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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-02-13
(45)【発行日】2024-02-21
(54)【発明の名称】抗Ａベータ抗体、その抗原結合フラグメントおよびそれらの用途
(51)【国際特許分類】
C07K 16/18 20060101AFI20240214BHJP
C07K 16/46 20060101ALI20240214BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20240214BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240214BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20240214BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20240214BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240214BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240214BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20240214BHJP
C07K 1/16 20060101ALI20240214BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240214BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20240214BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240214BHJP
【ＦＩ】
C07K16/18 ZNA
C07K16/46
C12N15/13
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12P21/08
C07K1/16
A61K39/395 N
A61P25/00
A61P35/00
【請求項の数】
19
(21)【出願番号】P 2021500547
(86)(22)【出願日】2019-07-16
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2021-11-04
(86)【国際出願番号】 CN2019096159
(87)【国際公開番号】W WO2020015637
(87)【国際公開日】2020-01-23
【審査請求日】2022-06-24
(31)【優先権主張番号】201810782196.2
(32)【優先日】2018-07-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(73)【特許権者】
【識別番号】510166892
【氏名又は名称】ジエンス ヘンルイ メデイシンカンパニー リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＪＩＡＮＧＳＵ ＨＥＮＧＲＵＩ ＭＥＤＩＣＩＮＥ ＣＯ．，ＬＴＤ．
(73)【特許権者】
【識別番号】508209602
【氏名又は名称】シャンハイ ヘンルイ ファーマスーティカル カンパニー リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＳＨＡＮＧＨＡＩ ＨＥＮＧＲＵＩ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＣＯ．， ＬＴＤ．
(74)【代理人】
【識別番号】100147485
【弁理士】
【氏名又は名称】杉村 憲司
(74)【代理人】
【識別番号】230118913
【弁護士】
【氏名又は名称】杉村 光嗣
(74)【代理人】
【識別番号】100175477
【弁理士】
【氏名又は名称】高橋 林太郎
(72)【発明者】
【氏名】イン ファ
(72)【発明者】
【氏名】チャン リン
(72)【発明者】
【氏名】シ チンピン
(72)【発明者】
【氏名】チャン シャオミン
(72)【発明者】
【氏名】スン チャーカン
(72)【発明者】
【氏名】フ キユウ
(72)【発明者】
【氏名】タオ ウェイカン
【審査官】鳥居 敬司
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１２－５２４０２３（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２００６－５１９７６２（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｋ １６／００－１６／４６
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
抗Ａベータ抗体またはその抗原結合フラグメントであって、当該抗Ａベータ抗体はヒトＡベータに特異的に結合し、かつ抗体重鎖ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３領域と抗体軽鎖ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３領域とを含み、前記ＨＣＤＲ１は配列番号：１７に示され、前記ＨＣＤＲ２は配列番号：１８または５２に示され、前記ＨＣＤＲ３は配列番号：２７に示され、前記ＬＣＤＲ１は配列番号：２０に示され、前記ＬＣＤＲ２は配列番号：２１に示され、前記ＬＣＤＲ３は配列番号：２２に示される、抗Ａベータ抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項2】
前記抗体は、マウス抗体、キメラ抗体またはヒト化抗体である、請求項１に記載の抗Ａベータ抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項3】
前記抗体はマウス抗体であり、前記抗体は、配列番号：９に示されるか、またはそれに対して少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域；および／または配列番号：１０に示されるか、またはそれに対して少なくとも９５％の配列同一性を有する軽鎖可変領域
を含む、請求項２に記載の抗Ａベータ抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項4】
前記抗体は、配列番号：９に示した重鎖可変領域と配列番号：１０に示した軽鎖可変領域とを含む、請求項３に記載の抗Ａベータ抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項5】
前記抗体は、配列番号：５０に示されるか、またはそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変領域と、配列番号：５１に示されるか、またはそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変領域とを含む、請求項２に記載の抗Ａベータ抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項6】
前記抗体は定常領域を含む、請求項１に記載の抗Ａベータ抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項7】
前記定常領域は重鎖定常領域と軽鎖定常領域を含み、前記重鎖定常領域のアミノ酸配列は、配列番号：４２に示したとおりであるか、またはそれに対して少なくとも８５％の配列同一性を有し、かつ前記軽鎖定常領域のアミノ酸配列は、配列番号：４３に示したとおりであるか、またはそれに対して少なくとも８５％の配列同一性を有する、請求項６に記載の抗Ａベータ抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項8】
前記抗体は、配列番号：４０に示されるか、またはそれに対して少なくとも８５％の配列同一性を有する重鎖、および／または、配列番号：４１に示されるか、またはそれに対して少なくとも８５％の配列同一性を有する軽鎖を含む、請求項６に記載の抗Ａベータ抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項9】
前記抗体は、配列番号：４０に示した重鎖と配列番号：４１に示した軽鎖とを含む、請求項６に記載の抗Ａベータ抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項10】
請求項１に記載の抗Ａベータ抗体またはその抗原結合フラグメントであって、前記抗原結合フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、ｄｓＦｖ、および請求項１に記載のＣＤＲを含むペプチドの抗原結合フラグメントからなる群から選択される、抗Ａベータ抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項11】
請求項１～１０のいずれか一項に記載の抗Ａベータ抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする、核酸分子。
【請求項12】
請求項１１に記載の核酸分子を含む、組換えベクター。
【請求項13】
請求項１２に記載の組換えベクターを含む宿主細胞であって、前記宿主細胞は、原核細胞および真核細胞からなる群から選択される、宿主細胞。
【請求項14】
真核細胞である、請求項１３に記載の宿主細胞。
【請求項15】
前記真核細胞は哺乳動物細胞である、請求項１４に記載の宿主細胞。
【請求項16】
以下のステップを含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の抗Ａベータ抗体またはその抗原結合フラグメントを調製する方法：培養培地中で請求項１３～１５のいずれか一項に記載の宿主細胞を培養するステップと、その後に前記抗体を精製および回収するステップ。
【請求項17】
以下を含む医薬組成物：請求項１～１０のいずれか一項に記載の抗Ａベータ抗体またはその抗原結合フラグメント、および
１つ以上の薬学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤。
【請求項18】
Ａベータ媒介性の疾患または障害の治療または予防のための薬剤の調製における、請求項１～１０のいずれか一項に記載の抗Ａベータ抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたは請求項１７に記載の医薬組成物の使用。
【請求項19】
前記疾患は、アルツハイマー病、軽度認知障害、前頭側頭型認知症、レビー小体病、パーキンソン病、ピック病、ベバック病（Ｂｅｖａｃ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、コンゴ親和性アミロイド血管症、脳アミロイド血管症、ダウン症、多発性梗塞性認知症、ハンチントン病、クロイツフェルト・ヤコブ病、エイズ認知症症候群、うつ病、不安障害、恐怖症、ベル麻痺、てんかん、脳炎、多発性硬化症、神経筋障害、神経腫瘍障害、脳腫瘍、脳卒中による神経血管障害、神経免疫障害、神経障害性耳科学疾患、脊髄損傷による神経外傷、神経障害性疼痛による痛み、小児の神経および神経精神障害、睡眠障害、トゥレット症候群、軽度認知障害、血管性認知症、多発性梗塞性認知症、嚢胞性線維症、ゴーシェ病、ならびにその他の中枢神経系の運動障害および疾患からなる群から選択される神経変性疾患である、請求項１８に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、バイオテクノロジーの分野に属する。より具体的には、本開示は、抗β-アミロイド抗体およびその用途に関する。
【背景技術】
【0002】
本記載は、本発明に関する背景情報を提供するだけであり、必ずしも先行技術を構成するものではない。
【0003】
β－アミロイド（アミロイド－ベータ（Ａｍｙｌｏｉｄ－ｂｅｔａ）、アミロイド－ベータ（ａｍｙｌｏｉｄ－ｂｅｔａ）、Ａベータ（Ａｂｅｔａ）、Ａβ）は、β－およびγ－セクレターゼタンパク質分解によってアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）から産生される３９～４３アミノ酸を含むポリペプチドである。β－アミロイドは、さまざまな細胞によって産生され、血液、脳脊髄液および脳間質液を循環している。ほとんどのβ－アミロイドはシャペロン分子に結合し、少数が遊離状態で存在する。Ａβは神経毒性である。Ａβの含有量が増加すると、細胞によって代謝することができなくなる。代わりに、Ａβは細胞内に大量に蓄積されてＡβ老人斑を形成し、その結果、ニューロンの損傷または死を促進する。人体におけるＡβの最も一般的なサブタイプはＡβ１－４０とＡβ１－４２であり、これらのうちＡβ１－４２がより毒性が高く、凝集してＡβ斑のコアを形成し、神経毒性作用を引き起こしやすい（“Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗ”、２００９年、１５（２３）：３５７５－３５７７頁）。
【0004】
アルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ、Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ、ＡＤ）は、１９０６年にドイツ人の精神科医および神経内科医Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ Ａｌｏｉｓによって最初に発見され、彼の名前にちなんで命名された。アルツハイマー病は老人性痴呆としても知られており、慢性神経変性疾患である。ＡＤの主な臨床症状には、段階的な記憶喪失、認知障害、異常行動、および社会不安が含まれる。研究によると、ＡＤ患者は主に以下の病理学的特徴を有する：大脳皮質と海馬におけるβ－アミロイドの凝集によって形成された老人斑、タウタンパク質の異常な凝集によって形成された神経原線維変化、および皮質と海馬における神経細胞の減少。Ａβの沈着は、ニューロンの変性変化に関連しているだけでなく、星状細胞およびミクログリア細胞の活性化、血液脳関門の破壊、および微小循環の変化などを含む一連の病理学的事象を活性化することもできる。Ａβの沈着は、脳内の老人斑周辺の神経変性とＡＤ患者の死亡の主な原因である（Ｏｈ， Ｅ．Ｓ．， Ｔｒｏｎｃｏｓｏ， Ｊ．Ｃ． ＆ Ｆａｎｇｍａｒｋ Ｔｕｃｋｅｒ， Ｓ．Ｍ． Ｎｅｕｒｏｍｏｌ Ｍｅｄ（２００８年）１０：１９５頁）。
【0005】
Ａβの沈着は、アルツハイマー病の老人斑だけでなく、脳アミロイド血管症など（ＣＡＡ、コンゴ親和性アミロイド血管症とも呼ばれる）の他の脳アミロイド疾患でも大量に見出された。ＣＡＡに見られるＡβの沈着は主に短い形態のＡβ（Ａβ１－４０）から構成されており、少量のＡβ１－４２も含まれている（Ｗｉｌｃｏｃｋ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ １（２４）：１－１１頁（２００４年））。
【0006】
ＡＤの病因におけるＡβの重要な役割と、Ａβの毒性がその量、凝集の程度およびクリアランス速度に依存することとに基づいて、研究者は、Ａβの産生を減少させること、Ａβの蓄積と沈着を防ぐこと、およびＡβの毒性を妨げることによってＡＤの進行を遅延および阻止することを試みて、Ａβ疾患を妨げるためのさまざまな方法を継続的に開発してきた。Ａβに対するさまざまな抗体が公開されており、これには、アデュカヌマブ（Ｂｉｏｇｅｎ）、バピネオズマブ（Ｊａｎｓｓｅｎ、Ｅｌａｎ、Ｐｆｉｚｅｒ）、ソラネズマブ（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）、ガンテネルマブ（Ｈｏｆｆｍａｎ－ＬａＲｏｃｈｅ）、および特許出願ＷＯ１９９４０１７１９７Ａ１、ＷＯ１９９８０４４９５５Ａ１、ＷＯ２００３０１６４６６Ａ３、ＷＯ２００３０７０７６０Ａ３、ＷＯ２００４０７１４０８Ａ３、ＷＯ２００６０８１１７１Ａ１、ＷＯ２００７１０８７５６Ａ１、ＷＯ２００８０１１３４８Ａ３、ＷＯ２００８０８１００８Ａ１、ＷＯ２０１２０５１４９８Ａ３などに開示されている抗Ａβ抗体が含まれる。しかしながら、バピネオズマブおよびソラネズマブを含むほとんどの抗体は失敗に終わった。バピネオズマブおよびソラネズマブは大きな期待を寄せられたが、第ＩＩＩ相臨床試験で失敗した。現在、アデュカヌマブのみがまだ第ＩＩＩ相臨床試験中であり、ＡＤ治療の承認が見込まれる唯一の新しい抗Ａβ抗体であると考えられているが、販売に適格かどうかを確認するには、さらなる臨床試験の結果が依然として必要である。
【0007】
したがって、β－アミロイドによって引き起こされる疾患または障害（ＡＤなど）の治療のために、新規な構造を有する抗Ａベータ抗体を開発することが依然として緊急に必要とされている。
【発明の概要】
【0008】
本発明者らは、広範な実験的研究の後に、完全に新規な構造を有する抗Ａベータ抗体およびその抗原結合フラグメントを開発した。該抗Ａベータ抗体およびその抗原結合フラグメントは、ヒトＡベータに高い親和性で特異的に結合することができ、優れた効率を示す。それらは、Ａベータによって引き起こされる疾患または障害（例えば、アルツハイマー病）の治療または予防に有用であることが期待される。
【0009】
いくつかの実施形態では、本開示は、ヒトＡベータに特異的に結合する抗Ａベータ抗体またはその抗原結合フラグメントであって、前記抗体は、以下のアミノ酸配列から選択されるかまたはそれに対して少なくとも８５％の配列同一性を有する少なくとも１つのＣＤＲ領域を含む、抗Ａベータ抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する：
（１）配列番号：１１、１７または２３に示した重鎖ＨＣＤＲ１領域のアミノ酸配列；
（２）配列番号：１２、１８、２４または５２に示した重鎖ＨＣＤＲ２領域のアミノ酸配列；
（３）配列番号：１３、１９、２５または２７に示した重鎖ＨＣＤＲ３領域のアミノ酸配列；
（４）配列番号：１４または２０に示した軽鎖ＬＣＤＲ１領域のアミノ酸配列；
（５）配列番号：１５または２１に示した軽鎖ＬＣＤＲ２領域のアミノ酸配列；および
（６）配列番号：１６、２２、２６または５３に示した軽鎖ＬＣＤＲ３領域のアミノ酸配列。
（１）配列番号：１１、１７または２３に示した重鎖ＨＣＤＲ１領域のアミノ酸配列；
（２）配列番号：１２、１８、２４または５２に示した重鎖ＨＣＤＲ２領域のアミノ酸配列；
（３）配列番号：１３、１９、２５または２７に示した重鎖ＨＣＤＲ３領域のアミノ酸配列；
（４）配列番号：１４または２０に示した軽鎖ＬＣＤＲ１領域のアミノ酸配列；
（５）配列番号：１５または２１に示した軽鎖ＬＣＤＲ２領域のアミノ酸配列；および
（６）配列番号：１６、２２、２６または５３に示した軽鎖ＬＣＤＲ３領域のアミノ酸配列。
【0010】
上記のように少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列については、当該配列は、好ましくは、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し；より好ましくは、当該配列は、９０％超、９５％超または９９％超の配列同一性を有し、最も好ましくは、当該配列は少なくとも９５％の配列同一性を有する。少なくとも８５％の配列同一性を有する上記のアミノ酸配列は、１つ以上のアミノ酸の欠失、挿入または置換によって得ることができる。
【0011】
いくつかの実施形態では、前記抗Ａベータ抗体は、約１０－７Ｍまたはそれ以下の解離平衡定数（ＫＤ）でヒトＡβ１－４２フィブリルおよび／またはＡβ１－４２モノマーに結合し；好ましくは、約１０－８Ｍ、１０－９Ｍまたは１０－１０Ｍ未満、またはそれ以下の解離平衡定数（ＫＤ）でヒトＡベータに結合する。ＫＤ値は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００装置の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術によって決定され得る。
【0012】
好ましくは、前記ヒトＡベータは、Ａβ１－４２フィブリルおよびＡβ１－４２モノマーである。
【0013】
いくつかの好ましい実施形態では、前記抗Ａベータ抗体またはその抗原結合フラグメントは、以下のうちのいずれか１つに示されるようなＨＣＤＲ１－３領域またはＬＤＣＲ１－３領域を含む：
（ｉ）配列番号：１１、１２および１３のアミノ酸配列にそれぞれ示される抗体重鎖ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３領域；
（ｉｉ）配列番号：１７、１８および１９のアミノ酸配列にそれぞれ示される抗体重鎖ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３領域；
（ｉｉｉ）配列番号：２３、２４および２５のアミノ酸配列にそれぞれ示される抗体重鎖ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３領域；
（ｉｖ）配列番号：１７、１８および２７のアミノ酸配列にそれぞれ示される抗体重鎖ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３領域；
（ｖ）配列番号：１７、５２および１９のアミノ酸配列にそれぞれ示される抗体重鎖ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３領域；
（ｖｉ）配列番号：１７、５２および２７のアミノ酸配列にそれぞれ示される抗体重鎖ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３領域；
および／または
（ｖｉｉ）配列番号：１４、１５および１６のアミノ酸配列にそれぞれ示される抗体軽鎖ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３領域；
（ｖｉｉｉ）配列番号：２０、２１および２２のアミノ酸配列にそれぞれ示される抗体軽鎖ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３領域；
（ｖｉｉｉｉ）配列番号：２０、２１および２６のアミノ酸配列にそれぞれ示される抗体軽鎖ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３領域；または
（ｘ）配列番号：２０、２１および５３のアミノ酸配列にそれぞれ示される抗体軽鎖ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３領域。
（ｉ）配列番号：１１、１２および１３のアミノ酸配列にそれぞれ示される抗体重鎖ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３領域；
（ｉｉ）配列番号：１７、１８および１９のアミノ酸配列にそれぞれ示される抗体重鎖ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３領域；
（ｉｉｉ）配列番号：２３、２４および２５のアミノ酸配列にそれぞれ示される抗体重鎖ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３領域；
（ｉｖ）配列番号：１７、１８および２７のアミノ酸配列にそれぞれ示される抗体重鎖ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３領域；
（ｖ）配列番号：１７、５２および１９のアミノ酸配列にそれぞれ示される抗体重鎖ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３領域；
（ｖｉ）配列番号：１７、５２および２７のアミノ酸配列にそれぞれ示される抗体重鎖ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３領域；
および／または
（ｖｉｉ）配列番号：１４、１５および１６のアミノ酸配列にそれぞれ示される抗体軽鎖ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３領域；
（ｖｉｉｉ）配列番号：２０、２１および２２のアミノ酸配列にそれぞれ示される抗体軽鎖ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３領域；
（ｖｉｉｉｉ）配列番号：２０、２１および２６のアミノ酸配列にそれぞれ示される抗体軽鎖ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３領域；または
（ｘ）配列番号：２０、２１および５３のアミノ酸配列にそれぞれ示される抗体軽鎖ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３領域。
【0014】
いくつかの実施形態では、本開示の抗Ａベータ抗体またはその抗原結合フラグメントは、以下のＡ～Ｄから選択されるいずれかの抗Ａベータ抗体またはその抗原結合フラグメントである：
Ａ）配列番号：１１のアミノ酸配列に示した重鎖ＨＣＤＲ１領域、配列番号：１２のアミノ酸配列に示した重鎖ＨＣＤＲ２領域および配列番号：１３のアミノ酸配列に示した重鎖ＨＣＤＲ３領域、ならびに配列番号：１４のアミノ酸配列に示した軽鎖ＬＣＤＲ１領域、配列番号：１５のアミノ酸配列に示した軽鎖ＬＣＤＲ２領域および配列番号：１６のアミノ酸配列に示した軽鎖ＬＣＤＲ３領域を含む、抗Ａベータ抗体またはその抗原結合フラグメント；
Ｂ）配列番号：１７のアミノ酸配列に示した重鎖ＨＣＤＲ１領域、配列番号：１８または５２のアミノ酸配列に示した重鎖ＨＣＤＲ２領域および配列番号：１９のアミノ酸配列に示した重鎖ＨＣＤＲ３領域、ならびに配列番号：２０のアミノ酸配列に示した軽鎖ＬＣＤＲ１領域、配列番号：２１のアミノ酸配列に示した軽鎖ＬＣＤＲ２領域および配列番号：２２のアミノ酸配列に示した軽鎖ＬＣＤＲ３領域を含む、抗Ａベータ抗体またはその抗原結合フラグメント；
Ｃ）配列番号：２３のアミノ酸配列に示した重鎖ＨＣＤＲ１領域、配列番号：２４のアミノ酸配列に示した重鎖ＨＣＤＲ２領域および配列番号：２５のアミノ酸配列に示した重鎖ＨＣＤＲ３領域、ならびに配列番号：２０のアミノ酸配列に示した軽鎖ＬＣＤＲ１領域、配列番号：２１のアミノ酸配列に示した軽鎖ＬＣＤＲ２領域および配列番号：２６または５３のアミノ酸配列に示した軽鎖ＬＣＤＲ３領域を含む、抗Ａベータ抗体またはその抗原結合フラグメント；および
Ｄ）配列番号：１７のアミノ酸配列に示した重鎖ＨＣＤＲ１領域、配列番号：１８または５２のアミノ酸配列に示した重鎖ＨＣＤＲ２領域および配列番号：２７のアミノ酸配列に示した重鎖ＨＣＤＲ３領域、ならびに配列番号：２０のアミノ酸配列に示した軽鎖ＬＣＤＲ１領域、配列番号：２１のアミノ酸配列に示した軽鎖ＬＣＤＲ２領域および配列番号：２２のアミノ酸配列に示した軽鎖ＬＣＤＲ３領域を含む、抗Ａベータ抗体またはその抗原結合フラグメント。
Ａ）配列番号：１１のアミノ酸配列に示した重鎖ＨＣＤＲ１領域、配列番号：１２のアミノ酸配列に示した重鎖ＨＣＤＲ２領域および配列番号：１３のアミノ酸配列に示した重鎖ＨＣＤＲ３領域、ならびに配列番号：１４のアミノ酸配列に示した軽鎖ＬＣＤＲ１領域、配列番号：１５のアミノ酸配列に示した軽鎖ＬＣＤＲ２領域および配列番号：１６のアミノ酸配列に示した軽鎖ＬＣＤＲ３領域を含む、抗Ａベータ抗体またはその抗原結合フラグメント；
Ｂ）配列番号：１７のアミノ酸配列に示した重鎖ＨＣＤＲ１領域、配列番号：１８または５２のアミノ酸配列に示した重鎖ＨＣＤＲ２領域および配列番号：１９のアミノ酸配列に示した重鎖ＨＣＤＲ３領域、ならびに配列番号：２０のアミノ酸配列に示した軽鎖ＬＣＤＲ１領域、配列番号：２１のアミノ酸配列に示した軽鎖ＬＣＤＲ２領域および配列番号：２２のアミノ酸配列に示した軽鎖ＬＣＤＲ３領域を含む、抗Ａベータ抗体またはその抗原結合フラグメント；
Ｃ）配列番号：２３のアミノ酸配列に示した重鎖ＨＣＤＲ１領域、配列番号：２４のアミノ酸配列に示した重鎖ＨＣＤＲ２領域および配列番号：２５のアミノ酸配列に示した重鎖ＨＣＤＲ３領域、ならびに配列番号：２０のアミノ酸配列に示した軽鎖ＬＣＤＲ１領域、配列番号：２１のアミノ酸配列に示した軽鎖ＬＣＤＲ２領域および配列番号：２６または５３のアミノ酸配列に示した軽鎖ＬＣＤＲ３領域を含む、抗Ａベータ抗体またはその抗原結合フラグメント；および
Ｄ）配列番号：１７のアミノ酸配列に示した重鎖ＨＣＤＲ１領域、配列番号：１８または５２のアミノ酸配列に示した重鎖ＨＣＤＲ２領域および配列番号：２７のアミノ酸配列に示した重鎖ＨＣＤＲ３領域、ならびに配列番号：２０のアミノ酸配列に示した軽鎖ＬＣＤＲ１領域、配列番号：２１のアミノ酸配列に示した軽鎖ＬＣＤＲ２領域および配列番号：２２のアミノ酸配列に示した軽鎖ＬＣＤＲ３領域を含む、抗Ａベータ抗体またはその抗原結合フラグメント。
【0015】
いくつかの実施形態では、前記抗Ａベータ抗体またはその抗原結合フラグメントは、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、または完全ヒト抗体である。
【0016】
いくつかの実施形態では、前記抗Ａベータ抗体またはその抗原結合フラグメントはマウス抗体であり、前記抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号：３、５、７もしくは９に示されるか、またはそれに対して少なくとも８５％の配列同一性を有し；かつ／または
前記抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号：４、６、８もしくは１０に示されるか、またはそれに対して少なくとも８５％の配列同一性を有する。
前記抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号：４、６、８もしくは１０に示されるか、またはそれに対して少なくとも８５％の配列同一性を有する。
【0017】
上記のように少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列については、当該配列は、好ましくは、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し；より好ましくは、当該配列は、９０％超、９５％超または９９％超の配列同一性を有し、最も好ましくは、当該配列は少なくとも９５％の配列同一性を有する。少なくとも８５％の配列同一性を有する上記のアミノ酸配列は、１つ以上のアミノ酸の欠失、挿入または置換によって得ることができる。好ましくは、前記抗体は、約１０－７Ｍまたはそれ以下の解離平衡定数（ＫＤ）でヒトＡベータに結合する。いくつかの実施形態では、前記抗体は、約１０－８Ｍ、１０－９Ｍまたは１０－１０Ｍ未満、またはそれ以下の解離平衡定数（ＫＤ）でヒトＡベータに結合し、ＫＤ値は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００装置の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術によって決定され得る。好ましくは、前記ヒトＡベータは、Ａβ１－４２フィブリルおよびＡβ１－４２モノマーである。
【0018】
いくつかの実施形態では、前記抗Ａベータ抗体またはその抗原結合フラグメントは、以下のＥ～Ｈから選択されるいずれかの抗Ａベータ抗体またはその抗原結合フラグメントである：
Ｅ）配列番号：３のアミノ酸配列に示した重鎖可変領域と配列番号：４のアミノ酸配列に示した軽鎖可変領域とを含む、抗Ａベータ抗体またはその抗原結合フラグメント；
Ｆ）配列番号：５のアミノ酸配列に示した重鎖可変領域と配列番号：６のアミノ酸配列に示した軽鎖可変領域とを含む、抗Ａベータ抗体またはその抗原結合フラグメント；
Ｇ）配列番号：７のアミノ酸配列に示した重鎖可変領域と配列番号：８のアミノ酸配列に示した軽鎖可変領域とを含む、抗Ａベータ抗体またはその抗原結合フラグメント；および
Ｈ）配列番号：９のアミノ酸配列に示した重鎖可変領域と配列番号：１０のアミノ酸配列に示した軽鎖可変領域とを含む、抗Ａベータ抗体またはその抗原結合フラグメント。
Ｅ）配列番号：３のアミノ酸配列に示した重鎖可変領域と配列番号：４のアミノ酸配列に示した軽鎖可変領域とを含む、抗Ａベータ抗体またはその抗原結合フラグメント；
Ｆ）配列番号：５のアミノ酸配列に示した重鎖可変領域と配列番号：６のアミノ酸配列に示した軽鎖可変領域とを含む、抗Ａベータ抗体またはその抗原結合フラグメント；
Ｇ）配列番号：７のアミノ酸配列に示した重鎖可変領域と配列番号：８のアミノ酸配列に示した軽鎖可変領域とを含む、抗Ａベータ抗体またはその抗原結合フラグメント；および
Ｈ）配列番号：９のアミノ酸配列に示した重鎖可変領域と配列番号：１０のアミノ酸配列に示した軽鎖可変領域とを含む、抗Ａベータ抗体またはその抗原結合フラグメント。
【0019】
本開示の上記の抗Ａベータ抗体またはその抗原結合フラグメントのいくつかの実施形態では、前記抗体はヒト化抗体である。好ましくは、前記抗体の前記ＦＲ領域配列はヒト生殖細胞系列抗体のＦＲ領域配列またはそのバリアントに由来する。好ましくは、必要に応じて、前記バリアントは、１つ以上のアミノ酸欠失、挿入または置換を含み；より好ましくは、前記ＦＲ領域のバリアントは、ヒト抗体の前記軽鎖フレームワーク領域および／または前記重鎖フレームワーク領域にそれぞれ最大１０個のアミノ酸復帰突然変異を有する。
【0020】
いくつかの実施形態では、前記抗Ａベータ抗体またはその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号：４４、４６、４８または５０に示されるか、またはそれに対して少なくとも８５％の配列同一性を有し；かつ／または、
前記抗体の軽鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号：４５、４７、４９または５１に示されるか、またはそれに対して少なくとも８５％の配列同一性を有する。
前記抗体の軽鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号：４５、４７、４９または５１に示されるか、またはそれに対して少なくとも８５％の配列同一性を有する。
【0021】
上記のように少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列については、当該配列は、好ましくは、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し；より好ましくは、当該配列は、９０％超、９５％超または９９％超の配列同一性を有し、最も好ましくは、当該配列は少なくとも９５％の配列同一性を有する。少なくとも８５％の配列同一性を有する上記のアミノ酸配列は、１つ以上のアミノ酸の欠失、挿入または置換によって得ることができる。好ましくは、前記抗体は、約１０－７Ｍまたはそれ以下の解離平衡定数（ＫＤ）でヒトＡベータに結合する。いくつかの実施形態では、前記抗体は、約１０－８Ｍ、１０－９Ｍまたは１０－１０Ｍ未満、またはそれ以下の解離平衡定数（ＫＤ）でヒトＡベータに結合し、ＫＤ値は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００装置の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術によって決定され得る。好ましくは、前記ヒトＡベータは、Ａβ１－４２フィブリルおよびＡβ１－４２モノマーである。
【0022】
いくつかの実施形態では、前記抗体は、以下のａ）～ｄ）のうちのいずれかの抗Ａベータ抗体またはその抗原結合フラグメントから選択されるヒト化抗体である：
ａ）抗Ａベータ抗体またはその抗原結合フラグメントであって、当該抗体の重鎖可変領域は、配列番号：４４に示した重鎖可変領域に対して少なくとも９０％の配列同一性を有し、当該抗体の軽鎖可変領域は、配列番号：４５に示した軽鎖可変領域に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、抗Ａベータ抗体またはその抗原結合フラグメント；
ｂ）抗Ａベータ抗体またはその抗原結合フラグメントであって、当該抗体の重鎖可変領域は、配列番号：４６に示した重鎖可変領域に対して少なくとも９０％の配列同一性を有し、当該抗体の軽鎖可変領域は、配列番号：４７に示した軽鎖可変領域に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、抗Ａベータ抗体またはその抗原結合フラグメント；
ｃ）抗Ａベータ抗体またはその抗原結合フラグメントであって、当該抗体の重鎖可変領域は、配列番号：４８に示した重鎖可変領域に対して少なくとも９０％の配列同一性を有し、当該抗体の軽鎖可変領域は、配列番号：４９に示した軽鎖可変領域に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、抗Ａベータ抗体またはその抗原結合フラグメント；および
ｄ）抗Ａベータ抗体またはその抗原結合フラグメントであって、当該抗体の重鎖可変領域は、配列番号：５０に示した重鎖可変領域に対して少なくとも９０％の配列同一性を有し、当該抗体の軽鎖可変領域は、配列番号：５１に示した軽鎖可変領域に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、抗Ａベータ抗体またはその抗原結合フラグメント。ここで、上記の少なくとも９０％の配列同一性には、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性が含まれる。
ａ）抗Ａベータ抗体またはその抗原結合フラグメントであって、当該抗体の重鎖可変領域は、配列番号：４４に示した重鎖可変領域に対して少なくとも９０％の配列同一性を有し、当該抗体の軽鎖可変領域は、配列番号：４５に示した軽鎖可変領域に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、抗Ａベータ抗体またはその抗原結合フラグメント；
ｂ）抗Ａベータ抗体またはその抗原結合フラグメントであって、当該抗体の重鎖可変領域は、配列番号：４６に示した重鎖可変領域に対して少なくとも９０％の配列同一性を有し、当該抗体の軽鎖可変領域は、配列番号：４７に示した軽鎖可変領域に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、抗Ａベータ抗体またはその抗原結合フラグメント；
ｃ）抗Ａベータ抗体またはその抗原結合フラグメントであって、当該抗体の重鎖可変領域は、配列番号：４８に示した重鎖可変領域に対して少なくとも９０％の配列同一性を有し、当該抗体の軽鎖可変領域は、配列番号：４９に示した軽鎖可変領域に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、抗Ａベータ抗体またはその抗原結合フラグメント；および
ｄ）抗Ａベータ抗体またはその抗原結合フラグメントであって、当該抗体の重鎖可変領域は、配列番号：５０に示した重鎖可変領域に対して少なくとも９０％の配列同一性を有し、当該抗体の軽鎖可変領域は、配列番号：５１に示した軽鎖可変領域に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、抗Ａベータ抗体またはその抗原結合フラグメント。ここで、上記の少なくとも９０％の配列同一性には、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性が含まれる。
【0023】
いくつかの実施形態では、前記抗体は、以下のうちのいずれかに示した可変領域を含むヒト化抗体である：
ａ）配列番号：１１、配列番号：１２および配列番号：１３にそれぞれ示したＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３、ならびに１Ｅ、７１Ａおよび９４Ｒからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸復帰突然変異を含有するＦＲ領域を含む抗体重鎖可変領域；および、配列番号：１４、配列番号：１５および配列番号：１６にそれぞれ示したＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含む抗体軽鎖可変領域；
ｂ）配列番号：１７および配列番号：１９にそれぞれ示したＨＣＤＲ１およびＨＣＤＲ３と配列番号：１８または５２に示したＨＣＤＲ２、ならびに２８Ａおよび８２Ｂ Ｔからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸復帰突然変異を含有するＦＲ領域を含む抗体重鎖可変領域；および、配列番号：２０、配列番号：２１および配列番号：２２にそれぞれ示したＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含む抗体軽鎖可変領域；
ｃ）配列番号：２３、配列番号：２４および配列番号：２５にそれぞれ示したＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む抗体重鎖可変領域；および、配列番号：２０および配列番号：２１にそれぞれ示したＬＣＤＲ１およびＬＣＤＲ２と配列番号：２６または５３に示したＬＣＤＲ３、ならびに２Ｖおよび４５Ｋからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸復帰突然変異を含有するＦＲ領域を含む抗体軽鎖可変領域；および
ｄ）配列番号：１７および配列番号：２７にそれぞれ示したＨＣＤＲ１およびＨＣＤＲ３と配列番号：１８または５２に示したＨＣＤＲ２とを含む抗体重鎖可変領域；および、配列番号：２０、配列番号：２１および配列番号：２２にそれぞれ示したＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３、ならびに２Ｖのアミノ酸復帰突然変異を含有するＦＲ領域を含む抗体軽鎖可変領域。
ａ）配列番号：１１、配列番号：１２および配列番号：１３にそれぞれ示したＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３、ならびに１Ｅ、７１Ａおよび９４Ｒからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸復帰突然変異を含有するＦＲ領域を含む抗体重鎖可変領域；および、配列番号：１４、配列番号：１５および配列番号：１６にそれぞれ示したＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含む抗体軽鎖可変領域；
ｂ）配列番号：１７および配列番号：１９にそれぞれ示したＨＣＤＲ１およびＨＣＤＲ３と配列番号：１８または５２に示したＨＣＤＲ２、ならびに２８Ａおよび８２Ｂ Ｔからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸復帰突然変異を含有するＦＲ領域を含む抗体重鎖可変領域；および、配列番号：２０、配列番号：２１および配列番号：２２にそれぞれ示したＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含む抗体軽鎖可変領域；
ｃ）配列番号：２３、配列番号：２４および配列番号：２５にそれぞれ示したＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む抗体重鎖可変領域；および、配列番号：２０および配列番号：２１にそれぞれ示したＬＣＤＲ１およびＬＣＤＲ２と配列番号：２６または５３に示したＬＣＤＲ３、ならびに２Ｖおよび４５Ｋからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸復帰突然変異を含有するＦＲ領域を含む抗体軽鎖可変領域；および
ｄ）配列番号：１７および配列番号：２７にそれぞれ示したＨＣＤＲ１およびＨＣＤＲ３と配列番号：１８または５２に示したＨＣＤＲ２とを含む抗体重鎖可変領域；および、配列番号：２０、配列番号：２１および配列番号：２２にそれぞれ示したＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３、ならびに２Ｖのアミノ酸復帰突然変異を含有するＦＲ領域を含む抗体軽鎖可変領域。
【0024】
いくつかの実施形態では、前記抗体は、以下のうちのいずれかに示した可変領域を含むヒト化抗体である：
ａ）配列番号：６６のアミノ酸配列に示した抗体重鎖可変領域またはそのＦＲ領域バリアント；および、配列番号：６７のアミノ酸配列に示した抗体軽鎖可変領域またはそのＦＲ領域バリアント；
ｂ）配列番号：６８のアミノ酸配列に示した抗体重鎖可変領域またはそのＦＲ領域バリアント；および、配列番号：６９のアミノ酸配列に示した抗体軽鎖可変領域またはそのＦＲ領域バリアント；
ｃ）配列番号：７０のアミノ酸配列に示した抗体重鎖可変領域またはそのＦＲ領域バリアント；および、配列番号：７１のアミノ酸配列に示した抗体軽鎖可変領域またはそのＦＲ領域バリアント；および
ｄ）配列番号：７２のアミノ酸配列に示した抗体重鎖可変領域またはそのＦＲ領域バリアント；および、配列番号：７３のアミノ酸配列に示した抗体軽鎖可変領域またはそのＦＲ領域バリアント；ここで、前記ＦＲ領域バリアントは、軽鎖フレームワーク領域および／または重鎖フレームワーク領域に別々に最大１０個のアミノ酸復帰変異を有する。
ａ）配列番号：６６のアミノ酸配列に示した抗体重鎖可変領域またはそのＦＲ領域バリアント；および、配列番号：６７のアミノ酸配列に示した抗体軽鎖可変領域またはそのＦＲ領域バリアント；
ｂ）配列番号：６８のアミノ酸配列に示した抗体重鎖可変領域またはそのＦＲ領域バリアント；および、配列番号：６９のアミノ酸配列に示した抗体軽鎖可変領域またはそのＦＲ領域バリアント；
ｃ）配列番号：７０のアミノ酸配列に示した抗体重鎖可変領域またはそのＦＲ領域バリアント；および、配列番号：７１のアミノ酸配列に示した抗体軽鎖可変領域またはそのＦＲ領域バリアント；および
ｄ）配列番号：７２のアミノ酸配列に示した抗体重鎖可変領域またはそのＦＲ領域バリアント；および、配列番号：７３のアミノ酸配列に示した抗体軽鎖可変領域またはそのＦＲ領域バリアント；ここで、前記ＦＲ領域バリアントは、軽鎖フレームワーク領域および／または重鎖フレームワーク領域に別々に最大１０個のアミノ酸復帰変異を有する。
【0025】
いくつかの実施形態では、本開示の上記の抗Ａベータ抗体またはその抗原結合フラグメントは、以下のＭ～Ｐから選択されるいずれかの抗Ａベータ抗体またはその抗原結合フラグメントである：
Ｍ）配列番号：４４のアミノ酸配列に示した重鎖可変領域と、配列番号：４５のアミノ酸配列に示した軽鎖可変領域とを含む、抗Ａベータ抗体またはその抗原結合フラグメント；
Ｎ）配列番号：４６のアミノ酸配列に示した重鎖可変領域と、配列番号：４７のアミノ酸配列に示した軽鎖可変領域とを含む、抗Ａベータ抗体またはその抗原結合フラグメント；
Ｏ）配列番号：４８のアミノ酸配列に示した重鎖可変領域と、配列番号：４９のアミノ酸配列に示した軽鎖可変領域とを含む、抗Ａベータ抗体またはその抗原結合フラグメント；
Ｐ）配列番号：５０のアミノ酸配列に示した重鎖可変領域と、配列番号：５１のアミノ酸配列に示した軽鎖可変領域とを含む、抗Ａベータ抗体またはその抗原結合フラグメント。
Ｍ）配列番号：４４のアミノ酸配列に示した重鎖可変領域と、配列番号：４５のアミノ酸配列に示した軽鎖可変領域とを含む、抗Ａベータ抗体またはその抗原結合フラグメント；
Ｎ）配列番号：４６のアミノ酸配列に示した重鎖可変領域と、配列番号：４７のアミノ酸配列に示した軽鎖可変領域とを含む、抗Ａベータ抗体またはその抗原結合フラグメント；
Ｏ）配列番号：４８のアミノ酸配列に示した重鎖可変領域と、配列番号：４９のアミノ酸配列に示した軽鎖可変領域とを含む、抗Ａベータ抗体またはその抗原結合フラグメント；
Ｐ）配列番号：５０のアミノ酸配列に示した重鎖可変領域と、配列番号：５１のアミノ酸配列に示した軽鎖可変領域とを含む、抗Ａベータ抗体またはその抗原結合フラグメント。
【0026】
いくつかの実施形態では、前記抗Ａベータ抗体またはその抗原結合フラグメントは、定常領域をさらに含む。
【0027】
いくつかの実施形態では、前記抗体重鎖定常領域はヒトＩｇＧ１定常領域であり、好ましくは、前記抗体重鎖定常領域のアミノ酸配列は、配列番号：４２に示されるとおりであるか、またはそれに対して少なくとも８５％の配列同一性を有し；前記抗体軽鎖定常領域は、ヒトカッパ（κ）定常領域から選択され、最も好ましくは、前記抗体軽鎖定常領域のアミノ酸配列は、配列番号：４３に示されるとおりであるか、またはそれに対して少なくとも８５％の配列同一性を有する。
【0028】
上記のように少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列については、当該配列は、好ましくは、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し；より好ましくは、当該配列は、９０％超、９５％超または９９％超の配列同一性を有し、最も好ましくは、当該配列は少なくとも９５％の配列同一性を有する。少なくとも８５％の配列同一性を有する上記のアミノ酸配列は、１つ以上のアミノ酸の欠失、挿入または置換によって得ることができる。
【0029】
いくつかの実施形態では、前記抗Ａベータ抗体の重鎖アミノ酸配列は、配列番号：３０、３４、３８または４０に示されるか、またはそれに対して少なくとも８５％の配列同一性を有し、かつ／または
前記抗体の軽鎖アミノ酸配列は、配列番号：３１、３５、３９または４１に示されるか、またはそれに対して少なくとも８５％の配列同一性を有する。
前記抗体の軽鎖アミノ酸配列は、配列番号：３１、３５、３９または４１に示されるか、またはそれに対して少なくとも８５％の配列同一性を有する。
【0030】
上記のように少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列については、当該配列は、好ましくは、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し；より好ましくは、当該配列は、９０％超、９５％超または９９％超の配列同一性を有し、最も好ましくは、当該配列は少なくとも９５％の配列同一性を有する。少なくとも８５％の配列同一性を有する上記のアミノ酸配列は、１つ以上のアミノ酸の欠失、挿入または置換によって得ることができる。好ましくは、前記抗体は、約１０－７Ｍまたはそれ以下の解離平衡定数（ＫＤ）でヒトＡベータに結合する。いくつかの実施形態では、前記抗体は、約１０－８Ｍ、１０－９Ｍまたは１０－１０Ｍ未満、またはそれ以下の解離平衡定数（ＫＤ）でヒトＡベータに結合し、ＫＤ値は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００装置の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術によって決定され得る。好ましくは、前記ヒトＡベータは、Ａβ１－４２フィブリルおよびＡβ１－４２モノマーである。
【0031】
いくつかの実施形態では、前記抗Ａベータ抗体またはその抗原結合フラグメントは、以下のＱ～Ｔから選択されるいずれかの抗Ａベータ抗体またはその抗原結合フラグメントである：
Ｑ）配列番号：３０のアミノ酸配列に示した重鎖と配列番号：３１のアミノ酸配列に示した軽鎖とを含む、抗Ａベータ抗体またはその抗原結合フラグメント；
Ｒ）配列番号：３４のアミノ酸配列に示した重鎖と配列番号：３５のアミノ酸配列に示した軽鎖とを含む、抗Ａベータ抗体またはその抗原結合フラグメント；
Ｓ）配列番号：３８のアミノ酸配列に示した重鎖と配列番号：３９のアミノ酸配列に示した軽鎖とを含む、抗Ａベータ抗体またはその抗原結合フラグメント；および
Ｔ）配列番号：４０のアミノ酸配列に示した重鎖と配列番号：４１のアミノ酸配列に示した軽鎖とを含む、抗Ａベータ抗体またはその抗原結合フラグメント。
Ｑ）配列番号：３０のアミノ酸配列に示した重鎖と配列番号：３１のアミノ酸配列に示した軽鎖とを含む、抗Ａベータ抗体またはその抗原結合フラグメント；
Ｒ）配列番号：３４のアミノ酸配列に示した重鎖と配列番号：３５のアミノ酸配列に示した軽鎖とを含む、抗Ａベータ抗体またはその抗原結合フラグメント；
Ｓ）配列番号：３８のアミノ酸配列に示した重鎖と配列番号：３９のアミノ酸配列に示した軽鎖とを含む、抗Ａベータ抗体またはその抗原結合フラグメント；および
Ｔ）配列番号：４０のアミノ酸配列に示した重鎖と配列番号：４１のアミノ酸配列に示した軽鎖とを含む、抗Ａベータ抗体またはその抗原結合フラグメント。
【0032】
いくつかの実施形態では、本開示の抗原結合フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、ｄｓＦｖ、およびＣＤＲを含むペプチドの抗原結合フラグメントからなる群から選択される。
【0033】
いくつかの実施形態では、ヒトＡベータへの結合について上記の抗体またはその抗原結合フラグメントと競合するか、または同じＡベータ抗原エピトープへの結合について上記の抗体またはその抗原結合フラグメントと競合する、抗Ａベータ抗体が提供される。
【0034】
いくつかの実施形態では、本開示は、上述したいずれかの抗Ａベータ抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする核酸分子も提供する。
【0035】
いくつかの実施形態では、前記核酸分子は、以下のＵ～Ｚから選択されるいずれかの核酸分子である：
Ｕ）配列番号：５２に示したヌクレオチド配列またはそれに対して少なくとも８５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、かつ／または、配列番号：５３に示したヌクレオチド配列またはそれに対して少なくとも８５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、核酸分子；
Ｖ）配列番号：５４に示したヌクレオチド配列またはそれに対して少なくとも８５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、かつ／または、配列番号：５５に示したヌクレオチド配列またはそれに対して少なくとも８５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、核酸分子；
Ｗ）配列番号：５６に示したヌクレオチド配列またはそれに対して少なくとも８５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、かつ／または、配列番号：５７に示したヌクレオチド配列またはそれに対して少なくとも８５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、核酸分子；および
Ｚ）配列番号：５８に示したヌクレオチド配列またはそれに対して少なくとも８５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、かつ／または、配列番号：５９に示したヌクレオチド配列またはそれに対して少なくとも８５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
Ｕ）配列番号：５２に示したヌクレオチド配列またはそれに対して少なくとも８５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、かつ／または、配列番号：５３に示したヌクレオチド配列またはそれに対して少なくとも８５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、核酸分子；
Ｖ）配列番号：５４に示したヌクレオチド配列またはそれに対して少なくとも８５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、かつ／または、配列番号：５５に示したヌクレオチド配列またはそれに対して少なくとも８５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、核酸分子；
Ｗ）配列番号：５６に示したヌクレオチド配列またはそれに対して少なくとも８５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、かつ／または、配列番号：５７に示したヌクレオチド配列またはそれに対して少なくとも８５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、核酸分子；および
Ｚ）配列番号：５８に示したヌクレオチド配列またはそれに対して少なくとも８５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、かつ／または、配列番号：５９に示したヌクレオチド配列またはそれに対して少なくとも８５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
【0036】
一態様では、本開示は、上記の核酸分子を含む組換えベクターも提供する。
【0037】
一態様では、本開示は、上記の組換えベクターで形質転換することによって得られる宿主細胞も提供し；前記宿主細胞は、原核細胞および真核細胞からなる群から選択され、好ましくは真核細胞であり、より好ましくはＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣細胞株）およびＮＳ０細胞を含む哺乳動物細胞である。
【0038】
別の態様では、本開示は、以下のステップを含む、上記の抗Ａベータ抗体またはその抗原結合フラグメントを調製する方法を提供する：培養培地中で上記の宿主細胞を培養するステップと、その後に前記抗体を精製および回収するステップ。
【0039】
別の態様では、本開示は、以下を含む医薬組成物も提供する：上記の抗Ａベータ抗体またはその抗原結合フラグメント、および１つ以上の薬学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤。
【0040】
別の態様では、本開示は、Ａベータによって引き起こされる疾患または障害の治療または予防のための薬剤の調製における、上記の抗Ａベータ抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたは上記の医薬組成物の使用も提供する。
【0041】
別の態様では、本開示は、Ａベータによって引き起こされる疾患または障害を治療または予防するための方法であって、治療有効量の上記の抗Ａベータ抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたは上記の医薬組成物を、前記疾患または障害を有する患者に投与することを含む、方法も提供する。
【0042】
別の態様では、本開示は、Ａベータ媒介性の疾患または障害の治療用の薬剤として使用するための、上記の抗Ａベータ抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたは上記の医薬組成物も提供する。
【0043】
いくつかの実施形態では、上記の疾患または障害は、アルツハイマー病、軽度認知障害、前頭側頭型認知症、レビー小体病、パーキンソン病、ピック病、ベバック病（Ｂｅｖａｃ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、コンゴ親和性アミロイド血管症、脳アミロイド血管症、ダウン症、多発性梗塞性認知症、ハンチントン病、クロイツフェルト・ヤコブ病、エイズ認知症症候群、うつ病、不安障害、恐怖症、ベル麻痺、てんかん、脳炎、多発性硬化症、神経筋障害、神経腫瘍障害、脳腫瘍、脳卒中による神経血管障害、神経免疫障害、神経障害性耳科学疾患、脊髄損傷による神経外傷、神経障害性疼痛による痛み、小児の神経および神経精神障害、睡眠障害、トゥレット症候群、軽度認知障害、血管性認知症、多発性梗塞性認知症、嚢胞性線維症、ゴーシェ病、ならびにその他の中枢神経系の運動障害および疾患からなる群から選択される神経変性疾患である。いくつかの実施形態では、前記疾患はアルツハイマー病である。
【0044】
いくつかの実施形態では、本開示は、治療有効量の上記の抗Ａベータ抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたは上記の医薬組成物を患者に投与することを含む、アルツハイマー病を治療または予防するための方法も提供する。
【0045】
本開示の抗Ａベータ抗体またはその抗原結合フラグメントは、生化学的試験およびｉｎ ｖｉｖｏ薬力学的アッセイの両方において良好な効率を示す。例えば、親和性検出アッセイにおいて、本開示の抗Ａベータ抗体（ＨＡＢ－２４０１、ＨＡＢ－５１０１、ＨＡＢ－３６０１およびＨＡＢ－９００１）は、１０－８Ｍ未満、さらには１０－１０Ｍ未満のＡβ１－４２フィブリルに対する親和性と、１０－７Ｍ未満～１０－８ＭのＡβ１－４２モノマーに対する親和性とを示す。特に、抗体ＨＡＢ－９００１は、現在最も優れた抗Ａベータ抗体として知られているアデュカヌマブのほぼ１００倍の親和性を示す。
【0046】
さらに、Ａβ１－４２モノマーのＡβ１－４２フィブリルへの凝集をブロッキングすることに対する抗体の効果のアッセイにおいて、その結果は、本開示の抗体ＨＡＢ－２４０１、ＨＡＢ－５１０１およびＨＡＢ－９００１がＡβ１－４２モノマーのＡβ１－４２フィブリルへの凝集を効果的に阻害することができるが、アデュカヌマブは阻害できないことを示している。
【0047】
生化学的試験において、その結果は、本開示の抗Ａベータ抗体ＨＡＢ－２４０１およびＨＡＢ－３６０１がラット初代ニューロンの保護に対する効果を有し、初代ミクログリア細胞によるＡβフィブリルの食作用を促進できることを示している。
【0048】
さらに、動物の薬力学的アッセイにおいて、その結果は、本開示の抗体ＨＡＢ－２４０１、ＨＡＢ－５１０１およびＨＡＢ－９００１が、５×ＦＡＤアルツハイマー病マウスの空間記憶および認知能力を有意に改善できることを示している。さらに、本開示の抗体は、陽性抗体アデュカヌマブと比較した場合、脳組織におけるサイトカイン（ＴＮＦα、ＩＦＮ－γ、ＩＬ１β、ＩＬ２、ＩＬ６、ＩＬ１２ｐ７０、ＩＬ４、ＩＬ１０、ＭＣＰ－１およびＫＣなど）の放出に対する影響が低く、本開示の抗体が安全性リスクの観点から制御可能であることを示している。本開示の抗Ａベータ抗体は、将来、Ａベータによって引き起こされる疾患または障害（アルツハイマー病など）の治療または予防に有用であることが期待される。
【図面の簡単な説明】
【0049】
【図1】チオフラビン（ＴｈＴ）蛍光アッセイを示す図であり、Ａβ１－４２モノマーのＡβ１－４２フィブリルへの凝集に対する抗Ａベータ抗体のブロッキング効果の実験結果を示している。
【図2】初代皮質ニューロンに対する保護のアッセイを示す図であり、ラット初代ニューロンに対する抗Ａベータ抗体の保護効果の実験結果を示している。
【図3】ＢＶ２食作用アッセイを示す図であり、ＢＶ２細胞によるＡβフィブリルの食作用を促進する抗Ａベータ抗体の実験結果を示している。
【図4】ラット初代ミクログリア細胞によるＡβフィブリルの食作用に対する抗Ａベータ抗体の効果の実験結果を示す図である。
【図5】マウスの巣作り能力をスコアリングするための代表的な写真である。
【図6】巣作り実験を示す図であり、棒グラフは、５×ＦＡＤトランスジェニックマウスの社会的行動の改善に対する抗Ａベータ抗体の効果を示している。
【図7】巣作り実験を示す図であり、散布図は、５×ＦＡＤトランスジェニックマウスの社会的行動の改善に対する抗Ａベータ抗体の効果を示している。
【図8】水迷路の概略図である。実線の円と点線の円は、それぞれプラットフォームとプラットフォームゾーンの位置を表す。
【図9】水迷路実験の学習曲線を示す図である；隠れたプラットフォーム訓練および学習の曲線の結果を示している。二元ＡＮＯＶＡは二元配置分散分析を指す；分析結果は以下のとおりである：
【図10】水迷路実験の結果を示す図である（図１０Ａ－１０Ｇ）：横軸は薬物投与群を示す；図１０Ａは、プラットフォームに到達するまでの潜時の結果を示し、図１０Ｂは、プラットフォームゾーンに到達するまでの潜時の結果を示し、図１０Ｃは、プラットフォームを通過した回数の結果を示し、図１０Ｄは、プラットフォームゾーンを通過した回数の結果を示し、図１０Ｅは、プラットフォーム上での継続時間の結果を示し、図１０Ｆは、プラットフォームゾーンでの継続時間の結果を示し、図１０Ｇは、プラットフォームの通過インデックスの結果を示す（通過インデックス＝標的領域を通過した回数－（他の３つの象限内の対応する領域を通過した回数の合計）／３）。図１０Ｂ－１０Ｇのレジェンドは図１０Ａのレジェンドと同じである（詳細については、図１０Ａのレジェンドを参照のこと）。一元ＡＮＯＶＡは一元配置分散分析を指す（図１２および図１３についても同じ）、対ビヒクル、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１；群間で有意差は検出されなかった。
【図11】Ａβ沈着のＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す図である（図１１Ａ－１１Ｄ）。図１１Ａは海馬に存在する不溶性Ａβ１－４０の含有量を示し、図１１Ｂは海馬に存在する不溶性Ａβ１－４２の含有量を示し（図１１Ｂのレジェンドは図１１Ａのレジェンドと同じある。詳細については図１１Ａを参照のこと）、図１１Ｃは皮質に存在する不溶性Ａβ１－４０の含有量を示し、図１１Ｄは皮質に存在する不溶性Ａβ１－４２の含有量を示す（図１１Ｄのレジェンドは図１１Ｃのレジェンドと同じある。詳細については図１１Ｃを参照のこと）。
【図12】海馬におけるＡβを示すグラフであり、Ａβ沈着（皮質）のＩＨＣ検出の結果を示している。一元ＡＮＯＶＡ、対ビヒクル、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図13】皮質におけるＡβを示すグラフであり、Ａβ沈着（海馬）のＩＨＣ検出の結果を示している。
【0050】
図面の簡単な説明：図９の補足
[図９]水迷路実験の学習曲線を示す図である；隠れたプラットフォーム訓練および学習の曲線の結果を示している。二元ＡＮＯＶＡは二元配置分散分析を指す；分析結果は以下のとおりである：
[図９]水迷路実験の学習曲線を示す図である；隠れたプラットフォーム訓練および学習の曲線の結果を示している。二元ＡＮＯＶＡは二元配置分散分析を指す；分析結果は以下のとおりである：
【0051】
・用語
本開示をより容易に理解するために、特定の技術的および科学的用語を以下に具体的に定義する。本明細書で明示的に定義されない限り、本明細書で使用される他のすべての技術的および科学的用語は、本開示が属する当業者によって一般的に理解される意味を有する。
本開示をより容易に理解するために、特定の技術的および科学的用語を以下に具体的に定義する。本明細書で明示的に定義されない限り、本明細書で使用される他のすべての技術的および科学的用語は、本開示が属する当業者によって一般的に理解される意味を有する。
【0052】
本開示で使用されるアミノ酸の３文字コードおよび１文字コードは、Ｊ． ｂｉｏｌ． ｃｈｅｍ，２４３，３５５８頁（１９６８年）に記載されているとおりである。
【0053】
本開示において、「ａ ＸＸＸ」は、１つ以上のその物質を指す；例えば、「抗Ａベータ抗体（ａｎ ａｎｔｉ－Ａｂｅｔａ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は、Ａベータに特異的に結合する１つ以上の抗体として理解されるべきである。したがって、「ａ」、「１つ以上（１つまたは複数）（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ）」および「少なくとも１つ（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ）」という用語は、本明細書では互換的に使用され得る。
【0054】
「アミロイドβ」、「β－アミロイド」、「Ａβ」および「Ａベータ」という用語は、本明細書において互換的に使用され得、β－セクレターゼ１（ＢＡＣＥ１）を使用してアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）を切断することによって生成されるセグメント、またはその任意の改変体もしくはその任意の機能的同等物を指し、Ａβ１－４０およびＡβ１－４２を含むがこれらに限定されない。Ａβはモノマーの形態で存在し、それらが組み合わさってオリゴマーとプロトフィブリル構造を形成することが知られている。そのようなＡβペプチドの構造および配列は当業者に周知であり、該ペプチドを生成するための、または脳および他の組織から該ペプチドを抽出するための方法もまた周知である（例えば、Ｇｌｅｎｎｅｒ ａｎｄ Ｗｏｎｇ， Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍ． １２９：８８５－８９０頁（１９８４年））。さらに、Ａβペプチドは市販されてもいる。ヒトＡβのアミノ酸配列の例として、配列番号：１はＡβ１－４０のアミノ酸配列を表し、配列番号：２はＡβ１－４２のアミノ酸配列を表す。
【0055】
本明細書で使用される場合、「抗体」は、２つの同一の重鎖および２つの同一の軽鎖の間のジスルフィド結合によって一緒に接続された４本のペプチド鎖構造である免疫グロブリンを指す。異なる免疫グロブリン重鎖定常領域は、異なるアミノ酸組成および配列を示し、したがって、異なる抗原性を示す。したがって、免疫グロブリンは５つのタイプに分類され得るか、免疫グロブリンアイソタイプ、即ちＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥと命名され得、それぞれ重鎖μ、δ、γ、αおよびεに対応する。ヒンジ領域のアミノ酸組成と重鎖ジスルフィド結合の数および位置に応じて、同じタイプのＩｇはさらに異なるサブタイプに分類され得る。例えば、ＩｇＧはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４に分類され得る。軽鎖は、異なる定常領域に基づいて、κ鎖またはλ鎖に分類され得る。５種類のＩｇのそれぞれが、κ鎖またはλ鎖を有する。
【0056】
本開示において、抗体軽鎖は、ヒトまたはマウスのκ、λ鎖またはそれらのバリアントを含む軽鎖定常領域をさらに含み得る；抗体重鎖は、ヒトまたはマウスのＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４またはそれらのバリアントを含む重鎖定常領域をさらに含み得る。
【0057】
抗体の重鎖および軽鎖のＮ末端に隣接する約１１０のアミノ酸配列は非常に可変的であり、軽鎖可変領域（ＶＬ）および重鎖可変領域（ＶＨ）を含む可変領域（Ｆｖ領域）として知られている；Ｃ末端に近い残りのアミノ酸配列は比較的安定であり、定常領域として知られている。可変領域には、３つの超可変領域（ＨＶＲ）と４つの比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）が含まれる。抗体の特異性を決定する３つの超可変領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）としても知られている。各軽鎖可変領域（ＶＬ）および各重鎖可変領域（ＶＨ）は、３つのＣＤＲ領域と４つのＦＲ領域からなり、アミノ末端からカルボキシル末端への順序は次のとおりである：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４。軽鎖の３つのＣＤＲ領域はＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を指し、重鎖の３つのＣＤＲ領域はＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を指す。本明細書に記載の抗体または抗原結合フラグメントのＣＤＲアミノ酸残基の番号および位置は、既知のＫａｂａｔナンバーリング基準および／またはＣｈｏｔｈｉａナンバーリング基準（（１９８３年）米国保健社会福祉省、“Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”）に準拠している。
【0058】
本開示の抗体には、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、好ましくはヒト化抗体が含まれる。
【0059】
本開示に記載される「マウス抗体」という用語は、当分野の知識及び技術に従って調製されたヒトＡベータ結合モノクローナル抗体を指す。調製中、試験対象にＡベータ抗原を注射し、その後、所望の配列または機能的特徴を有する抗体を発現するハイブリドーマを単離する。本開示の一実施形態では、マウスＡベータ抗体またはその抗原結合フラグメントは、マウスκ、λ鎖またはそのバリアントの軽鎖定常領域をさらに含み、かつ／またはマウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはそのバリアントの重鎖定常領域をさらに含む。
【0060】
本明細書に記載の用語「キメラ抗体」は、マウス抗体の可変領域をヒト抗体の定常領域と融合させることによる抗体であり、キメラ抗体はマウス抗体によって誘導される免疫応答を緩和することができる。キメラ抗体を確立するためには、最初に、特定のマウスモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを確立し、可変領域遺伝子をマウスハイブリドーマからクローニングする。次に、必要に応じて、ヒト抗体から定常領域遺伝子をクローニングする。マウス可変領域遺伝子をヒト定常領域遺伝子に接続してキメラ遺伝子を形成し、該キメラ遺伝子をその後、発現ベクターに挿入することができる。最後に、キメラ抗体分子は真核生物系または原核生物系で発現される。本開示の一実施形態では、キメラ抗体の軽鎖は、ヒトκ、λ鎖またはそれらのバリアントに由来する軽鎖定常領域をさらに含む。キメラ抗体の重鎖は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４またはそれらのバリアントに由来する重鎖定常領域をさらに含み、好ましくはヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２もしくはＩｇＧ４またはアミノ酸突然変異（ＹＴＥ突然変異または復帰突然変異など）を有するＩｇＧ１、ＩｇＧ２もしくはＩｇＧ４バリアントに由来する重鎖定常領域を含む。
【0061】
本明細書で使用される「ヒト化抗体」は、ＣＤＲ移植抗体としても知られ、マウスＣＤＲ配列をヒト抗体可変領域フレームワークに移植することによって生成される抗体、即ち、異なるタイプのヒト生殖細胞系列抗体フレームワーク配列において産生される抗体を指す。ヒト化抗体は、多数のマウスタンパク質成分を有するキメラ抗体によって誘導される異種応答を克服することができる。そのようなフレームワーク配列は、生殖細胞系列抗体遺伝子配列をカバーする公共のＤＮＡデータベースまたは公開された参考文献から取得することができる。例えば、ヒト重鎖および軽鎖可変領域遺伝子の生殖細胞系列ＤＮＡ配列は、「ＶＢａｓｅ」ヒト生殖細胞系列配列データベース（ｗｗｗ．ｍｒｃｃｐｅ．ｃｏｍ．ａｃ．ｕｋ／ｖｂａｓｅ）、ならびに、Ｋａｂａｔ， ＥＡら，１９９１年 Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， 第５版に見出すことができる。免疫原性の低下によって引き起こされる活性の低下を回避するために、ヒト抗体の可変領域中のフレームワーク配列は最小限の逆突然変異（ｒｅｖｅｒｓｅ ｍｕｔａｔｉｏｎ）または復帰突然変異（ｂａｃｋ ｍｕｔａｔｉｏｎ）を受けて、活性を維持することができる。本開示のヒト化抗体は、ファージディスプレイによってＣＤＲ親和性成熟が行われるヒト化抗体も含む。本開示の一実施形態では、Ａベータヒト化抗体のＣＤＲ配列は、配列番号：１１～２７から選択される。ヒト抗体可変領域フレームワークについては、設計およびセレクションの後、抗体重鎖ＦＲ領域配列は、ヒト生殖細胞系列ＩＧＨＶ１－２４＊０１およびｈｊｈ６．３、ＩＧＨＶ３－３０＊０１およびｈｊｈ６．３またはＩＧＨＶ２－７０Ｄ＊０４およびｈｊｈ６．１、またはそれらの変異体配列のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＪＨ６領域から選択される；軽鎖ＦＲ領域配列は、ヒト生殖細胞系列ＩＧＫＶ１－２７＊０１およびｈｊｋ４．１、ＩＧＫＶ１－３９＊０１およびｈｊｋ４．１、ＩＧＫＶ２－４０＊０１およびｈｊｋ４．１、ＩＧＫＶ２－４０＊０１およびｈｊｋ２．１、またはそれらの変異体配列のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＪＫ４、ＪＫ２領域から選択される。
【0062】
ＣＤＲの移植は、抗原と接触したフレームワーク残基のために、得られるＡベータ抗体またはその抗原結合フラグメントの抗原に対する親和性の低下をもたらす可能性がある。このような相互作用は、体細胞超突然変異に起因する可能性がある。したがって、ドナーフレームワークのアミノ酸をヒト化抗体フレームワークに移植することが依然として必要な場合がある。抗原結合に関与する非ヒトＡベータ抗体またはその抗原結合フラグメントに由来するアミノ酸残基は、マウスモノクローナル抗体可変領域の配列および構造を調べることによって同定することができる。ドナーＣＤＲフレームワークと生殖細胞系列の間で異なるアミノ酸残基は、関連していると見なすことができる。最も密接に関連する生殖細胞系列を決定することが不可能な場合、その配列は、サブタイプによって共有される共通配列または高い類似性パーセンテージを有するマウス配列と比較され得る。まれなフレームワーク残基は、体細胞の超突然変異の結果であると考えられ、結合において重要な役割を果たす。
【0063】
本明細書で使用される場合、「抗原結合フラグメント」または「機能的フラグメント」は、抗原への結合能力を保持する抗体の１つ以上のフラグメントを指す。全長抗体のフラグメントを用いて、特定の抗原に結合するという機能を達成できることが示されている。「抗原結合フラグメント」という用語に含まれる結合フラグメントの例には、以下が含まれる：（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインから構成される一価フラグメントである、Ｆａｂフラグメント；（ｉｉ）ヒンジ領域のジスルフィド結合によって連結された２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメントである、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；（ｉｖ）片腕のＶＨおよびＶＬドメインからなるＦｖフラグメント；（ｖ）ＶＨドメインから構成される単一ドメインまたはｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄら、（１９８９年）Ｎａｔｕｒｅ３４１：５４４－５４６頁）；および（ｖｉ）個別の相補性決定領域（ＣＤＲ）または（ｖｉｉ）合成リンカーによって任意に連結された２つ以上の個別のＣＤＲの組み合わせ。さらに、ＦｖフラグメントのＶＬドメインとＶＨドメインは２つの別々の遺伝子によってコードされているが、組換え法を使用することによりそれらを合成リンカーによって連結して、一本のタンパク質鎖を生成することができ、該一本のタンパク質鎖では、ＶＬドメインとＶＨドメインをペアにすることによって一価分子が形成されている（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）と呼ばれる；Ｂｉｒｄら（１９８８年）４２３－４２６頁；Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２；および、Ｈｕｓｔｏｎら（１９８８年） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ ＵＳＡ ８５：５８７９－５８８３頁を参照）。そのような一本鎖抗体はまた、「抗原結合フラグメント」という用語に含まれることも意図されている。そのような抗体は、当該分野で公知の従来技術を使用して得られ、インタクト抗体の場合と同じ方法を使用することによって機能的フラグメントについてスクリーニングされる。抗原結合部分は、組換えＤＮＡ技術によって、またはインタクト免疫グロブリンの酵素的もしくは化学的破壊によって生成され得る。抗体は、異なるアイソタイプ、例えば、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４サブタイプ）、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＭ抗体の形態であり得る。
【0064】
本明細書で使用される場合、Ｆａｂは、ＩｇＧ抗体分子を（Ｈ鎖の２２４位のアミノ酸残基を切断する）パパインで処理することにより得られる抗体フラグメントである。Ｆａｂフラグメントは、約５０，０００の分子量を有し、抗原結合活性を有し、Ｈ鎖のＮ末端側の約半分とＬ鎖全体がジスルフィド結合を介して結合している。本開示のＦａｂは、（ヒトＡベータを特異的に認識し、その細胞外領域または三次元構造に結合する）本発明のモノクローナル抗体をパパインで処理することにより生成され得る。さらに、Ｆａｂは、抗体のＦａｂをコードするＤＮＡを原核生物発現ベクターまたは真核生物発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物または真核生物に導入してＦａｂを発現させることによって生成され得る。
【0065】
本明細書で使用される場合、Ｆ（ａｂ’）２は、約１００，０００の分子量を有し、抗原結合活性を有し、ヒンジ位置で結合されている２つのＦａｂ領域を含む抗体フラグメントであり、ＩｇＧのヒンジ領域にある２つのジスルフィド結合の下流の部分をペプシンで消化することによって生成され得る。本開示のＦ（ａｂ’）２は、（ヒトＡベータを特異的に認識し、その細胞外領域または三次元構造に結合する）本発明のモノクローナル抗体をペプシンで処理することによって生成され得る。また、Ｆ（ａｂ’）２は、下記のＦａｂ’をチオエーテル結合またはジスルフィド結合を介して結合することによって生成され得る。
【0066】
本明細書で使用される場合、Ｆａｂ’は、約５０，０００の分子量を有し、抗原結合活性を有する抗体フラグメントである。Ｆａｂ’は、上記のＦ（ａｂ’）２のヒンジ領域でジスルフィド結合を切断することにより得られる。本開示のＦａｂ’は、（Ａベータを特異的に認識し、その細胞外領域または三次元構造に結合する）本開示のＦ（ａｂ’）２を、ジチオトレイトールなどの還元剤で処理することによって生成され得る。さらに、Ｆａｂ’は、抗体のＦａｂ’をコードするＤＮＡを原核生物発現ベクターまたは真核生物発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物または真核生物に導入してＦａｂ’を発現させることによって生成され得る。
【0067】
「一本鎖抗体」、「一本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」は、リンカーによって抗体軽鎖可変ドメイン（または領域；ＶＬ）に接続された抗体重鎖可変ドメイン（または領域；ＶＨ）を含む分子を指す。そのようなｓｃＦｖ分子は、ＮＨ２－ＶＬ－リンカー－ＶＨ－ＣＯＯＨまたはＮＨ２－ＶＨ－リンカー－ＶＬ－ＣＯＯＨの一般構造を有する。従来技術における適切なリンカーは、繰り返されるＧＧＧＧＳアミノ酸配列またはそのバリアント、例えば１～４回の繰り返しを有するバリアントからなる（Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、（１９９３年）， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：６４４４－６４４８頁）。本開示で使用され得る他のリンカーは、Ａｌｆｔｈａｎら（１９９５年）， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ． ８：７２５－７３１頁、Ｃｈｏｉら（２００１年）， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ３１：９４－１０６頁、Ｈｕら（１９９６年）， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５６：３０５５－３０６１頁、Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖら（１９９９年）， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２９３：４１－５６頁、およびＲｏｏｖｅｒｓら（２００１年）， Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌに記載されている。本開示のｓｃＦｖは、以下のステップによって生成することができる：ヒトＡベータを特異的に認識し、その細胞外領域または三次元構造に結合する本開示のモノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを得るステップ、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築するステップ、該ＤＮＡを原核生物発現ベクターまたは真核生物発現ベクターに挿入するステップ、およびその後該発現ベクターを原核生物または真核生物に導入してｓｃＦｖを発現させるステップ。
【0068】
本明細書で使用される場合、ダイアボディは、ｓｃＦｖが二量体化した抗体フラグメントであり、二価の抗原結合活性を有する抗体フラグメントである。その二価抗原結合活性において、２つの抗原は同じでも異なっていてもよい。本開示のダイアボディは、以下のステップによって生成することができる：ヒトＡベータを特異的に認識し、その細胞外領域または三次元構造に結合する本開示のモノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを得るステップ、リンカーペプチドの長さが８アミノ酸残基以下になるようにｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築するステップ、該ＤＮＡを原核生物発現ベクターまたは真核生物発現ベクターに挿入するステップ、およびその後該発現ベクターを原核生物または真核生物に導入してダイアボディを発現させるステップ。
【0069】
本明細書で使用される場合、ｄｓＦｖは、ＶＨおよびＶＬのそれぞれの１アミノ酸残基をシステイン残基で置換し、該２つのシステイン残基間のジスルフィド結合を介して置換されたポリペプチドを接続することによって得られる。システイン残基で置換されるアミノ酸残基は、既知の方法に従って抗体の三次元構造予測に基づいて選択することができる（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， ７， ６９７頁（１９９４年））。本開示のｄｓＦｖは、以下のステップによって生成することができる：ヒトＡベータを特異的に認識し、その細胞外領域または三次元構造に結合する本開示のモノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを得るステップ、ｄｓＦｖをコードするＤＮＡを構築するステップ、該ＤＮＡを原核生物発現ベクターまたは真核生物発現ベクターに挿入するステップ、およびその後該発現ベクターを原核生物または真核生物に導入してｄｓＦｖを発現させるステップ。
【0070】
本明細書で使用される場合、ＣＤＲ含有ペプチドは、ＶＨまたはＶＬのＣＤＲの１つ以上の領域から構築される。いくつかのＣＤＲを含むペプチドを、直接的にまたは適切なペプチドリンカーを介して接続することができる。本開示のＣＤＲ含有ペプチドは、以下のステップによって生成することができる：ヒトＡベータを特異的に認識し、その細胞外領域または三次元構造に結合する本開示のモノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬをコードするＤＮＡを構築するステップ、該ＤＮＡを原核生物発現ベクターまたは真核生物発現ベクターに挿入するステップ、およびその後該発現ベクターを原核生物または真核生物に導入してペプチドを発現させるステップ。ＣＤＲ含有ペプチドは、Ｆｍｏｃ法またはｔＢｏｃ法などの化学合成法によっても生成され得る。
【0071】
本明細書で使用される場合、「ＣＤＲ」は、主に抗原結合に寄与する抗体の可変ドメインに存在する６つの超可変領域のうちの１つを指す。６つのＣＤＲの最も一般的に使用される定義の１つは、Ｋａｂａｔ Ｅ．Ａ． ｅｔ ａｌ．（（１９９１年）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ． ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１－３２４２）によって与えられている。本明細書で使用される場合、ＣＤＲについてのＫａｂａｔの定義は、軽鎖可変ドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３（ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３またはＬ１、Ｌ２、Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメインのＣＤＲ２およびＣＤＲ３（ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３またはＨ２、Ｈ３）に適用される。
【0072】
本明細書で使用される場合、「抗体フレームワーク」は可変ドメインＶＬまたはＶＨのいずれかの一部を指し、これらは、この可変ドメインの抗原結合ループ（ＣＤＲ）のスキャフォールドとして機能する。基本的に、「抗体フレームワーク」は、ＣＤＲのない可変ドメインである。
【0073】
本明細書で使用される場合、「エピトープ」または「抗原決定基」または「抗原エピトープ」は、免疫グロブリンまたは抗体が特異的に結合する抗原上の部位（例えば、Ａベータ分子上の特定の部位）を指す。エピトープは、典型的には、固有の三次元コンフォメーション中に、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個の連続または非連続なアミノ酸を含む（例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第６６巻、Ｇ． Ｅ． Ｍｏｒｒｉｓ編（１９９６年）を参照）。
【0074】
本明細書で使用される場合、「特異的に結合する（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｂｉｎｄ ｔｏ）」、「選択的に結合する（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ ｂｉｎｄ ｔｏ）」、「選択的に結合する（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ ｂｉｎｄｓ ｔｏ）」または「特異的に結合する（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｂｉｎｄｓ）」は、抗原上の所定のエピトープへの抗体の結合を指す。典型的には、抗体は、約１０－７Ｍ未満、例えば、約１０－８Ｍ、１０－９Ｍもしくは１０－１０Ｍ未満またはそれより低い親和性（ＫＤ）で結合する。
【0075】
本明細書で使用される場合、「ＫＤ」または「Ｋｄ」は、特定の抗体‐抗原相互作用についての解離平衡定数を指す。典型的には、本開示の抗体は、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ Ｔ２００装置において表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術によって決定した場合、約１０－７Ｍ未満、例えば約１０－８Ｍ、１０－９Ｍもしくは１０－１０Ｍ未満またはそれより小さい解離平衡定数（ＫＤ）でヒトＡベータに結合する。
【0076】
本明細書で使用される場合、「競合的結合」および「競合的に結合する」は、抗体が本発明のモノクローナル抗体と同じヒトＡベータ上のエピトープ（抗原決定基としても知られる）またはその一部を認識して結合することを指す。本発明のモノクローナル抗体と同じエピトープに結合する抗体とは、本発明のモノクローナル抗体によって認識されるヒトＡベータのアミノ酸配列を認識して結合する抗体を指す。
【0077】
「競合」という用語が、同じエピトープに対して競合する抗原結合タンパク質（例えば、中和抗原結合タンパク質または中和抗体）の文脈で使用される場合、抗原結合タンパク質間で競合が起こることを意味する。これは、試験される抗原結合タンパク質（例えば、抗体またはその免疫学的な機能的フラグメント）が、共通の抗原（例えば、ＰＤ－Ｌ１抗原またはそのフラグメント）への参照抗原結合タンパク質（例えば、リガンドまたは参照抗体）の特異的結合を防止または阻害（例えば、低減）するアッセイによって決定される。抗原結合タンパク質が別の抗原結合タンパク質と競合するかどうかを判断するために、数多くの種類の競合結合アッセイが利用できる。これらのアッセイは、例えば、以下である：固相直接または間接ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、固相直接または間接酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、サンドイッチ競合アッセイ（例えば、Ｓｔａｈｌｉら、１９８３年、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ９：２４２－２５３頁を参照）；固相直接ビオチン－アビジンＥＩＡ（例えば、Ｋｉｒｋｌａｎｄら、１９８６年、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３７：３６１４－３６１９頁を参照）、固相直接標識アッセイ、固相直接標識サンドイッチアッセイ（例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ、１９８８年、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓを参照）；Ｉ－１２５標識を用いた固相直接標識ＲＩＡ（例えば、Ｍｏｒｅｌら、１９８８年、Ｍｏｌｅｃ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２５：７－１５頁を参照）；固相直接ビオチン－アビジンＥＩＡ（Ｃｈｅｕｎｇら、１９９０年、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７６：５４６－５５２頁を参照）；および直接標識ＲＩＡ（Ｍｏｌｄｅｎｈａｕｅｒら、１９９０年、Ｓｃａｎｄ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ３２：７７－８２頁を参照）。典型的には、アッセイは、非標識試験抗原結合タンパク質および標識参照抗原結合タンパク質の両方がロードされた固体表面または細胞に結合することができる精製された抗原の使用を含む。競合阻害は、試験抗原結合タンパク質の存在下で、固体表面または細胞に結合した標識の量を測定することによって決定される。通常、試験抗原結合タンパク質は過剰に存在する。競合アッセイ（抗原結合タンパク質と競合する）によって同定される抗原結合タンパク質には、次のものが含まれる：参照抗原結合タンパク質と同じエピトープに結合する抗原結合タンパク質；および、参照抗原結合タンパク質が結合するエピトープに十分に近いエピトープに結合する抗原結合タンパク質（ここで、２つのエピトープは、空間的に互いに干渉して結合を妨害する）。競合的結合を測定するための方法に関する追加の詳細は、本明細書の実施例に提供されている。典型的には、競合する抗原結合タンパク質が過剰に存在する場合、それは、共通抗原への参照抗原結合タンパク質の特異的結合の少なくとも４０～４５％、４５～５０％、５０～５５％、５５～６０％、６０～６５％、６５～７０％、７０～７５％または７５％またはそれ以上を阻害する（例えば、減少させる）。場合によっては、結合は、少なくとも８０～８５％、８５～９０％、９０～９５％、９５～９７％または９７％またはそれ以上阻害される。
【0078】
本明細書で使用される場合、「核酸分子」は、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子を指す。核酸分子は一本鎖でも二本鎖でもよいが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。核酸は、別の核酸配列と機能的な関係に置かれると、「作動可能に連結」される。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、それがコード配列の転写に影響を与える場合、該コード配列に作動可能に連結されている。
【0079】
本明細書で使用される場合、「ベクター」は、それが連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。一実施形態では、ベクターは、「プラスミド」であり、これは、追加のＤＮＡセグメントが連結され得る環状二本鎖ＤＮＡループを指す。別の実施形態では、ベクターはウイルスベクターであり、追加のＤＮＡセグメントがウイルスゲノムに連結され得る。本明細書で開示されるベクターは、それらが導入される宿主細胞で自己複製することができ（例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）、または宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込まれてもよく、それにより、宿主ゲノム（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）とともに複製される。
【0080】
本明細書で使用される場合、「宿主細胞」は、発現ベクターが導入されている細胞を指す。宿主細胞には、細菌、微生物、植物または動物の細胞が含まれ得る。形質転換されやすい細菌には、大腸菌やサルモネラ菌株などの腸内細菌科；枯草菌などのバチルス科；肺炎球菌；連鎖球菌およびインフルエンザ菌のメンバーが含まれる。適切な微生物には、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）およびピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）が含まれる。適切な動物宿主細胞株には、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣細胞株）およびＮＳ０細胞が含まれる。
【0081】
抗体および抗原結合フラグメントを生成および精製するための方法は、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌｆｏｒ ｆｏｒ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ５－８章および１５章など、当技術分野で周知である。例えば、マウスをヒトＡベータまたはそのフラグメントで免疫化することができ、次いで、得られた抗体を、当技術分野で周知の従来の方法を使用することにより、再生し、精製し、アミノ酸配列を配列決定することができる。抗原結合フラグメントはまた、従来の方法によって調製することができる。本開示の抗体または抗原結合フラグメントは、１つ以上のヒトフレームワーク領域および非ヒト抗体に由来するＣＤＲを含むように設計されている。ヒトＦＲ生殖細胞系列配列は、ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）のウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ）またはＴｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｆａｃｔｓ Ｂｏｏｋ，２００１年，ＩＳＢＮ ０１２４４１３５１から、ＩＭＧＴヒト抗体可変生殖細胞系列遺伝子データベースに対するアラインメントおよびＭＯＥソフトウェアの使用によって取得することができる。
【0082】
本開示の操作された抗体または抗原結合フラグメントは、公知の方法を用いて調製および精製され得る。例えば、重鎖および軽鎖をコードするｃＤＮＡ配列をクローニングし、ＧＳ発現ベクターに組み込むことができる。次に、組換え免疫グロブリンを発現するベクターを、ＣＨＯ細胞に安定的にトランスフェクトすることができる。当技術分野で周知のより推奨される方法として、哺乳動物の発現系は、典型的にはＦｃ領域の高度に保存されたＮ末端部位で、グリコシル化をもたらす。ヒトＴＩＭ－３に特異的に結合する抗体を発現する安定したクローンが得られた。陽性クローンは、抗体産生のためにバイオリアクター内の無血清培地で増殖させることができる。抗体が分泌された培地は、従来の技術により精製することができる。例えば、バッファーで平衡化したプロテインＡまたはＧセファロースＦＦカラムで精製を行うことができる。非特異的結合成分を洗浄により除去する。結合した抗体をｐＨ勾配で溶出し、抗体フラグメントをＳＤＳ－ＰＡＧＥで検出し、その後回収する。抗体は、一般的な技術を用いてろ過および濃縮することができる。サイズ排除またはイオン交換などの一般的な手法により、可溶性の凝集体および多量体を除去することができる。得られた生成物は、その後、例えば－７０℃で直ちに凍結されるか、または凍結乾燥され得る。
【0083】
本明細書で使用される場合、「突然変異」には、「復帰突然変異（ｂａｃｋ－ｍｕｔａｔｉｏｎ）」、「保存的改変（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」または「保存的置換または置換（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｏｒ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）」が含まれるが、これらに限定されない。本明細書で使用される場合、「保存的改変」または「保存的置換または置換」は、タンパク質の生物学的活性を変えることなくその変化が頻繁に起こり得るように、タンパク質中のアミノ酸を類似の特徴（例えば、電荷、側鎖サイズ、疎水性／親水性、主鎖のコンフォメーションおよび剛性など）を有する他のアミノ酸で置換することを指す。当業者は、一般に、ポリペプチドの非必須領域における単一のアミノ酸置換は、生物学的活性を実質的に変化させないことを認識している（例えば、Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９８７年） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ， Ｔｈｅ Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ Ｐｕｂ． Ｃｏ．，２２４頁（第４版）を参照）。さらに、構造的または機能的に類似したアミノ酸の置換は、生物学的活性を破壊する可能性が低い。
【0084】
本開示で言及される「変異配列」は、適切な置換、挿入または欠失によって本開示のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を改変した後、本開示のものに対してさまざまなパーセンテージの配列同一性を有するヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を指す。本開示に記載される配列同一性は、少なくとも８５％、９０％または９５％、好ましくは少なくとも９５％であり得る。非限定的な例には、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％が含まれる。配列比較および２つの配列間の同一性パーセントの決定は、米国国立生物工学情報センターのＷｅｂサイトで利用可能なＢＬＡＳＴＮ／ＢＬＡＳＴＰアルゴリズムをデフォルト設定で使用して実行され得る。
【0085】
本明細書で使用される場合、「相同性」または「同一性」または「一致性」は、２つのポリヌクレオチド配列間または２つのポリペプチド配列間の配列類似性を指す。比較される２つの配列の両方の位置が同じ塩基またはアミノ酸モノマーサブユニットで占められている場合、例えば、２つのＤＮＡ分子のそれぞれの位置がアデニンで占められている場合、分子はその位置で相同である。２つの配列間の相同性パーセントは、２つの配列で共有される一致または相同な位置の数を、比較する位置の数で割って１００倍した関数である。例えば、配列を最適にアラインメントしたとき、２つの配列の１０個の位置のうち６個が一致または相同であるならば、２つの配列は６０％の相同性を有する；２つの配列の１００個の位置のうち９５個が一致または相同であるならば、２つの配列は９５％の相同性を有する。一般に、比較は、２つの配列が最大の相同性パーセントを与えるようにアラインメントされたときに実行される。
【0086】
本開示で言及される「外因性」とは、状況に応じて、生物、細胞、またはヒトの外部で産生される物質を指す。「内因性」とは、状況に応じて、細胞、生物、またはヒトの内部で産生される物質を指す。
【0087】
本明細書で使用される場合、「細胞」、「細胞株」および「細胞培養物」は互換的に使用され、そのようなすべての名称は子孫を含む。したがって、「形質転換体」および「形質転換された細胞」という言葉には、継代数に関係なく、初代対象細胞およびそれに由来する培養物が含まれる。意図的またはランダムな突然変異のために、すべての子孫がＤＮＡの内容において正確に同一であるとは限らないことも理解されたい。最初に形質転換された細胞と同じ機能または生物学的活性を有する変異体子孫が含まれる。異なる名称が意図されている場合、それは文脈から明確に理解されるであろう。
【0088】
本明細書で使用される場合、「ポリメラーゼ連鎖反応」または「ＰＣＲ」は、例えば米国特許第４，６８３，１９５号に記載されるように、微量の核酸、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡの特定の部分が増幅される手順または技術を指す。一般に、オリゴヌクレオチドプライマーを設計できるように、関心領域の末端または関心領域を超える配列情報を入手できる必要がある；これらのプライマーは、増幅されるテンプレートの反対側の鎖と配列が同一または類似している。２つのプライマーの５’末端ヌクレオチドは、増幅される材料の末端と一致していることがある。ＰＣＲを用いて、特定のＲＮＡ配列、全ゲノムＤＮＡからの特定のＤＮＡ配列および全細胞ＲＮＡ、バクテリオファージまたはプラスミド配列などから転写されたｃＤＮＡを増幅することができる。一般的には、Ｍｕｌｌｉｓら、（１９８７年） Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ． Ｏｕａｎｔ． Ｂｉｏｌ． ５１：２６３頁； Ｅｒｌｉｃｈ編、（１９８９年） ＰＣＲ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ （Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎ．Ｙ．）を参照されたい。本開示で使用されるＰＣＲ試験は、核酸試験サンプルを増幅するためのポリメラーゼ反応法の唯一ではないが１つの例であると考えられる。該方法は、核酸の特定の部分を増幅または生成するための、プライマーとしての既知の核酸配列および核酸ポリメラーゼの使用を含む。
【0089】
本明細書で使用される場合、「医薬組成物」は、本開示による１つ以上の化合物またはその生理学的／薬学的に許容される塩またはプロドラッグ、ならびに生理学的／薬学的に許容される担体及および賦形剤などの他の化学成分を含む混合物を指す。医薬組成物は、生物への投与を促進し、有効成分の吸収を促進し、それにより生物学的効果を発揮させることを目的とする。
【0090】
「治療する」とは、本開示の結合化合物のいずれかを含む組成物などの治療薬を、該治療薬が既知の治療活性を有する１つ以上の疾患症状を有する患者に、内部的にまたは外部的に投与することを意味する。典型的には、該薬剤は、臨床的に測定可能な程度でそのような症状の退行を誘導するかまたは進行を阻害することにより、治療される患者または集団における１つ以上の疾患症状を緩和するのに有効な量で投与される。特定の疾患症状を緩和するのに有効な治療薬の量（「治療有効量」とも呼ばれる）は、患者の病状、年齢および体重、ならびに患者において所望の反応を誘発する薬物の能力などのさまざまな要因によって変動する可能性がある。疾患の症状が緩和されたかどうかは、その症状の重症度または進行状況を評価するために医師または他の熟練した医療提供者が通常使用する臨床測定によって評価できる。本開示の実施形態（例えば、治療方法または製品）は、全ての患者の標的疾患症状を緩和するのに効果的ではないかもしれないが、スチューデントのｔ検定、カイ２乗検定、マンおよびホイットニー（Ｍａｎｎ ａｎｄ Ｗｈｉｔｎｅｙ）によるＵ検定、クラスカル－ウォリス（Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ）検定（Ｈ検定）、ヨンクヒール－タプストラ（Ｊｏｎｃｋｈｅｅｒｅ－Ｔｅｒｐｓｔｒａ）検定、およびウィルコクソン検定などの当該技術分野で既知の任意の統計的試験によって決定されるように、統計的に有意な数の患者における標的疾患症状を緩和するはずである。
【0091】
本明細書で使用される場合、「有効量」は、疾病の症状または徴候を改善または予防するのに十分な量を包含する。有効量は、診断を可能または容易にするのに十分な量も意味する。特定の患者または獣医学的対象に対する有効量は、治療される状態、患者の全体的な健康状態、投与経路および投与量、ならびに副作用の重症度などの要因に応じて変化し得る。有効量は、重大な副作用または毒性作用を回避する、最大用量または投与プロトコルであり得る。
【0092】
本明細書で使用される場合、「投与」または「治療」は、動物、ヒト、実験対象、細胞、組織、臓器、または体液に適用される場合、外因性の医薬品、治療薬、診断薬、または組成物を動物、ヒト、対象、細胞、組織、臓器、または体液と接触させることを指す。「投与」または「治療」は、例えば、治療方法、薬物動態学的方法、診断方法、研究方法および実験方法を指すことができる。細胞の治療は、試薬を細胞と接触させること、ならびに試薬を流体と接触させることを含み、ここで、該流体は細胞と接触している。「投与」または「治療」は、例えば細胞の、試薬、診断、結合組成物または別の細胞による、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでの治療も意味する。「治療」は、ヒト、獣医、または研究対象に適用される場合、治療的処置、予防的または予防的措置（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ ｏｒ ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ ｍｅａｓｕｒｅｓ）、研究および診断への適用を指す。
【0093】
本明細書で使用される場合、「Ａベータによって引き起こされる疾患または障害」とは、β－アミロイドによって引き起こされる、またはβ－アミロイドに関連する疾患または障害を指し、Ａベータモノマー、またはプロトフィブリル、またはポリマー、またはそれらの任意の組み合わせからなるβ－アミロイドの存在または活性によって引き起こされる疾患および障害（例えば、神経変性疾患（例：アルツハイマー病、軽度認知障害、前頭側頭型認知症、レビー小体病、パーキンソン病、ピック病、ベバック病（Ｂｅｖａｃ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）など）、β－アミロイド沈着によって引き起こされるさまざまな眼疾患（例：黄斑変性、ドルーゼン関連視神経障害（ｄｒｕｓｅｎ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｏｐｔｉｃ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ）、緑内障、白内障など））を含むが、これらに限定されない。
【0094】
本明細書で使用される場合、「神経変性疾患」には、以下が含まれるが、これらに限定されない：アルツハイマー病、軽度認知障害、前頭側頭型認知症、レビー小体病、パーキンソン病、ピック病、ベバック病（Ｂｅｖａｃ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、コンゴ親和性アミロイド血管症、脳アミロイド血管症、ダウン症、多発性梗塞性認知症、ハンチントン病、クロイツフェルト・ヤコブ病、エイズ認知症症候群、うつ病、不安障害、恐怖症、ベル麻痺、てんかん、脳炎、多発性硬化症、神経筋障害、神経腫瘍障害、脳腫瘍、脳卒中を含む神経血管障害、神経免疫障害、神経障害性耳科学疾患、脊髄損傷を含む神経外傷、神経障害性疼痛を含む痛み、小児の神経および神経精神障害、睡眠障害、トゥレット症候群、軽度認知障害、血管性認知症、多発性梗塞性認知症、嚢胞性線維症、ゴーシェ病、ならびにその他の中枢神経系の運動障害および疾患。
【発明を実施するための形態】
【0095】
以下の例は、本開示をさらに説明するために提供されているが、本開示の範囲を限定することを意図するものではない。本開示の例において特定の条件が示されていない実験方法は、一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙなどの通常の条件に従って；またはメーカーが推奨する条件に従って実施される。供給源が明記されていない試薬は市販の試薬である。
【実施例】
【0096】
（実施例１．Ａベータ抗原の調製）
本開示の実施例および試験例で使用されるＡベータ抗原は、ＧＬ Ｂｉｏｃｈｅｍ、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔまたはＳｉｇｍａによって合成され、その後ｉｎ ｖｉｔｒｏで調製された（詳細については表１を参照）。免疫化に使用するためのＡベータ抗原は、Ａβ１－４２プロトフィブリルおよびＡβ１－４０ＫＬＨであった；スクリーニングに使用するためのＡベータ抗原は、Ａβ１－４０－ＢＳＡフィブリル、Ａβ１－４０ＤＭＳＯ懸濁液、Ａβ１－４２－ビオチンＤＭＳＯ懸濁液、Ａβ１－４２プロトフィブリルおよびＡβ１－４２フィブリルであった；検出に使用するためのＡベータ抗原は、Ａβ１－４２モノマーおよびＡβ１－４２フィブリルであった。
本開示の実施例および試験例で使用されるＡベータ抗原は、ＧＬ Ｂｉｏｃｈｅｍ、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔまたはＳｉｇｍａによって合成され、その後ｉｎ ｖｉｔｒｏで調製された（詳細については表１を参照）。免疫化に使用するためのＡベータ抗原は、Ａβ１－４２プロトフィブリルおよびＡβ１－４０ＫＬＨであった；スクリーニングに使用するためのＡベータ抗原は、Ａβ１－４０－ＢＳＡフィブリル、Ａβ１－４０ＤＭＳＯ懸濁液、Ａβ１－４２－ビオチンＤＭＳＯ懸濁液、Ａβ１－４２プロトフィブリルおよびＡβ１－４２フィブリルであった；検出に使用するためのＡベータ抗原は、Ａβ１－４２モノマーおよびＡβ１－４２フィブリルであった。
【0097】
Ａβ１－４０のアミノ酸配列は、以下の（配列番号：１）に示されている：
【化1】
【0098】
Ａβ１－４２のアミノ酸配列は、以下の（配列番号：２）に示されている：
【化2】
【0099】
Ａβ１－４０ＫＬＨおよびＡβ１－４０－ＢＳＡは、それぞれＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシアニン）およびＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）と結合した合成Ａβ１－４０ポリペプチドを指し、使用したＡβ１－４０は、結合および検出の便宜のために、Ｎ末端にアミノ酸Ｃｙｓが組み込まれている。
【0100】
Ａβ１－４２プロトフィブリルとは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでプロトフィブリルの形態で調製されたＡβ１－４２ポリペプチドを指す。
【0101】
Ａβ１－４０－ＢＳＡフィブリルとは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでフィブリルの形態で調製されたＢＳＡと結合したＡβ１－４２ポリペプチドを指す。
【0102】
Ａβ１－４０ＤＭＳＯ懸濁液とは、Ａβ１－４２ポリペプチドをＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）に直接溶解して調製した透明な溶液を指す。
【0103】
Ａβ１－４２－ビオチンＤＭＳＯ懸濁液とは、ビオチンタグ付きＡβ１－４２ポリペプチドをＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）に直接溶解して調製した透明な溶液を指す。
【0104】
Ａβ１－４２フィブリルとは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでフィブリルの形態で調製されたＡβ１－４２ポリペプチドを指す。
【0105】
Ａβ１－４２モノマーとは、Ａβ１－４２モノマーを指す。
【表1】
【0106】
（実施例２．抗ヒトＡベータハイブリドーマモノクローナル抗体の調製）
１．免疫化
抗ヒトＡベータモノクローナル抗体は、マウスを免疫化することによって生成された。ＳＪＬ白色マウス、雌、６～８週齢を実験に使用した（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｖｉｔａｌ Ｒｉｖｅｒ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ株式会社、動物生産ライセンス番号：ＳＣＸＫ（北京）２０１２－０００１）。給餌環境：ＳＰＦレベル。購入後、マウスを温度２０～２５℃、湿度４０～６０％、１２／１２時間の明／暗サイクルで１週間、実験室環境に保管した。次に、以下のスキームに従ってマウスを免疫した。免疫化のための抗原は、Ａβ１－４０－ＫＬＨおよびＡβ１－４２プロトフィブリルであった。
１．免疫化
抗ヒトＡベータモノクローナル抗体は、マウスを免疫化することによって生成された。ＳＪＬ白色マウス、雌、６～８週齢を実験に使用した（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｖｉｔａｌ Ｒｉｖｅｒ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ株式会社、動物生産ライセンス番号：ＳＣＸＫ（北京）２０１２－０００１）。給餌環境：ＳＰＦレベル。購入後、マウスを温度２０～２５℃、湿度４０～６０％、１２／１２時間の明／暗サイクルで１週間、実験室環境に保管した。次に、以下のスキームに従ってマウスを免疫した。免疫化のための抗原は、Ａβ１－４０－ＫＬＨおよびＡβ１－４２プロトフィブリルであった。
【0107】
免疫化スキーム１：免疫化に使用したアジュバントはＱｕｉｃｋＡｎｔｉｂｏｄｙ－Ｍｏｕｓｅ３Ｗ（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｋａｎｇｂｉｑｕａｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ株式会社、カタログ番号ＫＸ０２１００４２）であった。抗原とアジュバント（ＱｕｉｃｋＡｎｔｉｂｏｄｙ－Ｍｏｕｓｅ３Ｗ）の比率は１：１で、１０μｇ／マウス／時間であった。抗原とアジュバントを完全に混合し、０、７、１４、２１、２８、３５および４２日目に接種に使用した。０日目に、マウスの後肢に１０μｇ／マウスの混合抗原を筋肉内（ＩＭ）注射した。最初の免疫化を７、１４、２１、２８、３５および４２日目に繰り返し、同様にマウスの後肢に１０μｇ／マウスの混合抗原を筋肉内（ＩＭ）注射した。１９、４０および５５日目に血液サンプルを採取し、ＥＬＩＳＡ法によりマウス血清中の抗体価を測定した。７回目から８回目の免疫化の後、プラトーに達する傾向のある血清抗体価が高いマウスを脾細胞融合用に選択した。脾細胞融合の３日前に、生理食塩水で調製した抗原溶液を、追加免疫化のために、２０μｇ／マウスで腹腔内注射（ＩＰ）した。
【0108】
免疫化スキーム２：免疫化に使用したアジュバントはＱｕｉｃｋＡｎｔｉｂｏｄｙ－Ｍｏｕｓｅ５Ｗ（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｋａｎｇｂｉｑｕａｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ株式会社、カタログ番号ＫＸ０２１００４）であった。抗原とアジュバント（ＱｕｉｃｋＡｎｔｉｂｏｄｙ－Ｍｏｕｓｅ５Ｗ）の比率は１：１で、２５μｇ／マウス／時間（最初の免疫化）および２５μｇ／マウス／時間（追加免疫化）であった。抗原とアジュバントを完全に混合し、０、１４、２８、４２および５６日目に接種に使用した。０日目に、マウスの後肢に２５μｇ／マウスの混合抗原を筋肉内（ＩＭ）注射した。最初の免疫化を１４、２８、４２および５６日目に繰り返し、同様にマウスの後肢に２５μｇ／マウスの混合抗原を筋肉内（ＩＭ）注射した。２０日目および４９日目に血液サンプルを採取し、ＥＬＩＳＡ法によりマウス血清中の抗体価を測定した。５回目の免疫化の後、プラトーに達する傾向のある血清抗体価が高いマウスを脾細胞融合のために選択した。脾細胞融合の３日前に、生理食塩水で調製した抗原溶液を、追加免疫化のために、５０μｇ／マウスで腹腔内注射（ＩＰ）した。
【0109】
２．脾細胞融合
ハイブリドーマ細胞は、最適化されたＰＥＧを介した融合手順を使用して、脾臓リンパ球を骨髄腫Ｓｐ２／０細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－８２８７（商標））と融合させることによって得られた。融合したハイブリドーマ細胞を０．５～１×１０６／ｍｌの密度で完全培地（２０％ＦＢＳ、１×ＨＡＴ、１×ＯＰＩを含むＤＭＥＭ培地）に再懸濁し、１００μｌ／ウェルで９６ウェルプレートに播種し、３７℃および５％ＣＯ２で３～４日間インキュベートし、１００μｌ／ウェルのＨＡＴ完全培地を補充し、ピン状のクローン（ｐｉｎ－ｌｉｋｅ ｃｌｏｎｅｓ）が形成されるまで３～４日間培養した。上清を除去し、２００μｌ／ウェルのＨＴ完全培地（２０％ＦＢＳ、１×ＨＴおよび１×ＯＰＩを含むＲＰＭＩ－１６４０培地）を添加し、３７℃、５％ＣＯ２で３日間インキュベートした後、ＥＬＩＳＡ検出に供した。
ハイブリドーマ細胞は、最適化されたＰＥＧを介した融合手順を使用して、脾臓リンパ球を骨髄腫Ｓｐ２／０細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－８２８７（商標））と融合させることによって得られた。融合したハイブリドーマ細胞を０．５～１×１０６／ｍｌの密度で完全培地（２０％ＦＢＳ、１×ＨＡＴ、１×ＯＰＩを含むＤＭＥＭ培地）に再懸濁し、１００μｌ／ウェルで９６ウェルプレートに播種し、３７℃および５％ＣＯ２で３～４日間インキュベートし、１００μｌ／ウェルのＨＡＴ完全培地を補充し、ピン状のクローン（ｐｉｎ－ｌｉｋｅ ｃｌｏｎｅｓ）が形成されるまで３～４日間培養した。上清を除去し、２００μｌ／ウェルのＨＴ完全培地（２０％ＦＢＳ、１×ＨＴおよび１×ＯＰＩを含むＲＰＭＩ－１６４０培地）を添加し、３７℃、５％ＣＯ２で３日間インキュベートした後、ＥＬＩＳＡ検出に供した。
【0110】
３．ハイブリドーマ細胞のスクリーニング
細胞増殖密度に応じて融合の１０～１１日後に、予備スクリーニングのために、さまざまな形態のＡβポリペプチドを用いてＥＬＩＳＡ結合アッセイ（酵素免疫測定法としても知られる）をクローン培養上清に対して実施し、得られたハイブリドーマクローンのサブタイプを分類した。免疫原としてＡβ１－４０－ＫＬＨを用いたハイブリドーマ細胞をスクリーニングするために、Ａβ１－４０－ＢＳＡフィブリル、Ａβ１－４２ビオチンＤＭＳＯ懸濁液およびＡβ１－４０ＤＭＳＯ懸濁液を使用した；免疫原としてＡβ１－４２プロトフィブリルを用いたハイブリドーマ細胞をスクリーニングするために、Ａβ１－４２プロトフィブリル、Ａβ１－４２フィブリルおよびＡβ１－４２－ビオチンＤＭＳＯ懸濁液を使用した。陽性ウェルについては、細胞密度に応じて培地を交換し、２４ウェルプレートに拡張した。２４ウェルプレートに移した細胞株を再度試験した後、初めてサブクローニングした。最初のサブクローニングでスクリーニングした陽性細胞のいくつかを保存し、２回目のサブクローニングのために使用した。２回目のサブクローニングでスクリーニングした陽性細胞のいくつかを保存し、タンパク質発現のために使用した。Ａβポリペプチドに特異的に結合することができるハイブリドーマ細胞は、複数の融合から生じた。チオフラビン（ＴｈＴとも呼ばれる）蛍光アッセイ、神経保護アッセイ、マクロファージ食作用アッセイの後、ハイブリドーマクローンｍＡｂ－２４０１、ｍＡｂ－３６０１、ｍＡｂ－５１０１およびｍＡｂ－９００１が得られ、無血清細胞培養による抗体の調製に使用された。得られた抗体を精製例に従って精製し、精製した抗体を試験例で使用した。
細胞増殖密度に応じて融合の１０～１１日後に、予備スクリーニングのために、さまざまな形態のＡβポリペプチドを用いてＥＬＩＳＡ結合アッセイ（酵素免疫測定法としても知られる）をクローン培養上清に対して実施し、得られたハイブリドーマクローンのサブタイプを分類した。免疫原としてＡβ１－４０－ＫＬＨを用いたハイブリドーマ細胞をスクリーニングするために、Ａβ１－４０－ＢＳＡフィブリル、Ａβ１－４２ビオチンＤＭＳＯ懸濁液およびＡβ１－４０ＤＭＳＯ懸濁液を使用した；免疫原としてＡβ１－４２プロトフィブリルを用いたハイブリドーマ細胞をスクリーニングするために、Ａβ１－４２プロトフィブリル、Ａβ１－４２フィブリルおよびＡβ１－４２－ビオチンＤＭＳＯ懸濁液を使用した。陽性ウェルについては、細胞密度に応じて培地を交換し、２４ウェルプレートに拡張した。２４ウェルプレートに移した細胞株を再度試験した後、初めてサブクローニングした。最初のサブクローニングでスクリーニングした陽性細胞のいくつかを保存し、２回目のサブクローニングのために使用した。２回目のサブクローニングでスクリーニングした陽性細胞のいくつかを保存し、タンパク質発現のために使用した。Ａβポリペプチドに特異的に結合することができるハイブリドーマ細胞は、複数の融合から生じた。チオフラビン（ＴｈＴとも呼ばれる）蛍光アッセイ、神経保護アッセイ、マクロファージ食作用アッセイの後、ハイブリドーマクローンｍＡｂ－２４０１、ｍＡｂ－３６０１、ｍＡｂ－５１０１およびｍＡｂ－９００１が得られ、無血清細胞培養による抗体の調製に使用された。得られた抗体を精製例に従って精製し、精製した抗体を試験例で使用した。
【0111】
４．ハイブリドーマ抗体および組換え抗体の精製
細胞によって発現された上清サンプルを高速遠心分離して不純物を除去し、ハイブリドーマによって発現された上清をプロテインＧカラムで精製し、組換え抗体によって発現された上清をプロテインＡカラムで精製した。Ａ２８０の読み取り値がベースラインに低下するまで、カラムをＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄した。標的タンパク質を１００ｍＭ酢酸、ｐＨ３．０で溶出し、１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０で中和した。溶出したサンプルを適切に濃縮してから、ＰＢＳで事前に平衡化したゲルクロマトグラフィーＳｕｐｅｒｄｅｘ２００（ＧＥ）でさらに精製して、凝集体を除去した。モノマーのピークを収集し、使用のために分注した。
細胞によって発現された上清サンプルを高速遠心分離して不純物を除去し、ハイブリドーマによって発現された上清をプロテインＧカラムで精製し、組換え抗体によって発現された上清をプロテインＡカラムで精製した。Ａ２８０の読み取り値がベースラインに低下するまで、カラムをＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄した。標的タンパク質を１００ｍＭ酢酸、ｐＨ３．０で溶出し、１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０で中和した。溶出したサンプルを適切に濃縮してから、ＰＢＳで事前に平衡化したゲルクロマトグラフィーＳｕｐｅｒｄｅｘ２００（ＧＥ）でさらに精製して、凝集体を除去した。モノマーのピークを収集し、使用のために分注した。
【0112】
５．陽性ハイブリドーマクローンの配列決定
陽性ハイブリドーマ由来の配列をクローニングする手順は以下のとおりであった。対数増殖期のハイブリドーマ細胞を採取した。キットの指示に従ってＴｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１５５９６－０１８）を用いてＲＮＡを抽出し、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐ（商標）Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ、カタログ番号２６８０Ａ）を用いて逆転写した。得られたｃＤＮＡをマウスＩｇ－Ｐｒｉｍｅｒ Ｓｅｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ、ＴＢ３２６ Ｒｅｖ． Ｂ ０５０３）を用いたＰＣＲによって増幅し、会社によって配列決定した。ハイブリドーマクローンｍＡｂ－２４０１、ｍＡｂ－３６０１、ｍＡｂ－５１０１およびｍＡｂ－９００１のマウス抗体重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列は、以下のように決定された：
陽性ハイブリドーマ由来の配列をクローニングする手順は以下のとおりであった。対数増殖期のハイブリドーマ細胞を採取した。キットの指示に従ってＴｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１５５９６－０１８）を用いてＲＮＡを抽出し、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐ（商標）Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ、カタログ番号２６８０Ａ）を用いて逆転写した。得られたｃＤＮＡをマウスＩｇ－Ｐｒｉｍｅｒ Ｓｅｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ、ＴＢ３２６ Ｒｅｖ． Ｂ ０５０３）を用いたＰＣＲによって増幅し、会社によって配列決定した。ハイブリドーマクローンｍＡｂ－２４０１、ｍＡｂ－３６０１、ｍＡｂ－５１０１およびｍＡｂ－９００１のマウス抗体重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列は、以下のように決定された：
【化3】
【0113】
注：上記の抗体の可変領域アミノ酸配列は、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４として表されている。イタリック体の文字はＦＲ配列を示し、下線付きの文字はＣＤＲ配列を示している。
【0114】
抗体ｍＡｂ－２４０１、ｍＡｂ－３６０１、ｍＡｂ－５１０１およびｍＡｂ－９００１のＣＤＲ領域のアミノ酸配列を表２に示した。
【表2】
【0115】
（実施例３．抗ヒトＡベータハイブリドーマモノクローナル抗体のヒト化）
カノニカル構造（ｃａｎｏｎｉｃａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）は、マウス抗体の軽鎖可変領域配列および重鎖可変領域配列に従って決定された。同じ構造を有するヒト生殖細胞系列配列の中で、マウスの非ＣＤＲ領域（フレームワーク領域）に最も類似した配列が、ヒト化のためのテンプレートとして選択された。次に、マウス抗体のＣＤＲ領域を、選択されたヒト化のためのテンプレートに移植して、ヒトのＣＤＲ領域を置換した。必要に応じて、一部のＦＲ領域配列で復帰突然変異または点突然変異が行われた。次に、可変領域をヒト定常領域（ヒトＩｇＧ１定常領域など）と組み合わせて、ヒト化抗Ａベータ抗体を作製した。
カノニカル構造（ｃａｎｏｎｉｃａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）は、マウス抗体の軽鎖可変領域配列および重鎖可変領域配列に従って決定された。同じ構造を有するヒト生殖細胞系列配列の中で、マウスの非ＣＤＲ領域（フレームワーク領域）に最も類似した配列が、ヒト化のためのテンプレートとして選択された。次に、マウス抗体のＣＤＲ領域を、選択されたヒト化のためのテンプレートに移植して、ヒトのＣＤＲ領域を置換した。必要に応じて、一部のＦＲ領域配列で復帰突然変異または点突然変異が行われた。次に、可変領域をヒト定常領域（ヒトＩｇＧ１定常領域など）と組み合わせて、ヒト化抗Ａベータ抗体を作製した。
【0116】
１．ｍＡｂ－２４０１のヒト化
ｍＡｂ－２４０１抗体重鎖のヒト化のためのテンプレートは、ＩＧＨＶ１－２４＊０１およびｈｊｈ６．３であった。すなわち、ヒト生殖細胞系列重鎖ＩＧＨＶ１－２４からＦＲ１、ＦＲ２およびＦＲ３領域が選択され、ｈｊｈ６．３のＪＨ６領域がＦＲ４領域として選択された。軽鎖のためのテンプレートはＩＧＫＶ１－２７＊０１およびｈｊｋ４．１であった。すなわち、ヒト生殖細胞系列軽鎖ＩＧＫＶ１－２７からＦＲ１、ＦＲ２およびＦＲ３が選択され、ｈｊｋ４．１のＪＫ４領域がＦＲ４領域として選択された。
ｍＡｂ－２４０１抗体重鎖のヒト化のためのテンプレートは、ＩＧＨＶ１－２４＊０１およびｈｊｈ６．３であった。すなわち、ヒト生殖細胞系列重鎖ＩＧＨＶ１－２４からＦＲ１、ＦＲ２およびＦＲ３領域が選択され、ｈｊｈ６．３のＪＨ６領域がＦＲ４領域として選択された。軽鎖のためのテンプレートはＩＧＫＶ１－２７＊０１およびｈｊｋ４．１であった。すなわち、ヒト生殖細胞系列軽鎖ＩＧＫＶ１－２７からＦＲ１、ＦＲ２およびＦＲ３が選択され、ｈｊｋ４．１のＪＫ４領域がＦＲ４領域として選択された。
【0117】
ヒト生殖細胞系列（ＩＧＨＶ１－２４＊０１）重鎖テンプレートのアミノ酸配列を以下の（配列番号：２８）に示した：
【化4】
【0118】
ヒト生殖細胞系列（ＩＧＫＶ１－２７＊０１）軽鎖テンプレートのアミノ酸配列を以下の（配列番号：２９）に示した：
【化5】
【0119】
ヒト化重鎖および軽鎖の可変領域は以下のとおりであった：
ＨＡＢ－２４０１の移植されたＶＨ（配列番号：６６）：
ＨＡＢ－２４０１の移植されたＶＬ（配列番号：６７）：
ＨＡＢ－２４０１の移植されたＶＨ（配列番号：６６）：
【化6】
【化7】
【0120】
選択されたヒト化テンプレートにマウス抗体ＣＤＲ領域を移植して、ヒトテンプレートのＣＤＲ領域を置換し、重鎖の１位、７２位および９８位（天然配列ナンバーリング、Ｋａｂａｔナンバーリングによるとそれぞれ１位、７１位および９４位に対応する）で復帰突然変異を行ってから（Ｑ１Ｅ、Ｅ７２ＡおよびＴ９８Ｒ；ＫａｂａｔナンバーリングによるとＱ１Ｅ、Ｅ７１Ａ、Ｔ９４Ｒ）、ヒトＩｇＧ１の定常領域と組み合わせてヒト化抗体ＨＡＢ－２４０１を作製した。
【0121】
ＨＡＢ－２４０１の重鎖アミノ酸配列を以下の（配列番号：３０）に示した：
【化8】
【0122】
ＨＡＢ－２４０１の軽鎖アミノ酸配列を以下の（配列番号：３１）に示した：
【化9-1】
【化9-2】
【0123】
注： 上記のＨＡＢ－２４０１の軽鎖および重鎖アミノ酸配列において、イタリック体の文字はＦＲ配列を示し、下線付きの文字はＣＤＲ配列を示し、二重下線付きの文字は定常領域配列を示している。
【0124】
２．ｍＡｂ－３６０１のヒト化
ｍＡｂ－３６０１抗体重鎖のヒト化のためのテンプレートは、ＩＧＨＶ３－３０＊０１およびｈｊｈ６．３であった。すなわち、ヒト生殖細胞系列重鎖ＩＧＨＶ３－３０からＦＲ１、ＦＲ２およびＦＲ３領域が選択され、ｈｊｈ６．３のＪＨ６領域がＦＲ４領域として選択された。軽鎖のためのテンプレートはＩＧＫＶ１－３９＊０１／ｈｊｋ４．１であった。すなわち、ヒト生殖細胞系列軽鎖ＩＧＫＶ１－３９からＦＲ１、ＦＲ２およびＦＲ３が選択され、ｈｊｋ４．１のＪＫ４領域がＦＲ４領域として選択された。
ｍＡｂ－３６０１抗体重鎖のヒト化のためのテンプレートは、ＩＧＨＶ３－３０＊０１およびｈｊｈ６．３であった。すなわち、ヒト生殖細胞系列重鎖ＩＧＨＶ３－３０からＦＲ１、ＦＲ２およびＦＲ３領域が選択され、ｈｊｈ６．３のＪＨ６領域がＦＲ４領域として選択された。軽鎖のためのテンプレートはＩＧＫＶ１－３９＊０１／ｈｊｋ４．１であった。すなわち、ヒト生殖細胞系列軽鎖ＩＧＫＶ１－３９からＦＲ１、ＦＲ２およびＦＲ３が選択され、ｈｊｋ４．１のＪＫ４領域がＦＲ４領域として選択された。
【0125】
ヒト生殖細胞系列（ＩＧＨＶ３－３０＊０１）重鎖テンプレートのアミノ酸配列を以下の（配列番号：３２）に示した：
【化10】
【0126】
ヒト生殖細胞系列（ＩＧＫＶ１－３９＊０１）軽鎖テンプレートのアミノ酸配列を以下の（配列番号：３３）に示した：
【化11】
【0127】
ヒト化重鎖および軽鎖の可変領域は以下のとおりであった：
ＨＡＢ－３６０１の移植されたＶＨ（配列番号：６８）：
ＨＡＢ－３６０１の移植されたＶＬ（配列番号：６９）：
ＨＡＢ－３６０１の移植されたＶＨ（配列番号：６８）：
【化12】
ＨＡＢ－３６０１の移植されたＶＬ（配列番号：６９）：
【化13】
【0128】
選択されたヒト化テンプレートにマウス抗体ＣＤＲ領域を移植して、テンプレートのヒトＣＤＲ領域を置換し、重鎖の２８位および８６位（天然配列ナンバーリング、Ｋａｂａｔナンバーリングによるとそれぞれ２８位および８２Ｂ位に対応する）で復帰突然変異を行い（Ｔ２８ＡおよびＳ８６Ｔ；ＫａｂａｔナンバーリングによるとＴ２８ＡおよびＳ８２Ｂ Ｔ）、潜在的なアスパラギン酸の異性化を排除するために重鎖の５８位（天然配列ナンバーリング）で点突然変異を行ってから（Ｄ５８Ｎ）、ヒトＩｇＧ１の定常領域と組み合わせてヒト化抗体ＨＡＢ－３６０１を作製した。
【0129】
ＨＡＢ－３６０１の重鎖アミノ酸配列を以下の（配列番号：３４）に示した：
【化14-1】
【化14-2】
【0130】
ＨＡＢ－３６０１の軽鎖アミノ酸配列を以下の（配列番号：３５）に示した：
【化15】
【0131】
注： 上記のＨＡＢ－３６０１の軽鎖および重鎖アミノ酸配列において、イタリック体の文字はＦＲ配列を示し、下線付きの文字はＣＤＲ配列を示し、二重下線付きの文字は定常領域配列を示している。
【0132】
３．ｍＡｂ－５１０１のヒト化
ｍＡｂ－５１０１抗体重鎖のヒト化のためのテンプレートは、ＩＧＨＶ２－７０Ｄ＊０４およびｈｊｈ６．１であった。すなわち、ヒト生殖細胞系列重鎖ＩＧＨＶ２－７０ＤからＦＲ１、ＦＲ２およびＦＲ３が選択され、ｈｊｈ６．１のＪＨ６領域がＦＲ４領域として選択された。軽鎖のためのテンプレートはＩＧＫＶ２－４０＊０１およびｈｊｋ４．１であった。すなわち、ヒト生殖細胞系列軽鎖ＩＧＫＶ２－４０からＦＲ１、ＦＲ２およびＦＲ３が選択され、ｈｊｋ４．１のＪＫ４領域がＦＲ４領域として選択された。
ｍＡｂ－５１０１抗体重鎖のヒト化のためのテンプレートは、ＩＧＨＶ２－７０Ｄ＊０４およびｈｊｈ６．１であった。すなわち、ヒト生殖細胞系列重鎖ＩＧＨＶ２－７０ＤからＦＲ１、ＦＲ２およびＦＲ３が選択され、ｈｊｈ６．１のＪＨ６領域がＦＲ４領域として選択された。軽鎖のためのテンプレートはＩＧＫＶ２－４０＊０１およびｈｊｋ４．１であった。すなわち、ヒト生殖細胞系列軽鎖ＩＧＫＶ２－４０からＦＲ１、ＦＲ２およびＦＲ３が選択され、ｈｊｋ４．１のＪＫ４領域がＦＲ４領域として選択された。
【0133】
ヒト生殖細胞系列（ＩＧＨＶ２－７０Ｄ＊０４）重鎖テンプレートのアミノ酸配列を以下の（配列番号：３６）に示した：
【化16】
【0134】
ヒト生殖細胞系列（ＩＧＫＶ２－４０＊０１）軽鎖テンプレートのアミノ酸配列を以下の（配列番号：３７）に示した：
【化17】
【0135】
ヒト化可変領域は以下のとおりであった：
ＨＡＢ－５１０１の移植されたＶＨ（配列番号：７０）：
ＨＡＢ－５１０１の移植されたＶＬ（配列番号：７１）：
ＨＡＢ－５１０１の移植されたＶＨ（配列番号：７０）：
【化18】
ＨＡＢ－５１０１の移植されたＶＬ（配列番号：７１）：
【化19】
【0136】
選択されたヒト化テンプレートにマウス抗体ＣＤＲ領域を移植して、テンプレートのヒトＣＤＲ領域を置換し、軽鎖の２位および５０位（天然配列ナンバーリング、Ｋａｂａｔナンバーリングによるとそれぞれ２位および４５位に対応する）で復帰突然変異を行い（Ｉ２ＶおよびＱ５０Ｋ；ＫａｂａｔナンバーリングによるとＩ２ＶおよびＱ４５Ｋ）、潜在的なジスルフィド結合のミスマッチを排除するために軽鎖の９４位（天然配列ナンバーリング）で点突然変異を行ってから（Ｃ９４Ｓ）、ヒトＩｇＧ１の定常領域と組み合わせてヒト化抗体ＨＡＢ－５１０１を作製した。
【0137】
ＨＡＢ－５１０１の重鎖アミノ酸配列を以下の（配列番号：３８）に示した：
【化20-1】
【化20-2】
【0138】
ＨＡＢ－５１０１の軽鎖アミノ酸配列を以下の（配列番号：３９）に示した：
【化21】
【0139】
注： 上記のＨＡＢ－５１０１の軽鎖および重鎖アミノ酸配列において、イタリック体の文字はＦＲ配列を示し、下線付きの文字はＣＤＲ配列を示し、二重下線付きの文字は定常領域配列を示している。
【0140】
４．ｍＡｂ－９００１のヒト化
ｍＡｂ－９００１抗体重鎖のヒト化のためのテンプレートは、ＩＧＨＶ２－７０Ｄ＊０４およびｈｊｈ６．１であった。すなわち、ヒト生殖細胞系列重鎖ＩＧＨＶ２－７０からＦＲ１、ＦＲ２およびＦＲ３が選択され、ｈｊｈ６．１のＪＨ６領域がＦＲ４領域として選択された。軽鎖のためのテンプレートはＩＧＫＶ２－４０＊０１およびｈｊｋ２．１であった。すなわち、ヒト生殖細胞系列軽鎖ＩＧＫＶ２－４０からＦＲ１、ＦＲ２およびＦＲ３が選択され、ｈｊｋ２．１のＪＫ２領域がＦＲ４領域として選択された。
ｍＡｂ－９００１抗体重鎖のヒト化のためのテンプレートは、ＩＧＨＶ２－７０Ｄ＊０４およびｈｊｈ６．１であった。すなわち、ヒト生殖細胞系列重鎖ＩＧＨＶ２－７０からＦＲ１、ＦＲ２およびＦＲ３が選択され、ｈｊｈ６．１のＪＨ６領域がＦＲ４領域として選択された。軽鎖のためのテンプレートはＩＧＫＶ２－４０＊０１およびｈｊｋ２．１であった。すなわち、ヒト生殖細胞系列軽鎖ＩＧＫＶ２－４０からＦＲ１、ＦＲ２およびＦＲ３が選択され、ｈｊｋ２．１のＪＫ２領域がＦＲ４領域として選択された。
【0141】
ヒト生殖細胞系列（ＩＧＨＶ２－７０Ｄ＊０４）重鎖テンプレートのアミノ酸配列を以下の（配列番号：３６）に示した：
【化22】
【0142】
ヒト生殖細胞系列（ＩＧＫＶ２－４０＊０１）軽鎖テンプレートのアミノ酸配列を以下の（配列番号：３７）に示した：
【化23】
【0143】
ヒト化可変領域は以下のとおりであった：
ＨＡＢ－９００１の移植されたＶＨ（配列番号：７２）：
ＨＡＢ－９００１の移植されたＶＬ（配列番号：７３）：
ＨＡＢ－９００１の移植されたＶＨ（配列番号：７２）：
【化24】
ＨＡＢ－９００１の移植されたＶＬ（配列番号：７３）：
【化25】
【0144】
選択されたヒト化テンプレートにマウス抗体ＣＤＲ領域を移植して、テンプレートのヒトＣＤＲ領域を置換し、軽鎖の２位（天然配列ナンバーリング、Ｋａｂａｔナンバーリングによると２位に対応する）で復帰突然変異を行い（Ｉ２Ｖ）、潜在的なアスパラギン酸の異性化を排除するために重鎖の５８位（天然配列ナンバーリング）で点突然変異を行ってから（Ｄ５８Ｎ）、ヒトＩｇＧ１の定常領域と組み合わせてヒト化抗体ＨＡＢ－９００１を作製した。
【0145】
ＨＡＢ－９００１の重鎖アミノ酸配列を以下の（配列番号：４０）に示した：
【化26】
【0146】
ＨＡＢ－９００１の軽鎖アミノ酸配列を以下の（配列番号：４１）に示した：
【化27】
【0147】
注： 上記のＨＡＢ－９００１の軽鎖および重鎖アミノ酸配列において、イタリック体の文字はＦＲ配列を示し、下線付きの文字はＣＤＲ配列を示し、二重下線付きの文字は定常領域配列を示している。
【0148】
さらに、抗体ＨＡＢ－２４０１、ＨＡＢ－３６０１、ＨＡＢ－５１０１およびＨＡＢ－９００１の定常領域配列について、重鎖定常領域のアミノ酸配列を配列番号：４２に示し、軽鎖定常領域のアミノ酸配列を配列番号：４３に示し、可変領域のアミノ酸配列と全長のアミノ酸配列を次の表に示した：
【表3】
【0149】
（実施例４．ヒト化抗体の調製）
１．ヒト化抗体の分子クローニング
設計されたヒト化抗体配列に対してコドン最適化を実施して、ヒトコドン優先コーディング遺伝子配列を得た。各抗体のＶＨ／ＶＫ遺伝子フラグメントは、設計されたＰＣＲプライマーを用いて構築され、その後、相同組換えによって（シグナルペプチドと定常領域遺伝子（ＣＨ１－ＦＣ／ＣＬ）フラグメントを含む）発現ベクターｐＨｒに導入され、全長のヒト化抗体を発現するプラスミドＶＨ－ＣＨ１－ＦＣ－ｐＨｒ／ＶＫ－ＣＬ－ｐＨｒが構築された。正しいクローンを配列決定によって確認し、ＨＡＢ－２４０１については、重鎖をコードするヌクレオチド配列を配列番号：５４に示し、軽鎖をコードするヌクレオチド配列を配列番号：５５に示した；ＨＡＢ－３６０１については、重鎖をコードするヌクレオチド配列を配列番号：５６に示し、軽鎖をコードするヌクレオチド配列を配列番号：５７に示した；ＨＡＢ－５１０１については、重鎖をコードするヌクレオチド配列を配列番号：５８に示し、軽鎖をコードするヌクレオチド配列を配列番号：５９に示した；および、ＨＡＢ－９００１については、重鎖をコードするヌクレオチド配列を配列番号：６０に示し、軽鎖をコードするヌクレオチド配列を配列番号：６１に示した。
１．ヒト化抗体の分子クローニング
設計されたヒト化抗体配列に対してコドン最適化を実施して、ヒトコドン優先コーディング遺伝子配列を得た。各抗体のＶＨ／ＶＫ遺伝子フラグメントは、設計されたＰＣＲプライマーを用いて構築され、その後、相同組換えによって（シグナルペプチドと定常領域遺伝子（ＣＨ１－ＦＣ／ＣＬ）フラグメントを含む）発現ベクターｐＨｒに導入され、全長のヒト化抗体を発現するプラスミドＶＨ－ＣＨ１－ＦＣ－ｐＨｒ／ＶＫ－ＣＬ－ｐＨｒが構築された。正しいクローンを配列決定によって確認し、ＨＡＢ－２４０１については、重鎖をコードするヌクレオチド配列を配列番号：５４に示し、軽鎖をコードするヌクレオチド配列を配列番号：５５に示した；ＨＡＢ－３６０１については、重鎖をコードするヌクレオチド配列を配列番号：５６に示し、軽鎖をコードするヌクレオチド配列を配列番号：５７に示した；ＨＡＢ－５１０１については、重鎖をコードするヌクレオチド配列を配列番号：５８に示し、軽鎖をコードするヌクレオチド配列を配列番号：５９に示した；および、ＨＡＢ－９００１については、重鎖をコードするヌクレオチド配列を配列番号：６０に示し、軽鎖をコードするヌクレオチド配列を配列番号：６１に示した。
【0150】
２．ヒト化抗体の発現および精製
ＨＥＫ２９３Ｅ細胞に、抗体の重鎖および軽鎖をそれぞれ１：１．５の比率で発現するプラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクションの６日後、発現上清を回収し、高速遠心分離して不純物を除去し、プロテインＡカラムで精製した。Ａ２８０の読み取り値がベースラインに低下するまで、カラムをＰＢＳで洗浄した。標的タンパク質を１００ｍＭ酢酸、ｐＨ３．０で溶出し、１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０で中和した。溶出したサンプルを適切に濃縮してから、ＰＢＳで事前に平衡化したゲルクロマトグラフィーＳｕｐｅｒｄｅｘ２００（ＧＥ）でさらに精製して、凝集体を除去した。モノマーのピークを収集し、使用のために分注した。
ＨＥＫ２９３Ｅ細胞に、抗体の重鎖および軽鎖をそれぞれ１：１．５の比率で発現するプラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクションの６日後、発現上清を回収し、高速遠心分離して不純物を除去し、プロテインＡカラムで精製した。Ａ２８０の読み取り値がベースラインに低下するまで、カラムをＰＢＳで洗浄した。標的タンパク質を１００ｍＭ酢酸、ｐＨ３．０で溶出し、１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０で中和した。溶出したサンプルを適切に濃縮してから、ＰＢＳで事前に平衡化したゲルクロマトグラフィーＳｕｐｅｒｄｅｘ２００（ＧＥ）でさらに精製して、凝集体を除去した。モノマーのピークを収集し、使用のために分注した。
【0151】
本開示の性能および効果は、以下の生化学的試験またはｉｎ ｖｉｖｏ薬理学的試験によって検証された：
【0152】
（試験例１．ＢＩＡｃｏｒｅアッセイによって検出されたＡベータ抗体の親和性）
Ａβ１－４２フィブリルに対する抗体の親和性は、アミノカップリングの方法によって検出された。Ａβ１－４２フィブリルをＣＭ５バイオセンシングチップ（２００ ＲＵ）に結合させた後、抗体分子を該チップの表面に流した。反応シグナルはＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００装置でリアルタイムに検出され、結合および解離曲線を生成した。各実験サイクルの終わりに、解離が完了した後、バイオセンサーチップを洗浄し、１０ｍＭグリシン－ＨＣｌ（ｐＨ１．５）で再生した。陽性抗体であるアデュカヌマブは、ＷＨＯが発表したアデュカヌマブの配列情報に従って調製し（ＷＨＯ医薬品情報、Ｖｏｌ．２８、Ｎｏ．３、２０１４年を参照）、その調製方法を本開示の実施例４に記載した。
Ａβ１－４２フィブリルに対する抗体の親和性は、アミノカップリングの方法によって検出された。Ａβ１－４２フィブリルをＣＭ５バイオセンシングチップ（２００ ＲＵ）に結合させた後、抗体分子を該チップの表面に流した。反応シグナルはＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００装置でリアルタイムに検出され、結合および解離曲線を生成した。各実験サイクルの終わりに、解離が完了した後、バイオセンサーチップを洗浄し、１０ｍＭグリシン－ＨＣｌ（ｐＨ１．５）で再生した。陽性抗体であるアデュカヌマブは、ＷＨＯが発表したアデュカヌマブの配列情報に従って調製し（ＷＨＯ医薬品情報、Ｖｏｌ．２８、Ｎｏ．３、２０１４年を参照）、その調製方法を本開示の実施例４に記載した。
【0153】
Ａβ１－４２モノマーに対する抗体の親和性は、チップ上に抗体を捕捉することによって検出された。ＩｇＧをプロテインＡバイオセンシングチップ上に親和性捕捉し、次に抗原Ａβ１－４２モノマーを該チップの表面に流した。反応シグナルはＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００装置でリアルタイムに検出され、結合および解離曲線を生成した。各実験サイクルの終わりに、解離が完了した後、バイオセンサーチップを洗浄し、１０ｍＭグリシン－ＨＣｌ（ｐＨ１．５）で再生した。
【0154】
実験結果を表４に示した。ＨＡＢ－２４０１、ＨＡＢ－５１０１、ＨＡＢ－３６０１およびＨＡＢ－９００１は、１０－８～１０－１０Ｍの範囲のＡβ１－４２フィブリルに対する親和性を有し、そのうちＨＡＢ－９００１が最も強い親和性を有し、アデュカヌマブのそれより２桁強い。ＨＡＢ－２４０１、ＨＡＢ－５１０１、ＨＡＢ－３６０１およびＨＡＢ－９００１は、１０－７～１０－８Ｍの範囲のＡβ１－４２モノマーに対する親和性を有し、そのうちＨＡＢ－９００１が最も強い親和性を有し、アデュカヌマブのそれより２桁強い。４つの試験抗体はすべて、陽性抗体であるアデュカヌマブよりも強い親和性を有する。
【表4】
【0155】
（試験例２．Ａβ１－４２モノマーのＡβ１－４２フィブリルへの凝集のブロッキングに対する抗Ａベータ抗体の効果）
Ａβ１－４２モノマーのＡβ１－４２フィブリルへの凝集の阻害に対する抗Ａベータ抗体の効果は、ＴｈＴアッセイによって検出された。ＴｈＴ（チオフラビンＴ、チオフラビン）は蛍光色素の一種であり、（Ａベータ沈着物のような）βシートに富むタンパク質と結合すると、励起波長４５０ｎｍおよび発光波長４８２ｎｍでの蛍光シグナルが大幅に増強されるため、通常、Ａβフィブリルのｉｎ ｖｉｔｒｏ同定に使用される。ＴｈＴアッセイの具体的な実験手順を以下に示した。０．５ｍｇのヒトＡβ１－４２（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、カタログ番号ＲＰ１００１７）を２５０μｌの１０ｍＭ ＮａＯＨに加え、完全に溶解してから、中和のために等量の予冷した２×ＰＢＳに加えた。１ｍｇ／ｍｌの濃度のＡβ１－４２モノマー溶液を調製し、ｄｄＨ２Ｏで０．２５ｍｇ／ｍｌに希釈した。Ａβ１－４２モノマー（１０μｌ／ウェル、０．２５ｍｇ／ｍｌ）を２０μＭのＴｈＴ（ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｔ３５１６）と混合し、黒色の３８４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号４５１４）に添加し、またＡβ１－４２モノマーを添加していないウェルをネガティブコントロールとして使用した。次に、段階希釈した抗体（１ｍｇ／ｍｌから開始して２倍ずつ段階希釈、１０μｌ／ウェル）を上記の混合物に添加し、３７℃で２４時間インキュベートした。ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ３マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して、４４０ｎｍの励起波長と４８５ｎｍの発光波長で蛍光シグナルを読み取った。
Ａβ１－４２モノマーのＡβ１－４２フィブリルへの凝集の阻害に対する抗Ａベータ抗体の効果は、ＴｈＴアッセイによって検出された。ＴｈＴ（チオフラビンＴ、チオフラビン）は蛍光色素の一種であり、（Ａベータ沈着物のような）βシートに富むタンパク質と結合すると、励起波長４５０ｎｍおよび発光波長４８２ｎｍでの蛍光シグナルが大幅に増強されるため、通常、Ａβフィブリルのｉｎ ｖｉｔｒｏ同定に使用される。ＴｈＴアッセイの具体的な実験手順を以下に示した。０．５ｍｇのヒトＡβ１－４２（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、カタログ番号ＲＰ１００１７）を２５０μｌの１０ｍＭ ＮａＯＨに加え、完全に溶解してから、中和のために等量の予冷した２×ＰＢＳに加えた。１ｍｇ／ｍｌの濃度のＡβ１－４２モノマー溶液を調製し、ｄｄＨ２Ｏで０．２５ｍｇ／ｍｌに希釈した。Ａβ１－４２モノマー（１０μｌ／ウェル、０．２５ｍｇ／ｍｌ）を２０μＭのＴｈＴ（ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｔ３５１６）と混合し、黒色の３８４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号４５１４）に添加し、またＡβ１－４２モノマーを添加していないウェルをネガティブコントロールとして使用した。次に、段階希釈した抗体（１ｍｇ／ｍｌから開始して２倍ずつ段階希釈、１０μｌ／ウェル）を上記の混合物に添加し、３７℃で２４時間インキュベートした。ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ３マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して、４４０ｎｍの励起波長と４８５ｎｍの発光波長で蛍光シグナルを読み取った。
【0156】
実験結果を図１に示した。ＨＡＢ－２４０１、ＨＡＢ－５１０１およびＨＡＢ－９００１はすべて、Ａβ１－４２モノマーのＡβ１－４２フィブリルへの凝集を効果的に阻害することができる。一方、ＨＡＢ－３６０１とアデュカヌマブは、そのような機能を持たない。
【0157】
（試験例３．ラット初代ニューロンに対する抗Ａベータ抗体の保護）
在胎週数１６～１８日のＳＤ胎児ラットから大脳皮質を解剖し、トリプシン（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号２５２００－０７２）で消化し、ピペッティングおよびろ過して単細胞懸濁液にし、遠心分離して、カウントした。１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１００９９－１４１）を含むＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１０５６４－０２９）で細胞を１ウェルあたり１Ｅ４（１×１０４／ウェル）に希釈し、ＰＤＬ（ポリ－Ｄ－リジン、ポリリジン）（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｐ０８９９）でコーティングした９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３９０３）に播種した。インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）で一晩インキュベートした後、培地をＮｅｕｒｏｂａｓａｌ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号２１１０３０４９）＋２％Ｂ２７（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１７５０４０４４）と交換し、培地の半分を３～４日ごとに交換した。８日目に、１０μＭのＡβ１－４２フィブリル（ＧＬ ｂｉｏｃｈｅｍ、カタログ番号５３８１９）およびさまざまな濃度の試験抗体を添加した。３日間インキュベートした後、３０μｌ／ウェルのＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｇ７５７１）を添加し、化学発光法を用いてマイクロプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｖｅｃｔｏｒ３）でプレートを読み取った。
在胎週数１６～１８日のＳＤ胎児ラットから大脳皮質を解剖し、トリプシン（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号２５２００－０７２）で消化し、ピペッティングおよびろ過して単細胞懸濁液にし、遠心分離して、カウントした。１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１００９９－１４１）を含むＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１０５６４－０２９）で細胞を１ウェルあたり１Ｅ４（１×１０４／ウェル）に希釈し、ＰＤＬ（ポリ－Ｄ－リジン、ポリリジン）（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｐ０８９９）でコーティングした９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３９０３）に播種した。インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）で一晩インキュベートした後、培地をＮｅｕｒｏｂａｓａｌ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号２１１０３０４９）＋２％Ｂ２７（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１７５０４０４４）と交換し、培地の半分を３～４日ごとに交換した。８日目に、１０μＭのＡβ１－４２フィブリル（ＧＬ ｂｉｏｃｈｅｍ、カタログ番号５３８１９）およびさまざまな濃度の試験抗体を添加した。３日間インキュベートした後、３０μｌ／ウェルのＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｇ７５７１）を添加し、化学発光法を用いてマイクロプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｖｅｃｔｏｒ３）でプレートを読み取った。
【0158】
実験結果を図２に示した。ＨＡＢ－２４０１、ＨＡＢ－５１０１、ＨＡＢ－３６０１、ＨＡＢ－９００１および陽性抗体のアデュカヌマブは、初代神経細胞をＡβフィブリルの毒性から保護することができ、１０～１００μｇ／ｍｌの濃度範囲で用量依存的な効果が観察された。
【0159】
（試験例４．抗Ａベータ抗体はＢＶ２細胞によるＡβフィブリルの食作用を促進する）
対数増殖期のＢＶ２細胞（ＦｕＤａｎ ＩＢＳ Ｃｅｌｌ Ｃｅｎｔｅｒ、ＦＨ０３６６）を採取し、トリプシンで消化し、８００ｒｐｍで５分間遠心分離した。２４ウェルプレートにおける細胞密度をＲＰＭＩ１６４０（１０％ＦＢＳを含む）で１．２×１０５細胞／ウェル／５００μｌに調整し、単層の細胞が形成されるまで十分に振とうし、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターに一晩入れた。１６時間後、１００μｌの段階希釈Ａベータ抗体またはネガティブコントロール（無関係な標的に対する抗トロンビン抗体をネガティブコントロールとして使用し、該抗トロンビン抗体はＷＯ２０１７１３３６７３Ａ１に記載されているＨ１６０１－００８の調製方法に従って製造した）を（１００μｌのＦ－１２Ｋ基本培地で希釈した）１０μＭの蛍光標識Ａベータフィブリルと完全に混合し、３７℃で１時間インキュベートし、５００μｌの培地を除去した２４ウェルプレートに加え、３７℃、５％ＣＯ２で１時間インキュベートした。上清を除去し、細胞を４℃に予冷したＰＢＳで３回穏やかに洗浄した。次に、０．２５％の予冷したトリプシン－ＥＤＴＡ（１×）を２００μｌ／ウェルで添加し、４℃で２０分間置いた。１０％ＦＢＳを含むＦ－１２Ｋ培地でトリプシンを中和し、遠心分離した後、細胞を予冷したＰＢＳで３回洗浄し、１００μｌの細胞を収集してフローサイトメーターにアプライし、ＦＩＴＣ蛍光強度を読み取った。
対数増殖期のＢＶ２細胞（ＦｕＤａｎ ＩＢＳ Ｃｅｌｌ Ｃｅｎｔｅｒ、ＦＨ０３６６）を採取し、トリプシンで消化し、８００ｒｐｍで５分間遠心分離した。２４ウェルプレートにおける細胞密度をＲＰＭＩ１６４０（１０％ＦＢＳを含む）で１．２×１０５細胞／ウェル／５００μｌに調整し、単層の細胞が形成されるまで十分に振とうし、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターに一晩入れた。１６時間後、１００μｌの段階希釈Ａベータ抗体またはネガティブコントロール（無関係な標的に対する抗トロンビン抗体をネガティブコントロールとして使用し、該抗トロンビン抗体はＷＯ２０１７１３３６７３Ａ１に記載されているＨ１６０１－００８の調製方法に従って製造した）を（１００μｌのＦ－１２Ｋ基本培地で希釈した）１０μＭの蛍光標識Ａベータフィブリルと完全に混合し、３７℃で１時間インキュベートし、５００μｌの培地を除去した２４ウェルプレートに加え、３７℃、５％ＣＯ２で１時間インキュベートした。上清を除去し、細胞を４℃に予冷したＰＢＳで３回穏やかに洗浄した。次に、０．２５％の予冷したトリプシン－ＥＤＴＡ（１×）を２００μｌ／ウェルで添加し、４℃で２０分間置いた。１０％ＦＢＳを含むＦ－１２Ｋ培地でトリプシンを中和し、遠心分離した後、細胞を予冷したＰＢＳで３回洗浄し、１００μｌの細胞を収集してフローサイトメーターにアプライし、ＦＩＴＣ蛍光強度を読み取った。
【0160】
実験結果を図３に示した。ＨＡＢ－２４０１とＨＡＢ－３６０１はどちらも、陽性抗体のアデュカヌマブと同様に、ＢＶ２細胞によるＡβフィブリルの食作用を促進することができる。０．０３～０．３μｇ／ｍｌの濃度範囲で用量依存的な効果が観察された。
【0161】
（試験例５．ラット初代ミクログリアによるＡβフィブリルの食作用に対する抗Ａベータ抗体の効果）
大脳皮質を新生児ＳＤラットから解剖し、粉砕し、ろ過して細胞懸濁液を得た。２０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１００９９－１４１）に細胞を再懸濁し、ＰＤＬ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｐ０８９９）でプレコートされたＴ７５培養フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３４７３）に移し、インキュベーターに入れた（３７℃、５％ＣＯ２）。培地は３日に１回交換した。８日目に、培養フラスコをシェーカー上に置き、２００ｒｐｍで１時間振とうした。上清を収集し、遠心分離し、カウントし、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２（ＧＥ、カタログ番号ＳＨ３００２３．０１）培地で５Ｅ４／ウェル（５×１０４／ウェル）に希釈し、２４ウェルプレートにプレーティングした。６時間後、培地を無血清ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に交換し、一晩インキュベートした。９日目に、さまざまな濃度の抗体またはネガティブコントロール（無関係な標的に対する抗トロンビン抗体をネガティブコントロールとして使用し、該抗トロンビン抗体は、ＷＯ２０１７１３３６７３Ａ１に記載されているＨ１６０１－００８の調製方法に従って産生された）をそれぞれ１０μＭのＦＩＴＣ標識（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号Ａ３０００６）Ａベータ１－４２（ＧＬ ｂｉｏｃｈｅｍ、カタログ番号５３８１９）と混合し、３７℃で３０分間インキュベートし、余分な抗体を洗い流すために遠心分離した。抗体とＡベータの混合物を細胞に添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。細胞をＰＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、カタログ番号ＳＨ３０２５６．０１）で２回洗浄し、トリプシン（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号２５２００－０７２）を加え、細胞を消化するために４℃の冷蔵庫に１０分間入れた。その後、血清を加えて反応を停止し、遠心分離により上清を除去した後、細胞を回収し、予冷しておいたＰＢＳを加え、遠心分離により上清を除去し、細胞をＰＢＳで２回洗浄した。ＦＩＴＣ蛍光強度をフローサイトメーター（ＢＤ、Ｖｅｒｓｅ）で読み取った。
大脳皮質を新生児ＳＤラットから解剖し、粉砕し、ろ過して細胞懸濁液を得た。２０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１００９９－１４１）に細胞を再懸濁し、ＰＤＬ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｐ０８９９）でプレコートされたＴ７５培養フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３４７３）に移し、インキュベーターに入れた（３７℃、５％ＣＯ２）。培地は３日に１回交換した。８日目に、培養フラスコをシェーカー上に置き、２００ｒｐｍで１時間振とうした。上清を収集し、遠心分離し、カウントし、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２（ＧＥ、カタログ番号ＳＨ３００２３．０１）培地で５Ｅ４／ウェル（５×１０４／ウェル）に希釈し、２４ウェルプレートにプレーティングした。６時間後、培地を無血清ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に交換し、一晩インキュベートした。９日目に、さまざまな濃度の抗体またはネガティブコントロール（無関係な標的に対する抗トロンビン抗体をネガティブコントロールとして使用し、該抗トロンビン抗体は、ＷＯ２０１７１３３６７３Ａ１に記載されているＨ１６０１－００８の調製方法に従って産生された）をそれぞれ１０μＭのＦＩＴＣ標識（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号Ａ３０００６）Ａベータ１－４２（ＧＬ ｂｉｏｃｈｅｍ、カタログ番号５３８１９）と混合し、３７℃で３０分間インキュベートし、余分な抗体を洗い流すために遠心分離した。抗体とＡベータの混合物を細胞に添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。細胞をＰＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、カタログ番号ＳＨ３０２５６．０１）で２回洗浄し、トリプシン（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号２５２００－０７２）を加え、細胞を消化するために４℃の冷蔵庫に１０分間入れた。その後、血清を加えて反応を停止し、遠心分離により上清を除去した後、細胞を回収し、予冷しておいたＰＢＳを加え、遠心分離により上清を除去し、細胞をＰＢＳで２回洗浄した。ＦＩＴＣ蛍光強度をフローサイトメーター（ＢＤ、Ｖｅｒｓｅ）で読み取った。
【0162】
実験結果を図４に示した。ラット初代ミクログリアによる食作用の実験では、ＨＡＢ－２４０１およびＨＡＢ－３６０１は、陽性抗体のアデュカヌマブと同様に、初代ミクログリアによるＡβフィブリルの食作用を促進することができる。０．０３～０．３μｇ／ｍｌの濃度範囲で用量依存的な効果が観察された。
【0163】
（試験例６．抗Ａβ抗体のｉｎ ｖｉｖｏ薬理試験）
５×ＦＡＤ（５つの家族性ＡＤ突然変異（（Ｆｉｖｅ Ｆａｍｉｌｉａｌ ＡＤ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ））アルツハイマー病マウスモデルを使用して、抗Ａβ抗体のｉｎｖｉｖｏでの有効性を評価した。ＡＰＰ遺伝子の３つの突然変異（すなわち、スウェーデン突然変異（Ｋ６７０Ｎ、Ｍ６７１Ｌ）、フロリダ突然変異（Ｉ７１６Ｖ）およびロンドン突然変異（Ｖ７１７Ｉ））とＰＳ１遺伝子の２つの突然変異（すなわち、Ｍ１４６ＬおよびＬ２８６Ｖ）とを含む、ＡＰＰおよびＰＳ１遺伝子の５つの家族性遺伝子突然変異）を５×ＦＡＤマウスで過剰発現させた。したがって、野生型マウス（ＷＴ）と比較して、５×ＦＡＤマウスは認知機能および記憶に明らかな障害を示し、脳組織における有意なＡβ斑沈着を示した。この試験例は、巣作り能力および空間記憶（モリス水迷路における空間記憶）を含むマウスの行動の改善を試験することによって、ならびに脳組織におけるＡβ斑の含有量の変化を試験することによって、マウスの認知能力を改善し、Ａβ斑沈着を減少させる試験抗体の効率を評価するために設計された。
５×ＦＡＤ（５つの家族性ＡＤ突然変異（（Ｆｉｖｅ Ｆａｍｉｌｉａｌ ＡＤ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ））アルツハイマー病マウスモデルを使用して、抗Ａβ抗体のｉｎｖｉｖｏでの有効性を評価した。ＡＰＰ遺伝子の３つの突然変異（すなわち、スウェーデン突然変異（Ｋ６７０Ｎ、Ｍ６７１Ｌ）、フロリダ突然変異（Ｉ７１６Ｖ）およびロンドン突然変異（Ｖ７１７Ｉ））とＰＳ１遺伝子の２つの突然変異（すなわち、Ｍ１４６ＬおよびＬ２８６Ｖ）とを含む、ＡＰＰおよびＰＳ１遺伝子の５つの家族性遺伝子突然変異）を５×ＦＡＤマウスで過剰発現させた。したがって、野生型マウス（ＷＴ）と比較して、５×ＦＡＤマウスは認知機能および記憶に明らかな障害を示し、脳組織における有意なＡβ斑沈着を示した。この試験例は、巣作り能力および空間記憶（モリス水迷路における空間記憶）を含むマウスの行動の改善を試験することによって、ならびに脳組織におけるＡβ斑の含有量の変化を試験することによって、マウスの認知能力を改善し、Ａβ斑沈着を減少させる試験抗体の効率を評価するために設計された。
【0164】
５×ＦＡＤマウスは、ＳｈａｎｇｈａｉＣｈｅｍＰａｒｔｎｅｒ株式会社から提供された。生後３か月のマウスを選択し、２３±２℃の室温、１２／１２時間の明暗サイクルで、餌と水を自由に摂取させた。試験抗体はすべてヒト－マウスキメラ型であった。すなわち、抗体の長期投与によって引き起こされるＡＤＡ（抗薬物抗体）を回避するために、重鎖および軽鎖の定常領域をマウスの定常領域に置換した。６群（１群あたりｎ＝１５）が実験に含まれ、試験対象の抗体の４つの群、ポジティブコントロールとしてのアデュカヌマブの１つの群、ネガティブコントロールとしてのＰＢＳの１つの群が含まれていた。ＨＡＢ－２４０１およびＨＡＢ－３６０１はｍＩｇＧ１キメラ型であったのに対し、ＨＡＢ－５１０１、ＨＡＢ－９００１およびアデュカヌマブはｍＩｇＧ２ａキメラ型であり、それらは、それぞれ、ＨＡＢ－２４０１－Ｃｈ、ＨＡＢ－３６０１－Ｃｈ、ＨＡＢ－５１０１－Ｃｈ、ＨＡＢ－９００１－Ｃｈ、およびアデュカヌマブ－Ｃｈと呼ばれた。ＨＡＢ－２４０１－ＣｈおよびＨＡＢ－３６０１－Ｃｈは、ＨＡＢ－２４０１およびＨＡＢ－３６０１の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を、それぞれ、ｍＩｇＧ１の重鎖定常領域（ｍＩｇＧ１の重鎖定常領域のアミノ酸は配列番号：６２に示されている）およびｍＩｇＧ１の軽鎖定常領域（ｍＩｇＧ１の軽鎖定常領域のアミノ酸配列は配列番号：６３に示されている）に融合することによって生成された；ＨＡＢ－５１０１－Ｃｈ、ＨＡＢ－９００１－Ｃｈおよびアデュカヌマブ－Ｃｈは、ＨＡＢ－５１０１、ＨＡＢ－９００１およびアデュカヌマブの重鎖可変領域および軽鎖可変領域を、それぞれ、ｍＩｇＧ２ａの重鎖定常領域（ｍＩｇＧ２ａの重鎖定常領域のアミノ酸配列は配列番号：６４に示されている）およびｍＩｇＧ２ａの軽鎖定常領域（ｍＩｇＧ２ａの軽鎖定常領域のアミノ酸配列は配列番号：６５に示されている）に融合することによって生成された。抗体の調製方法は、本開示の実施例４に記載されている。抗体は週１回、１５ｍｐｋ（ｍｇ／ｋｇ、体重１ｋｇあたりのミリグラム）で腹腔内投与され、投与は合計１２週間、１３：００～１６：００に行われた。
【0165】
行動試験（試験例８）の後に、すべての５×ＦＡＤマウスに対応する抗体を追加注射した。マウスを、各群に５匹のマウスで３つのバッチに分けた。抗体治療後のさまざまな時点でＢＢＢに浸透する抗体の含有量を定量的に検出するために、追加投与の２４時間後、７２時間後および７日後にサンプルを採取した。Ａβ沈着（試験例９）およびサイトカイン（試験例１０）の検出に関して、同じ抗体の群について、追加投与後のさまざまな時点で採取されたすべてのサンプルは、データ処理のために一緒にプールされた。
【0166】
（試験例７．マウスの巣作り能力の試験）
巣作りはマウスの本能であり、通常、マウスの社会的行動を測定するための実験的方法として使用される。Ｔｇ２５７６、ＡＰＰｓｗｅ／ＰＳ１、３×Ｔｇ－ＡＤ、５×ＦＡＤ（Ｔｒａｎｓｌ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ． ２０１５年５月５日；５：ｅ５６２）などのＡＰＰを過剰発現するトランスジェニックマウスは、さまざまな程度で巣作りの能力に障害を示したことが報告されている。この試験例は、複数のパラメーターを用いてマウスの巣作り能力をスコアリングすることにより、５×ＦＡＤトランスジェニックマウスの社会的行動の改善に対する試験抗体の効果を評価する。
巣作りはマウスの本能であり、通常、マウスの社会的行動を測定するための実験的方法として使用される。Ｔｇ２５７６、ＡＰＰｓｗｅ／ＰＳ１、３×Ｔｇ－ＡＤ、５×ＦＡＤ（Ｔｒａｎｓｌ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ． ２０１５年５月５日；５：ｅ５６２）などのＡＰＰを過剰発現するトランスジェニックマウスは、さまざまな程度で巣作りの能力に障害を示したことが報告されている。この試験例は、複数のパラメーターを用いてマウスの巣作り能力をスコアリングすることにより、５×ＦＡＤトランスジェニックマウスの社会的行動の改善に対する試験抗体の効果を評価する。
【0167】
マウスの巣作りの具体的な手順は以下のとおりであった。実験初日の１６：００頃に、各ケージに圧縮綿を入れ、各マウスを別々のケージに入れた。ケージに入れる前に圧縮綿を計量し（重量１）、繁殖環境は変わらなかった。翌朝１０時にマウスを取り出し、元のケージに戻した。巣の形および綿片の位置は変更されなかった。まず、デジタルカメラを使ってマウスが作った巣の写真を撮った（巣の本当の形および高さを反映した正面図と側面図）。細かく引き裂かれていない綿を拾い上げて計量した（重量２）。残った綿の割合を計算した。写真に基づいて、巣の形、巣の高さ、および綿が引き裂かれた程度に応じて、各動物についての平均スコアが、スコアリング基準に従って、並行して提供された３つの独立したスコアから得られ、ここで該スコアは特定の状況に基づいて適切に調整され得る。スコアリング基準を表５に示した。
【表5】
【0168】
Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ ＣＳ４ソフトウェアパッケージのなげなわツールを使用して各動物の写真を分析し、巣の面積比（散らばった綿片の総面積に対する巣の面積の割合）を計算した。３つのパラメーターの総合スコア（３次スコア）は、次の式に従って計算された：
【0169】
３つのパラメーターの総合スコア＝残った綿の割合×巣の面積の割合×平均スコア
【0170】
試験結果を図６と図７に示した。ビヒクル（溶媒ブランクコントロール）とＷＴ（野生型）の間にはいくつかの違いがあり、これは試験の実験ウィンドウを反映している。アデュカヌマブ－Ｃｈ、ＨＡＢ－２４０１－ＣｈおよびＨＡＢ－９００１－Ｃｈ群は、ビヒクル群と比較していくらかの改善傾向を示した。
【0171】
（試験例８．水迷路行動試験（モリス水迷路））
水迷路実験は、げっ歯類の空間学習と記憶能力を評価するために神経生物学の分野で一般的に使用される行動試験である。そのような実験では、げっ歯類がトレーニングによってプールの水の下に隠れた脱出プラットフォームを見つけて覚えるように導くために、スイミングプールの周りの空間的な手がかりが使用された。
水迷路実験は、げっ歯類の空間学習と記憶能力を評価するために神経生物学の分野で一般的に使用される行動試験である。そのような実験では、げっ歯類がトレーニングによってプールの水の下に隠れた脱出プラットフォームを見つけて覚えるように導くために、スイミングプールの周りの空間的な手がかりが使用された。
【0172】
モリス水迷路は、直径１２０ｃｍ、高さ５０ｃｍの白色、無毒、無臭のプラスチック製の円形プールと透明なパースペックスプラットフォームからなっていた。プラットフォームの高さは３１ｃｍで、プラットフォームの上面の直径は８．５ｃｍであった。水面がプラットフォームから１ｃｍ上になるまでプールを水で満たした。プールは、ＮＥ、ＳＥ、ＳＷおよびＮＷの４つの象限に均等に分割され、Ｎ、ＮＥ、Ｅ、ＳＥ、Ｓ、ＳＷ、ＷおよびＮＷが、円形プールの外側の円に均等に分割された８つのポイントでマークされた。プラットフォームはＳＷ象限の中心に位置し、円の中心まで３０ｃｍの距離、プールの壁まで３０ｃｍの距離であった（水迷路の概略図を図８に示した）。インストールされたカメラデバイスを、コンピューターとモニターに接続した。円形プールは明るい実験室内に置かれた。明らかな視覚的手がかりが、ＮＥ、ＳＥ、ＳＷおよびＮＷマーカーで装飾された。実験前に、適量の白いプラスチック粒子を水にまき散らして水面を均一に覆い、水温を２３．０±２．０℃に保った。水は５日ごとに交換された。
【0173】
次のモジュールが水迷路実験に含まれていた：フラグ訓練、隠れたプラットフォーム、およびプローブ試験。
【0174】
８．１．フラグ訓練
動物をガイドするために、水面上のフラグがプラットフォームに置かれた。各実験動物をＮポイントで水に入れ（プールの壁に向けて）、６０秒間のビデオの追跡および記録を同時に開始した。動物が６０秒以内にプラットフォームに乗ることができなかった場合は、動物は手動でプラットフォームにガイドされ、迷路から外される前に２０秒間留まることを許される；動物が６０秒以内にプラットフォームを見つけたが、プラットフォームに２０秒未満留まった場合は、６０秒の訓練が終了した後、動物は迷路から外される前に２０秒間プラットフォームに強制的に留まらされる；動物が６０秒以内にプラットフォームを見つけ、２０秒間プラットフォームに留まった場合、動物は迷路から外される。訓練後、各動物をタオルで乾かし、ケージに戻した。すべての動物を訓練した後、同じ訓練の新しいラウンドを再開した。このようにして、各動物は１日で４回訓練された。
動物をガイドするために、水面上のフラグがプラットフォームに置かれた。各実験動物をＮポイントで水に入れ（プールの壁に向けて）、６０秒間のビデオの追跡および記録を同時に開始した。動物が６０秒以内にプラットフォームに乗ることができなかった場合は、動物は手動でプラットフォームにガイドされ、迷路から外される前に２０秒間留まることを許される；動物が６０秒以内にプラットフォームを見つけたが、プラットフォームに２０秒未満留まった場合は、６０秒の訓練が終了した後、動物は迷路から外される前に２０秒間プラットフォームに強制的に留まらされる；動物が６０秒以内にプラットフォームを見つけ、２０秒間プラットフォームに留まった場合、動物は迷路から外される。訓練後、各動物をタオルで乾かし、ケージに戻した。すべての動物を訓練した後、同じ訓練の新しいラウンドを再開した。このようにして、各動物は１日で４回訓練された。
【0175】
８．２．隠れたプラットフォーム
プラットフォームは水面下約１ｃｍに隠れていた。動物は１日４回、合計１２日間訓練された。マウスを水中に入れた場所を図８に示した。各訓練中、動物はプールの壁に面して配置され、ビデオの追跡および記録が同時に開始された。各訓練は６０秒間続いた。動物が６０秒以内にプラットフォームに見つけることができなかった場合は、動物は手動でプラットフォームにガイドされ、迷路から外される前に１５秒間留まることを許される；動物が６０秒以内にプラットフォームを見つけたが、プラットフォームに１５秒未満留まった場合は、６０秒の訓練が終了した後、動物は迷路から外される前に１５秒間プラットフォームに強制的に留まらされる；動物が６０秒以内にプラットフォームを見つけ、１５秒間プラットフォームに留まった場合、動物は迷路から外される。訓練後、各動物をタオルで乾かし、ケージに戻した。すべての動物を訓練した後、動物を水中に入れる場所を変えて、訓練の新しいラウンドを再開した。
プラットフォームは水面下約１ｃｍに隠れていた。動物は１日４回、合計１２日間訓練された。マウスを水中に入れた場所を図８に示した。各訓練中、動物はプールの壁に面して配置され、ビデオの追跡および記録が同時に開始された。各訓練は６０秒間続いた。動物が６０秒以内にプラットフォームに見つけることができなかった場合は、動物は手動でプラットフォームにガイドされ、迷路から外される前に１５秒間留まることを許される；動物が６０秒以内にプラットフォームを見つけたが、プラットフォームに１５秒未満留まった場合は、６０秒の訓練が終了した後、動物は迷路から外される前に１５秒間プラットフォームに強制的に留まらされる；動物が６０秒以内にプラットフォームを見つけ、１５秒間プラットフォームに留まった場合、動物は迷路から外される。訓練後、各動物をタオルで乾かし、ケージに戻した。すべての動物を訓練した後、動物を水中に入れる場所を変えて、訓練の新しいラウンドを再開した。
【0176】
８．３．プローブ試験
１２日目の最後の訓練から２４時間後、プローブ試験のために水中のプラットフォームを除去した。実験動物をＮＥポイントで水に入れ（プールの壁に向けて）、ビデオの追跡および記録を同時に開始した。６０秒後、追跡は終了した。動物をプールから取り出し、タオルで乾かし、ケージに戻した。動物の軌跡は、Ｎｏｌｄｕｓ Ｅｔｈｏｖｉｓｉｏｎソフトウェアで分析された。
１２日目の最後の訓練から２４時間後、プローブ試験のために水中のプラットフォームを除去した。実験動物をＮＥポイントで水に入れ（プールの壁に向けて）、ビデオの追跡および記録を同時に開始した。６０秒後、追跡は終了した。動物をプールから取り出し、タオルで乾かし、ケージに戻した。動物の軌跡は、Ｎｏｌｄｕｓ Ｅｔｈｏｖｉｓｉｏｎソフトウェアで分析された。
【0177】
８．４．水迷路実験の結果
隠れたプラットフォーム訓練の学習曲線を図９に示した。結果は、５×ＦＡＤ Ｔｇマウスビヒクル（溶媒ブランクコントロール）群とＷＴ群との間で、６日目に有意差が観察され、隠れたプラットフォーム訓練の１０日目と１１日目に非常に有意な差が観察されたことを示し、そのような差は安定する傾向があり、行動試験において５×ＦＡＤトランスジェニックマウスと野生型マウスとの間で空間記憶能力に差があることを示している。このような差は、試験薬の試験の基礎である；１日目から、ポジティブコントロール薬アデュカヌマブ－Ｃｈの群は常にビヒクル群よりもプラットフォームまでの潜時が短く、１１日目に有意差が観察され、アデュカヌマブ－Ｃｈがこの実験で優れた有効性を示したことを示している；アデュカヌマブ－Ｃｈ群と同様に、ＨＡＢ－２４０１－Ｃｈ、ＨＡＢ－５１０１－ＣｈおよびＨＡＢ－９００１－Ｃｈは、１１日目と１２日目に有意差を示し、アデュカヌマブ－Ｃｈと同様に、これら３つの薬剤がマウスの空間記憶と認知能力を大幅に改善できることを示している。
隠れたプラットフォーム訓練の学習曲線を図９に示した。結果は、５×ＦＡＤ Ｔｇマウスビヒクル（溶媒ブランクコントロール）群とＷＴ群との間で、６日目に有意差が観察され、隠れたプラットフォーム訓練の１０日目と１１日目に非常に有意な差が観察されたことを示し、そのような差は安定する傾向があり、行動試験において５×ＦＡＤトランスジェニックマウスと野生型マウスとの間で空間記憶能力に差があることを示している。このような差は、試験薬の試験の基礎である；１日目から、ポジティブコントロール薬アデュカヌマブ－Ｃｈの群は常にビヒクル群よりもプラットフォームまでの潜時が短く、１１日目に有意差が観察され、アデュカヌマブ－Ｃｈがこの実験で優れた有効性を示したことを示している；アデュカヌマブ－Ｃｈ群と同様に、ＨＡＢ－２４０１－Ｃｈ、ＨＡＢ－５１０１－ＣｈおよびＨＡＢ－９００１－Ｃｈは、１１日目と１２日目に有意差を示し、アデュカヌマブ－Ｃｈと同様に、これら３つの薬剤がマウスの空間記憶と認知能力を大幅に改善できることを示している。
【0178】
プローブ試験では、プラットフォームまでの潜時、プラットフォームゾーンまでの潜時、プラットフォームまたはプラットフォームゾーンを通過した回数、プラットフォーム上での継続時間とプラットフォームゾーン上での継続時間、およびＡＣＩインデックスなど、いくつかの実験パラメーターを評価した。
【0179】
プラットフォームまでの潜時の結果を図１０Ａに示した。ＷＴと実験ウィンドウ（ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｗｉｎｄｏｗ）であるビヒクル群の間には一定の差があった。（ＷＴ群について、プローブ試験におけるプラットフォームまでの潜時は、フラグ訓練におけるそれよりも長かった。これは、プローブ試験では１回の試験しか実行されなかったのに対し、フラグ訓練では４回の試験が実行されたため、実験のばらつきが原因である可能性がある）。ＨＡＢ－２４０１－Ｃｈ、ＨＡＢ－５１０１－ＣｈおよびＨＡＢ－９００１－Ｃｈの結果は、アデュカヌマブ－Ｃｈ群の結果と同等であり、ビヒクル群よりも短い期間を示した。
【0180】
プラットフォームゾーンまでの潜時の結果を図１０Ｂに示した。ＷＴ群は、ビヒクル群と比較した場合、約３倍の有意差を示した。アデュカヌマブ－Ｃｈ群はビヒクル群と比較して有意差を示したが、アデュカヌマブ－Ｃｈ群の結果はＷＴ群の結果に近く、陽性分子が５×ＦＡＤマウスの記憶を有意に改善できることを示している。ビヒクル群と比較した場合、４つの試験抗体すべてが有意差を示し、その中でＨＡＢ－９００１－Ｃｈはアデュカヌマブ－Ｃｈよりもさらに優れた有効性を示した。
【0181】
プラットフォームまたはプラットフォームゾーンを通過した回数の実験結果を図１０Ｃおよび図１０Ｄに示し、プラットフォーム上での継続時間およびプラットフォームゾーン上での継続時間の実験結果を図１０Ｅおよび図１０Ｆに示し、ＡＣＩインデックスの実験結果を図１０Ｇに示した。プローブテストでは、プラットフォームが除去されており、プラットフォームのマウスの記憶は理論的にこれらのパラメーターと正の相関がある。これらの５つのパラメーターについては、ＷＴ群とビヒクル群の間に一定の差があり、実験結果の実験ウィンドウを示している。ビヒクル群と比較して、アデュカヌマブ－Ｃｈは改善傾向を示した。ビヒクル群と比較して、ＨＡＢ－２４０１－Ｃｈ、ＨＡＢ－５１０１－ＣｈおよびＨＡＢ－９００１－Ｃｈはすべて異なる程度の改善を示し、ＨＡＢ－９００１－Ｃｈは最高のパフォーマンスを示した。
【0182】
要約すると、プローブ試験では、ビヒクル群と比較して、ＨＡＢ－２４０１－Ｃｈ、ＨＡＢ－５１０１－ＣｈおよびＨＡＢ－９００１－Ｃｈが、プラットフォームまでの潜時、プラットフォームゾーンまでの潜時、プラットフォーム上での継続時間、プラットフォームゾーン上での継続時間、プラットフォームを通過した回数、プラットフォームゾーンを通過した回数、およびＡＣＩインデックスにおいて、さまざまな程度の改善を示し、これら３つの試験抗体が５×ＦＡＤアルツハイマーマウスモデルの空間記憶と認知能力を大幅に改善できることを示唆している。
【0183】
（試験例９．Ａβ沈着の検出）
すべてのサンプルは、行動試験（試験例８）に使用したマウスから採取された。各マウスをＰＢＳ（ｐＨ７．４）で灌流させ、脳を採取した。左半球を直ちに４％ＰＦＡに浸し、７２時間固定し、右半球を氷上で解剖して前頭皮質と海馬を収集し、別々に秤量し、液体窒素で急速凍結し、その後のサンプル処理のために－８０℃の冷蔵庫に保管した。
すべてのサンプルは、行動試験（試験例８）に使用したマウスから採取された。各マウスをＰＢＳ（ｐＨ７．４）で灌流させ、脳を採取した。左半球を直ちに４％ＰＦＡに浸し、７２時間固定し、右半球を氷上で解剖して前頭皮質と海馬を収集し、別々に秤量し、液体窒素で急速凍結し、その後のサンプル処理のために－８０℃の冷蔵庫に保管した。
【0184】
右半球をホモジナイズする具体的な手順は次のとおりある：試験組織の重さを量り、ホモジナイズチューブに移し、１０倍量のジエチルアミンライセート（プロテアーゼ阻害剤を含有する５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．２％ＤＥＡ）を添加した。すなわち、１０ｍｇの組織を１００μｌの溶解溶液に加え、ホモジナイザーでホモジナイズし、氷水中で１５～２０秒間超音波処理した。ホモジネートを遠心分離管に移し、１００，０００×ｇ、４℃で３０分間遠心分離した。得られた可溶性Ａβを含む上清を収集し、－８０℃で保存した。１０倍量の塩酸グアニジン溶解溶液（ＰＢＳ中の５Ｍ ＧｕＨＣｌ）を遠心分離管に加え、ペレットを再懸濁し、氷水中で１５～２０秒間超音波処理した。サンプルを１００，０００×ｇ、４℃で３０分間遠心分離した。得られた不溶性Ａβを含む上清を収集し、－８０℃で保存した。
【0185】
脳組織ホモジネート中のＡβ沈着はＥＬＩＳＡ法により検出された（ヒトアミロイドベータ（ａａ １－４０）Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡキット：Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、ＤＡＢ１４０Ｂ；ヒトアミロイドベータ（ａａ １－４２）Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡキット：Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、ＤＡＢ１４２）。まず、脳ホモジネート中の不溶性成分（つまり、試験対象のサンプル）とスタンダードを希釈液で希釈した；プレコートプレートを洗浄バッファーで洗浄した；希釈したスタンダードとサンプルを添加した；プレートを密封し、４℃で２時間インキュベートした；プレートを洗浄バッファーで３～４回洗浄した；予冷しておいた二次抗体を添加した；プレートを密封し、４℃で２時間インキュベートした；プレートを洗浄バッファーで３～４回洗浄した；基質発色溶液を加え、室温で３０分間インキュベートした；停止溶液を加え、ＯＤ４５０をマイクロプレートリーダーで読み取った。
【0186】
ＥＬＩＳＡ試験の結果を図１１Ａ－１１Ｄに示した。ビヒクル（溶媒ブランクコントロール）群はＷＴ群と比較して有意なＡβ１－４０およびＡβ１－４２沈着を示し、Ａβ沈着物が５×ＦＡＤマウス脳組織において過剰発現したことを示している。ビヒクル群と比較して、Ａβ１－４０およびＡβ１－４２が減少する傾向がアデュカヌマブ－Ｃｈで観察された。試験した４つの抗体の中で、ＨＡＢ－３６０１－Ｃｈが最高のパフォーマンスを示し、ビヒクルと比較して不溶性Ａβ１－４０（海馬不溶性Ａβ１－４０）および不溶性Ａβ１－４２（海馬不溶性Ａβ１－４２）が減少する傾向を示した。
【0187】
左半球組織の免疫組織化学的染色の手順は以下のとおりであった。単離された脳の脱水：脳を４％ＰＦＡで７２時間固定し、次に脱水のために３０％ショ糖溶液に入れ、４℃の冷蔵庫に一晩入れ、この脱水手順を１回繰り返した；組織の包埋：イソペンタンをドライアイスに数分間入れて、イソペンタン中の液体を－７０℃に到達させた；脳組織を吸い取り紙で乾燥させ、余分な部分を取り除いた後、イソペンタンに入れて数秒間凍結させてから、脳組織をイソペンタンから取り出し、乾燥させ、ＯＴＣ（包埋剤）を用いて包埋ボックスに包埋し、次に、包埋ボックスをドライアイス上に置いて、ＯＴＣを固化した。包埋された脳組織を－８０℃の冷蔵庫に保存した；セクショニング：脳組織をクライオスタット中で矢状断面にスライスあたり２０μｍで切断した；内因性ペルオキシダーゼの不活化：脳スライスをＰＢＳで３回、各回５分間すすぎ、０．３％Ｈ２Ｏ２（ＰＢＳで調製）とともに１０分間インキュベートした；透過処理：脳スライスをＰＢＳで３回、各回５分間すすぎ、ＴＢＳＴ（０．２５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含むＴＢＳ）で３回、各回５分間インキュベートした；ブロッキング：ＰＢＳ中の０．３％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００および５％ＢＳＡと１時間インキュベートした；一次抗体とのインキュベーション：一次抗体３Ｄ６をＴＢＳＴ中の２％ＢＳＡで１０μｇ／ｍｌの作業濃度に希釈し、脳スライスを該一次抗体の作業溶液に入れ、４℃で一晩インキュベートした；二次抗体とのインキュベーション：脳スライスをＴＢＳＴで３回、各回５分間すすぎ、２％ＢＳＡを含むＴＢＳＴで二次抗体を希釈して、５μｇ／ｍｌの作業濃度を得、脳スライスを該二次抗体の作業溶液中で１時間インキュベートした；発色：脳スライスをＴＢＳＴで３回、各回５分間すすぎ、暗所で５分間発色溶液に入れ、純水に２回浸して発色反応を停止した；マウント：脳スライスをＰＢＳに出し入れし、乾燥させ、純水に浸して塩を除去し、乾燥させ、段階濃度のエタノール（７５％、９５％、無水エタノール）で固定し、樹脂でマウントし、乾燥させた；スキャンと定量分析：スライスをデジタルスライススキャナー（Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ｎａｎｏｚｏｏｍｅｒ Ｓ２１０）でスキャンして、スライスのスキャン画像を生成した。各脳スライス画像について、皮質および海馬の領域が最初にマウスの脳座標に従って示され、次にＡβ陽性シグナル領域がＢＩＯＴＯＰＩＸ（商標）分析システムソフトウェアによって示された。最後に、陽性シグナルの比率が、それぞれ皮質と海馬について計算された。すなわち、皮質におけるＡβ陽性シグナルの比率＝皮質におけるＡβ陽性シグナルの面積／皮質の総面積；海馬におけるＡβ陽性シグナルの比率＝海馬におけるＡβ陽性シグナルの面積／海馬の総面積。
【0188】
ＩＨＣ検出の実験結果を図１２と図１３に示した。野生型（ＷＴ）群と比較して、ビヒクル群はＡβ１－４０およびＡβ１－４２の明らかな沈着を示し、これはＥＬＩＳＡアッセイと一致している。ビヒクル群と比較して、ＨＡＢ－３６０１－Ｃｈ、ＨＡＢ－９００１－Ｃｈおよびアデュカヌマブ－ＣｈはＡβ沈着を大幅に減らすことができ、ＨＡＢ－３６０１－ＣｈおよびＨＡＢ－９００１－Ｃｈが、アデュカヌマブ－Ｃｈと同様にＡβ沈着を大幅に減らすことができることを示唆している。
【0189】
（試験例１０．脳組織におけるサイトカイン放出に対する抗体の効果）
この試験例で使用したサンプルは、試験例９の脳ホモジネートからの可溶性成分であり、使用した検出方法は、高感度エレクトロケミルミネッセンスアナライザーＭＳＤ（メソスケールディスカバリー）であった。具体的な実験手順は、製品マニュアル（Ｕ－ＰＬＥＸ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ Ｇｒｏｕｐ（マウス）Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘアッセイキット：ＭＳＤ、Ｎ０５２３５Ａ－１）に記載されている。簡単に説明すると、各サイトカインについてのビオチン化捕捉抗体をＵ－ＰＬＥＸの各リンカーに結合させ、室温で３０分間反応させた後、反応を停止させた；調製したＵ－ＰＬＥＸ結合抗体溶液を混合してＵ－ＰＬＥＸプレートにコーティングし、室温で振とうしながら１時間または４℃で一晩インキュベートした；スタンダードと試験サンプル（即ち、脳組織ホモジネート中の可溶性成分）は、マニュアルに従って希釈された；コーティングされたプレートをＰＢＳＴまたは１×ＭＳＤ洗浄バッファー（１×ＭＳＤ洗浄試薬）で３回洗浄し、２５μｌのサンプル希釈液、２５μｌの希釈したスタンダードおよび試験対象サンプルを添加し、プレートを密封して振とうしながら室温で１時間インキュベートした。コーティングしたプレートをＰＢＳＴまたは１×ＭＳＤ洗浄バッファーで３回洗浄し、５０μｌの希釈した検出抗体混合物を加え、プレートを密封し、室温で１時間振とうしながらインキュベートした。コーティングされたプレートをＰＢＳＴまたは１×ＭＳＤ洗浄バッファーで３回洗浄し、次に２×Ｒｅａｄバッファー試薬を添加した。最後に、プレートをＭＳＤ機器で読み取った。
この試験例で使用したサンプルは、試験例９の脳ホモジネートからの可溶性成分であり、使用した検出方法は、高感度エレクトロケミルミネッセンスアナライザーＭＳＤ（メソスケールディスカバリー）であった。具体的な実験手順は、製品マニュアル（Ｕ－ＰＬＥＸ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ Ｇｒｏｕｐ（マウス）Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘアッセイキット：ＭＳＤ、Ｎ０５２３５Ａ－１）に記載されている。簡単に説明すると、各サイトカインについてのビオチン化捕捉抗体をＵ－ＰＬＥＸの各リンカーに結合させ、室温で３０分間反応させた後、反応を停止させた；調製したＵ－ＰＬＥＸ結合抗体溶液を混合してＵ－ＰＬＥＸプレートにコーティングし、室温で振とうしながら１時間または４℃で一晩インキュベートした；スタンダードと試験サンプル（即ち、脳組織ホモジネート中の可溶性成分）は、マニュアルに従って希釈された；コーティングされたプレートをＰＢＳＴまたは１×ＭＳＤ洗浄バッファー（１×ＭＳＤ洗浄試薬）で３回洗浄し、２５μｌのサンプル希釈液、２５μｌの希釈したスタンダードおよび試験対象サンプルを添加し、プレートを密封して振とうしながら室温で１時間インキュベートした。コーティングしたプレートをＰＢＳＴまたは１×ＭＳＤ洗浄バッファーで３回洗浄し、５０μｌの希釈した検出抗体混合物を加え、プレートを密封し、室温で１時間振とうしながらインキュベートした。コーティングされたプレートをＰＢＳＴまたは１×ＭＳＤ洗浄バッファーで３回洗浄し、次に２×Ｒｅａｄバッファー試薬を添加した。最後に、プレートをＭＳＤ機器で読み取った。
【0190】
実験結果を図１４Ａ～図１４Ｄおよび図１５Ａ～図１５Ｆに示した。ＴＮＦα、ＩＦＮ－γ、ＩＬ１β、ＩＬ２、ＩＬ６、ＩＬ１２ｐ７０、ＩＬ４、ＩＬ１０、ＭＣＰ－１およびＫＣなどのすべてのサイトカインのレベルは非常に低く、検出方法の下限にほぼ達した。個々のマウス間に明らかな違いがあったので、群間に有意差はなかった。要約すると、４つの試験抗体群はポジティブコントロールのアデュカヌマブと比較して高レベルのサイトカインを示さず、試験抗体が安全であることを示していた。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10-1】
【図10-2】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15-1】
【図15-2】
