異的な標識を含みうる。ビーズはビーズに特異的な結合部位を含みうる。
【0061】
マイクロアレイの活性領域またはハイブリダイゼーション領域を縮小することにより、マイクロアレイの経済問題、および必要とされるハイブリダイゼーション時間を改善することができる。この場合、小さなマイクロアレイを製作することでコストを省き、かつそのより小さな活性領域によって、より濃縮されたサンプルを使用できるようになり、ハイブリダイゼーション活性を促進せるだろう。
【0062】
プローブは、核酸サンプル中に存在する標的配列を持つワトソン－クリック型塩基対の形成を可能とするオリゴヌクレオチドでありうる。プローブの長さは変動しうる。いくつかの例では、遺伝的特徴内のプローブは、長さが２０％、１０％、５％、または１％未満変動する。いくつかの例では、プローブは同じ長さである。プローブは、数十から数百もしくは数千の塩基対、または、数万または数十万の塩基対のサイズにさえ変動しうる。場合によっては、プローブは、約２０塩基長、約２５塩基長、約３０塩基長、約３５塩基長、約４０塩基長、約４５塩基長、約５０塩基長、約５５塩基長、約６０塩基長、約６５塩基長、約７０塩基長、約７５塩基長、約８０塩基長、約８５塩基長、約９０塩基長、約９５塩基長、約１００塩基長、約１１０塩基長、約１２０塩基長、約１３０塩基長、約１４０塩基長、約１５０塩基長、約２００塩基長、約２５０塩基長、約３００塩基長、約３５０塩基長、約４００塩基長、約４５０塩基長、約５００塩基長、約６００塩基長、約７００塩基長、約８００塩基長、約９００塩基長、約１０００塩基長、または１０００塩基長以上である。
【0063】
プローブは、バイオチップの表面上に、かつ被験体に特異的な特徴へと分布しうる。被験体に特異的な特徴は複数のプローブを含みうる。いくつかの例では、被験体に特異的な特徴は、１０、１００、１，０００、１０，０００、または１００，０００を超える個々のプローブを含む。被験体に特異的な特徴は複数の同一のプローブを含みうる。他の例では、被験体に特異的な特徴は複数のプールされた同一でないプローブを含みうる。同一でないプローブは、様々な領域における標的核酸に結合しうる。プローブは非重複領域における標的に結合しうる。場合によっては、同一でないプローブは重複配列を有する。被験体に特異的な特徴は少なくとも１０、１００、１，０００、１０，０００、または１００，０００以上の同一でないプローブを含みうる。いくつかの例では、バイオチップは１０、１００、１，０００、１０，０００、１００，０００、１，０００，０００、１０，０００，０００、１００，０００，０００、または１，０００，０００，０００を超える個々の被験体に特異的な特徴を含む。
【0064】
被験体に特異的な特徴は、分離したスポットまたはクラスタなどの中に、個々に対処可能（例えば、検知のために個々に対処可能）であるように、そのような方法でバイオチップ上に分布されうる。被験体に特異的な特徴に対応する複数のプローブは、プローブの１つ以上のセットへと配置されうる。プローブの各セット内では、複数のプローブは同一である可能性があり、または互いとは異なる可能性もある。各セット内では、複数のプローブはそれぞれ被験体に特異的な特徴を含みうる。各セット内の複数のプローブは、別のものから１つの被験体を判別する１つ以上の被験体に特異的な特徴を含みうる。場合によっては、被験体に特異的な特徴は、円形、正方形、または長方形の領域などのアレイ上のスポットまたは領域でありうる。場合によっては、被験体に特異的な特徴はビーズでありうる。場合によっては、被験体に特異的な特徴は特徴特異的タグによって標識された一連のプローブでありうる。特徴特異的タグは、例えば、特徴特異的バーコード、または特徴特異的標識のための結合部位でありうる。いくつかの例では、特徴は複製特徴を有する。いくつかの例では、複製特徴は同一である。いくつかの例では、複製特徴は、同じ標的ポリヌクレオチドを特定するように設計される。いくつかの例では、複製特徴は、同じゲノムを特定するように設計される。いくつかの例では、複製特徴は、種内のいかなる株も特定するように設計される。場合によっては、複製特徴は、個体を特定するように設計される。
【0065】
図１のＡ－Ｆは、典型的なバイオチップシステムを例示する。図１のＡは、同一のプローブを含む各特徴を有する４つの典型的な特徴、およびサンプル中の単一の被験体からの４つの未結合の標識化された標的を図示する。したがって、プローブに対して標的を結合することにより、各特徴からの１単位のシグナルを結果としてもたらすだろう。図１のＢは、サンプル中の単一の被験体からの４つのプローブおよび４つの未結合の標識化標的を備えた、被験体に特異的な特徴を図示する。したがって、プローブに対して標的を結合させることにより、結果として１つの特徴から４単位のシグナルをもたらすだろう。図１のＣは、各特徴からの１単位のシグナルを結果としてもたらす、４つの異なる特徴に結合されている４つの標的を図示する。図１のＤは、１つの特徴からの４単位のシグナルを結果としてもたらす、単一の被験体に特異的な特徴に結合されている４つの標的を図示する。図１のＣと図１のＤとの比較は、多数の被験体標的を対象とする複数の異なるプローブを使用するときに単一の特徴に存在しうるシグナル増幅を実証する。図１のＥは、図１のＡおよび図１のＣにおいて示されるもののようなアレイ性能を結果として生じる、別個の特徴における固有のプローブの順序付けられたプールによる特徴を図示する。図１のＦは、図１のＢおよび図１のＤにおいて示されるもののような配置を結果として生じる、特徴中の固有のプローブをランダムにプールする特徴を図示する。
【0066】
プローブセットまたは被験体に特異的な特徴内の多数の固有のプローブは、検出システムの解像度よりも小さい、または同等の大きさの領域内に位置しうる。多数の、固有な、順序付けられたプローブによって囲まれた領域は、検出システムの解像度よりも小さくなりうる、もしくは検出システムの解像度と同等になりうる、または全ての固有のプローブによって囲まれた領域は、セット中のランダムに順序付けられた固有のプローブの少なくとも２つによって囲まれた領域が検出システムの解像度とほぼ同等である、もしくはそれ未満である限り、より大きくなりうる。この場合、多数の固有のプローブまたは特徴からのシグナルは、１または少数のピクセル、または他の解像度要素において収集されるか統合されうる。このような取り組みは、単一の特徴へとプールする同一でないプローブに類似した結果を達成することができる。
【0067】
参考のために、マイクロアレイ光学的検出で使用される画像化システムは、ピクセルまたは解像度要素当たり、１マイクロメーター（μｍ）から５μｍの解像度を有しうる。典型的には、直径または長さが５μｍである光学的に検出されたマイクロアレイ特徴は、１μｍから５μｍの光学的解像度が可能な光学システムを用いて画像化されるだろう。別の例は、ビーズの中心から中心までの間隔が２μｍ離れた１μｍ径のビーズで構成されるマイクロアレイであるだろう。このアレイは、０．５μｍから１μｍの解像度光学システムをもちいて画像化されてもよい。
【0068】
一実施例では、個々の固有のプローブ（例えばＤＮＡ断片）はプローブセットとして基板に堆積させる前にプールされ、個々の固有のプローブは、固有のプローブとの間の平均距離、例えばプローブ中心からプローブ中心まで１０ナノメートル（ｎｍ）から数１０ｎｍ程度で基板に対して付着しうる。このプローブセットを含む単一の特徴の大きさは、例えば直径が約１μｍ、２μｍ、３μｍ、４μｍまたは５μｍでありうる。その後、例えば約１μｍの解像力を持つ画像化システムは、１ピクセルもしくは最大２５ピクセル、または他の解像度要素内の多数の個々のプローブからのシグナルを収集する、または統合することができる。
【0069】
いくつかの設計では、特徴は情報を含まない特徴との間に間隔を開けて配置されるか、またはその特徴はシグナルがない特徴との間にいかなる領域もないように、特徴の市松模様などの境界に接触して順序付けられうる。例えば、他の特徴に直接隣接して配置される５μｍ正方形の特徴の場合には、特徴を区別するために１μｍまたは２μｍの解像度が必要とされることもある。一方、５μｍのビーズが、他の５μｍのビーズとともに、中心から中心までの距離が１５μｍの間隔で配置された場合、その後、５μｍ、または場合によっては１０μｍの解像度の画像化システムが、マイクロアレイ上の異なる特徴とシグナルとを区別するのに適切でありうる。
【0070】
別の例では、多数の同一のプローブは、画像化システムの解像度よりも小さな大きさの第１の特徴において共にグループ化され、そしてこの特徴は、特徴内のプローブが同一であるが、第１の特徴中のプローブとは異なる、同じ被験体を標的とする他の特徴に隣接して位置決めされる。全てのプローブが検出システムの解像力によって画定されたおおよその領域以下の領域内において囲まれる場合、その後、検出器は、すべてのプローブからのシグナルを、単一のピクセルまたは解像度要素へと統合することができる。画像化システムの解像度近くまたはそれ未満の大きさの領域中の同一のプローブ型の群をプールすることによって、プローブのランダムにプールされたセットと同じ恩恵を受けることができる。
【0071】
バイオチップは多数の被験体に特異的な特徴を含みうる。いくつかの例では、バイオチップは１０、１００、１，０００、１０，０００、または１００，０００を超える被験体に特異的な特徴を含む。場合によっては、多数の被験体に特異的な特徴はプローブの多数のセットへと配置され、ここでプローブの各セットは異なる被験体を識別する。
【0072】
プローブは標的を結合することができる可能性がある。プローブは標的に相補的になりうる。プローブは標的に対する親和性を有しうる。プローブは３つ全ての組み合わせでありうる。異なる被験体において対象とされた特徴は異なるプローブを含みうる。いくつかの例では、非複製特徴は別の特徴を備えるプローブも共有しない。いくつかの例では、非複製特徴は、別の特徴を備える０．１％、１％、５％、または１０％未満のそのプローブを共有する。
【0073】
場合によっては、プローブの各セットは、固有のプローブ型の平均的な表現を有する。場合によっては、固有のプローブ型の平均的な表現は、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００またはそれ以上である。
【0074】
セット内のプローブ断片の総数、およびセット内の単一で固有のプローブ型の平均的な表現は、プローブセットの特異性およびプローブセットのダイナミックレンジを制御するために制御されうる。一実施例では、プローブの総数がおよそ１０００に限定され、かつセット中の固有のプローブ型の数が２５０である場合、そのとき、個々のプローブ型の平均的な表現は約４であろう。第１の例では、４つの被験体細胞のＤＮＡがサンプル内に存在し、４つの被験体細胞からのゲノムＤＮＡの約９０％がサンプル調製プロセス後にサンプル内にとどまり、実質的にアレイに結合する場合、シグナル強度は最大強度の約９５％になるだろう。同様に、２つの被験体細胞からのＤＮＡが存在し、処理され、９５％の効率でハイブリダイズされた場合、シグナル強度は最大強度の約５０％でありうる。第２の例では、被験体細胞がサンプル中に存在しないが、しかしながら、非被験体有機体が１０００を超える細胞のサンプル中に非常に豊富であり、非被験体有機体からのＤＮＡは単一のプローブ型とマッチする単一の領域を含む場合、単一のマッチしたプローブ型から生成されたシグナルは、平均して最大シグナルの約１％未満である。
【0075】
これに対して、上記の同じ２つの例を考慮すると、固有で個々のプローブ型の数が１０にセットされ、プローブ断片の総数が１０，０００である場合は、平均プローブ表現は約１０００だろう。このシナリオでは、上記例Ａを考慮すると、シグナル強度は最大シグナルの１％未満となり、場合によっては偽陰性判定を結果としてもたらすだろう。同じシナリオであるが、上記例Ｂを考慮すると、シグナル強度は最大シグナルの約１０％未満となり、起こりうる偽陽性判定を結果としてもたらすだろう。検出されうる標的細胞の観点からの検出の下限は、その後システムの特異性、すなわちセット内のプローブの１つ以上における結合エラーが原因である偽陽性コールを拒否する能力を増加させるように折衷されうる。
【0076】
いくつかの態様では、被験体に特異的な特徴中のプローブの総数は制御される。被験体に特異的な特徴中のプローブの総数を制御する方法は、限定されることなく、合計特徴サイズを制御する工程と、被験体に特異的な特徴内の個々のプローブ間隔を制御制御する工程と、を含む。
【0077】
いくつかの態様では、プローブは、偽陽性を検出するように設計されうる。例えば、プローブは、プローブセットを設計することにより設計することができ、ここで、プローブセット内の個々のプローブは、他のプローブセット中の個々のプローブにミスマッチされた１つ以上の塩基を考慮して設計されている。場合によっては、プローブセットは相補的である。その他の場合において、プローブセットは相補的ではない。別の例では、プローブセットは、多数の類似した株を有する被験体有機体を探すように設計されうる。この例において、標的でないが、１つ以上の個々の固有の特性を備えた標的のゲノムに非常に近いゲノムを有する株内に含まれる個々の配列を検出するために、プローブセットが添加されうる。
【0078】
プローブセットの設計は、起こり得る偽陽性の挙動についてより多く学ぶために、経験的スクリーニング工程も含みうる。この工程は、自然界で発見されうる、かつハイブリダイゼーション活性において含まれる非被験体材料の一部でありうる、様々な型のゲノムＤＮＡに対する対照を添加する工程に基づきうる。これらのプローブセットは、別個にまたはセットとしてスクリーニングされうる。
【0079】
バイオチップ上の特徴（例えばアレイスポット）は、それぞれ異なることもあり、限定されることなく、異なる数のプローブ、異なる型のプローブ、異なる被験体に特異的な特徴、固有のプローブの異なる平均的な表現、などを含む。非限定的な一実施例では、バイオチップは多数の被験体に特異的な特徴のアレイを含みうる。各被験体に特異的な特徴は、プローブのセットを含むことができ、各セットが複数の固有のプローブを含む。いくつかの特徴（またはスポット）では、プローブのセットは、アレイの感度を測定するために使用することができる、標的被験体のための固有のプローブの低い平均的な表現を含みうる。同じアレイ上の他の特徴では、プローブのセットは、サンプル中の標的核酸の存在量を測定するために使用することができる、同じ標的被験体のための固有のプローブの高い平均的な表現を含みうる。特徴の感度および／または存在量の任意の数は、バイオチップ上で設計されうる。
【0080】
そのバイオチップをもちいて、（例えば２つの異なるマイクロバイオームのサンプルからの）異なるソースのハイブリダイゼーション強度を連続的に比較するために、多数の調査実験をすることができる。例えば、バイオチップは多数の連続的なハイブリダイゼーション反応、および随意に多数の読み取り反応（ｒｅａｄ ｒｅａｃｔｉｏｎ）を受けることができ、各反応は、異なるプローブセットの特性に対して最適化されている。
【0081】
プローブは、ポリヌクレオチド（または標的）を標的とするようにハイブリダイズするために、設計されうる。標的ポリヌクレオチドはゲノム配列でありうる。標的ポリヌクレオチドはゲノムの非コード領域でありうる。標的はゲノム特徴でありうる。標的はミトコンドリアＤＮＡでありうる。標的はプラスミドからのＤＮＡでありうる。標的は変異体でありうる。標的は、ゲノムの保存領域、または病原性に関連する領域でありうる。
【0082】
標的は、別のゲノムからの判別可能なゲノムの領域でありうる。標的は、被験体の集団内の被験体に特有のポリヌクレオチドでありうる。標的は、そのマイクロバイオーム内に表現された特定の種とは別個の、マイクロバイオーム内のポリヌクレオチドでありうる。
【0083】
プローブ設計のための典型的なプロトコルは以下のとおりである。第一に、長さ基準（例えば３５塩基）をプローブセットに対して選択する。第二に、選択された長さのｋ－ｍｅｒのセットは、被験体のゲノムを通って連続して進むことにより、標的ゲノムから作り出される。第三に、ｋ－ｍｅｒを、同じ種類の他のゲノムと比較する（例えばＢＬＡＳＴによって）。第四に、ヒト、細菌、ウイルス等などの公的に入手可能な全ての他のゲノム（すなわち同じ種類ではない）と、ｋ－ｍｅｒを比較する（例えばＢＬＡＳＴによって）。場合によっては、第三および第四の工程は、いくらかの種類（例えばＥ．ｃｏｌｉ）に対しては非常に小さなセットしか結果としてもたらすことができないが、ともに実行することができる。第五に、固有の候補のｋ－ｍｅｒの一覧表を作る。さらに、これらの固有のプローブの中央の塩基を各直交塩基（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｂａｓｅ）に変更することができ（１つのｋ－ｍｅｒが３つのミスマッチｋ－ｍｅｒを結果としてもたらす）、ミスマッチｋ－ｍｅｒを公的に入手可能な全ての他のゲノムと（例えばＢＬＡＳＴによって）、および／または同じ種類の他のゲノムと比較することができる。第六に、自己相補性（ｓｅｌｆ ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｉｔｙ）（すなわち、プローブがそれ自体に結合するかどうか）に関して候補をテストする。第七に、融解温度を一本鎖の自由エネルギーに基づいて評価する。第八に、ｋ－ｍｅｒを、固有性の値（例えば固有の配列のパーセント）に基づいてランク付ける。さらに、ｋ－ｍｅｒは、ＧＣ含量などの他の特徴に関してフィルタリングされうる。例えば、場合によっては、＜６０％のＧＣ含量を有するｋ－ｍｅｒのみが含まれる。第九に、候補を、同じ種類の選択されたゲノムに対してハイブリダイズすることにより経験に基づいてテストする。第十に、これらの結果に基づいて、最終候補のプールを選択する。
【0084】
プローブは、既知の核酸配列に対して相補的になるように設計することができる。場合によっては、被験体のポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの配列を判定するために、プローブを設計する前に配列することができる。一旦ポリヌクレオチドが配列されたならば、プローブは被験体のポリヌクレオチドを標的とするように設計することができる。場合によっては、被験体のポリヌクレオチドは、被験体のゲノム中で発見される配列を含む。この例では、被験体のゲノムは配列され、プローブはゲノム内の標的ポリヌクレオチドに対して設計されうる。いくつかの例では、標的のリストは、２人以上の被験体間の非重複ゲノム領域を判定することにより生成されうる。場合によっては、標的はアセンブリを比較することにより識別される。配列決定法は、キャピラリー配列決定、次世代配列決定、サンガー配列決定、合成による配列決定、単一分子ナノポア配列決定、ライゲーションによる配列決定、ハイブリダイゼーションによる配列決定、ナノポアの流動を制限することによる配列決定（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ ｎａｎｏｐｏｒｅ ｃｕｒｒｅｎｔ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ）、またはそれらの組み合わせを含みうる。合成による配列決定は、可逆的な転写終結配列決定、前進的な単一分子配列決定、連続的なヌクレオチドフロー配列決定（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｆｌｏｗ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）、またはそれらの組み合わせを含みうる。連続的なヌクレオチドフロー配列決定は、パイロシークエンシング、ｐＨ媒介配列決定）、半導体配列決定、またはそれらの組み合わせを含みうる。１つ以上の配列決定反応の実施は、非標的配列決定（ｕｎｔａｒｇｅｔｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）（例えばゲノム全体の配列決定）、または標的配列決定（ｔａｒｇｅｔｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）（例えばエクソーム配列決定）を含む。
【0085】
配列決定法は、マクサム－ギルバート法（Ｍａｘｉｍ－Ｇｉｌｂｅｒｔ）、連鎖停止反応、またはハイスループットシステムを含みうる。代替的にまたは加えて、配列決定法は、Ｈｅｌｉｏｓｃｏｐｅ（商標）単一分子配列決定、ナノポアＤＮＡ配列決定、Ｌｙｎｘ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓの大規模並列シグネチャー配列決定（ＭＰＳＳ）、４５４パイロシークエンシング、単一分子リアルタイム（ＲＮＡＰ）配列決定、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（Ｓｏｌｅｘａ）配列決定、ＳＯＬｉＤ配列決定、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ（商標）、イオン半導体配列決定、単一分子ＳＭＲＴ（商標）配列決定、ポロニー配列決定、ＤＮＡナノボール配列決定、ＶｉｓｉＧｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓアプローチ、またはそれらの組み合わせを含みうる。代替的にまたは加えて、配列決定法は、限定されないが、Ｉｌｌｕｍｉｎａによって提供されたＧｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ ＩＩｘ， ＨｉＳｅｑ， ＮｅｘｔＳｅｑ、およびＭｉＳｅｑと、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）およびＳｏｌｅｘａ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒによって提供された、ＰａｃＢｉｏ ＲＳシステムなどのＳｉｎｇｌｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ（ＳＭＲＴ（商標））の技術と、Ｈｅｌｉｃｏｓ Ｉｎｃ．（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＭＡ）によって提供されたＨｅｌｉＳｃｏｐｅ（商標）シークエンサーなどのＴｒｕｅ Ｓｉｎｇｌｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ｔＳＭＳ（商標））の技術と、Ｇｅｎｉａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．によって開発されたナノポアベースの配列決定プラットフォームと、Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ ＭｉｎＩＯＮと、を含む１つ以上の配列決定プラットフォームを含む。
【0086】
場合によっては、配列または遺伝子発現のデータベースをクエリして、標的対象の既知の核酸配列を識別する。配列または遺伝子発現のデータベースの非限定的な例は、ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋ、ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ （ＥＭＢＬ）、ｔｈｅ ＤＮＡ ＤａｔａＢａｎｋ ｏｆ Ｊａｐａｎ （ＤＤＢＪ）、ＥＮＳＥＭＢＬ、ｔｈｅ Ａｓｈｂｙａ Ｇｅｎｏｍｅ Ｄａｔａｂａｓｅ （ＡＧＤ）、ＢｉｏＣｙｃ、ＣｌｅａｎＥｘ、ＣＹＧＤ、Ｄｉｃｔｙｂａｓｅ、ＥｃｈｏＢａｓｅ、ＥｃｏＧｅｎｅ、ｅｕＨＣＶｄｂ、ＥｖｏＴｒａｃｅ、ＦｌｙＢａｓｅ、ＧｅｎｅＣａｒｄｓ、ＧｅｎｅＤＢ、ＧｅｎｅＦａｒｍ、ＧｅｎｏＬｉｓｔ、Ｇｒａｍｅｎｅ、ＨＧＮＣ、ＨＩｎｖ－ＤＢ、ＨＯＧＥＮＯＭ、ＫＥＧＧ、ＭａｉｚｅＧＤＢ、ＭＥＲＯＰＳ、ＭＧＤ、ＮＭＰＤＲ、ＮＣＢＩ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｄｂ、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ、ＰＡＮＴＨＥＲ、ＰＣＣＤＢ、ＰｅｒｏｘｉＢａｓｅ、Ｐｆａｍ、ＰｈｏｓｐｈｏＳｉｔｅＰｌｕｓ、ＰｌａｓｍｏＤＢ、ＰｐｔａｓｅＤＢ、ＰｓｅｕｄｏＣａｐ、ＲＧＤ、ＳＧＤ、ＴＡＩＲ、ＴＩＧＲ／ＳＣＶＩ、ＵｎｉＧｅｎｅ、ＶｅｃｔｏｒＢａｓｅ、ＷｏｒｍＢａｓｅ、およびＺ－ＦＩＮを含む。
【0087】
＜方法＞
いくつかの態様において、本明細書に記載された方法は、複数の異なる被験体を含むサンプルを提供する工程を含む。場合によっては、サンプルは、複数の異なる被験体に由来する複数の核酸を含む。場合によっては、複数の核酸は、複数の様々な被験体の少なくとも２つ以上から得られる少なくとも１つの標的核酸を含む。
いくつかの態様において、本明細書に記載された方法は、複数の異なる被験体を含むサンプルを提供する工程を含む。場合によっては、サンプルは、複数の異なる被験体に由来する複数の核酸を含む。場合によっては、複数の核酸は、複数の様々な被験体の少なくとも２つ以上から得られる少なくとも１つの標的核酸を含む。
【0088】
いくつかの態様において、方法は、複数の被験体から核酸を抽出する工程をさらに含む。いくつかの態様において、方法はまた、複数の被験体から抽出された核酸を断片化する工程を含む。バイオチップへの適用に先立って、追加の処理工程を核酸に対して行うことができる。場合によっては、核酸を、バイオチップへのハイブリダイゼーションに先立って修正できる。例えば、本明細書に記載される通り、核酸を標識することができる。さらに、または代替的に、例えば、捕捉プローブの使用、または増幅工程によって、標的核酸を富化することができる。他の例では、非標的核酸は、ハイブリダイゼーションの前にサンプルから枯渇させることができる。
【0089】
さらなる態様では、方法はバイオチップへ複数の核酸をハイブリダイズさせる工程を含む。本明細書に記述されるようにバイオチップは設計することができる。ハイブリダイゼーション後、方法は、任意の数の洗浄工程をさらに含みうる。例えば、バイオチップ上のプローブへ核酸をハイブリダイズさせた後に、ハイブリダイズされない核酸を除去するために、例えば緩衝液または洗浄液でバイオチップを１回以上洗浄することができる。ハイブリダイズされない核酸は、さらなる工程のために、廃棄または収集されうる。
【0090】
いくつかの態様において、ハイブリダイズした核酸は、例えば、電気伝導度、容量または抵抗の変化によって検出することができる。場合によっては、バイオチップは画像化される。いくつかの例において、検出に先だってバイオチップに読み取り緩衝液を加えられる。読み取り緩衝液は、ハイブリダイズした核酸に適用すると検出可能なシグナルを生成する試薬を含みうる。他の例において、核酸分子は検出可能なように標識される。
【0091】
いくつかの態様において、追加の特異性のある工程を追加することができる。一例において、ハイブリダイゼーション後のライゲーション工程は、単一塩基のミスマッチを区別できる。特異性はまた、捕捉、検出、またはその両方のための追加のハイブリダイゼーション工程を加えることによって増大させることができる。例えば、図７Ａは、捕捉配列（７０２）、および、隣接するまたは近隣の検出配列（７０３）を含む標的核酸（７０１）を示す。捕捉オリゴヌクレオチド（７０５）（例えば、捕捉配列に相補的な配列）を有するアレイ基板（７０４）を用いて、標的核酸にハイブリダイズしそれを捕捉（７０７）することができる。検出オリゴヌクレオチド（７０６）（例えば、蛍光標識されたもの）を用いて、標的核酸の検出配列にハイブリダイズ（７０８）させて、標的核酸の検出を可能にすることができる。検出オリゴヌクレオチドは、非標識標的核酸を有する遊離溶液中に存在し得る。標的核酸への検出オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは、アレイ上での標的核酸の捕捉の前、最中または後に行うことができる。検出オリゴヌクレオチドは、完全に（またはほぼ完全に）相補的配列にハイブリダイズすることができる。検出は、迅速にハイブリダイズすることができるように、比較的高い濃度で存在することができる。捕捉配列および検出された配列は近くにあるので、これらの２つの配列がＤＮＡの小さな断片上で同時発生する可能性は低くなり、したがって、検出されたシグナルが非特異的である可能性が低くなる。
【0092】
場合によっては、捕捉配列および検出配列は、それらが標的核酸の別々の断片に位置する可能性を減少させるために十分に密接に配置される。
【0093】
捕捉配列および検出された配列が隣接している場合、エネルギー移動色素の組合せ（例えばＦＲＥＴ）の使用によりバックグラウンドを減少させることができる。一例では、図７Ｂに示されるように、ドナー色素は捕捉オリゴ（７１５）の３’末端上にあり、アクセプター色素は検出オリゴヌクレオチド（７１６）上の５’末端にある。捕捉配列（７１２）および検出配列（７１３）を含む標的核酸（７１１）は、アレイ基板（７１４）上で捕捉することができる。捕捉オリゴヌクレオチド（７１７）および検出オリゴヌクレオチド（７１８）の両方の標的核酸へのハイブリダイゼーションは、ドナーおよびアクセプター色素を互いにＦＲＥＴ距離にすることができる。一旦ＦＲＥＴ距離内に入ると、励起光（７１９）はＦＲＥＴドナーを励起することができ、次に共鳴エネルギー移動を介してＦＲＥＴアクセプターを励起し、ＦＲＥＴシグナル（７２０）の生成を可能にする。ドナー色素およびアクセプター色素の位置および配置は変更することができる。例えば、ドナー色素は検出オリゴヌクレオチド上にあることができ、アクセプター色素は捕捉オリゴヌクレオチド上にあることができる。色素は、捕捉オリゴヌクレオチド以外の位置でアレイ表面に結合することができる。これらの考えは、同じ特徴の多数の捕捉遺伝子座に対して拡大可能である（ｓｃａｌａｂｌｅ）。
【0094】
複数の捕捉および／または検出配列を単一の標的核酸に用いることができる。例えば、図７Ｃは、３つの捕捉配列（７３２）、（７３３）、（７３４）を含む標的核酸（７３１）の典型的な概略を示す。アレイ基板（７３５）は同様に、１つの特徴内に３つの捕捉オリゴヌクレオチド（７３６）、（７３７）、（７３８）を含む。ハイブリダイゼーション（７３９）の後、捕捉配列のそれぞれは、対応する捕捉オリゴヌクレオチドにハイブリダイズされる。標的核酸をアレイに結合されたままで保つために、全ての捕捉配列よりも少ない配列のハイブリダイゼーションが不十分であるように、局所条件（例えば、緩衝液組成、温度、ｐＨ）を構成することができ、分析の特異性を高める。複数の捕捉配列は、正しい標的配列が存在する場合には協調的に作用することができるが、相互作用が非特異的である場合には独立して作用する。ある領域が捕捉されると、他の隣接する領域は迅速に捕捉され、（例えば、捕捉配列の局所的な高濃度のために）除去するのが比較的難しい。
【0095】
同様に、複数の検出配列および対応する検出オリゴヌクレオチドを、すべての検出オリゴヌクレオチドの存在が陽性シグナルのために必要とされるように利用されうる。一例では、各検出オリゴヌクレオチドは異なる発光波長を有し、陽性シグナルを記録するために、異なる発光波長ごとにシグナルが検出される。別の例において、ＦＲＥＴ対の検出オリゴヌクレオチドを使用することができ、標的核酸上の検出配列へのハイブリダイゼーションにより、それらを互いにＦＲＥＴ距離内にすることができる。異なる検出オリゴヌクレオチドを使用して異なる特性を認識することができる。例えば、一つの検出オリゴヌクレオチドを用いて被験体の同一性（例えば、種、株または個体）を示すことができ、一方、別の検出オリゴヌクレオチドを用いて、被験体の遺伝子、変異、または他の特徴（例えば、抗生物質耐性、ビルレンス）を示すことができる。
【0096】
いくつかの態様において、元のサンプル中に存在する被験体の同一性は、サンプル中の核酸の存在の検出に基づいて決定され得る。場合によっては、特定の被験体の標的が、特定の株を検出するように設計することができる。場合によっては、標的は、対象の種についての、または、病原性に関連する代表的な保存された領域（複数可）などの他の方法において固有である対象内に含まれる他の領域についての、プローブを含み得る。場合によっては、標的は、特定の人などの、特定の個体を差別化することができるプローブを含むことができる。個々のプローブセットは一意に特定の個体を識別することができる。他の場合では、個体の識別は固有のものではないことがあり、固有性のレベルに基づいて有用なコール信頼水準（ｃａｌｌ ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ ｌｅｖｅｌ）を提供することができる。いくつかの実施形態では、個体コールの信頼水準（ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ａｎ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ｃａｌｌ）は、約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９６％、９８％、９９％、９９．９％、９９．９９％、または、９９．９９９％である可能性がある。いくつかの実施形態では、個体コールの信頼水準は、少なくとも、約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９６％、９８％、９９％、９９．９％、９９．９９％、または、９９．９９９％である可能性がある。いくつかの実施形態では、個体コールの信頼水準は、多くとも、約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９６％、９８％、９９％、９９．９％、９９．９９％、または、９９．９９９％である可能性がある。
【0097】
場合によっては、結果がレポートで提供される。そのレポートは、元のサンプル中の複数の被験体から識別された被験体を列挙することができる。被験体が、株特異的特徴、種特異的特徴、および被験体内に存在する保存された領域からなる特徴、などの複数の特徴によって表される場合、これらの他の特徴も検出されたかどうかをレポートで列挙することができる。次いで、最終的な陽性コールは、被験体に連結された特徴が全て検出されたか、全く検出されなかったか、一部が検出されたかどうかに基づいて計算された信頼水準に基づきうる。
【0098】
いくつかの態様において、方法は、検出の後に十分なサンプルを保存する能力を含む。これは、例えば、サンプル調製プロセスの時点でサンプルをＡサンプルおよびＢサンプルに分けることによって達成することができる。Ａサンプルは、完全なサンプル調製プロセスを進めることができ、Ｂサンプルは、後の処理のためにリザーバに流用することができる。別の例では、サンプルのハイブリダイズされない部分は、例えば、ハイブリダイズされない核酸を除去するためにバイオチップを洗浄することによって、ハイブリダイゼーションプロセス後にリザーバに転換され得る。さらに別の例では、ハイブリダイズされた核酸は、後でクエリするために、脱ハイブリダイズ（ｄｅ－ｈｙｂｒｉｄｉｚｅｄ）し、リザーバに転換されうる。
【0099】
本開示の技術は、工程の一部または全部について自動化した操作を使用して実施することができる。例えば、場合によっては、ユーザーが行う唯一の工程は、サンプルの充填であり、流体ハンドリング、アッセイ、検出、および結果の報告などの他のすべての工程は、自動的に行われる。他の場合では、サンプルの充填でさえ自動的に行うことができる。例えば、ラボラトリ自動化機器または環境サンプリング機器を使用して、分析のためのデバイスにサンプルを提供することができる。
【0100】
＜検出＞
本開示のいくつかの態様において、バイオチップ上のプローブへの標的核酸の結合が検出される。検出は、当業者に公知の任意の方法を包含し得る。場合によっては、検出は、標的核酸分子、プローブ、またはその両方に存在する検出可能な標識を検出することを含む。他の場合では、検出は、標的核酸分子とプローブとの相互作用に基づいて生成されるシグナルを検出することを含む。
本開示のいくつかの態様において、バイオチップ上のプローブへの標的核酸の結合が検出される。検出は、当業者に公知の任意の方法を包含し得る。場合によっては、検出は、標的核酸分子、プローブ、またはその両方に存在する検出可能な標識を検出することを含む。他の場合では、検出は、標的核酸分子とプローブとの相互作用に基づいて生成されるシグナルを検出することを含む。
【0101】
場合によっては、シグナルは蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）に基づくシグナルである。この例において、標的核酸分子およびプローブの両方が１つ以上の蛍光標識で標識される。１つ以上の蛍光標識は、１つ以上のＦＲＥＴ対であり得る。１つ以上のＦＲＥＴ対は、少なくとも１つのＦＲＥＴドナーおよび少なくとも１つのＦＲＥＴアクセプターを含むことができる。場合によっては、ＦＲＥＴドナーは標的核酸分子に付着し、ＦＲＥＴアクセプターはプローブに付着する。他の場合では、ＦＲＥＴアクセプターは標的核酸分子に付着し、ＦＲＥＴアクセプターはプローブに付着する。ＦＲＥＴドナーおよびアクセプターは、標的核酸分子およびプローブのいずれかの末端（３’または５’）に付着し得る。場合によっては、ＦＲＥＴドナーはＣｙ３であり、ＦＲＥＴアクセプターはＣｙ５である。ＦＲＥＴ対の他の非限定的な例には、ＦＩＴＣ／ＴＲＩＴＣ、ＥＧＦＰ／Ｃｙ３、ＣＦＰ／ＹＦＰ、およびＥＧＦＰ／ＹＦＰが含まれる。
【0102】
他の場合では、検出は、標的核酸上に存在する検出可能な標識を検出することを含む。この例において、検出可能に標識された標的核酸分子がプローブに結合されている場合にのみ、シグナルを検出することができる。場合によっては、標的核酸分子はＣｙ５で５’標識される。場合によっては、非標識ハイブリダイゼーション結合は、例えば、インターフェロメトリックオシレータ上の表面状態の差を検出すること、光路中の屈折率差、または走査型電子顕微鏡法（ＳＥＭ）技術を用いた直接検出によって検出することができる。
【0103】
光検出が利用される場合、バイオチップは、ＣＭＯＳカメラなどの光検出器の表面にあり得るか、または、バイオチップは外部光学システムによってプローブで探されるフローセル内にあり得る。光学的蛍光検出の場合、蛍光共焦点顕微鏡法を含む従来の蛍光光学的検出アーキテクチャを用いることができる。プローブがＣＭＯＳ検出器に直接固定されている場合、ＣＭＯＳ検出器は、システムの励起光を遮断し、選択された色素からの光を通過させる、ＣＭＯＳ検出器とプローブとの間の層を有することができる。
【0104】
蛍光標識に加えて、他の標識を使用することができる。標識は、それ自体が検出可能であることができ、または他の検出可能な種の結合を可能にすることができる。典型的な標識には、限定されないが、フルオロフォア、ナノ粒子（例えば金ナノ粒子）、量子ドット、放射性標識、磁性粒子、バーコード（例えば核酸バーコード）、活性部位、結合部位、ＦＲＥＴ可能標識、疎水性種、親水性種種、抗体、アプタマーを含む。それ自身では検出できない標識は、その後、検出可能な種と接触させることができる。例えば、標的核酸をビオチンで標識し、続いて検出のためにストレプトアビジン結合フルオロフォアに結合させることができる。別の例では、標的核酸を核酸バーコードで標識することができ；続いて、核酸バーコード配列を増幅して検出することができる。検出様式は、限定されないが、光検出（ＦＲＥＴ、蛍光寿命および他の光学的特性を含む）、電気的検出、磁気的検出、放射性標識検出、配列決定、サイズ検出（例えば、電気泳動分離による）、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、ラマン分光法、および質量分析法を含む。
【0105】
特徴間の相対的なシグナルは、特徴ごとに結合する標識の数によって判定することができる。例えば、図２に示されるように、異なる数のフルオロフォアが特徴ごとに結合することができ、結果として相対輝度が異なる。図２は、特徴あたり１フルオロフォア（上）、特徴あたり１０フルオロフォア（中）、および特徴あたり５０フルオロフォア（下）の相対輝度を示す。
【0106】
＜コンピュータシステム＞
本開示のシステムは１つ以上のコンピュータシステムを含むことができる。本開示の技術およびデバイスは、操作、自動化、サンプル処理、データ処理、データの送信、分析、結果の提示、および他の機能のためのコンピュータシステムを使用することができる。図３は、データを受信し、サンプル中の被験体の存在または非存在を識別するなど、本開示の方法を実施するようにプログラムされた、または他の形で構成された、コンピュータシステム（３０１）を示す。コンピュータシステム（３０１）は、単一コアまたはマルチコアプロセッサ、または並列処理のための複数のプロセッサとすることができる中央処理装置（ＣＰＵ、本明細書では「プロセッサ」および「コンピュータプロセッサ」）（３０５）を含む。コンピュータシステム（３０１）はまた、メモリ（３１０）（例えば、ランダムアクセスメモリ、リードオンリーメモリ、フラッシュメモリ）と、電子ストレージユニット（３１５）（例えば、ハードディスク）と、一つ以上の他のコンピュータシステムと通信するための通信インターフェース（３２０）（例えば、ネットワークアダプタ）と、キャッシュ、他のメモリ、データストレージおよび／または電子ディスプレイアダプタなどの周辺装置（１２５）と、を含む。メモリ（３１０）、ストレージユニット（３１５）、インターフェース（３２０）および周辺装置（３２５）は、マザーボードなどの通信バス（実線）を介してＣＰＵ（３０５）と通信する。ストレージユニット（３１５）は、データを保存するためのデータストレージユニット（またはデータリポジトリ）であってもよい。コンピュータシステム（３０１）は、通信インタフェース（３２０）の助けを借りてコンピュータネットワーク（「ネットワーク」）（３３０）に動作可能に結合される。ネットワーク（３３０）は、インターネット、インターネットおよび／またはエクストラネット、またはインターネットと通信しているイントラネットおよび／またはエクストラネット、であることができる。ネットワーク（３３０）は、場合によっては、電気通信および／またはデータネットワークである。ネットワーク（３３０）は、クラウドコンピューティングのような分散コンピューティングを可能にすることができる１つ以上のコンピュータサーバを含むことができる。ネットワーク（３３０）は、場合によっては、コンピュータシステム（３０１）の助けを借りて、コンピュータシステム（３０１）に連結されたデバイスがクライアントまたはサーバとして動作することを可能にするピアツーピアネットワークを実装することができる。コンピュータシステムは、物理的にデバイスの近くにある必要はなく；有線または無線のモダリティを介してデバイスと通信することができる。
本開示のシステムは１つ以上のコンピュータシステムを含むことができる。本開示の技術およびデバイスは、操作、自動化、サンプル処理、データ処理、データの送信、分析、結果の提示、および他の機能のためのコンピュータシステムを使用することができる。図３は、データを受信し、サンプル中の被験体の存在または非存在を識別するなど、本開示の方法を実施するようにプログラムされた、または他の形で構成された、コンピュータシステム（３０１）を示す。コンピュータシステム（３０１）は、単一コアまたはマルチコアプロセッサ、または並列処理のための複数のプロセッサとすることができる中央処理装置（ＣＰＵ、本明細書では「プロセッサ」および「コンピュータプロセッサ」）（３０５）を含む。コンピュータシステム（３０１）はまた、メモリ（３１０）（例えば、ランダムアクセスメモリ、リードオンリーメモリ、フラッシュメモリ）と、電子ストレージユニット（３１５）（例えば、ハードディスク）と、一つ以上の他のコンピュータシステムと通信するための通信インターフェース（３２０）（例えば、ネットワークアダプタ）と、キャッシュ、他のメモリ、データストレージおよび／または電子ディスプレイアダプタなどの周辺装置（１２５）と、を含む。メモリ（３１０）、ストレージユニット（３１５）、インターフェース（３２０）および周辺装置（３２５）は、マザーボードなどの通信バス（実線）を介してＣＰＵ（３０５）と通信する。ストレージユニット（３１５）は、データを保存するためのデータストレージユニット（またはデータリポジトリ）であってもよい。コンピュータシステム（３０１）は、通信インタフェース（３２０）の助けを借りてコンピュータネットワーク（「ネットワーク」）（３３０）に動作可能に結合される。ネットワーク（３３０）は、インターネット、インターネットおよび／またはエクストラネット、またはインターネットと通信しているイントラネットおよび／またはエクストラネット、であることができる。ネットワーク（３３０）は、場合によっては、電気通信および／またはデータネットワークである。ネットワーク（３３０）は、クラウドコンピューティングのような分散コンピューティングを可能にすることができる１つ以上のコンピュータサーバを含むことができる。ネットワーク（３３０）は、場合によっては、コンピュータシステム（３０１）の助けを借りて、コンピュータシステム（３０１）に連結されたデバイスがクライアントまたはサーバとして動作することを可能にするピアツーピアネットワークを実装することができる。コンピュータシステムは、物理的にデバイスの近くにある必要はなく；有線または無線のモダリティを介してデバイスと通信することができる。
【0107】
コンピュータシステム（３０１）は、処理システム（３３５）と通信することができる。処理システム（３３５）は、１つ以上の標的核酸配列の存在を識別する、または複数の被験体をレポートで分類するなど、本明細書に開示される方法を実施するように構成することができる。処理システム（３３５）は、ネットワーク（３３０）を通じて、または直接（例えば、有線、無線の）接続によって、コンピュータシステム（３０１と）通信することができる。処理システム（３３５）は、核酸配列分析などの分析のために構成することができる。
【0108】
本明細書で記載される方法およびシステムは、例えばメモリ（３１０）または電子ストレージユニット（３１５）などのコンピュータシステム（３０１）の電子ストレージ位置に保存されたマシン（またはコンピュータプロセッサ）実行可能コード（またはソフトウェア）によって実行されうる。使用中に、コードはプロセッサ（３０５）によって実行することができる。いくつかの例において、コードは、ストレージユニット（３１５）から検索され、プロセッサ（３０５）による容易なアクセスのためにメモリ（３１０）上に保存されうる。いくつかの状況では、電子ストレージユニット（３１５）を排除することができ、マシン実行可能命令はメモリ（３１０）に保存される。
【0109】
コードは、コードを実行するように適合されたプロセッサを有するマシンと共に使用するために予めコンパイルされかつ構成されることができ、または、実行時にコンパイルされることができ、または実行中に解釈することができる。コードは、プレコンパイルされた方法か、コンパイルされたままの方法か、または、解釈された方法でコードを実行できるように選択できるプログラミング言語で提供され得る。
【0110】
本明細書に提供されたシステムと方法の態様はプログラミングで具体化することができる。この技術の様々な態様は、マシン可読媒体の一種に搭載されているか、または組み込まれたマシン（またはプロセッサ）実行可能コードおよび／または関連データの形態で、典型的には「製品」または「製造品目」とみなすことができる。マシン実行可能コードは、メモリ（例えば、リードオンリーメモリ、ランダムアクセスメモリ、フラッシュメモリ）またはハードディスクなどの電子ストレージユニットに保存することができる。「ストレージ」タイプの媒体は、様々な半導体メモリ、テープドライブ、ディスクドライブなどの、コンピュータ、プロセッサなどの有形のメモリ、またはそれらの関連するモジュールのいずれかまたはすべてを含むことができ、ソフトウェアプログラミングのためにいつでも非一時的なストレージを提供し得る。ソフトウェアの全部または一部は、時には、インターネットまたは様々な他の電気通信ネットワークを介して通信され得る。このような通信は、例えば、管理サーバまたはホストコンピュータからアプリケーションサーバのコンピュータプラットフォームへといった、あるコンピュータまたはプロセッサから、別のコンピュータまたはプロセッサへの、ソフトウェアのローディングを可能にすることができる。したがって、ソフトウェア要素を保持できる別のタイプの媒体には、ローカルデバイス間の有線および光陸上通信線ネットワーク、および様々なエアリンクを介して使用されるような、光、電気および電磁波が含まれる。例えば有線または無線リンク、光リンクなどの、このような波を運ぶ物理的要素も、ソフトウェアを担持する媒体とみなすことができる。本明細書に使用されるように、非一時的な有形「ストレージ」媒体に限定されない限り、コンピュータまたはマシンの「可読媒体」などの用語は、実行のためにプロセッサに命令を提供することに関与する任意の媒体を指す。
【0111】
従って、コンピュータ実行可能コードなどのマシン可読媒体は、有形ストレージ媒体、搬送波媒体または物理的伝送媒体を含むが、これに限定されない、多くの形態をとることができる。不揮発性ストレージ媒体には、例えば、データベースなどを実装するために使用することができるような、任意のコンピュータなどにおけるストレージデバイスのいずれかなどの光学ディスクまたは磁気ディスクが含まれる。揮発性ストレージ媒体は、そのようなコンピュータプラットフォームのメインメモリのような動的メモリを含む。有形の伝送媒体には、同軸ケーブルが含まれ；コンピュータシステム内のバスを備えるワイヤを含む銅線および光ファイバを含む。搬送波送信媒体は、電気または電磁信号、または無線周波数（ＲＦ）および赤外線（ＩＲ）データ通信中に生成されるような音響波または光波の形態をとることができる。したがって、コンピュータ可読媒体の共通の形式には、例えば：フロッピーディスク、フレキシブルディスク、ハードディスク、磁気テープ、他の任意の磁気媒体、ＣＤ－ＲＯＭ、ＤＶＤまたはＤＶＤ－ＲＯＭ、任意の他の光学媒体、パンチカード紙テープ、穴のパターンを有する他の任意の物理的ストレージ媒体、ＲＡＭ、ＲＯＭ、ＰＲＯＭおよびＥＰＲＯＭ、ＦＬＡＳＨ－ＥＰＲＯＭ、他の任意のメモリチップまたはカートリッジ、データまたは命令を搬送する搬送波、そのような搬送波を搬送するケーブルまたはリンク、または、コンピュータがプログラミングコードおよび／またはデータを読み取ることができる他の任意の媒体が、含まれる。これらの形式のコンピュータ可読媒体の多くは、実行のために１つ以上の命令の１つ以上のシーケンスをプロセッサに送ることに関わりうる。
【0112】
コンピュータシステム（３０１）は、例えば、本開示の方法によって分析され得る遺伝的変異体のカスタマイズ可能なメニューを提供するためのユーザーインターフェース（ＵＩ）を含む電子ディスプレイを含むか、またはそれと通信することができる。ＵＩの例としては、限定しないが、グラフィカルユーザーインターフェース（ＧＵＩ）およびウェブベースのユーザーインターフェースを含む。
【0113】
幾つかの場合では、コンピュータシステム（３０１）は、ユーザーに視覚情報を提供するディスプレイを含む。幾つかの場合では、ディスプレイは、陰極線管（ＣＲＴ）である。幾つかの場合では、ディスプレイは、液晶ディスプレイ（ＬＣＤ）である。さらなる例では、ディスプレイは、薄膜トランジスタ液晶ディスプレイ（ＴＦＴ－ＬＣＤ）である。幾つかの場合では、ディスプレイは、有機発光ダイオード（ＯＬＥＤ）ディスプレイである。様々な更なる例では、ＯＬＥＤディスプレイは、パッシブマトリックスＯＬＥＤ（ＰＭＯＬＥＤ）またはアクティブマトリックスＯＬＥＤ（ＡＭＯＬＥＤ）のディスプレイである。幾つかの場合では、ディスプレイは、プラズマディスプレイである。他の場合では、ディスプレイは、ビデオプロジェクターである。またさらなる場合では、ディスプレイは、本明細書に開示されるものなどのデバイスの組み合わせである。ディスプレイは、本明細書に記載される方法によって生成されるようなエンドユーザーに１つ以上の生物医学的なレポートを提供することができる。
【0114】
幾つかの場合では、コンピュータシステム（３０１）は、ユーザーから情報を受信する入力デバイスを含む。幾つかの実施形態では、入力デバイスは、キーボードである。幾つかの実施形態では、入力デバイスは、限定しない例として、マウス、トラックボール、トラックパッド、ジョイスティック、ゲームコントローラ、またはスタイラスを含む、ポインティングデバイスである。幾つかの場合では、入力デバイスは、タッチスクリーンまたはマルタッチスクリーンである。他の場合では、入力デバイスは、声または他の音入力を捕らえるマイクロフォンである。他の場合では、入力デバイスは、動作または視覚の入力を捕らえるビデオカメラである。またさらなる例では、入力デバイスは、本明細書に開示されるものなどのデバイスの組み合わせである。
【0115】
コンピュータシステム（３０１）は、１つ以上のデータベースを含むことができるか、またはそれに動作可能に連結され得る。データベースは、ゲノム、プロテオミクス、薬理ゲノミクス、生物医学、および科学のデータベースを含むことができる。データベースは、公に利用可能なデータベースであり得る。代替的に、またはさらに、データベースは、プロプライエタリ・データベースを含むことができる。データベースは、市販のデータベースであり得る。データベースは、限定されないが、ＭｅｎｄｅｌＤＢ、ＰｈａｒｍＧＫＢ、Ｖａｒｉｍｅｄ、Ｒｅｇｕｌｏｍｅ、ｃｕｒａｔｅｄ ＢｒｅａｋＳｅｑ ｊｕｎｃｔｉｏｎｓ、Ｏｎｌｉｎｅ Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎ（ＯＭＩＭ）、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｄａｔａｂａｓｅ（ＨＧＭＤ）、ＮＣＢＩ ｄｂＳＮＰ、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ、ＧＥＮＣＯＤＥ、ＧＯ（ｇｅｎｅ ｏｎｔｏｌｏｇｙ）、およびＫｙｏｔｏ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅｓ（ＫＥＧＧ）を含む。
【0116】
データは、データのユーザーと同じ国を含む地理的位置において生成及び／又は送信され得る。データは、例えば、１か国の地理的位置から生成及び／又は送信され、データのユーザーは異なる国に存在し得る。幾つかの場合では、本開示のシステムによってアクセスされたデータは、複数の地理的位置の１つからユーザーに送信され得る。データは、例えば、ネットワーク、安全なネットワーク、不安定なネットワーク、インターネット、またはイントラネットによって複数の地理的位置の中から送受信され得る。
【0117】
トータルシステムは、各々が個別モジュールを有する３つの主要なコンポーネントを使用することができる様々な方法で設計され得る。コンポーネントは、ユーザーインターフェース、ハードウェアプラットフォーム、および消耗部品（ｃｏｎｓｕｍａｂｌｅ）を含むことができる。一例では、ユーザーインターフェースは、システムとの直接的なインタラクションを可能にするハードウェアに組み込まれ、消耗部品は、本開示の方法を実行するのに必要な試薬を含むことができる。システムインテリジェンスのすべてを含む又は全く含まない遠隔の、無線接続されたユーザーインターフェース、自動化またはヒューマンインタラクションを介して接続された１つ以上の複数のハードウェアコンポーネント、およびすべての試薬およびアッセイに存在する生物学的情報をプロセシングおよび報告のためにコンピュータに転送され得るデジタルまたはアナログの情報に変換するのに必要とされる検出システムのすべて又は一部を含む完全に内包された消耗部品を使用して、より複雑なアーキテクチャが設計され得る。システムは、限定しないが、システムによって連続的に又は並列して処理される多数のサンプルを制御するスケジューリングモジュール、およびシステムが、生物的制御を使用する内部機能のチェックまたは試験を介して適切に動作していることを確かなものとする品質保証モジュールを含む、複数の追加のモジュールを含むことができる。
【0118】
図９Ａに例示されるコンピュータシステム（９００）は、媒体（９０６）及び／又は固定媒体（９０７）を有しているサーバー（９０５）に随意に接続され得るネットワークポート（９０３）からの命令を読み取ることができる論理装置として理解され得る。図９Ａに示されるシステムなどのシステムは、ＣＰＵ（９０１）、を含むことができる、ディスクドライブ（９０２）、キーボード及び／又はマウスなどの随意の入力デバイス（９０８）、および随意のモニター（９０４）を含むことができる。データ通信は、示された通信媒体を通って、ローカル位置またはリモート位置でのサーバーへと達成され得る。通信媒体は、データを送信及び／又は受信するあらゆる手段を含むことができる。例えば、通信媒体は、ネットワーク接続、無線接続またはインターネット接続であり得る。そのような接続は、ワールドワイドウェブ上の通信を提供することができる。本開示に関連するデータは、図９Ａに例示されるような当事者（９０９）による受信及び／又はレビューのためのそのようなネットワークまたは接続を介して送信され得ることが想定される。
【0119】
図９Ｂは、本開示の例となる実施形態に関連して使用され得るコンピュータシステム（９１０）の第１の例となるアーキテクチャを例示するブロック図である。図９Ｂで示されるように、例となるコンピュータシステムは、命令を処理するためのプロセッサ（９１１）を含むことができる。プロセッサの限定しない例としては、以下が挙げられる：Ｉｎｔｅｌ Ｘｅｏｎ（商標）プロセッサ、ＡＭＤ Ｏｐｔｅｒｏｎ（商標）プロセッサ、Ｓａｍｓｕｎｇ ３２－ｂｉｔ ＲＩＳＣ ＡＲＭ １１７６ＪＺ（Ｆ）－Ｓ ｖ１．０（商標）プロセッサ、ＲＭ Ｃｏｒｔｅｘ－Ａ８ Ｓａｍｓｕｎｇ Ｓ５ＰＣ１００（商標）ＡＲＭ Ｃｏｒｔｅｘ－Ａ８ Ａｐｐｌｅ Ａ４（商標）プロセッサ、Ｍａｒｖｅｌｌ ＰＸＡ ９３０（商標）プロセッサ、または機能的に同等なプロセッサ。実行の複数のスレッドは、並列処理に使用され得る。幾つかの実施形態では、単一コンピュータシステム、クラスターであろうと、または複数のコンピュータ、携帯電話、及び／又はパーソナルデータアシスタントデバイスを含むネットワーク上でシステムにわたって分配されようと、複数のコアを備える複数のプロセッサが使用され得る。図９Ｂで例示されるように、最近プロセッサ（９１１）によって使用されている、または頻繁に使用される命令またはデータのための高速メモリを提供するために、高速キャッシュ（９１２）が、プロセッサ（９１１）に接続されるか、またはそこに組み込まれ得る。プロセッサ（９１１）は、プロセッサバス（９１４）によってノースブリッジ（９１３）に接続される。ノースブリッジ（９１３）は、メモリーバス（９１６）によってランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）（９１５）に接続され、プロセッサ（９１１）によってＲＡＭ（９１５）に対するアクセスを管理する。ノースブリッジ（９１３）はまた、チップセットバス（９１８）によってサウスブリッジ（９１７）に接続される。サウスブリッジ（９１７）は、順に、周辺バス（９１９）に接続される。周辺バスは、例えば、ＰＣＩ、ＰＣＩ－Ｘ、ＰＣＩ Ｅｘｐｒｅｓｓ、または他の周辺バスであり得る。ノースブリッジおよびサウスブリッジは、しばしば、プロセッサチップセットと呼ばれ、プロセッサ、ＲＡＭと、周辺バス（９１９）上の周辺コンポーネントの間のデータ転送を管理する。幾つかの代替的なアーキテクチャでは、ノースブリッジの機能性は、別のノースブリッジチップを使用する代わりに、プロセッサに組み込まれ得る。幾つかの実施形態では、システム（９１０）は、周辺バス（９１９）に付けられたアクセラレータカード（９２２）を含むことができる。アクセラレータは、フィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）または特定のプロセシングを加速するための他のハードウェアを含むことができる。例えば、アクセラレータは、適応データの再構成のために、または拡張された設定処理に使用される代数式を評価するために使用され得る。ソフトウェアおよびデータは、外部ストレージ（９２３）中に保存され、プロセッサによる使用のために、ＲＡＭ（９１５）及び／又はキャッシュ（９１２）にロードされ得る。システム（９１０）は、システムリソースを管理するためのオペレーティングシステムを含み、オペレーティングシステムの限定しない例としては、以下が挙げられる：Ｌｉｎｕｘ（登録商標）、Ｗｉｎｄｏｗｓ（商標）、ＭＡＣＯＳ（商標）、ＢｌａｃｋＢｅｒｒｙ ＯＳ（商標）、ｉＯＳ（商標）、および他の機能的に同等なオペレーティングシステムの他に、本開示の例となる実施形態に従ってデータの記憶および最適化を管理するためのオペレーティングシステム上で実行するアプリケーションソフトウェア。本実施例では、システム（９１０）はまた、ネットワーク接続ストレージ（ＮＡＳ）、および並列処理の分配に使用され得る他のコンピュータシステムなどの、外部ストレージにネットワークインターフェースを提供するための周辺バスに接続されたネットワークインターフェースカード（ＮＩＣ）（９２０）および（９２１）を含むことができる。
【0120】
図９Ｃは、複数のコンピュータシステム（９３１）、および（９３２）、複数の携帯電話およびパーソナルデータアシスタント（９３３）、およびネットワーク接続ストレージ（ＮＡＳ）（９３４）、および（９３５）を備えるネットワーク（９３０）を示す図である、例となる実施形態では、システム（９３１）、（９３２）および（９３３）は、データの記憶を管理し、ネットワーク接続ストレージ（ＮＡＳ）（９３４）および（９３５）に保存されたデータのためのデータアクセスを最適化することができる。数学的モデルが、データに使用され、コンピュータシステム（９３１）および（９３２）、および携帯電話およびパーソナルデータアシスタントのシステム（９３３）にわたる分配された並列処理を使用して評価され得る。コンピュータシステム（９３１）および（９３２）、および携帯電話およびパーソナルデータアシスタントのシステム（９３３）はまた、ネットワーク接続ストレージ（ＮＡＳ）（９３４）および（９３５）に保存されたデータの適応データの再構成に並列処理を提供することができる。図９Ｃは、単に一例を例示するものであり、種々様々な他のコンピュータアーのキテクチャーおよびシステムが、本開示の様々な実施形態とともに使用され得る。例えば、並列処理を提供するためにブレードサーバーを使用することができる。並列処理を提供するために、プロセッサブレードがバックプレーンで接続され得る。ストレージも、バックプレーンに接続され得るか、または別のネットワークインターフェースを介してネットワーク接続ストレージ（ＮＡＳ）として接続され得る。幾つかの例となる実施形態では、プロセッサは、別のメモリ空間を維持することができ、ネットワークインターフェース、バックプレーン、または他のプロセッサによる並列処理のための他のコネクターを介してデータを送信することができる。他の実施形態では、プロセッサの幾つかまたはすべては、共有の仮想アドレスメモリ空間を使用することができる。
【0121】
図９Ｄは、例となる実施形態による共有の仮想アドレスメモリ空間を使用して、マルチプロセッサコンピュータシステム（９４０）のブロック図である。システムは、共有メモリサブシステム（９４２）にアクセスすることができる複数のプロセッサ（９４１ａ）－（９４１ｆ）を含む。システムは、複数のプログラム可能なハードウェアメモリアルゴリズムプロセッサ（ＭＡＰ）（９４３ａ）－（９４３ｆ）を共有メモリサブシステム（９４２）に組み込む。ＭＡＰ（９４３ａ）－（９４３ｆ）はそれぞれ、メモリ（９４４ａ）－（９４４ｆ）および１つ以上のフィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）（９４５ａ）－（９４５ｆ）を含むことができる。ＭＡＰは、設定可能な機能ユニットを提供し、特定のアルゴリズムまたはアルゴリズムの部分が、それぞれのプロセッサと密に協働した処理のためにＦＰＧＡ（９４５ａ）－（９４５ｆ）に提供され得る。例えば、ＭＡＰは、データモデルに関する代数式を評価する及び例となる実施形態において適応データの再構成を実行するために使用され得る。本実施例では、ＭＡＰはそれぞれ、これらの目的のためのプロセッサのすべてによって地球規模で利用可能である。１つの構成では、ＭＡＰはそれぞれ、関連するメモリ（９４４ａ）－（９４４ｆ）にアクセスするために直接メモリアクセス（ＤＭＡ）を使用することができ、これによって、それぞれのマイクロプロセッサ（９４１ａ）－（９４１ｆ）とは無関係に、およびそれらとは非同期的にタスクを実行することが可能になる。この構成では、ＭＡＰは、アルゴリズムのパイプライン処理および並列実行のために別のＭＡＰに結果を直接供給することができる。
【0122】
上記のコンピュータアーのキテクチャーおよびシステムは、単に例であり、汎用のプロセッサ、コプロセッサ、ＦＰＧＡおよび他のプログラマブルロジックデバイス、システムオンチップ（ＳＯＣ）、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、並びに他の処理素子および論理素子のあらゆる組み合わせを使用するシステムを含む、種々様々な他のコンピュータ、携帯電話、パーソナルデータアシスタントのアーキテクチャおよびシステムが、例となる実施形態に関連して使用され得る。幾つかの実施形態では、コンピュータシステムのすべてまたは一部は、ソフトウェアまたはハードウェアにおいて実施され得る。ランダムアクセスメモリ、ハードドライブ、フラッシュメモリ、テープドライブ、ディスクアレイ、ネットワーク接続ストレージ（ＮＡＳ）、他のローカルまたは配信されたデータストレージデバイスおよびシステムを含む、あらゆる種類のデータストレージ媒体も、例となる実施形態に関連して使用され得る。
【0123】
例となる実施形態では、コンピュータシステムは、上記または他のコンピュータアーキテクチャおよびシステムのいずれかの上で実行するソフトウェアモジュールを使用して実施され得る。他の実施形態では、システムの機能は、ファームウェア、図９Ｄで参照されるようなフィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）、などのプログラマブルロジックデバイス、システムオンチップ（ＳＯＣ）、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、並びに他の処理素子および論理素子において部分的または完全に実施され得る。例えば、セットプロセッサ（Ｓｅｔ Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ）およびオプティマイザー（Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒ）は、図９Ｂに例示されるアクセラレータカード（９２２）などのハードウェアアクセラレータカードの使用によってハードウェアアクセラレーションで実施され得る。
【0124】
＜レポート＞
方法およびシステムはレポートの作成を提供し、ここでレポートは、複合サンプルに存在する１つ以上の被験体を特定することができる。代替的に、レポートは、マイクロアレイ上に含まれるすべての特徴の読み出しに関する詳細情報を提供することができる。レポートは、本明細書に記載される方法の結果がエンドユーザーに中継される技術であり得る。レポートは、スクリーンまたは電子ディスプレイに表示され得るか、または例えば１枚の紙に印刷され得る。幾つかの場合では、レポートはネットワークを介して送信される。幾つかの場合では、ネットワークはインターネットである。幾つかの場合では、レポートは手動で作成され得る。他の場合では、レポートは自動的に作成され得る。幾つかの場合では、レポートはリアルタイムで作成され得る。幾つかの場合では、レポートは、モバイルデバイス、スマートフォン、タブレットまたは別のネットワーク使用可能な装置に提供され得る。
方法およびシステムはレポートの作成を提供し、ここでレポートは、複合サンプルに存在する１つ以上の被験体を特定することができる。代替的に、レポートは、マイクロアレイ上に含まれるすべての特徴の読み出しに関する詳細情報を提供することができる。レポートは、本明細書に記載される方法の結果がエンドユーザーに中継される技術であり得る。レポートは、スクリーンまたは電子ディスプレイに表示され得るか、または例えば１枚の紙に印刷され得る。幾つかの場合では、レポートはネットワークを介して送信される。幾つかの場合では、ネットワークはインターネットである。幾つかの場合では、レポートは手動で作成され得る。他の場合では、レポートは自動的に作成され得る。幾つかの場合では、レポートはリアルタイムで作成され得る。幾つかの場合では、レポートは、モバイルデバイス、スマートフォン、タブレットまたは別のネットワーク使用可能な装置に提供され得る。
【実施例】
【0125】
実施例１．主題の特異的なプローブの生成
サンプルを得る。サンプルは複数の被験体を含む。特定されるべき各被験体のゲノムが得られる。被験体のゲノムの非重複領域が特定される。非重複領域に特異的なプローブが設計される。
サンプルを得る。サンプルは複数の被験体を含む。特定されるべき各被験体のゲノムが得られる。被験体のゲノムの非重複領域が特定される。非重複領域に特異的なプローブが設計される。
【0126】
実施例２．主題の特異的な特徴の構築
主題の特異的な特徴を含むバイオチップを構築する。特徴はそれぞれ、個々の被験体に特異的な複数のプローブを含む。
主題の特異的な特徴を含むバイオチップを構築する。特徴はそれぞれ、個々の被験体に特異的な複数のプローブを含む。
【0127】
実施例３．バイオチップを使用する被験体の存在に関する分析
多くのタイプの被験体を含む試験サンプルを得る。サンプルからのＤＮＡをひとまとめに得る。増幅なしで、ＤＮＡをバイオチップにハイブリダイズする。複数の標的がバイオチップの表面上のプローブに結合する。十分な数のプローブが特徴内で結合されると、シグナルが検出可能であり、被験体に特異的な特徴は陽性（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）と呼ばれる。陽性の特徴は、サンプル中の被験体の存在を暗示している。幾つかの場合では、陽性シグナルは、特異的な有機体または種の存在を示す。別の場合では、陽性シグナルは、対象の特異的な遺伝子または形質の存在を示す。
多くのタイプの被験体を含む試験サンプルを得る。サンプルからのＤＮＡをひとまとめに得る。増幅なしで、ＤＮＡをバイオチップにハイブリダイズする。複数の標的がバイオチップの表面上のプローブに結合する。十分な数のプローブが特徴内で結合されると、シグナルが検出可能であり、被験体に特異的な特徴は陽性（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）と呼ばれる。陽性の特徴は、サンプル中の被験体の存在を暗示している。幾つかの場合では、陽性シグナルは、特異的な有機体または種の存在を示す。別の場合では、陽性シグナルは、対象の特異的な遺伝子または形質の存在を示す。
【0128】
実施例４．２段階ＥＤＣプロトコルを使用するプローブの固定化の改善
２段階ＥＤＣ（１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩）プロトコルを利用して、シリカビーズへのプローブの固定化を改善した。シリカビーズを、低濃度のＥＤＣで処理し、洗浄し、続いてより高濃度のＥＤＣで処理した。下記の表１は、プローブの固定化の効率に対する異なるＥＤＣ濃度の効果を実証している。
２段階ＥＤＣ（１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩）プロトコルを利用して、シリカビーズへのプローブの固定化を改善した。シリカビーズを、低濃度のＥＤＣで処理し、洗浄し、続いてより高濃度のＥＤＣで処理した。下記の表１は、プローブの固定化の効率に対する異なるＥＤＣ濃度の効果を実証している。
【0129】
【表1】
【0130】
実施例５．Ｍ１３ｍｐ８配列に対するプローブ設計
プローブを、Ｍ１３バクテリオファージに由来するＭ１３ｍｐ８ファージベクターに対して設計した。簡単には、Ｍ１３ｍｐ８配列を、ＧｅｎＢａｎｋ Ｖｉｒｕｓｅｓ， Ｂａｃｔｅｒｉａ， ａｎｄ Ｈｕｍａｎのデータベースおよび「天然の」Ｍ１３バクテリオファージ配列に対してクエリした。Ｍ１３ｍｐ８が２２の固有の領域（例えば図４を参照）および３８０の固有の３５－ｍｅｒを有することが判定された。これらの配列を使用して、Ｍ１３ｍｐ８を複合サンプルと区別することができる１０のプローブを生成した。プローブを、様々なＧＣ含量／ＴｍおよびヘアピンＴｍを有するように設計した。幾つかの場合では、プローブを以下を含むように修正した：１．修飾なし；２．アミノ修飾（５’）；３．アミノ修飾（５’）＋Ｃｙ５（３’）。幾つかの場合では、標的核酸を、修飾なし又はＣｙ３（５’）修飾のいずれかで生成した。図５は、本明細書に提供される方法を使用して設計されたプローブの例を示す。
プローブを、Ｍ１３バクテリオファージに由来するＭ１３ｍｐ８ファージベクターに対して設計した。簡単には、Ｍ１３ｍｐ８配列を、ＧｅｎＢａｎｋ Ｖｉｒｕｓｅｓ， Ｂａｃｔｅｒｉａ， ａｎｄ Ｈｕｍａｎのデータベースおよび「天然の」Ｍ１３バクテリオファージ配列に対してクエリした。Ｍ１３ｍｐ８が２２の固有の領域（例えば図４を参照）および３８０の固有の３５－ｍｅｒを有することが判定された。これらの配列を使用して、Ｍ１３ｍｐ８を複合サンプルと区別することができる１０のプローブを生成した。プローブを、様々なＧＣ含量／ＴｍおよびヘアピンＴｍを有するように設計した。幾つかの場合では、プローブを以下を含むように修正した：１．修飾なし；２．アミノ修飾（５’）；３．アミノ修飾（５’）＋Ｃｙ５（３’）。幾つかの場合では、標的核酸を、修飾なし又はＣｙ３（５’）修飾のいずれかで生成した。図５は、本明細書に提供される方法を使用して設計されたプローブの例を示す。
【0131】
実施例６．結核サンプルの分析
ウイルス（ＴＢＶ）および非ウイルス（ＴＢＡ）の結核サンプルの２つのカテゴリーを、ビーズベースのプローブを使用して分析した。プローブを、異なるプールに入れて選択し、様々な多重のプローブを生成した。プローブを、その後、１ミクロンのビーズ上に置いた。その後、これらのビーズを、ＴＢ株の特異的な標的（ＴＢＶ）およびプローブが結合するべきでない非特異的な標的（ＴＢＡ）を使用してハイブリダイズした。
ウイルス（ＴＢＶ）および非ウイルス（ＴＢＡ）の結核サンプルの２つのカテゴリーを、ビーズベースのプローブを使用して分析した。プローブを、異なるプールに入れて選択し、様々な多重のプローブを生成した。プローブを、その後、１ミクロンのビーズ上に置いた。その後、これらのビーズを、ＴＢ株の特異的な標的（ＴＢＶ）およびプローブが結合するべきでない非特異的な標的（ＴＢＡ）を使用してハイブリダイズした。
【0132】
アッセイを、以下のプロトコルに従って実行した。ハイブリダイゼーション緩衝液および洗浄緩衝液は、表２に記載されている。１０ｍｇ／ｍＬのビーズ４μＬを、１Ｘハイブリダイゼーション緩衝液とともに２００μＬの全容積中に希釈した。その後、ビーズ溶液を超音波処理し（Ｂｒａｎｓｏｎ ２５１０の超音波処理器において１分間）、１０μＬのビーズ溶液を、最終的なハイブリダイゼーション溶液に加えて、０．１ｍｇ／ｍＬの終末濃度にした。最終的なハイブリダイゼーション溶液は、１Ｘハイブリダイゼーション緩衝液中に２０μＬの標識されたＤＮＡおよびビーズを含んだ。１０μＬのＤＮＡを、１Ｘハイブリダイゼーション緩衝液中の等価な望ましい細胞で最終的なハイブリダイゼーション溶液に加えた。サンプルを混合し、遠心沈殿させた。その後、温度を、５分間最大９５℃まで上昇させ、その後、毎分２℃の速度で４２℃まで低下させた。その後、サンプルを、再び遠心沈殿させ、箔で覆い、下垂（ｎｕｔａｔｅ）反応を、４２℃で一晩（約１６時間）実行した。その後、サンプルを、１００μＬの１Ｘハイブリダイゼーション緩衝液中で２回洗浄し、各洗浄工程で８０μＬ除去し、各々の再懸濁後にボルテックスした。その後、洗浄後の残りの最終的な２０μＬを、ボルテックスおよび超音波処理し、総量をフローセルに加えた。フローセルにおけるサンプルを、１０～１５分間インキュベートした。その後、レーンをそれぞれ、１５０μＬ（３Ｘ５０μＬ）の１Ｘ洗浄緩衝液で洗浄した。その後、結果を、顕微鏡での観察によって収集した。平均シグナルおよび平均バックグラウンドを、ハイブリダイゼーション反応当たりの少なくとも３０のビーズに対して測定した。
【0133】
【表2】
【0134】
図１０は、実験からの結果を示す。Ｘ軸は、固有のプローブの数を表わす、プローブの煩雑性（ｐｌｅｘｉｔｙ）（１、４、９、および１２）を示し、ｙ軸は、バックグラウンドより上の平均シグナルを示す。特異的な標的シグナル（ＴＢＶ、右）は、特異的な標的に対するプレックス（ｐｌｅｘ）因子の各々の増加に応じて増加する。さらに、非特異的なシグナル（ＴＢＡ、左）は、プレックス因子増加と横ばい状態である（ｆｌａｔ）。
【0135】
本発明は，１つ以上の好ましい実施形態の観点から記載されており、当然のことながら、明確に述べられていない限り、多くの同等物、代替案、変化および修正が可能であり、本発明の範囲内にある。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図1E】
【図1F】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図8】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【図9D】
【図10】
