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▶ ブラッコ・イメージング・ソシエタ・ペル・アチオニの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-02-09
(45)【発行日】2024-02-20
(54)【発明の名称】ＩＣＡＭ－１アプタマー、その診断および治療用途
(51)【国際特許分類】
C12N 15/115 20100101AFI20240213BHJP
A61B 5/055 20060101ALI20240213BHJP
A61K 31/7105 20060101ALI20240213BHJP
A61K 31/7115 20060101ALI20240213BHJP
A61K 31/712 20060101ALI20240213BHJP
A61K 31/7125 20060101ALI20240213BHJP
A61K 49/00 20060101ALI20240213BHJP
A61K 51/04 20060101ALI20240213BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20240213BHJP
G01T 1/161 20060101ALI20240213BHJP
【ＦＩ】
C12N15/115 Z ZNA
A61B5/055 383
A61K31/7105
A61K31/7115
A61K31/712
A61K31/7125
A61K49/00
A61K51/04 310
A61K51/04 320
A61P29/00
G01T1/161 D
【請求項の数】
15
(21)【出願番号】P 2021504188
(86)(22)【出願日】2019-07-24
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2021-11-18
(86)【国際出願番号】 EP2019069917
(87)【国際公開番号】W WO2020020947
(87)【国際公開日】2020-01-30
【審査請求日】2022-06-07
(31)【優先権主張番号】18185794.7
(32)【優先日】2018-07-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(73)【特許権者】
【識別番号】504448162
【氏名又は名称】ブラッコ・イメージング・ソシエタ・ペル・アチオニ
【氏名又は名称原語表記】ＢＲＡＣＣＯ ＩＭＡＧＩＮＧ Ｓ．Ｐ．Ａ．
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100156144
【弁理士】
【氏名又は名称】落合 康
(72)【発明者】
【氏名】ヴィットリオ・デ・フランチシス
(72)【発明者】
【氏名】シルヴィア・カトゥオーニョ
(72)【発明者】
【氏名】カルラ・ルチア・エスポージト
(72)【発明者】
【氏名】アレッサンドロ・マイオッキ
(72)【発明者】
【氏名】マルゲリータ・イアボーニ
(72)【発明者】
【氏名】ルイーザ・ポッジ
(72)【発明者】
【氏名】エリカ・レイターノ
【審査官】井関 めぐみ
(56)【参考文献】
【文献】中国特許出願公開第１０５７７９４５９（ＣＮ，Ａ）
【文献】宮川 伸ほか，“バイオ素材による創薬とＤＤＳ ＲＮＡアプタマーを用いた分子標的医薬の開発”，Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ，2008年，第23巻、第5号，p.534－543
【文献】秦野 雄ほか，“臨床セミナー これからの心不全バイオマーカー(第7回)接着因子(ICAM-1,VCAM-1,P-selectin)”，Fluid management renaissance = フルイドマネジメントルネッサンス / 「Fluid management renaissance」編集委員会 編，2013年01月，第3巻, 第1号，p.67－73
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／１１５
Ａ６１Ｐ ２９／００
Ａ６１Ｋ ４９／００
Ａ６１Ｋ ３１／７１０５
Ａ６１Ｂ ５／０５５
Ｇ０１Ｔ １／１６１
Ａ６１Ｋ ３１／７１１５
Ａ６１Ｋ ３１／７１２
Ａ６１Ｋ ３１／７１２５
Ａ６１Ｋ ５１／０４
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号１のＲＮＡ配列を含む、細胞間接着分子－１（ＩＣＡＭ－１）に結合するアプタマー。
【請求項2】
最大１００ヌクレオチドの長さを有することを特徴とする、請求項１に記載のアプタマー。
【請求項3】
５００ｎＭ～５０ｎＭの解離定数でＩＣＡＭ－１に結合することができる、請求項１または２に記載のアプタマー。
【請求項4】
配列番号２のＲＮＡ配列を含む、請求項１～３のいずれかに記載のアプタマー。
【請求項5】
すべてのピリミジン残基が２’－フルオロピリミジンに修飾されている、請求項１～４のいずれかに記載のアプタマー。
【請求項6】
少なくとも１つの化学修飾を含むようさらなる修飾がされており、該修飾が、糖の位置での化学的置換；リン酸の位置での化学置換；および核酸の塩基の位置での化学置換、から選択される、請求項５に記載のアプタマー。
【請求項7】
修飾が、修飾ヌクレオチドの組み込み、化合物とのコンジュゲーション、およびレポーター部分による標識からなる群から選択される、請求項６に記載のアプタマー。
【請求項8】
レポーター部分が、フルオロフォア部分、磁性または常磁性部分、放射性標識部分、親和性標識、Ｘ線部分、超音波イメージング部分、光音響イメージング部分およびナノ粒子ベース部分からなる群から選択される、請求項７に記載のアプタマー。
【請求項9】
ＩＣＡＭ１関連の病状、障害、機能不全、状態または疾患の診断、治療または視覚化における使用のための、請求項１～８のいずれかに記載のアプタマー。
【請求項10】
ＩＣＡＭ－１関連の病状、障害、機能不全、状態または疾患が、炎症または炎症関連疾患である、請求項９に記載の使用のためのアプタマー。
【請求項11】
前記診断または視覚化が、ＩＣＡＭ－１を発現する体組織または器官系のイメージングを含んでなる、請求項９に記載の使用のためのアプタマー。
【請求項12】
前記組織および器官系が、それぞれ内皮および血管である、請求項１１に記載の使用のためのアプタマー。
【請求項13】
薬学的に許容される担体および賦形剤と共に、請求項１～８のいずれかに記載のアプタマーを含有する、診断、治療またはイメージング組成物。
【請求項14】
器官または組織のイメージングに適している、請求項１３に記載の組成物。
【請求項15】
イメージングが、磁気共鳴画像法、陽電子放出断層撮影法（ＰＥＴ）、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）、超音波、光音響画像法（ＰＡＩ）、近赤外蛍光（ＮＩＲＦ）、または単一光子放出コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）に基づく、請求項１４に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、細胞間接着分子－１（ＩＣＡＭ－１）に結合する核酸アプタマー、それらの誘導体およびコンジュゲート、ならびに、特にＩＣＡＭ－１を発現する器官および組織のイメージングのための診断ツールとして、またはＩＣＡＭ－１関連疾患の予防または治療のための治療剤としてのそれらの使用を提供する。
【背景技術】
【0002】
発明の背景
アプタマー
最近、アプタマーと呼ばれる機能的なオリゴヌクレオチドベースの生体分子が、抗体の有望な代替物として大きな関心を集めている。アプタマー選択の技術は、病気の診断と治療に応用できるため科学界において注目されている。
アプタマー
最近、アプタマーと呼ばれる機能的なオリゴヌクレオチドベースの生体分子が、抗体の有望な代替物として大きな関心を集めている。アプタマー選択の技術は、病気の診断と治療に応用できるため科学界において注目されている。
【0003】
オリゴヌクレオチドアプタマーのサイズは約２０～約８０塩基（８～２５ｋＤａ）の範囲であり、それらの構造は分子内相互作用に関与している(Levy－Nissenbaum E. et al., Trends Biotechnol. 2008, 26(8), 442－449)。
【0004】
アプタマーは、芳香族化合物間の相互作用、水素結合による塩基対形成、ファンデルワールス相互作用、および荷電基または水素結合間の静電相互作用によって標的に結合する。その結果、アプタマーは、標的の認識と生体分子相互作用の後にコンフォメーション変化を受ける。
【0005】
これらのオリゴヌクレオチドは、その生物学的、物理的および化学的特性により、診断および治療のための効果的な認識ツールになる。リボザイムによる分解に起因して、生物学分野でのアプタマーの応用は限られている。それらをヌクレアーゼから保護し、熱安定性およびそれらの薬物動態学的特性を改善するために、化学修飾が必要である。
【0006】
修飾のうち、２’－Ｆまたは２’－ＮＨ２によるリボースの２’位でのＯＨの交換は、細胞環境におけるアプタマーの安定性を改善するために行うことができる。アプタマーの他の修飾としては、アミン、リン酸基、またはチミジンや他の非天然塩基の残基のような小分子による末端キャッピングが挙げられる（Gao S. et al, Anal. Bioanal. Chem. 2016, 408(17), 4567－4573）。
【0007】
アプタマーは、Systematic Evolution of Binding by Exponential Enrichment（SELEX）によるin vitroでの方法により選択される。この方法は、Tuerk and Gold（Science、1990、249、505－510）とEllington and Szostak（Nature、1990、346、818－822）によって、ほぼ同時期に記載された。SELEXは、結合サイクルの反復、溶出、およびランダム核酸ライブラリーからのリガンドの濃縮によるアプタマーの漸進的な選択を含むもので、標的に対してより高い結合親和性を有する配列を選択する。
【0008】
「cell－SELEX」と呼ばれる新しい技術が開発され、特定の標的細胞に結合するアプタマーの選択が可能になった（de Franciscis V. et al., Methods Mol Biol., 2016, 1380, 33－46）。
【0009】
選択パラメータは、広範囲の条件（pH、温度または緩衝液の組成）に対して、より効率的なアプタマーを得るために容易に操作することができる（Radom F. et al, Biotechnol. Adv. 2013, 31(8), 1260－1274）。例えば、親和性および特異性を最大化し、選択速度と選択されたアプタマーの成功率向上のための親和性クロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動および濾過膜などのいくつかの修飾が、これまでのSELEX法に組み込まれている（Stoltenburg R et al, Biomol. Eng. 2007, 24(4), 381－403）。選択されたオリゴヌクレオチドの特性は、種々の物理的、化学的および生物学的分析を用いて同定される（Song KM et al, Sensors, 2012, 12(1), 612－631）。
【0010】
一度選択すれば、化学反応により高精度かつ再現性のある大量合成が可能である。これらの化学的プロセスは、抗体の生産よりも費用効果が高い。抗体と比較した場合、アプタマーのサイズは比較的小さいため、化学合成と可能な修飾が容易になる。アプタマーは生体適合性があり、in vivoでの免疫原性が低い。アプタマーは、抗体（ミリモル／マイクロモル範囲のKd）と比べて、高い選択性と特定の標的に結合して認識する能力を有しており、ナノモル範囲の親和定数（Kd）を示す。また、分子量がかなり小さいため、組織にすばやくより効率的に浸透し、抗体では識別できないタンパク質の細胞外ドメインまたは細胞内ドメインを識別できる（Gopinath S.C. et al, J. Gen. Virol., 2006, 87(3), 479－487）。
【0011】
アプタマーの強い標的親和性／選択性、費用効率、化学的汎用性と安全性は、従来のペプチド又はタンパク質ベースのリガンドよりも優れており、分子イメージングに特に適している。したがって、アプタマーは、光学、磁気共鳴、核、コンピューター断層撮影、超音波、およびマルチモダリティイメージングに関して、さまざまな造影剤を標的の組織または細胞に誘導するのに非常に有用であると考えられている。
【0012】
ＩＣＡＭ－１
細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）は、免疫グロブリンスーパージーンファミリーの構造的に関連する膜貫通糖タンパク質であり、白血球に存在するβ２インテグリン分子のリガンドである（Almenar－Queralt A. et al., Am. J. Pathol., 1995, 147(5), 1278－1288; Hubbard AK et al, Free Radic. Biol. Med., 2000, 28, 1379－1386）。同定された５つのＩＣＡＭのうち、ＩＣＡＭ－１が最もよく研究されている（Koning et al., Endothelium, 2002, 9, 161－171; Muro et al., Curr. Pharm. Des., 2005, 11, 2383－2401）。ＩＣＡＭ－１（細胞間接着分子１）は、ヒトにおいてＩＣＡＭ１遺伝子によってコードされるタンパク質である。この遺伝子は、通常、内皮細胞および免疫系の細胞上に発現する細胞表面をコードする。ＩＣＡＭ－１は、CD11a/CD18型またはCD11b/CD18型のインテグリンに結合し、受容体としてライノウイルスに利用される。
細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）は、免疫グロブリンスーパージーンファミリーの構造的に関連する膜貫通糖タンパク質であり、白血球に存在するβ２インテグリン分子のリガンドである（Almenar－Queralt A. et al., Am. J. Pathol., 1995, 147(5), 1278－1288; Hubbard AK et al, Free Radic. Biol. Med., 2000, 28, 1379－1386）。同定された５つのＩＣＡＭのうち、ＩＣＡＭ－１が最もよく研究されている（Koning et al., Endothelium, 2002, 9, 161－171; Muro et al., Curr. Pharm. Des., 2005, 11, 2383－2401）。ＩＣＡＭ－１（細胞間接着分子１）は、ヒトにおいてＩＣＡＭ１遺伝子によってコードされるタンパク質である。この遺伝子は、通常、内皮細胞および免疫系の細胞上に発現する細胞表面をコードする。ＩＣＡＭ－１は、CD11a/CD18型またはCD11b/CD18型のインテグリンに結合し、受容体としてライノウイルスに利用される。
【0013】
ＩＣＡＭ－１は、炎症細胞の輸送、白血球エフェクター機能、抗原提示細胞のＴリンパ球への接着、微生物の病因、およびアウトサイドインシグナル伝達イベントを介したシグナル伝達経路に特異的に関与する。この接着分子は、内皮細胞の頂端面と基底外側面の両方に局在し、白血球の経内皮移動を促進するのに理想的な位置に存在している。実際、ＩＣＡＭ－１（およびＶＣＡＭ－１）は、炎症部位への白血球動員にとって最も重要な接着分子であると考えられており、多くの炎症および免疫応答、ならびに転移プロセスにおける上皮腫瘍形成に関連している。これらの特性により、ＩＣＡＭ－１は診断への応用のための有望な標的である。
【0014】
したがって、内皮ＩＣＡＭ－１発現の非侵襲的in vivo分子イメージングは、診断と治療を改善するために、心疾患に関連する炎症の進行に関する貴重な洞察を提供し得る。
【0015】
近年、造影超音波検査（ＣＥＵＳ）により、小血管のイメージングが劇的に改善された。現在臨床現場で使用されているマイクロバブルベースの造影剤は、病変に対する親和性が不足しており、造影時間は約２～５分である。標的化された超音波造影剤の開発とナノバブルの出現により、超音波分子造影技術は革新的に進歩しており、超音波の適用が焦点となっている。この意味においても、内皮ＩＣＡＭ－１は最も有望な標的の一つである。
【0016】
米国５，７５６，２９１は、例えばＩＣＡＭ－１、ＶＣＡＭ、第Ｘ因子、ＰＤＧＦ、ＦＧＦ、Ｅ－セレクチン、トロンビンおよびブラジキニンのような標的タンパク質に対するアプタマーを得る方法を開示している。ＩＣＡＭ－１に関する限り、標的は、その活性ドメインを含む、長さ１７～１９残基のアミノ末端から５つのペプチドで表されている。オリゴヌクレオチド混合物を３２Ｐで放射性標識し、標的とインキュベートした後、ゲルにロードする。プールを濃縮し、ゲルシフト法と最適な候補の選択を行われている。ＤＮＡを、開始プールと比較して移動が遅いものについて選択された。ただし、選択したアプタマーが細胞膜との関連でＩＣＡＭ－１に結合でき、その結果in vivo目的に適したツールになるという証拠はない。
【0017】
ＷＯ２００５／１１０４８９は、受容体結合アプタマーのリガンドアンタゴニストのレンジを増大させる方法を開示している。アプタマーは、標的が別の分子と結合するのを防ぐことができる高分子量の立体的な基（steric group）と一緒になっている。ＩＣＡＭ－１に関しては、アプタマーは、標的の細胞外部分のドメイン２を標的としている一方、立体的な基は、ＩＣＡＭ－１の天然のリガンドであるＬＦＡ－１インテグリンのドメイン１への結合を防止する。しかしながら、ＩＣＡＭ－１に対して親和性を有するアプタマーの配列は開示されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0018】
本発明の説明
本発明は、ＩＣＡＭ－１分子に高い親和性で結合することができるＲＮＡアプタマーの同定に基づく。特に、本発明のアプタマーは、それが生理学的に存在する部位、すなわち、ＩＣＡＭ－１が発現する細胞表面上で標的を特異的に認識するという課題を解決し、in vivoでそれらの使用に適していることを実証する。実際、本明細書に記載のアプタマーは、表面でＩＣＡＭ－１を過剰発現している細胞に直接結合できることが見出された。
本発明は、ＩＣＡＭ－１分子に高い親和性で結合することができるＲＮＡアプタマーの同定に基づく。特に、本発明のアプタマーは、それが生理学的に存在する部位、すなわち、ＩＣＡＭ－１が発現する細胞表面上で標的を特異的に認識するという課題を解決し、in vivoでそれらの使用に適していることを実証する。実際、本明細書に記載のアプタマーは、表面でＩＣＡＭ－１を過剰発現している細胞に直接結合できることが見出された。
【課題を解決するための手段】
【0019】
この目的のために、ＲＮＡ分子のライブラリーを、ヒトＩＣＡＭ－１で一過性トランスフェクトしたＣＯＳ７細胞に対する結合に関してアッセイした。選択ステップを反復した後、最も高いＣＯＳ７－ＩＣＡＭ－１結合を示すＲＮＡ分子を単離し、それらの配列とＩＣＡＭ－１結合親和性を決定した。
【0020】
以下の配列を有するアプタマー：
UCAUGAUACGUUGCGUGAGCAACUGCGGCGCUAAAGUUUGGUUGACUAGUACAUG（配列番号１）はＩＣＡＭ－１に対して最も高い結合親和性を示した。
UCAUGAUACGUUGCGUGAGCAACUGCGGCGCUAAAGUUUGGUUGACUAGUACAUG（配列番号１）はＩＣＡＭ－１に対して最も高い結合親和性を示した。
【0021】
配列番号１を含むアプタマーは、特に、以下の配列を有するアプタマー：
GGGAAGAGAAGGACAUAUGAUCAUGAUACGUUGCGUGAGCAACUGCGGCGCUAAAGUUUGGUUGACUAGUACAUGACCACUUGA （配列番号２）
は、同様にＩＣＡＭ－１に結合することができることが示された。
GGGAAGAGAAGGACAUAUGAUCAUGAUACGUUGCGUGAGCAACUGCGGCGCUAAAGUUUGGUUGACUAGUACAUGACCACUUGA （配列番号２）
は、同様にＩＣＡＭ－１に結合することができることが示された。
【発明を実施するための形態】
【0022】
したがって、第１の態様において、本発明は、細胞間接着分子－１（ＩＣＡＭ－１）に結合することができ、配列番号１のＲＮＡ配列を含むアプタマーを提供する。
【0023】
一実施形態では、上記のアプタマーは、最大１００ヌクレオチドの長さを有する。
【0024】
配列番号１を含み、ＩＣＡＭ－１結合能力を示すアプタマーの解離定数は、ＲＴ－ｑＰＣＲまたはフローサイトメトリーのいずれかによって決定され、その範囲は５００ｎＭ～５０ｎＭであると示された。
【0025】
さらなる態様では、本発明は、細胞間接着分子－１（ＩＣＡＭ－１）に結合することができ、配列番号２のＲＮＡ配列を含むアプタマーを提供する。
【0026】
好ましい実施形態では、上で定義したＲＮＡアプタマーは、ヌクレアーゼ耐性であることを特徴とする。
【0027】
より好ましい実施形態では、上で定義したＲＮＡアプタマーは、ピリミジン残基がすべて２’－フルオロピリミジンに改変されていることを特徴とする。
【0028】
本発明の好ましいアプタマーは、配列番号２からなる。より好ましくは、配列番号１からなる。
【0029】
アプタマー修飾
本発明のアプタマーは、例えば、ヌクレアーゼに対する耐性を高めるため、薬物動態を調節するため、または診断部分または治療部分とコンジュゲートさせるために修飾することができる。
本発明のアプタマーは、例えば、ヌクレアーゼに対する耐性を高めるため、薬物動態を調節するため、または診断部分または治療部分とコンジュゲートさせるために修飾することができる。
【0030】
好ましくは、本発明のＲＮＡアプタマーは、少なくとも１つまたはすべてのピリミジン残基が２’－フルオロピリミジンに修飾されている。さらに、修飾には、糖の位置での化学置換、リン酸の位置での化学置換、および核酸の塩基の位置での化学置換が含まれ得る。いくつかの実施形態では、修飾は、以下からなる群：ビオチン化、蛍光標識の組み込み、修飾ヌクレオチドの組み込み、２’－ピリミジン修飾、３’－位キャッピング、リンカーとのコンジュゲーション、化合物または薬物とのコンジュゲーション、細胞毒性部分とのコンジュゲーション、およびフルオロフォア、放射性同位元素、超音波造影剤またはレポーター部分による標識、から選択される。修飾の位置は、アプタマーに結合している部分のタイプに応じて変えることができる。
【0031】
適切に標識、またはレポーターもしくは治療部分とコンジュゲートされた本発明のアプタマーは、ＩＣＡＭ－１に関連する病状、障害、機能不全、状態または疾患、特に炎症または炎症関連疾患の診断、治療または視覚化に使用することができる。例示的な用途としては、以下の診断または治療が挙げられる：アテローム性動脈硬化症および心筋梗塞における血管炎症；心筋炎などの心血管系に影響を与える病気；炎症性心筋炎および心不全。
【0032】
本発明の特定の実施形態では、レポーター部分で標識されたアプタマーは、ＩＣＡＭ－１を発現する体組織または器官系、特に内皮および血管系、のイメージングに用いられる。適切なイメージング技術としては、磁気共鳴画像法、陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）、超音波、光音響画像法（ＰＡＩ）、近赤外蛍光（ＮＩＲＦ）、単一光子放射型コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）が挙げられる。
【0033】
イメージング用途の場合、アプタマーに結合したレポーター部分は、一般に以下から選択される：フルオレセインなどの蛍光シグナルを生成できる分子；FITC；Alexa色素；Cy色素；DyLight色素；IRDye色素またはVivoTag色素；光学イメージングを用いてコントラストまたはシグナルを生成するために使用することができる薬剤を含む光学部分；常磁性金属イオンと安定な錯体を形成することができる磁気共鳴剤のためのキレート剤を含む磁性部分；放射性標識部分；ヨウ素化有機分子または重金属イオンのキレートなど、Ｘ線イメージングを使用してコントラストまたはシグナルを生成するために使用できるＸ線部分；超音波標的マイクロバブルを使用してコントラストまたはシグナルを生成するために使用できる超音波イメージング部分；及び光音響イメージングに適合した薬剤を含む光音響イメージング部分。
【0034】
アプタマーおよびレポーター部分または標識は、共有結合または非共有結合により、場合により、ペプチド、アミノ酸または核酸を含む適切なリンカーまたはスペーサーの介在によって連結され得る。さらに、アプタマーとレポーター部分または標識は、ビオチン／アビジン、ビオチン／ストレプトアビジン、ビオチン／ニュートラアビジン、またはジゴキシゲニン（ＤＩＧ）システムを含むタグシステムを用いて連結させることができる。
【0035】
さらなる態様において、本発明は、本明細書で定義されるアプタマーを含む組成物を提供する。組成物の成分は、診断、治療、またはイメージングの用途であるかどうかにかかわらず、使用目的に応じて変えることができる。特に、組成物は、ＲＮＡ分子および１つ以上の治療用化合物および／または１つ以上の造影剤を含み得る。
【0036】
一実施形態では、組成物は、ＩＣＡＭ－１を有する標的組織のイメージングに使用され、上で定義されたレポーター部分とコンジュゲートまたは標識されたアプタマーを含む。組成物は、例えば、リポソームまたはナノ粒子の形態であり得、非経口投与、特に静脈内投与に適している。この組成物は、炎症を起こした内皮および血管系などのＩＣＡＭ－１発現組織または器官を視覚化するために使用することができる。
【0037】
配列表の簡単な説明
配列番号１は、アプタマー１０．Ｔ（５５ｎｔ）の５’からの配列を示している。
5’ UCAUGAUACGUUGCGUGAGCAACUGCGGCGCUAAAGUUUGGUUGACUAG
UACAUG 3’
配列番号２は、アプタマー１２ｃ－１０（８４ｎｔ）の５’からの配列を示している。
5’ GGGAAGAGAAGGACAUAUGAUCAUGAUACGUUGCGUGAGCAACUGCGGCG
CUAAAGUUUGGUUGACUAGUACAUGACCACU UGA 3’
配列番号１は、アプタマー１０．Ｔ（５５ｎｔ）の５’からの配列を示している。
5’ UCAUGAUACGUUGCGUGAGCAACUGCGGCGCUAAAGUUUGGUUGACUAG
UACAUG 3’
配列番号２は、アプタマー１２ｃ－１０（８４ｎｔ）の５’からの配列を示している。
5’ GGGAAGAGAAGGACAUAUGAUCAUGAUACGUUGCGUGAGCAACUGCGGCG
CUAAAGUUUGGUUGACUAGUACAUGACCACU UGA 3’
【図面の簡単な説明】
【0038】
【図1】抗ＩＣＡＭ－１ cell－SELEX法のスキーム。
【図2】抗ＩＣＡＭ－１ cell－SELEXの最後のサイクルをクローニングすることによって得られた濃縮された配列を視覚化するための樹状図（MUSCLEアルゴリズムによる）。
【図3】抗ＩＣＡＭ－１ cell－SELEXにより選択された配列のＲＴ－ｑＰＣＲ結合アッセイ。ａ）ＲＴ－ｑＰＣＲ結合アッセイによる３つの配列を３回実験。ｂ）３回実験した変化倍数のサマリー。各バーは、３回の実験の平均±標準偏差を示している。
【図4】RNA structure 5.8プログラムによる予測された、選択されたアプタマー抗ＩＣＡＭ－１および相対する短いバージョンの二次構造。低自由エネルギーで二次構造を予測したａ）長い１２ｃ－１０配列（配列番号２）、およびｂ）短い１０．Ｔ配列（配列番号１）。
【図5】抗ＩＣＡＭ－１cell－SELEXによって選択された１０．Ｔ配列についてのＲＴ－ｑＰＣＲ結合アッセイ。ａ）選択された１０．Ｔ配列についてＲＴ－ｑＰＣＲを３回実施。ｂ）３回実験した変化倍数のサマリー。各バーは、３回の実験の平均±標準偏差を示している。
【図6】ヒト血清中の１０．Ｔ配列の安定性。ａ）種々の時間で採取した１０．Ｔ配列サンプルを変性ゲルにロードし、ｂ）バンドをImageJプログラムによって定量化した。
【図7】１０．Ｔ配列プルダウンアッセイ。ａ）５’末端をビオチン化したオリゴヌクレオチドの構造。ＩＣＡＭ－１ ｃＤＮＡで一過性トランスフェクトしたＣＯＳ７のリゼート（ｂ）３００μｇまたはｃ）４５０μｇ）を１μＭのビオチン化１０．Ｔ配列とインキュベートした。ネガティブコントロールとしてＩＣＡＭ－１非関連２’Ｆ－ＲＮＡ配列とインキュベートした。
【図8】ＲＴ－ｑＰＣＲ結合アッセイによるＣＯＳ７－ＩＣＡＭ－１に対する１０．Ｔ配列の結合親和性の決定。種々の濃度の１０．Ｔ配列と非関連配列Ａ１０の回収されたＲＮＡ（μＭ）をプロットし、GraphPadソフトウェアを用いて解離定数Ｋｄを決定した。実験は３回反復し、エラーバーは平均の標準偏差を表す。
【図9】フローサイトメトリーによるＣＯＳ７－ＷＴおよびＣＯＳ７－ＩＣＡＭ－１に対するＡｌｅｘａ４８８－１０．Ｔコンジュゲートの結合親和性の決定。ａ）Ｃ１２アミノリンカーにより５’末端でAlexa－488フルオロフォアとコンジュゲートした１０．Ｔ配列の構造。ｂ）得られたＡｌｅｘａ４８８－１０．Ｔコンジュゲートの種々の濃度の平均蛍光強度をプロットして、GraphPadソフトウェアを使用して解離定数Ｋｄを決定した。実験は６回反復し、エラーバーは平均の標準偏差を表す。
【図10】フローサイトメトリーによるＨＭＥＣ１－ＷＴおよびＨＭＥＣ１－ＴＮＦａｌｐｈａに対するＡｌｅｘａ４８８－１０．Ｔコンジュゲートの結合親和性の決定。得られたＡｌｅｘａ４８８－１０．Ｔコンジュゲートの種々の濃度の平均蛍光強度をプロットし、GraphPadソフトウェアを使用して解離定数Ｋｄを決定した。実験は３回反復し、エラーバーは平均の標準偏差を表す。
【図11】ＥＬＯＮＡアッセイによるＨＳＡに対する１０．Ｔ配列のＫｄの評価。（ａ）１０．Ｔ配列、および（ｂ）抗ＨＳＡポリクローナル抗体の、４５０ｎｍでの吸光度。
【0039】
実験セクション
装置
フローサイトメトリーデータの取得は、BD AccuriTM Ｃ６フローサイトメーター（BD Bioscience）を使用して行った。ＲＴ－ｑＰＣＲは、StepOneTM PlusリアルタイムPCRシステム（Applied Biosystems）により行った。ゲルの可視化は、Gel Doc EZ System（Bio－Rad）を用いて行った。ELONAデータは、MultiskanTM ＦＣマイクロプレート光度計（ThermoFisher Scientific）によって取得した。
装置
フローサイトメトリーデータの取得は、BD AccuriTM Ｃ６フローサイトメーター（BD Bioscience）を使用して行った。ＲＴ－ｑＰＣＲは、StepOneTM PlusリアルタイムPCRシステム（Applied Biosystems）により行った。ゲルの可視化は、Gel Doc EZ System（Bio－Rad）を用いて行った。ELONAデータは、MultiskanTM ＦＣマイクロプレート光度計（ThermoFisher Scientific）によって取得した。
【0040】
略語の一覧
ICAM－1 細胞間接着分子－１
SELEX Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment
RNA リボ核酸
DNA デオキシリボ核酸
WT 野生型
nt ヌクレオチド
HSA ヒト血清アルブミン
KD 解離定数
HMEC－1 ヒト乳腺上皮細胞－１
TNFalpha 腫瘍壊死因子アルファ
COS7 SV40遺伝物質を有するCV－1（サル）を起源とする細胞
Rt－qPCR リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応
ICAM－1 細胞間接着分子－１
SELEX Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment
RNA リボ核酸
DNA デオキシリボ核酸
WT 野生型
nt ヌクレオチド
HSA ヒト血清アルブミン
KD 解離定数
HMEC－1 ヒト乳腺上皮細胞－１
TNFalpha 腫瘍壊死因子アルファ
COS7 SV40遺伝物質を有するCV－1（サル）を起源とする細胞
Rt－qPCR リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応
【実施例】
【0041】
実施例１：抗ＩＣＡＭ－１－アプタマーの選択
ＩＣＡＭ－１に対するアプタマーを特異的に選択するため、細胞表面に存在する他のタンパク質について異なる２つの細胞株（陽性／陰性）の代わりに、同じ細胞株（過剰発現した標的あり／なし）を用いて、cell－SELEX法に従い行った。
ＩＣＡＭ－１に対するアプタマーを特異的に選択するため、細胞表面に存在する他のタンパク質について異なる２つの細胞株（陽性／陰性）の代わりに、同じ細胞株（過剰発現した標的あり／なし）を用いて、cell－SELEX法に従い行った。
【0042】
このため、ＣＯＳ７細胞に発現プラスミドpCMV6－ICAM－1を一過性トランスフェクトした。
【0043】
詳細には、ＩＣＡＭ－１を選択的に標的化するため、レシピエント細胞株として用いたネガティブＣＯＳ７細胞にヒトICAM－1 cDNAを一過性トランスフェクトし、cell－SELEXプロトコルを実行した。このアプローチは、図１－ａのスキームに従って、ＷＴ（ＣＯＳ７－ＷＴ）および一過性トランスフェクトされたＣＯＳ７細胞（ＣＯＳ７－ＩＣＡＭ－１）のそれぞれについて、初発の混在ライブラリーの対抗選択（counter－selection）／選択のステップを１２サイクル含み、各ラウンドで選択圧を生じさせた（図１－ｂ）。
【0044】
cell－SELEXの各ラウンドの前に、ＲＮＡ配列に２’－フルオロピリミジンを組み込むことができる変異型のＴ７ＲＮＡポリメラーゼを使用してプールを転写した。
【0045】
cell－SELEXプロトコルの最後に、最終サイクルをクローンニングし、１６４個のサンプルの配列を決定した。得られた配列を、アラインメントにより濃縮について分析し、MUSCLEアルゴリズムにより、同一の配列または単一のミスマッチを伴う配列の可視化のため樹状図を作成した。
【0046】
濃縮された配列の分析に続いて、COS7－ICAM－1に結合できる配列を選択するために、ＲＴ－ｑＰＣＲによる結合アッセイを実施した。本質的に、ＤＮＡ配列が増幅され、転写された。次に、COS7－WTおよびCOS7－ICAM－1に対して、酵母ｔＲＮＡ ２００μｇ／ｍＬで前処理した後、ＲＮＡ配列を最終濃度５０ｎＭで３７℃にて１５分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、TRIsure試薬中に回収した。参照対照として用いたＲＮＡ配列を、正規化のために各ポイントでスポットした。COS7－WTに対するCOS7－ICAM－1の結合値を比べ比率（倍）を計算した。同一配列の組または群を代表する１２の配列をスクリーニングした。比率が高いものを選択して、実験を３回繰り返してさらに分析した。結果は、図３に示すように、配列番号２からなる１２Ｃ－１０について、COS7－WTに比べCOS7－ICAM－1に対する最も高い結合が確認された（変化倍数、即ちCOS7－ICAM－1の結合の値とCOS7－WTの結合の値の比、は３．１３である）。
【0047】
イメージングへの適用に有用な、より短い配列を得るため、配列番号２に相当する84merのもとの分子１２Ｃ－１０をトランケートし、配列番号１に相当する短い55merの配列１０．Ｔを得た。
【0048】
短いバージョンのフォールディングを維持する必要があることを考慮して、初発ライブラリーの縮合部分を含む、より構造化された領域（ステム、ループ、バルジ、および／またはヘアピンによって特徴付けられる）を単離することにより、配列を短くした。
【0049】
実施例２：アプタマー１０．ＴのＣＯＳ７－ＩＣＡＭ－１に対する結合および親和性
短いアプタマー１０．Ｔ（配列番号１）が、元の分子である１２Ｃ－１０（配列番号２）の活性部位を含み、COS7－ICAM－1に対する高い結合と親和性を保存しているかを試験する目的で、長いアプタマーのスクリーニングに使用したのと同じ条件を維持して結合アッセイを行った。
短いアプタマー１０．Ｔ（配列番号１）が、元の分子である１２Ｃ－１０（配列番号２）の活性部位を含み、COS7－ICAM－1に対する高い結合と親和性を保存しているかを試験する目的で、長いアプタマーのスクリーニングに使用したのと同じ条件を維持して結合アッセイを行った。
【0050】
ＲＮＡ配列１０．Ｔを、COS7－WTおよびCOS7－ICAM－1上で、最終濃度５０ｎＭとして３７℃にて１５分間インキュベートした。図５には、COS7－WTと比較したCOS7－ICAM－1の結合の値を比率（変化の倍数）として、２．２の値が示されている。この結果により、アプタマー１０．Ｔ（配列番号１）、並びに元の分子１２ｃ－１０（配列番号２）について、細胞表面の膜に露出した生理学的コンフォメーションで標的のＩＣＡＭ－１に結合する能力が確認された。
【0051】
実施例３：アプタマー１０．ＴのＣＯＳ７－ＩＣＡＭ－１に対する結合アッセイ
アプタマー１０．Ｔの結合について別の実験でさらに調べた。５’末端をビオチン化したアプタマー１０．Ｔについてプルダウンアッセイを行い、その配列が、標的であるＩＣＡＭ－１に結合することを確認した。ＣＯＳ７細胞をＩＣＡＭ－１ ｃＤＮＡで４８時間一過性トランスフェクトして回収し、リゼート３００μｇを、１μＭのビオチン化アプタマー１０．Ｔ、およびネガティブコントロールとして使用するＩＣＡＭ－１－非関連２’Ｆ－ＲＮＡ配列とインキュベートした。複合体をストレプトアビジンアガロースビーズと連続してインキュベートした。数回の洗浄と変性の後、図７に示すように、サンプルをイムノブロッティングで分析した。
アプタマー１０．Ｔの結合について別の実験でさらに調べた。５’末端をビオチン化したアプタマー１０．Ｔについてプルダウンアッセイを行い、その配列が、標的であるＩＣＡＭ－１に結合することを確認した。ＣＯＳ７細胞をＩＣＡＭ－１ ｃＤＮＡで４８時間一過性トランスフェクトして回収し、リゼート３００μｇを、１μＭのビオチン化アプタマー１０．Ｔ、およびネガティブコントロールとして使用するＩＣＡＭ－１－非関連２’Ｆ－ＲＮＡ配列とインキュベートした。複合体をストレプトアビジンアガロースビーズと連続してインキュベートした。数回の洗浄と変性の後、図７に示すように、サンプルをイムノブロッティングで分析した。
【0052】
結果は、１０．ＴがＩＣＡＭ－１に結合するのに対し、ＩＣＡＭ－１－非関連２’Ｆ－ＲＮＡ配列と未処理のサンプルは、抗ＩＣＡＭ－１抗体とのハイブリダイゼーション後もシグナルを生じなかったことを示した。この実験は２回行った。
【0053】
実施例４：ヒト血清におけるアプタマー１０．Ｔの安定性
アプタマー１０．Ｔを、ヒト血清中での安定性について試験した。８７％ヒト血清中で３７℃にてインキュベートした。サンプルを種々の時間（Ｔ０、１、２、４、８、１２、２４、４８、７２時間）で採取し、プロテイナーゼＫと３７℃で１時間インキュベートして血清タンパク質を分解し、変性ゲルにロードした。結果は、アプタマー１０．Ｔの半減期が４～８時間であることを示した。安定性の結果を図６に示す。
アプタマー１０．Ｔを、ヒト血清中での安定性について試験した。８７％ヒト血清中で３７℃にてインキュベートした。サンプルを種々の時間（Ｔ０、１、２、４、８、１２、２４、４８、７２時間）で採取し、プロテイナーゼＫと３７℃で１時間インキュベートして血清タンパク質を分解し、変性ゲルにロードした。結果は、アプタマー１０．Ｔの半減期が４～８時間であることを示した。安定性の結果を図６に示す。
【0054】
実施例５：アプタマー１０．Ｔの５’末端へのフルオロフォアのコンジュゲーション
イメージング用途における１０．Ｔアプタマー使用の可能性を実証するため、Ｃ１２－アミノリンカー（５’－Ｃ１２－ＮＨ２）を挿入した後、ＲＮＡ配列の５’末端を市販の色素Alexa Fluor488に結合させた。アミノリンカーは、塩基的触媒作用によりＣ１２脂肪族ジアミンとの縮合により５’末端リン酸に挿入した。得られたフリーのＮＨ２部分を、市販のAlexa Fluor 488－NHSエステルと反応させて共有結合によりアミド結合を形成した。Alexa Fluor 488－NHSエステルを高純度の無水ジメチルホルムアミド（DMF）またはジメチルスルホキシド（DMSO）に溶解し、０．１～０．２Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液（pH 8.3）中で室温にて反応させた。精製を、ＰＡＧＥ、続いてＨＰＬＣにより実施した。
イメージング用途における１０．Ｔアプタマー使用の可能性を実証するため、Ｃ１２－アミノリンカー（５’－Ｃ１２－ＮＨ２）を挿入した後、ＲＮＡ配列の５’末端を市販の色素Alexa Fluor488に結合させた。アミノリンカーは、塩基的触媒作用によりＣ１２脂肪族ジアミンとの縮合により５’末端リン酸に挿入した。得られたフリーのＮＨ２部分を、市販のAlexa Fluor 488－NHSエステルと反応させて共有結合によりアミド結合を形成した。Alexa Fluor 488－NHSエステルを高純度の無水ジメチルホルムアミド（DMF）またはジメチルスルホキシド（DMSO）に溶解し、０．１～０．２Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液（pH 8.3）中で室温にて反応させた。精製を、ＰＡＧＥ、続いてＨＰＬＣにより実施した。
【0055】
実施例６：アプタマー１０．Ｔおよびそのコンジュゲートの親和性アッセイ
標的に対する親和性を調べるため、アプタマー１０．Ｔを、酵母tRNA ２００μｇ／ｍＬで前処理した後、濃度を上げながら（１０－５０－１００－２５０－５００－１０００ｎＭ）COS7－ICAM－1細胞上で３７℃にて１５分間インキュベートした。同じ実験を、ネガティブコントロールとして非関連アプタマーＡ１０（配列はLupold S.E. et al., Cancer Res. 2002, 62, 4029－4033に開示）を用いて行った。結合をＲＴ－ｑＰＣＲによって評価した。図８に示されるようにＫｄ値は３７５．７±１５１．７ｎＭであった。
標的に対する親和性を調べるため、アプタマー１０．Ｔを、酵母tRNA ２００μｇ／ｍＬで前処理した後、濃度を上げながら（１０－５０－１００－２５０－５００－１０００ｎＭ）COS7－ICAM－1細胞上で３７℃にて１５分間インキュベートした。同じ実験を、ネガティブコントロールとして非関連アプタマーＡ１０（配列はLupold S.E. et al., Cancer Res. 2002, 62, 4029－4033に開示）を用いて行った。結合をＲＴ－ｑＰＣＲによって評価した。図８に示されるようにＫｄ値は３７５．７±１５１．７ｎＭであった。
【0056】
別の技術を使用してアプタマー１０．ＴＫのＫｄの値を確認またはより詳しく調べるため、実施例５で得られたアプタマー１０．ＴとＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ－４８８とのコンジュゲートを、酵母tRNA ２００μｇ／ｍＬで前処理した後、濃度を上げながら（１０－５０－１００－２００－４００－８００－１００－１５００－２０００ｎＭ）ＣＯＳ７－ＷＴおよびＣＯＳ７－ＩＣＡＭ－１上で３７℃にて３０分間インキュベートした。実験はフローサイトメトリーによって分析し、６回実行した結果、Ｋｄは１１５．５±４９．９ｎＭであった（図９の結果を参照）。
【0057】
誘導されたＨＭＥＣ－１細胞株でも同様の結果が得られた。ＨＭＥＣ－１細胞をTNFalphaで４８時間刺激して、ＩＣＡＭ－１の発現を誘導した。実験は、ＣＯＳ７細胞で用いたのと同じ条件で、３回実行し、Ｋｄは１０５．６±３５．２ｎＭであった（図１０の結果を参照）。
【0058】
実施例７：ＥＬＯＮＡアッセイ（ＨＳＡに対する結合親和性）
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）のＫｄ値を計算するため、ＥＬＯＮＡアッセイを行った。ビオチン化アプタマー１０．Ｔを、ＨＳＡ ２５ｎＭで事前にコーティングしたまたはコーティングされていない９６ウェルマイクロタイター高結合プレート上で、濃度を上げながら（１－１０－１００－１０００ｎＭ）インキュベートした。Ｋｄ値は計算できず、１０．Ｔは１０００ｎＭ以下ではＨＳＡと反応しないことを示した。各実験では、ビオチン化ポリクローナル抗体抗ＨＳＡをポジティブコントロールとして使用した。この実験の結果を図１１に示す。
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）のＫｄ値を計算するため、ＥＬＯＮＡアッセイを行った。ビオチン化アプタマー１０．Ｔを、ＨＳＡ ２５ｎＭで事前にコーティングしたまたはコーティングされていない９６ウェルマイクロタイター高結合プレート上で、濃度を上げながら（１－１０－１００－１０００ｎＭ）インキュベートした。Ｋｄ値は計算できず、１０．Ｔは１０００ｎＭ以下ではＨＳＡと反応しないことを示した。各実験では、ビオチン化ポリクローナル抗体抗ＨＳＡをポジティブコントロールとして使用した。この実験の結果を図１１に示す。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【配列表】