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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-02-09
(45)【発行日】2024-02-20
(54)【発明の名称】胃がん及び胆嚢・胆管がん初代細胞を培養する方法及び補助試薬
(51)【国際特許分類】
C12N 5/09 20100101AFI20240213BHJP
C12M 1/00 20060101ALI20240213BHJP
【ＦＩ】
C12N5/09
C12M1/00 A
【請求項の数】
19
(21)【出願番号】P 2021559639
(86)(22)【出願日】2019-11-04
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-06-23
(86)【国際出願番号】 CN2019115306
(87)【国際公開番号】W WO2020206999
(87)【国際公開日】2020-10-15
【審査請求日】2022-08-09
(31)【優先権主張番号】201910289073.X
(32)【優先日】2019-04-11
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(31)【優先権主張番号】201910289074.4
(32)【優先日】2019-04-11
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(73)【特許権者】
【識別番号】520492695
【氏名又は名称】北京基石生命科技有限公司
【氏名又は名称原語表記】ＧＥＮＥＸ ＨＥＡＬＴＨ ＣＯ．，ＬＴＤ
【住所又は居所原語表記】２０１－Ｃ１１ Ｗｅｓｔ， Ｅ－Ｐａｒｋ， Ｎｏ．６５ Ｘｉｎｇｓｈｉｋｏｕ Ｒｄ．， Ｈａｉｄｉａｎ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ， Ｂｅｉｊｉｎｇ １００１９５， Ｃｈｉｎａ
(74)【代理人】
【識別番号】110002077
【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人
(72)【発明者】
【氏名】▲いん▼申意
(72)【発明者】
【氏名】張函▲すうえ▼
【審査官】福澤 洋光
(56)【参考文献】
【文献】特開２０１０－２２７０８８（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１４－５１６５６２（ＪＰ，Ａ）
【文献】中国特許出願公開第１０８６２４５６１（ＣＮ，Ａ）
【文献】Acta Medica et Biologica，1986年，Vol.34, No.2，pp.39-45
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １／００－１５／９０
Ｃ１２Ｍ １／００－ ３／１０
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＰｕｂＭｅｄ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
胃がん及び／又は胆嚢・胆管がん初代細胞を培養するための培地であって、該培地は、３成分抗菌抗真菌剤、ＨＥＰＥＳ、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、非必須アミノ酸、ヒト組換えタンパク質ＥＧＦ、ヒト組換えタンパク質ｂＦＧＦ、ヒト組換えタンパク質ＨＧＦ、ヒト組換えタンパク質ＦＧＦ－１０、ヒト組換えタンパク質Ｗｎｔ－３ａ、ヒト組換えタンパク質Ｎｏｇｇｉｎ、ＳＢ２０２１９０、Ａ８３－０１、プリモシン（Ｐｒｉｍｏｃｉｎ）、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン、ニコチンアミド、Ｎ２サプリメント（Ｎ２Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）、コルチゾール、Ｂ－２７（商標）サプリメント（５０Ｘ）、ｍｉｎｕｓ ｖｉｔａｍｉｎ Ａ、インスリン、トランスフェリン、セレン、エタノールアミン溶液（ＩＴＳ－Ｘ）、ガストリン、Ｙ－２７６３２、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ／Ｈａｍ’ｓ Ｆ－１２培地からなり、前記３成分抗菌抗真菌剤におけるペニシリンの最終濃度が１００－２００Ｕ／ｍＬであり、前記３成分抗菌抗真菌剤におけるストレプトマイシンの最終濃度が１００－２００μｇ／ｍＬであり、前記３成分抗菌抗真菌剤におけるアムホテリシンＢの最終濃度が２５０－２５０ｎｇ／ｍＬであり、前記ＨＥＰＥＳの最終濃度が８－１２ｍＭであり、前記Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミンの最終濃度が０．８－１．２％（体積パーセント含有量）であり、前記非必須アミノ酸でグリシンの濃度が８０－１２０μＭであり、前記非必須アミノ酸におけるＬ－アラニンの濃度が８０－１２０μＭであり、前記非必須アミノ酸におけるＬ－アスパラギンの濃度が８０－１２０μＭであり、前記非必須アミノ酸におけるＬ－アスパラギン酸の濃度が８０－１２０μＭであり、前記非必須アミノ酸におけるＬ－グルタミン酸の濃度が８０－１２０μＭであり、前記非必須アミノ酸におけるＬ－プロリンの濃度が８０－１２０μＭであり、前記非必須アミノ酸におけるＬ－セリンの濃度が８０－１２０μＭであり、前記ヒト組換えタンパク質ＥＧＦの最終濃度が１０－１００ｎｇ／ｍＬであり、前記ヒト組換えタンパク質ｂＦＧＦの最終濃度が１０－５０ｎｇ／ｍＬであり、前記ヒト組換えタンパク質ＨＧＦの最終濃度が５－２５ｎｇ／ｍＬであり、前記ヒト組換えタンパク質ＦＧＦ－１０の最終濃度が５－２５ｎｇ／ｍＬであり、前記ヒト組換えタンパク質Ｗｎｔ－３ａの最終濃度が２００－３００ｎｇ／ｍＬであり、前記ヒト組換えタンパク質Ｎｏｇｇｉｎの最終濃度が１００－２００ｎｇ／ｍＬであり、前記ＳＢ２０２１９０の最終濃度が５－１０μＭであり、前記Ａ８３－０１の最終濃度が０．２５－１．２５μＭであり、前記プリモシン（Ｐｒｉｍｏｃｉｎ）の最終濃度が１％（体積パーセント含有量）であり、前記Ｎ－アセチル－Ｌ－システインの最終濃度が０．５－２ｍＭであり、前記ニコチンアミドの最終濃度が５－１０ｍＭであり、前記Ｎ２サプリメント（Ｎ２Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）の最終濃度が１％（体積パーセント含有量）であり、前記コルチゾールの最終濃度が２０－５０ｎｇ／ｍＬであり、前記Ｂ－２７（商標）サプリメント（５０Ｘ）、ｍｉｎｕｓ ｖｉｔａｍｉｎ Ａの最終濃度が１．５－２．５％（体積パーセント含有量）であり、前記インスリン、トランスフェリン、セレン、エタノールアミン溶液（ＩＴＳ－Ｘ）の最終濃度が０．８－１．２％（体積パーセント含有量）であり、前記ガストリンの最終濃度が８－１２ｎＭであり、前記Ｙ－２７６３２の最終濃度が５－２０μＭであり、残部はＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ／Ｈａｍ’ｓ Ｆ－１２培地である、胃がん及び／又は胆嚢・胆管がん初代細胞を培養するための培地。
【請求項2】
胃がん及び／又は胆嚢・胆管がん初代細胞を培養するための補助試薬であって、以下の（Ａ１）～（Ａ４）：（Ａ１）請求項１に記載の培地と、サンプル解離液、サンプル保存液及びサンプル洗浄液のうちの全て又は一部とからなり、
前記サンプル解離液がコラゲナーゼＩ、コラゲナーゼＩＩ、コラゲナーゼＩＶ、ＰＢＳからなり、前記コラゲナーゼＩの最終濃度が１５０－２５０Ｕ／ｍＬであり、前記コラゲナーゼＩＩの最終濃度が１５０－２５０Ｕ／ｍＬであり、前記コラゲナーゼＩＶの最終濃度が５０－１５０Ｕ／ｍＬであり、残部はＰＢＳであり、
前記サンプル保存液がウシ胎児血清、３成分抗菌抗真菌剤、ＨＥＰＥＳ、ＨＢＳＳからなり、前記ウシ胎児血清の最終濃度が１－５％（体積パーセント含有量）であり、前記３成分抗菌抗真菌剤におけるペニシリンの最終濃度が１００－２００Ｕ／ｍＬであり、前記３成分抗菌抗真菌剤におけるストレプトマイシンの最終濃度が１００－２００μｇ／ｍＬであり、前記３成分抗菌抗真菌剤におけるアムホテリシンＢの最終濃度が２５０－５００ｎｇ／ｍＬであり、前記ＨＥＰＥＳの最終濃度が８－１２ｍＭであり、残部はＨＢＳＳであり、
前記サンプル洗浄液が３成分抗菌抗真菌剤、ＰＢＳからなり、前記３成分抗菌抗真菌剤におけるペニシリンの最終濃度が１００－２００Ｕ／ｍＬであり、前記３成分抗菌抗真菌剤におけるストレプトマイシンの最終濃度が１００－２００μｇ／ｍＬであり、前記３成分抗菌抗真菌剤におけるアムホテリシンＢの最終濃度が２５０－５００ｎｇ／ｍＬであり、残部はＰＢＳであるもの、
（Ａ２）請求項１に記載の培地と、細胞分離緩衝液とからなり、
前記細胞分離緩衝液が２成分抗生物質Ｐ／Ｓ、ヘパリンナトリウム、ＰＢＳからなり、前記２成分抗生物質Ｐ／Ｓにおけるペニシリンの最終濃度が１００－２００Ｕ／ｍＬであり、前記２成分抗生物質Ｐ／Ｓにおけるストレプトマイシンの最終濃度が１００－２００μｇ／ｍＬであり、前記ヘパリンナトリウムの最終濃度が１０ＩＵ／ｍＬであり、残部はＰＢＳであるもの、
（Ａ３） （Ａ１）と、細胞消化液、消化停止液及び細胞凍結液のうちの全て又は一部の試薬とからなるもの、
（Ａ４） （Ａ２）と、細胞消化液、消化停止液及び細胞凍結液のうちの全て又は一部の試薬とからなるもの
から選択されるいずれかであって、
前記細胞消化液は、１０ｍＬの前記細胞消化液当たり４－６ｍＬのアキュターゼ（Ａｃｃｕｔａｓｅ）と、最終濃度５ｍＭのＥＤＴＡと、１．５－２．５ｍＬのＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｅｎｚｙｍｅ（１Ｘ）ｎｏ ｐｈｅｎｏｌ ｒｅｄとを含有し、残部はＰＢＳであるように構成され、
前記消化停止液はウシ胎児血清、３成分抗菌抗真菌剤、ＤＭＥＭ培地からなり、前記ウシ胎児血清の最終濃度が８－１２％（体積パーセント含有量）であり、前記３成分抗菌抗真菌剤におけるペニシリンの最終濃度が１００－２００Ｕ／ｍＬであり、前記３成分抗菌抗真菌剤におけるストレプトマイシンの最終濃度が１００－２００μｇ／ｍＬであり、前記３成分抗菌抗真菌剤におけるアムホテリシンＢの最終濃度が２５０－５００ｎｇ／ｍＬであり、残部はＤＭＥＭ培地であり、
前記細胞凍結液はＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ／Ｈａｍ’ｓ Ｆ－１２培地、ＤＭＳＯ、１％メチルセルロース溶液からなり、前記Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ／Ｈａｍ’ｓ Ｆ－１２培地と前記ＤＭＳＯと前記１％メチルセルロース溶液の体積比は２０：２：（０．８－１．２）であり、前記１％メチルセルロース溶液は濃度１ｇ／１００ｍＬのメチルセルロース水溶液である、胃がん及び／又は胆嚢・胆管がん初代細胞を培養するための補助試薬。
【請求項3】
（Ｂ１）胃がん及び／又は胆嚢・胆管がん初代細胞を培養するための請求項１に記載の培地の使用、（Ｂ２）胃がん及び／又は胆嚢・胆管がん固形腫瘍初代細胞を培養するための請求項２の（Ａ１）又は（Ａ３）に記載の補助試薬の使用、及び
（Ｂ３）胆嚢・胆管がんの胆汁サンプル初代腫瘍細胞を培養するための請求項２の（Ａ２）又は（Ａ４）に記載の補助試薬の使用、
から選択されるいずれかの使用。
【請求項4】
胃がん及び／又は胆嚢・胆管がん初代細胞の培養方法であって、（ａ１）請求項２に記載のサンプル解離液により胃がん及び／又は胆嚢・胆管がん固形腫瘍組織の解離処理を行って、胃がん及び／又は胆嚢・胆管がん固形腫瘍初代細胞を得るステップと、
（ａ２）請求項１に記載の培地でステップ（ａ１）の解離で得られた胃がん及び／又は胆嚢・胆管がん固形腫瘍初代細胞を懸濁培養するステップと
を含む、胃がん及び／又は胆嚢・胆管がん固形腫瘍初代細胞の培養方法である方法Ａ；又は
（ｂ１）胆嚢・胆管がん胆汁サンプルから胆嚢・胆管がんの胆汁サンプル初代腫瘍細胞を分離するステップと、
（ｂ２）請求項１に記載の培地により、ステップ（ｂ１）で分離された胆嚢・胆管がんの胆汁サンプル初代腫瘍細胞を懸濁培養するステップと
を含む、胆嚢・胆管がんの胆汁サンプル初代腫瘍細胞の培養方法である方法Ｂ
である、胃がん及び／又は胆嚢・胆管がん初代細胞の培養方法。
【請求項5】
ステップ（ａ１）では、１ｍｇの組織当たり０．１－０．３ｍＬの前記サンプル解離液の使用量で、切断された前記及び／又は胆嚢・胆管がん固形腫瘍組織を予め３７℃に加熱した前記サンプル解離液により処理し、３７℃でサンプル解離を行い、解離時間は１５分－３時間であるステップを含む方法によって、前記サンプル解離液により前記及び／又は胆嚢・胆管がん固形腫瘍組織の解離を行い、ステップ（ｂ１）では、請求項２に記載の細胞分離緩衝液により胆嚢・胆管がんの胆汁サンプル中の細胞を懸濁させ、その後、密度勾配遠心分離により胆嚢・胆管がん胆汁サンプル初代腫瘍細胞を得るステップを含む方法によって、胆嚢・胆管がんの胆汁サンプルから胆嚢・胆管がん胆汁サンプル初代腫瘍細胞を分離する、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
ステップ（ａ２）では、細胞培養容器Ｍにおいて、前記培地で前記胃がん及び／又は胆嚢・胆管がん固形腫瘍初代細胞を懸濁培養し、３７℃と５％ＣＯ２の条件下で培養し、２－４日ごとに培地を交換するステップを含む方法によって、前記培地で前記胃がん及び／又は胆嚢・胆管がん固形腫瘍初代細胞を懸濁培養し、ステップ（ｂ２）では、細胞培養容器Ｍにおいて、前記培地で前記胆嚢・胆管がんの胆汁サンプル初代腫瘍細胞を懸濁培養し、３７℃と５％ＣＯ２の条件下で培養し、２－４日ごとに培地を交換するステップを含む方法によって、前記培地で前記胆嚢・胆管がんの胆汁サンプル初代腫瘍細胞を懸濁培養し、
前記細胞培養容器Ｍは、
（Ｉ）ポリスチレン製の細胞培養容器、ポリカーボネート製の細胞培養容器、ポリメチルメタクリレート製の細胞培養容器、ＣＯＣ樹脂製の細胞培養容器、シクロオレフィンポリマー製の細胞培養容器もしくは低接着表面細胞培養容器、
（ＩＩ） （Ｉ）の細胞培養容器にペルフルオロ（１－ブテニルビニルエーテル）ポリマー修飾を行った細胞培養容器
から選択されるいずれかである、請求項４又は５に記載の方法。
【請求項7】
前記（ＩＩ）として、前記（Ｉ）の細胞培養容器に純酸素エッチングを行うステップであって、エッチング条件は出力２０Ｗで、エッチング時間は３分であるステップと、その後、１％ペルフルオロ（１－ブテニルビニルエーテル）ポリマー溶液で前記細胞培養容器表面を覆い、前記１％ペルフルオロ（１－ブテニルビニルエーテル）ポリマー溶液を乾燥させたらペルフルオロ（１－ブテニルビニルエーテル）ポリマー修飾が完了するステップとを含む方法により、前記（Ｉ）の細胞培養容器にペルフルオロ（１－ブテニルビニルエーテル）ポリマー修飾を行い、前記１％ペルフルオロ（１－ブテニルビニルエーテル）ポリマー溶液は、１００ｍＬの前記１％ペルフルオロ（１－ブテニルビニルエーテル）ポリマー溶液当たり１ｍＬのペルフルオロ（１－ブテニルビニルエーテル）ポリマーを含有し、残部はフッ素系オイルであるように構成される、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
ステップ（ａ１）の前に、前記胃がん及び／又は胆嚢・胆管がん固形腫瘍組織の解離前処理を行うステップをさらに含み、前記解離前処理には、体積パーセント含有量７０－７５％のエタノールにより胃がん及び／又は胆嚢・胆管がん固形腫瘍組織サンプルの表面を洗浄すること、請求項２に記載のサンプル洗浄液、次に無菌のＰＢＳ溶液により前記胃がん及び／又は胆嚢・胆管がん固形腫瘍組織サンプルを洗浄することを含む、請求項４～７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項9】
前記解離前処理が行われる前記胃がん及び／又は胆嚢・胆管がん固形腫瘍組織サンプルの生体外での時間は２時間以内であり、且つ前記解離前処理を行われるまでは請求項２に記載のサンプル保存液に保存されている、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
ステップ（ａ１）で、前記サンプル解離液により前記胃がん及び／又は胆嚢・胆管がん固形腫瘍組織の解離処理を行った後、請求項２に記載の消化停止液で解離反応を停止させて、細胞懸濁液を収集するステップ、前記細胞懸濁液を濾過して、組織残片と接着細胞を除去するステップ、遠心分離して無菌のＰＢＳで細胞を再懸濁させるステップ、再び遠心分離し、その後、請求項１に記載の培地で細胞ペレットを再懸濁させるステップをさらに含む、請求項４～９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項11】
ステップ（ａ２）で、前記胃がん及び／又は胆嚢・胆管がん固形腫瘍初代細胞が直径５０－８０μｍの塊を形成したら、前記胃がん及び／又は胆嚢・胆管がん固形腫瘍初代細胞を継代させるステップをさらに含み、ステップ（ｂ２）で、前記胆嚢・胆管がん胆汁サンプル初代腫瘍細胞が直径５０－８０μｍの塊を形成したら、前記胆嚢・胆管がん胆汁サンプル初代腫瘍細胞を継代させるステップをさらに含む、請求項４～１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項12】
前記継代を行う時に使用する細胞消化液が、請求項２に記載の細胞消化液である、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
前記継代を行う時に使用する消化停止液が、請求項２に記載の消化停止液である、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項14】
２－３回の継代増殖を経た前記胃がん及び／又は胆嚢・胆管がん固形腫瘍初代細胞又は前記胆嚢・胆管がん胆汁サンプル初代腫瘍細胞を凍結保存し且つ／又は蘇生させるステップをさらに含み、前記凍結保存を行う時に使用する細胞凍結液が、請求項２に記載の細胞凍結液であり、
前記蘇生させるステップが、
蘇生対象である細胞の入った凍結保存管を液体窒素から取り出して、３７－３９℃の無菌水で細胞を融解し、８００－１０００ｇ室温下で５－１０分間遠心分離した後、請求項１に記載の培地で細胞ペレットを再懸濁させ、その後、細胞培養容器Ｍにおいて細胞を懸濁培養し（初期播種密度は１０ ５ 個／ｃｍ ２ 容器底面積）、各管の細胞（１０ ６ 個）を蘇生させて３．５ｃｍ培養皿に移し、培養条件は３７℃、５％ＣＯ２であること
を含む、請求項４～１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項15】
（Ｅ１）生体から単離したばかりの胃がん及び／又は胆嚢・胆管がん固形腫瘍組織を請求項２に記載のサンプル保存液に入れて保存し、保存時間は２時間以内であるステップを含む胃がん及び／又は胆嚢・胆管がん固形腫瘍組織の保存方法、（Ｅ２）請求項４～１４のいずれか１項に記載のステップ（ｂ１）を含む胆嚢・胆管がんの胆汁サンプルから胆嚢・胆管がんの胆汁サンプル初代腫瘍細胞を分離する方法、
のいずれかの方法。
【請求項16】
前記胃がんは原発性胃がんであり、前記胆嚢・胆管がんは原発性胆嚢・胆管がんである、請求項１に記載の培地。
【請求項17】
前記胃がんは胃がん転移病巣であり、前記胆嚢・胆管がんは胆嚢・胆管がん転移病巣である、請求項１に記載の培地。
【請求項18】
前記胃がん初代細胞は胃がん固形腫瘍初代細胞であり、前記胆嚢・胆管がん初代細胞は胆嚢・胆管がん固形腫瘍初代細胞又は胆嚢・胆管がん胆汁サンプル初代腫瘍細胞である、請求項１に記載の培地。
【請求項19】
前記胃がん初代細胞は胃がん患者の手術サンプルから分離されたものであり、前記胆嚢・胆管がん初代細胞は胆嚢・胆管がん患者の手術サンプル、穿刺サンプル又は胆汁サンプルから分離されたものである、請求項１に記載の培地。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明はバイオ技術の分野に関し、具体的には胃がん及び胆嚢・胆管がん初代細胞を培養する方法及び補助試薬（Supporting reagents）に関する。
【背景技術】
【0002】
胃がんは、人間の健康を脅かす最も一般的な悪性腫瘍の１つである。中国は胃がんの高発生国で、胃がんの発生数は全世界の発生数の４２．６％を、死亡数は全世界の死亡数の４５％を占めている。中国では胃がんの発生率が１１．８％で、全ての悪性腫瘍で４位である。胃がんの死亡率は２２．０％で、全ての悪性腫瘍で５位である。経済の発展、生活水準の向上とライフスタイルの移り変わりに伴って、これからも胃がんの発生率が上がっていくと予想される。さらに、胃がんの再発と転移のリスクが高く、胃がん患者の５０％以上には、程度の差があっても根治的治療後の数ヶ月から数年以内に再発と転移が起こってしまう。
【0003】
胆嚢・胆管がんは胆嚢、胆管、肝内胆管に発生する一般的な消化器系悪性腫瘍で、胆嚢がん、胆管細胞がんなどを含む。中国では胆嚢胆管関連性悪性腫瘍の総発生率は約３％で、そのうち胆管がんが２％で、消化管悪性腫瘍全体で５位である。その発生率が高くはないが、胆嚢胆管関連性がんは悪性度が極めて高く、胆管がんは肝がんの中でも最難関のような存在で、最悪のがんとして知られる。切除不能な胆嚢がんの場合は、生存期間中央値がわずか８ヶ月である。
【0004】
世界各国の科学研究と医療機関は胃がんと胆嚢・胆管がんの病因及び発生と進行の研究に大きな力を入れているにも関わらず、当該疾患への認識はまだ浅い。胃がんも胆嚢・胆管がんも複雑な疾患で、その発生、進行は動的な過程で、多くのシグナル分子の相互作用が関与していることで、複雑な分子制御ネットワークが形成され、外部環境要因からも影響を受けている。胃がんと胆嚢・胆管がんの病因と発生、進行に個体差が大きいため、一概には言えない。そのため、胃がんと胆嚢・胆管がん初代細胞培養物をモデルとして個別化した的確な研究は、胃がんと胆嚢・胆管がんの研究分野、そして胃がん診断治療分野で一般的に行われるようになる。
【0005】
従来の初代腫瘍細胞の培養技術は主に２Ｄ培養、３Ｄ培養、リプログラミング培養などのいくつかがあり、これらの方法は程度の差こそあれ、いずれも培養期間が極めて長く、培養成功率が低く、不要な細胞は除去しにくいなどの問題を抱えている。
【発明の概要】
【0006】
本発明は上記の技術的課題を効果的に解決するためになされたもので、新規な胃がん及び／又は胆嚢・胆管がん初代細胞を培養する方法及び補助試薬を提供する。当該技術を要約すると、
（１）温和な細胞解離試薬で胃がんや胆嚢・胆管がん固形腫瘍組織を処理して、組織におけるがん細胞の生存性を最大限に保証し、温和な方法で胆汁サンプルから胆嚢がん・胆管がん初代腫瘍細胞を分離して、がん細胞の生存性を最大限に保証し、
（２）特殊な無血清培地を調製し、懸濁培養系を用いて胃がんや胆嚢・胆管がん由来の腫瘍細胞の体外培養を行って、がん細胞の正常な増殖を保証するとともに正常な細胞の干渉を最大限に排除する。
（１）温和な細胞解離試薬で胃がんや胆嚢・胆管がん固形腫瘍組織を処理して、組織におけるがん細胞の生存性を最大限に保証し、温和な方法で胆汁サンプルから胆嚢がん・胆管がん初代腫瘍細胞を分離して、がん細胞の生存性を最大限に保証し、
（２）特殊な無血清培地を調製し、懸濁培養系を用いて胃がんや胆嚢・胆管がん由来の腫瘍細胞の体外培養を行って、がん細胞の正常な増殖を保証するとともに正常な細胞の干渉を最大限に排除する。
【0007】
本発明の第１態様は、胃がん及び／又は胆嚢・胆管がん初代細胞を培養するための培地に関する。
【0008】
本発明に係る胃がん及び／又は胆嚢・胆管がん初代細胞を培養するための培地は、３成分抗菌抗真菌剤（ペニシリン－ストレプトマイシン－アムホテリシンＢ）、ＨＥＰＥＳ、ＧｌｕｔａＭａｘ、非必須アミノ酸（Ｎｏｎ－ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ）、ヒト組換えタンパク質ＥＧＦ、ヒト組換えタンパク質ｂＦＧＦ、ヒト組換えタンパク質ＨＧＦ、ヒト組換えタンパク質ＦＧＦ－１０、ヒト組換えタンパク質Ｗｎｔ－３ａ、ヒト組換えタンパク質Ｎｏｇｇｉｎ、ＳＢ２０２１９０（４－（４－フルオロフェニル）－２－（４－ヒドロキシフェニル）－５－（４－ピリジル）－１Ｈ－イミダゾール）、Ａ８３－０１（３－（６－メチル－２－ピリジニル）－Ｎ－フェニル－４－（４－キノリニル）－１Ｈ－ピラゾール－１－カルボチオアミド（３－（６－Ｍｅｔｈｙｌ－２－ｐｙｒｉｄｉｎｙｌ）－Ｎ－ｐｈｅｎｙｌ－４－（４－ｑｕｉｎｏｌｉｎｙｌ）－１Ｈ－ｐｙｒａｚｏｌｅ－１－ｃａｒｂｏｔｈｉｏａｍｉｄｅ））、プリモシン（Ｐｒｉｍｏｃｉｎ）（商標）、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン（Ｎ－ａｃｅｔｙｌ－Ｌ－ｃｙｓｔｅｉｎｅ）、ニコチンアミド（Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ）、Ｎ２サプリメント（Ｎ２Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）、コルチゾール、Ｂ２７、ＩＴＳ－Ｘ（インスリン（Ｉｎｓｕｌｉｎ）、トランスフェリン（Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ）、セレン（Ｓｅｌｅｎｉｕｍ）、エタノールアミン溶液（Ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ））、ガストリン（Ｇａｓｔｉｎ１）、Ｙ－２７６３２、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地から構成される。前記３成分抗菌抗真菌剤でペニシリンの最終濃度は１００－２００Ｕ／ｍＬ（例えば、１００Ｕ／ｍＬ）であり、前記３成分抗菌抗真菌剤でストレプトマイシンの最終濃度は１００－２００μｇ／ｍＬ（例えば、１００μｇ／ｍＬ）であり、前記３成分抗菌抗真菌剤でアムホテリシンＢの最終濃度は２５０－２５０ｎｇ／ｍＬ（例えば、２５０ｎｇ／ｍＬ）であり、前記ＨＥＰＥＳの最終濃度は８－１２ｍＭ（例えば、１０ｍＭ）であり、前記ＧｌｕｔａＭａｘの最終濃度は０．８－１．２％（例えば、１％、％は体積パーセントパーセント含有量）であり、前記非必須アミノ酸でグリシンの濃度は８０－１２０μＭであり、前記非必須アミノ酸でＬ－アラニンの濃度は８０－１２０μＭ（例えば、１００μＭ）であり、前記非必須アミノ酸でＬ－アスパラギンの濃度は８０－１２０μＭ（例えば、１００μＭ）であり、前記非必須アミノ酸でＬ－アスパラギン酸の濃度は８０－１２０μＭ（例えば、１００μＭ）であり、前記非必須アミノ酸でＬ－グルタミン酸の濃度は８０－１２０μＭ（例えば、１００μＭ）であり、前記非必須アミノ酸でＬ－プロリンの濃度は８０－１２０μＭ（例えば、１００μＭ）であり、前記非必須アミノ酸でＬ－セリンの濃度は８０－１２０μＭ（例えば、１００μＭ）であり、前記ヒト組換えタンパク質ＥＧＦの最終濃度は１０－１００ｎｇ／ｍＬであり、前記ヒト組換えタンパク質ｂＦＧＦの最終濃度は１０－５０ｎｇ／ｍＬであり、前記ヒト組換えタンパク質ＨＧＦの最終濃度は５－２５ｎｇ／ｍＬであり、前記ヒト組換えタンパク質ＦＧＦ－１０の最終濃度は５－２５ｎｇ／ｍＬであり、前記ヒト組換えタンパク質Ｗｎｔ－３ａの最終濃度は２００－３００ｎｇ／ｍＬであり、前記ヒト組換えタンパク質Ｎｏｇｇｉｎの最終濃度は１００－２００ｎｇ／ｍＬであり、前記ＳＢ２０２１９０の最終濃度は５－１０μＭであり、前記Ａ８３－０１の最終濃度は０．２５－１．２５μＭであり、前記プリモシン（Ｐｒｉｍｏｃｉｎ）の最終濃度は１％（体積パーセント含有量）であり、前記Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン（Ｎ－ａｃｅｔｙｌ－Ｌ－ｃｙｓｔｅｉｎｅ）の最終濃度は０．５－２ｍＭであり、前記ニコチンアミド（Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ）の最終濃度は５－１０ｍＭであり、前記Ｎ２サプリメント（Ｎ２Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）の最終濃度は１％（体積パーセント含有量）であり、前記コルチゾールの最終濃度は２０－５０ｎｇ／ｍＬであり、前記Ｂ２７の最終濃度は１．５－２．５％（例えば、２％、％は体積パーセント含有量）であり、前記ＩＴＳ－Ｘの最終濃度は０．８－１．２％（例えば、１％、％は体積パーセント含有量）であり、前記ガストリン（Ｇａｓｔｒｉｎ１）の最終濃度は８－１２ｎＭ（例えば、１０ｎＭ）であり、前記Ｙ－２７６３２の最終濃度は５－２０μＭであり、残部はＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地だけである。
【0009】
さらに、前記３成分抗菌抗真菌剤（ペニシリン－ストレプトマイシン－アムホテリシンＢ）の組成は次のとおりである。１ミリリットル当たり１００００単位のペニシリン（塩基）と、１００００μｇのストレプトマイシン（塩基）と、２５μｇのアムホテリシンＢとを含む。前記３成分抗菌抗真菌剤（ペニシリン－ストレプトマイシン－アムホテリシンＢ）は「Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ、１００Ｘ」（例えば、Ｇｉｂｃｏ＃１５２４００６２、又はそれと同じ組成の別の製品）である。前記「Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ、１００Ｘ」は１ミリリットル当たり１００００単位のペニシリン（塩基）と、１００００μｇのストレプトマイシン（塩基）と、２５μｇのアムホテリシンＢとを含み、０．８５％生理食塩水に溶解したペニシリンＧ（ナトリウム塩）、硫酸ストレプトマイシン及びアムホテリシンＢをファンギゾン（Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ）（登録商標）抗真菌剤として用いる。前記ＧｌｕｔａＭＡＸは「ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）サプリメント」（例えば、Ｇｉｂｃｏ＃３５０５００６１、又はそれと同じ組成の別の製品）である。前記「ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）サプリメント」の成分はＬ－アラニル－Ｌ－グルタミン（Ｌ－ａｌａｎｙｌ－Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）で、Ｌ－グルタミン（Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）の代替物であり、濃度は２００ｎＭで、溶媒は０．８５％ＮａＣｌ溶液である。前記非必須アミノ酸の組成は次のとおりである。前記非必須アミノ酸は１ミリリットル当たり７５０μｇのグリシンと、８９０μｇのＬ－アラニンと、１３２０μｇのＬ－アスパラギンと、１３３０μｇのＬ－アスパラギン酸と、１４７０μｇのＬ－グルタミン酸と、１１５０μｇのＬ－プロリンと、１０５０μｇのＬ－セリンとを含み、溶媒は水である（１ミリリットルの前記非必須アミノ酸当たりで前記各アミノ酸の濃度がいずれも１０ｍＭである）。前記プリモシン（Ｐｒｉｍｏｃｉｎ）は初代細胞用抗菌剤（例えば、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎｅ＃ａｎｔ－ｐｍ－１、又はそれと同じ組成の別の製品）であり、初代細胞を微生物の汚染から保護するための抗生物質であり、グラム陽性菌、グラム陰性菌、マイコプラズマ及び真菌のいずれにも殺傷効果がある。前記Ｎ２サプリメント（Ｎ２Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）は「Ｎ２サプリメント（Ｎ２Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）（１００Ｘ）」（例えば、Ｇｉｂｃｏ＃１７５０２００１、又はそれと同じ組成の別の製品）である。前記「Ｎ２サプリメント（Ｎ２Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）（１００Ｘ）」は最終濃度１ｍＭのヒト由来トランスフェリン（ホロ）（Ｈｕｍａｎ Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ （Ｈｏｌｏ））、５００ｍｇ／Ｌの組換えインスリン全鎖（Ｉｎｓｕｌｉｎ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｆｕｌｌ Ｃｈａｉｎ）、０．６３ｍｇ／Ｌのプロゲステロン（Ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ）、１０ｍＭのプトレシン（Ｐｕｔｒｅｓｃｉｎｅ）、０．５２ｍｇ／Ｌの亜セレン酸塩（Ｓｅｌｅｎｉｔｅ）を含有する。前記Ｂ２７は「Ｂ－２７（商標）サプリメント（５０Ｘ）、ｍｉｎｕｓ ｖｉｔａｍｉｎ Ａ」（例えば、Ｇｉｂｃｏ＃１２５８７０１０、又はそれと同じ組成の別の製品）である。前記「Ｂ－２７（商標）サプリメント（５０Ｘ）、ｍｉｎｕｓ ｖｉｔａｍｉｎ Ａ」はビオチン（Ｂｉｏｔｉｎ）、ＤＬ－α－トコフェロールアセテート（ＤＬ Ａｌｐｈａ Ｔｏｃｏｐｈｅｒｏｌ Ａｃｅｔａｔｅ）、ＤＬ－α－トコフェロール（ＤＬ Ａｌｐｈａ－Ｔｏｃｏｐｈｅｒｏｌ）、ＢＳＡ（ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｆｒｅｅ Ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｖ）、カタラーゼ（Ｃａｔａｌａｓｅ）、ヒト組換えインスリン（Ｈｕｍａｎ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｉｎｓｕｌｉｎ）、ヒトトランスフェリン（Ｈｕｍａｎ Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ）、スーパーオキサイドジスムターゼ（Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ Ｄｉｓｍｕｔａｓｅ）、コルチコステロン（Ｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｎｅ）、Ｄ－ガラクトース（Ｄ－Ｇａｌａｃｔｏｓｅ）、エタノールアミン塩酸塩（Ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ ＨＣｌ）、還元型グルタチオン（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ（ｒｅｄｕｃｅｄ））、左旋性カルニチン塩酸塩（Ｌ－Ｃａｒｎｉｔｉｎｅ ＨＣｌ）、リノール酸（Ｌｉｎｏｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）、リノレン酸（Ｌｉｎｏｌｅｎｉｃ Ａｃｉｄ）、プロゲステロン（Ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ）、プトレシン（Ｐｕｔｒｅｓｃｉｎｅ ２ＨＣｌ）、亜セレン酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ Ｓｅｌｅｎｉｔｅ）、トリヨードチロニン（Ｔ３（ｔｒｉｏｄｏ－Ｉ－ｔｈｙｒｏｎｉｎｅ））を含有する。前記ＩＴＳ－Ｘの溶媒はＥＢＳＳ溶液（Ｅａｒｌｅ’ｓ平衡塩溶液）で、溶質と濃度は次のとおりである。インスリンが１ｇ／Ｌ、トランスフェリンが０．５５ｇ／Ｌ、亜セレン酸ナトリウムが０．０００６７ｇ／Ｌ、エタノールアミンが０．２ｇ／Ｌである。前記ＧｌｕｔａＭＡＸは高級な細胞培養用添加剤で、細胞培地中のＬ－グルタミンの代わりとして用いられる。前記ＧｌｕｔａＭＡＸは「ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）サプリメント」（例えば、Ｇｉｂｃｏ＃３５０５００６１、又はそれと同じ組成の別の製品）である。前記Ｙ－２７６３２は「Ｙ－２７６３２の二塩酸塩（ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）（ＡＴＰ競合的なＲＯＣＫ－ＩとＲＯＣＫ－ＩＩ阻害剤で、Ｋｉがそれぞれ２２０ｎＭ、３００ｎＭ）である」（例えば、ＭＣＥ＃１２９８３０－３８－２、又はそれと同じ組成の別の製品である）。
【0010】
本発明の特定の実施例において、前記３成分抗菌抗真菌剤（ペニシリン－ストレプトマイシン－アムホテリシンＢ）のカタログ番号はＧｉｂｃｏ＃１５２４００６２であり、前記ＨＥＰＥＳのカタログ番号はＧｉｂｃｏ＃１５６３００８０であり、前記ＧｌｕｔａＭＡＸのカタログ番号はＧｉｂｃｏ＃３５０５００６１であり、前記非必須アミノ酸のカタログ番号はＧｉｂｃｏ＃１１１４００５０であり、前記ヒト組換えタンパク質ＥＧＦのカタログ番号はＰｅｐｒｏｔｅｃｈ＃ＡＦ－１００－１５－１００であり、前記ヒト組換えタンパク質ｂＦＧＦのカタログ番号はＰｅｐｒｏｔｅｃｈ＃ＡＦ－１００－１８Ｂ－５０であり、前記ヒト組換えタンパク質ＨＧＦのカタログ番号はＰｅｐｒｏｔｅｃｈ＃ＡＦ－１００－３９－１００であり、前記ヒト組換えタンパク質ＦＧＦ－１０のカタログ番号はＰｅｐｒｏｔｅｃｈ＃ＡＦ－１００－２６－１００であり、前記ヒト組換えタンパク質Ｗｎｔ－３ａのカタログ番号はＲ＆Ｄ＃５０３６－ＷＮ－５００であり、前記ヒト組換えタンパク質Ｎｏｇｇｉｎのカタログ番号はＮｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎ＃Ｃ０１８であり、前記ＳＢ２０２１９０のカタログ番号はＳｉｇｍａ＃Ｓ７０６７であり、前記Ａ８３－０１のカタログ番号はＴｏｃｒｉｓ＃２９３９であり、前記プリモシン（Ｐｒｉｍｏｃｉｎ）（商標）のカタログ番号はＩｎｖｉｖｏｇｅｎｅ＃ａｎｔ－ｐｍ－１であり、前記Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン（Ｎ－ａｃｅｔｙｌ－Ｌ－ｃｙｓｔｅｉｎｅ）のカタログ番号はＳｉｇｍａ＃Ａ９１６５であり、前記ニコチンアミド（Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ）のカタログ番号はＳｉｇｍａ＃Ｎ０６３６であり、前記Ｎ２サプリメント（Ｎ２Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）のカタログ番号はＧｉｂｃｏ＃１７５０２００１であり、前記コルチゾールのカタログ番号はＳｉｇｍａ＃Ｈ０８８８であり、前記Ｂ２７のカタログ番号はＧｉｂｃｏ＃１２５８７０１０であり、前記ＩＴＳ－Ｘのカタログ番号はＧｉｂｃｏ＃５１５０００５６であり、前記ガストリンのカタログ番号はＮＪＰｅｐｔｉｄｅ＃Ｐｅｐ１２３０７であり、前記Ｙ－２７６３２のカタログ番号はＭＣＥ＃１２９８３０－３８－２であり、前記Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地のカタログ番号はＧｉｂｃｏ＃１２６３４０１０である。
【0011】
さらに、前記胃がん及び／又は胆嚢・胆管がん初代細胞を培養するための培地の存在形態は次の２つである。
１つは、前記胃がん及び／又は胆嚢・胆管がん初代細胞を培養するための培地が前記３成分抗菌抗真菌剤、前記ＨＥＰＥＳ、前記ＧｌｕｔａＭａｘ、前記非必須アミノ酸、前記ヒト組換えタンパク質ＥＧＦ、前記ヒト組換えタンパク質ｂＦＧＦ、前記ヒト組換えタンパク質ＨＧＦ、前記ヒト組換えタンパク質ＦＧＦ－１０、前記ヒト組換えタンパク質Ｗｎｔ－３ａ、前記ヒト組換えタンパク質Ｎｏｇｇｉｎ、前記ＳＢ２０２１９０、前記Ａ８３－０１、前記プリモシン（Ｐｒｉｍｏｃｉｎ）（商標）、前記Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン、前記ニコチンアミド、前記Ｎ２サプリメント（Ｎ２Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）、前記コルチゾール、前記Ｂ２７、前記ＩＴＳ－Ｘ、前記ガストリン、前記Ｙ－２７６３２及び前記Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を含有する溶液である。
１つは、前記胃がん及び／又は胆嚢・胆管がん初代細胞を培養するための培地が前記３成分抗菌抗真菌剤、前記ＨＥＰＥＳ、前記ＧｌｕｔａＭａｘ、前記非必須アミノ酸、前記ヒト組換えタンパク質ＥＧＦ、前記ヒト組換えタンパク質ｂＦＧＦ、前記ヒト組換えタンパク質ＨＧＦ、前記ヒト組換えタンパク質ＦＧＦ－１０、前記ヒト組換えタンパク質Ｗｎｔ－３ａ、前記ヒト組換えタンパク質Ｎｏｇｇｉｎ、前記ＳＢ２０２１９０、前記Ａ８３－０１、前記プリモシン（Ｐｒｉｍｏｃｉｎ）（商標）、前記Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン、前記ニコチンアミド、前記Ｎ２サプリメント（Ｎ２Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）、前記コルチゾール、前記Ｂ２７、前記ＩＴＳ－Ｘ、前記ガストリン、前記Ｙ－２７６３２及び前記Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を含有する溶液である。
【0012】
前記培地は調製後に０．２２μｍシリンジフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＳＬＧＰ０３３ＲＳ）で濾過して除菌する必要があり、４℃で２週間保存することができる。
【0013】
もう１つは、前記胃がん及び／又は胆嚢・胆管がん初代細胞を培養するための培地の各成分が単独で存在し、使用時は配合に従って調製する。
【0014】
さらに、そのなかのヒト組換えタンパク質ＥＧＦ、ヒト組換えタンパク質ｂＦＧＦ、ヒト組換えタンパク質ＨＧＦ、ヒト組換えタンパク質ＦＧＦ－１０、ヒト組換えタンパク質Ｗｎｔ－３ａ、ヒト組換えタンパク質Ｎｏｇｇｉｎは原液（母液）の形態で存在してもよく（－８０℃で長期保存）、具体的には１０００倍原液（母液）であってもよい。ＳＢ２０２１９０、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン（Ｎ－ａｃｅｔｙｌ－Ｌ－ｃｙｓｔｅｉｎｅ）、ニコチンアミド（Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ）、コルチゾール、ガストリン、Ｙ－２７６３２は原液（母液）の形態で存在してもよく（－２０℃で長期保存）、具体的には１０００倍原液（母液）であってもよい。Ａ８３－０１は原液（母液）の形態で存在してもよく（－２０℃で長期保存）、具体的には１０００００倍原液（母液）であってもよい。
【0015】
１０００×ヒト組換えタンパク質ＥＧＦ原液はヒト組換えタンパク質ＥＧＦ、ＢＳＡ、ＰＢＳから構成され、前記ヒト組換えタンパク質ＥＧＦの最終濃度は２０μｇ／ｍＬで、前記ＢＳＡの最終濃度は０．０１ｇ／ｍＬであり、残部はＰＢＳだけである。
【0016】
１０００×ヒト組換えタンパク質ｂＦＧＦ原液はヒト組換えタンパク質ｂＦＧＦ、ＢＳＡ、ＰＢＳから構成され、前記ヒト組換えタンパク質ｂＦＧＦの最終濃度は２０μｇ／ｍＬであり、前記ＢＳＡの最終濃度は０．０１ｇ／ｍＬであり、残部はＰＢＳだけである。
【0017】
１０００×ヒト組換えタンパク質ＨＧＦ原液はヒト組換えタンパク質ＨＧＦ、ＢＳＡ、ＰＢＳから構成され、前記ヒト組換えタンパク質ＨＧＦの最終濃度は２０μｇ／ｍＬであり、前記ＢＳＡの最終濃度は０．０１ｇ／ｍＬであり、残部はＰＢＳだけである。
【0018】
１０００×ヒト組換えタンパク質ＦＧＦ－１０原液はヒト組換えタンパク質ＦＧＦ－１０、ＢＳＡ、ＰＢＳから構成され、前記ヒト組換えタンパク質ＦＧＦ－１０の最終濃度は２０μｇ／ｍＬであり、前記ＢＳＡの最終濃度は０．０１ｇ／ｍＬであり、残部はＰＢＳだけである。
【0019】
１０００×ヒト組換えタンパク質Ｗｎｔ－３ａ原液はヒト組換えタンパク質Ｗｎｔ－３ａ、ＢＳＡ、ＰＢＳから構成され、前記ヒト組換えタンパク質Ｗｎｔ－３ａの最終濃度は２００μｇ／ｍＬであり、前記ＢＳＡの最終濃度は０．０１ｇ／ｍＬであり、残部はＰＢＳだけである。
【0020】
１０００×ヒト組換えタンパク質Ｎｏｇｇｉｎ原液はヒト組換えタンパク質Ｎｏｇｇｉｎ、ＢＳＡとＰＢＳから構成され、前記ヒト組換えタンパク質Ｎｏｇｇｉｎの最終濃度は１００μｇ／ｍＬであり、前記ＢＳＡの最終濃度は０．０１ｇ／ｍＬであり、残部はＰＢＳだけである。
【0021】
上記の６種の１０００倍原液で、前記ＢＳＡは１００倍原液（母液）の形態で存在してもよく（直前調製）、具体的にはＢＳＡとＰＢＳから構成され、ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ＃Ａ１９３３）の最終濃度は０．１ｇ／ｍＬで、残部はＰＢＳだけである。
【0022】
また、１０００×ＳＢ２０２１９０原液はＳＢ２０２１９０とＤＭＳＯから構成され、前記ＳＢ２０２１９０の最終濃度は１０ｍＭで、残部はＤＭＳＯだけである。
【0023】
１０００００×Ａ８３－０１原液はＡ８３－０１とＤＭＳＯから構成され、前記Ａ８３－０１の濃度は２５ｍＭで、残部はＤＭＳＯだけである。
【0024】
１０００×Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン（Ｎ－ａｃｅｔｙｌ－Ｌ－ｃｙｓｔｅｉｎｅ）原液はＮ－アセチル－Ｌ－システイン（Ｎ－ａｃｅｔｙｌ－Ｌ－ｃｙｓｔｅｉｎｅ）、超純水から構成され、前記Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン（Ｎ－ａｃｅｔｙｌ－Ｌ－ｃｙｓｔｅｉｎｅ）の濃度は０．５Ｍで、残部は超純水だけである。
【0025】
１０００×ニコチンアミド（Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ）原液はニコチンアミド（Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ）と超純水から構成され、前記ニコチンアミド（Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ）の濃度は５Ｍで、残部は超純水だけである。
【0026】
１０００×コルチゾール原液はコルチゾール、無水エタノールと超純水から構成され、前記コルチゾールの最終濃度は２５μｇ／ｍＬであり、前記無水エタノールの最終濃度は５％（体積パーセント含有量）であり、残部は超純水だけである。
【0027】
１０００×ガストリン原液はガストリンと超純水から構成され、ガストリンの濃度は１０μＭで、残部は超純水だけである。
【0028】
１０００×Ｙ－２７６３２原液はＹ－２７６３２と超純水から構成され、Ｙ－２７６３２の最終濃度は１０ｍＭで、残部は超純水だけである。
【0029】
本発明の第２態様は、胃がん及び／又は胆嚢・胆管がん初代細胞を培養するための補助試薬の保護に関する。
【0030】
本発明に係る補助試薬は次のいずれかであり得る：
（Ａ１）上記の第１態様に記載の培地と、サンプル解離液、サンプル保存液及びサンプル洗浄液のうちの全て又は一部とから構成される。
（Ａ２）上記の第１態様に記載の培地と、細胞分離緩衝液とから構成される。
（Ａ３） （Ａ１）と、細胞消化液、消化停止液及び細胞凍結液のうちの全て又は一部の試薬とから構成される。
（Ａ４） （Ａ２）と、細胞消化液、消化停止液及び細胞凍結液のうちの全て又は一部の試薬とから構成される。
（Ａ１）上記の第１態様に記載の培地と、サンプル解離液、サンプル保存液及びサンプル洗浄液のうちの全て又は一部とから構成される。
（Ａ２）上記の第１態様に記載の培地と、細胞分離緩衝液とから構成される。
（Ａ３） （Ａ１）と、細胞消化液、消化停止液及び細胞凍結液のうちの全て又は一部の試薬とから構成される。
（Ａ４） （Ａ２）と、細胞消化液、消化停止液及び細胞凍結液のうちの全て又は一部の試薬とから構成される。
【0031】
前記サンプル解離液はコラゲナーゼＩ、コラゲナーゼＩＩ、コラゲナーゼＩＶおよびＰＢＳから構成され、前記コラゲナーゼＩの最終濃度は１５０－２５０Ｕ／ｍＬ（例えば、２００Ｕ／ｍＬ）であり、前記コラゲナーゼＩＩの最終濃度は１５０－２５０Ｕ／ｍＬ（例えば、２００Ｕ／ｍＬ）であり、前記コラゲナーゼＩＶの最終濃度は５０－１５０Ｕ／ｍＬ（例えば、１００Ｕ／ｍＬ）であり、残部はＰＢＳだけである。
【0032】
なお、プロテアーゼの酵素活性でコラゲナーゼ（前記コラゲナーゼＩ、前記コラゲナーゼＩＩ又は前記コラゲナーゼＩＶ）の単位Ｕを定義する。即ち、３７℃とｐＨ７．５の条件下で、１Ｕのプロテアーゼでコラゲナーゼ（前記コラゲナーゼＩ、前記コラゲナーゼＩＩ又は前記コラゲナーゼＩＶ）を５時間処理すると、１μｍｏｌのＬ－ロイシンが放出される。
【0033】
本発明の特定の実施例において、前記コラゲナーゼＩのカタログ番号はＧｉｂｃｏ＃１７１００－０１７であり、前記コラゲナーゼＩＩのカタログ番号はＧｉｂｃｏ＃１７１０１－０１５であり、前記コラゲナーゼＩＶのカタログ番号はＧｉｂｃｏ＃１７１０４－０１９であり、前記ＰＢＳのカタログ番号はＧｉｂｃｏ＃２１－０４０－ＣＶＲである。
【0034】
前記サンプル保存液はウシ胎児血清、３成分抗菌抗真菌剤（ペニシリン－ストレプトマイシン－アムホテリシンＢ）、ＨＥＰＥＳ、ＨＢＳＳ（Ｈａｎｋ’ｓ平衡塩溶液）から構成され、前記ウシ胎児血清の最終濃度は１－５％（例えば、２％、％は体積パーセント含有量）であり、前記３成分抗菌抗真菌剤（ペニシリン－ストレプトマイシン－アムホテリシンＢ）におけるペニシリンの最終濃度は１００－２００Ｕ／ｍＬ（例えば、１００Ｕ／ｍＬ）であり、前記３成分抗菌抗真菌剤（ペニシリン－ストレプトマイシン－アムホテリシンＢ）におけるストレプトマイシンの最終濃度は１００－２００μｇ／ｍＬ（例えば、１００μｇ／ｍＬ）であり、前記３成分抗菌抗真菌剤（ペニシリン－ストレプトマイシン－アムホテリシンＢ）におけるアムホテリシンＢの最終濃度は２５０－５００ｎｇ／ｍＬ（例えば、２５０ｎｇ／ｍＬ）であり、前記ＨＥＰＥＳの最終濃度は８－１２ｍＭ（例えば、１０ｍＭ）であり、残部はＨＢＳＳだけである。
【0035】
さらに、前記３成分抗菌抗真菌剤（ペニシリン－ストレプトマイシン－アムホテリシンＢ）の組成は次のとおりである。１ミリリットル当たり１００００単位のペニシリン（塩基）と、１００００μｇのストレプトマイシン（塩基）と、２５μｇのアムホテリシンＢとを含む。前記３成分抗菌抗真菌剤（ペニシリン－ストレプトマイシン－アムホテリシンＢ）は「Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ、１００Ｘ」（例えば、Ｇｉｂｃｏ＃１５２４００６２、又はそれと同じ組成の別の製品）である。前記「Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ、１００Ｘ」は１ミリリットル当たり１００００単位のペニシリン（塩基）と、１００００μｇのストレプトマイシン（塩基）と、２５μｇのアムホテリシンＢとを含み、０．８５％生理食塩水に溶解したペニシリンＧ（ナトリウム塩）、硫酸ストレプトマイシン及びアムホテリシンＢをファンギゾン（Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ）（登録商標）抗真菌剤として用いる。
【0036】
本発明の特定の実施例において、前記ウシ胎児血清のカタログ番号はＧｉｂｃｏ＃１６０００－０４４であり、前記３成分抗菌抗真菌剤（ペニシリン－ストレプトマイシン－アムホテリシンＢ）のカタログ番号はＧｉｂｃｏ＃１５２４００６２であり、前記ＨＥＰＥＳのカタログ番号はＧｉｂｃｏ＃１５６３００８０であり、前記ＨＢＳＳのカタログ番号はＧｉｂｃｏ＃１４１７０１６１である。
【0037】
前記サンプル洗浄液は３成分抗菌抗真菌剤（ペニシリン－ストレプトマイシン－アムホテリシンＢ）、ＰＢＳから構成され、前記３成分抗菌抗真菌剤（ペニシリン－ストレプトマイシン－アムホテリシンＢ）におけるペニシリンの最終濃度は１００－２００Ｕ／ｍＬ（例えば、１００Ｕ／ｍＬ）であり、前記３成分抗菌抗真菌剤（ペニシリン－ストレプトマイシン－アムホテリシンＢ）におけるストレプトマイシンの最終濃度は１００－２００μｇ／ｍＬ（例えば、１００μｇ／ｍＬ）であり、前記３成分抗菌抗真菌剤（ペニシリン－ストレプトマイシン－アムホテリシンＢ）におけるアムホテリシンＢの最終濃度は２５０－５００ｎｇ／ｍＬ（例えば、２５０ｎｇ／ｍＬ）であり、残部はＰＢＳだけである。
【0038】
さらに、前記３成分抗菌抗真菌剤（ペニシリン－ストレプトマイシン－アムホテリシンＢ）の組成は次のとおりである。１ミリリットル当たり１００００単位のペニシリン（塩基）と、１００００μｇのストレプトマイシン（塩基）と、２５μｇのアムホテリシンＢとを含む。前記３成分抗菌抗真菌剤（ペニシリン－ストレプトマイシン－アムホテリシンＢ）は「Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ、１００Ｘ」（例えば、Ｇｉｂｃｏ＃１５２４００６２、又はそれと同じ組成の別の製品）である。前記「Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ、１００Ｘ」は１ミリリットル当たり１００００単位のペニシリン（塩基）と、１００００μｇのストレプトマイシン（塩基）と、２５μｇのアムホテリシンＢとを含み、０．８５％生理食塩水に溶解したペニシリンＧ（ナトリウム塩）、硫酸ストレプトマイシン及びアムホテリシンＢをファンギゾン（Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ）（登録商標）抗真菌剤として用いる。
【0039】
本発明の特定の実施例において、前記３成分抗菌抗真菌剤（ペニシリン－ストレプトマイシン－アムホテリシンＢ）のカタログ番号はＧｉｂｃｏ＃１５２４００６２であり、前記ＰＢＳのカタログ番号はＧｉｂｃｏ＃２１－０４０－ＣＶＲである。
【0040】
前記細胞分離緩衝液は２成分抗生物質Ｐ／Ｓ（ペニシリン－ストレプトマイシン）、ヘパリンナトリウム、およびＰＢＳから構成され、前記２成分抗生物質Ｐ／Ｓ（ペニシリン－ストレプトマイシン）におけるペニシリンの最終濃度は１００－２００Ｕ／ｍＬ（例えば、１００Ｕ／ｍＬ）であり、前記２成分抗生物質Ｐ／Ｓ（ペニシリン－ストレプトマイシン）におけるストレプトマイシンの最終濃度は１００－２００μｇ／ｍＬ（例えば、１００μｇ／ｍＬ）であり、前記ヘパリンナトリウムの最終濃度は１０ＩＵ／ｍＬであり、残部はＰＢＳだけである。
【0041】
本発明の特定の実施例において、前記２成分抗生物質Ｐ／Ｓ（ペニシリン－ストレプトマイシン）のカタログ番号はＧｉｂｃｏ＃１５１４０１２２であり、前記ヘパリンナトリウムのカタログ番号はＳｏｌａｒｂｉｏ＃Ｈ８２７０であり、前記ＰＢＳのカタログ番号はＧｉｂｃｏ＃２１－０４０－ＣＶＲである。
【0042】
前記細胞消化液の組成は次のとおりである。前記細胞消化液は１０ｍＬ当たり４－６ｍＬ（例えば、５ｍＬ）のアキュターゼ（Ａｃｃｕｔａｓｅ）、最終濃度５ｍＭのＥＤＴＡ（即ち０．５ＭのＥＤＴＡ１０μＬ）、１．５－２．５ｍＬ（例えば、２ｍＬ）のＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓを含有し、残部はＰＢＳである。
【0043】
さらに、前記アキュターゼ（Ａｃｃｕｔａｓｅ）は「ＳｔｅｍＰｒｏ（商標） Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）細胞解離試薬」（例えば、Ｇｉｂｃｏ＃Ａ１１１０５－０１、又はそれと同じ組成の別の製品）である。前記アキュターゼ（Ａｃｃｕｔａｓｅ）は単一成分の酵素であり、Ｄ－ＰＢＳ、０．５ｍＭのＥＤＴＡ溶液に溶解する。前記ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓは「ＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｅｎｚｙｍｅ（１Ｘ）、フェノールレッド不含（ｎｏ ｐｈｅｎｏｌ ｒｅｄ）」（例えば、Ｇｉｂｃｏ＃１２６０４０１３、又はそれと同じ組成の別の製品）である。前記「ＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｅｎｚｙｍｅ（１Ｘ）、フェノールレッド不含（ｎｏ ｐｈｅｎｏｌ ｒｅｄ）」は２００ｍｇ／ＬのＫＣｌ、２００ｍｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、８０００ｍｇ／ＬのＮａＣｌ、２１６０ｍｇ／ＬのＮａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ、４５７．６ｍｇ／ＬのＥＤＴＡを含有し、組換プロテアーゼをさらに含有する。
【0044】
本発明の特定の実施例において、前記アキュターゼ（Ａｃｃｕｔａｓｅ）のカタログ番号はＧｉｂｃｏ＃Ａ１１１０５－０１であり、前記０．５ＭのＥＤＴＡのカタログ番号はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃ＡＭ９２６１であり、前記ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓのカタログ番号はＧｉｂｃｏ＃１２６０４０１３であり、前記ＰＢＳのカタログ番号はＧｉｂｃｏ＃２１－０４０－ＣＶＲである。
【0045】
前記消化停止液はウシ胎児血清、３成分抗菌抗真菌剤（ペニシリン－ストレプトマイシン－アムホテリシンＢ）およびＤＭＥＭ培地から構成され、前記ウシ胎児血清の最終濃度は８－１２％（例えば、１０％、％は体積パーセント含有量）であり、前記３成分抗菌抗真菌剤（ペニシリン－ストレプトマイシン－アムホテリシンＢ）におけるペニシリンの最終濃度は１００－２００Ｕ／ｍＬ（例えば、１００Ｕ／ｍＬ）であり、前記３成分抗菌抗真菌剤（ペニシリン－ストレプトマイシン－アムホテリシンＢ）におけるストレプトマイシンの最終濃度は１００－２００μｇ／ｍＬ（例えば、１００μｇ／ｍＬ）であり、前記３成分抗菌抗真菌剤（ペニシリン－ストレプトマイシン－アムホテリシンＢ）におけるアムホテリシンＢの最終濃度は２５０－５００ｎｇ／ｍＬ（例えば、２５０ｎｇ／ｍＬ）であり、残部はＤＭＥＭ培地だけである。
【0046】
さらに、前記３成分抗菌抗真菌剤（ペニシリン－ストレプトマイシン－アムホテリシンＢ）の組成は次のとおりである。１ミリリットル当たり１００００単位のペニシリン（塩基）と、１００００μｇのストレプトマイシン（塩基）と、２５μｇのアムホテリシンＢとを含む。前記３成分抗菌抗真菌剤（ペニシリン－ストレプトマイシン－アムホテリシンＢ）は「Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ、１００Ｘ」（例えば、Ｇｉｂｃｏ＃１５２４００６２、又はそれと同じ組成の別の製品）である。前記「Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ、１００Ｘ」は１ミリリットル当たり１００００単位のペニシリン（塩基）と、１００００μｇのストレプトマイシン（塩基）と、２５μｇのアムホテリシンＢとを含み、０．８５％生理食塩水に溶解したペニシリンＧ（ナトリウム塩）、硫酸ストレプトマイシン及びアムホテリシンＢをファンギゾン（Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ）（登録商標）抗真菌剤として用いる。
【0047】
本発明の特定の実施例において、前記ウシ胎児血清のカタログ番号はＧｉｂｃｏ＃１６０００－０４４であり、前記３成分抗菌抗真菌剤（ペニシリン－ストレプトマイシン－アムホテリシンＢ）のカタログ番号はＧｉｂｃｏ＃１５２４００６２であり、前記ＤＭＥＭ培地のカタログ番号はＧｉｂｃｏ＃１１９６５－０９２である。
【0048】
前記細胞凍結液はＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、ＤＭＳＯ、および１％メチルセルロース溶液から構成され、前記Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地と前記ＤＭＳＯと前記１％メチルセルロース溶液の体積比は２０：２：（０．８－１．２）で、例えば、２０：２：１であり、前記１％メチルセルロース溶液は濃度１ｇ／１００ｍＬのメチルセルロース水溶液である。
【0049】
本発明の特定の実施例において、前記Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地のカタログ番号はＧｉｂｃｏ＃１２６３４０１０であり、前記ＤＭＳＯのカタログ番号はＳｉｇｍａ＃Ｄ２４３８であり、前記メチルセルロースのカタログ番号はＳｉｇｍａ＃Ｍ７０２７である。
【0050】
前記サンプル保存液は生体から単離したサンプルの一時的な保存に用いられ、生体から単離したサンプルに対して、サンプル中の細胞の生存性を短時間に保持することができる。前記サンプル保存液は調製後に４℃で１ヶ月保存することができる。
【0051】
前記サンプル洗浄液はサンプルの洗浄と消毒に用いられる。前記サンプル洗浄液は直前調製する必要がある。
【0052】
前記サンプル解離液はサンプルの解離に用いられ、サンプル中の胃がん及び／又は胆嚢・胆管がん固形腫瘍初代細胞を組織から解離することができる。前記サンプル解離液は直前調製する必要があり、なお、コラゲナーゼＩ、コラゲナーゼＩＩ及びコラゲナーゼＩＶは原液（母液）の形態として－２０℃で長期保存することができ、具体的には１０又は２０倍原液（母液）であってもよい。１０×コラゲナーゼＩ原液は前記コラゲナーゼＩとＰＢＳから構成され、前記コラゲナーゼＩの最終濃度は２０００Ｕ／ｍＬであり、１０×コラゲナーゼＩＩ原液は前記コラゲナーゼＩＩとＰＢＳから構成され、前記コラゲナーゼＩＩの最終濃度は２０００Ｕ／ｍＬであり、残部はＰＢＳだけであり、２０×コラゲナーゼＩＶ原液は前記コラゲナーゼＩＶとＰＢＳから構成され、前記コラゲナーゼＩＶの最終濃度は２０００Ｕ／ｍＬであり、残部はＰＢＳだけである。前記コラゲナーゼＩ、コラゲナーゼＩＩ及び前記コラゲナーゼＩＶの酵素活性の定義は上記を参照。
【0053】
前記細胞分離緩衝液は、胆汁サンプル中の細胞を懸濁させるためものである。前記細胞分離緩衝液は調製された後、４℃で１ヶ月保存することができる。
【0054】
前記細胞消化液は細胞塊の消化と継代に用いられ、胃がん及び／又は胆嚢・胆管がん腫瘍塊を消化して単細胞を得ることができる。前記細胞消化液は直前調製する必要がある。
【0055】
前記消化停止液はサンプル解離又は細胞消化を停止させるために用いられる。前記消化停止液は調製した後、４℃で１ヶ月保存することができる。
【0056】
前記胃がん及び／又は胆嚢・胆管がん初代細胞培地は胃がん及び／又は胆嚢・胆管がん初代細胞の培養に用いられる。
【0057】
前記細胞凍結液は直前調製する必要がある。前記１％メチルセルロース溶液は４℃で長期保存することができる。
【0058】
本発明の第３態様は、次のいずれかの使用に関する：
（Ｂ１）胃がん及び／又は胆嚢・胆管がん初代細胞を培養するための上記の第１態様に記載の培地の使用、
（Ｂ２）胃がん及び／又は胆嚢・胆管がん固形腫瘍初代細胞を培養するための上記の第２態様の（Ａ１）又は（Ａ３）に記載の補助試薬の使用、
（Ｂ３）胆嚢・胆管がん胆汁サンプル初代腫瘍細胞を培養するための上記の第２態様の（Ａ２）又は（Ａ４）に記載の補助試薬の使用。
（Ｂ１）胃がん及び／又は胆嚢・胆管がん初代細胞を培養するための上記の第１態様に記載の培地の使用、
（Ｂ２）胃がん及び／又は胆嚢・胆管がん固形腫瘍初代細胞を培養するための上記の第２態様の（Ａ１）又は（Ａ３）に記載の補助試薬の使用、
（Ｂ３）胆嚢・胆管がん胆汁サンプル初代腫瘍細胞を培養するための上記の第２態様の（Ａ２）又は（Ａ４）に記載の補助試薬の使用。
【0059】
本発明の第４態様は、胃がん及び／又は胆嚢・胆管がん初代細胞の培養方法に関する。
【0060】
本発明に関する胃がん及び／又は胆嚢・胆管がん初代細胞の培養方法は、方法Ａ又は方法Ｂであってもよい。
方法Ａの胃がん及び／又は胆嚢・胆管がん固形腫瘍初代細胞の培養方法は、
（ａ１）上記の第２態様に記載のサンプル解離液で胃がん及び／又は胆嚢・胆管がん固形腫瘍組織の解離処理を行って、胃がん及び／又は胆嚢・胆管がん固形腫瘍初代細胞を得るステップと、
（ａ２）上記の第１態様に記載の培地でステップ（ａ１）で解離された胃がん及び／又は胆嚢・胆管がん固形腫瘍初代細胞を懸濁培養するステップとを含む。
方法Ａの胃がん及び／又は胆嚢・胆管がん固形腫瘍初代細胞の培養方法は、
（ａ１）上記の第２態様に記載のサンプル解離液で胃がん及び／又は胆嚢・胆管がん固形腫瘍組織の解離処理を行って、胃がん及び／又は胆嚢・胆管がん固形腫瘍初代細胞を得るステップと、
（ａ２）上記の第１態様に記載の培地でステップ（ａ１）で解離された胃がん及び／又は胆嚢・胆管がん固形腫瘍初代細胞を懸濁培養するステップとを含む。
【0061】
方法Ｂの胆嚢がん及び／又は胆管がんの胆汁サンプル初代腫瘍細胞の培養方法は、
（ｂ１）胆嚢がん及び／又は胆管がんの胆汁サンプルから胆嚢がん及び／又は胆管がん胆汁サンプルの初代腫瘍細胞を分離するステップと、
（ｂ２）上記の第１態様に記載の培地で、ステップ（ｂ１）で分離した胆嚢がん及び／又は胆管がん胆汁サンプルの初代腫瘍細胞を懸濁培養するステップとを含む。
（ｂ１）胆嚢がん及び／又は胆管がんの胆汁サンプルから胆嚢がん及び／又は胆管がん胆汁サンプルの初代腫瘍細胞を分離するステップと、
（ｂ２）上記の第１態様に記載の培地で、ステップ（ｂ１）で分離した胆嚢がん及び／又は胆管がん胆汁サンプルの初代腫瘍細胞を懸濁培養するステップとを含む。
【0062】
さらに、ステップ（ａ１）では、１ｍｇの組織当たり０．１－０．３ｍＬ（例えば、０．１ｍＬ）の前記サンプル解離液の使用量で、切断された前記胃がん及び／又は胆嚢・胆管がん固形腫瘍組織（例えば、０．８－１．２ｍｍ３に切断された小片）を予め３７℃に加熱した前記サンプル解離液で処理し、３７℃でサンプル解離を行い、解離時間は１５分－３時間であるステップを含む方法で、前記サンプル解離液で前記胃がん及び／又は胆嚢・胆管がん固形腫瘍組織の解離を行ってもよい。多くの単細胞が観察されるまで、１５分ごとに顕微鏡でサンプルの解離状況を観察し続ける。
【0063】
さらに、ステップ（ｂ１）では、上記の第２態様に記載の細胞分離緩衝液で胆嚢・胆管がんの胆汁サンプル中の細胞を懸濁させ、その後、密度勾配遠心分離（Ｆｉｃｏｌｌリンパ球分離液を使用）により胆嚢・胆管がんの胆汁サンプル初代腫瘍細胞を得るステップを含む方法で、胆嚢・胆管がん胆汁サンプルから胆嚢・胆管がん胆汁サンプル初代腫瘍細胞を分離してもよい。
【0064】
さらに、ステップ（ａ２）では、細胞培養容器Ｍにおいて、前記培地で前記胃がん及び／又は胆嚢・胆管がん固形腫瘍初代細胞を懸濁培養し、３７℃と５％ＣＯ２の条件下で培養し、２－４日（例えば、３日）ごとに培地を交換し、細胞が直径５０－８０μｍ（例えば、８０μｍ）の塊を形成するまでこれを続けるステップを含む方法で、前記培地で前記胃がん及び／又は胆嚢・胆管がん固形腫瘍初代細胞を懸濁培養してもよい。
【0065】
さらに、ステップ（ｂ２）では、細胞培養容器Ｍにおいて、前記培地で前記胆嚢・胆管がんの胆汁サンプル初代腫瘍細胞を懸濁培養し、３７℃と５％ＣＯ２の条件下で培養し、２－４日（例えば、３日）ごとに培地を交換し、細胞が直径５０－８０μｍ（例えば、８０μｍ）の塊を形成するまでこれを続けるステップを含む方法で、前記培地で前記胆嚢・胆管がん胆汁サンプル初代腫瘍細胞を懸濁培養してもよい。
【0066】
なお、初期播種密度は容器の底面積１ｃｍ２当たり１０５個／であってもよく、例えば、６ウェルプレートの場合は、１ウェル当たり１０６個の細胞の密度で播種する。
【0067】
なお、前記細胞培養容器Ｍは次のいずれかであってもよい：
（Ｉ）ポリスチレン製の細胞培養容器、ポリカーボネート製の細胞培養容器、ポリメチルメタクリレート製の細胞培養容器、ＣＯＣ樹脂製の細胞培養容器、シクロオレフィンポリマー製の細胞培養容器又は低接着表面細胞培養容器、
（ＩＩ） （Ｉ）の細胞培養容器にＣＹＴＯＰ修飾を行った細胞培養容器。
（Ｉ）ポリスチレン製の細胞培養容器、ポリカーボネート製の細胞培養容器、ポリメチルメタクリレート製の細胞培養容器、ＣＯＣ樹脂製の細胞培養容器、シクロオレフィンポリマー製の細胞培養容器又は低接着表面細胞培養容器、
（ＩＩ） （Ｉ）の細胞培養容器にＣＹＴＯＰ修飾を行った細胞培養容器。
【0068】
さらに、前記細胞培養容器は細胞培養皿、細胞培養ウェルプレート又は細胞培養用マイクロプレートチップである。
【0069】
前記（ＩＩ）としては、前記（Ｉ）の細胞培養容器に純酸素エッチングを行うステップであって、エッチング条件は電力２０Ｗで、エッチング時間は３分であるステップと、その後、１％ＣＹＴＯＰ溶液で前記細胞培養容器表面を覆い、前記１％ＣＹＴＯＰ溶液を乾燥させてからＣＹＴＯＰ修飾が完了するステップとを含む方法で、前記（Ｉ）の細胞培養容器にＣＹＴＯＰ修飾を行ってもよい。
【0070】
なお、前記１％ＣＹＴＯＰ溶液の組成は次のとおりである。前記１％ＣＹＴＯＰ溶液は１００ｍＬ当たり１ｍＬのＣＹＴＯＰを含有し、残部はフッ素系オイルである。
【0071】
さらに、ステップ（ａ１）の前に、前記胃がん及び／又は胆嚢・胆管がん固形腫瘍組織の解離前処理を行うステップをさらに含んでもよい。このステップには、体積パーセント含有量７０－７５％のエタノールで胃がん及び／又は胆嚢・胆管がん固形腫瘍組織サンプルの表面を洗浄すること、上記の第２態様に記載のサンプル洗浄液で前記胃がん及び／又は胆嚢・胆管がん固形腫瘍組織サンプルを１０－２０回（例えば、１０回）洗浄し、無菌のＰＢＳ溶液で前記胃がん及び／又は胆嚢・胆管がん固形腫瘍組織サンプルを５－１０回（例えば、５回）洗浄すること、その後、前記胃がん及び／又は胆嚢・胆管がん固形腫瘍組織サンプルから不純物、結合組織、脂肪組織、壊死組織などの初代細胞の培養に影響を与える成分を除去することを含む。
【0072】
前記胃がん及び／又は胆嚢・胆管がん固形腫瘍組織の解離前処理を行うステップは氷上で操作する必要があり、ステップの全体の操作は１０分以内に完了する必要がある。
【0073】
さらに、前記解離前処理が行われる前記胃がん及び／又は胆嚢・胆管がん固形腫瘍組織サンプルの生体外にある時間は２時間以内であり、且つ前記解離前処理を行われるまでは上記の第２態様に記載のサンプル保存液に保存されている。
【0074】
さらに、ステップ（ａ１）では、前記サンプル解離液で前記胃がん及び／又は胆嚢・胆管がん固形腫瘍組織の解離処理を行った後は、８－１５倍（例えば１０倍）の体積の上記の第２態様に記載の消化停止液で解離反応を停止させて、細胞懸濁液を収集するステップ、１００μｍ又は４０μｍの無菌のセルストレーナーで前記細胞懸濁液を濾過して、組織残片と接着細胞を除去するステップ、８００－１０００ｇ（例えば８００ｇ）で室温下で１０－１５分（例えば１０分）遠心分離して、上澄みを廃棄するステップ、その後、３－５ｍＬ（例えば、５ｍＬ）の無菌のＰＢＳで細胞を再懸濁させるステップ、８００－１０００ｇ（例えば、８００ｇ）で室温下で１０－１５分（例えば１０分）遠心分離して、上澄みを廃棄するステップ、その後、上記の第１態様に記載の培地で細胞ペレットを再懸濁させて、顕微鏡で細胞の状態を観察し、細胞の数をカウントするステップをさらに含む。
【0075】
さらに、ステップ（ｂ１）の前に、胆嚢・胆管がんの胆汁サンプルの分離前処理を行うステップであって、胆嚢・胆管がんの胆汁サンプルから不純物、血餅などの細胞密度勾配分離に影響を与える成分を除去するステップをさらに含む。
【0076】
さらに、ステップ（ａ２）では、前記胃がん及び／又は胆嚢・胆管がん固形腫瘍初代細胞が直径５０－８０μｍ（例えば８０μｍ）の塊を形成したら、前記胃がん及び／又は胆嚢・胆管がん固形腫瘍初代細胞を継代させるステップをさらに含んでもよい。
【0077】
さらに、ステップ（ｂ２）では、前記胆嚢・胆管がんの胆汁サンプル初代腫瘍細胞が直径５０－８０μｍ（例えば８０μｍ）の塊を形成したら、前記胆嚢・胆管がん胆汁サンプル初代腫瘍細胞を継代させるステップをさらに含んでもよい。
【0078】
なお、前記継代を行う時に使用する細胞消化液は、上記の第２態様に記載の細胞消化液である。
【0079】
なお、前記継代を行う時に使用する消化停止液は、上記の第２態様に記載の消化停止液である。
【0080】
さらに、前記継代を行う時、消化温度は３７℃である。
【0081】
より具体的には、前記継代は、継代対象細胞塊を収集し、遠心分離して無菌のＰＢＳ溶液で細胞塊を洗浄して、再び遠心分離し、その後、前記細胞消化液で細胞塊を再懸濁させ、３７℃で、細胞塊が単細胞になるまで消化し、前記消化停止液（使用量は５－１０倍の体積、例えば１０倍であり得る）で消化反応を停止させて、細胞懸濁液を収集するステップと、遠心分離して上記の第１態様に記載の培地で細胞ペレットを再懸濁させて、計数し、その後、上記の細胞培養容器Ｍにおいて細胞を懸濁培養し（初期播種密度は容器の底面積１ｃｍ２当たり１０５個であってもよく、例えば、６ウェルプレートの場合、１ウェル当たり１０６個の細胞の密度で播種する）、培養条件は３７℃と５％ＣＯ２であるステップとにより行われる。上記の継代ステップにおける遠心分離はいずれも、具体的には８００－１０００ｇ（例えば、８００ｇ）で室温下で１０－２０分間（例えば、１０分間）遠心分離することであってもよい。
【0082】
さらに、前記方法は２－３回の継代増殖を経た前記胃がん及び／又は胆嚢・胆管がん固形腫瘍初代細胞又は前記胆嚢・胆管がんの胆汁サンプル初代腫瘍細胞を凍結保存し且つ／又は蘇生させるステップをさらに含んでもよい。
【0083】
前記凍結保存を行う時に使用する細胞凍結液は上記の第２態様に記載の細胞凍結液である。
【0084】
さらに、前記凍結保存は具体的には、凍結保存対象である細胞塊を収集し、遠心分離して無菌のＰＢＳ溶液で細胞塊を洗浄し、再び遠心分離し、その後、前記細胞消化液で細胞塊を再懸濁させ、３７℃で、細胞塊が単細胞になるまで消化し、前記消化停止液（使用量は体積の５－１０倍、例えば１０倍であり得る）で消化反応を停止させて、細胞懸濁液を収集するステップと、遠心分離して前記細胞凍結液により、０．５－２×１０６／ｍＬ（例えば１０６／ｍＬ）の密度で細胞ペレットを再懸濁させて、勾配冷却ボックスで一晩凍結保存した後、液体窒素に移して長期保存するステップとで行われる。上記の凍結保存ステップにおける遠心分離はいずれも、具体的には８００－１０００ｇ（例えば８００ｇ）で室温下で１０－２０分間（例えば１０分間）遠心分離することであってもよい。
【0085】
さらに、前記蘇生の具体的なステップは次のとおりである。蘇生対象である細胞の入った凍結保存管を液体窒素から取り出して、３７－３９℃（例えば３７℃）の無菌水で細胞を迅速に融解し、遠心分離（例えば８００－１０００ｇ、例えば８００ｇで室温下で５－１０分間、例えば１０分間、遠心分離）した後、上記の第１態様に記載の培地で細胞ペレットを再懸濁させ、その後、上記の細胞培養容器Ｍにおいて細胞を懸濁培養し（初期播種密度は容器の底面積１ｃｍ２当たり１０５個であってもよい）、各チューブの細胞（１０６個）を蘇生させて３．５ｃｍ培養皿に移し、培養条件は３７℃と５％ＣＯ２である。
【0086】
本発明の第５態様は、次のいずれかの試薬に関する：
（Ｃ１）上記の第２態様に記載のサンプル解離液である胃がん及び／又は胆嚢・胆管がん固形腫瘍組織サンプル解離液、
（Ｃ２）上記の第２態様に記載のサンプル保存液である胃がん及び／又は胆嚢・胆管がん固形腫瘍組織サンプル保存液、
（Ｃ３）上記の第２態様に記載の細胞分離緩衝液である胆嚢・胆管がん胆汁サンプル分離緩衝液。
（Ｃ１）上記の第２態様に記載のサンプル解離液である胃がん及び／又は胆嚢・胆管がん固形腫瘍組織サンプル解離液、
（Ｃ２）上記の第２態様に記載のサンプル保存液である胃がん及び／又は胆嚢・胆管がん固形腫瘍組織サンプル保存液、
（Ｃ３）上記の第２態様に記載の細胞分離緩衝液である胆嚢・胆管がん胆汁サンプル分離緩衝液。
【0087】
本発明の第６態様は、次のいずれかの使用に関する：
（Ｄ１）胃がん及び／又は胆嚢・胆管がん固形腫瘍組織から胃がん及び／又は胆嚢・胆管がん固形腫瘍初代細胞を解離するための上記の第５態様の（Ｃ１）に記載のサンプル解離液の使用、
（Ｄ２）胃がん及び／又は胆嚢・胆管がん固形腫瘍組織を保存するための上記の第５態様の（Ｃ２）に記載のサンプル保存液の使用、
（Ｄ３）胆嚢・胆管がん胆汁サンプルから胆嚢・胆管がん胆汁サンプル初代腫瘍細胞を分離するための上記の第５態様の（Ｃ３）に記載の細胞分離緩衝液の使用。
（Ｄ１）胃がん及び／又は胆嚢・胆管がん固形腫瘍組織から胃がん及び／又は胆嚢・胆管がん固形腫瘍初代細胞を解離するための上記の第５態様の（Ｃ１）に記載のサンプル解離液の使用、
（Ｄ２）胃がん及び／又は胆嚢・胆管がん固形腫瘍組織を保存するための上記の第５態様の（Ｃ２）に記載のサンプル保存液の使用、
（Ｄ３）胆嚢・胆管がん胆汁サンプルから胆嚢・胆管がん胆汁サンプル初代腫瘍細胞を分離するための上記の第５態様の（Ｃ３）に記載の細胞分離緩衝液の使用。
【0088】
本発明の第７態様は、次のいずれかの方法に関する：
（Ｅ１）上記の第４態様に記載の方法のステップ（ａ１）を含む、胃がん及び／又は胆嚢・胆管がん固形腫瘍組織から胃がん及び／又は胆嚢・胆管がん固形腫瘍初代細胞を解離する方法、
（Ｅ２）生体から単離したばかりの胃がん及び／又は胆嚢・胆管がん固形腫瘍組織を上記の第２態様に記載のサンプル保存液に入れて保存し、保存時間は２時間以内であるステップを含む胃がん及び／又は胆嚢・胆管がん固形腫瘍組織の保存方法、
（Ｅ３）上記の第４態様に記載の方法のステップ（ｂ１）を含む、胆嚢・胆管がん胆汁サンプルから胆嚢・胆管がん胆汁サンプル初代腫瘍細胞を分離する方法。
（Ｅ１）上記の第４態様に記載の方法のステップ（ａ１）を含む、胃がん及び／又は胆嚢・胆管がん固形腫瘍組織から胃がん及び／又は胆嚢・胆管がん固形腫瘍初代細胞を解離する方法、
（Ｅ２）生体から単離したばかりの胃がん及び／又は胆嚢・胆管がん固形腫瘍組織を上記の第２態様に記載のサンプル保存液に入れて保存し、保存時間は２時間以内であるステップを含む胃がん及び／又は胆嚢・胆管がん固形腫瘍組織の保存方法、
（Ｅ３）上記の第４態様に記載の方法のステップ（ｂ１）を含む、胆嚢・胆管がん胆汁サンプルから胆嚢・胆管がん胆汁サンプル初代腫瘍細胞を分離する方法。
【0089】
上記の各態様において、前記胃がんは原発性胃がんであってもよく、前記胆嚢・胆管がんは原発性胆嚢・胆管がんであってもよい。
【0090】
上記の各態様において、前記胃がんは胃がん転移病巣であってもよく、前記胆嚢・胆管がんは胆嚢・胆管がん転移病巣であってもよい。
【0091】
上記の各態様において、前記胃がん初代細胞は胃がん固形腫瘍初代細胞であってもよく、前記胆嚢・胆管がん初代細胞は胆嚢・胆管がん固形腫瘍初代細胞又は胆嚢・胆管がん胆汁サンプル初代腫瘍細胞であってもよい。
【0092】
上記の各態様において、前記胃がん初代細胞は胃がん患者の手術サンプルから分離されたものであってもよく、前記胆嚢・胆管がん初代細胞は胆嚢・胆管がん患者の手術サンプル（固形腫瘍サンプル）、穿刺サンプル（固形腫瘍サンプル）又は胆汁サンプルから分離されたものであってもよい。
【0093】
上記の各態様において、前記胃がんの臨床病期分類はＩＩ期、ＩＩＩ期又はＩＶ期（ＴＮＭ分類適用）である。手術サンプルは重量が２０ｍｇを超えているサンプルである。
【0094】
上記の各態様において、前記胆嚢・胆管がんの臨床病期分類はＩＩ期、ＩＩＩ期又はＩＶ期（ＴＮＭ分類適用）である。手術サンプルとして得られた胆嚢・胆管がん固形腫瘍組織標本は重量が２０ｍｇを超えているのが好ましい。胆汁サンプルは１０ｍＬ以上が好ましい。穿刺サンプルは４件以上である。
【0095】
本発明において、前記ＰＢＳはいずれも１×ＰＢＳで、ｐＨが７．３－７．５であってもよい。その具体的な組成は次のとおりである。溶媒は水で、溶質と濃度はＫＨ２ＰＯ４が１４４ｍｇ／Ｌ、ＮａＣｌが９０００ｍｇ／Ｌ、Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏが７９５ｍｇ／Ｌである。
【図面の簡単な説明】
【0096】
【図1】胃がん組織を処理して得た単細胞を示す。スケールバーは１００μｍで、１００倍拡大である。
【図2】胃がん組織の初代培養で得た細胞塊を示す。スケールバーは１００μｍで、１００倍拡大である。
【図3】胃がん組織の初代培養で得た胃がん細胞塊の切片のＨＥ染色図を示す。スケールバーは１００μｍで、２００倍拡大である。
【図4】胃がん組織の初代培養で得たがん細胞塊の免疫蛍光染色図を示す。スケールバーは５０μｍで、２００倍拡大である。
【図5】配列決定結果に基づいてコピー数変異解析（ＣＮＶ）を行い、各世代の胃がん初代細胞培養物（Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５）が、原発胃がん腫瘍組織（Ｔｕｍｏｒ）のコピー数変異状況と非常に一致することを示す。
【図6】本発明で培養した初代胃がん細胞の体外薬物感受性試験結果を示す。
【図7】胆管がん組織を処理して得た単細胞を示す。スケールバーは１００μｍで、１００倍拡大である。
【図8】胆管がん組織の初代培養で得た細胞塊を示す。スケールバーは１００μｍで、１００倍拡大である。
【図9】胆管がん組織の初代培養で得た胆管がん細胞塊の切片のＨＥ染色図を示す。スケールバーは１００μｍで、２００倍拡大である。
【図10】胆管がん組織の初代培養で得たがん細胞塊のパラフィン切片の免疫組織化学染色図を示す。スケールバーは１００μｍで、２００倍拡大である。
【図11】胆管がん胆汁サンプルを処理して得た単細胞を示す。スケールバーは１００μｍで、１００倍拡大である。
【図12】胆管がん胆汁サンプルの初代培養で得た細胞塊を示す。スケールバーは１００μｍで、１００倍拡大である。
【図13】胆管がん胆汁サンプルの初代培養で得た胆管がん細胞塊の切片のＨＥ染色図を示す。スケールバーは１００μｍで、１００倍拡大である。
【図14】胆管がん胆汁サンプルの初代培養で得たがん細胞塊のパラフィン切片の免疫組織化学染色図を示す。スケールバーは５０μｍで、１００倍拡大である。
【図15】本発明のマイクロプレートチップの設計図を示す。
【発明を実施するための形態】
【0097】
下記の実施例は本発明を一層理解させるためのもので、本発明を限定するものではない。以下の実施例に記載の実験方法は、特に明記されていない限り、一般的な方法である。以下の実施例で使用する試験材料は、特に明記されていない限り、生化学試薬店で購入した通常のものである。以下の実施例で定量試験はいずれも３回繰り返され、結果はその平均値である。
【実施例】
【0098】
実施例１：胃がん初代細胞の培養用試薬の調製
１．サンプル保存液（１００ｍＬ）
サンプル保存液（１００ｍＬ）の配合の詳細は表１に示すとおりである。
サンプル保存液を調製した後、１５ｍＬ遠心管に分注して、各管は５ｍＬであった。分注後は４℃で１ヶ月保存することができる。
１．サンプル保存液（１００ｍＬ）
サンプル保存液（１００ｍＬ）の配合の詳細は表１に示すとおりである。
【0099】
２．サンプル洗浄液（１００ｍＬ）
サンプル洗浄液（１００ｍＬ）の配合の詳細は表２に示すとおりである。
サンプル洗浄液は直前に調製する必要がある。
サンプル洗浄液（１００ｍＬ）の配合の詳細は表２に示すとおりである。
【0100】
【0101】
表３におけるコラゲナーゼ原液の調製は表４－表６に示すとおりである。
１０×コラゲナーゼＩ原液を調製した後、１．５ｍＬ無菌遠心管に分注して、各管は１ｍＬであった。当該原液は－２０℃で長期保存することができる。
１０×コラゲナーゼＩＩ原液を調製した後、１．５ｍＬ無菌遠心管に分注して、各管は１ｍＬであった。当該原液は－２０℃で長期保存することができる。
２０×コラゲナーゼＩＶ原液を調製した後、１．５ｍＬ無菌遠心管に分注して、各管は１ｍＬであった。当該原液は－２０℃で長期保存することができる。
【0102】
表４、表５及び表６において、プロテアーゼの酵素活性によってコラゲナーゼ（前記コラゲナーゼＩ又は前記コラゲナーゼＩＶ）の単位Ｕを定義する。即ち、３７℃とｐＨ７．５の条件下で、１Ｕのプロテアーゼでコラゲナーゼ（前記コラゲナーゼＩ又は前記コラゲナーゼＩＶ）を５時間処理すると、１μｍｏｌのＬ－ロイシンが放出される。
【0103】
４．細胞消化液（１０ｍＬ）
細胞消化液（１０ｍＬ）の配合の詳細は表７に示すとおりである。
細胞消化液は直前調製。
細胞消化液（１０ｍＬ）の配合の詳細は表７に示すとおりである。
【0104】
５．消化停止液（１００ｍＬ）
消化停止液（１００ｍＬ）の配合の詳細は表８に示すとおりである。
調製した消化停止液は、４℃で１ヶ月保存することができる。
消化停止液（１００ｍＬ）の配合の詳細は表８に示すとおりである。
【0105】
６．胃がん固形腫瘍初代細胞培地（１００ｍＬ）
胃がん固形腫瘍初代細胞培地（１００ｍＬ）の配合の詳細は表９に示すとおりである。
胃がん固形腫瘍初代細胞培地（１００ｍＬ）の配合の詳細は表９に示すとおりである。
【0106】
胃がん固形腫瘍初代細胞培地を調製した後、０．２２μｍシリンジフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＳＬＧＰ０３３ＲＳ）で濾過して除菌すると、４℃で２週間保存することができる。
【0107】
表９におけるヒト組換えタンパク質原液の調製は表１１－表１６、ＳＢ２０２１９０原液の調製は表１７、Ａ８３－０１原液の調製は表１８、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン（Ｎ－ａｃｅｔｙｌ－Ｌ－ｃｙｓｔｅｉｎｅ）原液の調製は表１９、ニコチンアミド（Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ）原液の調製は表２０、コルチゾール原液の調製は表２１、ガストリン原液の調製は表２２、Ｙ－２７６３２原液の調製は表２３に示すとおりである。前記原液の調製に使用する１００×ＢＳＡ溶液の調製は表１０に示すとおりである。
１００×ＢＳＡ溶液は直前調製。
１０００×ヒト組換えタンパク質ＥＧＦ原液を調製した後、１．５ｍＬ無菌遠心管に分注し、当該原液は－８０℃で長期保存することができる。
１０００×ヒト組換えタンパク質ｂＦＧＦ原液を調製した後、１．５ｍＬ無菌遠心管に分注し、当該原液は－８０℃で長期保存することができる。
１０００×ヒト組換えタンパク質ＨＧＦ原液を調製した後、１．５ｍＬ無菌遠心管に分注し、当該原液は－８０℃で長期保存することができる。
１０００×ヒト組換えタンパク質ＦＧＦ－１０原液を調製した後、１．５ｍＬ無菌遠心管に分注し、当該原液は－８０℃で長期保存することができる。
１０００×ヒト組換えタンパク質Ｗｎｔ－３ａ原液を調製した後、１．５ｍＬ無菌遠心管に分注し、当該原液は－８０℃で長期保存することができる。
１０００×ヒト組換えタンパク質Ｎｏｇｇｉｎ原液を調製した後、１．５ｍＬ無菌遠心管に分注し、当該原液は－８０℃で長期保存することができる。
１０００×ＳＢ２０２１９０原液を調製した後、０．５ｍＬ無菌遠心管に分注し、当該原液は－２０℃で長期保存することができる。
１０００×Ａ８３－０１原液を調製した後、０．５ｍＬ無菌遠心管に分注し、当該原液は－２０℃で長期保存することができる。
１０００×Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン（Ｎ－ａｃｅｔｙｌ－Ｌ－ｃｙｓｔｅｉｎｅ）原液を調製した後、０．５ｍＬ無菌遠心管に分注し、当該原液は－２０℃で長期保存することができる。
１０００×ニコチンアミド（Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ）原液を調製した後、０．５ｍＬ無菌遠心管に分注し、当該原液は－２０℃で長期保存することができる。
１０００×コルチゾール原液を調製した後、１．５ｍＬ無菌遠心管に分注し、当該原液は－２０℃で長期保存することができる。
１０００×ガストリン原液を調製した後、０．５ｍＬ無菌遠心管に分注し、当該原液は－２０℃で長期保存することができる。
１０００×Ｙ－２７６３２原液を調製した後、０．５ｍＬ無菌遠心管に分注し、当該原液は－２０℃で長期保存することができる。
【0108】
７．細胞凍結液
細胞凍結液の配合の詳細は表２４に示すとおりである。
細胞凍結液は直前調製。
細胞凍結液の配合の詳細は表２４に示すとおりである。
【0109】
表２４において、１％メチルセルロース溶液の調製は表２５に示すとおりである。
調製した１％メチルセルロース溶液を４℃で長期保存することができる。
【0110】
８． １％ＣＹＴＯＰ溶液
調製した１％ＣＹＴＯＰ溶液は、常温下で長期保存することができる。
【0111】
実施例２：胃がんの手術後標本の取得
１．医学倫理審査を受けた上、三甲医院（中国で最高クラスの病院）から協力をいただいた。
２．主治医は医療ガイドラインに規定された臨床適応症に基づいて患者を選択して群に組み入れ、手術中の臨床適応症に基づいて体外培養用の適切なサンプルを選択し、サンプルの選択基準は次のとおりである。病理学的病期分類がＩＩ期、ＩＩＩ期又はＩＶ期の原発性胃がん、病理学的分類上の様々な胃がん又は胃がん転移病巣であり、かつ胃がん手術標本の重量が２０ｍｇを超えているサンプルであった。
３．主治医は患者の性別、年齢、病歴、家族歴、喫煙歴、病理学的病期と分類、臨床診断などの基本的な臨床情報を提供した。患者の氏名、身分証番号など患者のプライバシーに関連する情報は提供せず、所定仕様の実験番号を代用し、実験番号の命名規則は採取サンプルの８桁数字日付＋患者入院番号の後４桁であった。例えば、２０１８年１月１日に提供したサンプルで、患者の入院番号がＴ００１５１２７６５の場合は、サンプル実験番号は２０１８０１０１２７６５であった。
４．手術中に外科医は、手術室の無菌環境で新鮮な標本を採取して、予め用意しておいたサンプル保存液（実施例１参照）に入れた。サンプルは生体から単離した後、氷上で一時保存し、２時間以内に実験室に送って次の操作を行う。
１．医学倫理審査を受けた上、三甲医院（中国で最高クラスの病院）から協力をいただいた。
２．主治医は医療ガイドラインに規定された臨床適応症に基づいて患者を選択して群に組み入れ、手術中の臨床適応症に基づいて体外培養用の適切なサンプルを選択し、サンプルの選択基準は次のとおりである。病理学的病期分類がＩＩ期、ＩＩＩ期又はＩＶ期の原発性胃がん、病理学的分類上の様々な胃がん又は胃がん転移病巣であり、かつ胃がん手術標本の重量が２０ｍｇを超えているサンプルであった。
３．主治医は患者の性別、年齢、病歴、家族歴、喫煙歴、病理学的病期と分類、臨床診断などの基本的な臨床情報を提供した。患者の氏名、身分証番号など患者のプライバシーに関連する情報は提供せず、所定仕様の実験番号を代用し、実験番号の命名規則は採取サンプルの８桁数字日付＋患者入院番号の後４桁であった。例えば、２０１８年１月１日に提供したサンプルで、患者の入院番号がＴ００１５１２７６５の場合は、サンプル実験番号は２０１８０１０１２７６５であった。
４．手術中に外科医は、手術室の無菌環境で新鮮な標本を採取して、予め用意しておいたサンプル保存液（実施例１参照）に入れた。サンプルは生体から単離した後、氷上で一時保存し、２時間以内に実験室に送って次の操作を行う。
【0112】
実施例３：胃がん組織サンプルの解離前処理
以下のステップの操作は氷上で行い、１０分以内に完了する必要がある。
以下の操作で使用する手術器具は、全ては予め高温と高圧下で滅菌し、熱風乾燥した上で使用する。
以下のステップの操作は氷上で行い、１０分以内に完了する必要がある。
以下の操作で使用する手術器具は、全ては予め高温と高圧下で滅菌し、熱風乾燥した上で使用する。
【0113】
１．サンプルを秤量した。
２．７５％（体積パーセント含有量）エタノールにより、サンプルの表面を１０－３０秒間洗浄した。
３．サンプル洗浄液でサンプルを１０回洗浄し、無菌のＰＢＳ溶液でサンプルを５回洗浄した。
４．眼科用ハサミ、眼科用ピンセット、メスなどの器具を用いて、入念にサンプルから脂肪組織、結合組織、壊死組織を剥離した。
２．７５％（体積パーセント含有量）エタノールにより、サンプルの表面を１０－３０秒間洗浄した。
３．サンプル洗浄液でサンプルを１０回洗浄し、無菌のＰＢＳ溶液でサンプルを５回洗浄した。
４．眼科用ハサミ、眼科用ピンセット、メスなどの器具を用いて、入念にサンプルから脂肪組織、結合組織、壊死組織を剥離した。
【0114】
実施例４：胃がん組織サンプルの解離
以下の実施例で使用する手術器具は、全ては予め高温と高圧下で滅菌し、熱風乾燥した上で使用する。
以下の実施例で使用する手術器具は、全ては予め高温と高圧下で滅菌し、熱風乾燥した上で使用する。
【0115】
１．眼科用ハサミで組織を切断して１ｍｍ３程度の小片を得た。
２．１ｍｇの組織当たり０．１ｍＬのサンプル解離液（実施例１参照）の使用量で、予め３７℃に加熱したサンプル解離液で切断された組織サンプルを処理し、３７℃でサンプル解離を行い、解離時間は１５分－３時間であった。１５分ごとに顕微鏡でサンプルの解離状況を観察し、多くの単細胞が観察されるまでこれを続けた。
３．１０倍の体積の消化停止液（実施例１参照）で解離反応を停止させて、細胞懸濁液を収集した。
４．４０μｍの無菌のセルストレーナーで細胞懸濁液を濾過して、組織残片と接着細胞を除去した。
５．８００ｇで室温下で１０分間遠心分離して、上澄みを廃棄した。
６．５ｍＬの無菌のＰＢＳで細胞を再懸濁させ、８００ｇで室温下で１０分間遠心分離して、上澄みを廃棄した。
７．胃がん固形腫瘍初代細胞培地（実施例１参照）で細胞ペレットを再懸濁させて、顕微鏡で細胞の状態を観察し、細胞を計数した。
２．１ｍｇの組織当たり０．１ｍＬのサンプル解離液（実施例１参照）の使用量で、予め３７℃に加熱したサンプル解離液で切断された組織サンプルを処理し、３７℃でサンプル解離を行い、解離時間は１５分－３時間であった。１５分ごとに顕微鏡でサンプルの解離状況を観察し、多くの単細胞が観察されるまでこれを続けた。
３．１０倍の体積の消化停止液（実施例１参照）で解離反応を停止させて、細胞懸濁液を収集した。
４．４０μｍの無菌のセルストレーナーで細胞懸濁液を濾過して、組織残片と接着細胞を除去した。
５．８００ｇで室温下で１０分間遠心分離して、上澄みを廃棄した。
６．５ｍＬの無菌のＰＢＳで細胞を再懸濁させ、８００ｇで室温下で１０分間遠心分離して、上澄みを廃棄した。
７．胃がん固形腫瘍初代細胞培地（実施例１参照）で細胞ペレットを再懸濁させて、顕微鏡で細胞の状態を観察し、細胞を計数した。
【0116】
図１に示すように、解離して得た単細胞懸濁液には、腫瘍細胞の他に、様々な種類の細胞、例えば、赤血球、リンパ球、線維細胞などが多く混在していた。本方法の１つの利点は、後続の培養過程で、大量に増殖するのはがん細胞だけで、他の細胞の比率が徐々に低減しあるいは消失することで、最終的に純度の高い胃がん初代腫瘍細胞を得ることである。
【0117】
実施例５：胃がん初代細胞培養
１．低接着表面（ｌｏｗ－ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ－ｓｕｒｆａｃｅ）を利用して胃がん初代細胞を懸濁培養し、使用する培地は実施例１の胃がん固形腫瘍初代細胞培地（ヒト組換えタンパク質ＥＧＦの最終濃度は５０ｎｇ／ｍＬ、ヒト組換えタンパク質ｂＦＧＦの最終濃度は２０ｎｇ／ｍＬ、ヒト組換えタンパク質ＨＧＦの最終濃度は２０ｎｇ／ｍＬ、ヒト組換えタンパク質ＦＧＦ－１０の最終濃度は２０ｎｇ／ｍＬ、ヒト組換えタンパク質Ｗｎｔ－３ａの最終濃度は２５０ｎｇ／ｍＬ、ヒト組換えタンパク質Ｎｏｇｇｉｎの最終濃度は１００ｎｇ／ｍＬ、ＳＢ２０２１９０の最終濃度は１０μＭ、Ａ８３－０１の最終濃度は０．５μＭ、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン（Ｎ－ａｃｅｔｙｌ－Ｌ－ｃｙｓｔｅｉｎｅ）の最終濃度は１ｍＭ、ニコチンアミド（Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ）の最終濃度は１０ｍＭ、コルチゾールの最終濃度は２５ｎｇ／ｍＬ、Ｙ－２７６３２の最終濃度は１０μＭ）であり、例えば、６ウェルプレートの場合は、１ウェル当たり１０６個の細胞の密度で播種し、３７℃と５％ＣＯ２の条件下で細胞培養インキュベータにおいて培養した。
２．毎日に細胞の状態を観察し、３日ごとに培地を交換し、細胞が直径８０μｍほどの塊を形成するまでこれを続けた。
１．低接着表面（ｌｏｗ－ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ－ｓｕｒｆａｃｅ）を利用して胃がん初代細胞を懸濁培養し、使用する培地は実施例１の胃がん固形腫瘍初代細胞培地（ヒト組換えタンパク質ＥＧＦの最終濃度は５０ｎｇ／ｍＬ、ヒト組換えタンパク質ｂＦＧＦの最終濃度は２０ｎｇ／ｍＬ、ヒト組換えタンパク質ＨＧＦの最終濃度は２０ｎｇ／ｍＬ、ヒト組換えタンパク質ＦＧＦ－１０の最終濃度は２０ｎｇ／ｍＬ、ヒト組換えタンパク質Ｗｎｔ－３ａの最終濃度は２５０ｎｇ／ｍＬ、ヒト組換えタンパク質Ｎｏｇｇｉｎの最終濃度は１００ｎｇ／ｍＬ、ＳＢ２０２１９０の最終濃度は１０μＭ、Ａ８３－０１の最終濃度は０．５μＭ、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン（Ｎ－ａｃｅｔｙｌ－Ｌ－ｃｙｓｔｅｉｎｅ）の最終濃度は１ｍＭ、ニコチンアミド（Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ）の最終濃度は１０ｍＭ、コルチゾールの最終濃度は２５ｎｇ／ｍＬ、Ｙ－２７６３２の最終濃度は１０μＭ）であり、例えば、６ウェルプレートの場合は、１ウェル当たり１０６個の細胞の密度で播種し、３７℃と５％ＣＯ２の条件下で細胞培養インキュベータにおいて培養した。
２．毎日に細胞の状態を観察し、３日ごとに培地を交換し、細胞が直径８０μｍほどの塊を形成するまでこれを続けた。
【0118】
図２に示すように、３－１０日間の培養後、がん細胞が大量に増殖して直径８０μｍの細胞塊を形成し、腫瘍細胞の総数は１０７を超えており、他の種類の細胞の数は明らかに低減しあるいは消失していた。本方法は大量のサンプルで検証したところ、胃がん初代腫瘍細胞の体外培養の成功率が８０％に達していた。
【0119】
実施例６：胃がん初代細胞の継代
１．培養皿から細胞塊を収集し、８００ｇで室温下で１０分間遠心分離して、上澄みを廃棄した。
２．無菌のＰＢＳ溶液で細胞塊を洗浄し、８００ｇで室温下で１０分間遠心分離して、上澄みを廃棄した。
３．細胞消化液（実施例１参照）で細胞塊を再懸濁させて、３７℃で消化した。５分ごとに顕微鏡で細胞塊の消化の状況を観察し、細胞塊が単細胞になるまで消化した。
４．１０倍の体積の消化停止液（実施例１参照）で解離反応を停止させて、細胞懸濁液を収集した。
５．８００ｇで室温下で１０分間遠心分離して、上澄みを廃棄した。
６．胃がん固形腫瘍初代細胞培地で細胞ペレットを再懸濁させて、細胞の数をカウントした。
７．低接着表面（ｌｏｗ－ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ－ｓｕｒｆａｃｅ）を利用して胃がん初代細胞を培養し、使用する培地は実施例１の胃がん固形腫瘍初代細胞培地であり、例えば、６ウェルプレートの場合は、１ウェル当たり１０６個の細胞の密度で播種し、３７℃と５％ＣＯ２の条件下で細胞培養インキュベータにおいて培養した。
１．培養皿から細胞塊を収集し、８００ｇで室温下で１０分間遠心分離して、上澄みを廃棄した。
２．無菌のＰＢＳ溶液で細胞塊を洗浄し、８００ｇで室温下で１０分間遠心分離して、上澄みを廃棄した。
３．細胞消化液（実施例１参照）で細胞塊を再懸濁させて、３７℃で消化した。５分ごとに顕微鏡で細胞塊の消化の状況を観察し、細胞塊が単細胞になるまで消化した。
４．１０倍の体積の消化停止液（実施例１参照）で解離反応を停止させて、細胞懸濁液を収集した。
５．８００ｇで室温下で１０分間遠心分離して、上澄みを廃棄した。
６．胃がん固形腫瘍初代細胞培地で細胞ペレットを再懸濁させて、細胞の数をカウントした。
７．低接着表面（ｌｏｗ－ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ－ｓｕｒｆａｃｅ）を利用して胃がん初代細胞を培養し、使用する培地は実施例１の胃がん固形腫瘍初代細胞培地であり、例えば、６ウェルプレートの場合は、１ウェル当たり１０６個の細胞の密度で播種し、３７℃と５％ＣＯ２の条件下で細胞培養インキュベータにおいて培養した。
【0120】
実施例７：胃がん初代細胞の凍結保存
懸濁培養した胃がん初代細胞は２－３回の継代増殖された後、凍結保存を行うことができる。
１．培養皿から細胞塊を収集し、８００ｇで室温下で１０分間遠心分離して、上澄みを廃棄した。
２．無菌のＰＢＳ溶液で細胞塊を洗浄し、８００ｇで室温下で１０分間遠心分離して、上澄みを廃棄した。
３．細胞消化液（実施例１参照）で細胞塊を再懸濁させて、３７℃で消化した。１５分ごとに顕微鏡で細胞塊の消化の状況を観察し、細胞塊が単細胞になるまで消化した。
４．１０倍の体積の消化停止液（実施例１参照）で解離反応を停止させて、細胞懸濁液を収集し、細胞を計数した。
５．８００ｇで室温下で１０分間遠心分離して、上澄みを廃棄した。
６．細胞凍結液（実施例１参照）で、１０６／ｍＬの密度で細胞ペレットを再懸濁させ、２ｍＬ凍結保存管に各管１ｍＬで細胞懸濁液を移して、勾配冷却ボックスで一晩凍結保存した後、液体窒素に移して長期保存しておいた。
懸濁培養した胃がん初代細胞は２－３回の継代増殖された後、凍結保存を行うことができる。
１．培養皿から細胞塊を収集し、８００ｇで室温下で１０分間遠心分離して、上澄みを廃棄した。
２．無菌のＰＢＳ溶液で細胞塊を洗浄し、８００ｇで室温下で１０分間遠心分離して、上澄みを廃棄した。
３．細胞消化液（実施例１参照）で細胞塊を再懸濁させて、３７℃で消化した。１５分ごとに顕微鏡で細胞塊の消化の状況を観察し、細胞塊が単細胞になるまで消化した。
４．１０倍の体積の消化停止液（実施例１参照）で解離反応を停止させて、細胞懸濁液を収集し、細胞を計数した。
５．８００ｇで室温下で１０分間遠心分離して、上澄みを廃棄した。
６．細胞凍結液（実施例１参照）で、１０６／ｍＬの密度で細胞ペレットを再懸濁させ、２ｍＬ凍結保存管に各管１ｍＬで細胞懸濁液を移して、勾配冷却ボックスで一晩凍結保存した後、液体窒素に移して長期保存しておいた。
【0121】
実施例８：胃がん初代細胞の蘇生
液体窒素に保存していた胃がん初代細胞を蘇生させることができる。
１．予め５分前に３７℃の無菌水を用意した。
２．凍結保存管を液体窒素から取り出して、３７℃の無菌水において細胞を迅速に融解した。
３．８００ｇで室温下で１０分間遠心分離して、上澄みを廃棄した。
４．胃がん固形腫瘍初代細胞培地（実施例１参照）で細胞ペレットを再懸濁させて、低接着表面を利用して胃がん初代細胞を培養し、各管の細胞を蘇生させて３．５ｃｍ培養皿に移し、３７℃と５％ＣＯ２の条件下で細胞培養インキュベータにおいて培養した。
液体窒素に保存していた胃がん初代細胞を蘇生させることができる。
１．予め５分前に３７℃の無菌水を用意した。
２．凍結保存管を液体窒素から取り出して、３７℃の無菌水において細胞を迅速に融解した。
３．８００ｇで室温下で１０分間遠心分離して、上澄みを廃棄した。
４．胃がん固形腫瘍初代細胞培地（実施例１参照）で細胞ペレットを再懸濁させて、低接着表面を利用して胃がん初代細胞を培養し、各管の細胞を蘇生させて３．５ｃｍ培養皿に移し、３７℃と５％ＣＯ２の条件下で細胞培養インキュベータにおいて培養した。
【0122】
実施例９：胃がん初代細胞のＨＥ染色同定
以下の実施例で使用する試薬の説明である。
ＨＥ染色キット（北京索莱宝生物科技有限公司＃Ｇ１１２０）、
カチオン脱落防止スライドガラス（北京中杉金橋生物科技有限公司）、
キシレン、メタノール、アセトン（北京化学試薬公司、分析用純度）、
中性樹脂接着剤（北京益利精細化学品有限公司）。
以下の実施例で使用する試薬の説明である。
ＨＥ染色キット（北京索莱宝生物科技有限公司＃Ｇ１１２０）、
カチオン脱落防止スライドガラス（北京中杉金橋生物科技有限公司）、
キシレン、メタノール、アセトン（北京化学試薬公司、分析用純度）、
中性樹脂接着剤（北京益利精細化学品有限公司）。
【0123】
１．８００ｇで遠心分離して、実施例１の胃がん固形腫瘍初代細胞培地（ヒト組換えタンパク質ＥＧＦの最終濃度は２０ｎｇ／ｍＬ、ヒト組換えタンパク質ｂＦＧＦの最終濃度は２０ｎｇ／ｍＬ、ヒト組換えタンパク質ＨＧＦの最終濃度は２０ｎｇ／ｍＬ、ヒト組換えタンパク質ＦＧＦ－１０の最終濃度は２０ｎｇ／ｍＬ、ヒト組換えタンパク質Ｗｎｔ－３ａの最終濃度は２００ｎｇ／ｍＬ、ヒト組換えタンパク質Ｎｏｇｇｉｎの最終濃度は１００ｎｇ／ｍＬ、ＳＢ２０２１９０の最終濃度は５μＭ、Ａ８３－０１の最終濃度は１μＭ、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン（Ｎ－ａｃｅｔｙｌ－Ｌ－ｃｙｓｔｅｉｎｅ）の最終濃度は１ｍＭ、ニコチンアミド（Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ）の最終濃度は１０ｍＭ、コルチゾールの最終濃度は２５ｎｇ／ｍＬ、Ｙ－２７６３２の最終濃度は１０μＭ）で培養した胃がん固形腫瘍初代細胞塊を収集して、４％パラホルムアルデヒドで固定した。細胞ペレットをパラフィンで包埋して切片にし、切片の厚さは５μｍであった。
２．パラフィン切片をキシレン溶液に浸漬して室温下で５分間インキュベートして脱蝋し、これを３回繰り返した後、脱イオン水で切片を２回洗い流した。
３．切片を無水エタノールに浸漬して室温下で１０分間インキュベートし、これを２回繰り返した。
４．切片を９５％エタノールに浸漬して室温下で１０分間インキュベートして、これを２回繰り返した後、脱イオン水で切片を２回洗い流した。
５．スライドガラス上の水分が少し減ったら１００μＬのヘマトキシリン染色液を加えて１分間染色した。
６．ヘマトキシリン染色液を吸い取って、水道水でスライドガラスを３回洗浄した。
７．１００μＬの分化液を滴加して１分間、分化させた。
８．分化液を吸い取って、水道水でスライドガラスを２回、蒸留水でスライドガラスを１回洗浄した。
９．スライドガラスの表面の水分を吸い取って、２００μＬのエオシン染色液を滴加して４０秒間染色した。
１０．エオシン染色液を吸い取って、それぞれ７５％、８０％、９０％、１００％のエタノールでリンスして、それぞれ２０秒間、２０秒間、４０秒間、４０秒間脱水した。
１１．エタノールを乾燥させた後、５０μＬのキシレンを滴加して細胞を透過化させた。
１２．キシレンを完全に乾燥させた後、１滴の中性樹脂接着剤を滴加して、カバーガラスで封止し、顕微鏡で観察、撮影した。
２．パラフィン切片をキシレン溶液に浸漬して室温下で５分間インキュベートして脱蝋し、これを３回繰り返した後、脱イオン水で切片を２回洗い流した。
３．切片を無水エタノールに浸漬して室温下で１０分間インキュベートし、これを２回繰り返した。
４．切片を９５％エタノールに浸漬して室温下で１０分間インキュベートして、これを２回繰り返した後、脱イオン水で切片を２回洗い流した。
５．スライドガラス上の水分が少し減ったら１００μＬのヘマトキシリン染色液を加えて１分間染色した。
６．ヘマトキシリン染色液を吸い取って、水道水でスライドガラスを３回洗浄した。
７．１００μＬの分化液を滴加して１分間、分化させた。
８．分化液を吸い取って、水道水でスライドガラスを２回、蒸留水でスライドガラスを１回洗浄した。
９．スライドガラスの表面の水分を吸い取って、２００μＬのエオシン染色液を滴加して４０秒間染色した。
１０．エオシン染色液を吸い取って、それぞれ７５％、８０％、９０％、１００％のエタノールでリンスして、それぞれ２０秒間、２０秒間、４０秒間、４０秒間脱水した。
１１．エタノールを乾燥させた後、５０μＬのキシレンを滴加して細胞を透過化させた。
１２．キシレンを完全に乾燥させた後、１滴の中性樹脂接着剤を滴加して、カバーガラスで封止し、顕微鏡で観察、撮影した。
【0124】
図３は体外で培養した胃がん初代腫瘍細胞のＨＥ染色の効果図を示している。これらの細胞はほとんど核細胞質比が高く、核が濃く染まり、核内にクロマチンが凝集しており、多核の形態で、細胞の大きさが不均一であるなどのがん細胞の特徴を有し、数十から数百の腫瘍細胞が凝集して一定の立体構造を有する腫瘍細胞塊を形成していることが示された。
【0125】
実施例１０：胃がん初代細胞の免疫蛍光染色同定
以下の実施例で使用する試薬の説明である。
パラホルムアルデヒド（北京化学試薬公司、分析用純度）（超純水でパラホルムアルデヒド粉末を溶解して、４％（４ｇ／１００ｍＬ）パラホルムアルデヒド溶液を調製した。）、
メタノール、ジメチルスルホキシド（北京化学試薬公司、分析用純度）、
過酸化水素水（北京化学試薬公司、３５％）、
メタノール、ジメチルスルホキシド、３５％過酸化水素水を４：４：１（体積比）で混合して調製したDANCLANリンス液、
ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ＃Ａ１９３３）（ＰＢＳ溶液でウシ血清アルブミンを溶解して、３％（３ｇ／１００ｍＬ）ＢＳＡ溶液を調製した。）、
免疫蛍光一次抗体（Ａｂｃａｍ＃ａｂ１７１３９）、
免疫蛍光二次抗体（ＣＳＴ＃４４０８）、
Ｈｏｅｃｈｓｔ染色液（北京索莱宝生物科技有限公司＃Ｃ００２１）。
以下の実施例で使用する試薬の説明である。
パラホルムアルデヒド（北京化学試薬公司、分析用純度）（超純水でパラホルムアルデヒド粉末を溶解して、４％（４ｇ／１００ｍＬ）パラホルムアルデヒド溶液を調製した。）、
メタノール、ジメチルスルホキシド（北京化学試薬公司、分析用純度）、
過酸化水素水（北京化学試薬公司、３５％）、
メタノール、ジメチルスルホキシド、３５％過酸化水素水を４：４：１（体積比）で混合して調製したDANCLANリンス液、
ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ＃Ａ１９３３）（ＰＢＳ溶液でウシ血清アルブミンを溶解して、３％（３ｇ／１００ｍＬ）ＢＳＡ溶液を調製した。）、
免疫蛍光一次抗体（Ａｂｃａｍ＃ａｂ１７１３９）、
免疫蛍光二次抗体（ＣＳＴ＃４４０８）、
Ｈｏｅｃｈｓｔ染色液（北京索莱宝生物科技有限公司＃Ｃ００２１）。
【0126】
次の手順で、実施例１の胃がん固形腫瘍初代細胞培地（ヒト組換えタンパク質ＥＧＦの最終濃度は５０ｎｇ／ｍＬ、ヒト組換えタンパク質ｂＦＧＦの最終濃度は２５ｎｇ／ｍＬ、ヒト組換えタンパク質ＨＧＦの最終濃度は２５ｎｇ／ｍＬ、ヒト組換えタンパク質ＦＧＦ－１０の最終濃度は２５ｎｇ／ｍＬ、ヒト組換えタンパク質Ｗｎｔ－３ａの最終濃度は３００ｎｇ／ｍＬ、ヒト組換えタンパク質Ｎｏｇｇｉｎの最終濃度は２００ｎｇ／ｍＬ、ＳＢ２０２１９０の最終濃度は１０μＭ、Ａ８３－０１の最終濃度は０．５μＭ、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン（Ｎ－ａｃｅｔｙｌ－Ｌ－ｃｙｓｔｅｉｎｅ）の最終濃度は１ｍＭ、ニコチンアミド（Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ）の最終濃度は１０ｍＭ、コルチゾールの最終濃度は２５ｎｇ／ｍＬ、Ｙ－２７６３２の最終濃度は１０μＭである）で培養した胃がん細胞塊に免疫蛍光染色を行って、一次抗体がＣＫ８＋ＣＫ１８で、これによって上皮由来の細胞を特徴づけていた。
【0127】
１．培養皿から細胞塊を収集し、ＰＢＳで１回洗浄した後、４％パラホルムアルデヒドで細胞ペレットを再懸濁させて、４℃で一晩固定した。
２．８００ｇで遠心分離して上澄みを廃棄し、予め冷却したメタノール溶液で細胞ペレットを再懸濁させて、氷上で１時間静置した。
３．８００ｇで遠心分離して上澄みを廃棄し、DANCLANリンス液で細胞ペレットを再懸濁させて、室温下で２時間静置した。
４．８００ｇで遠心分離して上澄みを廃棄し、それぞれ７５％、５０％、２５％（体積パーセント含有量）のＰＢＳ希釈メタノール溶液で細胞を洗浄し、各回は１０分であった。
５．８００ｇで遠心分離して上澄みを廃棄し、３％ＢＳＡ溶液で細胞ペレットを懸濁させて、室温下で２時間ブロッキングした。
６．１：５００の比率に３％ＢＳＡ溶液で一次抗体を希釈し、抗体希釈液（３％ＢＳＡ溶液）で細胞ペレットを再懸濁させて、４℃で一次抗体に一晩保持していた。
７．８００ｇで遠心分離して上澄みを廃棄し、ＰＢＳ溶液で細胞ペレットを５回洗浄し、各回は２０分であった。
８．１：２０００の比率に３％ＢＳＡ溶液で二次抗体を希釈し、抗体希釈液（３％ＢＳＡ溶液）で細胞ペレットを再懸濁させて、室温下で二次抗体に２時間保持していた。
９．８００ｇで遠心分離して上澄みを廃棄し、ＰＢＳ溶液で細胞ペレットを５回洗浄し、各回は２０分であった。
１０．１：１００の体積比で１００×Ｈｏｅｃｈｓｔ染色液を加えて、室温下で２０分間染色した。
１１．ＰＢＳ溶液で細胞ペレットを２回洗浄し、各回は１０分であった。共焦点レーザー顕微鏡を用いて細胞塊の染色状況を観察した。
２．８００ｇで遠心分離して上澄みを廃棄し、予め冷却したメタノール溶液で細胞ペレットを再懸濁させて、氷上で１時間静置した。
３．８００ｇで遠心分離して上澄みを廃棄し、DANCLANリンス液で細胞ペレットを再懸濁させて、室温下で２時間静置した。
４．８００ｇで遠心分離して上澄みを廃棄し、それぞれ７５％、５０％、２５％（体積パーセント含有量）のＰＢＳ希釈メタノール溶液で細胞を洗浄し、各回は１０分であった。
５．８００ｇで遠心分離して上澄みを廃棄し、３％ＢＳＡ溶液で細胞ペレットを懸濁させて、室温下で２時間ブロッキングした。
６．１：５００の比率に３％ＢＳＡ溶液で一次抗体を希釈し、抗体希釈液（３％ＢＳＡ溶液）で細胞ペレットを再懸濁させて、４℃で一次抗体に一晩保持していた。
７．８００ｇで遠心分離して上澄みを廃棄し、ＰＢＳ溶液で細胞ペレットを５回洗浄し、各回は２０分であった。
８．１：２０００の比率に３％ＢＳＡ溶液で二次抗体を希釈し、抗体希釈液（３％ＢＳＡ溶液）で細胞ペレットを再懸濁させて、室温下で二次抗体に２時間保持していた。
９．８００ｇで遠心分離して上澄みを廃棄し、ＰＢＳ溶液で細胞ペレットを５回洗浄し、各回は２０分であった。
１０．１：１００の体積比で１００×Ｈｏｅｃｈｓｔ染色液を加えて、室温下で２０分間染色した。
１１．ＰＢＳ溶液で細胞ペレットを２回洗浄し、各回は１０分であった。共焦点レーザー顕微鏡を用いて細胞塊の染色状況を観察した。
【0128】
図４は体外培養した胃がん初代腫瘍細胞塊の免疫蛍光染色の効果図を示している。細胞塊を形成している細胞がすべてＣＫ８／ＣＫ１８陽性で、上皮に由来していることから、本方法の培養により得たのは純度の高い腫瘍細胞であることが証明された。２０個の胃がんサンプル初代培養物の免疫蛍光染色同定を行ったところ、本方法で得た胃がん初代細胞において、腫瘍細胞の比率が７０－９３％に達しているという統計結果であった（表２７）。
胃がんサンプル初代培養物の免疫蛍光染色同定
胃がんサンプル初代培養物の免疫蛍光染色同定
【0129】
実施例１１：胃がん初代細胞培養物と原発腫瘍組織
以下の実施例に記載のＤＮＡ抽出手順は天根生化科技（北京）有限公司による血液／組織／細胞ゲノム抽出キット（ＤＰ３０４）によって行われた。
以下の実施例に記載の文庫構築手順はＮＥＢ ＤＮＡ配列決定文庫構築キット（Ｅ７６４５）によって行われた。
以下の実施例に記載のハイスループット配列決定プロセスは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ Ｘ－ｔｅｎシーケンスプラットフォームによって行われた。
以下の実施例に記載のＤＮＡ抽出手順は天根生化科技（北京）有限公司による血液／組織／細胞ゲノム抽出キット（ＤＰ３０４）によって行われた。
以下の実施例に記載の文庫構築手順はＮＥＢ ＤＮＡ配列決定文庫構築キット（Ｅ７６４５）によって行われた。
以下の実施例に記載のハイスループット配列決定プロセスは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ Ｘ－ｔｅｎシーケンスプラットフォームによって行われた。
【0130】
１．胃がん固形腫瘍サンプルを採取し、体外培養を行う前に胃がん固形腫瘍サンプルを１０ｍｇ採取してＤＮＡ抽出、文庫構築及び全ゲノムハイスループット配列決定（ＷＧＳ）を行い、配列決定深さは３００×で、残りの固形腫瘍サンプルは胃がん初代細胞の体外培養に用いた。
２．胃がん組織を処理した後、実施例１の胃がん固形腫瘍初代細胞培地（ヒト組換えタンパク質ＥＧＦの最終濃度は５０ｎｇ／ｍＬ、ヒト組換えタンパク質ｂＦＧＦの最終濃度は２０ｎｇ／ｍＬ、ヒト組換えタンパク質ＨＧＦの最終濃度は２０ｎｇ／ｍＬ、ヒト組換えタンパク質ＦＧＦ－１０の最終濃度は２０ｎｇ／ｍＬ、ヒト組換えタンパク質Ｗｎｔ－３ａの最終濃度は２５０ｎｇ／ｍＬ、ヒト組換えタンパク質Ｎｏｇｇｉｎの最終濃度は１００ｎｇ／ｍＬ、ＳＢ２０２１９０の最終濃度は１０μＭ、Ａ８３－０１の最終濃度は１μＭ、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン（Ｎ－ａｃｅｔｙｌ－Ｌ－ｃｙｓｔｅｉｎｅ）の最終濃度は１ｍＭ、ニコチンアミド（Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ）の最終濃度は８ｍＭ；コルチゾールの最終濃度は２５ｎｇ／ｍＬ、Ｙ－２７６３２の最終濃度は８μＭ）で一定時間培養して、直径１００μｍ以上の細胞塊を得てＰ０世代細胞とし、以後は継代の回数でＰ１、Ｐ２、…、Ｐｎとした。Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５世代の胃がん初代腫瘍細胞培養物からそれぞれ１０６個の細胞を採取して、ＤＮＡ抽出、文庫構築及び全ゲノムハイスループット配列決定（ＷＧＳ）を行い、配列決定深さは３００×であった。
３．各配列決定結果はそれぞれコピー数変異分析（ＣＮＶ）を行って、原発胃がん腫瘍組織と各世代の胃がん初代細胞培養物のコピー数変異を比較し、例えば、図５に示すように、各世代の胃がん初代細胞培養物（Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５）が原発胃がん腫瘍組織（Ｔｕｍｏｒ）のコピー数変異状況と非常に一致し、したがって本方法で得た胃がん初代細胞は患者における原発腫瘍の実際の状況を反映している。
２．胃がん組織を処理した後、実施例１の胃がん固形腫瘍初代細胞培地（ヒト組換えタンパク質ＥＧＦの最終濃度は５０ｎｇ／ｍＬ、ヒト組換えタンパク質ｂＦＧＦの最終濃度は２０ｎｇ／ｍＬ、ヒト組換えタンパク質ＨＧＦの最終濃度は２０ｎｇ／ｍＬ、ヒト組換えタンパク質ＦＧＦ－１０の最終濃度は２０ｎｇ／ｍＬ、ヒト組換えタンパク質Ｗｎｔ－３ａの最終濃度は２５０ｎｇ／ｍＬ、ヒト組換えタンパク質Ｎｏｇｇｉｎの最終濃度は１００ｎｇ／ｍＬ、ＳＢ２０２１９０の最終濃度は１０μＭ、Ａ８３－０１の最終濃度は１μＭ、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン（Ｎ－ａｃｅｔｙｌ－Ｌ－ｃｙｓｔｅｉｎｅ）の最終濃度は１ｍＭ、ニコチンアミド（Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ）の最終濃度は８ｍＭ；コルチゾールの最終濃度は２５ｎｇ／ｍＬ、Ｙ－２７６３２の最終濃度は８μＭ）で一定時間培養して、直径１００μｍ以上の細胞塊を得てＰ０世代細胞とし、以後は継代の回数でＰ１、Ｐ２、…、Ｐｎとした。Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５世代の胃がん初代腫瘍細胞培養物からそれぞれ１０６個の細胞を採取して、ＤＮＡ抽出、文庫構築及び全ゲノムハイスループット配列決定（ＷＧＳ）を行い、配列決定深さは３００×であった。
３．各配列決定結果はそれぞれコピー数変異分析（ＣＮＶ）を行って、原発胃がん腫瘍組織と各世代の胃がん初代細胞培養物のコピー数変異を比較し、例えば、図５に示すように、各世代の胃がん初代細胞培養物（Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５）が原発胃がん腫瘍組織（Ｔｕｍｏｒ）のコピー数変異状況と非常に一致し、したがって本方法で得た胃がん初代細胞は患者における原発腫瘍の実際の状況を反映している。
【0131】
実施例１２：異なる初代細胞培地による胃がん初代細胞培養の成功率の比較
本実施例ですべてのサンプルの初代培養の操作方法は、培地の配合が異なること以外に、手順が同じ（上記の内容を参照）であった。試験対象となる各初代細胞培地は表２８を参照。構成Ｄは本発明で用いた配合であり、詳細は表９を参照（ヒト組換えタンパク質ＥＧＦの最終濃度は５０ｎｇ／ｍＬ、ヒト組換えタンパク質ｂＦＧＦの最終濃度は２０ｎｇ／ｍＬ、ヒト組換えタンパク質ＨＧＦの最終濃度は２０ｎｇ／ｍＬ、ヒト組換えタンパク質ＦＧＦ－１０の最終濃度は２０ｎｇ／ｍＬ、ヒト組換えタンパク質Ｗｎｔ－３ａの最終濃度は２５０ｎｇ／ｍＬ、ヒト組換えタンパク質Ｎｏｇｇｉｎの最終濃度は１００ｎｇ／ｍＬ、ＳＢ２０２１９０の最終濃度は１０μＭ、Ａ８３－０１の最終濃度は１μＭ、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン（Ｎ－ａｃｅｔｙｌ－Ｌ－ｃｙｓｔｅｉｎｅ）の最終濃度は１ｍＭ、ニコチンアミド（Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ）の最終濃度は８ｍＭ、コルチゾールの最終濃度は２５ｎｇ／ｍＬ、Ｙ－２７６３２の最終濃度は８μＭであった）。
本実施例ですべてのサンプルの初代培養の操作方法は、培地の配合が異なること以外に、手順が同じ（上記の内容を参照）であった。試験対象となる各初代細胞培地は表２８を参照。構成Ｄは本発明で用いた配合であり、詳細は表９を参照（ヒト組換えタンパク質ＥＧＦの最終濃度は５０ｎｇ／ｍＬ、ヒト組換えタンパク質ｂＦＧＦの最終濃度は２０ｎｇ／ｍＬ、ヒト組換えタンパク質ＨＧＦの最終濃度は２０ｎｇ／ｍＬ、ヒト組換えタンパク質ＦＧＦ－１０の最終濃度は２０ｎｇ／ｍＬ、ヒト組換えタンパク質Ｗｎｔ－３ａの最終濃度は２５０ｎｇ／ｍＬ、ヒト組換えタンパク質Ｎｏｇｇｉｎの最終濃度は１００ｎｇ／ｍＬ、ＳＢ２０２１９０の最終濃度は１０μＭ、Ａ８３－０１の最終濃度は１μＭ、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン（Ｎ－ａｃｅｔｙｌ－Ｌ－ｃｙｓｔｅｉｎｅ）の最終濃度は１ｍＭ、ニコチンアミド（Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ）の最終濃度は８ｍＭ、コルチゾールの最終濃度は２５ｎｇ／ｍＬ、Ｙ－２７６３２の最終濃度は８μＭであった）。
【0132】
【0133】
初代細胞培地を調製した後、０．２２μｍシリンジフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＳＬＧＰ０３３ＲＳ）で濾過して除菌すると、４℃で２週間保存することができる。
【0134】
４つの構成の初代細胞培地によって、それぞれ２０例のサンプルを処理し、実施例３、４、５に記載の方法でサンプルの処理及び培養操作を行い、１０日間の培養後、胃がん固形腫瘍初代細胞培養の成功率を統計し、表２９に示す。
【0135】
初代細胞培地が胃がん初代細胞培養の成功率に大きな影響を与え、本発明で使用する胃がん固形腫瘍初代細胞培地（表９）は胃がん固形腫瘍組織サンプル中のがん細胞の増殖を最大限に促進して、胃がん固形腫瘍初代細胞培養の成功率を高められることが示された。
【0136】
実施例１３：異なるサンプル保存液による胃がん初代細胞培養の成功率の比較
本実施例ですべてのサンプル初代培養の操作方法は、サンプル保存液の配合が異なること以外に、手順が同じ（上記の内容を参照）であった。試験対象となる各サンプル保存液は表３０を参照。構成Ｅは本発明で用いた配合であり、詳細は表１を参照。
本実施例ですべてのサンプル初代培養の操作方法は、サンプル保存液の配合が異なること以外に、手順が同じ（上記の内容を参照）であった。試験対象となる各サンプル保存液は表３０を参照。構成Ｅは本発明で用いた配合であり、詳細は表１を参照。
【0137】
【0138】
５つの構成のサンプル保存液によって、それぞれ２０例のサンプルを処理し、サンプルは生体から単離した後にサンプル保存液において４℃で一時保存し、生体から２時間単離した後、実施例３、４、５に記載の方法に従ってサンプルの処理及び培養操作を行い、１０日間の培養後、胃がん固形腫瘍初代細胞培養の成功率を統計し、表３１に示す。
【0139】
サンプル保存液の配合が胃がん固形腫瘍初代細胞培養の成功率に大きな影響を与え、本発明で使用するサンプル保存液（表１）は胃がん固形腫瘍組織サンプル中のがん細胞の生存性を最大限に保証して、培養の成功率を高められることが示された。
【0140】
実施例１４：異なるサンプル解離液による胃がん初代細胞培養の成功率の比較
本実施例でサンプル初代培養の操作方法は、サンプル解離液の配合が異なること以外に、手順が同じ（上記の内容を参照）であった。試験対象となる各サンプル解離液は表３２を参照。構成Ｄは本発明で用いた配合であり、詳細は表３を参照。
サンプル解離液は直前調製。
本実施例でサンプル初代培養の操作方法は、サンプル解離液の配合が異なること以外に、手順が同じ（上記の内容を参照）であった。試験対象となる各サンプル解離液は表３２を参照。構成Ｄは本発明で用いた配合であり、詳細は表３を参照。
【0141】
サンプルとして重量が１００ｍｇを超えている胃がん固形腫瘍組織塊を２０例選択して、均等に４つに分けて、それぞれは前記４種のサンプル解離液を用いて、実施例３、４、５に記載の方法に従ってサンプルの処理及び培養操作を行った。１０日間の培養後、胃がん固形腫瘍初代細胞培養の成功率を統計し、表３３に示す。
【0142】
サンプル解離液の配合が胃がん固形腫瘍初代細胞培養の成功率に大きな影響を与え、本発明で使用するサンプル解離液（表３）は胃がん固形腫瘍組織中のがん細胞を最大限に分離して、胃がん固形腫瘍初代細胞培養の成功率を高められることが示された。
【0143】
実施例１５：異なる細胞消化液による胃がん初代細胞継代の成功率の比較
本実施例でサンプル初代細胞継代の操作方法は、細胞消化液の配合が異なること以外に、手順が同じ（上記の内容を参照）であった。試験対象となる各サンプル解離液は表３４を参照。構成Ｄは本発明で用いた配合であり、詳細は表７を参照。
細胞消化液は直前調製。
本実施例でサンプル初代細胞継代の操作方法は、細胞消化液の配合が異なること以外に、手順が同じ（上記の内容を参照）であった。試験対象となる各サンプル解離液は表３４を参照。構成Ｄは本発明で用いた配合であり、詳細は表７を参照。
【0144】
培養が成功した胃がんサンプルを２０例選択して、培養した胃がん固形腫瘍初代細胞に対してそれぞれ前記４種の細胞消化液により、実施例６に記載の方法に従って連続継代を行った。がん細胞が増幅して直径１００μｍの細胞塊を形成するたびに継代を行い（１０回まで）、最大継代回数を記録した。結果の統計は表３５に示すとおりである。
【0145】
上表から明らかなように、細胞消化液の配合が胃がん固形腫瘍初代細胞継代の成功率に大きな影響を与え、本発明で使用する細胞消化液（表７）は、細胞塊中のがん細胞を温和に解離できるため、胃がん固形腫瘍初代細胞の生存性が損なわれずサンプルの連続継代が可能であった。
【0146】
実施例１６：異なる材質の細胞培養器具による胃がん初代腫瘍細胞の培養
本実施例でサンプル初代培養の操作方法は、細胞培養器具の材質（未修飾）が異なること以外に、手順が同じ（上記の内容を参照）であった（表３６）。
注：ポリスチレン（Ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ、略号ＰＳ）、ポリカーボネート（Ｐｏｌｙｃａｒｂｏｎａｔｅ、略号ＰＣ）、ポリメチルメタクリレート（ｐｏｌｙ－ｍｅｔｈｙｌ ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ、略号ＰＭＭＡ）、ＣＯＣ樹脂、シクロオレフィンポリマー（Ｃｙｃｌｏ Ｏｌｅｆｉｎ Ｐｏｌｙｍｅｒ、略号ＣＯＰ）、低接着表面（ｌｏｗ－ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ－ｓｕｒｆａｃｅ、略号ＬＡＳ）。
本実施例でサンプル初代培養の操作方法は、細胞培養器具の材質（未修飾）が異なること以外に、手順が同じ（上記の内容を参照）であった（表３６）。
【0147】
表３６から明らかなように、異なる材質の培養器具が胃がん固形腫瘍初代細胞培養の成功率にある程度は影響を与えており、低接着表面（ＬＡＳ）による培養の成功率が最も高かった。
【0148】
実施例１７：ＣＹＴＯＰ修飾した細胞培養器具による胃がん初代腫瘍細胞の培養
本実施例でサンプル初代培養の操作方法はいずれも手順が同じで（上記の内容を参照）、ＣＹＴＯＰ修飾の手順はいずれも同じで、細胞培養器具の材質が異なるだけであった（表３７）。
本実施例でサンプル初代培養の操作方法はいずれも手順が同じで（上記の内容を参照）、ＣＹＴＯＰ修飾の手順はいずれも同じで、細胞培養器具の材質が異なるだけであった（表３７）。
【0149】
ＣＹＴＯＰ修飾の手順は次のとおりである。まず細胞培養容器に対して純酸素エッチングを行って、エッチング条件は電力２０Ｗで、エッチング時間は３分であった。その後、適量（例えば、９６ウェルプレートの場合は１ウェル当たり２０μＬであり、適量とは培養皿の底部を完全に覆うことである）の１％ＣＹＴＯＰ溶液で、培養皿又は細胞培養プレートの表面を覆い、ＣＹＴＯＰ溶液が完全に乾燥したら使用できる。
【0150】
【0151】
実施例１８：胃がん初代腫瘍細胞による薬物感受性試験
本実施例で使用する化学療法薬、イリノテカン（Ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ）、５－フルオロウラシル（５－Ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）、オキサリプラチン（Ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）はＳｅｌｌｅｃｋ製であった。
本実施例で使用するＣｅｌｌｔｉｔｅｒ－Ｇｌｏ細胞生存性検出キットはＰｒｏｍｅｇａ製であった。
本実施例で使用する化学療法薬、イリノテカン（Ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ）、５－フルオロウラシル（５－Ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）、オキサリプラチン（Ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）はＳｅｌｌｅｃｋ製であった。
本実施例で使用するＣｅｌｌｔｉｔｅｒ－Ｇｌｏ細胞生存性検出キットはＰｒｏｍｅｇａ製であった。
【0152】
本発明で培養した初代胃がん細胞を用いて体外薬物感受性試験を行った。標準サイズの９６ウェル低接着細胞培養プレートに、１０５／ウェルの密度で初代細胞を播種し、各薬物は５つの薬物濃度勾配を設け、ｎ＝３とした。薬物を加えた後は３７℃と５％ＣＯ２の条件下で細胞を７日間インキュベートした。薬物が作用した後、Ｃｅｌｌｔｉｔｅｒ－Ｇｌｏ細胞生存性検出キットで各ウェルの細胞生存性を検出した。実験結果を図６に示す。当該結果は、本方法で得た初代胃がん細胞は体外薬物感受性検出に利用できることを示している。
【0153】
実施例１９：胆嚢・胆管がん固形腫瘍初代細胞の培養用試薬の調製
１．サンプル保存液（１００ｍＬ）
サンプル保存液（１００ｍＬ）の配合の詳細（表１）及び調製方法は、実施例１のステップ１を参照。
２．サンプル洗浄液（１００ｍＬ）
サンプル洗浄液（１００ｍＬ）の配合の詳細（表２）及び調製方法は、実施例１のステップ２を参照。
３．サンプル解離液（１０ｍＬ）
サンプル解離液（１０ｍＬ）の配合の詳細（表３）及び調製方法は、実施例１のステップ３を参照。
４．細胞消化液（１０ｍＬ）
細胞消化液（１０ｍＬ）の配合の詳細（表７）及び調製方法は、実施例１のステップ４を参照。
５．消化停止液（１００ｍＬ）
消化停止液（１００ｍＬ）の配合の詳細（表８）及び調製方法は、実施例１のステップ５を参照。
６．胆嚢・胆管がん固形腫瘍初代細胞培地（１００ｍＬ）
胆嚢・胆管がん固形腫瘍初代細胞培地（１００ｍＬ）の配合の詳細（表９）及び調製方法は、実施例１のステップ６を参照。
７．細胞凍結液
細胞凍結液の配合の詳細（表２４）及び調製方法は、実施例１のステップ７を参照。
８． １％ＣＹＴＯＰ溶液
１％ＣＹＴＯＰ溶液の配合の詳細（表２６）及び調製方法は、実施例１のステップ８を参照。
１．サンプル保存液（１００ｍＬ）
サンプル保存液（１００ｍＬ）の配合の詳細（表１）及び調製方法は、実施例１のステップ１を参照。
２．サンプル洗浄液（１００ｍＬ）
サンプル洗浄液（１００ｍＬ）の配合の詳細（表２）及び調製方法は、実施例１のステップ２を参照。
３．サンプル解離液（１０ｍＬ）
サンプル解離液（１０ｍＬ）の配合の詳細（表３）及び調製方法は、実施例１のステップ３を参照。
４．細胞消化液（１０ｍＬ）
細胞消化液（１０ｍＬ）の配合の詳細（表７）及び調製方法は、実施例１のステップ４を参照。
５．消化停止液（１００ｍＬ）
消化停止液（１００ｍＬ）の配合の詳細（表８）及び調製方法は、実施例１のステップ５を参照。
６．胆嚢・胆管がん固形腫瘍初代細胞培地（１００ｍＬ）
胆嚢・胆管がん固形腫瘍初代細胞培地（１００ｍＬ）の配合の詳細（表９）及び調製方法は、実施例１のステップ６を参照。
７．細胞凍結液
細胞凍結液の配合の詳細（表２４）及び調製方法は、実施例１のステップ７を参照。
８． １％ＣＹＴＯＰ溶液
１％ＣＹＴＯＰ溶液の配合の詳細（表２６）及び調製方法は、実施例１のステップ８を参照。
【0154】
実施例２０：胆嚢がん、胆管がん術後標本／生検穿刺標本の取得
１．医学倫理審査を受けた上、三甲医院から協力をいただいた。
２．主治医は医療指針に規定された臨床適応症に基づいて患者を選択して群に組み入れ、手術中の臨床適応症に基づいて体外培養用の適切なサンプルを選択した。手術サンプルの選択基準は次のとおりである。原発性胆嚢・胆管がんで、病理学的病期分類がＩＩ期、ＩＩＩ期又はＩＶ期の原発性胆嚢がん又は胆管がん、病理学的分類上の様々な胆嚢がん又は胆管がん転移病巣であり、手術標本の重量が２０ｍｇを超えているサンプルであった。生検穿刺サンプルの選択基準は次のとおりである。原発性胆嚢がんまたは胆管がんで、病理学的病期分類がＩＩ期、ＩＩＩ期又はＩＶ期、病理学的分類上の様々な胆嚢がん又は胆管がん転移病巣であり、穿刺標本が４件の以上サンプルであった。
３．主治医は患者の性別、年齢、病歴、家族歴、喫煙歴、病理学的病期と分類、臨床診断などの基本的な臨床情報を提供した。患者の氏名、身分証番号など患者のプライバシーに関連する情報は提供せず、所定仕様の実験番号を代用し、実験番号の命名規則は採取サンプルの８桁数字日付＋患者入院番号の後４桁であった。例えば、２０１８年１月１日に提供したサンプルであり、患者の入院番号がＴ００１５１２７６５の場合は、サンプル実験番号は２０１８０１０１２７６５であった。
４．手術中に外科医は、手術室の無菌環境で新鮮な手術標本を採取して、予め用意しておいたサンプル保存液（実施例１９を参照）に入れた。サンプルは生体から単離した後、氷上で一時保存し、２時間以内に実験室に送って次の操作を行った。
５．穿刺実施者は、穿刺手術室の無菌環境で新鮮な穿刺標本を採取して、予め用意しておいたサンプル保存液（実施例１９参照）に入れた。サンプルは生体から単離した後、氷上で一時保存し、２時間以内に実験室に送って次の操作を行った。
１．医学倫理審査を受けた上、三甲医院から協力をいただいた。
２．主治医は医療指針に規定された臨床適応症に基づいて患者を選択して群に組み入れ、手術中の臨床適応症に基づいて体外培養用の適切なサンプルを選択した。手術サンプルの選択基準は次のとおりである。原発性胆嚢・胆管がんで、病理学的病期分類がＩＩ期、ＩＩＩ期又はＩＶ期の原発性胆嚢がん又は胆管がん、病理学的分類上の様々な胆嚢がん又は胆管がん転移病巣であり、手術標本の重量が２０ｍｇを超えているサンプルであった。生検穿刺サンプルの選択基準は次のとおりである。原発性胆嚢がんまたは胆管がんで、病理学的病期分類がＩＩ期、ＩＩＩ期又はＩＶ期、病理学的分類上の様々な胆嚢がん又は胆管がん転移病巣であり、穿刺標本が４件の以上サンプルであった。
３．主治医は患者の性別、年齢、病歴、家族歴、喫煙歴、病理学的病期と分類、臨床診断などの基本的な臨床情報を提供した。患者の氏名、身分証番号など患者のプライバシーに関連する情報は提供せず、所定仕様の実験番号を代用し、実験番号の命名規則は採取サンプルの８桁数字日付＋患者入院番号の後４桁であった。例えば、２０１８年１月１日に提供したサンプルであり、患者の入院番号がＴ００１５１２７６５の場合は、サンプル実験番号は２０１８０１０１２７６５であった。
４．手術中に外科医は、手術室の無菌環境で新鮮な手術標本を採取して、予め用意しておいたサンプル保存液（実施例１９を参照）に入れた。サンプルは生体から単離した後、氷上で一時保存し、２時間以内に実験室に送って次の操作を行った。
５．穿刺実施者は、穿刺手術室の無菌環境で新鮮な穿刺標本を採取して、予め用意しておいたサンプル保存液（実施例１９参照）に入れた。サンプルは生体から単離した後、氷上で一時保存し、２時間以内に実験室に送って次の操作を行った。
【0155】
実施例２１：胆嚢がん又は胆管がんサンプル解離前処理
以下のステップの操作は氷上で行い、１０分以内に完了する必要がある。
以下の操作で使用する手術器具は、全ては予め高温と高圧下で滅菌し、熱風乾燥した上で使用する。
１．サンプルを秤量した。
２．７５％（体積パーセント含有量）エタノールでサンプルの表面を１０－３０秒間洗浄した。
３．サンプル洗浄液でサンプルを１０回洗浄し、無菌のＰＢＳ溶液でサンプルを５回洗浄した。
４．眼科用ハサミ、眼科用ピンセット、メスなどの器具を用いて、入念にサンプルから脂肪組織、結合組織、壊死組織を剥離した。
以下のステップの操作は氷上で行い、１０分以内に完了する必要がある。
以下の操作で使用する手術器具は、全ては予め高温と高圧下で滅菌し、熱風乾燥した上で使用する。
１．サンプルを秤量した。
２．７５％（体積パーセント含有量）エタノールでサンプルの表面を１０－３０秒間洗浄した。
３．サンプル洗浄液でサンプルを１０回洗浄し、無菌のＰＢＳ溶液でサンプルを５回洗浄した。
４．眼科用ハサミ、眼科用ピンセット、メスなどの器具を用いて、入念にサンプルから脂肪組織、結合組織、壊死組織を剥離した。
【0156】
実施例２２：胆嚢がん又は胆管がん組織サンプルの解離
以下の実施例で使用する手術器具は、全ては予め高温と高圧下で滅菌し、熱風乾燥した上で使用する。
１．眼科用ハサミで組織を切断して１ｍｍ３ほどの小片を得た。
２．１ｍｇの組織当たり０．１ｍＬのサンプル解離液（実施例１９参照）の使用量で、予め３７℃に加熱したサンプル解離液で切断された組織サンプルを処理し、３７℃でサンプル解離を行い、解離時間は１５分－３時間であった。１５分ごとに顕微鏡でサンプルの解離状況を観察し、多くの単細胞が観察されるまでこれを続けた。
３．１０倍の体積の消化停止液（実施例１９参照）で解離反応を停止させて、細胞懸濁液を収集した。
４．４０μｍの無菌のセルストレーナーで細胞懸濁液を濾過して、組織残片と接着細胞を除去した。
５．８００ｇで室温下で１０分間遠心分離して、上澄みを廃棄した。
６．５ｍＬの無菌のＰＢＳで細胞を再懸濁させ、８００ｇで室温下で１０分間遠心分離して、上澄みを廃棄した。
７．胆嚢がん、胆管がん固形腫瘍初代細胞培地（実施例１９参照）で細胞ペレットを再懸濁させて、顕微鏡で細胞の状態を観察し、細胞を計数した。
以下の実施例で使用する手術器具は、全ては予め高温と高圧下で滅菌し、熱風乾燥した上で使用する。
１．眼科用ハサミで組織を切断して１ｍｍ３ほどの小片を得た。
２．１ｍｇの組織当たり０．１ｍＬのサンプル解離液（実施例１９参照）の使用量で、予め３７℃に加熱したサンプル解離液で切断された組織サンプルを処理し、３７℃でサンプル解離を行い、解離時間は１５分－３時間であった。１５分ごとに顕微鏡でサンプルの解離状況を観察し、多くの単細胞が観察されるまでこれを続けた。
３．１０倍の体積の消化停止液（実施例１９参照）で解離反応を停止させて、細胞懸濁液を収集した。
４．４０μｍの無菌のセルストレーナーで細胞懸濁液を濾過して、組織残片と接着細胞を除去した。
５．８００ｇで室温下で１０分間遠心分離して、上澄みを廃棄した。
６．５ｍＬの無菌のＰＢＳで細胞を再懸濁させ、８００ｇで室温下で１０分間遠心分離して、上澄みを廃棄した。
７．胆嚢がん、胆管がん固形腫瘍初代細胞培地（実施例１９参照）で細胞ペレットを再懸濁させて、顕微鏡で細胞の状態を観察し、細胞を計数した。
【0157】
図７に示すように、解離して得た単細胞懸濁液には、腫瘍細胞の他に、様々な種類の細胞、例えば、赤血球、リンパ球、線維細胞などが多く混在していた。本方法の１つの利点は後続の培養過程で、大量に増殖するのはがん細胞だけで、他の細胞の比率が徐々に低減しあるいは消失したため、最終的に純度の高い胆嚢がん、胆管がん初代腫瘍細胞を得ることである。
【0158】
実施例２３：胆嚢がん、胆管がん初代細胞培養
１．低接着表面（ｌｏｗ－ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ－ｓｕｒｆａｃｅ）を利用して胆嚢がん、胆管がん固形腫瘍初代細胞を懸濁培養し、使用する培地は実施例１９の胆嚢がん、胆管がん初代細胞培地（ヒト組換えタンパク質ＥＧＦの最終濃度は５０ｎｇ／ｍＬ、ヒト組換えタンパク質ｂＦＧＦの最終濃度は２０ｎｇ／ｍＬ、ヒト組換えタンパク質ＨＧＦの最終濃度は２０ｎｇ／ｍＬ、ヒト組換えタンパク質ＦＧＦ－１０の最終濃度は２０ｎｇ／ｍＬ、ヒト組換えタンパク質Ｗｎｔ－３ａの最終濃度は２５０ｎｇ／ｍＬ、ヒト組換えタンパク質Ｎｏｇｇｉｎの最終濃度は１００ｎｇ／ｍＬ、ＳＢ２０２１９０の最終濃度は１０μＭ、Ａ８３－０１の最終濃度は０．５μＭ、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン（Ｎ－ａｃｅｔｙｌ－Ｌ－ｃｙｓｔｅｉｎｅ）の最終濃度は１ｍＭ、ニコチンアミド（Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ）の最終濃度は１０ｍＭ、コルチゾールの最終濃度は２５ｎｇ／ｍＬ、Ｙ－２７６３２の最終濃度は１０μＭ）であり、例えば、６ウェルプレートの場合は、１ウェル当たり１０６個の細胞の密度で播種し、３７℃と５％ＣＯ２の条件下で細胞培養インキュベータにおいて培養した。
２．毎日に細胞の状態を観察し、３日ごとに培地を交換し、細胞が直径８０μｍほどの塊を形成するまでこれを続けた。
１．低接着表面（ｌｏｗ－ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ－ｓｕｒｆａｃｅ）を利用して胆嚢がん、胆管がん固形腫瘍初代細胞を懸濁培養し、使用する培地は実施例１９の胆嚢がん、胆管がん初代細胞培地（ヒト組換えタンパク質ＥＧＦの最終濃度は５０ｎｇ／ｍＬ、ヒト組換えタンパク質ｂＦＧＦの最終濃度は２０ｎｇ／ｍＬ、ヒト組換えタンパク質ＨＧＦの最終濃度は２０ｎｇ／ｍＬ、ヒト組換えタンパク質ＦＧＦ－１０の最終濃度は２０ｎｇ／ｍＬ、ヒト組換えタンパク質Ｗｎｔ－３ａの最終濃度は２５０ｎｇ／ｍＬ、ヒト組換えタンパク質Ｎｏｇｇｉｎの最終濃度は１００ｎｇ／ｍＬ、ＳＢ２０２１９０の最終濃度は１０μＭ、Ａ８３－０１の最終濃度は０．５μＭ、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン（Ｎ－ａｃｅｔｙｌ－Ｌ－ｃｙｓｔｅｉｎｅ）の最終濃度は１ｍＭ、ニコチンアミド（Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ）の最終濃度は１０ｍＭ、コルチゾールの最終濃度は２５ｎｇ／ｍＬ、Ｙ－２７６３２の最終濃度は１０μＭ）であり、例えば、６ウェルプレートの場合は、１ウェル当たり１０６個の細胞の密度で播種し、３７℃と５％ＣＯ２の条件下で細胞培養インキュベータにおいて培養した。
２．毎日に細胞の状態を観察し、３日ごとに培地を交換し、細胞が直径８０μｍほどの塊を形成するまでこれを続けた。
【0159】
図８に示すように、３－１０日間の培養後、がん細胞が大量に増幅して直径８０μｍの細胞塊を形成し、腫瘍細胞の総数は１０７を超えており、他の種類の細胞の数は明らかに低減しあるいは消失していた。本方法は大量のサンプルで検証したところ、胆嚢がん、胆管がん初代腫瘍細胞の体外培養の成功率が８０％に達していた。
【0160】
実施例２４：胆嚢がん、胆管がん固形腫瘍初代細胞の継代
１．培養皿から細胞塊を収集し、８００ｇで室温下で１０分間遠心分離して、上澄みを廃棄した。
２．無菌のＰＢＳ溶液で細胞塊を洗浄し、８００ｇで室温下で１０分間遠心分離して、上澄みを廃棄した。
３．細胞消化液（実施例１９参照）で細胞塊を再懸濁させて、３７℃で消化した。５分ごとに顕微鏡で細胞塊の消化の状況を観察し、細胞塊が単細胞になるまで消化した。
４．１０倍の体積の消化停止液（実施例１９参照）で解離反応を停止させて、細胞懸濁液を収集した。
５．８００ｇで室温下で１０分間遠心分離して、上澄みを廃棄した。
６．胆嚢がん、胆管がん初代細胞培地で細胞ペレットを再懸濁させて、細胞を計数した。
７．低接着表面（ｌｏｗ－ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ－ｓｕｒｆａｃｅ）を利用して胆嚢がん、胆管がん初代細胞を培養し、使用する培地は、実施例１９の胆嚢がん、胆管がん固形腫瘍初代細胞培地であり、例えば、６ウェルプレートの場合は、１ウェル当たり１０６個の細胞の密度で播種し、３７℃と５％ＣＯ２の条件下で細胞培養インキュベータにおいて培養した。
１．培養皿から細胞塊を収集し、８００ｇで室温下で１０分間遠心分離して、上澄みを廃棄した。
２．無菌のＰＢＳ溶液で細胞塊を洗浄し、８００ｇで室温下で１０分間遠心分離して、上澄みを廃棄した。
３．細胞消化液（実施例１９参照）で細胞塊を再懸濁させて、３７℃で消化した。５分ごとに顕微鏡で細胞塊の消化の状況を観察し、細胞塊が単細胞になるまで消化した。
４．１０倍の体積の消化停止液（実施例１９参照）で解離反応を停止させて、細胞懸濁液を収集した。
５．８００ｇで室温下で１０分間遠心分離して、上澄みを廃棄した。
６．胆嚢がん、胆管がん初代細胞培地で細胞ペレットを再懸濁させて、細胞を計数した。
７．低接着表面（ｌｏｗ－ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ－ｓｕｒｆａｃｅ）を利用して胆嚢がん、胆管がん初代細胞を培養し、使用する培地は、実施例１９の胆嚢がん、胆管がん固形腫瘍初代細胞培地であり、例えば、６ウェルプレートの場合は、１ウェル当たり１０６個の細胞の密度で播種し、３７℃と５％ＣＯ２の条件下で細胞培養インキュベータにおいて培養した。
【0161】
実施例２５：胆嚢がん、胆管がん固形腫瘍初代細胞の凍結保存
懸濁培養した胆嚢がん、胆管がん固形腫瘍初代細胞については、２－３回の継代増殖をした後、凍結保存を行うことができる。
１．培養皿から細胞塊を収集し、８００ｇで室温下で１０分間遠心分離して、上澄みを廃棄した。
２．無菌のＰＢＳ溶液で細胞塊を洗浄し、８００ｇで室温下で１０分間遠心分離して、上澄みを廃棄した。
３．細胞消化液（実施例１９参照）で細胞塊を再懸濁させて、３７℃で消化した。１５分ごとに顕微鏡で細胞塊の消化の状況を観察し、細胞塊が単細胞になるまで消化した。
４．１０倍の体積の消化停止液（実施例１９参照）で解離反応を停止させて、細胞懸濁液を収集し、細胞を計数した。
５．８００ｇで室温下で１０分間遠心分離して、上澄みを廃棄した。
６．細胞凍結液（実施例１９参照）で、１０６／ｍＬの密度で細胞ペレットを再懸濁させ、２ｍＬ凍結保存管に各管１ｍＬで細胞懸濁液を移して、勾配冷却ボックスで一晩凍結保存した後、液体窒素に移して長期保存しておいた。
懸濁培養した胆嚢がん、胆管がん固形腫瘍初代細胞については、２－３回の継代増殖をした後、凍結保存を行うことができる。
１．培養皿から細胞塊を収集し、８００ｇで室温下で１０分間遠心分離して、上澄みを廃棄した。
２．無菌のＰＢＳ溶液で細胞塊を洗浄し、８００ｇで室温下で１０分間遠心分離して、上澄みを廃棄した。
３．細胞消化液（実施例１９参照）で細胞塊を再懸濁させて、３７℃で消化した。１５分ごとに顕微鏡で細胞塊の消化の状況を観察し、細胞塊が単細胞になるまで消化した。
４．１０倍の体積の消化停止液（実施例１９参照）で解離反応を停止させて、細胞懸濁液を収集し、細胞を計数した。
５．８００ｇで室温下で１０分間遠心分離して、上澄みを廃棄した。
６．細胞凍結液（実施例１９参照）で、１０６／ｍＬの密度で細胞ペレットを再懸濁させ、２ｍＬ凍結保存管に各管１ｍＬで細胞懸濁液を移して、勾配冷却ボックスで一晩凍結保存した後、液体窒素に移して長期保存しておいた。
【0162】
実施例２６：胆嚢がん、胆管がん固形腫瘍初代細胞の蘇生
液体窒素に保存していた胆嚢がん、胆管がん固形腫瘍初代細胞を蘇生させることができる。
１．予め５分前に３７℃の無菌水を用意した。
２．凍結保存管を液体窒素から取り出して、３７℃の無菌水において細胞を迅速に融解した。
３．８００ｇで室温下で１０分間遠心分離して、上澄みを廃棄した。
４．胆嚢がん、胆管がん固形腫瘍初代細胞培地（実施例１９参照）で細胞ペレットを再懸濁させて、低接着表面を利用して胆嚢がん、胆管がん固形腫瘍初代細胞を培養し、各管の細胞を蘇生させて３．５ｃｍ培養皿に移し、３７℃と５％ＣＯ２の条件下で細胞培養インキュベータにおいて培養した。
液体窒素に保存していた胆嚢がん、胆管がん固形腫瘍初代細胞を蘇生させることができる。
１．予め５分前に３７℃の無菌水を用意した。
２．凍結保存管を液体窒素から取り出して、３７℃の無菌水において細胞を迅速に融解した。
３．８００ｇで室温下で１０分間遠心分離して、上澄みを廃棄した。
４．胆嚢がん、胆管がん固形腫瘍初代細胞培地（実施例１９参照）で細胞ペレットを再懸濁させて、低接着表面を利用して胆嚢がん、胆管がん固形腫瘍初代細胞を培養し、各管の細胞を蘇生させて３．５ｃｍ培養皿に移し、３７℃と５％ＣＯ２の条件下で細胞培養インキュベータにおいて培養した。
【0163】
実施例２７：胆嚢がん、胆管がん固形腫瘍初代細胞のＨＥ染色同定
以下の実施例で使用した試薬を説明する。
ＨＥ染色キット（北京索莱宝生物科技有限公司＃Ｇ１１２０）、
カチオン脱落防止スライドガラス（北京中杉金橋生物科技有限公司）、
キシレン、メタノール、アセトン（北京化学試薬公司、分析用純度）、
中性樹脂接着剤（北京益利精細化学品有限公司）。
以下の実施例で使用した試薬を説明する。
ＨＥ染色キット（北京索莱宝生物科技有限公司＃Ｇ１１２０）、
カチオン脱落防止スライドガラス（北京中杉金橋生物科技有限公司）、
キシレン、メタノール、アセトン（北京化学試薬公司、分析用純度）、
中性樹脂接着剤（北京益利精細化学品有限公司）。
【0164】
１．８００ｇで遠心分離して、実施例１９の胆嚢がん、胆管がん固形腫瘍初代細胞培地（ヒト組換えタンパク質ＥＧＦの最終濃度は２０ｎｇ／ｍＬ、ヒト組換えタンパク質ｂＦＧＦの最終濃度は２０ｎｇ／ｍＬ、ヒト組換えタンパク質ＨＧＦの最終濃度は２０ｎｇ／ｍＬ、ヒト組換えタンパク質ＦＧＦ－１０の最終濃度は２０ｎｇ／ｍＬ、ヒト組換えタンパク質Ｗｎｔ－３ａの最終濃度は２００ｎｇ／ｍＬ、ヒト組換えタンパク質Ｎｏｇｇｉｎの最終濃度は１００ｎｇ／ｍＬ、ＳＢ２０２１９０の最終濃度は５μＭ、Ａ８３－０１の最終濃度は１μＭ、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン（Ｎ－ａｃｅｔｙｌ－Ｌ－ｃｙｓｔｅｉｎｅ）の最終濃度は１ｍＭ、ニコチンアミド（Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ）の最終濃度は１０ｍＭ、コルチゾールの最終濃度は２５ｎｇ／ｍＬ、Ｙ－２７６３２の最終濃度は１０μＭ）で培養した胆嚢がん、胆管がん固形腫瘍初代細胞塊を収集して、４％パラホルムアルデヒドで固定した。細胞ペレットをパラフィンで包埋して切片し、切片の厚さは５μｍであった。
２．パラフィン切片をキシレン溶液に浸漬して室温下で５分間インキュベートして脱蝋し、これを３回繰り返した後、脱イオン水で切片を２回洗い流した。
３．切片を無水エタノールに浸漬して室温下で１０分間インキュベートし、これを２回繰り返した。
４．切片を９５％エタノールに浸漬して室温下で１０分間インキュベートして、これを２回繰り返した後、脱イオン水で切片を２回洗い流した。
５．スライドガラス上の水分が少し減ったら１００μＬのヘマトキシリン染色液を加えて１分間染色した。
６．ヘマトキシリン染色液を吸い取って、水道水でスライドガラスを３回洗浄した。
７．１００μＬの分化液を滴加して１分間、分化させた。
８．分化液を吸い取って、水道水でスライドガラスを２回、蒸留水でスライドガラスを１回洗浄した。
９．スライドガラスの表面の水分を吸い取って、２００μＬのエオシン染色液を滴加して４０秒間染色した。
１０．エオシン染色液を吸い取って、それぞれ７５％、８０％、９０％、１００％のエタノールでリンスして、それぞれ２０秒間、２０秒間、４０秒間、４０秒間脱水した。
１１．エタノールを乾燥させた後、５０μＬのキシレンを滴加して細胞を透過化させた。
１２．キシレンを完全に乾燥させた後、１滴の中性樹脂接着剤を滴加して、カバーガラスで封止し、顕微鏡で観察、撮影した。
２．パラフィン切片をキシレン溶液に浸漬して室温下で５分間インキュベートして脱蝋し、これを３回繰り返した後、脱イオン水で切片を２回洗い流した。
３．切片を無水エタノールに浸漬して室温下で１０分間インキュベートし、これを２回繰り返した。
４．切片を９５％エタノールに浸漬して室温下で１０分間インキュベートして、これを２回繰り返した後、脱イオン水で切片を２回洗い流した。
５．スライドガラス上の水分が少し減ったら１００μＬのヘマトキシリン染色液を加えて１分間染色した。
６．ヘマトキシリン染色液を吸い取って、水道水でスライドガラスを３回洗浄した。
７．１００μＬの分化液を滴加して１分間、分化させた。
８．分化液を吸い取って、水道水でスライドガラスを２回、蒸留水でスライドガラスを１回洗浄した。
９．スライドガラスの表面の水分を吸い取って、２００μＬのエオシン染色液を滴加して４０秒間染色した。
１０．エオシン染色液を吸い取って、それぞれ７５％、８０％、９０％、１００％のエタノールでリンスして、それぞれ２０秒間、２０秒間、４０秒間、４０秒間脱水した。
１１．エタノールを乾燥させた後、５０μＬのキシレンを滴加して細胞を透過化させた。
１２．キシレンを完全に乾燥させた後、１滴の中性樹脂接着剤を滴加して、カバーガラスで封止し、顕微鏡で観察、撮影した。
【0165】
図９は、体外培養した胆管がん初代腫瘍細胞のＨＥ染色の効果図を示している。これらの細胞はほとんど核細胞質比が高く、核が濃く染まり、核内にクロマチンが凝集しており、多核の形態で、細胞の大きさが不均一であるなどのがん細胞の特徴を有し、数十から数百の腫瘍細胞が凝集して一定の立体構造を有する腫瘍細胞塊を形成していることが示された。
【0166】
実施例２８：胆嚢がん、胆管がん固形腫瘍初代細胞の免疫組織化学染色同定
以下の実施例で使用した試薬を説明する。
パラホルムアルデヒド（北京化学試薬公司、分析用純度）（超純水でパラホルムアルデヒド粉末を溶解して、４％（４ｇ／１００ｍＬ）パラホルムアルデヒド溶液を調製した。）、
過酸化水素水（北京化学試薬公司、３５％）、
ブロッキング用正常ヤギ血清（Ｓｏｌａｒｂｉｏ＃ＳＬ０３８）、
免疫組織化学一次抗体（Ａｂｃａｍ＃ａｂ２１５８３８）、
免疫組織化学二次抗体（Ａｂｃａｍ＃ａｂ２０５７１９）、
ＥＤＴＡ修復液（Ａｂｃａｍ＃ａｂ９３６８４）、
ＤＡＢ発色液（ＳｉｇｎａｌＳｔａｉｎ（登録商標）ＤＡＢ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｋｉｔ、８０５９Ｓ）。
以下の実施例で使用した試薬を説明する。
パラホルムアルデヒド（北京化学試薬公司、分析用純度）（超純水でパラホルムアルデヒド粉末を溶解して、４％（４ｇ／１００ｍＬ）パラホルムアルデヒド溶液を調製した。）、
過酸化水素水（北京化学試薬公司、３５％）、
ブロッキング用正常ヤギ血清（Ｓｏｌａｒｂｉｏ＃ＳＬ０３８）、
免疫組織化学一次抗体（Ａｂｃａｍ＃ａｂ２１５８３８）、
免疫組織化学二次抗体（Ａｂｃａｍ＃ａｂ２０５７１９）、
ＥＤＴＡ修復液（Ａｂｃａｍ＃ａｂ９３６８４）、
ＤＡＢ発色液（ＳｉｇｎａｌＳｔａｉｎ（登録商標）ＤＡＢ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｋｉｔ、８０５９Ｓ）。
【0167】
実施例１９の胆嚢がん、胆管がん固形腫瘍初代細胞培地（ヒト組換えタンパク質ＥＧＦの最終濃度は５０ｎｇ／ｍＬ、ヒト組換えタンパク質ｂＦＧＦの最終濃度は２５ｎｇ／ｍＬ、ヒト組換えタンパク質ＨＧＦの最終濃度は２５ｎｇ／ｍＬ、ヒト組換えタンパク質ＦＧＦ－１０の最終濃度は２５ｎｇ／ｍＬ、ヒト組換えタンパク質Ｗｎｔ－３ａの最終濃度は３００ｎｇ／ｍＬ、ヒト組換えタンパク質Ｎｏｇｇｉｎの最終濃度は２００ｎｇ／ｍＬ、ＳＢ２０２１９０の最終濃度は１０μＭ、Ａ８３－０１の最終濃度は０．５μＭ、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン（Ｎ－ａｃｅｔｙｌ－Ｌ－ｃｙｓｔｅｉｎｅ）の最終濃度は１ｍＭ、ニコチンアミド（Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ）の最終濃度は１０ｍＭ、コルチゾールの最終濃度は２５ｎｇ／ｍＬ、Ｙ－２７６３２の最終濃度は１０μＭ）で培養した胆嚢がん、胆管がん細胞塊を収集してパラフィン切片を作製し、次の手順で、ｐａｎ－ＣＫ抗体によって上皮由来の細胞を特徴づけていた。
【0168】
１．切片をキシレンＩに１０分間、そしてキシレンＩＩに１０分間、浸漬した。
２．次に、無水エタノールＩ（５分）－無水エタノールＩＩ（５分）－９５％アルコール（５分）－８０％アルコール（５分）－７０％アルコール（５分）の順に浸漬し、その後、脱イオン水で２回洗い流し、各回は２分であった。
３．組織切片を修復キットに入れ、その後、適量の希釈済みのＥＤＴＡ修復液（ｐＨ９．０）を加え、液面は組織を超えていた。
４．中程度のマイクロ波をかけて１０分間修復を行い（液体が沸騰したら計時を開始）、過程中は組織が乾かないよう注意する。
５．修復キットを電子レンジから取り出して、自然に冷却させ、修復液が室温に下がるとスライドガラスを取り出し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で３回洗い流し、各回は３分であった（洗い流す間、組織が破損しないようにする）。
６．調製した３％過酸化水素（脱イオン水で３０％過酸化水素を希釈したもの）を切片組織に滴加して内因性ペルオキシダーゼを遮断し、室温下で１５分間インキュベートし、ＰＢＳで３回洗い流し、各回は３分であった。
７．吸取紙でＰＢＳを吸い取って、スライドガラスに１０％ヤギ血清（二次抗体と同じ又は類似する種に由来）を滴加し、３７℃で６０分間ブロッキングした。
８．吸取紙でスライドガラス上の組織の周囲の液体を拭き取り、油性ペンを使って組織の周囲に円を描き、その後、希釈済みの一次抗体を滴加して、湿潤箱において４℃で一晩インキュベートした。
９． ＰＢＳで切片を３回洗い流し、各回は３分とし、吸取紙で切片を拭き取って西洋ワサビペルオキシダーゼ標識二次抗体を滴加して、室温下で６０分間インキュベートした。
１０． ＰＢＳで切片を３回洗い流し、各回は３分とし、ＰＢＳ液体を振り切って吸取紙で切片を拭き取り、各切片に調製したばかりのＤＡＢ発色液を滴加して、顕微鏡で観察し、陽性シグナルが出たら水道水で切片を洗い流して発色を停止させた。
１１．改めてヘマトキシリンで１分間染色し、水洗して酸性エタノール分化液で分化させ、また水道水で洗い流して青色に戻した。
１２．切片を水に入れて洗い流した後、７０％アルコール－８０％アルコール－９０％アルコール－９５％アルコール－無水エタノールＩ－無水エタノールＩＩ－キシレンＩ－キシレンＩＩの順に切片を浸漬して脱水して透明化させ、各試薬には２分間静置し、最後にドラフトチャンバーにおいて切片を通風乾燥させた。
１３．中性樹脂接着剤で封止して、カバーガラスをかけた。ドラフトチャンバーに入れて乾燥させた。
１４．乾燥させた切片は顕微鏡で観察又は撮影した。
２．次に、無水エタノールＩ（５分）－無水エタノールＩＩ（５分）－９５％アルコール（５分）－８０％アルコール（５分）－７０％アルコール（５分）の順に浸漬し、その後、脱イオン水で２回洗い流し、各回は２分であった。
３．組織切片を修復キットに入れ、その後、適量の希釈済みのＥＤＴＡ修復液（ｐＨ９．０）を加え、液面は組織を超えていた。
４．中程度のマイクロ波をかけて１０分間修復を行い（液体が沸騰したら計時を開始）、過程中は組織が乾かないよう注意する。
５．修復キットを電子レンジから取り出して、自然に冷却させ、修復液が室温に下がるとスライドガラスを取り出し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で３回洗い流し、各回は３分であった（洗い流す間、組織が破損しないようにする）。
６．調製した３％過酸化水素（脱イオン水で３０％過酸化水素を希釈したもの）を切片組織に滴加して内因性ペルオキシダーゼを遮断し、室温下で１５分間インキュベートし、ＰＢＳで３回洗い流し、各回は３分であった。
７．吸取紙でＰＢＳを吸い取って、スライドガラスに１０％ヤギ血清（二次抗体と同じ又は類似する種に由来）を滴加し、３７℃で６０分間ブロッキングした。
８．吸取紙でスライドガラス上の組織の周囲の液体を拭き取り、油性ペンを使って組織の周囲に円を描き、その後、希釈済みの一次抗体を滴加して、湿潤箱において４℃で一晩インキュベートした。
９． ＰＢＳで切片を３回洗い流し、各回は３分とし、吸取紙で切片を拭き取って西洋ワサビペルオキシダーゼ標識二次抗体を滴加して、室温下で６０分間インキュベートした。
１０． ＰＢＳで切片を３回洗い流し、各回は３分とし、ＰＢＳ液体を振り切って吸取紙で切片を拭き取り、各切片に調製したばかりのＤＡＢ発色液を滴加して、顕微鏡で観察し、陽性シグナルが出たら水道水で切片を洗い流して発色を停止させた。
１１．改めてヘマトキシリンで１分間染色し、水洗して酸性エタノール分化液で分化させ、また水道水で洗い流して青色に戻した。
１２．切片を水に入れて洗い流した後、７０％アルコール－８０％アルコール－９０％アルコール－９５％アルコール－無水エタノールＩ－無水エタノールＩＩ－キシレンＩ－キシレンＩＩの順に切片を浸漬して脱水して透明化させ、各試薬には２分間静置し、最後にドラフトチャンバーにおいて切片を通風乾燥させた。
１３．中性樹脂接着剤で封止して、カバーガラスをかけた。ドラフトチャンバーに入れて乾燥させた。
１４．乾燥させた切片は顕微鏡で観察又は撮影した。
【0169】
図１０は体外培養した胆管がん初代腫瘍細胞塊の免疫組織化学染色の効果図を示している。細胞塊を形成している細胞がすべてｐａｎ－ＣＫ陽性で、上皮に由来していることから、本方法の培養で得たのは純度の高い腫瘍細胞であることが証明された。５つの胆嚢がん、胆管がんサンプル初代培養物の免疫組織化学染色同定を行ったところ、本方法で得た胆嚢がん、胆管がん初代細胞で、腫瘍細胞の比率が８４－９５％に達しているという統計結果であった（表３８）。
【0170】
実施例２９：ＣＹＴＯＰ修飾した細胞培養器具による胆嚢がん、胆管がん固形腫瘍初代腫瘍細胞の培養
本実施例でサンプル初代培養の操作方法はいずれも手順が同じで（上記の内容を参照）、ＣＹＴＯＰ修飾の手順はいずれも同じで、細胞培養器具の材質が異なるだけであった（表３９）。
本実施例でサンプル初代培養の操作方法はいずれも手順が同じで（上記の内容を参照）、ＣＹＴＯＰ修飾の手順はいずれも同じで、細胞培養器具の材質が異なるだけであった（表３９）。
【0171】
ＣＹＴＯＰ修飾の手順は次のとおりである。まず細胞培養容器に対して純酸素エッチングを行って、エッチング条件は出力２０Ｗで、エッチング時間は３分であった。その後、適量（例えば、９６ウェルプレートの場合は１ウェル当たり２０μＬであり、適量とは培養皿の底部を完全に覆うことである）の１％ＣＹＴＯＰ溶液で培養皿又は細胞培養プレートの表面を覆い、ＣＹＴＯＰ溶液が完全に乾燥したら使用できる。
【0172】
【0173】
表３９から、ＣＹＴＯＰ修飾はサンプル培養の成功率を大幅に高められることが示された。
【0174】
実施例３０：胆嚢・胆管がんの胆汁サンプル初代細胞の培養用試薬の調製
１．細胞分離緩衝液（１００ｍＬ）
細胞分離緩衝液（１００ｍＬ）の配合の詳細は表４０に示すとおりである。
細胞分離緩衝液は調製した後、４℃で１ヶ月保存することができる。
１．細胞分離緩衝液（１００ｍＬ）
細胞分離緩衝液（１００ｍＬ）の配合の詳細は表４０に示すとおりである。
【0175】
表４０におけるヘパリンナトリウム溶液の調製は表４１に示すとおりである。
１０００×ヘパリンナトリウム溶液は直前調製。
【0176】
２．細胞消化液（１０ｍＬ）
細胞消化液（１０ｍＬ）の配合の詳細（表７）及び調製方法は実施例１のステップ４を参照。
細胞消化液（１０ｍＬ）の配合の詳細（表７）及び調製方法は実施例１のステップ４を参照。
【0177】
３．消化停止液（１００ｍＬ）
消化停止液（１００ｍＬ）の配合の詳細（表８）及び調製方法は実施例１のステップ５を参照。
消化停止液（１００ｍＬ）の配合の詳細（表８）及び調製方法は実施例１のステップ５を参照。
【0178】
４．胆嚢がん、胆管がんの胆汁サンプルの初代細胞培地（１００ｍＬ）
胆嚢がん、胆管がんの胆汁サンプルの初代細胞培地（１００ｍＬ）の配合の詳細（表９）及び調製方法は実施例１のステップ６を参照。
胆嚢がん、胆管がんの胆汁サンプルの初代細胞培地（１００ｍＬ）の配合の詳細（表９）及び調製方法は実施例１のステップ６を参照。
【0179】
５．細胞凍結液
細胞凍結液の配合の詳細（表２４）及び調製方法は実施例１のステップ７を参照。
細胞凍結液の配合の詳細（表２４）及び調製方法は実施例１のステップ７を参照。
【0180】
実施例３１：胆嚢がん、胆管がんの胆汁サンプルの取得
１．医学倫理審査を受けた上、三甲医院から協力をいただいた。
２．主治医は医療指針に規定された臨床適応症に基づいて患者を選択して群に組み入れ、手術中の臨床適応症に基づいて体外培養用の適切なサンプルを選択した。手術サンプルの選択基準は次のとおりである。原発性胆嚢がん、胆管がんで、病理学的病期分類がＩＩ期、ＩＩＩ期又はＩＶ期であり、胆汁サンプルの体積が２０ｍＬを超えているサンプルであった。
３．主治医は患者の性別、年齢、病歴、家族歴、喫煙歴、病理学的病期と分類、臨床診断などの基本的な臨床情報を提供した。患者の氏名、身分証番号など患者のプライバシーに関連する情報は提供せず、所定仕様の実験番号を代用し、実験番号の命名規則は採取サンプルの８桁数字日付＋患者入院番号の後４桁であった。例えば、２０１８年１月１日に提供したサンプルで、患者の入院番号がＴ００１５１２７６５の場合は、サンプル実験番号は２０１８０１０１２７６５であった。
４．患者の担当医師が無菌器具を使用して１０ｍＬ以上の新鮮な胆汁標本を採取した。サンプルを氷上で一時保存し、４８時間以内に実験室に送って次の操作を行う。
１．医学倫理審査を受けた上、三甲医院から協力をいただいた。
２．主治医は医療指針に規定された臨床適応症に基づいて患者を選択して群に組み入れ、手術中の臨床適応症に基づいて体外培養用の適切なサンプルを選択した。手術サンプルの選択基準は次のとおりである。原発性胆嚢がん、胆管がんで、病理学的病期分類がＩＩ期、ＩＩＩ期又はＩＶ期であり、胆汁サンプルの体積が２０ｍＬを超えているサンプルであった。
３．主治医は患者の性別、年齢、病歴、家族歴、喫煙歴、病理学的病期と分類、臨床診断などの基本的な臨床情報を提供した。患者の氏名、身分証番号など患者のプライバシーに関連する情報は提供せず、所定仕様の実験番号を代用し、実験番号の命名規則は採取サンプルの８桁数字日付＋患者入院番号の後４桁であった。例えば、２０１８年１月１日に提供したサンプルで、患者の入院番号がＴ００１５１２７６５の場合は、サンプル実験番号は２０１８０１０１２７６５であった。
４．患者の担当医師が無菌器具を使用して１０ｍＬ以上の新鮮な胆汁標本を採取した。サンプルを氷上で一時保存し、４８時間以内に実験室に送って次の操作を行う。
【0181】
実施例３２：胆嚢がん、胆管がんの胆汁サンプルの前処理
以下のステップの操作は氷上で行い、１０分以内に完了する必要がある。
１．胆汁サンプルを氷上で約３０分間静置し、サンプル中の血餅と大型の不溶固体をサンプル管の底部に沈降させた。
２．入念に上澄みを５０ｍＬ無菌遠心管に移して、等体積の予め冷却したＰＢＳを加えて均一に混合した。
３．２０００ｇで４℃で５分間遠心分離して、上澄みを廃棄した。
４．細胞分離緩衝液（実施例３０参照）で細胞ペレットを再懸濁させて、２０００ｇで４℃で５分間遠心分離して、上澄みを廃棄した。
５．細胞分離緩衝液（実施例３０参照）で細胞ペレットを再懸濁させて、細胞の濃度を１０７／ｍＬに調整した。
以下のステップの操作は氷上で行い、１０分以内に完了する必要がある。
１．胆汁サンプルを氷上で約３０分間静置し、サンプル中の血餅と大型の不溶固体をサンプル管の底部に沈降させた。
２．入念に上澄みを５０ｍＬ無菌遠心管に移して、等体積の予め冷却したＰＢＳを加えて均一に混合した。
３．２０００ｇで４℃で５分間遠心分離して、上澄みを廃棄した。
４．細胞分離緩衝液（実施例３０参照）で細胞ペレットを再懸濁させて、２０００ｇで４℃で５分間遠心分離して、上澄みを廃棄した。
５．細胞分離緩衝液（実施例３０参照）で細胞ペレットを再懸濁させて、細胞の濃度を１０７／ｍＬに調整した。
【0182】
実施例３３：胆嚢・胆管がんの胆汁サンプルの密度勾配遠心分離
１．５０ｍＬ無菌遠心管に細胞懸濁液と等体積のＦｉｃｏｌｌ細胞分離液（ＭＰ＃５０４９４）を取った。
２．入念に細胞懸濁液を細胞分離液の上層に加え、両者の間に明確な界面が形成された。
３．横型遠心分離機において、２０００ｇで常温下で２０分間遠心分離した。
４．中間の白い膜状物を吸引して、新しい管に移した。
５．２０ｍＬの無菌のＰＢＳで細胞ペレットを再懸濁させて、１５００ｇで常温下で１０分間遠心分離して、上澄みを廃棄した。
６．胆嚢がん、胆管がんの胆汁サンプルの初代細胞培地（実施例３０参照）で細胞ペレットを再懸濁させて、顕微鏡で細胞の状態を観察し、細胞を計数した。
１．５０ｍＬ無菌遠心管に細胞懸濁液と等体積のＦｉｃｏｌｌ細胞分離液（ＭＰ＃５０４９４）を取った。
２．入念に細胞懸濁液を細胞分離液の上層に加え、両者の間に明確な界面が形成された。
３．横型遠心分離機において、２０００ｇで常温下で２０分間遠心分離した。
４．中間の白い膜状物を吸引して、新しい管に移した。
５．２０ｍＬの無菌のＰＢＳで細胞ペレットを再懸濁させて、１５００ｇで常温下で１０分間遠心分離して、上澄みを廃棄した。
６．胆嚢がん、胆管がんの胆汁サンプルの初代細胞培地（実施例３０参照）で細胞ペレットを再懸濁させて、顕微鏡で細胞の状態を観察し、細胞を計数した。
【0183】
図１１に示すように、分離して得た単細胞懸濁液には、腫瘍細胞の他に、様々な種類の細胞、例えば、赤血球、リンパ球、線維細胞などが多く混在していた。本方法の１つの利点は後続の培養過程で、大量に増幅するのはがん細胞だけで、他の細胞の比率が徐々に低減しあるいは消失することで、最終的に純度の高い胆嚢がん、胆管がん初代腫瘍細胞を得ることである。
【0184】
実施例３４：胆嚢がん、胆管がんの胆汁サンプルの初代細胞の培養
１．低接着表面（ｌｏｗ－ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ－ｓｕｒｆａｃｅ）を利用して胆嚢がん、胆管がんの胆汁サンプル初代細胞を懸濁培養し、使用された培地は実施例３０の胆嚢がん、胆管がんの胆汁サンプル初代細胞培地（ヒト組換えタンパク質ＥＧＦの最終濃度は５０ｎｇ／ｍＬ、ヒト組換えタンパク質ｂＦＧＦの最終濃度は２０ｎｇ／ｍＬ、ヒト組換えタンパク質ＨＧＦの最終濃度は２０ｎｇ／ｍＬ、ヒト組換えタンパク質ＦＧＦ－１０の最終濃度は２０ｎｇ／ｍＬ、ヒト組換えタンパク質Ｗｎｔ－３ａの最終濃度は２５０ｎｇ／ｍＬ、ヒト組換えタンパク質Ｎｏｇｇｉｎの最終濃度は１００ｎｇ／ｍＬ、ＳＢ２０２１９０の最終濃度は１０μＭ、Ａ８３－０１の最終濃度は０．５μＭ、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン（Ｎ－ａｃｅｔｙｌ－Ｌ－ｃｙｓｔｅｉｎｅ）の最終濃度は１ｍＭ、ニコチンアミド（Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ）の最終濃度は１０ｍＭ、コルチゾールの最終濃度は２５ｎｇ／ｍＬ、Ｙ－２７６３２の最終濃度は１０μＭ）であり、例えば、６ウェルプレートの場合は、１ウェル当たり１０６個の細胞の密度で播種し、３７℃と５％ＣＯ２の条件下で細胞培養インキュベータにおいて培養した。
２．毎日に細胞の状態を観察し、３日ごとに培地を交換し、細胞が直径８０μｍほどの塊を形成するまでこれを続けた。
１．低接着表面（ｌｏｗ－ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ－ｓｕｒｆａｃｅ）を利用して胆嚢がん、胆管がんの胆汁サンプル初代細胞を懸濁培養し、使用された培地は実施例３０の胆嚢がん、胆管がんの胆汁サンプル初代細胞培地（ヒト組換えタンパク質ＥＧＦの最終濃度は５０ｎｇ／ｍＬ、ヒト組換えタンパク質ｂＦＧＦの最終濃度は２０ｎｇ／ｍＬ、ヒト組換えタンパク質ＨＧＦの最終濃度は２０ｎｇ／ｍＬ、ヒト組換えタンパク質ＦＧＦ－１０の最終濃度は２０ｎｇ／ｍＬ、ヒト組換えタンパク質Ｗｎｔ－３ａの最終濃度は２５０ｎｇ／ｍＬ、ヒト組換えタンパク質Ｎｏｇｇｉｎの最終濃度は１００ｎｇ／ｍＬ、ＳＢ２０２１９０の最終濃度は１０μＭ、Ａ８３－０１の最終濃度は０．５μＭ、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン（Ｎ－ａｃｅｔｙｌ－Ｌ－ｃｙｓｔｅｉｎｅ）の最終濃度は１ｍＭ、ニコチンアミド（Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ）の最終濃度は１０ｍＭ、コルチゾールの最終濃度は２５ｎｇ／ｍＬ、Ｙ－２７６３２の最終濃度は１０μＭ）であり、例えば、６ウェルプレートの場合は、１ウェル当たり１０６個の細胞の密度で播種し、３７℃と５％ＣＯ２の条件下で細胞培養インキュベータにおいて培養した。
２．毎日に細胞の状態を観察し、３日ごとに培地を交換し、細胞が直径８０μｍほどの塊を形成するまでこれを続けた。
【0185】
図１２に示すように、３－１０日間培養した後、がん細胞が大量に増幅して直径８０μｍの細胞塊を形成し、腫瘍細胞の総数は１０７を超えており、他の種類の細胞の数は明らかに低減しあるいは消失していた。本方法は大量のサンプルで検証したところ、胆嚢がん、胆管がんの胆汁サンプル初代腫瘍細胞の体外培養の成功率が７０％に達していた。
【0186】
実施例３５：胆嚢がん、胆管がんの胆汁サンプルの初代細胞の継代
１．培養皿から細胞塊を収集し、８００ｇで室温下で１０分間遠心分離して、上澄みを廃棄した。
２．無菌のＰＢＳ溶液で細胞塊を洗浄し、８００ｇで室温下で１０分間遠心分離して、上澄みを廃棄した。
３．細胞消化液（実施例３０参照）で細胞塊を再懸濁させて、３７℃で消化した。５分ごとに顕微鏡で細胞塊の消化の状況を観察し、細胞塊が単細胞になるまで消化した。
４．１０倍の体積の消化停止液（実施例３０参照）で解離反応を停止させて、細胞懸濁液を収集した。
５．８００ｇで室温下で１０分間遠心分離して、上澄みを廃棄した。
６．胆嚢がん、胆管がんの初代細胞培地で細胞ペレットを再懸濁させて、細胞を計数した。
７．低接着表面（ｌｏｗ－ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ－ｓｕｒｆａｃｅ）を利用して胆嚢がん、胆管がんの胆汁サンプル初代細胞を培養し、使用された培地は実施例３０の胆嚢がん、胆管がんの胆汁サンプル初代細胞培地であり、例えば、６ウェルプレートの場合は、１ウェル当たり１０６個の細胞の密度で播種し、３７℃と５％ＣＯ２の条件下で細胞培養インキュベータにおいて培養した。
１．培養皿から細胞塊を収集し、８００ｇで室温下で１０分間遠心分離して、上澄みを廃棄した。
２．無菌のＰＢＳ溶液で細胞塊を洗浄し、８００ｇで室温下で１０分間遠心分離して、上澄みを廃棄した。
３．細胞消化液（実施例３０参照）で細胞塊を再懸濁させて、３７℃で消化した。５分ごとに顕微鏡で細胞塊の消化の状況を観察し、細胞塊が単細胞になるまで消化した。
４．１０倍の体積の消化停止液（実施例３０参照）で解離反応を停止させて、細胞懸濁液を収集した。
５．８００ｇで室温下で１０分間遠心分離して、上澄みを廃棄した。
６．胆嚢がん、胆管がんの初代細胞培地で細胞ペレットを再懸濁させて、細胞を計数した。
７．低接着表面（ｌｏｗ－ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ－ｓｕｒｆａｃｅ）を利用して胆嚢がん、胆管がんの胆汁サンプル初代細胞を培養し、使用された培地は実施例３０の胆嚢がん、胆管がんの胆汁サンプル初代細胞培地であり、例えば、６ウェルプレートの場合は、１ウェル当たり１０６個の細胞の密度で播種し、３７℃と５％ＣＯ２の条件下で細胞培養インキュベータにおいて培養した。
【0187】
実施例３６：胆嚢がん、胆管がんの胆汁サンプル初代細胞の凍結保存
懸濁培養した胆嚢がん、胆管がん胆汁サンプル初代細胞は２－３回の継代増殖した後、凍結保存を行うことができる。
１．培養皿から細胞塊を収集し、８００ｇで室温下で１０分間遠心分離して、上澄みを廃棄した。
２．無菌のＰＢＳ溶液で細胞塊を洗浄し、８００ｇで室温下で１０分間遠心分離して、上澄みを廃棄した。
３．細胞消化液（実施例３０参照）で細胞塊を再懸濁させて、３７℃で消化した。１５分ごとに顕微鏡で細胞塊の消化の状況を観察し、細胞塊が単細胞になるまで消化した。
４．１０倍の体積の消化停止液（実施例３０参照）で解離反応を停止させて、細胞懸濁液を収集し、細胞を計数した。
５．８００ｇで室温下で１０分間遠心分離して、上澄みを廃棄した。
６．細胞凍結液（実施例３０参照）で、１０６／ｍＬの密度で細胞ペレットを再懸濁させ、２ｍＬ凍結保存管に各管で１ｍＬ細胞懸濁液を移して、勾配冷却ボックスで一晩凍結保存した後、液体窒素に移して長期保存しておいた。
懸濁培養した胆嚢がん、胆管がん胆汁サンプル初代細胞は２－３回の継代増殖した後、凍結保存を行うことができる。
１．培養皿から細胞塊を収集し、８００ｇで室温下で１０分間遠心分離して、上澄みを廃棄した。
２．無菌のＰＢＳ溶液で細胞塊を洗浄し、８００ｇで室温下で１０分間遠心分離して、上澄みを廃棄した。
３．細胞消化液（実施例３０参照）で細胞塊を再懸濁させて、３７℃で消化した。１５分ごとに顕微鏡で細胞塊の消化の状況を観察し、細胞塊が単細胞になるまで消化した。
４．１０倍の体積の消化停止液（実施例３０参照）で解離反応を停止させて、細胞懸濁液を収集し、細胞を計数した。
５．８００ｇで室温下で１０分間遠心分離して、上澄みを廃棄した。
６．細胞凍結液（実施例３０参照）で、１０６／ｍＬの密度で細胞ペレットを再懸濁させ、２ｍＬ凍結保存管に各管で１ｍＬ細胞懸濁液を移して、勾配冷却ボックスで一晩凍結保存した後、液体窒素に移して長期保存しておいた。
【0188】
実施例３７：胆嚢がん、胆管がんの胆汁サンプル初代細胞の蘇生
液体窒素に保存していた胆嚢がん、胆管がんの胆汁サンプル初代細胞を蘇生させることができる。
１．予め５分前に３７℃の無菌水を用意した。
２．凍結保存管を液体窒素から取り出して、３７℃の無菌水において細胞を迅速に融解した。
３． ８００ｇで室温下で１０分間遠心分離して、上澄みを廃棄した。
４．胆嚢がん、胆管がんの胆汁サンプル初代細胞培地（実施例３０参照）で細胞ペレットを再懸濁させて、低接着表面を利用して胆嚢がん、胆管がんの胆汁サンプル初代細胞を培養し、各管の細胞を蘇生させて３．５ｃｍ培養皿に移し、３７℃と５％ＣＯ２の条件下で細胞培養インキュベータにおいて培養した。
液体窒素に保存していた胆嚢がん、胆管がんの胆汁サンプル初代細胞を蘇生させることができる。
１．予め５分前に３７℃の無菌水を用意した。
２．凍結保存管を液体窒素から取り出して、３７℃の無菌水において細胞を迅速に融解した。
３． ８００ｇで室温下で１０分間遠心分離して、上澄みを廃棄した。
４．胆嚢がん、胆管がんの胆汁サンプル初代細胞培地（実施例３０参照）で細胞ペレットを再懸濁させて、低接着表面を利用して胆嚢がん、胆管がんの胆汁サンプル初代細胞を培養し、各管の細胞を蘇生させて３．５ｃｍ培養皿に移し、３７℃と５％ＣＯ２の条件下で細胞培養インキュベータにおいて培養した。
【0189】
実施例３８：胆嚢がん、胆管がんの胆汁サンプル初代細胞のＨＥ染色同定
以下の実施例で使用された試薬および器具を説明する。
ＨＥ染色キット（北京索莱宝生物科技有限公司＃Ｇ１１２０）、
カチオン脱落防止スライドガラス（北京中杉金橋生物科技有限公司）、
キシレン、メタノール、アセトン（北京化学試薬公司、分析用純度）、
中性樹脂接着剤（北京益利精細化学品有限公司）。
以下の実施例で使用された試薬および器具を説明する。
ＨＥ染色キット（北京索莱宝生物科技有限公司＃Ｇ１１２０）、
カチオン脱落防止スライドガラス（北京中杉金橋生物科技有限公司）、
キシレン、メタノール、アセトン（北京化学試薬公司、分析用純度）、
中性樹脂接着剤（北京益利精細化学品有限公司）。
【0190】
１． ８００ｇで遠心分離して、実施例３０の胆嚢がん、胆管がんの胆汁サンプル初代細胞培地（そのなか、ヒト組換えタンパク質ＥＧＦの最終濃度は２０ｎｇ／ｍＬ、ヒト組換えタンパク質ｂＦＧＦの最終濃度は２０ｎｇ／ｍＬ、ヒト組換えタンパク質ＨＧＦの最終濃度は２０ｎｇ／ｍＬ、ヒト組換えタンパク質ＦＧＦ－１０の最終濃度は２０ｎｇ／ｍＬ、ヒト組換えタンパク質Ｗｎｔ－３ａの最終濃度は２００ｎｇ／ｍＬ、ヒト組換えタンパク質Ｎｏｇｇｉｎの最終濃度は１００ｎｇ／ｍＬ、ＳＢ２０２１９０の最終濃度は５μＭ、Ａ８３－０１の最終濃度は１μＭ、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン（Ｎ－ａｃｅｔｙｌ－Ｌ－ｃｙｓｔｅｉｎｅ）の最終濃度は１ｍＭ、ニコチンアミド（Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ）の最終濃度は１０ｍＭ、コルチゾールの最終濃度は２５ｎｇ／ｍＬ、Ｙ－２７６３２の最終濃度は１０μＭ）で培養した胆嚢がん、胆管がん固形腫瘍初代細胞塊を収集して、４％パラホルムアルデヒドで固定した。細胞ペレットをパラフィンで包埋して切片し、切片の厚さは５μｍであった。
２．パラフィン切片をキシレン溶液に浸漬して室温下で５分間インキュベートして脱蝋し、これを３回繰り返した後、脱イオン水で切片を２回洗い流した。
３．切片を無水エタノールに浸漬して室温下で１０分間インキュベートし、これを２回繰り返した。
４．切片を９５％エタノールに浸漬して室温下で１０分間インキュベートして、これを２回繰り返した後、脱イオン水で切片を２回洗い流した。
５．スライドガラス上の水分が少し減ったら１００μＬのヘマトキシリン染色液を加えて１分間染色した。
６．ヘマトキシリン染色液を吸い取って、水道水でスライドガラスを３回洗浄した。
７．１００μＬの分化液を滴加して１分間分化させた。
８．分化液を吸い取って、水道水でスライドガラスを２回、蒸留水でスライドガラスを１回洗浄した。
９．スライドガラスの表面の水分を吸い取って、２００μＬのエオシン染色液を滴加して４０秒間染色した。
１０．エオシン染色液を吸い取って、それぞれ７５％、８０％、９０％、１００％のエタノールでリンスして、それぞれ２０秒間、２０秒間、４０秒間、４０秒間脱水した。
１１．エタノールを乾燥させた後、５０μＬのキシレンを滴加して細胞を透過化させた。
１２．キシレンを完全に乾燥させた後、１滴の中性樹脂接着剤を滴加して、カバーガラスで封止し、顕微鏡で観察、撮影した。
２．パラフィン切片をキシレン溶液に浸漬して室温下で５分間インキュベートして脱蝋し、これを３回繰り返した後、脱イオン水で切片を２回洗い流した。
３．切片を無水エタノールに浸漬して室温下で１０分間インキュベートし、これを２回繰り返した。
４．切片を９５％エタノールに浸漬して室温下で１０分間インキュベートして、これを２回繰り返した後、脱イオン水で切片を２回洗い流した。
５．スライドガラス上の水分が少し減ったら１００μＬのヘマトキシリン染色液を加えて１分間染色した。
６．ヘマトキシリン染色液を吸い取って、水道水でスライドガラスを３回洗浄した。
７．１００μＬの分化液を滴加して１分間分化させた。
８．分化液を吸い取って、水道水でスライドガラスを２回、蒸留水でスライドガラスを１回洗浄した。
９．スライドガラスの表面の水分を吸い取って、２００μＬのエオシン染色液を滴加して４０秒間染色した。
１０．エオシン染色液を吸い取って、それぞれ７５％、８０％、９０％、１００％のエタノールでリンスして、それぞれ２０秒間、２０秒間、４０秒間、４０秒間脱水した。
１１．エタノールを乾燥させた後、５０μＬのキシレンを滴加して細胞を透過化させた。
１２．キシレンを完全に乾燥させた後、１滴の中性樹脂接着剤を滴加して、カバーガラスで封止し、顕微鏡で観察、撮影した。
【0191】
図１３は体外培養した胆管がんの胆汁サンプル初代腫瘍細胞のＨＥ染色の効果図を示している。これらの細胞はほとんど核細胞質比が高く、核が濃く染まり、核内にクロマチンが凝集しており、多核の形態で、細胞の大きさが不均一であるなどのがん細胞の特徴を有し、数十から数百の腫瘍細胞が凝集して一定の立体構造を有する腫瘍細胞塊を形成していることが示された。
【0192】
実施例３９：胆嚢がん、胆管がん胆汁サンプル初代細胞の免疫組織化学染色同定
以下の実施例で使用された試薬を説明する。
パラホルムアルデヒド（北京化学試薬公司、分析用純度）（超純水でパラホルムアルデヒド粉末を溶解して、４％（４ｇ／１００ｍＬ）パラホルムアルデヒド溶液を調製した。）、
過酸化水素水（北京化学試薬公司、３５％）、
ブロッキング用正常ヤギ血清（Ｓｏｌａｒｂｉｏ＃ＳＬ０３８）、
免疫組織化学一次抗体（Ａｂｃａｍ＃ａｂ２１５８３８）、
免疫組織化学二次抗体（Ａｂｃａｍ＃ａｂ２０５７１９）、
ＥＤＴＡ修復液（Ａｂｃａｍ＃ａｂ９３６８４）、
ＤＡＢ発色液（ＳｉｇｎａｌＳｔａｉｎ（登録商標）ＤＡＢ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｋｉｔ、８０５９Ｓ）。
以下の実施例で使用された試薬を説明する。
パラホルムアルデヒド（北京化学試薬公司、分析用純度）（超純水でパラホルムアルデヒド粉末を溶解して、４％（４ｇ／１００ｍＬ）パラホルムアルデヒド溶液を調製した。）、
過酸化水素水（北京化学試薬公司、３５％）、
ブロッキング用正常ヤギ血清（Ｓｏｌａｒｂｉｏ＃ＳＬ０３８）、
免疫組織化学一次抗体（Ａｂｃａｍ＃ａｂ２１５８３８）、
免疫組織化学二次抗体（Ａｂｃａｍ＃ａｂ２０５７１９）、
ＥＤＴＡ修復液（Ａｂｃａｍ＃ａｂ９３６８４）、
ＤＡＢ発色液（ＳｉｇｎａｌＳｔａｉｎ（登録商標）ＤＡＢ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｋｉｔ、８０５９Ｓ）。
【0193】
実施例３０の胆嚢がん、胆管がんの胆汁サンプル初代細胞培地（ヒト組換えタンパク質ＥＧＦの最終濃度は５０ｎｇ／ｍＬ、ヒト組換えタンパク質ｂＦＧＦの最終濃度は２５ｎｇ／ｍＬ、ヒト組換えタンパク質ＨＧＦの最終濃度は２５ｎｇ／ｍＬ、ヒト組換えタンパク質ＦＧＦ－１０の最終濃度は２５ｎｇ／ｍＬ、ヒト組換えタンパク質Ｗｎｔ－３ａの最終濃度は３００ｎｇ／ｍＬ、ヒト組換えタンパク質Ｎｏｇｇｉｎの最終濃度は２００ｎｇ／ｍＬ、ＳＢ２０２１９０の最終濃度は１０μＭ、Ａ８３－０１の最終濃度は０．５μＭ、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン（Ｎ－ａｃｅｔｙｌ－Ｌ－ｃｙｓｔｅｉｎｅ）の最終濃度は１ｍＭ、ニコチンアミド（Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ）の最終濃度は１０ｍＭ、コルチゾールの最終濃度は２５ｎｇ／ｍＬ、Ｙ－２７６３２の最終濃度は１０μＭ）で培養した胆嚢がん、胆管がん胆汁サンプル初代細胞塊を収集してパラフィン切片を作製し、次の手順で、ｐａｎ－ＣＫ抗体によって上皮由来の細胞を特徴づけていた。
【0194】
１．切片をキシレンＩに１０分間、そしてキシレンＩＩに１０分間浸漬した。
２．次に、無水エタノールＩ（５分）－無水エタノールＩＩ（５分）－９５％アルコール（５分）－８０％アルコール（５分）－７０％アルコール（５分）の順に浸漬し、その後、脱イオン水で２回洗い流し、各回は２分であった。
３．組織切片を修復キットに入れ、その後、適量の希釈済みのＥＤＴＡ修復液（ｐＨ９．０）を加え、液面は組織を超えていた。
４．中程度のマイクロ波をかけて１０分間修復を行い（液体が沸騰すると計時開始）、過程中は組織が乾かないよう注意する。
５．修復キットを電子レンジから取り出して、自然に冷却させ、修復液が室温に下がるとスライドガラスを取り出し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で３回洗い流し、各回は３分であった（洗い流す間、組織が破損しないようにする）。
６．調製した３％過酸化水素（脱イオン水で３０％過酸化水素を希釈したもの）を切片組織に滴加して内因性ペルオキシダーゼを遮断し、室温下で１５分間インキュベートし、ＰＢＳで３回洗い流し、各回は３分であった。
７．吸取紙でＰＢＳを吸い取って、スライドガラスに１０％ヤギ血清（二次抗体と同じ又は類似する種に由来）を滴加し、３７℃で６０分間ブロッキングした。
８．吸取紙でスライドガラス上の組織の周囲の液体を拭き取り、油性ペンを使って組織の周囲に円を描き、その後、希釈済みの一次抗体を滴加して、湿潤箱において４℃で一晩インキュベートした。
９．ＰＢＳで切片を３回洗い流し、各回は３分とし、吸取紙で切片を拭き取って西洋ワサビペルオキシダーゼ標識二次抗体を滴加して、室温下で６０分間インキュベートした。
１０．ＰＢＳで切片を３回洗い流し、各回は３分とし、ＰＢＳ液体を振り切って吸取紙で切片を拭き取り、各切片に調製したばかりのＤＡＢ発色液を滴加して、顕微鏡で観察し、陽性シグナルが出たら水道水で切片を洗い流して発色を停止させた。
１１．改めてヘマトキシリンで１分間染色し、水洗して酸性エタノール分化液で分化させ、また水道水で洗い流して青色に戻した。
１２．切片を水に入れて洗い流した後、７０％アルコール－８０％アルコール－９０％アルコール－９５％アルコール－無水エタノールＩＩ－無水エタノールＩＩ－キシレンＩ－キシレンＩＩの順に切片を浸漬して脱水して透明化させ、各試薬には２分間静置し、最後にドラフトチャンバーにおいて切片を通風乾燥させた。
１３．中性樹脂接着剤で封止して、カバーガラスをかけた。ドラフトチャンバーに入れて乾燥させた。
１４．乾燥させた切片は顕微鏡で観察又は撮影した。
２．次に、無水エタノールＩ（５分）－無水エタノールＩＩ（５分）－９５％アルコール（５分）－８０％アルコール（５分）－７０％アルコール（５分）の順に浸漬し、その後、脱イオン水で２回洗い流し、各回は２分であった。
３．組織切片を修復キットに入れ、その後、適量の希釈済みのＥＤＴＡ修復液（ｐＨ９．０）を加え、液面は組織を超えていた。
４．中程度のマイクロ波をかけて１０分間修復を行い（液体が沸騰すると計時開始）、過程中は組織が乾かないよう注意する。
５．修復キットを電子レンジから取り出して、自然に冷却させ、修復液が室温に下がるとスライドガラスを取り出し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で３回洗い流し、各回は３分であった（洗い流す間、組織が破損しないようにする）。
６．調製した３％過酸化水素（脱イオン水で３０％過酸化水素を希釈したもの）を切片組織に滴加して内因性ペルオキシダーゼを遮断し、室温下で１５分間インキュベートし、ＰＢＳで３回洗い流し、各回は３分であった。
７．吸取紙でＰＢＳを吸い取って、スライドガラスに１０％ヤギ血清（二次抗体と同じ又は類似する種に由来）を滴加し、３７℃で６０分間ブロッキングした。
８．吸取紙でスライドガラス上の組織の周囲の液体を拭き取り、油性ペンを使って組織の周囲に円を描き、その後、希釈済みの一次抗体を滴加して、湿潤箱において４℃で一晩インキュベートした。
９．ＰＢＳで切片を３回洗い流し、各回は３分とし、吸取紙で切片を拭き取って西洋ワサビペルオキシダーゼ標識二次抗体を滴加して、室温下で６０分間インキュベートした。
１０．ＰＢＳで切片を３回洗い流し、各回は３分とし、ＰＢＳ液体を振り切って吸取紙で切片を拭き取り、各切片に調製したばかりのＤＡＢ発色液を滴加して、顕微鏡で観察し、陽性シグナルが出たら水道水で切片を洗い流して発色を停止させた。
１１．改めてヘマトキシリンで１分間染色し、水洗して酸性エタノール分化液で分化させ、また水道水で洗い流して青色に戻した。
１２．切片を水に入れて洗い流した後、７０％アルコール－８０％アルコール－９０％アルコール－９５％アルコール－無水エタノールＩＩ－無水エタノールＩＩ－キシレンＩ－キシレンＩＩの順に切片を浸漬して脱水して透明化させ、各試薬には２分間静置し、最後にドラフトチャンバーにおいて切片を通風乾燥させた。
１３．中性樹脂接着剤で封止して、カバーガラスをかけた。ドラフトチャンバーに入れて乾燥させた。
１４．乾燥させた切片は顕微鏡で観察又は撮影した。
【0195】
図１４は体外培養した胆管がん初代腫瘍細胞塊の免疫組織化学染色の効果図を示ししている。細胞塊を形成している細胞がすべてｐａｎ－ＣＫ陽性で、上皮に由来していることから、本方法の培養で得たのは純度の高い腫瘍細胞であることが証明された。５つの胆嚢がん、胆管がんサンプル初代培養物の免疫組織化学染色同定を行ったところ、本方法で得た胆嚢がん、胆管がん胆汁サンプル初代細胞で、腫瘍細胞の比率が６４－８０％に達しているという統計結果であった（表４２）。
【0196】
実施例４０：マイクロプレートチップの加工
本実施例では、射出成形加工プロセスを用いて、ＰＭＭＡ（又はＰＳ、ＰＣ、ＣＯＣ、ＣＯＰ、ＬＡＳなどの）材料を加工して本発明の胃がん、胆嚢・胆管がん初代細胞を培養するためのマイクロプレートチップを得た。当該チップは胃がん又は胆嚢・胆管がん初代細胞の培養及び体外薬物感受性検出実験に用いることができる。マイクロプレートチップの設計図面を図１５に示す。
本実施例では、射出成形加工プロセスを用いて、ＰＭＭＡ（又はＰＳ、ＰＣ、ＣＯＣ、ＣＯＰ、ＬＡＳなどの）材料を加工して本発明の胃がん、胆嚢・胆管がん初代細胞を培養するためのマイクロプレートチップを得た。当該チップは胃がん又は胆嚢・胆管がん初代細胞の培養及び体外薬物感受性検出実験に用いることができる。マイクロプレートチップの設計図面を図１５に示す。
【0197】
実際の使用として、具体的にはＰＭＭＡ（又はＰＳ、ＰＣ、ＣＯＣ、ＣＯＰ、ＬＡＳなどの）材料を用いて図１５の図面に示すようなマイクロプレートチップの構造を作製し、その後、上記のＣＹＴＯＰ修飾プロセス（実施例２９参照）によりその表面にＣＹＴＯＰ修飾を行うと、前記胃がん又は胆嚢・胆管がん初代細胞培養に用いるマイクロプレートチップが得られた。
【産業上の利用可能性】
【0198】
本発明は新鮮な胃がん手術サンプル、胆嚢・胆管がん手術サンプルもしくは生検穿刺組織サンプル又は胆嚢がん、胆管がんの胆汁サンプルから、胃がん、胆嚢・胆管がん初代腫瘍細胞を抽出して培養する方法及び補助試薬を提供し、当該方法は次の利点を有する。組織サンプルの使用量が少なく、約２０ｍｇの手術サンプル又は約１０－２０ｍＬの胆汁サンプルだけを使用する。胃がん、胆嚢・胆管がん原発腫瘍初代腫瘍細胞の培養、又は胃がん、胆嚢・胆管がん転移病巣初代腫瘍細胞の培養に用いることができる。培養期間が短く、３－１０日間だけで１０６－１０７単位で初代腫瘍細胞を得られる。培養の安定性が高く、本方法を用いて適格のサンプルを体外培養したところ７０％の高い成功率であった。細胞の純度が高く、本方法で得た胃がん、胆嚢・胆管がん初代細胞培養物において、がん細胞の比率が６０－９５％に達しており、不要な細胞の干渉が少ない。本発明の方法で得た胃がん、胆嚢・胆管がん初代細胞培養物は様々な細胞レベルの体外実験、二世代配列決定、動物モデルの構築、細胞株の構築などに利用することができる。当該培養方法は胃がん、胆嚢・胆管がんの研究及び臨床診断治療分野で幅広く利用されることが予想される。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
