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特許7434299インスリンペプチドおよびＥＧＦ（Ａ）ペプチドを含む二官能性化合物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-02-09
(45)【発行日】2024-02-20
(54)【発明の名称】インスリンペプチドおよびＥＧＦ（Ａ）ペプチドを含む二官能性化合物
(51)【国際特許分類】
C07K 14/62 20060101AFI20240213BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20240213BHJP
C07K 14/485 20060101ALI20240213BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20240213BHJP
A61P 3/06 20060101ALI20240213BHJP
A61K 38/28 20060101ALI20240213BHJP
A61K 38/18 20060101ALI20240213BHJP
A61K 47/55 20170101ALI20240213BHJP
【ＦＩ】
C07K14/62
C07K19/00 ZNA
C07K14/485
A61P3/10
A61P3/06
A61K38/28
A61K38/18
A61K47/55
【請求項の数】
13
(21)【出願番号】P 2021518432
(86)(22)【出願日】2019-10-04
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-01-13
(86)【国際出願番号】 EP2019076889
(87)【国際公開番号】W WO2020070276
(87)【国際公開日】2020-04-09
【審査請求日】2022-10-03
(31)【優先権主張番号】18198892.4
(32)【優先日】2018-10-05
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(73)【特許権者】
【識別番号】509091848
【氏名又は名称】ノヴォ ノルディスク アー／エス
(74)【代理人】
【識別番号】100108453
【弁理士】
【氏名又は名称】村山 靖彦
(74)【代理人】
【識別番号】100110364
【弁理士】
【氏名又は名称】実広 信哉
(74)【代理人】
【識別番号】100133400
【弁理士】
【氏名又は名称】阿部 達彦
(72)【発明者】
【氏名】マルティン・ヴェルナー・ボルクセニウス・ミュンツェル
(72)【発明者】
【氏名】スサンネ・ホストロプ
(72)【発明者】
【氏名】グロ・クリットガード・ポールセン
(72)【発明者】
【氏名】マティアス・ノーマン
(72)【発明者】
【氏名】トマス・ボーグラム・ケルスン
(72)【発明者】
【氏名】クラウディア・ウルリク・ヒョリンハード
(72)【発明者】
【氏名】ペーター・マセン
【審査官】松井 一泰
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１１／１１７４０１（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１７／１２１８５０（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２００９／０２２００６（ＷＯ，Ａ１）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００－ １５／９０
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
インスリンペプチド、ＥＧＦ（Ａ）ペプチド、スペーサー、および置換基を含む融合タンパク質であって、ｉ．前記インスリンペプチドが、ヒトインスリン（配列番号２および３）もしくは１～５個の変異を有するヒトインスリンの類似体であり、
ｉｉ．前記ＥＧＦ（Ａ）ペプチドが、ＬＤＬ－ＲのＥＧＦ（Ａ）ドメインの類似体であって、前記ＥＧＦ（Ａ）ドメインが、ＬＤＬ－Ｒの２９３～３３２位のアミノ酸（配列番号１）からなり、前記類似体が、１～５個の変異を有し、
ｉｉｉ．前記スペーサーが、（ＧＡＱＰ）ｎもしくは（ＧＱＡＰ）ｎ（ここで、ｎ＝２～１０）のセグメントを含み、前記インスリン類似体Ｂ鎖のＮ末端を、前記ＥＧＦ（Ａ）類似体のＣ末端と接続するペプチドリンカーであり、
ｉｖ．前記置換基が、式（Ｉ）：Ａｃｙ－ＡＡ２ｍ－ＡＡ３ｐ－を有し、式中、
Ａｃｙは、１６～２０個の炭素原子を含む脂肪二酸であり、
ＡＡ２は、酸性アミノ酸残基であり、式中、ｍは、１～１０の範囲の整数であり、
ＡＡ３は、中性のアルキレングリコール含有アミノ酸残基であり、ｐは、１～１０の範囲の整数であり、
前記ＡＡ２残基およびＡＡ３残基は、任意の順序で現れてもよい、融合タンパク質、またはその薬学的に許容される塩、アミド、もしくはエステル。
【請求項2】
前記ＥＧＦ（Ａ）類似体が、３０１Ｌを含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項3】
前記ＥＧＦ（Ａ）類似体が、３０９Ｒ、［３０９Ｒ，３１２Ｅ］、または［３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ］をさらに含む、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項4】
前記ＥＧＦ（Ａ）類似体配列が、３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅおよび３２１Ｅである、請求項１～３のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項5】
前記インスリン類似体が、ｄｅｓＢ３０を含む、請求項１～４のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項6】
前記置換基が、前記融合タンパク質内の前記インスリン配列中のＬｙｓ／Ｋアミノ酸残基を介して結合される、請求項１～５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項7】
前記置換基が、前記融合タンパク質の前記インスリン配列中のＬｙｓ／Ｋアミノ酸残基Ｂ２９Ｋを介して結合される、請求項６に記載の融合タンパク質。
【請求項8】
前記Ａｃｙが、１，１６－ヘキサデカン二酸、１，１８－オクタデカン二酸、および１，２０－エイコサン二酸から選択される脂肪二酸基である、請求項７に記載の融合タンパク質。
【請求項9】
前記融合タンパク質が、実施例１～２４の化合物：
●ＥＧＦ（Ａ）（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）－［ＧＡＱＰ］２－インスリン（Ｂ３Ｅ、Ｂ２９Ｋ（ヘキサデカンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０）（Ｃｈｅｍ．１）
●ＥＧＦ（Ａ）（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）－［ＧＡＱＰ］１０－インスリン（Ｂ２９Ｋ（オクタデカンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０）（Ｃｈｅｍ．２）
●ＥＧＦ（Ａ）（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）－［ＧＡＱＰ］２－インスリン（Ｂ３Ｅ、Ｂ２９Ｋ（オクタデカンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０）（Ｃｈｅｍ．３）
●ＥＧＦ（Ａ）（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）－［ＧＡＱＰ］２－インスリン（Ｂ２９Ｋ（オクタデカンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０）（Ｃｈｅｍ．４）
●ＥＧＦ（Ａ）（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）－［ＧＡＱＰ］２－インスリン（Ｂ３Ｅ、Ｂ２９Ｋ（オクタデカンジオイル－ｇＧｌｕ－ＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０）（Ｃｈｅｍ．５）
●ＥＧＦ（Ａ）（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）－［ＧＡＱＰ］２－インスリン（Ｂ３Ｅ、Ｂ２９Ｋ（エイコサンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０）（Ｃｈｅｍ．６）
●ＥＧＦ（Ａ）（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）－［ＧＡＱＰ］２－インスリン（Ｂ２９Ｋ（エイコサンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０）（Ｃｈｅｍ．７）
●ＥＧＦ（Ａ）（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）－［ＧＱＡＰ］２－インスリン（Ｂ２９Ｋ（オクタデカンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０）（Ｃｈｅｍ．８）
●ＥＧＦ（Ａ）（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）－［ＧＡＱＰ］３－インスリン（Ｂ２９Ｋ（オクタデカンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０）（Ｃｈｅｍ．９）
●ＥＧＦ（Ａ）（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）－［ＧＡＱＰ］３－インスリン（Ａ１４Ｅ、Ｂ２９Ｋ（オクタデカンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０）（Ｃｈｅｍ．１０）
●ＥＧＦ（Ａ）（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）－［ＧＡＱＰ］４－インスリン（Ａ１４Ｅ、Ｂ２９Ｋ（オクタデカンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０）（Ｃｈｅｍ．１１）
●ＥＧＦ（Ａ）（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）－［ＧＡＱＰ］４－インスリン（Ｂ２９Ｋ（オクタデカンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０）（Ｃｈｅｍ．１２）
●ＥＧＦ（Ａ）（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）－［ＧＡＱＰ］６－インスリン（Ａ１４Ｅ、Ｂ２９Ｋ（オクタデカンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０）（Ｃｈｅｍ．１３）
●ＥＧＦ（Ａ）（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）－［ＧＡＱＰ］６－インスリン（Ｂ２９Ｋ（オクタデカンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０）（Ｃｈｅｍ．１４）
●ＥＧＦ（Ａ）（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）－［ＧＡＱＰ］６－インスリン（Ａ１４Ｅ、Ｂ２９Ｋ（オクタデカンジオイル－ｇＧｌｕ－ＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０）（Ｃｈｅｍ．１５）
●ＥＧＦ（Ａ）（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）－［ＧＡＱＰ］６－インスリン（Ａ１４Ｅ、Ｂ２９Ｋ（エイコサンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０（Ｃｈｅｍ．１６）
●ＥＧＦ（Ａ）（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）－［ＧＡＱＰ］８－インスリン（Ｂ２９Ｋ（オクタデカンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０）（Ｃｈｅｍ．１７）
●ＥＧＦ（Ａ）（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）－［ＧＡＱＰ］１２－インスリン（Ｂ２９Ｋ（オクタデカンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０）（Ｃｈｅｍ．１８）
●ＥＧＦ（Ａ）（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）－［ＧＡＱＰ］１９－インスリン（Ｂ２９Ｋ（オクタデカンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０）（Ｃｈｅｍ．１９）
●ＥＧＦ（Ａ）（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）－［ＧＡＱＰ］１９－インスリン（Ａ１４Ｅ、Ｂ２９Ｋ（オクタデカンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０）（Ｃｈｅｍ．２０）
●ＥＧＦ（Ａ）（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）－［ＧＡＱＰ］１９－インスリン（Ｂ３Ｅ、Ｂ２９Ｋ（オクタデカンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０）（Ｃｈｅｍ．２１）
●ＥＧＦ（Ａ）（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）－［ＧＡＱＰ］１９－インスリン（Ｂ２９Ｋ（エイコサンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０）（Ｃｈｅｍ．２２）
●ＥＧＦ（Ａ）（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）－［ＧＡＱＰ］１９－インスリン（Ａ１４Ｅ、Ｂ２９Ｋ（エイコサンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０）（Ｃｈｅｍ．２３）
●ＥＧＦ（Ａ）（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）－［ＧＡＱＰ］１９－インスリン（Ｂ３Ｅ、Ｂ２９Ｋ（エイコサンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０）（Ｃｈｅｍ．２４）
からなる群から選択される、請求項１～８のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項10】
請求項１～９のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含む薬剤。
【請求項11】
糖尿病および糖尿病に関連する脂質異常症の治療で使用するための、請求項１０に記載の薬剤。
【請求項12】
糖尿病の治療を必要とする患者における糖尿病の治療のための医薬組成物であって、請求項１～９のいずれか一項に記載の治療有効量の融合タンパク質を、薬学的に許容される担体と共に含む、医薬組成物。
【請求項13】
糖尿病、１型糖尿病、２型糖尿病、耐糖能障害、高血糖症、および糖尿病性脂質異常症の治療または予防のための薬剤の製造のための、請求項１～９のいずれか一項に記載の融合タンパク質の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、インスリン類似体またはその誘導体、およびＥＧＦ（Ａ）類似体を含む新規の二官能性融合ペプチド、ならびにそれらの医薬用途に関する。さらに、本発明は、かかる二官能性融合ペプチドを含む医薬組成物、ならびに糖尿病に関連する医学的状態および糖尿病に関連する脂質異常症の治療または予防のためのかかる融合ペプチドの使用に関する。
【0002】
配列表の参照による組み込み
本出願は、電子形式の配列表と共に提出される。配列表の内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、電子形式の配列表と共に提出される。配列表の内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【0003】
糖尿病は、グルコースを利用する能力が部分的または完全に失われる代謝障害である。世界人口の５％超が糖尿病を抱えており、さらに数百万人がこの疾患を発症するリスクがある。糖尿病の治療のためのインスリン療法は数十年間使用されており、毎日数回のインスリン注射の投与を伴う。かかる療法は通常、１日１回または２回、長時間作用性基礎注射、および食事時の速効型インスリン（すなわち、食事時インスリン）の注射の投与を伴う。２型糖尿病患者は、高血糖症に加えて、多くの場合、現在のインスリン療法が有する有益な効果が限定的でしかない、代謝機能障害、例えば、脂質異常症、肥満、および循環器合併症などを患う。ＬＤＬ－ｃ（低密度リポタンパク質コレステロール）上昇、低ＨＤＬ、およびトリグリセリドの上昇を特徴とする糖尿病性脂質異常症は、心血管疾患（ＣＶＤ）の確立された原動力である。
【0004】
スタチンは、脂質異常症の治療に数十年間使用されており、その投与は、許容される安全性プロファイルを有する心血管事象の実質的かつ一貫した低減を示す。スタチンおよびその他の高脂血症治療薬の有効性および幅広い使用にもかかわらず、多くの患者では、その標的ＬＤＬ－Ｃレベルに達せず、ＣＶＤの発症については高リスクのままである。
【0005】
ＰＣＳＫ９（プロタンパク質転換酵素サブチリシン／Ｋｅｘｉｎタイプ９）は、肝臓のＬＤＬ－Ｒ（ＬＤＬ受容体）分解を促進し、それによって肝臓のＬＤＬ－Ｒの表面発現を減少させ、その結果としてＬＤＬ粒子のクリアランスを減少させる。逆に、ＰＣＳＫ９を遮断すると、ＬＤＬ－Ｃのクリアランス、ならびに中間密度リポタンパク質およびレムナント粒子などの他のアテローム性リポタンパク質のクリアランスが増加する。この追加のクリアランスは、ＬＤＬ低減のみによってもたらされるものを超える治療効果を有し得る。
【0006】
ＬＤＬ－ＲのＥＧＦ（Ａ）（上皮細胞増殖因子様ドメインＡ）配列（４０アミノ酸）（ＬＤＬ－Ｒ－（２９３－３３２））は、ＰＣＳＫ９結合のための部位として周知である。単離された野生型ＥＧＦ（Ａ）ペプチドは、ＬＤＬ－Ｒに対するＰＣＳＫ９の結合を低いμＭ範囲におけるＩＣ５０で阻害することが示されてきた（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ３７５（２００８）６９－７３）。この不十分な結合親和性のため、ＥＧＦ（Ａ）ペプチドの実用的な医薬使用が妨げられる。
【0007】
ＷＯ２０１２／１７７７４１およびＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２０１２）４２２，６８５－６９６は、ＥＧＦ（Ａ）の類似体およびそのＦｃ融合を開示するとされている。ＷＯ ２０１５／１２７２７３は、抗ＰＣＳＫ９とＧＬＰ－１の融合を開示するとされている。
【0008】
ＷＯ２０１７／１２１８５０は、脂肪酸置換基を有するＥＧＦ（Ａ）類似体を開示するとされている。
【0009】
近年、２つの抗ＰＣＳＫ９抗体、アリロクマブ（Ｐｒａｌｕｅｎｔ（登録商標）、Ｓａｎｏｆｉ－Ａｖｅｎｔｉｓ）およびエボロクマブ（Ｒｅｐａｔｈａ（登録商標）、Ａｍｇｅｎ Ｅｕｒｏｐｅ ＢＶ）が、２週間毎の皮下注射によって投与される、高ＬＤＬ－Ｃレベルの治療用に承認された。
【0010】
インスリン療法は、糖尿病患者における血糖値を調節するために確立されている。ＣＶＤのリスクが高い患者が、微小血管合併症（腎症、網膜症、ニューロパチーなど）を発症するリスクがあることも周知である。現在の療法では、糖尿病患者の約５０％がなお、心血管疾患で死亡している。したがって、現在、血糖降下とＬＤＬコレステロールの低減との効果を組み合わせることができる治療を提供することが強く求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0011】
【文献】ＷＯ２０１２／１７７７４１
【文献】ＷＯ２０１７／１２１８５０
【文献】ＷＯ２０１７／０３２７９８
【文献】ＷＯ２００９／１１５４６９
【文献】ＷＯ２００９／０２２００６
【非特許文献】
【0012】
【文献】Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２０１２）４２２，６８５－６９６
【文献】Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ
【文献】Ｇｌｅｎｄｏｒｆ Ｔ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４７ ４７４３－４７５１
【文献】Ｖｏｌｕｎｄ Ａ（１９７８）Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｓ ３４ ３５７－３６５
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0013】
最も広い態様では、本発明は、インスリンをＥＧＦ（Ａ）と組み合わせることに関する。
【0014】
別の態様では、本発明の化合物は、インスリンペプチドまたはその類似体、ＥＧＦ（Ａ）ペプチドまたはその類似体、スペーサー、および置換基を含む。
【0015】
別の態様では、本発明の化合物は、インスリンペプチドまたはその類似体、ＥＧＦ（Ａ）ペプチドまたはその類似体、スペーサー、および置換基を含む融合タンパク質である。
【0016】
別の態様では、本発明の融合タンパク質は、インスリンペプチド、ＥＧＦ（Ａ）ペプチド、スペーサー、および置換基を含み、
ｉ．前述のインスリンペプチドが、ヒトインスリン（配列番号２および３）もしくはヒトインスリンの類似体であり、
ｉｉ．前述のＥＧＦ（Ａ）ペプチドが、ＬＤＬ－Ｒ（２９３－３３２）（配列番号１）のＥＧＦ（Ａ）ドメインの類似体であり、
ｉｉｉ．前述のスペーサーが、（ＧＡＱＰ）ｎもしくは（ＧＱＡＰ）ｎ（ここで、ｎ＝１～２０）のセグメントを含み、インスリン類似体Ｂ鎖のＮ末端をＥＧＦ（Ａ）類似体のＣ末端と接続するペプチドリンカーであり、
ｉｖ．前述の置換基が、式（Ｉ）：Ａｃｙ－ＡＡ２ｍ－ＡＡ３ｐ－を有し、式中、
Ａｃｙは、約１６～約２０個の炭素原子を含む脂肪二酸であり、
ＡＡ２は、酸性アミノ酸残基であり、式中、ｍは、１～１０の範囲の整数であり、
ＡＡ３は、中性のアルキレングリコール含有アミノ酸残基であり、ｐは、１～１０の範囲の整数であり、
ＡＡ２残基およびＡＡ３残基の最大数は、１０であり、
ＡＡ２残基およびＡＡ３残基は、任意の順序で現れてもよいか、
またはその薬学的に許容される塩、アミド、もしくはエステルを含む。
ｉ．前述のインスリンペプチドが、ヒトインスリン（配列番号２および３）もしくはヒトインスリンの類似体であり、
ｉｉ．前述のＥＧＦ（Ａ）ペプチドが、ＬＤＬ－Ｒ（２９３－３３２）（配列番号１）のＥＧＦ（Ａ）ドメインの類似体であり、
ｉｉｉ．前述のスペーサーが、（ＧＡＱＰ）ｎもしくは（ＧＱＡＰ）ｎ（ここで、ｎ＝１～２０）のセグメントを含み、インスリン類似体Ｂ鎖のＮ末端をＥＧＦ（Ａ）類似体のＣ末端と接続するペプチドリンカーであり、
ｉｖ．前述の置換基が、式（Ｉ）：Ａｃｙ－ＡＡ２ｍ－ＡＡ３ｐ－を有し、式中、
Ａｃｙは、約１６～約２０個の炭素原子を含む脂肪二酸であり、
ＡＡ２は、酸性アミノ酸残基であり、式中、ｍは、１～１０の範囲の整数であり、
ＡＡ３は、中性のアルキレングリコール含有アミノ酸残基であり、ｐは、１～１０の範囲の整数であり、
ＡＡ２残基およびＡＡ３残基の最大数は、１０であり、
ＡＡ２残基およびＡＡ３残基は、任意の順序で現れてもよいか、
またはその薬学的に許容される塩、アミド、もしくはエステルを含む。
【0017】
インスリン投与を必要とする糖尿病患者は高ＣＶＤリスク群に入るため、インスリン化合物中にＬＤＬｃ低下特性を含むことによって、糖尿病患者のための改善された療法を提供し、特にコレステロールを低下させ、脂質異常症を治療し、かつＣＶＤリスクを低下させる。
【0018】
一態様では、本発明の二官能性融合タンパク質は、血糖値を低下させ、ＰＣＳＫ９に結合し、それによって肝臓における機能的ＬＤＬ－Ｒの発現を増強する。
【0019】
一態様では、本発明は、インスリン受容体の活性化およびＰＣＳＫ９への結合の両方が可能な、すなわち、血糖降下とＬＤＬコレステロール低減との効果を組み合わることが可能な、新規の二官能性融合タンパク質を提供する。
【0020】
別の態様では、本発明の二官能性融合ペプチドは、血糖値を低下させ、ＰＣＳＫ９に結合し、それによって肝臓における機能的ＬＤＬ－Ｒの発現を増強する。
【0021】
別の態様では、本発明の融合ペプチドは、血糖値を低減する。
【0022】
別の態様では、本発明の融合ペプチドは、ＬＤＬコレステロールを低減する。
【0023】
別の態様では、本発明は、本発明による融合ペプチドを含む医薬組成物に関する。
【0024】
別の態様では、本発明は、薬剤として使用するための本発明による融合ペプチドに関する。
【0025】
別の態様では、本発明は、糖尿病および糖尿病に関連する脂質異常症の治療で使用するための、本発明による融合ペプチドに関する。
【0026】
別の態様では、本発明は、本発明による融合ペプチドの医学的用途（複数可）に関する。
【0027】
本発明は、例示的な実施形態の開示から明らかになるさらなる問題も解決し得る。
【図面の簡単な説明】
【0028】
【図2】図２は、本発明の実施例２、１２、１７、１８、および１９の化合物の血糖降下効果を示し、すべてオクタデカンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ側鎖、および異なる長さのＧＱＡＰ／ＧＡＱＰスペーサーを有する。
【図3】図３は、異なる長さのＧＱＡＰ／ＧＡＱＰスペーサーを有する本発明の実施例４および１７の化合物の血糖降下効果を、ＧＱＥＰスペーサーを有する対照薬化合物１および２（すべてオクタデカンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ側鎖を有する）およびビヒクルの血糖降下効果と比較して示す。
【図4】図４は、異なる長さのＧＱＡＰ／ＧＡＱＰスペーサーを有する本発明の実施例３、１１、および１３の化合物の血糖降下効果を、ＧＱＥＰスペーサーを有する対照薬化合物１および２（すべてオクタデカンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ側鎖を有する）およびビヒクルの血糖降下効果と比較して示す。
【図5】図５は、２ｘＧＱＥＰスペーサーを有する対照薬化合物１の血糖降下効果と比較した、２ｘＧＱＡＰ／ＧＡＱＰスペーサーを有する本発明の実施例４および８の化合物の血糖降下効果を示し、すべてオクタデカンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ側鎖を有する。
【図6】図６は、４ｘＧＱＥＰスペーサーを有する対照薬化合物４の血糖降下効果と比較した、４ｘＧＡＱＰスペーサーを有する本発明の実施例１１および１２の化合物の血糖降下効果を示し、すべてオクタデカンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ側鎖を有する。
【図7】図７は、２ｘＧＱＥＰスペーサーを有する対照薬化合物１の血糖降下効果と比較した、２ｘＧＡＱＰスペーサーを有する本発明の実施例３、４、および５の化合物の血糖降下効果を示し、すべての化合物がオクタデカンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ側鎖を有する。
【図8】図８は、６ｘＧＱＥＰスペーサーを有する対照薬化合物６の血糖降下効果と比較した、６ｘＧＡＱＰスペーサーを有する本発明の実施例１３、１４、および１５の化合物の血糖降下効果を示し、すべてＣ１８側鎖を有する。
【図9】図９は、２ｘまたは８ｘＧＱＥＰスペーサーを有する対照薬化合物５および７の血糖降下効果と比較した、２ｘＧＡＱＰスペーサーを有する本発明の実施例１の化合物の血糖降下効果を示し、すべてヘキサデカンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ側鎖を有する。
【図10】図１０は、６ｘＧＱＥＰスペーサーを有する対照薬化合物３の血糖降下効果と比較した、６ｘＧＡＱＰスペーサーを有する本発明の実施例１６の化合物の血糖降下効果を示し、両方ともエイコサンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ側鎖を有する。
【図11】図１１は、「インスリンのみ」の対照薬化合物８の血糖降下効果と比較した、２ｘＧＡＱＰを有する本発明の実施例４の化合物の血糖降下効果を示し、両方ともオクタデカンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ側鎖を有する。
【図12】図１２は、ｔ＝０分でｉ．ｖ．投与された実施例３（０、３、１０、３０、および１００ｎｍｏｌ／ｋｇ）の化合物、続いて、ｔ＝１５分でのビヒクルまたはｈＰＣＳＫ９のｉ．ｖ．投与の用量反応を示す。糖尿病マウスへのビヒクルまたは実施例３の化合物の投与、続いて、ビヒクルまたはｈＰＣＳＫ９の投与の後の肝臓ＬＤＬ－ｒタンパク質の発現。
【発明を実施するための形態】
【0029】
本発明は、インスリン受容体を活性化し、ＰＣＳＫ９に結合する二官能性化合物に関する。
【0030】
一実施形態では、本発明は、インスリンペプチドおよびＥＧＦ（Ａ）ペプチドを含む融合タンパク質に関する。
【0031】
一実施形態では、本発明は、インスリン類似体およびＥＧＦ（Ａ）類似体を含む融合タンパク質に関し、前述のインスリン類似体は、ヒトインスリン（配列番号２および３）の類似体であり、前述のＥＧＦ（Ａ）類似体は、ＬＤＬ－Ｒ（２９３－３３２）（配列番号１）のＥＧＦ（Ａ）ドメインの類似体である。
【0032】
別の実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）ペプチドは、配列番号１のペプチドの類似体である。
【0033】
一実施形態では、インスリン類似体は、インスリン類似体Ｂ鎖のＮ末端アミノ酸残基を介して、ＥＧＦ（Ａ）ペプチド類似体のＣ末端アミノ酸と融合される。
【0034】
一実施形態では、本発明は、インスリンペプチド、ＥＧＦ（Ａ）ペプチド、スペーサー、および置換基を含む融合タンパク質であって、
ｉ．前述のインスリンペプチドが、ヒトインスリン（配列番号２および３）もしくはヒトインスリンの類似体であり、
ｉｉ．前述のＥＧＦ（Ａ）ペプチドが、ＬＤＬ－Ｒ（２９３－３３２）（配列番号１）のＥＧＦ（Ａ）ドメインの類似体であり、
ｉｉｉ．前述のスペーサーが、（ＧＡＱＰ）ｎもしくは（ＧＱＡＰ）ｎ（ここで、ｎ＝１～２０）のセグメントを含み、インスリン類似体Ｂ鎖のＮ末端をＥＧＦ（Ａ）類似体のＣ末端と接続するペプチドリンカーであり、
ｉｖ．前述の置換基が、式（Ｉ）：Ａｃｙ－ＡＡ２ｍ－ＡＡ３ｐ－を有し、式中、
Ａｃｙは、約１６～約２０個の炭素原子を含む脂肪二酸であり、
ＡＡ２は、酸性アミノ酸残基であり、式中、ｍは、１～１０の範囲の整数であり、
ＡＡ３は、中性のアルキレングリコール含有アミノ酸残基であり、ｐは、１～１０の範囲の整数であり、
ＡＡ２残基およびＡＡ３残基の最大数は、１０であり、
ＡＡ２残基およびＡＡ３残基は、任意の順序で現れてもよい、融合タンパク質、
またはその薬学的に許容される塩、アミド、もしくはエステルに関する。
ｉ．前述のインスリンペプチドが、ヒトインスリン（配列番号２および３）もしくはヒトインスリンの類似体であり、
ｉｉ．前述のＥＧＦ（Ａ）ペプチドが、ＬＤＬ－Ｒ（２９３－３３２）（配列番号１）のＥＧＦ（Ａ）ドメインの類似体であり、
ｉｉｉ．前述のスペーサーが、（ＧＡＱＰ）ｎもしくは（ＧＱＡＰ）ｎ（ここで、ｎ＝１～２０）のセグメントを含み、インスリン類似体Ｂ鎖のＮ末端をＥＧＦ（Ａ）類似体のＣ末端と接続するペプチドリンカーであり、
ｉｖ．前述の置換基が、式（Ｉ）：Ａｃｙ－ＡＡ２ｍ－ＡＡ３ｐ－を有し、式中、
Ａｃｙは、約１６～約２０個の炭素原子を含む脂肪二酸であり、
ＡＡ２は、酸性アミノ酸残基であり、式中、ｍは、１～１０の範囲の整数であり、
ＡＡ３は、中性のアルキレングリコール含有アミノ酸残基であり、ｐは、１～１０の範囲の整数であり、
ＡＡ２残基およびＡＡ３残基の最大数は、１０であり、
ＡＡ２残基およびＡＡ３残基は、任意の順序で現れてもよい、融合タンパク質、
またはその薬学的に許容される塩、アミド、もしくはエステルに関する。
【0035】
一実施形態では、インスリン類似体は、インスリン類似体Ｎ末端Ｂ鎖のＢ１アミノ酸残基を介して、ＥＧＦ（Ａ）ペプチド類似体のＣ末端アミノ酸と融合される。
【0036】
一実施形態では、インスリン類似体は、スペーサーを介して、インスリン類似体Ｂ鎖のＮ末端アミノ酸残基を介して、ＥＧＦ（Ａ）ペプチド類似体のＣ末端アミノ酸と融合される。
【0037】
一実施形態では、インスリン類似体は、（ＧＡＱＰ）ｎまたは（ＧＱＡＰ）ｎ（ここで、ｎ＝２～１９）のセグメントを含むスペーサーを介して、インスリン類似体Ｂ鎖のＮ末端アミノ酸残基を介して、ＥＧＦ（Ａ）ペプチド類似体のＣ末端アミノ酸と融合される。
【0038】
インスリン投与を必要とする糖尿病患者は高ＣＶＤリスク群に入るため、インスリン融合ペプチド中にＬＤＬｃ低下特性を含むことによって、糖尿病患者のための改善された療法を提供し、ＣＶＤリスクを低下させる。
【0039】
一実施形態では、本発明の融合ペプチドは、血糖値を低減する。
【0040】
別の実施形態では、本発明の融合ペプチドは、（ＧＱＥＰ）ｎを含む対照薬融合ペプチドと比較して、優れた血糖低減を示す。
【0041】
一実施形態では、本発明の融合ペプチドは、血糖降下とＬＤＬコレステロールの低減との効果を組み合わせる。
【0042】
別の実施形態では、本発明は、本発明による融合ペプチドを含む医薬組成物に関する。
【0043】
別の実施形態では、本発明は、本発明の融合ペプチドおよび薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物に関する。
【0044】
別の実施形態では、本発明は、薬剤として使用するための本発明による融合ペプチドに関する。
【0045】
別の実施形態では、本発明は、糖尿病および糖尿病に関連する脂質異常症の治療で使用するための、本発明による融合ペプチドに関する。
【0046】
別の実施形態では、本発明は、本発明による融合ペプチドの医学的用途に関する。
【0047】
一般的な定義
「化合物」という用語は、分子実体を指すために本明細書で使用され、したがって、「化合物」は、各化合物または化合物の群に対して定義される最小要素以外の異なる構造要素を有してもよい。化合物が定義された構造および／または機能的要素を含む限り、化合物は、融合化合物／ペプチドまたはその誘導体であってもよいということになる。「化合物」という用語はまた、本明細書の薬学的に意義のある形態を含むことを意味し、すなわち、本発明は、本明細書に定義される化合物、またはその薬学的に許容される塩、アミド、もしくはエステルに関する。
「化合物」という用語は、分子実体を指すために本明細書で使用され、したがって、「化合物」は、各化合物または化合物の群に対して定義される最小要素以外の異なる構造要素を有してもよい。化合物が定義された構造および／または機能的要素を含む限り、化合物は、融合化合物／ペプチドまたはその誘導体であってもよいということになる。「化合物」という用語はまた、本明細書の薬学的に意義のある形態を含むことを意味し、すなわち、本発明は、本明細書に定義される化合物、またはその薬学的に許容される塩、アミド、もしくはエステルに関する。
【0048】
「ペプチド」または「ポリペプチド」という用語は、例えば、本発明の文脈で使用される場合、アミド（またはペプチド）結合によって相互接続された一連のアミノ酸を含む化合物を指す。特定の実施形態では、ペプチドは、ペプチド結合によって相互接続されたアミノ酸からなる。
【0049】
「類似体」という用語は一般に、配列が参照アミノ酸配列と比較したときに１つ以上のアミノ酸変化を有するペプチドを指す。ある特定の変化を「含む」類似体は、それらの参照配列と比較したときにさらなる変化を含み得る。特定の実施形態では、類似体は、特定の変化を「有する」または「含む」。他の特定の実施形態では、類似体は、変化「からなる」。「なる」または「なっている」という用語が類似体との関連で使用される場合、例えば、類似体が、特定のアミノ酸突然変異の群からなるか、またはなっている場合、特定のアミノ酸突然変異が、類似体における唯一のアミノ酸突然変異であることが理解されるべきである。対照的に、特定のアミノ酸突然変異の群を「含む」類似体は、さらなる突然変異を有し得る。本出願の文脈において、「類似体」という用語はまた、ＥＧＦ（Ａ）ヒトインスリン融合タンパク質の類似体も示す。
【0050】
「誘導体」という用語は一般に、化学修飾によって、特に１つ以上の置換基の共有結合によって、天然ペプチドまたはその類似体から調製され得る化合物を指す。誘導体は、アシル化類似体とも称され得る。
【0051】
「アミノ酸」という用語は、タンパク質原性（または天然）アミノ酸（その中でも、２０個の標準アミノ酸）、並びに非タンパク質原性（または非天然）アミノ酸を含む。タンパク質原性アミノ酸は、タンパク質に天然に組み込まれるものである。標準アミノ酸は、遺伝子コードによってコードされるアミノ酸である。非タンパク質構成アミノ酸は、タンパク質中に見られないか、標準の細胞機構によって産生されないかのいずれかである（例えば、これらは翻訳後修飾を受けた可能性がある）。
【0052】
一般に、本明細書で使用されるアミノ酸残基（ペプチド／タンパク質配列）は、それらの完全名、それらの１文字コード、および／またはそれらの３文字コードによって識別され得る。これら３つの方法は、完全に同等であり、互換性がある。下文において、光学異性体が記載されていない本発明のペプチドの各アミノ酸は、（別段の指定がない限り）Ｌ異性体を意味すると理解されるべきである。アミノ酸は、アミノ基およびカルボン酸基、ならびに任意選択で、側鎖と呼ばれる場合が多い１つ以上の追加の基を含有する分子である。本明細書では、「アミノ酸残基」という用語は、形式上、ヒドロキシ基がカルボキシ基から除去されており、かつ／または形式上、水素原子がアミノ基から除去されている、アミノ酸である。
【0053】
「融合」および「融合された」という用語は、ペプチド結合によって、またはペプチドスペーサー（同様にペプチド結合によって接続される）によって接続される、２つの個々に定義されたペプチド／タンパク質配列を含む化合物に関連して使用される。
【0054】
インスリン
本明細書で使用される場合、「ヒトインスリン」という用語は、その構造および特性が周知のヒトインスリンホルモンを意味する。ヒトインスリンは、Ａ鎖およびＢ鎖と称される２つのポリペプチド鎖を有する。Ａ鎖は、２１個のアミノ酸のペプチドであり、Ｂ鎖は、３０個のアミノ酸のペプチドであり、２つの鎖は、ジスルフィド架橋によって接続され、第１の架橋は、Ａ鎖の７位のシステインとＢ鎖の７位のシステインとの間であり、第２の架橋は、Ａ鎖の２０位のシステインとＢ鎖の１９位のシステインとの間である。第３の架橋は、Ａ鎖の６位のシステインとＡ鎖の１１位のシステインとの間に存在する。
本明細書で使用される場合、「ヒトインスリン」という用語は、その構造および特性が周知のヒトインスリンホルモンを意味する。ヒトインスリンは、Ａ鎖およびＢ鎖と称される２つのポリペプチド鎖を有する。Ａ鎖は、２１個のアミノ酸のペプチドであり、Ｂ鎖は、３０個のアミノ酸のペプチドであり、２つの鎖は、ジスルフィド架橋によって接続され、第１の架橋は、Ａ鎖の７位のシステインとＢ鎖の７位のシステインとの間であり、第２の架橋は、Ａ鎖の２０位のシステインとＢ鎖の１９位のシステインとの間である。第３の架橋は、Ａ鎖の６位のシステインとＡ鎖の１１位のシステインとの間に存在する。
【0055】
ヒトインスリンＡ鎖は、以下の配列：ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮ（配列番号２）を有する一方、Ｂ鎖は、以下の配列：ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＴ（配列番号３）を有する。
【0056】
人体では、このホルモンは、プレペプチド－Ｂ－Ａｒｇ Ａｒｇ－Ｃ－Ｌｙｓ Ａｒｇ－Ａ（式中、Ｃは、３１個のアミノ酸の接続ペプチドである）の立体配置にある、２４個のアミノ酸のプレペプチドに続いて８６個のアミノ酸を含むプロインスリンからなる一本鎖前駆体プロインスリン（プレプロインスリン）として合成される。Ａｒｇ－ＡｒｇおよびＬｙｓ－Ａｒｇは、Ａ鎖およびＢ鎖からの接続ペプチドの切断のための切断部位である。
【0057】
本発明による「インスリン」は、本明細書では、ヒトインスリンまたはブタもしくはウシインスリン等の別の種由来のインスリンとして理解されるべきである。
【0058】
「インスリンペプチド」、「インスリン化合物」、または「インスリン」という用語は、本明細書で使用される場合、インスリン活性を有する、すなわち、インスリン受容体を活性化する、ヒトインスリンまたはその類似体もしくは誘導体のいずれかであるペプチドを意味する。
【0059】
インスリン類似体
本明細書で使用される「インスリン類似体」という用語は、インスリンの１つ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基によって置換されており、かつ／または１つ以上のアミノ酸残基がインスリンから欠失しており、かつ／または１つ以上のアミノ酸残基がインスリンに付加および／または挿入されている、修飾されたヒトインスリンを意味する。
本明細書で使用される「インスリン類似体」という用語は、インスリンの１つ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基によって置換されており、かつ／または１つ以上のアミノ酸残基がインスリンから欠失しており、かつ／または１つ以上のアミノ酸残基がインスリンに付加および／または挿入されている、修飾されたヒトインスリンを意味する。
【0060】
本明細書で使用される場合、「変異」という用語は、ヒトインスリンの配列内のアミノ酸の置換または欠失を意味する。変異という用語は、ヒトインスリンの配列への付加、伸長、または延長を含まない。インスリン分子における変異は、鎖（ＡまたはＢ）、位置、および天然アミノ酸残基を置換するアミノ酸残基に対する１文字コードまたは３文字コードを記載して示される。
【0061】
本明細書で使用される場合、インスリン類似体に対する任意の変異は、インスリンペプチド単独に対する変異を意味し、インスリンペプチド／類似体に結合されたいかなるスペーサーペプチドも含まない。
【0062】
「接続ペプチド」または「Ｃ－ペプチド」とは、一本鎖プロインスリン分子のＢ－Ｃ－Ａポリペプチド配列の接続部分「Ｃ」を意味する。ヒトインスリン鎖では、Ｃ－ペプチドは、Ｂ鎖の３０位およびＡ鎖の１位を接続し、３５個のアミノ酸の残基長である。ヒトインスリンにおいて、接続ペプチドは、２つの末端二塩基性アミノ酸配列、例えば、Ａｒｇ－ＡｒｇおよびＬｙｓ－Ａｒｇを含み、これらは、Ａ鎖およびＢ鎖から接続ペプチドを切断して、二本鎖インスリン分子を形成するための切断部位として機能する。
【0063】
「ｄｅｓＢ３０」または「Ｂ（１－２９）」とは、Ｂ３０アミノ酸を欠く天然インスリンＢ鎖またはその類似体を意味し、「Ａ（１－２１）」とは、天然インスリンＡ鎖を意味する。したがって、例えば、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリンは、Ｂ鎖の３０位のアミノ酸が欠失しているヒトインスリン類似体である。
【0064】
本明細書では、Ａ１、Ａ２、およびＡ３などの用語は、（Ｎ末端から数えて）インスリンのＡ鎖のそれぞれ１位、２位、および３位などのアミノ酸を示す。同様に、Ｂ１、Ｂ２、およびＢ３などの用語は、（Ｎ末端から数えて）インスリンのＢ鎖のそれぞれ１位、２位、および３位などのアミノ酸を示す。アミノ酸について一文字コードを使用して、Ａ２１Ａ、Ａ２１Ｇ、およびＡ２１Ｑなどの用語は、Ａ２１位におけるアミノ酸がそれぞれＡ、Ｇ、およびＱであることを示す。アミノ酸について三文字コードを使用して、対応する表現は、それぞれＡ２１Ａｌａ、Ａ２１Ｇｌｙ、およびＡ２１Ｇｌｎである。
【0065】
一実施形態では、本発明のヒトインスリンの類似体または誘導体は、血糖値を低減する能力を有する。
【0066】
一実施形態では、本発明のヒトインスリンの類似体または誘導体は、インスリン受容体を活性化する。
【0067】
一実施形態では、本発明のヒトインスリンの類似体または誘導体は、血糖を低下させる。
【0068】
一実施形態では、本発明の融合ペプチドは、ヒトインスリンの類似体またはその誘導体を含む。
【0069】
一実施形態では、本発明の融合ペプチドは、最大１２個の変異を含むヒトインスリンの類似体を含む。
【0070】
一実施形態では、本発明の融合ペプチドは、最大１０個の変異を含むヒトインスリンの類似体を含む。
【0071】
一実施形態では、本発明の融合ペプチドは、１～６個の変異を含むヒトインスリンの類似体を含む。
【0072】
一実施形態では、本発明の融合ペプチドは、１～３個の変異を含むヒトインスリンの類似体を含む。
【0073】
一実施形態では、本発明の融合ペプチドは、１個の変異を含むヒトインスリンの類似体を含む。
【0074】
一実施形態では、本発明の融合ペプチドは、２個の変異を含むヒトインスリンの類似体を含む。
【0075】
一実施形態では、本発明の融合ペプチドは、３個の変異を含むヒトインスリンの類似体を含む。
【0076】
一実施形態では、本発明の融合ペプチドは、４個の変異を含むヒトインスリンの類似体を含む。
【0077】
一実施形態では、本発明の融合ペプチドは、５個の変異を含むヒトインスリンの類似体を含む。
【0078】
一実施形態では、本発明の融合ペプチドは、６個の変異を含むヒトインスリンの類似体を含む。
【0079】
一実施形態では、本発明の融合ペプチドは、７個の変異を含むヒトインスリンの類似体を含む。
【0080】
一実施形態では、本発明の融合ペプチドは、８個の変異を含むヒトインスリンの類似体を含む。
【0081】
一実施形態では、本発明の融合ペプチドは、９個の変異を含むヒトインスリンの類似体を含む。
【0082】
一実施形態では、本発明の融合ペプチドは、１０個の変異を含むヒトインスリンの類似体を含む。
【0083】
一実施形態では、本発明の融合ペプチドは、ヒトインスリンを含む。
【0084】
一実施形態では、本発明の融合ペプチドは、ｄｅｓＢ３０を含むインスリン類似体を含む。
【0085】
一実施形態では、本発明の融合ペプチドは、Ａ１４Ｅを含むインスリン類似体を含む。
【0086】
一実施形態では、本発明の融合ペプチドは、Ｂ３Ｅを含むインスリン類似体を含む。
【0087】
一実施形態では、本発明の融合ペプチドは、Ａ１４Ｅ、ｄｅｓＢ３０を含むインスリン類似体を含む。
【0088】
一実施形態では、本発明の融合ペプチドは、Ｂ３Ｅ、ｄｅｓＢ３０を含むインスリン類似体を含む。
【0089】
一実施形態では、本発明の融合ペプチドは、ｄｅｓＢ３０を含むインスリン類似体、および前述のインスリン類似体におけるさらに９個の変異を含む。
【0090】
一実施形態では、本発明の融合ペプチドは、ｄｅｓＢ３０を含むインスリン類似体、および前述のインスリン類似体におけるさらに８個の変異を含む。
【0091】
一実施形態では、本発明の融合ペプチドは、ｄｅｓＢ３０を含むインスリン類似体、および前述のインスリン類似体におけるさらに７個の変異を含む。
【0092】
一実施形態では、本発明の融合ペプチドは、ｄｅｓＢ３０を含むインスリン類似体、および前述のインスリン類似体におけるさらに６個の変異を含む。
【0093】
一実施形態では、本発明の融合ペプチドは、ｄｅｓＢ３０を含むインスリン類似体、および前述のインスリン類似体におけるさらに５個の変異を含む。
【0094】
一実施形態では、本発明の融合ペプチドは、ｄｅｓＢ３０を含むインスリン類似体、および前述のインスリン類似体におけるさらに４個の変異を含む。
【0095】
一実施形態では、本発明の融合ペプチドは、ｄｅｓＢ３０を含むインスリン類似体、および前述のインスリン類似体におけるさらに３個の変異を含む。
【0096】
一実施形態では、本発明の融合ペプチドは、ｄｅｓＢ３０を含むインスリン類似体、および前述のインスリン類似体におけるさらに２個の変異を含む。
【0097】
一実施形態では、本発明の融合ペプチドは、ｄｅｓＢ３０を含むインスリン類似体、および前述のインスリン類似体におけるさらに１個の変異を含む。
【0098】
ＥＧＦ（Ａ）
「ＥＧＦ（Ａ）化合物」または「ＥＧＦ（Ａ）ペプチド」という用語は、一般的にＥＧＦ（Ａ）ペプチドを含む融合タンパク質を指すために本明細書で使用され、配列番号１およびその類似体によって定義されるｗｔ－ＬＤＬ－Ｒ（２９３－３３２）を包含する。ＥＧＦ（Ａ）化合物という用語は、ＥＧＦ－（Ａ）ペプチドの誘導体およびその類似体を包含し、すなわち、本明細書に記載されるアシル部分を有するＥＧＦ（Ａ）ペプチド類似体は、ＥＧＦ（Ａ）化合物の典型的な例である。本明細書において、「ＥＧＦ（Ａ）類似体」という用語は、ＬＤＬ－Ｒ（２９３－３３２）（配列番号１）の修飾されたＥＧＦ（Ａ）ドメインを指す。
「ＥＧＦ（Ａ）化合物」または「ＥＧＦ（Ａ）ペプチド」という用語は、一般的にＥＧＦ（Ａ）ペプチドを含む融合タンパク質を指すために本明細書で使用され、配列番号１およびその類似体によって定義されるｗｔ－ＬＤＬ－Ｒ（２９３－３３２）を包含する。ＥＧＦ（Ａ）化合物という用語は、ＥＧＦ－（Ａ）ペプチドの誘導体およびその類似体を包含し、すなわち、本明細書に記載されるアシル部分を有するＥＧＦ（Ａ）ペプチド類似体は、ＥＧＦ（Ａ）化合物の典型的な例である。本明細書において、「ＥＧＦ（Ａ）類似体」という用語は、ＬＤＬ－Ｒ（２９３－３３２）（配列番号１）の修飾されたＥＧＦ（Ａ）ドメインを指す。
【0099】
「ＬＤＬ－Ｒ」、「ＬＤＬ－Ｒ（２９３－３３２）」、「天然ＬＤＬ－Ｒ（２９３－３３２）」、「ＥＧＦ（Ａ）（２９３－３３２）」、「野生型ＥＧＦ（Ａ）」、「ｗｔ－ＥＧＦ（Ａ）」、または「天然ＥＧＦ（Ａ）」の「ＥＧＦ（Ａ）」ドメインという用語は、配列番号１からなるペプチドを指し、これは、
【0100】
Ｇｌｙ－Ｔｈｒ－Ａｓｎ－Ｇｌｕ－Ｃｙｓ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ａｓｎ－Ａｓｎ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｖａｌ－Ｃｙｓ－Ａｓｎ－Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ－Ｉｌｅ－Ｇｌｙ－Ｔｙｒ－Ｇｌｕ－Ｃｙｓ－Ｌｅｕ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ－Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｇｌｎ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ａｌａ－Ｇｌｎ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ｃｙｓ－Ｇｌｕである。
【0101】
この式において、アミノ酸残基の番号付けは、ＬＤＬ－Ｒ（２９３～３３２）のＥＧＦ（Ａ）ドメインの番号付けに従い、式中ＬＤＬ－ＲのＥＧＦ（Ａ）ドメインの最初の（Ｎ末端）アミノ酸残基は、位置番号２９３に番号付けされ、またはその位置と一致され、後続のＣ末端に向かうアミノ酸残基は、最後の（Ｃ末端）アミノ酸残基まで２９４、２９５、２９６などと番号付けされ、これはＬＤＬ－ＲのＥＧＦ（Ａ）ドメインでは、番号３３２がＧｌｕである。
【0102】
番号付けは、配列表では別の方法で行われ、配列番号１の最初のアミノ酸残基（Ｇｌｙ）には、番号１が割り当てられ、最後の（Ｇｌｕ）は４０である。同じことが配列表の他の配列に対しても適用され、すなわちＮ末端アミノ酸には、ＬＤＬ－Ｒ（２９３－３３２）に関して２９３Ｇｌｙまたは２９３置換アミノ酸残基に対するその位置決めに関係なく、番号１が割り当てられる。しかしながら、本明細書では、アミノ酸位置の番号付けは、上で説明したとおりＬＤＬ－Ｒ（２９３－３３２）に関する。
【0103】
ＥＧＦ（Ａ）類似体
「ＥＧＦ（Ａ）類似体」という用語は一般に、配列が参照アミノ酸配列と比較したときに１つ以上のアミノ酸変化を有するペプチドを指す。
「ＥＧＦ（Ａ）類似体」という用語は一般に、配列が参照アミノ酸配列と比較したときに１つ以上のアミノ酸変化を有するペプチドを指す。
【0104】
「ＬＤＬ－Ｒ（２９３－３３２）のＥＧＦ（Ａ）ドメイン」、「配列番号１のＬＤＬ－Ｒ（２９３－３３２）類似体のＥＧＦ（Ａ）ドメイン」、「ＬＤＬ－Ｒ（２９３－３３２）類似体」、「ＥＧＦ（Ａ）類似体」、または「配列番号１の類似体」は、本明細書で使用される場合、配列が変異、すなわち、配列番号１に対するアミノ酸置換または欠失を含むペプチドとみなされ得る。
【0105】
本明細書で使用される場合、ＥＧＦ（Ａ）類似体に対する任意の変異は、ＥＧＦ（Ａ）ペプチド単独に対する変異を意味し、ＥＧＦ（Ａ）ペプチド／類似体に結合されたいかなるスペーサーペプチドも含まない。
【0106】
一実施形態では、配列番号１によるＬＤＬ－Ｒ（２９３－３３２）のＥＧＦ（Ａ）ドメイン、またはその類似体は、ヒト低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬ－Ｒ）へのＰＣＳＫ９結合を阻害することができる。
【0107】
一実施形態では、配列番号１によるＬＤＬ－Ｒ（２９３－３３２）のＥＧＦ（Ａ）ドメイン、またはその類似体は、ＬＤＬ－ＲへのＰＣＳＫ９結合を阻害する能力を有する。
【0108】
一実施形態では、配列番号１によるＬＤＬ－Ｒ（２９３－３３２）のＥＧＦ（Ａ）ドメイン、またはその類似体は、ＬＤＬ－ＲへのＰＣＳＫ９結合を阻害し、かつ血中のＬＤＬレベルを低減する能力を有する。
【0109】
一実施形態では、配列番号１によるＬＤＬ－Ｒ（２９３－３３２）のＥＧＦ（Ａ）ドメイン、またはその類似体は、血中ＬＤＬレベルを低減する。
【0110】
一実施形態では、本発明の融合ペプチドは、配列番号１のＬＤＬ－Ｒ（２９３－３３２）類似体のＥＧＦ（Ａ）ドメインを含み、前述のＥＧＦ（Ａ）類似体は、配列番号１と比較して１～１５個のアミノ酸変異を含む。
【0111】
一実施形態では、本発明の融合ペプチドは、配列番号１のＬＤＬ－Ｒ（２９３－３３２）類似体のＥＧＦ（Ａ）ドメインを含み、前述のＥＧＦ（Ａ）類似体は、配列番号１と比較して１～１０個のアミノ酸変異を含む。
【0112】
一実施形態では、本発明の融合ペプチドは、配列番号１のＬＤＬ－Ｒ（２９３－３３２）類似体のＥＧＦ（Ａ）ドメインを含み、前述のＥＧＦ（Ａ）類似体は、配列番号１と比較して１～８個のアミノ酸変異を含む。
【0113】
一実施形態では、本発明の融合ペプチドは、配列番号１のＬＤＬ－Ｒ（２９３－３３２）類似体のＥＧＦ（Ａ）ドメインを含み、前述のＥＧＦ（Ａ）類似体は、配列番号１と比較して１～６個のアミノ酸変異を含む。
【0114】
一実施形態では、本発明の融合ペプチドは、配列番号１のＬＤＬ－Ｒ（２９３－３３２）類似体のＥＧＦ（Ａ）ドメインを含み、前述のＥＧＦ（Ａ）類似体は、１～５個の変異を含む。
【0115】
一実施形態では、本発明の融合ペプチドは、配列番号１のＬＤＬ－Ｒ（２９３－３３２）類似体のＥＧＦ（Ａ）ドメインを含み、前述のＥＧＦ（Ａ）類似体は、１個の変異を含む。
【0116】
一実施形態では、本発明の融合ペプチドは、配列番号１のＬＤＬ－Ｒ（２９３－３３２）類似体のＥＧＦ（Ａ）ドメインを含み、前述のＥＧＦ（Ａ）類似体は、２個の変異を含む。
【0117】
一実施形態では、本発明の融合ペプチドは、配列番号１のＬＤＬ－Ｒ（２９３－３３２）類似体のＥＧＦ（Ａ）ドメインを含み、前述のＥＧＦ（Ａ）類似体は、３個の変異を含む。
【0118】
一実施形態では、本発明の融合ペプチドは、配列番号１のＬＤＬ－Ｒ（２９３－３３２）類似体のＥＧＦ（Ａ）ドメインを含み、前述のＥＧＦ（Ａ）類似体は、４個の変異を含む。
【0119】
一実施形態では、本発明の融合ペプチドは、配列番号１のＬＤＬ－Ｒ（２９３－３３２）類似体のＥＧＦ（Ａ）ドメインを含み、前述のＥＧＦ（Ａ）類似体は、５個の変異を含む。
【0120】
一実施形態では、本発明の融合ペプチドは、配列番号１のＬＤＬ－Ｒ（２９３－３３２）類似体のＥＧＦ（Ａ）ドメインを含み、前述のＥＧＦ（Ａ）類似体は、６個の変異を含む。
【0121】
一実施形態では、本発明の融合ペプチドは、配列番号１のＬＤＬ－Ｒ（２９３－３３２）類似体のＥＧＦ（Ａ）ドメインを含み、前述のＥＧＦ（Ａ）類似体は、７個の変異を含む。
【0122】
一実施形態では、本発明の融合ペプチドは、配列番号１のＬＤＬ－Ｒ（２９３－３３２）類似体のＥＧＦ（Ａ）ドメインを含み、前述のＥＧＦ（Ａ）類似体は、８個の変異を含む。
【0123】
一実施形態では、本発明の融合ペプチドは、配列番号１のＬＤＬ－Ｒ（２９３－３３２）類似体のＥＧＦ（Ａ）ドメインを含み、前述のＥＧＦ（Ａ）類似体は、９個の変異を含む。
【0124】
一実施形態では、本発明の融合ペプチドは、配列番号１のＬＤＬ－Ｒ（２９３－３３２）類似体のＥＧＦ（Ａ）ドメインを含み、前述のＥＧＦ（Ａ）類似体は、１０個の変異を含む。
【0125】
言い換えれば、ペプチド類似体は、天然ＬＤＬ－Ｒ（２９３－３３２）ＥＧＦ（Ａ）ペプチド、すなわち、天然ＬＤＬ－Ｒ（２９３－３３２）ＥＧＦ（Ａ）（配列番号１）と比較したときに多数のアミノ酸残基が変化しているその類似体を参照することによって記述されてもよい。これらの変化は、独立して、１つ以上のアミノ酸変異を表し得る。
【0126】
本発明の融合ペプチドに組み込まれたＥＧＦ（Ａ）類似体は、以下のＬＤＬ－Ｒ（２９３－３３２）ＥＧＦ（Ａ）類似体と呼ばれてもよい：（３０１Ｌｅｕ、３０９Ａｒｇ、３１２Ｇｌｕ、３２１Ｇｌｕ）ＬＤＬ－Ｒ（２９３－３３２）ＥＧＦ（Ａ）、または（Ｌｅｕ３０１、Ａｒｇ３０９、Ｇｌｕ３１２、Ｇｌｕ３２１）－ＬＤＬ－Ｒ（２９３－３３２）ＥＧＦ（Ａ）、または（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）ＬＤＬ－Ｒ（２９３－３３２）、または（Ｌ３０１、Ｒ３０９、Ｅ３１２、Ｅ３２１）ＬＤＬ－Ｒ（２９３－３３２）。これは、この類似体が天然ＬＤＬ－Ｒ（２９３－３３２）とアライメントされているとき、それがｉ）アライメントに従って天然ＬＤＬ－Ｒ（２９３－３３２）ＥＧＦ（Ａ）の３０１位に対応する類似体の位置におけるＬｅｕ、ｉｉ）天然ＬＤＬ－Ｒ（２９３－３３２）ＥＧＦ（Ａ）の３０９位に対応する類似体の位置におけるＡｒｇ、ｉｉｉ）天然ＬＤＬ－Ｒ（２９３－３３２）ＥＧＦ（Ａ）の３１２位に対応する類似体の位置におけるＧｌｕ、ｉｖ）天然ＬＤＬ－Ｒ（２９３－３３２）ＥＧＦ（Ａ）の３２１位に対応する類似体の位置におけるＧｌｕを有することを意味する。
【0127】
一定の特定された変化を「含む」類似体は、配列番号１と比較したときに、さらなる変化を含み得る。
【0128】
本発明の融合ペプチド内のＥＧＦ（Ａ）ペプチド類似体は、ＡｓｎからＬｅｕまでのアミノ酸残基３０１のアミノ酸残基のアミノ酸置換を含み、Ａｓｎ３０１Ｌｅｕ、３０１Ｌｅｕ、または単に３０１Ｌとも記述される。
【0129】
一実施形態では、本発明の融合ペプチドは、配列番号１のＥＧＦ（Ａ）類似体を含み、前述のＥＧＦ（Ａ）類似体は、３０１Ｌｅｕを含む。
【0130】
一実施形態では、本発明の融合ペプチドは、配列番号１のＥＧＦ（Ａ）類似体を含み、前述のＥＧＦ（Ａ）類似体は、３０９Ｒを含む。
【0131】
一実施形態では、本発明の融合ペプチドは、配列番号１のＥＧＦ（Ａ）類似体を含み、前述のＥＧＦ（Ａ）類似体は、３１２Ｅを含む。
【0132】
一実施形態では、本発明の融合ペプチドは、配列番号１のＥＧＦ（Ａ）類似体を含み、前述のＥＧＦ（Ａ）類似体は、３２１Ｅを含む。
【0133】
一実施形態では、本発明の融合ペプチドは、配列番号１のＥＧＦ（Ａ）類似体を含み、前述のＥＧＦ（Ａ）類似体は、３０１Ｌおよび３０９Ｒを含む。
【0134】
一実施形態では、本発明の融合ペプチドは、配列番号１のＥＧＦ（Ａ）類似体を含み、前述のＥＧＦ（Ａ）類似体は、３０１Ｌ、３０９Ｒ、および３１２Ｅを含む。
【0135】
一実施形態では、本発明の融合ペプチドは、配列番号１のＥＧＦ（Ａ）類似体を含み、前述のＥＧＦ（Ａ）類似体は、３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、および３２１Ｅを含む。
【0136】
一実施形態では、本発明の融合ペプチドは、配列番号１のＥＧＦ（Ａ）類似体を含み、ＥＧＦ（Ａ）ペプチド類似体は、以下に列挙される群ｉ～ｖｉｉのいずれかによって表されるアミノ酸変異を含む。
ｉ．３０１Ｌｅｕ
ｉｉ．３０１Ｌｅｕおよび３０９Ａｒｇ
ｉｉｉ．３０１Ｌｅｕおよび３１２Ｇｌｕ
ｉｖ．３０１Ｌｅｕおよび３２１Ｇｌｕ
ｖ．３０１Ｌｅｕ、３０９Ａｒｇ、３１２Ｇｌｕ
ｖｉ．３０１Ｌｅｕ、３０９Ａｒｇおよび３２１Ｇｌｕ
ｖｉｉ．３０１Ｌｅｕ、３０９Ａｒｇ、３１２Ｇｌｕおよび３２１Ｇｌｕ。
ｉ．３０１Ｌｅｕ
ｉｉ．３０１Ｌｅｕおよび３０９Ａｒｇ
ｉｉｉ．３０１Ｌｅｕおよび３１２Ｇｌｕ
ｉｖ．３０１Ｌｅｕおよび３２１Ｇｌｕ
ｖ．３０１Ｌｅｕ、３０９Ａｒｇ、３１２Ｇｌｕ
ｖｉ．３０１Ｌｅｕ、３０９Ａｒｇおよび３２１Ｇｌｕ
ｖｉｉ．３０１Ｌｅｕ、３０９Ａｒｇ、３１２Ｇｌｕおよび３２１Ｇｌｕ。
【0137】
ＥＧＦ（Ａ）インスリン融合タンパク質
本発明の化合物または融合ペプチドは、インスリンペプチド、ＥＧＦ（Ａ）ペプチド、およびスペーサーを含み、
ｉ．前述のインスリンペプチドは、ヒトインスリン（配列番号２および３）またはヒトインスリンの類似体であり、
ｉｉ．前述のＥＧＦ（Ａ）ペプチドは、ＬＤＬ－Ｒ（２９３－３３２）（配列番号１）のＥＧＦ（Ａ）ドメインの類似体であり、かつ
ｉｉｉ．前述のスペーサーは、インスリン類似体Ｂ鎖のＮ末端をＥＧＦ（Ａ）類似体のＣ末端と接続するペプチドリンカーである。
本発明の化合物または融合ペプチドは、インスリンペプチド、ＥＧＦ（Ａ）ペプチド、およびスペーサーを含み、
ｉ．前述のインスリンペプチドは、ヒトインスリン（配列番号２および３）またはヒトインスリンの類似体であり、
ｉｉ．前述のＥＧＦ（Ａ）ペプチドは、ＬＤＬ－Ｒ（２９３－３３２）（配列番号１）のＥＧＦ（Ａ）ドメインの類似体であり、かつ
ｉｉｉ．前述のスペーサーは、インスリン類似体Ｂ鎖のＮ末端をＥＧＦ（Ａ）類似体のＣ末端と接続するペプチドリンカーである。
【0138】
本発明の化合物または融合タンパク質は、融合タンパク質のアミノ酸残基に結合した置換基をさらに含む。
【0139】
ＥＧＦ（Ａ）インスリン融合タンパク質の名称は、上で詳述したように、ＥＧＦ（Ａ）およびヒトインスリンタンパク質に対する類似体および誘導体として与えられる。２つのタンパク質と融合タンパク質に結合した置換基とを接続するスペーサーの命名は、以下で詳述される。
【0140】
本発明の化合物は、互換的に「本発明（ｔｈｅ ｉｎｖｅｎｔｉｏｎ）の化合物」、「本発明（ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｔ ｉｎｖｅｎｔｉｏｎ）の化合物」、「二官能性化合物」、「本発明（ｔｈｅ ｉｎｖｅｎｔｉｏｎ）の融合タンパク質」、「本発明（ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｔ ｉｎｖｅｎｔｉｏｎ）の融合タンパク質」と呼ばれてもよい。
【0141】
スペーサー
しばしば、融合ペプチド／タンパク質は、２つのペプチド／タンパク質の末端に存在する任意の機能性が、他のペプチド／タンパク質の近接によって妨害されないことを確実にするためのスペーサーを含む。
しばしば、融合ペプチド／タンパク質は、２つのペプチド／タンパク質の末端に存在する任意の機能性が、他のペプチド／タンパク質の近接によって妨害されないことを確実にするためのスペーサーを含む。
【0142】
一実施形態では、スペーサーは、ペプチドであり、本明細書において、スペーサーペプチド、またはペプチドスペーサー、またはペプチドリンカーと称される。様々なスペーサーペプチドが当該技術分野において既知であり、融合化合物を得るためにインスリン類似体とＥＧＦ（Ａ）類似体との間に配置されてもよい。
【0143】
２つのペプチドセグメントが融合されるとき、その順序は、結果として生じる融合化合物の機能性、およびそれを含む誘導体に影響を与え得る。
【0144】
本発明の一実施形態では、Ｎ末端から始まるＥＧＦ（Ａ）類似体およびインスリン類似体の順序は、ＥＧＦ（Ａ）類似体、続いて、インスリン類似体であり、任意選択でスペーサーペプチドにより分離される。一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体のＣ末端は、インスリン類似体Ｂ鎖のＮ末端と融合される。
【0145】
一実施形態では、スペーサーは、ペプチド結合を介して接続された４～８０個のアミノ酸からなるペプチドセグメントである。
【0146】
一実施形態では、スペーサーは、以下のアミノ酸残基のうちの１つ以上を含む：Ａｌａ（Ａ）、Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｇｌｎ（Ｑ）。
【0147】
驚くべきことに、本発明者らは、スペーサーのアミノ酸組成が、血糖値を低減する化合物の能力に影響を与えたことを発見した。非荷電スペーサー（ＧＱＡＰ）ｎまたは（ＧＡＱＰ）ｎを含む本発明の化合物は、（ＧＱＥＰ）ｎなどの荷電スペーサーを含む対照薬化合物と比較して、優れた血中の低減を示した。さらに、スペーサーの長さが、血糖値を低減する化合物の能力に影響を与えたこともわかった。
【表1】
【0148】
実施例４のＥＧＦ（Ａ）－インスリン融合タンパク質誘導体内のスペーサーは、［ＧＡＱＰ］２と命名され、ＥＧＦ（Ａ）ペプチドのＣ末端残基をインスリンＢ鎖のＮ末端残基と接続するスペーサーが、配列（ＧＡＱＰ）２を有することを意味し、ＧＡＱＰＧＡＱＰまたは２ｘＧＡＱＰまたは［ＧＡＱＰ］２または２ｘ（ＧＡＱＰ）とも表示され得る。アミノ酸残基は、その完全な名称、１文字のコード、および／または３文字のコードによって識別され得る。これら３つの方法は、完全に同等であり、互換性がある。
【0149】
同様に、実施例２のＥＧＦ（Ａ）－インスリン融合タンパク質誘導体内のスペーサーは、［ＧＡＱＰ］１０と命名され、ＥＧＦ（Ａ）ペプチドのＣ末端残基をインスリンＢ鎖のＮ末端残基と接続するスペーサーが、配列（ＧＡＱＰ）１０を有することを意味し、１０ｘＧＡＱＰ、［ＧＡＱＰ］１０、１０ｘ（ＧＡＱＰ）、またはＧＡＱＰＧＡＱＰＧＡＱＰＧＡＱＰＧＡＱＰＧＡＱＰＧＡＱＰＧＡＱＰＧＡＱＰＧＡＱＰとも表示され得る。
【0150】
一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、（ＧＱＥＰ）ｎを含む対照薬化合物と比較して、優れた血糖低減を示す。
【0151】
一実施形態では、スペーサーが（ＧＡＱＰ）ｎまたは（ＧＱＡＰ）ｎを含む本発明の融合タンパク質は、（ＧＱＥＰ）ｎを含む対照薬化合物と比較して、優れた血糖低減を示す。
【0152】
別の態様では、スペーサーが（ＧＡＱＰ）ｎまたは（ＧＱＡＰ）ｎ（ここで、ｎ＝１～２０）を含む本発明の融合タンパク質は、（ＧＱＥＰ）ｎを含む対照薬化合物と比較して、優れた血糖低減を示す。
【0153】
別の態様では、スペーサーが（ＧＡＱＰ）ｎまたは（ＧＱＡＰ）ｎ（ここで、ｎ＝２～１９）を含む本発明の融合タンパク質は、（ＧＱＥＰ）ｎを含む対照薬化合物と比較して、優れた血糖低減を示す。
【0154】
別の実施形態では、スペーサーが（ＧＡＱＰ）ｎ（ここで、ｎ＝２～１０）を含む本発明の融合タンパク質は、（ＧＱＥＰ）ｎを含む対照薬化合物と比較して、優れた血糖低減を示す。
【0155】
別の実施形態では、スペーサーが（ＧＡＱＰ）ｎ（ここで、ｎ＝２～１０）を含む本発明の融合タンパク質は、（ＧＱＥＰ）ｎを含む対照薬化合物および（ＧＡＱＰ）ｎ（ｎ＝１２～１９）を含む化合物の両方と比較して、優れた血糖低減を示す。
【0156】
一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、（ＧＡＱＰ）ｎまたは（ＧＱＡＰ）ｎ（ここで、ｎ＝１～２０）を含むスペーサーを含む。
【0157】
一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、（ＧＡＱＰ）ｎまたは（ＧＱＡＰ）ｎ（ここで、ｎ＝２～１９）を含むスペーサーを含む。
【0158】
一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、（ＧＡＱＰ）ｎまたは（ＧＱＡＰ）ｎ（ここで、ｎ＝２～１２）を含むスペーサーを含む。
【0159】
一実施形態では、本発明の融合ペプチドは、（ＧＡＱＰ）ｎまたは（ＧＱＡＰ）ｎ（ここで、ｎ＝２～１０）を含むスペーサーを含む。
【0160】
一実施形態では、本発明の融合ペプチドは、（ＧＡＱＰ）ｎまたは（ＧＱＡＰ）ｎ（ここで、ｎ＝２～８）を含むスペーサーを含む。
【0161】
一実施形態では、本発明の融合ペプチドは、（ＧＡＱＰ）ｎまたは（ＧＱＡＰ）ｎ（ここで、ｎ＝２～６）を含むスペーサーを含む。
【0162】
一実施形態では、本発明の融合ペプチドは、（ＧＡＱＰ）ｎまたは（ＧＱＡＰ）ｎ（ここで、＝２～４）を含むスペーサーを含む。
【0163】
一実施形態では、本発明の融合ペプチドは、（ＧＡＱＰ）ｎまたは（ＧＱＡＰ）ｎ（ここで、ｎ＝４～６）を含むスペーサーを含む。
【0164】
一実施形態では、本発明の融合ペプチドは、（ＧＡＱＰ）ｎまたは（ＧＱＡＰ）ｎ（ここで、ｎ＝２）を含むスペーサーを含む。
【0165】
一実施形態では、本発明の融合ペプチドは、（ＧＡＱＰ）ｎまたは（ＧＱＡＰ）ｎ（ここで、ｎ＝３）を含むスペーサーを含む。
【0166】
一実施形態では、本発明の融合ペプチドは、（ＧＡＱＰ）ｎまたは（ＧＱＡＰ）ｎ（ここで、ｎ＝４）を含むスペーサーを含む。
【0167】
一実施形態では、本発明の融合ペプチドは、（ＧＡＱＰ）ｎまたは（ＧＱＡＰ）ｎ（ここで、ｎ＝５）を含むスペーサーを含む。
【0168】
一実施形態では、本発明の融合ペプチドは、（ＧＡＱＰ）ｎまたは（ＧＱＡＰ）ｎ（ここで、ｎ＝６）を含むスペーサーを含む。
【0169】
一実施形態では、本発明の融合ペプチドは、（ＧＡＱＰ）ｎまたは（ＧＱＡＰ）ｎ（ここで、ｎ＝７）を含むスペーサーを含む。
【0170】
一実施形態では、本発明の融合ペプチドは、（ＧＡＱＰ）ｎまたは（ＧＱＡＰ）ｎ（ここで、ｎ＝８）を含むスペーサーを含む。
【0171】
一実施形態では、本発明の融合ペプチドは、（ＧＡＱＰ）ｎまたは（ＧＱＡＰ）ｎ（ここで、ｎ＝９）を含むスペーサーを含む。
【0172】
一実施形態では、本発明の融合ペプチドは、（ＧＡＱＰ）ｎまたは（ＧＱＡＰ）ｎ（ここで、ｎ＝１０）を含むスペーサーを含む。
【0173】
一実施形態では、本発明の融合ペプチドは、（ＧＡＱＰ）ｎまたは（ＧＱＡＰ）ｎ（ここで、ｎ＝１１）を含むスペーサーを含む。
【0174】
一実施形態では、本発明の融合ペプチドは、（ＧＡＱＰ）ｎまたは（ＧＱＡＰ）ｎ（ここで、ｎ＝１２）を含むスペーサーを含む。
【0175】
一実施形態では、本発明の融合ペプチドは、（ＧＡＱＰ）ｎまたは（ＧＱＡＰ）ｎ（ここで、ｎ＝１３）を含むスペーサーを含む。
【0176】
一実施形態では、本発明の融合ペプチドは、（ＧＡＱＰ）ｎまたは（ＧＱＡＰ）ｎ（ここで、ｎ＝１４）を含むスペーサーを含む。
【0177】
一実施形態では、本発明の融合ペプチドは、（ＧＡＱＰ）ｎまたは（ＧＱＡＰ）ｎ（ここで、ｎ＝１５）を含むスペーサーを含む。
【0178】
一実施形態では、本発明の融合ペプチドは、（ＧＡＱＰ）ｎまたは（ＧＱＡＰ）ｎ（ここで、ｎ＝１６）を含むスペーサーを含む。
【0179】
一実施形態では、本発明の融合ペプチドは、（ＧＡＱＰ）ｎまたは（ＧＱＡＰ）ｎ（ここで、ｎ＝１７）を含むスペーサーを含む。
【0180】
一実施形態では、本発明の融合ペプチドは、（ＧＡＱＰ）ｎまたは（ＧＱＡＰ）ｎ（ここで、ｎ＝１８）を含むスペーサーを含む。
【0181】
一実施形態では、本発明の融合ペプチドは、（ＧＡＱＰ）ｎまたは（ＧＱＡＰ）ｎ（ここで、ｎ＝１９）を含むスペーサーを含む。
【0182】
一実施形態では、本発明の融合ペプチドは、（ＧＡＱＰ）ｎまたは（ＧＱＡＰ）ｎ（ここで、ｎ＝２０）を含むスペーサーを含む。
【0183】
一実施形態では、本発明の融合ペプチドは、（ＧＡＱＰ）ｎもしくは（ＧＱＡＰ）ｎ（ここで、ｎ＝２～１９）、または［（ＧＡＱＰ）ｎもしくは（ＧＱＡＰ）ｎ］（ここで、ｎ＝２～１０）からなるスペーサーを含む。
【0184】
一実施形態では、本発明の融合ペプチドは、（ＧＡＱＰ）ｎもしくは（ＧＱＡＰ）ｎ（ここで、ｎ＝２～１９）、または［（ＧＡＱＰ）ｎもしくは（ＧＱＡＰ）ｎ］（ここで、ｎ＝２～６）からなるスペーサーを含む。
【0185】
置換基
一実施形態では、置換基／アシル部分は、本発明の融合タンパク質（すなわち、二官能性インスリンＥＧＦ（Ａ）融合化合物または二官能性化合物）に結合される。
一実施形態では、置換基／アシル部分は、本発明の融合タンパク質（すなわち、二官能性インスリンＥＧＦ（Ａ）融合化合物または二官能性化合物）に結合される。
【0186】
置換基は、ＥＧＦ（Ａ）ペプチドの機能性に対する効果がないかまたは最小であり、インスリン機能性に対して期待される効果、すなわち、ＥＧＦ（Ａ）ペプチドなしでインスリンにアシル部分を結合する効果と類似したインスリン受容体親和性の低減を有することが望ましい。
【0187】
一実施形態では、アシル部分は、インスリン類似体配列内のＬｙｓ／Ｋアミノ酸残基を介して結合される。
【0188】
一実施形態では、本発明の化合物に結合される置換基は、一般式（Ｉ）：Ａｃｙ－ＡＡ２ｍ－ＡＡ３ｐ－を有し、式中、
Ａｃｙは、約１６～約２０個の炭素原子を含む脂肪二酸であり、
ＡＡ２は、酸性アミノ酸残基であり、式中、ｍは、１～１０の範囲の整数であり、
ＡＡ３は、中性のアルキレングリコール含有アミノ酸残基であり、ｐは、１～１０の範囲の整数であり、
ＡＡ２残基およびＡＡ３残基の最大数は、１０であり、
ＡＡ２残基およびＡＡ３残基は、任意の順序で現れてもよいか、
またはその薬学的に許容される塩、アミド、もしくはエステルを有する。
Ａｃｙは、約１６～約２０個の炭素原子を含む脂肪二酸であり、
ＡＡ２は、酸性アミノ酸残基であり、式中、ｍは、１～１０の範囲の整数であり、
ＡＡ３は、中性のアルキレングリコール含有アミノ酸残基であり、ｐは、１～１０の範囲の整数であり、
ＡＡ２残基およびＡＡ３残基の最大数は、１０であり、
ＡＡ２残基およびＡＡ３残基は、任意の順序で現れてもよいか、
またはその薬学的に許容される塩、アミド、もしくはエステルを有する。
【0189】
一実施形態では、置換基は、式（Ｉ）Ａｃｙ－ＡＡ２ｍ－ＡＡ３ｐ－を有し、式中、前述のＡｃｙは、１，１６－ヘキサデカン二酸、１，１８－オクタデカン二酸、および１，２０－エイコサン二酸から選択される脂肪二酸基を含む。
【0190】
一実施形態では、置換基は、式（Ｉ）Ａｃｙ－ＡＡ２ｍ－ＡＡ３ｐ－を有し、式中、前述のＡｃｙは、脂肪二酸基１，１６－ヘキサデカン二酸を含む。
【0191】
一実施形態では、置換基は、式（Ｉ）Ａｃｙ－ＡＡ２ｍ－ＡＡ３ｐ－を有し、式中、前述のＡｃｙは、脂肪二酸基１，１８－オクタデカン二酸を含む。
【0192】
一実施形態では、置換基は、式（Ｉ）Ａｃｙ－ＡＡ２ｍ－ＡＡ３ｐ－を有し、式中、前述のＡｃｙは、脂肪二酸基１，２０－エイコサン二酸を含む。
【0193】
一実施形態では、置換基は、式（Ｉ）Ａｃｙ－ＡＡ２ｍ－ＡＡ３ｐ－を有し、式中、前述のＡＡ２ｍはｇＧｌｕを含み、以下の構造によって表されるガンマグルタミン酸残基を表す。
【化1】
【0194】
一実施形態では、置換基は、式（Ｉ）Ａｃｙ－ＡＡ２ｍ－ＡＡ３ｐ－を有し、式中、前述のＡＡ３ｐは、［２－（２－アミノエトキシ）エトキシ］アセチル、またはアミノ酸残基８－アミノ－３，６－ジオキサオクタン酸－ＮＨ（ＣＨ２）２Ｏ（ＣＨ２）２ＯＣＨ２ＣＯ－を含み、以下の構造によって表される。
【化2】
【0195】
一実施形態では、置換基は、式（Ｉ）Ａｃｙ－ＡＡ２ｍ－ＡＡ３ｐ－を有し、式中、ＡＡ２ｍ－ＡＡ３ｐ－は独立して、ｇＧｌｕ－ＯＥＧまたはｇＧｌｕ－ＯＥＧ－ＯＥＧによって表される。
【0196】
一実施形態では、置換基は、式（Ｉ）Ａｃｙ－ＡＡ２ｍ－ＡＡ３ｐ－を有し、式中、ＡＡ２ｍ－ＡＡ３ｐ－は、ｇＧｌｕ－ＯＥＧによって表される。
【0197】
一実施形態では、置換基は、式（Ｉ）Ａｃｙ－ＡＡ２ｍ－ＡＡ３ｐ－を有し、式中、ＡＡ２ｍ－ＡＡ３ｐ－は、ｇＧｌｕ－ＯＥＧ－ＯＥＧによって表される。
【0198】
一実施形態では、置換基は、式（Ｉ）Ａｃｙ－ＡＡ２ｍ－ＡＡ３ｐ－を有し、以下によって独立して表される：
ｉ．Ｃ１６二酸－ｇＧｌｕ、
ｉｉ．Ｃ１８二酸－ｇＧｌｕ－ＯＥＧ、
ｉｉｉ．Ｃ１８二酸－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ、または
ｉｖ．Ｃ２０二酸－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ。
ｉ．Ｃ１６二酸－ｇＧｌｕ、
ｉｉ．Ｃ１８二酸－ｇＧｌｕ－ＯＥＧ、
ｉｉｉ．Ｃ１８二酸－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ、または
ｉｖ．Ｃ２０二酸－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ。
【0199】
一実施形態では、置換基は、式（Ｉ）Ａｃｙ－ＡＡ２ｍ－ＡＡ３ｐ－を有し、Ｃ１６二酸－ｇＧｌｕによって表される。
【0200】
一実施形態では、置換基は、式（Ｉ）Ａｃｙ－ＡＡ２ｍ－ＡＡ３ｐ－を有し、Ｃ１８二酸－ｇＧｌｕ－ＯＥＧによって表される。
【0201】
一実施形態では、置換基は、式（Ｉ）Ａｃｙ－ＡＡ２ｍ－ＡＡ３ｐ－を有し、Ｃ１８二酸－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧによって表される。
【0202】
一実施形態では、置換基は、式（Ｉ）Ａｃｙ－ＡＡ２ｍ－ＡＡ３ｐ－を有し、Ｃ２０二酸－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧによって表される。
【0203】
別の実施形態では、本発明の融合ペプチドに結合したアシル部分は、一般式Ａｃｙ－ＡＡ２ｍ－ＡＡ３ｐ－（Ｉ）を有し、式中、ＡＡ２は、Ｌ－またはＤ－ｇＧｌｕ、Ｌ－またはＤ－Ｇｌｕ、Ｌ－またはＤ－Ａｓｐ、Ｌ－またはＤ－ホモＧｌｕから選択される。
【0204】
ＡＡ２と指定される酸性アミノ酸残基は、２つのカルボン酸基と、１つの一次または二次アミノ基とを含む、最大約２００Ｄａの分子量のアミノ酸である。
【0205】
ＡＡ３と指定される中性アルキレングリコール含有アミノ酸残基は、アルキレングリコール部分であり、任意選択で、一方の末端にカルボン酸官能基、および他方の末端にアミノ基官能基を含有するオリゴまたはポリアルキレングリコール部分である。
本明細書において、アルキレングリコール部分という用語は、モノ－アルキレングリコール部分ならびにオリゴ－アルキレングリコール部分を含む。モノおよびオリゴアルキレングリコールは、モノおよびオリゴエチレングリコール系、モノおよびオリゴプロピレングリコール系、ならびにモノおよびオリゴブチレングリコール系鎖、すなわち、反復単位ＣＨ２ＣＨ２Ｏ－、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｏ－、または－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｏ－に基づく鎖を含む。アルキレングリコール部分は、単分散である（明確に定義された長さ／分子量を有する）。モノアルキレングリコール部分は、各末端に異なる基を含有する－ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ－、－ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｏ－、または－ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｏ－を含む。
本明細書において、アルキレングリコール部分という用語は、モノ－アルキレングリコール部分ならびにオリゴ－アルキレングリコール部分を含む。モノおよびオリゴアルキレングリコールは、モノおよびオリゴエチレングリコール系、モノおよびオリゴプロピレングリコール系、ならびにモノおよびオリゴブチレングリコール系鎖、すなわち、反復単位ＣＨ２ＣＨ２Ｏ－、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｏ－、または－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｏ－に基づく鎖を含む。アルキレングリコール部分は、単分散である（明確に定義された長さ／分子量を有する）。モノアルキレングリコール部分は、各末端に異なる基を含有する－ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ－、－ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｏ－、または－ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｏ－を含む。
【0206】
本明細書で言及されるように、ＡＡ２およびＡＡ３が式（Ｉ）（Ａｃｙ－ＡＡ２ｍ－ＡＡ３ｐ－）でアシル部分に現れる順序は、独立して交換され得る。結果として、式Ａｃｙ－ＡＡ２ｍ－ＡＡ３ｐ－はまた、例えば、式Ａｃｙ－ＡＡ２ｍ－ＡＡ３ｐ－、式Ａｃｙ－ＡＡ２－ＡＡ３ｎ－ＡＡ２－、および式Ａｃｙ－ＡＡ３ｐ－ＡＡ２ｍ－などの部分も含み、式中、ＡｃｙＡＡ２、ＡＡ３、ｎ、ｍ、およびｐは、本明細書に定義されるとおりである。
【0207】
本明細書で言及されるように、部分Ａｃｙ、ＡＡ２、および／またはＡＡ３との間の接続は、それらが形式的に構築される親化合物から水を除去することによって、アミド結合（ペプチド結合）形成（－ＣＯＮＨ－）によって形式的に得られる。これは、式（Ｉ）（Ａｃｙ－ＡＡ２ｍ－ＡＡ３ｐ－（式中、Ａｃｙ、ＡＡ２、ＡＡ３、ｍ、およびｐは本明細書に定義されるとおりである））を有するアシル部分の完全な式を得るために、形式的に、Ａｃｙ、ＡＡ２、およびＡＡ３という用語に対して与えられる化合物をとり、それらから水素および／またはヒドロキシルを除去して、形式的に、そのようにして得られた構築ブロックを遊離末端で接続しなければならないことを意味する。
【0208】
置換基の命名について、ある場合では、ＩＵＰＡＣ命名法に従って命名が行われ、他の場合では、命名は、ペプチド命名法として行われる。
【0209】
一例として、以下の構造の実施例２の化合物のアシル部分：
は、例えば、「オクタデカンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ」、「オクタデカンジオイル－ｇＧｌｕ－（ＯＥＧ）２」、「オクタデカンジオイル－γＧｌｕ－２ｘＯＥＧ」、「オクタデカンジオイル－γＧｌｕ－（ＯＥＧ）２」、「１，１８－オクタデカンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ」、「（Ｃ１８二酸）－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ」、「Ｃ１８ｄ－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ」などと命名され得、ここで、γＧｌｕ（およびｇＧｌｕ）は、Ｌ－配置のアミノ酸ガンマグルタミン酸の略記であり、「２ｘ」は、後に続く残基が２回繰り返されることを意味する。
【化3】
【0210】
ガンマＧｌｕ、γＧｌｕ、およびｇＧｌｕは、Ｌ配置のアミノ酸ガンマグルタミン酸、Ｈ２Ｎ－ＣＨ（ＣＯ２Ｈ）－ＣＨ２ＣＨ２－ＣＯ２Ｈ（アルファアミノ基を介して、およびガンマ（側鎖）カルボキシ基を介して接続される）の略記である。
【0211】
ＯＥＧは、アミノ酸残基８－アミノ－３，６－ジオキサ－オクタン酸、ＮＨ２（ＣＨ２）２Ｏ（ＣＨ２）２ＯＣＨ２ＣＯ２Ｈの略記である。
【0212】
一実施形態では、式（Ｉ）Ａｃｙ－ＡＡ２ｍ－ＡＡ３ｐ－の置換基は、以下によって表される。
【化4】
【0213】
一実施形態では、式（Ｉ）Ａｃｙ－ＡＡ２ｍ－ＡＡ３ｐ－の置換基は、以下によって表される。
【化5】
【0214】
一実施形態では、式（Ｉ）Ａｃｙ－ＡＡ２ｍ－ＡＡ３ｐ－の置換基は、以下によって表される。
【化6】
【0215】
一実施形態では、式（Ｉ）Ａｃｙ－ＡＡ２ｍ－ＡＡ３ｐ－の置換基は、以下によって表される。
【化7】
【0216】
式Ａｃｙ－ＡＡ２ｍ－ＡＡ３ｐ－の置換基の上記の非限定的な例のいずれも、本発明の化合物のいずれかに存在するリジン残基のイプシロンアミノ基に結合され得、それによって本発明のアシル化化合物のさらなる特定の実施例を与える。式Ａｃｙ－ＡＡ２ｍ－ＡＡ３ｐ－の所望の基は、任意の便利な方法によって導入され得、かかる反応について多くの方法が先行技術に開示されている。
【0217】
上記で詳述した命名法を組み合わせて、実施例１のＥＧＦ（Ａ）－インスリン融合化合物誘導体は、「ＥＧＦ（Ａ）（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）－［ＧＡＱＰ］２－インスリン（Ｂ３Ｅ、Ｂ２９Ｋ（ヘキサデカンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０）」と命名されて、ＥＧＦ（Ａ）ペプチドが、天然ＥＧＦ（Ａ）に対して置換３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅを含有し、インスリンペプチドが、置換Ｂ３ＥおよびｄｅｓＢ３０を含有し、インスリンＢ２９位置のリジンが、ヘキサデカンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ部分で誘導体化（アシル化）されていることを示す。ＥＧＦ（Ａ）ペプチドのＣ末端残基をインスリンＢ鎖のＮ末端残基と接続するスペーサーは、配列（ＧＡＱＰ）２を有し、ＧＡＱＰＧＡＱＰまたは２ｘＧＡＱＰまたは［ＧＡＱＰ］２とも表示され得る。
【0218】
同様に、実施例２のＥＧＦ（Ａ）－インスリン融合タンパク質誘導体は、ＥＧＦ（Ａ）３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）－［ＧＡＱＰ］１０－インスリン（Ｂ２９Ｋ（オクタデカンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０）と命名されて、ＥＧＦ（Ａ）ペプチドが、天然ＥＧＦ（Ａ）に対して置換３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅを含有し、インスリンペプチドが、置換ｄｅｓＢ３０を含有し、インスリンＢ２９位置のリジンが、オクタデカンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ部分で誘導体化（アシル化）されていることを示す。ＥＧＦ（Ａ）ペプチドのＣ末端残基をインスリンＢ鎖のＮ末端残基と接続するスペーサーは、配列（ＧＡＱＰ）１０を有し、１０ｘＧＡＱＰ、［ＧＡＱＰ］１０、またはＧＡＱＰＧＡＱＰＧＡＱＰＧＡＱＰＧＡＱＰＧＡＱＰＧＡＱＰＧＡＱＰＧＡＱＰＧＡＱＰとも表示され得る。
【0219】
本出願全体を通して、本発明の好ましい化合物の式および名称の両方が与えられる。
【表2】
【0220】
一実施形態では、本発明は、実施例１～２４の融合タンパク質の群から選択される化合物に関する。
【0221】
一実施形態では、本発明は、実施例１の融合タンパク質の群から選択される化合物に関する。
【0222】
一実施形態では、本発明は、２～５、８～１５、および１７～２１から独立して選択される実施例の融合タンパク質の群から選択される化合物に関する。
【0223】
一実施形態では、本発明は、６、７、１６、２２、２３、および２４から独立して選択される実施例の融合タンパク質の群から選択される化合物に関する。
【0224】
一実施形態では、本発明は、１～４、５～１４、および１６～２４から独立して選択される実施例の融合タンパク質の群から選択される化合物に関する。
【0225】
一実施形態では、本発明は、１～１８から独立して選択される実施例の融合タンパク質の群から選択される化合物に関する。
【0226】
一実施形態では、本発明は、１および３～１７から独立して選択される実施例の融合タンパク質の群から選択される化合物に関する。
【0227】
一実施形態では、本発明は、１および３～１６から独立して選択される実施例の融合タンパク質の群から選択される化合物に関する。
【0228】
一実施形態では、本発明は、１および３～１２から独立して選択される実施例の融合タンパク質の群から選択される化合物に関する。
【0229】
一実施形態では、本発明は、１および３～８から独立して選択される実施例の融合タンパク質の群から選択される化合物に関する。
【0230】
一実施形態では、本発明は、実施例１：ＥＧＦ（Ａ）（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）－［ＧＡＱＰ］２－インスリン（Ｂ３Ｅ、Ｂ２９Ｋ（ヘキサデカンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０）であり、Ｃｈｅｍ．１によって表される融合ペプチドに関する。
【0231】
一実施形態では、本発明は、実施例３：ＥＧＦ（Ａ）（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）－［ＧＡＱＰ］２－インスリン（Ｂ３Ｅ、Ｂ２９Ｋ（オクタデカンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０）であり、Ｃｈｅｍ．３によって表される融合ペプチドに関する。
【0232】
一実施形態では、本発明は、実施例４：ＥＧＦ（Ａ）（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）－［ＧＡＱＰ］２－インスリン（Ｂ２９Ｋ（オクタデカンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０）であり、Ｃｈｅｍ．４によって表される融合ペプチドに関する。
【0233】
一実施形態では、本発明は、実施例５：ＥＧＦ（Ａ）（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）－［ＧＡＱＰ］２－インスリン（Ｂ３Ｅ、Ｂ２９Ｋ（オクタデカンジオイル－ｇＧｌｕ－ＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０）であり、Ｃｈｅｍ．５によって表される融合ペプチドに関する。
【0234】
一実施形態では、本発明は、実施例６：ＥＧＦ（Ａ）（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）－［ＧＡＱＰ］２－インスリン（Ｂ３Ｅ、Ｂ２９Ｋ（エイコサンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０）であり、Ｃｈｅｍ．６によって表される融合ペプチドに関する。
【0235】
一実施形態では、本発明は、実施例７：ＥＧＦ（Ａ）（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）－［ＧＡＱＰ］２－インスリン（Ｂ２９Ｋ（エイコサンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０）であり、Ｃｈｅｍ．７によって表される融合ペプチドに関する。
【0236】
一実施形態では、本発明は、実施例８：ＥＧＦ（Ａ）（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）－［ＧＱＡＰ］２－インスリン（Ｂ２９Ｋ（オクタデカンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０）であり、Ｃｈｅｍ．８によって表される融合ペプチドに関する。
【0237】
一実施形態では、本発明は、実施例９：ＥＧＦ（Ａ）（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）－［ＧＡＱＰ］３－インスリン（Ｂ２９Ｋ（オクタデカンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０）であり、Ｃｈｅｍ．９によって表される融合ペプチドに関する。
【0238】
一実施形態では、本発明は、実施例１０：ＥＧＦ（Ａ）（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）－［ＧＡＱＰ］３－インスリン（Ａ１４Ｅ、Ｂ２９Ｋ（オクタデカンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０）であり、Ｃｈｅｍ．１０によって表される融合ペプチドに関する。
【0239】
一実施形態では、本発明は、実施例１１：ＥＧＦ（Ａ）（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）－［ＧＡＱＰ］４－インスリン（Ａ１４Ｅ、Ｂ２９Ｋ（オクタデカンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０）であり、Ｃｈｅｍ．１１によって表される融合ペプチドに関する。
【0240】
一実施形態では、本発明は、実施例１２：ＥＧＦ（Ａ）（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）－［ＧＡＱＰ］４－インスリン（Ｂ２９Ｋ（オクタデカンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０）であり、Ｃｈｅｍ．１２によって表される融合ペプチドに関する。
【0241】
一実施形態では、本発明は、実施例１３：ＥＧＦ（Ａ）（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）－［ＧＡＱＰ］６－インスリン（Ａ１４Ｅ、Ｂ２９Ｋ（オクタデカンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０）であり、Ｃｈｅｍ．１３によって表される融合ペプチドに関する。
【0242】
一実施形態では、本発明は、実施例１４：ＥＧＦ（Ａ）（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）－［ＧＡＱＰ］６－インスリン（Ｂ２９Ｋ（オクタデカンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０）であり、Ｃｈｅｍ．１４によって表される融合ペプチドに関する。
【0243】
一実施形態では、本発明は、実施例１５：ＥＧＦ（Ａ）（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）－［ＧＡＱＰ］６－インスリン（Ａ１４Ｅ、Ｂ２９Ｋ（オクタデカンジオイル－ｇＧｌｕ－ＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０）であり、Ｃｈｅｍ．１５によって表される融合ペプチドに関する。
【0244】
一実施形態では、本発明は、実施例１６：ＥＧＦ（Ａ）（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）－［ＧＡＱＰ］６－インスリン（Ａ１４Ｅ、Ｂ２９Ｋ（エイコサンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０であり、Ｃｈｅｍ．１６によって表される融合ペプチドに関する。
【0245】
一実施形態では、本発明は、実施例１７：ＥＧＦ（Ａ）（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）－［ＧＡＱＰ］８－インスリン（Ｂ２９Ｋ（オクタデカンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０であり、Ｃｈｅｍ．１７によって表される融合ペプチドに関する。
【0246】
一実施形態では、本発明は、実施例１８：ＥＧＦ（Ａ）（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）－［ＧＡＱＰ］１２－インスリン（Ｂ２９Ｋ（オクタデカンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０）であり、Ｃｈｅｍ．１８によって表される融合ペプチドに関する。
【0247】
一実施形態では、本発明は、実施例１９：
ＥＧＦ（Ａ）（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）－［ＧＡＱＰ］１９－インスリン（Ｂ２９Ｋ（オクタデカンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０）であり、Ｃｈｅｍ．１９によって表される融合ペプチドに関する。
ＥＧＦ（Ａ）（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）－［ＧＡＱＰ］１９－インスリン（Ｂ２９Ｋ（オクタデカンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０）であり、Ｃｈｅｍ．１９によって表される融合ペプチドに関する。
【0248】
一実施形態では、本発明は、実施例２０：
ＥＧＦ（Ａ）（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）－［ＧＡＱＰ］１９－インスリン（Ａ１４Ｅ、Ｂ２９Ｋ（オクタデカンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０）であり、Ｃｈｅｍ．２０によって表される融合ペプチドに関する。
ＥＧＦ（Ａ）（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）－［ＧＡＱＰ］１９－インスリン（Ａ１４Ｅ、Ｂ２９Ｋ（オクタデカンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０）であり、Ｃｈｅｍ．２０によって表される融合ペプチドに関する。
【0249】
一実施形態では、本発明は、実施例２１：
ＥＧＦ（Ａ）３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）－［ＧＡＱＰ］１９－インスリン（Ｂ３Ｅ、Ｂ２９Ｋ（オクタデカンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０）であり、Ｃｈｅｍ．２１によって表される融合ペプチドに関する。
ＥＧＦ（Ａ）３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）－［ＧＡＱＰ］１９－インスリン（Ｂ３Ｅ、Ｂ２９Ｋ（オクタデカンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０）であり、Ｃｈｅｍ．２１によって表される融合ペプチドに関する。
【0250】
一実施形態では、本発明は、実施例２２：
ＥＧＦ（Ａ）（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）－［ＧＡＱＰ］１９－インスリン（Ｂ２９Ｋ（エイコサンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０）であり、Ｃｈｅｍ．２２によって表される融合ペプチドに関する。
ＥＧＦ（Ａ）（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）－［ＧＡＱＰ］１９－インスリン（Ｂ２９Ｋ（エイコサンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０）であり、Ｃｈｅｍ．２２によって表される融合ペプチドに関する。
【0251】
一実施形態では、本発明は、実施例２３：
ＥＧＦ（Ａ）（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）－［ＧＡＱＰ］１９－インスリン（Ａ１４Ｅ、Ｂ２９Ｋ（エイコサンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０）であり、Ｃｈｅｍ．２３によって表される融合ペプチドに関する。
ＥＧＦ（Ａ）（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）－［ＧＡＱＰ］１９－インスリン（Ａ１４Ｅ、Ｂ２９Ｋ（エイコサンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０）であり、Ｃｈｅｍ．２３によって表される融合ペプチドに関する。
【0252】
一実施形態では、本発明は、実施例２４：ＥＧＦ（Ａ）（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）－［ＧＡＱＰ］１９－インスリン（Ｂ３Ｅ、Ｂ２９Ｋ（エイコサンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０）であり、Ｃｈｅｍ．２４によって表される融合ペプチドに関する。
【0253】
中間生成物
本発明はさらに、本発明の置換基が結合され、本発明の融合ペプチドをもたらす、新規の骨格の形態の中間生成物に関する。
本発明はさらに、本発明の置換基が結合され、本発明の融合ペプチドをもたらす、新規の骨格の形態の中間生成物に関する。
【0254】
本発明はまた、以下からなる群から選択される、本発明の融合ペプチドの新規の骨格の形態の中間生成物に関する：
【表3】
【0255】
二官能性
異なる機能性が、インスリン類似体およびＥＧＦ（Ａ）類似体という２つの類似体に関連している。本発明の融合化合物誘導体において２つの類似体を組み合わせる場合、類似体が機能的なままであること、すなわち、インスリン類似体がインスリン受容体を活性化する能力を有し、ＥＧＦ（Ａ）類似体がＰＣＳＫ９に結合することが好ましい。かかる化合物の機能性は、以下に記載されるように試験され得る。
異なる機能性が、インスリン類似体およびＥＧＦ（Ａ）類似体という２つの類似体に関連している。本発明の融合化合物誘導体において２つの類似体を組み合わせる場合、類似体が機能的なままであること、すなわち、インスリン類似体がインスリン受容体を活性化する能力を有し、ＥＧＦ（Ａ）類似体がＰＣＳＫ９に結合することが好ましい。かかる化合物の機能性は、以下に記載されるように試験され得る。
【0256】
インスリン機能
ヒトインスリン受容体（ＩＲ）に対するインスリン類似体の相対結合親和性は、実施例２５に記載されるように、シンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）での競合結合によって決定され得る。
ヒトインスリン受容体（ＩＲ）に対するインスリン類似体の相対結合親和性は、実施例２５に記載されるように、シンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）での競合結合によって決定され得る。
【0257】
一実施形態では、本発明の融合ペプチドは、インスリン受容体に結合する能力を有する。
【0258】
実施例２６に記載される脂質生成アッセイは、インスリン類似体の機能的（アゴニスト）活性の尺度として使用され得る。
【0259】
一実施形態では、インスリン類似体を含む本発明の融合ペプチドは、インスリン受容体に結合し、それを活性化する能力を有する。
【0260】
一実施形態では、本発明の融合ペプチドは、血糖値を低減する能力を有する。
【0261】
本発明の融合ペプチドは、実施例２９および３０に記載されるように、薬物動態パラメータおよび／またはインスリン関連薬力学特性について試験され得る。
【0262】
本発明の融合ペプチドは、ラットへの皮下投与によって、例えば、このプロトコルに従って対照薬融合化合物および／または類似のＢ２９Ｋアシル化インスリン類似体と比較することによって試験され得る。
【0263】
一実施形態では、本発明の融合ペプチドは、血糖値を低下させる。
【0264】
別の実施形態では、本発明の融合ペプチドは、類似のＢ２９Ｋアシル化インスリン類似体と比較して同程度の血糖低減を示す。
【0265】
本発明の融合ペプチドは、非荷電スペーサー（ＧＱＡＰ）ｎまたは（ＧＡＱＰ）ｎを有するスペーサーを含み、荷電スペーサー（ＧＱＥＰ）ｎを含む対照薬化合物と比較して驚くほど優れた血糖低減を有する。
【0266】
スペーサー（ＧＱＡＰ）ｎまたは（ＧＡＱＰ）ｎ（ここで、ｎ＝２～１０）を含む本発明の融合ペプチドが、グルコース降下効果に関して等しい効力を有する一方で、ｎが１０を超えるスペーサーについては、効果はそれほど顕著ではないことがわかった（図１～２）。
【0267】
スペーサー（ＧＱＡＰ）ｎまたは（ＧＡＱＰ）ｎ（ここで、ｎ＝２～８）を含む本発明の融合ペプチドが、（ＧＱＥＰ）ｎ（ここで、ｎ＝２～８）を含む試験した全ての対照薬化合物よりも優れた血糖降下効果を示すことがわかった（図３～１１）。
【0268】
スペーサー（ＧＱＡＰ）ｎまたは（ＧＡＱＰ）ｎ（ここで、ｎ＝２）を含む本発明の融合ペプチドが、用量依存的血糖降下を示すことがわかった（図１３）。
【0269】
ＥＧＦ（Ａ）関数
ＥＧＦ（Ａ）ペプチド類似体は、ＰＣＳＫ９に結合する能力を有する。こうした結合は、本明細書における実施例２７に記載したアッセイを使用して評価され得る。
ＥＧＦ（Ａ）ペプチド類似体は、ＰＣＳＫ９に結合する能力を有する。こうした結合は、本明細書における実施例２７に記載したアッセイを使用して評価され得る。
【0270】
一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、ＰＣＳＫ９阻害剤である。
【0271】
一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、ヒト低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬ－Ｒ）に対するＰＣＳＫ９結合を阻害する。
【0272】
一実施形態では、本発明は、配列番号１のＥＧＦ（Ａ）ペプチド類似体を含む融合タンパク質を提供し、融合タンパク質は、ヒト低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬ－Ｒ）に対するＰＣＳＫ９結合を阻害することができる。
【0273】
一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、ＬＤＬ－ＲへのＰＣＳＫ９結合を阻害する能力を有する。
【0274】
一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、ＬＤＬ－ＲへのＰＣＳＫ９結合を阻害し、かつ血中のＬＤＬレベルを低減する能力を有する。
【0275】
一実施形態では、本発明の融合ペプチドは、血中ＬＤＬレベルを低減する。
【0276】
一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、天然ＬＤＬ－Ｒ（２９３－３３２）（（配列番号１、天然ＥＧＦ－（Ａ））と比較してＰＣＳＫ９に結合する能力が改善されている。一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、ＬＤＬ－Ｒ（２９３－３３２）ＥＧＦ（Ａ）類似体：（３０１Ｌｅｕ、３０９Ａｒｇ、３１２Ｇｌｕ、３２１Ｇｌｕ）（対照薬融合タンパク質９）と比較して、ＰＣＳＫ９に結合する同程度の能力を有する
【0277】
一実施形態では、ＰＣＳＫ９－ＬＤＬ－Ｒ結合競合ＥＬＩＳＡアッセイで測定した、本明細書に記載される本発明の融合タンパク質のＫｉは、２０ｎＭ未満、例えば１５ｎＭ未満、または例えば１０ｎＭ未満、または例えば５ｎＭ未満である。
【0278】
別の実施形態では、ＰＣＳＫ９－ＬＤＬ－Ｒ結合競合ＥＬＩＳＡアッセイで測定した、本明細書に記載される本発明の融合タンパク質のＫｉは、５ｎＭ未満である。
【0279】
本発明の融合タンパク質内のＥＧＦ（Ａ）類似体およびその誘導体の機能性は、本明細書の実施例２８に記載されているものなど、これらがＬＤＬ取り込みを改善する能力によってさらに特徴付けられ得る。
【0280】
一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、ＰＣＳＫ９の存在下でＬＤＬ取り込みを増加させる。
【0281】
一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、ＰＣＳＫ９媒介性のＬＤＬ取り込みの減少を逆転または低減することができる。
【0282】
一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、ＬＤＬ取り込みアッセイで測定したように、１５００ｎＭ未満、例えば１０００ｎＭ未満、例えば５００ｎＭ未満、または例えば２００ｎＭ未満のＥＣ５０を有する。
【0283】
一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、ＬＤＬ取り込みアッセイで測定したように、１５００ｎＭ未満のＥＣ５０を有する。
【0284】
一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、ＬＤＬ取り込みアッセイで測定したように、５００ｎＭ未満のＥＣ５０を有する。
【0285】
一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、ＬＤＬ取り込みアッセイで測定したように、２００ｎＭ未満のＥＣ５０を有する。
【0286】
マウスに投与されたｈＰＣＳＫ９が、肝臓ＬＤＬ受容体タンパク質のほぼ完全な下方制御をもたらしたことがわかった（図１２）。インスリン－ＥＧＦ（Ａ）融合タンパク質は、用量依存的な方法でＬＤＬｒタンパク質のこのＰＣＳＫ９媒介性下方制御を効果的に防止した。さらに、２つのインスリン－ＥＧＦ（Ａ）融合タンパク質が、ＥＧＦ（Ａ）誘導体のみで見られたものと同様に、ＬＤＬｒタンパク質のｈＰＣＳＫ９媒介性下方制御を防止することができたことが示された（図１４）。
【0287】
二官能性
二官能性または二重活性を実証するために、本発明の選択された化合物を、実施例３１に記載されるインビボモデルで試験した。二重活性は、インスリン－ＥＧＦ（Ａ）系抗ＰＣＳＫ９ペプチドで静脈内注射ｈＰＣＳＫ９の作用を阻害することによるマウス肝臓におけるＬＤＬ受容体発現レベルの上昇、および分子のインスリン部分によるグルコース降下効果を意味する。
二官能性または二重活性を実証するために、本発明の選択された化合物を、実施例３１に記載されるインビボモデルで試験した。二重活性は、インスリン－ＥＧＦ（Ａ）系抗ＰＣＳＫ９ペプチドで静脈内注射ｈＰＣＳＫ９の作用を阻害することによるマウス肝臓におけるＬＤＬ受容体発現レベルの上昇、および分子のインスリン部分によるグルコース降下効果を意味する。
【0288】
選択した化合物は、ＥＧＦ（Ａ）誘導体単独で見られたものと同様に、血糖を低下させ、ＬＤＬｒタンパク質のｈＰＣＳＫ９媒介性下方制御を防止することがわかった。
【0289】
一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、インスリン受容体を活性化する。
【0290】
一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、血糖を低下させる。
【0291】
一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、対照薬融合タンパク質と比較して、優れた血糖低減を示した。
【0292】
一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、対照薬融合タンパク質と比較して、改善された血糖低減を示した。
【0293】
一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、ＰＣＳＫ９に結合する。
【0294】
一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、ＬＤＬ－ＲへのＰＣＫＳ９結合を阻害する。
【0295】
一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、野生型ＥＧＦ（Ａ）と比較して、ＰＣＳＫ９に結合する能力の改善を示す。
【0296】
一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、ＰＣＳＫ９－ＬＤＬ－Ｒ結合競合ＥＬＩＳＡアッセイで測定した場合に、２０ｎＭ未満のＫｉを有する。
【0297】
一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、ＰＣＳＫ９－ＬＤＬ－Ｒ結合競合ＥＬＩＳＡアッセイで測定した場合に、５ｎＭ未満のＫｉを有する。
【0298】
一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、ＬＤＬ取り込みを増加させる。
【0299】
一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、ＬＤＬ取り込みアッセイで測定した場合に、１０００ｎＭ未満のＥＣ５０を有する。
【0300】
一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、ＬＤＬ取り込みアッセイで測定した場合に、５００ｎＭ未満のＥＣ５０を有する。
【0301】
一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、ＬＤＬ取り込みアッセイで測定した場合に、２００ｎＭ未満のＥＣ５０を有する。
【0302】
上述のように、本発明の二官能性融合タンパク質は、インビトロアッセイにおいて、インスリン受容体およびＰＣＳＫ９の両方に結合して、インスリン応答の活性化およびＰＣＳＫ９結合の防止、およびそれによってＬＤＬＲの分解をもたらすことがわかった。さらに、発明者らは驚くべきことに、インビボでのグルコース降下（インスリン効果）および肝臓ＬＤＬＲ発現の増強（ＰＣＳＫ９ｉ効果）に対する複合効果を発見した。
【0303】
さらに、驚くべきことに、非荷電スペーサーを含む本発明の融合タンパク質が、荷電スペーサー（ＧＱＥＰ）ｎを含む対照薬融合タンパク質と比較して、優れた血糖低減を示すこと、さらに、低減のレベルが、前述の非荷電スペーサーの長さに依存することさえもわかった。
【0304】
医薬組成物
本発明はまた、例えば、本発明の融合タンパク質、またはその薬学的に許容される塩、アミド、もしくはエステルを含む本発明の化合物、および１つ以上の薬学的に許容される賦形剤（複数可）を含む医薬組成物に関する。かかる組成物は、当該技術分野において既知のとおりに調製され得る。
本発明はまた、例えば、本発明の融合タンパク質、またはその薬学的に許容される塩、アミド、もしくはエステルを含む本発明の化合物、および１つ以上の薬学的に許容される賦形剤（複数可）を含む医薬組成物に関する。かかる組成物は、当該技術分野において既知のとおりに調製され得る。
【0305】
「賦形剤」という用語は、広く、活性治療成分（複数可）以外の任意の成分を指す。賦形剤は、不活性物質、非活性物質、および／または医薬的に活性でない物質であり得る。賦形剤は、例えば担体、媒体、希釈剤、錠剤補助剤として様々な目的を果たし、および／あるいは活性物質の投与および／または吸収を改善するように機能し得る。賦形剤の非限定的な例は、溶媒、希釈剤、緩衝液、防腐剤、張性調節剤、キレート剤および安定剤である。様々な賦形剤を伴った薬学的活性成分の製剤化は、当該技術分野において既知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（例えば、第２１版（２００５）および任意のその後の版）を参照されたい。
【0306】
本発明の組成物は、液体製剤、すなわち、水を含む水性製剤の形態であってもよい。液体製剤は、溶液または懸濁液であってもよい。あるいは、これは、固形製剤、例えば凍結乾燥または噴霧乾燥した組成物であってもよい。
【0307】
本発明の医薬組成物は、併用療法の場合に投与を簡略化し得る治療剤など、第２の有効成分をさらに含み得る。
【0308】
本発明の組成物は、例えば、皮下、筋肉内、腹腔内、または静脈内注射によって実施される非経口投与用であってもよい。
【0309】
薬学的適応
糖尿病
「糖尿病（ｄｉａｂｅｔｅｓ）」または「糖尿病（ｄｉａｂｅｔｅｓ ｍｅｌｌｉｔｕｓ）」という用語には、１型糖尿病、２型糖尿病、妊娠性糖尿病（妊娠中）、および高血糖症を引き起こす他の状態が含まれる。この用語は、膵臓が不十分な量のインスリンを産生するか、または身体の細胞がインスリンに適切に応答できず、したがって細胞がグルコースを吸収するのを妨げる、代謝障害に使用される。結果として、グルコースは、血液中に蓄積する。
糖尿病
「糖尿病（ｄｉａｂｅｔｅｓ）」または「糖尿病（ｄｉａｂｅｔｅｓ ｍｅｌｌｉｔｕｓ）」という用語には、１型糖尿病、２型糖尿病、妊娠性糖尿病（妊娠中）、および高血糖症を引き起こす他の状態が含まれる。この用語は、膵臓が不十分な量のインスリンを産生するか、または身体の細胞がインスリンに適切に応答できず、したがって細胞がグルコースを吸収するのを妨げる、代謝障害に使用される。結果として、グルコースは、血液中に蓄積する。
【0310】
インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）および若年発症糖尿病とも呼ばれる１型糖尿病は、通常は絶対的インスリン欠乏をもたらすＢ細胞破壊によって引き起こされる。
【0311】
非インスリン依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）および成人発症糖尿病としても既知の、２型糖尿病は、主なインスリン抵抗性、したがって相対的なインスリン欠乏および／またはインスリン抵抗性を伴う主なインスリン分泌不全に関連している。
【0312】
他の適応
一実施形態では、本発明による融合タンパク質は、ストレス誘発性高血糖症を含む高血糖症、２型糖尿病、耐糖能障害、１型糖尿病の治療または予防のための薬剤の調製に使用される。
一実施形態では、本発明による融合タンパク質は、ストレス誘発性高血糖症を含む高血糖症、２型糖尿病、耐糖能障害、１型糖尿病の治療または予防のための薬剤の調製に使用される。
【0313】
別の実施形態では、本発明による融合タンパク質は、２型糖尿病の疾患進行を遅延または予防するための薬剤として使用される。
【0314】
本発明の一実施形態では、融合タンパク質は、ストレス誘発性高血糖症を含む高血糖症、２型糖尿病、耐糖能障害、１型糖尿病の治療または予防のための薬剤として使用するためのものである。
【0315】
さらなる実施形態では、本発明は、ストレス誘発性高血糖症を含む高血糖症、２型糖尿病、耐糖能障害、１型糖尿病の治療または予防のための方法に関し、方法は、かかる治療を必要としている患者に、かかる治療のための有効量の本発明による融合タンパク質を投与することを含む。
【0316】
一実施形態では、本発明の融合タンパク質またはその組成物は、以下のために糖尿病患者において使用され得る：
（ｉ）脂質パラメータの改善、例えば、脂質異常症の予防および／または治療、総血清脂質の低下、ＬＤＬ－Ｃの低下、ＨＤＬの増加、小型高密度ＬＤＬの低下、ＶＬＤＬの低下、トリグリセリドの低下、コレステロールの低下、リポタンパク質ａ（Ｌｐ（ａ））の血漿レベルの低下。別の実施形態では、本発明は、以下のための糖尿病患者における治療のための方法に関する：
ｉ．脂質パラメータの改善、例えば、脂質異常症の予防および／または治療、総血清脂質の低下、ＨＤＬの増加、ＬＤＬ－Ｃの低下、小型高密度ＬＤＬの低下、ＶＬＤＬ－Ｃの低下、トリグリセリドの低下、コレステロールの低下、リポタンパク質ａ（Ｌｐ（ａ））の血漿レベルの低下。ここで、薬学的に活性な量の本発明による融合タンパク質、例えば、本発明によるペプチド類似体または誘導体が、糖尿病患者に投与される。
（ｉ）脂質パラメータの改善、例えば、脂質異常症の予防および／または治療、総血清脂質の低下、ＬＤＬ－Ｃの低下、ＨＤＬの増加、小型高密度ＬＤＬの低下、ＶＬＤＬの低下、トリグリセリドの低下、コレステロールの低下、リポタンパク質ａ（Ｌｐ（ａ））の血漿レベルの低下。別の実施形態では、本発明は、以下のための糖尿病患者における治療のための方法に関する：
ｉ．脂質パラメータの改善、例えば、脂質異常症の予防および／または治療、総血清脂質の低下、ＨＤＬの増加、ＬＤＬ－Ｃの低下、小型高密度ＬＤＬの低下、ＶＬＤＬ－Ｃの低下、トリグリセリドの低下、コレステロールの低下、リポタンパク質ａ（Ｌｐ（ａ））の血漿レベルの低下。ここで、薬学的に活性な量の本発明による融合タンパク質、例えば、本発明によるペプチド類似体または誘導体が、糖尿病患者に投与される。
【0317】
一実施形態では、本発明は、薬剤の製造で使用するのための本明細書に記載される融合タンパク質の使用に関する。
【0318】
本発明は、薬剤として、または薬剤の製造で使用するための、本発明の融合タンパク質またはその医薬組成物に関する。
【0319】
投与方法
「治療」という用語は、参照される疾患、障害、または状態の予防および最小化の両方を含むことを意味する（すなわち、「治療」は、文脈によって別段の指示がないか、または明確に矛盾しない限り、本発明の融合タンパク質または本発明の融合タンパク質を含む組成物の予防的および治療的投与の両方を指す。
「治療」という用語は、参照される疾患、障害、または状態の予防および最小化の両方を含むことを意味する（すなわち、「治療」は、文脈によって別段の指示がないか、または明確に矛盾しない限り、本発明の融合タンパク質または本発明の融合タンパク質を含む組成物の予防的および治療的投与の両方を指す。
【0320】
投与経路は、本発明の融合タンパク質を、非経口的に、例えば、皮下、筋肉内、または静脈内などで体内の望ましい場所または適切な場所に効果的に輸送する任意の経路であり得る。あるいは、本発明の融合タンパク質は、経口、肺、直腸内、経皮、口腔内、舌下、または経鼻で投与することができる。
【0321】
本明細書では、本発明の特定の特徴が例示および説明されているが、当業者には多数の修正、置換、変更、および同等物が思い浮かぶであろう。したがって、添付の実施形態が、本発明の真の趣旨の範囲内にあるようなかかる全ての修正および変更を網羅することを意図していることが理解されるべきである。
【0322】
実施形態
【0323】
１．インスリンペプチド、ＥＧＦ（Ａ）ペプチド、スペーサー、および置換基を含む融合タンパク質であって、
ｉ．前述のインスリンペプチドが、ヒトインスリン（配列番号２～３）もしくはヒトインスリンの類似体であり、
ｉｉ．前述のＥＧＦ（Ａ）ペプチドが、ＬＤＬ－Ｒ（２９３－３３２）（配列番号１）のＥＧＦ（Ａ）ドメインの類似体であり、
ｉｉｉ．前述のスペーサーが、（ＧＡＱＰ）ｎもしくは（ＧＱＡＰ）ｎ（ｎ＝２～１９）のセグメントを含み、インスリン類似体Ｂ鎖のＮ末端をＥＧＦ（Ａ）類似体のＣ末端と接続するペプチドリンカーであり、
ｉｖ．前述の置換基が、式（Ｉ）：Ａｃｙ－ＡＡ２ｍ－ＡＡ３ｐ－を有し、式中、
Ａｃｙは、約１６～約２０個の炭素原子を含む脂肪二酸であり、
ＡＡ２は、酸性アミノ酸残基であり、式中、ｍは、１～１０の範囲の整数であり、
ＡＡ３は、中性のアルキレングリコール含有アミノ酸残基であり、ｐは、１～１０の範囲の整数であり、
ＡＡ２残基およびＡＡ３残基の最大数は、１０であり、
前記ＡＡ２残基およびＡＡ３残基は、任意の順序で現れてもよい、融合タンパク質、
またはその薬学的に許容される塩、アミド、もしくはエステル。
ｉ．前述のインスリンペプチドが、ヒトインスリン（配列番号２～３）もしくはヒトインスリンの類似体であり、
ｉｉ．前述のＥＧＦ（Ａ）ペプチドが、ＬＤＬ－Ｒ（２９３－３３２）（配列番号１）のＥＧＦ（Ａ）ドメインの類似体であり、
ｉｉｉ．前述のスペーサーが、（ＧＡＱＰ）ｎもしくは（ＧＱＡＰ）ｎ（ｎ＝２～１９）のセグメントを含み、インスリン類似体Ｂ鎖のＮ末端をＥＧＦ（Ａ）類似体のＣ末端と接続するペプチドリンカーであり、
ｉｖ．前述の置換基が、式（Ｉ）：Ａｃｙ－ＡＡ２ｍ－ＡＡ３ｐ－を有し、式中、
Ａｃｙは、約１６～約２０個の炭素原子を含む脂肪二酸であり、
ＡＡ２は、酸性アミノ酸残基であり、式中、ｍは、１～１０の範囲の整数であり、
ＡＡ３は、中性のアルキレングリコール含有アミノ酸残基であり、ｐは、１～１０の範囲の整数であり、
ＡＡ２残基およびＡＡ３残基の最大数は、１０であり、
前記ＡＡ２残基およびＡＡ３残基は、任意の順序で現れてもよい、融合タンパク質、
またはその薬学的に許容される塩、アミド、もしくはエステル。
【0324】
２．ＥＧＦ（Ａ）ペプチド類似体が、ＥＧＦ（Ａ）類似体のＣ末端アミノ酸残基を介してインスリン類似体Ｂ鎖のＮ末端に融合される、実施形態１に記載の融合タンパク質。
【0325】
３．ＥＧＦ（Ａ）類似体が、配列番号１と比較して１～１５個のアミノ酸変異（複数可）を含む、実施形態１または２に記載の融合タンパク質。
【0326】
４．ＥＧＦ（Ａ）類似体が、配列番号１と比較して１～１３個のアミノ酸変異（複数可）を含む、実施形態１～３のいずれかに記載の融合タンパク質。
【0327】
５．ＥＧＦ（Ａ）類似体が、配列番号１と比較して１～１１個のアミノ酸変異（複数可）を含む、実施形態１～４のいずれかに記載の融合タンパク質。
【0328】
６．ＥＧＦ（Ａ）類似体が、配列番号１と比較して１～９個のアミノ酸変異（複数可）を含む、実施形態１～５のいずれかに記載の融合タンパク質。
【0329】
７．ＥＧＦ（Ａ）類似体が、配列番号１と比較して１～７個のアミノ酸変異（複数可）を含む、実施形態１～６のいずれかに記載の融合タンパク質。
【0330】
８．ＥＧＦ（Ａ）類似体が、配列番号１と比較して１～５個のアミノ酸変異（複数可）を含む、実施形態１～７のいずれかに記載の融合タンパク質。
【0331】
９．ＥＧＦ（Ａ）類似体が、配列番号１と比較して１～３個のアミノ酸変異（複数可）を含む、実施形態１～８のいずれかに記載の融合タンパク質。
【0332】
１０．ＥＧＦ（Ａ）類似体が、配列番号１と比較して１個または２個のアミノ酸変異（複数可）を含む、実施形態１～９のいずれかに記載の融合タンパク質。
【0333】
１１．ＥＧＦ（Ａ）類似体が、配列番号１と比較して８個のアミノ酸変異（複数可）を含む、実施形態１～１０のいずれかに記載の融合タンパク質。
【0334】
１２．ＥＧＦ（Ａ）類似体が、配列番号１と比較して７個のアミノ酸変異（複数可）を含む、実施形態１～１１のいずれかに記載の融合タンパク質。
【0335】
１３．ＥＧＦ（Ａ）類似体が、配列番号１と比較して６個のアミノ酸変異（複数可）を含む、実施形態１～１２のいずれかに記載の融合タンパク質。
【0336】
１４．ＥＧＦ（Ａ）類似体が、配列番号１と比較して５個のアミノ酸変異（複数可）を含む、実施形態１～１３のいずれかに記載の融合タンパク質。
【0337】
１５．ＥＧＦ（Ａ）類似体が、配列番号１と比較して４個のアミノ酸変異（複数可）を含む、実施形態１～１４のいずれかに記載の融合タンパク質。
【0338】
１６．ＥＧＦ（Ａ）類似体が、配列番号１と比較して３個のアミノ酸変異（複数可）を含む、実施形態１～１５のいずれかに記載の融合タンパク質。
【0339】
１７．ＥＧＦ（Ａ）類似体が、配列番号１と比較して２個のアミノ酸変異（複数可）を含む、実施形態１～１６のいずれかに記載の融合タンパク質。
【0340】
１８．ＥＧＦ（Ａ）類似体が、３０１Ｌを含む、実施形態１～１７のいずれかに記載の融合タンパク質。
【0341】
１９．ＥＧＦ（Ａ）類似体が、３０９Ｒを含む、実施形態１～１８のいずれかに記載の融合タンパク質。
【0342】
２０．ＥＧＦ（Ａ）類似体が、３１２Ｅを含む、実施形態１～１９のいずれかに記載の融合タンパク質。
【0343】
２１．ＥＧＦ（Ａ）類似体が、３２１Ｅを含む、実施形態１～２０のいずれかに記載の融合タンパク質。
【0344】
２２．ＥＧＦ（Ａ）類似体が、以下の組み合わせのうちの１つを含む、実施形態１～２１のいずれかに記載の融合タンパク質。
ａ．３０１Ｌｅｕおよび３０９Ａｒｇ
ｂ．３０１Ｌｅｕ、３０９Ａｒｇおよび３１２Ｇｌｕ
ｃ．３０１Ｌｅｕ、３０９Ａｒｇ、３１２Ｇｌｕおよび３２１Ｇｌｕ
ａ．３０１Ｌｅｕおよび３０９Ａｒｇ
ｂ．３０１Ｌｅｕ、３０９Ａｒｇおよび３１２Ｇｌｕ
ｃ．３０１Ｌｅｕ、３０９Ａｒｇ、３１２Ｇｌｕおよび３２１Ｇｌｕ
【0345】
２３．ＥＧＦ（Ａ）類似体が、３０１Ｌおよび３０９Ｒを含む、実施形態２２に記載の融合タンパク質。
【0346】
２４．ＥＧＦ（Ａ）類似体が、３０１Ｌ、３０９Ｒ、および３１２Ｅを含む、実施形態２２に記載の融合タンパク質。
【0347】
２５．ＥＧＦ（Ａ）類似体が、３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、および３２１Ｅを含む、実施形態２２に記載の融合タンパク質。
【0348】
２６．ＥＧＦ（Ａ）類似体が、３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅである、実施形態２２に記載の融合タンパク質。
【0349】
２７．インスリン類似体／誘導体が、０～１０個の変異を含むヒトインスリンの類似体／誘導体である、実施形態１～２６のいずれかに記載の融合タンパク質。
【0350】
２８．インスリンが、１～１０個の変異を含む、実施形態２７に記載の融合タンパク質。
【0351】
２９．インスリンが、１～８個の変異を含む、実施形態２８に記載の融合タンパク質。
【0352】
３０．インスリンが、１～６個の変異を含む、実施形態２８に記載の融合タンパク質。
【0353】
３１．インスリンが、５個の変異を含む、実施形態２８に記載の融合タンパク質。
【0354】
３２．インスリンが、１～４個の変異を含む、実施形態２８に記載の融合タンパク質。
【0355】
３３．インスリンが、４個の変異を含む、実施形態２８に記載の融合タンパク質。
【0356】
３４．インスリンが、１～３個の変異を含む、実施形態２８に記載の融合タンパク質。
【0357】
３５．インスリンが、１個または２個の変異を含む、実施形態２８に記載の融合タンパク質。
【0358】
３６．インスリンが、１個の変異を含む、実施形態２８に記載の融合タンパク質。
【0359】
３７．インスリン類似体が、以下の組み合わせのうちの１つを含む、実施形態１～３６のいずれかに記載の融合タンパク質。
ａ．Ａ１４Ｅ
ｂ．Ｂ３Ｅ
ｃ．ｄｅｓＢ３０
ｄ．Ａ１４Ｅ、ｄｅｓＢ３０
ｅ．Ｂ３Ｅ、ｄｅｓＢ３０
ａ．Ａ１４Ｅ
ｂ．Ｂ３Ｅ
ｃ．ｄｅｓＢ３０
ｄ．Ａ１４Ｅ、ｄｅｓＢ３０
ｅ．Ｂ３Ｅ、ｄｅｓＢ３０
【0360】
３８．前述のインスリン類似体が、ｄｅｓＢ３０を含む、実施形態３７に記載の融合タンパク質。
【0361】
３９．前述のインスリン類似体が、Ｂ３Ｅを含む、実施形態３７に記載の融合タンパク質。
【0362】
４０．前述のインスリン類似体が、Ａ１４Ｅ、ｄｅｓＢ３０を含む、実施形態３７に記載の融合タンパク質。
【0363】
４１．前述のインスリン類似体が、Ｂ３Ｅ、ｄｅｓＢ３０を含む、実施形態３７に記載の融合タンパク質。
【0364】
４２．前述のインスリン類似体が、Ａ１４Ｅ、ｄｅｓＢ３０である、実施形態３７に記載の融合タンパク質。
【0365】
４３．前述のインスリン類似体が、Ｂ３Ｅ、ｄｅｓＢ３０である、実施形態３７に記載の融合タンパク質。
【0366】
４４．前述のインスリン類似体が、インスリンｄｅｓＢ３０ヒトインスリンである、実施形態３７に記載の融合タンパク質。
【0367】
４５．融合タンパク質が、インスリン受容体を活性化し、ＰＣＳＫ９に結合する、実施形態１～４４のいずれかに記載の融合タンパク質。
【0368】
４６．前述の融合タンパク質が、ＥＧＦ（Ａ）類似体とインスリン類似体／誘導体とを接続するスペーサーを含む、実施形態１～４５のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
【0369】
４７．スペーサーが、アミド結合を含む、実施形態１～４６のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
【0370】
４８．スペーサーが、４～８０個のアミノ酸残基を含む、実施形態１～４７のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
【0371】
４９．スペーサーが、以下のアミノ酸残基：Ａｌａ（Ａ）、Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、および／またはＧｌｎ（Ｑ）のうちの１つ以上を含む、実施形態１～４８のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
【0372】
５０．スペーサーが、（ＧＡＱＰ）ｎまたは（ＧＱＡＰ）ｎ（ここで、ｎ＝１～２０）を含む、実施形態１～４９のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
【0373】
５１．スペーサーが、（ＧＡＱＰ）ｎまたは（ＧＱＡＰ）ｎ（ここで、ｎ＝２～１９）を含む、実施形態５０に記載の融合タンパク質。
【0374】
５２．スペーサーが、（ＧＡＱＰ）ｎまたは（ＧＱＡＰ）ｎ（ここで、ｎ＝２～１２）を含む、実施形態５０に記載の融合タンパク質。
【0375】
５３．スペーサーが、（ＧＡＱＰ）ｎまたは（ＧＱＡＰ）ｎ（ここで、ｎ＝２～１０）を含む、実施形態５０に記載の融合タンパク質。
【0376】
５４．スペーサーが、（ＧＡＱＰ）ｎまたは（ＧＱＡＰ）ｎ（ここで、ｎ＝２～８）を含む、実施形態５０に記載の融合タンパク質。
【0377】
５５．スペーサーが、（ＧＡＱＰ）ｎまたは（ＧＱＡＰ）ｎ（ここで、ｎ＝２～６）を含む、実施形態５０に記載の融合タンパク質。
【0378】
５６．スペーサーが、（ＧＡＱＰ）ｎまたは（ＧＱＡＰ）ｎ（ここで、ｎ＝２～４）を含む、実施形態５０に記載の融合タンパク質。
【0379】
５７．スペーサーが、（ＧＡＱＰ）ｎまたは（ＧＱＡＰ）ｎ（ここで、ｎ＝２）を含む、実施形態５０に記載の融合タンパク質。
【0380】
５８．スペーサーが、（ＧＡＱＰ）ｎまたは（ＧＱＡＰ）ｎ（ここで、ｎ＝３）を含む、実施形態５０に記載の融合タンパク質。
【0381】
５９．スペーサーが、（ＧＡＱＰ）ｎまたは（ＧＱＡＰ）ｎ（ここで、ｎ＝４）を含む、実施形態５０に記載の融合タンパク質。
【0382】
６０．スペーサーが、（ＧＡＱＰ）ｎまたは（ＧＱＡＰ）ｎ（ここで、ｎ＝５）を含む、実施形態５０に記載の融合タンパク質。
【0383】
６１．スペーサーが、（ＧＡＱＰ）ｎまたは（ＧＱＡＰ）ｎ（ここで、ｎ＝６）を含む、実施形態５０に記載の融合タンパク質。
【0384】
６２．スペーサーが、（ＧＡＱＰ）ｎまたは（ＧＱＡＰ）ｎ（ここで、ｎ＝７）を含む、実施形態５０に記載の融合タンパク質。
【0385】
６３．スペーサーが、（ＧＡＱＰ）ｎまたは（ＧＱＡＰ）ｎ（ここで、ｎ＝８）を含む、実施形態５０に記載の融合タンパク質。
【0386】
６４．スペーサーが、（ＧＡＱＰ）ｎまたは（ＧＱＡＰ）ｎ（ここで、ｎ＝１０）を含む、実施形態５０に記載の融合タンパク質。
【0387】
６５．スペーサーが、（ＧＡＱＰ）ｎまたは（ＧＱＡＰ）ｎ（ここで、ｎ＝１２）を含む、実施形態５０に記載の融合タンパク質。
【0388】
６６．スペーサーが、（ＧＡＱＰ）ｎまたは（ＧＱＡＰ）ｎ（ここで、ｎ＝１４）を含む、実施形態５０に記載の融合タンパク質。
【0389】
６７．スペーサーが、（ＧＡＱＰ）ｎまたは（ＧＱＡＰ）ｎ（ここで、ｎ＝１６）を含む、実施形態５０に記載の融合タンパク質。
【0390】
６８．スペーサーが、（ＧＡＱＰ）ｎまたは（ＧＱＡＰ）ｎ（ここで、ｎ＝１８）を含む、実施形態５０に記載の融合タンパク質。
【0391】
６９．スペーサーが、（ＧＡＱＰ）ｎまたは（ＧＱＡＰ）ｎ（ここで、ｎ＝１９）を含む、実施形態５０に記載の融合タンパク質。
【0392】
７０．スペーサーが、（ＧＡＱＰ）ｎまたは（ＧＱＡＰ）ｎ（ここで、ｎ＝２０）を含む、実施形態５０に記載の融合タンパク質。
【0393】
７１．前述の融合タンパク質が、１つの置換基を含む、実施形態１～７０のいずれかに記載の融合タンパク質。
【0394】
７２．前述の置換基が、Ｌｙｓ／Ｋアミノ酸残基を介して結合される、実施形態１～７１のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
【0395】
７３．前述の置換基が、前述の融合タンパク質のインスリン配列内のＬｙｓ／Ｋアミノ酸残基Ｂ２９Ｋを介して結合される、実施形態１～７２のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
【0396】
７４．ＡＡ２およびＡＡ３が式中に現れる順序が、独立して交換され得る、実施形態１～７３のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
【0397】
７５．式（Ｉ）：Ａｃｙ－ＡＡ２ｍ－ＡＡ３ｐ－のＡｃｙが、１，１６－ヘキサデカン二酸、１，１８－オクタデカン二酸、および１，２０－エイコサン二酸から選択される脂肪二酸基を含む、実施形態１～７４のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
【0398】
７６．Ａｃｙが、脂肪二酸基１，１６－ヘキサデカン二酸を含む、実施形態７５に記載の融合タンパク質。
【0399】
７７．Ａｃｙが、脂肪二酸基１，１８－オクタデカン二酸を含む、実施形態７５に記載の融合タンパク質。
【0400】
７８．Ａｃｙが、脂肪二酸基１，２０－エイコサン二酸を含む、実施形態７５に記載の融合タンパク質。
【0401】
７９．式（Ｉ）：Ａｃｙ－ＡＡ２ｍ－ＡＡ３ｐ－の前述のＡＡ２ｍが、ｇＧｌｕを含み、これが、以下の構造によって表されるガンマグルタミン酸残基を表す、実施形態１～７８のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
【化8】
【0402】
８０．式（Ｉ）：Ａｃｙ－ＡＡ２ｍ－ＡＡ３ｐ－の前述のＡＡ３ｐが、１ｘＯＥＧ、または［２－（２－アミノエトキシ）エトキシ］アセチル、またはアミノ酸残基８－アミノ－３，６－ジオキサオクタン酸－ＮＨ（ＣＨ２）２Ｏ（ＣＨ２）２ＯＣＨ２を含み、以下の構造によって表される、実施形態１～７９のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
【化9】
【0403】
８１．式（Ｉ）：Ａｃｙ－ＡＡ２ｍ－ＡＡ３ｐ－の前述のＡＡ３ｐが、２ｘＯＥＧを含む、実施形態１～８０のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
【0404】
８２．式（Ｉ）：Ａｃｙ－ＡＡ２ｍ－ＡＡ３ｐ－のＡＡ２ｍ－ＡＡ３ｐ－が、ｇＧｌｕ－ＯＥＧまたはｇＧｌｕ－ＯＥＧ－ＯＥＧによって独立して表される、実施形態１～８１のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
【0405】
８３．式（Ｉ）：Ａｃｙ－ＡＡ２ｍ－ＡＡ３ｐ－のＡＡ２ｍ－ＡＡ３ｐ－が、ｇＧｌｕ－ＯＥＧによって表される、実施形態８２に記載の融合タンパク質。
【0406】
８４．式（Ｉ）：Ａｃｙ－ＡＡ２ｍ－ＡＡ３ｐ－のＡＡ２ｍ－ＡＡ３ｐ－が、ｇＧｌｕ－ＯＥＧ－ＯＥＧによって表される、実施形態８２に記載の融合タンパク質。
【0407】
８５．前述の置換基Ａｃｙ－ＡＡ２ｍ－ＡＡ３ｐ－が、以下によって表される、実施形態１～８４のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
８６．前述の置換基Ａｃｙ－ＡＡ２ｍ－ＡＡ３ｐ－が、以下から選択される、実施形態８５に記載の融合タンパク質。
【化10】
【化11】
【0408】
８７．前述の置換基Ａｃｙ－ＡＡ２ｍ－ＡＡ３ｐ－が、以下によって独立して表される、実施形態１～８６のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
ｉ．Ｃ１６二酸－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ
ｉｉ．Ｃ１８二酸－ｇＧｌｕ－ＯＥＧ
ｉｉｉ．Ｃ１８二酸－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ
ｉｖ．Ｃ２０二酸－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ
ｉ．Ｃ１６二酸－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ
ｉｉ．Ｃ１８二酸－ｇＧｌｕ－ＯＥＧ
ｉｉｉ．Ｃ１８二酸－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ
ｉｖ．Ｃ２０二酸－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ
【0409】
８８．前述の置換基Ａｃｙ－ＡＡ２ｍ－ＡＡ３ｐ－が、Ｃ１６二酸－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧによって独立して表される、実施形態８７に記載の融合タンパク質。
【0410】
８９．前述の置換基Ａｃｙ－ＡＡ２ｍ－ＡＡ３ｐ－が、Ｃ１８二酸－ｇＧｌｕ－ＯＥＧによって独立して表される、実施形態８７に記載の融合タンパク質。
【0411】
９０．前述の置換基Ａｃｙ－ＡＡ２ｍ－ＡＡ３ｐ－が、Ｃ１８二酸－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧによって独立して表される、実施形態８７に記載の融合タンパク質。
【0412】
９１．前述の置換基Ａｃｙ－ＡＡ２ｍ－ＡＡ３ｐ－が、Ｃ２０二酸－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧによって独立して表される、実施形態８７に記載の融合タンパク質。
【0413】
９２．融合タンパク質が、インスリン受容体を活性化する、実施形態１～９１のいずれかに記載の融合タンパク質。
【0414】
９３．融合タンパク質が、血糖を低下させる能力を有する、実施形態１～９２のいずれかに記載の融合タンパク質。
【0415】
９４．融合タンパク質が、対照薬融合タンパク質と比較して、優れた血糖低減を示した、実施形態１～９３のいずれかに記載の融合タンパク質。
【0416】
９５．融合タンパク質が、対照薬融合タンパク質と比較して、改善された血糖低減を示した、実施形態１～９４のいずれかに記載の融合タンパク質。
【0417】
９６．融合タンパク質が、ＰＣＳＫ９に結合する、実施形態１～９５のいずれかに記載の融合タンパク質。
【0418】
９７．融合タンパク質が、ＬＤＬ－ＲへのＰＣＫＳ９結合を阻害する、実施形態１～９６のいずれかに記載の融合タンパク質。
【0419】
９８．融合タンパク質が、野生型ＥＧＦ（Ａ）と比較して、ＰＣＳＫ９に結合する改善された能力を有する、実施形態１～９７のいずれかに記載の融合タンパク質。
【0420】
９９．ＰＣＳＫ９－ＬＤＬ－Ｒ結合競合ＥＬＩＳＡアッセイで測定したときの融合タンパク質のＫｉが、２０ｎＭ未満である、実施形態１～９８のいずれかに記載の融合タンパク質。
【0421】
１００．ＰＣＳＫ９－ＬＤＬ－Ｒ結合競合ＥＬＩＳＡアッセイで測定したときの融合タンパク質のＫｉが、５ｎＭ未満である、実施形態１～９９のいずれかに記載の融合タンパク質。
【0422】
１０１．融合タンパク質が、ＬＤＬ取り込みを増加させる、実施形態１～１００のいずれかに記載の融合タンパク質。
【0423】
１０２．融合タンパク質が、ＬＤＬ取り込みアッセイで測定した場合に、１０００ｎＭ未満のＥＣ５０を有する、実施形態１～１０１のいずれかに記載の融合タンパク質。
【0424】
１０３．融合タンパク質が、ＬＤＬ取り込みアッセイで測定した場合に、５００ｎＭ未満のＥＣ５０を有する、実施形態１～１０２のいずれかに記載の融合タンパク質。
【0425】
１０４．融合タンパク質が、ＬＤＬ取り込みアッセイで測定した場合に、２００ｎＭ未満のＥＣ５０を有する、実施形態１～１０３のいずれかに記載の融合タンパク質。
【0426】
１０５．前述の融合タンパク質が、実施例１～２４の融合タンパク質によって表される、実施形態１～１０４のいずれかに記載の融合タンパク質。
【0427】
１０６．前述の融合タンパク質が、実施例１の融合タンパク質によって表される、実施形態１～１０５のいずれかに記載の融合タンパク質。
【0428】
１０７．前述の融合タンパク質が、実施例１～２４の融合タンパク質によって表される、実施形態１～１０６のいずれかに記載の融合タンパク質。
【0429】
１０８．前述の融合タンパク質が、実施例２～５、８～１５、および１７～２１の融合タンパク質によって表される、実施形態１～１０７のいずれかに記載の融合タンパク質。
【0430】
１０９．前述の融合タンパク質が、実施例６、７、１６、２２、２３、および２４の融合タンパク質によって表される、実施形態１～１０８のいずれかに記載の融合タンパク質。
【0431】
１１０．前述の融合タンパク質が、実施例１～４、５～１４、および１６～２４の融合タンパク質によって表される、実施形態１～１０９のいずれかに記載の融合タンパク質。
【0432】
１１１．前述の融合タンパク質が、実施例１～１８の融合タンパク質によって表される、実施形態１～１１０のいずれかに記載の融合タンパク質。
【0433】
１１２．前述の融合タンパク質が、実施例１および３～１７の融合タンパク質によって表される、実施形態１～１１１のいずれかに記載の融合タンパク質。
【0434】
１１３．前述の融合タンパク質が、実施例１および３～１６の融合タンパク質によって表される、実施形態１～１１２のいずれかに記載の融合タンパク質。
【0435】
１１４．前述の融合タンパク質が、実施例１および３～１２の融合タンパク質によって表される、実施形態１～１１３のいずれかに記載の融合タンパク質。
【0436】
１１５．前述の融合タンパク質が、実施例１および３～８の融合タンパク質によって表される、実施形態１～１１４のいずれかに記載の融合タンパク質。
【0437】
１１６．薬剤として使用するための、実施形態１～１１５のいずれかに記載の融合タンパク質。
【0438】
１１７．糖尿病患者における循環器疾患の予防または治療で使用するための、実施形態１～１１６のいずれかに記載の融合タンパク質。
【0439】
１１８．糖尿病患者における脂質パラメータを改善するための方法で使用するための、実施形態１～１１７のいずれかに記載の融合タンパク質。
【0440】
１１９．以下からなる群から選択される、本発明の融合ペプチドの新規の骨格の形態の中間生成物。
【表4】
【0441】
１２０．糖尿病、１型糖尿病、２型糖尿病、耐糖能障害、高血糖症、および／または脂質異常症の治療または予防で使用するための、実施形態１～１１５のいずれかに記載の融合タンパク質。
【0442】
１２１．脂質パラメータの改善、例えば、脂質異常症の予防および／もしくは治療、総血清脂質の低下、ＨＤＬ－Ｃの増加、ＬＤＬ－Ｃの低下、小型高密度ＬＤＬ－Ｃの低下、ＶＬＤＬ－Ｃの低下、トリグリセリドの低下、コレステロールの低下、リポタンパク質ａ（Ｌｐ（ａ））の血漿レベルの低下、またはアポリポタンパク質Ａ（ａｐｏ（Ａ））の生成の阻害のための、糖尿病患者における治療方法で使用するための、実施形態１～１１５のいずれかに記載の融合タンパク質。
【0443】
１２２．実施形態１～１１５のいずれかに記載の融合タンパク質と、薬学的に許容される賦形剤とを含む、医薬組成物。
【0444】
１２３．皮下投与のための、実施形態１２２に記載の医薬組成物。
【0445】
１２４．糖尿病の治療を必要とする患者における糖尿病の治療のための医薬組成物であって、実施形態１～１１５のいずれか１つに記載の治療有効量の融合タンパク質を、薬学的に許容される担体と共に含む、医薬組成物。
【0446】
１２５．薬剤として使用するための、実施形態１２２に記載の医薬組成物。
【0447】
１２６．糖尿病および高いリスクの循環器疾患を有する患者の治療で使用するための、実施形態１２２に記載の医薬組成物。
【0448】
１２７．糖尿病、１型糖尿病、２型糖尿病、耐糖能障害、高血糖症、脂質異常症の治療または予防のための薬剤の製造のための、実施形態１～１１５のいずれか１つに記載の融合タンパク質の使用。
【0449】
１２８．脂質パラメータを改善するための方法であって、糖尿病患者において、実施形態１～１１５のいずれかに記載の薬学的に活性な量の融合タンパク質を投与するステップを含む、方法。
【0450】
１２９．脂質異常症の予防および／または治療、総血清脂質の低下、ＨＤＬの増加、ＬＤＬ－Ｃの低下、小型高密度ＬＤＬ－Ｃの低下、ＶＬＤＬ－Ｃの低下、非＿ＨＤＬ－Ｃ、トリグリセリドの低下、コレステロールの低下、リポタンパク質ａ（Ｌｐ（ａ））の血漿レベルの低下など、糖尿病患者における脂質パラメータを改善するための方法であって、実施形態１～１１５のいずれかに記載の薬学的に活性な量の融合タンパク質を投与するステップを含む、方法。
【0451】
１３０．脂質パラメータの改善、例えば、脂質異常症の予防および／または治療、総血清脂質の低下、ＨＤＬ－Ｃの増加、ＬＤＬ－Ｃの低下、小型高密度ＬＤＬ－Ｃの低下、ＶＬＤＬ－Ｃの低下、トリグリセリドの低下、コレステロールの低下、リポタンパク質ａ（Ｌｐ（ａ））の血漿レベルの低下、またはアポリポタンパク質Ａ（ａｐｏ（Ａ））の生成の阻害、ならびに循環器疾患の予防および／または治療のための、糖尿病患者における治療方法で使用するための、実施形態１～１１５のいずれかに記載のインスリン類似体。
【0452】
１３１．糖尿病患者における循環器疾患の予防および／または治療のための方法であって、薬学的に活性な量の実施形態１～１１５のいずれかに記載の融合タンパク質を投与するステップを含む、方法。
【0453】
１３２．糖尿病、１型糖尿病、２型糖尿病、耐糖能障害、高血糖症、脂質異常症の治療または予防のための方法であって、実施形態１～１１５のいずれか１つに記載の治療有効量の融合タンパク質の投与を必要とする対象に投与を行うことを含む、方法。
【実施例】
【0454】
【表5】
【0455】
類似体、すなわち、二鎖非アシル化インスリンＥＧＦ（Ａ）融合タンパク質は、以下にさらに記載されるように、ｅ－ｃｏｌｉまたは酵母のいずれかで発現され得る。
【0456】
Ｅ．ｃｏｌｉおよび精製におけるＥＧＦ（Ａ）インスリン融合化合物類似体の組み換え発現
ＥＧＦ（Ａ）インスリン融合タンパク質類似体は、封入体（ＩＢ）としてＥ．ｃｏｌｉ中で良好に発現され得る。
ＥＧＦ（Ａ）インスリン融合タンパク質類似体は、封入体（ＩＢ）としてＥ．ｃｏｌｉ中で良好に発現され得る。
【0457】
インスリン－ＥＧＦ（Ａ）融合タンパク質類似体のｃＤＮＡをｐＥＴ１１ｂ由来ベクターにサブクローニングし、次いで、プラスミドをＢＬ２１（ＤＥ３）由来宿主株に形質転換した。既知組成培地中において、流加（ｆｅｄ－ｂａｔｃｈ）プロセスで発酵を行った。
【0458】
インスリン－ＥＧＦ（Ａ）融合タンパク質類似体を、以下のようにさらに精製した。
【0459】
細胞を採取し、細胞粉砕器を使用して、１５０ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭのｐＨ８．０トリス緩衝液中で溶解した。融合タンパク質のＩＢを含有する不溶性画分を回収し、５００ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭのｐＨ８．０トリス緩衝液およびＨ２Ｏで順次洗浄した。次いで、２０ｍＭのトリス、６Ｍの尿素、１０ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ９．０を使用して、ＩＢを室温（２０～２５℃）で１０ｍｇ／ｍＬの濃度に可溶化した。可溶化後、リフォールディングのために、溶液を２０ｍＭのグリシン、１ｍＭのシステイン、１０ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ１０．５で１０倍に希釈し、リフォールディングは、室温において６～１０時間で完了する。浄化（遠心分離または深層濾過）の後、Ｑセファロースビッグビーズ（２０ｍＭのトリス、１０ｍＭのＣａＣｌ２、１０％ ＥｔＯＨ、ｐＨ８．０）を使用して、タンパク質を捕捉した。その後、溶出プールを室温で３～４時間、１：１０００の比率でＡＬＰによって処理した。次いで、切断されたタンパク質を、分離のためにＳｏｕｒｃｅ ３０ＲＰＣに適用した。最終精製工程として、緩いＮａＣｌ勾配を使用したＳｏｕｒｃｅ ３０Ｑ（２０ｍＭのトリス、１０ｍＭのＣａＣｌ２、１０％ ＥｔＯＨ、ｐＨ８．０）を用いた。より長いスペーサー（すなわち、６回以上の反復）を有する類似体については、ｐＨ８．５を使用して、両方のアニオン交換ステップで結合を促進するべきである。
【0460】
酵母および精製におけるＥＧＦ（Ａ）インスリン融合化合物の組み換え発現
ＥＧＦ（Ａ）インスリン融合類似体は、例えば、ＷＯ２０１７／０３２７９８に開示されているような周知の技術によって発現および培養される。より具体的には、インスリン－ＥＧＦ（Ａ）融合タンパク質は、以下のように調製および精製される。
ＥＧＦ（Ａ）インスリン融合類似体は、例えば、ＷＯ２０１７／０３２７９８に開示されているような周知の技術によって発現および培養される。より具体的には、インスリン－ＥＧＦ（Ａ）融合タンパク質は、以下のように調製および精製される。
【0461】
ＳＰセファロースＢＢ上での前駆体の捕捉：
酵母上清を、ＳＰセファロースＢＢで充填されたカラム上に１０～２０ｃｖ／時間の流量で装填した。０．１Ｍのクエン酸、ｐＨ３．５による洗浄、および４０％ ＥｔＯＨによる洗浄を行った。類似体を０．２ＭのＮａ－酢酸塩ｐＨ５．５／３５％ ＥｔＯＨで溶出した。
酵母上清を、ＳＰセファロースＢＢで充填されたカラム上に１０～２０ｃｖ／時間の流量で装填した。０．１Ｍのクエン酸、ｐＨ３．５による洗浄、および４０％ ＥｔＯＨによる洗浄を行った。類似体を０．２ＭのＮａ－酢酸塩ｐＨ５．５／３５％ ＥｔＯＨで溶出した。
【0462】
ジスルフィド架橋の再シャフリング：
ＳＰプールをｐＨ９に調整した。再シャフリング試薬を最終濃度まで添加し（システイン２，５ｍＭ、シスチン０，２５ｍＭ、およびＣａＣｌ２ ２５ｍＭ）、ＵＰＬＣで追跡した。
ＳＰプールをｐＨ９に調整した。再シャフリング試薬を最終濃度まで添加し（システイン２，５ｍＭ、シスチン０，２５ｍＭ、およびＣａＣｌ２ ２５ｍＭ）、ＵＰＬＣで追跡した。
【0463】
ＡＬＰ消化：
再シャフリングプールをｐＨ９に調整し、ＡＬＰ酵素を１：１００（ｗ／ｗ）添加した。ＵＰＬＣで反応を追跡した。ＲＰＨＰＬＣ精製用に調製するために、ＡＬＰ切断プールをｐＨ２．５に調整し、２倍に希釈した。
再シャフリングプールをｐＨ９に調整し、ＡＬＰ酵素を１：１００（ｗ／ｗ）添加した。ＵＰＬＣで反応を追跡した。ＲＰＨＰＬＣ精製用に調製するために、ＡＬＰ切断プールをｐＨ２．５に調整し、２倍に希釈した。
【0464】
ＲＰＨＰＬＣ精製：
精製をＲＰＨＰＬＣ Ｃ１８によって以下のように実施した。
カラム：１５ｕｍ Ｃ１８ ５０×２５０ｍｍ ２００Å
緩衝液：
Ａ：２５ｍＭのＣａＣｌ２、０，２％ギ酸、５％ ＥｔＯＨ
Ｂ：０，２％ギ酸、５０％ ＥｔＯＨ
勾配：２０～５５％ Ｂ緩衝液
勾配：２０ＣＶ
流量 ２０ＣＶ／時間
装填ｇ 約５ｇ／Ｌ樹脂
精製をＲＰＨＰＬＣ Ｃ１８によって以下のように実施した。
カラム：１５ｕｍ Ｃ１８ ５０×２５０ｍｍ ２００Å
緩衝液：
Ａ：２５ｍＭのＣａＣｌ２、０，２％ギ酸、５％ ＥｔＯＨ
Ｂ：０，２％ギ酸、５０％ ＥｔＯＨ
勾配：２０～５５％ Ｂ緩衝液
勾配：２０ＣＶ
流量 ２０ＣＶ／時間
装填ｇ 約５ｇ／Ｌ樹脂
【0465】
分画をＵＰＬＣによって分析し、プールし、凍結乾燥させた。
【0466】
総論
以下の実施例および一般的手順は、本明細書および合成スキームにおいて特定される最終生成物に言及する。本発明の化合物の調製について、以下の実施例を使用して詳細に記載しているが、記載の化学反応は、本発明の化合物の調製に対するそれらの一般的適用可能性に関して開示されている。
以下の実施例および一般的手順は、本明細書および合成スキームにおいて特定される最終生成物に言及する。本発明の化合物の調製について、以下の実施例を使用して詳細に記載しているが、記載の化学反応は、本発明の化合物の調製に対するそれらの一般的適用可能性に関して開示されている。
【0467】
時には、本発明の開示された範囲内に含まれる各化合物に対して、反応が記載どおりには適用可能でないこともあり得る。これが生じる化合物は、当業者によって容易に認識されるであろう。これらの場合、当業者に既知の従来の修正によって、すなわち、干渉する基の適切な保護、他の従来の試薬への変更、または反応条件の通例の修正によって、反応を首尾よく実行することができる。
【0468】
代替的には、本明細書に開示される他の反応または別の従来の反応が、本発明の対応する化合物の調製に適用されることとなる。すべての調製方法では、すべての出発物質は既知であるか、または既知の出発物質から容易に調製され得る。すべての温度は摂氏温度で表されており、別段の指示がない限り、収率に言及する場合すべての部および割合は重量によるものであり、また溶媒および溶離液に言及する場合すべての部は体積によるものである。
分析方法：
分析方法：
【表6】
【表7】
【表8】
【表9】
【0469】
置換基の合成：
置換基を、例えばＷＯ２００９／１１５４６９に記載されるように、溶液中または固相上で合成した。
置換基を、例えばＷＯ２００９／１１５４６９に記載されるように、溶液中または固相上で合成した。
【0470】
本発明のインスリン－ＥＧＦ（Ａ）融合タンパク質のアシル化に関する一般的手順：
インスリン－ＥＧＦ（Ａ）融合タンパク質を水性緩衝液中に溶解し、任意選択で有機共溶媒（例えば、ＥｔＯＨ、アセトニトリル、ＤＭＳＯ、またはＮＭＰ）を添加し、ｐＨを１１．２に調整する。ＮＭＰ（１００ｍｇ／ｍＬ）中の活性化側鎖の溶液を、１Ｍ ＮａＯＨの添加によってｐＨを約１１．２に維持しながら滴下し、反応の進行をＬＣ－ＭＳによってモニタリングする。反応完了時に、ＴＦＡ、酢酸、または１Ｍ ＨＣｌを混合物に添加する。水で希釈した後、混合物を分取ＨＰＬＣによって精製する。純粋な画分をプールし、凍結乾燥させて、本発明の化合物を得る。
インスリン－ＥＧＦ（Ａ）融合タンパク質を水性緩衝液中に溶解し、任意選択で有機共溶媒（例えば、ＥｔＯＨ、アセトニトリル、ＤＭＳＯ、またはＮＭＰ）を添加し、ｐＨを１１．２に調整する。ＮＭＰ（１００ｍｇ／ｍＬ）中の活性化側鎖の溶液を、１Ｍ ＮａＯＨの添加によってｐＨを約１１．２に維持しながら滴下し、反応の進行をＬＣ－ＭＳによってモニタリングする。反応完了時に、ＴＦＡ、酢酸、または１Ｍ ＨＣｌを混合物に添加する。水で希釈した後、混合物を分取ＨＰＬＣによって精製する。純粋な画分をプールし、凍結乾燥させて、本発明の化合物を得る。
【0471】
この一般的手順は、以下の実施例１でさらに例示される。本発明の他のすべての化合物を同様に調製した。
【0472】
実施例１
ＥＧＦ（Ａ）（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）－［ＧＡＱＰ］２－インスリン（Ｂ３Ｅ、Ｂ２９Ｋ（ヘキサデカンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０）
Ｃｈｅｍ．１：
ＥＧＦ（Ａ）３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）－［ＧＡＱＰ］２－インスリン（Ｂ３Ｅ、ｄｅｓＢ３０）（４８ｍＬ、２．４４ｍｇ／ｍＬ、１１７ｍｇ）の溶液を、２０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０、１０ｍＭのＣａＣｌ２、１０％ ＥｔＯＨ、５０ｍＭのＮａＣｌからなる緩衝液中に溶解した。１Ｍ ＮａＯＨでｐＨを１１．１に上昇させた。ヘキサデカンジオイル－Ｇｌｕ－２ｘＯＥＧ－ＯＳｕの溶液（０．５ｍＬのＮＭＰ中２４ｍｇ）を、１Ｍ ＮａＯＨを使用してｐＨを一定の１１．１に維持しながら滴下した。最終反応後、混合物に、ｐＨ１．６になるまでＴＦＡを添加した。アセトニトリル（１４ｍＬ）を混合物に添加し、その後、水で１００ｍＬにした。混合物を、ＲＰ－ＨＰＬＣによって精製した。
カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｇｅｍｉｎｉ、５μＭ ５ｕ Ｃ１８ １１０Å、３０ｘ２５０ｍｍ
流量：２０ｍＬ／分
緩衝液Ａ：ＭｉｌｌｉＱ水中０．１％ ＴＦＡ
緩衝液Ｂ：アセトニトリル中０．１％のＴＦＡ
勾配：２０％ Ｂ～５０％ Ｂ、線形
勾配時間：４０分
画分サイズ：６ｍＬ
純粋な画分をプールし、凍結乾燥させて、表題の化合物５６ｍｇを得た。
ＬＣ－ＭＳ ３８（エレクトロスプレー）：ｍ／ｚ＝１８７３．２８（Ｍ＋６）／６。計算値：１８７３．２７。
Ｒｔ＝１．６７分
ＥＧＦ（Ａ）（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）－［ＧＡＱＰ］２－インスリン（Ｂ３Ｅ、Ｂ２９Ｋ（ヘキサデカンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０）
Ｃｈｅｍ．１：
【化12】
カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｇｅｍｉｎｉ、５μＭ ５ｕ Ｃ１８ １１０Å、３０ｘ２５０ｍｍ
流量：２０ｍＬ／分
緩衝液Ａ：ＭｉｌｌｉＱ水中０．１％ ＴＦＡ
緩衝液Ｂ：アセトニトリル中０．１％のＴＦＡ
勾配：２０％ Ｂ～５０％ Ｂ、線形
勾配時間：４０分
画分サイズ：６ｍＬ
純粋な画分をプールし、凍結乾燥させて、表題の化合物５６ｍｇを得た。
ＬＣ－ＭＳ ３８（エレクトロスプレー）：ｍ／ｚ＝１８７３．２８（Ｍ＋６）／６。計算値：１８７３．２７。
Ｒｔ＝１．６７分
【0473】
実施例２
ＥＧＦ（Ａ）（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）－［ＧＡＱＰ］１０－インスリン（Ｂ２９Ｋ（オクタデカンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０）
Ｃｈｅｍ．２：
ＬＣ－ＭＳ ３８（エレクトロスプレー）：ｍ／ｚ＝１５９７．３５（Ｍ＋９）／９。計算値：１５９７．００
Ｒｔ＝１．７５分
ＥＧＦ（Ａ）（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）－［ＧＡＱＰ］１０－インスリン（Ｂ２９Ｋ（オクタデカンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０）
Ｃｈｅｍ．２：
【化13】
Ｒｔ＝１．７５分
【0474】
実施例３
ＥＧＦ（Ａ）（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）－［ＧＡＱＰ］２－インスリン（Ｂ３Ｅ、Ｂ２９Ｋ（オクタデカンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０）
Ｃｈｅｍ．３：
ＬＣ－ＭＳ ２７（ＴＯＦ）：ｍ／ｚ＝１１５５２．８９。計算値：１１５５２．００
ＥＧＦ（Ａ）（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）－［ＧＡＱＰ］２－インスリン（Ｂ３Ｅ、Ｂ２９Ｋ（オクタデカンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０）
Ｃｈｅｍ．３：
【化14】
【0475】
実施例４
ＥＧＦ（Ａ）（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）－［ＧＡＱＰ］２－インスリン（Ｂ２９Ｋ（オクタデカンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０）
Ｃｈｅｍ．４：
ＬＣ－ＭＳ方法１（エレクトロスプレー）：ｍ／ｚ＝１９２４．３９（Ｍ＋６）／６。計算値：１９２３．８３
Ｒｔ＝２．１３分
ＥＧＦ（Ａ）（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）－［ＧＡＱＰ］２－インスリン（Ｂ２９Ｋ（オクタデカンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０）
Ｃｈｅｍ．４：
【化15】
Ｒｔ＝２．１３分
【0476】
実施例５
ＥＧＦ（Ａ）（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）－［ＧＡＱＰ］２－インスリン（Ｂ３Ｅ、Ｂ２９Ｋ（オクタデカンジオイル－ｇＧｌｕ－ＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０）
Ｃｈｅｍ．５：
ＬＣ－ＭＳ方法２（エレクトロスプレー）：ｍ／ｚ＝１９０２．０１（Ｍ＋６）／６。計算値：１９０２．１
Ｒｔ＝１．８分
ＥＧＦ（Ａ）（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）－［ＧＡＱＰ］２－インスリン（Ｂ３Ｅ、Ｂ２９Ｋ（オクタデカンジオイル－ｇＧｌｕ－ＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０）
Ｃｈｅｍ．５：
【化16】
Ｒｔ＝１．８分
【0477】
実施例６
ＥＧＦ（Ａ）（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）－［ＧＡＱＰ］２－インスリン（Ｂ３Ｅ、Ｂ２９Ｋ（エイコサンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０）
Ｃｈｅｍ．６：
ＬＣ－ＭＳ方法２（エレクトロスプレー）： ｍ／ｚ＝１９３０．７４（Ｍ＋６）／６。計算値：１９３１．０２
Ｒｔ＝１．８９分
ＥＧＦ（Ａ）（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）－［ＧＡＱＰ］２－インスリン（Ｂ３Ｅ、Ｂ２９Ｋ（エイコサンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０）
Ｃｈｅｍ．６：
【化17】
Ｒｔ＝１．８９分
【0478】
実施例７
ＥＧＦ（Ａ）（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）－［ＧＡＱＰ］２－インスリン（Ｂ２９Ｋ（エイコサンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０）
Ｃｈｅｍ．７：
ＬＣ－ＭＳ方法１（エレクトロスプレー）：ｍ／ｚ＝１９２８．６７（Ｍ＋６）／６。計算値：１９２８．５１
Ｒｔ＝２．２７分
ＥＧＦ（Ａ）（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）－［ＧＡＱＰ］２－インスリン（Ｂ２９Ｋ（エイコサンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０）
Ｃｈｅｍ．７：
【化18】
Ｒｔ＝２．２７分
【0479】
実施例８
ＥＧＦ（Ａ）（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）－［ＧＱＡＰ］２－インスリン（Ｂ２９Ｋ（オクタデカンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０）
Ｃｈｅｍ．８：
ＬＣ－ＭＳ方法１（エレクトロスプレー）：ｍ／ｚ＝１９２４．３３（Ｍ＋６）／６。計算値：１９２３．８３
Ｒｔ＝１．８７分
ＥＧＦ（Ａ）（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）－［ＧＱＡＰ］２－インスリン（Ｂ２９Ｋ（オクタデカンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０）
Ｃｈｅｍ．８：
【化19】
Ｒｔ＝１．８７分
【0480】
実施例９
ＥＧＦ（Ａ）（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）－［ＧＡＱＰ］３－インスリン（Ｂ２９Ｋ（オクタデカンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０）
Ｃｈｅｍ．９：
ＬＣ－ＭＳ方法１（エレクトロスプレー）：ｍ／ｚ＝１９８３．４４（Ｍ＋６）／６。計算値：１９８２．７２
Ｒｔ＝２．００分
ＥＧＦ（Ａ）（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）－［ＧＡＱＰ］３－インスリン（Ｂ２９Ｋ（オクタデカンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０）
Ｃｈｅｍ．９：
【化20】
Ｒｔ＝２．００分
【0481】
実施例１０
ＥＧＦ（Ａ）（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）－［ＧＡＱＰ］３－インスリン（Ａ１４Ｅ、Ｂ２９Ｋ（オクタデカンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０）
Ｃｈｅｍ．１０：
ＬＣ－ＭＳ方法２（エレクトロスプレー）：ｍ／ｚ＝１９７７．１８（Ｍ＋６）／６。計算値：１９７７．０５
Ｒｔ＝１．８分
ＥＧＦ（Ａ）（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）－［ＧＡＱＰ］３－インスリン（Ａ１４Ｅ、Ｂ２９Ｋ（オクタデカンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０）
Ｃｈｅｍ．１０：
【化21】
Ｒｔ＝１．８分
【0482】
実施例１１
ＥＧＦ（Ａ）（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）－［ＧＡＱＰ］４－インスリン（Ａ１４Ｅ、Ｂ２９Ｋ（オクタデカンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０）
Ｃｈｅｍ．１１：
ＬＣ－ＭＳ方法２（エレクトロスプレー）：ｍ／ｚ＝１５２７．１３（Ｍ＋８）／８。計算値：１５２７－２
Ｒｔ＝１．７８分
ＥＧＦ（Ａ）（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）－［ＧＡＱＰ］４－インスリン（Ａ１４Ｅ、Ｂ２９Ｋ（オクタデカンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０）
Ｃｈｅｍ．１１：
【化22】
Ｒｔ＝１．７８分
【0483】
実施例１２
ＥＧＦ（Ａ）（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）－［ＧＡＱＰ］４－インスリン（Ｂ２９Ｋ（オクタデカンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０）
Ｃｈｅｍ．１２：
ＬＣ－ＭＳ方法２（エレクトロスプレー）：ｍ／ｚ＝１７４９．９６（Ｍ＋７）／７。計算値：１７５０．１０
Ｒｔ＝１．７１分
ＥＧＦ（Ａ）（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）－［ＧＡＱＰ］４－インスリン（Ｂ２９Ｋ（オクタデカンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０）
Ｃｈｅｍ．１２：
【化23】
Ｒｔ＝１．７１分
【0484】
実施例１３
ＥＧＦ（Ａ）（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）－［ＧＡＱＰ］６－インスリン（Ａ１４Ｅ、Ｂ２９Ｋ（オクタデカンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０）
Ｃｈｅｍ．１３：
ＬＣ－ＭＳ方法２（エレクトロスプレー）：ｍ／ｚ＝１８４５．９（Ｍ＋７）／７。計算値：１８４６．２
Ｒｔ＝１．７４分
ＥＧＦ（Ａ）（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）－［ＧＡＱＰ］６－インスリン（Ａ１４Ｅ、Ｂ２９Ｋ（オクタデカンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０）
Ｃｈｅｍ．１３：
【化24】
Ｒｔ＝１．７４分
【0485】
実施例１４
ＥＧＦ（Ａ）（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）－［ＧＡＱＰ］６－インスリン（Ｂ２９Ｋ（オクタデカンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０）
Ｃｈｅｍ．１４：
ＬＣ－ＭＳ方法１（エレクトロスプレー）：ｍ／ｚ＝１８５１．０１（Ｍ＋７）／７。計算値：１８５１．０７
Ｒｔ＝２．０７分
ＥＧＦ（Ａ）（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）－［ＧＡＱＰ］６－インスリン（Ｂ２９Ｋ（オクタデカンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０）
Ｃｈｅｍ．１４：
【化25】
Ｒｔ＝２．０７分
【0486】
実施例１５
ＥＧＦ（Ａ）（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）－［ＧＡＱＰ］６－インスリン（Ａ１４Ｅ、Ｂ２９Ｋ（オクタデカンジオイル－ｇＧｌｕ－ＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０）
Ｃｈｅｍ．１５：
ＬＣ－ＭＳ方法４（ＴＯＦ）：ｍ／ｚ＝１２７７１．８２。計算値：１２７７１．２６
ＥＧＦ（Ａ）（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）－［ＧＡＱＰ］６－インスリン（Ａ１４Ｅ、Ｂ２９Ｋ（オクタデカンジオイル－ｇＧｌｕ－ＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０）
Ｃｈｅｍ．１５：
【化26】
【0487】
実施例１６
ＥＧＦ（Ａ）（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）－［ＧＡＱＰ］６－インスリン（Ａ１４Ｅ、Ｂ２９Ｋ（エイコサンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０
Ｃｈｅｍ．１６：
ＬＣ－ＭＳ方法２（エレクトロスプレー）：ｍ／ｚ＝１８５０．１６（Ｍ＋７）／７。計算値：１８５０．２１
Ｒｔ＝１．９８分
ＥＧＦ（Ａ）（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）－［ＧＡＱＰ］６－インスリン（Ａ１４Ｅ、Ｂ２９Ｋ（エイコサンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０
Ｃｈｅｍ．１６：
【化27】
Ｒｔ＝１．９８分
【0488】
実施例１７
ＥＧＦ（Ａ）（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）－［ＧＡＱＰ］８－インスリン（Ｂ２９Ｋ（オクタデカンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０）
Ｃｈｅｍ．１７：
ＬＣ－ＭＳ方法２（エレクトロスプレー）：ｍ／ｚ＝１７０８．１５（Ｍ＋８）／８。計算値：１７０８．１５
Ｒｔ＝１．７４分
ＥＧＦ（Ａ）（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）－［ＧＡＱＰ］８－インスリン（Ｂ２９Ｋ（オクタデカンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０）
Ｃｈｅｍ．１７：
【化28】
Ｒｔ＝１．７４分
【0489】
実施例１８
ＥＧＦ（Ａ）（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）－［ＧＡＱＰ］１２－インスリン（Ｂ２９Ｋ（オクタデカンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０）
Ｃｈｅｍ．１８：
ＬＣ－ＭＳ方法１（エレクトロスプレー）：ｍ／ｚ＝１８８４．７６（Ｍ＋８）／８。計算値：１８８４．８４
Ｒｔ＝２．０４分
ＥＧＦ（Ａ）（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）－［ＧＡＱＰ］１２－インスリン（Ｂ２９Ｋ（オクタデカンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０）
Ｃｈｅｍ．１８：
【化29】
Ｒｔ＝２．０４分
【0490】
実施例１９
ＥＧＦ（Ａ）（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）－［ＧＡＱＰ］１９－インスリン（Ｂ２９Ｋ（オクタデカンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０）
Ｃｈｅｍ．１９：
ＬＣ－ＭＳ方法３（ＴＯＦ）：ｍ／ｚ＝１７５４５．１７。計算値：１７５４４．３４
ＥＧＦ（Ａ）（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）－［ＧＡＱＰ］１９－インスリン（Ｂ２９Ｋ（オクタデカンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０）
Ｃｈｅｍ．１９：
【化30】
【0491】
実施例２０
ＥＧＦ（Ａ）（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）－［ＧＡＱＰ］１９－インスリン（Ａ１４Ｅ、Ｂ２９Ｋ（オクタデカンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０）
Ｃｈｅｍ．２０：
ＬＣ－ＭＳ方法１（エレクトロスプレー）：ｍ／ｚ＝１９４７．０（Ｍ＋９）／９。計算値：１９４６．６
Ｒｔ＝１．７３分
ＥＧＦ（Ａ）（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）－［ＧＡＱＰ］１９－インスリン（Ａ１４Ｅ、Ｂ２９Ｋ（オクタデカンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０）
Ｃｈｅｍ．２０：
【化31】
Ｒｔ＝１．７３分
【0492】
実施例２１
ＥＧＦ（Ａ）（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）－［ＧＡＱＰ］１９－インスリン（Ｂ３Ｅ、Ｂ２９Ｋ（オクタデカンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０）
Ｃｈｅｍ．２１：
ＬＣ－ＭＳ方法３（ＴＯＦ）：ｍ／ｚ＝１７５５９．９３。計算値：１７５５９．３５
ＥＧＦ（Ａ）（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）－［ＧＡＱＰ］１９－インスリン（Ｂ３Ｅ、Ｂ２９Ｋ（オクタデカンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０）
Ｃｈｅｍ．２１：
【化32】
【0493】
実施例２２
ＥＧＦ（Ａ）（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）－［ＧＡＱＰ］１９－インスリン（Ｂ２９Ｋ（エイコサンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０）
Ｃｈｅｍ．２２：
ＬＣ－ＭＳ方法３（ＴＯＦ）：ｍ／ｚ＝１７５７３．３７。計算値：１７５７２．３９
ＥＧＦ（Ａ）（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）－［ＧＡＱＰ］１９－インスリン（Ｂ２９Ｋ（エイコサンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０）
Ｃｈｅｍ．２２：
【化33】
【0494】
実施例２３
ＥＧＦ（Ａ）（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）－［ＧＡＱＰ］１９－インスリン（Ａ１４Ｅ、Ｂ２９Ｋ（エイコサンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０）
Ｃｈｅｍ．２３：
ＬＣ－ＭＳ方法１（エレクトロスプレー）： ｍ／ｚ＝１４６２．４５（Ｍ＋１２）／１２。計算値：１４６２．５３
Ｒｔ＝１．８４分
ＥＧＦ（Ａ）（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）－［ＧＡＱＰ］１９－インスリン（Ａ１４Ｅ、Ｂ２９Ｋ（エイコサンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０）
Ｃｈｅｍ．２３：
【化34】
Ｒｔ＝１．８４分
【0495】
実施例２４
ＥＧＦ（Ａ）（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）－［ＧＡＱＰ］１９－インスリン（Ｂ３Ｅ、Ｂ２９Ｋ（エイコサンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０）
Ｃｈｅｍ．２４：
ＬＣ－ＭＳ方法３（ＴＯＦ）：ｍ／ｚ＝１７５８７．９７。計算値：１７５８７．４０
ＥＧＦ（Ａ）（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）－［ＧＡＱＰ］１９－インスリン（Ｂ３Ｅ、Ｂ２９Ｋ（エイコサンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０）
Ｃｈｅｍ．２４：
【化35】
【0496】
対照薬化合物１
ＥＧＦ（Ａ）（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）－［ＧＱＥＰ］２－インスリン（Ｂ２９Ｋ（オクタデカンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０）
ＬＣ－ＭＳ方法１（エレクトロスプレー）：ｍ／ｚ＝１９４３．５９（Ｍ＋６）／６。計算値：１９４３．１８
Ｒｔ＝２．０９分
ＥＧＦ（Ａ）（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）－［ＧＱＥＰ］２－インスリン（Ｂ２９Ｋ（オクタデカンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０）
【化36】
Ｒｔ＝２．０９分
【0497】
対照薬化合物２
ＥＧＦ（Ａ）（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）－［ＧＱＥＰ］８－インスリン（Ａ１４Ｅ、Ｂ２９Ｋ（オクタデカンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０）
ＬＣ－ＭＳ方法１（エレクトロスプレー）：ｍ／ｚ＝１５６６．２９（Ｍ＋９）／９。計算値：１５６６．２７
Ｒｔ＝１．７９分
ＥＧＦ（Ａ）（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）－［ＧＱＥＰ］８－インスリン（Ａ１４Ｅ、Ｂ２９Ｋ（オクタデカンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０）
【化37】
Ｒｔ＝１．７９分
【0498】
対照薬化合物３
ＥＧＦ（Ａ）（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）－［ＧＱＥＰ］４－インスリン（Ｂ２９Ｋ（エイコサンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０）
ＬＣ－ＭＳ方法１（エレクトロスプレー）：ｍ／ｚ＝１７８７．１９（Ｍ＋７）／７。計算値：１７８７．２８
Ｒｔ＝２．１６分
ＥＧＦ（Ａ）（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）－［ＧＱＥＰ］４－インスリン（Ｂ２９Ｋ（エイコサンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０）
【化38】
Ｒｔ＝２．１６分
【0499】
対照薬化合物４
ＥＧＦ（Ａ）（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）－［ＧＱＥＰ］４－インスリン（Ｂ２９Ｋ（オクタデカンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０）
ＬＣ－ＭＳ方法３（ＴＯＦ）：ｍ／ｚ＝１２４７３。計算値：１２４７５
ＥＧＦ（Ａ）（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）－［ＧＱＥＰ］４－インスリン（Ｂ２９Ｋ（オクタデカンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０）
【化39】
【0500】
対照薬化合物５
ＥＧＦ（Ａ）（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）－［ＧＱＥＰ］２－インスリン（Ｂ２９Ｋ（ヘキサデカンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０）
ＬＣ－ＭＳ方法３（ＴＯＦ）：ｍ／ｚ＝１１６２５．００。計算値：１１６２５．００
ＥＧＦ（Ａ）（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）－［ＧＱＥＰ］２－インスリン（Ｂ２９Ｋ（ヘキサデカンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０）
【化40】
【0501】
対照薬化合物６
ＥＧＦ（Ａ）（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）－［ＧＱＥＰ］６－インスリン（Ｂ２９Ｋ（オクタデカンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０）
ＬＣ－ＭＳ方法３（ＴＯＦ）：ｍ／ｚ＝１３２９６。計算値：１３２９８
ＥＧＦ（Ａ）（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）－［ＧＱＥＰ］６－インスリン（Ｂ２９Ｋ（オクタデカンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０）
【化41】
【0502】
対照薬化合物７
ＥＧＦ（Ａ）（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）－［ＧＱＥＰ］８－インスリン（Ａ１４Ｅ、Ｂ２９Ｋ（ヘキサデカンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０）
ＬＣ－ＭＳ方法１（エレクトロスプレー）：ｍ／ｚ＝１７５８．５７（Ｍ＋８）／８。計算値：１７５８．４３
Ｒｔ＝１．６７分
ＥＧＦ（Ａ）（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）－［ＧＱＥＰ］８－インスリン（Ａ１４Ｅ、Ｂ２９Ｋ（ヘキサデカンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０）
【化42】
Ｒｔ＝１．６７分
【0503】
対照薬化合物８
Ｂ２９Ｋ（オクタデカンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
これは、ＷＯ２００９／０２２００６、実施例１に開示されている先行技術の分子である。
Ｂ２９Ｋ（オクタデカンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ）、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
【化43】
【0504】
対照薬化合物９
ＥＧＦ（Ａ）（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）
この化合物を、ＷＯ２０１７／１２１８５０に記載されるように調製した。
ＥＧＦ（Ａ）（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）
【化44】
【0505】
対照薬化合物１０
ＥＧＦ（Ａ）（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ、３２８Ｋ（ヘキサデカンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ）、３３０Ｋ（ヘキサデカンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ））
これは、ＷＯ２０１７／１２１８５０、実施例１５１に開示されている分子である。
ＥＧＦ（Ａ）（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ、３２８Ｋ（ヘキサデカンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ）、３３０Ｋ（ヘキサデカンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ））
【化45】
【0506】
実施例２５
可溶化受容体上で測定した、本発明の選択されたインスリン誘導体のインスリン受容体親和性
ヒトインスリン受容体（ＩＲ）に対する本発明のインスリン誘導体の相対的結合親和性を、シンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）における競合結合（Ｇｌｅｎｄｏｒｆ Ｔ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４７ ４７４３－４７５１に従うもの）によって決定する。
可溶化受容体上で測定した、本発明の選択されたインスリン誘導体のインスリン受容体親和性
ヒトインスリン受容体（ＩＲ）に対する本発明のインスリン誘導体の相対的結合親和性を、シンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）における競合結合（Ｇｌｅｎｄｏｒｆ Ｔ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４７ ４７４３－４７５１に従うもの）によって決定する。
【0507】
簡潔には、ヒトインスリン標準および試験されるインスリン類似体の希釈系列を９６ウェルＯｐｔｉｐｌａｔｅ（Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で行い、その後、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＳＯ４、および０．０２５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ ２０からなる結合緩衝液中、［１２５Ｉ－Ａ１４Ｙ］－ヒトインスリン、抗ＩＲマウス抗体８３－７、可溶化ヒトＩＲ－Ａ（ＩＲ－Ａホロ受容体を過剰発現するベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞由来の小麦胚芽凝集素クロマトグラフィーにより半精製されたもの）、およびＳＰＡビーズ（抗マウスポリビニルトルエンＳＰＡビーズ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を添加する。プレートを、穏やかに振盪しながら２２℃で２２～２４時間インキュベートし、２０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、ＴｏｐＣｏｕｎｔ ＮＸＴ（Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で計数する。
【0508】
ＳＰＡからのデータを、４パラメータロジスティックモデル（Ｖｏｌｕｎｄ Ａ（１９７８）Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｓ ３４ ３５７－３６５）に従って分析し、類似体の結合親和性を、同じプレート内で測定したヒトインスリン標準の結合親和性と比較して計算する。
【0509】
結合緩衝液が、より生理学的な状態を模倣するために１．５％ ＨＳＡ（ｗ／ｖ）（Ｓｉｇｍａ Ａ１８８７）を含有する、関連アッセイも使用する。
【0510】
本発明の選択されたインスリン類似体のインスリン受容体親和性および他のインビトロデータを、以下の表３に提示し、対照薬化合物に関するデータを以下の表４に提示する。
【0511】
実施例２６
ラット脂肪細胞における脂質生成
本発明のインスリンのインビトロ効力の尺度として、脂質生成を使用することができる。初代ラット脂肪細胞を精巣上体脂肪パッドから単離し、例えば、１％の脂肪を含まないＨＳＡおよび標準（ヒトインスリン、ＨＩ）または本発明のインスリンのいずれかを含有する緩衝液中３Ｈ－グルコースとインキュベートする。標識グルコースを用量依存的方法で抽出可能な脂質に変換し、完全濃度反応曲線を得る。結果を、標準（ＨＩ）と比較した本発明のインスリンの９５％信頼限界での相対的効力（％）として表す。
ラット脂肪細胞における脂質生成
本発明のインスリンのインビトロ効力の尺度として、脂質生成を使用することができる。初代ラット脂肪細胞を精巣上体脂肪パッドから単離し、例えば、１％の脂肪を含まないＨＳＡおよび標準（ヒトインスリン、ＨＩ）または本発明のインスリンのいずれかを含有する緩衝液中３Ｈ－グルコースとインキュベートする。標識グルコースを用量依存的方法で抽出可能な脂質に変換し、完全濃度反応曲線を得る。結果を、標準（ＨＩ）と比較した本発明のインスリンの９５％信頼限界での相対的効力（％）として表す。
【0512】
データを以下の表３および４に示す。
【表10】
【表11】
【0513】
本発明の化合物および対照薬化合物のインスリン受容体結合（および脂質生成効力）は異なっておらず、したがって、リンカーの組成（電荷）とは無関係であることがわかる。これは、本発明の化合物と比較して荷電ＧＱＥＰリンカーを含有する対照薬化合物の効力がかなり弱い、インビボ効力の観察された差異（実施例３０）と著しい対照をなしている。
【0514】
また、ＨＳＡの非存在下および１．５％ ＨＳＡの存在下の両方において、ペプチドリンカーを介してＥＧＦ（Ａ）ペプチドをインスリンのＮ末端に付加することによって、インスリン受容体親和性をほぼ半減させることもわかる。
【0515】
実施例２７
ＰＣＳＫ９－ＬＤＬ－Ｒ結合競合（ＥＬＩＳＡ）
このアッセイの目的は、ＥＧＦ（Ａ）化合物のＰＣＳＫ９に対する見かけの結合親和性を測定することである。
ＰＣＳＫ９－ＬＤＬ－Ｒ結合競合（ＥＬＩＳＡ）
このアッセイの目的は、ＥＧＦ（Ａ）化合物のＰＣＳＫ９に対する見かけの結合親和性を測定することである。
【0516】
ＬＤＬ－ＲとのＰＣＳＫ９の相互作用を阻害する能力により、本発明の化合物はＰＣＳＫ９阻害剤と呼ばれることもある。
【0517】
実験前日、組換えヒト低密度リポタンパク質受容体（ｒｈＬＤＬ－Ｒ；ＮＳＯ由来；Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ＃２１４８－ＬＤまたは自社生産）を５０ｍＭの炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６）に１μｇ／ｍＬで溶解した後、１００μＬの溶液をアッセイプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ ９６、ＮＵＮＣ ＃４３９４５４）の各ウェルに加え、４℃で一晩覆った。実験当日、ビオチン化ＰＣＳＫ９（０．５ｕｇ／ｍＬ、ＢｉｏＳｉｔｅ／ＢＰＳＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅカタログ番号７１３０４または自社生産）を含有するＥＧＦ（Ａ）化合物の８点濃度曲線を複製して作製した。ＥＧＦ（Ａ）化合物およびビオチン化ＰＣＳＫ９の混合物を製造し、２５ｍｍ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．２（１５６３０－０５６、１００ｍＬ、１Ｍ）、１５０ｍｍ ＮａＣｌ（Ｅｍｓｕｒｅ １．０６４０４．１０００）１％ ＨＳＡ（Ｓｉｇｍａ Ａ１８８７－２５Ｇ）０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ ６５５２０５）２ｍｍ ＣａＣｌ２（Ｓｉｇｍａ ２２３５０６－５００Ｇ）を含有するアッセイ緩衝液中で室温で１時間培養した。次に、覆われたアッセイプレートを２００μＬアッセイ緩衝液で４回洗浄した後、１００μＬのＥＧＦ（Ａ）化合物とビオチン化ＰＣＳＫ９の混合物をプレートに加え、室温で２時間培養した。プレートを、２００μＬのアッセイ緩衝液で４回洗浄した後、ストレプトアビジン－ＨＲＰ（２５ｎｇ／ｍＬ；ＶＷＲ ＃１４～３０－００）と共に室温で１時間培養した。反応は、５０μＬのＴＭＢ－ｏｎ（ＫＥＭ－ＥＮ－ＴＥＣ）を加えて、暗所で１０分間培養することにより検出される。次に、混合物に５０μＬの４Ｍ Ｈ３ＰＯ４を電子マルチピペッティングによって加えることによって反応を停止した。次に、プレートを１時間以内に４５０ｎｍおよび６２０ｎｍでＳｐｅｃｔｒａｍａｘで読み取った。６２０ｎｍの読取値をバックグラウンド除去法用に使用した。ＩＣ５０値は、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍを使用して、非線形回帰対数（阻害剤）と反応－変数勾配（４パラメータ）によって計算され、以下の式を使用してＫｉ値に変換した：Ｋｉ＝ＩＣ５０／（１＋（ビオチン－ＰＣＳＫ９）／（ｋｄ（ビオチン－ＰＣＳＫ９）））、式中、ビオチン－ＰＣＳＫ９のＫｄは、１．０９６７２７７１４μｇ／ｍＬであり、［ビオチン－ＰＣＳＫ９］＝０，５（μｇ／ｍＬ）である。
【0518】
本発明の化合物の結果を以下の表５に示し、対照薬化合物のデータを以下の表５に示す。Ｋｉ値が高くなると、ＰＣＳＫ９に対する見かけの結合親和性が低く反映され、その逆もそうである。一般に、多数の試験したＥＧＦ（Ａ）化合物が、低いｎＭ範囲でｈＬＤＬ－Ｒへの結合におけるＰＣＳＫ９を阻害する能力を示した。
【表12】
【表13】
【0519】
本発明の化合物および対照薬化合物のＰＣＳＫ９結合は異なっておらず、したがって、リンカーの組成（電荷）とは無関係であることがわかる。
【0520】
また、リンカーおよびインスリンをＥＧＦ（Ａ）ペプチドのＣ末端に付加することが、ＰＣＳＫ９への結合を変化させないことも観察され得る。
【0521】
実施例２８
ＨｅｐＧ２細胞におけるＬＤＬ取り込みアッセイ
ＰＣＳＫ９ペプチドおよびその誘導体の阻害強度を決定するための代替アッセイおよびＨｅｐＧ２細胞内におけるＬＤＬの取り込みの測定を以下に記載する。
ＨｅｐＧ２細胞におけるＬＤＬ取り込みアッセイ
ＰＣＳＫ９ペプチドおよびその誘導体の阻害強度を決定するための代替アッセイおよびＨｅｐＧ２細胞内におけるＬＤＬの取り込みの測定を以下に記載する。
【0522】
アッセイ原則：ＬＤＬ取り込みは、主に内因的に発現されるｈＬＤＬ－Ｒによって媒介され、したがってＬＤＬ取り込み能力は、ＬＤＬ－Ｒ発現の間接的尺度である。ｈＬＤＬ－Ｒは、用量依存的に外因性ＰＣＳＫ９と共に培養することにより下方制御することができる。したがって、ＰＣＳＫ９培養は、細胞がＬＤＬ分子を取り込む能力を減少させる。次に、ＬＤＬ取り込みのこの下方制御は、ＰＣＳＫ９／ＬＤＬ－Ｒ結合を中和または阻害する化合物の添加によって拮抗され得る。したがって、ＰＣＳＫ９阻害剤は、それらがＰＣＳＫ９の存在下でＬＤＬ取り込みを増加する、例えばＰＣＳＫ９媒介性ｈＬＤＬ－Ｒ下方制御を妨げる能力に基づいて特徴付けることができる。
【0523】
アッセイは、１０％リポタンパク質欠損ウシ胎児血清（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ ＃Ｓ５３９４）中で培養されたＨｅｐＧ２細胞（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ ＥＣＡＣＣ：Ａｃｃ ｎｏ．８５０１１４３０）を使用して実施され、細胞がＢＯＤＩＰＹ蛍光標識されたＬＤＬ粒子（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｅｕｒｏｐｅ ＢＶ ＃Ｌ３４８３）を取り込む能力が測定される。
【0524】
アッセイプロトコル：９６ウェルプレート（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、ＶｉｅｗＰｌａｔｅ－９６ Ｂｌａｃｋ ＃６０００５１８２）が、インキュベーター内で３７℃において１時間、ポリ－Ｄ－リシンで被覆された（１０ｍｇ／Ｌ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ ＃Ｐ６４０７、ＰＢＳ Ｇｉｂｃｏ ＃１４１９０－０９４に溶解）。次に、プレートを１００μＬのＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ ＃１４１９０－０９４）で２回洗浄した。ＥＧＦ（Ａ）化合物の８点濃度曲線のための試験組成物をアッセイ培地（ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ ＃３１９６６－０２１）中で希釈したＰＣＳＫ９（１０μｇ／ｍＬ、自社生産）、１０％リポタンパク質欠損ウシ胎児血清（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ ＃Ｓ５３９４）および１％ペンストレップ（Ｃａｍｂｒｅｘ ＃ＤＥ１７－６０２Ｅ）をすべて含めて製造し、５０μＬ／ウェルの体積でプレート上に添加した。
【0525】
３０～６０分後、５０．０００個のＨｅｐＧ２細胞（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ：ＥＣＡＣＣ：ＡＴＣＣ ｎｏ．８５０１１４３０、ロット：１３Ｂ０２３）をアッセイ培地で希釈したものを５０μＬ／ウェルの量で加え、プレートをＣＯ２透過性プラスチックバッグ（Ａｎｔａｌｉｓ Ｔｅａｍ、ＬＤＰＥバッグ１２０／３５ｘ３００ｘ０，０２５ｍｍ ＃２８１６０４）内で２０時間（３７℃、５％ＣＯ２で）インキュベートした。この後、プレートを空にし、その直後に、アッセイ媒体中１０μｇ／ｍＬの濃度の５０μＬのＦＬ－ＬＤＬ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｅｕｒｏｐｅ ＢＶ ＃Ｌ３４８３）を各ウェルに加え、プレートを、光から保護するために蓋の上に黒いカバーを使用したＣＯ２透過性プラスチックバッグ内で２時間（３７℃、５％ＣＯ２で）インキュベートした。プレートを空にし、１００μＬのＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ ＃１４１９０－０９４）で２回洗浄した。次に、１００μＬのＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ ＃１４１９０－０９４）を加え、その後１５分以内に、ＳｐｅｃｋｔｒａＭａｘ Ｍ４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上でフィルターＥｘ（５１５ｎｍ）／Ｅｍ（５２０ｎｍ）を使用してプレートを読み取った（底部読み取り）。
【0526】
最後に、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ、非線形回帰曲線フィット、Ｓ字状用量応答（可変勾配）を使用してＥＣ５０値を計算した。
結果を上記の表に示す。より低いＥＣ５０値は、ＬＤＬ取り込みのＰＣＳＫ９を媒介した下方制御を逆転する能力がより高いことを反映し、より高いＥＣ５０値は、ＬＤＬ取り込みのＰＣＳＫ９を媒介した下方制御を阻害する能力がより低い化合物であることを示す。
示されるように、試験した化合物は、ＬＤＬ取り込みアッセイで１００～２００ｎＭのＥＣ５０を示し、ＬＤＬ取り込みのＰＣＳＫ９を媒介した下方制御を逆転する能力が高い化合物であることを示している。
結果を上記の表に示す。より低いＥＣ５０値は、ＬＤＬ取り込みのＰＣＳＫ９を媒介した下方制御を逆転する能力がより高いことを反映し、より高いＥＣ５０値は、ＬＤＬ取り込みのＰＣＳＫ９を媒介した下方制御を阻害する能力がより低い化合物であることを示す。
示されるように、試験した化合物は、ＬＤＬ取り込みアッセイで１００～２００ｎＭのＥＣ５０を示し、ＬＤＬ取り込みのＰＣＳＫ９を媒介した下方制御を逆転する能力が高い化合物であることを示している。
【0527】
実施例２９
ラット薬物動態、静脈内ラットＰＫ：
意識のある非絶食雄Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラット、～３００グラムに、様々な用量のインスリン類似体を静脈内（ｉ．ｖ．）投与し、用いた化合物の血漿濃度を、免疫測定法または質量分析法を使用して、投与後最大４８時間にわたって所定の間隔で測定する。続いて、ＷｉｎＮｏｎＬｉｎ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ Ｉｎｃ．，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、薬物動態パラメータを計算する。
ラット薬物動態、静脈内ラットＰＫ：
意識のある非絶食雄Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラット、～３００グラムに、様々な用量のインスリン類似体を静脈内（ｉ．ｖ．）投与し、用いた化合物の血漿濃度を、免疫測定法または質量分析法を使用して、投与後最大４８時間にわたって所定の間隔で測定する。続いて、ＷｉｎＮｏｎＬｉｎ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ Ｉｎｃ．，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、薬物動態パラメータを計算する。
【表14】
【表15】
【0528】
本発明の化合物は、類似の対照薬化合物と類似のＰＫプロファイルを有すると結論付けられる。したがって、ＰＫデータは、本発明の化合物と比較して荷電ＧＱＥＰリンカーを含有する対照薬化合物の効力がかなり弱い、インビボ効力の観察された驚くべき差異（実施例３０）を説明することができない。
【0529】
実施例３０
Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットにおける本発明および先行技術のインスリン類似体の皮下ＰＫ／ＰＤプロファイル
本発明の融合ペプチド誘導体は、ラットへの皮下投与によって、例えば、このプロトコルに従って先行技術の類似のＢ２９Ｋアシル化インスリン類似体と比較することによって試験され得る。誘導体は、薬物動態および／または薬力学パラメータについて試験され得る。
Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットにおける本発明および先行技術のインスリン類似体の皮下ＰＫ／ＰＤプロファイル
本発明の融合ペプチド誘導体は、ラットへの皮下投与によって、例えば、このプロトコルに従って先行技術の類似のＢ２９Ｋアシル化インスリン類似体と比較することによって試験され得る。誘導体は、薬物動態および／または薬力学パラメータについて試験され得る。
【0530】
インビボプロトコール
これらの実験には、意識のある非絶食雄Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラット、～３５０グラムを使用する。試験期間中（投与後最大３０時間）、ラットは水および食物への自由なアクセスを有する。ラットの首に、ＮｏｖｏＰｅｎ Ｅｃｈｏ（登録商標）を使用して皮下投与する（９０ｎｍｏｌ／ｋｇ、６００μＭのインスリン誘導体の製剤）。０分（投与前）ならびにインスリン誘導体の投与後１５分、１、２、４、５．５、７、２４、２９／３０時間、および最終的には毎日最大３０時間の時点で、血液試料を採取し（舌下静脈、２００μＬをｍｉｃｒｏｖｅｔｔｅ（登録商標）２００ ＥＤＴＡ管に注入）、血漿を回収する。グルコースおよび最終的にはインスリン誘導体の血漿濃度を、ＢＩＯＳＥＮアナライザーおよび免疫測定法／ＬＣＭＳ分析のそれぞれを使用して定量化する。
これらの実験には、意識のある非絶食雄Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラット、～３５０グラムを使用する。試験期間中（投与後最大３０時間）、ラットは水および食物への自由なアクセスを有する。ラットの首に、ＮｏｖｏＰｅｎ Ｅｃｈｏ（登録商標）を使用して皮下投与する（９０ｎｍｏｌ／ｋｇ、６００μＭのインスリン誘導体の製剤）。０分（投与前）ならびにインスリン誘導体の投与後１５分、１、２、４、５．５、７、２４、２９／３０時間、および最終的には毎日最大３０時間の時点で、血液試料を採取し（舌下静脈、２００μＬをｍｉｃｒｏｖｅｔｔｅ（登録商標）２００ ＥＤＴＡ管に注入）、血漿を回収する。グルコースおよび最終的にはインスリン誘導体の血漿濃度を、ＢＩＯＳＥＮアナライザーおよび免疫測定法／ＬＣＭＳ分析のそれぞれを使用して定量化する。
【0531】
図１および図２から、スペーサー２ｘＧＡＱＰ、３ｘＧＡＱＰ、４ｘＧＡＱＰ、６ｘＧＡＱＰ、８ｘＧＡＱＰ、および１０ｘＧＡＱＰが同等のインスリン効力を付与している一方、より長いスペーサー１２ｘＧＡＱＰおよび１９ｘＧＡＱＰは、インスリン効力を損なうと結論付けられる。
【0532】
図３を観察すると、スペーサー２ｘＧＡＱＰおよび８ｘＧＡＱＰが同等のインスリン効力を付与している一方、スペーサー２ｘＧＱＥＰおよび８ｘＧＱＥＰは、インスリン効力を驚くほどかつ著しく損なうと結論付けられる。
【0533】
図４を観察すると、インスリン置換Ａ１４ＥまたはＢ３Ｅを有するリンカー２ｘＧＡＱＰ、４ｘＧＡＱＰ、および６ｘＧＱＡＰを含有する化合物の血糖降下効果は、等しい効力を有し、かつそれぞれリンカー２ｘＧＱＥＰおよび８ｘＧＱＥＰを含有する対照薬化合物１および２、ならびにビヒクルの血糖降下効果よりも優れていると結論付けられる。
【0534】
図５を観察すると、スペーサー２ｘＧＡＱＰおよび２ｘＧＱＡＰが同等のインスリン効力を付与している一方、スペーサー２ｘＧＱＥＰは、インスリン効力を驚くほど損なうと結論付けられる。
【0535】
図６を観察すると、スペーサー４ｘＧＡＱＰについて、インスリン置換ｄｅｓＢ３０、およびＡ１４Ｅ、ｄｅｓＢ３０が同等のインスリン効力を付与している一方、スペーサー４ｘＧＱＥＰは、インスリン効力を驚くほど損なうと結論付けられる。
【0536】
図７を観察すると、インスリン置換ｄｅｓＢ３０、およびＢ３Ｅ、ｄｅｓＢ３０は、等しいインスリン効力を付与しており、１つおよび２つのＯＥＧ部分を含有する側鎖が同等のインスリン効力を付与している一方、スペーサー２ｘＧＱＥＰは、スペーサー２ｘＧＡＱＰを有する類似の化合物と比較して、インスリン効力を驚くほど損うと結論付けられる。
【0537】
図８を観察すると、インスリン置換ｄｅｓＢ３０、およびＡ１４Ｅ、ｄｅｓＢ３０は、等しいインスリン効力を付与しており、１つおよび２つのＯＥＧ部分を含有する側鎖が同等のインスリン効力を付与している一方、スペーサー６ｘＧＱＥＰは、スペーサー６ｘＧＡＱＰを有する類似の化合物と比較して、インスリン効力を驚くほど損うと結論付けられる。
【0538】
図９を観察すると、実施例１の側鎖ヘキサデカンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ、スペーサー２ｘＧＡＱＰを有するインスリンが、スペーサー２ｘＧＱＥＰおよび８ｘＧＱＥＰよりもはるかに高いインスリン効力を驚くべきことに付与していると結論付けられる。
【0539】
図１０を観察すると、エイコサンジオイル－ｇＧｌｕ－２ｘＯＥＧ、スペーサー６ｘＧＡＱＰを有するインスリンが、スペーサー４ｘＧＱＥＰよりもはるかに高いインスリン効力を驚くべきことに付与していると結論付けられる。
【0540】
図１１を観察すると、非荷電リンカーを介して本発明のＥＧＦ（Ａ）部分をインスリンに付加すると、インスリン単独の効力と比較して、類似の糖力学的効力を有する化合物がもたらされると結論付けられる。本発明の融合タンパク質は、基礎インスリンに有利である作用の開始が遅い。
【0541】
実施例３１
概念モデルの急性インビボ試験 ストレプトゾトシン誘発性糖尿病マウスにおけるヒトＰＣＳＫ９（ｈＰＣＳＫ９）攻撃接種モデル
このモデルの目的は、インスリン－ＥＧＦ（Ａ）融合タンパク質の二重活性を実証することである。二重活性は、インスリン－ＥＧＦ（Ａ）系抗ＰＣＳＫ９ペプチドで静脈内注射ｈＰＣＳＫ９の作用を阻害することによるマウス肝臓におけるＬＤＬ受容体発現レベルの上昇、および分子のインスリン部分によるグルコース降下効果を意味する。
概念モデルの急性インビボ試験 ストレプトゾトシン誘発性糖尿病マウスにおけるヒトＰＣＳＫ９（ｈＰＣＳＫ９）攻撃接種モデル
このモデルの目的は、インスリン－ＥＧＦ（Ａ）融合タンパク質の二重活性を実証することである。二重活性は、インスリン－ＥＧＦ（Ａ）系抗ＰＣＳＫ９ペプチドで静脈内注射ｈＰＣＳＫ９の作用を阻害することによるマウス肝臓におけるＬＤＬ受容体発現レベルの上昇、および分子のインスリン部分によるグルコース降下効果を意味する。
【0542】
方法：健康な雄ＢａｌＢＣマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を、単回の高皮下（ｓ．ｃ．）用量のストレプトゾトシン（２３０～２５０ｍｇ／ｋｇ）によって糖尿病の状態にした。５～７日後、糖尿病動物を指定された処置群に無作為化した。実験当日、動物に、ビヒクル、ＥＧＦ（Ａ）誘導体、またはインスリン－ＥＧＦ（Ａ）融合タンパク質を、ｔ＝０分において静脈内（ｉ．ｖ．）注射した（グラフ上の１回目の投与）。ｔ＝１５分において、ｈＰＣＳＫ９またはビヒクルを０．４ｍｇ／ｋｇの用量でｉ．ｖ．注射した（グラフ上の２回目の投与）。血糖値を、時間＝０、１５、４５、および７５分において測定した。ｈＰＣＳＫ９の注射の６０分後（ｔ＝７５分）、動物をイソフルランで麻酔し、頚椎脱臼によって安楽死させた。肝臓を速やかに切除し、液体窒素中で凍結させた。肝臓試料を分析まで摂氏－８０度に保った。肝臓試料中のＬＤＬ－ｒタンパク質を、ＥＬＩＳＡによって定量化した。
【0543】
マウスＬＤＬ－Ｒ ＥＬＩＳＡ：肝臓片（１０ｍｇ）を、鋼ビーズを使用して、ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ上で２．５分、３０Ｈｚにおいて、５００ｕＬのＰＢＳ中で均質化した。次いで、組織を、５００ｕＬの２Ｘ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ ２（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号８９５３４７）を添加することによって溶解し、シェーカー（５００ｒｐｍ）上で１時間インキュベートした。肝臓溶解物を２００００ｇ、４℃で１０分間遠心分離した。透明上清を、キャリブレーター希釈剤で５０倍に希釈し、５０ｕＬを、ｍＬＤＬ－Ｒ ＥＬＩＳＡ（ＲＤ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＭＬＤＬＲ０）上での分析に使用した。肝臓溶解物中のＬＤＬ－Ｒ濃度の値を、同じ試料中のタンパク質濃度で正規化した。溶解物をＰＢＳ中で２０倍に希釈し、２５ｕＬを、Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（カタログ番号２３２２５）に従った２つの複製におけるタンパク質定量に使用した。
【0544】
ストレプトゾトシン糖尿病マウスへの化合物の投与後の血糖変化および肝臓ＬＤＬ－ｒタンパク質の発現を調査することによって、インスリン－ＥＧＦ（Ａ）融合タンパク質に対するインビボ二重活性が実証された。実施例３のインスリン－ＥＧＦ（Ａ）融合タンパク質を０、３、１０、３０、および１００ｎｍｏｌ／ｋｇで投与した（ｎ＝１群当たり５～６匹の動物）。図１２は、マウスに投与されたｈＰＣＳＫ９が、肝臓ＬＤＬ受容体タンパク質のほぼ完全な下方制御をもたらしたことを示す。インスリン－ＥＧＦ（Ａ）融合タンパク質は、用量依存的な方法でＬＤＬｒタンパク質のこのＰＣＳＫ９媒介性下方制御を効果的に防止した。さらに、インスリン－ＥＧＦ（Ａ）融合タンパク質は、血糖を用量依存的に低下させた（図１３）。さらに、２つのインスリン－ＥＧＦ（Ａ）融合タンパク質が、ＥＧＦ（Ａ）誘導体のみで見られたものと同様に、ＬＤＬｒタンパク質のｈＰＣＳＫ９媒介性下方制御を防止することができたことが示された（図１４）。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【配列表】