【図1】 図1は、いくつかの実施形態による、単一細胞AAVキャプシド及びプロモーターライブラリースクリーニングのための戦略及びパッケージングコンストラクトのマップを示す。

【図2-1】 図2は、いくつかの実施形態による、AAVキャプシド及びプロモーターの単一細胞スクリーニングを伴う方法を示す。本方法は、例として、網膜組織において示す。パネルA:バーコード付加したAAVのライブラリーを組織に注入する。ライブラリーからのウイルスバリアントは、異なる効率で異なる細胞に感染する。パネルB:効率的なウイルスは細胞に侵入し、核へと移動してmRNAの発現をもたらす。パネルC:組織を単一細胞へと分離し、個々の細胞からのmRNAを、細胞特異的なDNAバーコードによりタグ付加する。パネルD:個々の細胞のトランスクリプトームプロファイルを分析して細胞型並びに、どのAAVが細胞に感染したか並びにAAV特異性及び効率を決定する。パネルE:エンハンサー/プロモーターライブラリーについて、ライブラリーを広範の指向性を有する単一AAVキャプシドにパッケージングする。パネルF:異なるプロモーターは、個々の細胞型内で異なるレベルの遺伝子発現を駆動する。パネルG:単一細胞懸濁液を作製し、個々の細胞からのmRNAに細胞特異的DNAバーコードによりタグ付加する。パネルH:個々の細胞のトランスクリプトームプロファイルを分析し、細胞型を特定し、プロモーター特異性及び効率を決定する。

【図2-2】 図2-1の続きである。

【図2-3】 図2-2の続きである。

【図2-4】 図2-3の続きである。

【図2-5】 図2-4の続きである。

【図2-6】 図2-5の続きである。

【図3】 図3は、霊長類の網膜及び脳でインビボスクリーニングしたAAV血清型のライブラリー構築の例を示す。23のAAVのライブラリーを、特有のDNAに融合した緑色蛍光ペプチド(GFP)の発現を駆動する汎用プロモーターを含むゲノムで個々にパッケージングした。

【図4】 図4は、図3に記載するようにAAVライブラリーを注入した後の霊長類の網膜及び脳におけるGFP発現を示す。これらのバリアントをパッケージングし、プールし、アカゲザルの網膜、前頭前皮質(PFC)及び線条体に注入した。ライブラリーの注入により、網膜及び脳におけるGFP発現が引き起こされた。

【図5】 図5は、アカゲザル(Rhesus)の網膜中の内因性光感受性網膜神経節細胞(RGC)の特定及び特異的なAAV血清型からのバーコードの回収に関するデータを示す。各円は個々の細胞である。パネルAは、OPN4+/-細胞がICA空間においてクラスター化することを示す。パネルBは、OPN4+/-及びPOU4F2+/-RGC細胞の特定を表す。より大きな円は、AAVゲノム(バーコードにより特定される)が回収された細胞を示す。

【図6】 図6は、細胞型にわたるAAV指向性のヒートマップである。23の既存の血清型の定量により、予期されるように網膜において感染性について進化したAAV(K916、K94、7m8、K912、NHP26)は、他のバリアントより優れていることが明らかになっている。対照的に、AAV9ベースのベクターは、被殻における最高性能のバリアントであり、アプローチを実証している。分析した細胞型に感染しなかったAAVバリアントは、ヒートマップには示されていない。

【図7A】 図7Aは、最小プロモーターと小ペプチド配列との間に介在配列(IVS)がない本明細書中に示すライブラリーのAAVベクターのマップである。

【図7B】 図7Bは、最小プロモーターと小ペプチド配列との間にIVSを有する、本明細書中に示すライブラリーのAAVベクターのマップである。

【図8】 図8は、cap発現を駆動するためのAAVプロモーター(P40又はP19+P40)、次いでITR内の導入遺伝子(例えば、CAG-GFP、CAG-GFP11又は膜シグナルペプチドを有するCAG-スプリットGFP)を駆動するためのプロモーター(例えばCAGプロモーター)を含むライブラリーのAAVベクターのマップである。

【図9】 図9は、ITRを持たない、全長rep配列を含むrepイントランスのプラスミドのマップである。

【図10】 図10は、マーモセット黄斑scATAC-seqデータ(SnapATACを使用)から作成し、次いで同一サンプルからのscRNA-seqデータと統合したクラスターのグラフを含む。細胞型を、統合したscRNA-seqデータ(Seuratを使用)からの遺伝子発現に基づいて予測した。RHO=杆体特異的遺伝子、RGR=ミュラーグリア細胞特異的遺伝子及びGRIK1=オフ型双極細胞特異的遺伝子。

【図11-1】 図11A～Cは、それぞれ、RS1(レチノスキシン)、USH2A(ウシェリン)及びABCA4(ATP結合カセットサブファミリーAメンバー4)について決定した、疾患遺伝子プロファイルを含む(左上=アカゲザル黄斑、左下=マーモセット黄斑、右上=マーモセット上部、右下=マーモセット下部)。

【図11-2】 図11-1の続きである。

【図11-3】 図11-2の続きである。